KR20060069207A - 간세포암 또는 결장암에 관련된 유전자 및 폴리펩티드 - Google Patents

간세포암 또는 결장암에 관련된 유전자 및 폴리펩티드 Download PDF

Info

Publication number
KR20060069207A
KR20060069207A KR1020047019881A KR20047019881A KR20060069207A KR 20060069207 A KR20060069207 A KR 20060069207A KR 1020047019881 A KR1020047019881 A KR 1020047019881A KR 20047019881 A KR20047019881 A KR 20047019881A KR 20060069207 A KR20060069207 A KR 20060069207A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
seq
polypeptide
set forth
nucleic acid
acid sequence
Prior art date
Application number
KR1020047019881A
Other languages
English (en)
Inventor
유수케 나카무라
요이치 후루카와
Original Assignee
온코세라피 사이언스 가부시키가이샤
고쿠리츠다이가쿠호우진 도쿄다이가쿠
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 온코세라피 사이언스 가부시키가이샤, 고쿠리츠다이가쿠호우진 도쿄다이가쿠 filed Critical 온코세라피 사이언스 가부시키가이샤
Publication of KR20060069207A publication Critical patent/KR20060069207A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2/00—Peptides of undefined number of amino acids; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/303—Liver or Pancreas
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4748—Tumour specific antigens; Tumour rejection antigen precursors [TRAP], e.g. MAGE
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3046—Stomach, Intestines
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57419—Specifically defined cancers of colon
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57438—Specifically defined cancers of liver, pancreas or kidney
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 상응하는 비종양성 조직과 비교할 때, 대부분의 간세포암 및 결장암에서 각각 발현이 현저히 증가하는 신규한 인간 유전자인 WDRPUH 및 KRZFPUH, 그리고 PPIL1, 뿐만 아니라 원발성 결장암에서 발현이 증가되고 결장암 세포로 야생형 APC1을 형질감염시켰을 때 발현이 감소하는 신규한 인간 유전자인 APCDD1를 제공한다. 상기 유전자 및 상기 유전자에 의하여 코딩되는 폴리펩티드는 예를 들어, 세포 증식성 질환을 진단하고 질병에 대한 치료제를 개발하기 위한 표적 분자로 사용될 수 있다.
간세포암, 결장암, 세포 증식성 질환

