ES2248997T3 - Proteina-quinasas ste20-relacionadas. - Google Patents

Abstract

Una molécula de ácido nucleico, aislada, enriquecida o purificada, la cual codifica un polipéptido de quinasa STLK2, comprendiendo, la citada molécula de ácido nucleico, una secuencia de nucleótidos que: (a) codifica la secuencia de aminoácidos completa, tal y como se presenta en la SEQ ID NO:5; (b) es el complemento de la secuencia de nucleótidos de (a); (c) codifica por lo menos 40 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO:5, y que tiene actividad quinasa; (d) es el complemento de la totalidad de la secuencia de nucleótidos de (c), (e) codifica un polipéptido que tiene actividad quinasa, que comprende la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO:5, excepto en cuanto al hecho de que, ésta, carece de uno o más de los dominios definidos por los segmentos de aminoácidos 1 ¿ 21, ó 275 ¿ 416 de la SEQ ID NO:5; (f) es el complemento de la totalidad de la secuencia de nucleótidos de (e)

Description

Proteína-quinasas STE20-relacionadas.

Solicitudes relacionadas

La presenta solicitud, reivindica prioridad a solicitud provisional de patente estadounidense U.S. de la serie Nº 60/081.784, de Plowmann y Martínez, titulada Proteina-quinasas STE20-relacionadas, presentada en fecha 14 de Abril de 1998 (Lyon & Lyon, documento Nº 232/279).

Sector de la invención

La presente invención, se refiere a nuevos polipéptidos de quinasas, secuencias nucleótidas que codifican a los nuevos polipéptidos de quinasas, así como a varios productos y procedimientos de utilidad para el diagnóstico y tratamiento de varias enfermedades y condiciones relacionadas con quinasas.

Antecedentes y trasfondo de la invención

La siguiente descripción del trasfondo de la invención, se proporciona para ayudar en la comprensión de la invención, pero no pretende corresponder o describir al arte anterior a la invención.

La transducción celular de señales, es un mecanismo fundamental, mediante el cual, los estímulos externos que regulan diversos procesos celulares, se retransmiten al interior de las células. Uno de los mecanismos bioquímicos claves de transducción de señales, involucra la fosforilación reversible de proteínas, lo cual posibilita la regulación de la actividad de proteínas maduras, procediendo a modificar su estructura y función.

Las proteína-quinasas mejor caracterizadas en eucariotas, fosforilizan proteínas en la porción hidroxilo de residuos de serina, treonina y tirosina. Estas quinasas, en su mayor parte, se dividen en dos grupos, aquéllas específicas para fosforilizar serinas y treoninas, y aquéllas específicas para fosforilizar tirosinas. Algunas quinasas, a las cuales se les hace referencia como quinasas de "especificidad dual", son aptas para fosforilizar sobre residuos de tirosina, así como de serina/treonina.

Las proteína-quinasas, pueden también caracterizarse por su ubicación en el interior de la célula. Algunas quinasas, son proteínas transmembrana del tipo receptor, capaces de modificar directamente su actividad catalítica, como respuesta al entorno medioambiental exterior, tal como el enlace de un ligando. Otras, son proteínas del tipo no receptor, que carecen de cualquier dominio o propiedad de transmembrana. Éstas pueden encontrarse en una variedad de compartimientos celulares, desde la superficie interior de la membrana de la célula hasta el nú-
cleo.

Muchas quinasas, se encuentran involucradas en cascadas regulatorias, en donde, sus substratos, pueden incluir otras quinasas cuyas actividades se encuentran reguladas por su estado de fosforilación. Fundamentalmente, la actividad de algún efector corriente abajo, se modula mediante la fosforilación resultante de la activación de tal tipo de trayectoria.

Las proteína-quinasas, son unas de las mayores familias de proteínas eucarióticas con algunos centenares de miembros conocidos. Estas proteínas, comparten un dominio de 250-300 aminoácidos, el cual puede subdividirse en 12 subdominios distintos, los cuales comprenden la estructura catalítica del núcleo, común. Estos motivos o formaciones conservadas de proteínas, han sido recientemente explotados utilizando estrategias de clonación basadas en PCR, que conducen a una significativa expansión de las quinasas conocidas.

El alineamiento múltiple de las secuencias, en el dominio catalítico de las proteínas quinasas y análisis cautelar subsiguiente, permite la segregación de quinasas relacionadas en las distintas ramas o subfamilias, incluyendo: Tirosino-quinasas, las quinasas cíclicas nucleótido-dependientes, las quinasas de calcio/calmodulina, las quinasas ciclino-dependientes, y las quinasas MAP, los receptores de quinasa de serina-treonina, y algunos otras subfamilias menormente definidas.

Resumen de la invención

Mediante la utilización de una estrategia establecida como objetivo, de clonación por PCR, y de un programa bioinformático de "extracción de motivos", se han identificado miembros mamíferos de la familia kinasa STE-20, como pare de la presente invención. El alineamiento múltiple del análisis cautelar subsiguiente del dominio catalítico de todos estos miembros de la familia STE20, revela el hecho de que, estas proteínas, se agrupan en 9 distintos subgrupos. La clasificación en esta forma, ha probado ser altamente precisa, no únicamente en la predicción de motivos o formaciones presentes en la porción remanente no catalítica de cada proteína, sino también en su regulación, substratos y trayectorias de señalización. La presente invención, incluye la secuencia parcial o completa de un nuevo miembro de la familia STE20, su clasificación, estructura de proteína predicha o deducida, y una estrategia para elucidar su relevancia biológica y terapéutica.

Así, de esta forma, un primer aspecto de la invención, representa una molécula aislada, enriquecida o purificada, de ácido nucléico, la cual codifica a la STLK2.

Por "aislado", en referencia al ácido nucleico, se quiere dar a entender un polímero de nucleótidos conjugados los unos con los otros, incluyendo DNA y RNA, el cual se encuentra asilado a partir de una fuente natural o que se encuentra sintetizado. El ácido nucleico aislado de la presente invención, es único, en el sentido de que, éste, no se encuentra en un estado puro o separado en la naturaleza. El uso del término "aislado", indica el hecho de que, una secuencia de origen natural, se ha retirado de su entorno medioambiental celular normal (por ejemplo, cromosómico). Así, de esta forma, la secuencia puede encontrarse en una solución libre de células, o emplazarse en un entorno medioambiental celular diferente. El término, no implica el que, la secuencia, sea la única cadena nucleótida presente, sino que, ésta se encuentre esencialmente libre (por lo menos un 90-95% pura) de material no nucleótido, naturalmente asociado con ésta, y así, se distingue de los cromosomas aislados.

Mediante la utilización del término "enriquecido", en referencia al ácido nucleico, se quiere dar a entender el hecho de que, la secuencia específica de DNA ó RNA, constituye una fracción significativamente mayor (de 2 a 5 veces más grande), del DNA ó RNA total presente en las células o solución de interés, que en las células normales o enfermas, o en células a partir de las cuales se tomó la secuencia. Esto podría ser provocado por una persona, mediante la reducción preferente en la cantidad de otro DNA ó RNA presente, o mediante un incremento preferencial en la cantidad de la secuencia específica de DNA ó RNA, o mediante una combinación de las dos. No obstante, debería tomarse debida nota en cuanto al hecho de que, enriquecido, no implica el que no hayan otras secuencias de DNA ó RNA presentes, sino que, únicamente, la cantidad relativas de la secuencia de interés, se ha incrementado de una forma significativa. El término "significativo", se utiliza para indicar el que, el nivel de incremento, es de utilidad para la persona que realiza tal tipo de incremento y, generalmente, significa un incremento relativo con respecto a otros ácidos nucleicos, de aproximadamente por lo menos 2 veces y, de una forma más preferible, de por lo menos 5 a 10 veces, o incluso más. El término, también, no implica que no haya DNA o RNA de otras fuentes. El DNA de otras fuentes, puede comprender, por ejemplo, DNA procedente de un genoma de levadura o bacteriano, o un vector de clonación tal como el pUC19. Este término, se distingue de los sucesos de origen natural, tales como la infección vírica o crecimientos de tipo tumoral, en los cuales, el nivel de mRNA, puede incrementarse de una forma natural, con relación a otras especies de mRNA. Esto significa que, el término, quiere dar a entender que cubre únicamente aquéllas situaciones en las cuales, una persona, ha intervenido para elevar la proporción del ácido nucleico deseado.

Es también ventajoso, para algunos propósitos, el hecho de que, una secuencia de ácido nucléico, se encuentre en forma purificada. El término "purificada", en referencia al ácido nucleico, no requiere un pureza absoluta (tal como una preparación homogénea). En lugar de ello, éste representa una indicación en cuanto al hecho de que, la secuencia, es relativamente más pura que en el entorno medioambiental natural (en comparación con el nivel natural, este nivel, debe ser por lo menos 2-5 veces mayor, por ejemplo, en términos de mg/ml). Los clones individuales aislados a partir de una biblioteca de cDNA, pueden purificarse a homogeneidad electroforética. La moléculas de DNA reivindicadas obtenidas a partir de dichos clones, podrían obtenerse directamente a partir de DNA total o a partir de RNA total. Los clones de cDNA, no son de origen natural, sino que, más bien, se obtienen, de una forma preferible, vía la manipulación de una substancia parcialmente purificada de origen natural (RNA mensajero). La construcción de una biblioteca de cDNA a partir de mRNA, involucra la creación de una substancia sintética (cDNA) y pueden aislarse clones puros individuales de DNA, a partir de la biblioteca sintética, mediante la selección clónica de las células que portan la biblioteca de cDNA. Así, de este modo, el procedimiento el cual incluye la construcción de una biblioteca de cDNA a partir de mRNA y el aislamiento de distintos clones de cDNA, proporciona un rendimiento productivo correspondiente a una purificación de aproximadamente 10^{6} veces mayor, del mensajero nativo. Así, de este modo, se contempla expresamente la purificación de por lo menos un orden de magnitud, de una forma preferible, de dos o tres órdenes de magnitud y, de una forma más preferible, de cuatro o cinco órdenes de magnitud.

Por "polipétido de quinasa", se quiere dar a entender 32 o más aminoácidos contiguos (preferiblemente 40, de una forma más preferible 45, de una forma mayormente preferible 55), que se presentan en la secuencia de aminoácido SEQ ID NO: 2 ó la correspondiente secuencia de aminoácidos en su longitud total. En ciertos aspectos, se prefieren los polipéptidos de 100, 200, 300 ó más aminoácidos. El polipéptido de quinasa, puede codificarse mediante una secuencia de ácido nucléico de longitud total, o por cualquier porción de la secuencia de la longitud total del ácido nucleico, siempre y cuando se conserve la actividad funcional del polipétido.

La secuencia de aminoácidos, será substancialmente similar a la secuencia mostrada en las SEQ IN NO:2, ó a la correspondiente secuencia de aminoácidos en su longitud total, ó fragmentos de ésta. Una secuencia que sea substancialmente similar a la SEQ ID NO:2, tendrá preferiblemente por lo menos un 90% de identidad (de una forma más preferible, por lo menos un 95% y, de una forma mayormente preferible, del 99-100%) de la de la secuencia de la SEQ ID NO:2.

Por "identidad", se quiere dar a entender una propiedad de las secuencias que mide su similitud o relación. La identidad, se mide procediendo a dividir el número de residuos idénticos entre el total de residuos y huecos, y multiplicando el producto por 100. Los "huecos", son espacios en un alineamiento, los cuales son el resultado de adiciones o deleciones de aminoácidos. Así, de este modo, dos copias de exactamente la misma frecuencia, tienen un 100% de identidad, pero, secuencias las cuales se encuentran menos altamente conservadas, y que tienen deleciones, adiciones o reemplazos, pueden tener un menor grado de identidad. Aquéllas personas expertas en el arte de la técnica especializada, reconocerán el hecho de que, se encuentran disponibles algunos programas de computadoras, para determinar la identidad de secuencias, que utilizan parámetros standard, por ejemplo, Blast (Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402), Blast 2 (Altschul, et al. (1990) J. mol. biol. 215: 403-410), y Smith - Waterman (Smith, et al. (1981) J. Mol. Biol. 147: 195-197).

En formas preferidas de presentación, la invención, presenta moléculas de ácidos nucléicos, aisladas, enriquecidas o purificadas, las cuales codifican un polipéptido de quinasa que comprende una secuencia de nucleótidos que: (a) codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO:2, (b) es el complemento de la secuencia de nucleótidos de (a); (c) hibrida bajo condiciones altamente rigurosas a la molécula de nucleótidos de (a), y codifica un polipéptido de quinasa de origen natural, que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2, excepto en cuanto al hecho de que, ésta, carece de uno o más, pero no de todos los siguientes segmentos de residuos de aminoácidos: 1-21, 22-274, ó 275-416 de la SEQ ID NO:2; (e) es el complemento de la secuencia de nucleótidos de (d); (f) codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO:2, de los residuos de aminoácidos 1-21, 22 274 ó 275-416 de la SEQ ID NO:2; (g) es el complemento de la secuencia de nucleótidos de (f); (h) codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO:2, excepto en cuanto a lo referente al hecho de que, ésta, carece de uno o más dominios seleccionados de entre el grupo consistente en un dominio N-terminal, un dominio catalítico, un dominio C-terminal, una región helicoidal enrollada, una región rica en prolina, una región de espaciador, un inserto, una cola C-terminal; ó (i) es el complemento de una secuencia nucleótida de (h).

El término complemento, se refiere a dos nucleótidos los cuales pueden formar interacciones múltiples favorables, el uno con el otro. Así, por ejemplo, la adenina, es complementaria a la timina, puesto que éstas pueden formar dos enlaces de hidrógeno. De una forma similar, la guanina y la citosina, son complementarias, debido al hecho de que, éstas, pueden formar tres enlaces de hidrógeno. Una secuencia de nucleótidos, es el complemento de otra secuencia de nucleótidos, si todos los nucleótidos de la primera secuencia, son complementarios a todos los nucleótidos de la segunda secuencia.

El término "dominio", se refiere a una región de una polipéptido, el cual contiene una función particular. Por ejemplo, dominios N-terminal ó C-terminal de proteínas de transducción de señal, pueden servir funciones, incluyendo, pero no de una forma limitada a ello, el enlace de moléculas que localizan la molécula de transducción de señal, a diferentes regiones de la célula, o el enlace de otras moléculas de señalización directamente responsables para propagar una señal celular particular. Algunos dominios, pueden expresarse separadamente del resto de la proteína y función, por sí mismas, mientras que, otras, pueden permanecer como parte de la proteína intacta, para retener la función. Éstos últimos, se denominan regiones funcionales de proteínas, y se refieren también a dominios.

El término "dominio N-terminal", se refiere a la región extracatalítica localizada entre la metionina iniciadora y el dominio catalítico de la proteína-quinasa. El dominio N-terminal, puede identificarse siguiendo un alineamiento de la secuencia de proteína contra la base de datos no redundante de proteína, para definir el límite N-terminal del dominio catalítico. Dependiendo de su longitud, el dominio N-terminal, puede jugar o no puede jugar un rol interpretativo en la función quinasa. Un ejemplo de la proteína quinasa, cuyo dominio terminal ha mostrado jugar un rol interpretativo regulatorio, es la PAK65, la cual contiene un motivo o formación CRIB para el enlace de Cdc42 y rac (Burbelo, P.D. et al. (1995) J. Biol. Chem 270, 29071-210740).

El dominio N-terminal, se extiende en los residuos de aminoácidos 1-21 de la secuencia presentada en la SEQ ID NO:2.

El término "dominio catalítico", se refiere a una región de la proteína quinasa, la cual es, de una forma típica, de 25-300 aminoácidos de longitud, y es responsable para llevar a cabo la reacción de transferencia de fosfato, desde una molécula donante de fosfato, de alta energía, tal como la ATP o la AGT, a ésta misma (autofosforilación) o a otras proteínas (fosforilación exógena). El dominio catalítico de las proteína-quinasas, está hecho de 12 subdominios, los cuales contienen residuos de aminoácidos altamente conservados, y son responsables para el doblado o multiplicación propio de polipéptidos y para catalizadores. El dominio catalítico, puede identificarse siguiendo un alineamiento de Smith-Waterman de la secuencia de proteína, contra la base de datos redundante de la proteína.

El dominio catalítico, abarca los residuos de aminoácidos 22-274, de la secuencia presentada en la SEQ ID NO:2.

El término "actividad catalítica", tal y como se utiliza aquí, en este documento, define la tasa a la cual el dominio catalítico de la quinasa, fosforiliza un substrato. La actividad catalítica, puede medirse, por ejemplo, procediendo a determinar la cantidad de un substrato convertido a un producto fosforilado, como función del tiempo. La actividad catalítica, puede medirse, mediante procedimientos de la invención, procediendo a mantener el tiempo constante y determinando la concentración de un substrato fosforilado, después de un período fijo de tiempo.

La fosforilación de un substrato, acontece en el sitio activo de una proteína quinasa. El sitio activo, es normalmente una cavidad, en la cual, el substrato, se une a la proteína quinasa, y se fosforiliza.

El término "substrato", tal y como se utiliza aquí, se refiere a una molécula fosforilada por una quinasa de la invención. Las quinasas, fosforilizan substratos en aminoácidos de serina/treonina o tirisina. La molécula, puede ser otra proteína o un polipéptido.

El término "dominio C-terminal", se refiere a la región localizada entre el dominio catalítico o último dominio funcional (localizado lo más próximo al término C), y el residuo aminoácido carboxi-terminal de la proteína-quinasa.

Por dominio "funcional", se quiere dar a entender cualquier región del polipéptido, la cual puede jugar un rol interpretativo regulatorio o catalítico, tal y como se pronostica a partir de la homología de la secuencia de aminoácidos a otras proteínas, o mediante la presencia de secuencias de aminoácidos que pueden dan lugar a conformaciones estructurales específicas (a saber, helicoides enrollados). El dominio C-terminal, puede identificarse procediendo a utilizar un alineamiento de Smith-Waterman de la secuencia de proteína, contra la base de datos de proteína no redundante, para definir el límite C-terminal del dominio catalítico o de cualquier dominio extracatalítico funcional C-terminal. En dependencia de su longitud y de su composición de aminoácidos, el dominio C-terminal, puede jugar, o no, un rol interpretativo regulatorio en la función quinasa. Un ejemplo de una proteína-quinasa cuyo domino C-terminal puede jugar un rol interpretativo regulatorio, es la PAK3, la cual contiene un sitio de enlace de subunidad, G_{b}, heterotrimérico, cerca de su término C (Leeuw, T. et al. (1998) Nature, 391, 191-195).

El dominio C-terminal, abarca los residuos de aminoácidos 275-416, de la secuencia presentada en la SEQ ID NO:2.

El término "trayectoria de transducción de señal", se refiere a las moléculas que propagan una señal extracelular a través de la membrana de célula, para convertirse en una señal intracelular. Esta señal, puede entonces estimular una respuesta celular. Las moléculas de polipéptidos involucradas en los procesos de transducción de señales, son típicamente proteína-tirosina-quinasas receptoras y no receptoras, proteína-fosfatasas receptoras y no receptoras, dominios SRC de homología 2 y 3, proteínas de enlace de fosofotirosina (proteínas que contienen el dominio (PTB y PH) de enlace de SRC homología 2 (SH2) y fosfotirosina), proteínas de enlace ricas en prolina (proteínas que contienen el dominio SH3), factores de intercambio de nucleótidos, y factores de transcripción.

Pueden utilizarse varias condiciones de hibridación de baja o de alta rigurosidad, en dependencia de la especificidad y selectividad deseadas. Estas condiciones, son bien conocidas por parte de aquéllas personas expertas en el arte de la técnica especializada. Como condiciones rigurosas de hibridación, sólo hibridan las secuencias de ácido nucleico altamente complementarias. De una forma preferible, tales tipos de condiciones, evitan el que, la hibridación del ácido nucleico, tengan más de 1 o 2 fallos de emparejamiento, por cada 20 nucleótidos contiguos, de una forma más preferible, tales condiciones evitan la hibridación de ácidos nucleicos que tengan más de 1 ó 2 fallos de emparejamiento, por cada 50 nucleótidos contiguos, de una forma mayormente preferible, tales condiciones, evitan la hibridación de ácidos nucleicos que tengan más de 1 ó 2 fallos de emparejamiento, por cada 100 nucleótidos contiguos. En algunos casos, las condiciones, puede evitar la hibridación de ácidos nucleico que tengan más de 5 fallos de emparejamiento, en la secuencia de la longitud total.

Por condiciones rigurosas de ensayo de hibridación, se quiere dar a entender condiciones de ensayo de hibridación por lo menos tan rigurosas como las siguientes: hibridación en formamida al 50%, 5X SSC, 50 mM NH_{2}PO_{5}, pH 6,8, 0,5% SDS, 0,1 mg/ml de DNA de esperma de salmón tratado por ultrasonidos y 5X solución de Denhart a una temperatura de 42ºC, durante el transcurso de toda la noche; lavado con 2X SSC, 0,1% SDS a 45ºC; y lavado con 0,2 X SSC, 0,1% SDS a 45ºC. Bajo algunas de las condiciones de ensayo de hibridación mayormente rigurosas, el segundo lavado, puede realizarse con 0,1X SSC, a una a un temperatura de hasta 70ºC (Berger y al. (1987) Guide to Molecular Cloning Techniques, -Guía para las técnicas de clonado molecular-, página 421, incorporado aquí, en este documento, a título de referencia, y que incluye algunas figuras, tablas o dibujos). No obstante, otras aplicaciones, pueden requerir el uso de condiciones que caigan entre este juego de condiciones. Procedimientos para determinar las condiciones requeridas para lograr las hibridaciones deseadas, son bien conocidas por parte de aquéllas personas comúnmente expertas en arte de esta técnica especializada, y se basan en varios factores, incluyendo, pero no de una forma limitativa, a las secuencias a hibridar y a las muestras a ser sometidas a tests de ensayo.

En otras formas preferidas de presentación, la invención, presenta moléculas de ácido nucleico, enriquecidas, o purificadas, que codifican el polipéptido de quinasa, el cual comprende adicionalmente un vector o promotor efectivo para iniciar la transcripción en una célula huésped.

La invención, presenta también un ácido nucleico recombinante, preferiblemente, en una célula o un organismo. El ácido nucleico recombinante, puede contener una frecuencia presentada en la SEQ ID NO:1, o un derivado funcional de ésta, y un vector o un promotor efectivo para iniciar la transcripción en una célula huésped. El ácido nucleico recombinante, puede contener, de una forma alternativa, una región transcripcional de iniciación, funcional, en una célula, una secuencia complementaria a una secuencia de RNA que codifica un polipéptido de quinasa, y una región transcripcional funcional en una célula. Las combinaciones de vectores específicos y de células huésped, se discuten aquí, en este documento.

El término "vector", se refiere a un ácido nucleico de hebra individual o de doble hebra, el cual puede transfectarse al interior de células y replicarse dentro de un genoma de células, o independientemente de éste. Una molécula de ácido nucleico de doble hebra, circular, puede cortarse y, mediante ello, linealizarse con el tratamiento con enzimas de restricción. Para aquéllas personas expertas en el arte de esta técnica especializada, se encuentra fácilmente a disposición un surtido de vectores de ácidos nucleicos, enzimas de restricción y los conocimientos de las secuencias nucleótidas cortadas mediante enzimas de restricción. Una molécula de ácido nucleico que codifica a una quinasa, puede inser-
tarse en un vector, mediante el corte del vector con las enzimas de restricción y ligando los dos pedazos conjuntamente.

