JP5167464B2 - 肝細胞癌または結腸直腸癌に関連する遺伝子およびポリペプチド - Google Patents
肝細胞癌または結腸直腸癌に関連する遺伝子およびポリペプチド Download PDFInfo
- Publication number
- JP5167464B2 JP5167464B2 JP2009130107A JP2009130107A JP5167464B2 JP 5167464 B2 JP5167464 B2 JP 5167464B2 JP 2009130107 A JP2009130107 A JP 2009130107A JP 2009130107 A JP2009130107 A JP 2009130107A JP 5167464 B2 JP5167464 B2 JP 5167464B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- seq
- polypeptide
- cells
- ppil1
- protein
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2/00—Peptides of undefined number of amino acids; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
- C07K16/303—Liver or Pancreas
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4748—Tumour specific antigens; Tumour rejection antigen precursors [TRAP], e.g. MAGE
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
- C07K16/3046—Stomach, Intestines
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
- G01N33/57419—Specifically defined cancers of colon
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
- G01N33/57438—Specifically defined cancers of liver, pancreas or kidney
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Zoology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
本発明は生物科学の分野に関し、より具体的には癌研究の分野に関する。特に、本発明は、細胞の増殖機構に関与する新規遺伝子WDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、およびAPCDD1、ならびにこれらの遺伝子によってコードされるポリペプチドに関する。本発明の遺伝子およびポリペプチドは、例えば、細胞増殖性疾患の診断に、および、疾患に対する薬剤を開発するための標的分子として、用いることができる。
肝細胞癌(HCC)および結腸直腸癌は世界的に癌による死亡の主な原因となっている(Akriviadisら、Br J Surg 85(10):1319-31 (1998))。近年、診断および治療の戦略が進歩しているにもかかわらず、現在も数多くの患者は進行期になってから癌と診断されており、彼らを疾患から完全に治癒させることは差し迫った懸念事項である。腫瘍抑制遺伝子および/または癌遺伝子の変化が発癌に関与していることが最近の分子学的研究の進歩によって明らかになってきたが、その厳密な機序は依然として不明である。
本発明の1つの目的は、肝細胞癌または結腸直腸癌細胞の増殖機構に関与する新規タンパク質、これらのタンパク質をコードする遺伝子、さらにはこれらを生産して肝細胞癌(HCC)または結腸直腸癌の診断および治療に用いるための方法を提供することである。
薬学的組成物は、細胞増殖性疾患の治療のための化合物に関する本スクリーニング方法によって選択された化合物を含むものであってもよい。
本明細書で用いる「1つの(a)」「1つの(an)」および「その(the)」という用語は、別に特記する場合を除き、「少なくとも1つの」を意味する。
配列番号:93、配列番号:24、および25(WDRPUH);
配列番号:94、配列番号:26、および27(WDRPUH);
配列番号:95、配列番号:28、および29(WDRPUH);
配列番号:96、配列番号:30、および31(WDRPUH);
配列番号:97、配列番号:104、および105(KRZFPUH);
配列番号:98、配列番号:106、および107(KRZFPUH);
配列番号:99、配列番号:108、および109(KRZFPUH);
配列番号:100、配列番号:110、および111(KRZFPUH);
配列番号:101、配列番号:47、および48(PPIL1);
配列番号:102、配列番号:49、および50(PPIL1);ならびに
配列番号:103、配列番号:51、および52(PPIL1)。
1.目的の転写物のAUG開始コドンから開始して、AAジヌクレオチド配列に関して下流へとスキャンする。各AAおよび3'側に隣接した19ヌクレオチドの出現率をsiRNA標的の可能性がある部位として記録する。Tuschlらは、siRNAを5'および3'非翻訳領域(UTR)ならびに開始コドン付近(75塩基内)の領域に対しては設計しないように推奨しており、これは、これらの領域には調節タンパク質の結合部位が多く含まれる可能性があるためである。UTR結合タンパク質および/または翻訳開始複合体は、siRNAエンドヌクレアーゼ複合体の結合を妨げる可能性がある。
2.標的の可能性がある部位をヒトゲノムデータベースと比較し、他のコード配列と明らかな相同性を有するどの標的領域も検討から除外する。相同性検索はBLASTを用いて行うことができ、これはNCBIのサーバー:www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/上にある。
3.合成用の適格な標的配列を選択する。アンビオン社では、遺伝子の全長に沿っていくつかの標的配列を評価用に選択することができる。
a)候補化合物を、WDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1を発現する細胞と接触させる段階;および
b)WDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1の発現レベルを、被験化合物の非存在下で検出される発現レベルと比較して低下させる化合物を選択する段階が含まれていてもよい。
a)1つまたは複数のマーカー遺伝子がWDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、およびAPCDD1からなる群より選択され、この1つまたは複数のマーカー遺伝子の転写調節領域および転写調節領域の制御下で発現するレポーター遺伝子を含むベクターを導入した細胞に、候補化合物を接触させる段階;
b)前記レポーター遺伝子の活性を測定する段階;ならびに
c)前記レポーター遺伝子の発現レベルを対照と比較して低下させる化合物を選択する段階を含みうる。
‐腫瘍に対する細胞障害性リンパ球の誘導、
‐腫瘍を認識する抗体の誘導、および
‐抗腫瘍サイトカイン産生の誘導。
本発明は以下の実施例によって詳細に例示されるが、これらの実施例には限定されない。
23040種の遺伝子を含む、ゲノム全域にわたるcDNAマイクロアレイ(施設内で作製した)を用いて、20例のHCCの発現プロファイルを、対応する非癌肝組織のプロファイルと比較した。より具体的には、HCC組織および対応する非癌組織は、外科手術を受けた患者の外科手術標本からインフォームドコンセントを得た上で入手した。キアゲンRNeasyキット(キアゲン)またはTrizol試薬(ライフテクノロジーズ(Life Technologies))を用い、製造者のプロトコールに従って全RNAを顕微解剖組織から抽出した。抽出した全RNAをDNアーゼIで消化し、Ampliscribe T7転写キット(エピセンターテクノロジーズ(Epicentre Technologies))を用いて増幅し、逆転写時にCy色素(アマシャム(Amersham))を用いて標識した。非癌組織および腫瘍由来のRNAを標識するためにそれぞれCy5およびCy3を用いた。続いて、ハイブリダイゼーション、洗浄、および検出をOnoらの方法(Cancer Res 60:5007-11(2000))に従って行った。各標的スポットでのCy5およびCy3の蛍光強度をArray Visionソフトウエア(アマシャムファルマシア(Amersham Pharmacia))を用いて測定した。測定は2回ずつ行い、各標的スポットで検出された蛍光強度からバックグラウンドシグナルを差し引いた後に、平均値を算出した。続いて、各スライドについて、52種のハウスキーピング遺伝子の平均Cy5強度および平均Cy3強度が合致するように、スライド上で検出されたすべての蛍光強度を標準化した。Cy3およびCy5の両方に関して蛍光強度が25,000単位未満であった遺伝子は以降の検討から除外し、Cy3/Cy5シグナル比が>2.0であったものを以降の評価のために選択した。
WDRPUHフォワードプライマー:5'-CAGGTGGAAATGACCATCTGGTCAAAG-3'(配列番号:9)およびリバースプライマー:5'-CATCAGCTTCAGGAGGTATATGGTAC-3'(配列番号:10);ならびに
KRZFPUHフォワードプライマー:5'-GTGGCACTGTGGTGTTACCTTAT-3'(配列番号:11)およびリバースプライマー:5'-CCTCTAAACCTTTGCCTACGACT-3'(配列番号:12)。
