ES2255715T3 - Diagnostico y tratamiento de transtornos relacionados con la aur-1 y/o la aur-2. - Google Patents
Diagnostico y tratamiento de transtornos relacionados con la aur-1 y/o la aur-2.Info
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A LOS POLIPEPTIDOS AUR 1 Y/O AUR - 2, ACIDOS NUCLEICOS QUE CODIFICAN DICHOS POLIPEPTIDOS, CELULAS, TEJIDOS Y ANIMALES QUE CONTENGAN DICHOS ACIDOS NUCLEICOS, ANTICUERPOS CONTRA DICHOS POLIPEPTIDOS, ENSAYOS UTILIZANDO DICHOS POLIPEPTIDOS, Y METODOS RELACIONADOS CON TODO LO ANTERIOR. SE PROPORCIONAN METODOS PARA EL TRATAMIENTO, DIAGNOSTICO, Y BUSQUEDA DE ESTADOS O ENFERMEDADES RELACIONADAS CON EL AUR - 1 Y/O EL AUR - 2 QUE SE CARACTERIZAN POR UNA INTERACCION ANORMAL ENTRE UN POLIPEPTIDO AUR - 1 Y/O AUR - 2 Y UN SEGUNDO COMPONENTE AL QUE SE UNE AUR - 1 Y/O AUR - 2.
Description
Diagnóstico y tratamiento de trastornos
relacionados con la AUR-1 y/o la
AUR-2.
La presente invención se refiere a las nuevas
proteínas denominadas AURORA UNO y AURORA DOS
("AUR-1" y "AUR-2"), a
secuencias de nucleótidos que codifican a la AUR-1
y/o a la AUR-2 así como a varios productos y métodos
útiles para el diagnóstico y el tratamiento de diversos trastornos y
estados patológicos relacionados con la AUR-1 y/o la
AUR-2.
La siguiente descripción de los antecedentes de
la invención se facilita para ayudar a comprender la invención, pero
no se admite que sea la técnica anterior de la invención.
La transducción de señales celulares es un
mecanismo fundamental por el que los estímulos externos, que regulan
diversos procesos celulares, se transfieren al interior de las
células. Uno de los mecanismos bioquímicos clave de la transducción
de señales implica la fosforilación reversible de proteínas, que
permite la regulación de la actividad de proteínas maduras mediante
la alteración de su estructura y de su funcionamiento.
Las proteína-quinasas mejor
caracterizadas de los eucariotas fosforilan las proteínas del resto
alcohol de los grupos serina, treonina y tirosina. Estas quinasas se
subdividen en general en dos grupos, las específicas de la
fosforilación de serinas y treoninas y las que son específicas de la
fosforilación de tirosinas. Algunas quinasas, denominadas quinasas
de "especificidad dual", son capaces de fosforilar los restos
tirosina y también los restos serina/treonina.
Las proteína-quinasas pueden
caracterizarse también por su ubicación dentro de la célula. Algunas
quinasas son proteínas de tipo receptor transmembrana, capaces de
alterar directamente su capacidad catalítica en respuesta al entorno
externo, por ejemplo la fijación de un ligando. Otras son proteínas
de tipo no receptor, que carecen del dominio transmembrana. Pueden
hallarse en una gran variedad de compartimentos celulares, desde la
superficie interior de la membrana celular hasta el núcleo.
Muchas quinasas intervienen en las cascadas
reguladoras, en las que sus sustratos pueden incluir otras quinasas,
cuyas actividades están reguladas por su estado de fosforilación.
Finalmente, la actividad de algún efector en dirección a
3'(downstream) está modulada por la fosforilación resultante de la
activación de tal conducto.
La familia de las
serina/treonina-quinasas incluye a miembros que se
hallan en todos los pasos de varias cascadas de señalización,
incluidos los que intervienen en el crecimiento, la migración y la
diferenciación celulares y la secreción de hormonas, la
fosforilación de factores de transcripción que conduce a una
alteración de la expresión genética, a la contracción muscular, al
metabolismo de la glucosa, al contro de la síntesis de proteínas
celulares y a la regulación del ciclo celular.
La presente invención se refiere a polipéptidos
AUR-1 y/o AUR-2, a ácidos nucleicos
que codifican a tales polipéptidos, a células que contienen tales
ácidos nucleicos, a anticuerpos contra tales polipéptidos, a ensayos
que utilizan dichos polipéptidos y a métodos relacionados con todo
lo anterior. La presente invención se basa en el aislamiento y la
caracterización de nuevas proteínas que hemos denominado
AUR-1 y/o AUR-2. Los polipéptidos y
ácidos nucleicos pueden producirse empleando técnicas estándar bien
conocidas de síntesis, si se dan las secuencias presentas aquí. La
AUR-1 y la AUR-2 son
serina/treonina-quinasas afines, de extensiones
N-terminales cortas. Los homólogos de
Drosophila y de levadura parecen intervenir en la regulación
mitótica. Las proteínas humanas parecen participar en el cáncer y/u
otros trastornos de transducción de señales. El RNA de la AUR1 se
expresa ampliamente en células de división rápida, derivadas de
tejidos tanto normales como tumorales. En cambio, el RNA de la AUR2
se expresa en un modelo más restringido, estando poco presente o
incluso ausente de la mayor parte de tejidos normales y abundante
solamente en un subgrupo de líneas celulares derivadas de tumores,
en particular las de origen colorrectal.
Tanto la Aurora1 como la Aurora2 presentan una
expresión intermedia en el hígado fetal, en los testículos de
adultos y en el timo, lo cual sugiere un rol normal de estas
proteínas en la división meiótica.
Tanto la AUR1 como la AUR2 parecen regular la
división nuclear, la interrupción de su señalización provoca la
formación de células poliploides. Este fenotipo se debe
probablemente a la mala segregación cromosómica, tal como se observa
en su homólogo de levadura IPL1. Dado que la poliploidía es un
distintivo de las células tumorales y de células que carecen del
supresor tumoral p53, hemos verificado el rol de la AUR1 y de la
AUR2 en la transformación celular.
El análisis de la secuencia primaria de los genes
humanos revela que contienen un dominio de
proteína-quinasa C-terminal muy
conservado y un dominio N-terminal débilmente
conservado de 74 a 130 aminoácidos que desempeña un papel o función
reguladora como motivo de fijación a sustrato. Los genes humanos
contienen además un sitio R/KR/KXS/T de fosforilación cAMP/PKA en el
bucle de activación del dominio quinasa, lo cual sugiere que existe
un conducto regulador similar al ciclo celular regulado por
proteínas afines CDC2/CDK.
El análisis "Southern" con sondas derivadas
de las regiones N-terminales únicas de la AUR1 y de
la AUR2 indica que existen en forma de genes de copia simple en las
células humanas. Sin embargo, en condiciones de baja restricción,
hemos podido detectar fragmentos SacI de 1,3 kb y 3,2 kb, que se
hibridan débilmente con la sonda de AUR1. La clonación y el análisis
de secuencia revelan que esta región codifica a un pseudogén sin
intrón relacionado con la AUR1 (llamado AUR3), con múltiples
desplazamientos de marco. Además, en posición inmediatamente
siguiente en dirección a 5'(upstream) del pseudogén AUR3 existe una
región con repeticiones invertidas de complejo, que previsiblemente
forman un bucle de herradura (hairpin loop) muy estable. La
secuencia del DNA de la AUR3 es homóloga de la AUR1 y empieza con el
primer nucleótido del cDNA de la AUR1. En posición inmediatamente
contigua a este sitio en dirección a 5'(upstream) se halla el bucle
de herradura previsto de la AUR3. Actualmente estamos caracterizando
los clones genómicos de la AUR1 para determinar si la homología con
la AUR3 continúa en dirección a 5'después de este nucleótido y si el
cDNA de la AUR1 incluye o está precedido por un bucle de herradura
similar.
La utilidad de la presente invención incluye la
capacidad de explorar los inhibidores de crecimiento celular y de
desarrollar terapéuticas de moléculas pequeñas para tratar el
cáncer.
Por ello, en un primer aspecto, la invención se
refiere a una molécula de ácido nucleico aislada, enriquecida o
purificada, caracterizada porque codifica a un polipéptido
AUR-1 de por lo menos 100 aminoácidos contiguos de
la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO: 3 o un
polipéptido AUR-2 de por lo menos 100 aminoácidos
contiguos de la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO:
4.
Con "aislado" en referencia a un ácido
nucleico se indica un polímero de nucleótidos conjugados entre sí,
que incluye el DNA o el RNA, que se aísla a partir de una fuente
natural o que se sintetiza. En ciertas formas de ejecución de esta
invención son preferidos los ácidos nucleicos más largos, por
ejemplo los que tienen 600, 900 ó más nucleótidos y/o los que tienen
por lo menos una identidad del 50%, 60%, 75%, 90%, 95% o 99% con la
secuencia de longitud completa presentada en la SEQ ID NO: 1 o la
SEQ ID NO: 2. El ácido nucleico aislado de la presente invención es
único en el sentido de que no se halla en la naturaleza en estado
puro ni en estado separado. El uso del término "aislado"
indica que una secuencia de origen natural se ha apartado de su
entorno celular normal (p.ej. cromosómico). Por lo tanto, la
secuencia puede estar en una solución libre de células o colocada en
un entorno celular diferente. El término no implica que la secuencia
sea la única cadena de nucleótidos presente, pero que está
esencialmente libre (con una pureza por lo menos del 90 - 95%) de
material no nucleótido asociado de forma natural con ella y
significa por tanto que se distingue de los cromosomas aislados.
Con el uso del término "enriquecido" en
relación a un ácido nucleico se indica que la secuencia específica
de DNA o RNA constituye una fracción significativamente mayor (de 2
a 5 veces) del DNA o RNA total presente en las células o en la
solución de interés, de la que se ha tomado la secuencia. Esto puede
realizarlo una persona con reducción preferente de la cantidad de
otro DNA o RNA presente, o por aumento preferente de la cantidad de
la secuencia específica de DNA o RNA, o por combinación de ambos.
Sin embargo, hay que señalar que "enriquecido" no implica que
no haya presentes otras secuencias de DNA o RNA, sino que
precisamente la cantidad relativa de la secuencia de interés ha
aumentado de forma significativa. El término "significativo"
se utiliza aquí para indicar que el nivel de aumento es útil para la
persona que provoca tal aumento, y en general significa un aumento
con respecto a otros ácidos nucleicos del orden por lo menos de 2
veces, con mayor preferencia por lo menos de 5 a 10 veces o incluso
más. El término no implica que no pueda haber DNA o RNA de otras
fuentes. Otras fuentes de DNA pueden ser por ejemplo un genoma de
levadura o de una bacteria, o un vector de clonación, por ejemplo el
pUC19. Este término distingue entre acontecimientos de tipo natural,
por ejemplo una infección vírica, o crecimientos de tipo tumoral, en
los que el nivel de un mRNA puede aumentar de forma natural con
respecto a otras especies de mRNA. Es decir, este término indica
únicamente aquellas situaciones en las que una persona interviene
para elevar la proporción de un ácido nucleico deseado.
También es ventajoso para algunos propósitos que
la secuencia de nucleótidos esté en forma purificada. El término
"purificada" en relación a un ácido nucleico no requiere que la
pureza sea absoluta (por ejemplo, en forma de preparación
homogénea); pero sí contiene la indicación de que la secuencia es
relativamente más pura que en el entorno natural (si se compara con
el nivel natural, este nivel debería ser por lo menos
2-5 veces mayor, p.ej. en términos de mg/ml). Los
clones individuales aislados de una biblioteca de cDNA pueden
purificarse hasta la homogeneidad electroforética. Las moléculas de
DNA reivindicadas, obtenidas a partir de estos clones, pueden
obtenerse directamente del DNA total o del RNA total. Los clones de
cDNA no son de origen natural, sino que se obtienen con preferencia
mediante la manipulación de una sustancia de origen natural que se
purifica parcialmente (RNA mensajero). La construcción de una
biblioteca de cDNA a partir del mRNA implica la creación de una
sustancia sintética (cDNA) y los clones de cDNA individualmente
puros pueden aislarse a partir de la biblioteca sintética por
selecciones de clones de las células que llevan la biblioteca de
cDNA. Por lo tanto, el proceso que implica la construcción de una
biblioteca de cDNA a partir de mRNA y el aislamiento de diferentes
clones de cDNA proporciona una purificación aproximadamente de
10^{6} veces del mensaje nativo. Por ello se contempla
expresamente la purificación por lo menos de un orden de magnitud,
con preferencia dos o tres órdenes y con preferencia especial de
cuatro o cinco órdenes de magnitud.
Con un "polipéptido AUR-1"
y/o un "polipéptido AUR-2" se entienden 100 o
más aminoácidos continuos dispuestos en la secuencia de aminoácidos
de longitud total SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4 o un derivado
funcional de los mismos, tal como se describe aquí. En ciertos
aspectos son preferidos los polipéptidos de 200, 300 ó más
aminoácidos. El polipéptido AUR-1 y/o
AUR-2 puede codificarse con una secuencia de
aminoácidos de longitud completa o cualquier porción de una
secuencia de aminoácidos de longitud completa, en el supuesto de que
se conserve la actividad funcional del polipéptido.
En las formas preferidas de ejecución, el ácido
nucleico aislado contiene, consta esencialmente de o consta de una
secuencia de ácidos nucleicos definida en la secuencia de
aminoácidos de longitud completa SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4, un
derivado funcional de las mismas o codifica por lo menos 200 ó 300
aminoácidos contiguos de las mismas.
El ácido nucleico puede aislarse a partir de una
fuente natural por clonación de cDNA o hibridación sustractiva; la
fuente natural puede ser sangre, semen o tejido (humano) de mamífero
y el ácido nucleico puede sintetizarse por el método del triéster o
empleando un sintetizador automático de DNA. En otras formas de
ejecución preferidas, el ácido nucleico es una región conservada o
única, por ejemplo las que son útiles para el diseño de sondas de
hibridación para facilitar la identificación y la clonación de
polipéptidos adicionales, el diseño de sondas de PCR para facilitar
la clonación de polipéptidos adicionales y la obtención de
anticuerpos contra regiones del polipéptido.
Los ejemplos de secuencias de aminoácidos
incluyen las siguientes:
- ENSYPWPYGRQ (SEQ ID NO: 5)
- CISGP (SEQ ID NO: 6)
- QFPO (SEQ ID NO: 7)
- VNSGQ (SEQ ID NO: 8)
- RKEPVTPSA-LV (SEQ ID NO: 9)
- LMSRSNVQPTAAP (SEQ ID NO: 10)
- VQNQKQKQLQATSVPH (SEQ ID NO: 11)
- PVSRPLNNTQK (SEQ ID NO: 12)
- VMENSSGTPD (SEQ ID NO: 13)
- ILTRHFTID (SEQ ID NO: 14)
- SKQPLPSAPENNPEEQLASKQK (SEQ ID NO: 15).
Se entiende por "regiones conservadas de ácido
nucleico" aquellas regiones que están presentes en dos o más
ácidos nucleicos que codifican a un polipéptido
AUR-1 y/o AUR-2, con las que puede
hibridarse una secuencia concreta de ácido nucleico en condiciones
de restricción escasa. Los ejemplos de condiciones de restricción
escasa, idóneas para la exploración de ácidos nucleicos que
codifican a polipéptidos AUR-1 y/o
AUR-2 se encontrará en Abe y col., J. Biol. Chem.
19, 13361, 1992.
Con preferencia, las regiones conservadas
diferentes en menos de 5 entre 20 nucleótidos.
Se entiende por "región única de ácido
nucleico" una secuencia que está presente en un ácido nucleico de
longitud completa que codifica a un polipéptido
AUR-1 y/o AUR-2 y que no está
presente en una secuencia que codifique a cualquier otro polipéptido
de origen natural. Tales regiones abarcan con preferencia 30 ó 45
nucleótidos contiguos, presentes en el ácido nucleico de longitud
completa que codifica a un polipéptido AUR-1 y/o
AUR-2. En particular, una región única de ácido
nucleico tiene con preferencia su origen en un mamífero.
La invención se refiere además a una sonda de
ácido nucleico para la detección de un polipéptido
AUR-1 y/o AUR-2 o de un ácido
nucleico que codifica a un polipéptido AUR-1 y/o
AUR-2 en una muestra. La sonda de ácido nucleico
contiene un ácido nucleico que se híbrida con una secuencia definida
en SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 o un derivado funcional del
mismo.
La sonda de ácido nucleico es altamente
complementaria del ácido nucleico que codifica por lo menos a 105,
120, 150, 200, 250, 300 ó 350 aminoácidos contiguos de la secuencia
de longitud completa definida en la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 o un
derivado funcional de las mismas. Pueden utilizarse varias
condiciones de hibridación de restricción escasa o elevada en
función de la especificidad y de la selectividad deseadas. Se
entiende por condiciones de hibridación restrictiva aquellas en las
que solamente se hibridan las secuencias altamente complementarias
de ácidos nucleicos. Tales condiciones impiden con preferencia la
hibridación de ácidos nucleicos que tienen 1 ó 2 apareamientos
defectuosos entre 20 nucleótidos contiguos.
