ES2336416T3 - Dimetilarginina dimetilaminohidrolasa. - Google Patents

Abstract

Un polinucleótido que: (a) codifica un polipéptido que tiene actividad metilarginasa, seleccionándose dicho polinucleótido de: (1) la secuencia codificante de la SEC ID Nº: 3; y (2) una secuencia que está degenerada como resultado del código genético con respecto a una secuencia definida en (1); o (b) es una secuencia complementaria a un polinucleótido definido en (a).

Description

Dimetilarginina dimetilaminohidrolasa.

Método de exploración.

Campo técnico de la invención

Esta invención se refiere a métodos de exploración para compuestos que regulen específicamente diferentes isoformas de dimetilarginina dimetilaminohidrolasa.

Antecedentes de la invención

Los restos arginina en proteínas se metilan por una familia de proteínas arginina N-metiltransferasas (PRMT). Estas enzimas catalizan la metilación de nitrógenos guanidino de arginina para producir N^{G} monometil-L-arginina (L-NMMA), N^{G}N'^{G} dimetil-L-arginina (dimetilarginina asimétrica; ADMA) y N^{G}N^{G} dimetilarginina (dimetilarginina simétrica; SDMA). La proteolisis de proteínas que contienen estos restos libera metilargininas libres. Aunque el papel biológico de restos metilarginina no está claro, la L-NMMA y ADMA libres, pero no la SDMA, son inhibidores de las tres isoformas de la óxido nítrico sintasa (NOS) y podrían alterar la actividad de NOS en la salud o en la enfermedad.

Las metilargininas libres se encuentran en el citosol celular, plasma y tejidos y sus concentraciones difieren entre tejidos y entre regiones dentro de un solo tejido u órgano. Se han detectado concentraciones elevadas de ADMA en células endoteliales que repueblan vasos sanguíneos dañados por lesión con globo, en el plasma de pacientes o animales experimentales con hiperlipidemia, insuficiencia renal o aterosclerosis y en pacientes con esquizofrenia o esclerosis múltiple. Una biosíntesis alterada del óxido nítrico (NO) se ha implicado en la patogénesis de todas estas afecciones y es posible que la acumulación de ADMA endógena sea la causa subyacente de la inhibición de la generación de NO.

La producción de metilargininas es probablemente una etapa obligatoria en la renovación de proteínas y las velocidades de producción pueden mostrar variaciones temporales y específicas de tejido. Sin embargo, la L-NMMA y ADMA, pero no la SDMA, se metabolizan activamente a citrulina y metilaminas por acción de la dimetilarginina dimetilaminohidrolasa (DDAH). Ciertos tejidos que expresan NOS también parecen expresar DDAH. La inhibición farmacológica de DDAH aumenta la concentración de ADMA en células endoteliales e inhibe la relajación dependiente del endotelio mediada por NO de los vasos sanguíneos. Estas observaciones sugieren que la actividad de DDAH asegura que la concentración local de ADMA no aumente normalmente lo suficiente para afectar a la generación de NO, y que los cambios en la actividad de DDAH podrían alterar de forma activa la actividad de NOS.

Sumario de la invención

La presente invención se basa en el descubrimiento de que los seres humanos expresan dos metilarginasas funcionalmente activas, que se han denominado DDAHI y DDAHII. Se han clonado los polinucleótidos que codifican las isoformas DDAHI y DDAHII y se han estudiado los patrones de expresión de estas dos metilarginasas mediante transferencia de ARN. Estos experimentos pusieron de manifiesto que la DDAHI tiene una distribución tisular en seres humanos que es similar a la de la isoforma neuronal de la óxido nítrico sintasa (nNOS), mientras que la DDAHII se expresa mucho en tejidos vasculares que también expresan la isoforma endotelial (eNOS).

Además, se ha demostrado que la DDAHII se expresa en tejidos inmunes y se localiza en el cromosoma 6p21.3. Ese locus cromosómico se ha implicado en la susceptibilidad a varias enfermedades, incluyendo artritis reumatoide y diabetes mellitus insulinodependiente (IDDM) y la producción alterada de óxido nítrico se ha implicado en la patología de ambas enfermedades.

Los datos proporcionan pruebas de que la concentración de metilarginina está regulada de forma activa en células que expresan NOS y además, sugieren que existe un mecanismo de regulación de la NOS por el que se regulan específicamente isoformas diferentes de NOS ya que las concentraciones de metilarginina están moduladas por la acción de enzimas DDAH específicas.

Por lo tanto, la DDAHI y DDAHII proporcionan nuevas dianas para el aislamiento de sustancias que pueden modular específicamente la actividad de isoformas de NOS particulares u otras enzimas que utilizan arginina a través de la interacción específica con isoformas de DDAH particulares. Dichas sustancias pueden ser útiles en el tratamiento de enfermedades en las que están implicados niveles anormales de metilargininas y/o óxido nítrico.

Además se ha descubierto que la DDAHI y DDAHII humanas comparten una homología significativa con arginina desiminasas bacterianas. Las arginina desiminasas se han descrito solamente en organismos procariotas y en el eucariota primitivo Giardia intestinales. Las arginina desiminasas catalizan la hidrólisis de arginina a amoniaco y citrulina en una reacción que se parece mucho a la hidrólisis de metilarginina a metilamina y citrulina catalizada por DDAHI.

Se han aislado secuencias de DDAHI de tres especies de bacterias y una secuencia de arginina desiminasa de P. aeruginosa. Las enzimas codificadas por estas secuencias pueden expresarse a altos niveles y pueden recuperarse grandes cantidades de la enzima expresada. Por lo tanto, se ha identificado una fuente excelente de enzimas que pueden usarse para identificar compuestos capaces de modular la actividad de enzimas DDAH.

De acuerdo con la presente invención se proporciona por lo tanto un polinucleótido que:

(a)

codifica un polipéptido que tiene actividad metilarginasa, seleccionándose dicho polinucleótido de:

(1)

la secuencia codificante de la SEC ID Nº: 3; y

(2)

una secuencia que está degenerada como resultado del código genético con respecto a una secuencia definida en (1); o

(b)

es una secuencia complementaria a un polinucleótido definido en (a).

La invención también proporciona:

-

un polipéptido que tiene actividad metilarginasa y que comprende la secuencia expuesta en la SEC ID Nº: 4;

-

un vector que incorpora un polinucleótido de la invención;

-

una célula que alberga un vector de la invención;

-

un anticuerpo capaz de unirse a un polipéptido que tiene actividad metilarginasa y que comprende la secuencia expuesta en la SEC ID Nº: 4, siendo el anticuerpo capaz de discriminar entre un polipéptido de DDAHI y un polipéptido de DDAHII;

-

un animal transgénico no humano que no es capaz de expresar una forma activa de una dimetilarginina dimetilaminohidrolasa II (DDAHII), en el que, en el animal transgénico, la secuencia polinucleotídica del locus del gen de DDAHII se ha delecionado o sustituido con una secuencia polinucleotídica de otro locus u otro organismo o en el que la secuencia codificante del gen de DDAHII se ha alterado de modo que el polipéptido expresado no muestre actividad metilarginasa, y en el que dicho animal no humano es un mamífero.

-

un proceso para la preparación de un polipéptido que tiene actividad metilarginasa, comprendiendo dicho proceso cultivar una célula hospedadora que alberga un vector de expresión de la invención en condiciones para proporcionar la expresión de dicho polipéptido y recuperar el polipéptido expresado; y

-

un método para identificar un modulador de la actividad y/o expresión de metilarginasa, que comprende:

(i)

poner en contacto un polinucleótido de la invención, un polipéptido de la invención, un vector de la invención o una célula de la invención y una sustancia de ensayo en condiciones que permitirían actividad metilarginasa en ausencia de la sustancia de ensayo; y

(ii)

determinar por lo tanto si dicha sustancia modula la actividad y/o expresión de una metilarginasa.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra un alineamiento de aminoácidos de DDAHI de rata y humana con DDAHII humana. Las secuencias de aminoácidos obtenidas de DDAHI humana y de rata y DDAHII humana se alinearon usando el programa clustal. Se indican las identidades de aminoácidos (*), sustituciones altamente conservativas (:) y sustituciones conservativas (.).

La Figura 2 muestra la expresión recombinante de DDAHII humana. Se resolvieron alícuotas de E. coli transfectadas con vector vacío (carriles 1 y 3) o vector que contiene ADNc de DDAH II humana (carriles 2 y 4) en geles de SDS-PAGE al 15%. Los geles se tiñeron para proteína total con azul de Coomassie (carriles 1 y 2) o se procesaron para transferencia de western (carriles 3 y 4) como se describe en los Procedimientos Experimentales. La flecha oscura indica la proteína recombinante de \sim40 kDa que se reconoce específicamente por el anticuerpo anti-PentaHis. Se indica la migración de marcadores de peso molecular.

La Figura 3 muestra la actividad DDAH de DDAH II recombinante. Se ensayaron alícuotas de lisados celulares de E. coli transfectadas con vector vacío o vector que contiene ADNc de DDAH II humana para determinar la actividad DDAH como se describe en los Procedimientos Experimentales. Los ensayos se realizaron por triplicado y los datos se expresan como el promedio de las tres repeticiones después de restar el fondo. Los datos presentados son el resultado de un experimento representativo. Se obtuvieron resultados similares en cuatro experimentos independientes. Los datos que se muestran representan la hidrólisis de \sim1 mmol de L-NMMA h^{-1} por lisados de E. coli que contienen DDAH II recombinante. En las mismas condiciones, un homogeneizado de hígado de rata al 30% hidrolizaba \sim18 mmol de L-NMMA h^{-1}.

La Figura 4 muestra la distribución tisular de DDAH humana e isoformas de NOS. Se hibridaron de forma secuencial sondas marcadas específicas para DDAH I, DDAH II, NOS neuronal, NOS endotelial y b-actina humanas con una transferencia de northern de múltiples tejidos disponible en el mercado. Se indica la migración de marcadores de peso molecular.

La Figura 5 muestra el alineamiento de DDAHI y II humanas con Arginina Desiminasa de Pseudomonas. Los aminoácidos obtenidos de DDAHI y II humanas se alinearon con la secuencia de aminoácidos de arginina desiminasa de Pseudomonas X. Se indican las identidades de aminoácidos (*), sustituciones altamente conservativas (:) y sustituciones conservativas (.). Las regiones recuadradas indican motivos altamente conservados entre arginina desiminasas.

La Figura 6A muestra el alineamiento usando Clustal W de DDAH I humana y DDAH de S. coelicolor, P. aeruginosa y M. tuberculosis. Los aminoácidos idénticos se indicante mediante (*), las sustituciones de aminoácidos altamente conservativas mediante (:) y las sustituciones de aminoácidos conservativas mediante (.).

La DDAH de S. coelicolor está codificada por los restos 33784 a 33011 del cósmido St4C6. La secuencia no tiene un número de acceso individual. La secuencia de DDAH de P. aeruginosa está contenida en una secuencia de ADN genómico contigua (cóntigo 1281). De nuevo, la secuencia no tiene un número de acceso individual. La DDAH de M. tuberculosis se ha depositado bajo el número de acceso DDAH Z797022.

La Figura 6B muestra un alineamiento similar usando Clustal W de DDAH de P. aeruginosa y arginina desiminasa.