Description

간세포암 또는 결장암에 관련된 유전자 및 폴리펩티드{GENES AND POLYPETIDES RELATING TO HEPATOCELLULAR OR COLORECTAL CARCINOMA}
본 발명은 생물 과학 분야, 보다 상세하게는 암 연구 분야에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 세포의 증식 기작과 관련된 신규한 유전자인 WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1 및 APCDD1과 상기 유전자에 의하여 코딩되는 폴리펩티드에 관한 것이다. 본 발명의 유전자 및 폴리펩티드는 세포 증식성 질환을 진단하는데 사용될 수 있고, 상기 질환에 대한 약물을 개발하기 위한 표적 분자로 사용될 수 있다.
간세포암(hepatocellular carcinoma, HCC)과 결장암(colorectal carcinoma)은 세계적으로 암으로 인한 사망에 있어 주요 원인이 되는 암이다(Akriviadis et al., Br. J. Surg., 85(10):1319-31, 1998). 최근의 의학적 진보로 인해 진단과 치료방법이 발달했을지라도 많은 수의 암 환자는 여전히 암이 진행된 단계에서 발견되고 있고 암 완치는 가장 시급한 문제이다. 최근 분자 연구의 발전으로 종양 억제 유전자 및/또는 암유전자(oncogene)의 변화가 암발생에 관련이 있다고 알려지 고 있으나 정확한 기작은 아직 밝혀지지 않고 있다.
최근 분자생물학의 발전으로 결장암의 발생 및 진행에서와 같이 다단계 과정이 간세포암의 원인이라는 것이 밝혀지고 있다. 이러한 과정은 다양한 유전자 산물의 양적, 질적 변화와 관련되어 있다. 베타-카테닌(β-catenin)/Tcf 신호전달과정은 암 진행 중 형태형성(morphogenesis)에 관련되어 있다고 보고되어 왔다(Wodarz and Nusse, Annu. Rev. Cell. Dev. Biol., 14:59-88, 1998; Polakis, Genes Dev., 14:1837-51, 2000; Bienz and Clevers, Cell, 103:311-20, 2000). 최근 암 연구의 진전으로 인해 결장, 간, 전립선, 위, 뇌, 자궁내막 또는 그 이외 어느 부위에서 발생하든지 인간 종양 발생에 있어 신호전달 경로의 중요성이 강조되어 왔다(Bullions and Levine, Curr. Opin. Oncol., 10:81-7, 1998). 종양 억제인자인 선종성 결장 용종증(adenomatous polyposis coli, APC) 유전자는 베타-카테닌, 옥신(Axin), 컨덕틴(conductin) 및 글리코겐 합성효소 키나아제-3β(glycogen synthase kinase-3β, GSK-3β)와 상호작용을 하고 유비퀴틴-프로테오좀 시스템(ubiquitin-proteosome system)을 통해 베타-카테닌 분해를 촉진한다(Polakis, Genes Dev., 14:1837-51, 2000). 대부분의 산발적인 결장암은 APC, AXIN1 또는 AXIN2[conductin(컨덕틴)]에 있는 돌연변이를 불활성화 시키거나 CTNNB1(베타-카테닌)에 있는 암유전자 돌연변이를 활성화시킴으로써 세포질 및/또는 핵에 베타-카테닌을 축적시키고 그 결과 베타-카테닌/Tcf 전사복합체를 구조적으로 활성화시킨다(Polakis, Genes Dev., 14:1837-51, 2000; Korinek et al., Science, 275:1784-7, 1997). 그 결과 복합체는 c-myc, cyclin D1, matrilysin(MMP-1), c-jun , fra-1, 유로키나제-형 플스미노겐 활성제 수용체(urokinase-type plasminogen activator receptor, uPAR), 커넥신43(connexin43), CD44, PPAR-∂, AF-17 및 ENC-1 과 같은 표적 유전자를 활성화시킨다(He et al., Science, 281:1509-12, 1998; Shtutman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 96:5522-7, 1999; Brabletz et al., Am. J. Pathol., 155: 1033-1038, 1999; Crawford et al., Oncogene, 18:2883-91, 1999; Mann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 96:1603-8, 1999; van der Heyden et al., J. Cell. Sci., 111:1741-9, 1998; Wielenga et al., Am. J. Pathol., 154:515-23, 1999; He et al., Cell, 99:335-45, 1999; Lin et al., Cancer Res., 61:6345-9, 2001; Fujita et al., Cancer Res., 61:7722-6, 2001). 그러나 결장암에서 이러한 경로의 활성화에 의한 암 발생의 정확한 기작은 명확히 밝혀져 있지 않다.
스타트민(stathmin)과 같은 또 다른 단백질 역시 여러 종류의 암과 관련되어 있다고 알려져 있다(Hanash et al., J. Biol.Chem., 263:12813-5, 1988; Roos et al., Leukemia, 7:1538-46, 1993; Nylander et al., Histochem. J., 27:155-60, 1995; Friedrich et al., Prostate., 27:102-9, 1995; Bieche et al., Br. J. Cancer 78:701-9, 1998). 스타트민(Sobel et al., J. Biol. Chem., 264:3765-72, 1989; Sobel et al., Trends Biol. Sci., 16:301-5, 1991)은 또한 이미 p19, 프로솔린(prosolin), Lap18, 온코프로테인 18(oncoprotein 18), 메타블라스틴(metablastin), 및 Op 18이라 지칭되어 온 148 개의 아미노산 잔기로 이루어진 19 kD 크기의 세포질 인단백질이다. 스타트민은 생쥐 포배(blastocyst)의 내부 세포 괴(inner cell mass)의 다능성 배아암세포(multipotential embryonic carcinoma cell)에서 매우 높게 발현되는 것으로 밝혀졌다(Doye et al., Differentiation, 50:89-96, 1992). 스타트민은 세포내에서 몇 가지 인산화되지 않은 형태와 인산화된 형태로 존재하는데, 그 양상은 많은 생물학적 시스템에서 세포의 증식, 분화 또는 활성화 상태에 따라 달라진다(Sobel et al., Trends Biol. Sci., 16:301-5, 1991). 더 나아가 스타트민의 미세소관 탈중합 활성(depolymerizing activity)은 스타트민의 인산화 수치의 변화에 따라 조절되고 스타트민의 탈중합 활성은 세포주기의 각각의 시기 동안 미세소관의 동적 불안정성(dynamic instability) 조절에 있어 매우 중요한 역할을 하는 것으로 보고되고 있다(Marklund et al., EMBO J., 15:5290-8, 1996; Horwitz et al., J. Biol. Chem., 272:8129-31, 1997). 체세포 분열 동안에는 스타트민에 광범위한 인산화가 일어나고(Strahler et al., Biochem. Biophy. Res. Commun., 185:197-203, 1992; Luo et al., J. Biol. Chem., 269:10312-8, 1994; Brattsand et al., Eur. J. Biochem., 220:359-68, 1994), 이는 세포 주기의 진행에 있어 필수적인 것으로 여겨진다. 그러나 스타트민 인산화의 정확한 기작 그리고 암 발생과 스타트민 인산화의 관련성은 아직 분명히 밝혀져 있지 않다.
cDNA 마이크로어레이(cDNA microarray) 기술로 정상 및 암 세포에서 유전자 발현의 포괄적인 양상을 구하는 것이 가능해졌다(Okabe et al., Cancer Res., 61:2129-37, 2001; Lin et al., Oncogene, 21:4120-8, 2002; Hasegawa et al., Cancer Res., 62:7012-7, 2002). 상기의 접근방법은 암 세포의 복잡한 특성을 밝 혀내고 암 발생의 기작을 이해하는데 도움을 줄 수 있다. 종양에서 발현이 조절되지 않는 유전자를 규명함으로써 각각의 암을 보다 정확하고 분명하게 진단하고, 치료를 위한 신규한 표적을 개발하는 것이 가능해졌다(Bienz and Clevers, Cell, 103:311-20, 2000). 게놈의 영역에서 암 발생의 기작을 밝혀내고, 진단 및 신규한 치료제 개발을 위한 표적 분자를 밝혀내기 위하여, 본 발명자들은 23040종류의 유전자의 cDNA 마이크로어레이를 사용하여 종양 세포의 유전자발현 양상을 분석하였다(Okabe et al., Cancer Res., 61:2129-37, 2001); Kitahara et al., Cancer Res., 61:3544-9, 2001; Lin et al., Oncogene, 21:4120-8, 2002; Hasegawa et al., Cancer Res., 62:7012-7, 2002).
암 발생 기작을 밝히기 위한 연구는 항암제의 표적 분자를 밝혀내는 연구를 촉진시켰다. 예를 들어, 원래 Ras와 관련된 성장-신호전달 경로(growth-signaling pathway)를 억제하기 위하여 개발된 파넥실 전이효소 억제제(inhibitor of farnexyl transferase, FTI)는 동물모델에서 Ras에 의해 발생하는 암을 치료하는데 효과를 나타내었다(He et al., Cell, 99:335-45, 1999). 원암 유전자(proto-oncogene)인 수용체 HER2/neu를 분석하기 위하여 항암제와 항-HER2 단클론성 항체인 트라스투주마브(trastuzumab)를 함께 사용한 사람을 대상으로 임상 실험을 실시한 결과, 유방암 환자의 임상 결과와 전체적인 생존률이 전에 비해 높아졌다(Lin et al., Cancer Res., 61:6345-9, 2001). 선택적으로 bcr-abl 융합 단백질을 불활성화시키는 티로신 키나아제 억제제는 bcr-abl 티로신 키나아제의 구조적인 활성화로 인해 백혈구가 변형되는 만성 골수성 백혈병(chronic myelogenous leukemia)을 치료하기 위해 개발되었다. 이러한 종류의 약물은 특정 유전자 산물에 의한 암 유전자 활성화를 억제하도록 고안된다(Fujita et al., Cancer Res., 61:7722-6, 2001).
발명의 요약
본 발명의 목적은 간세포암 또는 결장암 세포의 증식 기작과 관련된 신규한 단백질과 상기 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 단백질 및 유전자를 생산하는 방법 및 상기 단백질 및 유전자를 간세포암 또는 결장암의 진단과 치료에 이용하는 방법을 제공하는 것이다.
간세포암 또는 결장암 발생의 기작을 밝히고 신규한 진단 마커 및/또는 상기 암을 치료하기 위한 약물의 표적을 동정하기 위하여, 본 발명자들은 23040 종류의 유전자를 포함하는 게놈 영역의 cDNA 마이크로어레이(cDNA microarray)를 사용하여 간세포암과 결장암에서 발현되는 유전자의 발현양상을 분석하였다. 약학적 견지에서 암유전자의 신호를 억제하는 것은 암-억제 효과를 활성화시키는 것보다 더 용이하다. 그러므로, 본 발명자들은 간세포암과 결장암 발생시 발현이 증가하도록 조절되는 유전자를 동정하였다.
간세포암에서 일반적으로 발현이 상향 조절되는 전사체 중에 염색체 밴드 17p13 및 16p11에서 각각 신규한 인간 유전자인 WDRPUH(간세포암에서 발현이 상향 조절되는 WD40 반복 단백질(repeat protein))과 KRZFPUH(간세포암에서 발현이 상향조절되는 크루펠 타입 징크 핑거 단백질(Kruppel-type zinc finger protein))을 각각 동정하였다. WDRPUH 또는 KRZFPUH 유전자로 형질감염된 세포는 세포분화가 촉진되었다. 더 나아가, 상기 유전자에 특이적인 안티센스(anti-sense) S-올리고뉴클레오티드의 형질감염으로 인한 WDRPUH 또는 KRZFPUH의 발현 감소는 간세포암 세포의 성장을 억제하였다. DNA 및/또는 RNA 합성 억제제, 대사 억제제 및 DNA의 염기쌍내로 삽입되는 물질(intercalator)과 같은 많은 항암제는 암세포 뿐 아니라 정상세포에도 독성이 있다. 그러나 WDRPUH 및 KRZFPUH의 발현을 억제하는 물질은 이러한 유전자의 정상 발현이 고환에 한정되기 때문에, 다른 장기에 부작용을 나타내지는 않을 것이므로, 암을 치료하는데 매우 중요할 것이다.
아울러, 결장암에서 일반적으로 발현이 상향조절되는 전사체 중에서 염색체 밴드 6p21.1에 위치한 PPIL1 유전자(peptidyl prolyl isomerase-like 1)를 동정하였다. 부가하여, 면역침강법으로 PPILI 단백질이 비타민 D 수용체의 전사활성에 관여하는 SNWI(SKI interacting protein)과 세포 주기의 진행에 관여하는 세포질 인단백질(phosphoprotein)인 스타트민(stathmin)과 결합한다는 것을 밝혀냈다. 본 발명자들은 또한 간세포암과 결장암에서 비정상적으로 발현이 상향 조절되는 베타-카테닌/Tcf4 복합체를 확인하고, 염색체 밴드18p11.2에 위치한 신규한 유전자인 APCDD1(Down-regulated by adenomatosis polyposis coli)를 동정하였다. APCDD1 유전자의 발현은 자연형형 APC의 발현에 의하여 감소했고 대부분의 결장암 조직에 서는 증가했다. PPIL1 또는 APCDD1의 유전자를 형질전환시키면 이러한 유전자 중 어느 하나가 발현되지 않는 세포의 증식이 촉진되었다. 더 나아가, PPIL1 또는 APCDD1에 특이적인 안티센스 S-올리고뉴클레오티드의 형질전환에 의한 PPIL1 또는 APCDD1 발현의 감소는 결장암 세포의 증식을 억제하였다.
그러므로, 본 발명은 신규한 유전자인 WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1 및 APCDD1을 제공한다. 이들은 암 진단 마커 후보물질이고 신규한 진단방법과 효과적인 항암제를 개발하기 위한 잠재적인 가능성을 가진 표적이다. 더 나아가, 본 발명은 상기 유전자에 의하여 코딩되는 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드의 생산방법 및 상기 폴리펩티드의 용도를 제공한다. 보다 상세하게 본 발명은 다음을 제공한다:
본 발명은 세포증식을 촉진하고 간세포암이나 결장암과 같은 세포 증식성 질환에서 발현이 상향 조절되는 신규한 인간 펩타이드인 WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1 및 APCDD1 또는 그의 기능적 등가물을 제공한다.
바람직한 실시태양에서, WDRPUH 폴리펩티드는 서열번호 1의 개방형 판독틀(open reading frame, ORF)에 의해 코딩되는 11개의 WD40 반복 도메인을 갖는 620개의 아미노산으로 구성된 단백질을 포함한다. 바람직하게는, WDRPUH 폴리펩티드는 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명은 또한 WDRPUH 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 1로 기재되는 서열과 적어도 15%, 보다 바람직하게는 적어도 25% 이상 상보적인 폴리뉴클레오티드 서열의 적어도 일부분으로부터 코딩되는 분리된 단백질을 제공한다.
한편, 바람직한 실시태양에서 KRZFPUH 폴리펩티드는 집쥐 유전자인 징크 핑 거(zinc finger) 단백질 HIT-39(GenBank Accession No. AF277902)과 상동성을 갖는 500개의 아미노산과 서열번호 3으로 기재되는 개방형 판독틀에 의해 코딩되는 크루펠-형 징크 핑거 도메인(Kruppel-type zinc finger domain, KRAB)을 포함한다. KRZFPUH 폴리펩티드는 바람직하게는 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명은 또한 KRZFPUH 폴리뉴클레오티드 서열의 적어도 일부분으로부터 코딩된 단백질 또는 서열번호 3으로 기재되는 서열과 적어도 15%, 보다 바람직하게는 25% 이상 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 아울러, 바람직한 실시태양에서, PPIL1 폴리펩티드는 서열번호 5의 개방형 판독틀에 의해 코딩되고, Ppil1 과 98.1%, PPIA와 41.6%, Cyp2와 57.4%, CypE와 50% 동일한 아미노산으로 구성된 단백질을 포함한다. PPIL1 폴리펩티드는 바람직하게는 서열번호 6으로 기재되는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 PPIL1 폴리펩티드 서열의 적어도 일부분으로부터 코딩되는 단백질 또는 서열번호 5로 기재되는 서열과 적어도 15%, 보다 바람직하게는 적어도 25% 이상 상보적인 폴리펩티드 서열을 제공한다. 아울러, 바람직한 실시태양에서APCDD1 폴리펩티드는 서열번호 7로 기재되는 개방형 판독틀에 의해 코딩되는 Themobacillus xylanilyticus의 엔도-1,4-베타-실라나제(endo--1,4-β-xylanase)와 31% 동일성을 나타내는 514 아미노산을 포함한다. APCDD1 폴리펩티드는 바람직하게는 서열번호 8로 기재되는 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명은 또한 APCDD1 폴리뉴클레오티드 서열의 적어도 일부분으로부터 코딩된 단백질 또는 서열번호 7로 기재되는 서열과 적어도 15%, 보다 바람직하게는 25% 이상 상보적인 폴리뉴클레오 티드 서열로부터 코딩된 단백질을 제공한다.
더 나아가 본 발명은 정상인 간 조직에 비해 간세포암 세포의 대부분에서 발현이 매우 증가하는 신규한 인간 유전자인 WDRPUH 및 KRZFPUH를 제공한다. 분리된 WDRPUH 유전자는 서열번호 1로 기재되는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 보다 상세하게, WDRPUH cDNA는 1860개의 핵산의 개방형 판독틀을 포함하는 2152개의 핵산을 포함한다. 아울러, 본 발명은 서열번호 1로 기재되는 폴리뉴클레오티드 서열과 혼성화하고, 서열번호 1로 기재되는 폴리뉴클레오티드와 적어도 15%, 보다 바람직하게는 적어도 25% 이상 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 더 나아가, 본 발명은 WDRPUH 단백질 또는 그와 기능적인 등가물을 코딩하는 한, 서열번호 1로 기재되는 폴리뉴클레오티드와 혼성화하고 상기 폴리뉴클레오티드와 적어도 15%, 보다 바람직하게는 적어도 25% 이상 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 그러한 폴리뉴클레오티드의 예는 서열번호 1의 축퇴체(degenerate) 및 대립유전자 돌연변이(allelic mutant)이다. 한편, 분리된 KRZFPUH 유전자는 서열번호 3으로 기재되는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 보다 상세하게, KRZFPUH cDNA는 1500개 핵산의 개방형 판독틀임을 포함하는 2744개의 핵산을 포함한다. 본 발명은 더 나아가 KRZFPUH 단백질 또는 그의 기능적인 등가물을 코딩하는 한, 서열번호 3으로 기재되는 폴리 뉴클레오타이드와 혼성화되고, 적어도 15%, 보다 바람직하게는 적어도 25% 이상 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 그러한 폴리뉴클레오티드의 예는 서열번호 3으로 기재되는 서열의 축퇴체와 대립 유전자 돌연변이이다.
더 나아가, 본 발명은 정상 조직과 비교할 때 대부분의 결장암에서 발현이 상당히 증가되는 신규한 인간 유전자인 PPIL1을 제공한다. 분리된 PPIL1 유전자는 서열번호 5로 기재되는 폴리뉴클레오티드를 포함한다: 구체적으로 PPIL1 cDNA는 498개 핵산의 개방형 판독틀을 포함하는 1734개의 핵산을 포함한다. 더 나아가 본 발명은 PPIL1 단백질이나 그의 기능적 등가물을 코딩하는 한, 서열번호 5로 기재되는 폴리뉴클레오티드와 혼성화하고 서열번호 5로 기재되는 폴리뉴클레오티드와 적어도 15%, 보다 바람직하게는 적어도 25% 이상 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 그러한 폴리뉴클레오티드의 예는 서열번호 5의 축퇴체 및 대립 유전자 돌연변이이다.
더욱이, 본 발명은 정상 조직과 비교할 때 대부분의 원발성 결장암(primary colon cancer)에서 발현이 상당히 증가하고 야생형 APC1을 대장암 세포로 형질전환 했을 때 발현이 감소되는 신규한 인간 유전자인 APCDD1을 제공한다. 분리된 APCDD1 유전자는 서열번호 7로 기재되는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 구체적으로 APCDD1 cDNA는 1542개의 핵산으로 이루어진 개방형 판독틀을 포함하는 2607개의 핵산을 포함한다. 더 나아가, 본 발명은 APCDD1 단백질이나 그의 기능적 등가물을 코딩하는 한, 서열번호 7로 기재되는 폴리뉴클레오티드 서열과 혼성화하고 서열번호 5로 기재되는 폴리뉴클레오티드와 적어도 15%, 보다 바람직하게는 적어도 25% 이상 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 그러한 폴리뉴클레오티드의 예는 서열번호 7의 축퇴체와 대립 유전자 돌연변이이다.
본 문서에서 사용된 바와 같이, 분리된 유전자는 그 구조가 어떠한 자연적으로 존재하는 폴리뉴클레오티드 또는 자연적으로 존재하는 세 개 이상의 개별 유전 자에 걸친 게놈 폴리뉴클레오티드의 어떠한 단편의 구조와도 동일하지 않은 폴리뉴클레오티드이다. 그러므로, 상기 용어는 예를 들어, (a) 개체의 게놈에 자연적으로 존재하는 게놈 DNA 분자 일부분의 서열을 가지고 있는 DNA; (b) 벡터로 삽입되거나 원핵세포 또는 진핵세포의 게놈 DNA로 삽입되고 삽입 결과 생성된 분자가 자연적으로 존재하는 벡터 또는 게놈 DNA와 동일하지 않은 폴리뉴클레오티드; (c) cDNA, 게놈 단편, 중합효소 연쇄반응(PCR)에 의해 생성된 단편 또는 제한 효소로 처리된 단편; 및 (d) 하이브리드 유전자의 일부분인 재조합 핵산서열, 즉 융합 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 포함한다.
따라서, 본 발명은 본문에 기술된 폴리펩티드를 코딩하는 분리된 폴리뉴클레오티드나 그의 단편을 제공한다. 바람직하게는, 분리된 폴리펩티드는 서열번호 1, 3, 5 또는 7로 기재되는 핵산과 적어도 60% 동일한 핵산서열을 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 분리된 핵산은 서열번호 1, 3, 5 또는 7로 기재된 핵산과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일하다. 참고 서열의 경우에, 예를 들어, 서열번호 1, 3, 5 또는 7과 길이가 같거나 더 긴 분리된 폴리뉴클레오티드의 경우에 참고 서열의 전장와 비교한다. 분리된 폴리뉴클레오티드가 참고 서열, 예를 들어 서열번호 1, 3, 5 또는 7보다 더 짧을 때, 동일한 길이의 참고 서열 단편(상동성 계산이 필요한 루프(loop)는 제외)과 비교한다.
또한, 본 발명은 또한 숙주세포를 WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1 또는 APCDD1 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 형질전환시켜 단백질을 생산하는 방법 및 상기 폴리뉴클레오티드를 발현하는 방법을 제공한다. 부가하여, 본 발명은 WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1 또는 APCDD1 단백질을 코딩하는 핵산서열을 포함하는 벡터 및 WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1 또는 APCDD1 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 갖고 있는 숙주세포를 제공한다. 그러한 벡터와 숙주세포는 WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1, 또는 APCDD1 단백질을 생산하는데 사용될 수 있다.
또한 본 발명은 WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1 또는 APCDD1 단백질을 인식하는 항체를 제공한다. 부분적으로 WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1 또는 APCDD1 유전자의 안티센스 폴리뉴클레오티드(예를 들어 안티센스 DNA), 리보자임(ribozyme) 및 작은 간섭 RNA(small interfering RNA, siRNA)를 제공한다.
더 나아가, 본 발명은 표본의 생물학적 시료에서 유전자의 발현수준을 측정하는 단계; 상기 시료에서의 WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1 또는 APCDD1 유전자의 발현수준을 정상 시료에서의 상기 유전자의 발현수준과 비교하는 단계; 및 상기 시료에서의 WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1 또는 APCDD1 유전자의 높은 발현수준을 암과 같은 세포 증식성 질환에 걸린 것으로 판정하는 단계를 포함하는 세포 증식성 질환의 진단방법을 제공한다. WDRPUH 또는 KRZFPUH의 발현수준으로 진단할 수 있는 질환은 간세포암이고; PPIL1 또는 APCDD1의 발현수준으로 탐지할 수 있는 질환은 결장암이다.
또한, 본 발명은 세포 증식성 질환의 치료를 위한 화합물을 선별하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1 또는 APCDD1 폴리펩티드를 시험 대상 화합물과 접촉시키는 단계; 및 WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1 또는 APCDD1 폴리펩티드와 결합하는 시험 대상 화합물을 선별하는 단계를 포함한다.
본 발명은 세포 증식성 질환의 치료를 위한 화합물을 선별하는 방법을 추가적으로 제공한다. 여기서 상기 방법은 WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1 또는 APCDD1 폴리펩티드를 시험 대상 화합물과 접촉시키는 단계; 및 WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1 또는 APCDD1 폴리펩티드의 발현수준 또는 생물학적 활성을 억제하는 시험 대상 화합물을 선택하는 단계를 포함한다.
또한 본 발명은 세포 증식성 질환의 치료를 위한 화합물을 선별하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 시험 대상 화합물, 베타-카테닌/Tcf 4 복합체 및 리포터 유전자의 발현에 적합한 조건하에 있는 두 개의 Tcf/LEF 결합 모티프로 구성되어 있는 APCDD1 전사조절영역를 갖는 리포터 유전자를 접촉시키는 단계; 및 리포터 유전자의 발현을 억제하는 화합물을 선별하는 단계를 포함한다.
더 나아가, 본 발명은 세포 증식성 질환의 치료를 위한 화합물을 선별하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 시험 대상 화합물의 존재하에 PPIL1와 스타트민 또는 SNW1을 접촉시키는 단계; 및 PPIL1과 스타트민 또는 SNW1의 결합을 억제하는 시험 대상 화합물을 선별하는 단계를 포함한다.
본 발명은 아울러 암과 같은 세포 증식성 질환의 치료를 위한 약학적 조성물을 제공한다. 약학적 조성물은 예를 들면 항암제와 같은 것일 수 있다. 약학적 조성물은 각각 서열번호 1, 3, 5 또는 7로 기재되는 WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1 또는 APCDD1 폴리뉴클레오티드 서열의 안티센스 S-올리고뉴클레오티드나 siRNA의 적어도 일부분으로 기재될 수 있다. 적당한 안티센스 S-올리고뉴클레오티드는 서열번호 16, 37, 44 또는 89로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 핵산서열이 다. 서열번호 16으로 기재되는 핵산서열을 갖는 핵산을 포함하는 WDRPUH의 안티센스 S-올리고뉴클레오티드는 간세포암 및 위암을 치료하는데 사용될 수 있고; 서열번호 37로 기재되는 핵산서열을 갖는 핵산을 포함하는 KRZFPUH의 안티센스 S-올리고뉴클레오티드는 간세포암, 위암 및 폐암을 치료하는데 사용될 수 있으며; 서열번호 44로 기재되는 핵산서열을 갖는 핵산을 포함하는 PPIL1의 안티센스 S-올리고뉴클레오티드는 결장암을 치료하는데 사용될 수 있고; 서열번호 89로 기재되는 핵산서열을 갖는 핵산을 포함하는 APCDD1의 안티센스 S-올리고뉴클레오티드 결장암을 치료하는데 사용될 수 있다. 상기 약학적 조성물은 또한 본 발명의 세포 증식성 질환의 치료를 위한 화합물의 탐색방법에 의하여 선별되는 화합물을 포함할 수 있다.
약학적 조성물의 작용 방향은 바람직하게는 암세포의 성장을 억제하는 것이다. 상기 약학적 조성물은 인간 및 가축을 포함하는 포유류에 사용될 수 있다.
본 발명은 본 발명에 의해 제공되는 약학적 조성물을 사용하여 세포 증식성 질환을 치료하는 방법을 추가적으로 제공한다.
부가하여, 본 발명은 WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1 또는 APCDD1 폴리펩티드를 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료 및 예방방법을 제공한다. 항-종양 면역성(anti tumor immunity)은 WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1 또는 APCDD1 폴리펩티드를 투여함으로써 유도된다. 그러므로, 본 발명은 또한 항암 면역성을 유도하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1 또는 APCDD1 폴리펩티드를 포함하는 암 치료 또는 예방용 약학적 조성물 뿐만 아니라, WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1 또는 APCDD1 폴리펩티드를 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명의 상술한 요약 및 뒤따르는 발명의 상세한 설명은 바람직한 실시태양에 관한 것이지, 본 발명 또는 본 발명의 다른 변화된 실시태양을 제한하지는 않는 것으로 이해되어야 한다.
발명의 상세한 설명
본 문서에서 사용된 "a", "an" 및 "the"은 특별히 지시하지 않는 이상 "적어도 하나 이상의"를 의미한다.
본 발명은 상응하는 비종양성 간 조직과 비교하여 간세포암 조직(hepatocellular carcinoma, HCC)에서 그 발현이 현저하게 증가하는 신규한 인간 유전자인 WDRPUH 및 KRZFPUH에 관한 것이다. 상기 WDRPUH cDNA는 서열번호 1에 기재된 바와 같이, 1860 염기의 개방형 판독틀(open reading frame, ORF)을 포함하는 2152 염기로 구성된다. 상기 개방형 판독틀은 11개의 WD40 반복 도메인을 가진 잠재적인 620 아미노산의 단백질을 코딩한다. 따라서, 상기 단백질을 WDRPUH(WD40 repeats protein up-regulated in HCCs)라고 명명하였다. 한편, KRZFPUH cDNA는 서열번호 3에 기재된 바와 같이 1500 염기의 개방형 판독틀(open reading frame, ORF)을 포함하는 2744 염기로 구성된다. 상기 개방형 판독틀은 크루펠-형 징크 핑거 단백질(Kruppel-type zinc finger protein) 도메인을 포함하는 잠재적인 500 아미노산의 단백질을 코딩한다. 따라서, 상기 단백질을 KRZFPUH(Kruppel-type zinc finger protein up-regulated in HCCs)로 명명하였다.
아울러, 본 발명은 상응하는 비종양성 조직과 비교하여 결장암 조직에서 그 발현이 현저하게 증가하는 신규한 인간 유전자인 PPIL1 및 APCCD1을 포함한다. 상기 PPIL1 cDNA는 서열번호 5에 기재된 바와 같이 498 염기의 개방형 판독틀을 포함하는 1734 염기로 구성된다. 상기 개방형 판독틀은 잠재적인 166 아미노산의 단백질을 코딩한다. PPIL1은 비타민 D 수용체 및 세포 주기의 진행에 관련된 세포질 인산단백질인 스타트민(stathmin)의 전사활성과 관련된 단백질인 SKI 상호작용 단백질(SNW1)과 직접적으로 상호작용한다. 한편, APCDD1 cDNA는 서열번호 7로 기재된 바와 같이 1542 염기의 개방형 판독틀(open reading frame, ORF)을 포함하는 2607 염기로 구성된다. 상기 개방형 판독틀은 알려진 모티프를 가지지 않은 잠재적인 514 아미노산의 단백질을 코딩한다. 상기 유전자는 APCDD1(down-regulated by APC1)으로 명명하였다. 아울러, APCDD1의 전사조절 영역에 존재하는 두 개의 Tcf/LEF 결합 모티프에 베타-카테닌/Tcf4 복합체(β-catenin/Tcf4 complex)가 결합함으로써, APCDD1의 발현은 상기 복합체에 의하여 조절된다.
일관되게, 세포로의 WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1 또는 APCDD1의 외인성 발현은 증가된 세포성장을 야기하는 반면, 상기 유전자의 발현을 안티센스 S-올리고뉴클레오티드 또는 작은 간섭 RNA(small interfering RNA, siRNA)로 억제하면 종양 세포의 성장이 유의한 수준으로 억제된다. 상기와 같은 발견은 WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1 및 APCDD1이 암세포에서의 암발생 활성을 담당하며, 상기 단백질의 활성을 억제가 암의 치료를 위한 전도 유망한 전략이 될 수 있음을 제시하고 있다.
본 발명은 서열번호 2에 개시된 아미노산 서열 또는 그의 기능적 등가물을 포함하는 WDRPUH 단백질을 코딩하는 정도의 축퇴체(degenerate) 및 그의 돌연변이(mutant) 뿐만 아니라, 서열번호 1에 기재된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 신규한 인간 WDRPUH 유전자를 포함한다. WDRPUH에 기능적으로 동등한 폴리텝티드에는 예를 들어, 인간 WDRPUH 단백질의 돌연변이 뿐만 아니라 인간 WDRPUH 단백질에 상응하는 다른 생명체의 상동 단백질이 포함된다.
본 발명은 또한 서열번호 4에 개시된 아미노산 서열 또는 그의 기능적 등가물을 포함하는 KRZFPUH 단백질을 코딩하는 정도의 축퇴체(degenerate) 및 그의 돌연변이(mutant) 뿐만 아니라, 서열번호 3에 기재된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 신규한 인간 KRZFPUH 유전자를 포함한다. KRZFPUH에 기능적으로 동등한 폴리텝티드에는 예를 들어, 인간 KRZFPUH 단백질의 돌연변이 뿐만 아니라 인간 KRZFPUH 단백질에 상응하는 다른 생명체의 상동 단백질이 포함된다.
아울러, 본 발명은 서열번호 6에 개시된 아미노산 서열 또는 그의 기능적 등가물을 포함하는 PPIL1 단백질을 코딩하는 정도의 축퇴체(degenerate) 및 그의 돌연변이(mutant) 뿐만 아니라, 서열번호 5에 기재된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 신규한 인간 PPIL1 유전자를 포함한다. PPIL1에 기능적으로 동등한 폴리텝티드에는 예를 들어, 인간 PPIL1 단백질의 돌연변이 뿐만 아니라 인간 PPIL1 단백질에 상응하는 다른 생명체의 상동 단백질이 포함된다.
본 발명은 더 나아가 서열번호 8에 개시된 아미노산 서열 또는 그의 기능적 등가물을 포함하는 APCDD1 단백질을 코딩하는 정도의 축퇴체(degenerate) 및 그의 돌연변이(mutant) 뿐만 아니라, 서열번호 7에 기재된 폴리뉴클레오티드 서열을 포 함하는 신규한 인간 APCDD1 유전자를 포함한다. APCDD1에 기능적으로 동등한 폴리텝티드에는 예를 들어, 인간 APCDD1 단백질의 돌연변이 뿐만 아니라 인간 APCDD1 단백질에 상응하는 다른 생명체의 상동 단백질이 포함된다.
본 발명에서, “기능적으로 동등한”은 본 발명의 폴리펩티드가 WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1 또는 APCDD1 단백질과 같이 세포증식을 촉진하고 암세포로의 암발생 활성을 부여하는 활성을 갖는 것을 의미한다. 본 발명의 폴리펩티드가 세포 증식 활성을 갖는지 아닌지는 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 각각의 폴리펩티드를 발현하는 세포로 도입하고 세포증식의 촉진 또는 콜로니 형성 활성의 증가를 탐지함으로써 판정될 수 있다.
그러한 세포는 예를 들어, WDRPUH에 대하여는 NIH3T3, SNU475 및 HepG2; KRZFPUH에 대하여는 COS7 및 알렉산더 세포(Alexander cell); PPIL1에 대하여는 NIH3T3, HCT 116, SW480, SNU-C4, SNU-C5 및 LoVo; 그리고 APCDD1에 대하여는 SW480 세포가 포함된다. 이와 달리, 본 발명의 폴리펩티드가 PPIL1과 기능적으로 동등한지 여부는 SNW1 또는 스타트민(stathmin)과의 결합 능력을 탐지함으로써 판정될 수 있다.
특정 단백질과 기능적으로 동등한 폴리펩티드를 제조하는 방법은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자(이하, “당업자”라 약칭하기로 함)에게 잘 알려져 있으며, 상기 단백질에 돌연변이를 도입하는 공지의 방법을 포함한다. 예를 들어, 당업자가 위치-지정 돌연변이 유발법(site-directed mutagenesis)으로 단백질의 아미노산 서열 내에 적절한 돌연변이를 도입함으로써, 인간 WDRPUD, KRZFPUH, PPIL1 또는 APCDD1과 기능적으로 동등한 폴리펩티드를 제조할 수 있다(Hashimoto-Gotoh et al., Gene 152:271-275, 1995; Zoller and Smith, Methods Enzymol., 100: 468-500 (1983); Kramer et al., Nucleic Acids Res., 12:9441-9456, 1984; Kramer and Fritz, Methods Enzymol., 154:350-367, 1987; Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 82:488-492, 1985; Kunkel, Methods Enzymol., 85:2763-2766, 1988). 아미노산 돌연변이는 자연적으로도 발생할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 인간 WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1 또는 APCDD1의 아미노산 서열을 갖되 하나 또는 그 이상의 아미노산이 돌연변이되고 그 결과로 형성된 돌연변이된 폴리펩티드가 인간 WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1 또는 APCDD1과 기능적으로 동등한 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 돌연변이된 아미노산은 일반적으로 10개 이하이고, 바람직하게는 6개 이하이며, 보다 바람직하게는 3개 이하이다.
돌연변이되거나 변형된 단백질, 특정 아미노산 서열의 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 치환, 삭제, 삽입 및/또는 부가함으로써 변형된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본래의 생물학적 활성을 유지하는 것으로 알려져 있다(Mark et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 81:5662-5666, 1984; Zoller and Smith, Nucleic Acids Res., 10:6487-6500, 1982; Dalbadie-MacFarland et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 79:6409-6413, 1982).
돌연변이될 아미노산 잔기는 바람직하게는 (보존 아미노산 치환으로 알려진 공정에 의하여) 아미노산의 측쇄의 특성이 보존된 다른 아미노산으로 돌연변이된 다. 아미노산 측쇄의 특성의 예에는 소수성 아미노산(A, I, L, M, F, P, W, Y 및 V), 친수성 아미노산(R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S 및 T) 및 하기의 기능기 또는 공통된 특성을 가진 측쇄가 있다: 지방족 측쇄(G, A, V, L, I 및 P); 히드록실기 포함 측쇄(S, T 및 Y); 황원자 포함 측쇄(C 및 M); 카르복실산 및 아마이드 함유 측쇄(D, N, E 및 Q); 염기 포함 측쇄(R, K 및 H); 및 방향족 포함 측쇄(H, F, Y 및 W). 이때, 괄호안의 문자는 아미노산의 단일 문자 코드를 지칭한다.
인간 WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1 또는 APCDD1 단백질의 아미노산 서열에 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 부가된 폴리펩티드의 예는 인간 WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1 또는 APCDD1 단백질을 포함하는 융합단백질이다. 융합단백질은 인간 WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1 또는 APCDD1 단백질과 다른 펩티드 또는 단백질과의 융합체로서 본 발명에 포함된다. 상기 융합단백질은 인간 WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1 또는 APCDD1 단백질을 코딩하는 DNA와 다른 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 DNA를 판독틀이 맞게 연결하고, 상기 융합 DNA를 발현벡터에 삽입한 다음, 숙주에서 발현시키는 것과 같은 당업자에게 잘 알려진 방법에 의하여 제조될 수 있다. 본 발명의 단백질에 융합될 펩티드 또는 단백질은 특별히 제한되지 않는다.
공지의 펩티드가 본 발명의 단백질에 융합되는 펩티드로 사용될 수 있는데, 여기에는 예로, FLAG(Hopp et al., Biotechnology, 6:1204-1210, 1988), 6xHis 함유 6 His(히스티딘) 잔기, 10xHis, 인플루엔자 아글루티닌(Influenza agglutinin, HA), 인간 c-myc 단편, VSP-GP 단편, p18HIV 단편, T7-태그, HSV-태그, E-태그, SV40T 항원 단편, lck 태그, α-튜불린 단편, B-태그, 단백질 C 단편 및 이의 유사 체가 포함된다. 융합되는 단백질의 예로는 글루타티온-S-트린스퍼라제(glutathione-S-transferase, GST), 인플루엔자 아글루티닌(Influenza agglutitn, HA), 면역글로불린 불변지역(immunglobulin constant region), 베타-갈락토시다제, 말토스-결합 단백질(maltose-binding protein) 등이 포함된다.
융합단백질은 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA와 상술한 융합펩티드 또는 단백질을 코딩하는 상업적으로 이용가능한 DNA를 융합시키고, 상기 융합된 DNA를 발현시킴으로써 제조될 수 있다.
기능적으로 동등한 폴리펩티드를 분리하는 당업계에 공지된 다른 방법은 예를 들어, 혼성화(hybridization) 기술을 이용한 방법이다(Sambrook et al., Molecular Cloning 2nd ed., 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). 당업자는 인간 WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1 또는 APCDD1 단백질을 코딩하는 DNA 서열(즉, 서열번호 1, 3, 5 또는 7)의 전체 또는 일부와 높은 상동성을 갖는 DNA를 용이하게 분리할 수 있고, 상기 분리한 DNA로부터 인간 WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1 또는 APCDD1 단백질과 기능적으로 동등한 폴리펩티드를 분리할 수 있다. 상기 폴리펩티드는 인간으로부터 유래한 단백질에 상응하는 포유동물 기원의 상동체(예를 들어, 원숭이, 집쥐, 토끼 및 소의 유전자에 의하여 코딩되는 폴리펩티드)를 포함한다. 인간 WDRPUH 단백질를 코딩하는 DNA에 대한 높은 상동성을 갖는 cDNA를 동물로부터 분리하는 데에는 고환(testis) 조직을 사용하는 것이 특히 바람직하다. 이와 달리, 인간 KRZFPUH 단백질를 코딩하는 DNA에 대한 높은 상동성을 갖는 cDNA를 동물로부터 분리하는 데에는 태반(placenta) 또는 고환 조직을 이용하는 것이 특히 바람직하다. 아울러, 인간 PPIL1 단백질를 코딩하는 DNA에 대한 높은 상동성을 갖는 cDNA를 동물로부터 분리하는 데에는 심장, 골격근(skeletal muscle), 고환, 흉선(thymus) 또는 부신선(adrenal gland) 조직을 이용하는 것이 특별히 바람직하고, 인간 APCDD1 단백질을 코딩하는 DNA에 대하여 높은 상동성을 갖는 cDNA를 분리하는 데에는 심장, 췌장(pancreas), 전립선(prostate), 난소(ovary), 폐, 간, 신장, 비장(spleen), 흉선, 결장 또는 말초 백혈구(peripheral leukocyte) 조직을 사용하는 것이 바람직하고, 이중, 심장, 췌장, 전립선 또는 난소 조직을 이용하는 것이 특히 바람직하다.
인간 WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1 또는 APCDD1 단백질과 기능적으로 동등한 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 분리하기 위한 혼성화 조건은 당업자에 의하여 통상적으로 선택될 수 있다. 예를 들어, 혼성화는 “Rapid-hyb 완충용액”(Amersham Life Science)를 이용하여 30분 또는 그 이상 동안 68°℃에서 전혼성화공정(prehybridization)를 수행하는 단계; 탐침(probe)을 첨가하는 단계; 및 68℃에서 1시간 이상 가열하는 단계를 통해 수행될 수 있다. 하기의 세척 단계는 예를 들어 저엄격 조건(low stringent dondition)으로 수행될 수 있다. 저엄격 조건은 예를 들어, 42℃, 2X SSC 및 0.1% SDS 또는 바람직하게는 50℃, 2X SSC 및 0.1% SDS의 조건을 말한다. 보다 바람직하게는, 고엄격 조건(high stringent condition)이 사용된다. 고엄격 조건은 예를 들어, 상온에서 20분 동안 2X SSC 및 0.01% SDS으로 3회 세척한 다음, 37℃에서 20분동안 1x SSC, 0.1% SDS로 3회 세척하고, 50℃에서 20분동안 1x SSC 및 0.1% SDS로 2회 세척하는 조건을 말한다. 그러나, 온도 및 염 의 농도와 같은 제공되는 요소(factor)는 혼성화의 엄격도(stringency)에 영향을 미칠 수 있고, 당업자는 요구되는 엄격도를 달성하기 위한 요소를 적절하게 선택할 수 있다.
혼성화 대신에, 인간 WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1 또는 APCDD1 단백질과 기능적으로 동등한 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 분리하는데, 상기 단백질을 코딩하는 DNA의 서열정보(서열번호 1, 3, 5 또는 7)에 기반을 두어 합성한 프라이머를 이용하는 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR) 방법과 같은 유전자 증폭방법이 사용될 수 있다.
상기 혼성화 기술 또는 유전자 증폭기술을 통해 분리되는 DNA에 의하여 코딩되는 인간 WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1 또는 APCDD1 단백질과 기능적으로 동등한 폴리펩티드는 정상적으로는 인간 WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1 또는 APCDD1 단백질의 아미노산 서열과 높은 상동성을 갖는다. “높은 상동성”은 전형적으로 40% 이상의, 바람직하게는 60% 이상의, 보다 바람직하게는 80% 이상의, 그 보다 더욱 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 의미한다. 폴리펩티드의 상동성은 윌버 및 립프만에 의하여 발표된 알고리즘에 따라 결정될 수 있다(Wilbur and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 80:726-730, 1983).
본 발명의 폴리펩티드는 생산에 사용되는 세포 또는 숙주 또는 사용되는 정제방법에 따라, 아미노산 서열, 분자량, 등전점(isoelectric point), 당쇄의 존부 또는 형태에 있어서 다양성을 가질 수 있다. 그럼에도 불구하고, 그것이 본 발명의 인간 WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1 또는 APCDD1 단백질과 기능적으로 동등한 이상, 그것은 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명의 폴리펩티드는 당업자에게 잘 알려진 방법에 의하여 재조합 또는 천연의 단백질의 형태로 제조될 수 있다. 재조합 단백질은 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA(예를 들어, 서열번호 1, 3, 5 또는 7의 핵산서열을 포함하는 DNA)를 적절한 발현벡터에 삽입하고, 상기 벡터를 적절한 숙주세포에 도입하여, 추출물을 수득하고, 상기 추출물을 예를 들어, 이온 교환 크로마토크래피(ion exchange chromatography), 역상 크로마토그래피(reverse phase chromatography), 겔여과(gel filtration) 또는 본 발명의 단백질에 대한 항체가 고정된 칼럼(column)을 이용하는 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography)에 적용하거나, 상기 칼럼을 하나 이상 조합하여 상기 폴리펩티드를 정제함으로써 제조할 수 있다.
아울러, 본 발명의 폴리펩티드가 숙주세포(예를 들어, 동물세포 및 대장균)내에서 글루타티온-S-트랜스퍼라제 또는 다중 히스티딘이 부가된 융합 단백질의 형태로 발현될 때, 상기 발현된 재조합 단백질은 글루타티온 칼럼 또는 니켈 칼럼을 이용하여 정제될 수 있다. 이와 달리, 본 발명의 폴리펩티드가 c-myc, 다중 히스티딘 또는 FLAG가 부가된 단백질 형태로 발현될 때, 상기 폴리펩티드는 각각 c-myc, 히스티딘 또는 FLAG에 대한 항체를 이용하여 검출되고 정제될 수 있다.
상기 융합단백질을 정제한 후에, 필요에 따라, 트롬빈 또는 Xa 인자(factor-Xa)로 절단함으로써, 목적 폴리펩티드 외의 부분을 제거하는 것 또한 가능하다.
천연 단백질은 당업자에게 예를 들어, 하기에 기재된 WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1 또는 APCDD1 단백질에 결합하는 항체가 결합된 친화성 칼럼에 본 발명의 폴 리펩티드를 발현하는 조직 또는 세포의 추출물을 접촉시킴으로써 공지된 방법으로 분리될 수 있다. 상기 항체는 다클론성 항체 또는 단클론성 항체일 수 있다.
본 발명은 아울러 본 발명의 폴리펩티드의 부분 펩티드를 포함한다. 상기 부분 펩티드는 본 발명의 폴리펩티드에 특이적인 아미노산을 갖고 적어도 7 아미노산으로 구성되며, 바람직하게는 8 이상의 아미노산으로, 보다 바람직하게는 9 이상의 아미노산으로 구성된다. 상기 부분 펩티드는 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드에 대한 항체를 제조하기 위해서, 본 발명의 폴리펩티드에 결합하는 화합물을 탐색하기 위해서, 그리고 본 발명의 폴리펩티드의 촉진제 또는 저해제를 탐색하기 위해서 사용될 수 있다.
본 발명의 부분 펩티드는 유전공학기법에 의하여, 공지된 펩티드 합성방법에 의하여 또는 적절한 펩티다제로 본 발명의 폴리펩티드를 절단함으로써 제조할 수 있다. 펩티드 합성을 위하여, 예를 들어, 고체상 합성 또는 액체상 합성방법이 사용될 수 있다.
아울러, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 상술한 바와 같이 본 발명의 폴리펩티드의 생체 내(in vivo) 또는 시험관 내(in vitro) 생산을 위해 사용되거나 본 발명의 단백질을 코딩하는 유전자에 있어서 유전학적 이상에 기인한 질환에 대한 유전자요법(gene therapy)에 사용될 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 mRNA, RNA, cDNA, 게놈 DNA, 화학적으로 합성한 폴리뉴클레오티드를 포함하여 어떠한 형태일지라도 그것이 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 한 사용될 수 있다. 본 발명의 폴 리뉴클레오티드는 주어진 핵산서열뿐만 아니라, 당해 DNA가 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 한, 그의 축퇴 서열(degenerated sequence)까지도 포함한다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 당업자에게 공지된 방법으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 폴리펩티드를 발현하는 세포로부터 cDNA 라이브러리(cDNA library)를 제조하고, 본 발명의 DNA(예를 들어, 서열번호 1, 3, 5 또는 7)의 부분서열을 탐침(probe)으로 이용하여 혼성화반응을 수행함으로서 제조할 수 있다. cDNA 라이브러리는 예를 들어, 샘브룩 등의 문헌에 기재된 방법으로 제조하여 사용하거나(Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), 이와 달리, 상업적으로 이용가능한 cDNA 라이브러리를 사용할 수 있다. cDNA 라이브러리는 본 발명의 폴리펩티드를 발현하는 세포로부터 RNA를 추출하는 단계; 본 발명의 DNA(예를 들어, 서열번호 1, 3, 5 또는 7)의 서열에 기반하여 올리고 DNA를 합성하는 단계; 상기 올리고 DNA를 프라이머로 PCR을 수행하는 단계; 및 본 발명의 단백질을 코딩하는 cDNA를 증폭하는 단계를 통해 제조할 수 있다.
아울러, 상기 수득된 cDNA의 핵산에 대한 염기서열분석(sequencing)을 통하여, 상기 cDNA에 의하여 코딩되는 해독 지역(translation region)을 통상적으로 결정하고, 본 발명의 폴리펩티드의 아미노산 서열을 용이하게 구할 수 있다. 더욱이, 상기 수득한 cDNA 또는 탐침으로 사용한 그의 부분을 이용하여 게놈 DNA를 탐색함으로써 게놈 DNA를 분리할 수 있다.
보다 상세하게, mRNA는 본 발명의 대상 폴리펩티드가 발현되는 세포, 조직 또는 기관(예를 들어, WDRPUH에 대하여 고환; KRZFPUH에 대하여 태반 또는 고환; PPIL1에 대하여 심장, 골격근, 고환, 흉선 또는 부신선; 및 APCDD1에 대하여 심장, 췌장, 전립선, 난소, 폐, 간, 신장, 비장, 흉선, 결장 또는 말초 백혈구, 바람직하게는 심장, 췌장, 전립선 또는 난소)로부터 최초로 제조될 수 있다. mRNA의 제조에는 다음과 같은 공지의 방법을 사용할 수 있다: 예를 들어, 구아니딘 초원심분리(guanidine ultracentrifugation) 방법(Chirgwin et al., Biochemistry 18:5294-5299, 1979) 또는 AGPC 방법(Chomczynski and Sacchi, Anal. Biochem., 162:156-159, 1987)으로 총 RNA(total RNA)를 제조할 수 있다. 부가하여, mRNA는 mRNA 정제 키트(Pharmacia)를 이용하여 총 RNA로부터 정제하거나, 이와 달리, QuickPrep mRNA 정제 키트(Pharmacia)로 직접 mRNA를 정제할 수 있다.
상기 수득된 mRNA는 역전사효소(reverse transcriptase)를 이용하여 cDNA를 합성하는데 이용될 수 있다. cDNA는 AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit(Seikagaku Kogyo)와 같은 상업적으로 이용가능한 키트를 이용하여 합성할 수 있다. 이와 달리, cDNA를 합성하고 그에 뒤따르는 5'-RACE 방법에 의하여 증폭할 수 있는데(Frohman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 85:8998-9002, 1988; Belyavsky et al., Nucleic Acids Res., 17:2919-2932, 1989), 상기 방법은 프라이머와 본 문서에 기재된 것과 같이 5'-Ampli FINDER RACE Kit(Clontech) 및 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 이용한다.
원하는 DNA 단편은 PCR 산물로부터 제조되고 벡터 DNA에 결찰될 수 있다. 상기 재조합 벡터는 대장균 따위를 형질전환시키는데 사용될 수 있으며, 원하는 재 조합 벡터는 선택된 콜로니로부터 제조될 수 있다. 상기 원하는 핵산서열은 디디옥시뉴클레오티드 사슬 종결(dideoxynucleotide chain termination)과 같은 통상적인 방법으로 확인할 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드의 핵산서열은 발현에 사용되는 숙주에서의 코돈 사용빈도(fequency of codon usage)를 고려함으로써, 보다 효과적으로 발현될 수 있도록 고안될 수 있다(Grantham et al., Nucleic Acids Res., 9:43-74, 1981). 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 서열은 상업적으로 이용가능한 키트 또는 통상의 방법으로 변이될 수 있다. 예를 들어, 상기 서열은 제한효소로 절단하거나, 합성 올리고뉴클레오티드 또는 적절한 폴리뉴클레오티드 단편을 삽입하거나, 링커를 부가하거나, 또는 개시코돈(ATG) 및/또는 종결코돈(TAA, TGA 또는 TAG)을 삽입함으로써 변이될 수 있다.
상세하게, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1, 3, 5 또는 7의 핵산서열을 포함하는 DNA를 포함한다.
아울러, 본 발명은 서열번호 1, 3, 5 또는 7의 핵산서열을 갖는 폴리뉴클레오티드와 엄격조건에서 혼성화할 수 있고, 상술한 본 발명의 WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1 또는 APCDD1 단백질과 기능적으로 동등한 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 당업자는 엄격조건을 적절하게 선택할 수 있다. 예를 들어, 저엄격 조건(low strengency)이 사용될 수 있다. 상기 조건은 상술한 바와 동일하다. 상기 혼성화하는 DNA는 바람직하게는 cDNA 또는 염색체 DNA이다.
본 발명은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드가 삽입된 벡터를 제공한다. 본 발명의 벡터는 숙주 세포에서 본 발명의 폴리뉴클레오티드 특히 DNA를 유지하거나, 본 발명의 폴리펩티드를 발현하거나, 또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 유전자 요법을 위해 투여하는데 유용하다.
대장균(E. coli)가 숙주세포이고 벡터가 대장균(예를 들어, JM109, DH5α, HB101 또는 XL1Blue)에서 대량으로 증폭 및 생산되는 경우에는, 상기 벡터는 대장균에서 증폭되기 위한 복제기점 “ori" 및 형질전환된 대장균의 선별을 위한 마커 유전자(예를 들어, 앰피실린(ampicillin), 테트라사이클린(tetracycline), 가나마이신(kanamycin), 클로람페니콜(chloramphenicol) 또는 이의 유사체와 같은 항생제에 대하여 선택되는 항생제 내성 유전자)를 갖는다. 예를 들어, M13 계열의 벡터, pUC 계열의 벡터, pBR322, pBluescript, pCR-Script 등이 사용될 수 있다. 부가하여, 상기 벡터뿐만 아니라, pGEM-T, pDIRECT 및 pT7도 cDNA의 추출 및 서브클로닝(sub cloning)에 사용될 수 있다. JM109, DH5α, HB101 또는 XL1Blue과 같은 대장균이 숙주세포로 사용되는 경우, 상기 벡터는 대장균에서 원하는 유전자를 효율적으로 발현시킬 수 있도록, 예를 들어, lacZ 프로모터(Ward et al., Nature, 341:544-546, 1989; FASEB J., 6:2422-2427, 1992), araB 프로모터(Better et al., Science, 240:1041-1043, 1988) 또는 T7 프로모터 또는 그의 유사체와 같은 프로모터를 구비하여야 한다. 이와 관련하여, pGEX-5X-1(Pharmacia), "QIAexpress systme"(Qiagen), pEGFP 및 pET(상기의 경우, 숙주는 T7 RNA 중합효소를 발현하는 BL21이 바람직하다)가 예를 들어 상기 벡터 대신에 사용될 수 있다. 부가적으로, 상기 벡터는 또한 폴리펩티드 분비를 위한 신호서열(signal sequence)를 포함할 수 있다. 폴리펩티드를 대장균의 페리플라즘(periplasm)으로 분비시키기 위한 신호서열의 예로는 pelB 신호서열(Lei et al., J. Bacteriol., 169:4379, 1987)이 있다. 숙주세포에 상기 벡터를 도입하기 위한 수단에는 예를 들어, 염화칼슘(calcium chloride) 방법 및 엘렉트로포레이션(electroporation) 방법이 포함된다.
대장균에 부가하여, 예를 들어, 포유동물 기반의 발현벡터(예를 들어, pcDNA3(Invitrogen), pEGF-BOS(Nucleic Acids Res., 18(17):5322, 1990), pEF 또는 pCDM8 등), 곤충세포 유래의 발현벡터(예를 들어, “Bac-to-BAC baculovirus expression system"(Gibco BRL), pBacPAk8 등), 식물 기반의 발현벡터(예를 들어, pMH1 또는 pMH2), 동물바이러스 유래의 발현벡터(예를 들어, pHSV, pMV 또는 pAdexLacw), 레트로바이러스 유래의 발현벡터(예를 들어, pZIpneo), 효모 유래의 발현벡터("Pichia Expression Kit"(Invitrogen), pNV11 또는 SP-Q01) 및 고초균(Bacillus subtilis) 유래의 발현벡터(예를 들어, pPL608 또는 pKTH50)가 본 발명의 폴리펩티드의 생산에 사용될 수 있다.