Los métodos para utilizar las sondas incluyen la
detección de la presencia o de la cantidad del RNA de la
AUR-1 y/o de la AUR-2 en una muestra
poniendo en contacto la muestra con la sonda de ácido nucleico en
condiciones tales que tenga lugar la hibridación y detectando la
presencia o la cantidad de la sonda fijada al RNA de la
AUR-1 o de la AUR-2. El ácido
nucleico dúplex formado entre la sonda y la secuencia de ácido
nucleico que codifica a un polipéptido AUR-1 y/o
AUR-2 puede utilizarse para la identificación de la
secuencia del ácido nucleico detectado (véase por ejemplo Nelson y
col., Nonisotopic DNA Probé Techniques, Academic Press, San Diego,
coordinador: Kricka, p. 275, 1992).
Pueden construirse kit para llevar estos métodos
a la práctica, de modo que incluyan un recipiente que contenga una
sonda de ácido nucleico.
La invención se refiere también a ácido nucleico
recombinante que codifica por lo menos a 100 aminoácidos contiguos
de una secuencia definida como SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4 o a un
derivado funcional del mismo y a un vector o a un promotor eficaz
para iniciar la transcripción en una célula hospedante. El ácido
nucleico recombinante puede contener alternativamente una región
funcional de iniciación de transcripción en una célula, una
secuencia complementaria de una secuencia de RNA que codifica a un
polipéptido AUR-1 y/o AUR-2 y una
región funcional de terminación de transcripción en una célula.
En otro aspecto, la invención se refiere a un
polipéptido AUR-1 y/o AUR-2 aislado,
enriquecido o purificado.
Se entiende por "aislado" en relación a un
polipéptido un polímero de 100 o más aminoácidos contiguos de una
secuencia definida en la SEQ ID NO: 3 o en la SEQ ID NO: 4,
conjugados entre sí, incluidos los polipéptidos que se aíslan de una
fuente natural o que se sintetizan. En ciertos aspectos se prefieren
los polipéptidos más largos, como son los que tienen 402, 407, 413 ó
425 aminoácidos contiguos, definidos en las SEQ ID NO: 3 o SEQ ID
NO: 4. Los polipéptidos aislados de la presente invención son únicos
en el sentido de que no se hallan en estado puro ni separado en la
naturaleza. El uso del término "aislado" indica que la
secuencia de origen natural se ha apartado de su entorno celular
normal. Por lo tanto, la secuencia puede estar en una solución
exenta de células o colocada en un entorno celular diferente. El
término no implica que la secuencia sea la única cadena de
aminoácidos que está presente, pero que está esencialmente libre
(pureza por lo menos del 90-95%) de material no
aminoácido asociado naturalmente a ella.
Con el uso del término "enriquecido" en
relación a un polipéptido se indica que la secuencia específica de
aminoácidos contiene una fracción significativamente mayor (de 2 a 5
veces) del total de aminoácidos que están presentes en las células o
en la solución de interés con respecto a las células normales o
enfermas o con respecto a las células de las que se ha tomado la
secuencia. Esto puede provocarlo una persona con la reducción
preferente de la cantidad de otros aminoácidos presentes o por un
incremento preferente de la cantidad de la secuencia de aminoácidos
de interés o por combinación de ambos. Sin embargo, hay que indicar
que enriquecido no implica que pueden estar presentes otras
secuencias de aminoácidos, sino que precisamente la cantidad
relativa de la secuencia de interés ha aumento de modo
significativo. El término significativo se emplea aquí para indicar
que el nivel del aumento es útil para la persona que realiza tal
aumento, y significa con preferencia un aumento con respecto a otros
aminoácidos en una cantidad por lo menos de 2 veces, con mayor
preferencia de 5 a 10 veces o más. El término no implica que no haya
aminoácidos de otras fuentes. Otra fuente de aminoácidos puede
comprender, por ejemplo, los aminoácidos codificados por un genoma
de levadura o de bacteria o un vector de clonación, como el pUC19.
El término abarca solamente aquellas situaciones en las que
interviene una persona para elevar la proporción del ácido nucleico
deseado.
Es también ventajoso para algunos propósitos que
la secuencia de aminoácidos esté en forma purificada. El término
"purificado" en relación a un polipéptido no requiere que la
pureza sea absoluta (por ejemplo en una preparación homogénea); sino
que contiene la indicación de que la secuencia es relativamente más
pura que en el entorno natural (si se compara con el nivel, este
nivel debería ser por lo menos 2-5 veces mayor,
p.ej. en términos de mg/ml). Se contempla de modo expreso la
purificación por lo menos en un orden de magnitud, con preferencia
dos o tres órdenes y con preferencia especial cuatro o cinco órdenes
de magnitud. La sustancia está con preferencia libre de
contaminación en un nivel funcionalmente significativo, por ejemplo
tendrá una pureza del 90%, del 95% o del 99%.
En las formas preferidas, el polipéptido
AUR-1 y/o AUR-2 contiene por lo
menos 200, 250, 300 ó 350 aminoácidos contiguos de la secuencia de
longitud completa definida en la SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4 o un
derivado funcional de las mismas.
En otro aspecto, la invención se refiere a un
anticuerpo (p.ej. un anticuerpo monoclonal o policlonal) que tiene
una afinidad de fijación específica con el polipéptido
AUR-1 y/o AUR-2. El anticuerpo
contiene una secuencia de aminoácidos que es capaz de fijarse
específicamente a un polipéptido AUR-1 y/o
AUR-2 que tiene por lo menos 100 aminoácidos
contiguos en la secuencia de longitud completa definida en SEQ ID
NO: 3 o SEQ ID NO: 4. Se entiende por "afinidad específica de
fijación" que el anticuerpo se fija sobre polipéptidos
AUR-1 y/o AUR-2 con mayor afinidad
que sobre otros polipéptidos en condiciones especificadas.
Los anticuerpos que tienen afinidad específica de
fijación sobre los polipéptidos AUR-1 y/o
AUR-2 pueden utilizarse en métodos para la detección
de la presencia y/o la cantidad de un polipéptido
AUR-1 y/o AUR-2 en una muestra,
poniendo en contacto la muestra con el anticuerpo en condiciones
tales que se forme un inmunocomplejo y detectando la presencia y/o
la cantidad del anticuerpo conjugado con el polipéptido
AUR-1 y/o AUR-2. Los kits de
diagnóstico para la puesta en práctica de tales métodos pueden
construirse de modo que incluyan un primer recipiente que contiene
un anticuerpo y un segundo recipiente que contiene un conjugado de
un reactivo de fijación del anticuerpo y un marcador.
En otro aspecto, la invención se refiere a un
hibridoma que produce un anticuerpo que tiene afinidad específica de
fijación sobre un polipéptido AUR-1 y/o
AUR-2 que tiene por lo menos 100 aminoácidos
contiguos de la secuencia de longitud completa definida en la SEQ ID
NO: 3 o SEQ ID NO: 4. Se entiende por hibridoma una línea celular
inmortalizada que es capaz de secretar un anticuerpo, por ejemplo un
anticuerpo de AUR-1 y/o de
AUR-2.
Mediante "purificado" en relación a un
anticuerpo se indica que el anticuerpo es distinto del anticuerpo de
origen natural, por ejemplo está en forma purificada. El anticuerpo
se genera con técnica estándar con preferencia en forma de
preparación homogénea. Los usos de los anticuerpos contra
polipéptidos clonados incluyen la terapia y las herramientas de
diagnóstico.
La invención se refiere a un método para la
exploración de células humanas que contiene un polipéptido
AUR-1 y/o AUR-2 o una secuencia
equivalente. El método consiste en identificar el nuevo polipéptido
en células humanas empleando técnicas que son habituales y estándar
en el ámbito de la genética, por ejemplo las descritas en esta
solicitud para identificar la AUR-1 y/o la
AUR-2 (clonación molecular, análisis de
transferencia "Southern" o "northern", hibridación
"in situ", amplificación por PCR, etc.).
En otro aspecto, la invención proporciona un
ensayo para identificar los agentes capaces de interferir en la
interacción entre la AUR-1 y/o la
AUR-2 y un reactivo de fijación de la
AUR-1 y/o de la AUR-2. Dichos
ensayos pueden realizarse "in vitro" o "in
vivo" y se describen con detalle en la presente o pueden
obtenerse por modificación de otros ensayos ya existentes, por
ejemplo el ensayo de crecimiento descrito en el documento que lleva
el número de serie 08/487,088, depositado con fecha 7 de junio de
1995, o los ensayos descritos en el documento que lleva el número de
serie 60/005,167, depositado con fecha 13 de octubre de 1995. Otro
ensayo que podría modificarse para el uso en genes de la presente
invención se describe en la solicitud internacional nº WO 94/23039,
publicada con fecha 13 de octubre de 1994. Otras posibilidades
incluyen la detección de la actividad de quinasa en ensayos de
autofosforilación o la verificación de la actividad de quinasa en
sustratos estándar, por ejemplo histonas, proteína básica de
mielina, gamma-tubulina o proteínas de centrosomas.
Los reactivos de fijación pueden identificarse colocando la porción
N-terminal de la proteína en una pantalla de dos
híbridos o detectando la fosfotirosina de una quinasa de
especificidad dual, ver Fields y Song, patente US-5
283 173, publicada el 1 de febrero de 1994.
Un medio para definir los inhibidores de la
actividad de la Aurora consiste en un sistema de exploración que
emplea un mutante de levadura sensible a la temperatura, como el
descrito por Chan y Botstein, Genetics 135,
677-691, 1993; véase también Francisco y col., Mol.
Cell. Bio. 14(7), 4731-4740, 1994.
Resumiendo, la cepa de levadura
CCY72-3D-1 (ipl
1-2), que expresa una forma sensible a la
temperatura del homólogo de levadura de la Aurora (ip11) al tiempo
que es viable a 26ºC, es incapaz de crecer a 37ºC. La transfección
de esta cepa con un plásmido de expresión que contiene un gen
híbrido de Aurora, que contiene la porción
N-terminal del ip11, que contiene el o los dominios
putativos de interacción con el sustrato, y la porción
C-terminal de las Auroras 1 y 2, que contienen el
dominio catalítico, supera esta sensibilidad a la temperatura de
crecimiento. La cepa de levadura que expresa la Aurora puede
cultivarse entonces a 37ºC en presencia de una sustancia de ensayo.
No se observa crecimiento en presencia de sustancias que inhiben la
función catalítica de la Aurora. Los inhibidores potenciales
incluyen los compuestos químicos de peso molecular bajo y/o los
productos naturales aislados de diversos organismos, por ejemplo
hongos, organismos marinos, plantas, etc.
El resumen de la invención recién descrito es no
limitante y otras características y ventajas de la invención
resultarán evidentes de la descripción que sigue de las formas
preferidas de ejecución y también de las reivindica-
ciones.
ciones.
La presente invención se refiere a polipéptidos
AUR-1 y/o AUR-2, a ácidos nucleicos
que codifican tales polipéptidos, a anticuerpos contra tales
polipéptidos, a ensayos que utilizan dichos polipéptidos y a métodos
relacionados con todo lo anterior.
Se incluyen dentro del alcance de esta invención
los equivalentes funcionales de las moléculas de ácido nucleico
aisladas, descritas en esta solicitud. La degeneración del código
genético permite la sustitución de ciertos codones por otros
codones, que especifican el mismo aminoácido y por ello dan lugar a
la misma proteína. La secuencia de ácido nucleico puede variar
sustancialmente porque, excepto la metionina y el triptófano, los
aminoácidos conocidos pueden codificarse por acción de más de un
codón. Por ello, las porciones o la totalidad de los genes de
AUR-1 y/o AUR-2 pueden sintetizarse
para obtener una secuencia de ácido nucleico significativamente
diferente de la definida en la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2. Sin
embargo, la secuencia de aminoácidos codificada debería
conservarse.
Además, la secuencia de ácido nucleico puede
contener una secuencia de nucleótidos que resulte de la adición,
deleción o sustitución por lo menos de un nucleótido del extremo
5'y/o del extremo 3'de la fórmula de ácido nucleico definida en la
SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 o un derivado de la misma. A tal efecto
puede emplearse cualquier nucleótido o polinucleótido, con la
condición de que su adición, deleción o sustitución no altere la
secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4 que se
codifica con la secuencia de nucleótidos. Por ejemplo, la presente
invención incluye cualquier secuencia de ácido nucleico que resulte
de la adición del ATG como codón de iniciación en el extremo 5'de
la secuencia de ácido nucleico de la invención o de su derivado o de
la adición de TTA, TAG o TGA como codón de terminación en el extremo
3'de la secuencia de nucleótidos de la invención o de su derivado.
Además, la molécula de ácido nucleico de la presente invención puede
tener, si fuera necesario, sitios de reconocimiento de endonucleasa
de restricción añadidos a su extremo 5'y/o extremo 3'.
Tales alteraciones funcionales de una secuencia
determinada de ácido nucleico proporcionan una oportunidad para
promover la secreción y/o el procesado de proteínas heterólogas
codificadas por secuencias de ácidos nucleico ajenas, fusionadas a
las mismas. Todas las variaciones de secuencias de nucleótidos de
los genes y fragmentos de la AUR-1 y/o
AUR-2 permitidas por el código genético se incluyen,
por tanto, en esta invención.
Además, es posible la deleción de codones o la
sustitución de uno o varios codones por codones diferentes de los
codones degenerados para producir un polipéptido estructuralmente
modificado, pero que tiene sustancialmente la misma utilidad o
actividad que el polipéptido producido por la molécula no modificada
de ácido nucleico. Tal como se reconoce en la técnica, los dos
polipéptidos son funcionalmente equivalentes, como lo son las dos
moléculas de ácido nucleico que dan lugar a su producción, incluso a
pesar de que las diferencias entre las moléculas de ácido nucleico
no guarden relación con la degeneración del código genético.
Puede utilizarse una sonda de ácido nucleico de
la presente invención para explorar una biblioteca apropiada de
cromosomas o de cDNA mediante los métodos habituales de hibridación,
obteniendo otra molécula de ácido nucleico de la presente invención.
Una biblioteca de DNA cromosómicos o de cDNA puede prepararse a
partir de células apropiadas con arreglo a métodos ya reconocidos de
la técnica (véase "Molecular Cloning: A Laboratory Manual",
segunda edición, coordinado por Sambrook, Fritsch & Maniatis,
Cold Spring Harbor Laboratory, 1989).
Como alternativa, la síntesis química se lleva a
cabo para obtener sondas de ácido nucleico que tengan secuencias de
nucleótidos que corresponden a las porciones
N-terminales y C-terminales de la
secuencia de aminoácidos del polipéptido de interés. Por lo tanto,
las sondas de ácido nucleico sintetizadas pueden utilizarse como
cebadores para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), realiza
con arreglo a técnicas PCR reconocidas, esencialmente con arreglo a
los protocolos PCR descritos en "A Guide to Methods and
Applications", coordinado por Michael y col., Academic Press,
1990, empleando una biblioteca apropiada de cromosomas o de cDNA
para obtener el fragmento de la presente invención.
Un experto en la materia puede diseñar fácilmente
tales sondas, basadas en la secuencia publicada en esta solicitud y
utilizando métodos de análisis computerizado de alineamiento y
secuencias ya conocidos de la técnica (véase "Molecular Cloning: A
Laboratory Manual", segunda edición, coordinado por Sambrook,
Fritsch & Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989). Las
sondas de hibridación de la presente invención pueden marcarse por
técnicas estándar de marcado, por ejemplo con radiomarcadores,
marcadores enzimáticos, marcadores fluorescentes, marcadores de
biotina-avidina, quimioluminiscencia y similares.
Después de la hibridación, las sondas pueden visualizarse empleando
métodos conocidos.
Las sondas de ácido nucleico de la presente
invención incluyen las sondas de RNA y también las de DNA, por
ejemplo las sondas que se generan aplicando técnicas ya conocidas.
La sonda de ácido nucleico puede inmovilizarse sobre un soporte
sólido. Los ejemplos de tales soportes sólidos incluyen, pero no se
limitan a plásticos, por ejemplo el policarbonato, hidratos de
carbono complejos, por ejemplo la agarosa y la Sepharose, y resinas
acrílicas, por ejemplo las poliacrilamidas y las esferillas de
látex. Las técnicas para fijar las sondas de ácido nucleico sobre
tales soportes sólidos son bien conocidas.
Las muestras idóneas para el ensayo en métodos de
exploración de ácidos nucleicos de la presente invención incluyen
por ejemplo las células y los extractos de ácidos nucleicos de
células o los fluidos biológicos. La muestra empleada en los métodos
recién descritos puede variar en función del formato de ensayo, el
método de detección y la naturaleza de los tejidos, células o
extractos a ensayar. Los métodos de preparación de extractos de
ácidos nucleicos de células son bien conocidos en la técnica y
pueden adaptarse fácilmente para obtener una muestra que sea
compatible con el método utilizado.
Un método para detectar la presencia de la
AUR-1 y/o la AUR-2 en una muestra
consiste en (a) poner en contacto dicha muestra con la sonda de
ácido nucleico recién descrita, en condiciones tales que tenga lugar
la hibridación y (b) detectar la presencia de dicha sonda fijada
sobre dicha molécula de ácido nucleico. Un experto en la materia
podrá seleccionar la sonda de ácido nucleico con arreglo a técnicas
ya conocidas y descritas anteriormente. Las muestras a ensayar
incluyen, pero no se limitan a muestras de RNA de tejidos
humanos.