La Figura 7 muestra la actividad enzimática de ScDDAH y PaDDAH. El efecto de ADMA y SDMA 10 mM sobre ScDDAH y paDDAH recombinantes se estudió usando las condiciones de ensayo descritas en la sección de materiales y métodos a continuación. Se realizaron ensayos por triplicado en alícuotas de lisados celulares que contenían vector vacío, ADNc de scDDAH o ADNc de paDDAH y los datos se expresaron como una media del número total de repeticiones después de restar el fondo. Los resultados que se muestran son la media de tres experimentos independientes.

Descripción detallada de la invención Polinucleótidos

La invención proporciona un polinucleótido que:

(a)

codifica un polipéptido que tiene actividad metilarginasa, seleccionándose dicho polinucleótido de:

(1)

la secuencia codificante de la SEC ID Nº: 3; y

(2)

una secuencia que está degenerada como resultado del código genético con respecto a una secuencia de ácido nucleico definida en (1); o

(b)

es una secuencia complementaria a un polinucleótido definido en (a).

Las SEC ID Nº: 1, 3, 5, 7, 9 y 11 exponen las secuencias de DDAHI y DDAHII humanas, DDAH de S. coelicolor, DDAH de P. aeruginosa, arginina desiminasa de P. aeruginosa y DDAH de M. tuberculosis, respectivamente.

Los polinucleótidos de la invención también incluyen variantes de la secuencia codificante de la SEC ID Nº: 3 que pueden funcionar como metilarginasas. Dichas variantes tienen por tanto la capacidad de catalizar la producción de citrulina a partir de metilargininas. Típicamente, un polinucleótido de la invención comprende una secuencia de nucleótidos contigua que es capaz de hibridar en condiciones selectivas con la complementaria de la secuencia codificante de la SEC ID Nº: 3.

Un polinucleótido de la invención y la complementaria de la secuencia codificante de la SEC ID Nº: 3 pueden hibridar a un nivel significativamente superior al fondo. Puede darse una hibridación de fondo, por ejemplo, debido a otros ADNc presentes en una genoteca de ADNc. El nivel de señal generado por la interacción entre un polinucleótido de la invención y la complementaria de la secuencia codificante de la SEC ID Nº: 3 es típicamente de al menos 10 veces, preferiblemente de al menos 100 veces, la intensidad de interacciones entre otros polinucleótidos y la secuencia codificante de la SEC ID Nº: 3. La intensidad de interacción puede medirse, por ejemplo, por radiomarcaje de la sonda, por ejemplo, con ^{32}P. La hibridación selectiva puede conseguirse típicamente usando condiciones de baja rigurosidad (cloruro sódico 0,03 M y citrato sódico 0,03 M a aproximadamente 40ºC), rigurosidad media (por ejemplo, cloruro sódico 0,03 M y citrato sódico 0,03 M a aproximadamente 50ºC) o alta rigurosidad media (por ejemplo, cloruro sódico 0,03 M y citrato sódico 0,03 M a aproximadamente 60ºC).

Una secuencia de nucleótidos que es capaz de hibridar selectivamente con la complementaria de la secuencia de ADN codificante de la SEC ID Nº: 3, tendrá generalmente una identidad de secuencia de al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 98% o al menos el 99% con la secuencia codificante de la SEC ID Nº: 1, 3, 5, 7, 9 u 11 a lo largo de una región de al menos 20, preferiblemente al menos 30, por ejemplo al menos 40, al menos 60, más preferiblemente al menos 100 nucleótidos contiguos o más preferiblemente a lo largo de la longitud completa de la SEC ID Nº: 3.

Cualquier combinación de los grados de identidad de secuencia y tamaños mínimos mencionados anteriormente pueden usarse para definir polinucleótidos de la invención, prefiriéndose las combinaciones más rigurosas (es decir, mayor identidad de secuencia a lo largo de mayores longitudes). Por lo tanto, por ejemplo, un polinucleótido que tiene una entidad de secuencia de al menos el 90% sobre 25, preferiblemente sobre 30 nucleótidos constituye un aspecto de la invención, así como un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95% sobre 40 nucleótidos.

La secuencia codificante de la SEC ID Nº: 3 puede modificarse por sustituciones de nucleótidos, por ejemplo de 1, 2 ó 3 a 10, 25, 50 ó 100 sustituciones. El polinucleótido de la SEC ID Nº: 3 puede modificarse como alternativa o adicionalmente mediante una o más inserciones y/o deleciones y/o por extensión en cualquiera o ambos extremos. El polinucleótido modificado codifica generalmente un polipéptido que tiene actividad metilarginasa. Pueden realizarse sustituciones degeneradas y/o pueden realizarse sustituciones que darían como resultado una sustitución de aminoácidos conservativa cuando se traduce la secuencia modificada, por ejemplo, como se muestra en la Tabla a continuación.

Los polinucleótidos de la invención pueden comprender ADN o ARN. También pueden ser polinucleótidos que incluyan en los mismos nucleótidos sintéticos o modificados. Se conocen en la técnica varios tipos diferentes de modificación en polinucleótidos. Éstos incluyen cadenas principales metilfosfonato y fosforotioato, además de cadenas de acridina o polilisina en los extremos 3' y/o 5' de la molécula. Para los fines de la presente invención, debe entenderse que los polinucleótidos descritos en este documento pueden modificarse por cualquier método disponible en la técnica. Dichas modificaciones pueden realizarse para aumentar la actividad in vivo o la vida útil de polinucleótidos de la invención.

Los polinucleótidos de la invención pueden usarse como cebador, por ejemplo, un cebador de PCR, un cebador para una reacción de amplificación alternativa, una sonda, por ejemplo, marcada con un marcador indicador por medios convencionales usando marcadores radioactivos o no radioactivos o los polinucleótidos pueden clonarse en vectores.

Dichos cebadores, sondas y otros fragmentos serán preferiblemente de al menos 10, preferiblemente de al menos 15 o al menos 20, por ejemplo de al menos 25, al menos 30 o al menos 40 nucleótidos de longitud. Serán típicamente de hasta 40, 50, 60, 70, 100 ó 150 nucleótidos de longitud. Las sondas y fragmentos pueden ser más largos de 150 nucleótidos de longitud, por ejemplo de hasta 200, 300, 400, 500, 600, 700 nucleótidos de longitud o incluso de hasta unos pocos nucleótidos, tales como cinco o diez nucleótidos, de corto de la secuencia codificante de la
SEC ID Nº: 3.

Pueden producirse polinucleótidos tales como un polinucleótido de ADN y cebadores de acuerdo con la invención de forma recombinante, sintética o cualquier medio disponible para los especialistas en la técnica. También pueden clonarse mediante técnicas convencionales. Los polinucleótidos se proporcionan típicamente en forma aislada y/o purificada.

En general, se producirán cebadores por medios sintéticos, lo que implica una fabricación por etapas de la secuencia de ácido nucleico deseada de un nucleótido en un nucleótido. Están disponibles en la técnica procedimientos para lograr esto usando técnicas automatizadas.

Los polinucleótidos más largos se producirán generalmente usando medios recombinantes, por ejemplo, usando técnicas de clonación por PCR (reacción en cadena de la polimerasa). Esto implicará generar un par de cebadores (por ejemplo de aproximadamente 15-30 nucleótidos) para una región del gen G14 que se desea clonar, poner los cebadores en contacto con ARNm o ADNc obtenido de una célula humana, realizar una reacción en cadena de la polimerasa en condiciones que provoquen la amplificación de la región deseada, aislar el fragmento amplificado (por ejemplo, por purificación de la mezcla de reacción en un gel de agarosa) y recuperar el ADN amplificado. Los cebadores pueden diseñarse para que contengan sitios de reconocimiento de enzimas de restricción adecuados, de modo que el ADN amplificado pueda clonarse en un vector de clonación adecuado.

Dichas técnicas pueden usarse para obtener todos o parte de los genes de DDAHI y DDAHII descritos en este documento. Los clones genómicos correspondientes al ADNc de la SEC ID Nº 3 que contienen, por ejemplo, intrones y regiones promotoras, también son aspectos de la invención y también pueden producirse usando medios recombinantes, por ejemplo, usando técnicas de clonación por PCR (reacción en cadena de la polimerasa), partiendo de ADN genómico de, por ejemplo, una célula bacteriana, animal o humana.

Aunque en general las técnicas mencionadas en este documento son bien conocidas en la técnica, puede hacerse referencia en particular a Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: a laboratory manual.

Los polinucleótidos que no tienen una identidad de secuencia del 100% con la secuencia de la SEC ID Nº: 3 pero que se incluyen en el alcance de la invención pueden obtenerse de varias formas:

1. Pueden obtenerse otras variantes alélicas humanas de la secuencia de DDAHII humana proporcionada en la SEC ID Nº: 3, por ejemplo, sondando genotecas de ADN genómico obtenidas a partir de una variedad de individuos, por ejemplo, individuos de diferentes poblaciones o individuos con diferentes tipos de trastornos relacionados con un metabolismo de NO aberrante, usando sondas como se han descrito anteriormente.

\global\parskip0.900000\baselineskip

Además, pueden obtenerse homólogos de la SEC ID Nº: 3 de otros animales, particularmente mamíferos (por ejemplo, ratones y conejos) o peces (por ejemplo, Fugu) o insectos (por ejemplo, D. melanogaster) u otros invertebrados (por ejemplo, C. elegans), plantas (por ejemplo, A. thaliana), bacterias y levaduras y dichos homólogos y fragmentos de los mismos serán capaces en general de hibridar selectivamente con la secuencia codificante de la SEC ID Nº: 3 o su complementaria. Dichas secuencias pueden obtenerse por sondaje de ADNc o genotecas genómicas a partir de células en división o tejidos u otras especies animales con sondas como se ha descrito anteriormente. Pueden prepararse sondas degeneradas por medios conocidos en la técnica que tienen en cuenta la posibilidad de una variación degenerada entre la secuencia de ADN de la SEC ID Nº: 3 y las secuencias que se sondan en las condiciones de hibridación selectivas dadas anteriormente.

2. También pueden obtenerse variantes alélicas y homólogos de especies usando PCR degenerada que usará cebadores diseñados para dirigirse a secuencias dentro de las variantes y homólogos que codifican secuencias de aminoácidos probablemente conservadas. Pueden predecirse secuencias probablemente conservadas a partir del alineamiento de las secuencias de aminoácidos de la invención. Los cebadores contendrán uno o más posiciones degeneradas y se usarán en condiciones de rigurosidad inferiores a las usadas para clonar secuencias con cebadores de una sola secuencia frente a secuencias conocidas.

3. Como alternativa, pueden obtenerse polinucleótidos mediante mutagénesis dirigida de la SEC ID Nº: 3 o variantes alélicas de la misma. Esto puede ser útil, por ejemplo, cuando sean necesarios cambios de codones silentes en secuencias para optimizar las preferencias de codones para una célula hospedadora particular en la que se están expresando las secuencias polinucleotídicas. Pueden desearse otros cambios de secuencia para introducir sitios de reconocimiento de enzimas de restricción o para alterar la propiedad o la función de los polipéptidos codificados por los polinucleótidos.

La invención proporciona además polinucleótidos bicatenarios que comprenden un polinucleótido de la invención y su complementario.

Los polinucleótidos, sondas o cebadores de la invención pueden llevar un marcador indicador. Los marcadores adecuados incluyen radioisótopos tales como ^{32}P o ^{35}S, marcadores enzimáticos u otros marcadores proteicos tales como biotina. Dichos marcadores pueden añadirse a polinucleótidos, sondas o cebadores de la invención y pueden detectarse usando técnicas conocidas por sí mismas.