상기 벡터를 CHO, COS 또는 NIH3T3 세포와 같은 동물세포에서 발현시키기 위하여, 상기 벡터는 예를 들어, SV40 프로모터(Mulligan et al., Nature, 277:108, 1979), MMLV-LTR 프로모터, EF1α 프로모터 (Mizushima et al., Nucleic Acids Res., 18:5322, 1990), CMV 프로모터 및 그의 유사체와 같은 상기 세포에서의 발현에 필수적인 프로모터 및 바람직하게는 형질전환체를 선별하기 위한 마커 유전자(예를 들어, 네오마이신 또는 G148)를 구비하여야 한다. 상기 특성을 가진 공지의 벡터에는 예를 들어, pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV 및 pOP13을 포함된다.
부가하여, 유전자를 안정적으로 발현시키는 동시에 세포내로 당해 유전자의 복제수를 증폭시키기 위한 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 상보적인 DHFR 유전자(예를 들어, pCHO I)를 포함하는 벡터로 핵산 합성 경로가 일부 결여된 CHO 세포를 형질전환시킨 다음, 메토트렉세이트(methotraxate, MTX)로 증폭시킬 수 있다. 아울러, 유전자의 일시적 발현의 경우에는, SV40 복제 기점을 포함하는 벡터(예를 들어, pcD)로 염색체 상에 SV40 T 항원 발현 유전자가 삽입된 COS 세포를 형질전환시키는 방법이 사용될 수 있다.
상기와 같이 얻어진 본 발명의 폴리펩티드는 숙주세포의 내부 또는 외부(예를 들어 배지와 같은)로부터 분리되고, 실질적으로 순수한 균질한 폴리펩티드로 정제될 수 있다. “실질적으로 순수한”이라는 용어는 본 문서에서 주어진 폴리펩티드가 다른 생물학적 거대분자(macromolecule)가 실질적으로 없는 폴리펩티드라는 의미로 사용된다. 실질적으로 순수한 폴리펩티드는 적어도 건조중량에 대하여 75%(예를 들어, 적어도 80, 85, 95 또는 99%) 정도는 순수하다. 순도는 예를 들어, 칼럼 크로마토그래피(column chromatography), 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(polyacrylamide gel electrophoresis) 또는 HPLC 분석과 같은 적절한 표준 방법으로 측정할 수 있다. 폴리펩티드 분리 및 정제방법은 어떠한 특정 방법으로 제한되지 않으며, 실제로, 어떠한 표준 방법이라도 사용될 수 있다.
본 발명의 단백질을 분리하고 정제하기 위하여, 예를 들어, 칼럼 크로마토그래피, 여과(filter), 초여과(ultrafiltration), 염 침전(salt precipitation), 용매 침전(solvent precipitation), 용매 추출(solvent extraction), 증류, 면역침강 법(immunprecipitation), SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동, 등전점 전기영동(isoelectric point electrophoresis), 투석(dialysis) 및 재결정화(recrystallization)과 같은 방법을 적절하게 선택하고 조합할 수 있다.
크로마토그래피의 예로는 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography), 이온-교환 크로마토그래피(ion-exchange chromatography), 소수성 크로마토그래피(hydrophobic chromatography), 겔 여과(gel filtration), 역상 크로마토그래피(reverse phase chromatography), 흡착 크로마토그래피(adsorption chromatography) 등이 있다(Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed. Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996). 상기 크로마토그래피는 HPLC 또는 FPLC와 같은 액체상 크로마토그래피로 수행될 수 있다. 이리하여, 본 발명은 상기 방법에 의하여 제조된 고순도의 폴리펩티드를 제공한다.
본 발명의 폴리펩티드는 선택에 따라, 정제 전 또는 후에 적절한 단백질 수식효소로 처리함으로써 변형되거나 부분적으로 절단될 수 있다. 유용한 단백질 수식효소는 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 트립신, 키모트립신, 리실엔도펩티다제(lysylrendoeptidase), 단백질 키나제, 글루코시다제(glucosidase) 등이 포함된다.
본 발명은 본 발명의 폴리펩티드에 결합하는 항체를 제공한다. 본 발명의 항체는 단클론성 항체(monoclonal antibody) 또는 다클론성 항체(polyclonal antibody) 등 어떠한 형태로도 사용될 수 있고, 본 발명의 폴리펩티드로 토끼와 같 은 동물을 면역화함으로써 수득되는 항혈청(antiserum), 모든 종류의 다클론성 항체 및 단클론성 항체, 인간 항체 및 유전자 재조합에 의하여 생산되는 인간화 항체를 포함한다.
항체를 수득하기 위한 항원으로 사용되는 본 발명의 폴리펩티드는 어떠한 동물 종으로부터 유래될 수 있으나, 바람직하게는 인간, 생쥐 또는 집쥐와 같은 포유동물, 보다 바람직하게는 인간으로부터 유래된다.
본 발명에 의하면, 면역화 항원으로 사용될 폴리펩티드는 전체 단백질 또는 상기 단백질의 부분 펩티드일 수 있다. 부분 펩티드는 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드의 아미노(N)-말단 또는 카르복시(C)-말단을 포함할 수 있다. 본 문서에서 항체는 본 발명의 폴리펩티드의 전장 또는 단편 중 어느 것과도 반응할 수 있는 단백질로 정의된다.
본 발명의 폴리펩티드 또는 그의 단편을 코딩하는 유전자는 공지의 발현벡터에 삽입될 수 있고, 이어 본 문서에 기재된 대로 숙주세포를 형질전환시키는데 이용될 수 있다. 원하는 폴리펩티드 또는 그의 단편은 통상적인 방법 중 어느 하나로 숙주세포의 내부 또는 외부로부터 회수될 수 있으며, 다음에 항체로 이용될 수 있다. 대안으로, 상기 폴리펩티드를 발현하는 세포 전체 또는 그의 용해체(lysate) 또는 화학적으로 합성된 폴리펩티드도 항체로 이용될 수 있다.
어떠한 포유동물 세포라도 상기 항체로 면역화하는데 사용될 수 있으나, 세포 융합에 사용된 모세포와의 적합성(compatibility)을 고려하여야 한다. 일반적으로, 쥐목(Rodentia), 토끼목(Lagomorpha) 또는 영장목(Primate)의 동물이 사용된 다. 쥐목의 동물에는 예를 들어, 생쥐(mouse), 집쥐(rat) 및 햄스터(hamster)가 포함된다. 토끼목의 동물에는 예를 들어 토끼가 포함된다. 영장목의 동물에는 예를 들어, Macaca fascicularis, 붉은털 원숭이(rhesus monkey), 망토개코원숭이(sacred baboon) 및 침팬지와 같은 협비류(Catarrhini)의 원숭이(구세계 원숭이)가 포함된다.
항원으로 동물을 면역화하는 방법은 당업계에서 공지되어 있다. 항원의 복막내 주입 또는 피하주입이 포유동물의 면역화에 대한 표준방법이다. 보다 상세하게, 항원은 적절한 용량의 인산 완충 염수(phosphate buffered saline, PBS), 생리학적 염수 등에 희석하고 현탁할 수 있다. 필요로 하는 경우에는, 프로인드 완전 보조제(Freund's complete adjuvant)와 같은 표준 보조제(standard adjuvant)를 유화제(emulsion)로 제조하여 상기 항원 현탁액에 혼합한 다음, 포유동물에 투여할 수 있다. 바람직하게는, 매 4 내지 21일마다 적절한 용량의 프로인드 완전 보조제와 혼합한 항원을 몇 차례 투여하는 단계가 뒤따른다. 상기와 같은 투여 이후에 원하는 항체의 양의 증가여부에 알아보기 위하여 표준방법으로 혈청을 분석할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드에 대한 다클론성 항체는 혈청에서 원하는 항체의 증가가 있는 것으로 확인된 면역화된 포유동물로부터 혈액을 수집하고 어떠한 통상적인 방법으로든 혈액으로부터 혈청을 분리함으로써 제조될 수 있다. 다클론성 항체는 혈청으로부터 분리된 다클론성 항체를 함유하는 분획 뿐만 아니라 다클론성 항체를 함유하는 혈청을 포함한다. 면역글로불린 G 또는 M은 예를 들어, 본 발명의 폴리 펩티드가 부착된 친화성 칼럼(affinity column)을 이용하여 본 발명의 폴리펩티드를 인식하는 분획으로부터 제조될 수 있고, 단백질 A 또는 단백질 G 칼럼을 이용하여 상기 분획을 추가적으로 정제할 수 있다.
단클론성 항체를 제조하기 위하여, 면역세포를 본 발명의 항체로 면역화된 포유동물로부터 선별하고, 상기와 같이 혈청으로부터 원하는 항체의 증가된 수준을 검사한 다음, 세포 융합에 적용시킬 수 있다. 세포 융합에 이용되는 상기 면역세포는 바람직하게는 비장으로부터 수득된다. 상기 면역세포와 융합될 다른 바람직한 모 세포에는 예를 들어, 포유동물의 골수종 세포(myeloma cell) 및 더욱 바람직하게는 항생제로 융합된 세포를 선벽할 수 있는 획득된 특성을 가진 골수종 세포가 포함된다.
상기 면역세포 및 골수종 세포는 예를 들어, 밀스타인 등의 방법(Galfre and Milstein, Methods Enzymol., 73:3-46, 1981)과 같은 공지의 방법에 의하여 융합될 수 있다.
세포융합의 결과로 수득된 하이브리도마(hybridoma)는 HAT 배지(하이폭산틴(hypoxanthine,) 아미노테린(aminopterin) 및 티미딘(thymidine) 함유 배지)와 같은 표준 선별 배지로 상기 하이브리도마를 배양함으로써 선별할 수 있다. 상기 세포 배양은 전형적으로 HAT 배지에서 원하는 하이브리도마를 제외한 다른 모든 세포(비-융합 세포들)이 사멸되는데 충분한 시간이 되도록 수일 내지 수주동안 계속된다. 그런 다음, 원하는 항체를 생산하는 하이브리도마를 선별하고 클로닝하기 위하여, 표준 제한 희석(standard limiting dilution)이 수행된다.
하이브리도마 제조를 위한 항체로 비-인간 동물을 면역화하는 상기 방법에 부가하여, EB 바이러스에 의하여 감염된 임파구(lymphocyte)와 같은 인간 임파구가 심험관 내의 조건으로 폴리펩티드, 폴리펩티드 발현 세포 또는 그의 용해체에 의하여 면역화될 수 있다. 그런 다음, 본 발명의 폴리펩티드와 결합할 수 있는 원하는 인간항체를 생산하는 하이브리도마를 제조하기 위하여, 상기 면역화된 임파구는 U266과 같은 무한히 분열할 수 있는 능력을 가진 인간-유래의 골수종 세포와 융합된다(심사되지 않은 공개 일본특허 JP-A 昭 63-17688).
상기 수득된 하이브리도마는 이어, 생쥐의 복강(abdominal cavity)에 이식되고 복수가 추출된다. 상기 수득된 단클론성 항체는 예를 들어 황산 암모늄 침전(ammonium sulfate precipitation), 단백질 A 또는 단백질 G 칼럼, DEAE 이온 교환 크로마토그래피 또는 본 발명의 폴리펩티드가 결합된 친화성 칼럼(affinity column)에 의하여 정제될 수 있다. 상기 본 발명의 항체는 본 발명의 항체의 정제 및 검출에만 사용되는 것이 아니라, 본 발명의 폴리펩티드의 작용제(agonist) 및 길항제(antagonist)의 후보로 사용될 수 있다. 부가하여, 상기 항체는 본 발명의 폴리펩티드와 관련된 질환에 대한 항체 치료에 사용될 수 있다. 상기 수득된 항체가 인체에 투여되는 경우(항체요법), 면역유발성의 감소를 위해 인간 항체 또는 인간화 항체를 사용하는 것이 바람직하다.
예를 들어, 인간 항체의 유전자의 레퍼토리(repertory)를 가진 형질전환 동물이 본 발명의 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 발현하는 세포 또는 그의 용해체로부터 선택되는 항원으로 면역화될 수 있다. 그런 다음, 항체 생산 세포는 상기 동 물로부터 수집되어, 본 발명의 폴리펩티드에 대한 인간 항체가 제조될 수 있는 하이브리도마를 얻기 위하여 골수종 세포와 융합된다(WO 92/03918, WO 93/2227, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/33735 및 WO 96/34096 참조).
이와 달리, 항체를 생산하는 면역화된 임파구와 같은 면역세포를 종양형성 유전자(oncogene)으로 불멸화(immortalize)시켜, 단클론성 항체를 제조하는데 이용할 수 있다.
이와 같이 수득되는 단클론성 항체는 유전공학 기법을 이용하여 재조합하여 제조될 수 있다(예를 들어, Borrebaeck and Larrick, Therapeutic Monoclonal Antibodies, published in the United Kingdom by MacMillan Publishers LTD, 1990 참조). 예를 들어, 항체를 코딩하는 DNA는 항체를 생산하는 하이브리도마 또는 면역화된 임파구와 같은 면역세포로부터 클로닝되어, 적절한 벡터에 삽입되고, 재조합 항체를 제조할 수 있는 숙주세포로 도입될 수 있다. 본 발명은 또한 상기와 같이 제조된 재조합 항체를 제공한다.
더 나아가, 본 발명의 항체는 그것이 하나 또는 그 이상의 본 발명의 폴리펩티드와 결합하는 한, 항체의 단편 또는 변형된 항체일 수 있다. 예를 들어, 항체 단편은 Fab, F(ab')2, Fv 또는 단일쇄 Fv (single chain Fv, scFv)일 수 있는데, 이때, 중쇄(heavy chain) 및 경쇄(light chain)으로부터의 Fv는 적절한 링커에 결찰된다(Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 85:5879-5883, 1988). 보다 상세하게, 항체 단편은 항체를 파파인 또는 펩신과 같은 효소로 처리함으로써 제조될 수 있다. 이와 달리, 상기 항체를 코딩하는 유전자를 제조하여 발현벡터에 삽 입한 다음, 적절한 숙주세포에서 발현시킬 수 있다(예를 들어, Co et al., J. Immunol., 152:2968-2976, 1994; Better and Horwitz, Methods Enzymol., 178:476-496, 1989; Pluckthun and Skerra, Methods Enzymol., 178:497-515, 1989; Lamoyi, Methods Enzymol., 121:652-663, 1986; Rousseaux et al., Methods Enzymol., 121:663-669, 1986 및 Bird and Walker, Trends Biotechnol., 9:132-137, 1991).
항체는 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG)와 같은 다양한 분자와 결합시킴으로써 변형될 수 있다. 본 발명은 그러한 변형된 항체를 제공한다. 상기 변형된 항체는 항체를 화학적으로 변형함으로써 수득될 수 있다. 이러한 변형방법은 당업계에서 통상적으로 사용된다.
이와는 달리, 본 발명의 항체는 비인간 항체로부터 유래한 가변 영역(variable region)과 인간항체로부터 유래한 불변영역(constant region)사이의 키메라성 항체(chimeric antibody) 또는 비인간 항체로부터 유래된 상보성 결정 영역(complementray determining region, CDR) 및 인간 항체로부터 유래한 구조영역(frame work region) 및 불변영역을 포함하는 인간화 항체의 형태로 제조될 수 있다. 그러한 항체는 공지의 방법을 이용하여 제조할 수 있다.
상기와 같이 제조된 항체는 균일하게 정제될 수 있다. 예를 들어, 상기 항체의 분리 및 정제는 일반적인 단백질에 사용되는 분리 및 정제 방법에 따라 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 항체는 친화성 크로마토그래피와 같은 칼럼 크로마토그래피, 여과, 초여과, 염석(salting-out), 투석, SDS 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동, 등전 집중(isoelectric focusing) 및 다른 방법(Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988) 중에서 적절하게 선택되고 조합함으로써 분리 및 정제될 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다. 단백질 A 칼럼 및 단백질 G 칼럼이 친화성 칼럼으로 사용될 수 있다. 사용되는 단백질 A 칼럼의 예로는 Hyper D, POROS 및 Sepharose F.F.(Pharmacia)가 포함된다.
친화성 크로마토그래피를 제외한 크로마토그래피의 예로는 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 겔 여과, 역상 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피(adsorption chromatography) 및 이와 유사한 것이 포함된다(Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996). 상기 크로마토그래피 공정은 HPLC 및 FPLC와 같은 액체상 크로마토그래피로 수행될 수 있다.
예를 들어, 흡광도의 측정, 효소-연결 면역흡수 분석(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 효소 면역분석(enzyme immunoassay, EIA), 방사선면역분석(radiommunoassay, RIA) 및/또는 면역형광분석이 본 발명의 항체의 항원 결합 활성을 측정하는데 사용될 수 있다. ELISA에서, 본 발명의 항체는 기판에 고정되고, 본 발명의 폴리펩티드가 상기 기판에 처리되며, 그 이후에 항체를 생산하는 세포의 배양 상등액(supernatant) 또는 정제된 항체와 같은 원하는 항체가 포함된 시료가 도포된다. 그런 다음, 상기 일차항체를 인식하고 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase) 같은 효소로 표지된 이차항체가 도포되어 상기 기판을 배 양한다. 이어, 세척하고, p-니트로페닐 포스페이트(p-nitrophenyl phosphate)와 같은 효소기질을 상기 기판에 첨가하고 상기 시료의 항원 결합 활성을 평가하기 위하여 흡광도를 측정한다. C-말단 또는 N-말단 단편과 같은 본 발명의 폴리펩티드의 단편이 폴리펩티드로 사용될 수 있다. BIAcore(Pharmacia)가 본 발명에 따른 항체의 활성을 평가하기 위하여 사용될 수 있다.
상기 방법은 본 발명의 폴리펩티드를 함유하고 있는 것으로 추정되는 시료에 본 발명의 항체를 노출시키고, 상기 폴리펩티드와 상기 항체에 의하여 형성된 면역 복합체를 검출하거나 측정함으로써 본 발명의 폴리펩티드를 검출 또는 측정할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 폴리펩티드의 검출 또는 측정방법은 폴리펩티드를 특이적으로 검출 또는 측정할 수 있기 때문에, 상기 방법은 상기 폴리펩티드가 이용되는 다양한 실험에 유용할 수 있다.
본 발명은 아울러 인간 WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1 또는 APCDD1 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 1, 3, 5 또는 7)와 혼성화할 수 있는 적어도 15 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적인 가닥을 제공한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA와 특이적으로 혼성화할 수 있는 폴리뉴클레오티드인 것이 바람직하다. 본 문서에서 사용된 “특이적으로 혼성화하는(specifically hybridize)”이라는 용어는 보통의 혼성화 조건 하에서, 바람직하게는 엄격조건 하에서 다른 단백질을 코딩하는 DNA와 두드러지게 교차-혼성화(cross-hybridization)가 일어나지 않는 것을 의미한다. 그러한 폴리뉴클레 오티드에는 본 발명의 폴리펩티드를 코딩한는 DNA 또는 그의 상보적 가닥과 특이적으로 혼성화하는 탐침(probe), 프라이머(primer), 핵산(nucleotide) 및 안티센스 올리고뉴클레오티드, 리보자임과 같은 핵산 유도체(nucleotide derivative)가 포함된다. 더욱이, 그러한 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 DNA 칩의 제조에 사용될 수 있다.
본 발명은 서열번호 1, 3, 5 또는 7의 핵산서열내의 어떠한 위치와도 혼성화할 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오티드(antisense oligonucleotide)를 포함한다. 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1, 3, 5 또는 7의 핵산서열 중 적어도 15개의 연속적 핵산에 대응하는 것이 바람직하다. 상술한 적어도 15개의 연속적인 핵산 내에 개시코돈을 포함하고 있는 안티센스 올리고뉴클레오티드가 더욱 바람직하다. 보다 상세하게, 그러한 안티센스 올리고뉴클레오티드는 WDRPUH의 발현을 억제하기 위하여 서열번호 16; KRZFPUH에 대하여는 서열번호 37; PPIL1에 대하여는 서열번호 44 및 APCDD1에 대하여는 서열번호 89의 핵산서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
안티센스 올리고뉴클레오티드의 유도체 또는 변형된 산물이 안티센스 올리고뉴클레오티드로 사용될 수 있다. 그러한 변형된 산물의 예에는 메틸-유기인산염-형(methyl-phosphonate-type) 또는 에틸-유기인산염-형(ethyl-phosphonate-type), 인티오산염(phosphorothioate) 변형 및 포스포로아미데이트(phosphoroamidate) 변형와 같은 저급 알킬 인산염 변형(lower alkyl phosphonate modification)이 포함된다.
본 문서에서 사용된 "안티센스 올리고뉴클레오티드"라는 용어는 DNA 또는 mRNA의 특정 지역을 구성하는 부분에 상응하는 핵산이 전부가 상보적인 것뿐만 아니라, 그 DNA 또는 mRNA 및 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드가 서열번호 1, 3, 5 또는 7의 핵산서열과 특이적으로 혼성화할 수 있는 한, 하나 또는 그 이상의 핵산이 불일치하는 것까지 의미한다.
그러한 폴리뉴클레오티드는 “적어도 15개의 연속적인 핵산서열 지역” 내에서 적어도 70% 이상의, 바람직하게는 80% 이상의, 보다 바람직하게는 90% 이상의, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는다. 본 문서에서 언급된 알고리즘이 상동성을 결정하는데 사용될 수 있다. 그러한 폴리뉴클레오티드는 뒤에 따르른 실시예에서 언급되는 바와 같이, 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 분리하거나 검출하기 위한 탐침 또는 증폭을 위한 프라이머로 유용하다.
본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드 유도체는 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 또는 mRNA에 결합함으로써, 그의 전사 또는 번역을 저해하고, 상기 mRNA의 분해를 촉진하며, 본 발명의 폴리펩티드의 발현을 억제하여, 본 발명의 폴리펩티드를 생산하는 세포에 작용할 수 있다.
본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드 유도체는 상기 유도체에 대하여 비반응성인 적절한 기재(base material)과 혼합함으로써 연고제(liniment) 또는 습포제(poultice)와 같은 외용제(external preparation)로 제조될 수 있다.
아울러, 필요에 따라, 상기 유도체는 부형제(excipient), 등장제(isotonic agent), 안정제(stabilizer), 보존제(preservative), 진통제(pain-killer) 등을 첨 가하여, 정제(tablet), 산제(powder), 과립제(granule), 캡슐제(capsule), 리포좀 캡슐제(liposome capsule), 주사제(injection), 액제(solution), 점비제(nose-drop), 동결-건조제(freeze-drying agent)로 제제화될 수 있다. 상기의 제제는 하기의 통상적인 방법으로 제조할 수 있다.
상기 안티센스 올리고뉴클레오티드 유도체는 환부에 직접 투여함으로써 또는 혈관내로 주사하여 환부에 도달할 수 있도록 함으로써 환자에게 투여될 수 있다.
안티센스-고정 매체(antisense-mounting medium)는 또한 내구성 및 막-투과성을 증가시키는데 이용될 수 있다. 이에 대한 예로는 리포좀, 폴리-L-리신, 지질, 콜레스테롤, 리포펙틴(lipofectin) 또는 이들의 유도체 등이 있다.
본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드 유도체의 투여량은 환자의 상태에 따라 적절하게 조절될 수 있고, 필요로 하는 용량으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 0.1 내지 100 mg/kg, 바람직하게는 0.1 내지 50 mg/kg의 투여량이 투여될 수 있다.
본 발명은 아울러, 서열번호 1, 3, 5 또는 7의 핵산서열의 센스 가닥 핵산 및 안티센스 가닥 핵산을 포함하는 siRNA를 포함한다. "siRNA"라는 용어는 표적 mRNA의 번역을 방해하는 이중가닥 RNA를 의미한다. siRNA를 세포에 도입하는 표준 기법이 사용되는데, 여기에는 DNA가 그로부터 RNA가 전사되는 주형으로 사용되는 방법이 포함된다. 상기 siRNA는 인간 WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1 또는 APCDD1 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 1, 3, 5 또는 7)의 센스 핵산서열 및 안티센스 핵산서열을 포함한다. 상기 siRNA는 예를 들어 헤어핀(hairpin)과 같이 단일 전사체가 표적 유전자로부터 센스 및 상보적인 안티센스 서열 모두를 갖도록 제조될 수 있다.
상기 방법은 예를 들어, 세포의 악성종양화(malignant transformation)의 결과로 WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1 또는 APCDD1의 발현이 상향-조절된 상기 세포에서의 유전자 발현을 변경시키는 데 이용된다. 상기 siRNA가 표적세포에서 WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1 또는 APCDD1 전사체에 결합하면, 상기 세포에서의 상기 단백질의 감소가 초래된다. 상기 올리고뉴클레오티드의 길이는 적어도 10 핵산이고 자연적으로 발생하는 전사체만큼 길 수 있다. 바람직하게는, 상기 올리고뉴클레오티드는 19 내지 25 핵산 길이를 가진다. 가장 바람직하게는, 상기 올리고뉴클레오티드는 75, 50 또는 25 핵산 길이 미만이다. 포유동물 세포에서의 발현을 억제하는 WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1 또는 APCDD1 siRNA 올리고뉴클레오티드의 예는 서열번호 93 내지 103 중 어느 것이든지 포함하는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 이들 서열은 각각 하기의 siRNA 서열의 표적 서열이다:
서열번호 93, 서열번호 24 및 25 (WDRPUH);
서열번호 94, 서열번호 26 및 27 (WDRPUH);
서열번호 95, 서열번호 28 및 29 (WDRPUH);
서열번호 96, 서열번호 30 및 31 (WDRPUH);
서열번호 97, 서열번호 104 및 105 (KRZFPUH);
서열번호 98, 서열번호 106 및 107 (KRZFPUH);
서열번호 99, 서열번호 108 및 109 (KRZFPUH);
서열번호 100, 서열번호 110 및 111 (KRZFPUH);
서열번호 101, 서열번호 47 및 48 (PPIL1);
서열번호 102, 서열번호 49 및 50 (PPIL1); 및
서열번호 103, 서열번호 51 및 52 (PPIL1).
siRNA의 핵산서열은 Ambion사의 웹사이트(http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html)에서 이용가능한 siRNA 고안 컴퓨터 프로그램을 이용하여 고안되었다. 상기 컴퓨터 프로그램은 하기의 프로토콜에 다라 siRNA 합성을 위한 핵산서열을 선벽한다.
siRNA 표적 부위의 선별:
1. 목표 전사체의 AUG 개시코돈에서 시작하여, AA 이핵산서열에 대하여 하류방향으로 탐색하라. 각각의 AA 및 잠재적인 siRNA 표적 부위로 3' 인접한 19 핵산의 출현을 기록하라.
투쉴(Tuschl) 등은 5' 및 3' 비번역 지역(untranslated region, UTR) 및 개시코돈 근처지역(75 염기 이내)에 대하여 siRNA를 고안하는 것을 추천하지 않는데, 이는 이 지역에 조절 단백질 결합 부위가 많이 있을 수 있기 때문이다. UTR-결합 단백질 및/또는 번역 개시 복합체가 siRNA 엔도뉴클라제 복합체의 결합을 방해할 수 있다.
2. 잠재적인 표적 부위를 인간 게놈 데이터베이스와 비교하고 다른 코딩 서열과 현저한 상동성을 갖는 어떠한 표적 서열이라도 고려대상에서 제거하라. 상기 상동성 검색은 http://www.ncibi.nlm.nih.gov/BLAST/를 주소로 둔 NCBI 서버상에서 찾을 수 있는 BLAST를 이용하여 수행될 수 있다.
3. 합성을 위한 자격을 부여받은 표적 서열을 선별하라. Ambion사에서, 바람직하게는 일부 표적 서열이 평가 대상의 유전자의 길이에 따라 선택될 수 있다.
본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 siRNA는 본 발명의 폴리펩티드의 발현을 억제하고, 그에 따라 본 발명의 폴리펩티드의 생물학적 활성을 억제하는데 유용하다. 아울러, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 siRNA를 포함하는 발현-억제제는 본 발명의 폴리펩티드의 생물학적 활성을 억제한다는 점에서 유용하다. 따라서, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 siRNA를 포함하는 조성물은 암과 같은 세포 증식성 질환의 치료에 유용하다.
더욱이, 본 발명은 진단 마커로서 본 발명의 폴리펩티드의 발현수준을 이용하여 세포 증식성 질환의 진단방법을 제공한다.
상기 진단방법은 (a) 본 발명의 WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1 또는 APCDD1 유전자를 검출하는 단계; 및 (b) 암과 같은 세포 증식성 질환에서의 발현수준의 상승과 결부시키는 단계를 포함한다.
특정 표본에서의 상기 WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1 또는 APCDD1 유전자의 발현수준은 상응하는 mRNA 또는 상기 WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1 또는 APCDD1 유전자에 의하여 코딩되는 단백질을 정량함으로써 측정할 수 있다. mRNA의 정량방법은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1 또는 APCDD1 유전자에 상응하는 mRNA의 수준은 노던블롯 분석(northern blotting) 또는 RT-PCR에 의하여 측정될 수 있다. WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1 또는 APCDD1 유전자의 전장 핵산서열이 서열번호 1, 3, 5 또는 7에 각각 나타나있으므로, 당업자라면 누구든지 WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1 또는 APCDD1 유전자를 정량하기 위한 탐침 또는 프라이머에 대한 핵산서열을 고안할 수 있다.
상기 WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1 또는 APCDD1 유전자의 발현수준은 아울러, 상기 유전자에 의하여 코딩되는 단백질의 활성 또는 양에 기반하여 분석할 수 있다. 상기 WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1 또는 APCDD1 유전자의 양을 측정하는 방법은 하기와 같다. 예를 들어, 면역분석 방법은 생물학적 물질(biological material)에서 단백질의 측정을 하는데 유용하다. 어떠한 생물학적 물질이더라도 상기 단백질 또는 그 활성을 측정하는데 이용될 수 있다. 예를 들어, 혈액시료는 혈청 마커에 의하여 코딩되는 단백질의 측정을 위하여 분석된다. 한편, 적절한 방법이 각각의 분석대상이 되는 단백질의 활성에 따라 상기 WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1 또는 APCDD1 유전자에 의하여 코딩되는 단백질의 활성을 측정하기 위하여 적절한 방법이 선택될 수 있다.
표본(검사 시료)에서의 상기 WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1 또는 APCDD1 유전자의 발현수준을 측정하고 정상 시료에서의 발현수준과 비교한다. 그러한 비교 결과 정상 시료에서의 발현수준보다 표적 유전자의 발현수준이 더 높을 경우, 그 검사 대상 시료는 세포 증식성 질환에 걸린 것으로 판정된다. 정상 시료 및 검사 대상 시료로부터의 표본에서의 상기 WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1 또는 APCDD1 유전자의 발현수준을 동시에 측정할 수 있다. 이와는 달리, 정상적인 범위의 발현수준은 대조군으로부터 사전에 선별된 표본에서의 상기 유전자의 발현수준을 분석하여 수득한 결과 에 기반을 둔 통계학적 방법에 의하여 결정될 수 있다. 정상범위의 발현수준과 검사대상 시료에서의 발현수준을 비교함으로써 결과를 구할 수 있다; 상기 결과가 정상 범위내에 포함되지 않는 경우, 검사 대상은 상기 세포 증식성 질환에 걸린 것으로 판정된다. 본 발명에서, 상기 세포 증식성 질환은 바람직하게는 암으로 진단된다. 보다 바람직하게는, WDRPUH 또는 KRZFPUH 유전자의 발현수준을 측정하고 정상 시료의 발현수준과 비교하는 경우, 세포 증식성 질환은 간세포암(hepatocellular carcinoma)으로 진단되고; PPIL1 또는 APCDD1 유전자의 발현수준을 측정하는 경우, 상기 질환은 결장암(colorectal cancer)으로 진단된다. 더 나아가, KRZFPUH 유전자의 발현수준을 측정하고 정상 시료의 발현수준과 비교하는 경우, 상기 세포 증식성 질환은 간세포암에 부가하여 위암(gastric carcinoma) 또는 폐암(lung carcinoma)으로 진단될 수 있다.
본 발명에서는, 아울러 간세포암 및 결장암을 포함하는 암과 같은 세포 증식성 질환을 진단하기 위한 진단시약을 제공한다. 본 발명의 진단시약은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드와 결합하는 화합물을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 폴리뉴클레오티드와 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드가 그와 같은 화합물로 사용될 수 있다.
더욱이, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 이용하여 세포 증식성 질환의 치료를 위한 화합물을 탐색하는 방법을 제공한다. 상기 탐색 방법의 일 실시태양은 (a) 본 발명의 폴리펩티드를 시험 대상 화합물과 접촉시키는 단계; (b) 본 발명의 폴리펩티드와 상기 시험 대상 화합물 사이의 결합 활성을 검출하는 단계; 및 (c) 본 발명의 폴리펩티드와 결합하는 화합물을 선별하는 단계를 포함한다.
탐색에 사용될 본 발명의 폴리펩티드는 재조합 폴리펩티드 또는 천연 유래의 단백질 또는 그의 부분 펩티드일 수 있다. 예를 들어, 세포 추출물, 세포배양 상등액, 발효 미생물의 산물, 해양생물(marine organism)로부터의 추출물, 식물 추출물, 정제된 또는 조 단백질(crude protein), 펩티드, 비-펩티드 화합물, 합성 소분자(synthetic micromolecule) 및 천연 화합물과 같이 어떠한 시험 대상 화합물일지라도 사용될 수 있다. 시험 대상 화합물과 접촉되는 본 발명의 폴리펩티드는 예를 들어, 정제된 폴리펩티드, 수용성 단백질, 담체(carrier)에 결합된 형태 또는 다른 폴리펩티드와 융합된 융합단백질일 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드에 결합하는 단백질에 대한 탐색 방법으로는, 당업자에게 잘 알려진 많은 방법이 사용될 수 있다. 그러한 탐색방법은 예를 들어, 면역침강법에 의하여 수행될 수 있는데, 상세하게는 상기 면역침강법은 하기의 과정을 통하여 수행될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 pSV2neo, pcDNA I 및 pCD8과 같은 외래유전자를 위한 발현벡터에 삽입시킴으로써, 상기 유전자를 동물세포 등에서 발현시킬 수 있다. 상기 발현에 이용되는 프로모터는 통상적으로 사용될 수 있는 어떠한 프로모터라도 사용될 수 있으며, 여기에는 SV40 초기 프로모터(Rigby in Williamson (ed.), Genetic engineering, vol. 3. Academic Press, London, 83-141, 1982), EF-α 프로모터(Kim et al., Gene, 91:217-223,1990), CAG 프로모터(Niwa et al., Gene, 108:193-200, 1991), RSV LTR 프로모터(Cullen, Methods in Enzymology, 152: 684-704, 1987), SRα프로모터 (Takebe et al., Mol. Cell. Biol., 8:466,1988), CMV 즉시초기(immediate early) 프로모터(Seed and Aruffo, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 84:3365-3369, 1987), SV40 후기 프로모터(Gheysen and Fiers, J. Mol. Appl. Genet., 1:385-394, 1982), 아데노바이러스 후기 프로모터(Kaufman et al., Mol. Cell. Biol., 9:946, 1989), HSV TK 프로모터 등이 포함된다. 상기 유전자를 외래유전자를 발현하기 위한 동물세포에 도입하는 것은 어떠한 방법에 의해서든지 수행될 수 있는데, 여기에는 예를 들어, 엘렉트로포레이션(electroporation) 방법(Chu et al., Nucleic Acids Res., 15:1311-1326, 1987), 인산칼슘(calcium phosphate) 방법(Chen and Okayama, Mol. Cell. Biol., 7:2745-2752, 1987), DEAE 덱스트란 방법(Lopata et al., Nucleic Acids Res., 12:5707-5717, 1984; Sussman and Milman, Mol. Cell. Biol., 4:642-1643, 1985), 리포펙틴(Lipofectin) 방법(Derijard, Cell, 7:1025-1037, 1994; Lamb et al., Nature Genetics, 5:22-30, 1993; Rabindran et al., Science, 259:230-234, 1993) 등이 포함된다. 본 발명의 폴리펩티드는 N- 또는 C-말단에 특이성이 밝혀진 단클론성 항체의 인식부위(recognition site, epitope)를 도입함으로써, 단클론성 항체의 인식부위(에피토프)를 포함할 수 있다. 상업적으로 이용가능한 에피토프-항체 시스템이 사용될 수 있다(Experimental Medicine, 13: 85-90, 1995). 예를 들어, 벡터 내의 다중 클로닝 부위를 이용함으로써 베타-갈락토시다제(β-galactosidase), 말토스 결합 단백질(maltose binding protein), 글루타티온 S-트랜스퍼라제(glutathione S-transferase), 녹색형광 단백질(green fluorescent protein, GFP) 등과 같은 단백질과의 융합단백질로 발현할 수 있는 벡터가 상업적 으로 이용가능하다.
아울러, 본 발명의 폴리펩티드의 특성을 변화시키지 않는 한도 내에서의 몇 개 내지 12개 정도의 아미노산으로 구성된 작은 에피토프만을 융합에 의하여 도입함으로써 제조되는 융합단백질이 보고되고 있다. 본 발명의 폴리펩티드에 결합하는 단백질을 탐색하기 위한 에피토프-항체 시스템으로는, 예를 들어 다중히스티딘(His-tag), 인플루엔자 응집소(influenza aggregate) HA, 인간 c-myc, FLAG, 소낭성 구내염 바이러스 당단백질(vesicular stomatitis virus glycoprotein, VSV-GP), T7 유전자 10 단백질(T7-tag), 인간 단순포진 바이러스 당단백질(human simple herpes virus glycoprotein, HSV-tag), E-tag(단클론성 파지상의 에피토프) 등등의 에피토프 및 이들을 인식할 수 있는 단클론성 항체가 사용될 수 있다(Experimental Medicine, 13: 85-90, 1995).
면역침강법(immunoprecipitation)에서는, 면역 복합체가 절절한 계면활성제(detergent)를 사용하여 제조된 세포 용해체에 상기 항체를 첨가함으로써 형성될 수 있다. 상기 면역 복합체는 본 발명의 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드와 결합 능력을 포함하는 폴리펩티드, 및 항체로 구성된다. 면역침강법은 상기 에피토프에 대한 항체(이때 상기 항체는 상술한 바와 같이 제조될 수 있다)를 사용하는 것을 제외하고는, 본 발명의 폴리펩티드에 대한 항체를 이용하여 수행될 수 있다.
면역 복합체는 예를 들어, 상기 항체가 생쥐 IgG 항체인 경우에는 단백질 A 세파로즈 또는 단백질 G 세파로즈를 이용하여 침전될 수 있다. 만일 본 발명의 폴리펩티드가 GST와 같은 에피토프와의 융합단백질로 제조된다면, 면역복합체는 글루 타티온-세파로즈 4B와 같은 상기 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 사용함으로써 본 발명의 폴리펩티드에 대한 항체를 사용할 때와 동일한 방식으로 형성될 수 있다.
면역침강법은 하기와 같이 또는 예를 들어, 문헌에 기재된 방법에 따라 수행될 수 있다(Harlow and Lane, Antibodies, 511-552, Cold Spring Harbor Laboratory publications, New York, 1988).
SDS-PAGE는 면역침강된 단백질의 분석에 통상적으로 사용되고 상기 결합된 단백질은 적절한 농도의 겔을 이용하여 상기 단백질의 분자량에 관하여 분석될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드에 결합한 단백질은 쿠마시 염색(Coomassie staining) 또는 은 염색(silver staining)과 같은 통상적인 염색방법에 의하여 검출되지 어렵기 때문에, 35S-메티오닌 또는 35S-시스테인과 같은 방사성 동위원소를 포함하는 배양배지에서 세포를 배양하여, 세포내의 단백질을 표지하고, 상기 단백질을 검출함으로써, 상기 단백질의 검출감도를 향상시킬 수 있다. 당해 단백질의 분자량이 이미 밝혀졌다면, 상기 표적 단백질은 SDS-폴리아크릴아마이드 겔로부터 직접 정제될 수 있으며, 서열까지 결정할 수 있다.
상기 폴리펩티드를 이용하는 본 발명의 폴리펩티드에 결합하는 단백질을 탐색하는 방법으로는, 예를 들어, 웨스트-웨스턴 블롯 분석(West-Western blotting analysis, Skolnik et al., Cell, 65:83-90, 1991)이 사용될 수 있다. 상세하게는, 본 발명의 폴리펩티드에 결합하는 단백질은 세포, 조직, 기관(예를 들어, WDRPUH에 결합하는 단백질을 탐색하는 데에는 고환 조직; KRZFPUH에 결합하는 단백질을 탐색하는 데에는 태반 또는 고환 조직; PPIL1에 결합하는 단백질을 탐색하는 데에는 심장, 골격근, 고환, 흉선 또는 부신선 조직; 그리고 APCDD1에 결합하는 단백질을 탐색하는 데에는 심장, 췌장, 전립선, 난소, 폐, 간, 신장, 비장, 흉선, 결장 또는 말초 백혈구 조직) 또는 파지(phage) 벡터(예를 들어, ZAP)를 이용하여 본 발명의 폴리펩티드와 결합하는 단백질을 발현할 것으로 기대되는 배양세포로부터 cDNA 라이브러리를 제조하는 단계; LB-아가로즈 상에 상기 단백질을 발현시키는 단계, 필터 상에 상기 단백질을 고정하는 단계; 상기 필터와 정제되고 표지된 본 발명의 폴리펩티드를 반응시키는 단계; 및 상기 표지에 따라 본 발명의 폴리펩티드와 결합한 단백질을 발현하는 플라크(plaque)를 검출하는 단계를 통해 제조될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 비오틴(biotin) 및 아비딘(avidin) 사이의 결합을 이용하거나 본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명의 폴리펩티드에 융합된 펩티드 또는 폴리펩티드(예를 들어, GST)에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 표지될 수 있다. 방사성 동위원소(radioisotope) 또는 형광(fluorescent) 등을 이용한 방법 또한 본 발명에서 사용될 수 있다.
이와 달리, 본 발명의 탐색방법의 다른 실시태양에서, 이중-하이브리드 시스템(two-hybridization system) 이용 세포를 이용할 수 있다("MATCHMAKER Two-Hybrid system", "Mammalian MATCHMAKER Two-Hybrid Assay Kit", "MATCHMAKER one-Hybrid system"(Clontech); "HybriZAP Two-Hybrid Vector System"(Stratagene); "Dalton and Treisman, Cell, 68: 597-612, 1992"; "Fields and Sternglanz, Trends Genet., 10:286-292, 1994").
이중-하이브리드 시스템에서, 본 발명의 폴리펩티드는 SRF-결합 영역 또는 GAL4-결합 영역에 융합되어 효모세포에서 발현된다. cDNA 라이브러리는 상기 라이브러리가 발현될 때 VP16 또는 GAL4 전사촉진 영역과 융합되도록 본 발명의 폴리펩티드에 결합하는 단백질을 발현할 것으로 기대되는 세포로부터 제조된다. 그런 다음, 상기 cDNA 라이브러리는 상기 효모세포로 도입되고, 상기 라이브러리로부터 유래된 cDNA가 검출된 양성 클론으로부터 분리된다(본 발명의 폴리펩티드와 결합하는 단백질이 효모세포에서 발현되는 경우, 상기 두 단백질의 합으로 리포터 유전자가 활성화되어 양성 클론을 검출할 수 있게 한다). 상기 cDNA에 의하여 코딩되는 단백질은 상기에서 분리된 cDNA를 대장균에 도입하고 상기 단백질을 발현시킴으로써 제조될 수 있다.
리포터 유전자로는 예를 들어, HIS3 유전자에 덧붙여, de2 유전자, lacZ 유전자, CAT 유전자, 루시퍼라제 유전자(luciferase gene) 등등이 사용될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드와 결합하는 화합물은 또한 친화성 크로마토그래피를 이용하여 탐색될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드를 친화성 칼럼의 운반체(carrier) 상에 고정하고, 본 발명의 폴리펩티드와 결합할 수 있는 단백질을 포함하는 시험 대상 화합물을 상기 칼럼에 적재한다. 여기서 시험 대상 화합물은 예를 들어, 세포 추출물, 세포 용해체 등이 될 수 있다. 상기 시험 대상 화합물을 적재한 다음, 상기 칼럼을 세척함으로써, 본 발명의 폴리펩티드에 결합한 화합물을 제조할 수 있다.
상기 시험 대상 화합물이 단백질인 경우, 상기 수득된 단백질의 아미노산 서열을 분석하고, 상기 서열에 따라 올리고 DNA를 합성한 다음, 상기 단백질을 코딩하는 DNA를 얻기 위한 탐침으로 상기 올리고 DNA를 사용하여 cDNA 라이브러리를 탐색할 수 있다.
표면 플라스몬 공명현상(surface plasmon resonance phenomenon)을 이용한 바이오센서(biosensor)가 본 발명에서 결합한 화합물을 검출하거나 정량하는 수단으로 사용될 수 있다. 그와 같은 바이오센서(예를 들어, BIAcore, Pharmacia)를 이용할 때, 본 발명의 폴리펩티드와 시험 대상 화합물 사이의 상호작용은 미세한 양의 폴리펩티드만을 이용하고 표지하지도 않은 채로, 표면 플라스몬 공명신호로서 실시간으로 관찰할 수 있다. 따라서, BIAcore와 같은 바이오센서를 이용하여 본 발명의 폴리펩티드와 시험 대상 화합물 사이의 결합을 측정하는 것이 가능하다.
본 발명의 고정된 폴리펩티드가 합성 화학적 화합물(synthetic chemical compound), 천연 물질군(natural substance group) 또는 무작위적인 파지 펩티드 표시 라이브러리(random phage peptide display library)에 노출되었을 때, 결합하는 분자에 대한 탐색방법 및 본 발명의 단백질과 결합하는 단백질은 물론 (작용제 및 길항제를 포함하는) 화학적 화합물을 분리할 수 있는 조합적인 화학 기법에 기반을 둔 대용량 분석기술(Wrighton et al., Science, 273: 458-64, 1996; Verdine, Nature, 384:11-13, 1996; Hogan, Nature, 384:17-9, 1996)을 이용한 탐색방법은 당업자에게 잘 알려져 있다.
상기 탐색방법에 의하여 분리되는 화합물은 예를 들어, 암과 같은 세포 증식 성 질환에 속하는 질환의 치료 또는 치료를 위하여, 본 발명의 폴리펩티드의 활성을 촉진시키거나 억제하는 약물의 후보가 된다. 본 발명의 폴리펩티드와 결합하는 활성을 갖는 본 발명의 탐색방법에 의하여 구해진 화합물의 구조의 일부가 부가, 결실 및/또는 치환에 의하여 변환된 화합물이 본 발명의 탐색방법에 의하여 얻어진 화합물 내에 포함될 수 있다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명은 세포 증식 질병의 치료에 있어서 잠재적인 목적이 되는 후보 약물을 탐색하는 방법을 제공한다. 상기에서 자세하게 논의된 바와 같이, WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1 또는 APCDD1의 발현수준을 조절함으로써, 암의 개시 및 진행을 조절할 수 있다. 따라서, 세포 증식성 질환에 대한 치료에 있어서 잠재적 목적이 되는 후보 약물은 지표로서 WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1 또는 APCDD1의 발현수준 및 활성을 이용하는 탐색방법을 통해 동정될 수 있다. 본 발명에서, 그러한 탐색방법은 예를 들어 하기의 단계를 포함한다:
(a) WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1 또는 APCDD1를 발현하는 세포와 후보 화합물을 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 후보 화합물이 없는 상태에서 측정된 발현수준과 비교하여 WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1 또는 APCDD1의 발현수준을 감소시키는 화합물을 선별하는 단계.
WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1 또는 APCDD1의 적어도 하나 이상을 발현하는 세포는 예를 들어, HCC 또는 결장암으로부터 확립된 세포주를 포함하는데, 그러한 세포는 본 발명의 상술한 탐색방법을 위하여 사용될 수 있다. 상기 발현수준은 당업자에게 잘 알려진 방법으로 측정될 수 있다. 상기 탐색방법에서 WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1 또는 APCDD1 중 적어도 어느 하나의 발현수준을 감소시키는 화합물을 후보 약물로 선별할 수 있다.
본 발명의 세포 증식성 질환의 치료를 위한 화합물의 탐색방법의 또 다른 실시태양에서, 상기 방법은 지표로서 본 발명의 폴리펩티드의 생물학적 활성을 이용한다. 본 발명의 WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1 또는 APCDD1 단백질은 세포 증식 활성을 가지기 때문에, 발명의 상기 단백질의 하나의 활성을 촉진하거나 억제하는 화합물은 지표로서 상기 활성을 이용하여 탐색될 수 있다. 상기 탐색방법은 (a) 본 발명의 폴리펩티드와 시험 대상 화합물을 접촉시키는 단계; (b) 상기 단계 (a)의 폴리펩티드의 생물학적 활성을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 시험 대상 화합물이 없을 때 측정된 생물학적 활성과 비교하여 상기 폴리펩티드의 생물학적 활성을 억제하는 화합물을 선별하는 단계를 포함한다.
어떠한 폴리펩티드일지라도 그것이 WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1 또는 APCDD1 단백질의 생물학적 활성을 포함하는 한 탐색에 사용될 수 있다. 그러한 생물학적 활성에는 인간 WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1 또는 APCDD1 단백질의 세포 증식 활성과 PPIL1의 SNW1 또는 스타트민에 결합하는 활성이 포함된다. 예를 들어, 인간 WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1 또는 APCDD1 단백질이 사용될 수 있고, 상기 단백질과 기능적으로 동등한 폴리펩티드 역시 사용될 수 있다. 그러한 폴리펩티드는 내생적으로 또는 세포에 의하여 외생적으로 발현될 수 있다.
예를 들어, 세포 추출물, 세포 배양 상등액, 미생물 발효 산물, 해양 생물의 추출물, 식물 추출물, 정제 또는 조 단백질, 펩티드, 비-펩티드성 화합물, 합성 소 분자 화합물 또는 천연 화합물 등과 같은 어떠한 시험 대상 화합물이라도 사용될 수 있다.
상기 탐색방법에 의하여 분리되는 화합물은 본 발명의 폴리펩티드의 작용제(agonist) 또는 길항제(antagonist)에 대한 후보가 된다. “작용제”라는 용어는 본 발명의 폴리펩티드에 결합함으로써 상기 폴리펩티드의 기능을 할성화시키는 분자를 의미한다. 마찬가지로, “길항제”라는 용어는 본 발명의 폴리펩티드에 결합함으로써, 상기 폴리펩티드의 기능을 억제하는 분자를 의미한다. 더욱이, 상기 탐색방법으로 분리된 화합물은 본 발명의 폴리펩티드의 생체 내에서 (DNA 및 단백질을 포함하는) 분자들과의 상호작용을 저해하는 화합물의 후보가 된다.
본 발명의 방법에서 측정될 생물학적 활성이 세포 증식인 경우, 상기 활성은 실시예에서 기재된 바와 같이 콜로니 형성 활성을 측정함으로써 뿐만 아니라, 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드를 발현하는 세포를 제조하는 단계; 검사 대상의 화합물이 존재하는 조건에서 상기 세포를 배양하는 단계; 및 세포 증식의 속도를 측정하고, 세포 주기 등을 측정하는 단계에 의하여 측정될 수 있다.
상기 탐색법에 의하여 분리된 화합물은 본 발명의 폴리펩티드의 활성을 억제하는 약물의 후보이며, 암을 포함하는 세포 증식성 질환과 같은 본 발명의 폴리펩티드와 관련된 질환의 치료에 사용될 수 있다. 보다 상세하게, WDRPUH 또는 KRZFPUH 단백질의 생물학적 활성을 지표로 사용하는 경우, 본 발명의 방법에 의하여 탐색된 화합물은 간세포암의 치료를 위한 약물 후보가 된다. 더 나아가, KRZFPUH 단백질의 생물학적 활성을 지표로 사용하는 경우, 간세포암과는 별개로, 본 발명의 방법에 의하여 탐색된 화합물은 위암 또는 폐암의 치료를 위한 약물의 후보가 된다. 한편, PPIL1 또는 APCDD1 단백질이 지표로 사용되는 경우, 본 발명의 방법에 의하여 탐색된 화합물은 결장암의 치료를 위한 약물 후보가 된다.
더 나아가, WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1 또는 APCDD1 단백질의 활성을 억제하는 화합물의 구조의 일부가 부가, 결실 및/또는 치환에 의하여 변환된 화합물이 본 발명의 탐색방법에 의하여 얻어진 화합물 내에 포함될 수 있다.
이와 달리, 본 발명의 탐색방법은 하기의 단계를 포함할 수 있다:
(a) 하나 또는 그 이상의 마커 유전자의 전사 조절 영역(transcriptional regulatory region) 및 상기 전사조절 영역의 조절하에서 발현되는 리포터 유전자를 포함하는 벡터가 도입된 세포와 후보 화합물을 접촉시키는 단계(이때, 하나 또는 그 이상의 마커 유전자는 WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1 및 APCDD1로 구성된 군으로부터 선택된다);
(b) 상기 리포터 유전자의 활성을 측정하는 단계; 및
(c) 대조군과 비교하여 상기 리포터 유전자의 발현수준을 감소시킨 화합물을 선별하는 단계.
적절한 리포터 유전자 및 숙주세포는 당업계에서 잘 알려져 있다. 탐색에 필요한 리포터 컨스트럭트는 마커 유전자의 전사 조절 영역을 이용함으로써 제조할 수 있다. 마커 유전자의 전사 조절 영역이 당업자에게 공지되어 있는 경우에는, 리포터 컨스트럭트는 기존의 서열 정보를 이용하여 제조될 수 있다. 마커 유전자의 전사 조절 영역이 아직 확인되지 않은 상태라면, 상기 마커 유전자의 핵산서열 정보에 기반하여, 게놈 라이브러리로부터 상기 전사 조절 영역을 포함하는 핵산 단편을 분리할 수 있다.
아울러, 본 발명의 세포 증식성 질환의 치료를 위한 화합물의 탐색방법의 다른 실시태양에서, 상기 방법은 APCDD1의 프로모터 영역을 이용한다. 본 발명에 따르면, 베타-카테닌(β-catenin)/Tcf4 복합체가 APCDD1 유전자의 전사 조절 영역내에 있는 두 곳의 Tcf/LEF 결합 모티프에 결합하며, APCDD1의 전사활성화에 관련되어 있는 것으로 밝혀졌다. 그러므로, APCDD1의 전사 활성화를 억제하는 화합물은 본 발명의 APCDD1 폴리펩티드의 활성을 억제하는 약물의 후보가 되고, 상기 폴리펩티드와 관련된 질병, 예를 들어, 암, 특히 결장암과 같은 세포 증식성 질환의 치료에 사용될 수 있다.
이러한 탐색방법은 (a) 리포터 유전자의 상부에 두 곳의 APCDD1의 Tcf/LEF 결합 모티프를 포함하는 벡터를 제조하는 단계; (b) 상기 단계 (a)의 벡터로 세포를 형질전환시키는 단계; (c) 시험 대상 화합물 및 베타-카테닌/Tcf4 복합체를 상기 단계 (d)의 세포와 접촉시키는 단계; (e) 리포터 유전자의 발현을 측정하는 단계; 및 (f) 상기 시험 대상 화합물이 없는 조건에서의 발현수준과 비교하여 리포터 유전자의 발현을 억제시킨 화합물을 선별하는 단계를 포함한다.
예를 들어, 세포 추출물, 세포 배양 상등액, 미생물 발효 산물, 해양 생물의 추출물, 식물 추출물, 정제 또는 조 단백질, 펩티드, 비-펩티드성 화합물, 합성 소분자 화합물 또는 천연 화합물 등과 같은 어떠한 시험 대상 화합물이라도 사용될 수 있다.
상기 탐색방법은 예를 들어, 실시예 28에 기재된 방법에 따라 수행될 수 있다. 예를 들어, 리포터 유전자의 상부에 APCDD1의 두 곳의 Tcf/LEF 결합 모티프를 포함하는 벡터는 리포터 유전자를 포함하는 발현벡터에 APCDD1의 프로모터 영역을 삽입함으로써 제조될 수 있다. APCDD1의 프로모터 영역은 인간 APCDD1 유전자(서열번호 7)의 5' 영역을 탐침으로 사용함으로써 게놈 라이브러리로부터 얻어질 수 있다. 베타-카테닌 및 Tcf-4는 실시예 28에 기재된 바에 따라 제조될 수 있다.
어떠한 리포터 유전자라도 그 발현을 검출할 수 있는 한, 상기 탐색에 사용할 수 있다. 리포터 유전자의 예에는 베타-gal 유전자, CAT 유전자 및 루시퍼라제 유전자가 포함된다. 리포터 유전자의 발현에 대한 검출은 리포터 유전자의 유형에 따라 수행될 수 있다. 상기 벡터가 도입되는 세포에 대한 특별한 제한은 없으나, 발람직한 실시예에는 HeLa 세포가 포함된다.
상기 탐색방법에 의하여 분리된 화합물은 본 발명의 APCDD1 단백질의 발현을 억제하는 약물 후보가 되며, APCDD1 단백질과 관련된 질환, 예를 들어, 암, 보다 바람직하게는 결장암과 같은 세포 증식성 질환의 치료에 사용될 수 있다. 더 나아가, 베타-카테닌/Tcf-4 복합체에 의하여 APCDD1 단백질의 전사 활성을 억제하는 화합물의 구조의 일부가 부가, 결실 및/또는 치환에 의하여 변환된 화합물이 본 발명의 탐색방법에 의하여 얻을 수 있는 화합물 내에 포함될 수 있다.
본 발명의 세포 증식성 질환의 치료를 위한 화합물의 탐색방법의 또 다른 실시태양에서, 상기 방법은 PPIL1이 SNW1(SKI 상호작용 단백질) 또는 스타트민과 결합하는 능력을 사용한다. 본 발명의 상기 PPIL1 단백질은 비타민 D 수용체의 전사 활성과 관련된 단백질인 SNW1 및 세포주기의 진행과 관련된 세포질 인산단백질인 스타트민과 연관되어 있는 것으로 밝혀졌다. 상기와 같은 발견은 본 발명의 PPIL1 단백질 SNW1 및 스타트민과 같은 분자와 결합함으로써 세포 증식 기능을 발휘함을 시사한다. 따라서, PPIL1 및 SNW1 또는 스타트민 사이의 결합을 억제하면, 세포 증식이 억제되고, 상기 결합을 억제하는 화합물은 암과 같은 세포 증식성 질환을 치료하기 위한 약제가 될 것으로 기대된다. 본 발명의 방법에 의하여 탐색된 화합물로 처리한 상기 세포 증식성 질환은 바람직하게는 결장암이다.
상기 탐색방법은 (a) 시험 대상 화합물이 존재하는 조건에서 스타트민 또는 SNW1과 본 발명의 폴리펩티드를 접촉시키는 단계; (b) 상기 폴리펩티드 및 스타트민 또는 SNW1 사이의 결합을 검출하는 단계; 및 (c) 상기 폴리펩티드와 스타트민 또는 SNW1 사이의 결합을 저해하는 화합물을 선별하는 단계를 포함한다.
상기 탐색방법에 이용되는 본 발명의 PPIL1 폴리펩티드 및 SNW1 또는 스타트민은 재조합 폴리펩티드 또는 천연 유래의 단백질뿐만 아니라, 서로간의 결합능력이 유지되는 한 그의 부분 펩티드도 될 수 있다. 상기 탐색방법에 이용되는 본 발명의 PPIL1 폴리펩티드 및 SNW1 또는 스타트민은 예를 들어, 정제된 폴리펩티드, 수용성 단백질, 담체에 결합된 형태 또는 다른 폴리펩티드와 융합된 융합 단백질일 수 있다.
예를 들어, 세포 추출물, 세포 배양 상등액, 미생물 발효 산물, 해양 생물의 추출물, 식물 추출물, 정제 또는 조 단백질, 펩티드, 비-펩티드성 화합물, 합성 소분자 화합물 또는 천연 화합물 등과 같은 어떠한 시험 대상 화합물이라도 사용될 수 있다.
