KR20120000062A - Ｐａ－ｃａｒｄ로 암을 예방 및/또는 치료하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 세균으로부터 유래된 단백질로 암세포를 죽이는 방법 및 물질에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 아주린, Laz, Pa-CARD, 및 융합 단백질 Azu-H.8 및 H.8-Azu에 관한 것이고, 백혈병 세포 및/또는 난소암 세포를 죽이는데에 사용하는 것에 관한 것이다.

Description

ＰＡ－ＣＡＲＤ로 암을 예방 및/또는 치료하기 위한 조성물 및 방법{COMPOSITIONS AND METHODS TO PREVENT AND/OR TREAT CANCER WITH PA-CARD}

본원은 2009년 2월 20일에 출원된 미국 가출원번호 61/154,236 및 2009년 5월 19일에 출원된 미국 가출원번호 61/179,435에 대하여 35 U.S.C. §§119 및 120 하의 우선권을 주장하고; 우선권 주장의 기초가 된 가출원은 2008년 12월 15일에 출원된 미국특허 출원번호 12/314,703의 부분계속출원이며; 2006년 8월 23일에 출원된 미국특허 출원번호 11/508,173의 부분계속출원이며; 2005년 10월 6일에 출원된 미국특허 출원번호 11/244,105의 부분계속출원이며; 2006년 7월 19일에 출원된 미국특허 출원번호 11/488,695의 부분계속출원이다. 이러한 출원서의 전체 내용은 본 명세서에 참조로 모두 포함된다.

백혈병은 골수 및 혈액의 악성 암이다. 비정상 혈구의 비조절된 축적에 의해 특정되며, 백혈병은 정상 혈구 기능의 억제를 초래하고, 많은 경우에서 죽음을 초래한다. 백혈병은 2008년도 미국에서 약 44,270명의 새로운 사람에게 영향을 미쳤다고 추정되었다. 백혈병은 남성의 암 사망 중 5번째로 가장 흔한 원인이고, 여성의 암 사망 중 6번째로 가장 흔한 원인이다. 백혈병은 20살 미만의 어린이들 중에서 다른 암보다 더 많은 죽음을 초래한다("Cancer facts and figures 2008," Atlanta: American Cancer Society (2008); Xie Y 등, Cancer 97:2229-35 (2003)). 백혈병의 어떤 유형은 치료하기가 극도로 어려우며-예를 들어, 급성 전골수구성백혈병(APL)은 드물지만 오직 30 %의 환자만이 표준 화학요법에 반응하는 치명적인 질병이다.

수많은 현재의 치료 방식은 어느 정도 효과가 있지만, 암세포에 대한 특이성이 부족하기 때문에 현저한 유해한 부작용을 가진다. 목표-특이적 치료법을 발달시키기 위한 노력은 이미티니브(imatinib)의 성공에 의해 상당히 박차를 가했으며, 상기 이미티니브는 Gleevec®으로 알려진 매우 효과적인 약물이다. Gleevec®은 Bcr-Abl 티로신 키나아제를 특이적으로 억제한다. 만성 골수성 백혈병(CML)에서 크로모좀 자리옮김은 Bcr-Abl 티로신 키나아제의 본질적인 활성화를 야기해서, 암 성장을 촉진하는 세포의 신호전달의 활성을 야기한다. 삼산화 비소(As2O3)와 콘쥬게이션된, 세포 분화에 수반되는 호르몬인, 레티노산은 APL을 치료하는 데에 사용된다.

반면에, 저항성의 발달은 약물의 구조-특이적 결합이 변화될 수 있는 키나아제와 같은 공격의 한점을 목표로 하는 약물과 관련하여 중대한 문제이다. 백혈병 환자에서 저항성이 증가된 경우에는 종양 특이적 약물들은 약물 활성의 상승 작용을 자아내도록 혼합하여 비특이적 약물의 적은 투여량의 사용을 가능하게 하는 기존의 약물 조합 치료법의 실행에 임상의가 의존하게 하고, 다른 효과적인 치료법을 알아 봐야한다.

본 발명의 목적은 조성물, 및 Pa-CARD로 암을 예방 및/또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 암, 구체적으로 백혈병 및/또는 난소암을 죽이기 위한 조성물 및 세포독성 펩타이드의 사용방법에 관한 것이다. 본 발명의 일 양태는 암세포를 죽일 수 있는, 카스파아제 보강(CARD)-유사 도메인을 포함하는 단리된 펩타이드이다. 상기 단리된 펩타이드는 세균, 구체적으로 녹농균으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 단리된 펩타이드는 Pa-CARD이다. 다른 실시예에서, 상기 단리된 펩타이드는 서열번호:27을 포함하거나 서열번호:27로 구성된다. 일부 실시예에서, 상기 단리된 펩타이드는 백혈병, 섬유육종, 난소암 및/또는 유방암 세포를 죽일 수 있다. 다른 실시예에서, 상기 단리된 펩타이드는 혈류 중의 반감기를 연장시키거나 최적화하기 위해 화학적으로 변형된다.

또한, 본 발명은 암세포를 죽일 수 있는, 카스파아제 보강(CARD)-유사 도메인, Laz, H8-Azu 및 Azu-H8을 포함하는 단리된 펩타이드로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질과 상기 세포를 접촉시킴으로써 암세포를 죽이는 방법에 관한 것이다. 일부 실시예에서, 상기 암세포는 백혈병 세포, 섬유육종 세포, 난소암 세포 및 유방암세포로 구성된 군으로부터 선택된다. 이 방법은 암세포를 죽일 수 있는 하나 이상의 세포독성제와 상기 세포를 접촉시키는 단계를 더 포함한다. 이러한 세포독성 물질은 시스플라틴, Gleevec®, 레티노산, 5'-aza-2'-디옥시시티딘 및 삼산화 비소일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 구체적인 실시예에서, 상기 방법은 시스플라틴과 상기 암세포를 접촉시키는 단계를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 상기 암세포는 하나 이상의 단백질과 거의 동시에 하나 이상의 세포독성제와 접촉된다.

또한, 본 발명은 암세포를 죽일 수 있는, 카스파아제 보강(CARD)-유사 도메인, Laz, H8-Azu 및 Azu-H8을 포함하는 단리된 펩타이드로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 암으로 고통받는 포유류 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시예에서, 상기 암은 백혈병, 섬유육종, 난소암 및 유방암으로 구성된 군으로부터 선택된다. 추가 실시예에서, 암세포를 죽일 수 있는 하나 이상의 세포독성 물질은 환자에게 투여될 수도 있다. 상기 세포독성 물질은 시스플라틴, Gleevec®, 레티노산, 5'-aza-2'-디옥시시티딘 및 삼산화 비소일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 추가 실시예에서, 환자에게 투여되는 부가적인 세포독성 물질은 시스플라틴이다. 또 다른 실시예에서, 상기 하나 이상의 세포독성 물질은 하나 이상의 단백질과 거의 동시에 투여된다.

또한, 본 발명은 Laz의 H.8 영역을 포함하는 아주린 및 펩타이드와 세포를 접촉시킴으로써 백혈병 세포를 죽이는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 추가 실시예에서, 상기 백혈병 세포는 Laz의 H.8 영역을 포함하는 아주린 및 펩타이드와 거의 동시에 또는 거의 동시에 접촉된다.

또한, 본 발명은 Laz의 H.8 영역을 포함하는 아주린 및 펩타이드를 백혈병으로 고통받는 포유류 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 추가 실시예에서, Laz의 H.8 영역을 포함하는 아주린 및 펩타이드는 동시에 또는 거의 동시에 투여된다.

또한, 본 발명은 Laz, 아주린, H.8-Azu, Azu-H.8, 및 암세포를 죽일 수 있는 카스파아제 보강(CARD)-유사 도메인을 포함하는 단리된 펩타이드로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질과 백혈병 세포를 접촉시킴으로써 백혈병 세포의 세포 분화를 유도하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 Laz, 아주린, H.8-Azu, Azu-H.8, 및 암세포를 죽일 수 있는 카스파아제 보강(CARD)-유사 도메인을 포함하는 단리된 펩타이드로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질과 암세포를 접촉시킴으로써 암세포에 선택적으로 진입하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이며; 상기 암세포는 백혈병 세포 및 난소암세포로 구성된 군으로부터 선택된다.

또한, 본 발명은 Laz, 아주린, H.8-Azu, Azu-H.8, 및 암세포를 죽일 수 있는, 카스파아제 보강(CARD)-유사 도메인을 포함하는 단리된 펩타이드로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질과 암세포를 접촉시킴으로써 암세포에서 세포 주기 정지를 유도하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 상기 암세포는 백혈병 세포, 섬유육종 세포, 유방암 및 난소암 세포로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 추가 실시예에서, 상기 단백질은 세포 중의 Wee1 단백질 수준을 증가시킨다. 또 다른 실시예에서, 상기 단백질은 인산화된 AKT-Ser-473의 감소를 유발한다. 또 다른 실시예에서, 상기 단백질 모두는 세포 중의 Wee1 단백질 수준을 증가시키고 인산화된 AKT-Ser-473의 감소를 유발한다.

또한, 본 발명은 암세포를 죽일 수 있는, 카스파아제 보강(CARD)-유사 도메인을 포함하는 단리된 펩타이드와 암세포를 접촉시킴으로써 카스파아제 3 활성을 통해 암세포 중의 세포 사멸을 유도하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 추가 실시예에서, 상기 암세포는 난소암 세포이다.

또한, 본 발명은 암세포를 죽일 수 있는, 카스파아제 보강(CARD)-유사 도메인을 포함하는 단리된 펩타이드와 암세포를 접촉시킴으로써 암세포에서 NF-kB 신호전달 경로 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 추가 실시예에서, 상기 암세포는 난소암 세포이다.

또한, 본 발명은 암세포를 죽일 수 있는, 카스파아제 보강(CARD)-유사 도메인을 포함하는 단리된 펩타이드를 암호화하는 발현 벡터에 관한 것이다. 구체적인 실시예에서, 상기 발현 벡터는 Pa-CARD를 암호화한다.

또한, 본 발명은 암세포를 죽일 수 있는, 카스파아제 보강(CARD)-유사 도메인을 포함하는 단리된 펩타이드를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 추가 실시예에서, 상기 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 더 포함한다. 또 다른 실시예에서, 상기 약학 조성물은 아주린, Laz, H.8-Azu 및 Azu-H.8로 구성된 군으로부터 선택되는 단백질을 더 포함한다. 또 다른 실시예에서, 상기 약학 조성물은 암세포를 죽일 수 있는 하나 이상의 세포독성 물질을 더 포함한다. 구체적인 실시예에서, 상기 약학 조성물은 정맥 내 주사에 적절한 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다.