次に、WDRPUHのPCR産物をプローブとして用いる多組織ノーザンブロット分析を行った。より具体的には、ヒト多組織ブロット(クロンテック)をWDRPUHの32P標識PCR産物とハイブリダイズさせた。プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、および洗浄は供給元の推奨に従って行った。ブロットのオートラジオグラフィーは増感スクリーンにより-80℃で24〜72時間行った。その結果、2kb転写物が精巣で大量に発現することが見いだされた(図2a)。D3197はノーザンブロット上で検出されたWDRPUH cDNAよりもサイズが小さかったため、本発明者らは次にWDRPUH cDNAの5'配列を調べた。まず、BLASTプログラムを用いてゲノムデータベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)中のD3197に対応するゲノム配列を検索し、染色体バンド17p13に位置づけられているコスミド配列(GenBankアクセッション番号AC026855)を見いだした。このゲノム配列のエクソン配列候補をGENSCAN、Gene RecognitionおよびAssembly Internet Linkプログラムを用いて予想し、予想されたエクソン配列を連結した。続いて、cDNA末端の5'迅速増幅(5'RACE)を以下の通りに行った。Marathon cDNA増幅キット(クロンテック)を用い、製造者の指示に従って5'RACEを行った。WDRPUHの5'部分を、遺伝子特異的リバースプライマー5'-TTACCGTCGTTCCATGCTGAAATGATGC-3'(配列番号:13)およびキットに付属のAP-1プライマーを用いて調製した。cDNA鋳型はヒト精巣mRNA(クロンテック)から合成し、増幅産物をTAクローニングキット(インビトロジェン)を用いてクローニングし、その配列をABI PRISM 3700DNAシークエンサー(アプライドバイオシステムズ(Applied Biosystems))で決定した。決定されたアセンブルされた配列は、620個のアミノ酸残基を有するタンパク質をコードする1860ヌクレオチドのオープンリーディングフレームを含む2152ヌクレオチド(GenBankアクセッション番号AB065281)からなっていた。Simple Modular Architecture Research Tool(SMART、http://smart.embl-heidelberg.de)を用いたタンパク質モチーフに関する検索により、予想されるタンパク質に11個のWD40反復ドメインがあることが判明した(図2b)。決定したWDRPUHのヌクレオチド配列およびその予想されるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号:1および2に示す。
WDRPUHに対応する全コード領域を、遺伝子特異的プライマーのセット:5'-GGGGTACCACCATGGATAACAAAATTTCGCCGGAG-3'(配列番号:14)および5'-CGGAATTCTCAGGAGGTATATGGGTACTTCCATGC-3'(配列番号:15)を用いて増幅し、pcDNA3.1myc/Hisベクター(インビトロジェン)中にクローニングした。続いて、構築されたベクターpcDNA3.1myc/His-WDRPUHをSNU475細胞(韓国細胞株バンク(Korea cell-line bank))に一過的にトランスフェクトし、この細胞をRPMI1640中で増殖させた。4%パラホルムアルデヒドを含むPBS中で細胞を15分間かけて固定し、続いて0.1%Triton X-100を含むPBSにより室温(RT)で2.5分間の透過化処理を行った。その後に、非特異的なハイブリダイゼーションをブロックするために細胞を2%BSA(PBS中)で覆い、4℃で24時間おいた。1:1000に希釈したマウス抗mycモノクローナル抗体(シグマ(Sigma))を免疫細胞化学染色のための一次抗体として用い、ローダミン結合抗マウス二次抗体(LeincoおよびICN)とのインキュベーションにより反応物を可視化した。核は4',6'-ジアミジン-2'-フェニルインドール二塩酸(DAPI)で対比染色した。蛍光画像はECLIPSE E800顕微鏡によって得た。その結果、タグ標識WDRPUHタンパク質が細胞の細胞質中に存在することが判明した(図3)。
細胞増殖に対するWDRPUHの作用を分析するために、WDRPUHを発現するプラスミド(pcDNA-WDRPUH)をNIH3T3細胞(ATCC、Rockville、MD)にトランスフェクトして、コロニー形成アッセイを行った。具体的には、WDRPUHに対応する全コード領域を実施例3の通りに増幅し、pcDNA3.1(インビトロジェン)中にクローニングした。この細胞に対してpcDNA-WDRPUHプラスミド、対照プラスミド(擬似)およびWDRPUHの相補鎖を発現するプラスミド(pcDNA-アンチセンス)のそれぞれをトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、適切な濃度のジェネティシンを含むダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)中で10〜21日インキュベートした。続いて細胞を100%メタノールで固定し、ギムザ溶液によって染色した。実験はすべて3回ずつ行った。
WDRPUHの抑制により、HCC細胞の増殖遅延および/または細胞死がもたらされるか否かを検証するために、WDRPUHの発現を抑制するよう設計された種々のアンチセンスS-オリゴヌクレオチドを合成した。SNU475細胞(韓国細胞株バンク)を10cm培養皿にプレーティングし(2×105個/培養皿)、これに対してWDRPUHの第1エクソン-イントロン境界を含むアンチセンスS-オリゴヌクレオチド(WDRPUH-AS4;5'-GGCCTCACCATTGAAG-3'(配列番号:16))または対照S-オリゴヌクレオチド (WDRPUH-S4;5'-CTTCAATGGTGAGGCC-3'(配列番号:17))をLIPOFECTIN試薬(GIBCO BRL)を用いてトランスフェクトし、適切な濃度のジェネティシンを加えたRPMI1640中で6〜12日にわたって培養した。この細胞を、RT-PCRおよびウエスタンブロットによってWDRPUHおよびGAPDHの発現に関して分析した。
哺乳動物細胞において、相補的ヌクレオチド19個および3'末端にチミジンまたはウリジンの相補的二量体を有する20〜21塩基長の二本鎖RNA(dsRNA)から構成される低分子干渉RNA(siRNA)は、遺伝子発現の全体的な変化を伴わずに、遺伝子特異的な遺伝子サイレンシング作用を有することが最近示されている。このため、WDRPUHの発現に対する効果について検討するために、本発明者らはさまざまなWDRPUH-siRNAを発現するプラスミドを構築した。
psiH1BX-WDRPUH01、5'-CACCAATGTGATCTTCTCCAGGTGCTTCAAGAGAGCACCTGGAGAAGATCACATT-3'(配列番号:24)および5'-AAAAAATGTGATCTTCTCCAGGTGCTCTCTTGAAGCACCTGGAGAAGATCACATT-3'(配列番号:25);
psiH1BX-WDRPUH02、5'-CACCAAGGACACCAGTTTCTCGTAGTTCAAGAGACTACGAGAAACTGGTGTCCTT-3'(配列番号:26)および5'-AAAAAAGGACACCAGTTTCTCGTAGTCTCTTGAACTACGAGAAACTGGTGTCCTT-3'(配列番号:27);
psiH1BX-WDRPUH03、5'-CACCAAAGAGACGCTCATAGCGACTTTCAAGAGAAGTCGCTATGAGCGTCTCTTT-3'(配列番号:28)および5'-AAAAAAAGAGACGCTCATAGCGACTTCTCTTGAAAGTCGCTATGAGCGTCTCTTT-3'(配列番号:29);
psiH1BX-WDRPUH05、5'-CACCAACGACGGTAAAATCCGAGCCTTCAAGAGAGGCTCGGATTTTACCGTCGTT-3'(配列番号:30)および5'-AAAAAACGACGGTAAAATCCGAGCCTCTCTTGAAGGCTCGGATTTTACCGTCGTT-3'(配列番号:31);ならびに
対照psiH1BX-EGFP (擬似)、5'-CACCGAAGCAGCACGACTTCTTCTTCAAGAGAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC-3'(配列番号:32)および5'-AAAAGAAGCAGCACGACTTCTTCTCTCTTGAAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC-3'(配列番号:33)。
それぞれの配列中のsiRNAの標的配列には下線を施してある。
WDRPUHの発現について検討し、その機能を解明するために、WDRPUHに対するポリクローナル抗体を以下の通りに調製した。まず、His標識した組換えWDRPUHを大腸菌で産生させ、Pro Bond(商標)ヒスチジンレジン(インビトロジェン)を用い、製造者の推奨に従って細胞から精製した。この組換えタンパク質をウサギの免疫処置に用い、WDRPUHに対するポリクローナル抗体を血清から精製した。
C6242 cDNAをプローブとして用いて、実施例2の通りに多組織ノーザンブロット分析を行った。その結果、2.8kb転写物が胎盤および精巣で大量に発現されることが示された(図8a)。C6242はノーザンブロット上で検出されたものよりもサイズが小さかったため、KRZFPUH cDNAの5'部分の配列を調べた。まず、BLASTプログラムを用いてゲノムデータベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)中のC6242に対応するゲノム配列を検索し、染色体バンド16p11に位置づけられているワーキングドラフト(working draft)配列(GenBankアクセッション番号:NT-024802)を見いだした。このゲノム配列とGENSCAN、Gene RecognitionおよびAssembly Internet Linkプログラムを用いてエクソン配列候補を予想し、予想されたエクソン配列を連結した。続いて、プライマーとして5'-TAGATTCTGGGCGCACTTGTGGCTCTCC-3'(配列番号:34)を用いた以外は実施例2の通りに5'RACEを行い、その結果、500アミノ酸のタンパク質をコードする1500ヌクレオチドのオープンリーディングフレームを含む2744ヌクレオチドのアセンブルされた配列(GenBankアクセッション番号AB065282)を得た。Simple Modular Architecture Research Tool(SMART、http://smart.embl-heidelberg.de)を用いたタンパク質モチーフに関する検索により、予想されるタンパク質がKruppel型ジンクフィンガードメインを含むことが判明した(図8b)。決定されたKRZFPUHのヌクレオチド配列およびその予想されるアミノ酸配列はそれぞれ配列番号:3および4に示されている。