El término "transfección", define un número de procedimientos para insertar un vector de ácido nucleico u otras moléculas de ácido nucleico, en un organismo celular. Estos procedimientos, involucran una variedad de técnicas, tales como el tratar las células con altas concentraciones de sal, un campo eléctrico, detergente, o DMSO, con objeto de convertir a la membrana o pared exterior de las células, permeable a las moléculas de ácido nucleico de interés o uso de varias estrategias de transducción vírica.

El término "promotor", tal y como se utiliza aquí, en este documento, se refiere a una secuencia de ácido nucleico que se necesita para la expresión de la secuencia de un gen. Las regiones promotoras, varían de organismo a organismo, pero éstas, son bien conocidas por parte de aquéllas personas expertas en el arte de esta técnica especializada, para diferentes organismos. Así, por ejemplo, en los procariotas, la región promotora, contiene ambos, el promotor (el cual dirige la iniciación de la transcripción de RNA), así como también las secuencias de DNA, las cuales, cuando se transcriben en RNA, señalizarán la iniciación de la síntesis. Tales tipos de regiones, incluirán normalmente aquéllas secuencias 5' no codificantes, involucradas con la iniciación de la transcripción y translación, tales como la secuencia TATA, secuencia de bloqueo, secuencia CAAT, y por el estilo.

En formas preferidas de presentación, el ácido nucleico aislado, comprende, consiste esencialmente en, o consiste en, una secuencia de ácido nucleico presentada en la SEQ ID NO:1, ó la correspondiente secuencia en su longitud total, codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2, ó la correspondiente secuencia de amino ácidos en su longitud total, un derivado funcional de ésta, o por lo menos 40, 45, 50, 60, 100, 200, ó 300 aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO:2, ó la correspondiente secuencia de aminoácidos en su longitud total. El polipéptido de quinasa, comprende, consiste esencialmente en, o consiste en, por lo menos 40, 45, 50, 60, 100, 200, ó 300 aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO:2, ó la correspondiente secuencia de aminoácidos en su longitud total, o derivados de ésta. El ácido nucleico, puede aislarse a partir de una fuente natural, mediante clonación de cDNA, o mediante hibridación substractiva. La fuente natural, puede ser de mamíferos, preferiblemente, humanos, sangre, semen o tejido y, el ácido nucleico, puede
sintetizarse mediante el procedimiento del triéster, o mediante la utilización de un sintetizador automatizado de ADN.

El término "mamífero", se refiere, de una forma preferible, a tales tipos de organismos, tales como ratones, ratas, conejos, conejillos de indias, ovejas, cabras, de una forma preferible, gatos, perros, micos y monos y, de una forma mayormente preferible, humanos.

En todavía otras formas preferidas de presentación, el ácido nucleico, es una región conservada o única, por ejemplo, aquéllas que son de utilidad para diseñar sondas de hibridación, para facilitar la identificación y clonación de polipéptidos adicionales, obteniendo anticuerpos a regiones polipéptidas y diseñando oligonucleótidos antisentido.

Por "regiones de ácido nucleico conservadas", se quiere dar a entender regiones presentes en dos o más ácidos nucleicos que codifican un polipéptido de quinasa, a las cuales puede hibridar una secuencia particular de ácido nucleico, bajo reducidas condiciones de rigurosidad. Ejemplos de condiciones de reducida rigurosidad apropiadas para el rastreo de ácido nucleico que codifica polipéptidos de quinasa, se proporcionan en Abe, et al. (J. Biol. Chem. 19:13361-13368, 1992), cuyo trabajo se incorpora aquí, en su totalidad, a título de referencia, incluyendo cualesquiera dibujos, figuras o tablas. De una forma preferible, las regiones conservadas, difieren en no más de 5 de cada 20 nucleótidos, de una forma incluso más preferible, de 2 de cada 20 nucleótidos o, de una forma mayormente preferible, de 1 de cada 20 nucleótidos.

Por "región única de ácido nucleico", se quiere dar a entender una secuencia presente en un ácido nucleico que codifica a un polipéptido de quinasa que no se encuentra presente en una secuencia que codifica a cualquier otro polipéptido de origen natural. Tales tipos de regiones, codifican, de una forma preferible, 23 aminoácidos contiguos (de una forma más preferible, 40, de una forma todavía más preferible, 45 y, de una forma mayormente preferible, 55), mostrados en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:2, ó en la correspondiente secuencia de aminoácidos en su longitud total, o derivados funcionales de ésta. De una forma particular, una región única de ácido nucleico es, de una forma preferible, de origen de mamíferos.

Un segundo aspecto de la segunda invención, presenta una sonda de ácido nucleico para la detección de ácido nucleico que codifica un polipéptido de quinasa en una muestra, en donde, el citado polipéptido, es STLK2. De una forma preferible, la sonda de ácido nucleico, codifica un polipéptido de quinasa que es un fragmento de la proteína codificada por la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO:2, ó las correspondientes secuencias de aminoácidos en su longitud total. La sonda de ácidos nucleicos, contiene una secuencia base de nucleótidos, la cual hibrida a la secuencia mostrada en la SEQ ID NO:1, ó la correspondiente secuencia de aminoácidos en su longitud total, o un derivado funcional de ésta.

En las formas preferidas de presentación, la sonda de ácido nucleico, hibrida a un ácido nucleico que codifica por lo menos 6, 12, 75, 90, 105, 120, 150, 200, 250, 300 ó 350 aminoácidos contiguos de la secuencia mostrada en la SEQ ID NO:2, ó la correspondiente secuencia de aminoácidos en su longitud total, o derivados funcionales de ésta.

Los procedimientos para utilizar las secuencias, incluyen la detección de la presencia o de la cantidad de RNA quinasa en una muestra, procediendo a contactar la muestra con una sonda de ácido nucleico, bajo unas condiciones tales que acontezca hibridación, y detectando la presencia o cantidad de sonda enlazada a la RNA quinasa. El dúplex de ácido nucleico formado entre la sonda y una secuencia de ácido nucleico que codifica polipéptidos de quinasa, puede utilizarse en la identificación de la secuencia de ácido nucleico detectada (Nelson et al., en Nonisotopic DNA Probe Techniques, Academic Press, San Diego, Kricka, ed., página 275, 1992, trabajo éste que se incorpora aquí, a título de referencia, es su integridad, incluyendo los dibujos, figuras o tablas). Pueden construirse equipos, a modo de "kits", para incluir un medio recipiente, el cual tenga una sonda de ácido nucleico dispuesta en su interior.

En un tercer aspecto, la invención, describe una célula o tejido recombinante, que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica al polipéptido de quinasa STLK2. En tales tipos de células, el ácido nucleico, puede encontrarse bajo el control de los elementos genómicos regulatorios, o puede encontrarse bajo el control de elementos regulatorios exógenos, incluyendo un promotor exógeno. Por "exógeno", se quiere dar a entender un promotor el cual no se encuentra normalmente acoplado in vivo, transcripcionalmente a la secuencia de codificación de polipéptidos de quinasa.

El polipéptido, de una forma preferible, es un fragmento de una proteína codificada por la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO:2. Por "fragmento", se quiere dar a entender una secuencia de aminoácidos presente en un polipéptido de quinasa. De una forma preferible, tal tipo de secuencia, comprende por lo menos 32, 45, 50, 60, 100, 200 ó 300 aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO:2, ó de la correspondiente secuencia de aminoácidos de longitud completa, o un derivado funcional de ésta.

En un cuarto aspecto, la invención, presenta el polipéptido de quinasa, aislado, enriquecido o purificado.

"Por aislado", en referencia a un polipéptido, se quiere dar a entender un polímero de aminoácidos (2 ó más aminoácidos), conjugados el uno con el otro, incluyendo polipéptidos que se aíslan a partir de una fuente natural o que se sintetizan. Los polipéptidos aislados de la presente invención, son únicos, en el sentido de que, éstos no se encuentran en un estado puro o separado, en la naturaleza. El uso del término "aislado", indica que, una secuencia de origen natural, se ha retirado de su entorno medioambiental celular natural. Así, de este modo, la secuencia, puede encontrase en una solución exenta de células, o emplazarse en un entorno medioambiental celular diferente. El término, no implica el que, la secuencia, sea la única cadena de aminoácidos presente, sino que, ésta, se encuentra esencialmente exenta (aproximadamente 90-95% pura, en su longitud), de material de aminoácidos naturalmente asociados con ésta.

Mediante la utilización del término "enriquecido", en referencia a un polipéptido, se quiere dar a entender que, la secuencia específica de aminoácidos, constituye una fracción significativamente mayor (de 2 a 5 veces más grande), del total de las secuencias de aminoácidos presentes en las células o solución de interés, que en las células normales o enfermas, o en las células de las cuales se ha tomado la secuencia. Esto podría estar causado por una persona, mediante la reducción preferencial en la cantidad de otras secuencias de aminoácidos presentes, o mediante un incremento preferencial en la cantidad de la secuencia de aminoácidos de interés, o mediante la combinación de las dos. No obstante, debería tomarse debida nota en cuanto al hecho de que, enriquecido, no implica el que no se encuentren presentes otras secuencias de aminoácidos, sino que, la cantidad relativa de la secuencia de interés, se ha incrementado de una forma significativa. El término "significativo", se utiliza aquí, en este caso, para indicar el que, el nivel o incremento, es de utilidad, para la persona que realiza tal incremento y, de una forma general, significa un incremento relativo a las otras secuencias de aminoácidos, de aproximadamente 2 veces mayor, de una forma preferible, por lo menos de 5 a 10 veces mayor, o incluso más. El término, no implica tampoco el hecho de que no haya secuencias de aminoácidos procedentes de otras fuentes. La otra fuente de aminoácidos, puede comprender, por ejemplo, secuencias de aminoácidos codificadas por un genoma de levadura o de bacteria, o un vector de clonación, tal como el pUC19. Se entiende que, el término, cubre únicamente aquéllas situaciones, en las cuales, se ha intervenido para incrementar la proporción de la deseada secuencia de aminoácidos.

Es también ventajoso, para algunos propósitos, el hecho de que, una secuencia de aminoácidos, se encuentre en su forma purificada. El término "purificado", en referencia a un polipéptido, no requiere la pureza absoluta (tal como una preparación homogénea); en lugar de ello, éste representa una indicación en cuanto al hecho de que, la secuencia, es relativamente más pura que en el entorno medioambiental natural. Comparado al nivel natural, este nivel, debería ser, por lo menos, 2-5 veces mayor (por ejemplo, en términos de mg/ml). Se contempla, de una forma expresa, la purificación de por lo menos un orden de magnitud, preferiblemente, de dos o tres órdenes y, de una forma más preferible, de cuatro o cinco órdenes de magnitud. La substancia, se encuentra preferiblemente exenta de contaminación, a un nivel significativo de funcionalidad, por ejemplo, 90%, 95% ó 99% puro.

En formas preferidas de presentación, el polipéptido de quinasa, es un fragmento de proteína, codificado por la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:2, o las correspondientes secuencias de aminoácidos en su longitud total. De una forma preferible, el polipéptido de quinasa, contiene por lo menos 32, 45, 50, 60, 100, 200 ó 300 aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO:2, ó la correspondiente secuencia de aminoácidos en su longitud total, o un derivado funcional de ésta.

En formas preferidas de presentación, el polipéptido de quinasa, comprende una secuencia de aminoácidos que tiene (a) la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO:2, b) la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID: NO:2, excepto en cuanto al hecho de que, ésta, carece de uno o más, pero no de todos los siguientes segmentos de los residuos de aminoácidos 1-21, 22-274, ó 275-416, o de la SEQ ID NO:2; c) la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO:2, de los residuos de aminoácidos 1-21, 22-274, ó 275-416 de la SEQ ID NO:5; d) la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID: NO:2, excepto en cuanto al hecho de que, ésta, carece de uno o más, pero no de todos los dominios seleccionados de entre el grupo consistente en un dominio C-terminal, un dominio catalítico, y un dominio N-terminal.

El polipéptido, puede aislarse a partir de una fuente natural, mediante procedimientos bien conocidos en el arte de la técnica especializada. La fuente natural preferida, puede ser la de mamíferos, preferiblemente, humanos, sangre, semen o tejido y, el polipéptido, puede sintetizarse utilizando un sintetizador polipeptídico automatizado. El polipéptido de quinasa aislado, enriquecido, o purificado, es preferiblemente: un polipéptido STLK2.

En algunas formas de presentación, la invención, incluye el polipéptido recombinante de quinasa STLK2. Por "polipéptido recombinante de quinasa", se quiere dar a entender un polipéptido producido por técnicas de DNA recombinante, de tal forma que, éste, sea distinto de un polipéptido de origen natural, bien ya sea en su ubicación, o bien ya sea en (por ejemplo, presente en una célula o tejido diferente que el que se encuentra en la naturaleza), en su pureza, o en su estructura. Generalmente, un polipéptido recombinante de este tipo, se encontrará presente en una célula, en una cantidad diferente con la respecto a la normalmente observada en la naturaleza.

En un quinto aspecto, la invención, presenta un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal o policlonal) que tiene una afinidad específica de enlace a un polipéptido de quinasa, o un dominio de polipéptido de quinasa o un fragmento en donde el polipéptido es SRLK2. Por "afinidad de enlace específica", se quiere dar a entender el hecho de que, el anticuerpo, se enlaza al polipéptido de quinasa diana, con una mayor afinidad que la que éste se enlaza a otros polipéptidos, bajo unas condiciones específicas. Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, son polipéptidos que contienen regiones que pueden enlazar a otros polipéptidos. El término "afinidad de enlace específica", describe un anticuerpo que se enlaza a un polipéptido de quinasa, con una mayor afinidad que la que éste se enlaza a otros polipéptidos, bajo unas condiciones específicas.

El término "policlonal", se refiere a anticuerpos que son populaciones heterogéneas de moléculas de anticuerpos, derivadas de sueros de animales inmunizados con un antígeno o un derivado antígeno funcional de éstos. Para la producción de anticuerpos policlonales pueden inmunizarse varios animales huéspedes, mediante la inyección de un antígeno. Pueden utilizarse varios adyuvantes para incrementar la respuesta inmunológica, en dependencia de las especies de huéspedes.

"Anticuerpos monoclonales", son populaciones de anticuerpos substancialmente homogéneas, a un antígeno particular. Estos pueden obtenerse mediante cualesquiera técnicas, las cuales proporcionen medios para la producción de moléculas de anticuerpos mediante líneas de células continuas en cultivo. Los anticuerpos monoclonales, pueden obtenerse mediante procedimientos conocidos por parte de aquéllas personas expertas en este arte especializado de la técnica (Kohler et al., Nature 256: 495-497, 1975, y la patente estadounidense U.S. nº 4.376.110, ambos de los cuales, se incorporan aquí, en este documento, a título de referencia, en su íntegra totalidad, incluyendo cualesquiera figuras, tablas o dibujos).

El término "fragmento anticuerpo", se refiere a una porción de un anticuerpo, a menudo, la región hiper-variable, y porciones de las cadenas ligeras y pesadas circundantes, las cuales exhiben una afinidad de enlace especifica para una molécula particular. Una región hiper-variable, es una porción de un anticuerpo, la cual enlaza, de una forma física, al polipéptido diana.

Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que tienen una afinidad de enlace específica a un polipéptido de quinasa de la invención, pueden utilizarse en procedimientos para detectar la presencia y/o la cantidad de polipéptido en una muestra, probando la muestra con el anticuerpo, bajo unas condiciones apropiadas para la formación inmunocompleja de anticuerpos de quinasa y la detección de la presencia y/o cantidad del anticuerpo conjugado al polipéptido de quinasa. Los equipos de diagnóstico, a modo de "kits", para la realización de tales tipos de procedimientos, pueden construirse para incluir anticuerpos o fragmentos de anticuerpos específicos para la quinasa, así como también un conjugado de un compañero de enlace de los anticuerpos o los anticuerpos en sí mismos.

Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo con una afinidad de enlace específica a un polipéptido de quinasa de la invención, puede aislarse, enriquecerse, o purificarse, a partir de un organismo procariótico o eucariótico. Los procedimientos de rutina conocidos por parte de aquéllas personas especializadas en el arte especializado de la técnica, capacitan la producción de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, en ambos, los organismos procarióticos y los organismos eucarióticos. La purificación, enriquecimiento e aislamiento de anticuerpos, los cuales son moléculas de polipéptidos, se describen anteriormente, arriba.

Los anticuerpos que tienen una afinidad de enlace específica a un polipéptido de quinasa de la invención, pueden utilizarse en procedimientos para detectar la presencia y/o la cantidad de un polipéptido de quinasa en una muestra, procediendo a poner en contacto la muestra con el anticuerpo, bajo unas condiciones tales que, se forma un inmunocomplejo, y se detecta la presencia y/o la cantidad de un anticuerpo conjugado al polipéptido de quinasa. Los equipos de diagnóstico, a modo de "kits", para la realización de tales tipos de procedimientos, pueden construirse de tal modo que incluyan un primer recipiente, el cual contenga el anticuerpo, y un segundo recipiente, el cual tenga un conjugado de un compañero de enlace del anticuerpo, y un marcador, tal como, por ejemplo, un radioisótopo. El equipo de diagnóstico a modo de "kit", puede también incluir la notificación de una utilización aprobado por las normas FDA, e instrucciones para ello.

En un sexto aspecto, la invención, presenta un hibridoma, el cual produce un anticuerpo que tiene una afinidad de enlace específica, o un dominio de polipéptido de quinasa, en donde, el polipéptido, es STLK2. Por "hibridoma", se quiere dar a entender una línea de células inmortalizada, la cual es capaz de secretar un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo a la quinasa de la invención. En formas preferidas de presentación, el anticuerpo de la quinasa, comprende una secuencia de aminoácidos que es capaz de enlazar, de una forma específica, a un polipéptido de quinasa de la invención.

En un séptimo aspecto, la invención, presenta un agente de enlace de un polipéptido de quinasa, capaz de enlazarse a un polipéptido de quinasa STLK2. El agente de enlace, es preferiblemente un anticuerpo purificado el cual reconoce un epítopo presente en el polipéptido de quinasa de la invención. Otros agentes de enlace, incluyen moléculas que se enlazan a polipéptidos de quinasa y moléculas análogas que se enlazan a un polipéptido de quinasa. Tales tipos de agentes de enlace, pueden identificarse utilizando ensayos que miden la actividad de medición del compañero de enlace de quinasa, tales como aquéllos que miden la actividad PDGFR.

La invención, se refiere, también, a un procedimiento para el rastreo células humanas que contienen un polipéptido de quinasa de la invención, o una secuencia equivalente. El procedimiento, involucra el identificar el nuevo polipéptido en células humanas, utilizando técnicas que son de rutina y de tipo standard, en el arte de la técnica especializada, tales como aquéllas descritas aquí, en este documento, para la identificación de quinasas de la invención (por ejemplo, clonación, análisis de marcaje de Southern o de Northern, hibridación in situ, amplificación por PCR, etc.).

En un octavo aspecto, la invención, presenta procedimientos para identificar una substancia que modula la actividad quinasa, la cual comprende dos etapas: (a) el contactar el polipéptido de quinasa con una substancia de test de ensayo; (b) la medición de la actividad del citado polipéptido; y (c) la determinación de si, la citada substancia, modula la actividad del citado polipéptido.

El término "modula", se refiere a la capacidad de un compuesto para modificar la función de una quinasa de la invención. Un modulador, de una forma preferible, activa o inhibe la actividad de una quinasa de la invención, en dependencia de la concentración del compuesto expuesto a la quinasa.

El término "activa", se refiere al incremento de la actividad celular de una quinasa. El término "inhibe", se refiere al decrecimiento de la actividad celular de una quinasa. La actividad quinasa es, de una forma preferible, la interacción con un compañero de enlace natural.

El término "modula", se refiere, también, a modificar la función de quinasas de la invención, procediendo a incrementar o hacer decrecer la probabilidad de que, se forme un complejo, entre la quinasa y un compañero natural de enlace. Un modulador, de una forma preferible, incrementa la probabilidad de que se forme tal tipo de complejo, entre la quinasa, y el compañero natural de enlace, en dependencia de la concentración del compuesto expuesto a la quinasa y, de una forma mayormente preferible, hace decrecer la probabilidad de que se forme un complejo, entre la quinasa y el compañero natural de enlace.

El término "complejo", se refiere a un ensamblado o montaje de por lo menos dos moléculas enlazadas la una con la otra. Los complejos de transducción de señal, contienen a menudo por lo menos dos moléculas de proteínas enlazadas la uno con la otra. Así, por ejemplo, una proteína quinasa receptora de tirosina de proteína, GRB2, SOS, RAF y RAS, se ensamblan, para formar un complejo de transducción de señal, como respuesta en un ligando mitogénico.

El término "compañero natural de enlace", se refiere a polipéptidos, lípidos, moléculas pequeñas o ácidos nucleicos, los cuales se enlazan a quinasas, en células. Un cambio en una proteína-quinasa receptora de tirosina de proteína, y un compañero natural de enlace, puede manifestarse, en sí mismo, como una probabilidad incrementada o disminuida en cuanto al hecho de que se forma una interacción, o una concentración incrementada o diminuida de un complejo de compañero de enlace natural/de quinasa.

El término "contactar", tal y como se utiliza aquí, en este documento, se refiere al concepto de mezclar una solución que comprende el compuesto de ensayo con un medio líquido que baña a las células de los procedimientos. La solución que comprende el compuesto, puede también comprender otro componente, tal como por ejemplo dimetilsulfóxido (DMSO), el cual facilita la absorción del compuesto o compuestos de ensayo, al interior de las células de los procedimientos. La solución que comprende el compuesto de ensayo, puede añadirse al medio que baña las células, mediante la utilización de un aparato de suministro, tal como un dispositivo basado en una pipeta o un dispositivo basado en una jeringa.

En un noveno aspecto, la invención presenta procedimientos para identificar una substancia que modula la actividad quinasa en un célula que comprende las etapas de: (a) expresar un polipéptido de quinasa en una célula, en donde, el citado polipéptido, es STLK2, (b) añadir una substancia de ensayo, a la citada célula; y (c), controlar el cambio en un fonotipo de célula o la interacción entre el citado polipéptido y un compañero natural.

El término "expresar", tal y como se utiliza aquí, en este documento, se refiere a la producción de quinasa de la invención, a partir de un vector de ácido nucleico que contiene genes de quinasa en una célula. El vector de ácido nucleico, se transfecta al interior de las células, utilizando técnicas bien conocidas en el arte especializado de la técnica, tal y como se describen aquí, en este documento.

En un décimo aspecto, la invención, proporciona procedimientos para tratar una enfermedad mediante la administración, a un paciente en necesidad de dicho tratamiento, de una substancia que modula la actividad de la quinasa STLK2. De una forma preferible, la enfermedad, se selecciona de entre el grupo consistente en enfermedades o trastornos inmuno-relacionados, trasplantes de órganos, infartos microcardíacos, enfermedades cardiovasculares, apoplejía, fallo renal, trastornos neurodegenerativos oxidantes relacionados con el estrés. De la forma más probable, las enfermedades y los trastornos inmuno-relacionados, incluyen, pero no de una forma limitada a éstos, a la artritis reumatoidea, la aterosclerosis, y los trastornos autoinmunes.