또한, 본 발명은 본 발명에서 개시된 하나 이상의 약학 조성물은 백혈병으로 고통받는 환자에게 치료적 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 추가 실시예에서, 상기 약학 조성물은 정맥 내, 국부, 피하, 근육 내, 경구로 구성된 군으로부터 선택되는 방식으로 환자에게 투여되고, 종양 안에 투여된다.

본 발명의 또 다른 양태는 본 명세서에서 개시된 하나 이상의 단리된 펩타이드를 암호화하는 핵산 분자이다.

본 발명의 또 다른 양태는 본 명세서에서 개시된 하나 이상의 약학 조성물을 포함하는 키트이다.

서열목록의 간단한 설명

서열번호:1은 임균 laz 유전자의 서열을 암호화하는 게놈 DNA이며, 이는 Genbank 등록번호 Y00530 (ctggcaggct tgacgcttcg atacgctctg tttcggtcag gctggtcccg aaaccggaaa aaccgccgaa aaccaatacc ctgcatttga gtaaggctgc gctggagagt ttcggttcgg cggcggcaaa gttggaaaaa cggcatcccg aattggcgga ggcattggca aacttggtta gaaggcatgg cgcataaaat gtatacggga atttgtgtaa acatccgtta atattaagaa gtaaaggata atgggtctaa tactaaagaa ataggttcgg ggtaaaattg ccccttttaa agtaaacgat tgtaaacttg cagacaggct ttgatttcaa atgaaatttg tagcaaaatg ccgccccgaa acatctgttt gtgcaacgcg gcggaatctt tttcaaggtt ttgttaatgg cggttgcact ttgatttctg taaaaccgaa tattatttta tcgattggag atttaccatg aaagcttatc tggctctgat ttctgccgcc gttatcggtt tggctgcctg ctctcaagaa cctgccgcgc ctgctgccga ggcaactcct gctgctgaag cacccgcttc cgaagcgcct gccgccgaag ctgctcctgc agatgctgcc gaagcccctg ctgccggcaa ttgtgcggca actgtcgaat ccaacgacaa tatgcagttc aacaccaaag acatccaagt cagcaaagca tgtaaagagt ttaccatcac tctgaaacat accggtacgc aacccaaagc cagcatgggt cacaaccttg tgattgccaa agctgaagac atggacggcg tatttaaaga cggcgtaggt gctgccgata ccgactatgt caaacctgac gatgcgcgcg ttgttgccca caccaaactg atcggcggcg gcgaagagtc ttccctgact ctggatcctg ccaaattggc tgacggcgac tacaaatttg cctgcacttt cccgggtcac ggtgctttga tgaacggcaa agtgactttg gtcgattaat ccgcrtaaag tctcaaaaga cggacagcct gctttgtgca ggctgtttta ttataaaatg actgcttgaa aagtgccccg ttgagaacga aaacatgaat ccgtttgaaa)이다.

서열번호:2는 녹농균 아주린 유전자의 서열을 암호화하는 게놈 DNA이다 (ctttttcatg cagcggatcg ctcgcgcatc acttcagggt cagggtgccc ttcatcagcg cggagtggcc cgggaaggtg cagaagaaca tgtactgctc gccttccttc agcttggaga cgtcgaaggt caccgagtcc ttctcgcccg agccgatcag cttggtgtgg gcgatgacac ggctgtcgtc gggcttcagg taatccttgt ccaggccgga agccatgccg tcggtgacca cgccctgcat gtcggcggcg gtgctcagta cccagttgtg gcccatgacg ttcttcggca ggttgccggg gtgggacagg ttgacggtga actgcttgca gctcttgtcg acggtgatgg cattggtgtt gaactgcatc tggtcgttac cctggatgtc caccgagcac tcggcagcca gcagtggcgc actgagcagg gacagcaggg ataccgcagc gagtttacgt agcatggagc agcctcctag gcaggttggg cgatgaatcc tgaaagagca gactgcccga tcgggcaccg).

서열번호:3은 임균 laz 유전자의 H.8 영역의 서열을 암호화하는 게놈 DNA이다(tgctctcaag aacctgccgc gcctgctgcc gaggcaactc ctgccggtga agcacccgct tccgaagcgc ctgccgccga agctgctcct gcagatgctg ccgaagcccc tgctgcc).

서열번호:4는 임균의 Laz-암호화 유전자(laz)를 PCR 증폭하기 위한 정방향 프라이머이다(ccggaattcc ggcagggatg ttgtaaatat ccg).

서열번호:5는 임균의 Laz-암호화 유전자(laz)를 PCR 증폭하기 위한 역방향 프라이머이다(ggggtaccgc cgtggcaggc atacagcatt tcaatcgg).

서열번호:6은 pUC18-laz의 3.1 kb 단편을 PCR 증폭하기 위한 정방향 프라이머이다(ggcagcaggg gcttcggcag catctgc).

서열번호:7은 pUC18-laz의 3.1 kb 단편을 PCR 증폭하기 위한 역방향 프라이머이다(ctgcaggtcg actctagagg atcccg).

서열번호:8은 pUC19-paz의 0.4 kb 단편을 PCR 증폭하기 위한 정방향 프라이머이다(gccgagtgct cggtggacat ccagg).

서열번호:9는 pUC19-paz의 0.4 kb 단편을 PCR 증폭하기 위한 역방향 프라이머이다(tactcgagtc acttcagggt cagggtg).

서열번호:10은 pUC19-paz의 3.3 kb 단편을 PCR 증폭하기 위한 정방향 프라이머이다(cttcagggtc agggtgccct tcatc).

서열번호:11는 pUC19-paz의 3.3 kb 단편을 PCR 증폭하기 위한 역방향 프라이머이다(ctgcaggtcg actctagagg atcccg).

서열번호:12는 pUC18-laz의 0.13 kb 단편을 PCR 증폭하기 위한 정방향 프라이머이다(tgctctcaag aacctgccgc gcctgc).

서열번호:13은 pUC18-laz의 0.13 kb 단편을 PCR 증폭하기 위한 역방향 프라이머이다(taggatcctt aggcagcagg ggcttcggca gcatctgc).

서열번호:14는 pGEX-5X-3으로부터의 GST-암호화 유전자를 PCR 증폭하기 위한 정방향 프라이머이다(cgagctcatg tcccctatac taggttattg g).

서열번호:15는 pGEX-5X-3으로부터의 GST-암호화 유전자를 PCR 증폭하기 위한 역방향 프라이머이다(cccaagcttt caggggatcc cacgaccttc gatcagatcc).

서열번호:16은 pUC18-laz로부터 유래된 신호 펩타이드 및 laz의 H.8-암호화 영역을 PCR 증폭하기 위한 정방향 프라이머이다(ggaattcata tgaaagctta tctggc).

서열번호:17은 pUC18-laz로부터 유래된 신호 펩타이드 및 laz의 H.8-암호화 영역을 PCR 증폭하기 위한 역방향 프라이머이다(ccggaattcg gcagcagggg cttcggc).

서열번호:18은 pUC18-laz로부터 유래된 H.8-암호화 영역을 PCR 증폭하기 위한 정방향 프라이머이다(cgggatcccc tgctctcaag aacctgccgc gee).

서열번호:19는 pUC18-laz로부터 유래된 H.8-암호화 영역을 PCR 증폭하기 위한 역방향 프라이머이다(cggaattctt aggcagcagg ggcttcggca gcatctgcag g).

서열번호:20은 pGEX-5X-3-H.8로부터 유래된 GST-H.8 융합 영역을 PCR 증폭하기 위한 정방향 프라이머이다(cgagctcatg tcccctatac taggttattg g).

서열번호:21은 pGEX-5X-3-H.8로부터 유래된 GST-H.8 융합 영역을 PCR 증폭하기 위한 역방향 프라이머이다(ccgctcgagt caggcagcag gggcttcggc ag).

서열번호:22는 임균 균주 F62 Laz 단백질의 아미노산 서열이며, 이의 Genbank 등록번호 Y00530는 (Cys Ser Gln Glu Pro Ala Ala Pro Ala Ala Glu Ala Thr Pro Ala Gly Glu Ala Pro Ala Ser Glu Ala Pro Ala Ala Glu Ala Ala Pro Ala Asp Ala Ala Glu Ala Pro Ala Ala Gly Asn Cys Ala Ala Thr Val Glu Ser Asn Asp Asn Met Gln Phe Asn Thr Lys Asp lie Gln Val Ser Lys Ala Cys Lys Glu Phe Thr Ile Thr Leu Lys His Thr Gly Thr Gln Pro Lys Ala Ser Met Gly His Asn Leu Val lie Ala Lys Ala Glu Asp Met Asp Gly Val Phe Lys Asp Gly Val Gly Ala Ala Asp Thr Asp Tyr Val Lys Pro Asp Asp Ala Arg Val Val Ala His Thr Lys Leu lie Gly Gly Gly Glu Glu Ser Ser Leu Thr Leu Asp Pro Ala Lys Leu Ala Asp Gly Asp Tyr Lys Phe Ala Cys Thr Phe Pro Gly His Gly Ala Leu Met Asn Gly Lys Val Thr Leu Val Asp)이다.

서열번호:23는 녹농균 아주린의 아미노산 서열이다(Ala Glu Cys Ser Val AspIle Gln Gly Asn Asp Gln Met Gln Phe Asn Thr Asn Ala Ile Thr Val Asp Lys Ser Cys Lys Gln Phe Thr Val Asn Leu Ser His Pro Gly Asn Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Trp Val Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp Ser Arg Val Ile Ala His Thr Lys Leu lie Gly Ser Gly Glu Lys Asp Ser Val Thr Phe Asp Val Ser Lys Leu Lys Glu Gly Glu Gln Tyr Met Phe Phe Cys Thr Phe Pro Gly His Ser Ala Leu Met Lys Gly Thr Leu Thr Leu Lys).

서열번호:24는 임균 F62 Laz 단백질로부터 유래된 H.8 영역의 아미노산 서열이다(Cys Ser Gln Glu Pro Ala Ala Pro Ala Ala Glu Ala Thr Pro Ala Gly Glu Ala Pro Ala Ser Glu Ala Pro Ala Ala Glu Ala Ala Pro Ala Asp Ala Ala Glu Ala Pro Ala Ala).

서열번호:25는 펩타펩타이드 모티프의 아미노산 서열이다(Ala Ala Glu Ala Pro).