Polipéptidos

Un polipéptido de la invención comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 4 o una secuencia sustancialmente homóloga o un fragmento de dicha secuencia, y tiene actividad metilarginasa. En general, se prefiere la secuencia de aminoácidos de origen natural que se muestra en la SEC ID Nº: 4.

Las SEC ID Nº: 2, 4, 6, 8, 10 y 12 exponen las secuencias de aminoácidos de la DDAHI humana, DDAHII humana, DDAH de S. coelicolor, DDAH de P. aeruginosa, arginina desiminasa de P. aeruginosa y DDAH de M. tuberculosis respectivamente.

En particular, un polipéptido de la invención puede comprender:

(a)

la secuencia polipeptídica de la SEC ID Nº: 4;

(b)

una variante alélica u homólogo de especie de la misma; o

(c)

una proteína con una identidad de secuencia de al menos el 70, al menos el 80, al menos el 90, al menos el 95, al menos el 98 o al menos el 99% con (a) o (b).

Una variante alélica será una variante que aparecerá de forma natural, por ejemplo, en un ser humano, bacteria o levadura y que funcionará de una forma sustancialmente similar a la proteína de la SEC ID Nº: 4, por ejemplo, actúa como una metilarginasa. De forma similar, un homólogo de especie de la proteína será la proteína equivalente que aparece de forma natural en otra especie y que puede funcionar como una metilarginasa.

Pueden obtenerse variantes alélicas y homólogos de especie siguiendo los procedimientos descritos en este documento para la producción de los polipéptidos de la SEC ID Nº: 2, 4, 6, 8, 10 ó 12 y realizando dichos procedimientos en una fuente celular adecuada, por ejemplo, una célula humana o bacteriana. También es posible usar una sonda como se ha definido anteriormente para sondar genotecas preparadas a partir de células humanas o bacterianas para obtener clones que codifiquen las variantes alélicas o de especie. Los clones pueden manipularse por técnicas convencionales para generar un polipéptido de la invención que después puede producirse mediante técnicas recombinantes o sintéticas conocidas por sí mismas.

Un polipéptido de la invención tiene preferiblemente una identidad secuencia de al menos el 60% con la proteína de la SEC ID Nº: 4, más preferiblemente una identidad de secuencia de al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 97% o al menos el 99% con la misma a lo largo de una región de al menos 20, preferiblemente al menos 30, por ejemplo al menos 40, al menos 60, al menos 100 aminoácidos contiguos o a lo largo de longitud completa de la SEC ID Nº: 4.

\global\parskip1.000000\baselineskip

La secuencia del polipéptido de la SEC ID Nº: 4 y de variantes alélicas y homólogos de especie puede modificarse por lo tanto para proporcionar polipéptidos de la invención. Pueden realizarse sustituciones de aminoácidos, por ejemplo, de 1, 2 ó 3 a 10, 20 ó 30 sustituciones. El polipéptido modificado conserva generalmente la actividad como metilarginasa, como se ha definido en este documento. Pueden realizarse sustituciones conservativas, por ejemplo, de acuerdo con la siguiente Tabla. Los aminoácidos en el mismo bloque en la segunda columna y preferiblemente en la misma línea en la tercera columna pueden sustituirse entre sí.

1

Los polipéptidos de la invención también incluyen fragmentos de los polipéptidos de longitud completa mencionados anteriormente y variantes de los mismos, incluyendo fragmentos de la secuencia expuesta en la SEC ID Nº: 4. Dichos fragmentos conservan típicamente la actividad como metilarginasa.

Otros fragmentos preferidos incluyen los que incluyen un epítopo. Los fragmentos adecuados serán de al menos 5, por ejemplo al menos 10, al menos 12, al menos 15 o al menos 20 aminoácidos de tamaño. Los fragmentos de epítopos pueden ser típicamente de hasta 50, 60, 70, 80, 100, 150 ó 200 aminoácidos de tamaño. Los fragmentos polipeptídicos de los polipéptidos de la SEC ID Nº: 3 y variantes alélicas y de especie de los mismos pueden contener uno o más (por ejemplo, 1, 2, 3 ó 5 a 10, 20 ó 30) sustituciones, deleciones o inserciones, incluyendo sustituciones conservativas. Pueden determinarse los epítopos por procedimientos tales como técnicas de barrido de péptidos ya conocidas en el campo. Estos fragmentos serán útiles para obtener anticuerpos contra polipéptidos de la invención.

Los polipéptidos de la invención pueden estar en una forma sustancialmente aislada. Se entenderá que el polipéptido puede mezclarse con vehículos o diluyentes que no interferirán con el fin destinado al polipéptido y aún así considerarse todavía sustancialmente aislado. Un polipéptido de la invención también puede ser una forma sustancialmente purificada, en cuyo caso comprenderá generalmente el polipéptido en una preparación en la que más del 50%, por ejemplo, más del 80%, 90%, 95% o 99% en peso del polipéptido de la preparación sea un polipéptido la invención.

Los polipéptidos de la invención pueden modificarse químicamente, por ejemplo, modificarse postraduccionalmente. Por ejemplo, pueden glicosilarse o comprender restos aminoacídicos modificados. También pueden modificarse por adición de restos Histidina para contribuir a su purificación o por adición de una secuencia señal para promover su secreción a partir de una célula. Dichos polipéptidos modificados y proteínas se incluyen en el alcance del término "polipéptido" de la invención.

Los polipéptidos de la invención pueden modificarse, por ejemplo, por adición de restos Histidina o un marcador T7 para contribuir a su identificación o purificación o por adición de una secuencia señal para promover su secreción a partir de una célula cuando el polipéptido no contiene de forma natural dicha secuencia.

Vectores

Pueden incorporarse polinucleótidos de la invención en un vector replicable recombinante. El vector puede usarse para replicar el ácido nucleico en una célula hospedadora compatible. Por lo tanto, en una realización adicional, la invención proporciona un método de generación de polipéptidos de la invención introduciendo un polinucleótido de la invención en un vector replicable, introduciendo el vector una célula hospedadora compatible y cultivando la célula hospedadora en condiciones que provoquen la replicación del vector. El vector puede recuperarse de la célula hospedadora.

Los polinucleótidos de acuerdo con la invención también pueden insertarse en los vectores descritos anteriormente en una orientación antisentido para proporcionar la producción de ARN antisentido. También puede producirse ARN antisentido u otros polinucleótidos antisentido por medios sintéticos. Dichos polinucleótidos antisentido pueden usarse en un método de control de los niveles de metilarginasas o sus variantes u homólogos de especie.

Preferiblemente, un polinucleótido de la invención en un vector se une operativamente a una secuencia de control que es capaz de proporcionar la expresión de la secuencia codificante por la célula hospedadora, es decir, el vector es un vector de expresión. La expresión "unido operativamente" se refiere a una yuxtaposición en la que los componentes descritos están en una relación que les permite funcionar de la forma en la que están destinadas a hacerlo. Una secuencia reguladora, tal como un promotor, "unida operativamente" a una secuencia codificante se sitúa de tal forma que se consigue la expresión de la secuencia codificante en condiciones compatibles con la secuencia reguladora.

Los vectores de la invención pueden usarse para transformar una célula hospedadora adecuada como se ha descrito anteriormente para proporcionar la expresión de un polipéptido de la invención. Por lo tanto, en un aspecto adicional la invención proporciona un proceso para preparar un polipéptido de acuerdo con la invención que comprende cultivar una célula hospedadora transformada o transfectada con un vector de expresión que codifica el polipéptido y recuperar el polipéptido expresado.

Los vectores pueden ser, por ejemplo, vectores plasmídicos, virales o de fagos proporcionados con un origen de replicación, opcionalmente un promotor para la expresión de dicho polinucleótido y opcionalmente un regulador del promotor. Los vectores pueden contener uno o más genes marcadores de selección, por ejemplo, un gen de resistencia a ampicilina en el caso de un plásmido bacteriano o un gen de resistencia para un vector fúngico. Pueden usarse vectores in vitro, por ejemplo, para la producción de ARN o usarse para transfectar o transformar una célula hospedadora, por ejemplo, E. coli. Los vectores también pueden adaptarse para usarse in vivo, por ejemplo, en un método de terapia génica.

Una realización adicional de la invención proporciona células hospedadoras transformadas o transfectadas con los vectores para la replicación y/o expresión de polinucleótidos de la invención. Las células se seleccionarán para que sean compatibles con dicho vector y pueden ser por ejemplo, bacterianas (por ejemplo, E. coli), de levadura, insecto o mamífero.

Los promotores y otras señales de regulación de la expresión pueden seleccionarse para que sean compatibles con la célula hospedadora para la que se diseña la expresión. Por ejemplo, los promotores de levaduras incluyen promotores GAL4 y ADH de S. cerevisiae, promotores nmt1 y adh de S. pombe. Los promotores de mamífero incluyen el promotor de la metalotioneína que puede inducirse en respuesta a metales pesados tales como cadmio. También pueden usarse promotores virales tales como el promotor del antígeno T grande de SV40 o promotores de adenovirus. Todos estos promotores están fácilmente disponibles en la técnica.

Pueden usarse promotores de mamíferos, tales como promotores de \beta-actina. Se prefieren especialmente promotores específicos de tejido, en particular promotores específicos de células endoteliales o neuronales (por ejemplo, los promotores de DDAHI y DDAHII). También pueden usarse promotores virales, por ejemplo, la repetición terminal larga del virus de la leucemia murina de Moloney (LTR de MMLV), el promotor LTR del virus del sarcoma de Rous (RSV), el promotor de SV40, el promotor IE de citomegalovirus humano (CMV), adenovirus, promotores de SHV (tales como los promotores IE de SHV) o promotores de HPV, particularmente la región reguladora cadena arriba de HPV (URR). Están fácilmente disponibles en la técnica promotores virales.

El vector puede incluir además secuencias que flanquean el polinucleótido dando origen a un ARN antisentido que comprende secuencias homólogas a secuencias genómicas eucariotas, preferiblemente secuencias genómicas de mamíferos o secuencias genómicas de virus. Esto permitirá la introducción de los polinucleótidos de la invención en el genoma de células eucariotas o virus por recombinación homóloga. En particular, un vector plasmídico que comprende el casete de expresión flanqueado por secuencias virales puede usarse para preparar un vector viral adecuado para suministrar los polinucleótidos de la invención a una célula de mamífero. Otros ejemplos de vectores virales adecuados incluyen vectores de virus herpes simple (por ejemplo, como se describe en los documentos WO 98/04726 y WO 98/30707) y retrovirus, incluyendo lentivirus, adenovirus, virus adenoasociados y virus HPV (tales como HPV-16 o HPV-18). Los especialistas en la técnica conocen procedimientos de transferencia génica usando estos virus. Por ejemplo, pueden usarse vectores de retrovirus para integrar de forma estable el polinucleótido dando origen al ARN antisentido en el genoma hospedador. Por el contrario, los vectores de adenovirus de replicación defectuosa permanecen episomales y por lo tanto permiten una expresión transitoria.

Anticuerpos

La invención también proporciona anticuerpos monoclonales o policlonales contra polipéptidos codificados por polinucleótidos de la invención, contra polipéptidos de la invención y contra fragmentos de los mismos. La invención proporciona además un proceso para la producción de anticuerpos monoclonales o policlonales de la invención.

Los anticuerpos de la invención pueden ser anticuerpos contra polipéptidos humanos o fragmentos de los mismos. Los anticuerpos preferidos son los que son capaces de discriminar entre un polipéptido de DDAHI o fragmento del mismo y un polipéptido de DDAHII o fragmento del mismo y, en particular, entre los polipéptidos de DDAHI y II humanos y fragmentos de los mismos.