KRZFPUHに対応する全コード領域を、遺伝子特異的プライマーのセット:5'-GGGGTACCACCATGGCGCCACCTTCG-3'(配列番号:35)および5'-CGGAATTCATGGGCGTTGCCCCTCTGACTGG-3'(配列番号:36)を用いて増幅し、pcDNA3.1myc/Hisベクター(インビトロジェン)中にクローニングした。続いて、この構築物をSNU475細胞(韓国細胞株バンク)に一過的にトランスフェクトし、KRZFPUHの細胞内局在を実施例3の通りに調べた。細胞の免疫細胞化学染色により、タグ標識KRZFPUHタンパク質が核内に存在することが判明した(図9)。
細胞増殖に対するKRZFPUHの作用を分析するために、KRZFPUHを発現するプラスミド(pcDNA-KRZFPUH)をCOS7細胞(ATCC、Rockville、MD)にトランスフェクトして、コロニー形成アッセイを行った。具体的には、KRZFPUHに対応する全コード領域を実施例9の通りに増幅し、pcDNA3.1(インビトロジェン)中にクローニングした。この細胞に対してpcDNA-KRZFPUHプラスミド、対照プラスミド(擬似)およびKRZFPUHの相補鎖を発現するプラスミド(pcDNA-アンチセンス)のそれぞれをトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、適切な濃度のジェネティシンを含むDMEM中で10〜21日インキュベートした。その後に、細胞を100%メタノールで固定し、ギムザ溶液によって染色した。実験はすべて3回ずつ行った。図10aおよびbに示したように、KRZFPUHの相補鎖を発現する対照プラスミド(pcDNA-アンチセンス)に比べ、pcDNA-KRZFPUHはCOS7細胞で著しく多くのコロニーを形成した。この結果は3回の独立した実験によって確認された。有意差を判定するためにスチューデントtのt検定による統計分析を行った。
KRZFPUH発現の抑制により、HCC細胞の増殖遅延および/または細胞死がもたらされるか否かを検証するために、KRZFPUHの発現を抑制するために設計された種々のアンチセンスS-オリゴヌクレオチドを合成した。Alexander細胞(ATCC、Rockville、MD)を10cm培養皿にプレーティングし(2×105個/培養皿)、これに対してKRZFPUHの第1エクソン-イントロン境界を含むアンチセンスS-オリゴヌクレオチド(KRZFPUH-AS4;5'-GGCCTCACCGAGCGCG-3'(配列番号:37))または対照S-オリゴヌクレオチドKRZFPUH-S4;5'-CGCGCTCGGTGAGGCC-3'(配列番号:38))をLIPOFECTIN試薬(GIBCO BRL)を用いてトランスフェクトし、適切な濃度のジェネティシンを加えたRPMI1640中で6〜12日間培養した。続いて細胞を100%メタノールで固定し、ギムザ溶液によって染色した。大量のKRZFPUHを構成性に発現するAlexander細胞において、KRZFPUHの内因性発現および生存細胞の数は、アンチセンスS-オリゴヌクレオチド(KRZFPUH-AS4)のトランスフェクションにより、対照センスS-オリゴヌクレオチド(KRZFPUH-S4)よりも有意に低下し(図11aおよびb)、このことからKRZFPUHがHCC細胞の細胞増殖および/または生存に重要な役割を果たしている可能性が示唆された。この結果は3回の独立した実験によって確認された。有意差を判定するためにスチューデントのt検定による統計分析を行った。
二本鎖オリゴヌクレオチドをpsiU6BX3.0ベクター中にクローニングすることにより、KRZFPUH-siRNAを発現するプラスミドを調製した。KRZFPUH-siRNA用に用いたオリゴヌクレオチドは以下の通りであった:
psiU6BX-KRZFPUH1に対しては、5'-CACCAACGAAACACCGATGACTGGGTTCAAGAGACCCAGTCATCGGTGTTTCGTT-3'(SEQ ID NO:104) および5'-AAAAAACGAAACACCGATGACTGGGTCTCTTGAACCCAGTCATCGGTGTTTCGTT-3' (SEQ ID NO:105) ;
psiU6BX-KRZFPUH2に対しては、5'-CACCAATCACCGGACCACACACACATTCAAGAGATGTGTGTGTGGTCCGGTGATT-3' (SEQ ID NO:106) および5'-AAAAAATCACCGGACCACACACACATCTCTTGAATGTGTGTGTGGTCCGGTGATT-3' (SEQ ID NO:107);
psiU6BX-KRZFPUH3に対しては、5'-CACCAAACCTTGCCTACGACATGTTTTCAAGAGAAACATGTCGTAGGCAAGGTTT-3' (SEQ ID NO:108) および5'-AAAAAAACCTTGCCTACGACATGTTTCTCTTGAAAACATGTCGTAGGCAAGGTTT-3' (SEQ ID NO:109) ;ならびに
psiU6BX-KRZFPUH4に対しては、5'-CACCAAAAGGTTTCCGTTAGCCCCGTTCAAGAGACGGGGCTAACGGAAACCTTTT-3' (SEQ ID NO:110) および5'-AAAAAAAAGGTTTCCGTTAGCCCCGTCTCTTGAACGGGGCTAACGGAAACCTTTT-3' (SEQ ID NO:111) 。
それぞれの配列中のsiRNAの標的配列には下線を施してある。
23040種の遺伝子を含む、ゲノム全域にわたるcDNAマイクロアレイ(施設内で作製した)を用いて、実施例1のように、11例の結腸癌組織の発現プロファイルを対応する非癌結腸粘膜組織のものと比較した。この分析により、対応する非癌組織に比べ癌組織で発現レベルが高頻度に上昇している遺伝子が数多く同定された。それらのうち、CGI-124/PPIL1遺伝子(GenBankアクセッション番号:AF151882)に対応する施設内アクセッション番号B9486の遺伝子は、選択基準を満たした6例中全例において、対応する非癌粘膜に比べ癌組織で発現レベルが高く、倍率2.36〜4.68倍の範囲であることが判明した(図14a)。マイクロアレイの結果を明確にするために、別の結腸癌試料におけるこれらの転写物の転写の発現を、プライマー:5'-GGACAGGTCGAGGTGGTGC-3'(フォワード)(配列番号:39)および5'-CTCGACGAGTTCTCCCATCG-3'(リバース)(配列番号:40)を用い、実施例1の通りに半定量的RT-PCRを行って検討した。この半定量的RT-PCRによれば、PPIL1の発現は20例中17例で上昇していることが確認された(図14b)。
PPIL1に対応するAF151882の配列に関する相同性検索を、米国国立バイオテクノロジー情報センター(National Center for Biotechnology Information)のBLASTプログラム(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)を用いて公開データベースを対象にさらに行ったところ、PPIL1の5'部分または3'部分をそれぞれ含むBE908798、AK026636を含むESTが同定され、染色体バンド6p21.1に位置づけられているゲノム配列(GenBankアクセッション番号NT_007592)が同定された。アセンブルされたPPIL1のcDNA配列は、498ヌクレオチドのオープンリーディングフレームを含む1734ヌクレオチドを有していた。cDNA配列とゲノム配列との比較により、この遺伝子が4つのエクソンからなることが示された。この遺伝子の予想されるアミノ酸配列はマウスのものと98%の同一性を有していた(図15)。決定されたPPIL1のヌクレオチド配列およびその予想されるアミノ酸配列を、それぞれ配列番号:5および6に示す。
細胞増殖に対するPPIL1の作用を分析するために、myc標識PPIL1を発現するプラスミド(pcDNA3.1myc/His-PPIL1)をNIH3T3細胞(ATCC、Rockville、MD)にトランスフェクトして、コロニー形成アッセイを行った。プラスミドは以下の通りに構築した。まず、キアゲンRNeasyキット(キアゲン)またはTrizol試薬(ライフテクノロジーズ)を用い、製造者のプロトコールに従って全RNAを抽出した。ポリdT12-18プライマー(アマシャムファルマシアバイオテク)をSuperscript II逆転写酵素(ライフテクノロジーズ)とともに用いて、全RNAの10μgアリコートを逆転写し、一本鎖cDNAとした。得られた一本鎖cDNA調製物を、容積20μlのPCR緩衝液(タカラ)中に希釈した。続いて、PPIL1に対応する全コード領域を増幅するために、標準的なRT-PCR実験によるPCR増幅を以下のプライマーを用いて行った:5'-AGACAAGCTTTCCGCCGCCGGC-3'(フォワード)(配列番号:41)および5'-GTCTCTCGAGAAGGGTATGCCTTAATGATCTTC-3'(リバース)(配列番号:42)。