서열번호:26는 녹농균 아르기닌 디이미나아제(ADI)의 아미노산 서열이다(Met Ser Thr Glu Lys Thr Lys Leu Gly Val His Ser Glu Ala Gly Lys Leu Arg Lys Val Met Val Cys Ser Pro Gly Leu Ala His Gln Arg Leu Thr Pro Ser Asn Cys Asp Glu Leu Leu Phe Asp Asp Val Ile Trp Val Asn Gln Ala Lys Arg Asp His Phe Asp Phe Val Thr Lys Met Arg Glu Arg Gly Ile Asp Val Leu Glu Met His Asn Leu Leu Thr Glu Thr Ile Gln Asn Pro Glu Ala Leu Lys Trp Ile Leu Asp Arg Lys Ile Thr Ala Asp Ser Val Gly Leu Gly Leu Thr Ser Glu Leu Arg Ser Trp Leu Glu Ser Leu Glu Pro Arg Lys Leu Ala Glu Tyr Leu Ile Gly Gly Val Ala Ala Asp Asp Leu Pro Ala Ser Glu Gly Ala Asn Ile Leu Lys Met Tyr Arg Glu Tyr Leu Gly His Ser Ser Phe Leu Leu Pro Pro Leu Pro Asn Thr Gln Phe Thr Arg Asp Thr Thr Cys Trp Ile Tyr Gly Gly Val Thr Leu Asn Pro Met Tyr Trp Pro Ala Arg Arg Gln Glu Thr Leu Leu Thr Thr Ala Ile Tyr Lys Phe His Pro Glu Phe Ala Asn Ala Glu Phe Glu Ile Trp Tyr Gly Asp Pro Asp Lys Asp His Gly Ser Ser Thr Leu Glu Gly Gly Asp Val Met Pro Ile Gly Asn Gly Val Val Leu Ile Gly Met Gly Glu Arg Ser Ser Arg Gln Ala Ile Gly Gln Val Ala Gln Ser Leu Phe Ala Lys Gly Ala Ala Glu Arg Val Ile Val Ala Gly Leu Pro Lys Ser Arg Ala Ala Met His Leu Asp Thr Val Phe Ser Phe Cys Asp Arg Asp Leu Ile Val Pro Phe Ser Leu Arg Pro Asp Pro Ser Ser Pro Tyr Gly Met Asn Ile Arg Arg Glu Glu Lys Thr Phe Leu Glu Val Val Ala Glu Ser Leu Gly Leu Lys Lys Leu Arg Val Val Glu Thr Gly Gly Asn Ser Phe Ala Ala Glu Arg Glu Gln Tip Asp Asp Gly Asn Asn Val Val Cys Leu Glu Pro Gly Val Val Val Gly Tyr Asp Arg Asn Thr Tyr Thr Asn Thr Leu Leu Arg Lys Ala Gly Val Glu Val Ile Thr Ile Ser Ala Ser Glu Leu Gly Arg Gly Arg Gly Gly Gly His Cys Met Thr Cys Pro Ile Val Arg Asp Pro Ile Asp Tyr).

서열번호:27은 녹농균 ADI의 CARD 영역의 아미노산 서열의 잔기 75-225이다(Leu Leu Thr Glu Thr Ile Gln Asn Pro Glu Ala Leu Lys Trp Ile Leu Asp Arg Lys Ile Thr Ala Asp Ser Val Gly Leu Gly Leu Thr Ser Glu Leu Arg Ser Trp Leu Glu Ser Leu Glu Pro Arg Lys Leu Ala Glu Tyr Leu Ile Gly Gly Val Ala Ala Asp Asp Leu Pro Ala Ser Glu Gly Ala Asn Ile Leu Lys Met Tyr Arg Glu Tyr Leu Gly His Ser Ser Phe Leu Leu Pro Pro Leu Pro Asn Thr Gln Phe Thr Arg Asp Thr Thr Cys Trp Ile Tyr Gly Gly Val Thr Leu Asn Pro Met Tyr Trp Pro Ala Arg Arg Gln Glu Thr Leu Leu Thr Thr Ala Ile Tyr Lys Phe His Pro Glu Phe Ala Asn Ala Glu Phe Glu Ile Trp Tyr Gly Asp Pro Asp Lys Asp His Gly Ser Ser Thr Leu Glu Gly).

서열번호:28은 녹농균 ADI 유전자의 CARD 모티프를 PCR 증폭하기 위한 정방향 프라이머의 뉴클레오티드 서열이다(ATGC AC AATC TGCTGACCGA GACCATCCAG).

서열번호:29는 녹농균 ADI 유전자의 CARD 모티프를 PCR 증폭하기 위한 역방향 프라이머의 뉴클레오티드 서열이다(CAGGTCGAGG AGCCGTGGTC CTTGTC).