Para los fines de esta invención, el término "anticuerpo", a menos que se especifique lo contrario, incluye fragmentos de anticuerpos completos que mantienen su actividad de unión por un polipéptido codificado por un polinucleótido de la invención, un polipéptido de la invención o un fragmento del mismo. Dichos fragmentos incluyen fragmentos Fv, F(ab') y F(ab')_{2}, así como anticuerpos de cadena sencilla. Además, los anticuerpos y fragmentos de los mismos pueden ser anticuerpos quiméricos, anticuerpos injertados a CDR o anticuerpos humanizados.

Los anticuerpos de la invención pueden usarse, entre otros, en un método para detectar polipéptidos de la invención presentes en una muestra biológica, comprendiendo dicho método

(a)

proporcionar un anticuerpo de la invención;

(b)

incubar una muestra biológica con dicho anticuerpo en condiciones que permitan la formación de un complejo de antígeno-anticuerpo; y

(c)

determinar si se forma el complejo de antígeno-anticuerpo que comprende dicho anticuerpo.

Una muestra puede ser por ejemplo un extracto tisular. Los anticuerpos de la invención pueden estar unidos a un soporte sólido y/o envasados en kits en un recipiente adecuado junto con reactivos, controles, instrucciones, etc. adecuados.

Los anticuerpos de la invención pueden producirse por cualquier método adecuado. Se conocen bien en la técnica medios para preparar y caracterizar anticuerpos, véase, por ejemplo, Harlow y Lane (1988) "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. Por ejemplo, un anticuerpo puede producirse generando un anticuerpo en un animal hospedador contra el polipéptido completo o un fragmento del mismo, por ejemplo, un epítopo antigénico del mismo, en lo sucesivo el "inmunógeno".

Un método para producir un anticuerpo policlonal comprende inmunizar a un animal hospedador adecuado, por ejemplo, un animal de experimentación, con el inmunógeno y aislar inmunoglobulinas a partir del suero. Por lo tanto, el animal puede inocularse con el inmunógeno, la sangre extraerse posteriormente del animal y la fracción de IgG purificarse.

Un método para producir un anticuerpo monoclonal comprende inmortalizar células que producen el anticuerpo deseado. Pueden producirse células de hibridoma fusionando células de bazo de un animal de experimentación inoculado con células tumorales (Kohler y Milstein (1975) Nature 256, 495-497).

Una célula inmortalizada que produce el anticuerpo deseado puede seleccionarse mediante un procedimiento convencional. Los hibridomas pueden cultivarse en cultivo o inyectarse por vía intraperitoneal para la formación de líquido ascético o en el torrente sanguíneo de un hospedador alogénico u hospedador inmunocomprometido. Pueden prepararse anticuerpos humanos por inmunización in vitro de linfocitos humanos, seguido de transformación de los linfocitos con virus de Epstein-Barr.

Para la producción tanto de anticuerpos monoclonales como policlonales, el animal de experimentación es convenientemente una cabra, conejo, rata o ratón. Si se desea, el inmunógeno puede administrarse como un conjugado en el que el inmunógeno se acopla, por ejemplo, a través de una cadena lateral de uno de los restos aminoacídicos, con un vehículo adecuado. La molécula de vehículo es típicamente un vehículo fisiológicamente aceptable. El anticuerpo obtenido puede aislarse y, si se desea, purificarse.

Animales

La invención proporciona un animal no humano que no es capaz de expresar o que no es capaz de expresar una forma activa de una o más isoformas de metilarginasa. Preferiblemente, la isoforma de metilarginasa es una DDAHI y/o una DDAH II. Típicamente, el tipo silvestre del animal no humano será capaz de expresar una forma activa de la metilarginasa que el animal no humano de la invención no puede expresar.

Un animal que no es capaz de expresar una o más isoformas de metilarginasa es uno que muestra una expresión sustancialmente indetectable de al menos un ARNm de metilarginasa. Un animal que no es capaz de expresar una forma activa de una o más isoformas de metilarginasa es uno que expresa al menos un polipéptido relacionado con metilarginasa, no mostrando el polipéptido sustancialmente actividad metilarginasa.

Un animal de la invención puede ser uno en el que dicha secuencia polinucleotídica de un locus de un gen codificante de metilarginasa se ha delecionado o sustituido con secuencias polinucleotídicas de otro locus o de otro organismo. Por lo tanto, sustancialmente no puede expresarse ARNm de metilarginasa a partir de ese locus de metilarginasa. Como alternativa, la secuencia codificante de un gen de metilarginasa puede haberse alterado de modo que el polipéptido expresado no muestre sustancialmente actividad metilarginasa.

Típicamente, un animal o humano de la invención es un denominado "animal knock out". El término animal "animal knock out" es bien conocido por los especialistas en la técnica. Típicamente, un animal no humano de la invención, por ejemplo, un animal knock out, será un animal transgénico.

Un animal knock out puede producirse de acuerdo con cualquier método adecuado. En general, se produce una construcción polinucleotídica que comprende un gen marcador, por ejemplo, flanqueado por secuencias genómicas. Esas secuencias genómicas se corresponden con secuencias genómicas en el locus del gen codificante de metilarginasa del animal en cuestión. Por lo tanto, si la construcción polinucleotídica se pone en contacto con el locus del gen codificante de metilarginasa del animal de interés, los acontecimientos de recombinación homóloga pueden conducir a la sustitución de la secuencia cromosómica bordeada por las secuencias genómicas usadas en la construcción polinucleotídica con el gen marcador. Si el gen marcador sustituye a la secuencia codificante o a una secuencia reguladora, por ejemplo, una secuencia promotora, puede suprimirse la expresión y/o actividad del gen.

La construcción polinucleotídica se transfiere típicamente a un huevo fertilizado por microinyección pronuclear de modo que pueda producirse el contacto descrito anteriormente. Pueden usarse estrategias alternativas, por ejemplo, de transferencia génica mediada por células madre embrionarias o por retrovirus en líneas germinales. Independientemente de qué estrategia se adopte, se generan después animales transgénicos. Por ejemplo, pueden implantarse huevos microinyectados en una hembra hospedadora y la progenie puede explorarse para determinar la expresión del gen marcador. Los animales fundadores que se obtienen pueden reproducirse.

Un animal no humano de la invención es un mamífero, preferiblemente un ratón. Los animales no humanos preferidos son ratones. Los animales preferidos son por lo tanto ratones en los que por ejemplo se ha deleccionado o sustituido todo o parte del locus del gen de DDAHII, es decir, ratones knock out para DDAHII.

La invención también proporciona una célula o línea celular obtenida de un animal no humano de la invención.

La tecnología transgénica descrita anteriormente es por supuesto igualmente aplicable a la producción de animales no humanos que sobre expresen una o más isoformas de metilarginasa o expresen una o más isoformas de metilarginasa que tengan actividades extraordinariamente altas. En dichos casos la construcción polinucleotídica usada no sustituye una porción endógena de un gen de metilarginasa con un gen marcador. En su lugar, un gen de metilarginasa endógeno puede sustituirse con una construcción polinucleotídica que comprenda un promotor, por ejemplo, uno que dirija altos niveles de expresión, alineado operativamente con una secuencia codificante de metilarginasa. Como alternativa, la construcción puede comprender una secuencia promotora de metilarginasa unida operativamente a un gen indicador. También es posible producir construcciones que no sustituyen secuencias de metilarginasa endógenas. El uso de dichas construcciones dará como resultado animales que contengan secuencias de metilarginasa endógenas y las secuencias insertadas por la construcción.

Los animales no humanos descritos anteriormente pueden usarse en los ensayos de exploración descritos a continuación para la identificación de moduladores de la actividad y/o expresión de metilarginasa.

Ensayos

La invención proporciona un método para identificar un modulador de la actividad y/o expresión de metilarginasa, que comprende:

(i)

poner en contacto un polinucleótido de acuerdo con la invención, un polipéptido de acuerdo con la invención, un vector de acuerdo con la invención o una célula de acuerdo con la invención y una sustancia de ensayo en condiciones que permitirían la actividad metilarginasa en ausencia de la sustancia de ensayo; y

(ii)

determinar de este modo si dicha sustancia modula la actividad y/o expresión de metilarginasa.

Puede usarse cualquier formato de ensayo adecuado para identificar un modulador de la actividad y/o expresión de metilarginasa.

En el caso de usar un polinucleótido o vector de la invención, el ensayo se realizará típicamente en una célula que albergue el polinucleótido o el vector o en un extracto celular que comprenda el polinucleótido o vector. La célula o extracto celular permitirán típicamente la transcripción y traducción del polinucleótido o vector en ausencia de una sustancia de ensayo.

Un ensayo típico es el siguiente:

-

se inoculan un número definido de células que albergan un polinucleótido o vector de la invención en medio de cultivo en los pocillos de una placa de microtitulación de plástico en presencia de una sustancia que se va a ensayar;

-

las placas de microtitulación se cubren y se incuban a una temperatura apropiada (por ejemplo, 37ºC para E. coli) en la oscuridad;

-

se retiran muestras a intervalos de tiempo regulares y se ensayan para determinar la actividad metilarginasa, como se describe en los Ejemplos;

-

pueden realizarse experimentos de control en paralelo, en los que se omite la sustancia que se va a ensayar.

Además, como control, las muestras pueden ensayarse para cualquier otra enzima para excluir la posibilidad de que la sustancia de ensayo sea un inhibidor general de la expresión génica o de la actividad enzimática.

\newpage

El ensayo también puede realizarse usando un polipéptido de la invención, en el que puede usarse cualquier formato adecuado para identificar un modulador de la actividad metilarginasa. Más preferiblemente, dicho ensayo se realizaría en un solo pocillo de una placa de microtitulación de plástico, de modo que puede realizarse una exploración de alto rendimiento para moduladores de la actividad metilarginasa. En la práctica, la reacción enzimática se comienza por adición de una metilarginasa o de un sustrato para metilarginasa. Por lo tanto, puede iniciarse un ensayo para un modulador de metilarginasa proporcionando un medio que contiene una sustancia de ensayo y uno de una metilarginasa y un sustrato de metilarginasa. Como control, puede seguirse el desarrollo del ensayo en ausencia de la sustancia de ensayo.

Además, la sustancia ensayada puede ensayarse con cualquier otro polipéptido/enzima conocida para excluir la posibilidad de que la sustancia de ensayo sea un inhibidor general de la actividad enzimática.

Pueden obtenerse metilarginasas adecuadas para el ensayo usando las técnicas recombinantes descritas anteriormente. Son sustratos adecuados los que comprenden metilargininas asimétricas, por ejemplo, N^{G}monometil-L-arginina (L-NMMA), dimetilarginina asimétrica (ADMA). Además de la metilarginasa y de un sustrato adecuado, la mezcla de reacción puede contener un tampón adecuado, cofactores adecuados y cationes divalentes adecuados como cofactores. Un tampón adecuado incluye cualquier tampón biológico adecuado que puede proporcionar una capacidad tamponante a un pH que lleve a satisfacer las necesidades de reacción de la enzima.

El ensayo de la invención puede realizarse a cualquier temperatura a la que sea activa una metilarginasa en ausencia de cualquier inhibidor. Típicamente, sin embargo, el ensayo se realizará en el intervalo de 25ºC a 37ºC.