Un kit para la detección de la presencia de
AUR-1 y/o AUR-2 en una muestra
contiene por lo menos un recipiente que contiene en su interior la
sonda de ácido nucleico descrita antes. El kit puede contener además
otros recipientes que contengan uno o varios de los siguientes:
reactivos de lavado y reactivos capaces de detectar la presencia de
una sonda de ácido nucleico fijada. Los ejemplos de reactivos de
detección incluyen, pero no se limitan a sonda radiomarcadas, sondas
marcadas enzimáticamente (peroxidasa de rábano rusticano, fosfatasa
alcalina) y sondas marcadas por afinidad (biotina, avidina o
estreptavidina).
En detalle, un kit dividido en compartimentos
incluye cualquier kit en el que los reactivos están almacenados en
recipientes separados. Dichos recipientes incluyen recipientes
pequeños de vidrio, recipientes de plástico o tiras de plástico o de
papel. Tales recipientes permiten la transferencia eficaz de los
reactivos de un compartimento a otro compartimento, de modo que las
muestras y los reactivos no sufran contaminación cruzada y los
reactivos o soluciones de cada recipiente puedan añadirse de modo
cuantitativo desde un compartimento a otro. Tales recipientes pueden
incluir un recipiente para la muestra a ensayar, un recipiente para
la sonda o cebadores empleados en el ensayo, recipientes para los
reactivos de lavado (por ejemplo solución salina tamponada con
fosfato, tampones Tris y similares) y recipientes para reactivos
empleados para detectar la sonda hibridada, el anticuerpo fijado, el
producto amplificado o similares. Un experto en la materia
reconocerá fácilmente que las sondas de ácido nucleico descritas en
la presente invención pueden incorporarse con facilidad a uno de los
formatos de kit establecidos, que son bien conocidos en la
técnica.
La presente invención se refiere también a una
molécula de DNA recombinante que contiene, de 5'a 3', un promotor
eficaz para iniciar la transcripción en una célula hospedante y las
moléculas de ácido nucleico recién descritas. Además, la presente
invención se refiere a una molécula de DNA recombinante que contiene
un vector y una molécula de ácido nucleico descrita antes. La
presente invención se refiere además a una molécula de ácido
nucleico que contiene una región funcional de transcripción a una
célula, una secuencia complementaria de una secuencia de RNA que
codifica a una secuencia de aminoácido correspondiente al
polipéptido descrito anteriormente y una región funcional de
terminación de la transcripción en dicha célula. Las moléculas
recién descritas pueden ser moléculas de DNA aisladas y/o
purificadas.
La presente invención se refiere además a una
célula u organismos que contiene la molécula de ácido nucleico
descrita antes y por ello es capaz de expresar un péptido. El
polipéptido puede purificarse a partir de células que se hayan
alterado para expresar el polipéptido. Se dice que una célula "se
altera para expresar un polipéptido deseado" cuando dicha célula
por manipulación genética se crea de modo que produzca una proteína
que normalmente no produce o que la célula normalmente produce en
niveles bajos. Un experto en la materia puede adaptar rápidamente
los procedimientos para introducir y expresar secuencias genómicas,
de cDNA o sintéticas en células eucariotas o procariotas.
Se dice que una molécula de ácido nucleico, por
ejemplo el DNA es "capaz de expresar" un polipéptido si
contiene secuencias de nucleótidos que contengan información
reguladora de la transcripción y de la traducción y tales secuencias
están "unidas operativamente" a las secuencias de nucleótidos
que codifican al polipéptido. Un engarce operativo es un engarce en
el que las secuencias reguladoras de RNA y la secuencia de DNA que
se pretenden expresar están conectadas de tal manera que permita la
expresión de la secuencia genética. La naturaleza exacta de las
regiones reguladoras que se necesitan para la expresión de la
secuencia genética pueden variar de un organismo a otro, pero en
general deberán contener una región de promotor que, en los
procariotas, contiene tanto el promotor (que dirige la iniciación de
la transcripción del RNA) como secuencias de DNA que, cuando se
transcriben al RNA, señalarán el inicio de la síntesis. Tales
regiones incluyen normalmente las secuencias 5'no codificadoras que
participan en la iniciación de la transcripción y traducción, por
ejemplo la caja TATA, la secuencia de remate (capping), la secuencia
CAAT y similares.
Si se desea, la región 3'no codificadora de la
secuencia que codifica al gen de la AUR-1 y/o
AUR-2 puede obtenerse por los métodos recién
descritos. Esta región puede retenerse para sus secuencias
reguladoras de terminación de transcripción, por ejemplo la
terminación y la poliadenilación. Por lo tanto, cuando se retiene la
región 3', que está naturalmente contigua a la secuencia de DNA que
codifica un gen de AUR-1 y/o de
AUR-2, pueden proporcionarse señales de terminación
de la transcripción. Cuando las señales de terminación de la
transcripción no funcionan satisfactoriamente en la célula
hospedante de la expresión, entonces puede sustituirse la región
funcional 3'de la célula hospedante.
Se dice que dos secuencias de DNA (por ejemplo
una secuencia de región de promotor y una secuencia de
AUR-1 y/o AUR-2) están unidas
operativamente, cuando la naturaleza del engarce entre las dos
secuencias de DNA (1) no provoca la introducción de una mutación de
desplazamiento de marco y (2) no interfiere en la capacidad de la
secuencia de región de promotor para dirigir la transcripción de una
secuencia de gen de AUR-1 y/o AUR-2
o (3) no interfiere con la capacidad de una secuencia de gen de
AUR-1 y/o AUR-2 de transcribirse por
acción de la secuencia de la región de promotor. Por lo tanto, la
región de promotor debería estar unida operativamente con una
secuencia de DNA, si el promotor es capaz de efectuar la
transcripción de dicha secuencia de DNA. Por ello, para expresar un
gen de AUR-1 y/o AUR-2 son
necesarias señales de transcripción y de traducción que sean
reconocidas por un hospedante apropiado.
La presente invención abarca la expresión del gen
de la AUR-1 y/o de la AUR-2 (o un
derivado funcional del mismo) en células procariotas o eucariotas.
Los hospedantes procariotas son en general muy eficaces y
convenientes para la producción de proteínas recombinantes y son,
por ello, un tipo de sistema de expresión preferido para los genes
de la AUR-1 y/o AUR-2. Los
procariotas están representados con gran frecuencia por varias cepas
de E. coli. Sin embargo pueden utilizarse también otras cepas
microbianas, incluidas otras cepas bacterianas.
En sistemas procariotas pueden utilizarse
vectores plásmidos que contienen sitios de replicación y secuencias
de control derivadas de una especie compatible con el hospedante.
Los ejemplos de vectores plásmidos idóneos pueden incluir el pBR322,
el pUC118, el pUC119 y similares; los vectores idóneos de fago o
bacteriófago pueden incluir el \gammagt10, el \gammagt11 y
similares; y los vectores víricos idóneos pueden incluir el
pMAM-neo, el pKRC y similares. El vector
seleccionado de la presente invención tendrá con preferencia
capacidad de replicarse en la célula hospedante elegida.
Los hospedantes procariotas reconocidos incluyen
las bacterias, p.ej. E. coli, los bacilos, el
Streptomyces, los Pseudomonas, la Salmonella,
la Serratia y similares. Sin embargo, en tales condiciones
los péptidos no se glucosilarán. El hospedante procariota tiene que
ser compatible con el replicón las secuencias de control del
plásmido de expresión.
Para expresar la AUR-1 y/o
AUR-2 (o un derivado funcional de las mismas) en una
célula procariota es necesario unir operativamente la secuencia de
la AUR-1 y/o AUR-2 con un promotor
procariota funcional. Tales promotores pueden ser constitutivos o,
con mayor preferencia, regulables (es decir, inducibles o
desrepresibles). Los ejemplos de promotores constitutivos incluyen
el promotor int del bacteriófago \lambda, el promotor bla de la
secuencia del gen de \beta-lactamasa del pBR322 y
el promotor CAT de la secuencia del gen de
cloranfenicol-acetil-transferasa del
pPR325 y similares. Los ejemplos de promotores procariotas
inducibles incluyen los promotores principales derecho e izquierdo
del bacteriófago \lambda (P_{L} y P_{R}), el trp, el recA, el
\lambdaacZ, el \lambdaacI y los promotores gal de la E.
coli, la \alpha-amilasa (Ulmanen y col., J.
Bacteriol. 162, 176-182, 1985) y los
promotores específicos \varsigma-28 del B.
subtilis (Gilman y col., Gene sequence 32,
11-20, 1984), los promotores del bacteriófago de
bacilos (Gryczan, The Molecular Biology of the Bacilli, Academic
Press Inc., NY, 1982) y los promotores de Streptomyces (Ward
y col., Mol. Gen. Genet. 203, 468-478,
1986). Los promotores procariotas se reseñan en Glick (J. Ind.
Microbiot. 1, 277-282, 1987); Cenatiempo
(Biochimie 68, 505-516, 1986) y Gottesman
(Ann. Rev. Genet. 18, 415-442, 1984).
La expresión correcta en una célula procariota
requiere además la presencia de un sitio de fijación de ribosoma en
dirección a 5'(upstream) de la secuencia que codifica a la secuencia
del gen. Tales sitios de fijación de ribosomas se describen por
ejemplo en Gold y col., Ann. Rev. Microbiol. 35,
365-404, 1981. La selección de secuencias de
control, vectores de expresión, métodos de transformación y
similares dependerá del tipo de célula hospedante empleada para
expresar el gen. Tal como se emplea en esta solicitud,
"célula", "línea celular" y "cultivo celular" pueden
utilizarse indistintamente y todas las denominaciones incluyen la
progenie. Por lo tanto, los términos "transformantes" o
"células transformadas" incluyen las células en cuestión
primarias y los cultivos derivados de las mismas, con independencia
del número de transferencias. Se da por supuesto además que toda la
progenie puede no ser exactamente idéntica en cuanto a contenido de
DNA, debido a las mutaciones deliberadas o inadvertidas. Sin
embargo, tal como se ha definido, la progenie mutante tiene la misma
funcionalidad que la célula originalmente transformada.
Las células hospedantes que pueden utilizarse
para los sistemas de expresión de la presente invención no están
limitadas de forma estricta, con la condición de que sean idóneas
para el uso en la expresión del péptido AUR-1 y/o
AUR-2 de interés. Los hospedantes idóneos pueden
incluir a menudo células eucariotas. Los hospedantes eucariotas
preferidos incluyen por ejemplo la levadura, los hongos, las células
de insectos, la células de mamíferos, ya sea "in vivo",
ya sea en cultivo de tejido. Las células de mamíferos que pueden ser
útiles como hospedantes incluyen las células HeLa, las células de
origen fibroblasto tal como VERO o CHO-K1 o las
células de origen linfoide y sus derivados. Las células hospedantes
de mamíferos preferidas incluyen las SP2/0 y J558L así como las
líneas celulares de neuroblastoma, por ejemplo la IMR 332, que puede
proporcionar una mejor capacidad para el procesado correcto de la
post-traducción.
Además, las células de plantas están disponibles
también como hospedantes y están disponibles secuencias de control
compatibles con células de plantas, por ejemplo el virus del mosaico
de coliflor 35S y 19S y promotor de nopalina-sintasa
y secuencias de señales de poliadenilación. Otro hospedante
preferido es una célula de insecto, por ejemplo de larvas de
Drosophila. Empleando como hospedantes las células de
insectos, podrá utilizarse el promotor de
alcohol-deshidrogenasa de la Drosophila,
véase Rubín, Science 240, 1453-1459, 1988.
Como alternativa pueden diseñarse vectores baculovirus para expresar
grandes cantidades de AUR-1 y/o
AUR-2 en células de insectos (Jasny, Science
238, 1653, 1987; Miller y col., Genetic Engineering,
coordinadores: Setlow, J.K. y col., editorial Plenum, vol. 8, pp.
277-297, 1986).
Puede utilizarse cualquiera de una serie de
sistemas de expresión de secuencias genéticas de levadura, que
incorporen promotor y elementos de terminación de secuencias
genéticas expresadas activamente, que codifican enzimas glucolíticas
producidas en grandes cantidades, cuando se cultivan las levaduras
en medios ricos en glucosa. Las secuencias conocidas de genes
glucolíticos proporcionan además señales muy eficaces de control de
transcripción. La levadura proporciona ventajas sustanciales por el
hecho de que realiza también modificaciones de péptidos después de
la traducción. Existe un gran número de estrategias de DNA
recombinante que recurren a promotores fuertes y número elevado de
copias de plásmidos que pueden utilizarse para la producción de las
proteínas deseadas de la levadura. La levadura reconoce las
secuencias guía (leader) de productos de secuencia genética clonados
de mamíferos y secreta péptidos que llevan secuencias guía (es
decir, pre-péptidos). Para un hospedante mamífero se
disponen de varios sistemas de vectores para la expresión de la
AUR-1 y/o AUR-2.
Pueden emplearse un gran número de secuencias
reguladoras de la transcripción y de la traducción, en función de la
naturaleza del hospedante. Las señales reguladoras de la
transcripción y de la traducción pueden derivarse de fuentes
víricas, por ejemplo de un adenovirus, de
papilloma-virus bovino, de citomegalovirus, de virus
de simios o similares, en las que las señales reguladoras están
asociadas con una secuencia genética particular, que tiene un nivel
alto de expresión. Como alternativa pueden emplearse promotores de
productos de expresión de mamíferos, por ejemplo actina, colágeno,
miosina y similares. Pueden elegirse señales reguladoras de
iniciación de transcripción que permitan la represión o la
activación, de modo que pueda modularse la expresión de las
secuencias del gen. Son de interés las señales reguladoras que son
sensibles a la temperatura, de modo que variando la temperatura
puede reprimirse o iniciarse la expresión o que estén sometidas a
una regulación química (por ejemplo de un metabolito).
La expresión de la AUR-1 y/o
AUR-2 en hospedantes eucariotas requiere el uso de
regiones reguladoras eucariotas. Tales regiones incluyen en general
una región de promotor suficiente para dirigir la iniciación de la
síntesis del RNA. Los promotores eucariotas preferidos incluyen, por
ejemplo, el promotor de la secuencia del gen de la metalotioneína I
del ratón (Hamer y col., J. Mol. Appl. Gen. 1,
273-288, 1982); el promotor TK del herpes virus
(McKnight, Cell 31, 355-365, 1982); el promotor
precoz SV40 (Benoist y col., Nature (Londres) 290,
304-310, 1981); el promotor de secuencia del gen
ga14 de levadura (Johnston y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
79, 6971-6975, 1982; Silver y col., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 81, 5951-5955,
1984).
La traducción del mRNA eucariota se inicia en el
codón que codifica a la primera metionina. Por esta razón es
preferible asegurar que el engarce entre el promotor eucariota y una
secuencia de DNA que codifica a la AUR-1 y/o
AUR-2 (o un derivado funcional de las mismas) no
contenga ningún codón que intervenga, que sea capaz de codificar a
la metionina (es decir, AUG). La presente de tales codones provoca
la formación de una proteína de fusión (si el codón AUG está en el
mismo marco de lectura que la secuencia que codifica a la
AUR-1 y/o AUR-2) o una mutación de
desplazamiento de marco (si el codón AUG no está en el mismo marco
de lectura que la secuencia que codifica a la AUR-1
y/o AUR-2).
Una molécula de ácido nucleico de
AUR-1 y/o AUR-2 y un promotor unido
operativamente pueden introducirse en una célula receptora
procariota o eucariota, ya sea como molécula de DNA (o RNA) no
replicativa, que puede ser una molécula lineal o, con más
preferencia, una molécula circular covalente cerrada. Dado que tales
moléculas son incapaces de replicación autónoma, la expresión del
gen puede tener lugar por la expresión transitoria de la secuencia
introducida. Como alternativa, puede realizarse la expresión
permanente por integración de la secuencia de DNA introducida en el
cromosoma hospedante.
Puede emplearse un vector que sea capaz de
integrar las secuencias genéticas deseadas en el cromosoma de la
célula hospedante. Las células que integran de manera estable el DNA
introducido en sus cromosomas pueden seleccionarse también
introduciendo uno o varios marcadores que permitan la selección de
las células hospedantes que contienen el vector de expresión. El
marcador puede proporcionar la fototrofia a un hospedante
auxotrófico, resistencia a biocidas, p.ej. antibióticos o metales
pesados, por ejemplo cobre o similares. La secuencia del gen
marcador seleccionado puede unirse directamente a las secuencias de
gen de DNA que se quieren expresar o puede introducirse en la misma
célula por co-transfección. Pueden necesitarse
elementos adicionales para una síntesis óptima del mRNA de la
proteína de fijación de cadena simple. Estos elementos incluyen las
señales de empalme así como los promotores de transcripción,
amplificadores y señales de terminación. Los vectores de expresión
de cDNA que incorporan tales elementos incluyen los descritos por
Okayama, Molec. Cell. Biol. 3, 280, 1983.