PPIL1 단백질 및 SNW1 또는 스타트민 사이의 결합을 억제하는 화합물의 탐색방법으로 당업자에게 잘 알려진 많은 방법이 사용될 수 있다. 그러한 탐색방법은 예를 들어 세포성 시스템(cellular system)과 같은 시험관내 분석 시스템으로 수행될 수 있다. 보다 상세하게는, 첫째, PPIL1 폴리펩티드 또는 SNW1 또는 스타트민 중 어느 하나를 지지체에 결합시키고, 다른 단백질을 검사 대상 시료와 함께 첨가한다. 그런 다음, 상기 혼합물을 배양하고, 세척하고 상기 지지체에 결합된 다른 단백질을 검출 및/또는 측정하게 된다.
단백질의 결합에 이용되는 지지체의 예로는 아가로즈, 셀룰로즈 및 덱스트린과 같은 불용성 다당류; 및 폴리아크릴아마이드, 폴리스티렌 및 실리콘과 같은 합성 수지가 포함되며; 바람직하게는 상업적으로 이용가능한 비드 및 상기 소재로 제조된 기판(예를 들어, 다중-웰 플레이트(multi-well plate), 바오오센서 칩 등)이 이용될 수 있다. 비드를 이용하는 경우, 이를 칼럼에 충진할 수 있다.
지지체로의 단백질의 결합은 화학 결합 및 물리적 흡착과 같은 통상적인 방법으로 수행될 수 있다. 이와는 달리, 단백질은 상기 단백질을 특이적으로 인식하는 항체를 통해 지지체에 결합될 수 있다. 아울러, 지지체로의 단백질의 결합은 아비딘 및 비오틴 결합을 이용하여 수행될 수 있다.
단백질 사이의 결합은 완충용액, 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 상기 완충용액이 상기 단백질 사이의 결합을 저해하지 않는 한, 예를 들어, 인산 완충용액 및 트리스(Tris) 완충용액 내에서 수행된다.
본 발명에서, 표면 플라스몬 공명현상을 이용한 바이오센서는 결합된 단백질을 검출하거나 정량하기 위한 수단으로 이용될 수 있다. 그러한 바이오센서를 이용하는 경우, 표지 없이, 극 소량의 폴리펩티드만을 이용하여, 단백질 사이의 상호작용을 표면 플라스몬 공명 신호 형태로 실시간으로 측정할 수 있다(에를 들어, BIAcore, Pharmacia). 따라서, BIAcore와 같은 바이오센서를 이용하여 PPIL1 폴리펩티드 및 SNW1 또는 스타트민 사이의 결합여부를 검정하는 것이 가능하다.
이와는 달리, PPIL1 폴리펩티드 또는 SNW1 또는 스타트민 중 어느 하나가 표지되고, 결합된 단백질의 표지를 상기 결합된 단백질의 검출 또는 측정에 사용할 수 있다. 상세하게, 상기 단백질 중 하나를 전-표지(pre-labeling)한 다음, 상기 표지된 단백질을 시험 대상 화합물이 존재하는 조건에서 다른 단백질과 함게 접촉을 시키고, 이어, 결합된 단백질을 세척 후, 상기 표지를 이용하여 검출 또는 측정하게 된다.
방사성 동위원소(예를 들어, 3H, 14C, 32P, 33P, 35S, 125I 및 131I), 효소(예를 들어, 알칼라인 포스파타제, 고추냉이 퍼옥시다제((horseradish peroxidase), 베타-갈락토시다제, 베타-클루코시다제), 형광물질(예를 들어, 플루오레세인 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate), 로다민(rhodamine)) 및 비오틴/아비딘과 같은 표지 물질 이 본 발명의 방법에서 단백질을 표지하는데 사용될 수 있다. 단백질을 방사성 동위원소로 표지하는 경우, 검출 또는 측정은 액상 섬광(liquid scintillation)을 이용하여 검출 또는 측정할 수 있다. 이와 달리, 효소로 표지된 단백질은 기질의 발색과 같은 효소적 변화를 흡수계(absorptiometer)로 검출하기 위하여 상기 효소에 특이적인 기질을 첨가함으로써 검출 또는 측정할 수 있다. 아울러, 형광물질이 표지로 이용되는 경우에는, 상기 결합된 단백질은 형광광도계(fluorophotometer)를 이용하여 검출 또는 측정할 수 있다.
아울러, PPIL1 폴리펩티드 및 SNW1 또는 스타트민의 결합은 PPIL1 폴리펩티드 및 SNW1 또는 스타트민에 특적인 항체를 이용하여 검출 또는 측정할 수 있다. 예를 들어, 지지체에 고정된 PPIL1 폴리펩티드를 시험 대상 화합물 및 SNW1 또는 스타트민과 접촉시킨 다음, 상기 혼합물을 배양하고 세척한 다음 SNW1 또는 스타트민에 특이적인 항체를 이용하여 검출 또는 측정을 수행할 수 있다. 이와 달리, SNW1 또는 스타트민이 지지체에 고정되고, PPIL1에 대한 항체가 사용될 수 있다.
본 발명의 탐색방법에서 항체를 이용하는 경우, 상기 항체는 바람직하게는 상기 표지물질 중의 하나로 표지되고, 상기 표지 물질에 기반하여 검출 또는 측정된다. 이와 달리, PPIL1 폴리펩티드, SNW1 또는 스타트민에 특이적인 항체가 일차 항체로 사용되어 상기 표지 물질로 표지된 이차항체로 검출하는데 사용될 수 있다. 더 나아가, 본 발명의 탐색방법에서 단백질에 결합된 항체는 단백질 G 또는 단백질 A 칼럼을 이용하여 검출 또는 측정될 수 있다.
이와 달리, 본 발명의 탐색 방법의 또 다른 실시태양에서, 이중-하이브리드 시스템(two-hybridization system) 이용 세포를 이용할 수 있다("MATCHMAKER Two-Hybrid system", "Mammalian MATCHMAKER Two-Hybrid Assay Kit", "MATCHMAKER one-Hybrid system"(Clontech); "HybriZAP Two-Hybrid Vector System"(Stratagene); "Dalton and Treisman, Cell, 68: 597-612, 1992"; "Fields and Sternglanz, Trends Genet., 10:286-292, 1994").
이중-하이브리드 시스템에서, 본 발명의 PPIL1 폴리펩티드는 SRF-결합 영역 또는 GAL4-결합 영역에 융합되어 효모세포에서 발현된다. 본 발명의 PPIL1 폴리펩티드에 결합하는 SNW1 또는 스타트민은 VP16 또는 GAL4 전사촉진 영역과 융합되어, 시험 대상 화합물이 존재하는 조건하에서 발현된다. 상기 시험 대상 화합물이 PPIL1 폴리펩티드 및 SNW1 또는 스타트민과의 결합을 억제하지 않는 경우, 상기 두 단백질의 결합에 의하여 리포터 유전자가 활성화되고, 검출가능한 양성 클론이 형성된다.
리포터 유전자로는 예를 들어, HIS3 유전자에 덧붙여, de2 유전자, lacZ 유전자, CAT 유전자, 루시퍼라제 유전자(luciferase gene) 등등이 사용될 수 있다.
본 발명의 탐색방법에 의하여 분리된 화합물은 본 발명의 PPIL1 단백질의 활성을 억제하는 약물의 후보가 되고 PPIL1 단백질과 관련된 질환, 예를 들어, 암 보다 상세하게는, 결장암과 같은 세포 증식성 질환에 대한 치료에 사용될 수 있다. 더 나아가, PPIL1 단백질 및 SNW1 또는 스타트민 사이의 결합을 억제하는 화합물의 구조의 일부가 부가, 결실 및/또는 치환에 의하여 변환된 화합물이 본 발명의 탐색방법에 의하여 얻을 수 있는 화합물 내에 포함될 수 있다.
인간 및 생쥐, 집쥐, 기니피그(guinea-pigs), 토끼, 닭, 고양이, 개, 양, 돼지, 소, 원숭이, 망토원숭이(baboon), 침팬지(chimpanzee)와 같은 다른 포유동물에 대한 세포 증식성 질환(예를 들어, 암)의 치료제로서 본 발명의 방법에 의하여 분 리된 화합물을 사용하는 경우, 상기 분리된 화합물은 공지의 약학적 제제화 방법에 의하여 투여 형태로 제조될 수 있다. 예를 들어, 필요에 따라, 상기 약물은 당의정(sugarcoated tablet), 캡슐제, 엘릭시르제(elixir) 및 미세캡슐(microcapsule)로 경구로 투여될 수 있거나, 물 또는 다른 어떠한 약학적으로 허용되는 액체와의 멸균 용액 또는 현탁액의 주사제 형태로 비경구로 투여될 수 있다. 예를 들어, 상기 화합물은 약리학적으로 허용가능한 담체 또는 매질(media), 특히, 증류수, 생리학적 염수, 식물유(plant-oil), 유화제(emulsifier), 현탁제(suspending agent), 계면활성제(surfactant), 안정제(stabilizer), 향미제(flavoring agent), 부형제(excipient), 운반체(vehicle), 보존제(preservative), 결합제(binder) 등과 혼합하여, 일반적으로 허용되는 약물의 제조공정을 위해 요구되는 투여 단위 형태로 제조할 수 있다. 상기 제제화에 있어서 유효 성분(active ingredient)의 용량은 표시된 범위 내의 적절한 투여량을 얻을 수 있도록 조절될 수 있다.
정제 및 캡슐제에 혼합될 수 있는 첨가제의 예에는 젤라틴, 옥수수 녹말(corn starch), 트라가칸스 검(tragacanth gum) 및 아라비아 검(arabic gum)과 같은 결합제(binder); 결정질 셀룰로오즈(crystalline cellulose)와 같은 부형제; 옥수수 녹말, 젤라틴 및 알긴산(alginic acid)와 같은 팽창제(swelling agent), 스테아르산 마그네슘(magnesium stearate)과 같은 활택제(lubricant); 슈크로즈, 락토오즈 또는 사카린(saccharin)과 같은 감미제(sweetener); 페퍼민트(peppermint), 가울테리아 아데노트릭스 기름(Gaultheria adenothrix oil) 및 체리와 같은 향미료(flavoring agents)가 있다. 투여단위가 캡슐인 경우, 기름과 같은 액상 담체 또 한 상기 성분에 추가적으로 포함될 수 있다. 주사를 위한 멸균 조성물은 주사에 사용되는 증류수와 같은 운반체를 이용하여 정상적인 약물 제조공정에 따라 제제화될 수 있다.
생리학적 염수, 포도당 및 디-솔비톨(D-sorbitol), 디-만노스(D-mannose), 디-만니톨(D-mannitol) 및 염화 나트륨(sodium chloride)와 같은 보조제를 포함하는 등장성 액체가 주사를 위한 수용액으로 사용될 수 있다. 상기 수용액은 알콜, 특히 에탄올, 프로필렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리알콜(polyalcohol), Polysorbate 80TM 및 HCO-50과 같은 비 이온성 계면활성제와 같은 적절한 용해제(solubilizer)과 함께 사용될 수 있다.
참기름 또는 콩기름은 유성 액체로 사용할 수 있고, 용해제로 벤질 안식향산염(benzyl benzoate) 또는 벤질 알콜과 함께 사용될 수 있으며, 인산 완충액 및 아세트산 나트륨(sodium acetate) 완충액과 같은 완충액; 프로케인 하이드로클로라이드(procaine hydrochloride)와 같은 진통제; 벤질 알콜, 페놀과 같은 안정제; 및 항산화제(anti-oxidant)와 함께 제제화될 수 있다. 상기 제조된 주사제는 적절한 앰퓰에 충진될 수 있다.
당업자에게 잘 알려진 방법은 본 발명의 약학적 화합물을 환자에게 투여하는데 사용될 수 있는데, 예를 들어, 동맥내(intraarterial), 정맥내(intravenou), 경피적(percutaneous) 주사 및 비강내(intranasal), 경기관지파급(transbronchial), 근육내(intramuscular) 또는 경구(oral) 투여가 사용될 수 있다. 투여량 및 투여 방법은 환자의 체중 및 나이 그리고 투여방법에 따라 달라질 수 있으나, 당업자라면 통상적으로 그중에서 취사선택할 수 있다. 만일 상기 화합물이 DNA에 의하여 코딩가능하다면, DNA는 유전자 치료법을 위한 벡터에 삽입될 수 있고, 상기 벡터를 치료를 위해 투여할 수 있다. 투여량 및 투여방법은 환자의 체중, 나이 및 증상에 따라 달라질 수 있으나 당업자는 적절히 그중에서 취사선택할 수 있다.
예를 들어, 증상에 따라 약간의 차이는 있지만, 본 발명의 폴리펩티드와 결합하고 그의 활성을 조절하는 화합물의 투여량은 정상적인 성인(체중 60 kg)에게 경구로 투여되는 경우, 일일당 대략 0.1 mg 내지 약 100 mg, 바람직하게는 일일당 약 0.1 mg 내지 약 50 mg, 보다 바람직하게는 일일당 약 0.1 mg 내지 약 20 mg이 된다.
정상적인 성인(체중 60 kg)에 주사형태의 비경구 투여의 경우, 환자, 표적 기관, 증상 및 투여방법에 따라 달라질 수 있으나, 일일당 약 0.01 내지 약 30 mg, 바람직하게는 일일당 약 0.1 내지 약 20 mg, 보다 바람직하게는 일일당 약 0.1 내지 10 mg의 투여량으로 정맥내 주사하는 것이 편리하다. 아울러, 다른 동물의 경우에는, 체중 60 kg에 대한 변환된 용량을 투여하는 것이 가능하다.
아울러, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드에 특이적인 항체를 이용하여, 암과 같은 세포 증식성 질환을 치료하거나 예방할 수 있는 방법을 제공한다. 상기 방법에 의하면, 본 발명의 폴리펩티드에 대한 항체의 약제학적으로 유효한 투여량이 투여된다. WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1 및 APCDD1 단백질의 발현은 암 세포에서 상향 조절되고, 상기 단백질의 발현의 억제는 세포 증식 활성의 감소를 유도하므로, 상기 단백질과 상기 항체를 결합시킴으로서 세포 증식성 질환이 치료될 것으로 기대된다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드에 대한 항체는 본 발명의 단백질의 활성을 감소시키기에 충분한 투여량으로 투여되는데, 이는 일일당 0.1 내지 250 mg/kg 정도이다. 성인 인간에 대한 투여량 범위는 일반적으로 일일당 5 내지 17.5 g 정도이고, 바람직하게는 일일당 약 5 내지 약 10 g이며, 가장 바람직하게는 일일당 100 내지 3 g 정도이다. 이와 달리, 종양 세포 특이적 표면 마커에 결합하는 항체가 약물 전달의 도구로 사용될 수 있다. 예를 들어, 세포독성을 갖는 항체가 종양 세포를 공격하기 위하여 투여될 수 있다.
본 발명은 또한 WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1 또는 APCDD1 단백질 또는 그의 면역학적 활성을 갖는 단편 또는 상기 단백질 및 그의 단편 중의 어느 하나를 코딩하는 핵산을 투여하는 단계를 포함하는 항-종양 면역성을 유도하는 방법에 관한 것이다. WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1 또는 APCDD1 또는 그의 면역학적 활성을 갖는 단편은 세포 증식성 질환에 대한 백신으로 유용하다. 본 발명에서, 세포 증식성 질환에 대한 백신은 동물에 접종시켰을 때, 항-종양 면역성을 유발하는 효과를 가진 물질을 의미한다. 일반적으로, 항-종양 면역성에는 하기와 같은 면역반응이 포함된다:
- 종양에 대항하는 세포독성 임파구(cytotoxic lymphocyte)의 유도,
- 종양을 인식하는 항체의 유도, 및
- 항-종양 사이토카인(cytokine) 생산의 유도.
따라서, 특정 단백질의 동물로의 접종으로 상기 면역 반응 중 어느 하나가 유도될 때, 상기 단백질은 항-종양 면역성 유도 효과가 있다고 할 수 있다. 단백 질에 의한 상기 항-종양 면역성의 유도는 생체 내 또는 시험관 내에서 상기 단백질에 대한 숙주에서 면역계의 반응을 관찰함으로써 검출될 수 있다.
예를 들어, 세포독성 T 임파구의 유도를 검출하는 방법은 잘 알려져 있다. 생체(living body)로 진입된 외래 물질은 항원 제공 세포(antigen presenting cell, APC)의 활동에 의하여 T 세포 및 B 세포에 제공된다. APC에 의하여 항원 특이적 방법으로 제공된 항원과 반응하는 T 세포는 항원에 의한 자극에 의하여 세포독성 T 세포(또는 cytotoxic T lymphocyte, CTL)로 분화한 다음, 증식한다(이를 T 세포의 활성화라고 지칭한다). 따라서, 특정 펩티드에 의한 CTL 유도는 APC로 T 세포에 상기 펩티드를 제공하고, CTL의 유도를 검출함으로써 검정될 수 있다. 더 나아가, APC는 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 대식세포(macrophage), 호산백혈구(eosinophil)및 NK 세포를 활성화하는 효과를 가지고 있다. CD4+ T 세포 및 CD8+ 세포는 항-종양 면역성에서 중요한 역할을 하며, 상기 펩티드의 항-종양 면역성 유도작용은 이들 세포들의 활성화 효과를 지표로 사용하여 검정할 수 있다.
예를 들어, APC로 수지상세포(dendritic cell, DC)를 이용하여 CTL의 유도 작용을 측정하는 방법이 잘 알려져 있다. DC는 가장 강력한 CTL 유도 작용을 갖는 대표적인 APC이다. 상기 방법에서, 검사 대상의 폴리펩티드는 DC와 최초로 접촉된 다음, 상기 DC는 T 세포와 접촉된다. DC와의 접촉 후에 관심을 갖는 세포에 대한 세포독성 효과를 가진 T 세포의 검출은 검사 대상 폴리펩티드가 세포독성 T 세포를 유도하는 활성을 가졌음을 보여준다. 종양에 대한 CTL의 활성은 예를 들어, 지표 로 51Cr-표지 종양 세포의 용해를 이용하여 측정될 수 있다. 이와 달리, 지표로서 3H-티미딘(3H-thymidine) 흡수 활성 또는 LDH(lactose dehydrogenase)-방출을 이용하여 종양 세포의 손상의 정도를 측정하는 방법 또한 잘 알려져 있다.
APC는 DC로 제한되지는 않으며, 말초 혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)가 사용될 수 있다. 이 경우에, CTL의 유도는 GM-CSF 및 IL-4의 존재하에서 PBMC를 배양함으로써 향상될 수 있다는 보고가 있다. 유사하게, CTL은 열쇠구멍 삿갓조개 헤모시아닌(kehole limpet hemocyanin, KLH) 및 IL-7의 존재하에서 PBMC를 배양함으로써 유도될 수 있는 것으로 밝혀졌다.
상기 방법에 의하여 CTL 유도 활성을 가진 것으로 확인된 검사 대상 폴리펩티드는 DC 활성화 효과 및 그에 이은 CTL 유도 활성을 가진 폴리펩티드이다. 그러므로, 종양 세포에 대항하여 CTL을 유도하는 폴리펩티드는 종양에 대한 백신으로 유용한다. 아울러, 상기 폴리펩티드와 접촉함으로써 튜머에 대항하여 CTL을 유도하는 능력을 획득한 APC는 종양에 대한 백신으로 유용하다. 더 나아가, APC에 의하여 상기 단백질 항원의 제공에 따른 세포독성을 획득한 CTL또한 종양에 대한 백신으로 유용할 수 있다. APC 및 CTL에 기인한 항-종양 면역성을 이용하는 그러한 종양 치료방법 세포성 면역요법으로 지칭된다.
일반적으로, 세포성 면역요법을 위한 폴리펩티드를 이용할 때, CTL 유도의 효과는 다른 구조를 가진 다수의 폴리펩티드를 조합하고, 이를 DC에 접촉시킴으로써 증가되는 것으로 알려져 있다. 따라서, DC를 단백질 단편으로 자극하는 경우, 다양한 유형의 단편을 혼합하여 사용하는 것이 유리하다.
이와 달리, 폴리펩티드에 의한 항-종양 면역성의 유도는 종양에 대한 항체 생산의 유도를 측정함으로써 확인될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드에 대한 항체가 상기 폴리펩티드로 면역화된 실험 돌물에서 유도될 때, 그리고 종양 세포의 성장이 상기 항체에 의하여 억제될 때, 상기 폴리펩티드는 항-종양 면역성을 유발하는 능력을 가졌다.
항-종양 면역성은 본 발명의 백신을 투여함으로써 유도되고, 이는 HCC 또는 결장암의 치료 및 예방을 가능하게 한다. 암에 대한 치료 또는 암의 개시를 예방하는 효과는 하기의 단계, 예를 들어 악성 종양 세포의 성장에 대항하는 억제 활성, 암의 퇴화, 및 악성 종양의 발생의 억제 중 어느 하나에서 나타날 수 있다. 그렇지 않으면, 악성 종양을 갖는 개체의 사망률을 감소, 혈액에서 종양 마커의 감소, 암에 수반되는 진단가능한 증상의 완화 등등이 될 수 있다. 그러한 효과는 통계학적으로 유의한 것이 바람직한데, 예를 들어, 5% 또는 그 이하의 유의성 수준에서, 상기 백신을 투여하지 않은 대조군과 비교하여 악성 종양에 대한 치료효과 또는 암의 발생에 대한 예방적 효과가 관찰되는 것이 바람직하다. 예를 들어, 스튜던트의 t-검정법(Student's t-test), 맨-휘트니 U-검정법(Mann-Whitney U-test) 또는 ANOVA가 통계학적 분석에 사용될 수 있다.
면역학적 활성을 갖는 상기 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 벡터는 보조제와 함께 조합될 수 있다. 보조제는 상기 면역학적 활성을 갖는 단백질과 함께(또는 연속적으로) 투여되었을 때, 상기 단백질에 대한 면역반응을 향상시키는 화 합물을 지칭한다. 보조제의 예에는 콜레라 독소(cholera toxin), 살모넬라 톡신(salmonella toxin), 명반(alum) 등이 포함되나 특별히 이에 제한되는 것은 아니다. 아울러, 본 발명의 백신은 약학적으로 허용가능한 담체와 적절하게 조합될 수 있다. 그러한 담체의 예로는 증류수, 생리학적 염수, 인산 완충액, 배양액 등등이 포함된다. 더 나아가, 상기 담체에는 필요에 따라, 안정제, 현탁제, 보존제, 계면활성제 등이 포함될 수 있다. 상기 백신은 전신 또는 국부 투여된다. 백신 투여는 단일 투여되거나, 또는 다중 투여에 의하여 부양될 수도 있다.
본 발명의 백신으로 APC 또는 CTL을 사용할 때, 예를 들어 생체 외(ex vivo) 방법에 의하여 종양을 치료 또는 예방할 수 있다. 보다 상세하게, 치료 또는 예방조치를 받아야 하는 개체로부터 PBMC를 수집하고, 상기 세포를 생체 외에서 상기 폴리펩티드와 접촉시키고, APC 또는 CTL을 유도한 다음, 상기 세포를 상기 개체에 투여할 수 있다. APC는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 벡터를 PBMC에 생체 외에서 도입시킴으로써 유도될 수 있다. 시험관 내에서 유도된 APC 또는 CTL은 투여에 앞서 클로닝될 수 있다. 표적 세포에 손상을 줄 수 있는 높은 활성을 가진 세포를 클로닝하고 배양함으로써 세포성 면역요법은 보다 효과적으로 수행될 수 있다. 아울러, 상기 방법으로 분리된 APC 및 CTL은 상기 세포가 유래된 개체에 대하여만이 아니라, 다른 개체로부터의 유사한 유형의 종양에 대한 세포성 면역요법에 사용될 수 있다.
더 나아가, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드의 약학적으로 유효한 용량을 포함하는 암과 같은 세포 증식성 질환에 대한 치료 또는 예방을 위한 약학적 조성물 을 제공한다. 상기 약학적 조성물은 항 종양 면역성을 증가시키기 위하여 사용될 수 있다. WDRPUH 및 KRZFPUH의 정상적 발현은 고환, 태반 및 고환의 각각으로 제한되고, 그럼으로써, 상기 유전자의 억제는 다른 기관에 불리한 영향을 미치지 않을 수 있다. 따라서, 상기 WDRPUH 및 KRZFPUH 폴리펩티드는 세포 증식성 질환, 특히 HCC의 치료에 있어서 바람직하다.
하기의 실시예는 본 발명을 설명하고, 본 발명을 제조하고 사용하는 데 있어서 당업자에게 도움을 주기 위위하여 제시된다. 상기 실시예는 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 의도에서 기재된 것은 아니다.
다른 정의가 없는 한, 본 문서에서 사용된 모든 기술적이고 과학적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 공통적으로 이해되도록 동일한 의미를 갖는다. 본 문서에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 소재가 본 발명을 실시하거나 검정하기 위하여 사용될 수 있지만, 적절한 방법과 소재가 하기에 기재되어 있다. 본 문서에 인용된 어떠한 특허, 특허출원 및 간행물일지라도 본 문서에 참고문헌으로 삽입된다.
도 1a 내지 1d는 HCC에서의 WDRPUH 및 KRZFPUH의 발현을 나타낸다. 도 1a는 cDNA 마이크로어레이에 의하여 분석된 20 HCC(hepatocellular carcinoma) 임상 사례에서의 WDRPUH의 상대적 발현비율(종양/비종양)을 나타낸다. 기준치 필터(Cy3 및 Cy5 신호 양자모두 25,000 이상)를 통과한 12 HCC 임상 사례 중 11 사례에서 발 현이 상향 조절되었다(Cy3:Cy5 형광강도 비율 > 2.0). 도 1b는 20 HCC에서의 KRZFPUH의 상대적 발현비율(종양/비종양)을 나타낸다. 기준치 필터를 통과한 14 HCC 임상 사례 중 11 사례에서 발현이 상향 조절되었다(Cy3:Cy5 형광강도 비율 > 2.0). 도 1c 및 1d는 부가적인 10 HCC 임상 사례를 이용하여(T, 종양조직; N, 정상조직) 반-정량적(semi-quantitative) RT-PCR에 의하여 분석된 WDRPUH 및 KRZFPUH의 발현을 나타내는 사진을 나타낸다. 이때, GAPDH의 발현양상을 내부 대조군으로 사용하였다.
도 2a 및 2b는 다양한 인간 조직에서의 WDRPUH 발현양상 및 WDRPUH의 예상되는 단백질 구조 및 단백질 모티프를 나타낸다. 도 2a는 다중 조직 노던블롯 분석에 의하여 분석된 다양한 인간 조직에서의 WDRPUH의 발현양상을 나타내는 사진이다. 도 2b는 WDRPUH의 예상되는 단백질 구조를 나타낸다.
도 3은 pcDNA3.1myc/His-WDRPUH으로 형질감염된 SNU475 세포에 대하여, 항-myc 단클론성 항체 및 시각화를 위한 FITC 결합 항-생쥐 IgG 항체를 이용한 면역세포화학분석(immunocytochemistry) 결과, 관찰된 WDRPUH의 세포내 위치를 나타내는 사진이다. 핵은 DAPI로 대비염색하였다.
도 4a 및 4b는 NIH3T3 세포의 성장에 대한 WDRPUH의 영향을 나타낸다.
도 4a는 WDRPUH, WDRPUH에 대한 안티센스 및 벡터 자체로 형질감염된 NIH3T3 세포에서의 콜로니 형성 분석의 결과를 나타내는 사진이다. 도 4b는 전자 밀도계로 계수된 콜로니의 숫자를 나타낸다. (*)는 스튜던트의 t 검정법(Student's t test)에 의하여 결정된 대조세포와의 유의한 차이(p<0.05)를 의미한다.
도 5a 및 5b는 WDRPUH를 억제하기 위해 고안된 안티센스 S-올리고뉴클레티드의 성장 억제적 효과를 나타낸다. 도 5a는 센스(WDRPUH-S4) 또는 안티센스(WDRPUH-AS4) 올리고뉴클레오티드를 12시간 동안 처리한 SNU475세포에서의 WDRPUH 및 GAPDH(대조군)의 발현양상을 나타내는 사진이다. 도 5b는 올리고뉴클레오티드 처리 후 72시간 경과후 MTT 분석으로 측정한 SNU475 세포의 생존도를 나타낸다.
도 6a 및 6b는 WDRPUH-siRNA의 성장 억제적 효과를 나타낸다. 도 6a는 WDRPUH 및 GAPDH(대조군)의 발현을 나타내는 사진이다. 도 6b는 대조-siRNA 또는 WDRPUH-siRNA를 처리한 생존세포에 대한 김자 염색(Giemsa's staining) 결과를 나타내는 사진이다.
도 7은 FLAG-표지 WDRPUH 단백질을 항-WDRPUH 항체(#1, #2 및 #3), 프리-이뮨(pre-immune) 항체 및 항-FLAG 항체를 이용한 슬롯블롯 분석한 결과를 나타내는 사진이다.
도 8a 및 8b는 다양한 인간 조직에서 KRZFPUH의 발현양상 및 KRZFPUH의 예상되는 단백질 구조 및 단백질 모티프를 나타낸다. 도 8a는 다중 조직 노던블롯 분석(multiple yissue northern blot analysis)에 의하여 분석된 다양한 인간 조직에서의 KRZFPUH의 발현양상을 나타내는 사진이다. 도 2b는 KRZFPUH의 예상되는 단백질 구조를 나타낸다.
도 9는 pcDNA3.1myc/His-KRZFPUH으로 형질감염된 SNU475 세포에 대하여, 항-myc 단클론성 항체 및 시각화를 위한 로다민(Rhodamine) 결합 항-생쥐 IgG 항체를 이용한 면역세포화학분석(immunocytochemistry) 결과, 관찰된 KRZFPUH의 세포내 위 치를 나타내는 사진이다. 핵은 DAPI로 대비염색하였다.
도 10a 및 10b는 COS7 세포의 성장에 있어서의 KRZFPUH의 영향을 나타낸다. 도 10a는 KRZFPUH 및 KRZFPUH에 대한 안티센스로 형질감염된 COS7 세포에서의 콜로니 형성 분석의 결과를 나타내는 사진이다. 도 10b는 전자 밀도계로 계수된 콜로니의 숫자를 나타낸다. (*)는 스튜던트의 t 검정법에 의하여 결정된 대조세포와의 유의한 차이(p<0.05)를 의미한다.
도 11a 및 11b는 KRZFPUH를 억제하기 위해 고안된 안티센스 S-올리고뉴클레티드의 성장 억제적 효과를 나타낸다. 도 11a는 센스(KRZFPUH-S4) 또는 안티센스(KRZFPUH-AS4) 올리고뉴클레오티드로 형질감염된 알렉산더(Alexander) 세포에서의 WDRPUH 및 GAPDH(대조군)의 발현양상을 나타내는 사진이다. 도 11b는 KRZFPUH-S4 또는 KRZFPUH-AS4를 12시간 처리한 SNU475 세포에서의 KRZFPUH의 발현양상을 나타낸다. (*)는 스튜던트의 t 검정법에 의하여 결정된 대조세포와의 유의한 차이(p<0.05)를 의미한다.
도 12a 내지 12d는 Huh7 세포에서의 KRZFPUH의 발현에 대한 KRZFPUH-siRNA의 성장 억제적 효과를 나타낸다. 도 12a는 psiU6BX-KRZFPUH2 (Si-02), psiU6BX-EGFP(EGFP) 또는 공 벡터(Mock)로 형질감염된 Huh7 세포로부터 추출한 RNA를 이용하여 수행한 반-정량적(semiquantitive) RT-PCR의 결과를 나타낸다. 도 12b는 형질감염 5일째에 대조군 플라스미드(Mock 및 EGF) 또는 KRZFPUH-siRNA를 발현하는 플라스미드로 형질감염된 세포의 생존도를 MTT 분석으로 분석한 결과를 나타낸다. (*)는 피셔의 보호 최소 유의차 검정법(Fisher's protected least significant difference test)에 의하여 결정된 유의한 차이(p<0.01)를 의미한다. 도 12c는 형질감염 10일째에 대조군 플라스미드(Mock 및 EGF) 또는 KRZFPUH-siRNA를 발현하는 플라스미드로 형질감염된 세포의 생존도를 MTT 분석으로 분석한 결과를 나타낸다. (*)는 피셔의 보호 최소 유의차 검정법(Fisher's protected least significant defference test)에 의하여 결정된 유의한 차이(p<0.01)를 의미한다. 도 12d는 형질감염 10일째에 대조군 플라스미드(Mock 및 EGF) 또는 KRZFPUH-siRNA를 발현하는 플라스미드로 형질감염된 세포에 대한 김자 염색의 결과를 나타내는 사진이다.
도 13a 내지 13c는 다양한 세포에서의 생존도에 대한 KRZFPUH-siRNA의 효과를 나타낸다. 도 13a는 형질감염 10일째에 대조군 벡터(Mock 및 EGFP) 또는 psiU6BX-KRZFPUH2(Si-02)로 형질감염된 알렉산더 세포를 이용하여 수행된 MTT 분석의 결과를 나타낸다. 도 13b는 형질감염 10일째에 대조군 벡터(Mock 및 EGFP) 또는 psiU6BX-KRZFPUH2(Si-02)로 형질감염된 SNU449 세포를 이용하여 수행된 MTT 분석의 결과를 나타낸다. 도 13c는 MTT 분석에 의하여 측정된 HepG2 세포의 생존도에 대한 KRZFPUH-siRNA의 영향을 나타낸다. (*)는 피셔의 보호 최소 유의차 검정법에 의하여 결정된 유의한 차이(p<0.01)를 의미한다.
도 14a 및 14b는 결장암에서의 PPIL1의 발현양상을 나타낸다. 도 14a는 cDNA 마이크로어레이로 분석한 11건의 결장암 임상사례에서 PPIL1의 상대적 발현비율(종양/비종양)를 나타낸다. 기준치 필터를 통과한 6사례 중 6건에서 그 발현이 상향조절되었다(Cy3:Cy5 형광강도 비율 > 2.0). 도 14b는 추가적인 20건의 결장암 임상 사례(T, 종양조직; N, 정상조직)를 이용한 반-정량적 RT-PCR에 의해 분석된 PPIL1의 발현양상을 나타내는 사진이다. 이때, GAPDH의 발현양상을 내부 대조군으로 사용하였다.
도 15는 PPIL1(Homo sapiens), Ppil1(Mus musculus), Cyp2 (Schzosaccharomyces pombe) 및 CypE(Dictiostelium discoideum) 사이의 유사성을 나타낸다.
도 16은 NIH3T3 및 HCT116의 세포성장에 대한 PPIL1의 영향을 나타낸다. 도 16a는 PPIL1으로 형질감염된 NIH3T3 세포에 대한 콜로니 형성 분석의 결과를 나타내는 사진이다. 도 16b는 PPIL1으로 형질감염된 HCT116 세포에 대한 콜로니 형성 분석의 결과를 나타내는 사진이다. 양 실험에서, pcDNA-LacZ 및 PPIL1의 코딩지역의 상보적 가닥을 발현하는 pcDNA3.1-antisense를 음성대조군으로 사용하였다.
도 17 내지 17c는 인간 결장암 세포주인 SW480에서의 PPIL1의 안티센스 S-올리고뉴클레오티드의 성장 억제적 효과를 나타낸다. 도 17a는 센스(PPIL1-S2), 안티센스(PPIL1-AS2) 또는 스크램블(scramble, PPIL1-SCR2) S-올리고뉴클레오티드로 형질감염된 SW480 세포에서의 PPIL1 및 GAPDH(대조군)의 발현양상을 나타내는 사진이다. 도 17b는 PPIL1-AS2의 성장억제적 효과를 나타내는 사진이다. 도 17c는 MTT 분석에 의하여 측정한 올리고뉴클레오티드 처리 후 72시간 경과한 SE480, SNUC4 및 SNUC5 세포의 생존도를 나타낸다.
도 18은 시험관내에서 PPIL1이 SNW1과 결합하는 것을 묘사하는 사진이다. COS7 세포를 pFLAG CMV-PPIL1 및 pcDNA3.1myc/His-SNW1로 공 형질감염시켰다. 상기 세포로부터 용혈체를 항-c-Myc 다클론성 항체 또는 항-FLAG 단클론성 항체로 면 역침강법시킨 다음, 각각 항-FLAG 단클론성 항체 또는 항 c-Myc 다클론성 항체로 면역블롯을 수행하였다.
도 19는 FLAG-표지 PPIL1 및 myc-표지 SNW1 단백질의 세포내 위치를 나타내는 사진이다. 상기 도면에서, a는 pFLAG-CMV-PPIL1으로 형질감염되고 항-FLAG M2 단클론성 항체로 염색된 COS7 세포에 대한 사진이다. 상기 표지된 단백질은 로다민으로 표지된 항-생쥐 IgG 항체로 시각화되었다. b는 pcDNA3.1myc/His-SNW1으로 형질감염되고 항-Myc 항체로 염색된 COS7 세포에 대한 사진이다. 상기 표지된 단백질은 FITC로 표지된 항-토끼 IgG 항체로 시각화되었다. c는 핵을 DAPI로 대비염색한 상기 세포에 대한 사진이다. d는 a, b 및 c를 병합한 이미지이다. PPIL1 및 SNW1이 핵내에서 동위치에 존재하였다.
도 20은 다중-조직 노던블롯 분석으로 분석한 다양한 조직에서의 PPIL1의 발현양상을 나타내는 사진이다.
도 21a 및 21b는 SNUC4 및 SNUC5 세포에서의 PPIL1-siRNA의 성장 억제적 효과를 나타낸다. 도 21a는 PPIL1-siRNA로 형질감염된 SNUC4 및 SNUC5 세포에서 PPIL1 및 GAPDH(대조군)의 발현양상을 나타내는 사진이다. 도 21b는 대조군-siRNA 또는 PPIL1-siRNA로 처리된 다양한 세포에 대한 김자 염색 결과를 나타내는 사진이다.
도 22a 및 22b는 E. coli에서의 PPIL1 재조합 단백질의 발현양상을 나타낸다. 도 22a는 GST-융합 PPIL1 단백질의 발현양상을 나타내는 사진이다. 도 22b는 His-표지 PPIL1 단백질의 발현양상을 나타내는 사진이다.
도 23a 및 23b는 효모 이중-하이브리드 시스템(two-hybrid system)에서 PPIL1 및 스타트민(stathmin) 사이의 상호작용을 나타낸다. 도 23a는 상기 이중-하이브리드 시스템에서 PPIL1의 스타트민과의 상호작용을 나타내는 사진이다. 도 23b는 생체 내에서 PPIL1의 스타트민과의 상호작용을 나타내는 사진이다.
도 24는 pFLAG-PPIL1 and pCMV-HA-STMN로 공 형질감염된 COS7의 세포질에서 PPIL1 및 스타트민의 동위치 존재를 나타낸다. 도 24는 COS7 세포의 세포질에서의 PPIL1 및 스타트민의 형광 면역조직화학 염색(immunohistochemical staining)의 결과를 나타내는 사진이다.
도 25a 및 25b는 생체 내에서 PPIL1과 스타트민의 다양한 삭제 돌연변이와의 상호작용을 나타낸다. 도 25a는 스타트민의 다양한 삭제 돌연변이의 구조를 나타내는 개요도이다. 도 25b는 생체 내에서 스타트민의 발현과 삭제 돌연변이와 PPIL1과의 공-침전(co-precipitation)을 나타내는 사진이다.
도 26a 및 26b는 생체 내에서 돌연변이 스타트민의 발현과 PPIL1과의 상호작용을 나타낸다. 도 26a는 세린이 알라닌으로 치환된 스타트민 돌연변이에 대한 개요도이다. 도 26b는 생체 내에서 스타트민의 발현과 돌연변이와 PPIL1과의 공-침전을 나타내는 사진이다.
도 27a 내지 27c는 APCDD1의 발현을 보여주는 사진이다. 도 27a는 Ad-APC 또는 Ad-Axin으로 형질감염된 SW480 세포에서 APCDD1의 발현의 감소를 보여주는 사진이다. RNA 및 단백질 추출물을 MOI100에서 상기 아데노바이러스로 감염시키고 72시간 동안 배양한 SW480 세포로부터 분리하였다. 도 27b는 노던블롯 분석으로 분석한 성인 인체 조직에서의 APCDD1의 발현양상을 나타내는 사진이다. APCDD1은 심장, 췌장, 전립선 및 난소에서 현저하게 발현되는 반면, 폐, 간, 신장, 비장, 흉선, 결장 및 혈구세포에서는 거의 발현되지 않았다. 도 27c는 반-정량적 RT-PCR로 조사한 결장암 조직(T) 및 이에 상응하는 비-종양성 점막 조직(N)에서의 APCDD1의 발현양상을 나타내는 사진이다. 30건의 임상 사례 중 20 사례(67%)에서 발현이 증가하였다. 이때, GAPDH의 발현양상을 내부 대조군으로 사용하였다.
도 28은 APCDD1를 발현하는 다양한 플라스미드를 이용하여 수행한 리포터 분석의 결과를 나타낸다. 도 28a는 APCDD1의 5' 인접부위의 잠재적 Tcf4-결합 요소 및 APCDD1의 다양한 리포터 플라스미드를 나타내는 개요도이다. 잠재적 전사-개시부위로부터의 핵산의 위치를 양수 또는 음수로 표시하였다. 도 28b는 상기 리포터 플라스미드 및 발현 플라스미드(pcDNa-mock, pcDNA-mut β-catenin, pcDNA-wtTcf-4 또는 pcDNA-dnTcf4)를 다양한 조합으로 공-형질감염시킨 HeLa 세포의 루시퍼라제 활성을 나타낸다. 상기 리포터 분석은 형질감연 48시간 후 세번 반복하여 수행하였다. 막대는 표준편차를 의미하고, (*)는 쉐페의 F 검정법(Scheffe's F test)에 의하여 결정된 유의한 차이(p<0.01)를 의미한다.
도 29는 TBM1 또는 TBM2 중 어느 하나를 포함하는 요소(element)와 베타-카테닌(β-catenin)/Tcf4 복합체와의 상호작용을 나타내는 사진이다. 상기 복합체를 나타내는 밴드의 초이동(supershift)이 항-베타-카테닌 항체를 첨가한 후에 관찰된 반면(2열), 항-p53 항체를 첨가한 후에는 상기 밴드의 초이동이 관찰되지 않았다(3열). Tcf4-프로브 및 베타-카테닌/Tcf4-프로브에 상응하는 밴드는 비표지된 자연형 프로브의 첨가로 인하여 특이적으로 차단되었다(5열).
도 30은 시험관 내 조건에서의 LoVo 세포의 성장에 대한 APCDD1의 영향을 나타낸다. 도 30a는 LoVo 세포에서의 콜로니 형성 분석의 결과를 보여주는 사진이다. 상기 세포를 pcDNA3.1-APCDD1, pcDNA 또는 pcDNA-antisense로 형질감염시켰다. 도 30b는 외래 APCDD1를 발현하는 LoVo 세포(LoVo-APCDD1) 및 대조군(LoVo-vector) 세포에서의 APCDD1의 발현양상을 나타내는 사진이다. 도 30c는 LoVo-APCDD1 및 LoVo-vector의 성장을 나타낸다. 도 30d는 누드 생쥐에서 LoVo-APCDD1 세포의 두 클론 및 LoVo-vector 세포의 두 클론에서의 종양의 성장을 나타낸다.
도 31a 내지 31c는 APCDD1의 발현을 감소시키기 위하여 고안된 안티센스 S-올리고뉴클레오티드의 성장 억제 효과를 나타낸다. 도 31a는 센스(APCDD-S2) 또는 안티센스(APCDD-AS2) S-올리고뉴클레오티드로 24시간 동안 처리한 SW480 세포에서의 APCCD1의 발현양상을 나타낸다. 이때, GAPDH의 발현양상을 내부 대조군으로 사용하였다. 도 31b는 APCDD-AS2의 성장 억제적 효과를 나타내는 사진이다. 도 31c는 MTT 분석으로 조사한 올리고뉴클레오티드 처리후의 SW480 세포의 생존도를 타타낸다. 막대는 표준편차를 의미하고, (*)는 쉐페의 F 검정법에 의하여 결정된 유의한 차이(p<0.01)를 의미한다.
도 32는 APCDD1 단독 또는 pFLAG-APCDD1와 함께 형질감염시킨 COS7 세포 및 결장암 세포주에 대한 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타내는 사진이다.
도 33은 SW480 세포주에서 APCDD1의 세포내 위치를 나타내는 사진이다.
도 34는 비종양성 점막조직(mucosa, A) 및 결장의 악성선암(adonocarcinoa, B)에서의 APCDD1의 형광 면역조직화학 염색(immunohistochemical staining) 결과를 나타내는 사진이다.
도 35는 결장암 조직에서의 APCDD1의 면역조직화학 염색 결과를 나타내는 사진이다.
도 36은 콜론의 선종(adenoma)에서의 APCDD1의 면역조직화학 염색 결과를 나타내는 사진이다.
본 발명의 최상의 실시예
본 발명은 다음의 실시예에서 상세히 기술되어 있으나 본 발명이 이 실시예만으로 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 간세포암에서 발현이 상향 조절되는 신규 유전자인 WDRPUH 과 KRZFDUH 동정
23040가지 유전자를 포함하는 내부 게놈 전영역 cDNA 마이크로어레이(in-house genome-wide cDNA microarray)를 이용하여 20 명 간세포암 임상사례의 유전자 발현양상을 이에 상응하는 정상 간 조직에서의 발현양상과 비교하였다. 보다 구체적으로, 간세포암 조직 및 이에 상응하는 비종양성 조직은 충분한 고지 후에 동의를 얻어 수술 받은 환자의 수술 표본으로부터 수득하였다. 제조사 프로토콜에 따라 Qiagen RNeasy 키트(Qiagen) 또는 Trizol(Life Technologies)를 이용하여 미 세절개한 조직으로부터 총 RNA를 추출하였다. 추출한 총 RNA는 DNase I을 처리하고 Ampliscribe T7 Transcription Kit(Epicentre Technologies)로 증폭하여 역전사가 일어나는 동안 Cy-염료(Amersham)로 표지되도록 하였다. Cy5 과 Cy3은 정상 조직 및 암조직의 각각의 RNA를 표지하기 위하여 사용하였다. 그런 다음, 오노 등의 방법(Ono et al., Cancer Res., 60:5007-11, 2000)에 따라 혼성화, 세척 및 검출을 수행하였다. 각각의 표적 부위에서 Cy5 및 Cy3의 형광강도는 Array Vision software(Amersham Pharmacia)를 사용하여 측정하였다. 두 세트를 측정하고 각각의 표적 부위에서 탐지된 형광 강도로부터 배경 신호를 없앤 후에 그 평균을 계산하였다. 이어, 슬라이드 상에서 검출되는 모든 형광 강도를 52개의 하우스키핑(housekeeping) 유전자(세포 생존에 필수적인 단백질을 코드하여 발현량이 크게 변하지 않는 유전자)의 평균 Cy5 및 Cy3 강도에 맞추도록 표준화시켰다. Cy3 및 Cy5 둘 다에 대해 25000 유니트 이하의 강도를 갖는 유전자는 이후의 실험에서 제외하였고 Cy3/Cy5 신호비율이 2.0보다 큰 유전자를 이후의 실험을 위해 선택하였다.
일반적으로 간세포암에서 발현이 상향 조절되는 유전자 중에서 UniGene cluster(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/)의 EST (Hs. 122614)에 해당하는 in-house accession number D3197을 가진 유전자는 비종양성 간 조직에 해당하는 부분과 비교할 때 20건의 간세포암 임상사례 중 11건에서 발현이 증가하였다(도 1 a). 상기 유전자는 WD40 반복서열을 가진 단백질을 코딩하는 개방 판독틀을 포함하고 WDRPUH(WD40 repeats protein up-regulated in HCCs)로 명명된다. WDRPUH는 또한 위암 환자 2명 중 1명에서 발현이 상향조절되었다. 더 나아가 내부 접근번호 (in-house accession number) C6242(EST Hs. 58461)를 갖는 유전자는 비종양성 간 조직 부분과 비교할 때, 14건의 간세포암 임상사례 중 11건에서 발현이 상향 조절되는 것으로 탐지되었고(도 1b), 징크 핑거 모티프(zinc finger motif를 포함하는 단백질을 코딩하므로 KRZFPUH(Kruppel-type zinc finger protein up-regulated in HCC)라 명명되었다. KRZFPUH는 또한 모든 테스트한 위암 임상사례(2 사례) 및 36건의 폐암 임상사례 중 2건에서 발현이 상향 조절되었다.
이어서 또 다른 10건의 간세포암 임상사례에서의 WDRPUH 과 KRZFPUH의 발현이 증가했는지 확인하기 위하여 반-정량적 RT-PCR(semi-quantitative RT-PCR)을 수행하였다(도 1c 및 d). 구체적으로, 제조사의 프로토콜에 따라 Qiagen RNeasy 키트(Qiagen) 또는 Trizol(Life Technologies)로 총 RNA를 추출하였다. 10 ㎍의 총 RNA는 다중dT12-18 프라이머(Amersham Pharmacia Biotech)와 Superscript II 역전사 효소(Life Technologies)를 이용하여 cDNA로 역전사하였다. 수득한 단일가닥 cDNA는 20 ml의 PCR 완충용액(TaKaRa)에 희석하였다. 이어, 하기의 프라이머를 사용하여 표준 RT-PCR에 의하여 PCR 증폭을 실시하였다:
WDRPUH
정방향 프라이머: 5'-CAGGTGGAAATGACCATCTGGTCAAAG-3'(서열번호 9) 및
역방향 프라이머: 5'-CATCAGCTTCAGGAGGTATATGGTAC-3'(서열번호 10); 및
KRZFPUH
정방향 프라이머: 5'-GTGGCACTGTGGTGTTACCTTAT-3'(서열번호 11) 및
역방향 프라이머: 5'-CCTCTAAACCTTTGCCTACGACT-3'(서열번호 12).
하기의 조건 하에서 GeneAmp PCR 시스템 9700(Perkin-Elmer)을 사용하여 증폭을 실시하였다:
94℃에서 4분간 변성; 94℃ 에서 30초, 56℃에서 30초 및 72℃에서 45초로 35사이클.
실시예 2: 신규한 인간 유전자 WDRPUH 의 발현, 분리 및 분석
다음으로, WDRPUH 의 PCR 산물을 프로브로 사용하여 다중-조직 노던 블롯 분석(multiple-tissue northern blot analysis)을 수행하였다. 보다 상세하게, 인간 다중-조직 블롯(human multiple-tissue blots, Clontech)을 32P로 표지한 WDRPUH의 PCR 산물과 혼성화시켰다. 공급자의 권고에 따라 예비-혼성화(Pre-hybridization), 혼성화 및 세척을 수행하였다. 상기 블롯은 -80℃로 24 내지 72 시간 동안 증감지(intensifying screens)로 자기방사 이미지(autoradiography)를 수득하였다. 그 결과, 2-kb 전사체가 고환에서 많이 발현되는 것으로 탐지되었다(도 2a). D3197이 노던 블롯 분석에서 탐지된 WDRPUH cDNA 보다 작기 때문에 다음으로 본 발명자들은 WDRPUH cDNA 의 5' 서열을 확인하였다. 먼저 염색체 밴드 17p13에 위치한 코스미드(cosmid) 서열(GenBank Accession No. AC026855)을 찾기 위해서 D3197에 해당하는 게놈서열을 BLAST 프로그램을 사용하여 게놈 데이터베이스(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)에서 찾았다. 유전자 인식 및 연결 인터 넷 링크 프로그램(Gene Recognition and Assembly Internet Link program)인 GENSCAN을 사용하여 게놈 서열의 후보-엑손 서열을 예측하고 예측한 엑손 서열을 연결하였다. 그런 다음, 5'-RACE(5' rapid amplification of cDNA ends)를 다음과 같이 실시하였다: 5' RACE는 제조사의 지시에 따라 cDNA 제조키트(Marathon cDNA amplification kit, Clontech)를 사용하여 수행하였다. WDRPUH의 5' 부분은 유전자 특이적인 역방향 프라이머인 5'-TTACCGTCGTTCCATGCTGAAATGATGC-3'(서열번호 13) 와 상기 키트 내의 AP-1 프라이머를 사용하여 제조하였다. cDNA 주형은 인간 고환 mRNA(Clontech)로부터 합성하였고 증폭된 산물은 염기서열 분석기(ABI PRISM 3700 DNA sequencer, Applied Biosystems)로 서열을 결정하기 위하여 TA 클로닝 키트(Invitrogen)을 사용하여 클로닝하였다. 결정된 서열은 620개의 아미노산 잔기로 이루어진 단백질(GenBank Accession No. AB065281)을 코딩하는 1860개의 뉴클레오타이드로 이루어진 개방 판독틀을 포함하는 2152개의 뉴클레오타이드로 구성되었다. 단백질 구조분석 프로그램(Simple Modular Architecture Research Tool, SMART, http://smart.embl-heidelberg.de)으로 단백질 모티프를 찾은 결과 11개의 WD40 반복 도메인이 있음을 확인하였다(Fig. 2b). 확정된 WDRPUH의 핵산서열과 이로부터 예측한 아미노산 서열을 서열번호 1과 2로 각각 표시하였다.
실시예 3: WDRPUH의 세포내 위치
WDRPUH 에 해당하는 전체 코딩 부위를 하기의 유전자 특이적인 프라이머 세트를 사용하여 증폭하였다:
5'-GGGGTACCACCATGGATAACAAAATTTCGCCGGAG-3'(서열번호 14) 및
5'-CGGAATTCTCAGGAGGTATATGGGTACTTCCATGC-3'(서열번호 15).
상기 PCR 반응 산물을 pcDNA3.1myc/His 벡터(Invitrogen)로 클로닝하였다. 그런 다음, 상기반응으로 제조된 재조합 벡터 pcDNA3.1myc/His-WDRPUH로 SNU475 세포(Korea cell-line bank)를 일시적으로 형질감염시키고, 상기 형질감염된 세포는 RPMI1640에서 배양하였다. 상기 형질감염된 세포들은 4% 파라포름알데히드를 포함한 PBS에 15분 동안 고정하고, 상온에서 2.5분 동안 0.1% Triton X-100을 포함하는 PBS로 처리하여 침투화시켰다. 이어서, 상기 세포들을 2% BSA를 포함한 PBS로 4℃에서 24시간 동안 침지하여, 비-특이적인 혼성화를 방지하였다. 1:1000으로 희석된 생쥐 항-myc 단일클론 항체(Sigma)를 면역세포화학적 염색(immunocytochemical staining)을 위한 일차항체로 사용하였고, 이를 로다민(Rhodamine)-결합 항-생쥐 이차항체(Leinco and ICN)와 함께 정온배치하여 반응 결과를 시각화하였다. 핵은 DAPI(4',6'-diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride)로 대비염색(counter-stain)하였다. ECLIPSE E800 현미경 하에서 형광이미지를 수득하였다. 그 결과 표지된 WDRPUH 단백질이 세포의 세포질 내에 존재하는 것으로 밝혀졌다(도 3).
실시예 4: WDRPUH 이 세포 성장에 미치는 영향
WDRPUH이 세포 성장에 미치는 영향을 확인하기 위하여, NIH3T3 세포(ATCC, Rockville, MD)를 WDRPUH(pcDNA-WDRPUH)를 발현하는 플라스미드로 형질전환시켜 콜로니 형성 분석(colony formation assay)을 수행하였다. 구체적으로 WDRPUH에 해 당하는 전체 코딩 부위를 실시예 3에서와 같이 증폭하고 pcDNA3.1(Invitrogen)으로 클로닝하였다. 세포들은 pcDNA-WDRPUH 플라스미드, 대조군 플라스미드(mock), 및 WDRPUH의 상보적인 가닥을 발현하는 플라스미드(pcDNA-antisense)로 각각 형질전환시켰다. 형질전환된 세포들은 10 내지 12일 동안 적당한 농도의 제네티신(geneticin)을 첨가한 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)에 배양하였다. 그런 다음, 세포들은 100% 메탄올로 고정하고 김자 용액(Giemsa solution)으로 염색하였다. 모든 실험은 3회 반복하여 수행하였다.
그 결과 대조군 플라스미드(mock) 또는 pcDNA-안티센스와 비교할 때, pcDNA-WDRPUH으로 형질전환된 세포에서 현저하게 많은 콜로니가 생성되었다(도4a 및b). 스튜던트의 t 검정법(Student's t test)에 따른 통계분석을 실시하여 유의한 차이를 측정하였다.
실시예 5: WDRPUH 의 발현을 감소시키는 안티센스 S-올리고뉴클레오티드에 의한 간세포암 세포의 성장 억제
WDRPUH의 억제 결과 간세포암 세포의 성장 지체 및/또는 세포 사멸이 일어나는지 확인하기 위하여, WDRPUH의 발현을 억제하는 다양한 안티센스 S-올리고뉴클레오티드를 합성하였다. 10-cm 배양접시에 도말한(2x105 세포/접시) SNU475 세포(Korea cell-line bank)를 LIPOFECTIN(GIBCO BRL)을 사용하여 WDRPUH(WDRPUH-AS4; 5'-GGCCTCACCATTGAAG-3', 서열번호 16)의 첫번째 엑손-인트론 경계를 포함하는 안 티센스 S-올리고뉴클레오티드 또는 대조군 S-올리고뉴클레오티드(WDRPUH-S4; 5'-CTTCAATGGTGAGGCC-3', 서열번호 17)로 형질전환시켰다; 이를 적당한 농도의 제네티신을 첨가한 RPMI1 640에서 6일에서 12일 동안 배양하였다. 세포들은 RT-PCR과 웨스턴 블롯 분석을 이용하여 WDRPUH와 GAPDH의 발현을 분석하였다.
WDRPUH-AS4을 형질전환시킴으로써 대조군(WDRPUH-S4)에 비해 WDRPUH의 세포내 발현이 상당히 감소하였다(도 5a).
다음으로, 100 mm 배양접시에 접시당 5 x105 세포의 밀도로 SNU475 세포를 도말하여 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 분석을 수행하였다. 센스 또는 WDRPUH를 억제하는 안티센스 S-올리고뉴클레오티드로 세포를 각각 3회 형질전환시켰다. 72 시간동안 배양한 다음, 배지를 500 ㎎/㎖의 MTT(Sigma)를 함유한 신선한 배지로 바꾸고, 섭씨 37도에서 4시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 세포들은 0.01 N HCl/10% SDS 1 ㎖를 첨가하여 용해시켰다. 반응결과 나타난 색상은 570 nm 파장에서 ELISA 플레이트 판독기로 정량하였다(기준 파장 630 nm). 세포 생존율은 대조군과 흡광도를 비교하여 나타내었다
RT-PCR에 의한 상기 분석과 유사하게, WDRPUH-AS4로 형질전환시킨 결과 WDRPUH-S4(도 5b)로 형질전환시킨 세포와 비교할 때, 살아 있는 세포의 수가 상당히 줄어들었다. 이는 WDRPUH가 간세포암 세포의 성장 및/또는 생존에 있어 중요한 역할을 한다는 것을 암시한다. 상기 결과는 세 가지 실험에 의해 검증되었다.
실시예6: WDRPUH siRNA를 발현하는 플라스미드의 제조와 상기 플라스미드가 간세포암 세포의 성장에 미치는 영향
포유류 세포에서 티미딘(thymidine)이나 유리딘(uridine)의 19개의 상보적인 뉴클레오타이드와 3'-말단에 상보적인 이합체를 가지고 있는 20 내지 21-머의 두 가닥의 RNA로 구성된 siRNA(short interfering RNA)가 최근 유전자 발현시 전체적인 변화(global change)를 유발하지 않고, 유전자 특이적인 유전자 침묵 효과(silencing effect)를 가지고 있는 것으로 나타났다. 그러므로, 본 발명자들은 다양한 WDRPUH-siRNA를 발현하는 플라스미드를 제작하고 상기 플라스미드가 WDRPUH의 발현에 미치는 영향을 알아보았다.
먼저, psiH1BX3.0 벡터를 다음과 같이 제작하였다. H1RNA 유전자는 RNA 중합효소 III에 의해 전사되어 3'-말단에 유리딘을 갖는 전사체를 생성한다고 보고되어 있다. 프로모터 부위를 포함한 H1RNA 유전자의 게놈 단편을 다음과 같은 프라이머 세트를 사용하여 PCR로 증폭하였다:
5'-TGGTAGCCAAGTGCAGGTTATA-3'(서열번호 18) 및
5'-CCAAAGGGTTTCTGCAGTTTCA-3'(서열번호 19).
그리고 인간 태반 DNA를 주형으로 사용하였다. PCR 산물은 순수분리하고 TA 클로닝 키트(Invitrogen)를 이용하여 공급자의 프로토콜에 따라 pCR2.0 플라스미드 벡터로 클로닝하였다. H1RNA 유전자를 포함하는 단편은 하기의 프라이머를 사용하여PCR에 의해 증폭되었다:
5'-TGCGGATCCAGAGCAGATTGTACTGAGAGT-3'(서열번호 20) 및
5'-CTCTATCTCGAGTGAGGCGGAAAGAACCA-3'(서열번호 21).
그리고 BamH I 와 Xho I 제한효소로 절단되고 순수분리되었다. 그리고나서 H1RNA유전자를 포함하는 순수분리된 BamH I-Xho I 단편은 pcDNA3.1(+) (Invitrogen)의 1257 내지 56 위치의 단편에 클로닝되었다. 결찰된 DNA는 하기의 프라이머와 함께 PCR을 위한 주형으로 사용되었다:
5'-TTTAAGCTTGAAGACCATTTTTGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAC-3'(서열번호 22) 및
5'-TTTAAGCTTGAAGACATGGGAAAGAGTGGTCTCA-3'(서열번호 23).
상기 PCR 산물은 Hind III으로 절단한 다음, 자가-결찰(self-ligated)시켜 psiH1BX3.0 벡터 플러스미드를 제조하였다.
대조군 플라스미드와 WDRPUH-siRNA를 발현하는 플라스미드는 두 가닥의 올리고뉴클레오티드를 psiH1BX3.0 벡터의 Bbs I 부위로 클로닝하여 제조하였다. 벡터에 클로닝된 올리고뉴클레오티드는 다음과 같다:
psiH1BX-WDRPUH01,
5'-CACCAATGTGATCTTCTCCAGGTGCTTCAAGAGAGCACCTGGAGAAGATCACATT-3'(서열번호 24) 및
5'-AAAAAATGTGATCTTCTCCAGGTGCTCTCTTGAAGCACCTGGAGAAGATCACATT-3'(서열번호 25);
psiH1BX-WDRPUH02,
5'-CACCAAGGACACCAGTTTCTCGTAGTTCAAGAGACTACGAGAAACTGGTGTCCTT-3'(서열번호 26) 및
5'-AAAAAAGGACACCAGTTTCTCGTAGTCTCTTGAACTACGAGAAACTGGTGTCCTT-3'(서열번호 27);
psiH1BX-WDRPUH03,
5'-CACCAAAGAGACGCTCATAGCGACTTTCAAGAGAAGTCGCTATGAGCGTCTCTTT-3'(서열번호 28) 및
5'-AAAAAAAGAGACGCTCATAGCGACTTCTCTTGAAAGTCGCTATGAGCGTCTCTTT-3'(서열번호 29);
psiH1BX-WDRPUH05,
5'-CACCAACGACGGTAAAATCCGAGCCTTCAAGAGAGGCTCGGATTTTACCGTCGTT-3'(서열번호 30) 및
5'-AAAAAACGACGGTAAAATCCGAGCCTCTCTTGAAGGCTCGGATTTTACCGTCGTT-3'(서열번호 31); 및
대조군 psiH1BX-EGFP(mock),
5'-CACCGAAGCAGCACGACTTCTTCTTCAAGAGAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC-3'(서열번호 32) 및
5'-AAAAGAAGCAGCACGACTTCTTCTCTCTTGAAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC-3'(서열번호 33).
상기의 각 서열 중 siRNA의 표적 서열은 밑줄로 표시하였다.
공급자의 프로토콜에 따라 FuGENE6(Roche)를 사용하여 HepG2세포를 상기 플라스미드들로 형질감염시켰다. 총 RNA는 형질감염 후 48시간 만에 추출하였다.
그 결과, 상기 벡터 가운데 psiHBX-WDRPUH01는 세포에서의 WDRPUH의 발현을 유의하게 억제하였으나, psiH1BX-WDRPUH02, psiH1BX-WDRPUH03 또는 psiH1BX-WDRPUH05는 그러하지 아니하였다(도6a). WDRPUH의 억제가 간세포암 세포의 성장 억제를 유발하는지 알아보기 위하여, HepG2 세포를 psiH1BX-WDRPUH01, psiH1BX-WDRPUH02, psiH1BX-WDRPUH03 또는 psiH1BX-WDRPUH05, 또는 대조군 벡터로 psiH1BX-EGFP로 형질감염시켰다.
psiH1BX-WDRPUH01로 형질감염된 세포는 psiH1BX-WDRPUH02, psiH1BX-WDRPUH03, psiH1BX-WDRPUH05 또는 psiH1BX-WDRPUH05 또는 대조군으로 siH1BX-EGFP 으로 형질감염된 세포들에 비하여 살아있는 세포가 현저히 줄어들었다. 이는 WDRPUH의 발현 감소가 간세포암 세포의 성장을 억제한다는 것을 나타낸다(도 6b).
실시예 7: 항-WDRPUH 항체 제조
WDRPUH의 발현을 확인하고 WDRPUH의 작용을 알아보기 위하여 WDRPUH에 대한 다클론성 항체를 다음과 같이 제조하였다.
먼저, His로 표지된 재조합 WDRPUH를 대장균에서 생산하고 제조사의 프로토콜에 따라 Pro BondTM histidine Resin(Invitrogen)를 사용하여 세포로부터 순수분리하였다. 재조합 단백질은 래빗을 면역시키는데 사용되었다. WDRPUH에 대한 다중클론 항체는 혈청에서 순수분리되었다.
항-WDRPUH 혈청으로 면역블롯 분석을 수행한 결과, 70 kD 크기의 FLAG-표지 WDRPUH의 밴드가 나타났으나 전면역이 된(pre-immune) 혈청에서는 나타나지 않았 다. 70 kD 은 항- FLAG 항체를 사용하여 탐지한 것과 같은 크기이다(Fig. 7).
실시예 8: 신규한 유전자 KRZFPUH 의 발현, 분리 및 분석
C6242 cDNA를 프로브로 사용하여 실시예 2에서와 같이 복합-조직(Multi-tissue) 노던 블롯 분석을 수행하였다. 그 결과 2.8-kb 전사체가 태반과 고환에서 많이 발현되었다(도 8a). C6242은 노던 블롯에서 탐지된 것보다 크기가 더 작았기 때문에, KRZFPUH cDNA의 5' 부분의 서열을 확인해보았다. 먼저, 염색체 밴드 16p11에 할당된 윤곽 서열(GenBank accession number:NT-024802)을 찾아내기 위하여 게놈 데이터베이스에서 BLAST 프로그램(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)을 사용하여 C6242에 해당하는 게놈 서열을 찾아내었다. 유전자 인식 및 연결 인터넷 링크 프로그램인 GENSCAN을 이용하여, 상기 게놈 서열로 엑손 후보 서열을 예측하였다. 그런 다음, 500개의 아미노산으로 이루어진 단백질(GenBank Accession No. AB065282)을 코딩하는 1500개의 뉴클레오타이드로 이루어진 개방 판독틀을 포함하는 2744개의 핵산서열을 수득하기 위하여 5'-TAGATTCTGGGCGCACTTGTGGCTCTCC-3'(서열번호 34)를 프라이머로 사용한다는 것만 제외하고 실시예 2에서와 같이 5' RACE를 수행하였다. 단백질 구조분석 프로그램(Simple Modular Architecture Research Tool, SMART, http://smart.embl-heidelberg.de)으로 단백질 모티프를 찾아본 결과 예상되는 단백질은 크푸펠-형 징크 핑거 도메인(Kruppel-type zinc finger domain, 도 8b)을 포함하고 있다는 것을 알아냈다. KRZFPUH의 확인된 핵산서열과 그로부터 예상되는 아미노산 서열은 각각 서열번호 3과 4로 기재된다.