Los especialistas en la técnica conocen en general medidas de actividad enzimática de la actividad metilarginasa, incluyendo constantes de equilibrio, velocidades de reacción de la aparición de productos de reacción o del consumo de sustratos de reacción, cinética de la reacción, termodinámica de la reacción, análisis espectrofotométrico de los productos de reacción, detección de los componentes de la reacción marcados, etc. Véase, en general, Segel, Biochemical Calculations 2^{a} Edición, John Wiley and Sons, Nueva York (1976); Suelter, A Practical Guide to Enzymology, John Eiley and Sons, Nueva York (1985). El método preferido de medición de la actividad enzimática es por medición de la producción de [^{14}C]citrulina después de que se haya incubado la metilarginasa con [^{14}C]L-NMMA o [^{14}C]ADMA.

También pueden realizarse ensayos usando construcciones que comprenden un promotor de un gen de metilarginasa unido operativamente a una secuencia codificante heteróloga, para identificar compuestos que modulen la expresión de metilarginasas a nivel de transcripción.

Un promotor media un promotor de la transcripción. Pueden aislarse promotores de genes de metilarginasa por métodos conocidos por los especialistas en la técnica y como se han descrito anteriormente. El término "heterólogo" indica que la secuencia codificante no está unida operativamente al promotor en la naturaleza; la secuencia codificante es generalmente de un organismo diferente al del promotor.

La secuencia promotora puede fusionarse directamente a una secuencia codificante o a través de un enlazador. La secuencia enlazadora puede comprender un intrón. Excluyendo la longitud de cualquier secuencia intrónica, el enlazador puede estar compuesto por hasta 45 bases. La secuencia enlazadora puede comprender una secuencia que tenga características potenciadoras, para estimular los niveles de expresión.

Preferiblemente, el promotor está unido operativamente a la secuencia codificante de un polipéptido indicador. El polipéptido indicador puede ser, por ejemplo, el polipéptido bacteriano \beta-glucoronidasa (GUS), proteína verde fluorescente (GFP), luciferasa (luc), cloranfenicol transferasa (CAT) o \beta-galactosidasa (lacZ).

Pueden incorporarse construcciones de promotor:gen indicador tales como las descritas anteriormente en un vector replicable recombinante. El vector puede usarse para replicar la construcción de ácido nucleico en una célula hospedadora compatible. Los vectores pueden ser, por ejemplo, vectores plasmídicos, virales o de fagos proporcionados con un origen de replicación. Puede usarse cualquier célula hospedadora en la que el promotor sea funcional, pero típicamente la célula hospedadora será una célula de la especie de la que procede el promotor. Las construcciones génicas de promotor: indicador de la invención puede introducirse en células hospedadoras usando técnicas convencionales.

Por lo tanto, la invención proporciona un método para identificar un modulador de la expresión de metilarginasa. Típicamente, una construcción de promotor:polipéptido indicador o una célula que albergue esa construcción se pondrá en contacto con una sustancia de ensayo en condiciones que permitirían la expresión del polipéptido indicador en ausencia de la sustancia de ensayo.

Puede usarse cualquier polipéptido indicador, pero típicamente se usa GUS o GFP. GUS se ensaya por medición de la hidrólisis de un sustrato adecuado, por ejemplo, ácido 5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-glucurónico (X-gluc) o 4-metilumbeliferil-\beta-glucuronida (MUG). La hidrólisis de MUG produce un producto que puede medirse fluorométricamente. La GFP se cuantifica midiendo la fluorescencia a 590 nm después de la excitación a 494 nm. Estos métodos son bien conocidos para los especialistas en la técnica.

Metilarginasas

Una metilarginasa codificada por un polinucleótido de la invención o una metilarginasa que tiene la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de la invención puede usarse en los ensayos descritos anteriormente. Las enzimas pueden obtenerse a partir de extractos. Como alternativa, las enzimas pueden producirse de forma recombinante, a partir de, por ejemplo, bacterias, levaduras o células eucariotas superiores tales como líneas celulares de insectos. Una metilarginasa preferida es DDAHII humana que tiene la secuencia que se muestra en la SEC ID Nº: 4.

La expresión recombinante de enzimas DDAHII humana y DDAHI bacteriana se describe en los Ejemplos.

Sustancias de Ensayo

Una sustancia que modula la expresión o actividad de una metilarginasa puede hacerlo uniéndose directamente al promotor génico pertinente, inhibiendo o activando de este modo la transcripción del gen. La inhibición puede producirse impidiendo el inicio o la finalización de la transcripción. La activación puede suceder, por ejemplo, por aumento de la afinidad del complejo de transcripción por el promotor. Como alternativa, un modulador puede unirse a una proteína que se asocie con el promotor y que sea necesaria para la transcripción.

Una sustancia que modula la actividad de una metilarginasa puede hacerlo uniéndose a la enzima. Dicha unión puede dar como resultado la activación o inhibición de la proteína.

La inhibición puede producirse, por ejemplo, si el modulador se parece al sustrato y se une al sitio activo de la metilarginasa. Por lo tanto, se impide que el sustrato se una al mismo sitio activo y se reduce la velocidad de catálisis al reducirse la proporción de moléculas enzimáticas unidas a sustrato. Un modulador que inhibe la actividad de una metilarginasa puede hacerlo por unión al sustrato. El propio modulador puede catalizar una reacción del sustrato, de modo que el sustrato no esté disponible para la enzima. Como alternativa, el inhibidor puede impedir simplemente que el sustrato se una a la enzima.

La activación puede producirse, por ejemplo, si el modulador aumenta la afinidad del sustrato por la enzima o viceversa. Esto significa que la proporción de moléculas enzimáticas unidas a un sustrato se aumenta y la velocidad de catálisis aumentará por lo tanto.

Las sustancias de ensayo adecuadas que pueden usarse en los ensayos descritos anteriormente incluyen productos de anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales y policlonales, anticuerpos de cadena sencilla, anticuerpos quiméricos y anticuerpos injertados a CDR) que son específicos para una metilarginasa o miméticos de una metilarginasa. Además, también pueden ensayarse bibliotecas combinatorias, identidades químicas definidas, péptidos y peptidomiméticos, oligonucleótidos y bibliotecas de productos naturales, tales como bibliotecas de presentación (por ejemplo, bibliotecas de presentación en fagos). Las sustancias candidatas pueden ser compuestos químicos.

Pueden usarse lotes de las sustancias de ensayo en una exploración inicial de, por ejemplo, diez sustancias por reacción y las sustancias de los lotes que muestren inhibición ensayarse individualmente.

Moduladores

Un modulador de la expresión y/o actividad de metilarginasa, por ejemplo, de una DDAH o una arginina desiminasa, es uno que produce una reducción o aumento medible en la expresión y/o actividad de metilarginasa en los ensayos descritos anteriormente. Por lo tanto, los moduladores de la expresión y/o actividad de metilarginasa pueden ser inhibidores o activadores de la expresión y/o actividad de metilarginasa. Un modulador de una metilarginasa puede ser un modulador de una DDAHI o una DDHAII.

Los inhibidores preferidos son los que inhiben la expresión y/o actividad de metilarginasa en al menos el 10%, al menos el 20%, al menos el 30%, al menos el 40%, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 95% o al menos el 99% a una concentración del inhibidor de 1 \mug ml^{-1}, 10 \mug ml^{-1}, 100 \mug ml^{-1}, 500 \mug ml^{-1}, 1 mg ml^{-1}, 10 mg ml^{-1}, 100 mg ml^{-1}.

Son activadores preferidos los que activan la expresión y/o actividad de metilarginasa en al menos el 10%, al menos el 25%, al menos el 50%, al menos el 100%, al menos el 200%, al menos el 500% o al menos el 1000% a una concentración del activador de 1 \mug ml^{-1}, 10 \mug ml^{-1}, 100 \mug ml^{-1}, 500 \mug ml^{-1}, 1 mg ml^{-1}, 10 mg ml^{-1},
100 mg ml^{-1}.

El porcentaje de inhibición o activación representa el porcentaje de disminución o aumento de la expresión/activi-
dad en una comparación de ensayos en presencia y ausencia de la sustancia de ensayo. Cualquier combinación de los grados de porcentaje de inhibición o activación y concentración de inhibidor o activador mencionados anteriormente puede usarse para definir un inhibidor o activador, prefiriéndose una mayor inhibición o activación a menores concentraciones.

Pueden ensayarse sustancias candidato que muestren actividad en ensayos tales como los descritos anteriormente en sistemas in vivo, un modelo animal. Podrían ensayarse inhibidores candidato para determinar su capacidad para aumentar los niveles de ADMA y L-NMMA y/o para aumentar la presión arterial y/o para disminuir la relajación dependiente del endotelio de los vasos sanguíneos.

Podrían ensayarse activadores candidato por su capacidad para aumentar la generación de óxido nítrico según se evalúa por medición de NO y/o para disminuir los niveles de ADMA y L-NMMA. En última instancia, dichas sustancias se ensayarían en modelos animales de las patologías diana.

Uso terapéutico

Pueden usarse polinucleótidos, péptidos, vectores de expresión y moduladores de la actividad y/o expresión de metilarginasa y moduladores de la actividad y/o expresión de metilarginasa identificados por los métodos de la invención para el tratamiento de una afección en la que esté implicado un metabolismo anormal de NO.

Pueden usarse polinucleótidos, péptidos, vectores de expresión y activadores de la actividad y/o expresión de metilarginasa en el tratamiento de afecciones en las que esté implicada una producción reducida de NO. En particular, dichas afecciones como hiperlipidemia, insuficiencia renal, hipertensión, reestenosis después de angioplastia, complicaciones de insuficiencia cardiaca o aterosclerosis y sus complicaciones pueden tratarse y también pueden tratarse pacientes con esquizofrenia, esclerosis múltiple o cáncer.

Los moduladores que son inhibidores de la actividad y/o expresión de metilarginasa pueden usarse en el tratamiento de afecciones en las que esté implicada una producción aumentada de NO. En particular pueden tratarse afecciones tales como lesión por isquemia-reperfusión del cerebro o del corazón, cáncer, hipotensión letal en afecciones inflamatorias graves tales como choque séptico o insuficiencia multiorgánica o trastornos inflamatorios locales y sistémicos incluyendo artritis, trastornos cutáneos, enfermedad cardiaca inflamatoria o migraña.

Como alternativa, podría usarse un inhibidor de la actividad y/o expresión de metilarginasa como una terapia de conjunto con un inhibidor de la actividad de la NOS (por ejemplo, una metilarginina). Por ejemplo, podría usarse un inhibidor específico de una isoforma de DDAH con la metilarginina L-NMMA. Esta estrategia puede alterar radicalmente el perfil de actividad de la L-NMMA y puede dar como resultado que la L-NMMA tenga un efecto inhibidor aumentado para una isoforma de NOS específica. Por lo tanto, los productos contienen un inhibidor de la actividad y/o expresión de metilarginasa y una metilarginina como una preparación combinada para uso simultáneo, separado o secuencial en el tratamiento de una lesión por isquemia-reperfusión del cerebro o del corazón, cáncer, hipotensión letal en afecciones inflamatorias graves tales como choque séptico o insuficiencia multiorgánica, o trastornos inflamatorios locales y sistémicos incluyendo artritis, trastornos cutáneos, enfermedad cardiaca inflamatoria o migraña.

También pueden usarse inhibidores de la expresión y/o actividad de metilarginasa como agentes antimicrobianos, por ejemplo, antibacterianos. Por lo tanto, los inhibidores de microbios, por ejemplo, de la expresión y/o actividad de DDAH y arginina desiminasa bacterianas son útiles como agentes antimicrobianos. Por lo tanto, un inhibidor de una metilarginasa bacteriana, por ejemplo, una DDAH o una arginina desiminasa para el uso en el tratamiento de una infección bacteriana.