도 1. 도 1은 임균으로부터 유래된 laz(a) 및 녹농균으로부터 유래된 paz(b)의 개략적 묘사를 도시한다. 대장균에서 복제 및 과다발현을 위한 상기 녹농균 아주린 유전자는 주변 세포질 위치를 결정하는 아주린 유전자 자체(paz) 및 신호 펩타이드(psp) 서열로 구성되었다(b). laz의 H.8 영역은 나이세리아(Neisserial)신호 서열 nsp(pIC18-H.8-paz)를포함하는 paz의 5'-말단에서(c) 또는 paz 유전자의 3'-말단(pUC18-paz-H.8)(d) 중 어느 하나의 뼈대에서 복제되었다. 구조물을 제조하기 위한 구체적인 절차는 실시예 1에서 주어진다. 임균의 아주린 유사 서열인 naz는 laz 유전자; 나이세리아 신호 펩타이드 서열인 naz에 존재한다. 두 가지 경우 모두에서 신호 펩타이드 서열은 성숙한 Paz(주변 세포질) 및 Laz(표면 노출된) 단백질을 생산하도록 쪼개진다. (e), Laz, Paz 및 융합 단백질의 SDS-PAGE. Laz, H.8-Paz 또는 Paz-H.8(모두 약 17kDa)과 같은 H.8 융합 단백질의 비정상적 이주(anomalous migration)는 lapidated H,8-함유 단백질로 이미 언급되었다(Cannon, Clin. Microbiol. Rev. 2:S1-S4 (1989); Fisette, 등, J. Biol. Chem. 278:46252-46260(2003)).
도 2. 도 2는 H.8-Paz 융합 단백질이 다양한 암세포에 대하여 세포독성의 정도를 그래프로 묘사하는 것을 도시한다. (a) 교모세포종 LN-229 세포에 대하여 Paz(Paz-H.8)의 카복시 말단과 Paz(H.8-Paz)의 아미노 말단에서 합성 H.8 펩타이드, Paz, Laz 및 H.8 융합의 세포독성. 세포는 3가지의 다른 농도로(10, 20 및 40 μM) 6, 12 및 24시간 동안 단백질로 처리됐다. MTT 측정은 세포독성(세포사 비율)을 설명하기 위하여 생존 세포의 정도를 측정하기 위해 행해졌다. 세포독성의 비율을 계산하기 위하여, 비-처리된 생존가능한 세포의 값은 100 %를 가졌고, 생존가능한 세포의 수는 Paz, Laz 및 H.8-융합 단백질로 처리된 시료에서 결정했다. 이후에, 세포독성(%)의 정도는 죽은 세포로부터 결정됐다. (b) 인간 유방암 MCF-7 세포에 대하여 H.8 펩타이드, Paz, Paz-H.8, H.8-Paz 및 Laz의 세포독성. 모든 처리 조건은 상기(a)와 유사하다.
도 3. 도 3은 교모세포종 LN-229 및 유방암 MCF-7 세포 안으로 다양한 형광으로 표지된 아주린 연관 단백질의 진입을 묘사한다. (a) Alexafluor^® 568과 콘쥬게이션된 H.8 펩타이드, Paz, Paz-H.8, H.8-Paz 및 Laz(각각 20 μM)는 사진을 찍은 후에 커브글라스 상에서 37 ℃조건으로 30분 동안 LN-229 세포와 배양됐다. (b) Alexafluor^® 568과 콘쥬게이션된 다양한 단백질의 MCF-7 세포 안으로의 국재화(internalization)를 공초점 현미경에 의해 그리고 (a)에서 설명된 것처럼 시각화했다. (c) Laz의 국재화는 공초점 현미경에 의해 시각화되었다. 형광으로 표지된 Laz의 다양한 농도(2, 4, 8 및 16 μM)는 37 ℃에서 30분 동안 LN-299 세포와 배양되었다. 핵은 DAPI(4,6-디아미디노-2-페닐인돌)로 청색으로 표지된다. (d) Alexafluor^® 568과 콘쥬게이션된 Laz(10 μM)는 37 ℃에서 다양한 기간(5, 10, 20 및 30 분) 동안 LN-229 세포와 배양되었다. 국재화는 공초점 현미경에 의해 시각화되었다. (e) Alexafluor^® 568과 콘쥬게이션된 Paz(10 μM)는 영상을 찍은 후에 37 ℃에서 다양한 시간 동안 LN-229 세포와 배양되었다. 매우 작은 측정가능한 형광은 (e)에서 검출되었다.
도 4. 도 4는 도 3a 내지 3d의 공초점 현미경 영상에서 발견된 형광의 정량을 나타내는 막대 그래프를 도시한다. (a) 도 3a의 영상에서 형광의 정량. 아주린 단백질에서 형광의 정량은 Adobe^® Photoshop^® 을 사용하여 이루어졌다. 오차 막대는 단일 시료 중의 세개의 다른 세포에서 형광의 표준편차를 나타낸다. (b) 도 3b의 영상에서 형광의 정량. 정량은 도 4a에서처럼 수행했다. (c) 도 3c의 영상에서 형광의 정량. 정량은 도 4a에서처럼 수행했다. (d) 도 3d의 영상에서 형광의 정량. 정량은 도 4a에서처럼 수행했다.
도 5. 도 5는 세포 중의 표지된 융합 단백질의 영상 및 흡수와 세포독성의 그래프를 각각 도시한다. H.8-GST 융합 단백질과 함께 합동 처리는 교모세포종 LN-229 세포에서 Alexafluor^® 568로 표지된 Paz의 흡수를 가능하게 한다. 미표지된 20 μM의 (a) H.8, (b) GST, (c) GST-H.8, (d) H.8-GST, (e) PBS 완충액 및 Alexafluor^® 568과 콘쥬게이션된 20 μM의 Paz는 37 ℃에서 30분 동안 LN-229세포와 함께 배양되었다. 국재화는 공초점 현미경에 의해 시각화되었다. (f) Paz를 갖거나 갖지 않는 합성 H.8 펩타이드, GST 및 GST-H.8/H.8-GST 융합 유도체의 세포독성. 약 5 x 10³ LN-229 세포는 96-웰 배양판 안에 심어졌고, H.8 펩타이드, GST, GST-H.8, H.8-GST를 각각 20 μM로 또는 동일한 부피의 PBS 완충액으로 20 μM의 Paz와 함께(+paz) 또는 없이(-paz) 24시간 동안 처리했다.
도 6. 도 6은 IRdye^® 800CW(LI-COR Biotechnology, Lincoln, Nebraska)와 콘쥬게이션된 Paz, H.8-Paz 및 Laz가 주입된 마우스의 뇌의 영상을 도시한다. (a) 살아있는 마우스로부터의 뇌 영상. IRdye^® 800CW와 콘쥬게이션된 Paz, H.8-Paz 및 Laz 500 μg은 살아있는 누드 마우스에 복막 내로 주입했다. 24시간 후에, 마우스를 죽였고, 뇌를 꺼내고 LI-COR Odyssey^® Infrared Imaging System을 사용하여 형광을 검출하고 측정했다. (b) (a)에서처럼 처리된 누드 마우스 뇌의 두측(rostral) 중뇌 영역 영상. 마우스 뇌는 수평으로 절단되었고 영상을 찍었다.
도 7. 도 8은 대장균 중의 H.8-Gst 융합 단백질의 국부화의 SDS-PAGE, 웨스턴 블로팅(western blotting) 및 공초점 현미경 영상을 도시한다. (a) 복제된 gst, H.8-gst 또는 gst-H.8 유전자를 갖는 대장균 BL21(DE3) 세포는 37 ℃에서 0.1 mM의 IPTG와 함께 배양되었다. 세포 펠렛은 PBS로 2회 씻어졌고, 전혈 용해물은 SDS-PAGE 상에서 이동했다. 쿠마시 블루 염색(coomassie blue staining)은 단백질의 검출을 위해 사용되었다. (b) 상기 절차가 반복되었지만, 전혈 용해물과 주변 세포질 공간의 내용물 모두는 각기 단리되었고, SDS-PAGE 상에서 이동했고(20 μg 단백질), GST 또는 GST-H.8 융합 단백질은 단백질의 전체 농도 그리고 주변 세포질 농도를 결정하기 위해서 단일 클론 항-GST 항체로 웨스턴 블로팅하여 검출하였다. (c) 복제된 gst, H.8-gst 또는 gst-H.8 유전자를 갖는 대장균 균주 BL21(DE) 세포(표 2)는 37 ℃에서 0.4 mM IPTG와 함께 배양되었다. 이러한 세균 배양의 1 ml씩은 원심분리되었고, 결과물로 세균 펠릿을 수집했다. PBS로 2회 세퍽한 후에, 항-GST 항체를 함유하는(1:2000) 1 % FBS-PBS 1 ml를 가했다. 세포 현탁액은 1 시간 동안 배양되었고, 이후에 PBS로 2회 세척했다. 세균 세포는 30분 동안 1 % FBS-PBS 중의 FITC-콘쥬게이션된 항-래빗 IgG와 함께 배양되었다. 비결합된 항체를 제거하기 위하여, 세포를 다시 세척했고, 얼음 상에서 에탄올로 고정했다. DAPI(청색을 나타냄)로 처리된 대장균 시료는 공초점 현미경으로(x100 대물렌즈)로 관찰되었고, 단일 세포는 사진 찍혔다. (d) pUC19-paz(녹농균 아주린), pUC19-laz(나이세리아), pUC18-H.8-paz 또는 pUC18-paz-H.8을 갖는 대장균 세포는 37 ℃에서 0.1 mM의 IPTG의 존재하에서 밤새도록 배양되었다. 이러한 배양의 0.5 ml는 원심분리되었고, 결과물 세균 펠릿은 차가운 PBS로 2회 세척되었다. 1 ml의 1 % FBS-PBS 중의 항-아주린 항체(1:500)를 가했고, 1시간 동안 얼음 상에서 배양했다. PBS로 2회 세척한 후에, FITC-콘쥬게이션된 항-래빗 항체를 가했고, 30분 동안 얼음 상에서 배양했고, PBS로 2회 세척했고, 차가운 에탄올로 고정했다. 세균 시료는 공초점 현미경(x100 대물렌즈)에 의해 관찰되었다.
도 8. 도 8은 MTT 측정에 의해 결정되는 세포의 세포독성을 보여주는 그래프를 도시한다. (a 및 b) 세포의 세포독성은 24시간, 48시간 및 72시간 후에 10 μM의 Laz, 아주린(Azu), H8-Azu, 및 Azu-H8 또는 양성 대조군으로서 5 μM DAC로 처리된 HL60(a) 및 K562(b) 세포를 MTT 측정하여 결정되었다. (c) 낮은 농도(3.75 nM, 37,5 nM, 75 nM, 2.5 μM, 5 μM 및 10 μM의 Laz, Azu, H8-Azu, Azu-H8 또는 양성 대조군으로서 5 μM의 DAC)로 처리된 K562 세포. (d) 다양한 농도(1 μM, 2.5 μM, 5 μM 및 10 μM의 Laz, Azu, H8-Azu, Azu-H8 또는 5 μM DAC)로 처리된 HL60 세포의 MTT 측정에 의해 결정된 세포의 세포독성. 데이터는 반복된 세 번의 분리된 실험의 평균(±표준편차)을 나타낸다. 모든 값은 대조군으로부터 현저히 상이하다(p<0.05)
도 9. 도 9는 HL60 및 K562 세포에서 Laz 및 아주린에 의해 유도된 세포 형태학의 변화를 형광 현미경 영상으로 도시한다. Laz는 형광 현미경에 의해 보여지는 것처럼 HL60 및 K562 세포에서 형태학적 변화를 유도한다. (a) 및 (b)는 미처리된 HL60 및 K562 세포를 나타낸다. 10 μM의 Laz로 48 시간 동안 처리된 HL60(c) 또는 K562(d) 세포는 분화를 겪으며, 차후의 세포의 세포사멸이 이어지는 과정을 겪는다. 화살표는 분화된 육아종 세포를 가리킨다. 세포독성이 여전히 높은데도 불구하고, 약간의 형태학적 변화는 48시간 동안 10 μM 아주린으로 처리된 HL60 세포(e) 또는 K562 세포(f)에서 보여진다.
도 10. 도 10은 HL60 및 K562 세포 안으로 Laz 및 아주린의 선택적 진입을 보여주는 공초점 현미경으로부터의 영상을 도시한다. 패널 1: 10 μM 농도(a 및 b)에서 1시간 배양 후에 아주린 또는 Laz 중 어느것도 정상 말초 혈액 단핵 세포(PBMCs)에 진입하지 않는다. 아주린은 1시간 배양 후에 K562 세포에 진입하고(d), Laz에도 진입한다(c). 아주린은 1시간 배양 후에 HL60 세포에 진입하고(f), Laz에도 진입한다(e). 패널 2: 대조군 K562 세포에 비해서, Azu-H8, H8-Aau는 이러한 K562 세포뿐만 아니라 Laz에 진입한다.
도 11. 도 11은 아주린, Laz 및 DAC의 부존재 및 존재 하에서 세포 주기 진행의 그래프 차트를 도시한다. K562 세포는 48시간 동안 10 μM의 Laz, 아주린 및 5 μM의 DAC로 처리되었고, 고정되었고, 착색되었고, 상술한 바와 같이 DNA 함량에 대하여 분석되었다.
도 12. 도 12는 면역 블롯의 영상을 도시한다. 이 도면은 세포질 및 핵 추출에서 Laz- 및 Pa-CARD-처리된 K562 및 HL-60 세포 중의 단백질의 면역 블로팅을 통해 AKT(AKT-p-Ser473) 및 Wee1 단백질의 인산화 수준의 상태의 분석을 제공한다. 미처리된 세포의 대조군과 비교할 때 10 μM Laz 또는 10 μM Pa-CARD로 처리한지 48시간 후에 HL60 및 K562로부터 Wee1 및 인산화-AKT 세린 473의 수준을 비교하는 세포질 및 핵 단백질의 웨스턴 블롯 분석을 보여준다.
도 13. 도 13은 백혈병 세포에 대하여 세포독성 활성을 갖는 녹농균으로부터 유래된 ADI의 CARD 도메인의 개략적인 묘사를 도시한다. (a) Pa-ADI 및 Ma-ADI 중에 CARD 도메인이 존재하지만, 구조에 기초한 서열 정렬로부터 보여지는 DDAH 및 AGAT와 같은 구아니디노기 변형 상과(superfamily) 효소의 다른 멤버에는 존재하지 않는다. CARD 도메인은 포유류의 카스파아제-9를 보여준다. DDAH, 디메틸아르기닌 디메틸아미노히드로라아제; AGAT, 아르기닌: 글리신 아미디노트랜스퍼라아제. β-가닥 및 α-나선은 화살표, 조각으로 각각 보여진다. 로마자 I 내지 V는 다섯개의 ββαβ 서브유닛이다. 클립 부분(α-나선 모듈)은 카스파아제-9 단백질 분자의 CARD 도메인을 형성하는 6개의 α-나선 모듈에 구조적 상동 관계를 함유하는 Pa-ADI 및 Ma-ADI에서 보여진다. N,N-말단; C,C 말단. (b) 녹농균으로부터 유래된 정제된 46 kDa ADI 및 17 kDa CARD 단백질의 SDS-PAGE 겔 이주. (c) 섬유 육종(HT-1080), 유방감(MCF-7) 및 백혈병(HL60) 세포에 대하여 Pa-ADI 및 Pa-CARD의 세포독성 활성. 세포 생존력을 MTT 측정으로 결정한 후에, 세포는 48시간 동안 10 μM의 Pa-ADI 또는 Pa-CARD와 배양되었다.
도 14. 도 14는 마이코플라스마 아르기니니(mycoplasma arginini) 및 녹농균으로부터 유래된 아르기닌 디이미나아제(ADI) 효소의 구조적 특성을 보여주는 영상을 도시한다. (a) 두 개의 도메인이 형광으로 표시되는(MolMol 프로그램) 녹농균 ADI(1RXX_A)의 리본 드로잉(Ribbon drawing). (b) 도 13a에서 도시되는 영상의 복사. (c) 녹농균 ADI(Pa-ADI)의 전체적인 접힘과 위상 기하학을 보여주는 개략적인 도해이다.
도 15. 도 15는 Pa-ADI 및 Pa-CARD의 정제 및 아르기닌 디이미나아제 효소적 활성을 보여주는 겔 영상과 그래프를 도시한다. (a) 녹농균으로부터 유래된 정제된 ADI 및CARD 단백질의 SDS-PAGE 겔 이주. (b) 37 ℃, pH 7.2에서 정제된 Pa-ADI 및 Pa-CARD의 ADI 활성의 동역학. 효소에 의한 반응의 산물인 시트룰린은 490 nm에서 측정되었다. Pa-CARD의 아르기닌 디이미나아제 효소적 활성은 검출되지 않았다.
도 16. 도 16은 암세포 영역에 대하여 Pa-CARD는 Pa-ADI보다 더 높은 세포독성을 갖는다는 것을 보여주는 그래프를 도시한다. (a) 섬유육종(HT-1080), 유방암(MCF-7) 및 난소암(SKOV-3) 세포는 생존력을 MTT 측정으로 결정한 후에, 48시간 동안 20 μM의 Pa-ADI 또는 Pa-CARD와 함께 배양되었다. 웰 당 생존 가능한 세포의 수의 평균(±표준편차)은 세 번 반복시험으로부터 결정되었다. 모든 값은 대조군과 현저한 차이를 갖는다(p<0.05). (b) 시간(24, 48 및 72시간)에 대한 함수로서 난소암 SKOV-3 세포에 대하여 Pa-CARD에 의해 보이는 투여량 의존 세포독성. (c) 동일한 실험은 Pa-ADI로도 이루어졌다. 웰 당 생존 가능한 세포의 수의 평균(±표준편차)은 a에서 설명된 것처럼 세 번 반복시험으로부터 결정되었다(p<0.05).
도 17. 도 17은 난소암 SKOV-3 세포에서 Pa-CARD, 아주린 및 시스플라틴의 상대적인 세포독성 효과를 보여주는 그래프를 도시한다. (a) Pa-ADI, Pa-CARD, 아주린 및 시스플라틴 모두 20 μM은 생존력을 MTT 측정으로 결정한 후에, 48시간 동안 SKOV-3 또는 정상 난소 HOSE6-3 세포 중 어느 하나와 함께 배양되었다. (b) Pa-CARD는 SKOV-3 세포로 각각 처리된 것과 비교할 때 시스플라틴의 일부 부가적인 효과를 보여준다.
도 18. 도 18은 Pa-CARD가 SKOV-3 세포에서 세포사멸을 유도하지만 HOSE6-3에서는 카스파아제 활성을 통해 세포사멸을 유도하지 않는 다는 r서을 보여주는 사진을 도시한다. TUNEL 측정은 당소에서(in situ) Cell Death Detection Fluorescein kit(Roche)를 사용하여 형광-표지된 dUPT의 체내화를 측정함으로써 세포사멸-유도 DNA 가닥 절단을 검출하기 위해 사용되었다. SKOV-3 및 HOSE6-3 세포는 8개 웰의 Lab Tek 챔버 슬라이드에서 성장했고, 48시간 동안 10 μM의 Pa-CARD, Pa-ADI 및 아주린과 함께 배양되었다. 또한, BSA로 처리되지 않거나 처리된 음성 대조군은 평행하게 유지되었다(밑에 줄). 세포의 핵은 DAPI를 사용하여 청색으로 염색되었다. 세포는 녹색(a) 및 청색(b) 채널 하에서 보여질 뿐만 아니라, 중첩된 영상(c)(청록색)이 보여진다.
도 19. 도 19는 Pa-CARD에 의한 카스파아제 활성을 보여주는 그래프를 도시한다. 카스파아제 활성은 Promega로부터 구입한 Caspase-GloTM 3/7 측정 키트로 측정되었다. Pa-ADI 및 Pa-CARD는 투여량 반응 효과를 평가하기 위하여 두 개의 상이한 농도에서 사용되었다. 카스파아제 활성의 증가는 약물 처리를 하지 않은 대조군과 비교할 때 배수 증가를 보여준다.