La molécula de ácido nucleico introducida puede
incorporarse a un vector plásmido o vírico, capaz de replicación
autónoma en el hospedante receptor. A tal fin puede emplearse uno
cualquiera de un gran número de vectores. Los factores importantes
en el momento de elegir un vector plásmido o vírico particular
incluyen: la facilidad con que las células receptoras que contienen
el vector podrán ser reconocidas y seleccionadas por aquellas
células receptoras que no contienen el vector; el número de copias
del vector que se desean en un hospedante concreto; y si es
deseable que sea capaz de actuar de "lanzadera" (shuttle) del
vector entre las células hospedantes de diferentes especies.
Los vectores procariotas preferidos incluyen los
plásmidos tales que sean capaces de replicación en E. coli
(por ejemplo el pBR322, ColEl, pSC101, pACYC 184, nVX. Tales
plásmidos se describen por ejemplo en el manual de Sambrook (véase
"Molecular Cloning: A Laboratory Manual", segunda edición,
coordinadores: Sambrook, Fritsch & Maniatis, Cold Spring Harbor
Laboratory, 1989). Los plásmidos de bacilos incluyen el pC194,
pC221, pT127 y similares. Tales plásmidos se han publicado en
Gryczan (The Molecular Biology of the Bacilli, Academic Press, NY,
1982, pp. 307-329). Los plásmidos idóneos de
Streptomyces incluyen el plJ101 (Kendall y col., J.
Bacteriol. 169, 4177-4183, 1987) y los bacteriófagos
de Streptomyces, por ejemplo el \varphiC31 (Chater y col.,
Sixth International Symposium on Actinomycetales Biology, Adademiai
Kaido, Budapest, Hungría, 1986, pp. 45-54). Los
plásmidos de Pseudomonas se revisan en John y col. (Rev. Infect.
Dis. 8, 693-704, 1986) y en Izaki (Jpn. J.
Bacteriol. 33, 729-742, 1978).
Los plásmidos eucariotas preferidos incluyen, por
ejemplo, el BPV, la viruela, el SV40, el círculo de 2 micras y
similares, o sus derivados. Tales plásmidos son bien conocidos en la
técnica (Botstein y col., Miami Wntr. Symp. 19,
265-274, 1982; Broach, en: "The Molecular Biology
of the Yeast Saccharomyces: Life Cycle and Inheritance", Cold
Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, pp.
445-470, 1981; Broach, Cell 28,
203-204, 1982; Bollon y col., J. Clin. Hematol.
Oncol. 10, 39-48, 1980; Maniatis, en: Cell
Biology: A Comprehensive Treatise, vol. 3, Gene Sequence
Expression, Academic Press, NY, pp. 563-608,
1980).
Una vez se ha preparado para la expresión el
vector o la molécula de ácido nucleico que contiene el o los
constructos, el o los constructos de DNA pueden introducirse en una
célula hospedante apropiada por uno cualquiera de los muchos
disponibles, p.ej. transformación, transfección, conjugación, fusión
de protoplastos, electroporación, tecnología de disparo de
partículas, precipitación con fosfato cálcico, microinyección
directa y similares. Después de la introducción del vector, se
cultivan las células receptoras en un medio selectivo, que
selecciona el crecimiento de las células que contienen vector. La
expresión de la o de las moléculas del gen clonado da lugar a la
producción de la AUR-1 y/o la AUR-2
o de fragmentos de las mismas. Esto puede tener lugar en las células
transformadas de por sí o después de la inducción de estas células a
una diferenciación (por ejemplo mediante la administración de
bromodesoxicuracilo a las células del neuroblastoma o similares).
Puede utilizarse una gran variedad de condiciones de incubación para
formar el péptido de la presente invención. Las condiciones
preferidas son las condiciones que imitan las condiciones
fisiológicas.
Para obtener un péptido de la presente invención
puede utilizarse una gran variedad de metodologías ya conocidas de
la técnica. El péptido puede purificarse a partir de tejidos o de
células que producen el péptido de forma natural. Como alternativa,
los fragmentos de ácidos nucleico aislados recién descritos podrían
utilizarse para expresar la proteína UAR-1 y/o
AUR-2 en cualquier organismo. Las muestras de la
presente invención incluyen células, extractos de proteína o
extractos de membrana de células, o fluidos biológicos. La muestra
puede variar en base del formato del ensayo, el método de detección
y la naturaleza de los tejidos, células o extractos empleados como
muestra.
Como fuente de péptido de la invención puede
utilizarse cualquier organismo eucariota, en el supuesto de que el
organismo fuente contenga naturalmente tal péptido. Tal como se
emplea en esta descripción, el término "organismo fuente"
indica un organismo original, a partir del cual se deriva la
secuencia de aminoácidos de la subunidad, con independencia del
organismo del que y en el que en último término se expresa la
subunidad.
Un experto en la materia puede aplicar fácilmente
métodos conocidos para aislar proteínas con el fin de obtener el
péptido libre de contaminantes naturales. Estos incluyen, pero no se
limitan a: cromatografía de exclusión de tamaños, HPLC,
cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de
inmunoafinidad.
La presente invención se refiere a un anticuerpo
que tiene afinidad de fijación a un polipéptido
AUR-1 y/o AUR-2. El polipéptido
puede tener la secuencia de aminoácidos definida en la SEQ ID NO: 3
o SEQ ID NO: 4, o un derivado funcional de las mismas o por lo menos
9 aminoácidos contiguos de las mismas (con preferencia por lo menos
20, 30, 35 ó 40 aminoácidos contiguos de las mismas).
La presente invención se refiere a un anticuerpo
que tiene afinidad de fijación específica sobre un polipéptido
AUR-1 y/o AUR-2. Tal anticuerpo
puede aislarse comparando su afinidad de fijación a un polipéptido
AUR-1 y/o AUR-2 con la afinidad de
fijación que tiene a otro polipéptido. Los que se fijan
selectivamente sobre la AUR-1 y/o
AUR-2 se eligen para el uso en los métodos que
requieren la distinción entre la AUR-1 y/o la
AUR-2 y otros polipéptidos. Tales métodos incluyen,
pero no se limitan a: el análisis de la expresión alterada de la
AUR-1 y/o la AUR-2 en un tejido que
contenga otros polipéptidos.
Las proteínas AUR-1 y/o
AUR-2 de la presente invención pueden utilizarse en
una gran variedad de procedimientos y métodos, por ejemplo la
generación de anticuerpos, para el uso en identificar composiciones
farmacéuticas y para estudiar la interacción DNA/proteína.
Los péptidos AUR-1 y/o
AUR-2 de la presente invención pueden utilizarse
para producir anticuerpos o hibridomas. Un experto en la materia
reconocerá que si se desea un anticuerpo, tal péptido podrá
generarse del modo descrito en esta solicitud y emplearse como
inmunógeno. Los anticuerpos de la presente invención incluyen a los
anticuerpos monoclonales y a los policlonales, así como a fragmentos
de estos anticuerpos y formas humanizadas. Las formas humanizadas
de anticuerpos de la presente invención pueden generarse empleando
uno de los procedimientos ya conocidos de la técnica, por ejemplo la
quimerización o el injerto por CDR. La presente invención se refiere
además a un hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal recién
descrito o un fragmento de fijación del mismo. Un hibridoma es una
línea celular inmortalizada que es capaz de secretar un anticuerpo
monoclonal
específico.
específico.
En general, las técnicas para la preparación de
anticuerpos monoclonales e hibridomas son bien conocidas en genética
(Campbell, "Monoclonal Antibody Technology: Laboratory Techniques
in Biochemistry and Molecular Biology", Elsevier Science
Publishers, Amsterdam, Holanda, 1984; St. Groth y col., J. Immunol.
Methods 31, 1-21, 1980). Cualquier animal
(ratón, conejo y similares), del que se sabe que produce
anticuerpos, podrá inmunizarse con el polipéptido seleccionado. Los
métodos para la inmunización son bien conocidos en la técnica. Tales
métodos incluyen la inyección subcutánea o intraperitoneal del
polipéptido. Un experto en la material podrá reconocer que la
cantidad de polipéptido utilizada para la inmunización puede variar
en base al animal que se pretende inmunizar, la antigenicidad del
polipéptido y el sitio de la inyección.
El polipéptido puede modificarse o administrarse
en un adyuvante con el fin de aumentar la antigenicidad del péptido.
Los métodos para incrementar la antigenicidad de un polipéptido son
bien conocidos en la técnica. Tales procedimientos incluyen la
adición del antígeno sobre una proteína heteróloga (por ejemplo la
globulina o la \beta-galactosidasa) o por
inclusión de un adyuvante durante la inmunización.
Para los anticuerpos monoclonales, se extraen
células del bazo de animales inmunizados, se fusionan con células de
mieloma, por ejemplo células de mieloma SP2/2-Agl4,
y se deja que se conviertan en células de hibridoma que producen
anticuerpos monoclonales. Uno cualquier de los muchos métodos bien
conocidos de la técnica podrá utilizarse para identificar la célula
de hibridoma que produce un anticuerpo la célula de hibridoma que
produce un anticuerpo de características deseadas. Estos incluyen la
exploración de hibridomas con un ensayo ELISA, análisis "western
blot" o radioinmunoensayo (Lutz y col., Exp. Cell Res.
175, 109-124, 1988). Se clonan los hibridomas
que secretan los anticuerpos deseados y se determina el grupo y
subgrupo empleando procedimientos ya conocidos de la técnica
(Campbell, "Monoclonal Antibody Technology: Laboratory Techniques
in Biochemistry and Molecular Biology", lugar citado, 1984).
Para el caso de anticuerpos policlonales, se
aíslan anticuerpos que contienen anticuerpos a partir de un animal
inmunizado y se exploran para determinar la presencia de anticuerpos
de la especificidad deseada empleando uno de los procedimientos
mencionados anteriormente. Los anticuerpos descritos antes pueden
marcarse de forma detectable. Los anticuerpos pueden marcarse de
forma detectable con el uso de radioisótopos, marcadores de afinidad
(por ejemplo biotina, avidina y similares), marcadores enzimáticos
(por ejemplo peroxidasa de rábano rusticano, fosfatasa alcalina y
similares), marcadores fluorescentes (por ejemplo el FITC o la
rodamina y similares), átomos paramagnéticos y similares. Los
procedimientos para realizar tal marcado son bien conocidos en la
técnica, véase por ejemplo (Stemberger y col., J. Histochem.
Cytochem. 18, 315, 1970; Bayer y col., Meth. Enzym.
62, 308, 1979; Engval y col., Immunot. 109, 129, 1972;
Goding, J. Immunol. Meth. 13, 215, 1976). Los anticuerpos
marcados de la presente invención pueden utilizarse para ensayos
"in vitro", "in vivo" e "in
situ" para identificar células o tejidos que expresan un
péptido específico.
Los anticuerpos recién descritos pueden
inmovilizarse también en un soporte sólido. Los ejemplos de tales
soportes sólidos incluyen los plásticos, por ejemplo el
policarbonato, los hidratos de carbono complejos, por ejemplo la
agarosa y la Sepharose, las resinas acrílicas, por ejemplo la
poliacrilamida, y las bolas de látex. Las técnicas para fijar
anticuerpos sobre dichos soportes sólidos ya son conocidas en la
técnica (Weir y col., "Handbook of Experimental Immunology", 4ª
ed., Blackwell Scientific Publications, Oxford, Inglaterra, 1986,
capítulo 10; Jacoby y col., Meth. Enzym. 34, Academic Press, N.Y.,
1974). Los anticuerpos inmovilizados de la presente invención pueden
utilizarse en ensayos "in vitro", "in vivo"
e "in situ" así como en inmunocromatografía.
Además, un experto en la materia puede adaptar
fácilmente los procedimientos actualmente disponibles así como las
técnicas, métodos y kits publicados en párrafos anteriores relativos
a anticuerpos, para generar péptidos capaces de fijar una secuencia
específica de péptido con el fin de generar péptidos de antipéptido
diseñados racionalmente, véase por ejemplo Hurby y col.,
"Application of Synthetic Peptides: Antisense Peptides", en
Synthetic Peptides, A User's Guide, W.H. Freeman, NY, pp.
289-307, 1992; y Kaspczak y col., Biochemistry
28, 2930-8, 1989.
Los péptidos anti-péptido pueden
generarse reemplazando los restos aminoácido básicos que se hallan
en la secuencia de péptido de la AUR-1 y/o
AUR-2 por restos ácidos, pero conservando los grupos
hidrófobos y los polares no cargados. Por ejemplo, los restos
lisina, arginina y/o histidina se reemplazan por restos ácido
aspártico o ácido glutámico y los restos ácidos glutámico se
reemplazan por lisina, arginina o histidina.
La presente invención abarca un método para la
detección de un polipéptido AUR-1 y/o
AUR-2 en una muestra, que consiste en: (a) poner en
contacto la muestra con un anticuerpo descrito antes, en condiciones
tales que se formen inmunocomplejos y (b) detectar la presencia de
dicho anticuerpo fijado sobre el polipéptido. En detalle, los
métodos consisten en incubar una muestra a analizar con uno o varios
anticuerpos de la presente invención y ensayar si el anticuerpo se
fija sobre la muestra. Los niveles alterados de
AUR-1 y/o AUR2 en una muestra, si se comparan con
los niveles normales, pueden indicar la existencia de una
enfermedad.
Las condiciones para incubar un anticuerpo con
una muestra a analizar son variables. Las condiciones de incubación
dependen del formato empleado en el ensayo, los métodos de detección
empleados y el tipo y la naturaleza del anticuerpo empleado en el
ensayo. Un experto en la materia sabrá reconocer que uno cualquiera
de los formados de ensayo inmunológico habitualmente disponibles
(por ejemplo los radioinmunoensayos, los ensayos inmunoabsorbentes
de fijación sobre enzimas, Ouchterlony basado en la difusión o
ensayos de cohete inmunofluorescente) pueden adaptarse fácilmente
para que puedan emplearse los anticuerpos de la presente invención.
Los ejemplos de tales ensayos se pueden encontrar en Chard, "An
Introduction to Radioimmunoassays and Related Techniques",
Elsevier Science Publishers, Amsterdam, Holanda, 1986; Bullock y
col., "Techniques in Imunocitochemistry", Academic Press,
Orlando, FL, vol. 1 (1982), vol. 2 (1983), vol. 3 (1985); Tijssen,
"Practice and Theory of Enzyme Immunoassays: Laboratory Techniques
in Biochemistry and Molecular Biology", Elsevier Science
Publishers, Amsterdam, Holanda, 1985.
Las muestras a analizar mediante ensayos
inmunológicos de la presente invención incluyen células, proteínas o
extractos de membrana de células o líquidos biológicos, por ejemplo
sangre, suero, plasma u orina. La muestra a analizar utilizada en el
método recién mencionado puede variar en función del formato de
ensayo, la naturaleza del método de detección y los tejidos, células
o extractos empleados como muestra a analizar. Los métodos para
preparar los extractos de proteínas o los extractos de membrana de
células son bien conocidos en la técnica y pueden adaptarse
fácilmente con el fin de obtener una muestra que sea susceptible de
análisis con el sistema empleado.
Un kit contiene todos los reactivos necesarios
para llevar a cabo los métodos de detección mencionados antes. El
kit puede contener: (i) un primer recipiente que contenga un
anticuerpo ya descrito antes e (ii) un segundo recipiente que
contenga un conjugado compuesto por un reactivo de fijación del
anticuerpo y un marcador. En otra forma preferida de ejecución, el
kit contiene además uno o varios recipientes más que contienen uno o
varios de los siguientes: reactivos de lavado y reactivos capaces de
detectar la presencia de anticuerpos fijados.
Los ejemplos de reactivos de detección incluyen,
pero no se limitan a: anticuerpos secundarios marcados, o como
alternativa, si el anticuerpo primario está marcado, los reactivos
cromóforos, enzimáticos o de fijación de anticuerpo que sean capaces
de reaccionar con el anticuerpo marcado. El kit dividido en
compartimentos puede ser como los kits descritos antes para sondas
de ácido nucleico. Un experto en la materia reconocerá fácilmente
que los anticuerpos descritos en la presente invención pueden
incorporarse fácilmente a uno de los formados establecidos de kit,
que son bien conocidos en la técnica.
La presente invención se refiere además a un
método para detectar un compuesto capaz de fijarse sobre un
polipéptido AUR-1 y/o AUR-2, que
consiste en incubar el compuesto con la AUR-1 y/o
AUR-2 y detectar la presencia del compuesto fijado
sobre la AUR-1 y/o la AUR-2. El
compuesto puede estar presente dentro de una mezcla compleja, por
ejemplo suero, fluido sanguíneo o extractos celulares.
La presente invención se refiere además a un
método para detectar un agonista o antagonista de la actividad de la
AUR-1 y/o AUR-2 o de la actividad de
un reactivo de fijación de la AUR-1 y/o
AUR-2 que consiste en incubar las células que
producen la AUR-1 y/o la AUR-2 en
presencia de un compuesto y detectar los cambios en el nivel de
actividad de la AUR-1 y/o AUR-2 o de
actividad del reactivo de fijación de la AUR-1 y/o
AUR-2. Los compuestos así identificados producirán
un cambio en la actividad, lo cual indica la presencia del
compuesto. El compuesto puede estar presente dentro de una mezcla
compleja, por ejemplo suero, líquidos corporales o extractos
celulares. Una vez se ha identificado el compuesto, este podrá
aislarse empleando métodos bien conocidos de la técnica.