실시예9: KRZFPUH의 세포내 위치
KRZFPUH에 해당하는 전체 코딩 부위는 유전자 특이적인 하기의 프라이머 세트를 사용하여 증폭시켰다:
5'-GGGGTACCACCATGGCGCCACCTTCG-3'(서열번호 35) 및
5'-CGGAATTCATGGGCGTTGCCCCTCTGACTGG-3'(서열번호 36).
상기 PCR 반응 산물을 pcDNA3.1myc/His vector(Invitrogen)로 클로닝시켰다. 그런 다음, 상기 재조합 벡터로 SNU475 세포(Korea cell-line bank)를 일시적으로 형질감염시키고 상기 실시예 3에서와 같이 KRZFPUH의 세포내 위치를 확인하였다. 세포의 면역세포화학 염색으로 표지된 KRZFPUH 단백질은 핵에 존재한다는 것을 확인하였다(도 9).
실시예10: KRZFPUH 이 세포 성장에 미치는 영향
KRZFPUH이 세포 성장에 미치는 영향을 분석하기 위하여 COS7 세포(ATCC, Rockville, MD)에 KRZFPUH를 발현하는 플라스미드(pcDNA-KRZFPUH)를 형질전환시켜 콜로니 형성 분석을 수행하였다. 구체적으로, KRZFPUH에 해당하는 전체 코딩 부위를 상기 실시예 9에서와 같이 증폭하여 pcDNA3.1(Invitrogen)으로 클로닝하였다. 세포들을 pcDNA-KRZFPUH 플라스미드, 대조군 플라스미드(mock) 및 KRZFPUH에 상보적인 가닥을 발현하는 플라스미드(pcDNA-안티센스)로 각각 형질전환시켰다. 형질전환된 세포는 적당한 농도의 제네티신을 첨가한 DMEM에 10 내지 21일간 배양하였 다. 그런 다음, 세포들을 100% 메탄올에 고정시키고 김자 용액(Giemsa solution)으로 염색하였다. 모든 실험은 3회 반복하여 실시하였다.
KRZFPUH에 상보적인 가닥을 발현하는 대조군 플라스미드(pcDNA-안티센스)와 비교할 때, pcDNA-KRZFPUH COS7 세포에서 현저하게 더 많은 콜로니가 만들어졌다(도 10a 및 b). 이러한 결과는 세 번 반복 실험하여 검증하였다. 유의한 차이를 측정하기 위하여 스튜던트의 t 검정법에 따라 통계 분석을 수행하였다.
실시예11 : KRZFPUH 의 발현을 감소시키는 안티센스 S-올리고뉴클레오티드에 의한 간세포암세포의 성장 억제
KRZFPUH의 발현 억제가 간세포암세포의 성장 지체 및/또는 세포 사멸을 일으키는지 확인하기 위하여, KRZFPUH의 발현을 억제하는 다양한 안티센스 S-올리고뉴클레오티드를 합성하였다. 10-cm 배양접시에 2x105 세포/배양접시의 밀도로 도말한 알렉산더(Alexander) 세포(ATCC, Rockville, MD)를 LIPOFECTIN(GIBCO BRL)를 이용하여 KRZFPUH의 첫번째 엑손-인트론 경계를 포함하는 안티센스 S-뉴클레오타이드
(KRZFPUH-AS4; 5'-GGCCTCACCGAGCGCG-3'(서열번호 37) 또는 대조군 S-올리고뉴클레오티드(KRZFPUH-S4; 5'-CGCGCTCGGTGAGGCC-3'(서열번호 38))로 형질감염시켰다.
그리고 적당한 농도의 제네시틴을 첨가한 RPMI1640에서 6 내지 12일 동안 배양하였다. 세포들을 100% 메탄올로 고정시키고 김자 용액(Giemsa solution)으로 염색하였다. 알렉산더 세포에 안티센스 S-올리고뉴클레오티드(KRZFPUH-S4)를 형질 전환한 결과, 센스 S-올리고뉴클레오티드(KRZFPUH-S4) 와 비교할 때 KRZFPUH의 세포 내 발현과 살아 있는 세포수는 상당히 감소하였고(도11a 및b), 이는 KRZFPUH가 간세포암세포의 성장 및/또는 생존에 있어 중요한 역할을 할 수 있다는 것을 나타낸다.
이 결과는 세 번 반복 실험하여 검증되었다. 유의한 차이를 측정하기 위하여 스튜던트의 t 검정법에 따른 통계 분석을 수행하였다.
실시예12: KRZFPUH siRNA를 발현하는 플라스미드 제작과 간세포암 성장에 미치는 영향
KRZFPUH-siRNA를 발현하는 플라스미드는 두 가닥의 올리고뉴클레오티드를 psiU6BX3.0 벡터로 클로닝하여 제조하였다. KRZFPUH-siRNAs에 사용된 올리고뉴클레오티드는 하기과 같다:
psiU6BX-KRZFPUH1에 대하여,
5'-CACCAACGAAACACCGATGACTGGGTTCAAGAGACCCAGTCATCGGTGTTTCGTT-3'(서열번호 104) 및
5'-AAAAAACGAAACACCGATGACTGGGTCTCTTGAACCCAGTCATCGGTGTTTCGTT-3'(서열번호 105);
psiU6BX-KRZFPUH2에 대하여,
5'- CACCAATCACCGGACCACACACACATTCAAGAGATGTGTGTGTGGTCCGGTGATT-3'(서열번호 106) 및
5'-AAAAAATCACCGGACCACACACACATCTCTTGAATGTGTGTGTGGTCCGGTGATT-3'(서열번호 107);
psiU6BX-KRZFPUH3에 대하여,
5'-CACCAAACCTTGCCTACGACATGTTTTCAAGAGAAACATGTCGTAGGCAAGGTTT-3'(서열번호 108) 및
5'-AAAAAAACCTTGCCTACGACATGTTTCTCTTGAAAACATGTCGTAGGCAAGGTTT-3'(서열번호 109);
psiU6BX-KRZFPUH4에 대하여,
5'-CACCAAAAGGTTTCCGTTAGCCCCGTTCAAGAGACGGGGCTAACGGAAACCTTTT-3'(서열번호 110) 및
5'-AAAAAAAAGGTTTCCGTTAGCCCCGTCTCTTGAACGGGGCTAACGGAAACCTTTT-3'(서열번호 111).
상기 각각의 서열에서 siRNA의 표적서열은 밑줄로 나타내었다.
psiU6BX-KRZFPUH, psiU6BX-EGFP 또는 psiH1BX-mock 플라스미드는 공급자의 프로토콜(Roche)에 따라 FuGENE6를 사용하여 세포로 형질전환시켰다. 총 RNA는 형질전환 48시간 후에 추출하였다.
포유류 세포에서 19개의 상보적인 뉴클레오타이드와 3'-말단에 상보적인 티미딘이나 유리딘 이합체를 갖고, 20 내지 21-머 의 이중 가닥 RNA로 이루어진 siRNA(small interfering RNA)는 최근에 유전자 발현시 전체적인 변화(global changes)를 유도하지 않고, 유전자 특이적인 유전자 침묵 효과(gene silencing effect)를 갖는 것으로 나타났다. 그러므로 다양한 KRZFPUH-siRNA를 발현하는 플라스미드를 제작하여, KRZFPUH-siRNA가 KRZFPUH 발현에 미치는 영향을 알아보았다. siRNA 중에, psiU6BX-KRZFPUH2는 Huh7, 알렉산더, HepG2 및 SNU449 세포에서 KRZFPUH의 발현을 유의하게 억제하였으나, psiU6BX-KRZFPUH1, psiU6BX-KRZFPUH3 또는 psiU6BX-KRZFPUH4는 발현을 억제하지 않았다. KRZFPUH의 발현 억제가 간암 세포의 성장 억제를 유발하는 지 알아보기 위하여, Huh7 및 Alexander 세포를 psiU6BX-KRZFPUH2, psiH1BX-KRZFPUH1, psiH1BX-KRZFPUH3, psiH1BX-KRZFPUH4, psiH1BX-EGFP 또는 공벡터(mock vector)로 형질감염시켰다. 그 결과, psiU6BX-KRZFPUH2로 형질감염된 세포의 생존 세포수는 psiH1BX-KRZFPUH1, psiH1BX-KRZFPUH3, psiH1BX-KRZFPUH4, psiU6BX-EGFP 또는 대조군으로 형질감염된 세포에 비하여 현저히 줄어들었는데, 이는 KRZPUH의 발현 감소가 간암 세포의 성장을 억제한다는 것을 나타낸다(도 12 및 13).
실시예 13: 인간의 결장암에서 일반적으로 발현이 상향 조절되는 신규한 유전자인 PPIL1 의 동정
11건 임상사례에서의 결장암 조직의 발현 양상을 상기 실시예 1에서와 같이 23040가지 유전자를 포함하는 cDNA 마이크로어레이(microarray)을 사용하여 상응하는 비종양성 결장 점막조직의 유전자 발현양상과 비교하였다. 상기 분석으로 상응하는 비종양성 조직과 비교할 때, 암 조직에서 빈번히 발현 수준이 증가하는 다수의 유전자를 밝혀냈다. 그들 가운데, 기준치 필터를 통과한 모든 6건의 임상사례 에서 2.36와 4.68 사이의 확대 범위에서, 정상 점막의 해당 부위와 비교하여 CGI-124/PPIL1 유전자(GenBank Accession number: AF151882)에 해당하는 내부 접근 번호(in-house accession number) B9486을 가진 유전자가 암 조직에서 발현수준이 증가한다는 것이 밝혀졌다(도 14a).
마이크로어레이의 결과를 더욱 분명히 하기 위해서, 추가적인 결장암 시료에서 하기의 프라이머를 사용하여 상기 실시예 1에서와 같은 반-정량적인 RT-PCR에 의하여 이러한 전사체의 발현을 확인하였다:
5'-GGACAGGTCGAGGTGGTGC-3'(정방향, 서열번호 39) 및
5'-CTCGACGAGTTCTCCCATCG-3'(역방향, 서열번호 40).
반-정량적인(semi-quantitative) RT-PCR에 따르면 PPIL1의 발현은 20건의 임상사례 중 17건에서 증가하는 것으로 확인되었다(도 14b).
실시예14: PPIL1 의 구조
미국 생명공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information, NCBI)의 BLAST 프로그램(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)을 사용하여 공공 데이터베이스에서 PPIL1에 해당하는 AF151882 서열에 대한 부가적인 상동성 검사 결과, PPIL1의 5' 또는 3' 부분을 각각 포함하는 BE908798, AK026636을 포함하는 EST 그리고 염색체 밴드 6p21.1에 위치한 게놈 서열(GenBank Accession No. NT_007592)을 동정하였다. 연결된 PPIL1의 cDNA 서열은 498개의 뉴클레오타이드로 이루어진 개방 판독틀을 가진 1734개의 뉴클레오타이드를 가지고 있었다. cDNA 서열과 게놈 서열의 비교를 통해 상기 유전자가 4개의 엑손으로 이루어져 있다는 것을 밝혀냈다. 상기 유전자의 예상되는 아미노산 서열은 쥐과(murine)의 아미노산 서열과 98% 동일했다(Fig. 15). PPIL1의 결정된 핵산서열과 이로부터 예상되는 아미노산 서열은 서열번호 5와 6으로 각각 나타내었다.
실시예15: PPIL1 가 세포 성장에 미치는 영향
PPIL1가 세포 성장에 미치는 영향을 조사하기 위해서, NIH3T3 세포(ATCC, Rockville, MD)를 myc-표지 PPIL1 단백질을 발현하는 플라스미드(pcDNA3.1myc/His-PPIL1)로 형질감염시켜 콜로니 형성 분석(colony formation assay)을 수행하였다. 제작된 플라스미드는 다음과 같다. 먼저 제조사의 프로토콜에 따라 총 RNA를 Qiagen RNeasy 키트(Qiagen) 또는 Trizol(Life Technologies)을 이용하여 추출하였다. 총 RNA 중 10 ㎍을 Superscript II 역전사 효소(Life Technologies)와 다중dT12-18 프라이머(Amersham Pharmacia Biotech)를 이용하여 cDNA로 역전사하였다. 수득한 단일-가닥 cDNA는 20 ml의 PCR 완충용액(TaKaRa)에 희석하였다. 이어, 하기의 프라이머를 사용하여 PPIL1의 전체 코딩 부위를 증폭하기 위하여 표준 RT-PCR에 의해 PCR 증폭을 실시하였다:
5'-AGACAAGCTTTCCGCCGCCGGC-3'(전방향, 서열번호 41) 및
5'-GTCTCTCGAGAAGGGTATGCCTTAATGATCTTC-3'(역방향, 서열번호 42).
PCR 기기(GeneAmp PCR 시스템 9700, Perkin-Elmer, Foster City, CA)를 사용 하여 하기의 조건 하에서 RT-PCR을 실시하였다:
94℃에서 4분간 변성; 94℃에서 30초, 56℃에서 30초, 및 72℃ 에서 45초로 28 사이클.
증폭된 단편은 pcDNA3.1myc/His(Invitrogen) 벡터에 삽입하였다. 그런 다음, 재조합 pcDNA3.1myc/His-PPIL1로 NIH3T3 세포를 형질감염시켰다.
대조군 플라스미드인 pcDNA3.1myc/His-LacZ 또는 PPIL1의 상보적인 가닥을 발현하는 pcDNA3.1myc/His-asPPIL1와 비교할 때, pcDNA3.1myc/His-PPIL1는 NIH3T3 세포에서 현저히 많은 콜로니 형성을 유도하였다(도 16a).
더 나아가, 적은 양의 세포내 PPIL1을 발현하는 HCT116 인간 결장암 세포(ATCC, Rockville, MD)가 pcDNA3.1myc/His-PPIL1로 형질감염될 세포로 사용된 것만 제외하고 상기와 같은 유사한 실험이 수행되었다. 그 결과, 형질감염된 HCT116 인간 결장암 세포에서 콜로니 형성 활성이 향상되었다(도 16b).
실시예16: PPIL1 의 발현을 감소시키는 안티센스 S-올리곤뉴클레오티드에 의한 결장암 세포의 성장 억제
PPIL1 억제가 결장암 세포의 성장 지체 및/또는 세포 사멸을 유발하는지 확인하기 위하여 시험하기 위하여, 대조군과 PPIL1에 해당하는 안티센스 S-올리곤뉴클레오티드 네 쌍을 합성하였다:
대조군 센스 올리고뉴클레오티드 PPIL1-S2,
5'-CTTCGCTATGGCGGCA-3'(서열번호 43);
안티센스 S-올리고뉴클레오티드 PPIL1-AS2,
5'-TGCCGCCATAGCGAAG-3'(서열번호 44); 및
혼합된 S-올리고뉴클레오티드 PPIL1-SCR2,
5'-GTTGCACAGCGACGCA-3'(서열번호 92).
합성된 올리고뉴클레오티드 각각은 LIPOFECTIN(GIBCO BRL)를 사용하여 인간 결장암 세포 SW480(ATCC, Rockville, MD), SNU-C4 및SNU-C5 세포(모두 Korea Cell-line bank)를 형질감염시켰는데 이들은 실험한 11개의 결장암 세포주 중에서 높은 PPIL1 발현수준을 나타내었다. SW480은 Leibovitz's L-15 배지에서 배양되었고, SNU-C4 및 SNU-C5는 RPMI1640에서 배양되었는데 모든 배지에 적당한 농도의 제네티신을 첨가하여 6 내지 12일 동안 배양하였다.
안티센스 S-올리곤뉴클레오티드 중에서, PPIL1-AS2는 SNU-C5 세포의 대조군 센스(PPIL1-S2)와 비교할 때, PPIL1의 발현이 상당히 감소하였다(도 17a). 형질감염 6일 후에, PPIL1-AS2로 형질감염된 살아 있는 세포의 수는 대조군, PPIL1-S2 또는 혼합된 S-올리고뉴클레오티드(PPIL1-SCR2)로 형질감염된 살아 있는 세포의 수보다 유의하게 적었다. 이는 PPIL1 억제가 형질감염된 세포의 성장 및/또는 생존을 감소시켰음을 나타낸다(도17b). 세 번의 실험에서도 동일한 결과가 나왔다.
SW480, SNU-C4 및 SNU-C5 세포에서 PPIL1-AS2의 성장억제 효과를 측정하기 위하여 추가적으로 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 분석을 실시하였다. 구체적으로 100 mm 배양접시당 5X105 세포의 밀도로 도말한 세포를 PPIL1을 억제하는 센스 또는 안티센스 S-올리고뉴클레오티드로 세 세트를 형질전환시켰다. 형질전환 72시간 후에 500 mg/ml의 MTT(Sigma)를 포함하는 신선한 배지로 교체하고, 배양접시를 37℃로 4시간 동안 배양하였다. 이어서, 0.01 N HCl/10% SDS 1 ml을 첨가하여 세포를 용해시키고, 상등액의 흡광도를 ELISA 플레이트 판독기로 570 nm 파장에서 측정하였다(기준 파장 630 nm). 세포 생존률은 대조 세포와 비교한 흡광도로 나타났다. 그 결과, PPIL1-AS2로 형질전환시킨 살아 있는 세포의 수는 PPIL1-S2로 형질전환시킨 상기 세 가지 세포주보다 유의하게 감소하였다(도 17c).
실시예17: PPIL1 단백질과SNW1의 상호작용
PPIL1과 매우 상동성이 높은 두 개의 원핵세포 단백질인 Cyp2 (Schizosaccharomyces pombe)와 CypE(Dictiostelium discoideum)은 Snw1 및 SnwA와 각각 상호작용한다고 보고되고 있다. 그러므로, PPIL1 단백질도 Snw1과 SnwA의 인간 상동체(homologue)인 SNW1/SKIP과 상호작용한다는 가설을 세웠다. 이 가설을 확인하기 위하여, FLAG-표지된 PPIL1 단백질을 발현하는 pFLAG-PPIL1을 제작하였다. 먼저, PPIL1의 전체 코딩 부위를 상기 실시예 15와 같이 증폭시켜 pFLAG-PPIL1을 제조하기 위해 그 산물을 pFLAG-CMV-5c(Sigma)의 클로닝 부위로 클로닝하였다. 유사하게, SNW1의 전체 코딩 부위는 하기의 유전자 특이적인 프라이머 세트를 사용하여 RT-PCR로 증폭시켰다:
5'-TGGGAAQTTCCGGAAGAAGATGGCGCTCACCAGC-3'(정방향, 서열번호 45) 및
5'-GTGCCTCGAGCTTCCTCCTCTTCTTGCCTTCATGC-3'(역방향, 서열번호 46);
그리고 myc-표지된 SNW1을 발현하는 pcDNA3.1myc-SNW1를 제작하기 위하여, pcDNA3.1myc/His(Invitrogen)의 클로닝 부위로 삽입하였다. 다음으로 pFLAG-PPIL1를 pcDNA3.1myc-SNW1와 함께 또는 pcDNA3.1myc-SNW1 없이 COS7 세포(ATCC, Rockville, MD)에 형질전환시켰다.
그런 다음, 세포 상등액을 항-FLAG 항체로 하기과 같이 면역침강을 실시하였다: COS7 세포는 pFLAG-PPIL1과 pcDNA3.1myc/His-SNW1으로 형질전환시키고 48 시간 후에 회수하여 20 mM Tris-HCl, pH7.5, 150 mM NaCl, 1% NP-40, and 1X 완전 프로테아제 저해제 칵테일(complete Protease Inhibitor Cocktail) EDTA (-) (Boehringer)를 포함하는 세포용해 완충용액으로 형질감염된 세포를 용해시켰다. 세포 상등액을 항-FLAG M2 항체(SIGMA)로 면역침강시켰다. 침강한 단백질은 SDS-PAGE로 분리하고 항-FLAG M2 항체를 사용하여 면역블롯 분석을 실시하였다.
면역침강에 이어, 항-c-Myc 항체를 사용하여 면역블롯 분석을 수행하였다. 구체적으로, 세포들을 pFLAG-PPIL1 및/또는 pcDNA3.1myc/His-SNW1으로 형질감염시키고 PBS로 두 번 세척하여 세포용해 완충용액(150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 50 mM Tris-HCl pH 7.4, 1 mM DTT, 및 1X 완전 프로테아제 저해제 칵테일(complete Protease Inhibitor Cocktail, Boehringer)으로 회수하였다. 세포들을 균질화하여 10,000xg에서 30분간 원심분리하여, 상등액은 브래드포드 분석(Bradford assay, Bio-Rad)으로 단백질 농도를 확인하였다. 단백질은 10% SDS-PAGE로 분리하였고 생쥐 항-myc 항체(SANTA CRUZ)로 면역블롯하였다. HRP-결합 염소 항-생쥐 IgG (Amersham)를 ECL 탐지 시스템(Amersham)의 이차항체로 사용하였다.
그 결과 myc-표지된 SNW1 단백질에 해당하는 밴드는 플라스미드 둘 다로 형질감염된 경우에 관찰되는 것으로 확인되었다(도 18). 더욱이, 항-cMyc 항체로 상등액을 면역침강한 결과 FLAG-표지된 PPIL1 단백질을 침강시켰다. 이러한 결과는 생체내에서 PPIL1이 직접 또는 간접적으로 SNW1과 결합할 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예18: PPIL1과 SNW1의 Co-localization
PPIL1과 SNW1의 결합을 확인하기 위하여, pFLAG-PPIL1 및 pcDNA3.1myc-SNW1으로 함께 형질감염시킨 세포를 항-FLAG 항체를 사용하여 면역조직화학 염색함으로써, COS7 세포에서 FLAG-표지된 PPIL1 단백질과 myc-표지된 SNW1 단백질의 세포 내 위치를 알아보았다.
구체적으로, pFLAG-PPIL1 및 pcDNA3.1myc/His-SNW1으로 형질전환된 세포는 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)를 포함하는 PBS로 15분 동안 고정하고 0.1% Triton X-100을 포함하는 PBS에 상온에서 2.5분 동안 처리하여 침투가 되도록 하였다. 이어, 상기 세포들은 2% BSA가 첨가된 PBS로 4℃에서 24시간 동안 도포하여 비-특이적인 혼성화를 차단하였다. 1:1000으로 희석한 생쥐 항-myc 단일클론 항체(Sigma) 또는 1:2000으로 희석한 생쥐 항-FLAG 항체(Sigma)를 일차항체로 사용하고, 로다민(Rhodamine)-결합 항-생쥐 이차항체(Leinco and ICN)와 정온배치한 다음, 반응 결과를 시각적으로 확인하였다. 핵은 DAPI로 염색하였다. ECLIPSE E800 현미경으로 형광상을 획득하였다.
항-FLAG 항체로 세포들을 면역조직화학 염색(immunohistochemical staining)한 결과 핵에서 신호가 나타났고, 항-myc 항체는 핵과 세포질에서 유사한 양성 염색이 나타났다. 도 19의 a 및 b와 DAPI로 염색한 대응 염색한 결과를 나타내는 도 19의 c의 병합 이미지는 FLAG-표지된 PPIL1 단백질과 myc-표지된 SNW1이 핵에 함께 존재함을 보여주고 있는데(도 19의 d), 이는 PPIL1과 SNW1 사이의 상호작용이 있다는 개념과 일치한다.
실시예19: 인간 복합 조직에서 PPIL1 의 발현
PPIL1 cDNA를 탐침(probe)으로 사용하여 복합-조직 노던 블롯 분석을 실시하였다. 구체적으로, 인간 다중-조직 블롯(human mutiple-tissue blot, Clontech, Palo Alto, CA)을 32P-표지된 PCR 산물과 혼성화시켰다. 공급자의 프로토콜에 따라, 전-혼성화(Pre-hybridization), 혼성화 및 세척을 수행하였다. 블롯은 -80℃로 24 내지 72시간 동안 증감지(intensifying screens)로 자기방사 이미지(autoradiography)을 구하였다.
그 결과 1.7kb 전사체가 산재함을 확인하였다. 시험한 조직 가운데 심장, 골격근, 갑상선 및 부신에서 매우 많이 발현되었다(도 20).
실시예 20: PPIL1 siRNAs을 발현하는 플라스미드의 제작 및 상기 플라스미드가 결 장암 세포에 미치는 영향
다양한 PPIL1-siRNA를 발현하는 플라스미드는 PPIL1 발현이 미치는 영향을 시험하기 위해 제작하였다. 먼저, 상기 실시예 6과 유사하게 psiH1BX3.0 벡터를 제작하였다. 더 나아가 실시예 6과 같이 대조군 벡터인 psiH1BX-EGFP를 제조하였다. 그리고나서 두 가닥의 올리고뉴클레오티드를 psiH1BX3.0 vector의 BbsI 부위로 클로닝하여 PPIL1-siRNAs를 발현하는 플라스미드를 제조하였다.
올리곤뉴클레오티드는 다음과 같이 벡터로 클로닝되었다:
psiH1BX-PPIL-A,
5'-TCCCGCATGCTCCAAAGACCTGTTTCAAGAGAACAGGTCTTTGGAGCATGC-3'(서열번호 47) 및
5'-AAAAGCATGCTCCAAAGACCTGTTCTCTTGAAACAGGTCTTTGGAGCATGC-3'(서열번호 48);
psiH1BX-PPIL-B,
5'-TCCCAGACTTCATGATCCAAGGATTCAAGAGATCCTTGGATCATGAAGTCT-3'(서열번호 49) 및
5'-AAAAAGACTTCATGATCCAAGGATCTCTTGAATCCTTGGATCATGAAGTCT-3'(서열번호 50);
psiH1BX-PPIL-C,
5'-TCCCTGGCAGCCAGTTCTTTGTGTTCAAGAGACACAAAGAACTGGCTGCCA-3'(서열번호 51) 및
5'-AAAATGGCAGCCAGTTCTTTGTGTCTCTTGAACACAAAGAACTGGCTGCCA-3'(서열번호 52).
상기 각각의 서열에서 siRNA의 표적서열을 밑줄로 나타냈었다.
플라스미드는 공급자의 프로토콜에 따라 FuGENE6(Roche)를 사용하여 SNUC4 또는 SNUC5와 같은 결장암 세포주에 형질감염되었다. 총 RNA는 형질감염 48 시간 후에 세포로부터 추출하였다.
그들 가운데, psiH1BX-PPIL-A는 SNUC4 및 SNUC5에서 PPIL1의 발현을 상당히 억제하였으나, psiH1BX-PPIL-B 또는 psiH1BX-PPIL-C는 그렇지 않았다(Fig. 21A). PPIL1 억제가 결장암 세포의 성장 억제를 유도하는지 확인하기 위하여, SNUC4 및 SNUC5 세포를 psiH1BX-PPIL-A, psiH1BX-PPIL-B, psiH1BX-PPIL-C 또는 대조군psiH1BX-EGFP로 형질감염시켰다. psiH1BX-PPIL-A로 형질감염된 세포는 psiH1BX-PPIL-B, psiH1BX-PPIL-C 또는 psiH1BX-EGFP로 형질감염된 세포에 비하여 살아 있는 세포의 수가 현저히 줄어들었는데, 이는 PPIL1의 발현이 감소하면 결장암 세포의 성장을 억제한다는 것을 나타낸다(도 21B).
실시예 21: 재조합 PPIL1 단백질 제조
PPIL1에 대한 특이적인 항체를 만들기 위하여, PPIL1의 재조합 단백질을 제조하였다. PPIL1의 전체 코딩 부위는 다음의 프라이머 세트로 RT-PCR을 실시하여 증폭하였다:
5'-CGCCGGATCCGCTATGGCGGCAATTCCCCCAG-3'(서열번호 53) 및
5'-AGCACTCGAGCCCAGAAGGGTATGCCTTAATGATC-3'(서열번호 54). 반응 산물을 정제하고 BamH l 과 Xho l으로 절단하여 pGEX-6P-1(pGEX-PPIL1) 또는 pET21a(pET-PPIL1) 벡터의 적당한 클로닝 부위로 클로닝하였다. E. coli DH10B 또는 BL21 코 돈 플러스(BL21 codon plus) 세포는 pGEX-PPIL1 또는 pET-PPIL1로 형질전환되었다. 재조합 단백질은 IPTG를 첨가하여 유도하였고, 제조사의 프로토콜에 따라 추출물로부터 정제하였다. 플라스미드로 E. coli 세포가 형질전환되었을 때, SDS-PAGE 상에서 기대되는 크기의 재조합 단백질이 생산되는 것이 관찰되었다(도 22a 및 b).
실시예 22: 박테리아 이중-하이브리드 탐색 시스템(bacterial two-hybrid screening system)에 의하여 PPIL1과 상호작용하는 단백질인 스타트민의 동정
PPIL1의 작용을 분석하기 위해서, 박테리아 이중-하이브리드 탐색 시스템(bacterial two-hybrid screening system)을 이용하여 PPIL1과 상호작용하는 단백질은 모두 찾아내었다. 제조사의 프로토콜에 따라 박테리아 이중-하이브리드 탐색 시스템(BacterioMatch Two-Hybrid system, Stratagene)으로 박테리아 이중-하이브리드 분석을 수행하였다. 상기 실시예 21에서와 같이 수득한 PPIL1의 전체 코딩 서열은 pBT 벡터의 BamH l-Xho l 절단 부위로 클로닝하여 미끼(bait)를 만들고 인간 태아 뇌 cDNA 라이브러리(Stratagene)를 탐색하였다. 양성 클론으로 확인된 것 가운데, 박테리아를 pBT-PPIL1과 pTRG-STMN으로 동시에 형질전환시킨 결과 스타트민(stathmin)은 PPIL1과 상호작용하는 것으로 나타났다(도 23A).
더 나아가, 면역침강법을 수행하였다. 구체적으로, COS7 세포를 실시예 17에서와 같이 FLAG-표지된 PPIL1을 발현하는 pFLAG-PPIL1와 HA-표지된 스타트민 단백질을 발현하는 pCMV-HA-STMN 또는 다른 조합으로 형질감염시키고 이를 PBS로 세척하고 150 mM NaCl, 1% NP-40, 10 mM Tris-HCl pH8.0, 1 mM EDTA, 및 1X 완전 프 로테아제 저해제 칵테일(complete Protease Inhibitor Cocktail, Roche)을 포함하는 NET-N 완충용액에 세포를 용해시켰다. 면역침강반응에서 전체 세포 추출물 중 300 mg을 1 mg의 생쥐 항-FLAG(SIGMA), 또는 3 mg의 집쥐 항-HA 항체 및 20 ml의 단백질 G 세파로즈 비드(protein G Sepharose bead, Zymed)와 함께 4℃에 1 내지 2 시간 동안 정온배치하였다. 상기 비드는 NET-N 완충용액으로 5회 세척하고 결합된 단백질은 SDS 시료 완충용액에서 끓여 용리하였다. 침강된 단백질은 SDS-PAGE로 분리하고 항-HA 항체나 항-FLAG M2 항체를 이용하여 면역 블롯 분석을 수행하였다.
상기에 기재된 것과 같이, FLAG-표지된 PPIL1 단백질과 HA-표지된 스타트민 단백질의 생체내 결합은 COS7 세포에서 면역침강분석으로 확인하였다(도 23B). 흥미롭게도, 항-스타트민 항체를 사용한 웨스턴 블롯 분석으로 18 kDa과 20 kDa 단백질에 해당하는 두 개의 밴드를 발견하였는데 이는 스타트민의 변형된 형태가 존재한다는 것을 암시한다. 스타트민은 세린/트레오닌 인산화 부위(Ser16, Ser25, Ser38 and Ser63)로 추정되는 부분을 가지고 있기 때문에, 둘 중 더 큰 밴드는 스타트민이 인산화된 형태일 것이다. 더 나아가 항-FLAG 항체로 면역침강한 결과 20 KDa에 해당하는 단일 밴드를 나타냈는데 이는 PPIL1이 변형된 스타트민과 결합하거나 스타트민에 결합하여 스타트민의 변형을 촉진하기 때문일 것이다.
실시예 23: 세포 내에서 FLAG-표지된 PPIL1 과 HA-표지된 스타트민의 동일위치 존재(Co-localization)
PPIL1과 스타트민이 세포 내에서 동일위치에 존재하는지 시험해보기 위하여, pFLAG-PPIL1 과 pCMV-HA-STMN을 실시예 22에서와 같이 COS7 세포로 함께 형질전환시켜 면역조직화학 염색으로 세포 내 위치를 확인해보았다(도 24). 항-FLAG 항체로 염색한 결과 FLAG-표지된 PPIL1 이 핵과 세포질에 모두 존재하는 것으로 나타났다. 반면에 항-HA 항체로 염색한 결과 HA-결합된 스타트민은 세포질에서 PPIL1과 함께 위치하는 것으로 나타났다.
실시예 24: 스타트민 중 PPIL1과의 상호작용하는 부위
더 나아가, 상호작용에 상응하는 부위를 확인하기 위하여, pCMV-HA-STMN의 다양한 결실 돌연변이(deletion mutant)과 야생형 pFLAG-PPIL1를 이용하여 실시예 22와 유사하게 면역침강 어세이를 실시하여 하였다. STMN의 상기 결실 돌연변이는 하기의 프라이머 세트를 이용하여 증폭하였다:
결실 돌연변이 1에 대하여,
5'-ATTGGTACCATGGAGCTGATTCTCAGCCCTCGGTC-3'(서열번호 55) 및
5'-AATCTCGAGGTCAGCTTCAGTCTCGTCAGCAG-3'(서열번호 56);
결실 돌연변이 2에 대하여,
5'-ATTGGTACCATGGTTCCAGAATTCCCCCTTTCCCCT-3'(서열번호 57) 및
5'-AATCTCGAGGTCAGCTTCAGTCTCGTCAGCAG-3'(서열번호 58);
결실 돌연변이 3에 대하여,
5'-ATTGGTACCATGGATCTTTCCCTGGAGGAAATTCAG-3'(서열번호 59) 및
5'-AATCTCGAGGTCAGCTTCAGTCTCGTCAGCAG-3'(서열번호 60) ;
결실 돌연변이 4에 대하여,
5'-ATTGGTACCATGGCTGAGGTCTTGAAGCAGCTGGC-3'(서열번호 61) 및
5'-AATCTCGAGGTCAGCTTCAGTCTCGTCAGCAG-3'(서열번호 62)
결실 돌연변이 5에 대하여,
5'-ATTGGTACCTTCACCATGGCTTCTTCTGATATCC-3'(서열번호 63) 및
5'-AATCTCGAGGCGTCTTTCTTCTGCAGCTTC-3'(서열번호 64).
그리고 전장 클론(pFLAG-PPIL1)을 주형으로 하였다. PCR 산물은 pcDNA3.1myc/His의 Kpn l 과 Xho l 부위로 클로닝하였다.
스타트민의 1 내지 43 번째 아미노산이 결실된 결실 돌연변이(Del3)은 PPIL1과 결합할 수 있었지만 1 내지 65번째 아미노산이 결실된 돌연변이인 Del4는 결합할 수 없었다. 반면에, 1 내지 61번째 아미노산을 포함하는 다른 돌연변이는 결합할 수 있었다(도 25A 와 B), 이는 코돈 44와 61 사이의 부위가 결합에 중요하다는 것을 나타낸다.
실시예 25: 스타트민의 인산화와 인산화된 스타트민과 PPIL1과의 상호작용
항-FLAG 항체로 면역침강을 실시한 결과 스타트민의 변화된 형태에 해당하는 단일 밴드가 나타났으므로, PPIL1와의 결합을 시험하기 위하여 세린 인산화 부위로 추정되는 부위에 돌연변이가 일어난 스타트민을 발현하는 플라스미드를 제조하였다(도 26a). 구체적으로, 위치지정 돌연변이 키트(QuikChange site-directed mutagenesist kit, Stratagene) 및 하기의 프라이머 세트를 사용하여 돌연변이(세 린이 알라닌으로 치환된)를 제조하였다.
S16A에 대하여,
5'-CTGGAGAAGCGTGCCGCAGGCCAGGCTTTTG-3'(서열번호 65) 및
5'-CAAAAGCCTGGCCTGCGGCACGCTTCTCCAG-3'(서열번호 66);
S25A에 대하여,
5'-GCTTTTGAGCTGATTCTCGCCCCTCGGTCAAAAGAATCTG-3'(서열번호 67) 및
5'-CAGATTCTTTTGACCGAGGGGCGAGAATCAGCTCAAAAGC-3'(서열번호 68);
S38A에 대하여,
5'-CCAGAATTCCCCCTTGCCCCTCCAAAGAAGAAG-3'(서열번호 69) 및
5'-CTTCTTCTTTGGAGGGGCAAGGGGGAATTCTGG-3'(서열번호 70);
S63A에 대하여,
5'-CAGAAGAAAGACGCAAGGCCCATGAAGCTGAGG-3'(서열번호 71) 및
5'-CCTCAGCTTCATGGGCCTTGCGTCTTTCTTCTG-3'(서열번호 72).
S16A 또는 S63A 돌연변이로 형질감염된 세포의 웨스턴 블롯 분석으로 스타트민의 인산화된 형태와 인산화되지 않은 형태를 검출하였다. 반면에 S38A로 형질감염된 세포는 인산화되지 않은 형태에 해당하는 단일 밴드를 나타내었다. 그러므로 스타트민의 세린38은 세포에서 인산화될 가능성이 있다. 놀랍게도, 스타트민-S38A 돌연변이는 PP1L1과 결합할 수 있다(도 26b). 그러므로, PPIL1과 스타트민의 결합은 스타트민의 코돈 44와 61 사이의 PPIL1-결합 부위에 인접한 세린 38의 인산화를 촉진할 수 있다.
실시예26: APC에 의해 조절되는 유전자인 APCDD1 분리
결장암 발생은 초기 단계에서 베타-카테닌/Tcf 경로의 조절이 손상된 것과 관련이 있다. 그러므로 이러한 경로의 하위 단계의 유전자를 찾아내기로 하였다. 결장암 세포를 APC로 형질전환시키면 전환은 핵에서 베타-카테닌의 수준을 감소시키고 이어서 베타-카테닌/Tcf 복합체의 전사촉진 활성(transactivating activity)을 억제한다(van der Heyden et al., J. Cell. Sci., 111:1741-9, 1998). 그러므로, 많은 양의 베타-카테닌이 핵과 세포질에 축적되는 SW480 세포의 발현 양상을 상기 실시예 1과 유사한 마이크로어레이(microarray)를 사용하여 비교하였다.
베타-카테닌/Tcf 복합체에 의해 조절되는 유전자의 동정을 위하여 SW480 세포(ATCC, Rockville, MD)를 야생형 APC(Ad-APC) 또는 LacZ(Ad-LacZ; 대조군 유전자)를 발현하는 MOI=100인 아데노바이러스로 감염시키고 Leibovitz's L-15 배지로 배양하였다. 감염 72 시간 후에, 세포로부터 총 RNA를 추출하고 추출물로부터 분리한 polyA RNA를 사용하여 사토 등의 방법에 따라(Satoh et al., Nat. Genet., 24:245-50, 2000)에 따라 T7-based RNA 증폭을 실시하였다. Ad-APC와 Ad-LacZ를 이용하여 SW480 세포로부터 증폭한 RNA(aRNA)는 Cy5-dCTP 와 Cy3-dCTP로 각각 표지하고, 그로부터 나온 동일한 양을 마이크로어레이 슬라이드 상에서 함께 혼성화시키기 위한 탐침으로 사용하였다.
APC의 형질전환에 의해 발현이 하향 조절되는 여러 유전자를 동정하기 위하여, Ad-APC으로 감염된 SW480 세포에서 23040가지 유전자의 발현양상을 Ad-LacZ로 감염된 세포의 유전자 발현양상과 비교하였다. 상기 유전자 중, 발현수준이 Ad- LacZ에 비해 Ad-APC에 의하여 약 4배 감소하고 내부 접근 번호 B7323N을 가지며 NCBI(the National Center for Biotechnology Information)의 UniGene cluster의 Hs.20665에 해당하는 유전자를 동정하였다.
이어서, APC의 발현이 감소하였다는 것을 확인하기 위하여 반정량적인RT-PCR을 실시하였다(도 27a). 구체적으로, 총 RNA를 제조사의 프로토콜에 따라 Qiagen RNeasy 키트(Qiagen) 또는 Trizol(Life Technologies, Inc.)으로 추출하였다. 총 RNA 중 10 ㎍을 다중dT12-18 프라이머(Amersham Pharmacia Biotech) 와 Superscript II 역전사 효소(Life Technologies)를 사용하여 cDNA로 역전사시켰다. 획득한 단일 가닥 cDNA는 20 ml의 PCR 완충용액(TaKaRa)에 희석시켰다. 그런 다음, 표준 RT-PCR에 의해 하기의 프라이머를 사용하여PCR 증폭을 실시하였다:
정방향, 5'-GGATCATCTATCGGTCAGACG-3'(서열번호 73); 및
역방향; 5'-TGGGTCACATCCTGCTGGATG-3'(서열번호 74).
다음의 조건 하에서 PCR 기기(GeneAmp PCR system 9700, Perkin-Elmer)를 이용하여 증폭을 실시하였다:
94℃에서 4분 동안 변성; 94℃ 에서 30초, 56℃에서 30초 및 72℃에서 45초로 30 사이클.
더욱이, 세포들을 베타-카테닌/Tcf-4 복합체의 활성을 낮추는 야생형 AXIN1을 발현하는 아데노바이러스인 Ad-Axin로 처리하고 B7323N의 발현을 확인하였다. 그 결과, AXIN1의 형질감엽에 의하여 B7323N의 발현이 감소된 것이 관찰되었다(도 27a).
B7323N의 cDNA 서열로 공용 데이터베이스에서 상동성 조사를 실시한 결과 100개 이상의 EST와 염색체 밴드 18p11.2에 위치한 인간게놈서열(GenBank Accession number NT_019631)을 동정하였다. B7323N의 전장 cDNA서열을 결정하기 위하여, 상기 실시예 2에서와 같이 B7323N에 대해 유전자 특이적인 프라이머를 사용하여 5' RACE를 실시하여(5'-GCTCGTCTGACCGATAGATGATCC-3'(서열번호 75) cDNA 서열을 획득하였다. 그 결과 전장 cDNA 서열을 결정하였다. 상기 cDNA(GenBank accession No. AB104887)는 514개의 아미노산으로 이루어지고 58.8kD의 크기를 가진 단백질을 코딩하는 1542개의 핵산을 포함하는 열린 해독틀을 가진 2607개의 핵산으로 구성되어 있다. 예상되는 APCDD1 단백질은 Thermobacillus xylanilyticus의 엔도-1,4-베타-실라나제(endo-1,4-beta-xylanase)와 31% 동일하였다. SMART (http://smart/embl-heidelberg/de/)와 PSORT II Prediction (http://psort.nibb.ac.jp/form2.html) 컴퓨터 프로그램을 이용한 모티프 조사로는 데이테베이스상에서 어떠한 도메인도 찾아내지 못했다. 이에 따라, 상기 유전자를 APCDD1(down-regulated by APC 1)로 명명하였다. 게놈 서열과 cDNA 서열 비교로 APCDD1의 게놈 구조를 결정하게 되었는데, APCDD1는 5개의 엑손으로 이루어져 있고 약 40 kb의 게놈 영역에 걸쳐 있었다. 결정된 APCDD1의 핵산 서열과 예상되는 아미노산 서열은 서열번호 7과 8로 각각 나타내었다.
마지막으로 상기 실시예 2에서와 같이 APCDD1에 대한 노던 블롯 분석을 수행하였다. 노던 블롯 분석으로 APCDD1의 2.6 kb 전사체는 심장, 췌장 및 난소에서는 높게 발현되고, 폐, 간, 장, 비장, 흉선, 결장 및 말초 백혈구에서는 거의 발현되지 않는 것으로 나타났다(도 27b).
실시예27: 결장암 조직에서 APCDD1 의 발현
베타-카테닌의 축적은 결장암의 주된 특징이므로 결장암과 이에 상응하는 정상 조직에서 APCDD1의 발현은 실시예 26에서와 같이 반정량적인 RT-PCR로 확인하여 검사한 30건의 임상사례 중 20건에서(67%) 발현이 증가한 것을 확인하였다(도 27c). 상기 결과는 베타-카테닌/Tcf 복합체의 활성화에 따라 APCDD1의 발현이 상향조절된다는 사실과 일치한다.
실시예 28: APCDD1 의 프로모터 활성은 베타-카테닌과 야생형 Tcf4 복합체에 의해 상향조절된다
APCDD1의 프로모터 활성이 베타-카테닌/Tcf4 복합체에 의해 조절되는지 알아보기 위하여, 두 개의 Tcf/LEF 결합 모티프(TBM1 와 2)로 추정되는 부위를 포함하는 플라스미드 P1를 돌연변이 베타-카테닌과 야생형 Tcf4의 활성화된 형태가 있거나/없이 HeLa 세포에 형질감염시켰다(도 28a). 보다 구체적으로, APCDD1의 전사시작부위로 추정되는 부위를 인간 게놈 서열(GenBank accession No. NT_019631.4)과 APCDD1 cDNA 서열을 비교하여 결정하였다. APCDD1의 5' 인접한 부위의 세 개의 단편을 PCR(P1, P2, and P3)로 증폭하고 pGL3-Basic vector(Promega)의 적당한 제한 효소 부위로 클로닝하였다. QuickChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit (STRATAGENE)을 사용하여 하나 또는 두 개의 Tcf/LEF 결합 모티프로 추정되는 부위를 포함하는 P1 과 P2에 대한 위치 지정 돌연변이(Site directed mutagenesis)를 수행하였다. 돌연변이 베타-카테닌의 활성화된 형태는 하기의 프라이머 세트를 사용하여 RT-PCR로 제조하였다:
5'-AAGGATCCGCGTGGACAATGGCTACTCAAG-3'(서열번호 76) 및
5'-GGACTCGAGACAGGTCAGTATCAAACCAGGCCAG-3'(서열번호 77).
그리고 HCT116 결장암 세포로부터 추출한 RNA를 주형으로 사용하여 pcDNA3.1 벡터(Invitrogen)의 적당한 부위로 클로닝하였다. 전체 코딩 부위의 인간 cDNA 단편과 Tcf-4의 5'가 결실된 부위(wtTcf4, dnTcf4)를 하기의 프라이머 세트를 사용하여 RT-PCR 로 증폭하였다:
TcfF1: 5'-AAGAATTCTGCTGGTGGGTGAAAAAAAAATGC-3'(서열번호 78),
TcfR1: 5'-CTACTCGAGTTCTAAAGACTTGGTGACGAGCGAC-3'(서열번호 79),
TcfF3: 5'-AGGAATTCGTGCATCATGGTCCCACCACATCATAC-3'(서열번호 80) 및
TcfR1.
RT-PCR 산물 또한 pcDNA3.1 플라스미드 벡터로 클로닝하였다. 형질감염 효율(transfection efficiency)을 표준화하기 위하여, 각각의 리포터 플라스미드 2 mg 및 각각의 발현 재조합 벡터 1.5 mg을 0.5 mg의 pRL-TK 플라스미드(Promega)와 함께 FuGENE6(Boehringer Mannheim)를 사용하여 HeLa 세포에 공-형질감염시켰다. 공급자의 프로토콜에 따라 이중-루시퍼라제 리포터분석 시스템(Dual-Luciferase Reporter Assay System, Promega)을 이용하여 리포터분석을 수행하였다.
플라스미드 P1의 리포터 활성은 베타-카테닌과 야생형 Tcf4의 활성화된 형태를 도입하자 상당히 증가하였다(도 28b). 흥미롭게도, P1을 Tcf4의 우성-음성 형태(dominant-negative form)와 함께 형질감염시켰을 때는 증가했던 활성이 줄어들었는데, 이는 Tcf4가 APCDD1의 프로모터 활성에 영향을 미친다는 것을 나타낸다.
APCDD1의 프로모터 활성에 영향을 미치는 요소를 결정하기 위하여, P1의 다양한 결실 돌연변이 각각에 대한 프로모터 활성을 비교하였다. P1의 활성은 P2와 P3 각각의 활성에 비해 상당히 높았고 TBM2만을 포함하는 P2의 활성은 P3보다 상당히 높았다(도 28b). 상기 데이터는 -971 과 -151을 포함하는 부위가 베타-카테닌/Tcf4 복합체와 결합하여 APCDD1 프로모터의 활성에 관여할 수 있다는 것을 나타낸다. 이러한 부위는 두 가지의 가능한 Tcf/LEF-결합 모티프를 포함하고 있기 때문에 이러한 모티프는 전사 활성화에 관련이 있을 것이라고 가정할 수 있다.
상기가설을 확인하기 위하여, Tcf/LEF-결합 모티프라 추정되는 부위를 CTTTGGC(서열번호 81)로 치환하여 베타-카테닌 복합체가 결합할 수 없도록 한 리포터 플라스미드 P1M 및 P2M를 제작하였다. 상기 다섯 개의 플라스미드를 이용한 리포터 분석로, 돌연변이 모티프를 포함하는 P1M 와 P2M 단편은 APCDD1의 전사를 활성화시키는 능력이 감소한다는 것; 그리고 상기 단편의 루시퍼라제 활성은 P2 또는 P3 단편의 루시퍼라제 활성과 같다는 것을 밝혀냈다(도 28b). 이러한 결과는 Tcf/LEF-결합 모티프로 추정되는 부위가 APCDD1의 전사 활성화에 관여한다는 것을 암시한다.
실시예 29: 전기영동 이동성 변화 분석(Electrophoretic Mobility Shift Assay)
베타-카테닌/Tcf4 복합체가 TBM1과 TBM2와 직접적으로 결합되어 있는지 확인하기 위하여, TBM1 서열(APCDD1-TBM1) 및 TBM2 서열(APCDD1-TBM2)을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 사용하여 전기영동 이동성 변화 분석(electrophoretic mobility shift assay, EMSA)을 수행하였다. 구체적으로, SW480의 핵의 추출물을 사용하여 종래에 기술된바와 같이(van der Heyden et al., J. Cell. Sci., 111:1741-9, 1998) EMSA를 수행하였다. 두 개의 이중가닥 16-핵산 DNA 탐침은 APCDD1-TBM1의 경우, FF (5'-GCTTTGATTGTGGTGA-3', 서열번호 82) 및 RR(5'-TCACCACAATCAAAGC-3', 서열번호 83); 및, APCDD1-TBM2의 경우, FF2(5'-CCCCTTTGAACACCTT-3', 서열번호 84) 및 RR2(5'-AAGGTGTTCAAAGGGG-3', 서열번호85)을 서냉(annealing)함으로써 제조하였다.
항-베타-카테닌 항체의 첨가에 의하여, APCDD1-TBM1 및 APCDD1-TBM2에 베타-카테닌/Tcf4이 결합한 것에 해당하는 밴드의 이동을 관찰하였다. 그러나, p53 항체(대조군)로는 상기와 같은 결과를 관찰할 수 없었다(도 29). 예상한대로, 이 결합은 표지되지 않은 야생형의 올리고뉴클레오티드를 넣자 결합이 해리되었으나 표지되지 않은 돌연변이 올리고뉴클레오티드를 넣었을 때는 결합이 그대로 유지되었다.
실시예 30: APCDD1 이 시험관내에서 LoVo 세포의 성장에 미치는 영향
결장암에서 APCDD1의 역할을 규명하기 위하여, APCDD1(pcDNA-APCDD1) 및APCDD1의 상보적인 가닥(pcDNA-antisense)을 발현하는 플라스미드를 제조하여 적은 양의 APCDD1을 발현하는 LoVo 세포(ATCC, Rockville, MD)에서 콜로니 형성 분석을 수행하였다. 보다 구체적으로, 하기의 유전자 특이적인 프라이머로 RT-PCR을 실시하여 APCDD1의 전체 코딩 부위를 증폭하였다:
5'-GCGGAATTCAGGGCCCAGAGCAGGACTG-3'(서열번호 86)
5'-TAGCTCGAGCTAAAACTTCTATCTGCGGATGT-3'(서열번호 87).
PCR 산물은 pcDNA3.1(Invitrogen)의 적당한 부위로 클로닝하였다. 그런다음, LoVo 세포를 재조합 pcDNA-APCDD1 또는 pcDNA-안티센스로 형질감염시키고 세포를 적당한 농도의 제네티신을 첨가한 HAM's F-12 배지에서 10 내지 21일간 배양하였다. 세포들을 100% 메탄올로 고정하고 김자 용액(Giemsa solution)으로 염색하였다.
그 결과, 대조군 플라스미드인, pcDNA-안티센스 또는 pcDNA와 비교할 때, pcDNA-APCDD1은 현저히 많은 콜로니를 형성시켰다(도 30a). 상기의 결과는 세 번 반복 실험하여 검증하였다. 시험관내에서 APCDD1이 세포 성장에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 외래의 APCDD1을 발현하는 LoVo 세포(LoVo-APCDD1 cells)를 만들어 목(mock) 벡터로 형질감염된 대조군 세포와 성장속도를 비교하였다(도 30b). LoVo-APCDD1 세포는 대조군 LoVo-mock 세포와 비교할 때, 성장 속도가 현저히 증가했다(도 30c).