정의

본 명세서에서 사용되는, 용어 "세포"는 본 명세서에서 특별히 "단일 세포"라고 하지 않는 한, 상기 용어의 단수 또는 복수 모두를 포함한다.

본 명세서에서 사용되는, 용어 "세포독성 펩타이드"는 암세포, 구체적으로 백혈병 세포에 대하여 선택적으로 세포독성이지만 정상세포에 대해서는 세포독성이 아닌 본 발명의 펩타이드를 의미한다.

본 명세서에서, “폴리펩타이드”, “펩타이드”, 그리고 “단백질”이라는 용어는 아미노산 잔기의 중합체를 표기하기 위해 상호 교환적으로 사용되었다. 상기 용어는 하나 이상의 아미노산 잔기가 자연적으로 존재하는 아미노산에 대응되는 인공적인 화학적 유사체인 아미노산 중합체에 적용된다. 또한, 상기 용어는 자연적으로 존재하는 아미노산 중합체에도 적용된다. 또한, “폴리펩타이드”, “펩타이드”, 그리고 “단백질”이라는 용어는 글리코실화 반응, 지질 부착, 황산화, 글루탐산 잔기의 감마 카복실화, 수산화, 그리고 ADP-리보스화를 포함하지만 이에 제한되지 않는 변화를 의미한다. 폴리펩타이드가 항상 완전한 선형 구조로 존재하는 것은 아니라는 것이 인식될 것이다. 예를 들어, 폴리펩타이드는 유비퀴틴 표지의 결과로 분지 될 수 있으며, 자연적으로 발생하지 않는 인간에 의한 조작이 불러온 사건들과 자연적으로 발생하는 사건을 포함하는 단백질 번역 후 사건들의 결과로서 구형(가지를 포함하거나 포함하지 않는)을 띨 수 있다. 구형의, 가지를 띤, 그리고 가지를 띤 구형의 폴리펩타이드는 비-번역 자연적 과정에 의해 합성될 수 있으며, 완전히 인공적인 방법으로도 합성될 수 있다. 합성 펩타이드는 세포 성분의 도움없이 제조된 것이다. 펩타이드를 제조하기 위한 합성 방법은 당해 분야에 잘 알려지고, 상업적으로 사용가능하다. 나아가, 본 발명은 메티오닌을 함유하는 및 메티오닌을 함유하지 않는 본 발명의 단백질의 아미노 말단 변이체의 사용을 고려한다.

본 명세서에서 사용되는, 용어 "질환"은 살아있는 동물의 정상 상태의 장애를 구성하거나, 신체 기능의 수행을 교란하거나 변형하는 정상으로부터의 해부학적 및 생리학적 일탈을 포함한다.

본 명세서에서 사용되는, 용어 "세포 성장을 억제"는 세포 분열 및/또는 세포팽창을 늦추거나 중단시키는 것을 의미한다. 또한, 이 용어는 세포 발생의 억제 또는 세포 죽음을 증가시키는 것을 포함한다.

본 명세서에서 사용되는, 용어 "~고통받고 있는"은 질환의 증상을 현재 나타내는 것과, 관찰 가능한 증상 없이 질환을 가지는 것과, 질환으로부터 회복하는 것, 그리고 질환으로부터 회복한 것을 포함한다.

본 명세서에서 사용되는, 용어 "치료"라는 용어는 치료되고 있는 질환과 연관된 질환 또는 증상의 진행 또는 심각성을 막는 것, 낮추는 것, 멈추는 것, 또는 반전시키는 것을 포함한다. 그러한 맥락에서, "치료"라는 용어는 필요한 의료적, 치료적 및/또는 예방적 투여를 포함한다. 또한 치료는 전암성 병소 또는 암과 같은 질환의 발달을 예방하거나 줄이는 것을 포함할 수 있다.

"치료적 유효량"은 치료받고 있는 피험자의 특정 질환의 나타나는 증상의 발달을 방지하거나, 낮추거나, 멈추게 하거나 후퇴시키기 위한 유효량 또는 이를 부분적으로 또는 완전히 완화시키기 위한 유효량이다. 치료적 유효량의 결정은 당해 분야의 기술자의 능력에 의한다.

본 발명의 단백질 또는 다른 세포 산물을 한정하기 위해 사용되는 경우에, 본 명세서에서 사용되는 용어 "실질적으로 순수한"은 예를 들어, 다른 단백질 및/또는 활성 억제 화합물이 실질적으로 없는 형태 또는 다른 것이 섞이지 않은 형태로 성장 배지 또는 세포의 함유물로부터 단리된 단백질을 나타낸다. 상기 용어 "실질적으로 순수한"은 단리된 분획의 적어도 약 75 %(건조중량) 또는 적어도 "75 % 실질적으로 순수함"을 나타낸다. 더 구체적으로, 용어 "실질적으로 순수한"은 적어도 약 85 %(건조중량)의 활성 화합물을 갖는 화합물을 나타내거나, "85 % 실질적으로 순수함"을 나타낸다. 매우 구체적으로, 용어 "실질적으로 순수한"은 적어도 약 95 %(건조중량)의 활성 화합물을 갖는 화합물을 나타내거나, 적어도 "95 % 실질적으로 순수함"을 나타낸다. 또한, 상기 용어 "실질적으로 순수한"은 합성 제조된 본 발명의 단백질 또는 화합물을 제한하기 위해 사용될 수 있으며, 예를 들어, 상기 합성 단백질은 합성반응의 시약 및 부산물로부터 단리된다.

본 발명의 펩타이드 또는 화합물을 나타내는 경우에, 본 명세서에서 사용되는 용어 "약학적 등급(pharmaceutical grade)"은 합성 시약 및 부산물을 포함하는 천연 상태로 발견되는 물질을 일반적으로 동반하는 구성 성분으로부터 실질적으로 또는 필수적으로 단리되는 펩타이드 또는 화합물, 그리고 약학적으로 이의 사용을 악화시키는 구성 성분으로부터 실질적으로 또는 필수적으로 단리되는 펩타이드 또는 화합물이다. 예를 들어, "약학적 등급" 펩타이드는 임의의 발암 물질로부터 단리되어 떨어져 있을 수 있다. 일부 예에서, 환자에게 정맥 내 투여가 부적합한 조성물이 되도록 하는 임의의 물질로부터 실질적으로 또는 필수적으로 단리되는 펩타이드 또는 화합물을 명시하기 위하여, "정맥 내 약학적 등급"과 같은 "약학적 등급"은 투여의 의도된 방법에 의해 수정될 수 있다. 예를 들어, "정맥 내 약학적 등급" 펩타이드는 SDS와 같은 용제 및 아자이드(azide)와 같은 항균제로부터 단리될 수 있다.

관용구 "단리된", "정제된" 또는 "생물학적 순수한"은 천연 상태로 발견되는 물질을 보통 동반하는 구성 성분을 실질적으로 또는 필수적으로 포함하지 않는 물질을 나타낸다. 따라서, 본 발명에 따른 단리된 펩타이드는 보통 당소(in situ) 환경에서 펩타이드와 연관된 물질을 함유하지 않는 것이 바람직하다. "단리된" 영역은 유래된 상기 영역으로부터 폴리펩타이드의 전체 서열을 포함하지 않는 영역을 나타낸다. "단리된" 핵산, 단백질 또는 이의 각각의 절편은 생체조건 환경에서 실질적으로 제거되어서, 숙련된 기술자에 의해 뉴클레오티드 서열분석, 제한효소절단, 부위 특이적 돌연변이, 및 핵산 절편에 대한 발현 벡터 안으로 서브클로닝(subcloning) 하는 것뿐만 아니라 실질적으로 순수한 양으로 단백질 또는 단백질 절편을 얻도록 다루어 질 수 있다.