La presente invención abarca además un método
para fomentar (estimular) o contrarrestar (antagonizar) la actividad
asociada con la AUR-1 y/o AUR-2 en
un mamífero, que consiste en administrar a dicho mamífero un
agonista o un antagonista de la AUR-1 y/o
AUR-2 en una cantidad suficiente para efectuar dicho
estímulo o antagonismo. La presente invención contempla además un
método para tratar enfermedades de un mamífero con un agonista o con
un antagonista de la actividad de la AUR-1 y/o
AUR-2 consiste en administrar el agonista o el
antagonista al mamífero en una cantidad suficiente para fomentar o
contrarrestar las funciones asociadas a las AUR-1
y/o AUR-2.
Una gran variedad de métodos están disponibles
para la producción de animales transgénicos asociados con esta
invención. El DNA puede inyectarse dentro del pronúcleo de un huevo
fecundado antes de la fusión de los pronúcleos de macho y hembra o
inyectarse en el núcleo de una célula embriónica (p.ej. el núcleo de
un embrión de dos células) después de la iniciación de la división
celular (Brinster y col., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82,
4438-4442, 1985). Los embriones pueden infectarse
con virus, en especial con retrovirus, modificados para que lleven
secuencias de nucleótidos receptores de iones inorgánicos de la
invención.
Los células germinales pluripotentes derivadas de
la masa celular interior del embrión y estabilizadas en cultivo
pueden manipularse en el cultivo para que incorporen secuencias de
nucleótidos de la invención. Un animal transgénico puede producirse
a partir de tales células por implantación en un blastocisto que
está implantado en una madre adoptiva y dejar que llegue a término.
Los animales idóneos para ensayos transgénicos se obtienen de
proveedores comerciales estándar, por ejemplo Charles River
(Wilmington, MA), Taconic (Germantown, NY), Harlan Sprague Dawley
(Indianapolis, IN), etc.
Los procedimientos de manipulación de un embrión
de roedor y para la microinyección de DNA en el pronúcleo de un
cigoto son bien conocidos de los expertos en la materia (Hogan y
col., lugar citado). Los procedimientos de microinyección en peces,
huevos de anfibios y aves se describen con detalle en Houdebine y
Chourrout, Experientia 47, 897-905, 1991.
Otros procedimientos para la introducción de DNA en tejidos de
animales se describen en la patente US-4 945 050
(Sandford y col., 30 de julio de 1990).
A título meramente ilustrativo, para preparar un
ratón transgénico se inducen la superovulación de las hembras de
ratón. Se colocan las hembras junto a los machos y las hembras
fecundadas se sacrifican por asfixia con CO_{2} o por dislocación
cervical y se recuperan los embriones de los oviductos extirpados.
Se extraen las células cúmulo adyacentes. Después se lavan los
embriones pronucleares y se almacenan hasta el momento de la
inyección. Se aparean hembras de ratón adulto de ciclo aleatorio con
machos vasectomizados. Las hembras receptoras se fecundan al mismo
tiempo como hembras dadoras. A continuación se realiza la
transferencia quirúrgica de los embriones. El procedimiento para
generar ratas transgénicas es similar al de los ratones, véase
Hammer y col., Cell 63, 1099-1112, 1990.
Los métodos para cultiva células germinales
embrionarias (ES) y la posterior producción de animales transgénicos
por introducción de DNA en las células ES empleando métodos tales
como la electroporación, la precipitación de DNA con fosfato cálcico
y la inyección directa son bien conocidas de los expertos en la
materia, véase por ejemplo "Teratocarcinomas and Embryonic Stem
Cells, A Practical Approach", de E.J. Robertson, coordinador, IRL
Press, 1987.
En los casos, en los que se realiza una
integración genética aleatoria, un clon que contiene la o las
secuencias de la invención se cotransfecta con un gen que codifica
resistencia. Como alternativa, el gen que codifica la resistencia a
la neomicina se fija físicamente sobre la o las secuencias de la
invención. La transfección y el aislamiento de los clones deseados
se llevan a cabo por cualquiera de los diversos métodos bien
conocidos de los expertos en la materia (E.J. Robertson, lugar
citado).
Las moléculas de DNA introducidas en células ES
pueden integrarse también en el cromosoma por un proceso de
recombinación homóloga, ver Capecchi, Science 244,
1288-1292, 1989. Ya se han descrito métodos para la
selección positiva del acontecimiento de recombinación (es decir, la
neorresistencia) y la sección dual positivo-negativo
(es decir, la neorresistencia y la resistencia al gancyclovir) y la
posterior identificación de los clones deseados por PCR, véase
Capecchi, lugar citado, y Joyner y col., Nature 338,
153-156, 1989, cuyas enseñanzas se incorporan a la
presente solicitud. La fase final del procedimiento consiste en
inyectar células ES diana a los blastocistos y transferir los
blastocistos a hembras pseudopreñadas. Los animales quiméricos
resultantes se nutren y se analizan los descendientes por
"Southern blotting" para identificar los individuos que llevan
los transgenes. Otros autores han debatido los procedimientos para
la producción de mamíferos no roedores y otros animales, véase
Houdebine y Chourrout, lugar citado; Pursel y col., Science
244, 1281-1288, 1989; y Simms y col.,
Bio/Technology 6, 179-183, 1988.
Por lo tanto, la invención proporciona mamíferos
transgénicos no humanos que llevan un transgén que codifica a un
polipéptido AUR-1 y/o AUR-2 o un gen
que efectúa la expresión de un polipéptido AUR-1 y/o
AUR-2. Tales mamíferos transgénicos no humanos son
útiles en particular como sistema de ensayo "in vivo"
para estudiar los efectos de la introducción de un polipéptido
AUR-1 y/o AUR-2, para regular la
expresión de polipéptido AUR-1 y/o
AUR-2 (es decir, por introducción de genes
adicionales, ácidos nucleicos antisentido o ribozimas).
Un "animal transgénico" es un animal que
tiene células que contienen DNA que se ha insertado artificialmente
en la célula, dicho DNA se convierte en parte del genoma del animal,
que se desarrolla a partir de tal célula. Los animales transgénicos
preferidos son los primates, ratones, ratas, vacas, cerdos,
caballos, cabras, ovejas, perros y gatos. El DNA transgénico puede
codificar a un polipéptido AUR-1 y/o
AUR-2 humano. La expresión nativa en un animal puede
reducirse proporcionando una cantidad de RNA antisentido o DNA, que
sea eficaz para reducir la expresión del receptor.
La AUR-1 y/o
AUR-2 o sus secuencias genéticas serán útiles además
en la terapia genética (revisión en Miller, Nature 357,
455-460, 1992). Miller constata que se han
registrado avances en las estrategias prácticas de terapia genética
humana que confirman los resultados positivos iniciales. La ciencia
básica de la terapia genética se describe en Mulligan, Science
260, 926-931, 1993.
En una forma preferida de ejecución se inserta un
vector de expresión que contienen la secuencia que codifica a la
AUR-1 y/o AUR-2 en células, se
cultivan las células "in vitro" y después se infunden en
gran cantidad en los pacientes. En otra forma preferida de ejecución
se transfiere un segmento de DNA que contiene un promotor a elegir
(por ejemplo un promotor fuerte) a células que contienen la
AUR-1 y/o AUR-2 endógena, de tal
manera que el segmento del promotor incremente la expresión del gen
de la AUR-1 y/o AUR-2 endógena (por
ejemplo, el segmento del promotor se transfiere a la célula de modo
que quede unida directamente al gen de la AUR-1 y/o
AUR-2 endógena).
La terapia genética puede incluir el uso de un
adenovirus que contenga el cDNA de la AUR-1 y/o
AUR-2 dirigido a un tumor, un aumento de la
AUR-1 y/o AUR-2 por implantación de
células de ingeniería genética, la inyección con virus de
AUR-1 y/o AUR-2 o la inyección de
AUR-1 y/o AUR-2 desnuda a tejidos
apropiados.
Las poblaciones de células diana pueden
modificarse por introducción de formas alteradas de uno o de varios
componentes de los complejos de proteína con el fin de modular la
actividad de tales complejos. Por ejemplo, reduciendo o inhibiendo
la actividad de un componente del complejo dentro de las células
diana puede reducirse, inhibirse o invertirse un acontecimiento
anormal de transducción de señales que conduzca a un estado
patológico. La deleción o los mutantes de sentido erróneo de un
componente, que conservan la capacidad de interaccionar con otros
componentes de los complejos de proteínas, pero no pueden funcionar
en la transducción de señales, pueden utilizarse para inhibir un
acontecimiento anormal o nocivo de transducción de señales.
Los vectores de expresión derivados de virus,
tales como retrovirus, virus de viruela, adenovirus, adenovirus
asociados, herpes virus, diversos virus de RNA o virus del papilloma
bovino, pueden utilizarse para el transporte de secuencias de
nucleótidos (p.ej. cDNA) que codifican a la proteína
AUR-1 y/o AUR-2 recombinante hasta
la población de células diana (p.ej. células tumorales). Los
métodos, que son bien conocidos de los expertos en la materia,
pueden utilizarse para construir vectores víricos recombinantes que
contengan secuencias codificadoras, véase por ejemplo las técnicas
descritas por Maniatis y col., Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. 1989 y por Ausubel y
col., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing
Associates y Wiley Interscience, N.Y. 1989. Como alternativa, las
moléculas de ácido nucleico recombinantes, que codifican a
secuencias de proteínas, pueden utilizarse como DNA desnudo o en
sistemas reconstituidos, p.ej. liposomas u otros sistemas de lípidos
para el transporte de células diana (véase p.ej. Felgner y col.,
Nature 337, 387-8, 1989). Existen diversos
métodos más para la transferencia directa de DNA plásmido a células
que pueden utilizarse en la terapia genética humana y consiste en
dirigir el DNA a receptores de las células mediante el complejado de
DNA plásmido en proteínas, véase Miller, lugar citado.
En su forma más simple, la transferencia genética
puede realizarse por simple inyección de cantidades minúsculas de
DNA en el núcleo de una célula, mediante un proceso de
microinyección, véase Capecchi, M.R., Cell 22,
479-88, 1980. Una vez se han introducido los genes
recombinantes en la célula, pueden reconocerse por los mecanismos
normales de las células de transcripción y traducción y se expresará
un producto genético. Existen otros métodos que también se han
probado para introducir DNA en un gran número de células. Estos
métodos incluyen: la transfección, en la que se precipita el DNA con
CaPO_{4} y se recoge en las células por pinocitosis (Chen, C. y
Okayama, H., Mol. Cell Biol. 7, 2745-52,
1987), electroporación, en la que se exponen las células a pulsos de
voltaje elevado para introducir orificios en la membrana (Chu. G. y
col., Nucleic Acid Res. 15, 1311-26, 1987);
lipofección/fusión de liposomas, en la que el DNA se empaqueta en
vesículas lipófilas, que se fusionan con la célula diana (Felgner,
P.L. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84,
7413-7, 1987); y bombardeo de partículas, empleando
el DNA fijado sobre pequeños proyectiles (Yang, N.S. y col., Proc.
Natl. Acad. Sci. 87, 9568-72, 1990). Otro
método para la introducción de DNA en células consiste en unir el
DNA a proteínas modificadas químicamente.
Se ha puesto de manifiesto además que las
proteínas de adenovirus son capaces de desestabilizar los endosomas
y aumentar la absorción de DNA en las células. La adición de
adenovirus a soluciones que contienen complejos de DNA o la fijación
del DNA a polilisina unida con enlace covalente a adenovirus
empleando agentes de reticulación de proteínas mejora
sustancialmente la absorción y expresión del gen recombinante,
Curiel, D.T. y col., Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 6,
247-52, 1992.
Tal como se emplea aquí, "transferencia
genética" significa el proceso de introducir una molécula de
ácido nucleico ajeno en una célula. La transferencia genética se
realiza habitualmente para permitir la expresión de un producto
concreto, codificado por el gen. El producto puede incluir una
proteína, un polipéptido, un DNA o RNA antisentido o un RNA activo
en sentido enzimático. La transferencia genética puede realizarse a
células cultivadas o por administración directa a animales. La
transferencia genética supone en general un proceso de contacto del
ácido nucleico con una célula diana mediante interacciones no
específicas o mediadas por un receptor, la absorción del ácido
nucleico en la célula a través de la membrana o por endocitosis y la
liberación del ácido nucleico en el citoplasma de la membrana
plasmática o endosoma. La expresión puede requerir, además, el
movimiento del ácido nucleico hacia el núcleo de la célula y la
fijación sobre factores nucleares apropiados para la
transcripción.
Tal como se emplea aquí, "terapia genética"
es una forma de transferencia genética y está incluida en la
definición de transferencia genética empleada aquí y se refiere
específicamente a la transferencia genética para expresar un
producto terapéutico de una célula "in vivo" o "in
vitro". La transferencia genética puede realizarse "ex
vivo" en células que después se trasplantan a un paciente, o
puede realizarse por administración directa del ácido nucleico o del
complejo de proteínas del ácido nucleico a un paciente.
En otra forma preferida de ejecución se
proporciona un vector que tiene secuencias de ácido nucleico que
codifican a la AUR-1 y/o AUR-2,
dicha secuencia de ácido nucleico se expresa únicamente en tejidos
específicos. Los métodos para realizar la expresión genética
específica de tejido se describen en la publicación internacional WO
93/09236, depositada con fecha 3 de noviembre de 1992 y publicada
con fecha 13 de mayo de 1993.
En todos los vectores precedentes descritos
antes, otro aspecto de la invención es que la secuencia de ácido
nucleico contenida en el vector puede incluir adiciones, deleciones
o modificaciones de una parte o de toda la secuencia del ácido
nucleico, definido antes.
En otra forma preferida de ejecución se define un
método de reemplazo de genes. Tal como se emplea aquí, el término
"reemplazo de genes" indica el suministro de una secuencia de
ácido nucleico que es capaz de expresarse "in vivo" en
un animal y de este modo proporcionar o aumentar la función de un
gen endógeno, que está ausente o deficiente en el animal.
Los ejemplos que siguen no son limitantes, sino
que son meramente ilustrativos de varios aspectos y características
de la presente invención. Los siguientes ejemplos describen el
aislamiento y la caracterización de las nuevas proteínas
AUR-1 y AUR-2.
Las proteína-quinasas son uno de
los grupos más numerosos de proteínas eucariotas, con varios
centenares de miembros conocidos. Estas proteínas comparten un
dominio de 250-300 aminoácidos, que puede
subdividirse en 12 subdominios distintos, que abarcan la estructura
nuclear catalítica común. Estos motivos proteicos conservados se han
explotado recientemente empleando estrategias de clonación basadas
en la PCR, que conduce a una expansión significativa de la quinasas
conocidas. El alineamiento múltiple de las secuencias del dominio
catalítico permite su segregación en un árbol filogenético. De este
modo, las quinasas afines se reúnen en distintas ramas o subgrupos,
que incluyen: las tirosina-quinasas, la quinasas
dependientes de nucleótidos cíclicos, las quinasas de
calcio/calmodulina, las quinasas dependientes de ciclina y las
MAP-quinasas, así como otros subgrupos menos
definidos.
Inicialmente hemos empezado a identificar
homólogos del CCK4, un receptor que representa un grupo distinto de
tirosina-quinasas. Los alineamientos múltiples
sugieren que el CCK4 es muy afín con el ROS y el grupo TRK de las
tirosina-quinasas de receptor. Hemos diseñado
cebadores degenerados para secuencias conservadas dentro de los
subdominios I y IX de quinasa de estos receptores. El subdominio I
está en el extremo N del dominio de quinasa y contiene el motivo de
consenso GXGXXGXV que interviene en el anclaje del ATP sobre la
unidad catalítica de todas las clases de quinasas. El subdominio IX
contiene un Asp casi invariable que actúa estabilizando el bucle
catalítico y uniendo los restos del subdominio VIB. Este Asp
invariable y los aminoácidos que lo flanquean se utilizan a menudo
en las estrategias de clonación por PCR, ya que distingue las
tirosina-quinasas (DVWSY/FGI/V) de las
serina/treonina-quinasas (DXWA/SXGI/V). Basándonos
en la comparación de todas las proteína-quinasas
conocidas, hemos diseñado cebadores oligonucleótidos degenerados
para los subdominios I y IX que recogerían únicamente el CCK4 y su
homólogo KLG de pollo por PCR.
Hemos diseñado cebadores degenerados, el A y el
DVW, basados en restos conservados dentro del dominio de quinasa del
CCK4, que pueden utilizarse para identificar nuevas quinasas
empleando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Cuando se
aplica a la célula HEPM el sscDNA como molde se aíslan múltiples
copias del CCK4 así como un nuevo fragmento de DNA
(43-43) de 567 bp con homología con otras quinasas.
La nueva secuencia es muy similar a la
Aurora-quinasa de la Drosophila (Genebank
número de registro #X83465) y el clon se denomina Aurora1 humana.
Utilizando este fragmento como sonda hemos explorado los RNA de un
gran número de líneas celulares de cáncer de colon y un "Northern
blot" de tejido múltiple humano, demostrando una aparente
selectividad de expresión de la Aurora1 en células tumorales.