Puede administrarse un modulador en una diversidad de formas de dosificación. Por lo tanto, pueden administrarse por vía oral, por ejemplo, como comprimidos, trociscos, grageas, suspensiones acuosas u oleosas, polvos o gránulos dispersables. Los moduladores también pueden administrarse por vía parenteral, ya sea por vía subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraesternal, transdérmica o por técnicas de infusión. Los moduladores también pueden administrarse como supositorios. Un médico será capaz de determinar la vía necesaria de administración para cada paciente particular.

La formulación de un modulador para el uso en la prevención o tratamiento de las afecciones descritas anteriormente dependerá de factores tales como la naturaleza del inhibidor exacto, de si se desea un uso farmacéutico o veterinario, etc. Un modulador puede formularse para uso simultáneo, separado o secuencial.

Un modulador se formula típicamente para administración en la presente invención con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. El vehículo o diluyente farmacéutico puede ser, por ejemplo, una solución isotónica. Por ejemplo, las formas orales sólidas pueden contener junto con el compuesto activo diluyentes, por ejemplo, lactosa, dextrosa, sacarosa, celulosa, almidón de maíz o almidón de patata; lubricantes, por ejemplo, sílice, talco, ácido esteárico, estearato de magnesio o de calcio y/o polietilenglicoles; agentes de unión; por ejemplo, almidones, goma arábiga, gelatina, metilcelulosa, carboximetilcelulosa o polivinilopirrolidona; agentes disgregantes, por ejemplo, almidón, ácido algínico, alginatos o almidón glicolato sódico; mezclas efervescentes; colorantes; edulcorantes; agentes humectantes tales como lecitina, polisorbatos, laurilsulfatos; y, en general, sustancias no tóxicas y farmacológicamente inactivas usadas en formulaciones farmacéuticas. Dichas preparaciones farmacéuticas pueden fabricarse de una forma conocida, por ejemplo, por medio de mezcla, granulación, preparación de comprimidos, procesos de recubrimiento con azúcares o recubrimiento con película.

Las dispersiones líquidas para administración oral pueden ser jarabes, emulsiones o suspensiones. Los jarabes pueden contener como vehículos, por ejemplo, sacarosa o sacarosa con glicerina y/o manitol y/o sorbitol.

\newpage

Las suspensiones y emulsiones pueden contener como vehículo, por ejemplo, una goma natural, agar, alginato sódico, pectina, metilcelulosa, carboximetilcelulosa o alcohol polivinílico. Las suspensiones o soluciones para inyecciones intramusculares pueden contener, junto con el compuesto activo, un vehículo farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, agua estéril, aceite de oliva, oleato de etilo, glicoles, por ejemplo, propilenglicol y, si se desea, una cantidad adecuada de clorhidrato de lidocaína.

Las soluciones para administración o infusión intravenosa pueden contener como vehículo, por ejemplo, agua estéril o preferiblemente pueden estar en forma de soluciones salinas isotónicas, acuosas, estériles.

Una cantidad terapéuticamente eficaz de un modulador se administra a un paciente. La dosis de un modulador puede determinarse de acuerdo con diversos parámetros, especialmente de acuerdo con la sustancia usada; la edad, peso y estado del paciente que se va a tratar; la vía de administración; y el régimen necesario. De nuevo, un médico será capaz de determinar la vía de administración y la dosificación necesarias para cualquier paciente particular. Una dosis diaria típica es de aproximadamente de 0,1 a 50 mg por kg de peso corporal, de acuerdo con la actividad del modulador específico, la edad, el peso y el estado del sujeto que se vaya a tratar, el tipo y la gravedad de la degeneración y la frecuencia y la vía de administración. Preferiblemente, los niveles de dosificación diaria son de 5 mg a 2 g.

La expresión y/o actividad de una isoforma particular de NOS puede regularse específicamente. Pueden administrarse inespecíficamente sustancias que tengan efectos específicos para una isoforma de metilarginasa particular, por ejemplo, una DDAHI o una DDAHII, ya que sólo modularán la expresión o actividad de una metilarginasa particular y por lo tanto la actividad de una isoforma particular de NOS.

Sin embargo, algunas sustancias pueden afectar a más de una isoforma de metilarginasa. Puede ser necesario administrar dichos moduladores a sitios específicos si son necesarios para regular solamente una isoforma particular de NOS. Por ejemplo, si una afección requiere la regulación de NOS, el modulador tendrá que suministrarse a neuronas. Esto puede conseguirse, por ejemplo, por suministro mediante una cepa viral tal como virus herpes simple. Se han descrito anteriormente vectores virales que comprenden polinucleótidos de la invención. El método de suministro por vector viral puede usarse en caso de la administración de, por ejemplo, polinucleótidos de la invención.

Los polinucleótidos y vectores de la invención pueden administrarse directamente como una construcción de ácido nucleico desnudo. La captación de construcciones de ácido nucleico desnudo por células de mamífero se potencia mediante varias técnicas de transfección conocidas, por ejemplo, las que incluyen el uso de agentes de transfección. Los ejemplos de estos agentes incluyen agentes catiónicos (por ejemplo, fosfato de calcio y DEAE-dextrano) y agentes de lipofección (por ejemplo, lipofectam^{TM} y transfectam^{TM}).

Típicamente, las construcciones de ácido nucleico se mezclan con el agente de transfección para producir una composición. Preferiblemente, la construcción de ácido nucleico desnudo, el vector viral que comprende el polinucleótido o la composición se combina con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable para producir una composición farmacéutica. Los vehículos y diluyentes adecuados incluyen soluciones salinas isotónicas, por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato. La composición puede formularse para administración parenteral, intramuscular, intravenosa, subcutánea o transdérmica.

La composición farmacéutica se administra de tal modo que el polinucleótido de la invención, el vector viral para terapia génica, puede incorporarse en células en un área apropiada. Cuando el polinucleótido de la invención se suministra a células mediante un vector viral, la cantidad de virus administrado está en el intervalo de 10^{6} a 10^{10} ufp, preferiblemente de 10^{7} a 10^{9} ufp, más preferiblemente de aproximadamente 10^{8} ufp para vectores adenovirales. Cuando se inyecta, típicamente se administran 1-2 ml de virus en un vehículo o diluyente adecuado farmacéuticamente aceptable. Cuando el polinucleótido de la invención se administra como un ácido nucleico desnudo, la cantidad de ácido nucleico administrado está típicamente en el intervalo de 1 \mug a 10 mg.

Cuando el polinucleótido que da origen al producto está bajo el control de un promotor inducible, puede ser sólo necesario inducir la expresión génica durante la duración del tratamiento. Una vez que se ha tratado la afección, el inductor se elimina y cesa la expresión del polipéptido de la invención. Esto tendrá claramente ventajas clínicas. Dicho sistema puede implicar, por ejemplo, administrar el antibiótico tetraciclina para activar la expresión del gen a través de su efecto sobre la proteína de fusión represor tet/VP16.

El uso de promotores específicos de tejido será de ayuda en el tratamiento de una enfermedad usando los polipéptidos, polinucleótidos y vectores de la invención. Será ventajoso ser capaz de expresar genes terapéuticos sólo en los tipos celulares afectados pertinentes, especialmente cuando dichos genes sean tóxicos cuando se expresan en otros tipos celulares.

Las vías de administración y dosificaciones descritas anteriormente pretenden servir solamente como guía puesto que un médico especialista será capaz de determinar fácilmente la vía de administración y la dosificación óptimas para cualquier paciente y afección particular.

La invención se ilustra mediante el siguiente Ejemplo:

\newpage

Ejemplo

Materiales y métodos

A menos que se indique otra cosa, los métodos usados son técnicas de bioquímica y biología molecular convencionales. Los ejemplos de libros de texto de metodología adecuados incluyen Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1989) y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley and Sons, Inc.

Búsqueda en bases de datos y clonación de ADNc

La secuencia de ADNc de la DDAHI humana se obtuvo por una combinación de búsqueda en base de datos, RT-PCR específica y RACE 5'/3'. Se realizó una búsqueda en la base de datos de marcadores de secuencia expresada (dbEST) con la secuencia de ADNc correspondiente a la fase de lectura abierta de la DDAHI de rata (Kimoto, M., Sasakawa, T., Tsuji, H., Miyatake, S., Oka, T., Nio, N. y Ogawa, T., 1997, Biochim. Biophys. Acta 1337, 6-10) usando el programa "blast". Esta búsqueda identificó una sola secuencia de ADNc humano que comprendía 161 pb del ADNc de la DDAHI humana fusionadas cadena abajo de 160 pb de secuencia desconocida. Usando esta secuencia se diseñaron dos cebadores oligonucleotídicos específicos de DDAHI humana HDDAHI.1 y HDDAHI.2. Se realizó una transcripción inversa de ARN poliA+ de riñón humano a partir de un cebador oligo dT, después de la cual se amplificó por PCR el ADNc de la DDAHI humana en dos reacciones de PCR que incorporaban HDDAHI.1 y RDDAHI.1 o HDDAHI.2 y RDDAHI.2. Para determinar la secuencia de los extremos 5' y 3' de la fase de lectura abierta de la DDAHI humana se realizó una RACE 5' y 3'. Para la RACE 5' se realizó una transcripción inversa de ARNm poliA de riñón humano usando el cebador HDDAHI.3. Después de la transcripción inversa, se digirió el ARN con ARNasa H y se purificó el ADNc usando un kit de purificación de ADN HighPure (Boehringer). Se añadió una cola poliA al ADNc purificado por incubación con una transferasa terminal en presencia de dATP. Se usó el ADNc con cola poliA directamente en reacciones de PCR que incorporaban Anclaje Oligo dT y HDDAI.4. Para la RACE 3', se cebó el ARN poliA+ humano con Anclaje Oligo dT y se realizó una transcripción inversa antes de la PCR con los oligonucleótidos HDDAHI.5 y Anclaje. Todos los productos de PCR se clonaron en pCRTOPO2.1 (In Vitrogen) siguiendo las instrucciones de los fabricantes. Se secuenciaron los insertos de ADNc usando un kit de secuenciación con T7 (Amersham) de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes.

La secuencia de la DDAHII humana se obtuvo por búsqueda en base de datos. Se realizó una búsqueda en la base de datos de fases de lectura abierta traducidas EMBL (trembl) con la secuencia peptídica de la DDAHI de rata. Esta búsqueda identificó una fase de lectura abierta de ratón hipotética (número de acceso O08972) que tenía la capacidad de codificar una proteína de 228 aminoácidos con una similitud del 63% con la DDAHI de rata. La consulta de la dbEST con la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de ratón hipotética identificó numerosos EST humanos solapantes que contenían una fase de lectura abierta de 858 pb con el potencial de codificar una proteína de 285 aminoácidos que tiene una identidad del 52% con la DDAHI humana. Los oligonucleótidos usados en estos experimentos se muestran en la Tabla 1.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1 Oligonucleótidos usados

2

3

\vskip1.000000\baselineskip

Expresión recombinante

La fase de lectura abierta de la DDAHII humana completa se amplificó por PCR a partir de ADNc de riñón humano cebado con oligo dT usando los oligonucleótidos HDDAII.1 y HDDAHII.2. El oligonucleótido HDDAHII.1 es complementario a los pares de bases 2-15 del ADNc de la DDAHII humana y contiene un sitio EcoRI en fase de lectura con el sitio EcoTI de pPROX.HTa (Life Technologies). El HDDAHII.2 es complementario a los pares de bases 858-840 del ADNc de la DDAHII humana y contiene un sitio XbaI artificial. La PCR producía un solo producto de \sim850 pb que se digirió con EcoRI y XbaI, se ligó en pRPROX.HTa digerido con EcoRI y XbaI y se usó para transformar E. coli DH5\alpha competentes. Se identificó un clon positivo (pPDDAHII) que contenía un inserto de 858 pb y se secuenció el inserto en ambas cadenas. Para la expresión de DDHAII humana recombinante, se cultivaron E. coli en cultivo líquido a 25ºC hasta una DO_{600} de 0,5-0,6. Después se indujo la expresión por adición de IPTG a una concentración final de 1 mM y se continuó con la incubación durante dos horas adicionales. Después de la inducción, las células se recogieron por centrifugación, se pesaron y se resuspendieron en tampón de ensayo enfriado en hielo (Na_{2}HPO_{4} 100 mM pH 6,5) a 1 g células/ml. Las células se rompieron por sonicación (6 x 10 s, con intervalos de 10 s) y se centrifugaron a 50.000 g para separar el material soluble de los residuos celulares insolubles.