La invención, presenta procedimientos para tratar o prevenir una enfermedad o un trastorno, mediante la administración, a un paciente en necesidad de tal tipo de tratamiento, de una substancia que modula la actividad del polipéptido de quinasa STLK2. De una forma preferible, la enfermedad o trastorno, se selecciona de entre el grupo consistente en enfermedades y trastornos inmuno-relacionados, infarto de miocardio, cardimiopatías, apoplejías, fallo renal y trastornos neurodegenerativos oxidantes relacionados con el estrés. De una forma mayormente preferible, las enfermedades y lo desórdenes inmuno-relacionados, se seleccionan de entre el grupo consistente en artritis reumatoidea, enfermedad inflamatoria crónica del intestino, enfermedad inflamatoria crónica de la pelvis, esclerosis múltiple, asma, osteorartritis, psoriasis, aterosclerosis, rinitis, autoinmunidad, y trasplantes de órganos.

Las substancias de utilidad para el tratamiento de los trastornos o enfermedades relacionados con la quinasa, muestran, de una forma preferible, unos resultados positivos en uno o más de los ensayos in vitro para una actividad correspondiente al tratamiento de la enfermedad o trastorno en cuestión (ejemplos de tales tipos de ensayos, se proporcionan en las referencias, en la sección IV, posteriormente, más abajo. Ejemplos de substancias que pueden rastrearse para una actividad positiva, se proporcionan y se encuentran referenciados en la sección VI que se facilita posteriormente, más abajo, en este documento. Las substancias que modulan la actividad de las quinasas, incluyen, de una forma preferible, aunque no de una forma limitativa, a los oligonucleótidos antisentido y a los inhibidores de proteínas quinasas, tal y como se determina mediante los procedimientos y rastreos referenciados en la sección IV que se facilita posteriormente, abajo, en este documento.

El término "prevenir", se refiere a la acción de disminuir o hacer decrecer la probabilidad de que un organismo contraiga o desarrolle una condición anormal.

El término "tratar", se refiere a la acción de tener un efecto terapéutico y aliviar o abrogar, por lo menos parcialmente, una condición anormal en el organismo.

El término "efecto terapéutico", se refiere a los factores de inhibición o de activación que causan, o contribuyen a la condición anormal. Un efecto terapéutico, alivia o mitiga, en cierta extensión, uno o más de los síntomas de la condición anormal. En referencia al tratamiento de condiciones anormales, un efecto terapéutico, puede referirse a uno o más de los siguientes efectos: (a) un incremento en la proliferación, crecimiento y/o diferenciación de las células; (b) una inhibición (es decir, en enlentecimiento o paro) de la muerte de la célula; (c) la inhibición de la degeneración; (d) el alivio o mitigación, en cierta extensión, de uno o más de los síntomas asociados con la condición anormal; y (e) la intensificación de la función de la populación de la células afectadas.

Los compuestos que demuestran una eficacia contra las condiciones anormales, pueden identificarse tal y como se describe aquí, en este documento.

El término "condición anormal", se refiere a una función en las células o tejidos o un organismo que se desvía de sus funciones normales en dicho organismo. Una condición anormal, puede referirse a la proliferación de las células, la diferenciación de las células, o a la supervivencia de las células.

Las condiciones anormales de proliferación de células, incluyen a los cánceres tales como trastornos fibróticos y mesangiales, angiogénesis y vasculogénesis anormales, curación de heridas, psoriasis, diabetes mellitis, e inflamación.

Las condiciones anormales de diferenciación, incluyen, pero no de una forma limitativa, a los trastornos neurodegenerativos, tasas o grados lentos de curación de heridas, y tasas o grados lentos de curación de injertos de tejidos.

Las condiciones anormales de supervivencia de células, se refiere a unos condiciones, en las cuales, las trayectorias programadas de la muerte de las células (apoptosis), se activan o se abrogan. Un determinado número de proteína-quinasas, se encuentran asociadas con los cursos o trayectorias de apoptosis. Las aberraciones en la función de cualesquiera de las proteínas quinasas, podrían conducir a la inmortalidad de las células o la muerte prematura de las células.

El término "aberración", conjuntamente con la función de una quinasa, en un proceso de transducción de señal, se refiere a una quinasa, la cual se encuentra sobre o infra-expresada, en un organismo mutado, de tal forma que, su actividad catalítica, es inferior o mayor que la actividad de la proteína quinasa del tipo salvaje, mutada de tal forma que, ésta, no se modifica ya más por parte de otra proteína quinasa o proteína fosfatasa, o no interreacciona ya más con un compañero de enlace natural.

El término "administrar", se refiere a un procedimiento de incorporación de un compuesto en las células o tejidos de un organismo. La condición anormal, puede prevenirse o tratarse cuando, las células o tejidos del organismo, existen en el interior del organismo o en el exterior del organismo. Las células que existen fuera del organismo, pueden mantenerse o crecer en placas de cultivo de células. Para células recolectadas en el interior del organismo, existen muchas técnicas, en el arte de la técnica especializada, para administrar compuestos, incluyendo (pero no de una forma limitativa), aplicaciones parenterales, dermales, por inyección y mediante aerosol. Para células que se encuentran en el exterior del organismo, existen múltiples técnicas, en el arte de la técnica especializada, para administrar los compuestos, incluyendo (pero no de una forma limitativa), técnicas de microinyección, técnicas de transformación, y técnicas de soportes o vehículos.

La condición anormal, puede también prevenirse o tratarse, procediendo a administrar un compuesto a un grupo de células que tienen una aberración en la trayectoria o curso de una transducción de señal, a un organismo. El efecto de administrar un compuesto en la función del organismo, puede ser controlado. El organismo, es preferiblemente un ratón, una rata, un conejo, un conejillo de indias, una cabra, de una forma más preferible, un mico o mono y, de una forma más preferible, un humano.

En un undécimo aspecto, la invención, presenta procedimientos para la detección de un polipéptido de quinasa, en una muestra, como una herramienta de diagnóstico para enfermedades o trastornos, en donde, el procedimiento, comprende las etapas: (a) el poner en contacto la muestra con una sonda de ácido nucleico, la cual hibrida bajo condiciones de ensayo de hibridación a una región diana de ácido nucleico del polipéptido de quinasa STLK2, comprendiendo, la citada sonda, la secuencia de ácido nucleico que codifica al polipéptido, fragmentos de ésta, y los complementos de la secuencias y fragmentos; y (b) la detección de la presencia o cantidad de sonda: híbrido de la región diana, como una indicación de la enfermedad.

En formas preferidas de presentación de la invención, la enfermedad o desorden, se selecciona de entre grupo consistente en artritis reumatoidea, arterosclerosis, trastornos autoinmunes, trasplante de órganos, infarto de miocardio, cardiomiopatías, apoplejía, fallo renal, trastornos neurodegenerativos oxidantes relacionados con el estrés, y cáncer.

La "región diana" de quinasa, es la secuencia de bases de nucleótidos SEQ ID NO:1, un derivado funcional de ésta, o un fragmento de ésta, al cual hibridará específicamente la sonda de ácido nucleico. La hibridación específica, indica el hecho de que, en presencia de otros ácidos nucleicos, la sonda, únicamente hibrida, de una forma detectable, con la quinasa de la región diana de la invención. Las regiones diana putativas, pueden identificarse mediante procedimientos que son bien conocidos en el arte de esta técnica especializada, consistentes en un alineamiento y comparación de las secuencias más íntimamente relacionadas en la base de datos.

En formas preferidas de presentación, la sonda de ácido nucleico, hibrida a un región diana de quinasa, que codifica a por lo menos a 6, 12, 75, 90, 105, 120, 150, 200, 250, 300 ó 350 aminoácidos contiguos de la secuencia presentada en la SEQ ID NO:2, ó la correspondiente secuencia de aminoácidos en su longitud completa, o un derivado funcional de ésta. Las condiciones de hibridación, deberían ser tales que, la hibridación, acontezca únicamente con los genes de quinasa, en presencia de otras moléculas de ácido nucleico. Bajo rigurosas condiciones de hibridación, únicamente hibridan secuencias complementarias de ácido nucleico, altamente complementarias. De una forma preferible, tales tipos de condiciones, previenen la hibridación de ácidos nucleicos que tengan más de 1 ó 2 emparejamientos fallidos de cada 20 nucleótidos contiguos. Tales tipos de condiciones, se definen anteriormente, arriba.

Las enfermedades cuya detección de genes de quinasa en una muestra podría conducir a su diagnóstico, incluyen a enfermedades, en la cuales, se procede a amplificar ácido nucleico de quinasa (DNA y/o RNA), en comparación con células normales. Por "amplificación", se quiere dar a entender números incrementados de DNA ó RNA quinasa, en una célula, en comparación con células normales. En células normales, las quinasas, se encuentran, de una forma típica, como genes de copia individual. En enfermedades seleccionadas, la ubicación cromosómica de los genes de quinasa, pueden amplificarse, dando como resultado copias múltiples del gen, o amplificación. La amplificación de genes, puede conducir a la amplificación de RNA quinasa, o puede amplificarse RNA quinasa, en ausencia de amplificación de DNA quinasa.

"Amplificación", puesto que ésta se refiere a RNA, puede ser la presencia detectable de RNA quinasa, en células, debido al hecho de que, en algunas células normales, no existe expresión basal de RNA quinasa. En otras células normales, existe un nivel basal de la expresión de quinasa y, por lo tanto, en estos casos, la amplificación, es la detección en un valor de por lo menos 1-2 veces mayor de RNA quinasa y, de una forma preferible, un valor mayor, en comparación con el nivel basal.

Las enfermedades que podrían diagnosticarse mediante la detección de ácido nucleico de quinasa, en una muestra, incluyen, de una forma preferible, a los cánceres. Las muestras de ensayo apropiadas para procedimientos de ensayo con sondas de ácido nucleico, de la presente invención, incluyen, por ejemplo, extractos de células o de ácido nucleico de células, o fluidos biológicos. La muestras utilizadas en los procedimientos descritos anteriormente, arriba, variarán en base al formato de ensayo, el procedimiento de detección y la naturaleza de los tejidos, células o extractos a ser ensayados. Los procedimientos para preparar extractos de ácidos nucleicos de células, son bien conocidos en el arte de la técnica especializada, y pueden fácilmente adaptarse, con objeto de obtener una muestra que sea compatible con el procedimiento utilizado.

En un aspecto final, la invención, presenta un procedimiento para la detección de un polipéptido de quinasa en una muestra, como una herramienta de diagnóstico para una enfermedad o trastorno, en donde, el procedimiento, comprende: (a) la comparación de una región de ácido nucleico diana, que codifica al polipéptido de quinasa en una muestra, en donde, el polipéptido de quinasa, es STLK2, o uno o más fragmentos de ésta, con una región de ácido nucleico diana, que codifica el polipéptido de quinasa, o uno o más fragmentos de ésta; y (b) la detección de las diferencias en secuencia o cantidad entre la región diana y la región de control diana, como una indicación de la enfermedad o trastorno. De una forma preferible la enfermedad o trastorno, se selecciona de entre el grupo consistente en enfermedades o trastornos inmuno-relaccionados, trasplantes de órganos, infartos microcardíacos, enfermedades cardiovasculares, apoplejía, fallo renal, trastornos neurodegenerativos oxidantes relacionados con el estrés, y cáncer. Las enfermedades y trastornos inmuno-relacionados, incluyen, pero no de una forma limitativa en cuanto a ellos, a aquéllos que se han discutido previamente.

El término "comparar", tal y como se utiliza aquí, en este documento, se refiere a la identificación de discrepancias entre la región de ácido nucleico diana aislada de una muestra, y la región de control diana de ácido nucleico. Las discrepancias, pueden encontrarse en las secuencias de nucleótidos, por ejemplo, inserciones, deleciones, o mutaciones puntuales, o en la cantidad de una secuencia de nucleótidos dada. Los procedimientos para determinar estas discrepancias en secuencias, son bien conocidos para aquéllas personas comúnmente expertas en el arte de esta técnica especializada. El "control" de la región de ácido nucleico diana, se refiere a la secuencia o cantidad de la secuencia encontrada en células normales, por ejemplo, células que no se encuentran enfermas tal y como se ha discutido previamente, arriba.

La invención, se ha descrito aquí, de una forma extensa y genérica. Cada una de las especies más reducidas o estrechas y agrupaciones subgenéricas que caigan dentro de la revelación genérica, forman también parte de la invención. Esto incluyen a la descripción genérica de la invención, con la condición o limitación negativa que elimina cualquier cuestión objetiva de género, independientemente en cuanto al hecho de que, el material eliminado, se encuentre, o no, específicamente mencionado aquí.

El resumen de la invención descrita anteriormente, arriba, en este documento, no es limitativa, y pueden aparecer otras características y ventajas de la invención, a partir de la descripción detallada de la invención y de las reivindicaciones.

Descripción resumida de la invención

La figura 1, muestra una secuencia múltiple de alineamiento de las secuencias de aminoácidos de las familias de quinasas STE20-STE20.

La figura 2, muestra la secuencia de aminoácidos de STLK2 humana.

La figura 3, muestra la secuencia de ácidos nucleicos de STLK2 humana.

Descripción detallada de la invención

La presente invención, se refiere, en parte, a polipéptidos de quinasa, ácidos nucleícos que codifican tales polipéptidos, células que contienen tales tipos de ácidos nucleicos, anticuerpos con respecto a tales polipéptidos, ensayos que utilizan tales tipos de polipéptidos, y procedimientos que se refieren a todo lo anterior. La presente invención, se base en el aislamiento y caracterización de polipéptidos de quinasa. Los polipéptidos y ácidos nucleicos, pueden producirse utilizando técnicas de síntesis standard y bien conocidas, cuando se dan las secuencias aquí presentadas.

La reciente aclaración de la secuencia de DNA de la Saccharomyces cerevesiae, ha proporcionado el primer ejemplo completo de la información genética contenida en un organismo eucariótico simple. El análisis de este genoma de levadura, revela el hecho de que, éste, contiene por lo menos 113 proteína-quinasas. Estas quinasas, se subdividieron adicionalmente en varios grupos estructuralmente relacionados. Uno de estos grupos nuevamente definido, se denominó como familia STE20, para representar a su miembro encontrado STE20, el cual es una proteína-quinasa involucrada en la trayectoria o curso de respuesta de feromona, el cual origina una cascada de proteína quinasa como respuesta a una señal mediatizada por proteína G. La S. cerevesiae, tiene dos miembros adicionales de esta familia, CLA4, y YOL113W (HRA655).

Varios homólogos de mamíferos, han sido recientemente identificados como pertenecientes a la familia STE20, incluyendo SOK-1, (STE20 humana), quinasa GC, KHS, HPK1, SLK, GEK, PAK1, PAK65, MST1, y CDC7. Adicionalmente, los esfuerzos de trabajos sobre el genoma de la Drosophila y de la C. elegans, han identificado proteína-quinasas adicionales, las cuales pertenecen a la familia ST20, pero, no obstante, éstas tienen dominios extracatalíticos estructuralmente únicos, incluyendo a las quinasas ZC504.4 y SULU procedentes de la C. elegans, y NINAC procedente de la Drosophila.

Las proteína-quinasas relacionadas con la STE20, han sido implicadas como regularizadoras de una variedad de respuestas inmunes, incluyendo la respuesta a los factores de crecimiento o citoquinas, trayectorias del estrés oxidantes o relacionadas con rayos UV o con irradiaciones, señales inflamatorias (por ejemplo, TNF\alpha), estimulaciones apoptóticas (por ejemplo, Fas), co-estimulaciones de la células T y B, el control de la arquitectura citoesquelética, y la transformación celular. De una forma típica, las quinasas relacionadas con STE210, sirven como reguladores corriente arriba de cascadas MAPK. Los ejemplos incluyen a: KPK1, una quinasa de proteína-serina/treonina, (STK), la cual posee un dominio semejante a STE20, el cual activa una trayectoria de proteína-quinasa que conduce a la proteína-quinasa SAP/JNK, activada por el estrés; PAK1, una STK, con un dominio de codificación de DCC42, corriente arriba, que interactúa con Rac, y juega un rol interpretativo en la transformación celular, a través de la trayectoria de Ras-MAPK, y NIK murina, la cual interactúa con quinasas de tirosina receptoras corriente arriba, y conecta con una familia de quinasa STE11, corriente abajo.

Las quinasas STE20, poseen una variedad de dominios no catalíticos, los cuales se cree que interactúan con reguladores corriente arriba. Los ejemplos, incluyen a los dominios ricos en prolina, para la interacción con proteínas que contienen SH3, o dominios específicos para la interacción con las pequeñas proteínas G del tipo Rac, Rho, Rab. Estas interacciones, pueden proporcionar un mecanismo para el diálogo cruzado entre distintas trayectorias bioquímicas, como respuesta a estímulos externos tales como la activación de una variedad de receptores de la superficie de las células, incluyendo quinasas de tirosinas, receptores de citoquinas, receptor TNF, FAS, receptores de células T, CD28 ó CD40.

I. Los ácidos nucleicos de la invención

En el ámbito de la presente invención, se encuentran incluidos los equivalentes funcionales de las moléculas aisladas de ácido nucleico, descritas aquí, en este documento. La capacidad de degeneración del código genético, permite la sustitución de ciertos codones por otros codones, que especifican a los mismos aminoácidos y, así, de este modo, darían lugar a la misma proteína. La secuencia de ácido nucleico, puede variar de una forma substancial, debido al hecho de que, con la excepción de la metionina y del triptófano, los conocidos aminoácidos, pueden codificarse para más de un codón. Así, de este modo, las porciones o la totalidad de los genes de quinasa de la invención, podrían sintetizarse para proporcionar una secuencia de ácido nucleico significativamente diferente de la que se muestra en la SEQ ID NO:1. La secuencia de aminoácidos codificada, de éstos, no obstante, se preservaría.

Adicionalmente a ello, la secuencia de ácido nucleico, puede comprender una secuencia nucléotida, la cual resulta de la adición, deleción o sustitución de por lo menos un nucleótido, en el extremo 5' y/o el extremo 3' de la fórmula del ácido nucleico mostrada en la SEQ ID NO:1, o un derivado de ésta. En este sentido, puede utilizarse cualquier nucleótido o polinucleótido, con la condición de que, su adición, deleción o sustitución, no altere la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2, la cual se encuentra codificada por la secuencia nucleótida. Así, por ejemplo, se pretende que, la presente invención, incluya cualquier secuencia de ácido nucleico resultante de la adición de ATG como un codón de iniciación, en el extremo 5' de la secuencia de ácido nucleico de la invención, o de la adición de TTA, TAG o TGA, como un codón de terminación, en el extremo 3' de las secuencia nucleótida de la invención, o su derivado. Además de ello, la molécula de ácido nucleico de la presente invención, puede tener, en la medida que sea necesario, sitios de restricción de reconocimiento de endonucleasa, añadidos a su extremo 5' y/o extremo 3'.

Tales tipos de alteraciones funcionales de una secuencia de ácido nucleico dada, proporcionan una oportunidad para fomentar la secreción y/o el procesado de proteínas heterólogas codificadas por una secuencia de ácido nucleico extraña, fusionadas a ésta. Todas las variaciones de la secuencia nucleótida de los genes de quinasa de la invención y fragmentos de ésta, permitidos por el código genético, se encuentran, por lo tanto, incluidas en esta invención.

Además, es posible el proceder a la deleción de codones o sustituir uno o más codones, con codones distintos de los codones degenerados, para producir un polipéptido estructuralmente modificado, pero que tenga, uno de ellos, substancialmente la misma utilidad o actividad que el polipéptido producido por la molécula no modificada de ácido nucleico. Tal y como se reconoce en el arte correspondiente a esta técnica especializada, los dos polipéptidos, son funcionalmente equivalentes, tal y como lo son las dos moléculas de ácido nucleico que dan lugar a su producción, incluso a pesar de que, la diferencia entre las moléculas de ácido nucleico, no se encuentren relacionadas con la degeneración del código genético.

STLK2 de mamíferos

El STLK2-cDNA humano, en su longitud total (SEQ ID NO:1), es de una longitud de 3268 pb, y consiste en un marco de lectura abierto (ORF) de 1248 pb, el cual se encuentra flanqueado por un región no traducida 5' de 181 pb (UTR; 1-181) y una UTR 3' de 1784 pb (1433-3216), a la cual le sigue un región poliadenilada de 52 nucleótidos. En las posiciones (3193-3198), se encuentra una señal de poliadenilación (AATAAA). La secuencia que flanquea a laprimera ATG, conforma, según el consenso de Kozac (Kozak, M., Nucleic Acids Res. 15, 8125-8148 (1987), una metionina de iniciación, y se cree que es el sitio de inicio de traducción para la STLK2. Además de ello, la STLK2 humana y las proteínas SOK-1- y MST3-relacionadas, conservan la secuencia de aminoácidos que sigue inmediatamente a esta presumible metiotina de iniciación.

Algunos fragmentos de EST, abarcan la secuencia completa de STLK2, con AA191319, en el extremo 4', y W16504 en el extremo 3'.

II. Sondas de ácido nucléico, procedimientos y equipos a modo de "kit" para la detección de quinasas STE20-relacionadas

Con objeto de probar o sondear una biblioteca cromosómica o de cDNA, apropiada, puede utilizarse una sonda de ácido nucleico de la presente invención, mediante procedimientos usuales de hibridación, para obtener moléculas de ácido nucléico de la presente invención. Puede prepararse una biblioteca de DNA cromosómico o de cDNA, a partir de células apropiadas, en concordancia con procedimientos reconocidos en el arte de esta técnica especializada (compárese con "Molecular Cloning: A Laboratory manual", -"Clonación molecular: Un manual de lobarotorio"- segunda edición. Cold Spring Harbor Laboratory, Sambrook, Fritsch & Maniatis, eds. 1989).

Como alternativa, puede llevarse a cabo una síntesis química, con objeto de obtener sondas de ácido nucleico que tengan secuencias de nucleótidos, las cuales correspondan a porciones N-terminales y C-terminales de la secuencia de aminoácidos del polipéptido de interés. Las sondas de ácido nucleico sintetizadas, pueden utilizarse como cebadores, en una reacción en cadena de la polimerasa (PCR), realizada en concordancia con técnicas de PCR reconocidas, esencialmente, en concordancia con los protocolos de PCR, "A Guide to Methods and Applications", -"Una guía para procedimientos y aplicaciones"-, Academic Press, Michael, et al., eds., 1990, utilizando la apropiada biblioteca cromosómica o de CDNA, par obtener el fragmento de la presente invención.

Una persona experta en el arte de la técnica especializada, puede diseñar fácilmente tales tipos de sondas basadas en las secuencias dadas aquí a conocer, en este documento, utilizando procedimientos de alineamiento y análisis de secuencias, por computadora, los cuales son conocidos en el arte de esta técnica especializada ("Molecular cloning: A laboratory manual", -Clonación molecular, un manual de laboratorio, 1989-, anteriormente citado). Las sondas de hibridación de la presente invención, pueden marcarse mediante técnicas standard de marcaje o etiquetado, tal como mediante un radio-marcador, un marcador de enzimas, un marcador fluorescente, un marcador de biotina-avidina, un marcador quimio-luminiscente, y por el estilo. Después de la hibridación, las sondas, pueden visualizarse utilizando procedimientos conocidos.

Las sondas de ácido nucléico de la presente invención, incluyen sondas de RNA así como también sondas de DNA, generándose, dichas sondas, utilizando técnicas conocidas en el arte especializado de la técnica. La sonda de ácido nucleico, puede inmovilizarse sobre un soporte sólido. Los ejemplos de tales tipos de soportes sólidos, incluyen, pero no de una forma limitativa en cuanto a ellos, a los plásticos, tales como el policarbonato, a hidratos de carbono complejos, tales como la agarosa y la sefarosa, a las resinas acrílicas, tales como las perlas de poliacrilamida y de látex. Las técnicas para acoplar sondas de ácido nucleico, a tales tipos de soportes sólidos, son bien conocidas en el arte de la técnica especializada.