펩타이드에 관하여 본 명세서에서 사용되는 용어 "변이체"는 야생형 폴리펩타이드에 비해 치환되거나, 결손되거나, 삽입된 아미노산을 가질 수 있는 아미노산 서열 변이체를 나타낸다. 변이체는 야생형 펩타이드의 절단일 수 있다. "결손"은 야생형 단백질 내로부터의 하나 이상의 아미노산을 제거하는 것이며, 반면에 "절단"은 야생형 단백질의 하나 이상의 말단으로부터 하나 이상의 아미노산을 제거하는 것이다. 따라서, 변이체 펩타이드는 폴리펩타이드를 복사하는 유전자의 처리에 의해 제조될 수 있다. 변이체는 폴리펩타이드의 기본 조성물 또는 특징을 바꿈으로써 제조될 수 있지만, 적어도 폴리펩타이드의 기본적인 활성의 일부를 바꾸지 않는다. 예를 들어, 나이세리아 펩타이드 또는 Pa-CARD 펩타이드의 "변이체"는 백혈병 세포를 죽이는 능력을 보유하는 돌연변이된 나이세리아 펩타이드 또는 Pa-CARD 펩타이드일 수 있다. 일부 경우에서, 변이체 펩타이드는 ε-(3,5-디니트로벤조일)-Lys 잔기와 같은 비-천연 아미노산으로 합성된다(Ghadiri & Fernholz, J. Am. Chem. Soc., 112:9633-9635 (1990)). 일부 실시예에서, 상기 변이체는 야생형 펩타이드에 비해, 치환되거나, 결손되거나, 삽입된 아미노산이 20개, 19개, 18개, 17개 또는 16개를 넘지 않는다. 일부 실시예에서, 상기 변이체는 야생형 펩타이드에 비해, 치환되거나, 결손되거나, 삽입된 아미노산이 15개, 14개, 13개, 12개 또는 11개를 넘지 않는다. 일부 실시예에서, 상기 변이체는 야생형 펩타이드에 비해, 치환되거나, 결손되거나, 삽입된 아미노산이 10개, 9개, 8개 또는 7개를 넘지 않는다. 일부 실시예에서, 상기 변이체는 야생형 펩타이드에 비해, 치환되거나, 결손되거나, 삽입된 아미노산이 6개를 넘지 않는다. 일부 실시예에서, 상기 변이체는 야생형 펩타이드에 비해, 치환되거나, 결손되거나, 삽입된 아미노산이 5개 또는 4개를 넘지 않는다. 일부 실시예에서, 상기 변이체는 야생형 펩타이드에 비해, 치환되거나, 결손되거나, 삽입된 아미노산이 3개, 2개 또는 1개를 넘지 않는다. 일부 실시예에서, 변이체는 미국특허 출원번호 12/389,120에서 설명되는 기술 및 방법을 사용하여 제조되었으며, 상기 공개 문헌은 본 명세서에 전체가 참조로 포함된다.

본 명세서에서 사용된 용어 "아미노산"은 임의의 자연적으로 발생 또는 비-자연적으로 발생된 아미노산 잔기 또는 합성된 아미노산 잔기, 즉 적어도 하나의 카복실기 및 1개, 2개, 3개 이상의 탄소 원자, 보통 하나의(α) 탄소 원자에 결합된 적어도 하나의 아미노 잔기를 포함하는 부분을 포함하는 아미노산 부분을 의미한다. 용어 "잔기"는 "아미노산"과 매우 밀접하다.

펩타이드와 관련하여 본 명세서에 사용된 용어 "유도체"는 연구 대상 펩타이드로부터 유래된 펩타이드를 나타낸다. 유도체는 펩타이드가 이의 기본적인 활성의 일부를 여전히 보유하는 펩타이드의 화학적 변형을 포함한다. 예를 들어, 나이세리아 펩타이드 또는 Pa-CARD 펩타이드의 "유도체"는 백혈병 및/또는 난소암 세포를 죽이는 능력을 보유하는 화학적으로 변형된 나이세리아 펩타이드 또는 Pa-CARD 펩타이드이다. 관심이 있는 화학적 변형은 펩타이드의 아미드화, 아세틸화, 황산화, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 변형, 인산화 또는 글리코실화를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 게다가, 유도체 펩타이드는 화합물에 폴리펩타이드 또는 이의 단편이 융합된 것일 수 있으며, 상기 화합물의 예는 다른 펩타이드, 약물 분자 물질, 다른 치료적 물질, 약학적 물질 또는 검출가능한 프로브(probe)가 있지만 이에 제한되지 않는다. 일부 실시예에서, 유도체는 미국특허 출원번호 12/389,120에서 설명되는 기술 및 방법을 사용하여 제조되었으며, 상기 공개 문헌은 본 명세서에 전체가 참조로 포함된다.

용어 "퍼센트(%) 아미노산 서열 동일성"은 두 개의 아미노산 서열을 나란히 놓는 경우에, 후보 서열(candidate sequence)의 아미노산 잔기와 동일한 폴리펩타이드의 아미노산 잔기의 퍼센트로서 정의된다. % 아미노산 동일성을 결정하기 위하여, 서열을 나란히 놓고, 만일 필요하다면, 최대 %의 서열 동일성을 얻기 위해 간격을 두며; 보존적 치환은 서열 동일성의 일부로서 고려되지 않는다. 퍼센트 동일성을 결정하기 위해 아미노산 서열을 나란히 놓는 과정은 당해 분야의 기술자에게 잘 알려져 있다. 종종 공개적으로 사용가능한 컴퓨터 소프트웨어 예를 들어, BLAST, BLAST2, ALIGN2 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어가 펩타이드 서열을 나란히 놓기 위해 사용된다. 구체적인 실시예에서, 긴 복잡한 필터, 예상(expect) 10, 글자크기 3, 존재(existence) 11 및 연장(extension) 1의 디폴트 파라메터를 사용하는 Blastp(Bethesda MD의 National Centor for Biothechnology Information에서 공급함)가 사용된다.

아미노산 서열이 나란히 놓이면, 주어진 아미노산 서열 B에, B와 함께 또는 B에 대하여 주어진 아미노산 서열 A의 % 아미노산 서열 동일성(주어진 아미노산 서열 B에, B와 함께 또는 B에 대하여 특정 % 아미노산 서열 동일성을 갖는 주어진 아미노산 서열 A로 또한 표현될 수 있음)은:

% 아미노산 서열 동일성 = X/Y * 100

으로 계산될 수 있으며,

상기 X는 서열 얼라인먼트(alignment) 프로그램 또는 A와 B의 알고리즘 얼라인먼트에 의한 동일한 매치(match)로서 점수 매겨졌고, Y는 B의 아미노산 잔기의 총 수이다.

만일 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않으면, B에 대한 A의 % 아미노산 서열 동일성은 A에 대한 B의 % 아미노산 서열 동일성과 같지 않을 것이다. 만일 더 긴 서열을 더 짧은 서열에 비교하면, 더 짧은 서열은 "B" 서열일 것이다. 예를 들어, 만일 절단된 펩타이드를 상응하는 야생형 폴리펩타이드에 비교하면, 상기 절단된 펩타이드는 "B" 서열일 것이다.

일반

본 발명은 암세포에 대하여 세포독성 효과를 갖지만 정상세포에는 세포독성을 갖지 않는 세균성 펩타이드, 변이체, 유도체, 및 이러한 펩타이드의 구조적 등가물을 포함하는 조성물을 제공하고, 포유류에서 암의 발달을 막는 방법, 포유류에서 암을 치료하는 방법, 및 포유류의 암세포를 죽이는 방법을 제공한다. 특히, 본 명세서에서 개시되는 상기 조성물 및 방법은 백혈병 및/또는 난소암을 예방, 치료 및/또는 죽이기 위해 사용될 수 있다.

수많은 큐프레독신 단백질, 구체적으로 녹농균 아주린 및 이의 절단은 수많은 유형의 고형의 포유류 암세포를 생체 내에서 그리고 시험관 내에서 모두 우선적으로 진입하고 죽일 수 있는 능력을 가진다고 알려져 왔다(Yamada 등, Cell. Biol. 7:1418-1431 (2005); Hiraoka 등, PNAS 101 :6427-6432 (2004); Hiraoka 등, Biochem. Biophys. Res. Comm. 338: 1284-1290 (2005)). 또한, 미국특허 제7,491,394호, 제7,381,701호 및 제7,084,105호, 그리고 미국특허 출원번호 11/488,693, 11/950,165, 11/854,654 및 12/338,480를 참조하고, 상기 공개문헌은 본 명세서에 전부가 참조로 포함된다. 아주린-유사 유전자는 임균 및, 수막염균과 같은 수많은 임균 그리고 수막염균으로 존재한다(Gotschlich & Seiff, FEMS Microbiol. Lett. 43 :253-255 (1987); Kawula, 등, Mol. Microbiol. 1 : 179-185 (1987)). 아주린은 다수의 병원성 세균에 의해 생산되고, 이러한 유전자들 중에 현저한 서열 상동성이 있다(Yamada, 등, Cell. Microbiol. 7:1418-1431 (2005)).

"H.8"로 불리는 단백질 에피토프(epitope)는 병원성 나이세리아 종들 중에 보존되고 단일클론 항체로 지정된 H.8의 결합에 의해 검출된다. 별개의 임균 유전자 laz는 상기 H.8 단일클론 항체와 교차 반응하는 단백질을 암호화한다(Hayashi & Wu, J. Bioenerg. Biomembr. 22:451-471 (1990)).

Laz는 지방산 및 글리세롤로 시스테인 잔기의 N-말단의 아실화를 초래하기 위해 서열을 처리하는, 세균성 효소 신호 펩티다아제 II에 의해 알아내는 신호 펩타이드 지질 단백질 공통 배열을 함유하는 임균의 외부 표면 단백질이다(Hayashi & Wu, id .; Yamada, 등, Cell. Microbiol. 7:1418-1431 (2005)). Laz 지질 단백질은 약 17 kDa이며, 모티프 Ala-Ala-Glu-Ala-Pro(AAEAP(서열번호:25))이 반복되는 불완전한 펜타펩타이드(pentapeptide)를 함유하는 N-말단에서 39개의 아미노산 영역인 H.8 영역을 포함한다(Gotschlich & Seiff, id; Kawula, 등, id; Woods 등, Mol. Microbiiol. 3: 43-48 (1989)). 이런 39개의 아미노산 이후에, Laz 중의 N-말단 영역은 녹농균 아주린에 매우 상동인 127개의 아미노산 영역이 있다(Cannon, Clin. Microbiol. Rev. 2:S1-S4 (1989)). Laz는 산화 스트레스 및 구리 독성에 대항한 방어에 수반되고 탈체(ex vivo) 초기 인간 외자궁경관 상피 분석(primary human ectocervical epithelial assay)에서 생존률을 증가시킨다(Wu, 등, Infect. Immun. 73:8444-8448 (2005)).

Laz 단백질, 임균 및 다른 나이세리아종으로부터 유래된 아주린 유사 단백질은 교모세포종 세포와 같은 뇌암세포뿐만 아니라, 다른 종양에도 특이적으로 진입하여 종양을 죽일 수 있다고 현재 알려져 있다(실시예 2 및 실시예 7 참조). 나아가, Laz 단백질의 H.8 영역은 N-말단 또는 C-말단 중 어느 하나에 융합되면, 교모세포종 세포에 진입하고 죽이는 능력을 녹농균 아주린에 부여할 수 있다(실시예 2 및 3 참조).