La sonda Aurora1 se utiliza también para explorar
una biblioteca de cDNA construida a partir de mRNA de línea celular
de cáncer de páncreas humano para aislar los clones que se solapan,
abarcando el marco abierto completo de lectura de la Aurora1. De los
múltiples clones aislados, siete corresponden a la Aurora1 humana.
Se aíslan además otros dos clones, que se hibridan débilmente,
durante la exploración y el análisis de secuencia revela que
corresponden a una quinasa afín, aunque distinta, que hemos
denominado Aurora2 humana.
La AURORA1 y AURORA2 recombinantes expresadas en
células COS migran con Mr aparente de 39.000 y 46.000, consistente
con sus pesos moleculares previstos de 39.264 y 46.730, basados en
su secuencia primaria de aminoácidos. Este análisis confirma que la
proteína recombinante puede producirse de forma estable en células
de mamíferos. Están en marcha ensayos de fosforilación para
determinar la especificidad de diana de estas supuestas
quinasas.
Los inmunorreactivos específicos se generan en
conejos contra la secuencia de péptido a partir de los dominios
N-terminales de AUR1 y AUR2, estos reactivos tienen
que localizar la expresión de Auroras endógenas y recombinantes
dentro de las células. Además, estos reactivos pueden utilizarse en
el empeño por identificar sustratos para las Auroras con el fin de
comprender mejor su rol biológico normal.
Las formas negativas dominantes y
constitutivamente activas de la AUR1 y AUR2 serán útiles para
delinear consecuencias biológicas de reducción (oblation) o de
sobreexpresión de estas supuestas
serina/treonina-quinasas. Los estudios iniciales con
constructos de DNA alterados demuestran que en apenas 2 horas
después de la infección de las células de NIH3T3 o BALB/3T3 con los
materiales retrovíricos AUR1 o AUR2, las células se convierten en
multinucleadas. Este fenotipo persiste de modo que 2 días después de
la infección se observa que algunas células tienen hasta 20 núcleos.
Las células multinucleadas tienen como es lógico un citoplasma mayor
y límites celulares difusos. La inmunotinción con actina y DAPI
confirma que estos núcleos están contenidos todos ellos dentro de
una sola célula y que el citoesqueleto de activa es aparentemente
normal. Los experimentos en curso se dirigen a esclarecer el
contenido cromosómico y la integridad dentro del núcleo, el número y
ubicación de los cromosomas y la organización general de la red del
microtúbulo.
La caracterización de las consecuencias a largo
plazo de la expresión de la AUR1 o AUR2 normal, constitutivamente
activa y negativamente dominante está en marcha y se estudia en
particular si inducen o invierten la transformación celular. Se
están aislando clones estables que expresan estas proteínas
recombinantes. Se caracterizarán por su velocidad de crecimiento,
síntesis de DNA, inhibición de contacto celular (formación de
"foci"), crecimiento independiente del anclaje (ensayos en agar
blando) y tumorigenicidad en ratones desnudos (= sin pelo).
¿Qué papel desempeñan las Auroras en la
replicación y segregación centrosómica en mamíferos? La disrupción o
desregulación de tales funciones se sabe que provocan una mala
agregación de cromosomas, husos (spindles) monopolares y división
nuclear asimétrica en la levadura, la Drosophila y los
anfibios. La homología entre las Auroras humanas, la levadura IPL1 y
la Aurora de la Drosophila es sorprendente. Por ello hemos
deseado evaluar si las Auroras humanas son equivalentes funcionales
de la levadura IPL1. El gen de la levadura IPL1 se requiere para la
segregación cromosómica de alta fidelidad en el Saccharomyces
cerevisiae (Francisco, L. y col., Mol. Cell. Biol. 14,
4731-4740, 1994) y se ha aislado un mutante sensible
a la temperatura. Hemos planificado determinar si varias versiones
de longitud completa y quiméricas de las Auroras humanas pueden
complementar este mutante sensible a la temperatura en la levadura.
Los constructos quiméricos que contienen el dominio
N-terminal de la IPL1 y el dominio quinasa de las
Auroras humanas nos permitirán determinar si la quinasa es
funcionalmente equivalente, evitando los potenciales roles regulador
o de localización intracelular, mediados por dominios
N-terminales peor conservados. Si los genes humanos
compensan la pérdida de función de la IPL1, entonces podríamos
utilizar esta línea para explorar los inhibidores de molécula
pequeña de la Aurora-quinasa humana.
Ejemplo
1
Se aíslan RNA totales empleando el protocolo de
extracción con sales de guanidina/fenol de Chomczynski y Sacchi (P.
Chomczynski y N. Sacchi, Anal. Biochem. 162, 156, 1987) a
partir de células humanas normales de próstata, duodeno, ovarios,
hígado, pituitaria, cerebro, timo y glándulas salivales, de células
HEMP humanas (mesénquima palatal), de tumor de Wilms primario humano
y de carcinoma de ovarios y de líneas celulares tumorales humanas
originadas en el colon/recto (HT29, SW480, SW1463, SW1417, SW837,
SW948, SW620, SW403, SW1116, T84, HTC15, LS123 y
Caco-2), riñón (CaKi-1,
CaKi-2), hígado
(SK-HEP-1), páncreas (HS766T, ASPC,
Capan-1) y mama (MCF7).
Estos RNA se utilizan como molde para generar
cDNA de hebra simple empleando el kit llamado Superscript
Preamplification System for First Strand Synthesis kit, suministrado
por Gibco BRL (Life Technologies, EE.UU; Gerard, G.F. y col., FOCUS
11, 66, 1989) en las condiciones recomendadas por el
fabricante. Una reacción típica emplea 10 \mug de RNA total o 2
\mug de poly(A)* RNA, con 1,5 \mug de
oligo(dT)_{12-18} en un volumen de
reacción de 60 \mul. El producto se trata con RNasa H y se diluye
con 100 \mul de H_{2}O. Para la siguiente amplificación por PCR
se emplean en cada reacción 1-4 \mul de estos
sscDNA.
Los oligonucleótidos se sintetizan en un
sintetizador del tipo Applied Biosystems 394 DNA Synthetizer
utilizando la química ya establecida de las fosforamiditas y después
de la precipitación en etanol se utilizan sin purificar. Los
cebadores de oligonucleótidos degenerados son:
- A = 5'-GARTTYGGNGARGTNTTYYTNGC-3'(SEQ ID NO: 16) (sentido) y
- DVW: 5'-AGNACNCCRAANGCCCACACRTC-3'(SEQ ID NO: 17) (antisentido).
Estos cebadores derivan de las secuencias de
péptido EFGEVFLA (SEQ ID NO: 18) (hebra sentido del subdominio I de
quinasa) y DVW(A/S)FGVL (hebra antisentido del
subdominio IX de quinasa), respectivamente. Las denominaciones de
restos de nucleótidos degenerados son: N = A, C, G o T; R = A o G; e
Y = C o T. Utilizando el CCK4 como molde, estos cebadores producen
un producto de 567 bp.
Se lleva a cabo una reacción PCR empleando los
cebadores A y DVW aplicados a las fuentes de hebras simples recién
descritas. Los cebadores se añaden en una concentración final de 5
\muM a una mezcla que contiene Tris-HCl 10 mM (pH
8,3), KCl 50 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, 200 \muM de cada trifosfato de
desoxinucleósido, un 0,001% de gelatina y 1,5 U de
DNA-polimerasa AmpliTaq
(Perkin-Elmer/Cetus) y 1-4 \mul de
cDNA. Después de una desnaturalización a 95ºC durante 3 min, las
condiciones del ciclo son 94ºC durante 30 s, 37ºC durante 1 min, una
rampa de 2 min hasta 72ºC y a 72ºC durante 1 min para los 3
primeros ciclos, después siguen 94ºC durante 30 s, 50ºC durante 1
min y 72ºC durante 1 min 45 s para otros 35 ciclos. Se aíslan los
fragmentos de la PCR que migran entre 500-600 bp a
través de geles de agarosa del 2% empleando GeneClean (Bio101) y
T-A clonado en el vector pCRII (Invitrogen Corp.,
EE.UU.) con arreglo a las instrucciones del fabricante.
Las colonias se seleccionan para preparaciones de
DNA mini-plásmido empleando columnas Qiagen y los
DNA plásmidos se secuencian empleando un kit terminador de colorante
para secuenciación en ciclos con DNA-polimerasa
AmpliTaq, FS (ABI, Foster City, CA). Los productos de la reacción de
secuenciación se obtienen en un aparato del tipo ABI Prism 377 DNA
Sequencer y se analizan aplicando el algoritmo de alineamiento BLAST
(Altschul, S.F. y col., J. Mol. Biol. 215,
403-10). Se aísla un nuevo clon
(#43-43) por PCR con los cebadores A y DVW
utilizando como molde un cDNA de hebra simple de mesénquima palatal
embrionario humano (HEPM o CRL1486). A continuación se denomina este
clon un fragmento de la Aurora1 humana.
Se construye una biblioteca de cDNA
lambda-ZapII (Stratagene Cloning Systems, La Jolla,
CA) empleando como molde para la síntesis de la primera hebra del
cDNA un mRNA de un banco (pool) de líneas celulares de carcinoma de
páncreas. Se exploran los fagos en filtros de nitrocelulosa con un
inserto marcado con P^{33} y cebado aleatoriamente a partir del
p43-43 que codifica a la Aurora1 humana a 2x10^{6}
cpm/ml en tampón de hibridación que contiene 6xSSC, 1x reactivo de
Denhardt, 0,1% de SDS, con 0,1 mg/ml de DNA de esperma de salmón
desnaturalizado y fragmentado. Después de una hibridación a 65ºC
durante una noche se lavan los filtros a 65ºC en 0,1xSSC, 0,1% de
SDS. Se secuencian los clones de cDNA de longitud completa en bandas
hebras empleando la secuenciación manual con polimerasa T7 y
cebadores de oligonucleótidos (Tabor y Richardson, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 84, 4767-71, 1987).
Ejemplo
2
Los "northern blots" que contienen 2 \mug
de poly A+RNA por pista de 16 tejidos diferentes de humanos adultos
(bazo, timo, próstata, testículos, ovarios, intestino delgado,
mucosa de colon, corazón, cerebro, placenta, pulmón, hígado,
músculos de esqueleto, riñón, páncreas y leucocitos de sangre
periférica), cuatro tejidos diferentes de fetos humanos (cerebro,
pulmón, hígado y riñón) y 8 líneas celulares de cáncer humano (HL60,
HeLa, K-562, MOLT-4, Raji, SW480 y
G361) en una membrana de poliamida (Nylon) modificada en carga se
obtienen de Clontech (Palo Alto, CA). Los "northern blots"
adicionales se preparan cromatografiando 10 \mug de RNA total
aislado a partir de células tumorales humanas a través de un gel
desnaturalizador de agarosa con un 1,2% de formaldehído y
transfiriéndolos a membranas de poliamida.
Se hibridan los filtros con sondas marcadas con
dCTP[P^{32}] cebadas aleatoriamente, sintetizadas ya sea
del inserto de 527 bp del clon 43-43 de la Aurora1
humana, ya sea del fragmento EcoRI de 1162 bp del pSG20, o ya sea
del fragmento EcoRI de 1 kb del clon 11-1A de la
Aurora2 humana o del fragmento BamHI-NotI de 1257 bp
del pS621. Se realiza la hibridación a 60ºC durante una noche en
6XSSC, 0,1% de SDS, 1X solución de Denhardt, 100 mg/ml de DNA de
esperma de arenque desnaturalizado con 1-2 x
10^{6} cpm/ml de sondas de DNA marcado con P^{32}. Los filtros
se lavan con 0,1 x SSC/0,1% de SDS, 65ºC y se exponen durante una
noche sobre una película XAR-2 de Kodak.
Se identifica un transcrito de mRNA de AUR1 de
aproximadamente 1,4 kb y se constata que es más abundante en el timo
y en el intestino delgado, con señales débiles en las muestras de
testículos, ovarios, colon, placenta y bazo. La próstata y los
linfocitos de sangre periférica son negativos. Son también positivos
el hígado y el riñón fetales humanos, con una señal débil en el
pulmón fetal y sin expresión en el cerebro fetal (ver tabla).
Un análisis similar de la expresión de la AUR2
humana presenta un perfil de expresión más restringido. Se detecta
con intensidad un solo transcrito de AUR2 de 2,4 kb en testículos de
adulto y en timo y débilmente en [corazón, placenta, músculos
esqueléticos] y en hígado y en riñón fetal, mientras que las demás
fuentes de tejido normal son negativas (ver tabla).
\vskip1.000000\baselineskip
Análisis "northern" de
AURORA 1 y AURORA 2 en tejidos humanos normales y en células
cancerosas
| Tipo de célula | Origen | AUR 1 | AUR 2 |
| timo | tejido normal | 5 | 4 |
| hígado fetal | tejido normal | 4 | 2 |
| riñón fetal | tejido normal | 4 | 1 |
| pulmón | tejido normal | 3 | 0 |
| duodeno | tejido normal | 2 | 1 |
| colon | tejido normal | 2 | 0 |
| pulmón fetal | tejido normal | 2 | 0 |
| ovario | tejido normal | 2 | 0 |
| testículos | tejido normal | 2 | 2 |
| cerebro | tejido normal | 0 | 0 |
| cerebelo | tejido normal | 0 | 0 |
| glándula salival | tejido normal | 0 | 0 |
| corazón | tejido normal | 0 | 0 |
| hígado | tejido normal | 0 | 0 |
| páncreas | tejido normal | 0 | 0 |
| riñón | tejido normal | 0 | 0 |
| bazo | tejido normal | 0 | 0 |
| estómago | tejido normal | 0 | 0 |
| útero | tejido normal | 0 | 0 |
| próstata | tejido normal | 0 | 0 |
| músculo esquelético | tejido normal | 0 | 0 |
| cerebro fetal | tejido normal | 0 | 0 |
| PBL | tejido normal | 0 | 0 |
| glándula salival | tejido normal | 0 | 0 |
| placenta | tejido normal | 0 | 0 |
(Continuación)
| Tipo de célula | Origen | AUR 1 | AUR 2 |
| SF-268 | tumor del SNC | 4 | ND |
| CCRF-CEM | leucemia | 4 | ND |
| K-562 | leucemia | 4 | ND |
| HCC-2998 | tumor de colon | 4 | ND |
| SW620 | tumor de colon | 4 | 2 |
| KM-12 | leucemia | 4 | ND |
| MCF7/ADR-RES | tumor de mama | 4 | 2 |
| MDA-N | tumor de mama | 4 | ND |
| BT-549 | tumor de mama | 4 | ND |
| SW480 | tumor de colon | 4 | 4 |
| SW48 | tumor de colon | 4 | ND |
| Calu-3 | tumor de pulmón | 4 | ND |
| Calu3 | tumor de pulmón | 4 | 2 |
| T47D | tumor de mama | 4 | 2 |
| A375 | melanoma | 4 | 0 |
| SF767 | tumor del SNC | 4 | 0 |
| SW1417 | tumor de colon | 4 | 4 |
| CaKi2 | tumor de riñón | 4 | 0 |
| CaKi1 | tumor de riñón | 4 | 0 |
| Caco2 | tumor de colon | 4 | 4 |
| SW1417 | tumor de colon | 4 | 0 |
| T98G | tumor del SNC | 4 | 0 |
| SF-539 | tumor del SNC | 3 | ND |
| SK-MEL-2 | melanoma | 3 | ND |
| SK-MEL-5 | melanoma | 3 | ND |
| R-48 | tumor gástrico | 3 | ND |
| RF-1 | tumor gástrico | 3 | ND |
| SW948 | tumor de colon | 3 | ND |
| AGS | tumor gástrico | 3 | ND |
| HFL1 | pulmón normal | 3 | ND |
| OVCAR-8 | tumor de ovarios | 2 | ND |
| HT-29 | tumor de colon | 2 | ND |
| MDA-MB-231 | tumor de mama | 2 | ND |
| MDA-MB-435 | tumor de mama | 2 | ND |
| SK-MEL-5 | melanoma | 2 | ND |
| Kato-3 | tumor gástrico | 2 | ND |
| Colo 205 | tumor de colon | 2 | ND |
| Colo 320DM | tumor de colon | 2 | 2 |
| WiDr | tumor de colon | 2 | ND |
| HT-29 | tumor de colon | 2 | ND |
| SNU-C2B | tumor de colon | 2 | ND |
| HTC15 | tumor de colon | 2 | 2 |
| T84 | tumor de colon | 2 | 0 |
| SW948 | tumor de colon | 2 | 0 |
| Daoy | tumor del SNC | 2 | 0 |
| OVCAR3 | tumor de ovarios | 2 | 0 |
| HS766T | tumor de páncreas | 2 | 0 |
| SW1116 | tumor de colon | 2 | 0 |
| tumor de Wilms | tumor de riñón | 2 | 0 |
| UO-31 | tumor renal | 0 | ND |
\newpage
El perfil de expresión del mRNA de la AUR1 en
diversos tumores primarios y líneas celulares múltiples de diversos
orígenes neoplásicos se determina mediante el análisis Northern y
mediante un ensayo semicuantitativo por PCR empleando cebadores de
secuencias del dominio de quinasa AUR1. Los resultados se incluyen
en la tabla. Los transcritos de AUR1 se detectan en cada línea
tumorales y se ensayan con la expresión máxima en diversas líneas
celulares de cáncer de colon humano (SW480, Colo320, SW620, SW1417,
Caco2, SW12417) y en carcinoma de pulmón (Calu3), carcinoma de mama
(T47D, MCF7), melanoma (A375), carcinoma de riñón
(CaKi-1, CaKi-2), carcinoma de
hígado (SK-HEP-1) y tumores
neurológicos (SF767, T98G). La expresión menor de la AUR1 se observa
en otros carcinomas de colon (HTC15, T84, SW948, SW1116, HT29),
tumores neurológicos (Daoy), carcinoma de ovarios (Ovcar3, tumor
primario), carcinoma de páncreas (HS766T) y tumor primario de
riñón.