Las muestras de ensayo apropiadas para los procedimientos de sondeo de ácido nucleico de la presente invención, incluyen, por ejemplo, a extractos de células o de ácido nucleico, o a fluidos biológicos. Las muestras utilizadas en los procedimientos anteriormente descritos, arriba, variarán en base al formato de ensayo, el procedimiento de detección y la naturaleza de los tejidos, células o extractos a ser ensayados. Los procedimientos para preparar extractos de ácido nucleico de células, son bien conocidos en el arte de la técnica especializada, y pueden adaptarse fácilmente, con objeto de obtener una muestra, la cual sea compatible con el procedimiento utilizado.

Un procedimiento para la detección de la presencia de ácidos nucleicos de la invención, en una muestra, comprende, (a) el poner en contacto la citada muestra, con la sonda de ácido nucleico anteriormente descrita, arriba, bajo unas condiciones tales que acontezca hibridación, y (b), el detectar la presencia de la citada sonda, enlazada a la citada molécula de ácido nucleico. Una persona especializada en arte de esta técnica especializada, seleccionaría la sonda de ácido nucleico, en concordancia con técnicas conocidas en el arte de la técnica especializada, tal y como se ha descrito anteriormente, arriba. Las sondas a ser sometidas a tests de ensayo, incluyen, pero no de una forma limitativa en cuanto a éstas, a muestras de RNA de tejido humano.

Un equipo, a modo de "kit", para detectar la presencia de ácidos nucleicos de la invención, en una muestra, comprende por lo menos un medio a modo de recipiente contenedor, el cual tiene dispuestos, en éste, la sonda anteriormente descrita de ácido nucleico. El equipo a modo de "kit", puede adicionalmente comprender otros recipientes contenedores que comprenden uno o más de los siguientes: reactivos de lavado y reactivos capaces de detectar la presencia de una sonda de ácido nucleico enlazada. Los ejemplos de reactivos de detección, incluyen, por no de una forma limitativa en cuanto a éstos, a sondas radio-marcadas, sondas enzimáticamente marcadas (peroxidasa del rábano picante, fosfatasa alcalina), y sondas marcadas de afinidad (biotina, avidina, o esteptavidina).

En detalle, un equipo a modo de "kit", compartimentado, incluye a cualquier equipo a modo de "kit", en el cual, los reactivos, se encuentran ubicados en recipientes contenedores separados. Tales tipos de recipientes contenedores, incluyen a reducidos recipientes contenedores de vidrio, recipientes contenedores de plástico, o tiras de plástico o de papel. Tales tipos de recipientes contenedores, permiten la transferencia eficiente de reactivos, desde un compartimiento hasta otro compartimiento, de tal forma que, las muestras y reactivos, no se contaminen de una forma cruzada y, los agentes o soluciones de cada recipiente contenedor, puedan añadirse de una forma cuantitativa desde un compartimiento al otro. Tales tipos de contenedores, incluirán un recipiente contenedor, el cual acogerá la muestra de ensayo, un recipiente contenedor el cual contiene las sonda de cebadores utilizada en el ensayo, recipientes contenedores los cuales contienen reactivos de limpieza (tal como soluciones salinas fosfatadas, tamponadas, tris-tampones, y por el estilo), y recipientes contenedores los cuales contienen reactivos utilizados para detectar la sonda de hibridación, anticuerpo de enlace, producto amplificado, o por el estilo. Una persona especializada en el arte especializado de la técnica, reconocerá rápida y fácilmente el hecho de que, las sondas de ácido nucleico descritas en la presente invención, pueden incorporarse fácilmente en los formatos de equipos a modo de "kit" establecidos, los cuales son bien conocidos en el arte especializado de la técnica.

III. Construcciones de DNA, que comprenden una molécula de ácido nucléico relacionada con STE20 y células que contienen estas construcciones

La presente invención, se refiere también a una molécula de DNA recombinante que comprende, 5' a 3', un promotor efectivo para iniciar la transcripción en una célula huésped y las moléculas de ácido nucleico anteriormente descritas, arriba. Adicionalmente a ello, la presente invención, se refiere a una molécula de DNA recombinante, que comprende un vector y una molécula de ácido nucleico arriba descrita. La presente invención, se refiere también a una molécula de ácido nucleico que comprende una región transcripcional funcional, en una célula, una secuencia complementaria a una secuencia de RNA que codifica a una secuencia de aminoácidos que corresponde al polipéptido anteriormente descrito, arriba, y una región transcripcional de terminación, funcional, en la citada célula. Las moléculas anteriormente descritas, arriba, pueden ser moléculas de DNA aisladas y/o purificadas.

La presente invención, se refiere también a una célula o un organismo, el cual contiene la molécula anteriormente descrita, arriba, de ácido nucleico y, con ello, es capaz de expresar un polipéptido.

El polipéptido, puede purificarse a partir de células que se han modificado para expresar el polipéptido. Se dice que, una célula, "se modifica para expresar un polipéptido deseado", cuando la célula en cuestión, se manipula, mediante ingeniería genética, de tal forma que produzca una proteína la cual, normalmente, ésta no produce, o la cual, la célula, produce a unos niveles inferiores. Una persona experta en el arte de le técnica especializada, puede fácilmente adaptar procedimientos para la introducir o expresar, bien ya sea secuencias genómicas, secuencias de sDNA ó secuencias sintéticas, en ambas, células eucarióticas o células procariotas.

Se dice que, una molécula de ácido nucleico, tal como el DNA, es "capaz de expresar" un polipéptido, si ésta contiene secuencias nucleótidas las cuales contienen información reguladora transcripcional y traductora y, tales secuencias, están "operativamente ligadas" a secuencias nucleótidas las cuales codifican el polipéptido. Un ligamiento operativo, es un ligamiento, en el cual, las secuencias regulatorias de DNA y las secuencia DNA que se pretende expresar, se encuentran conectadas de tal forma que se permita una expresión genética de la secuencia. La naturaleza precisa de las regiones reguladoras, la cual se necesita para la expresión genética de la secuencia, puede variar de organismo a organismo, pero incluirá, generalmente, una región promotora, la cual en los procariotas, contiene ambos, el promotor (el cual dirige la iniciación de la transcripción de RNA) así como también las secuencias de DNA, las cuales, cuando se transcriben en RNA, señalizarán la síntesis de iniciación. Tales tipos de regiones, incluirán normalmente a aquéllas secuencias 5' no codificantes, involucradas con la iniciación de la transcripción y la traslación, tal como la secuencia TATA, la secuencia de formación del casquete (de bloqueo de extremos), la secuencia CAAT, y por el estilo.

En caso deseado, la región no codificante 3' a la secuencia que codifica a la quinasa de la invención, puede obtenerse mediante los procedimientos anteriormente descritos, arriba. Esta región, puede retenerse para sus secuencias reguladoras transcripcionales de terminación, tales como la terminación y la poliadenilación. Así, de esta forma, reteniendo la región 3' naturalmente contigua a la secuencia de DNA que codifica a la quinasa de la invención, pueden proporcionarse las señales transcripcionales de terminación. Allí en donde, las señales transcripcionales de terminación, no sean satisfactoriamente funcionales en la célula huésped de expresión, se sustituirá entonces una región funcional 3', en la célula huésped.

Se dice que, dos secuencias de DNA (tales como una secuencia de la región promotora y una secuencia que codifica a la quinasa de la invención), se encuentran operativamente ligadas, si la naturaleza del ligamiento entre las dos secuencias de DNA, (1) tiene como resultado la introducción de una mutación del marco de lectura, (2), interfiere con la capacidad de la región promotora para dirigir la transcripción de una secuencia genética que codifica la quinasa de la invención, o (3), interfiere con la capacidad de la secuencia genética de la quinasa de la invención, para que se transcriba mediante la secuencia de la región promotora. Así, de esta forma, la región promotora, se ligará, de una forma operativa, a la secuencia de DNA, si el promotor fuera capaz de efectuar la transcripción de la secuencia de DNA. Así, de esta forma, para expresar el gen que codifica a la quinasa de la invención, son necesarias las señales transcripcionales y de traducción reconocidas por un huésped apropiado.

La presente invención, abarca la expresión de un gen que codifica a la quinasa de la invención (o un derivado funcional de ésta), en ambos tipos de células, procarióticas y eucarióticas. Los huéspedes procarióticos, son, generalmente, muy eficientes y convenientes para la producción de proteínas recombinantes y, por lo tanto, son un tipo de sistema de expresión preferido para quinasas de la invención. Los procariotas, se representan, de la forma más frecuente, mediante varias cepas de E. Coli. No obstante, pueden también utilizarse otras cepas microbianas, incluyendo otras cepas bacterianas.

En sistemas procarióticos, pueden utilizarse vectores de plásmidos que contienen sitios de replicación y secuencias de control derivadas de una especie compatible con el huésped. Los ejemplos de vectores de plásmidos apropiados, pueden incluir a los pBR322, pUC118, pUC119 y por el estilo; los vectores de fagos y bacteriófagos, pueden incluir a los \gammagt10, \gammagt11 y por el estilo; y vectores de virus apropiados, pueden incluir a los pNAM-neo, pKRC y por el estilo. De una forma preferible, el vector seleccionado de la presente invención, tiene la capacidad de replicar en la célula huésped seleccionada.

Los huéspedes procarióticos seleccionados, incluyen a bacterias tales como las E. coli, Bacillus, Streptomyces, Pseudomonas, Salmonella, Serratia, y por el estilo. No obstante, bajo tales tipos de condiciones, el polipéptido, no se glicolizará. El huésped procariótico, debe ser compatible con el replicón y las secuencias de control en el plásmido de expresión.

Para expresar la quinasa de la invención (o un derivado funcional de ésta), en una célula procariótica, es necesario el ligar operativamente la secuencia que codifica la quinasa de la invención, a un promotor procariótico funcional. Tales tipos de promotores, pueden ser, o bien constitutivos, o, de una forma preferible, regulables (es decir, inducibles o desrepresivos). Los ejemplos de promotores constitutivos, incluyen al promotor int del bacteriófago \lambda, el promotor bla de la secuencia genética de la \beta-lactama del pBR322, y el promotor cat de la secuencia genética de la cloranfenicol-acetil-transferasa del pPR325, y por el estilo. Los ejemplos de promotores procarióticos inducibles, incluyen los promotores mayores derecho e izquierdo del bacteriófago \lambda (P_{L} y P_{R}) los promotores tpr, recA, \lambdaacZ, \lambdaacI, y promotores gal de E. coli, la \alpha-amilasa (Ulmanen et al., J. Bacteriol. 162: 176-182, 1985) y los promotores ç-28-específicos de B. Subtilis (Gilmann et al. Gen Secuence, - Secuencia genética, 32: 11-20, 1984), los promotores de los bacteriófagos de Bacillus (Gryczan, In: The Molecular Biology of the Bacilli, -La biología molecular de los bacilos-, Academic Press, Inc., NY, 1982), y promotores de Streptomyces (Ward et al., Mol. Gen. Genet. 203: 468-478, 1986. Los promotores procarióticos, se revisan por parte de Glick (Ind. Microbiot. 1: 277-282, 1987), Cenatiempo (Biochimie 68: 505-516, 1986), y Gottesman (Ann. Tev. Genet. 18: 415-442, 1984).

La expresión apropiada, en una célula procariótica, requiere también la presencia de una sitio de enlace de la ribosoma, corriente arriba de la secuencia que codifica la secuencia genética. Tales sitios de enlace de la ribasoma, se dan a conocer, por ejemplo, por parte de Gold et al. (Ann. Rev. Microbiol. 35: 365-404, 1981). La selección de las secuencias de control, vectores de expresión, procedimientos de transformación, y por el estilo, son dependientes del tipo de célula huésped utilizada, para expresar el gen. Tal y como se utilizan aquí, en este documento, "célula", "línea de células" y "cultivo de células", pueden utilizarse de una forma intercambiable y, todas estas expresiones, incluyen progenie. Así, de este modo, las palabras "transformantes" ó "células transformadas", incluyen la célula objeto primaria, y los cultivos derivados de ésta, sin tener en cuenta el número de transferencias. Se entenderá también el hecho de que, toda la progenie, puede no ser precisamente idéntica, en el contenido del DNA, debido a mutaciones deliberadas o accidentales. No obstante, tal y como se ha definido, la progenie mutante, tiene la misma funcionalidad que la de la célula originalmente transformada.

Las células huésped que pueden utilizarse en la expresión de sistemas de la presente invención, no están estrictamente limitadas, con la condición de que, éstas, sean apropiadas para su uso en la expresión del polipéptido de quinasa de interés. Los huéspedes apropiados, pueden incluir, a menudo, células eucarióticas. Los huéspedes eucarióticos preferidos, incluyen, por ejemplo, a las levaduras, hongos, células de insectos, células de mamíferos, bien ya sea in vivo, o en tejido de cultivo. Las células de mamíferos, las cuales pueden ser de utilidad como huéspedes, incluyen a las células HeLa, células de origen de fibroplastos, tales como VERO ó CHO-K1, o células de origen linfoide, y sus derivados. Las células preferidas de mamíferos, incluyen a las SP2/0 y J558L, así como también líneas de células de neuroblastomas, tales como las IMR 332, las cuales pueden proporcionar mejores capacidades para un procesado de post-traducción, correcto.

Adicionalmente a ello, las células de plantas, son también asequibles como huéspedes, y son asequibles secuencias de control compatibles con células de plantas, tales como el virus del mosaico de la coliflor, 35S y 19S, y el promotor de nopalina-sitasa y secuencias de señal de poliadición. Otro huésped preferido, es una célula de insecto, por ejemplo, la Drosophila larvae. Utilizado células de insectos como huéspedes, puede utilizarse el promotor de alcohol-deshidrogenasa de la Drosophila (Rubin, Science, 240: 1453-1459, 1988). De una forma alternativa, pueden diseñarse, mediante ingeniería genética, vectores de baculovirus, para expresar mayores cantidades de quinasas de la invención en células de insectos (Jasny, Science 238:1653, 1987; Miller et al., In: Genetic Engineering, Vol. 8, Plenum, Setlow et al., eds., páginas 277-297, 1986).

Puede utilizarse cualquiera de las series de los sistemas de expresión de levaduras, las cuales incorporen elementos de promotor y terminación procedentes de las secuencias activamente expresadas que codifiquen para enzimas glicolíticas que se producen en amplias cantidades cuando las levaduras se hacen crecer en medios ricos en glucosa. Las conocidas secuencias genéticas glicolíticas, pueden también producir señales transcripcionales de control muy eficientes. La levadura, proporciona ventajas substanciales consistentes en el hecho de que, éstas, pueden portar modificaciones post-operatorias. Existe un gran número de estrategias de DNA recombinante, utilizando secuencias de promotoras fuertes, y un gran número de copias de plásmidos, las cuales pueden utilizarse para la producción de las proteínas deseadas en una levadura. La levadura, reconoce a las secuencias conductoras en genes clonados de mamíferos, y segrega péptidos que portan secuencias conductoras (por ejemplo, pre-péptidos). Algunos posibles sistemas de vectores, se encuentran disponibles para la expresión de la quinasa de la invención, en un huésped
mamífero.

Pueden emplearse una gran variedad de secuencias regulatorias transcripcionales y de traducción (translacionales), en dependencia de la naturaleza del huésped. Las señales reguladoras transcripcionales y de traducción, pueden derivarse de fuentes víricas, tales como los adenovirus, virus del papiloma bovino, citomegalovirus, virus símico, y por el estilo, en donde, las señales regulatorias, se encuentran asociadas con unas secuencia genética particular, la cual tiene un alto nivel de expresión. De una forma alternativa, pueden emplearse los promotores procedentes de los productos de expresión, mamíferos, teles como la actina, el colágeno, la miosina y por el estilo. Pueden seleccionarse señales reguladoras transcripcionales de iniciación, las cuales permitan la represión o la activación, de tal forma que se pueda modular la expresión de las secuencias genéticas. Son de interés, las señales reguladoras las cuales son sensibles a la temperatura, de tal forma que, procediendo a variar la temperatura, puede reprimirse o iniciarse la expresión, o que se someten a la regulación química (tal como un metabolito).

La expresión de la quinasa de la invención en huéspedes eucarióticos, requiere el uso de regiones eucarióticas regulatorias. Tales tipos de regiones, incluyen, por regla general, una región promotora suficiente como para dirigir la iniciación de la síntesis de RNA. Los promotores eucarióticos preferidos, incluyen, por ejemplo, al promotor de la secuencia genética de la metalotioneína I del ratón (Hamer et al., J. Mol. Appl. Gen. 1: 273-288, 1982); el promotor TK del virus del Herpes (McKnight, Cell 31: 355-365, 1982), el promotor temprano SV40 (Benoist et al., Nature (London) 290: 304-31, 1981); y el promotor de la secuencia genética de la levadura gal4 (Johnston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79: 6971-6975, 1982; Silver et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 81: 5951-5955, 1984).

La traducción del mRNA eucariótico, se inicia en el codón que codifica a la primera metionina. Por esta razón, es preferible el asegurar el hecho de que, el ligamiento entre un promotor eucariótico y una secuencia de DNA la cual codifica a una quinasa de la invención, (o un derivado de ésta), no contenga ningún codón de intervención que sea capaz de codificar a una metionina (es decir, AUG). La presencia de tales tipos de codones, tiene como resultado bien ya sea la formación de una proteína de fusión (si el codón AUG se encuentra en el mismo marco de lectura), o bien ya sea mutación del cambio del marco de lectura (si el codón AUG no se encuentra en el mismo marco de lectura que la quinasa de la invención).

Puede introducirse, en la célula procariota o eucariota recipientaria, una molécula de ácido nucleico que codifica a la quinasa de la invención y un promotor operativamente ligado, como ambas, una molécula de DNA ó una molécula de RNA, no replicantes, de una forma preferible, una molécula circular, cerrada, covalente. Puesto que, tales tipos de moléculas, son incapaces de producir una replicación autónoma, puede acontecer la expresión del gen, a través de la integración de la secuencia de DNA introducida en el cromosoma huésped.

Puede utilizarse un vector, el cual sea capaz de integrar las deseadas secuencias genéticas en el cromosoma de la célula huésped. Las células que tienen integrado de una forma estable, el DNA introducido en sus cromosomas, puede seleccionarse procediendo también a introducir uno o más marcadores que permitan la selección de células que contienen el vector de expresión. El marcador, puede proporcionar prototrofia a un huésped auxotrófico, resistencia antibiótica, por ejemplo, antibióticos, o metales pesados, tales como cobre o por el estilo. El gen marcador seleccionable, puede, o bien ligarse directamente con las secuencias genéticas de DNA a ser expresado, o bien introducirse en la misma célula, mediante co-transfección. Pueden también ser necesarios elementos adicionales para la síntesis óptima de mRNA. Estos elementos, pueden incluir señales de corte y empalme, así como también promotores de transcripción, intensificadores, y señales de terminación. Los vectores de expresión de cDNA que incorporan tales tipos de elementos, incluyen a aquéllos que se describen por parte de Okayama (Mol. Cell. Biol. 3:280-1983).

La molécula introducida de ácido nucleico, puede incorporarse en un vector plasmídico o vírico, capaz de la replicación autónoma en el huésped receptor. Para este propósito, pueden emplearse cualesquiera, entre una amplia variedad de vectores. Los factores de importancia en la selección de un vector plasmídico o vírico particular, incluyen: la facilidad con la que, las células receptoras que contienen el vector, pueden reconocerse y seleccionarse de entre aquéllas células receptoras que no contienen el vector; el número de copias del vector que se desean en un huésped particular; y el hecho de si es deseable el ser capaz de "lanzar" el vector entre las distintas células huésped de diferentes especies.

Los vectores procariotas preferidos, incluyen a plásmidos tales como aquéllos capaces de la replicación en E. coli (tales como, por ejemplo, pBR322, ColE1, pSC101, pACYC 184, pVX; "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", - Clonación molecular: Un manual de laboratorio, 1989, citado anteriormente arriba). Los plásmidos de Bacillus, incluyen a los pC194, pC221, pT127, y por el estilo (Gryczan, In: The Molecular Bilogy of the Bacilli, -La biología molecular de los bacilos-, Academic Press, NY, páginas 3070-329, 1982).

Los plásmidos apropiados de Streptomyces, incluyen al plJ101 (Kendall et al., J. Bacteriol. 169: 4177-4183, 1987), y bacteriófagos de streptomyces, tales como el \bulletC31 (Chater et al., en: Sixth International Symposium on Actinomycetales Biology, -Sexto simposio internacional de biología de actinomicetales-, Academiai Caído, Budapest, Hungría, páginas 45-54, 1986). Los plásmidos de Spseudomonas, se revisan por parte de John et al. (Rev. Infect. Dis. 8: 693-704, 1986) e Izaki (Jpn. J. Bacteriol. 33: 729:742, 1978).

Los plásmidos eucarióticos preferidos, incluyen, por ejemplo, a los BPV, vaccinia, SV40, círculo de 2 micrones, y por el estilo, u otros derivados. Tales tipos de plásmidos, son bien conocidos en el arte de la técnica especializada (Botstein et al., Miami Wntr. Symp. 19: 265-274, 1982; Broach In; "The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Live Cycle and Inheritance", -La biología molecular de las levaduras de Sacharomyces: Ciclo de vida y herencia-, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Springer Harbor, NY, páginas 445-470, 1981; Broach, Cell 28: 203-204, 1982; Bollon et al., J. Clin. Hematol. Oncol. 10: 39-48; 1980. Maniatis, In: Cell Biology: A Comprehensive Treatise, -Biología cellular, un tratado comprensivo-, Vol. 3. Gen Sequence Expresion, Academic Press, NY, páginas 5632-608, 1980).

Una vez que el vector de la molécula de ácido nucleico que contiene la construcción o las construcciones se ha preparado para la expresión, la construcción o las construcciones de DNA, pueden introducirse en una célula huésped apropiada, mediante uno cualquiera de entre una variedad de medios apropiados, por ejemplo, transformación, transfección, conjugación, fusión de protoplastos, electroporación, tecnología de lanzamiento de partículas, precipitación de fosfato cálcico, microinyección directa, y por el estilo. Después de la introducción de un vector, las células receptoras, se hacen crecer en un medio selectivo, el cual selecciona el crecimiento de las células que contienen vectores. La expresión del gen o de los genes clonados, tiene como resultado la producción de la quinasa de la invención, o fragmentos de ésta. Esto puede tener lugar en las células transformadas como tales, o después de la inducción de estas células para su diferenciación (por ejemplo, mediante la administración de bromodesoxiuracilo a las células de neuroblastomas o por el estilo). Puede utilizarse una variedad de condiciones de incubación para formar el péptido de la presente invención. Las condiciones mayormente preferidas son aquéllas que imitan a las condiciones fisiológicas.

IV. Las proteínas de la invención

Para obtener el polipéptido de la presente invención, pueden utilizarse una gran variedad de metodologías conocidas en el arte especializado de la técnica. El polipéptido, puede purificarse a partir de tejidos o células que producen el polipéptido de una forma natural. De una forma alternativa, para expresar la quinasa de la presente invención, en cualquier organismo, pueden utilizarse los fragmentos aislados de ácido nucleico anteriormente descritos, arriba. Las muestras de la presente invención, incluyen a células, extractos de proteínas o extractos de membranas de células o de fluidos biológicos. Las muestras, variarán en base al formato de ensayo, el procedimiento de detección y la naturaleza de los tejidos, las células o los extractos utilizados como muestra.