또한, 교모세포종 세포에 진입하는 능력을 단백질에 부여하기 위해서 H.8 영역이 공동 투여된 단백질에 물리적으로 부착되어야만 하는 것은 아니라고 알려져 있다(실시예 5 참조). H.8 및 GST의 N-말단에 융합된 H.8은 모두 아주린만 있는 경우와 비교할 때 교모세포종 세포 안으로 물리적으로 부착되지 않은 아주린의 진입을 증가시켰지만, 반면에 GST의 C-말단에 융합된 H.8은 효과적이지 않다. 나아가, 상기 H.8 및 GST의 N-말단에 융합된 H.8이 아주린과 함께 공동투여되는 경우에 둘다 교모세포종 세포에 대한 아주린의 세포독성을 향상시켰다(실시예 5 참조). 또한, AAEAP(서열번호:25) 반복 단위는 백혈병 세포를 죽일 펩타이드를 설계하는데에 사용될 수 있다.

아주린 및 laz는 p53의 복합체 형성 및 안정화에 의한 세포사멸의 유도, 혈관생성의 억제뿐만 아니라, EphB2/에프린 B2와 같은 수용체 티로신 키나아제에 의해 매개된 세포 신호전달의 억제와 같은 암 진행 경로 중의 다수의 단계를 목표로 함으로써, 저항성 발달의 기회를 최소화한다고 알려져 있다. 미국특허 제7,381,701호를 참조하며, 상기 공개문헌은 본 명세서에 전체가 참조로 포함된다. 아주린 및 Laz는 정상 세포와 비교할 때, 흑색종 또는 유방암 세포에서 특이적인 진입을 한다고 알려져 있다.

놀랍게도, 고형 암세포에 세포독성을 갖는 것 외에, 상기 아주린 및 Laz 단백질은 본 명세서에 제시되는 실시예에 의해 보여지는 백혈병과 같은 액체 함유 암에 대하여도 효과적이다. 실시예는 아주린 및 Laz가 백혈병 세포주에 각각 진입하여 그 안에서 세포독성 효과를 가진다는 것을 보여준다. 나아가, 실시예 9 및 11에서 논의되고 도 8 내지 도 11에 의해 증명되는 것처럼, Laz는 백혈병 세포주에 효과적인데 반하여 매우 제한된 진입을 하는 정상 말초혈액 단핵 세포(PBMCs)에 대하여 약간의 효과를 가진다. 이러한 세균성 단백질은 백혈병 세포에서 특이적인 진입을 하지만, 정상 PBMCs에는 진입하지 않는다(도 10, 패널 1).

아주린 및 Laz 뿐만 아니라, 아스파라기나아제 및 아르기닌 디이미나아제(ADI)는 유방암, 흑색종, 신세포암, 간세포암 등을 포함하는 고형 종양에 대하여 활성을 보이고, 또한, 마이코플라스마 아르기니니(Ma-ADI)로부터 유래된 ADI는 인간 백혈병 세포의 증식을 억제한다고 보고되었다(Yamada T 등, Proc Natl Acad Sci USA 2002;99:14098-103; Punj V 등, Oncogene 23:2367-78 (2004); Ni Y 등, Cancer Lett. 261 :1-11 (2008); Fialho AM, Chakrabarty AM, Anticancer Drug Discov 2:224-34 (2007); Ensor CM 등, Cancer Res 62:5443-50 (2002); Yoon CY 등, Int. J Cancer 120:897-905 (2007); Gong H 등, Leukemia 14:826-9 (2000)). Ma-ADI 중의 촉매 삼합체(catalytic triad)는 Cys 398-His 269-Glu213이다. 반면에, 백혈병 세포에 Ma-ADI의 효과의 하나의 보고 외에, 이전에는 백혈병에 대하여 가능한 치료적 응용으로 ADI와 같은 세균성 단백질의 역할에 대하여 조금만 알려졌었다.

또한, 녹농균은 Cys406-His278-Asp166인 촉매 삼합체 및 Ma-ADI에 상동하는 최초 서열을 갖는 ADI(Pa-ADI)를 생산한다. 이차 구조 매칭(SSM) 프로그램의 사용은 CARD 도메인을 함유하는 카스파아제-9의 pro-도메인에 알아볼 수 있는 구조적 상동성(PDB ID code 3YGS)을 갖는 Pa-ADI 중 N-말단 영역에서(Protein Data Bank, PDB ID code 1RXX) 카스파아제 보강 도메인("CARD")-유사 도메인을 보였다. 도 14d에서 보여주듯이, 구아니딘기 상과(superfamily)의 구성원들 중에서, ADI는 CARD 도메인을 가지는 유일한 것이다. 세균 단백질 중의 CARD 유사 도메인은 상기 논의된 마이코플라스마 아르기니니 ADI 중의 CARD-유사 도메인(PDB ID code 1LXY)을 제외하고는 알려진 것이 없다. 놀랍게도, 본 명세서에 개시된 것처럼, Pa-ADI 중의 CARD 도메인(Pa-CARD)은 강력한 항암 활성을 가진다. 간단히 말하면, 상기 CARD 도메인 폴리펩타이드는 현저한 항암 활성을 보이는 반면에, 정상세포에 대해서는 적은 세포독성을 보인다.

포유류 CARD를 함유하는 단백질은 일반적으로 약 95개의 아미노산 잔기로 구성되고 사멸 도메인(death domain)(DDs) 및 사멸 효과물질 도메인(DEDs)과 유사한 서열을 가진다. CARD의 결정학상의 구조는 소수성 포켓(pocket)을 둘러싸는 약 6개의 단단히 다져진 알파-나선으로 구성된다는 것을 시사한다. 유사하게, Pa-CARD는 "클립 온 팬(clip-on-fan)" 일부분의 형태를 갖는 5개의 다져진(packed) 알파-나선을 형성하는 85개의 아미노산 잔기로 구성된다(도 14b 및 도 14c). 일부 포유류 CARD 도메인이 암의 성장을 촉진하기 때문에, 흥미로운 가능성은 세균성 CARD가 포유류의 CARD 활성에 개입하는 것에 기여함으로써, 추정 CARD-유사 도메인을 함유하는 Pa-ADI의 항암 활성에 기여한다. Pa-CARD는 포유류의 CARD를 함유하는 단백질로부터 뽑아내질 수 있고, Pa-CARD는 암세포에서 과다발현된다고 알려진 포유류의 CARD 단백질과 단백질-단백질 상호작용을 통해 암세포에, 적어도 일부분에서, 세포독성 효과를 가할 수 있다고 생각된다. 나아가, 이러한 상호작용은 암-성장의 조절에서 ADI의 작용에 대한 이유일 수 있다고 생각된다.

Pa-CARD(서열번호:27)는 백혈병 세포 및 난소암 세포에 대하여 놀라운 세포독성 활성을 보여준다. 특히, Pa-CARD 폴리펩타이드는 백혈병 세포 증식을 억제하는 능력을 가진다. 상기 백혈병 세포주 HL60 및 K562에서, Laz 및 Pa-CARD의 항암 활성은 Wee1 단백질 안정화 및 수많은 암 유형에서 종종 디스레귤레이트(dysregulate)되는 세린/트레오닌 키나아제의 활성 형태인 인산화된 AKT-Ser-473의 감소를 수반하는 G2/M기에서 세포 주기 정지를 통해 매개된다(실시예 11 및 12, 및 도 12참조). 구체적으로, Pa-CARD 및 Laz는 K562에서 Wee1 단백질의 상향조절 및 HL60 세포에서 활성 AKT P-Ser473의 하향조절을 통해 백혈병 세포에서 세포 주기를 억제한다(도 12).

Wee1 및 인산화된 AKT-Ser473(AKT-P-Ser473) 모두는 G2/M기에서 세포 주기 정지를 수반하여서 세포 죽음을 초래한다고 알려져 있다. 예를 들어, 유사분열 촉진 키나아제, CDK1으로도 알려진 CDC2의 활성은 Thr-14 및 Tyr-15 잔기에 대한 CDC2의 인산화가 중요한 진핵 세포의 G2기로부터 M기로의 전환을 필요로 한다. 억제적 Tyr-15 인산화는 Wee1 단백질 키나아제에 의해 매개되고, 따라서 이의 향상된 수준은 M기로의 전이의 억제를 매개한다. 바이러스성 단백질은 Laz/pa-CARD-매개된 Wee 단백질 키나아제 수준 증가를 모방하는 것으로 알려져 있다. 인간 유두종 바이러스 유형 1(HPV-1) E4 단백질은 높은 수준의 Wee1에 의해 촉진된 억제적 Tyr-15 인산화를 통한 비활성 시클린 B1-CDK1 복합체의 형성을 통해 세포 주기의 G2기에서 M기로의 전이를 억제한다. 따라서, Wee1의 과다발현은 G2기 세포 주기 정지를 향상시키는 반면에, 적은 간섭 RNA(siRNA)에 의한 Wee1의 감소는 E4-유도된 G2기 장애를 완화한다. 유사하게, 바이러스성 종양 유전자 v-akt의 인간 상동체인 AKT(단백질 키나아제 B)는 포스파티딜 이노시톨 3-키나아제(PI3K) 경로에서 역할을 담당한다. PDK2에 의한 AKT-1 중의 Ser-472 잔기의 인산화는 세포 주기 과정에 중요한 반면에, 인산화된 Akt Ser-473(Akt-P-S473) 수준의 감소는 G2/M기 정지를 향상시키고, 이는 HL60 세포에서 Laz 및 Pa-CARD 모두에 의해 증명되었다.

Pa-CARD는 GM-CSF를 암호화하는 유전자의 전사 촉진을 통해 SKOV-3(난소암) 세포상에서 효과를 가진다. GM-CSF 및 IL-12 모두(이의 유전자는 약 3배 촉진됨)는 종양 부위에서 과립세포, 대식세포 및 수지상세포의 침투를 촉발하여, 종양 항원 제공을 크게 향상시키는 수많은 종양 모델에서 항-종양 면역의 강력한 유도 인자로 알려져 있다. 따라서, 분명히 Pa-CARD-유도된 세포사멸(도 18)이 Pa-CARD의 존재 하에서 임의의 GM-CSF 과다생산의 항-종양 반응에 중요하게 첨가될 수 있는 것 같다. 유전자 프로파일 발현이 많은 시토카인 유전자의 촉진을 보여줌과 동시에, 케모카인 CCL2(C-C 모티프 리간드 2)에 대한 유전자는 단핵구 케모어트랙턴트 단백질-1(MCP-1)에서 현저한(17 배) 억제를 보였다(도 3). CCL2는 종양에서 단핵구 보강 및 유해한 종양-연관 대식세포(TAM)를 증가시킴으로써 유방암의 악성 변환을 촉진한다고 종종 보여졌다. 또한, CCL2는 짐작컨대 MCPIP, 카데린 유전자 cdh12 및 cdh19의 전사를 활성화하는 신규한 전사인자를 통해 혈관형성 및 전이를 촉진하는 것으로 알려져 있다. 따라서, Pa-CARD에 의한 CCL2 수준의 감소는 혈관생성 및 종양 성장 과정에 개입함으로써 종양 퇴축(regression)을 가능하게 할 수 있다.