PPIL1の抑制により、結腸癌細胞の増殖遅延および/または細胞死がもたらされるか否かを検証するために、PPIL1に対応する4組の対照S-オリゴヌクレオチドおよびアンチセンスS-オリゴヌクレオチドを合成した:対照センスオリゴヌクレオチドPPIL1-S2、5'-CTTCGCTATGGCGGCA-3'(配列番号:43);アンチセンスS-オリゴヌクレオチドPPIL1-AS2、5'-TGCCGCCATAGCGAAG-3'(配列番号:44);およびスクランブル(scramble)S-オリゴヌクレオチドPPIL1-SCR2、5'-GTTGCACAGCGACGCA-3'(配列番号:92)。合成したオリゴヌクレオチドのそれぞれを、検討した11種の結腸癌細胞株の中でPPIL1発現レベルが高いことが示されたヒト結腸癌細胞SW480(ATCC、Rockville、MD)、SNU-C4およびSNU-C5(いずれも韓国細胞株バンク)に対して、LIPOFECTIN試薬(GIBCO BRL)を用いてトランスフェクトした。どの培地にも適切な濃度のジェネティシンを加えた上で、SW480はライボビッツL-15培地中、SNU-C4およびSNU-C5はRPMI1640中で6〜12日間培養した。続いて細胞を100%メタノールで固定し、ギムザ溶液によって染色した。
PPIL1との相同性が高い2種類の原核生物タンパク質、Cyp2(分裂酵母(Schizosaccharomyces pombe))およびCypE(細胞性粘菌(Dictiostelium discoideum))は、それぞれSnw1およびSnwAと相互作用することが報告されている。このため、PPIL1タンパク質はSnw1およびSnwAのヒトホモログであるSNW1/SKIPと会合するとの仮説を立てた。この仮説を検討するために、Flag標識PPIL1タンパク質を発現するpFLAG-PPIL1を構築した。まず、PPIL1の全コード領域を実施例15の通りに増幅し、その産物をpFLAG-CMV-5c(シグマ)のクローニング部位にクローニングしてpFLAG-PPIL1を調製した。同様に、SNW1の全コード領域を、遺伝子特異的プライマーのセット:5'-TGGGAAQTTCCGGAAGAAGATGGCGCTCACCAGC-3'(フォワード)(配列番号:45)および5'-GTGCCTCGAGCTTCCTCCTCTTCTTGCCTTCATGC-3'(リバース)(配列番号:46)を用いてRT-PCRにより増幅し、pcDNA3.1myc/His(インビトロジェン)のクローニング部位にクローニングして、myc標識SNW1を発現するpcDNA3.1myc-SNW1を構築した。次に、pFLAG-PPIL1を単独で、またはpcDNA3.1myc-SNW1とともにCOS7細胞(ATCC、Rockville、MD)にトランスフェクトした。
PPIL1とSNW1の会合をさらに確かめるために、COS7細胞におけるFLAG標識PPIL1タンパク質およびmyc標識SNW1タンパク質の細胞内局在を、pFLAG-PPIL1およびpcDNA3.1myc-SNW1を同時トランスフェクトした細胞に対し抗FLAG抗体を用いて免疫組織化学染色することで検討した。具体的には、pFLAG-PPIL1およびpcDNA3.1myc/His-SNW1をトランスフェクトした細胞を、4%パラホルムアルデヒドを含むPBS中に15分間おいて固定した後に、0.1%Triton X-100を含むPBS中に室温で2.5分間おいて透過化処理を行った。その後、非特異的なハイブリダイゼーションをブロックするために細胞を2%BSA(PBS中)で覆い、4℃で24時間おいた。1:1000に希釈したマウス抗mycモノクローナル抗体(シグマ)または1:2000に希釈したマウス抗FLAG抗体(シグマ)を免疫細胞化学染色のための一次抗体として用い、ローダミン結合抗マウス二次抗体(LeincoおよびICN)とのインキュベーションにより反応物を可視化した。核はDAPIで対比染色した。蛍光画像はECLIPSE E800顕微鏡によって得た。
PPIL1 cDNAをプローブとして用いて多組織ノーザンブロット分析を行った。具体的には、ヒト多組織ブロット(クロンテック、Palo Alto、CA)をPPIL1の32P標識PCR産物とハイブリダイズさせた。プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、および洗浄は供給元の推奨に従って行った。ブロットのオートラジオグラフィーは増感スクリーンを-80℃で24〜72時間用いて行った。
PPIL1発現の影響を検討するために、さまざまなPPIL1-siRNAを発現するプラスミドを構築した。まず、psiH1BX3.0ベクターを実施例6と同じように構築した。さらに、対照ベクターpsiH1BX-EGFPも実施例6のように調製した。続いて、PPIL1-siRNAを発現するプラスミドを、二本鎖オリゴヌクレオチドをpsiH1BX3.0ベクターのBbsI部位にクローニングすることによって調製した。ベクター中にクローニングしたオリゴヌクレオチドは以下の通りであった:
psiH1BX-PPIL-A、5'-TCCCGCATGCTCCAAAGACCTGTTTCAAGAGAACAGGTCTTTGGAGCATGC-3'(配列番号:47)および5'-AAAAGCATGCTCCAAAGACCTGTTCTCTTGAAACAGGTCTTTGGAGCATGC-3' (配列番号:48);
psiH1BX-PPIL-B、5'-TCCCAGACTTCATGATCCAAGGATTCAAGAGATCCTTGGATCATGAAGTCT-3'(配列番号:49)および5'-AAAAAGACTTCATGATCCAAGGATCTCTTGAATCCTTGGATCATGAAGTCT 3'(配列番号:50);ならびに
psiH1BX-PPIL-C、5'-TCCCTGGCAGCCAGTTCTTTGTGTTCAAGAGACACAAAGAACTGGCTGCCA-3'(配列番号:51)および5'-AAAATGGCAGCCAGTTCTTTGTGTCTCTTGAACACAAAGAACTGGCTGCCA-3'(配列番号:52)。
それぞれの配列中のsiRNAの標的配列には下線を施してある。
PPIL1に対する特異的抗体を作製するために、PPILの組換えタンパク質を調製した。PPIL1の全コード領域は、プライマーのセット:5'-CGCCGGATCCGCTATGGCGGCAATTCCCCCAG-3'(配列番号:53)および5'-AGCACTCGAGCCCAGAAGGGTATGCCTTAATGATC-3'(配列番号:54)を用いてRT-PCRにより増幅した。その産物を精製し、BamHlおよびXholで消化し、pGEX-6P-1ベクター(pGEX-PPIL1)またはpET21aベクター(pET-PPIL1)の適切なクローニング部位にクローニングした。pGEX-PPIL1またはpET-PPIL1を大腸菌DH10B細胞またはBL21コドンプラス細胞に形質転換した。組換えタンパク質をIPTGの添加によって誘導し、製造者のプロトコールに従って抽出物から精製した。プラスミドを大腸菌細胞に形質転換したところ、SDS-PAGE上に予想されたサイズで組換えタンパク質の産生が観察された(図22AおよびB)。
PPIL1の機能を分析するために、細菌2-ハイブリッドスクリーニング系を用いてPPIL1相互作用性タンパク質を検索した。BacterioMatch 2-ハイブリッド系(ストラタジーン)を用い、製造者のプロトコールに従って細菌2-ハイブリッドアッセイを行った。実施例21の通りに入手したPPIL1の全コード配列をpBTベクターのBamHl-Xhol部位にベイト(bait)としてクローニングし、ヒト胎児脳cDNAライブラリー(ストラタジーン)をスクリーニングした。同定された陽性クローンのうち、スタスミンは細菌でのpBT-PPIL1およびpTRG-STMNによる同時形質転換により、PPIL1との相互作用を示した(図23A)。
PPIL1およびスタスミンが細胞内で共存するか否かを検証するために、実施例22のように、COS7細胞に対してpFLAG-PPIL1およびpCMV-HA-STMNを同時にトランスフェクトし、免疫組織化学染色によって細胞内局在を検討した(図24)。抗FLAG抗体を用いた染色ではFlag標識PPIL1は核および細胞質の両方に局在することが示されたが、抗HA抗体による染色ではHA標識スタスミンが細胞質中にPPIL1と共存することが示された。このデータは、PPIL1およびスタスミンが細胞質中で相互作用するという見解を支持するものである。
さらに、この相互作用の責任領域を明らかにするために、pCMV-HA-STMNの種々の欠失変異体および野生型pFLAG-PPIL1を用いて、実施例22と同じように免疫沈降アッセイを行った。STMNの欠失変異体は、以下のプライマーのセット:
欠失変異体1に対しては、5'-ATTGGTACCATGGAGCTGATTCTCAGCCCTCGGTC-3'(配列番号:55)および5'-AATCTCGAGGTCAGCTTCAGTCTCGTCAGCAG-3'(配列番号:56);
欠失変異体2に対しては、5'-ATTGGTACCATGGTTCCAGAATTCCCCCTTTCCCCT-3'(配列番号:57)および5'-AATCTCGAGGTCAGCTTCAGTCTCGTCAGCAG-3'(配列番号:58);
欠失変異体3に対しては、5'-ATTGGTACCATGGATCTTTCCCTGGAGGAAATTCAG-3'(配列番号:59)および5'-AATCTCGAGGTCAGCTTCAGTCTCGTCAGCAG-3'(配列番号:60);
欠失変異体4に対しては、5'-ATTGGTACCATGGCTGAGGTCTTGAAGCAGCTGGC-3'(配列番号:61)および5'-AATCTCGAGGTCAGCTTCAGTCTCGTCAGCAG-3'(配列番号:62);ならびに
欠失変異体5に対しては、5'-ATTGGTACCTTCACCATGGCTTCTTCTGATATCC-3'(配列番号:63)および5'-AATCTCGAGGCGTCTTTCTTCTGCAGCTTC-3'(配列番号:64)を用い、完全長クローン(pFLAG-PPIL1)を鋳型に増幅した。PCR産物はpcDNA3.1myc/HisのKpnlおよびXhol部位にクローニングした。