Como fuente para el polipéptido de la invención, puede utilizarse cualquier organismo eucariótico, siempre y cuando que, la fuente del organismo, contenga tal polipéptido de una forma natural. Tal y como se utiliza aquí, en este documento, "organismo fuente", se refiere a organismo original a partir del cual se deriva la secuencia de aminoácidos de la subunidad, independientemente del organismo cuya subunidad se exprese, en una forma aislada de una forma fundamental.

Una persona especializada en el arte especializado de la técnica, puede seguir fácilmente procedimientos para el aislamiento de proteínas, con objeto de obtener los polipéptidos, exentos de contaminantes naturales. Esto incluye, pero no de una forma limitativa en cuanto a ello, a la cromatografía de exclusión de tamaño, HPLC, cromatografía de intercambio de iones, y cromatografía de inmuno-afinidad.

STLK2 de mamíferos

En análisis de las secuencias de aminoácidos, predice que, la STLK2, es un quinasa de serina/trionina, que carece de ambos, una secuencia de señal y un dominio transmembrana. La STLK2, contiene un dominio N-terminal de 21 aminoácidos, un dominio catalítico de 253 aminoácidos, con todos los motivos o formaciones característicos de una quinasa de serina/trionina, seguido de un dominio C-terminal de 142 aminoácidos.

La STLK2, se encuentra más íntimamente relacionada con las subfamilia de quinasas STE20, MTS3 (GB;AF0 24636) y SOK-1 (GB; X99325) y una quinasa C. elegans yk34b11.5 (GB:U53153) compartiendo unas tasas de un 72,7%, un 68,7% y un 69,3% de identidad de aminoácidos, respectivamente.

El dominio de N-terminal de 21 aminoácidos de la STLK2 humana, es idéntico, en un porcentaje del 71,4%, al término N de la MST3 (GB;AF024636). La STLK2 humana, carece de residuo de glicina en la posición 2, y, es por lo tanto poco probable que experimente miristilación. Una investigación de Smith-Waterman de la base de datos de la proteína, no redundante, no revela ningunas homologías significativas que pudieran sugerir una función potencial para este dominio.

El dominio catalítico de 253 aminoácidos de la STLK2 humana, se encuentra mayormente relacionado con la SOK-1 humana (X99325), MTS3 (GB;AF024636), C. elegans yk34b11.5 (GB:U53153) y STLK3, compartiendo unas tasas de un 88,9%, un 87,4%, un 78,4% y un 49% de identidad de aminoácidos, respectivamente, emplazándolo en la subfamilia STLK de las quinasas relacionadas con la STE20. El dominio de la quinasa STLK2, exhibía una homología menor a otras quinasas relacionadas con la STE20, incluyendo: un 55,9% a la MST2 humana, (GB:US26424), un 49,2% a la GCK humana (GB: U07349), un 49,2% a la KHS1 humana (GB: U477129), un 44,2% a la HPK1 humana (GB:U66464). El lazo de activación del dominio catalítico de la STLK2 humana, es idéntica al de la SOK-1 y MST3 humanas, incluyendo la presencia de cuatro sitios potenciales de fosforilación, de treonina, los cuales podrían servir un rol interpretativo autorregulatorio en la actividad quinasa.

El dominio C-terminal de 142 aminoácidos de la STLK2 humana, está mayormente relacionado a la SOK-1 humana (X99325), MTS3 humana (GB:AF024636) y C. elegans yk34b11.5 (GB:U53153), compartiendo unas tasas de un 39,9%, un 39,9%, y un 33,3% de indentidad de aminoácidos, respectivamente. Este dominio C-terminal, comparte alguna similitud significativa de aminoácidos de la STLK3 y STLK4 humanas, relacionadas.

El término C de la quinasa SOK-1 humana relacionada (GB:X99325), ha mostrado ser inhibitoria a la actividad catalítica de esta quinasa (Pombo, C.M. Boventre, J.V., Molnar, A., Kryarkis, J. y Force, T. EMBO J. 15, 4537-4546 (1996). En base a la identidad de secuencias entre los términos C de la SOK-1 humana (GB:X99325) y la STLK2 humana (39,2%), el término C de la STLK2 humana, puede también funcionar como un dominio inhibitorio para su quinasa.

V. Anticuerpos, hibridomas, procedimientos de uso, y equipos a modo de "kit", para la detección de quinasas STE20-relacionadas

La presente invención, se refiere a un anticuerpo que tiene afinidad de enlace a la quinasa de la invención. El polipéptido, puede tener la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2, o un derivado funcional de ésta, o por lo menos 9 aminoácidos contiguos de ésta (de una forma preferible, por lo menos 20, 30, 35 ó 40 ó más aminoácidos contiguos de ésta.

La presente invención, se refiere, también, a un anticuerpo que tiene afinidad de enlace específica a la quinasa de la invención. Tal tipo de anticuerpo, puede aislarse mediante la comparación de su afinidad de enlace a la quinasa de la invención, con su afinidad de enlace a otros polipéptidos. Se elegirían aquéllos que enlacen selectivamente a la quinasa de la invención, para su uso en procedimientos que requieran una distinción entre la quinasa de la invención y otros polipéptidos. Tales tipos de procedimientos, incluyen pero no de una forma limitativa, al análisis de la expresión modificada de la quinasa en tejido que contiene otros polipéptidos.

La quinasa STE20-relacionada de la presente invención, puede utilizarse en una variedad de procedimientos y métodos, tales como, por ejemplo, la generación de anticuerpos para su uso en la identificación de composiciones farmacéuticas y para estudiar la interacción DNA/proteína.

La quinasa de la presente invención, puede utilizarse para producir anticuerpos o hibridomas. Una persona experta en el arte de la técnica especializada, reconocerá el hecho de que, si se desea un anticuerpo, tal tipo de péptido, podría generarse tal y como se describe aquí, en este documento, y utilizarse como un inmunógeno. Los anticuerpos de la presente invención, incluyen a anticuerpos monoclonales y policlonales, así como también fragmentos de estos anticuerpos, y formas humanizadas. Las formas humanizadas de los anticuerpos de la presente invención, pueden generarse utilizando uno de los procedimientos conocidos en el arte especializado de la técnica, tales como la quimerización o el injerto de CDR.

La presente invención, se refiere también a un hibridoma, el cual produce el anticuerpo monoclonal anteriormente descrito, arriba, o un fragmento de enlace de éste. Un hibrodoma, es una línea de células inmortalizada, la cual es incapaz de secretar un anticuerpo monoclonal específico.

De una forma general, las técnicas para la preparación de anticuerpos monoclonales e hibridomas, son bien conocidas en el arte de la técnica especializada (Campbell, "Monoclonal Antibody Technology: Laboratory Techniques en Biochemistry and Molecular Biology", -Tecnología de los anticuerpos monoclanales: Técnicas de laboratorio en bioquímica y biología molecular-, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, The Netherlands, 1984; St. Groth et al., J. Immunol. Methods 35: 1-121, 1980). Cualquier animal (ratón, conejo, y por el estilo), el cual se sabe que produce anticuerpos, puede inmunizarse, con el polipéptido seleccionado. Una persona experta en el arte especializado de esta técnica, reconocerá el hecho de que, la cantidad de polipéptidos utilizados para la inmunización, variará en base al animal que se inmuniza, la antigenicidad del polipéptido y el sitio de inyección.

El polipéptido, puede modificarse o administrase en un adyuvante, con objeto de incrementar la antigenicidad del péptido. Los procedimientos para incrementar la antigenicidad de un polipéptido, son bien conocidos en arte especializado de esta técnica. Tales tipos de procedimientos, incluyen al acoplamiento del antígeno con una proteína heteróloga (tal como la globulina o la \beta-galactosidasa) o a través de la inclusión de un adyuvante durante la inmunización.

Para anticuerpos monoclonales, se retiran células de bazo, de los animales, se fusionan con células de mieloma, tales como las células del mieloma SP2/0-Ag14, y se deja que se conviertan en anticuerpos monoclonales que producen células de hibridoma. Puede utilizarse cualquiera de los procedimientos existentes en el arte de esta técnica especializada, para identificar la célula de hibridoma que produce un anticuerpo con las deseadas características. Éstas incluyen el rastreo de los hibridomas con un ensayo ELISA, un análisis de "Western blot", o un ensayo de radioinmunidad (Lutz et al., Exp. Cell Res. 175: 109-124; 1988). Los hibridomas que segregan los anticuerpos deseados, se clonan y, la clase y la subclase, se determinan utilizando procedimientos que son conocidos en el arte de esta técnica especializada (Campbell, "Monoclonal Antibody Technology: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology", -Tecnología de los anticuerpos monoclonales: Técnicas de laboratorio en bioquímica y biología molecular-, anteriormente citada, 1984).

Para los anticuerpos policlonales, se aísla un antisuero que contiene anticuerpos, procedente de un animal inmunizado, y se rastrea para la presencia de anticuerpos con la deseada especificidad, utilizando uno de los procedimientos anteriormente descritos, arriba. Los cuerpos anteriormente descritos, arriba, pueden marcarse de una forma que sea susceptible de detección. Los anticuerpos, pueden marcarse de una forma detectable, procediendo al uso de radioisótopos, marcadores de afinidad (tales como biotina, avidina, y por el estilo), marcadores enzimáticos (tales como la peroxidasa del rábano picante, fosfatasa alcalina, y por el estilo), marcadores fluorescentes (tales como PITC o rodamina, y por el estilo), átomos paramagnéticos, y por el estilo. Los procedimientos para cumplir con tales tipos de marcadores, son bien conocidos en el arte especializado de esta técnica, véase a dicho efecto, por ejemplo, Stemberger et al., J. Histochem. Cytochem. 18: 315, 1970, Bayer et al., Meth. Enzym. 62: 308-, 1979; Engval et al., Immunol. 109-129-, 1972; Goding, J. Immunol. -Meth. 13-215-, 1976. Los anticuerpos marcados de la presente invención, pueden utilizarse para ensayos in vitro, in vivo, e in situ, para identificar células o tejidos que expresan un péptido específico.

Los anticuerpos anteriormente descritos, arriba, pueden también inmovilizarse en un soporte sólido. Los ejemplos de tales tipos de soportes sólidos, incluyen plásticos tales como policarbonato, carbohidratos complejos tales como agarosa y sefarosa, resinas acrílicas tales como poliacrilamina y perlas de látex. Las técnicas para acoplar los anticuerpos a tales tipos de soportes, son bien conocidas en arte de esta técnica especializada (Weir et al., "Handbook of Experimental Inmunology", -Manual de la inmunología experimental-, 4ª edición, Blackwell Scientific Publications, Oxford, Inglaterra, capítulo 10, 1986; Jacoby et al, Meth. Enzym, 34, Academic Press, N.Y. 1974. Los anticuerpos inmovilizados de la presente invención pueden utilizarse para ensayos en vitro, in vivo y in situ, así como también en inmunocromotografía.

Adicionalmente, una persona experta en el arte de esta técnica especializada, puede fácilmente adaptar procedimientos que puede obtenerse de una forma usual, así como también técnicas, métodos y equipos a modo de "kit", revelados aquí, en este documento, con respecto a los anticuerpos, para generar péptidos capaces de enlazar a una secuencia péptida específica, con objeto de generar péptidos antipéptidos racionalmente diseñados (Hurby et al., "Aplication of Synthetic Peptides: Antisense Peptides", -Aplicación de péptidos sintéticos: Péptidos antisentido- en -Synthetic Peptides, A Users Guide, -Péptidos sintéticos, una guía para usuarios, W. H. Freeman, NY páginas 289-307, 1992; Kaspczack et al., Biochemistry, 28:9230.9238, 1989).

Los péptidos anti-péptidos, pueden generarse procediendo a reemplazar los residuos básicos de aminoácidos encontrados en las secuencias del polipéptido de la quinasa de la invención, con residuos ácidos, al mismo tiempo que se mantienen los grupos hidrofóbicos y no cargados. Por ejemplo, los residuos de lisina, arginina, y/o histidina, se reemplazan con ácido aspártico o ácido glutámico y, los residuos se reemplazan por lisina, arginina o histidina.

La presente invención, abarca también un procedimiento para detectar la quinasa STE20-relacionada en una muestra, el cual comprende, (a) el contactar la muestra con el anticuerpo anteriormente descrito, bajo unas condiciones tales que se formen inmunocomplejos, y (b) el detectar la presencia del citado anticuerpo enlazado al polipéptido. En detalle, los procedimientos, comprenden el incubar una muestra de ensayo con uno o más de los anticuerpos de la presente invención y ensayar o probar si el anticuerpo se enlaza a la muestra de ensayo. Los niveles modificados de la quinasa de la invención, en una muestra, en comparación con niveles normales, pueden indicar la existencia de enfermedad.

Las condiciones para incubar un anticuerpo con una muestra de ensayo, varían. Las condiciones de incubación, dependen del formato empleado en el ensayo, los procedimientos de detección empleados, y el tipo y la naturaleza del anticuerpo utilizado en el ensayo. Una persona especializada en el arte de esta técnica, reconocerá el hecho de que, cualquiera de los formatos de ensayo inmunológicos que se encuentran usualmente obtenibles en el mercado (tales como los radioinmuno-ensayos, ensayos inmuno-absorbentes unidos a enzimas, la técnica de Ouchterlony basada en difusión, o ensayos de inmunofluorescencia cohética, pueden fácilmente adaptarse para emplear los anticuerpos de la presente invención. Los ejemplos de tales tipos de ensayos, pueden encontrarse en Chard ("An introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques" -Una introducción a los inmuno-ensayos y técnicas relacionadas-, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, The Netherlands, 1986), Bullock et al. ("Techniques in Immunocytochemistry", -Técnicas en inmunocitoquímica-, Academic Press, Orlando, FL Vol. 1, 1982; Vol. 2, 1983, Vol. 3, 1985), Tijssen ("Practice and Theory of Enzyme Immunoassays: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology", -Práctica y teoría de inmuno-ensayos de enzimas: Técnicas de laboratorio en bioquímica y biología molecular-, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, The Netherlands, 1985).

Las muestras de ensayo para ensayos inmunológicos de la presente invención, incluyen células, extractos de proteínas o extractos de membranas de células, o fluidos biológicos tales como sangre, suero, plasma u orina. Las muestras de ensayo utilizadas en el procedimiento anteriormente descrito, arriba, variará en base al formato de ensayo, la naturaleza de los procedimientos de detección y el tejido, células o extractos utilizados en la muestra a ser ensayada. Los procedimientos para preparar los extractos de proteínas o extractos de membranas de células, son bien conocidos en el arte especializado de la técnica y pueden adaptarse fácilmente, con objeto de obtener una muestra la cual sea susceptible de poderse ensayar con el sistema utilizado.

Un equipo a modo de "kit", contiene todos lo reactivos necesarios para llevar a cabo los procedimientos de detección anteriormente descritos, arriba. El equipo a modo de "kit", puede comprender (i) un primer medio recipiente contenedor que contiene un anticuerpo anteriormente descrito, arriba, y (ii), un segundo medio recipiente contenedor que contiene un conjugado que comprende un compañero de enlace del anticuerpo y un marcador. En otra forma preferida de presentación, el equipo a modo de "kit", comprende adicionalmente uno o más de otros recipientes contenedores que comprenden uno o más de los siguientes reactivos: reactivos de limpieza y reactivos capaces de detectar la presencia de anticuerpos enlazados.

Los ejemplos de detección de reactivos, incluyen, pero de una forma limitativa en cuanto a éstos, anticuerpos secundarios marcados o, como alternativa, si el anticuerpo primario se encuentra marcado, los reactivos de enlace cromofórico, enzimático o de anticuerpos, los cuales son capaces de reaccionar con el anticuerpo marcado. El equipo a modo de "kit", compartimentado, puede ser del tipo que se describe anteriormente, arriba, para equipos a modo de kit para sondas de ácido nucleico. Una persona experta en el arte especializado de esta técnica, reconocerá rápida y fácilmente el hecho de que, los anticuerpos descritos en la presente invención, pueden incorporarse fácilmente en uno de los formatos establecidos, de equipos a modo de kit, los cuales son bien conocidos en el arte de esta técnica especializada.

IV. Aislamiento de compuestos que interfieren con quinasas STE20-relacionadas

La presente invención, se refiere también a un procedimiento para la detección de un compuesto capaz de unirse a la quinasa ST20-relacionada de la invención, que comprende la incubación del compuesto con la quinasa de la invención y la detección de la presencia de los compuestos unidos a la quinasa. El compuesto, puede encontrarse presente dentro de una mezcla compleja, por ejemplo, suero, fluido corporal, o extractos de células.

La presente invención, se refiere también a un procedimiento para la detección de un agonista o antagonista de la actividad quinasa o la actividad de un compañero de enlace de la quinasa, el cual comprende el incubar células que producen la quinasa de la invención en presencia de un compuesto, y la detección de cambios en el nivel de la actividad quinasa o actividad de un compañero de enlace de la quinasa. Los compuestos de esta forma identificados, producirán un cambio en la actividad, indicativa de la presencia del compuesto. El compuesto, pueden encontrarse presenta en una mezcla compleja, por ejemplo, suero, fluido corporal o extracto de células. Una vez que el compuesto se haya identificado, éste puede aislarse utilizando técnicas bien conocidas en arte de la técnica.

La presente invención, abarca también un procedimiento para proceder al agonismo (estimulación) o antagonismo de la actividad asociada con la quinasa, en un mamífero, que comprende la administración, al citado mamífero, de un agonista o de un antagonista a la quinasa de la invención, en una cantidad suficiente como para efectuar el citado agonismo o antagonismo. La presente solicitud, abarca también un procedimiento para tratar enfermedades, en un mamífero, con un agonista o un antagonista de la actividad quinasa STE20-relacionada, que comprende el administrar el agonista o antagonista a una mamífero, en una cantidad suficiente para agonizar o antiagonizar las funciones asociadas con la quinasa STE20-relacionada.

En un esfuerzo para descubrir nuevos tratamientos para enfermedades, los investigadores biomédicos y los químicos, han diseñado, sintetizado y ensayado, moléculas que inhiben la función de las proteína-quinasas. Algunas moléculas orgánicas pequeñas, forman una clase de compuestos que modulan la función las proteína-quinasas. Los ejemplos de moléculas que se han reportado, para inhibir la función de las proteína-quinasas, incluyen, pero de una de una forma limitada en cuanto a éstas, a los compuestos arilio bis-monocíclicos, bicíclicos, o heterocíclicos (PCT WO 92/20642, publicada en fecha 26 de Noviembre de 1992, por parte de Maguire et al.), derivados de vinil-azaindol (PCT WO 94/14808, publicado en fecha 7 de Julio de 1994, por parte de Ballinari et al.), 1-ciclopropil-4-piridil-quinolonas (patente estadounidense US 5.330.9929), compuestos de estirilo (patente estadounidense US n1 5.217.999), compuestos de piridilo sustituido por estirilo (patente estadounidense US nº 5 302 606), ciertos derivados de quinazolina (solicitud de patente europea EP-A-0 566 266 A1), seleoindoles y selenidas (documento de patente PCT WO 94/03427), publicado en fecha 17 de febrero de 1994, por Denny et al.), compuestos tricíclicos polihidroxílicos (documento de patente PCT WO 92/21660, publicado en fecha 10 de diciembre de 1992 por parte de Dow), y compuestos del ácido bencilfosfónico (documento de patente PCT WO 91/15494, publicado en fecha 17 de Octubre de 1991 por parte de Dow et al).

Los compuestos que pueden atravesar membranas de células y que son resistentes a la hidrólisis de ácidos, son potencialmente ventajosos como terapéuticos y éstos pueden convertirse en altamente biodisponibles después de administrarse oralmente a pacientes. No obstante, muchas de estos inhibidores de proteína-quinasas, inhiben únicamente de una forma débil la función de las proteína-quinasas. Adicionalmente a ello, mucho de ellos, inhiben una variedad de proteína-quinasas y provocarán múltiples efectos laterales, como terapéuticos para enfermedades.

Algunos compuestos de indolinona, no obstante, forman clases de moléculas orgánicas que son resistentes a los ácidos y permeables a las membranas. El documento de patente internacional WO 96/22976 (publicado en fecha 1 de Agosto de 1996 por parte de Ballinari et al.) describe compuestos hidrosolubles de indolidona que hospedan sustituyentes de tetralina, naftaleno, quinolina e indol, fusionados en el anillo de oxindol. Estos sustituyentes bicíclicos, se sustituyen, a su vez, con porciones polares que incluyen a alquilos hidroxilados, fosfato y otras porciones. Las solicitudes de patentes estadounidenses US de números de serie 08/702 232, presentada en fecha 23 de Agosto de 1996, titulada "Indolinone Combinatorial Libraries and Related Products and Methods for the Tratement of Disease", -"Bibliotecas combinatorias de indolinona y productos relacionados para el tratamiento de enfermedades" de Tang et al. (certificado de Lyon & Lyon nº 221/187) y 08/485.323, presentado en fecha 7 de Junio de 1995 y titulado "Benzyliden-Z-Indine Compounds for the Treatment of Disease", -Compuestos de beniliden-Z-indolina para el tratamiento de enfermedades-, de Tang et al. (Certificado de Lyon & Lyon nº 223/298), y la publicación internacional de patente WO 96/22976, publicada en fecha 1 de Agosto de 1996, por parte de Ballinari et al., incluyendo algunos dibujos, describen bibliotecas químicas de indolidona de compuestos de indolidona que hospedad otras porciones bicíclicas así como también porciones monocíclicas fusionadas al anillo de oxindol. Las solicitudes 08/702.232 presentada en fecha 23 de Agosto de 1996, titulada "Indolinone Combinatorial Libraries and Relate Products and Methods for the Treatement of Disease", -Bibliotecas combinadas de indolinona y productos y procedimientos relacionados, para el tratamiento de enfermedades-, por parte de Tang et al. (Certificado de Lyon & Lyon nº 221/187), 0,8/485.323, presentada en fecha 7 de Junio de 1995, titulada, "Benzyliden-Z-Indine Compound for the Treatment of Disease", -Compuestos de beniliden-Z-indolina para el tratamiento de enfermedades-, de Tang et al. (Certificado de Lyon & Lyon nº 223/298), y la publicación internacional de patente WO 96/22976, publicada en fecha 1 de Agosto de 1996, por parte de Ballinari et al., enseñan procedimientos de la síntesis de indolinona, procedimientos para el ensayo de la actividad biológica de compuestos de indolidona en células, y modelos patrón de inhibición de derivados de
indolinona.