\newpage

Ensayo de DDAH

Se incubaron alícuotas de lisados de E. coli a 37ºC durante 60 min con 250 ml de Na_{2}HPO_{4} 100 mM pH 6,5 que contenía [^{14}C]L-NMMA 0,02 \muCi como se ha descrito anteriormente (MacAllister et al., 1996, Br. J. Pharmacol. 115, 1001-1004). Después de la incubación se prepararon las muestras para la determinación de la producción de [^{14}C]-citrulina por recuento de centelleo. Se agitaron vorticialmente las reacciones con 1 ml de dowex 50X8-400 al 50% (p/v), se centrifugaron a 10.000 g durante 5 min y después se mezclaron 500 \mul del sobrenadante con 5 ml de líquido de centelleo líquido y se determinó el contenido de [^{14}C].

\vskip1.000000\baselineskip

Ensayo de DDAH

Las muestras se ensayaron por incubación de 100 \mul de lisados celulares con un volumen equivalente de mezcla de ensayo (Na_{2}HPO_{4} 100 mM pH 6,5 que contenía [^{14}C]L-NMMA 0,02 \muCi y L-NMMA fría 100 \muM) a 37ºC durante 60 min, como se ha descrito anteriormente. Las muestras se prepararon después para recuento por centelleo para medir la producción de [^{14}C]-citrulina por adición de 400 \mul de Dowex 50X-400 al 50% (p/v) a las reacciones, agitación vorticial y centrifugación a 13000 g durante 2 min. Después se determinó el contenido de [^{14}C] de 100 \mul de sobrenadante en 1 ml de líquido de escintilación.

\vskip1.000000\baselineskip

Análisis de transferencia de Northern

La distribución tisular de ARNm de DDAHI, DDAHII, NOS endotelial y NOS neuronal humanas se determinó por hibridación de sondas de ADNc marcadas con ^{32}P con una transferencia de Northern disponible en el mercado (Clontech, transferencia de Northern de múltiples tejidos humanos). Se produjeron sondas mediante amplificación por PCR de ARNm poliA+ de riñón humano cebado con oligo dT usando los pares de cebadores oligonucleotídicos HDDAHI 4 y 5; HDDAHII 3 y 4, HENOS 1 y 2 y HNNOS 1 y 2. Después, los productos de reacción de PCR se resolvieron en geles de agarosa al 2%, se aislaron del gel y se marcaron usando un kit de marcaje por cebado aleatorio (Boehringer) de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes. Las sondas marcadas se purificaron en columnas Nick (Pharmacia) y se hibridaron con filtros de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes.

\vskip1.000000\baselineskip

Búsqueda en base de datos para secuencias bacterianas

Se añadió la secuencia de aminoácidos de la DDAHI humana para realizar una búsqueda en la base de datos de marcadores de secuencia expresada (dbEST). Se identificaron fases de lectura abierta que mostraban una similitud significativa con esta secuencia en S. coelicolor (del 46,5% sobre 163 aminoácidos), P. aeruginosa (del 44,3% sobre 226 aminoácidos) y M. tuberculosis (del 37,5% sobre 24 aminoácidos). Las secuencias de ADNc que codifican estas supuestas DDAH bacterianas se usaron después para diseñar los cebadores ScDDAHI y ScDDAH2, después se usaron las PaDDAH para diseñar los cebadores ScDDAHI y ScDDAH2, PaDDAH y PaDDAH4 y TbDDAH1 y TbDDAH4. Estos oligonucleótidos PaDEIM2 y PaDEIM3 se diseñaron a partir de la secuencia de ADNc de la arginina desiminasa de P. aeruginosa para amplificar la región codificante. Se diseñaron los cebadores TbDDAH1 y TbDDAH4 para amplificar una fase de lectura abierta a partir del cósmido Y3G12 que se identificó por búsqueda en la base de datos usando hDDAH1. Los oligonucleótidos usados en estos experimentos se muestran en la Tabla 2.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 2 Oligonucleótidos Usados

4

5

\vskip1.000000\baselineskip

Reacción en Cadena de la Polimerasa y Clonación de ADNc

La amplificación de DDAH de S. coelicolor a partir del cósmico 4C6 se realizó mediante PCR usando los oligonucleótidos ScDDAH1 y ScDDAH2. La PCR se realizó sobre ADN genómico de P. aeruginosa usando los cebadores PADDAG1 y PADDAG4 para amplificar la supuesta DDAH. La arginina desiminasa de P. aeruginosa se amplificó también usando los oligonucleótidos PaDEIM2 y PaDEIM3. Los oligonucleótidos TbDDAH1 y TbDDAH4 se usaron en una PCR para amplificar la DDAH de M. tuberculosis a partir del ADN cosmídico de Y3G12.

Todos los productos de PCR se clonaron en pCRTOPO2.1 (In Vitrogen) siguiendo las instrucciones de los fabricantes.

\vskip1.000000\baselineskip

Expresión de Proteínas Recombinantes

Los insertos que contenían las fases de lectura abierta de las DDAH bacterianas se escindieron del vector usando EcoRI y HindIII, se purificaron en gel, se ligaron en pProEX.HT digerido con EcoRI y HindIII y se usaron para transformar E. coli DH5\alpha competentes. La arginina desiminasa se trató como anteriormente pero se clonó en pBAD B digerido con EcoRI y HindIII (In Vitrogen).

Para la expresión de las proteínas recombinantes, se escogió un clon positivo y se cultivó en medio líquido complementado con ampicilina 100 \mug/ml. Se cultivaron E. coli a 25ºC a una DO_{600} de 0,5-0,6 para las DDAH bacterianas en pProEX.HT y a 37ºC para la arginina desiminasa en pBAD B. La inducción de la expresión de las DDAH bacterianas se realizó por adición de IPTG a una concentración final de 1 mM y una incubación adicional de 2 horas a 25ºC. La expresión de la arginina desiminasa se indujo por adición de arabinosa a una concentración final del 0,02% (p/v) e incubación durante 4 horas adicionales a 37ºC.

\global\parskip0.900000\baselineskip

Después de la inducción, las células se recogieron por centrifugación y se resuspendieron a una concentración de 250 mg/ml en tampón de ensayo (Na_{2}HPO_{4} 100 mM, pH 6,5). Las células se rompieron por sonicación (6 x 10 s) y se centrifugaron a 18.000 g para eliminar el material particulado.

\vskip1.000000\baselineskip

Electroforesis en Gel de SDS-Poliacrilamida y Análisis de Transferencia de Western

Se realizó un SDS-PAGE en tampón Tris/glicina, pH 8,3, en gel de separación al 12% (p/v) con un gel de concentración al 3,5% (p/v). Las proteínas se transfirieron sobre una membrana de Immobilon-P (Millipore) a 200 A durante 30 minutos. Después, las membranas se bloquearon en leche al 5% (p/v) en solución salina tamponada con fosfato con Tween 20 0,1 (PBST) durante 2 horas. La transferencia se sondó con un anticuerpo de poliHistidina (Sigma) a una dilución de 1:3000 seguido de anticuerpo anti-Ig de ratón acoplado a peroxidasa de rábano picante (Amersham) a una dilución de 1:5000 que después se le reveló usando un kit de quimioluminiscencia de ECL (Amershan).

\vskip1.000000\baselineskip

Resultados Clonación del DDAHI y DDAHII humanas

Usando una combinación de RT-PCR y RACE, se ensambló un ADNc que codifica la fase de lectura abierta completa de la DDHAI humana. La fase de lectura abierta de 858 pb tiene una homología del 90% con la ORF de la DDAHI de rata (no se muestran los datos) y codifica un polipéptido de 285 aminoácidos que tiene una identidad del 95% con la proteína de rata (Figura 1). Una búsqueda en la base de datos "trembl" usando la secuencia de aminoácidos de la DDAHI de rata identificó una fase de lectura abierta de ratón que codificaba una proteína con una homología del 63% sobre 228 aminoácidos con la de DDAH de rata. Una búsqueda adicional en la base de datos identificó un ADNc humano de 2000 pb que contenía una fase de lectura abierta de 858 pb con el potencial para codificar una proteína de 285 aminoácidos (en lo sucesivo denominada DDAHII). Esta fase de lectura abierta tenía una homología del 63% con la DDAHI humana a nivel de nucleótidos (no se muestran los datos) y la proteína predicha tiene una similitud del 62% con la DDAHI humana a nivel de aminoácidos (Figura 1). Como la DDAHI, la DDAHII parece estar altamente conservada en todas las especies de mamíferos con una homología del 98% entre las secuencias de aminoácidos de la DDAHII murina y humana (no se muestran los datos).

\vskip1.000000\baselineskip

Expresión recombinante de la DDAHII humana

Se expresó un cuerpo de DDAHII marcado N-terminalmente con His 6X en E. coli bajo el control de un promotor inducible por IPTG. Después de la inducción, era evidente una banda de \sim40 kDA (DDAHII humana de \sim35 kDa + marcador His 6X de 4 kDa y enlazador) en la fracción soluble de los lisados celulares (Figura 2). La proteína inducida de \sim40 kDa se reconoce específicamente por un anticuerpo anti-His6 que confirma su identidad como DDAHII humana recombinante (Figura 2). Para establecer si la DDAHII es un homólogo funcional de la DDAHI se ensayaron lisados de células bacterianas para determinar la actividad de DDAH. Los lisados de células transfectadas con vector vacío no metabolizaban la [^{14}C]L-NMMA. Por el contrario, los lisados de células que expresaban DDAHII recombinante metabolizaban la [^{14}C]L-NMMA (Figura 3). Esta acción se inhibió por el inhibidor de DDAH ácido S-2-amino-4(3-metilguanidino)butanoico (4124 W) [ref] y por competición con un exceso molar de L-NMMA, ADMA o citrulina frías. La actividad enzimática no se veía afectada por la presencia de un exceso molar de SDMA fría.