抗Flag抗体を用いた免疫沈降によって修飾型のスタスミンに対応する単一のバンドが示されたため、セリンリン酸化部位と推定される部位でのその変異型を発現するプラスミドを調製し、それとPPIL1との結合を検討した(図26A)。具体的には、変異体(SerがAlaに置換)は、QuikChange部位特異的変異誘発キット(ストラタジーン)およびプライマーのセット:
S16Aに対しては、5'-CTGGAGAAGCGTGCCGCAGGCCAGGCTTTTG-3'(配列番号:65)および5'-CAAAAGCCTGGCCTGCGGCACGCTTCTCCAG-3'(配列番号:66);
S25Aに対しては、5'-GCTTTTGAGCTGATTCTCGCCCCTCGGTCAAAAGAATCTG-3'(配列番号:67)および5'-CAGATTCTTTTGACCGAGGGGCGAGAATCAGCTCAAAAGC-3'(配列番号:68);
S38Aに対しては、5'-CCAGAATTCCCCCTTGCCCCTCCAAAGAAGAAG-3'(配列番号:69)および5'-CTTCTTCTTTGGAGGGGCAAGGGGGAATTCTGG-3'(配列番号:70);
S63Aに対しては、5'-CAGAAGAAAGACGCAAGGCCCATGAAGCTGAGG-3'(配列番号:71)および5'-CCTCAGCTTCATGGGCCTTGCGTCTTTCTTCTG-3'(配列番号:72)を用い、供給元の推奨に従って調製した。
結腸直腸癌の発生には、βカテニン/Tcf経路の調節障害が初期段階としてかかわる。このため、次の手順として、この経路の下流遺伝子を検索した。結腸癌細胞へのAPCの形質導入は核内のβカテニンレベルを低下させ、引き続いてβカテニン/Tcf複合体の転写促進活性を抑制する(van der Heydenら、J Cell Sci 111:1741-9(1998))。このため、大量のβカテニンが核および細胞質に蓄積するSW480細胞の発現プロファイルを、実施例1と同様のマイクロアレイ手法を用いて比較した。
βカテニンの蓄積は結腸直腸腫瘍に高頻度にみられる特徴であるため、結腸癌組織および対応する非癌組織におけるAPCDD1の発現を実施例26の通りに半定量的RT-PCRによって検討したところ、検討した30例の腫瘍のうち20例(67%)で発現上昇が検出された(図27c)。この結果は、APCDD1がβカテニン/Tcf転写複合体の活性化に応答して上方制御されるという事実と一致した。
APCDD1のプロモーター活性がβカテニン/Tcf4複合体によって制御されるか否かを検証するために、Tcf/LEF結合モチーフと推定される2つのモチーフ(TBM1および2)を含むレポータープラスミドP1を、活性化型である変異型βカテニンと野生型Tcf4の存在下または非存在下でHeLa細胞にトランスフェクトした(図28a)。より具体的には、APCDD1の転写開始部位(TIS)と推定される部位を、ヒトゲノム配列(GenBankアクセッション番号NT_019631.4)とAPCDD1 cDNAの配列とを比較して決定した。APCDD1の5'隣接領域の3つの断片をPCRによって増幅し(P1、P2、およびP3)、pGL3-Basicベクター(プロメガ(Promega))の適切な酵素部位にクローニングした。Tcf/LEF結合モチーフと推定されるモチーフを1つまたは2つ含むP1およびP2に対してQuickChange(商標)部位特異的変異誘発キット(ストラタジーン)を用いることによって部位特異的変異誘発法を実施した。活性化型である変異型βカテニンは、プライマーのセット:5'-AAGGATCCGCGTGGACAATGGCTACTCAAG-3'(配列番号:76)および5'-GGACTCGAGACAGGTCAGTATCAAACCAGGCCAG-3'(配列番号:77)を用い、HCT116結腸癌細胞から抽出したRNAを鋳型にRT-PCRによって調製し、その後にpcDNA3.1プラスミドベクター(インビトロジェン)の適切なクローニング部位にクローニングした。Tcf-4の全コード領域のヒトcDNA断片およびその5'欠失領域(wtTcf4、dnTcf4)は、プライマーのセット:TcfF1:5'-AAGAATTCTGCTGGTGGGTGAAAAAAAAATGC-3'(配列番号:78)およびTcfR1:5'-CTACTCGAGTTCTAAAGACTTGGTGACGAGCGAC-3'(配列番号:79)、ならびにTcfF3:5'-AGGAATTCGTGCATCATGGTCCCACCACATCATAC-3'(配列番号:80)およびTcfR1をそれぞれ用い、RT-PCRによって増幅した。その産物もpcDNA3.1プラスミドベクター中にクローニングした。2μgの各レポータープラスミドおよび1.5μgの各発現構築物を、0.5μgのpRL-TKプラスミド(プロメガ)とともに、トランスフェクションの効率を標準化するためのFuGENE6(ベーリンガーマンハイム(Boehringer Mannheim))を用いて、HeLa細胞に同時トランスフェクトした。レポーターアッセイはDual-Luciferaseレポーターアッセイ系を用い、供給元の推奨(プロメガ)に従って行った。
βカテニン/Tcf4複合体がTBM1およびTBM2と直接会合するか否かを検討するために、TBM1配列(APCDD1-TBM1)およびTBM2配列(APCDD1-TBM2)を含むように設計されたオリゴヌクレオチドを用いて電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)を行った。具体的には、EMSAは以前の記載(van der Heydenら、J Cell Sci 111:1741-9(1998))の通りに、SW480細胞の無傷核から得た抽出物を用いて行った。2つの二本鎖16ヌクレオチドDNAプローブを、APCDD1-TBM1に関してはFF(5'-GCTTTGATTGTGGTGA-3'(配列番号:82))およびRR(5'-TCACCACAATCAAAGC-3'(配列番号:83))を、APCDD1-TBM2に関してはFF2(5'-CCCCTTTGAACACCTT-3'(配列番号:84))およびRR2(5'-AAGGTGTTCAAAGGGG-3'(配列番号:85))をアニーリングさせることによって調製した。
結腸直腸腫瘍発生におけるAPCDD1の役割を明らかにするために、少量のAPCDD1を発現するLoVo細胞(ATCC、Rockville、MD)においてコロニー形成アッセイを行う目的で、APCDD1(pcDNA-APCDD1)およびAPCDD1の相補鎖(pcDNA-アンチセンス)を発現するプラスミドを調製した。より具体的には、APCDD1の全コード領域を、遺伝子特異的プライマーのセット:5'-GCGGAATTCAGGGCCCAGAGCAGGACTG-3'(配列番号:86)および5'-TAGCTCGAGCTAAAACTTCTATCTGCGGATGT-3'(配列番号:87)を用い、RT-PCRによって増幅した。このPCR産物をpcDNA3.1(インビトロジェン)の適切なクローニング部位にクローニングした。続いて、LoVo細胞に対して構築したpcDNA-APCDD1またはpcDNA-アンチセンスをトランスフェクトし、適切な濃度のジェネティシンを加えたハムF-12培地中で細胞を10〜21日間インキュベートした。細胞を100%メタノールで固定し、ギムザ溶液によって染色した。
インビボでのAPCDD1の役割を調べるために、ヌードマウスでのLoVo-APCDD1細胞の2種類のクローンまたはLoVo-擬似細胞の2種類のクローンのいずれかを、12匹のBALBcAnN Crj-nu/nuマウスに同時に移植した。具体的には、腫瘍細胞、LoVo-APCDD1、またはLoVo-ベクターを最終濃度が5×107個/mlになるように調整し、その100μlをBALB/cAnN Crj-nu/nuマウスの中背部後方にそれぞれ皮下注射した。腫瘍の計測は7日毎に8週間にわたって行い、体積を式V=π/6×a2×bによって概算したが、ここで「a」は短軸であり、「b」は長軸である。
APCDD1の増殖促進的な役割を評価するために、APCDD1に対応する、さまざまな対の対照S-オリゴヌクレオチドおよびアンチセンスS-オリゴヌクレオチドを合成し、それらを、検討した11種の結腸癌細胞株のなかでAPCDD1を大量に発現するSW480細胞にトランスフェクトした。この方法は、SNU475細胞の代わりにSW480細胞を用い、以下のS-オリゴヌクレオチドを用いた点以外は、実施例5に記載した手順に従って行った:対照センスS-オリゴヌクレオチドAPCDD1-S2、5'-ATGTCCTGGCCGCGCC-3'(配列番号:88);アンチセンスS-オリゴヌクレオチドAPCDD1-AS2、5'-GGCGCGGCCAGGACAT-3'(配列番号:89);リバースS-オリゴヌクレオチドAPCDD1-R2、5'-TACAGGACCGGCGCGG-3'(配列番号:90);およびスクランブルS-オリゴヌクレオチドAPCDD1-Sc2、5'-ATCTGGTCCGGCGCGG-3'(配列番号:91)。
APCDD1の発現および機能について検討するために、APCDD1に対するポリクローナル抗体を以下の通りに調製した。まず、組換えHis標識したAPCDD1タンパク質を大腸菌で産生させ、Pro Bond(商標)ヒスチジンレジン(インビトロジェン)を用い、製造者の推奨に従って細胞から精製した。この組換えタンパク質をウサギの免疫処置に用い、APCDD1に対するポリクローナル抗体を血清から精製した。ウエスタンブロット分析に関しては、タンパク質を10%SDS-PAGEによって分離し、抗APCDD1抗体を用いてイムノブロットを行った。HRP結合ヤギ抗ウサギIgG(サンタクルズバイオテクノロジー(Santa Cruz Biotechnology))をECL検出システム(アマシャムファルマシアバイオテク)用の二次抗体として用いた。
その細胞内局在を調べるために、SW480細胞を用いてAPCDD1の蛍光免疫組織化学染色を行った。細胞を固定し、抗APCDD1で染色し、フルオレセインを結合させた二次抗体によって可視化した。シグナルは細胞間境界および細胞質で観察された(図33)。
APCDD1タンパク質の発現レベルを非癌上皮細胞と腫瘍細胞との間で比較するために、パラフィン包埋した組織を免疫組織化学染色に供した。癌細胞の方が非癌上皮細胞よりも抗APCDD1抗体によって強く染色された(図35)。また、腺腫細胞でも弱いシグナルが観察された(図36)。