Otros ejemplos de substancias capaces de modular la actividad quinasa, incluyen, por no de una forma limitativa en cuanto a éstas, a las tirofostinas, quinazolinas, quinoxolinas y quinolinas. Las quinazolinas, tirofostinas, quinolinas y quinoxilinas a las que se hace referencia anteriormente, arriba, incluyen a compuestos bien conocidos tales como aquéllos que se describen en la bibliografía especializada. Así, por ejemplo, las publicaciones representativas que describen a las quinazolinas, incluyen a Barker et al., Publicación EPO nº 0 520 722 A1; Jones et al., patente estadounidense US nº 4.447.608; Kabbe et al., patente estadounidense US nº 4.757.072; Kaul y Vougioukas, patente estadounidense US nº 5.316.553; Kreighbaum y Comer, patente estadounidense US nº 4.342.940; Pegg y Wardleworth, Publicación EPO nº 0 562 734 A1; Barker et al., Proc. of Am. Assoc. For Cancer Research 32:327 (1991); Bertino, J.R., Cancer Research 3: 293-304 (1979); Bertino, J.R. Cancer Research 9(2 parte 1): 293-304 (1979); Curtin el al., Br. J. Cancer 53: 361-368 (1986); Fernandes et al., Cancer Research 43: 1117-1123 (1983); Ferris et al. J. Org. Chem. 44 (2): 173-178; Frey et al., Science 265: 1093-1095 (1994); Jackmann et al., Cancer Research 51: 5579-5586 (1981); Jones et al. J. Med. Chem. 29(6): 1114-1118; Lee y Skibo, Bochemistry 26 (23: 7355-7362 (1987); Lemus et al., J. Org. Chem. 54: 3511-3518 (1989): Ley y Seng. Synthesis 1075: 415-522 (1975); Maxwell et al., Magnetic Resonance in Medicine 17: 189-196 (1991); Mini et al., Cancer Research 45: 325-330 (1985), Phillips y Castle. J. Heterocyclic Chem. 17(19): 1489-1596 (1980), Reece et al., Cancer Research 47 (11): 2996-2999 (1977); Sculier et al., Cancer Immunol. And Immunother. 23: A65 (1986); Sikora et al., Cancer Letters 23: 289-295 (1984); Sikora et al., Analytical Biochem. 172: 344-355 (1988).

La quinoxalina, se describe en Kaul y Vougioukas, patente estadounidense US nº 5.316.553.

Las quinolinas, se describen en Dolle et al., J. Med. Chem. 37: 2627-2629 (1944); MaGuire, J. Med. Chem. 37: 2129-2131 (1994); Burke et al., J. Med. Chem. 36: 425-532 (1993); y Burke et al. BioOrganic Med. Chem Letters 2: 1771-1774 (1992).

Las tirofostinas, se describen en Allen et al., Clin. Exp. Immunol. 91: 141-156 (1993); Anafi et al., Blood 82: 12: 3524-3529 (1993); Baker et al., J. Cell Sci. 102: 543-555 (1992); Bilder et al., Amer. Physiol. Soc. Páginas 6363-6143; C721-C730 (1991), Brunton et al., Proceedings of Amer Assoc. Cancer Rsch. 33: 558 (1992); Bryckaert et al., Experimental Cell Research 199: 255-261 (1992); Dong et al., J. Leukocyte Biology 53: 53-60 (1993); Dong et al., J. Immunol. 151 (5): 2717-2724 (1993); Gazit el al., J. Med. Chem. 32: 2344-2352 (1989); Gazit et al., J. Med. Chem. 36: 3556-3564 (1993); Kaur et al., Anti-Cancer Drugs 5: 213-222 (1994); Kaur et al., Kig et al., Biochem. J. 275: 413-138 (1991); Kuo et al., Cancer Letters 74: 197-202 (1993); Levitzki, A. The FASEB J. 6: 3275-3282 (1992); Lyall et al., J. Biol. Chem. 264-14503 (1989); Peterson et al., The Prostate 22: 335-345 (1993); Pillemer et al., Int. J. Cancer 50: 80-85 (1992); Posner et al., Molecular Pharmacology 45: 673-683 (1993); Rendu et al., Biol. Pharmacology 44(5): 881-888 (1992); Sauro y Thomas, Life Sciences 53: 371-376 (1993); Sauro y Thomas, J. Pharm. And Experimental Therapeutics 267 (3): 119-1125 (1993); Wolbring et al., J. Biol. Chem. 269 (36): 22470-22472 (1994); y Yoneda et al., Cancer Research 51 4420-4435 (1991);

Otros productos que se podrían utilizar como moduladores, incluyen a las oxindolinonas, tales como las que se describen en la solicitud de patente estadounidense US de la serie nº 08 7 702.232, presentada en fecha 23 de Agosto de 1986.

VII. Significado biológico, aplicaciones y relevancia química de nuevas quinasas humanas STLK2 relacionadas con la quinasa STE20

La STLK2, pertenece a una familia en expansión de STK2 intracelulares, que tienen grados variables de homología de secuencia a la SOK-1, una quinasa implicada en los agentes de estrés, oxidantes (Pombo, CM et al. EMBO J. (17) 4537-4546, 1996). Nuestros datos, muestran el hecho de que, la STLK2, se expresa altamente en células hematopoyésicas. Así, por lo tanto, la STLK2, puede participar en el curso de la respuesta oxidante, durante la inflamación. Adicionalmente a ello, la STLK2, podría también ser un posible componente en los cursos o trayectorias de señalización que conducen a la activación de las células T. Los altos niveles de STLK2, en algunos líneas de células tumorales, podrían también implicar el hecho de que, la STLK2, podría encontrarse involucrada en tumorogénesis. Adicionalmente a ello, la STLK2, podría también encontrarse implicada en la tumorogé-
nesis.

La STLK2, se encuentra íntimamente relacionada con dos subfamilias de las quinasas humanas STE20: La MST3 y la SOK-1. La MST3, es una quinasa citoplásmica de 52.000 daltons, la cual se expresa de una forma omnipresente con sus más altos niveles de expresión encontrados en el corazón, músculos esqueléticos y páncreas. La actividad quinasa de serina/treonina de la MST3, se activa mediante fosforilación. De una forma distinta a la SOK-1, la MST3, prefiere Mn^{++} por encima de Mg^{++}, y puede utilizar ambos donantes de fosfato, consistentes en GTP y ATP. La MST3, puede experimentar dimerización. No se han identificado todavía ningunos agonistas que activen la MST3. El mecanismo de señalización corriente abajo, de esta quinasa, se desconoce (Schinkmann, K and Blenis, J. (1977) J, Biol.. Chem. 272, 28695-28703).

La SOK-1, es una quinasa citoplásmica de 50.000 daltons, expresada predominantemente en los testículos, en el intestino grueso, en el cerebro y en el estómago y, en una menor extensión, en el corazón y en el pulmón. La SOK-1, se expresa también en la línea del centro germinal de las células T (RAMOS) y en una línea de células B, madura (Sultán HS). La actividad quinasa de serina/treonina, se activa mediante fosforilación.

El término C de la SOK-1, ha mostrado ser inhibitorio a la actividad catalítica de esta quinasa. Los únicos agonistas que se conoce que activan la SOK-1, son agentes oxidantes, como la H_{2}O_{2} y la menadiona, una quinona que es un potente generador intracelular, para especies de oxígeno reactivo (Pombo, C.M. et al., EMBO J. 15, 4537-4546). La SOK-1 , se activa también mediante una anoxia química, a través de las especies de oxígeno reactivo y, la liberación de calcio al interior del citoplasma, procedente de reservas intracelulares. La SOK-1, por lo tanto, puede jugar un importante rol interpretativo en la isquemia, la causa del infarto de miocardio, apoplejía y fallo renal agudo (Pombo, CM et al., J. Bio. Chem. 272, 29372-29373 (1997)). La actividad de la SOK-1, en al respuesta de estrés oxidante, está inversamente correlacionada con la actividad de las quinasas de proteínas activadas por estrés (SAPKs): la elevada actividad SOK-1, se correlaciona con la actividad SAPK ausente y viceversa. La SOK-1, no activa ninguna de las trayectorias o cursos de las cuatro quinasas MAP, SAPKs, p38, ERK-1 ó MEK-5/ERK-5 (Pombo. C.M. et al., EMBO. J. 15, 4537-4546). El mecanismo de señalización corriente abajo de estas quinasas, permanece desconocido.

La STLK2, se expresa en una amplia variedad de tipos de células y de tejidos inmunes, incluyendo a los thymus, dendrocitos, células mastocíticas, monocitos, células B (primarias, de Jurkat, EPMI, SR), células T (CD8/CD4+, TH1, TH2, CEM, MOLT4) y megacariocitos (K562). Por consiguiente, esta STK, podría participar en la trayectoria de la respuesta oxidativa durante la inflamación, lesiones de reperfusión (apoplejía, cirugía, shock), señalización mediatizada por TNF\alpha, desensibilización a la insulina, aterogénesis, lesión vascular, co-estimulación de células T ó B, o de una forma alternativa, podría participar en oros procesos de transducción de señal MAPK-relacionados.

El alto grado de homología de secuencia en los términos C de las SOK-1 y STLK2, aumenta la posibilidad de que, estas nuevas STK1, como la SOK-1, puedan estar sometidas a autoinhibición a través de un motivo o formación conservado C-terminal.

Aplicaciones clínicas STLK2 humana

Los homólogos de la subfamilia de STLK2 de las proteínas quinasas de STE20, tales como la STLK4, pueden jugar un importante rol interpretativo como mediadores de la respuesta inmune. Así, de este modo, éstas son dianas u objetivos para el desarrollo de inhibidores específicos de moléculas pequeñas, para tratar las enfermedades immunológicas, incluyendo, pero no de una forma limitativa en cuanto a éstas, a la artritis reumatoidea. Las enfermedades crónicas inflamatorias del intestino (por ejemplo, la enfermedad de Crohn), la enfermedad inflamatoria crónica de la pelvis, la esclerosis múltiple, el asma, la osteoatritis, la psoriasis, la aterosclerosis, la rinitis y la autoinmunidad, así como también el trasplante de órganos. Otras enfermedades, incluyen a las enfermedades cardiovasculares.

Las STLKs humanas, pueden también jugar un rol interpretativo importante en la regulación del crecimiento de la células. Así, esta forma, estas son objetivos o dianas para desarrollar inhibidores de quinasa de moléculas pequeñas, para el tratamiento de cáncer y metástasis.

El rol interpretativo potencial de la STLK-2 humana, en el estrés mediatizante oxidante, sugiere fuertemente el hecho de que, los fármacos que tienen a estas quinasa como diana, podrían probar también su utilidad en el tratamiento del infarto de miocardio, de la arritmia y otras cardiopatías, tales como la apoplejía, el fallo renal, los trastornos neurodegenerativos relacionados con el estrés oxidante, tales como la esclerosis lateral amiotrófica, la enfermedad de Parkinson y el síndrome de Leigh, una encefalopatía mitocondríaca necrosizante.

VIII. Animales Transgénicos

Se encuentran a disposición una variedad de métodos para la producción de animales transgénicos, asociados con esta invención. El DNA, puede inyectarse al interior del pronúcleo de un huevo fertilizante, antes de la fusión de los núcleos masculino y femenino, o inyectarse en el interior del núcleo de una célula embrionaria (por ejemplo, el núcleo de un embrión de dos células), seguido de la iniciación de la división celular (Brinster et al., Proc. Nat. Acd. Sci., USA 82: 4438-4442, 1985). Los embriones, pueden infectarse con virus, especialmente, retrovirus, modificados, para portar las secuencias nucleótidas receptoras de iones inorgánicos.

Las células germinales pluripotentes derivadas de la masa interior celular del embrión, y estabilizadas en el cultivo, pueden manipularse en cultivo, para incorporar secuencias nucleótidas de la invención. Un animal transgénico, puede producirse, a través de tales tipos de células, mediante la implantación, en un blastocisto, que se implanta en una madre adoptiva, y que se permite que llegue hasta su término. Los animales apropiados para los experimentos transgénicos, pueden obtenerse a partir de fuentes standard comerciales, tales como Charles River (Wilmington, MA), Taconic (Germantown, NY), Harlan Sprague Dawley (Indianapolis, IN), etc.

Los procedimientos para la manipulación del embrión de roedor y para la microinyección de DNA en un pronúcleo del zigoto, son bien conocidos por parte de aquéllas personas usualmente expertas en el arte de esta técnica especializada (Hogan et al., mencionado anteriormente). Los procedimientos de microinyección para peces, huevos anfibios, y pájaros, se detallan por parte de Houdebine y Chourrout (Experientia 47: 897-905, 1991). Otros procedimientos para la introducción de DNA en tejidos de animales, se describen en la patente estadounidense US nº 4.945.050 (Stanford et al., 30 de Julio de 1990).

Únicamente a título de ejemplo, se procede a preparar un ratón transgénico, induciendo ratones hembra a superovular. Las hembras, se emplazan con machos y, las hembras apareadas, se sacrifican mediante asfixia con CO_{2}, o mediante dislocación cervical y, los embriones, se recuperan a partir de oviductos cortados. Se retiran las células de cúmulos circundantes. Los embriones pronucleares, se lavan a continuación, y se guardan, hasta el tiempo de la inyección. Se procede a aparejar ratones hembras de ciclación aleatoria, con machos a los que se les ha efectuado una vasectomía. Hembras receptoras, se aparean, al mismo tiempo, como hembras donantes. Los embriones, se transfieren, a continuación, quirúrgicamente. El procedimiento para generar ratas transgénicas, es similar al de los ratones (Hammer et al., Cell 63:1099-1112, 1990).

Los procedimientos para el cultivo de células germinales embrionarias (ES) y la subsiguiente producción de animales transgénicos, mediante la introducción de DNA en las células ES, utilizando procedimientos tales como la electroporación, precipitación de fosfato cálcico/DNA, y la inyección directa, son bien conocidos para aquéllas personas comúnmente expertas en el arte de esta técnica especializada (Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells, A práctical Approach, -Teracarcinomas y células germinales embrionarias, Un estudio práctico-, E. J. Robertson, ed., IRL Press, 1987).

En los casos en los que se encuentra involucrada la integración aleatoria de genes, se cotransfiere un clon que contiene la(s) secuencia(s) de la invención, con un gen que codifica resistencia. De una forma alternativa, el gen que codifica resistencia a la neomicina, se encuentra físicamente ligado a la(s) secuencia(s) de la invención. La transfección y el aislamiento de los clones deseados, se lleva a cabo mediante cualesquiera de los varios procedimientos que son bien conocidos por parte de aquéllas personas usualmente especializadas en este arte de la técnica (E.J. Robertson, citado anteriormente).

Las moléculas de DNA introducidas en las células ES, pueden también integrarse en el cromosoma, mediante el procedimiento de la recombinación homóloga (Capechi, Science 244: 1288-1292, 1989). Los procedimientos para la selección positiva del evento de recombinación (es decir, neo-resistencia), y selección dual positiva-negativa (es decir, neo-resistencia y resistencia ganciclovir) y la subsiguiente identificación de los clones deseados por PCR, se han descrito por parte de Capecchi, mencionado anteriormente, en este documento, y por parte de Joyner et al. (Nature 338: 153-156, 1989). La fase final del procedimiento, es la de inyectar células ES pretendidas como diana, en el interior de blastocistos, y transferir los blastocistos al interior de hembras pseudo-grávidas. Los animales quiméricos resultantes, se engendran y, los animalitos descendientes, se analizan mediante análisis de marcaje de Southern, para identificar los individuos que portan el transgén. Los procedimientos para la producción de mamíferos no roedores, y otros animales, se ha discutido por parte de otros investigadores (Houdebine and Chourrout, mencionado anteriormente en este documento; Pursel et al., Science 244: 1281-1288, 1989; y Simms et al., Bio/Technology 6: 179-183, 1988).

Así, de esta forma, la invención, proporciona mamíferos transgénicos, no humanos, que contienen un transgén que codifica a la quinasa de la invención, o un gen que efectúa la expresión de la quinasa. Tales tipos de mamíferos no humanos transgénicos, son particularmente de utilidad como sistemas de test de ensayo in vivo, para estudiar los efectos de la introducción de una quinasa, o para regular la expresión de una quinasa (es decir, la introducción de genes adicionales, ácidos nucleicos antisentido, o ribozimas).

Un "animal transgénico", es un animal que tiene células que contienen DNA, el cual se ha insertado artificialmente en una célula, DNA éste que se convierte en parte del genoma del animal que se desarrolla a partir de esta célula. Los animales transgénicos preferidos, son primates, ratones, ratas, vacas, cerdos, caballos, cabras, ovejas, perros y gatos. El DNA transgénico, puede tener codificada la STLK2 humana. La expresión nativa de un animal, puede reducirse mediante la provisión de una cantidad de RNA o DNA antisentido, efectiva para reducir la expresión del receptor.

IX. Terapia genética

La STLK-2 o sus secuencias genéticas, serán también de utilidad en la terapia genética (revisada en Miller, Nature 357: 455-460, 1992). Miller, afirma que, se han producido avances en los estudios prácticos de las terapia genética humana, los cuales han demostrado unos resultados iniciales positivos. La ciencia básica de la terapia genética, se describe en Mulligan (Science 260: 926-931, 1993).

En una forma preferida de presentación, el vector de expresión que contiene la secuencia de codificación del STLK2, se inserta en el interior de las células, las células se hacen crecer in vitro y, a continuación, se infunden en un amplio número, en pacientes. En otra forma preferida de presentación, el segmento de DNA que contiene un promotor de elección (por ejemplo, un promotor fuerte), se transfiere al interior de las células que contiene el gen endógeno en el cual se encuentra codificada la quinasa de la invención, de tal forma que, el segmento promotor, mejora la expresión del gen de quinasa endógeno (por ejemplo, el segmento promotor, se transfiere al interior de la célula, de tal forma que éste se convierte en directamente ligado al gen de quinasa, endógeno.

La terapia genética, puede involucrar el uso de un adenovirus que contiene cDNA quinasa, que tiene como diana a un tumor, incremento sistemático de quinasa mediante la implantación de células diseñadas por ingeniería genética, inyección con virus que tienen codificada la quinasa, o la inyección de DNA quinasa, desnudo, en los tejidos apropiados.

Las poblaciones de células diana, pueden modificarse mediante la introducción de formas modificadas de uno o más componentes de los complejos de proteínas, con objeto de modular la actividad de tales complejos. Así, por ejemplo, procediendo a reducir o a inhibir una actividad compleja de un componente, dentro de las células diana, puede hacerse disminuir, inhibirse o invertirse, un(s) evento(s) anormal(es) de transducción de señal, que conduce(n) a una condición. Con objeto de inhibir un evento anormal de transducción de señal, perjudicial, pueden utilizarse mutantes de deleción o de sentido fallido de un componente, que retienen la capacidad de interactuar con otros componentes de los complejos de proteínas, pero que no pueden funcionar en las transducción de señal.

Los vectores de expresión derivados de virus, tales como los retrovirus, virus vacunal, adenovirus, virus adeno-asociado, virus del herpes, algunos virus de RN, virus del papiloma bovino, pueden utilizarse para suministrar secuencias nucleótidas (por ejemplo, cDNA) que codifican a la quinasa recombinante de la proteína de la invención, en la población de células establecidas como diana (por ejemplo, células tumorales). Con objeto de construir vectores víricos recombinantes que contienen secuencias codificantes, pueden utilizarse los procedimientos que son bien conocidos por parte de aquellas personas especializadas en el arte de esta técnica (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, -Clonación molecular: Un manual de laboratorio-, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y.), 1989; Ausubel et al., Corrent Protocols in Molecular Biolgy, -Protocolos actuales en biología molecular; Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y., 1989). De una forma alternativa, las moléculas de ácido nucleico recombinante que tienen codificadas secuencias de proteínas, pueden utilizarse como DNA desnudo o en un sistema reconstituido, por ejemplo, Liposomas u otros sistemas de lípidos para el suministro a células diana (por ejemplo, Felgner et al., Nature 337: 387-8, 1989). Existen algunos otros métodos para la transferencia directa de DNA plásmido en células, para su utilización en terapia genética humana, e involucran el objetivizar como diana el DNA, para receptores, en células, procediendo a complejar el plásmido DNA para proteínas (Miller, citado anteriormente).

En su forma más simple, la transferencia de genes, puede realizarse mediante simplemente procede a inyectar diminutas cantidades de DNA en el interior del núcleo de una célula, mediante un procedimiento de microinyección (Capecchi, Cell, 22: 479-88, 1980). Una vez que los genes recombinantes se han introducido en una célula, éstos pueden reconocerse mediante los mecanismos normales de la célula, para la transcripción y la traducción, y se expresará un producto genético. Se han intentado también otros procedimientos, para la introducción de DNA en un gran número de células. Estos procedimientos incluyen: la transfección, en donde, el DNA, se precipita con CaPO_{4}, y se introducen en las células, mediante pinocitosis,(Chen et al., Mol. Cell Biol. 7: 2745-52; 1987), electroporación, en donde, las células, se exponen a impulsos de alto voltaje, para introducir orificios en el interior de las membranas (Chu et al., Nucleic Acids Res. 15: 1311-26, 1987), lipofección/fusión de liposomas, en donde, el DNA, es carga en vesículas lipofílicas, las cuales se fusionan con un célula diana (Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84: 7413-7417, 1987); y bombardeo de partículas, utilizando DNA enlazado a pequeños proyectiles (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Scie. 87: 9568-9572, 1990). Otro procedimiento para introducir DNA en células, es el de acoplar el DNA a proteínas químicamente modificadas.

Se ha mostrado también el hecho de que, las proteínas de adenovirus, son capaces de desestabilizar endosomas e intensificar la admisión de DNA en las células. La mezcla de adenovirus en soluciones que contienen complejos de DNA a polilisina convalentemente unida a adenovirus, utilizando agentes reticulantes de proteínas, mejora substancialmente la admisión (cantidad admitida) y la expresión en genes recombinantes (Curiel et al., Am. J. Respir. Cell, Mol. Biol., 6:247-52 1992).

Tal y como se utiliza aquí, en este documento, "transferencia genética", significa el procedimiento de introducción de una molécula de ácido nucleico extraño en una célula. La transferencia genética, se realiza, de una forma usual, para permitir la expresión de un producto particular codificado por el gen. El producto, puede incluir una proteína, un polipéptido, un DNA o RNA antisentido, o RNA enzimáticamente activo. La transferencia de genes, puede realizarse en células cultivadas o mediante la administración directa en animales. De una forma general, la transferencia genética, involucra el proceso del contactar el ácido nucleico con una célula diana, mediante interacciones no específicas o mediatizadas por receptores, la admisión de ácido nucleico en el interior de la célula, a través de la membrana, o mediante endocitosis, y la liberación de ácido nucleico en el citoplasma, a partir de la membrana de plasma o endosoma. La expresión, puede requerir, adicionalmente, el movimiento del ácido nucleico hacia el interior del núcleo de la célula, y la unión a factores nucleares apropiados para la transcripción.

Tal y como se utiliza aquí, en este documento, "terapia genética", es una forma de transferencia genética y se encuentra incluida en la definición de transferencia genética, tal y como se utiliza aquí, y se refiere, de una forma específica, a la transferencia genética, para expresar un producto terapéutico a partir de una célula, in vivo o in vitro. La transferencia genética, puede realizarse ex vivo, en células que se transplantan a un paciente, o puede realizarse mediante la administración directa del ácido nucleico o complejo de proteína de ácido nucleico, a un paciente.

En otra forma preferida de presentación de la invención, se proporciona un vector que tiene secuencias de ácido nucleico que codifican al polipéptido STLK-2, en el cual, la secuencia de ácido nucleico, se expresa únicamente en tejido específico. Los procedimientos para lograr la expresión genética específica de un tejido, se presentan en la publicación del documento internacional de patente nº WO 93/09236, presentado en fecha 3 de Noviembre de 1992, y publicado en fecha 13 de Mayo de 1993.

En la totalidad de los vectores precedentes presentados anteriormente, arriaba, un aspecto adicional de la invención, es que, la secuencia de ácido nucleico contenida en el vector, puede incluir adiciones, deleciones o modificaciones, de algunas o de la totalidad de secuencias de ácido nucleico, tal y como se definen anteriormente, arriba.

En otra forma preferida de presentación, se presenta un procedimiento de reemplazo genético. "Reemplazo genético", tal y como se utiliza aquí, en este documento, significa el reemplazar una secuencia de ácido nucleico que es capaz de expresarse in vivo, en un animal, proporcionando o aumentándose con ello, la función de un gen endógeno, la cual no se encuentra presente, o es defectuosa, en el animal.