실시예 31: APCDD1 이 누드 생쥐의 종양 성장에 미치는 영향
생체 내에서 APCDD1의 역할을 알아보기 LoVo-APCDD1 세포의 클론 두 개 또는 LoVo-mock 세포의 클론 두 개를 12 BALB/cAnN Crj-nu/nu 생쥐로 피하이식 하였다. 구체적으로, 종양 세포 LoVo-APCDD1 또는 LoVo-벡터를 최종농도 5 x 107 cells/ml에 맞추고 100 ml를 BALB/cAnN Crj-nu/nu 생쥐의 등 뒤 가운데(posterior mid-dorsum) 피하로 각각 투여하였다. 종양은 8주 동안 7일 마다 측정하였고 부피는 V = π/6 x a 2 x b의 식으로 측정하였다. 이때, a는 단축, b는 장축을 나타낸다.
그 결과, 이식 8주 후에 LoVo-APCDD1 클론의 평균 종양 크기는 약 482 및 653 mm3인 반면 LoVo-mock 클론의 평균 종양 크기는 65 및 277 mm3이었다; 이는 APCDD1의 도입으로 생체내에서 세포의 성장이 촉진되었음을 나타낸다(도 30d).
실시예 32: APCDD1 의 발현을 감소시키는 안티센스 S-올리고뉴클레오티드의 성장-억제 효과
APCDD1의 성장-촉진 효과를 알아보기 위하여, 다양한 쌍의 대조군과 APCDD1의 안티센스 S-올리고뉴클레오티드를 합성하여 SW480 세포로 형질감염시켰다. 상기 세포는 실험한 11가지의 결장암 세포주 중에서 APCDD1을 가장 많이 발현하는 세포이다. SW480 세포가 SNU475 세포 대신에 사용한 것과 다음의 S-올리고뉴클레오티드 APCDD1-S2를 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 5에서 기술된 방법에 따라 실험을 수행하였다:
대조군인 센스 S-올리고뉴클레오티드 APCDD1-S2,
5'-ATGTCCTGGCCGCGCC-3'(서열번호 88);
안티센스 S-올리고뉴클레오티드 APCDD1-AS2,
5'-GGCGCGGCCAGGACAT-3'(서열번호 89);
역방향 S-올리고뉴클레오티드 APCDD1-R2,
5'-TACAGGACCGGCGCGG-3'(서열번호 90); 및
혼합한(scrambled) S-올리고뉴클레오티드 APCDD1-Sc2
5'-ATCTGGTCCGGCGCGG-3'(서열번호 91).
상기 뉴클레오타이드 중에, APCDD1-AS2는 세포내에서 대조군 APCDD1-S1에 비해 APCDD1의 발현을 유의하게 억제하였다(도31a). 흥미롭게도, 형질감염 6일 후에, APCDD1-AS2의 도입은 APCDD1-S2을 도입한 것에 비해 세포의 콜로니 형성을 확실히 억제하였다. 이는 APCDD1 억제가 형질감염된 세포의 성장과/또는 생존을 감소시킨다는 것을 나타낸다(도 31b). MTT 어세이로 APCDD1-R2, APCDD1-Sc2 및 처리하지 않은 세포와 비교할 때, APCDD1-AS2에 의해 세포 생존이 감소한다는 것을 확인하였다(도 31c).
실시예 33: 결장암 세포주에서 APCDD1 의 발현
APCDD1의 발현과 작용을 알아보기 위하여, APCDD1에 대한 다클론성 항체를 다음과 같이 제조하였다. 먼저, 재조합 His-표지된 APCDD1 단백질을 E. coli에서 생산하고 제조사의 권고 프로토콜에 따라 Pro BondTM 히스티딘 수지(Invitrogen)를 사용하여 세포로부터 분리하였다. 재조합 단백질은 토끼를 면역하는데 사용하였다. 혈청으로부터 APCDD1에 대한 다클론성 항체를 분리하였다. 웨스턴 블롯 분석을 위하여 단백질을 10% SDS-PAGE로 분리하고 항-APCDD1 항체로 면역블롯팅 하였다. HRP-연결된 염소 항-토끼 IgG(HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG, Santa Cruz Biotechnology)는 ECL 탐색 시스템(Amersham Pharmacia Biotech)의 이차항체로 사용하였다.
SW480 세포와 동결된 조직의 면역조직화학적 염색 또한 항-APCDD1 항체를 사용하여 상기 실시예 18에 기재된 바와 같이 수행되었다. 제조사의 프로토콜에 따라, 파라핀-포매 조직 박리절편(paraffin-embeded tissue section)을 SAB-PO 퍼옥시다제 면역염색 시스템(Nichirei)으로 면역염색하였다.
전자레인지에서 700W로 10분 동안 슬라이드를 구연산 완충용액(pH6)으로 전처리함으로써, 파라핀을 제거하고 재수화한 조직으로부터 항원을 복구시켰다. HCT116, SNUC4 및 SW480를 포함한 결장암 세포 추출물을 사용하여 항-APCDD1 항체로 웨스턴 블롯 분석을 실시한 결과 APCDD1에 해당하는 58 kDa 밴드를 확인하였다(도 32). 세포내 APCDD1 단백질의 크기는 항-FLAG 항체로 검출한 외래의 FLAG-표지된 APCDD1 단백질의 크기와 매우 비슷했다. APCDD1은 세 가지 결장암 세포주 중 SW480에서 가장 많이 발현되었다.
실시예 34: 결장암 세포와 조직에서 APCDD1의 세포내 위치
APCDD1의 세포내 위치를 알아보기 위하여, SW480 세포로 APCDD1에 형광 면역조직화학 염색을 수행하였다. 세포들을 고정하고, 항-APCDD1 항체를 처리한 후 형광 결합된 이차항체를 이용하여 결과를 시각적으로 나타내었다(도 33).
비종양성 결장 점막조직 및 암 조직에서 APCDD1의 발현 또한 염색으로 확인한 결과, 비종양성 세포 및 암 세포의 세포질 모두에서 APCDD1가 발현하는 것으로 나타났다(도34). 특히, 상피세포의 정단판(apical boarder)에서 강한 신호가 관찰되었다.
실시예 35: 결장의 정상적인 상피, 선종, 및 결장암에서 APCDD1의 발현
비종양성 상피세포와 종양 세포에서 APCDD1 단백질의 발현 수치를 비교하기 위하여 파라핀-포매 조직을 면역조직화학적으로 염색하였다. 암세포는 항-APCDD1 항체로 비종양성 상피세포보다 더 강하게 염색이 되었다(도 35). 부가하여, 선종세포에서도 약한 신호가 관찰되었다(도 36).
신규한 인간 유전자인 WDRPUH 과 KRZFPUH은 비종양성 간 조직과 비교할 때 간세포암 세포에서 발현이 현저히 증가한다. 반면 신규한 인간 유전자인 PPIL1과 APCDD1와는 암이 아닌 조직과 비교할 때 결장암 세포에서 발현이 현저히 증가한다. 따라서, 상기 유전자들은 암의 진단 마커로 사용될 수 있고, 이로부터 코딩되는 단백질은 진단분석에 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 신규한 단백질인 WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1 또는 APCDD1의 발현이 세포 성장을 촉진하고 WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1 또는 APCDD1 유전자에 상응하는 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 siRNA에 의해 세포 성장이 억제된다는 것을 보여주었다. 이러한 발견은 WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1 또는 APCDD1 단백질이 발암활성을 자극한다는 것을 나타낸다. 그러므로, 이러한 신규한 암단백질은 항암제 개발을 위한 유용한 표적이다. 예를 들어, WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1 또는 APCDD1의 발현을 억제하거나 활성을 막는 물질은 항암제, 특히 간세포암과 결장암 치료를 위한 항암제로 사용될 수 있다. 그러한 물질의 예는 WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1 또는 APCDD1를 인식하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA 및 항체를 포함한다.
더 나아가, 본 발명자들은 PPIL1이 직접적으로 스타트민과 결합한다는 것을 입증하였는데, 상기 결과는 PPIL1이 생체내에서 스타트민의 인산화를 촉진하는 기능이 있다는 것을 나타낸다. 스타트민은 세포 주기 진행에 관련되어 있고 다양한 종류의 암에 연관되어 있다고 보고되었으므로, 복합체의 활성을 억제하는 물질은 또한 결장암 치료 및 예방에 사용될 수 있다.
더욱이, 본 발명은 베타-카테닌/Tcf-4 복합체와 APCDD1의 두 개의 Tcf/LEF 결합 모티프의 결합이 APCDD1 의 전사 활성화에 관련되어 있다는 것을 입증하였다. 그러므로, 상기 복합체가 상기 결합 모티프에 결합하는 것을 방해하는 물질 또한 결장암 치료 및 예방에 사용될 수 있다.
본 발명은 상세하게 그리고 구체적인 실시예로 기재되어 있으나, 본 발명의 정신과 범위로부터 벗어나지 않는 다양한 변화와 변형이 만들어질 수 있다는 것은 당업자에게 있어서 매우 자명하다.
<110> ONCOTHERAPY SCIENCE, INC. JAPAN AS REPRESENTED BY THE PRESIDENT OF THE UNIVERSITY OF TOKYO <120> GENES AND POLYPEPTIDES RELATING TO HEPATOCELLULAR OR COLORECTAL CARCINOMA <130> 4fpi-11-12 <150> US 60/386,985 <151> 2002-06-06 <160> 111 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 2152 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (35)..(1894) <223> WDRPUH <400> 1 agcgggagag caaagtaatc agaacctccc aagg atg gat aac aaa att 49 Met Asp Asn Lys Ile 1 5 tcg ccg gag gcc caa gtg gcg gag ctg gaa ctt gac gcc gtg atc ggc 97 Ser Pro Glu Ala Gln Val Ala Glu Leu Glu Leu Asp Ala Val Ile Gly 10 15 20 ttc aat gga cat gtg ccc act ggt ctc aaa tgc cat cct gac cag gag 145 Phe Asn Gly His Val Pro Thr Gly Leu Lys Cys His Pro Asp Gln Glu 25 30 35 cat atg att tat cct ctt ggt tgc aca gtc ctc att cag gca ata aat 193 His Met Ile Tyr Pro Leu Gly Cys Thr Val Leu Ile Gln Ala Ile Asn 40 45 50 act aaa gag cag aac ttc cta cag ggt cat ggc aac aac gtc tcc tgc 241 Thr Lys Glu Gln Asn Phe Leu Gln Gly His Gly Asn Asn Val Ser Cys 55 60 65 ttg gcc atc tcc agg tct gga gag tac atc gcc tcc gga caa gtc aca 289 Leu Ala Ile Ser Arg Ser Gly Glu Tyr Ile Ala Ser Gly Gln Val Thr 70 75 80 85 ttc atg ggg ttc aag gca gac atc att ttg tgg gat tat aag aac aga 337 Phe Met Gly Phe Lys Ala Asp Ile Ile Leu Trp Asp Tyr Lys Asn Arg 90 95 100 gag ctg ctt gct cgg ctg tcc ctt cac aaa ggc aaa att gaa gct ctg 385 Glu Leu Leu Ala Arg Leu Ser Leu His Lys Gly Lys Ile Glu Ala Leu 105 110 115 gcc ttt tct cca aat gat ttg tac ttg gta tca cta gga ggc cca gat 433 Ala Phe Ser Pro Asn Asp Leu Tyr Leu Val Ser Leu Gly Gly Pro Asp 120 125 130 gac gga agt gtg gtg gtg tgg agc ata gcc aag aga gat gcc atc tgt 481 Asp Gly Ser Val Val Val Trp Ser Ile Ala Lys Arg Asp Ala Ile Cys 135 140 145 ggc agc cct gca gcc ggc ctc aat gtt ggc aat gcc acc aat gtg atc 529 Gly Ser Pro Ala Ala Gly Leu Asn Val Gly Asn Ala Thr Asn Val Ile 150 155 160 165 ttc tcc agg tgc cgg gat gag atg ttt atg act gct gga aat ggg aca 577 Phe Ser Arg Cys Arg Asp Glu Met Phe Met Thr Ala Gly Asn Gly Thr 170 175 180 att cga gta tgg gaa ttg gat ctt cca aat aga aaa atc tgg cca act 625 Ile Arg Val Trp Glu Leu Asp Leu Pro Asn Arg Lys Ile Trp Pro Thr 185 190 195 gag tgc caa aca gga cag ttg aaa aga ata gtc atg agt att gga gtg 673 Glu Cys Gln Thr Gly Gln Leu Lys Arg Ile Val Met Ser Ile Gly Val 200 205 210 gat gat gat gat agc ttt ttc tac ctt ggc acc acg act gga gat att 721 Asp Asp Asp Asp Ser Phe Phe Tyr Leu Gly Thr Thr Thr Gly Asp Ile 215 220 225 cta aaa atg aac ccc agg act aaa ctg ctg aca gat gtt ggg cct gcg 769 Leu Lys Met Asn Pro Arg Thr Lys Leu Leu Thr Asp Val Gly Pro Ala 230 235 240 245 aag gac aaa ttc agt ttg gga gtg tca gct atc agg tgc ctg aag atg 817 Lys Asp Lys Phe Ser Leu Gly Val Ser Ala Ile Arg Cys Leu Lys Met 250 255 260 ggg ggt ttg ttg gtg ggc tct gga gcc gga ctg ctg gtc ttc tgt aaa 865 Gly Gly Leu Leu Val Gly Ser Gly Ala Gly Leu Leu Val Phe Cys Lys 265 270 275 agc cct ggc tac aaa ccc atc aag aag att cag tta caa ggc ggc atc 913 Ser Pro Gly Tyr Lys Pro Ile Lys Lys Ile Gln Leu Gln Gly Gly Ile 280 285 290 act tct atc aca ctt cga gga gaa gga cac cag ttt ctc gta gga aca 961 Thr Ser Ile Thr Leu Arg Gly Glu Gly His Gln Phe Leu Val Gly Thr 295 300 305 gaa gaa tcg cac att tat cgt gtc agc ttc acg gat ttc aaa gag acg 1009 Glu Glu Ser His Ile Tyr Arg Val Ser Phe Thr Asp Phe Lys Glu Thr 310 315 320 325 ctc ata gcg act tgt cac ttt gat gct gtc gag gat att gtc ttt cca 1057 Leu Ile Ala Thr Cys His Phe Asp Ala Val Glu Asp Ile Val Phe Pro 330 335 340 ttt ggc act gct gag cta ttt gca acc tgt gcc aag aag gat atc agg 1105 Phe Gly Thr Ala Glu Leu Phe Ala Thr Cys Ala Lys Lys Asp Ile Arg 345 350 355 gtg tgg cac aca tca tcc aac agg gag ctg ctg cgg atc acc gtg ccc 1153 Val Trp His Thr Ser Ser Asn Arg Glu Leu Leu Arg Ile Thr Val Pro 360 365 370 aac atg acc tgc cac ggc atc gac ttc atg agg gac ggc aaa agc atc 1201 Asn Met Thr Cys His Gly Ile Asp Phe Met Arg Asp Gly Lys Ser Ile 375 380 385 att tca gca tgg aac gac ggt aaa atc cga gcc ttc gcc cca gag aca 1249 Ile Ser Ala Trp Asn Asp Gly Lys Ile Arg Ala Phe Ala Pro Glu Thr 390 395 400 405 ggc cga ctg atg tat gtc att aac aat gct cac agg atc ggc gtc acc 1297 Gly Arg Leu Met Tyr Val Ile Asn Asn Ala His Arg Ile Gly Val Thr 410 415 420 gcc atc gcc acc acc agt gac tgt aaa agg gtc atc agt ggc ggt ggg 1345 Ala Ile Ala Thr Thr Ser Asp Cys Lys Arg Val Ile Ser Gly Gly Gly 425 430 435 gaa ggg gag gtg agg gta tgg cag ata ggc tgt cag acc cag aag ctg 1393 Glu Gly Glu Val Arg Val Trp Gln Ile Gly Cys Gln Thr Gln Lys Leu 440 445 450 gag gag gcc ctg aag gaa cac aag tca tca gtg tcc tgc att agg gtg 1441 Glu Glu Ala Leu Lys Glu His Lys Ser Ser Val Ser Cys Ile Arg Val 455 460 465 aag agg aac aac gag gag tgt gtc acc gcc agc acc gat ggg act tgt 1489 Lys Arg Asn Asn Glu Glu Cys Val Thr Ala Ser Thr Asp Gly Thr Cys 470 475 480 485 atc att tgg gac ctt gtg cgt ctc agg agg aat cag atg ata cta gcc 1537 Ile Ile Trp Asp Leu Val Arg Leu Arg Arg Asn Gln Met Ile Leu Ala 490 495 500 aac acc tta ttc cag tgt gtg tgc tat cac cct gag gag ttc cag atc 1585 Asn Thr Leu Phe Gln Cys Val Cys Tyr His Pro Glu Glu Phe Gln Ile 505 510 515 atc acc agc gga aca gac aga aag att gct tac tgg gaa gta ttt gat 1633 Ile Thr Ser Gly Thr Asp Arg Lys Ile Ala Tyr Trp Glu Val Phe Asp 520 525 530 ggg aca gta atc aga gaa ttg gaa ggt tcc ctg tct ggg tcg ata aat 1681 Gly Thr Val Ile Arg Glu Leu Glu Gly Ser Leu Ser Gly Ser Ile Asn 535 540 545 ggc atg gat atc aca cag gaa ggg gtg cac ttt gtc aca ggt gga aat 1729 Gly Met Asp Ile Thr Gln Glu Gly Val His Phe Val Thr Gly Gly Asn 550 555 560 565 gac cat ctg gtc aaa gtt tgg gat tat aat gag ggt gaa gtg act cac 1777 Asp His Leu Val Lys Val Trp Asp Tyr Asn Glu Gly Glu Val Thr His 570 575 580 gtt ggg gtg gga cac agt ggc aac atc aca cgc atc cgc ata agt cca 1825 Val Gly Val Gly His Ser Gly Asn Ile Thr Arg Ile Arg Ile Ser Pro 585 590 595 gga aat caa tat att gtt agt gta agt gcc gat gga gcc att ttg cga 1873 Gly Asn Gln Tyr Ile Val Ser Val Ser Ala Asp Gly Ala Ile Leu Arg 600 605 610 tgg aag tac cca tat acc tcc tgaagc tgatgagatg tctctgagcc 1920 Trp Lys Tyr Pro Tyr Thr Ser 615 620 ttggcgttgc acgcagtcct gttgaagact gagtttagat aactccaaca ctagtcttca 1980 tttctcacag ctctgttttt gttcttgagt caatttttct ctttttcttt atagaatgca 2040 ttttatattc ttaaattgca tattaaaatt gaagtatgtt caagaataat ttgtgcagac 2100 tctaattaga acttttaaca ttttgaataa attcttagtt gttggtaaaa aa 2152 <210> 2 <211> 620 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Asp Asn Lys Ile Ser Pro Glu Ala Gln Val Ala Glu Leu Glu Leu 1 5 10 15 Asp Ala Val Ile Gly Phe Asn Gly His Val Pro Thr Gly Leu Lys Cys 20 25 30 His Pro Asp Gln Glu His Met Ile Tyr Pro Leu Gly Cys Thr Val Leu 35 40 45 Ile Gln Ala Ile Asn Thr Lys Glu Gln Asn Phe Leu Gln Gly His Gly 50 55 60 Asn Asn Val Ser Cys Leu Ala Ile Ser Arg Ser Gly Glu Tyr Ile Ala 65 70 75 80 Ser Gly Gln Val Thr Phe Met Gly Phe Lys Ala Asp Ile Ile Leu Trp 85 90 95 Asp Tyr Lys Asn Arg Glu Leu Leu Ala Arg Leu Ser Leu His Lys Gly 100 105 110 Lys Ile Glu Ala Leu Ala Phe Ser Pro Asn Asp Leu Tyr Leu Val Ser 115 120 125 Leu Gly Gly Pro Asp Asp Gly Ser Val Val Val Trp Ser Ile Ala Lys 130 135 140 Arg Asp Ala Ile Cys Gly Ser Pro Ala Ala Gly Leu Asn Val Gly Asn 145 150 155 160 Ala Thr Asn Val Ile Phe Ser Arg Cys Arg Asp Glu Met Phe Met Thr 165 170 175 Ala Gly Asn Gly Thr Ile Arg Val Trp Glu Leu Asp Leu Pro Asn Arg 180 185 190 Lys Ile Trp Pro Thr Glu Cys Gln Thr Gly Gln Leu Lys Arg Ile Val 195 200 205 Met Ser Ile Gly Val Asp Asp Asp Asp Ser Phe Phe Tyr Leu Gly Thr 210 215 220 Thr Thr Gly Asp Ile Leu Lys Met Asn Pro Arg Thr Lys Leu Leu Thr 225 230 235 240 Asp Val Gly Pro Ala Lys Asp Lys Phe Ser Leu Gly Val Ser Ala Ile 245 250 255 Arg Cys Leu Lys Met Gly Gly Leu Leu Val Gly Ser Gly Ala Gly Leu 260 265 270 Leu Val Phe Cys Lys Ser Pro Gly Tyr Lys Pro Ile Lys Lys Ile Gln 275 280 285 Leu Gln Gly Gly Ile Thr Ser Ile Thr Leu Arg Gly Glu Gly His Gln 290 295 300 Phe Leu Val Gly Thr Glu Glu Ser His Ile Tyr Arg Val Ser Phe Thr 305 310 315 320 Asp Phe Lys Glu Thr Leu Ile Ala Thr Cys His Phe Asp Ala Val Glu 325 330 335 Asp Ile Val Phe Pro Phe Gly Thr Ala Glu Leu Phe Ala Thr Cys Ala 340 345 350 Lys Lys Asp Ile Arg Val Trp His Thr Ser Ser Asn Arg Glu Leu Leu 355 360 365 Arg Ile Thr Val Pro Asn Met Thr Cys His Gly Ile Asp Phe Met Arg 370 375 380 Asp Gly Lys Ser Ile Ile Ser Ala Trp Asn Asp Gly Lys Ile Arg Ala 385 390 395 400 Phe Ala Pro Glu Thr Gly Arg Leu Met Tyr Val Ile Asn Asn Ala His 405 410 415 Arg Ile Gly Val Thr Ala Ile Ala Thr Thr Ser Asp Cys Lys Arg Val 420 425 430 Ile Ser Gly Gly Gly Glu Gly Glu Val Arg Val Trp Gln Ile Gly Cys 435 440 445 Gln Thr Gln Lys Leu Glu Glu Ala Leu Lys Glu His Lys Ser Ser Val 450 455 460 Ser Cys Ile Arg Val Lys Arg Asn Asn Glu Glu Cys Val Thr Ala Ser 465 470 475 480 Thr Asp Gly Thr Cys Ile Ile Trp Asp Leu Val Arg Leu Arg Arg Asn 485 490 495 Gln Met Ile Leu Ala Asn Thr Leu Phe Gln Cys Val Cys Tyr His Pro 500 505 510 Glu Glu Phe Gln Ile Ile Thr Ser Gly Thr Asp Arg Lys Ile Ala Tyr 515 520 525 Trp Glu Val Phe Asp Gly Thr Val Ile Arg Glu Leu Glu Gly Ser Leu 530 535 540 Ser Gly Ser Ile Asn Gly Met Asp Ile Thr Gln Glu Gly Val His Phe 545 550 555 560 Val Thr Gly Gly Asn Asp His Leu Val Lys Val Trp Asp Tyr Asn Glu 565 570 575 Gly Glu Val Thr His Val Gly Val Gly His Ser Gly Asn Ile Thr Arg 580 585 590 Ile Arg Ile Ser Pro Gly Asn Gln Tyr Ile Val Ser Val Ser Ala Asp 595 600 605 Gly Ala Ile Leu Arg Trp Lys Tyr Pro Tyr Thr Ser 610 615 620 <210> 3 <211> 2744 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (343)..(1842) <223> KRZFPUH <400> 3 acacttgagg gcaaagaggt taggaagccg gcatggcgct ccggtcaata aaatcgatag 60 ctggaagctg cctgtgttcc aggcaaaggc ggtgcggtag cagcgccgcc attttccccg 120 aaggcatctt ccggtgcctt tcacccaagt tcgggcagga gtttcctgaa taacagcaaa 180 aggtttccgt tagccccgcg ggcgaccaat tccgattccc tccgggcctc cccggccacg 240 ctcagccctg gtccggcagg ggctcctcga tcccaggggc cgccagcgcc cgagggccga 300 ggcctggaca cggaaggccg tggcgccggc ttctcgggtc cc atg gcg cca 351 Met Ala Pro 1 cct tcg gct ccg ctc cct gcg cag gga cca gga aag gcc aga ccc agt 399 Pro Ser Ala Pro Leu Pro Ala Gln Gly Pro Gly Lys Ala Arg Pro Ser 5 10 15 cgg aaa agg ggc agg agg ccg agg gct ctg aag ttc gtg gac gtg gcc 447 Arg Lys Arg Gly Arg Arg Pro Arg Ala Leu Lys Phe Val Asp Val Ala 20 25 30 35 gtg tac ttc tcc ccg gag gag tgg ggc tgc ctg cgg ccc gcg cag agg 495 Val Tyr Phe Ser Pro Glu Glu Trp Gly Cys Leu Arg Pro Ala Gln Arg 40 45 50 gcc ctg tac cgg gac gtg atg cgg gag acc tac ggt cac ctg ggc gcg 543 Ala Leu Tyr Arg Asp Val Met Arg Glu Thr Tyr Gly His Leu Gly Ala 55 60 65 ctc ggg tgc gca ggt ccc aaa cca gcc ctc atc tcc tgg ttg gaa cga 591 Leu Gly Cys Ala Gly Pro Lys Pro Ala Leu Ile Ser Trp Leu Glu Arg 70 75 80 aac acc gat gac tgg gaa ccg gct gct cta gat ccg cag gag tac ccg 639 Asn Thr Asp Asp Trp Glu Pro Ala Ala Leu Asp Pro Gln Glu Tyr Pro 85 90 95 aga ggg cta aca gtc cag aga aaa agc aga acc aga aag aag aat ggg 687 Arg Gly Leu Thr Val Gln Arg Lys Ser Arg Thr Arg Lys Lys Asn Gly 100 105 110 115 gag aag gaa gta ttc ccg cct aag gag gca ccc cga aag ggg aag cga 735 Glu Lys Glu Val Phe Pro Pro Lys Glu Ala Pro Arg Lys Gly Lys Arg 120 125 130 ggc cgg agg ccc agc aaa ccc cga ctg att cct agg cag acg tcc ggg 783 Gly Arg Arg Pro Ser Lys Pro Arg Leu Ile Pro Arg Gln Thr Ser Gly 135 140 145 ggc ccc atc tgc cct gac tgc ggc tgt acc ttc cct gat cat cag gcc 831 Gly Pro Ile Cys Pro Asp Cys Gly Cys Thr Phe Pro Asp His Gln Ala 150 155 160 ctg gag agc cac aag tgc gcc cag aat cta aaa aag cct tac cct tgc 879 Leu Glu Ser His Lys Cys Ala Gln Asn Leu Lys Lys Pro Tyr Pro Cys 165 170 175 cca gac tgt ggg cgc cgc ttt tcc tat cca tcc ctg ctg gtc agt cac 927 Pro Asp Cys Gly Arg Arg Phe Ser Tyr Pro Ser Leu Leu Val Ser His 180 185 190 195 cgg cgg gca cac tcc ggc gag tgc ccc tat gtt tgt gac cag tgt ggc 975 Arg Arg Ala His Ser Gly Glu Cys Pro Tyr Val Cys Asp Gln Cys Gly 200 205 210 aaa cgt ttc tcc cag cgc aag aac ctc tcc cag cac cag gtc atc cat 1023 Lys Arg Phe Ser Gln Arg Lys Asn Leu Ser Gln His Gln Val Ile His 215 220 225 aca ggg gag aag ccc tat cac tgc cct gac tgt ggt cgc tgc ttc cgg 1071 Thr Gly Glu Lys Pro Tyr His Cys Pro Asp Cys Gly Arg Cys Phe Arg 230 235 240 agg agc cgg tcc ttg gcc aat cac cgg acc aca cac aca ggt gaa aaa 1119 Arg Ser Arg Ser Leu Ala Asn His Arg Thr Thr His Thr Gly Glu Lys 245 250 255 ccc cac cag tgc cct agc tgt gga cgt cgc ttc gcc tac ccc tcc ctg 1167 Pro His Gln Cys Pro Ser Cys Gly Arg Arg Phe Ala Tyr Pro Ser Leu 260 265 270 275 cta gcc atc cac cag cgt aca cac acg gga gag aag ccc tac act tgc 1215 Leu Ala Ile His Gln Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Thr Cys 280 285 290 ctc gag tgc aac cgc cgc ttc cgc cag cgc acg gcc ctc gtc atc cac 1263 Leu Glu Cys Asn Arg Arg Phe Arg Gln Arg Thr Ala Leu Val Ile His 295 300 305 cag cgc atc cac acg ggc gag aag ccc tac ccg tgc ccg gac tgc gag 1311 Gln Arg Ile His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Pro Cys Pro Asp Cys Glu 310 315 320 cgg cgc ttc tcc tcc tcc tct cgc ctg gtc agt cac cgg cgt gtg cac 1359 Arg Arg Phe Ser Ser Ser Ser Arg Leu Val Ser His Arg Arg Val His 325 330 335 tct ggg gag cgt ccc tat gcc tgc gag cac tgt gag gcc cgc ttc tcc 1407 Ser Gly Glu Arg Pro Tyr Ala Cys Glu His Cys Glu Ala Arg Phe Ser 340 345 350 355 cag cgc agc acg ctg ctc cag cac cag ctc ttg cac acc gga gag aag 1455 Gln Arg Ser Thr Leu Leu Gln His Gln Leu Leu His Thr Gly Glu Lys 360 365 370 ccc tac ccc tgc cca gac tgt ggg cgt gcc ttc cgg cgg agc ggc tcc 1503 Pro Tyr Pro Cys Pro Asp Cys Gly Arg Ala Phe Arg Arg Ser Gly Ser 375 380 385 ctg gcc atc cat cgc agc acg cac aca gag gag aag ctg cac gcc tgc 1551 Leu Ala Ile His Arg Ser Thr His Thr Glu Glu Lys Leu His Ala Cys 390 395 400 gac gac tgt ggt cgc cgc ttt gcc tac ccc tca ctg ctg gcc agc cac 1599 Asp Asp Cys Gly Arg Arg Phe Ala Tyr Pro Ser Leu Leu Ala Ser His 405 410 415 cgg cgc gtg cac tcg ggc gag cgg ccc tat gcc tgc gac ctt tgc tcc 1647 Arg Arg Val His Ser Gly Glu Arg Pro Tyr Ala Cys Asp Leu Cys Ser 420 425 430 435 aag cgt ttt gct cag tgg agc cac ctg gcc cag cac cag ctg ctg cac 1695 Lys Arg Phe Ala Gln Trp Ser His Leu Ala Gln His Gln Leu Leu His 440 445 450 acg ggg gag aag cct ttc ccc tgc ctc gag tgt ggc cgg tgc ttc cgc 1743 Thr Gly Glu Lys Pro Phe Pro Cys Leu Glu Cys Gly Arg Cys Phe Arg 455 460 465 cag agg tgg tct ctg gct gtc cac aag tgt agc ccc aag gcc cca aac 1791 Gln Arg Trp Ser Leu Ala Val His Lys Cys Ser Pro Lys Ala Pro Asn 470 475 480 tgt agc cct aga tct gct atc ggg ggc tcc agt cag agg ggc aac gcc 1839 Cys Ser Pro Arg Ser Ala Ile Gly Gly Ser Ser Gln Arg Gly Asn Ala 485 490 495 cat tagaaggg gaaggactgc ctacgttcat ttcattttat ggagggtccc 1890 His 500 agaaaaggga aggaggagcc ccaggtcata cagggcagag tcagaactaa acccgggtct 1950 cctgctgcac agagctgaac tttgtatctt gcaatgcgct ggctgcctcc ctgtgcgtgt 2010 ctggaacagt cccattagga gaggtgacgt catttgctta aagttttcca agctacccta 2070 tcctaaaata gtttgtgtgg atatcagggc taaaagttct ccccatctat tttaggggct 2130 gtctgctttt ctagtctgtc cacacaggga ttacctgtca tcttgcatgc aatcaggaga 2190 atctcatagg ggcaggacct tcccctactc tgcctcttcc tccatactag gttggaaaaa 2250 tctggtttag cccacttttt gcaacactcc tgccaagtgg tcttctaccc attgcttgaa 2310 aatctctctt gacagggagc tcactacctc acaaggcagg tcatttcatt gtgggatcta 2370 tagaaggtta agtaccacat tctcctctaa accttgccta cgacatgttt aatacttcat 2430 ctacatagca gcccttcaga taatcacaac cactttgccc ccaagttttc aggttaagta 2490 gcatgaattt ggtcattcct taaagacagg gtttcaattt ccacacatga tctctgcaaa 2550 caggcactgg gttttcagtg tcctttttga agggtcatat aaaaataagg taacaccaca 2610 gtgccactac accttctggg gctggacttg tttcagcagc tttggttgca ctgaatttgg 2670 gggagctgca tggtaccagg ggtttattgg gttgcagata tataaatgcc ctaaacttaa 2730 aaaaaaaaaa aaaa 2744 <210> 4 <211> 500 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Ala Pro Pro Ser Ala Pro Leu Pro Ala Gln Gly Pro Gly Lys Ala 1 5 10 15 Arg Pro Ser Arg Lys Arg Gly Arg Arg Pro Arg Ala Leu Lys Phe Val 20 25 30 Asp Val Ala Val Tyr Phe Ser Pro Glu Glu Trp Gly Cys Leu Arg Pro 35 40 45 Ala Gln Arg Ala Leu Tyr Arg Asp Val Met Arg Glu Thr Tyr Gly His 50 55 60 Leu Gly Ala Leu Gly Cys Ala Gly Pro Lys Pro Ala Leu Ile Ser Trp 65 70 75 80 Leu Glu Arg Asn Thr Asp Asp Trp Glu Pro Ala Ala Leu Asp Pro Gln 85 90 95 Glu Tyr Pro Arg Gly Leu Thr Val Gln Arg Lys Ser Arg Thr Arg Lys 100 105 110 Lys Asn Gly Glu Lys Glu Val Phe Pro Pro Lys Glu Ala Pro Arg Lys 115 120 125 Gly Lys Arg Gly Arg Arg Pro Ser Lys Pro Arg Leu Ile Pro Arg Gln 130 135 140 Thr Ser Gly Gly Pro Ile Cys Pro Asp Cys Gly Cys Thr Phe Pro Asp 145 150 155 160 His Gln Ala Leu Glu Ser His Lys Cys Ala Gln Asn Leu Lys Lys Pro 165 170 175 Tyr Pro Cys Pro Asp Cys Gly Arg Arg Phe Ser Tyr Pro Ser Leu Leu 180 185 190 Val Ser His Arg Arg Ala His Ser Gly Glu Cys Pro Tyr Val Cys Asp 195 200 205 Gln Cys Gly Lys Arg Phe Ser Gln Arg Lys Asn Leu Ser Gln His Gln 210 215 220 Val Ile His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr His Cys Pro Asp Cys Gly Arg 225 230 235 240 Cys Phe Arg Arg Ser Arg Ser Leu Ala Asn His Arg Thr Thr His Thr 245 250 255 Gly Glu Lys Pro His Gln Cys Pro Ser Cys Gly Arg Arg Phe Ala Tyr 260 265 270 Pro Ser Leu Leu Ala Ile His Gln Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Pro 275 280 285 Tyr Thr Cys Leu Glu Cys Asn Arg Arg Phe Arg Gln Arg Thr Ala Leu 290 295 300 Val Ile His Gln Arg Ile His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Pro Cys Pro 305 310 315 320 Asp Cys Glu Arg Arg Phe Ser Ser Ser Ser Arg Leu Val Ser His Arg 325 330 335 Arg Val His Ser Gly Glu Arg Pro Tyr Ala Cys Glu His Cys Glu Ala 340 345 350 Arg Phe Ser Gln Arg Ser Thr Leu Leu Gln His Gln Leu Leu His Thr 355 360 365 Gly Glu Lys Pro Tyr Pro Cys Pro Asp Cys Gly Arg Ala Phe Arg Arg 370 375 380 Ser Gly Ser Leu Ala Ile His Arg Ser Thr His Thr Glu Glu Lys Leu 385 390 395 400 His Ala Cys Asp Asp Cys Gly Arg Arg Phe Ala Tyr Pro Ser Leu Leu 405 410 415 Ala Ser His Arg Arg Val His Ser Gly Glu Arg Pro Tyr Ala Cys Asp 420 425 430 Leu Cys Ser Lys Arg Phe Ala Gln Trp Ser His Leu Ala Gln His Gln 435 440 445 Leu Leu His Thr Gly Glu Lys Pro Phe Pro Cys Leu Glu Cys Gly Arg 450 455 460 Cys Phe Arg Gln Arg Trp Ser Leu Ala Val His Lys Cys Ser Pro Lys 465 470 475 480 Ala Pro Asn Cys Ser Pro Arg Ser Ala Ile Gly Gly Ser Ser Gln Arg 485 490 495 Gly Asn Ala His 500 <210> 5 <211> 1706 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (205)..(702) <223> PPIL1 <400> 5 tgttcttgag cccagcttct tctcgtctcc caccccagct tcccggcatt ggaagaaggg 60 accgtcctct tccttgtctt ggccacccaa atcctggtat cgaaagggtt gaacggaccg 120 gaagtgtgca gcagcgacgg gtccccagct aatcgacgcc ggaagtagca attactagac 180 aagcattccg ccgccggctt cgct atg gcg gca att ccc cca gat tcc 228 Met Ala Ala Ile Pro Pro Asp Ser 1 5 tgg cag cca ccc aac gtt tac ttg gag acc agc atg gga atc att gtg 276 Trp Gln Pro Pro Asn Val Tyr Leu Glu Thr Ser Met Gly Ile Ile Val 10 15 20 ctg gag ctg tac tgg aag cat gct cca aag acc tgt aag aac ttt gct 324 Leu Glu Leu Tyr Trp Lys His Ala Pro Lys Thr Cys Lys Asn Phe Ala 25 30 35 40 gag ttg gct cgt cga ggt tac tac aat ggc aca aaa ttc cac aga att 372 Glu Leu Ala Arg Arg Gly Tyr Tyr Asn Gly Thr Lys Phe His Arg Ile 45 50 55 atc aaa gac ttc atg atc caa gga ggt gac cca aca ggg aca ggt cga 420 Ile Lys Asp Phe Met Ile Gln Gly Gly Asp Pro Thr Gly Thr Gly Arg 60 65 70 ggt ggt gca tct atc tat ggc aaa cag ttt gaa gat gaa ctt cat cca 468 Gly Gly Ala Ser Ile Tyr Gly Lys Gln Phe Glu Asp Glu Leu His Pro 75 80 85 gac ttg aaa ttc acg ggg gct gga att ctc gca atg gcc aat gcg ggg 516 Asp Leu Lys Phe Thr Gly Ala Gly Ile Leu Ala Met Ala Asn Ala Gly 90 95 100 cca gat acc aat ggc agc cag ttc ttt gtg acc ctc gcc ccc acc cag 564 Pro Asp Thr Asn Gly Ser Gln Phe Phe Val Thr Leu Ala Pro Thr Gln 105 110 115 120 tgg ctt gac ggc aaa cac acc att ttt ggc cga gtg tgt cag ggc ata 612 Trp Leu Asp Gly Lys His Thr Ile Phe Gly Arg Val Cys Gln Gly Ile 125 130 135 gga atg gtg aat cgc gtg gga atg gta gaa aca aac tcc cag gac cgc 660 Gly Met Val Asn Arg Val Gly Met Val Glu Thr Asn Ser Gln Asp Arg 140 145 150 cct gtg gac gac gtg aag atc att aag gca tac cct tct ggg tagacttg 710 Pro Val Asp Asp Val Lys Ile Ile Lys Ala Tyr Pro Ser Gly 155 160 165 ctaccctctt gagcagctct tctgagatgg ccccagtgaa ccagcttcta gatgacatag 770 aatgacatgt aatgctaaat ttcattttgg ctttgcaagt catgaagctt aggaggcctg 830 gcatcttggg tgagttagag atggaagtac attttaatag gatgcttctt ttctcttccc 890 ccagtgccta ggttgccaga gcatttgcac aaatgcccct gtttatcaat aggtgactac 950 ttactacaca tgaaccataa tgctgcttct tgtgcatgtc tgctctgata tacgtcgaac 1010 aatgtagcag ccactgtcat ttctcagtgg ttttgcctaa ccaaacttct tcctaaggag 1070 atttatattc tggcctacac agcagtcctt gatggctgac agccacagaa ttccaaacca 1130 agtagtgtct gtcagccctc ttaactctgt gcacgcccta tttcagtctt ttacatttgt 1190 tcttctaggg aatgtatgca tctctatata tattttccct ctcaaaacca gaacatcaac 1250 agtgctgttt ctgacacttc agacatccca cgcaaagcca cattgaattt ttgccaaatg 1310 aaaaacacat ccaacaatca agtttctaag aaggtgtcaa gtggggaata ataataatgt 1370 ataataatca agaaattagt ttattaaaag gaagcagaag cattgaccat tttttcccag 1430 agaagaggag aaatctgtag tgagcaaagg acagaccatg aatcctcctt gagaagtagt 1490 actctcagaa aggagaagcg ccactcaagt tcttttaacc caagacttta gagaaattag 1550 gtccaagatt tttatatgtt cagttgttta tgtataaaaa taactttctg gattttgtgg 1610 ggaggagcag gagaggaagg aagttaatac ctatgtaata catagaaact tccacaataa 1670 aatgccattg atggttgaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 1706 <210> 6 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Ala Ala Ile Pro Pro Asp Ser Trp Gln Pro Pro Asn Val Tyr Leu 1 5 10 15 Glu Thr Ser Met Gly Ile Ile Val Leu Glu Leu Tyr Trp Lys His Ala 20 25 30 Pro Lys Thr Cys Lys Asn Phe Ala Glu Leu Ala Arg Arg Gly Tyr Tyr 35 40 45 Asn Gly Thr Lys Phe His Arg Ile Ile Lys Asp Phe Met Ile Gln Gly 50 55 60 Gly Asp Pro Thr Gly Thr Gly Arg Gly Gly Ala Ser Ile Tyr Gly Lys 65 70 75 80 Gln Phe Glu Asp Glu Leu His Pro Asp Leu Lys Phe Thr Gly Ala Gly 85 90 95 Ile Leu Ala Met Ala Asn Ala Gly Pro Asp Thr Asn Gly Ser Gln Phe 100 105 110 Phe Val Thr Leu Ala Pro Thr Gln Trp Leu Asp Gly Lys His Thr Ile 115 120 125 Phe Gly Arg Val Cys Gln Gly Ile Gly Met Val Asn Arg Val Gly Met 130 135 140 Val Glu Thr Asn Ser Gln Asp Arg Pro Val Asp Asp Val Lys Ile Ile 145 150 155 160 Lys Ala Tyr Pro Ser Gly 165 <210> 7 <211> 2607 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (354)..(1895) <223> APCDD1 <400> 7 gaaatatgaa gagacgctgc agctgcggtg gcggtggcgg ccactgcagc tcagagcggc 60 gcacgcggcg gccggggcgg gacgcggggc cgggcgcgga gaagtcgggg cgggcggcag 120 agaggccggg acgcggaccg ggccggggcg cccacagccg cccgacggcg cccagagagc 180 gcgcgccccg cagccccgcg cctagcccgc cgggcatggg gcgcgcggca gccgcctgaa 240 gccccggcct ggcccggccg cacccggccg gaggggaggg cagagcgcgc gcccagttgc 300 ccgggcacca aatcggagcg cggcgtgcgg gagggcccag agcaggactg gaa 353 atg tcc tgg ccg cgc cgc ctc ctg ctc aga tac ctg ttc ccg gcc ctc 401 Met Ser Trp Pro Arg Arg Leu Leu Leu Arg Tyr Leu Phe Pro Ala Leu 1 5 10 15 ctg ctt cac ggg ctg gga gag ggt tct gcc ctc ctt cat cca gac agc 449 Leu Leu His Gly Leu Gly Glu Gly Ser Ala Leu Leu His Pro Asp Ser 20 25 30 agg tct cat cct agg tcc tta gag aaa agt gcc tgg agg gct ttt aag 497 Arg Ser His Pro Arg Ser Leu Glu Lys Ser Ala Trp Arg Ala Phe Lys 35 40 45 gag tca cag tgc cat cac atg ctc aaa cat ctc cac aat ggt gca agg 545 Glu Ser Gln Cys His His Met Leu Lys His Leu His Asn Gly Ala Arg 50 55 60 atc aca gtg cag atg cca cct aca atc gag ggc cac tgg gtc tcc aca 593 Ile Thr Val Gln Met Pro Pro Thr Ile Glu Gly His Trp Val Ser Thr 65 70 75 80 ggc tgt gaa gta agg tca ggc cca gag ttc atc aca agg tcc tac aga 641 Gly Cys Glu Val Arg Ser Gly Pro Glu Phe Ile Thr Arg Ser Tyr Arg 85 90 95 ttc tac cac aat aac acc ttc aag gcc tac caa ttt tat tat ggc agc 689 Phe Tyr His Asn Asn Thr Phe Lys Ala Tyr Gln Phe Tyr Tyr Gly Ser 100 105 110 aac cgg tgc aca aat ccc act tat act ctc atc atc cgg ggc aag atc 737 Asn Arg Cys Thr Asn Pro Thr Tyr Thr Leu Ile Ile Arg Gly Lys Ile 115 120 125 cgc ctc cgc cag gcc tcc tgg atc atc cga ggg ggc acg gaa gcc gac 785 Arg Leu Arg Gln Ala Ser Trp Ile Ile Arg Gly Gly Thr Glu Ala Asp 130 135 140 tac cag ctg cac aac gtc cag gtg atc tgc cac aca gag gcg gtg gcc 833 Tyr Gln Leu His Asn Val Gln Val Ile Cys His Thr Glu Ala Val Ala 145 150 155 160 gag aag ctc ggc cag cag gtg aac cgc aca tgc ccg ggc ttc ctc gca 881 Glu Lys Leu Gly Gln Gln Val Asn Arg Thr Cys Pro Gly Phe Leu Ala 165 170 175 gac ggg ggt ccc tgg gtg cag gac gtg gcc tat gac ctc tgg cga gag 929 Asp Gly Gly Pro Trp Val Gln Asp Val Ala Tyr Asp Leu Trp Arg Glu 180 185 190 gag aac ggc tgt gag tgc acc aag gcc gtg aac ttt gcc atg cat gaa 977 Glu Asn Gly Cys Glu Cys Thr Lys Ala Val Asn Phe Ala Met His Glu 195 200 205 ctt cag ctc atc cgg gtg gag aag cag tac ctt cac cac aac ctc gac 1025 Leu Gln Leu Ile Arg Val Glu Lys Gln Tyr Leu His His Asn Leu Asp 210 215 220 cac ctg gtc gag gag ctc ttc ctt ggt gac att cac act gat gcc acc 1073 His Leu Val Glu Glu Leu Phe Leu Gly Asp Ile His Thr Asp Ala Thr 225 230 235 240 cag agg atg ttc tac cgg ccc tcc agt tac cag ccc cct ctg cag aat 1121 Gln Arg Met Phe Tyr Arg Pro Ser Ser Tyr Gln Pro Pro Leu Gln Asn 245 250 255 gcc aag aac cac gac cat gcc tgc atc gcc tgt cgg atc atc tat cgg 1169 Ala Lys Asn His Asp His Ala Cys Ile Ala Cys Arg Ile Ile Tyr Arg 260 265 270 tca gac gag cac cac cct ccc atc ctg ccc cca aag gca gac ctg acc 1217 Ser Asp Glu His His Pro Pro Ile Leu Pro Pro Lys Ala Asp Leu Thr 275 280 285 atc ggc ctg cac ggg gag tgg gtg agc cag cgc tgt gag gtg cgc ccc 1265 Ile Gly Leu His Gly Glu Trp Val Ser Gln Arg Cys Glu Val Arg Pro 290 295 300 gaa gtc ctc ttc ctc acc cgc cac ttc atc ttc cat gac aac aac aac 1313 Glu Val Leu Phe Leu Thr Arg His Phe Ile Phe His Asp Asn Asn Asn 305 310 315 320 acc tgg gag ggc cac tac tac cac tac tca gac ccg gtg tgc aag cac 1361 Thr Trp Glu Gly His Tyr Tyr His Tyr Ser Asp Pro Val Cys Lys His 325 330 335 ccc acc ttc tcc atc tac gcc cgg ggc cgc tac agc cgc ggc gtc ctc 1409 Pro Thr Phe Ser Ile Tyr Ala Arg Gly Arg Tyr Ser Arg Gly Val Leu 340 345 350 tcg tcc agg gtc atg gga ggc acc gag ttc gtg ttc aaa gtg aat cac 1457 Ser Ser Arg Val Met Gly Gly Thr Glu Phe Val Phe Lys Val Asn His 355 360 365 atg aag gtc acc ccc atg gat gcg gcc aca gcc tca ctg ctc aac gtc 1505 Met Lys Val Thr Pro Met Asp Ala Ala Thr Ala Ser Leu Leu Asn Val 370 375 380 ttc aac ggg aat gag tgc ggg gcc gag ggc tcc tgg cag gtg ggc atc 1553 Phe Asn Gly Asn Glu Cys Gly Ala Glu Gly Ser Trp Gln Val Gly Ile 385 390 395 400 cag cag gat gtg acc cac acc aat ggc tgc gtg gcc ctg ggc atc aaa 1601 Gln Gln Asp Val Thr His Thr Asn Gly Cys Val Ala Leu Gly Ile Lys 405 410 415 cta cct cac acg gag tac gag atc ttc aaa atg gaa cag gat gcc cgg 1649 Leu Pro His Thr Glu Tyr Glu Ile Phe Lys Met Glu Gln Asp Ala Arg 420 425 430 ggg cgc tat ctg ctg ttc aac ggt cag agg ccc agc gac ggg tcc agc 1697 Gly Arg Tyr Leu Leu Phe Asn Gly Gln Arg Pro Ser Asp Gly Ser Ser 435 440 445 cca gac agg cca gag aag aga gcc acg tcc tac cag atg ccc ttg gtc 1745 Pro Asp Arg Pro Glu Lys Arg Ala Thr Ser Tyr Gln Met Pro Leu Val 450 455 460 cag tgt gcc tcc tct tcg ccg agg gca gag gac ctc gca gaa gac agt 1793 Gln Cys Ala Ser Ser Ser Pro Arg Ala Glu Asp Leu Ala Glu Asp Ser 465 470 475 480 gga agc agc ctg tat ggc cgg gcc cct ggg agg cac acc tgg tcc ctg 1841 Gly Ser Ser Leu Tyr Gly Arg Ala Pro Gly Arg His Thr Trp Ser Leu 485 490 495 ctg ctg gct gca ctt gcc tgc ctt gtc cct ctg ctg cat tgg aac atc 1889 Leu Leu Ala Ala Leu Ala Cys Leu Val Pro Leu Leu His Trp Asn Ile 500 505 510 cgc aga tagaa gttttagaaa gttctatttt ttccaaacca ggattcctta 1940 Arg Arg ctattgacag atttgcttta ccaaaagaaa agacatttat tcttttgatg cacttgaatg 2000 ccagagaact gtccttcttt ttctcctctc cctccctccc agcccctgag tcatgaacag 2060 caaggagtgt ttgaagtttc tgctttgaac tccgtccagc ctgatccctg gcctgagcaa 2120 cttcacaaca gtaattgcac tttaagacag cctagagttc tggacgagcg tgtttggtag 2180 cagggatgaa agctagggcc tcttattttt ttctcttaat tattattata tttctgagtt 2240 aaacttagaa gaaacaacta tcaagctaca acttttcctg ccattttcct gtggttgcag 2300 cctgtcttcc tttgaaattg ttttactctc tgagttttat atgctggaat ccaatgcaga 2360 gttggtttgg gactgtgatc aagacacctt ttattaataa agaagagaca caggtgtaga 2420 tatgtatata caaaaagatg tacggtctgg ccaaaccacc ttcccagcct ttatgcaaaa 2480 aaaggggaga atcaaagctt tcatttcaga aatgttgcgt ggaaaagtat ctgtaattaa 2540 agtttcgaag taatttaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaag aaaaaaaaaa 2600 aaaaaaa 2607 <210> 8 <211> 514 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Met Ser Trp Pro Arg Arg Leu Leu Leu Arg Tyr Leu Phe Pro Ala Leu 1 5 10 15 Leu Leu His Gly Leu Gly Glu Gly Ser Ala Leu Leu His Pro Asp Ser 20 25 30 Arg Ser His Pro Arg Ser Leu Glu Lys Ser Ala Trp Arg Ala Phe Lys 35 40 45 Glu Ser Gln Cys His His Met Leu Lys His Leu His Asn Gly Ala Arg 50 55 60 Ile Thr Val Gln Met Pro Pro Thr Ile Glu Gly His Trp Val Ser Thr 65 70 75 80 Gly Cys Glu Val Arg Ser Gly Pro Glu Phe Ile Thr Arg Ser Tyr Arg 85 90 95 Phe Tyr His Asn Asn Thr Phe Lys Ala Tyr Gln Phe Tyr Tyr Gly Ser 100 105 110 Asn Arg Cys Thr Asn Pro Thr Tyr Thr Leu Ile Ile Arg Gly Lys Ile 115 120 125 Arg Leu Arg Gln Ala Ser Trp Ile Ile Arg Gly Gly Thr Glu Ala Asp 130 135 140 Tyr Gln Leu His Asn Val Gln Val Ile Cys His Thr Glu Ala Val Ala 145 150 155 160 Glu Lys Leu Gly Gln Gln Val Asn Arg Thr Cys Pro Gly Phe Leu Ala 165 170 175 Asp Gly Gly Pro Trp Val Gln Asp Val Ala Tyr Asp Leu Trp Arg Glu 180 185 190 Glu Asn Gly Cys Glu Cys Thr Lys Ala Val Asn Phe Ala Met His Glu 195 200 205 Leu Gln Leu Ile Arg Val Glu Lys Gln Tyr Leu His His Asn Leu Asp 210 215 220 His Leu Val Glu Glu Leu Phe Leu Gly Asp Ile His Thr Asp Ala Thr 225 230 235 240 Gln Arg Met Phe Tyr Arg Pro Ser Ser Tyr Gln Pro Pro Leu Gln Asn 245 250 255 Ala Lys Asn His Asp His Ala Cys Ile Ala Cys Arg Ile Ile Tyr Arg 260 265 270 Ser Asp Glu His His Pro Pro Ile Leu Pro Pro Lys Ala Asp Leu Thr 275 280 285 Ile Gly Leu His Gly Glu Trp Val Ser Gln Arg Cys Glu Val Arg Pro 290 295 300 Glu Val Leu Phe Leu Thr Arg His Phe Ile Phe His Asp Asn Asn Asn 305 310 315 320 Thr Trp Glu Gly His Tyr Tyr His Tyr Ser Asp Pro Val Cys Lys His 325 330 335 Pro Thr Phe Ser Ile Tyr Ala Arg Gly Arg Tyr Ser Arg Gly Val Leu 340 345 350 Ser Ser Arg Val Met Gly Gly Thr Glu Phe Val Phe Lys Val Asn His 355 360 365 Met Lys Val Thr Pro Met Asp Ala Ala Thr Ala Ser Leu Leu Asn Val 370 375 380 Phe Asn Gly Asn Glu Cys Gly Ala Glu Gly Ser Trp Gln Val Gly Ile 385 390 395 400 Gln Gln Asp Val Thr His Thr Asn Gly Cys Val Ala Leu Gly Ile Lys 405 410 415 Leu Pro His Thr Glu Tyr Glu Ile Phe Lys Met Glu Gln Asp Ala Arg 420 425 430 Gly Arg Tyr Leu Leu Phe Asn Gly Gln Arg Pro Ser Asp Gly Ser Ser 435 440 445 Pro Asp Arg Pro Glu Lys Arg Ala Thr Ser Tyr Gln Met Pro Leu Val 450 455 460 Gln Cys Ala Ser Ser Ser Pro Arg Ala Glu Asp Leu Ala Glu Asp Ser 465 470 475 480 Gly Ser Ser Leu Tyr Gly Arg Ala Pro Gly Arg His Thr Trp Ser Leu 485 490 495 Leu Leu Ala Ala Leu Ala Cys Leu Val Pro Leu Leu His Trp Asn Ile 500 505 510 Arg Arg <210> 9 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 9 caggtggaaa tgaccatctg gtcaaag 27 <210> 10 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 10 catcagcttc aggaggtata tggtac 26 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 11 gtggcactgt ggtgttacct tat 23 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 12 cctctaaacc tttgcctacg act 23 <210> 13 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 13 ttaccgtcgt tccatgctga aatgatgc 28 <210> 14 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 14 ggggtaccac catggataac aaaatttcgc cggag 35 <210> 15 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 15 cggaattctc aggaggtata tgggtacttc catgc 35 <210> 16 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized S-oligonucleotide <400> 16 ggcctcacca ttgaag 16 <210> 17 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized S-oligonucleotide <400> 17 cttcaatggt gaggcc 16 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 18 tggtagccaa gtgcaggtta ta 22 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 19 ccaaagggtt tctgcagttt ca 22 <210> 20 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 20 tgcggatcca gagcagattg tactgagagt 30 <210> 21 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 21 ctctatctcg agtgaggcgg aaagaacca 29 <210> 22 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 22 tttaagcttg aagaccattt ttggaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaac 47 <210> 23 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 23 tttaagcttg aagacatggg aaagagtggt ctca 34 <210> 24 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized oligonucleotide for siRNA <400> 24 caccaatgtg atcttctcca ggtgcttcaa gagagcacct ggagaagatc acatt 55 <210> 25 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized oligonucleotide for siRNA <400> 25 aaaaaatgtg atcttctcca ggtgctctct tgaagcacct ggagaagatc acatt 55 <210> 26 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized oligonucleotide for siRNA <400> 26 caccaaggac accagtttct cgtagttcaa gagactacga gaaactggtg tcctt 55 <210> 27 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized oligonucleotide for siRNA <400> 27 aaaaaaggac accagtttct cgtagtctct tgaactacga gaaactggtg tcctt 55 <210> 28 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized oligonucleotide for siRNA <400> 28 caccaaagag acgctcatag cgactttcaa gagaagtcgc tatgagcgtc tcttt 55 <210> 29 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized oligonucleotide for siRNA <400> 29 aaaaaaagag acgctcatag cgacttctct tgaaagtcgc tatgagcgtc tcttt 55 <210> 30 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized oligonucleotide for siRNA <400> 30 caccaacgac ggtaaaatcc gagccttcaa gagaggctcg gattttaccg tcgtt 55 <210> 31 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized oligonucleotide for siRNA <400> 31 aaaaaacgac ggtaaaatcc gagcctctct tgaaggctcg gattttaccg tcgtt 55 <210> 32 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized oligonucleotide <400> 32 caccgaagca gcacgacttc ttcttcaaga gagaagaagt cgtgctgctt c 51 <210> 33 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized oligonucleotide <400> 33 aaaagaagca gcacgacttc ttctctcttg aagaagaagt cgtgctgctt c 51 <210> 34 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 34 tagattctgg gcgcacttgt ggctctcc 28 <210> 35 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 35 ggggtaccac catggcgcca ccttcg 26 <210> 36 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 36 cggaattcat gggcgttgcc cctctgactg g 31 <210> 37 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized S-oligonucleotide <400> 37 ggcctcaccg agcgcg 16 <210> 38 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized S-oligonucleotide <400> 38 cgcgctcggt gaggcc 16 <210> 39 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 39 ggacaggtcg aggtggtgc 19 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 40 ctcgacgagt tctcccatcg 20 <210> 41 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 41 agacaagctt tccgccgccg gc 22 <210> 42 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 42 gtctctcgag aagggtatgc cttaatgatc ttc 33 <210> 43 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized S-oligonucleotide <400> 43 cttcgctatg gcggca 16 <210> 44 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized S-oligonucleotide <400> 44 tgccgccata gcgaag 16 <210> 45 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <220> <221> misc_feature <222> (7) <223> q <400> 45 tgggaanttc cggaagaaga tggcgctcac cagc 34 <210> 46 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 46 gtgcctcgag cttcctcctc ttcttgcctt catgc 35 <210> 47 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized oligonucleotide for siRNA <400> 47 tcccgcatgc tccaaagacc tgtttcaaga gaacaggtct ttggagcatg c 51 <210> 48 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized oligonucleotide for siRNA <400> 48 aaaagcatgc tccaaagacc tgttctcttg aaacaggtct ttggagcatg c 51 <210> 49 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized oligonucleotide for siRNA <400> 49 tcccagactt catgatccaa ggattcaaga gatccttgga tcatgaagtc t 51 <210> 50 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized oligonucleotide for siRNA <400> 50 aaaaagactt catgatccaa ggatctcttg aatccttgga tcatgaagtc t 51 <210> 51 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized oligonucleotide for siRNA <400> 51 tccctggcag ccagttcttt gtgttcaaga gacacaaaga actggctgcc a 51 <210> 52 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized oligonucleotide for siRNA <400> 52 aaaatggcag ccagttcttt gtgtctcttg aacacaaaga actggctgcc a 51 <210> 53 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 53 cgccggatcc gctatggcgg caattccccc ag 32 <210> 54 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 54 agcactcgag cccagaaggg tatgccttaa tgatc 35 <210> 55 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 55 attggtacca tggagctgat tctcagccct cggtc 35 <210> 56 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 56 aatctcgagg tcagcttcag tctcgtcagc ag 32 <210> 57 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 57 attggtacca tggttccaga attccccctt tcccct 36 <210> 58 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 58 aatctcgagg tcagcttcag tctcgtcagc ag 32 <210> 59 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 59 attggtacca tggatctttc cctggaggaa attcag 36 <210> 60 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 60 aatctcgagg tcagcttcag tctcgtcagc ag 32 <210> 61 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 61 attggtacca tggctgaggt cttgaagcag ctggc 35 <210> 62 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 62 aatctcgagg tcagcttcag tctcgtcagc ag 32 <210> 63 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 63 attggtacct tcaccatggc ttcttctgat atcc 34 <210> 64 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 64 aatctcgagg cgtctttctt ctgcagcttc 30 <210> 65 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 65 ctggagaagc gtgccgcagg ccaggctttt g 31 <210> 66 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 66 caaaagcctg gcctgcggca cgcttctcca g 31 <210> 67 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 67 gcttttgagc tgattctcgc ccctcggtca aaagaatctg 40 <210> 68 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 68 cagattcttt tgaccgaggg gcgagaatca gctcaaaagc 40 <210> 69 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 69 ccagaattcc cccttgcccc tccaaagaag aag 33 <210> 70 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 70 cttcttcttt ggaggggcaa gggggaattc tgg 33 <210> 71 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 71 cagaagaaag acgcaaggcc catgaagctg agg 33 <210> 72 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 72 cctcagcttc atgggccttg cgtctttctt ctg 33 <210> 73 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 73 ggatcatcta tcggtcagac g 21 <210> 74 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 74 tgggtcacat cctgctggat g 21 <210> 75 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 75 gctcgtctga ccgatagatg atcc 24 <210> 76 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 76 aaggatccgc gtggacaatg gctactcaag 30 <210> 77 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 77 ggactcgaga caggtcagta tcaaaccagg ccag 34 <210> 78 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 78 aagaattctg ctggtgggtg aaaaaaaaat gc 32 <210> 79 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 79 ctactcgagt tctaaagact tggtgacgag cgac 34 <210> 80 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 80 aggaattcgt gcatcatggt cccaccacat catac 35 <210> 81 <211> 7 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 81 ctttggc 7 <210> 82 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized probe sequence <400> 82 gctttgattg tggtga 16 <210> 83 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized probe sequence <400> 83 tcaccacaat caaagc 16 <210> 84 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized probe sequence <400> 84 cccctttgaa cacctt 16 <210> 85 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized probe sequence <400> 85 aaggtgttca aagggg 16 <210> 86 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 86 gcggaattca gggcccagag caggactg 28 <210> 87 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 87 tagctcgagc taaaacttct atctgcggat gt 32 <210> 88 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized S-oligonucleotide <400> 88 atgtcctggc cgcgcc 16 <210> 89 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized S-oligonucleotide <400> 89 ggcgcggcca ggacat 16 <210> 90 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized S-oligonucleotide <400> 90 tacaggaccg gcgcgg 16 <210> 91 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized S-oligonucleotide <400> 91 atctggtccg gcgcgg 16 <210> 92 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized S-oligonucleotide <400> 92 gttgcacagc gacgca 16 <210> 93 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 93 aatgtgatct tctccaggtg c 21 <210> 94 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 94 aaggacacca gtttctcgta g 21 <210> 95 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 95 aaagagacgc tcatagcgac t 21 <210> 96 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 96 aacgacggta aaatccgagc c 21 <210> 97 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 97 aacgaaacac cgatgactgg g 21 <210> 98 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 98 aatcaccgga ccacacacac a 21 <210> 99 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 99 aaaccttgcc tacgacatgt tt 22 <210> 100 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 100 aaaaggtttc cgttagcccc g 21 <210> 101 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 101 gcatgctcca aagacctgtt 20 <210> 102 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 102 agacttcatg atccaaggat 20 <210> 103 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 103 tggcagccag ttctttgtgt 20 <210> 104 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequencely synthesized target sequence for siRNA <400> 104 caccaacgaa acaccgatga ctgggttcaa gagacccagt catcggtgtt tcgtt 55 <210> 105 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequencely synthesized target sequence for siRNA <400> 105 aaaaaacgaa acaccgatga ctgggtctct tgaacccagt catcggtgtt tcgtt 55 <210> 106 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequencely synthesized target sequence for siRNA <400> 106 caccaatcac cggaccacac acacattcaa gagatgtgtg tgtggtccgg tgatt 55 <210> 107 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequencely synthesized target sequence for siRNA <400> 107 aaaaaatcac cggaccacac acacatctct tgaatgtgtg tgtggtccgg tgatt 55 <210> 108 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequencely synthesized target sequence for siRNA <400> 108 caccaaacct tgcctacgac atgttttcaa gagaaacatg tcgtaggcaa ggttt 55 <210> 109 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequencely synthesized target sequence for siRNA <400> 109 aaaaaaacct tgcctacgac atgtttctct tgaaaacatg tcgtaggcaa ggttt 55 <210> 110 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequencely synthesized target sequence for siRNA <400> 110 caccaaaagg tttccgttag ccccgttcaa gagacggggc taacggaaac ctttt 55 <210> 111 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequencely synthesized target sequence for siRNA <400> 111 aaaaaaaagg tttccgttag ccccgtctct tgaacggggc taacggaaac ctttt 55