\vskip1.000000\baselineskip

Distribución tisular de DDAH humana y NOS

Para determinar la distribución tisular de ARN mensajero de DDAHI y DDAHII y para explorar cualquier correlación entre la expresión de isoformas de DDAH y NOS se sondaron transferencias de northern de múltiples tejidos humanos disponibles en el mercado con ADNc cebado marcado específico para cada isoforma (Figura 4). Una sonda de ADNc de DDAHI hibridaba con una sola banda de \sim4,4 Kb que se expresaba mucho en riñón, cerebro, páncreas e hígado. También era claramente evidente una expresión de menor nivel en músculo esquelético mientras que apenas eran detectables las señales de corazón, placenta y pulmón. Por el contrario, una sonda de ADNc para DDAHII hibridaba con una sola banda de \sim2 Kb que se expresaba más altamente en corazón, riñón y placenta. En el caso de la DDAHII, apenas era detectable una expresión de menor nivel en el cerebro. Una sonda específica para nNOS puso de manifiesto un alto nivel de expresión en músculo esquelético y cerebro, menores niveles en riñón y páncreas y ninguna expresión detectable en corazón, placenta, pulmón e hígado. La NOS endotelial se expresaba mucho en placenta y corazón, siendo evidentes niveles menores en músculo esquelético, hígado, riñón, páncreas y pulmón, mientras que la expresión en cerebro era indetectable. El nivel de mensaje de \beta-actina en cada carril se muestra como indicativo de la carga de ARNm.

Para ampliar este análisis de distribución de isoforma de DDAH se ha examinado el nivel de ARNm de DDAHI y II en 43 tejidos adultos y 7 fetales mediante análisis de transferencia puntual de ARN usando sondas específicas de isoforma. Este análisis indicaba que en el cerebro se expresa DDAHI a altos niveles mientras que la DDAHII se expresa a niveles relativamente reducidos, expresándose ambas isoformas a altos niveles en la médula espinal. Sin embargo, en tejidos altamente vascularizados, tales como el corazón, la aorta, la placenta y el pulmón la expresión de DDAHII predomina claramente sobre la de DDAHI. En tejidos inmunes (bazo, timo, leucocitos periféricos, ganglios linfáticos y médula ósea) la expresión de DDAHII es claramente evidente mientras que la expresión de DDAHI es apenas detectable. Este patrón diferente de expresión de DDAH concuerda con la sugerencia anterior de que la DDAHI predomina en tejidos que expresan altos niveles de la isoforma neuronal de NOS y la expresión de DDAHII es más marcada en tejidos que también expresan la forma endotelial de NOS.

\vskip1.000000\baselineskip

La localización cromosómica de la DDAHI y II humanas

Para determinar la localización cromosómica de los genes de DDAHI y de DDAHII humanas se emplearon técnicas de mapeo híbrido por radiación e hibridación in situ fluorescente (FISH). Para el mapeo híbrido por radiación se exploró el panel de ADN híbrido por radiación Genebridge 4 (creadores Peter Goodfellow y Jean Weissenbach, obtenido del UK HGMP Resource Centre) usando pares de oligonucleótidos para amplificar los nucleótidos 47 a 273 de del ADNc de DDAHI y los nucleótidos -16 a -163 del ADNc de la DDAHII. Los resultados se enviaron al servicio de mapeo HGMP RhyME que mapeó la DDAHI en el cromosoma 1 (LOD = 2,7) y la DDAHII en el cromosoma 6p21-23 (LOD > 3). Para el mapeo por FISH, se identificó un clon genómico de DDAHI humana (clon nº 2218H15, número de acceso AQ145822) mediante una búsqueda blast de la base de datos GSS usando la secuencia de ADNc de la DDAHI humana. Se aisló un clon genómico (clon nº 84h3) que contenía el gen de DDAHII humana mediante exploración por PCR de una genoteca PAC de genómico humano (RPCII, construida por Pieter de Jong y obtenida del UK HGMP Resource Centre). Se usaron los clones 2218H15 y 84h3 como sondas en FISH, que localizó la DDAHI en el cromosoma 1p22 y la DDAHII en el cromosoma 6p21.3.

\vskip1.000000\baselineskip

Identificación de proteínas relacionadas con DDAH

Para identificar proteínas con una homología de secuencia primaria significativa con DDAH I/I I se realizó una búsqueda en la base de datos swissprot con las secuencias proteicas tanto de la DDAHI como de la DDAHII humanas. Esta búsqueda puso de manifiesto una homología significativa entre ambas secuencias de DDAH y las secuencias de enzimas arginina desiminasas de varias especies microbianas. El mayor grado de homología se encontró con la secuencia de la arginina desiminasa de Pseudomonas putida (nº de acceso p41142) (Figura 5). La homología era más fuerte dentro de un dominio de 69 aminoácidos (restos 123 a 191 de la DDAHI) en el que la identidad aumenta hasta el 22% y la similitud hasta el 70%. En este dominio, la DDAHI y DDAHII tienen una identidad del 80%. La comparación de las secuencias de la DDAHI y DDAHII humanas con otras enzimas que utilizan arginina o productoras de arginina, tales como peptidilarginina desiminasa, arginasa, argininosuccinato lisasa, arginina descarboxilasa y óxido nítrico sintasa no puso de manifiesto ninguna homología de aminoácidos significativa.

\vskip1.000000\baselineskip

Clonación de DDAH de Streptomyces y Pseudomonas

Se muestra un alineamiento ClustalW de las secuencias de aminoácidos de las DDAH de S. coelicolor, P. aeruginosa, M. tuberculosis y DDAHI humana en la Figura 6A. También se muestran los alineamientos de la DDAH y arginina desiminasa de P. aeruginosa en la Figura 6B.

Se diseñaron los oligonucleótidos ScDDAH 1 y ScDDAH 2 a partir de la fase de lectura abierta de una supuesta DDAH de S. coelicolor identificada por exploración de una base de datos. Estos cebadores dieron un producto de PCR de aproximadamente 850 pb. Los cebadores PaDDAH1 y PaDDAH4 amplificaron un producto de aproximadamente 780 pb a partir de ADN genómico de P. aeruginosa y TbDDAH 1 y TbDDAH 4 dieron un producto de PCR de aproximadamente 1150 pb a partir del cósmido Y3G12.

\vskip1.000000\baselineskip

Expresión de DDAH Bacterianas Recombinantes

Se realizó la expresión de formas marcadas N-terminalmente con His 6X de DDAH de S. coelicolor, M. tuberculosis y P. aeruginosa en E. coli bajo el control de un promotor inducible con IPTG. Después de la inducción se observó una banda de \sim36 kDa en lisados celulares de S. coelicolor (DDAH de S. coelicolor de \sim32 kDa + marcador His 6X de \sim4 kDa) y de 33 kDa en lisados celulares de P. aeruginosa (DDAH de P. aeruginosa de 29 kDa + marcador His 6X de \sim4 kDa). Un anticuerpo de poliHistidina reconocía específicamente estas bandas proporcionando una confirmación de la identidad de estas proteínas como DDAH de S. coelicolor y P. aeruginosa recombinante respectivamente.

Actividad de Proteínas DDAH Bacterianas Recombinantes

Se ensayaron los lisados celulares de DDAH bacteriana para determinar la actividad de DDAH para determinar si eran homólogos funcionales de la DDAH I humana. Se descubrió que metabolizaban la [^{14}C]L-NMMA, como se muestra en la Figura 7. También se transfectó vector vacío en células y se descubrió que los lisados de éstas no metabolizaban la [^{14}C]L-NMMA. La DDAH de P. aeruginosa mostraba una mayor actividad en comparación con la DDAH de S. coelicolor.

Se descubrió que tanto la ADMA como la SDMA competían con la L-NMMA como sustratos para las DDAH bacterianas (Figura 7), mostrando la ADM un mayor efecto que la SDMA sobre el metabolismo de la L-NMMA. Se han obtenido resultados similares para la DDAH de M. tuberculosis.

\global\parskip0.000000\baselineskip

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: UNIVERSITY COLLEGE LONDON

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: Gower Street

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Londres

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: Reino Unido

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): WC1E 6BT

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: MÉTODO DE EXPLORACIÓN

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 12

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE SOPORTE: Disquete flexible

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: PC Compatible con IBM

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: PatentIn Release nº 1.0. Versión nº 1.30 (EPO)

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 1

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 858 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1:

6

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 2

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 285 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

7

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 858 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 285 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 4:

9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 777 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 258 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 6:

11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 765 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 7:

12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 254 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 8:

13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1257 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 9:

14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 418 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 10:

15

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1014 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 11

\vskip1.000000\baselineskip

17

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 305 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 12:

\vskip1.000000\baselineskip

19

20

Claims (16)

1. Un polinucleótido que:

(a)

codifica un polipéptido que tiene actividad metilarginasa, seleccionándose dicho polinucleótido de:

(1)

la secuencia codificante de la SEC ID Nº: 3; y

(2)

una secuencia que está degenerada como resultado del código genético con respecto a una secuencia definida en (1); o

(b)

es una secuencia complementaria a un polinucleótido definido en (a).

\vskip1.000000\baselineskip

2. Un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1, que es una secuencia de ADN.

3. Un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 4.

4. Un polipéptido que tiene actividad metilarginasa y que comprende la secuencia expuesta en la SEC ID Nº: 4.

5. Un vector que incorpora un polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

6. Un vector de acuerdo con la reivindicación 5, que es un vector de expresión.

7. Una célula que alberga un vector de acuerdo con la reivindicación 5 ó 6.

8. Un proceso para la preparación de un polipéptido que tiene actividad metilarginasa, comprendiendo dicho proceso cultivar una célula hospedadora que alberga un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 6 en condiciones para proporcionar la expresión de dicho polipéptido y recuperar el polipéptido expresado.

9. Un anticuerpo capaz de unirse a un polipéptido que tiene actividad metilarginasa y que comprende la secuencia expuesta en la SEC ID Nº: 4, en el que el anticuerpo es capaz de discriminar entre un polipéptido de DDAHI y un polipéptido de DDAHII.

10. Un animal transgénico no humano que no es capaz de expresar una forma activa de una dimetilarginina dimetilaminohidrolasa II (DDAHII), en el que, en el animal transgénico, la secuencia polinucleotídica del locus del gen de la DDAHII se ha deleccionado o sustituido con la secuencia polinucleotídica de otro locus o de otro organismo, o en el que la secuencia codificante del gen de la DDAHII se ha alterado de modo que el polipéptido expresado no muestre actividad metilarginasa y en el que dicho animal no humano es un mamífero.

11. Un animal no humano de acuerdo con la reivindicación 10, que es un ratón.

12. Un método para identificar un modulador de la actividad y/o expresión de metilarginasa, comprendiendo dicho método:

(i)

poner en contacto un polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 4, un vector de acuerdo con la reivindicación 6 o una célula de acuerdo con la reivindicación 7 y una sustancia de ensayo en condiciones que permitirían la actividad metilarginasa en ausencia de la sustancia de ensayo; y

(ii)

determinar de este modo si dicha sustancia modula la actividad y/o expresión de metilarginasa.

\vskip1.000000\baselineskip

13. Un polinucleótido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 4 o un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 6 para el uso en un método de tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia.

14. Un polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 4 o un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 6 para el uso en un método de tratamiento de hiperlipidemia, insuficiencia renal, hipertensión, reestenosis después de angioplastia, aterosclerosis, complicaciones de insuficiencia cardiaca, esquizofrenia, esclerosis múltiple o cáncer.

15. Uso de un polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 4 o un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 6 para la fabricación de un medicamento para el uso en el tratamiento de hiperlipidemia, insuficiencia renal, hipertensión, reestenosis después de angioplastia, aterosclerosis, complicaciones de insuficiencia cardiaca, esquizofrenia, esclerosis múltiple o cáncer.

16. Una composición farmacéutica que comprende un polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 4 o un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 6 y un vehículo y/o diluyente farmacéuticamente aceptable.