X. Administración de substancias

Los procedimientos para determinar las dosificaciones de compuestos a ser administrados a un paciente, y las formas de administración de compuestos a un organismo, se dan a conocer en la solicitud de patente estadounidense US de la serie nº 08/702.282, presentada en fecha 23 de Agosto de 1996, en la publicación del documento de patente internacional número WO 96/22 976, publicado en fecha 1 de Agosto de 1996. Aquéllas personas expertas en el arte de la técnica especializada, apreciarán el hecho de que, tales tipos de descripciones, son aplicables a la presente invención, y pueden fácilmente adaptarse a ésta.

La dosificación apropiada, depende de varios factores, tales como el tipo de enfermedad que se esté tratando, la composición particular que se esté utilizando, y el tamaño de la condición fisiológica de un paciente. Las dosificaciones terapéuticamente efectivas, para los compuestos descritos aquí, en este documento, pueden estimarse, inicialmente, a partir del cultivo de células, y de los modelos de animales. Así, por ejemplo, una dosis, puede formularse en modelos de animales, para lograr unos márgenes de concentración circulantes, los cuales, inicialmente, tengan en cuenta la IC_{50}, tal y como se determina en los ensayos de cultivo. Los datos del modelo de animal, pueden ser utilizados para determinar, de una forma más precisa, las dosis de utilidad en humanos.

La vida media del plasma y la biodistribución del fármaco y de los metabolitos en el plasma, tumores y órganos mayores, pueden también determinarse para facilitar la selección de fármacos, que sean más apropiados para inhibir un trastorno. Tales tipos de mediciones, pueden llevarse a cabo. Así, por ejemplo, el análisis de HPLC, puede realizarse a partir del plasma o animales tratados con el fármaco y, la ubicación de compuestos radio-marcados, puede determinarse utilizando procedimientos de deleción, teles como los consistentes en rayos X, exploración CAT, y MRI. Los compuestos que muestran una potente actividad inhibitoria en los ensayos de rastreo, pero que tienen pobres características farmacinéticas, pueden optimizarse mediante la modificación de su estructura química y re-ensayo. En este sentido, los compuestos que exhiben unas buenas características farmacinéticas, pueden ser utilizados como modelo.

Los estudios de toxicidad, pueden también llevarse a cabo procediendo a medir la composición de la célula sanguínea. Así, por ejemplo, los estudios de toxicidad, pueden llevarse a cabo en un modelo de animal apropiado, de la siguiente forma: 1) el compuesto se administra a los ratones (debe utilizarse un ratón de control no tratado); 2) se obtienen periódicamente muestras de sangre, de un ratón, en cada grupo de tratamiento; y 3) las muestras, se analizan para cuentas de células rojas y blancas, composición de células de sangre y el porcentaje de linfocitos, versus células polimorfonucleares. Una comparación de resultados para cada régimen de dosificación, con los controles, indica si se encuentra presente toxicidad.

Al terminar cada estudio de toxicidad, pueden llevarse a cabo estudios adicionales, procediendo a sacrificar los animales (de una forma preferible, en concordancia con las instrucciones facilitadas por el American Veterinary Medical Association guidelines Report ot the American Veterinary Medical Assoc. Panel on Eutanasia, Journal of American Veterinary Medical Assoc., 202: 229-249, 1993). Los animales representativos para cada grupo de tratamiento, pueden examinarse, a continuación, mediante necroscopia bruta, con objeto de proceder a la evidencia inmediata de metástasis, enfermedades inusuales, o toxicidad. Las anormalidades brutas, en los tejidos, se anotan y, los tejidos, se examinan histológicamente. Los compuestos que provocan una reducción en el peso humano o en los componentes de la sangre, son menos preferidos, como lo son también los compuestos que tienen unos efectos adversos en los órganos mayores. De una forma general, cuanto mayor es el efecto adverso, menos se prefiere el compuesto.

Para el tratamiento de los cánceres, la dosis diaria esperada, de agente farmacéutico hidrofóbico, es de 1 a 500 mg/día, de una forma preferible, de 1 a 250 mg/día y, de una forma mayormente preferible, de 1 a 50 mg/día. Los fármacos, pueden suministrarse de una forma menos frecuente, con la condición de que, los niveles de plasma de la porción activa, sean suficientes como para mantener la efectividad terapéutica.

Los niveles de plasma, deben reflejar el potencial del fármaco. De una forma general, cuanto más potente es el compuesto, menores son los niveles de plasma necesarios para lograr la eficiencia.

Ejemplos

Los ejemplos que se facilitan a continuación, no son limitativos, y son meramente representativos de varios aspectos y características de la presente invención. Los ejemplos que se facilitan a continuación, demuestran el aislamiento y caracterización de las quinasas STE20-relacionadas de la invención.

Ejemplo 1 Aislamiento de cDNAs que codifican a las proteina-quinasas STE20-relacionadas Materiales y procedimientos Identificación de nuevos clones

La totalidad de los RNAs, se aislaron utilizando el protocolo de extracción de sales de guanidina/fenol, de
Chomczynski y Sachi (P. Chomzcynski y Sachi, Anal. Biochem. 162, 156 (1987)), a partir de tumores humanos primarios, líneas de células normales y de tumores, tejidos humanos normales, y células humanas hematopoyésicas variadas. Estos RNAs, se utilizaron para generar dDNA de simple hebra, utilizando el método de Superscript Preamplification System, -Sistema de preamplificación de superescritura-, (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD; Gerard, GF et al., (1989), FOCUS 11, 66) bajo las condiciones recomendadas por el fabricante. Una reacción típica, utilizaba 10 \mug de RNA total, con 1,5 \mug de oligo(dT)_{12-18}, en un volumen de reacción de 60 \mul. El producto, se trató con RnaseH y se diluyó a 100 \mul, con H_{2}O. Para la subsiguiente amplificación por PCR, se utilizaron 1-4 \mul de este sscDNA, en cada reacción.

Se sintetizaron oligonucleótidos degenerados en un sintetizador de DNA del tipo Applied Biosystems 3948DNA, utilizando química establecida de fosforamidita, se precipitaron con etanol y se utilizaron de forma impurificada para PCR. La secuencia de algunos de los cebadores oligonucleótidos degenerados y la formación de aminoácidos que ésta tiene codificados, es como sigue:

TRK1	5'-CTGAATTCGGNGCNTTYGGNAARTG-3'	GAFGKVb (sentido)
TRK4	5'-GCTGGATCCYTCNGGNGGCATCCA-3'	WMPPE (antisentido)
ROS1	5'-GCNTTYGGNGARGTNTAYGARGG-3'	AFGEVYEG (sentido)
CCK4b	5'-GCTGGATCCYTCNGGNSWCATCCA-3'	WMSPE (antisentido)
CCK4c	5'-GAGTTYGGNGARGTNTTYYTNGC-3'	EFGEVYEG (sentido)

Estos cebadores, se derivaron de las hebras sentido y antisentido de motivos o formaciones dentro del dominio catalítico de algunas proteína-quinasas. Las designaciones de los residuos de nucleótidos degenerados, son N = A, C, G, ó T; R = A ó G; Y = C ó T; H = A, C ó T no G; D = A, G ó T no C; S = C ó G; y W = A ó T.

Las reacciones de PCR, se realizaron utilizando cebadores degenerados amplificados a múltiples cDNAs de doble hebra. Los cebadores, se añadieron a una concentración final de 5 \muM, cada uno, a una mezcla que contenía 10 mM TrisHCl, pH 8,3, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl_{2}, 200 \muM de cada desoxinucleósido trifosfato, 0,001% de gelatina, 1,5 U AmpliTaq DNA Polimerasa (Perking-Elmer/Cetus), y 1,4 \mul de cDNA. Después de haber procedido a 3 minutos de desnaturalización, a una temperatura de 95ºC, la condiciones de ciclado, fueron de 94ºC durante 30 segundos, 50ºC durante 1 minuto, y de 72ºC durante 1 minuto y 45 segundos para 35 ciclos. Los fragmentos de PCR, que migraban entre 300-350 pb, se aislaron en geles de un 2% de agarosa, utilizando el equipo a modo de kit, GeneClean (Bio101), y los T-A se clonaron en el vector pCRII (Invitrogen Corp. U.S.A.), en concordancia con el protocolo del
fabricante.

Las colonias, se seleccionaron para las mini-preparaciones de plásmidos de DNA, utilizando columnas de Qiagen y, el DNA plásmido, se secuenció utilizando un equipo de secuenciación de ciclado de terminación mediante tinción, a modo de kit, del tipo "cycle secuencing dye-terminator kit", con AmpliTaq DNA Polimerasa, del modelo FS (ABI, Foster City, CA). La secuenciación de los productos de reacción, se realizó en un secuenciador de DNA del tipo ABI Prism 377 DNA Sequencer, y se analizó utilizando el algoritmo de alineamiento BLAST (Altschul, S.F. et al., J. Mol. Biol. 215: 403-10).

Se emplearon estrategias adicionales de PCR, para conectar varios fragmentos de PCR o ESTs, utilizando cebadores oligonucleótidos exactos o casi exactos, tal y como se detalla en la sección de resultados, para cada cDNA. Las condiciones de PCR, fueron tal y como se describe anteriormente, arriba, excepto en cuanto a lo referente al hecho de que, las temperaturas de reasociación, se calcularon para cada oligo-par utilizando la fórmula: Tm = 4 (G + C) + 2 (A + T).

Aislamiento de los clones de cDNA

Se procedió a sondar las bibliotecas de cDNA humana, con fragmentos de PCR o de EST, correspondientes a genes relacionados con la STE20. Las sondas, se marcaron con ^{32}P, mediante cebado aleatorio, y se utilizaron a razón de 10x10^{6} cpm/ml, seguido de técnicas standard para el rastreo de bibliotecas. La prehibridación (3 h) y la hibridación (durante toda la noche), se condujeron a una temperatura de 42ºC, en 5X SSC, 5X Solución de Denhart, 2,5% sulfato de dextrano, 50 mM Na_{2}PO_{4}/NaHPO_{4}, pH 7,0, 50% formamida, con 100 mg/ml de DNA de esperma de salmón, desnaturalizado. Se realizaron lavados rigurosos, a una temperatura de 65ºC, en 0,1X SSC y 0,1% de SDS. La secuenciación de DNA, se realizó en ambas hebras, utilizando un equipo de secuenciación de ciclado de terminación mediante tinción, a modo de kit, del tipo "cycle secuencing dye-terminator kit", con AmpliTaq DNA Polimerasa, del modelo FS (ABI, Foster City, CA). Los productos de la reacción de secuenciación, se procesaron en un secuenciador de DNA del tipo ABI Prism 377 DNA Sequencer.

Programa ensamblador bioinformático de EST, "Makegene"

Los reportes sobre EST, se descargaron de un ncbi (www.ncbi-nlm.-nih.gov). Después de descomprimir los archivos, se inscribió el programa "reporte2est", para extraer la siguiente información: 1) Nombres de los EST, 2) número de acceso al GenBank (banco de genes), 3) números de gi del banco de genes, 4) números de id de los clones), 5) secuencias de nucleótidos de los ESTs, 6) el organismo, 7) el nombre la biblioteca, 8) el nombre del lab, y 9) la institución. La información de salida del "report2est", es un archivo en el formato FASTA, con la totalidad de la información listada anteriormente, arriba, en la segunda línea de cada entrada. El archivo resultante, se formatea para BLAST, utilizando "pressdb" (obtenible como parte de las herramientas del equipo a modo del ncbi).

El programa "makegene", se desarrolló para crear un gen, a partir de ESTs. Los datos de entrada para este programa, son una secuencia de interrogación y, el organismo/especies para la cual debe crearse el gen. Se procede a realizar una búsqueda inicial de la base de datos de EST formateada, descrita anteriormente, arriba, utilizando BLAST (blastn). Se procede a eliminar, de las interrogaciones futuras, cualesquiera resultados que contengan colas de avisos o advertencias, tales como las colas de polyA, u otros elementos de repetición. Los programas "blast_parse_reports", se desarrollaron para extraer la línea de cabeza FASTA, de los resultados de búsqueda y, los datos de salida, se filtran, a continuación, para extraer únicamente las líneas de cabeza FASTA para las especies deseadas.

Habiéndose procedido a filtrar los resultados iniciales, en cuanto a prevenciones y especies, éstos se envían a un circuito cerrado, en el cual, se procede a repetir las investigaciones, comparándoles con la base de datos, hasta que ya no se encuentran ESTs nuevos El circuito cerrado, consiste en las siguientes etapas: 1) Cuando sea posible, se extraen los nombres de los dos finales de los ESTs, de la base de datos, procediendo a buscar el campo "Clone id" (identidad del clon), o la parte del campo de "EST name" (nombre del EST), antes de las post-inscripción de .r o .s, 2) cualesquiera de los ESTs que se hayan utilizado como preguntas o interrogaciones en circuitos cerrados anteriores, se retiran de la pregunta o interrogación actual, mediante el programa "substract", (sustracción), 3) la lista resultante de los ESTs, es utiliza para extraer la secuencia de la base de datos, mediante el programa batch_parse_fasta. 4) se hace funcionar BLAST, comparándolo con la base de datos, utilizando cada secuencia, 5) los archivos de salida, de los avisos que contienen BLAST, se retiran, 6) los resultados, se filtran mediante especies, y 7) el circuito cerrado, se vuelve a introducir, si no se han encontrado nuevos ESTs en las pasadas previas a través del circuito cerrado.

Los ESTs elegidos por el programa "makegene", se utilizan como datos de entrada para el programa "mpde2-cluster" (Hide, W., Burke, J. and Davison, D. U. de Houston, -trabajo no publicado-), el cual agrupa secuencias que se solapan. Los programas "conting" (Kerlavage, T., TIGR, -no publicado-), "gde2mult" y "gde2sing" (Smith, S.W., et al., CABIOS 10, 671-675 (1994)), se utilizan para realizar una secuencia de alineamiento y de consenso de los ESTs que se solapan.

Resultados Clonación de DNA y caracterización de la STLK2

La secuencia de cDNA de STLK2 humana, se encuentra compuesta de dos fragmentos de EST solapados,
AA191319 y W16504, los cuales se identificaron utilizando una investigación del tipo Smith-Waterman de la base de datos de EST, con STLK1 (MST3 GB:AF024636) como pregunta o interrogante. La secuencia completa de ambos clones, se determinó y se utilizó para genera la secuencia de la STL2 humana, en su longitud total.

El clon EST, AA191319, contiene un inserto de 1327 pb, y un ORF de 1146 pb (382 aminoácidos). El clon EST, W16504, contiene un inserto de 2174 pb (que no incluye la cola de poli A), y un ORF de 687 pb (382 aminoácidos).

El cDNA de STKL2 humana (SEQ ID NO: 1), es de 3268 pb de longitud. El AA191319, abarca las posiciones 1-1327 y, el W16504, abarca las posiciones 743-3216. El solapado entre estos dos clones, muestra una identidad de secuencia del 100%. El cDNA de STK2 humana, consiste en un ORF de 1248 pb, flanqueado por un una 5' UTR de 181 pb (1-181), y una 3' UTR de 1748 pb (1433-32116) la cual se sigue por una región nucleótida poliadenilada. En las posiciones 3193-3198, se encuentra una señal de poliadenilación (AATAA). La secuencia que flanquea a la primera ATG, conforma, según el consenso de Kozac, una metionina de iniciación, y se cree que es el sitio de inicio de traducción para la STLK2. Además de ello, la STLK2 humana y las proteínas SOK-1 y MST3 relacionadas, conservan la secuencia de aminoácidos que sigue inmediatamente a esta presumible metionina de iniciación.

Algunos fragmentos de EST, abarcan la secuencia completa de STLK2, con AA191319, en el extremo 5', y W165404 en el extremo 3'.

Todas las investigaciones comparadas con la base de datos pública de ácidos nucleicos, (NRN, -del inglés, public nucleic acid database-), y la base de datos de proteínas (NRP -del inglés, protein database-), se condujeron utilizando el programa de alineamiento de espacios Smith-Waterman. (Smith, TF an Waterman, MS (1981), J. Mol. Biol., 147, 195-197.) con la matriz PMA100, y espacio abierto y penalizaciones de extensión de 14:1, respectivamente.

Ejemplo 2 Análisis de expresión de proteína-quinasas relacionadas con STE20 de mamíferos Materiales y procedimientos Análisis cuantitativo de PCR

Se procedió a aislar RNA, procedente de una variadas de tejidos y líneas de células humanos. Se procedió a sintetizar cDNA de simple hebra, a partir de 10 \mug de cada RNA, tal y como se describe anteriormente, arriba, utilizando el método de Superscript Preamplification System, -Sistema de superescritura de preamplificación- (GibcoBRL). Estos moldes de hebra individual, se utilizaron, a continuación, en una reacción de PCR de 25 ciclos, con cebadores específicos para cada clon. Los productos de reacción, se sometieron a electroforesis, sobre geles de agarosa al 2%, se marcaron con tintura consistente en bromuro de etidio, y se fotografiaron en una caja de luz UV. Se procedió a estimar la intensidad relativa de las bandas STK-específicas, para cada muestra.

Análisis de expresión basados en series de DNA

Se procedió a preparar marcajes de series de DNA de plásmidos, cargando 0,5 \mug de plásmido desnaturalizado para quinasa STE20-relacionada, sobre una membrana de nylon. Las sondas de simple hebra marcadas con [\alpha^{32}P]dCTP, se sintetizaron a partir del RNA total, aislado de algunas fuentes de tejido humano inmune o de células tumorales (thymus, dendrocitos, células mastocíticas, monocitos, células B (primarias, Jurkat, RPMI8226, SR), células T (CD8/CD4+, TH1, TH2, CEM, MOLT4), K562 (megacariocitos). La hibridación, se realizó a una temperatura de 42ºC, durante un transcurso de tiempo de 16 horas, en 6X SSC, 0,1% SDS, 1X solución de Denhardt, 100 \mug de esperma de DNA de arenque desnaturalizado, con 10^{6} cmp/ml de sonda de hebra simple, desnaturalizada con [\alpha^{32}P]dCTP. Los filtros, se lavaron con 0,1X SSC/0,1%, a una temperatura de 65ºC, y se expusieron para el análisis cuantitativo, en un dispositivo dinámico de formación de imágenes moleculares, del tipo "Molecular Dynamics phosphoroimager".

Resultados Distribución de transcriptos de genes STE20-relacionados en tejidos normales y en líneas de células de tumores

Se procedió a examinar todas las quinasas STE20-relacionadas, en un panel de tejidos/células humanas, inmunes, mediante la hibridación a un marcaje de serie de DNA, que contenía plásmidos que codificaban a cada uno de estos genes. Se procedió a expresar ampliamente la STLK2, en cada una de las 14 muestras inmunes, con lo cual, la STL4 y la PAK4, se expresaron altamente en un subjuego de 6-7 de las muestras (tabla 3). Algunas otras quinasas (SULU3, ZC4, KHS2), tenían una expresión más restringida, mientras que, otras, se expresaron en únicamente una fuente inmune individual (STLK3, thymus; ZC1, dendrocitos; ZC3, monocitos; PAK5, células mastocíticas y MOLT4), y algunas más, se encontraban ausentes de todas las fuentes inmunes ensayadas (GEK2, SULU1, ZC2, STLK5). Estos modelos patrón de expresión, eran bien distintos entre los miembros de la misma subfamilia (es decir, ZC1, ZC2, ZC3 Y ZC4, ó PAK1, PAK3, PAK2, PAK4, PAK5). Este análisis, sugiere el hecho de que, algunas de estas quinasas, pueden ser dianas candidatas para varios trastornos inmunes, y pueden mediatizar funciones vitales para la biología básica o células mayormente proliferantes.

TABLA 3 Expresión de quinasa ST20-relacionada, en un panel humano, inmune

Quinasa	Thymus	Dendrocitos	Células	Monocitos	Células B	CD8+ CD4+	TH1	TH2
			mastocíticas
GEK2	350	350	350	350	350	350	350	350
SULU1	350	350	350	350	350	350	350	350
SULU3	350	350	350	350	12149	350	5115	350
STLK2	117770	13771	27620	92036	18305	39109	5408	3564
STLK3	8624	350	350	350	350	350	350	350
STLK4	8524	350	350	350	350	8685	5642	350
STLK5	xxx	xxx	xxx	xxx	350	350	350	xxx
ZC1	350	3377	350	350	350	350	350	350

TABLA 3 (continuación)

Quinasa	Thymus	Dendrocitos	Células	Monocitos	Células B	CD8+ CD4+	TH1	TH2
			mastocíticas
ZC2	350	350	350	350	350	350	350	350
ZC3	350	350	350	20156	350	350	350	350
ZC4	xxx	xxx	xxx	xxx	350	350	350	xxx
KHS2	8766	2508	350	56575	350	350	350	350
PAK4	32658	7684	3729	100948	350	350	350	1604
PAK5	350	350	4905	350	350	350	350	350

Quinasa	CEM	MOLT4	JURKAT	RPMI8226	SR	K562 (MO)
	(Células T)	(Células T)	(Células B)	(Células B)	(Células B)
GEK2	350	350	350	350	350	350
SULU1	350	350	350	350	350	350
SULU3	350	350	350	350	350	350
STLK2	47236	53262	47605	22560	65936	30390
STLK3	350	350	350	350	350	350
STLK4	3648	350	26772	1570	350	350
STLK5	350	350	350	xxx	350	350
ZC1	350	350	350	350	350	350
ZC2	350	350	350	350	350	350
ZC3	350	350	350	350	350	350
ZC4	1094	7813	14945	xxx	350	6385
KHS2	350	350	350	350	350	350
PAK4	350	10246	350	3229	350	350
PAK5	350	12672	350	350	350	350

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Tamaño de transcripción de datos de Northerm

Qinasa	(kb)
STK2	3,8
STLK4	5,0
ZC1	6,9/4,7
ZC2	6,0/8,0
ZC4	5

(Continuación)

Qinasa	(kb)
KHS2	4,4
SULU1	4,5
SULU3	10,0
GEK2	5,5
PAK4	4,8
PAK5	3,5

La STLK2 se expresa ampliamente; los niveles de expresión más altos, se encontraron en la placenta, bazo y PBL.

La STLK4, es expresa también ampliamente en tejidos normales, incluyendo el corazón, el cerebro, la placenta, los pulmones, el hígado, el músculo esquelético, los riñones, el páncreas, el bazo, el thymus, la próstata, los testículos, los ovarios, el intestino delgado, colón y linfocitos de sangre periférica. La STLK4, se detectó también en células T de Jurkat.

La ZC2, se expresa en el cerebro y en los testículos.

La SULU3, mostró un amplio modelo patrón de expresión en el panel de tejido normal de RNAs.

La GEK2, se expresó en el bazo, en el thymus y en los testículos.

La PAK4, se expresó en los tejidos normales: cerebro, testículos y próstata.

La PAK5, mostró unos débiles niveles de expresión en los tejidos normales: cerebro, testículos, vesícula, colon, médula supra-renal, bazo, hígado fetal, pecho, corteza cerebral, cerebelo, thymus, glándulas salivares, pulmones, estómago, duodeno, útero, próstata, músculo esquelético y placenta.