Claims (33)

  1. 하기와 같이 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 실질적으로 순수한 폴리펩티드:
    (a) 서열번호 2, 4, 6 또는 8로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    (b) 서열번호 2, 4, 6 또는 8로 기재되며, 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가되고, 서열번호 2, 4, 6 또는 8로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 단백질과 동등한 생물학적 활성을 갖는 폴리펩티드; 및
    (c) 엄격조건에서 서열번호 1, 3, 5 또는 7로 기재되는 핵산서열을 포함하는 핵산과 혼성화하는 핵산에 의하여 코딩되고, 서열번호 2, 4, 6 또는 8 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와 동등한 생물학적 활성을 갖는 폴리펩티드.
  2. 제 1항의 폴리펩티드를 코딩하는 분리된 핵산.
  3. 제 2항의 핵산을 포함하는 벡터.
  4. 제 2항의 핵산 또는 제 3항의 벡터를 함유하는 숙주세포.
  5. (a) 제 4항의 숙주세포를 배양하는 단계;
    (b) 숙주세포가 폴리펩티드를 발현하도록 하는 단계; 및
    (c) 발현된 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는 제 1항의 폴리펩티드를 생산하는 방법.
  6. 제 1항의 폴리펩티드에 결합하는 항체.
  7. 제 2항의 핵산 또는 그의 상보적인 가닥에 상보적이고 적어도 15개의 핵산을 포함하는 핵산.
  8. 제 2항의 핵산에 대한 안티센스(antisense) 핵산 또는 작은 간섭 RNA(small interfering RNA).
  9. 제 8항에 있어서, 안티센스 핵산은 서열번호 16, 37, 44 및 89로 기재되는 핵산서열로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 안티센스 핵산.
  10. 제 8항에 있어서, siRNA는 그의 센스가닥이 서열번호 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102 및 103으로 기재되는 핵산서열을 포함하는 핵산으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 작은 간섭 RNA.
  11. (a) 표본의 생물학적 시료에서 서열번호 2, 4, 6 또는 8로 기재되는 아미노산 서열을 코딩하는 유전자의 발현수준을 측정하는 단계; 및
    (b) 발현수준 증가를 세포 증식성 질환과 연관시키는 단계를 포함하는 세포 증식성 질환을 진단하는 방법.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 발현수준은 하기와 같이 구성된 군으로부터 선택되는 어떠한 하나의 방법에 의하여 측정되는 것을 특징으로 하는 방법:
    (a) 서열번호 2, 4 6, 또는 8로 기재되는 아미노산 서열을 코딩하는 mRNA를 측정하는 방법;
    (b) 서열번호 2, 4, 6, 또는 8 로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 측정하는 방법; 및
    (c) 서열번호 2, 4, 6 또는 8로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질의 생물학적 활성을 측정하는 단계.
  13. 하기의 단계를 포함하는 세포 증식성 질환의 치료를 위한 화합물을 탐색하는 방법:
    (a) 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드와 시험 대상 화합물을 접촉시키는 단계:
    (1) 서열번호 2, 4, 6 또는 8로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    (2) 서열번호 2, 4, 6 또는 8로 기재되는 아미노산 서열을 포함하고, 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 추가되고 서열번호 2, 4, 6 또는 8로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 동등한 생물학적 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드; 및
    (3) 엄격조건에서 서열번호 1, 3, 5 또는 7로 기재되는 핵산서열을 포함하는 핵산과 혼성화하는 핵산에 의하여 코딩되고, 서열번호 2, 4, 6 또는 8로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와 동등한 생물학적 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드;
    (b) 폴리펩티드와 시험 대상 화합물 사이의 결합 활성을 탐지하는 단계; 및
    (c) 상기 폴리펩티드에 결합하는 화합물을 선별하는 단계.
  14. 하기의 단계를 포함하는 세포 증식성 질환의 치료를 위한 화합물을 탐색하는 방법:
    (a) 서열번호 1, 3, 5 또는 7로 기재되는 핵산서열을 포함하는 하나 또는 그 이상의 핵산과 후보물질을 접촉시키는 단계; 및
    (b) 시험 대상 화합물이 존재하지 않을 때의 발현수준과 비교하여 서열번호 1, 3, 5 또는 7로 기재되는 핵산서열을 포함하는 하나 또는 그 이상의 핵산의 발현수준을 감소시키는 화합물을 선별하는 단계.
  15. 하기의 단계를 포함하는 세포 증식성 질환의 치룔를 위한 화합물을 탐색하는 방법:
    (a) 시험 대상 화합물을 하기와 같이 구성되는 군으로부터 선택되는 폴리펩티드와 접촉시키는 단계:
    (1) 서열번호 2, 4, 6 또는 8로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    (2) 서열번호 2, 4, 6 또는 8로 기재되는 아미노산 서열을 포함하며, 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 첨가되고, 서열번호 2, 4, 6 또는 8로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 동등한 생물학적 활성을 갖는 펩타이드; 및
    (3) 엄격조건에서 서열번호 1, 3, 5, 또는 7로 기재되는 핵산서열을 포함하는 핵산과 혼성화하는 핵산에 의해 코딩되고 서열번호 2, 4, 6, 또는 8로 기재되는 아미노산 서열과 등가인 생물학적 활성을 갖는 폴리펩티드;
    (b) 단계 (a)의 폴리펩티드의 생물학적 활성을 검출하는 단계; 및
    (c) 시험 대상 화합물이 존재하지 않을 때 검출되는 생물학적 활성과 비교할 때 상기 폴리펩티드의 생물학적 활성을 억제하는 화합물을 선별하는 단계.
  16. 제 15항에 있어서, 상기 생물학적 활성은 세포 증식 활성인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 하기의 단계를 포함하는, 세포 증식성 질환의 치료를 위한 화합물을 탐색하는 방법:
    (a) 하나 또는 그 이상의 마커 유전자의 전사 조절 영역 및 상기 전사 조절 영역의 조절하에 발현되는 리포터 유전자를 포함하는 벡터가 도입된 세포와 검사 대상 화합물을 접촉시키는 단계(이때, 하나 또는 그 이상의 마커 유전자는 서열번 호 1, 3, 5 또는 7로 구성된 군으로부터 선택되는 핵산 중 어느 하나를 포함한다);
    (b) 상기 리포터 유전자의 활성을 측정하는 단계; 및
    (c) 대조군과 비교하여 상기 리포터 유전자의 발현수준를 감소시키는 화합물을 선별하는 단계.
  18. 하기의 단계를 포함하는, 세포 증식성 질환을 치료하는 화합물을 탐색하는 방법:
    (a) 리포터 유전자의 상위(upstream)에 APCDD1의 두 개의 Tcf/LEF 결합 모티프를 포함하는 벡터를 제작하는 단계;
    (b) 단계 (a)의 벡터로 세포를 형질전환시키는 단계;
    (c) 베타-카테닌/Tcf4 복합체의 존재하에 단계 (b)의 세포와 시험 대상 화합물을 접촉시키는 단계;
    (d) 리포터 유전자의 발현을 탐지하는 단계; 및
    (e) 시험 대상 화합물이 존재하지 않는 경우의 리포터 유전자의 발현과 비교하여, 리포터 유전자의 발현을 억제하는 화합물을 선별하는 단계.
  19. 하기의 단계를 포함하는, 세포 증식성 질환을 치료하는 화합물을 선별하는 방법:
    (a) 시험하려는 화합물의 존재하에, 하기와 같이 구성된 군으로부터 선택되는 폴리펩티드 및 스타트민 또는 SNW1을 접촉시키는 단계:
    (1) 서열번호 6으로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    (2) 서열번호 6으로 기재되는 아미노산 서열을 포함하며, 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 추가되고 서열번호 6으로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 동등한 생물학적 활성을 갖는 폴리펩티드; 및
    (3) 엄격조건에서 서열번호 5로 기재되는 핵산서열을 포함하는 핵산에 혼성화하고, 서열번호 6으로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와 동등한 생물학적 활성을 갖는 폴리펩티드;
    (b) 상기 폴리펩티드 및 스타트민 또는 SNW1 사이의 결합을 탐지하는 단계; 및
    (c) 상기 폴리펩티드와 스타트민 또는 SNW1 사이의 결합을 억제하는 화합물을 선별하는 단계.
  20. 제 11항 내지 19항 중 어느 하나의 항에 있어서, 세포 증식성 질환은 암인 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 하기와 같이 구성된 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산에 대 해 약학적으로 유효한 양의 안티센스 핵산 또는 작은 간섭 RNA(small interfering RNA, siRNA)를 포함하는, 세포 증식성 질환의 치료를 위한 조성물:
    (a) 서열번호 2, 4, 6 또는 8로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    (b) 서열번호 2, 4, 6 또는 8로 기재되는 아미노산 서열을 포함하며, 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 추가되고 서열번호 2, 4, 6 또는 8로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 동등한 생물학적 활성을 갖는 폴리펩티드; 및
    (c) 엄격조건에서 서열번호 1, 3, 5 또는 7로 기재되는 핵산서열을 포함하는 핵산과 혼성화하는 핵산에 의해 혼성화되고, 서열번호 2, 4, 6 또는 8로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와 동등한 생물학적 활성을 갖는 폴리펩타드.
  22. 하기와 같이 구성된 군으로부터 선택되는 폴리펩티드에 대해 약학적으로 유효한 양의 항체를 포함하는, 세포 증식성 질환을 치료하는 조성물:
    (a) 서열번호 2, 4 6, 또는 8로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    (b) 서열번호 2, 4, 6 또는 8로 기재되는 아미노산을 포함하며, 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 추가되고 서열번호 2, 4, 6 또는 8로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 동등한 생물학적 활성을 갖는 폴 리펩티드; 및
    (c) 엄격조건에서 서열번호 1, 3, 5 또는 7로 기재되는 핵산서열을 포함하는 폴리펩티드에 혼성화하는 핵산에 의해 코딩되고, 서열번호 2, 4, 6 또는 8로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와 동등한 생물학적 활성을 갖는 폴리펩티드.
  23. 제 13 내지 19항 중 어느 하나의 항의 방법에 의해 선택된 화합물의 약학적으로 유효한 양을 포함하는 세포 증식성 질환의 치료를 위한 조성물.
  24. 제 21항 내지 23항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 증식성 질환은 암인 것을 특징으로 하는 조성물.
  25. 하기와 같이 구성된 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산에 대한 안티센스 핵산 또는 작은 간섭 RNA의 약학적으로 유효한 양을 투여하는 단계를 포함하는 세포 증식성 질환을 치료하는 방법:
    (a) 서열번호 2, 4, 6 또는 8로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    (b) 서열번호 2, 4, 6 또는 8로 기재되는 아미노산 서열을 포함하며. 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 추가되고, 서열번호 2, 4, 6 또는 8로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 동등한 생물학적 활성을 갖는 폴리펩티드; 및
    (c) 엄격조건에서 서열번호 1, 3, 5 또는 7로 기재되는 핵산서열을 포함하는 핵산과 혼성화하는 핵산에 의해 코딩되고, 서열번호 2, 4, 6 또는 8로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와 동등한 생물학적 활성을 갖는 폴리펩티드.
  26. 하기와 같이 구성된 군으로부터 선택되는 폴리펩티드에 대한 약학적으로 유효한 양의 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 세포 증식성 질환을 치료하는 방법:
    (a) 서열번호 2, 4, 6 또는 8로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
    (b) 서열번호 2, 4, 6 또는 8로 기재되는 아미노산 서열을 포함하며, 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 추가되고 서열번호 2, 4, 6 또는 8로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 동등한 생물학적 활성을 갖는 폴리펩티드; 및
    (c) 엄격조건에서 서열번호 1, 3, 5 또는 7로 기재되는 핵산서열을 포함하는 핵산과 혼성화하는 핵산에 의해 코딩되고 서열번호 2, 4, 6 또는 8로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와 동등한 생물학적 활성을 갖는 폴리펩티드.
  27. 제 13 내지 19 항 중 어느 하나의 항의 방법에 의해 선별된 화합물의 약학적으로 유효한 양을 투여하는 단계를 포함하는 세포 증식성 질환을 치료하는 방법.
  28. 제 25항 내지 27항 중 어느 하나의 항에 있어서, 세포 증식성 질환은 암인것을 특징으로 하는 방법.
  29. (a) 내지 (c)로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 약학적으로 유효한 양을 투여하는 단계를 포함하는, 암의 치료 또는 예방방법:
    (a) 서열번호 2, 4, 6 또는 8로 기재되는 아미노산을 포함하는 폴리펩티드 또는 그의 단편;
    (b) 서열번호 2, 4, 6 또는 8로 기재되는 아미노산 서열을 포함하며, 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 추가되고, 서열번호 2, 4, 6 또는 8로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 동등한 생물학적 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 그의 단편; 및
    (c) 엄격조건에서 서열번호 1, 3, 5 또는 7로 기재되는 핵산서열을 포함하는 핵산과 혼성화하는 핵산에 의해 코딩되고, 서열번호 2, 4, 6 또는 8로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와 동등한 생물학적 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 그의 단편.
  30. (a) 내지 (c)로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리펩티드와 항원제공세포(antigen presenting cells)를 접촉시키는 단계 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 또는 상기 핵산을 포함하는 벡터를 항원제공세포로 도입하는 단계를 포함하는, 항 종양 면역성(anti tumor immunity)을 유도하는 방법:
    (a) 서열번호 2, 4, 6 또는 8로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 그의 단편;
    (b) 서열번호 2, 4, 6 또는 8로 기재되는 아미노산 서열을 포함하며, 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 첨가되고, 서열번호 2, 4, 6 또는 8로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 동등한 생물학적 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 그의 단편; 및
    (c) 엄격조건에서 서열번호 1, 3, 5 또는 7로 기재되는 핵산서열을 포함하는 핵산과 혼성화하는 핵산에 의해 코딩되고, 서열번호 2, 4, 6 또는 8로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와 동등한 생물학적 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 그의 단편.
  31. 제 30항에 있어서, 치료대상에게 항원제공세포를 투여하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. (a) 내지 (c)로 구성된 군으로부터 선택된 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 약학적 유효량을 포함하는, 암의 치료 또는 예방을 위한 약학적 조성물:
    (a) 서열번호 2, 4, 6 또는 8로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 그의 단편;
    (b) 서열번호 2, 4, 6 또는 8로 기재되는 아미노산 서열을 포함하며, 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 추가되고 서열번호 2, 4, 6 또는 8로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 동등한 생물학적 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 그의 단편; 및
    (c) 엄격조건에서 서열번호 1, 3, 5 또는 7로 기재되는 핵산서열을 포함하는 핵산과 혼성화하는 핵산에 의해 코딩되고, 서열번호 2, 4, 6 또는 8로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와 동등한 생물학적 활성을 가진 폴리펩티드 또는 그의 단편.
  33. 제 32항에 있어서, 상기 핵산은 발현벡터 형태로 삽입되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
KR1020047019881A 2002-06-06 2003-06-04 간세포암 또는 결장암에 관련된 유전자 및 폴리펩티드 KR20060069207A (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US38698502P 2002-06-06 2002-06-06
US60/386,985 2002-06-06