新規ヒト遺伝子WDRPUHおよびKRZFPUHの発現は非癌肝組織に比べ肝細胞癌で顕著に上昇している。一方、新規ヒト遺伝子PPIL1およびAPCDD1の発現は非癌組織に比べ結腸癌細胞で顕著に上昇している。したがって、これらの遺伝子は癌の診断マーカーとして役立つと思われ、それらによってコードされるタンパク質は診断アッセイに用いることができると考えられる。
Claims (20)
- 以下からなる群より選択される、ポリペプチド:
(a)配列番号:2のアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(b)配列番号:2のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等な細胞増殖活性を有する、1つまたは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加された配列番号:2のアミノ酸配列を含むポリペプチド;ならびに
(c)配列番号:2のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等な細胞増殖活性を有する、配列番号:1のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド。 - 請求項1記載のポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
- 請求項2記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項2記載のポリヌクレオチドまたは請求項3記載のベクターを保有する宿主細胞。
- 以下の段階を含む、請求項1記載のポリペプチドを生産するための方法:
(a)請求項4記載の宿主細胞を培養する段階;
(b)宿主細胞にポリペプチドを発現させる段階;および
(c)発現されたポリペプチドを収集する段階。
を含む方法。 - 請求項1記載のポリペプチドと結合する抗体。
- 配列番号:1のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドまたはその相補鎖に対して相補的であって、前記ポリヌクレオチドまたはその相補鎖を定量するための、少なくとも15ヌクレオチドを含むプローブまたはプライマー。
- 配列番号:1のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み配列番号:2のポリペプチドの発現を阻害するアンチセンスポリヌクレオチド、またはセンス鎖配列とアンチセンス鎖配列の組み合わせを含み、前記センス鎖配列が配列番号:1のヌクレオチド配列中の19−25ヌクレオチド長のヌクレオチド配列を標的配列として含み配列番号:2のポリペプチドの産生を減少させる低分子干渉RNA。
- 配列番号:16のヌクレオチド配列を含む請求項8記載のアンチセンスポリヌクレオチド。
- その標的配列が、配列番号:93、94、95、および96のヌクレオチド配列を標的配列として含むヌクレオチドからなる群より選択される、請求項8記載の低分子干渉RNA。
- 対象から採取された標本の生物試料における、配列番号:1のヌクレオチド配列を含むWDRPUH遺伝子の発現レベルを細胞増殖性疾患のマーカーとして検出する段階を含む細胞増殖性疾患のマーカーを検出するための方法。
- 以下からなる群より選択される方法のいずれか1つによって発現レベルが検出される、請求項11記載の方法:
(a)配列番号:1のヌクレオチド配列を含むWDRPUH遺伝子のmRNAを検出する段階;
(b)配列番号:2のアミノ酸配列を含むポリペプチドを検出する段階;および
(c)配列番号:2のアミノ酸配列を含むポリペプチドの細胞増殖活性を検出する段階。 - 細胞増殖性疾患が癌である、請求項11〜12のいずれか一項記載の方法。
- 次の要素(a)または(b)を含む細胞増殖性疾患の診断薬;
(a)配列番号:1のヌクレオチド配列またはその相補配列に相補的な少なくとも15ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド;または
(b)配列番号:2のアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体。 - 以下の段階を含む、細胞増殖性疾患を治療するための候補化合物に関するスクリーニングの方法:
(a)被験化合物を、
(1)配列番号:2のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
(2)配列番号:2のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等な細胞増殖活性を有する、1つまたは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加された配列番号:2のアミノ酸配列を含むポリペプチド、および
(3)配列番号:2のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等な細胞増殖活性を有する、配列番号:1のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、
からなる群より選択されるポリペプチドと接触させる段階;
(b)ポリペプチドと被験化合物との結合活性を検出する段階;ならびに
(c)ポリペプチドと結合する化合物を選択する段階。 - 以下の段階を含む、細胞増殖性疾患を治療するための化合物に関するスクリーニングの方法:
(a)被験化合物を、配列番号:1のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを発現する細胞と接触させる段階;および
(b)配列番号:1のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの発現レベルを、被験化合物の非存在下で検出される発現レベルと比較して低下させる化合物を選択する段階。 - 以下の段階を含む、細胞増殖性疾患を治療するための化合物に関するスクリーニングの方法:
(a)被験化合物を、
(1)配列番号:2のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
(2)配列番号:2のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等な生物学的活性を有する、1つまたは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加された配列番号:2のアミノ酸配列を含むポリペプチド、および
(3)配列番号:2のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等な生物学的活性を有する、配列番号:1のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、
からなる群より選択されるポリペプチドと接触させる段階;
(b)段階(a)のポリペプチドの生物学的活性を検出する段階;ならびに
(c)被験化合物の非存在下で検出される生物学的活性と比較してポリペプチドの生物学的活性を抑制する化合物を選択する段階
であって、前記生物学的活性が細胞増殖活性である方法。 - 細胞増殖性疾患が癌である、請求項15〜17のいずれか一項記載の方法。
- 配列番号:1のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み配列番号:2のポリペプチドの発現を阻害するアンチセンスポリヌクレオチドまたはセンス鎖配列とアンチセンス鎖配列の組み合わせを含み、前記センス鎖配列が配列番号:1のヌクレオチド配列中の19−25ヌクレオチド長のヌクレオチド配列を標的配列として含み配列番号:2のポリペプチドの産生を減少させる低分子干渉RNAの薬学的有効量を含む、細胞増殖性疾患を治療するための組成物。
- 細胞増殖性疾患が癌である、請求項19記載の組成物。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US38698502P | 2002-06-06 | 2002-06-06 | |
US60/386,985 | 2002-06-06 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2004511344A Division JP2006505247A (ja) | 2002-06-06 | 2003-06-04 | 肝細胞癌または結腸直腸癌に関連する遺伝子およびポリペプチド |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2009278976A JP2009278976A (ja) | 2009-12-03 |
JP5167464B2 true JP5167464B2 (ja) | 2013-03-21 |
Family
ID=29736242
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2004511344A Ceased JP2006505247A (ja) | 2002-06-06 | 2003-06-04 | 肝細胞癌または結腸直腸癌に関連する遺伝子およびポリペプチド |
JP2009130107A Expired - Lifetime JP5167464B2 (ja) | 2002-06-06 | 2009-05-29 | 肝細胞癌または結腸直腸癌に関連する遺伝子およびポリペプチド |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2004511344A Ceased JP2006505247A (ja) | 2002-06-06 | 2003-06-04 | 肝細胞癌または結腸直腸癌に関連する遺伝子およびポリペプチド |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US20060019252A1 (ja) |
EP (1) | EP1532245B1 (ja) |