El perfil de expresión de la AUR2 en líneas
celulares tumorales es sorprendentemente más restringido que el de
la AUR1. Una expresión fuerte de la AUR2 se detecta solamente en las
líneas celulares de carcinoma de colon (Caco2, SW480, SW1417,
SW620), mientras que se observan señales débiles en otras líneas
celulares de tumores de colon (HTC15, Colo320), mama (T47D, MCF7) y
pulmón (Calu3). Diversas líneas tumorales más no tienen transcritos
detectables de la AUR2.
Ejemplo
3
Se aísla el RNA de una gran variedad de líneas
celulares humanas, tejidos congelados frescos y tumores primarios.
Se sintetiza el cDNA de hebra simple a partir de 10 mg de cada RNA
del modo descrito anteriormente empleando el sistema llamado
Superscript Preamplification System (Gibco BRL). Entonces se
utilizan moldes de hebra simple en una reacción PCR de 35 ciclos con
dos oligonucleótidos específicos de la AURORA1 (3476:
5'-TTTGGCTCGGGAGAA
GAAAAGCCAT-3' (SEQ ID NO: 19) y 3506: 5'-CAATCATCTCTGGGGGCAGGTAGT-3') SEQ ID NO: 20). Los productos de reacción se someten a electroforesis en geles de agarosa del 2%, se tiñen con bromuro de etidio y se fotografían en una caja de luz UV. Se estima la intensidad relativa de las bandas específicas de la AURORA1 de \approx475 bp de cada muestra.
GAAAAGCCAT-3' (SEQ ID NO: 19) y 3506: 5'-CAATCATCTCTGGGGGCAGGTAGT-3') SEQ ID NO: 20). Los productos de reacción se someten a electroforesis en geles de agarosa del 2%, se tiñen con bromuro de etidio y se fotografían en una caja de luz UV. Se estima la intensidad relativa de las bandas específicas de la AURORA1 de \approx475 bp de cada muestra.
Ejemplo
4
Se aísla el DNA genómico de un gran número de
líneas humanas transformadas (CaCO2, HTC15, LS147T,
SKCO4, SW480, SW403, SW620, SW948, SW1417, SW1116, MCF7, BT474) empleando procedimientos estándar (Maniatis y col.). Se tripsinizan las células, se lavan con PBS y se suspenden de nuevo a razón de \approx10^{8} células/ml en un tampón de digestión (NaCl 100 mM, Tris 10 mM, pH 8, EDTA 25 mM, pH 8, SDS del 0,5%, 0,1 mg/ml de proteinasa K). Se lisan las células por incubación a 50ºC durante 12 horas, después se extraen con fenol/cloroformo y se precipitan con un volumen igual de acetato amónico 7,5 M y EtOH del 100%. Se resuspenden los DNA en tampón TE. Se digieren aproximadamente 20 microgramos de DNA genómico con HindIII o XhoII a 37ºC por lo menos durante 4 horas antes del fraccionamiento a través de geles de agarosa del 1%. Los fragmentos de DNA se transfieren a membranas de nitrocelulosa por el método de transferencia capilar (Southern, E.M., J. Mol. Biol. 98, 503, 1975) y se hibridan
con sondas específicas de la Aurora1 y de la Aurora2 humanas del modo descrito en el anterior análisis Northern Blot.
SKCO4, SW480, SW403, SW620, SW948, SW1417, SW1116, MCF7, BT474) empleando procedimientos estándar (Maniatis y col.). Se tripsinizan las células, se lavan con PBS y se suspenden de nuevo a razón de \approx10^{8} células/ml en un tampón de digestión (NaCl 100 mM, Tris 10 mM, pH 8, EDTA 25 mM, pH 8, SDS del 0,5%, 0,1 mg/ml de proteinasa K). Se lisan las células por incubación a 50ºC durante 12 horas, después se extraen con fenol/cloroformo y se precipitan con un volumen igual de acetato amónico 7,5 M y EtOH del 100%. Se resuspenden los DNA en tampón TE. Se digieren aproximadamente 20 microgramos de DNA genómico con HindIII o XhoII a 37ºC por lo menos durante 4 horas antes del fraccionamiento a través de geles de agarosa del 1%. Los fragmentos de DNA se transfieren a membranas de nitrocelulosa por el método de transferencia capilar (Southern, E.M., J. Mol. Biol. 98, 503, 1975) y se hibridan
con sondas específicas de la Aurora1 y de la Aurora2 humanas del modo descrito en el anterior análisis Northern Blot.
Se restringen los DNA con HindIII, dado que los
DNA tanto de la AUR1 como de la AUR2 contienen un sitio único para
esta enzima de restricción. La AUR1 presenta una banda única de 4,3
kb de igual densidad a partir de todas las fuentes, lo cual sugiere
que se trata de un gen de copia simple, no reordenado, en los
múltiples tipos de tumor ensayados. Sin embargo, en condiciones de
baja restricción, hemos sido capaces de detectar fragmentos SacI de
1,3 kb y 3,2 kb, que se hibridan débilmente con la sonda de la AUR1.
La clonación y el análisis de secuencia revelan que esta región
codifica un pseudogén afín a la AUR1 sin intrón (denominado AUR3),
que presentan múltiples desplazamientos de marco. Además,
inmediatamente después del pseudogén AUR3 en dirección a
5'(upstream) existe una región con repeticiones invertidas
complejas, que previsiblemente formarán un bucle de herradura
(hairpin) muy estable. La secuencia de DNA de la AUR3 es homóloga
con la AUR1 empezando desde el primer nucleótido del cDNA de la
AUR1. Inmediatamente después de este sitio en dirección a
5'(upstream) existe el bucle de herradura previsto de la AUR3.
Actualmente estamos caracterizando los clones genómicos de la AUR1
para determinar si la homología de la AUR3 continúa en dirección a
5'después de este nucleótido y si el cDNA de la AUR1 incluye o está
precedido por un bucle de herradura similar. La AUR2 presenta
bandas en 7,0 kb y 4,3 kb y una banda de pesos moleculares
ligeramente superior en \approx10 kb a partir de todas las
fuentes. Estos datos sugieren que la AUR2 es también un gen de copia
simple. Las múltiples bandas que se han visto en las transferencias
(blots) con sondas de AUR2 se deben probablemente al hecho de que se
emplea una sonda de cDNA de longitud completa.
Ejemplo
5
La secuencia completa de la Aurora1 y de la
Aurora2 humanas se determina a partir de clones de longitud completa
de cada una de ellas, aislada a partir de la biblioteca del
carcinoma de páncreas humano, a partir del duodeno humano normal y
de material aislado de Aurora1 humana parcial de células HEPM.
La secuencia de nucleótidos de la Aurora1 humana
de 1,244 bp (AUR1_h) se presenta en la SEQ ID NO: 1 o en la SEQ ID
NO: 2 y contiene un único marco de lectura abierto que codifica a un
polipéptido de 344 aminoácidos. La región codificadora de la AUR1_1
está flanqueada por un región de 54 nucleótidos no traducida en 5'y
una región de 132 nucleótidos no traducida en 3', que termina en una
cola poly(A).
La secuencia de nucleótidos de la Aurora2 humana
(AUR2_h) de 2,198 bp se presenta en la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO:
2 y contiene un único marco abierto de lectura que codifica a un
polipéptido de 403 aminoácidos. La región codificadora de la AUR2_h
está flanqueada por una región de 200 nucleótidos con 5'sin
traducida y una región de 768 nucleótidos con 3'sin traducir.
Las secuencias de los cDNA de la AUR1 y AUR2 se
secuencian a partir tanto de tumores pancreáticos humanos como de
duodeno humano normal, sin diferencias de secuencia, excepto algunos
sitios probablemente polimórficos. Estas ambigüedades incluyen:
| cDNA | nucleótido | Comentario: |
| AUR1 | 1174 | un clon tiene insertada la polyA |
| 873 | T en todos los clones duodenales, C en el tumor de páncreas | |
| 469 | T en un clon, C en todos los demás | |
| 848 | G en un clon, A en todos los demás, cambia el aminoácido E por G | |
| 1097 | G en un clon, T en otros 2 | |
| 956 | G en un clon, A en otros 4 | |
| 29 | empalme con 103 en 5 clones, sin empalme (diseminado) en 5 clones | |
| AUR2 | 349 | T en 1 clon, C en muchos otros (cambio del aminoácido P por L) |
| 369 | A en 3 clones, G en muchos otros (cambio del AA V por I). |
Las porciones terminales en C de la AUR1 y de la
AUR2 conservan los 12 subdominios característicos de
proteína-quinasas eucariotas. Estos dominios de
quinasa de AUR1 y AUR2 están precedidos por un dominio
N-terminal que tiene 74 y 130 aminoácidos,
respectivamente. La comparación de nucleótidos de la AUR1 y AUR2 y
las secuencias de aminoácidos deducidas (SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO:
4) con el DNA disponible y las bases de datos de secuencias de
proteínas indican que son únicos, con la excepción de que varias
secuencias EST comparten una gran identidad de secuencia. Pero,
tienen una homología sorprendente tanto en los dominios
N-terminales como en los catalíticos con la Aurora
de la Drosophila y los genes IPL1 del Saccharomyces
cerevisiae. Además, dos entradas de bases de datos no publicadas
apoyan la verosimilitud de que son homólogos próximos del Xenopus
laevis (p46APK - GB nº de registro #Z17206 y p46BPK - GB nº de
registro #Z17207).
Los dominios N-terminales de las
Auroras de humanos, de la rana, de la Drosophila y de la
levadura comparten una identidad limitada de secuencia. La AUR2
requerida tiene abundancia de glutamatos que están presentes a
menudo en pares separados por un resto único.
La comparación de los dominios catalíticos de
estas proteínas revela que la AUR1 comparte un 70% de identidad de
aminoácidos con la AUR2, un 61% con la Aurora de la
Drosophila y un 45% con el gen IPL1 de la levadura. La
quinasa de la AUR2 comparte un 60% de identidad de aminoácidos con
la proteína de la Drosophila y un 45% de identidad con el
IPL1 de la levadura. Tanto la AUR1 como la AUR2 comparten menos de
un 45% de homología con otras quinasas conocidas de mamíferos (la
más próxima es la proteína-quinasa A dependiente de
cAMP), lo cual sugiere que son homólogas de estas quinasas de
Drosophila y de levadura.
Tanto la AUR1 como la AUR2 contienen un sitio de
fosforilación de proteína-quinasa dependiente de
cAMP (THR232 de la AUR1 y THR288 de la AUR2), que está conservado en
los homólogos de Drosophila y de levadura y es un sitio
regulador conocido de la quinasa p34cdc2 dependiente de ciclina. La
AUR2 contiene un sitio PKA adiciona en SER342. Ambas proteínas
tienen además múltiples sitios de fosforilación de
caseína-quinasas II (cinco y seis para la AUR1 y
AUR2) y proteína-quinasas C (cuatro y diez para la
AUR1 y AUR2). Además, la AUR2 tiene un sitio de consenso de
fosforilación único para la tirosina en TYR334, que está también
conservado en la Aurora de la Drosophila, pero no está
presenta en la AUR1 ni en el IPL1 de la levadura.
Es curioso que los mutantes naturales de la
Aurora de la Drosophila AUR_dm y del gen IPL1 de la levadura
sufren una división nuclear asimétrica que conduce a una mala
agregación de cromosomas y husos monopolares atípicos. Este fenotipo
parece ser el resultado de un fallo en la separación de centrosomas.
Parece no estar afectada la arquitectura de microtúbulo asociada.
Los mutantes naturales de los restos de aminoácidos diana tanto de
la Drosophila como de la levadura están estrictamente
conservados entre las Auroras humanas, lo cual confirma que pueden
ser homólogos funcionales. Los restos correspondientes de la AUR1
que se hallan en los mutantes naturales de la AUR_dm o del IPL1 son
el GLU125, el THR232, el PRO312 y el HIS324. Todas estas mutaciones
están dentro del dominio catalítico y, notablemente, una representa
el sitio de fosforilación PKA conservado. Una mutación adicional de
la AUR_dm en ASP47 es en un resto no conservado del dominio
N-terminal.
Estos resultados sugieren que la actividad
catalítica puede desempeñar un papel muy importante en la biología
de la replicación o segregación de centrosomas en organismos
inferiores y sugieren además que las Auroras humanas pueden tener un
papel complementario en las células de mamíferos.
Ejemplo
6
Los constructos de expresión se generan por
mutagénesis asistida por PCR en la que los dominios codificadores
completos de la Aurora1 y de la Aurora2 se marcan en sus extremos
terminados en carboxi con el epítope YPYDVPDYAS del la hemaglutinina
(HA) del Haemophilus influenzae (SEQ ID NO: 21) (Pati, 1992).
Estos constructos se introducen en dos vectores de expresión en
mamíferos: pLXSN (Miller, A.D. & Rosman, G.J., Biotechniques
7, 980-988, 1989) para la generación de
líneas productoras de virus; y pRK5 para en análisis de expresión
transitoria. Los insertos se diseñan para ir flanqueados por sitios
BamHI y NotI únicos y se clonan directamente en pLXSN o pRK5 de los
sitios 5'-BamHI y 3'-NotI.
Los constructos AUR1 y AUR2 de longitud completa
con BamHI-NotI se ligan al RS316 (Liu, H. y col.,
Genetics 132, 665-673, 1992). Este vector
contiene un promotor inducible por galactosa en un vector lanzadera
(shuttle) centrómero para la expresión en el Saccharomyces
cerevisiae. Se tiene que evaluar si los genes humanos pueden
complementar el mutante afín IPL1 de la levadura, sensible a la
temperatura, que es muy afín a la AUR1. Además se generan
constructos de fusión que contienen el dominio
N-terminal del IPL1 de la levadura fusionado con los
dominios de quinasa C-terminales de la AUR1 y de la
AUR2. Estos se producen por inserción de un sitio ClaI artificial en
el extremo 5'de los dominios de las quinasas, en la secuencia
conservada
Asp-Asp-Phe-Glu.
Los constructos dominantes negativos de la AUR1 y
AUR2 se generan también tanto en el pLXSN como en el pRK5 por
mutación de la Lys invariable (posiciones de aminoácidos 106 y 162
de la AUR1 y de la AUR2, respectivamente) en la Met por mutagénesis
de PCR. Los constructos se denominan AUR1KM y AUR2KM. Las formas
constitutivamente activas de la AUR1 y de la AUR2 se generan por
mutación del DNA que dirige la codificación del sitio de
fosforilación (232 y 288) hacia un Asp, resultando de ello la AUR1TD
y la AUR2TD.
Los constructos de expresión tanto en el pLXSN
como en el pRK5 se producen también para que contengan precisamente
el dominio no catalítico N-terminal de la AUR1 y
AUR2. Estos se generan por PCR a partir de constructos originales
previos y contienen 77 aminoácidos N-terminales de
la AUR1 y los 132 aminoácidos N-terminales de la
AUR2.
Los marcos completos de lectura abiertos de la
AUR1 y AUR2 (no marcados con HA), excluyendo las metioninas de
inicio, se generan por PCR y se ligan al vector pGEX para la
producción bacteriana de proteínas de fusión GST para la
inmunización de conejos para la producción de anticuerpos.
Ejemplo
7
Para generar existencias concentradas de virus se
transfectan constructos recombinantes de pLXSN ya sea de genes de
AUR1, ya sea de AUR2, en una línea de células auxiliares
anfotrópicas PA317 empleando la transfección mediada por CaCl_{2}.
Después de la selección a través del G418 se extienden las células
en placas en medio normal, sin G418 (500 \mug/ml). Se utilizan los
líquidos sobrenadantes de células resistentes para infectar la línea
de células auxiliares ecotrópica GP+E86 y se seleccionan de nuevo
las células a través del G418. Se recogen de nuevo las células
resistentes del G418 y se recogen los líquidos sobrenadantes cada
8-12 horas y se reúnen en forma de existencias
víricas (Redemann, N., Holzmann, B., Wagner, E.F., Schlessinger, J.
& Ullrich, A., Mol. Cell. Biol. 12,
491-498, 1992). Las concentraciones de las
existencias víricas se sitúan por ejemplo en
\approx10^{6}/ml.