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20060069207A true KR20060069207A (ko) 2006-06-21

Family

ID=29736242

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020047019881A KR20060069207A (ko) 2002-06-06 2003-06-04 간세포암 또는 결장암에 관련된 유전자 및 폴리펩티드

Country Status (10)

Country Link
US (3) US20060019252A1 (ko)
EP (1) EP1532245B1 (ko)
JP (2) JP2006505247A (ko)
KR (1) KR20060069207A (ko)
CN (5) CN101613405A (ko)
AU (1) AU2003240221A1 (ko)
CA (1) CA2488621A1 (ko)
ES (1) ES2361541T3 (ko)
SI (1) SI1513934T1 (ko)
WO (1) WO2003104276A2 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20110099018A (ko) * 2008-12-05 2011-09-05 온코세라피 사이언스 가부시키가이샤 Ｗｄｒｐｕｈ 에피토프 펩티드 및 이를 포함하는 백신

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006141297A (ja) * 2004-11-19 2006-06-08 Eiken Chem Co Ltd 血管新生を検出するためのマーカー
EP2325305B1 (en) 2005-02-25 2014-02-12 Oncotherapy Science, Inc. Peptide vaccines for lung cancers expressing TTK, URLC10 or KOC1 polypeptides
WO2007127002A2 (en) * 2006-03-31 2007-11-08 Cell Signaling Technology, Inc. Protein markers of responsiveness to type iii receptor tyrosine kinase inhibitors
JP2007282591A (ja) * 2006-04-19 2007-11-01 Yamaguchi Univ スタスミンチップ及びこれを用いたスタスミン結合タンパク質の検出方法
WO2008112988A2 (en) * 2007-03-14 2008-09-18 Novartis Ag Apcdd1 inhibitors for treating, diagnosing or detecting cancer
WO2010051534A2 (en) * 2008-10-31 2010-05-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Method for apcdd1 mediated regulation of hair growth and pigmentation and mutants thereof
WO2010093066A1 (en) * 2009-02-10 2010-08-19 Industrial Cooperation Foundation Chonbuk National University Ppia marker for diagnosis of liver cancer and antibody, and screening method of compounds useful for inhibiting liver cancer
US8372819B2 (en) * 2010-04-11 2013-02-12 Salk Institute For Biological Studies Methods and compositions for targeting skip
JP2013528622A (ja) * 2010-06-04 2013-07-11 ザ・ブリガーム・アンド・ウーメンズ・ホスピタル・インコーポレーテッド 炎症性障害の処置
WO2012019061A2 (en) * 2010-08-05 2012-02-09 Stem Centrx, Inc. Novel effectors and methods of use
ES2797533T3 (es) * 2012-02-28 2020-12-02 Novartis Ag Selección de pacientes con cáncer para la administración de inhibidores de la señalización Wnt utilizando el estado mutacional de Rnf43
EP2757157A1 (en) * 2013-01-17 2014-07-23 Ecole Polytechnique Federale de Lausanne (EPFL) Modulation of mitophagy and use thereof
JP2017518040A (ja) * 2014-04-21 2017-07-06 アッヴィ・ステムセントルクス・エル・エル・シー 新規の抗ｒｎｆ４３抗体および使用方法
WO2016100301A1 (en) 2014-12-15 2016-06-23 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Use of cadherin-11 antagonists to treat obesity-associated conditions and other metabolic disorders
KR102429243B1 (ko) 2018-03-13 2022-08-05 엘지전자 주식회사 냉장고
JP7220515B2 (ja) 2018-03-27 2023-02-10 フクシマガリレイ株式会社 冷蔵庫
CN109320592A (zh) * 2018-09-20 2019-02-12 山西医科大学 用于治疗结肠癌的多肽、多肽组合物及其应用
CN109293746A (zh) * 2018-09-20 2019-02-01 山西医科大学 一种多肽、多肽组合物在治疗结肠癌中的应用
KR102073144B1 (ko) * 2018-12-13 2020-02-04 주식회사 엘베이스 올리고펩티드를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
CN112980951A (zh) * 2021-02-01 2021-06-18 深圳市人民医院 线粒体蛋白slc25a24在结直肠癌诊断、预后判断中的应用
CN117069821A (zh) * 2023-07-14 2023-11-17 中山大学肿瘤防治中心（中山大学附属肿瘤医院、中山大学肿瘤研究所） 靶向人pkm1蛋白的nudt13多肽及其在制备药物中的应用

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100272077B1 (ko) 1990-08-29 2000-11-15 젠팜인터내셔날,인코포레이티드 이종 항체를 생산할 수 있는 전이유전자를 가진 인간이외의 동물
WO1993002227A1 (en) 1991-07-15 1993-02-04 Eco-Tec Limited Process and apparatus for treating fluoride containing acid solutions
JPH07509137A (ja) 1992-07-24 1995-10-12 セル　ジェネシス，インク． 異種抗体の生産
US5285485A (en) 1993-02-01 1994-02-08 General Electric Company Composite nuclear fuel container and method for producing same
EP0754225A4 (en) 1993-04-26 2001-01-31 Genpharm Int HETEROLOGIC ANTIBODY-PRODUCING TRANSGENIC NON-HUMAN ANIMALS
KR20050085971A (ko) 1995-04-27 2005-08-29 아브게닉스, 인크. 면역화된 제노마우스 유래의 인간 항체
AU2466895A (en) 1995-04-28 1996-11-18 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
WO2000000610A2 (en) 1998-06-26 2000-01-06 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Human signal peptide-containing proteins
WO2000050588A2 (en) * 1999-02-22 2000-08-31 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Genes associated with diseases of the colon
WO2001009318A1 (fr) * 1999-07-29 2001-02-08 Helix Research Institute Genes associes au cancer du foie
WO2001009316A1 (fr) * 1999-07-29 2001-02-08 Helix Research Institute Nouveaux genes codant la proteine kinase / proteine phosphatase
WO2001009315A1 (fr) * 1999-07-29 2001-02-08 Helix Research Institute Nouveau gene participant au maintien de la differenciation des cellules des muscles lisses
US6908748B2 (en) * 1999-07-29 2005-06-21 Kenji Sobue Genes associated with the maintenance of differentiation of smooth muscle cells
EP1690872A3 (en) * 1999-12-01 2006-08-23 Genentech, Inc. Composition and methods for the diagnosis of tumours
CN1170848C (zh) * 2000-04-17 2004-10-13 上海市肿瘤研究所 新的人肝癌相关蛋白及其编码序列
CN100532549C (zh) * 2002-06-06 2009-08-26 肿瘤疗法科学股份有限公司 与人结肠癌相关的基因和多肽

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20110099018A (ko) * 2008-12-05 2011-09-05 온코세라피 사이언스 가부시키가이샤 Ｗｄｒｐｕｈ 에피토프 펩티드 및 이를 포함하는 백신
US9745343B2 (en) 2008-12-05 2017-08-29 Oncotherapy Science, Inc. Method of inducing an immune response by administering WDRPUH epitope peptides

Also Published As

Publication number Publication date
AU2003240221A1 (en) 2003-12-22
CN101613405A (zh) 2009-12-30
EP1532245B1 (en) 2014-12-31
WO2003104276A3 (en) 2005-03-31
SI1513934T1 (sl) 2011-06-30
CN101533029A (zh) 2009-09-16
JP5167464B2 (ja) 2013-03-21
US20060019252A1 (en) 2006-01-26
EP1532245A2 (en) 2005-05-25
US20080207549A1 (en) 2008-08-28
WO2003104276A2 (en) 2003-12-18
ES2361541T3 (es) 2011-06-17
CN101613406A (zh) 2009-12-30
CN1675360A (zh) 2005-09-28
CA2488621A1 (en) 2003-12-18
CN101532060A (zh) 2009-09-16
WO2003104276A9 (en) 2004-05-27
AU2003240221A8 (en) 2003-12-22
US8124341B2 (en) 2012-02-28
US20100291567A1 (en) 2010-11-18
JP2009278976A (ja) 2009-12-03
JP2006505247A (ja) 2006-02-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8124341B2 (en) Genes and polypeptides relating to hepatocellular or colorectal carcinoma
CA2488404C (en) Genes and polypeptides relating to human colon cancers
US8148080B2 (en) Gene and protein relating to hepatocellular carcinoma and methods of use thereof
KR20050067409A (ko) 전립선암에 관련된 유전자 및 폴리펩티드
WO2001009316A1 (fr) Nouveaux genes codant la proteine kinase / proteine phosphatase
JP4942127B2 (ja) 新規アルマジロリピート含有蛋白質、ａｌｅｘ１
US20030157501A1 (en) Novel human rna helicase, helicain
EP1492884A2 (en) Methods of diagnosing and treating colorectal cancer

Legal Events

Date Code Title Description
N231 Notification of change of applicant
N231 Notification of change of applicant
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application