JP (2) | JP2006505247A (ja) |
KR (1) | KR20060069207A (ja) |
CN (5) | CN101613406A (ja) |
AU (1) | AU2003240221A1 (ja) |
CA (1) | CA2488621A1 (ja) |
ES (1) | ES2361541T3 (ja) |
SI (1) | SI1513934T1 (ja) |
WO (1) | WO2003104276A2 (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP7220515B2 (ja) | 2018-03-27 | 2023-02-10 | フクシマガリレイ株式会社 | 冷蔵庫 |
JP7273026B2 (ja) | 2018-03-13 | 2023-05-12 | エルジー エレクトロニクス インコーポレイティド | 冷蔵庫 |
Families Citing this family (20)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2006141297A (ja) * | 2004-11-19 | 2006-06-08 | Eiken Chem Co Ltd | 血管新生を検出するためのマーカー |
PL2325305T3 (pl) * | 2005-02-25 | 2014-07-31 | Oncotherapy Science Inc | Szczepionki peptydowe na nowotwory płuc z ekspresją polipeptydów TTK, URLC10 lub KOC1 |
WO2007127002A2 (en) * | 2006-03-31 | 2007-11-08 | Cell Signaling Technology, Inc. | Protein markers of responsiveness to type iii receptor tyrosine kinase inhibitors |
JP2007282591A (ja) * | 2006-04-19 | 2007-11-01 | Yamaguchi Univ | スタスミンチップ及びこれを用いたスタスミン結合タンパク質の検出方法 |
EP2125898B1 (en) * | 2007-03-14 | 2013-05-15 | Novartis AG | Apcdd1 inhibitors for treating, diagnosing or detecting cancer |
WO2010051534A2 (en) * | 2008-10-31 | 2010-05-06 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Method for apcdd1 mediated regulation of hair growth and pigmentation and mutants thereof |
TWI539160B (zh) * | 2008-12-05 | 2016-06-21 | 腫瘤療法 科學股份有限公司 | Wdrpuh抗原決定位胜肽以及含此胜肽之疫苗 |
WO2010093066A1 (en) * | 2009-02-10 | 2010-08-19 | Industrial Cooperation Foundation Chonbuk National University | Ppia marker for diagnosis of liver cancer and antibody, and screening method of compounds useful for inhibiting liver cancer |
US8372819B2 (en) * | 2010-04-11 | 2013-02-12 | Salk Institute For Biological Studies | Methods and compositions for targeting skip |
US20130209476A1 (en) * | 2010-06-04 | 2013-08-15 | The Brigham And Women's Hospital Inc. | Treatment of inflammatory disorders |
WO2012019061A2 (en) * | 2010-08-05 | 2012-02-09 | Stem Centrx, Inc. | Novel effectors and methods of use |
CN104302782A (zh) * | 2012-02-28 | 2015-01-21 | 诺华股份有限公司 | 利用rnf43突变状态选择wnt信号转导抑制剂给药的癌症患者 |
EP2757157A1 (en) * | 2013-01-17 | 2014-07-23 | Ecole Polytechnique Federale de Lausanne (EPFL) | Modulation of mitophagy and use thereof |
CR20160486A (es) * | 2014-04-21 | 2017-02-20 | Abbvie Stemcentrx Llc | Anticuerpos anti-rnf43 novedosos y métodos para su uso |
US11097005B2 (en) | 2014-12-15 | 2021-08-24 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Use of cadherin-11 antagonists to treat metabolic disorders and/or increase insulin sensitivity |
CN109320592A (zh) * | 2018-09-20 | 2019-02-12 | 山西医科大学 | 用于治疗结肠癌的多肽、多肽组合物及其应用 |
CN109293746A (zh) * | 2018-09-20 | 2019-02-01 | 山西医科大学 | 一种多肽、多肽组合物在治疗结肠癌中的应用 |
KR102073144B1 (ko) * | 2018-12-13 | 2020-02-04 | 주식회사 엘베이스 | 올리고펩티드를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 |
CN112980951A (zh) * | 2021-02-01 | 2021-06-18 | 深圳市人民医院 | 线粒体蛋白slc25a24在结直肠癌诊断、预后判断中的应用 |
CN117069821A (zh) * | 2023-07-14 | 2023-11-17 | 中山大学肿瘤防治中心(中山大学附属肿瘤医院、中山大学肿瘤研究所) | 靶向人pkm1蛋白的nudt13多肽及其在制备药物中的应用 |
Family Cites Families (16)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE69133476T2 (de) | 1990-08-29 | 2006-01-05 | GenPharm International, Inc., Palo Alto | Transgene Mäuse fähig zur Produktion heterologer Antikörper |
WO1993002227A1 (en) | 1991-07-15 | 1993-02-04 | Eco-Tec Limited | Process and apparatus for treating fluoride containing acid solutions |
NZ255101A (en) | 1992-07-24 | 1997-08-22 | Cell Genesys Inc | A yeast artificial chromosome (yac) vector containing an hprt minigene expressible in murine stem cells and genetically modified rodent therefor |
US5285485A (en) | 1993-02-01 | 1994-02-08 | General Electric Company | Composite nuclear fuel container and method for producing same |
EP0754225A4 (en) | 1993-04-26 | 2001-01-31 | Genpharm Int | HETEROLOGIC ANTIBODY-PRODUCING TRANSGENIC NON-HUMAN ANIMALS |
EP1978033A3 (en) | 1995-04-27 | 2008-12-24 | Amgen Fremont Inc. | Human antibodies derived from immunized xenomice |
EP0823941A4 (en) | 1995-04-28 | 2001-09-19 | Abgenix Inc | HUMAN ANTIBODIES DERIVED FROM IMMUNIZED XENO MOUSES |
AU4834999A (en) | 1998-06-26 | 2000-01-17 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Human signal peptide-containing proteins |
EP1155126A2 (en) * | 1999-02-22 | 2001-11-21 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Genes associated with diseases of the colon |