Ejemplo
8
Se cultivan células NIH-3T3 y
BALB/3T3 en placas de 100 mm con DMEM (Gibco) que contiene un 10% de
suero fetal bovino (FCS). Se superinfectan las células con
retrovirus de AUR1 y AUR2 por adición de aproximadamente 3 ml de
líquido sobrenadante vírico a 15 ml de medio de cultivo durante
aproximadamente 24 horas. Después se seleccionan las células que
expresan los constructos retrovíricos mediante crecimiento en FCS al
10% en DMEM suplementado con 500 \mug/ml de G418.
\newpage
Ejemplo
9
Los inmunorreactivos específicos de la AURORA se
cultivan en conejos contra péptidos sintéticos conjugados con KLH,
correspondiente a la región N-terminal de la AUR2
(^{104}SAPENNPEEQLASK^{117}) (SEQ ID NO: 22) y
(^{90}RPLNNTQKSKQPL^{102}) (SEQ ID NO: 23) o el dominio del
extremo N o el dominio del extremo N de la AUR1 humana
(^{1}MAQKENSYPWPYG^{13}) (SEQ ID NO: 24) y
(^{53}PGQKVMENSSGTP^{65}) (SEQ ID NO: 25). Los inmunorreactivos
adicionales se generan inmunizando conejos con proteínas de fusión
GST de la AUR1 y AUR2 de longitud completa expresadas en
bacterias.
Ejemplo
10
Se introducen plásmidos de expresión pRK5 (10
\mug de DNA/placa de 100 mm) que contienen los genes de AUR1 y
AUR2 marcados con HA en células COS y 293 con lipofectamina (Gibco
BRL). Pasadas 72 horas se recogen las células en 0,5 ml de tampón de
solubilización (HEPES 20 mM, pH 7,35, NaCl 150 mM, glicerina al 10%,
Tritón X-100 al 1%, MgCl_{2} 1,5 mM, EGTA 1 mM,
fluoruro de fenilmetilsulfonilo 2 mM, aprotinina 1 \mug/ml). Se
resuelven partes alícuotas de muestra por electroforesis a través de
gel de SDS-poliacrilamida (PAGE) a través de geles
de acrilamida al 15%/bis-acrilamida al 0,5% y se
transfieren por electroforesis a la nitrocelulosa. Se bloquea la
fijación no específica preincubando los materiales a transferir
(blots) en "blotto" (solución salina tamponada con fosfato que
contiene un 5% p/v de leche desnatada deshidratada y un 0,2% v/v de
Nonidet P-40 (Sigma)) y se detecta la proteína
recombinante empleando un anticuerpo monoclonal (mab) murino contra
el marcador decapéptido HA. Como alternativa, la proteína
recombinante puede detectarse empleando varios antisueros
específicos de la AUR1 o AUR2.
Ejemplo
11
Se cultivan células SW480 de adenocarcinoma
colorrectal humano en RPMI 1640 más un 10% de suero fetal bovino,
L-glutamina, penicilina y estreptomicina. Se lavan
los cultivos confluyentes de células SW480 tres veces con solución
salina tamponada con fosfato (PBS) enfriada con hielo y después se
raspan sobre 1 ml de PBS enfriado con hielo. Se centrifugan las
células a 1.000 rpm a 4ºC, se quita el PBS por aspiración y se
almacena el culote resultante de células a -80ºC. Se descongelan
sobre hielo los culotes obtenidos con tres placas de 15 cm y se
resuspenden en un total de 1 ml de tampón de lisis de quinasa HEPES
50 mM, pH 7,4, KCl 100 mM, NaF 25 mM, NaVO_{3} 1 mM, 0,5% de
NP40, DTT 1 mM, aprotinina 2 \mug/ml y leupeptina 1 \mug/ml y se
agitan por rotación suave a 4ºC durante 20 minutos. Después se
centrifugan las muestras a 10.000 rpm a 4ºC durante 10 minutos y se
transfiere el líquido sobrenadante resultante a un tubo de
centrífuga limpio de 1,5 ml y se almacena o se guarda sobre hielo.
Se determina la concentración de proteína por análisis de Bradford.
Se preclarifica un miligramo de proteína total con 10 \mul de
proteína A-Sepharose (Boehringer) a 4ºC durante 15
minutos y después por adición de 2 \mul de suero preinmune de
conejo, o antisuero de péptido de Aurora1 purificado por afinidad,
o antisuero de péptido de Aurora1 purificado por afinidad más 6
\mug de péptido competidor de Aurora1, antisuero de péptido de
Aurora2 purificado por afinidad, antisuero de péptido de Aurora2
purificado por afinidad más 6 \mug de péptido competidor de
Aurora2 y se incuba a 4ºC durante 30 minutos. A continuación se
añaden 10 \mul de proteína A-Sepharose y se
prosigue la incubación a 4ºC durante 45 minutos más. Se centrifugan
los tubos brevemente para obtener un culote de complejo de
anticuerpo-proteína A-Sepharose y se
quita el líquido sobrenadante por aspiración. Se lava dos veces el
culote de anticuerpo-proteína
A-Sepharose con 0,5 ml de tampón de lisis de quinasa
y después se lava con 0,5 ml de tampón de quinasa (HEPES 20 mM, pH
7,4, KCl 125 mM, MgCl_{2} 10 mM, NaF 1 mM, NaVO_{3} 1 mM y DTT 1
mM). Se resuspende el culote de anticuerpo-proteína
A-Sepharose en 20 \mul de tampón de quinasa que
contiene 5 \muCi de ATP-[\gamma-P^{32}] y 0,5
mg/ml de proteína básica de mielina (Sigma), se incuba a 37ºC
durante 20 minutos y después se añaden 10 \mul de tampón de
muestra de proteína Tris-Cl 200 mM, pH 6,8,
glicerina del 40%, B-mercaptoetanol 730 mM, SDS del
0,4% y azul de bromofenol del 0,05%). Se mezcla bien el contenido de
los tubos y se incuba a 100ºC durante 5 minutos. Se resuelven las
muestras a través de un gel de SDS al 18% en poliacrilamida y se
visualizan por autorradiografía.
Los inmunocomplejos de Aurora1 y Aurora2 son
capaces de fosforilar la proteína básica de la mielina. Cuando se
emplea un péptido competidor en las inmunoprecipitaciones, ni los
inmunocomplejos de antisueros de Aurora1 ni de Aurora2 son capaces
de fosforilar la proteína básica de la mielina en mayor grado que
los sueros preinmunes de control. Esto sugiere que la actividad de
quinasa observada es debida a la Aurora1 y 2 y no a otras proteínas
que estén presentes en el inmunocomplejo.
Esta observación da pie a la purificación de la
quinasa activa Aurora1 y 2 empleando la proteína básica de la
mielina como sustrato para explorar la actividad de quinasa. Esto
permite además desarrollar un ensayo de quinasa "in
vitro" empleando las proteínas recombinantes de Aurora1 y 2.
Además, el ensayo de quinasa "in vitro" de la Aurora1 y
2 permite explorar colecciones de moléculas pequeñas para detectar
los inhibidores de las quinasas Aurora1 y 2, midiendo la inhibición
de la fosforilación de la proteína básica de la mielina.
La invención descrita a título ilustrativo puede
ponerse en práctica de modo conveniente en ausencia de cualquier
elemento o elementos, limitación o limitaciones, que no se haya
descrito específicamente en esta solicitud. Los términos y
expresiones se han empleado como términos de la descripción y no de
limitación y no existe intención alguna de que el uso de tales
términos y expresiones pueda excluir ninguno de los equivalentes de
las características presentadas y descritas ni de porciones de las
mismas, al contrario, se reconoce que son posibles varias
modificaciones dentro del alcance de las invención reivindicada. Por
lo tanto, se da por supuesto que aunque la presente invención se
haya descrito específicamente mediante formas preferidas de
ejecución y características opcionales, la modificación y la
variación de los conceptos descritos en esta solicitud puede
emprenderse por parte de los expertos en la materia, pero tales
modificaciones y variaciones se consideran contempladas dentro del
alcance de esta invención, que se define en las reivindicaciones
adjuntas.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Mossie, Kevin G. Plowman, Gregory D.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Aplicación de Aurora humana
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 6
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN POSTAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Lyon & Lyon
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 633 West Fifth Street, Suite 4700
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Los Ángeles
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: CA
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Estados Unidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 90071-2066
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE CON ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA INFORMÁTICO: PatentIn Release #1.0, versión #1.30
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA PRESENTE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: US
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DEL DEPÓSITO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Warburg, Richard J.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 32,327
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: (213) 489-1600
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: (213) 955-0440
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TELEX: 67-3510
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 1
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1244 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: no
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: no
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Homo sapiens
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEQ ID NO: 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 2
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2198 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: no
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: no
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEQ ID NO: 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 3
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 344 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: no
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: no
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEQ ID NO: 3
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 1
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 403 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: no
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: no
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEQ ID NO: 4
Claims (31)
1. Una molécula de ácido nucleico aislada,
enriquecida o purificada, caracterizada porque codifica a un
polipéptido AUR-1 que tiene una longitud por lo
menos de 100 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos
presentada en la SEQ ID NO: 3 o a un polipéptido
AUR-2 que tiene una longitud por lo menos de 100
aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos presentada en
la SEQ ID NO: 4.
2. La molécula de ácido nucleico de la
reivindicación 1, en la que dicho ácido nucleico es un ácido
nucleico humano.
3. La molécula de ácido nucleico de la
reivindicación 1 o de la reivindicación 2, dicha molécula codifica
por lo menos 200 aminoácidos contiguos de la secuencia de
aminoácidos presentada en la SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4, con
preferencia por lo menos 300.
4. Una sonda de ácido nucleico para la detección
del ácido nucleico que codifica a un polipéptido
AUR-1 de por lo menos 100 aminoácidos contiguos de
la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO: 3, dicha
sonda es muy complementaria de la longitud completa de dicho ácido
nucleico o a un polipéptido AUR-2 de por lo menos
100 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos presentada
en la SEQ ID NO: 4, dicha sonda es muy complementaria de la longitud
completa de dicho ácido nucleico, con la condición de que dicha
sonda de ácido nucleico no sea la secuencia EST yg60d11.r1 (GenBank
gi: 98371, nº de registro R97911), ni la EST97212 (GenBank gi:
618232, nº de registro T36134) ni el complemento de las mismas.
5. La sonda de la reivindicación 4, dicha sonda
es muy complementaria del ácido nucleico que codifica por lo menos a
200 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos presentada
en la SEQ ID NO. 3 o SEQ ID NO: 4, con preferencia por lo menos a
300.
6. Una molécula de ácido nucleico recombinante,
caracterizada porque codifica a un polipéptido
AUR-1 de por lo menos 100 aminoácidos contiguos de
la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO. 3 o a un
polipéptido AUR-2 de por lo menos 100 aminoácidos
contiguos de la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO.
4 y un vector o promotor eficaz para iniciar la transcripción en una
célula hospedante.
7. Una molécula de ácido nucleico recombinante,
caracterizada porque contiene una región funcional de
transcripción en una célula, una secuencia complementaria de una
secuencia de RNA que codifica a un polipéptido AUR-1
de por lo menos 100 aminoácidos contiguos de la secuencia de
aminoácidos presentada en la SEQ ID NO. 3 o a un polipéptido
AUR-2 de por lo menos 100 aminoácidos contiguos de
la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO. 4 y una
región funcional de terminación de la transcripción en una
célula.
8. Un polipéptido aislado, enriquecido o
purificado, caracterizado porque dicho polipéptido es un
polipéptido AUR-1 de por lo menos 100 aminoácidos
contiguos de la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO.
3 o un polipéptido AUR-2 de por lo menos 100
aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos presentada en
la SEQ ID NO. 4.
9. El polipéptido AUR-1 o
AUR-2 de la reivindicación 8, dicho polipéptido
consta por lo menos de 200 aminoácidos contiguos de la secuencia de
aminoácidos presentada en la SEQ ID NO: 3 O SEQ ID NO: 4, con
preferencia por lo menos de 300 aminoácidos.
10. El polipéptido AUR-1 o
AUR-2 de la reivindicación 8 o de la reivindicación
9, dicho polipéptido se aísla, purifica o enriquece a partir de un
mamífero.
11. El polipéptido AUR-1 o
AUR-2 de la reivindicación 10, dicho polipéptido se
aísla, se purifica o se enriquece a partir de un ser humano.
12. Un polipéptido según una cualquiera de las
reivindicaciones de 8 a 11, dicho polipéptido es un polipéptido
AUR-1.
13. Un polipéptido según una cualquiera de las
reivindicaciones de 8 a 11, dicho polipéptido es un polipéptido
AUR-2.
14. Un anticuerpo caracterizado porque
tiene una afinidad de fijación específica sobre un polipéptido
AUR-1 de por lo menos 100 aminoácidos contiguos de
la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO: 3 o sobre un
polipéptido AUR-2 de por lo menos 100 aminoácidos
contiguos de la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO:
4.
15. El anticuerpo de la reivindicación 14, en el
que dicho polipéptido se aísla, purifica o enriquece a partir de un
mamífero.
\newpage
16. El anticuerpo de la reivindicación 15, en el
que dicho polipéptido se aísla, purifica o enriquece a partir de un
humano.
17. El anticuerpo de una cualquiera de las
reivindicaciones de 14 a 16, en el que dicho polipéptido es un
polipéptido AUR-1.
18. El anticuerpo de una cualquiera de las
reivindicaciones de 14 a 16, en el que dicho polipéptido es un
polipéptido AUR-2.
19. Un hibridoma caracterizado porque
produce un anticuerpo que tiene afinidad de fijación específica
sobre un polipéptido AUR-1 de por lo menos 100
aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos presentada en
la SEQ ID NO: 3 o sobre un polipéptido AUR-2 de por
lo menos 100 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos
presentada en la SEQ ID NO: 4.
20. El hibridoma de la reivindicación 19, en la
que dicho polipéptido AUR-1 o AUR-2
contiene por lo menos 200 aminoácidos contiguos de la secuencia de
aminoácidos presentada en la SEQ ID NO: 3 o en la SEQ ID NO: 4, con
preferencia por lo menos 300 aminoácidos.
21. El hibridoma de la reivindicación 19 o de la
reivindicación 20, en el que dicho polipéptido se aísla, se purifica
o se enriquece a partir de un mamífero.
22. El hibridoma de la reivindicación 21, en el
que dicho polipéptido se aísla, se purifica o se enrique a partir de
un ser humano.
23. El hibridoma de la reivindicación 20 o de la
reivindicación 21, en el que dicho polipéptido es un polipéptido
AUR-1.
24. El hibridoma de la reivindicación 20 o de la
reivindicación 21, en el que dicho polipéptido es un polipéptido
AUR-2.
25. El uso de la sonda de ácido nucleico según
una cualquiera de las reivindicaciones de 4 a 6 en un método para
detectar la presencia de ácido nucleico que codifique a un
polipéptido AUR-1 de por lo menos 100 aminoácidos
contiguos de la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO:
3 o a un polipéptido AUR-2 de por lo menos 100
aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos presentada en
la SEQ ID NO: 4.
26. Un kit para detectar la presencia de ácido
nucleico que codifica a un polipéptido AUR-1 de por
lo menos 100 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos
presentada en la SEQ ID NO: 3 o a un polipéptido
AUR-2 de por lo menos 100 aminoácidos contiguos de
la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO: 4, que
consta por lo menos de un recipiente que contiene una sonda de ácido
nucleico con arreglo a una cualquiera de las reivindicaciones de 4 a
6.
27. El uso de un anticuerpo según una cualquiera
de las reivindicaciones de 14 a 18 en un método para detectar un
polipéptido AUR-1 de por lo menos 100 aminoácidos
contiguos de la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO:
3 o un polipéptido AUR-2 de por lo menos 100
aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos presentada en
la SEQ ID NO: 4.
28. Un kit para detectar la presencia de un
polipéptido AUR-1 de por lo menos 100 aminoácidos
contiguos de la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO:
3 o de un polipéptido AUR-2 de por lo menos 100
aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos presentada en
la SEQ ID NO: 4, que consta de i) un primer recipiente que contiene
un anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones de 14 a
18 e ii) un segundo recipiente que contiene un conjugado que consta
de un reactivo de fijación del anticuerpo y de un marcador.
29. Un método para detectar un compuesto capaz de
fijarse sobre un polipéptido AUR-1 o
AUR-2, que consiste en el paso de incubar el
compuesto con un polipéptido AUR-1 de por lo menos
100 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos presentada
en la SEQ ID NO: 3 o con un polipéptido AUR-2 de por
lo menos 100 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos
presentada en la SEQ ID NO: 4 y de detectar la presencia del
compuesto fijado sobre dicho polipéptido AUR-1 y/o
AUR-2.
30. Un método para detectar un agonista o
antagonista de la actividad de la AUR-1 o
AUR-2, que consiste en incubar las células que
producen un polipéptido AUR-1 de por lo menos 100
aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos presentada en
la SEQ ID NO: 3 o un polipéptido AUR-2 de por lo
menos 100 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos
presentada en la SEQ ID NO: 4 en presencia de un compuesto y en
detectar los cambios en el nivel de actividad de dicho polipéptido
AUR-1 y/o AUR-2.
31. Un método según la reivindicación 30, en el
que dicha actividad de la AUR-1 o
AUR-2 es la fosforilación de una molécula de
sustrato.
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