Ejemplo 4 Generación de inmuno-reactivos específicos a las proteína-quinasas ST20-relacionadas Materiales y procedimientos

Se procedió a producir inmuno-reactivos específicos en conejos, contra péptidos sintéticos KLH- ó MAP-conjugados, correspondientes a las quinasas relacionadas con la STE20 humana. Se procedió a conjugar péptidos C-terminales, a KLH, con glutaraldehído, dejando un término C. Se conjugaron péptidos internos, con un término N, bloqueado. Pueden también generarse inmuno-reactivos adicionales, procediendo a inmunizar conejos con las proteínas de GST-fusión, bacterianamente expresadas, que contienen dominios citoplasmáticos de cada nueva KTK.

Los varios sueros inmunes, se sometieron en primer lugar a tests de ensayo, en cuanto a la reactividad y la selectividad a proteína recombinante, previamente a realizar los tests de ensayo de las fuentes endógenas.

Marcajes de Western

Se procede a transferir proteínas en SDS PAGE, a membranas de inmovilización ("immobilon"). El tampón de lavado, es PBST (suero salino tamponado fosfatado standard, pH 7,4 + 0,1% de tritón x 100). El tampón de bloqueo y de incubación de anticuerpos, es PBST + 5% de leche. Las diluciones de anticuerpos, variaban de 1:1000 a 1:2000.

Resultados

Tres antisueros de SULU1 (contra ambos, 539A y 540A), y dos antisueros SULU3 (542A), reaccionaron específicamente con los antígenos de péptidos. El enlace de antisueros, era compatible con el péptido. Los experimentos con extractos procedentes de células transfectadas con genes epítope-etiquetados SULU1 y SULU3, se encuentran en camino.

Los antisueros contra el péptido C-terminal PAK4, 554A, reaccionaron con GSt-PAK4 purificada, y detectaron una proteína del peso molecular correcto procedente de células de cultivo.

Los experimentos específicos de inmunoprecipitación, están en marcha, para determinar la reactividad con proteína nativa.

Se encuentran en camino experimentos de ensayos similares de inmunización y de antisueros, para cada una de las otras ST20-quinasas, nuevas.

Inmuno-genes de péptidos de proteína-quinasas ST20-relacionadas y su especificidad en el reconocimiento de proteínas endógenas mediante procedimiento de marcajes de Western o inmuno-precipitaciones

Proteína	Secuencia	Posiciones Aa	Conj	West.	IP
STLK2	EKFQKCSADESP	405-416	KLH	Y	Y
STLK4	SISNSELFPTTDPVGT	252-267	KLH	Y	Y
SULU1	LDFPKEDYR	890-898	KLH	Y	Y
SULU1	HGDPRPEPRPTQ	409-420	KLH	Y	Y
SULU3	PSTNRAGSLKDPEC	2-14	KLH	N	ND
SULU3	DPRTRASDPQSPPQVSRHK	411-429	KLH	ND	ND
PAK4	CLVPLIQLYRKQTSTC	666-680	KLH	ND	Y
PAK5	PLMRQNRTR	390-398	KLH	Y	Y
PAK5	SGDRRRAGPEKRPKSS	148-163	KLH	Y	Y
PAK5	(C9) RRKSLVGTPYWMAPE	417-485	KLH	Y	ND
ND = Todavía no realizado

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Inmuno-genes de proteínas de fusión de GST de proteína-quinasas ST20-relacionadas y su especificidad en el reconocimiento de proteínas endógenas mediante procedimiento de marcajes de Western o inmuno-precipitaciones

Proteína	Dominio	Posiciones Aa	West.	IP
ZC1	Helicoide-enrollado	350-867	Y	Y
	/pro/B/C
ZC1	B	615-732	Y	Y
ZC2	Helicoide-enrollado	348-762	ND	ND
	/pro/B/
ZC2	B	658-762	Y	Y
PAK4	N-term	252-426	ND	ND
PAK4	quinasa/C term	350-681	ND	Y
PAK5	A/Nterm	53-330	ND	ND
PAK5	A/term	53-330	ND	ND
ND = Todavía no realizado

La proteína STKL2 de 50kD, se expresó altamente en algunas líneas de células hematopoyésicas, incluyendo a las Jurkat, pGL10, Ramos, A20, VEHI-231, K562, HEL y timocitos recientemente aislados de ratones C57/BL6. Se detectaron también altos niveles de expresión en varias líneas de células tumorales, incluyendo a las Calu6, Colo205, LS180, MDAMB231, y A 549.

La proteína ZC1 de 160 kD, se detectó en las células T de Jurkat, Colo205, HCT116, RIE-1, 293T, MDAMB231, y SK-MEL28.

La proteína ZC2 de 170 kD, se detectó en las SK-Me128 y UACC-62.

Se confirmaron elevados niveles de proteína PAK5 de 64 kD, en las líneas de células de cáncer de pecho MDA-231 y MCF-7, y en la línea de células de cáncer de pulmón A549.

Ejemplo 5 Expresión recombinante y ensayos biológicos para proteína-quinasas ST20-relacionadas Materiales y procedimientos Expresión transitoria de quinasas Ste20-relacionadas en células de mamíferos

Los plásmidos de expresión de pcDNA (10 \mug DNA/100 mm placa), que contenían construcciones de quinasa STE20-relacionada, se introducen en 293 células con lipofectamina (Gibco BRL). Después de un transcurso de tiempo de 72 horas, las células, se recolectan en 0,5 ml de tampón de solubilización (20 mM HEPES, pH 7,35, 150 mM NaCl, 10% glicerol, 1% Triton X-100, 1,5 mM MgCl_{2}, 1 mM EGTA, 2 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo, 1 \mug/ml aprotinina). Se procedió a redisolver una mezcla de alícuotos mediante electroforesis en gel de poliacrilamida SDS (PAGE - del inglés, poliacrilamide gel electrophoresis), sobre 6% gel de acrilamida/0,5% gel de bisacrilamida, y se transfirieron electroforéticamente a nitrocelulosa. El enlace no específico, se bloqueó mediante marcajes de preincubación, en Blotto (tampón salino de fosfato con un contenido de un 5% peso/volumen de leche no grasa, secada, y un 0,2% Volumen/volumen, de nonidet P-40 (Sigma) y, se detectó la proteína recombinante, utilizando los varios antipéptidos o antisueros específicos anti-fusión de GST.

Ensayos de quinasas in vitro

Tres días después de la transfección con construcciones de expresión de quinasas STE20-relacionadas, se procedió a lavar una placa de 10 cm, de 293 células, con PBS, y se solubilizó en hielo, con 2 ml de PBSTDS que contenía inhibidores de fosfatasa (10 mM NaHPO_{4}, pH 7,25, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,5% desoxicolato, 0,1% SDS, 0,2% azida sódica, 1 mM NaF, 1mM EGTA, 4 mM ortovanadato de sodio, 1% aprotinina, 5 \mug/ml de leupeptina). Se procedió a retirar los residuos de células, mediante centrifugación (1200 x g, 15 minutos, 4ºC) y, el lisado, se pre-clarificó mediante dos incubaciones sucesivas, con 50 \mul de una suspensión 1:1 de sefarosa de proteína A, durante una hora, cada una de ellas. Se procedió a hacer reaccionar medio ml del sobrenadante, con 10 \mul de antisuero quinasa-específico purificado de proteína A (generado a partir de una proteína de fusión de GST o antisuero antipéptido), más 50 \mul de una suspensión 1:1 de sefarosa de proteína A, durante 2 horas, a una temperatura de 4ºC. Las perlas, se lavaron, a continuación, 2 veces, en PBSTDS, y 2 veces en HNTG (20 mM HEPES, pH 7,5/150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100, 10% glicerol).

Las quinasas inmunopurificadas sobre perlas de agarosa, se resuspendieron en 20 \mul HNTG más 30 mM MgCl_{2}, 10 mM MnCl_{2}, y 20 \muCl [\alpha^{32}P*ATP (300 Ci/mmol). Las reacciones de la quinasa, se realizaron durante un transcurso de tiempo de 30 minutos, a la temperatura ambiente, y se pararon mediante la adición de HNTG suplementado con 50 mM EDTA. La muestras, se lavaron 6 veces en HNTG, se hicieron hervir durante un transcurso de tiempo de 5 minutos en tampón de muestra de SDS, y se analizaron mediante SDS-PAGE, seguido de autorradiografía. Los análisis de fosfoaminoácidos, se realizaron mediante procedimientos de bandas P^{32}-marcadas, cortadas a partir del gel SDS-PAGE.

Se procedió a llevar a cabo ensayos similares, en construcciones de fusión de GST, de las quinasas, bacterialmente expresadas.

Tampón de ensayo ZC1

20 mM Tris pH 7,4, 200 mM NaCl, 0,5 mM DTT, 3 mM MgCl_{2}, 0,3 mM Mn CL2, 100 \muM ^{32}P\gammaATP.

Substratos:

Proteína básica de mielina (MBP), a 0,28 mg/ml y péptido fosforilado RTVGRRNTFIGT-PPYWMAPE, a 17 \muM (el fuerte residuo subrayado, muestra el sitio de fosforilación).

A mayores concentraciones de MgCl_{2} (3 mM), la actividad de ZC1, (ambos dominios, el dominio de la longitud completa y el dominio de quinasa recombinante), es hasta 10 veces mayor con respecto al substrato exógeno MBP. Como contraste de ello, la autofosforilación y la fosforilación del substrato de activación péptido de recirculación, se inhiben ambos. El Mn++, no inhibe la autofosforilación y la fosforilación peptídica, mediante la forma de dominio truncado de la quinasa. No obstante, ambas, la MBP-fosforilación, la actividad AND que prefiere el Mn++, y la autofosforilación, la actividad que prefiere el Mn++, se eliminan con la mutación de lisina de enlace de ATP en ZC1 (Lys54A1a), indicando que, ambas actividades, son atribuibles al dominio de la quinasa ZC1.

Tampón de ensayo SULU1

Este tampón es idéntico al descrito para el ZC1, excepto en cuanto a lo referente al hecho de que, se utilizan 5 mM de MgCl_{2}. Bajo estas condiciones, se inhibieron otros miembros de la familia STE20 (PAK4, ZC1), para la autofosforilación, y requirieron la reducción del [Mn], a < 0,3 mM, para una reacción de autofosforilación eficiente.

Substratos: MBP, fosvitina, ó \alpha-caseína, a 0,28 mg/ml.

Tampón de ensayo PAK4, PAK5

20 mM Hepes, pH 7,2, 130 mM KCl, 10 mM MgCl_{2}, 01 mM NaF, 20 mM B-fosfato de glicerol, 0,5 mM DDT, 50 \muM ATP, 0,5 \muCi ^{32}P\gammaATP.

Substratos: MBT a 0,28 mg/ml y substratos de péptido derivados de la recirculación de activación de PAK5, a 2,5 \mum.

Tampón de ensayo STLK2

Similar al descrito anteriormente, arriba, excepto en cuanto a lo referente al hecho de que se incluyen 0,5 mM NgCl_{2}, 5 mM MnCl_{2}, y 5 \muCi ^{32}P\gammaATP.

Resultados

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Expresión de proteínas y actividad quinasa de nuevas proteína-quinasas STE20-relacionadas

Proteína	Tamaño observado	Tamaño predicho	Actividad quinasa	Actividad quinasa
	(kD)	(kD)	in vitro	endógena
STLK2	50	46	Y	Y
STLK4	55	50	Y	ND
ZC1	160	140	Y	Y
ZC2	170	150	Y	Y
KHS	ND	101	ND	ND
SULU1	119	105	Y	Y
SULU3	140	115	ND	Y
PAK4	80	75	Y	Y
PAK5	64	64	Y	Y

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Una persona especializada en el arte de esta técnica especializada, apreciará fácilmente el hecho de que, la presente invención, está bien adaptada para llevar a cabo los objetos, y obtener las finalidades y ventajas mencionadas, así como también aquéllas inherentes en ellas. Los complejos moleculares y los métodos, procedimientos, tratamientos, moléculas, compuestos específicos descritos aquí, son actualmente representativos de las formas preferidas de presentación, son a título de ejemplo, y no se pretende que sean limitativos del ámbito o alcance de la invención. Cambios en éstos, y otros usos, podrán ocurrírseles a aquellas personas expertas en este arte especializado de la técnica, cambios y usos éstos que se encuentran comprendidos en el espíritu de la invención, y que se encuentran definidos en el ámbito de las reivindicaciones.

Resultará fácilmente evidente, para una persona especializada en el arte de esta técnica, el hecho de que pueden realizarse sustituciones y modificaciones variadas, en la invención dada aquí a conocer, sin salirse del ámbito y espíritu de la invención.

Todas las patentes y publicaciones mencionadas en la especificación, son indicativas de los niveles de aquéllas personas especializadas en el arte de esta técnica, a los cuales pertenece la invención.

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La invención, descrita aquí de una forma ilustrativa, puede practicarse, de una forma apropiada, en ausencia de algún elemento o de algunos elementos, limitación o limitaciones, las cuales no se encuentran específicamente reveladas aquí. Así, de esta forma, por ejemplo, en cada uno de los casos y ejemplos que se facilitan aquí, los términos "comprendiendo", "consistiendo esencialmente" y "consistiendo en", pueden reemplazarse con cualesquiera de los otros dos términos. Los términos y expresiones que se han empleado, se utilizan como términos de la descripción, y no como limitación, y no existe intención de que, en el uso de los términos y expresiones, se excluyan cualesquiera equivalentes de características que se muestran y se describen, o porciones de éstos, sino que, se reconoce el hecho de que son posibles varias modificaciones en el ámbito de la invención reivindicada.

De una forma particular, si bien algunas formulaciones descritas aquí, se han identificado mediante excipientes añadidos a las formulaciones, la invención está pensada para cubrir también las formulaciones finales formadas por la combinación de estos excipientes. De una forma específica, la invención, incluye formulaciones en las cuales, de uno a todos los excipientes añadidos, experimentan una reacción durante la formulación, y no se encuentran ya presentes en las formulación final, o se encuentran presentes en formas modificadas.

Adicionalmente, allí en donde las características o aspectos de la invención se encuentran descritos en términos de grupos de Markush, aquéllas personas expertas en este arte especializado de la técnica, reconocerán el hecho de que, la invención, se encuentra también descrita mediante éstos, en términos de cualquier miembro individual o subgrupo de miembros del grupo de Markush. Así, por ejemplo, si X se describe como un grupo consistente en bromo, cloro y yodo, las reivindicaciones para el caso en donde X es bromo y las reivindicaciones para el caso en donde X es bromo y cloro, se encuentran completamente descritas.

En las reivindicaciones que se facilitan a continuación, se encuentran otras formas de presentación.

<110> SUGEN, INC.

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<120> PROTEÍNA-QUINASAS STE20-RELACIONADAS

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<130> 240/300-PCT

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<140> A SER ASIGNADO

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<141> Adjunto

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<150> US 60/081, 784

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<151> 1998-04-14

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<160> 2

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<170> FastSEQ para Windows Versión 3,0

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<210> 1

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<211> 3268

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<212> DNA

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<213> STLK2 DE MAMÍFERO (HUMANO)

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<400> 1

1

2

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<210> 2

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<211> 416

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<212> PRT

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<213> STLK2 DE MAMÍFERO (HUMANO)

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<400> 2

3

4

Claims (18)

1. Una molécula de ácido nucleico, aislada, enriquecida o purificada, la cual codifica un polipéptido de quinasa STLK2, comprendiendo, la citada molécula de ácido nucleico, una secuencia de nucleótidos que:

(a) codifica la secuencia de aminoácidos completa, tal y como se presenta en la SEQ ID NO:5;

(b) es el complemento de la secuencia de nucleótidos de (a);

(c) codifica por lo menos 40 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO:5, y que tiene actividad quinasa;

(d) es el complemento de la totalidad de la secuencia de nucleótidos de (c),

(e) codifica un polipéptido que tiene actividad quinasa, que comprende la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO:5, excepto en cuanto al hecho de que, ésta, carece de uno o más de los dominios definidos por los segmentos de aminoácidos 1-21, ó 275-416 de la SEQ ID NO:5;

(f) es el complemento de la totalidad de la secuencia de nucleótidos de (e)

2. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, en donde, la citada molécula de ácido nucleico se aísla, se enriquece o se purifica, a partir de mamíferos.

3. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 2, en donde, el citado mamífero, es un humano.

4. La molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, la cual comprende adicionalmente un vector o promotor efectivo para iniciar la transcripción en una célula huésped.

5. Una sonda de ácido nucleico para la detección de ácido nucleico que codifica un polipéptido de quinasa STLK2 en una muestra, en donde, la citada sonda, hibridiza específicamente a una molécula de ácido nucleico que codifica a la secuencia completa de aminoácidos presentada en las SEQ ID NO:5, o codifica por lo menos 40 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO:5, y que tiene actividad quinasa.

6. Una célula recombinante que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de quinasa STLK2, que tiene la secuencia de aminoácidos presentada en las SEQ ID NO:5, o codifica por lo menos 40 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO:5, y que tiene actividad quinasa.

7. Un polipéptido de quinasa, aislado, enriquecido o purificado, que tiene la secuencia de aminoácidos presentada en las SEQ ID NO:5, o un fragmento de ésta, que comprende por lo menos 40 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO:5, y que tiene actividad quinasa.

8. Un polipéptido de quinasa, aislado, enriquecido o purificado, que tiene la secuencia de aminoácidos presentada en las SEQ ID NO:5, excepto en cuanto a lo referente al hecho de que, ésta, carece de uno o más de los dominios definidos por los segmentos de aminoácidos 1-21, ó 275-416 de la SEQ ID NO:5n y que tiene actividad quinasa.

9. La molécula polipéptida de quinasa de la reivindicación 7 ó la reivindicación 8, en donde, el citado polipéptido, se aísla, se enriquece o se purifica a partir de un mamífero.

10. La molécula polipéptida de quinasa de la reivindicación 9, en donde, el citado mamífero, es un humano.

11. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, que tiene una afinidad de enlace específica a un polipéptido de quinasa STLK2, que tiene la secuencia de aminoácidos completa, presentada en la SEQ ID NO:5, comprendiendo, un fragmento de ésta, por lo menos 40 aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO:5, y que tiene actividad quinasa o que tiene la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO:5, excepto en cuanto al hecho de que, ésta, carece de uno o más de los dominios definidos por los segmentos de aminoácidos 1-21, ó 275-416, de la SEQ ID NO:5.

12. Un hibridoma que produce un anticuerpo que tiene una afinidad de enlace específica a un polipéptido de quinasa STLK2, que tiene la secuencia de aminoácidos completa, presentada en la SEQ ID NO:5, comprendiendo, un fragmento de ésta, por lo menos 40 aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO:5, y que tiene actividad quinasa o que tiene la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO:5, excepto en cuanto al hecho de que, ésta, carece de uno o más de los dominios definidos por los segmentos de aminoácidos 1-21, ó 275-416, de la SEQ ID NO:5.

13. Un procedimiento para identificar una substancia que modula la actividad quinasa, la cual comprende las etapas de:

(a) contactar el polipéptido de quinasa STLK2, que tiene la secuencia de aminoácidos completa, presentada en la SEQ ID NO:5, comprendiendo, un fragmento de ésta, por lo menos 40 aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO:5, y que tiene actividad quinasa o que tiene la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO:5, excepto en cuanto al hecho de que, ésta, carece de uno o más de los dominios definidos por los segmentos de aminoácidos 1-21, ó 275-416, de la SEQ ID NO:5, con una substancia de test de ensayo;

(b) la medición de la actividad del citado polipéptido; y

(c) la determinación de si, la citada substancia, modula la actividad del citado polipéptido.

14. Un procedimiento para identificar una substancia que modula la actividad quinasa, el cual comprende las etapas de:

(a) Expresar, en una célula, un polipéptido de quinasa STK2, que tiene la secuencia de aminoácidos completa, presentada en la SEQ ID NO:5, comprendiendo, un fragmento de ésta, por lo menos 40 aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO:5, y que tiene actividad quinasa o que tiene la secuencia de aminoácidos presentada en las SEQ ID NO:5, excepto en cuanto al hecho de que, ésta, carece de uno o más de los dominios definidos por los segmentos de aminoácidos 1-21, ó 275-416, de la SEQ ID NO:5;

(b) añadir una substancia de ensayo, a la citada célula; y

(c) controlar el cambio en un fenotipo de célula o la interacción entre el citado polipéptido y el un compañero de enlace natural.

15. Un procedimiento para la detección de un polipéptido de quinasa STLK2, en una muestra, como una herramienta de diagnóstico para enfermedades o trastornos, en donde, el citado procedimiento, comprende las etapas de:

(a) el poner en contacto la muestra con una sonda de ácido nucleico, la cual hibrida específicamente, bajo condiciones de hibridación, las cuales son por lo menos tan rigurosas como la hibridación, en un 50% de formamida, 5XSSC. 50 mM NaH_{2}PO_{4}, pH 6,8, 0,5% SDS, 0,1% mg/ml de DNA de esperma de salmón tratado por ultrasonidos y 5X solución de Denhart a una temperatura de 42ºC, el lavado durante el transcurso de toda la noche con 2X SSC, 0,1% SDS a 45ºC; y lavado con 0,2 X SSC, 0,1% SDS a 45ºC, a una región diana de ácido nucleico del polipéptido de quinasa STLK2, la cual,

codifica a la secuencia completa de ácido nucleico tal y como se presenta en la SEQ ID NO:5, o que es el complemento de todos los nucleótidos de ésta, codifica por lo menos 40 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO:5, y que tiene actividad quinasa o el complemento de toso los nucleótidos de ésta, o codifica un polipéptido que tiene actividad quinasa, que comprende la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO:5, excepto en cuanto al hecho de que, ésta, carece de uno o más de los dominios definidos por los segmentos de aminoácidos 1-21, ó 275-416, de la SEQ ID NO:5, ó es el complemento de todas las regiones nucléotidas de ésta, y.

(b) la detección de la presencia o cantidad de sonda: híbrido de la región diana, como una indicación de la citada enfermedad.

16. Un procedimiento, según la reivindicación 15, en donde, la citada enfermedad o el citado trastorno, se selecciona de entre el grupo consistente en enfermedades y trastornos inmuno-relacionados, trasplantes de órganos, infartos microcardíacos, enfermedades cardiovasculares, apoplejía, fallo renal, trastornos neurodegenerativos oxidantes relacionados con el estrés, y cáncer.

17. Un procedimiento para la detección de un polipéptido de quinasa STLK2, en una muestra, como una herramienta de diagnóstico de enfermedad o trastorno, en donde, el citado procedimiento, comprende:

(a) comparar un región de ácido nucleico diana que codifica el citado polipéptido de quinasa STLK2, en una muestra, teniendo, el citado polipéptido de quinasa, una secuencia de aminoácidos como la presentada en la SEQ ID NO:5, comprendiendo, por lo menos 40 aminoácidos contiguos de ésta y que tiene actividad quinasa, o la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO:5, excepto en cuanto al hecho de que, ésta, carece de uno o más de los dominios definidos por los segmentos de aminoácidos 1-21, ó 275-416, de la SEQ ID NO:5, con una región de control de ácido nucleico que codifica el citado polipéptido de actividad quinasa; y

(d) detectar diferencias en la secuencia, o cantidad, entre la citada región diana y la citada región diana de control, como una indicación de la citada enfermedad o el citado trastorno.

18. El procedimiento según la reivindicación 17, en donde, la citada enfermedad o el citado trastorno, se selecciona de entre el grupo consistente en enfermedades y trastornos inmuno-relacionados, trasplantes de órganos, infartos microcardíacos, enfermedades cardiovasculares, apoplejía, fallo renal, trastornos neurodegenerativos oxidantes relacionados con el estrés, y cáncer.