US6908748B2 (en) * | 1999-07-29 | 2005-06-21 | Kenji Sobue | Genes associated with the maintenance of differentiation of smooth muscle cells |
AU6181000A (en) * | 1999-07-29 | 2001-02-19 | Chugai Research Institute For Molecular Medicine, Inc. | Novel genes encoding protein kinase/protein phosphatase |
WO2001009315A1 (fr) * | 1999-07-29 | 2001-02-08 | Helix Research Institute | Nouveau gene participant au maintien de la differenciation des cellules des muscles lisses |
WO2001009318A1 (fr) * | 1999-07-29 | 2001-02-08 | Helix Research Institute | Genes associes au cancer du foie |
EP1661996A1 (en) * | 1999-12-01 | 2006-05-31 | Genentech, Inc. | Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same |
AU6201301A (en) * | 2000-04-17 | 2001-11-20 | Shanghai Cancer Institute | A novel human hepatoma associated protein and the polynucleotide encoding said polypeptide |
AU2003241179C1 (en) * | 2002-06-06 | 2010-11-25 | Oncotherapy Science, Inc. | Genes and polypeptides relating to human colon cancers |
-
2003
- 2003-06-03 CN CN200910165164A patent/CN101613406A/zh active Pending
- 2003-06-03 SI SI200331981T patent/SI1513934T1/sl unknown
- 2003-06-03 CN CN200910165163A patent/CN101613405A/zh active Pending
- 2003-06-03 ES ES03730791T patent/ES2361541T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2003-06-04 CN CNA038189429A patent/CN1675360A/zh active Pending
- 2003-06-04 AU AU2003240221A patent/AU2003240221A1/en not_active Abandoned
- 2003-06-04 JP JP2004511344A patent/JP2006505247A/ja not_active Ceased
- 2003-06-04 CN CNA2009101330154A patent/CN101532060A/zh active Pending
- 2003-06-04 WO PCT/JP2003/007070 patent/WO2003104276A2/en active Application Filing
- 2003-06-04 US US10/517,151 patent/US20060019252A1/en not_active Abandoned
- 2003-06-04 EP EP03733286.3A patent/EP1532245B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-06-04 KR KR1020047019881A patent/KR20060069207A/ko not_active Application Discontinuation
- 2003-06-04 CA CA002488621A patent/CA2488621A1/en not_active Abandoned
- 2003-06-04 CN CNA200910133014XA patent/CN101533029A/zh active Pending
-
2007
- 2007-11-30 US US11/948,790 patent/US20080207549A1/en not_active Abandoned
-
2009
- 2009-05-29 JP JP2009130107A patent/JP5167464B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2010
- 2010-02-03 US US12/699,711 patent/US8124341B2/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP7273026B2 (ja) | 2018-03-13 | 2023-05-12 | エルジー エレクトロニクス インコーポレイティド | 冷蔵庫 |
JP7220515B2 (ja) | 2018-03-27 | 2023-02-10 | フクシマガリレイ株式会社 | 冷蔵庫 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN101613406A (zh) | 2009-12-30 |
CN1675360A (zh) | 2005-09-28 |
US20080207549A1 (en) | 2008-08-28 |
JP2009278976A (ja) | 2009-12-03 |
EP1532245A2 (en) | 2005-05-25 |
KR20060069207A (ko) | 2006-06-21 |
SI1513934T1 (sl) | 2011-06-30 |
JP2006505247A (ja) | 2006-02-16 |
CN101532060A (zh) | 2009-09-16 |
EP1532245B1 (en) | 2014-12-31 |
US20060019252A1 (en) | 2006-01-26 |
CN101613405A (zh) | 2009-12-30 |
AU2003240221A1 (en) | 2003-12-22 |
US20100291567A1 (en) | 2010-11-18 |
CN101533029A (zh) | 2009-09-16 |
WO2003104276A9 (en) | 2004-05-27 |
CA2488621A1 (en) | 2003-12-18 |
AU2003240221A8 (en) | 2003-12-22 |
WO2003104276A2 (en) | 2003-12-18 |
ES2361541T3 (es) | 2011-06-17 |
US8124341B2 (en) | 2012-02-28 |
WO2003104276A3 (en) | 2005-03-31 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5167464B2 (ja) | 肝細胞癌または結腸直腸癌に関連する遺伝子およびポリペプチド | |
JP4594085B2 (ja) | ヒト結腸癌に関連する遺伝子およびポリペプチド | |
US8148080B2 (en) | Gene and protein relating to hepatocellular carcinoma and methods of use thereof | |
JP2006517783A (ja) | ヒト骨髄性白血病に関連する遺伝子およびポリペプチド | |
JP2006518186A (ja) | 前立腺癌関連遺伝子およびポリペプチド | |
TWI324608B (en) | Genes and polypeptides relating to human colorectal cancers | |
JP2005521421A (ja) | 結腸直腸癌を診断および治療する方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20110921 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20111118 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20111207 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20120203 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20120912 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20121030 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20121119 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20121122 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5167464 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20160111 Year of fee payment: 3 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
EXPY | Cancellation because of completion of term |