요약하자면, 본 명세서에의 실시예 및 공개내용은 아주린, Laz 및 Pa-CARD와 같은 세균성 단백질이 백혈병 세포 안으로 진입할 수 있고, CDC2-시클린 B 억제 경로 및 세포의 PI3K/AKT 경로에 의해 매개된 세포 신호전달의 조절에 의해 촉발되는 것으로 보이는 G2/M기에서 세포 주기 정지를 유도한다는 것을 보여준다. 나아가, ADI는 효소에 의한 아르기닌의 감소 및 ADI 활성이 없는 N-말단 추정 CARD-유사 도메인을 통해 몇몇의 방법으로 항암 활성을 가질 수 있다(도 14 내지 16). Pa-CARD 단백질은 주로 암세포에 대하여 억제적 역할을 보이고 정상세포에 대하여는 억제적 역할을 보이지 않는다(도 18). 나아가, 항암 활성은 카스파아제 활성(도 19)를 통해 매개될 수 있으며, 난소암 세포에서 세포사멸을 유도할 수 있다.

본 발명의 조성물

본 발명은 세포독성 펩타이드 및/또는 이러한 펩타이드의 변이체, 유도체, 절단 또는 구조적 동등체 자체 또는 하나 이상의 다른 세포독성 물질과의 결합을 제공한다.

일부 실시예에서, 상기 세포독성 펩타이드는 큐프레독신 또는 이의 절단이다. 일부 이러한 실시예에서, 상기 세포독성 펩타이드는 아주린 또는 이의 절단이다. 다른 이러한 실시예에서, 상기 세포독성 펩타이드는 Laz 또는 이의 절단이다. 다른 실시예에서, 상기 세포독성 펩타이드는 Laz의 H.8 영역이다. 일부 실시예에서, 상기 세포독성 펩타이드는 서열번호:22 내지 24로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 서열을 포함한다.

다른 실시예에서, 상기 세포독성 펩타이드는 CARD 도메인을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 세포독성 펩타이드는 CARD-함유 단백질이다. 일부 실시예에서, 상기 CARD-함유 단백질은 세균으로부터 유래된다. 또 다른 실시예에서, 상기 세균은 녹농균이다. 일 실시예에서, 상기 세포독성 펩타이드는 Pa-CARD이다. 또 다른 이러한 실시예에서, 상기 세포독성 펩타이드는 서열번호:27을 포함한다.

일부 실시예에서, 상기 세포독성 펩타이드는 당해 분야에 잘 알려진 기술을 이용하여 더 나은 세포독성 효과를 부여하는 또 다른 펩타이드와 융합된다. 이러한 일 실시예에서, 다른 펩타이드는 Laz의 H.8 영역이다. 또 다른 펩타이드에서, 상기 다른 펩타이드는 서열번호:24를 포함하는 서열을 가진다. 일 실시예에서, 상기 세포독성 펩타이드는 융합 단백질 Azu-H.8이다. 또 다른 실시예에서, 상기 세포독성 펩타이드는 융합 단백질 H.8-Azu이다(도 1).

본 명세서에서 셜명되는 세포독성 펩타이드와 함께 투여될 수 있는 하나 이상의 다른 세포독성 물질은 암 치료 약물일 수 있으며, 이러한 암 치료 약물은 시스플라틴, Gleevec®, 레티노산, 5'-aza-2'-디옥시시티딘("DAC"), 및/또는 삼산화 비소와 병용하는 레티노산을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

Gleevec®, 레티노산, DAC, 및/또는 삼산화 비소와 병용하는 레티노산을 제외한 암 치료 약물은 p53과 같은 세포 주기 대조군 단백질; p16, p21 또는 p27과 같은 시클린-의존성 키나아제 억제제; 티미딘 키나아제 또는 니트로환원효소와 같은 자살 단백질; 인터류킨1, 인터류킨2 또는 과립대식세포집락작극인자(GM-CSF)와 같은 시토킨 또는 다른 면역조절 단백질; 녹농균 외독소 A와 같은 독소; 5-플루오로우라실; 인터페론 α; 메토트렉사트; 타목시펜; 랄록시펜; 빈크린스틴; 질소머스타드, 알킬 설폰산, 니트로소유리아, 에틸렌이민 및 트리아젠과 같은 알킬화제; 엽산 길항제, 퓨린 유사체 및 피리미딘 유사체와 같은 항대사물질; 안트라시클린, 블레오마이신, 미토마이신, 닥티노마이신 및 플리카마이신과 같은 항생제; L-아스파라기나아제와 같은 효소; 파르네실 단백질 전이 효소 억제제; 5 알파 환원효소 억제제; 17 베타 히드록시스테로이드 탄수소효소형 3의 억제제; 글루코코르티코이드, 에스트로겐/항에스트로겐, 안드로겐/항안드로겐. 프로게스틴와 같은 호르몬제, 황체 형성 호르몬 방출 호르몬 길항제, 옥트레오티드 아세테이트; 엑티나시딘(ecteinascidin) 또는 이의 유사체 및 유도체와 같은 미소관 교란물질; 탁산, 예를 들어 파클리탁셀(Taxol^TM), 도세탁셀(Taxotere^TM) 및 이의 유사체, 그리고 에포틸론 A-F 및 이의 유사체와 같은 에포틸론와 같은 미소관 안정화제; 빈카 알칼로이드, 에피포도필로톡신(epipodophyllotoxin), 탁산과 같은 식물-유래 산물; 및 토포이소머라아제(topoiosomerase) 억제제; 프레닐-단백질 전이 효소 억제제; 및 히드록시요소, 프로카바진, 미토탄, 헥사메틸멜라민, 백금 배위 착물(예, 시스플라틴 및 카보플라틴)과 같은 다양한 물질; 및 생체반응조절물질, 성장인자와 같은 항암 및 세포독성 물질; 면역 조절자 및 단일클론항체; 메클로레타민 히드로클로라이드, 시클로포스파미드, 클로람부실(chlorambucil), 멜파란, 이포스파마이드(ifosfamide), 부설팬(busulfan), 카무스틴(carmustin), 세무스틴, 스트렙토조신(streptozocin), 티오테파(thiotepa), 다카바진, 메토트렉세이트(methotrexate), 티오구아닌, 메르캅토퓨린, 플루다라빈, 펜타스타틴, 클라드리빈, 시타라빈, 플루오로우라실, 독소루비신 히드로클로라이드, 다우노루비신, 이다루비신, 블레오마이신 설페이트,미토마이신 C, 액티노마이신 D, 사프라신, 사프라마이신, 퀴노카르신, 디스코데르몰리드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 비노렐빈 타르트레이트, 에토포시드, 에토포시드 포스페이트, 테니포시드, 파크리탁셀, 에스트라무스틴, 에스트라무스틴 포스페이트 소듐, 플루타미드, 부세렐린, 루프롤라이드, 프테리딘, 디인(diyneses), 레바미솔, 아플라콘, 인터페론, 인터류킨, 알데스류킨, 필그라스팀, 사그라모스팀(sargramostim), 리툭시맵(rituximab), BCG, 트레티노인, 이리노테칸 히드로클로라이드, 베타메토손, 젬시타빈 히드로클로라이드, 알크레타민 및 토포테카 및 이의 임의의 유사체 또는 유도체를 포함한다.

또한, 다른 세포독성 물질의 예는 독일특허 제4138042.8호; WO 97/19086, WO 98/22461, WO 98/25929, WO 98/38192, WO 99/01124, WO 99/02224, WO 99/02514, WO 99/03848, WO 99/07692, WO 99/27890, WO 99/28324, WO 99/43653, WO 99/54330, WO 99/54318, WO 99/54319, WO 99/65913, WO 99/67252, WO 99/67253 및 WO 00/00485에서 발견되는 에포틸론 유도체; WO 99/24416 (미국특허 제6,040,321호 참조)에서 발견되는 시클린 의존성 키나아제 억제제; 및 WO 97/30992와 WO 98/54966에서 발견되는 프레닐-단백질 전이효소 억제제; 및 미국특허 제6,011,029호에서 일반적으로 및 구체적으로 설명되는 것들과 같은 물질을 포함하며, 이러한 화합물들은 AR 조절자, ER 조절자와 같은 임의의 NHR 조절자와 함께 사용될 수 있으며, 특히 암의 치료에서 LHRH 조절자와 함께 사용될 수 있다.

본 발명은 큐프레독신의 변이체, 유도체, 절단 또는 구조적 동등체 및/또는 CARD-함유 단백질인 세포독성 펩타이드를 더 제공한다. 일부 실시예에서, 세포독성 펩타이드는 단리된다. 일부 실시예에서, 세포독성 펩타이드는 실질적으로 순수하거나 약학적 등급이다. 다른 실시예에서, 세포독성 펩타이드는 세포독성 펩타이드를 포함하거나 이를 필수적 구성성분으로 구성되는 조성물 안에 포함된다. 다른 실시예에서, 세포독성 펩타이드는 세포독성 펩타이드와 적어도 하나의 다른 세포독성 물질을 모두 포함하는 조성물 안에 포함된다. 또 다른 구체적인 실시예에서, 세포독성 펩타이드는 비-항원성이고 포유류, 더 구체적으로 인간에서 면역 반응을 일으키지 않는다. 일부 실시예에서, 세포독성 펩타이드는 전체-길이(full-length) 큐프레독신 또는 CARD-함유 단백질보다 적고, 전체 길이 단백질의 약학적 활성의 일부를 함유한다. 특히, 일부 실시예에서, 세포독성 펩타이드는 암세포, 구체적으로 백혈병 세포를 죽이는 능력을 함유할 수 있다.

큐프레독신들 간의 높은 구조적 상동성 때문에, 다른 큐프레독신이 아주린 및 Laz, 특히 백혈병과 관련하여 동일한 세포독성 성질을 가질 것이다. 일부 실시예에서, 큐프레독신은 아주린, 슈도아주린, 플라스토시아닌, 루스티시아닌, 오라시아닌, 스텔라시아닌, 오이 기본 단백질 또는 Laz이지만, 이에 제한되지 않는다. 특히, 구체적인 실시예에서, 아주린 또는 Laz는 녹농균, 알칼리게네스페칼리스(Alcaligenes faecalis), 아크로모박터 자일로속시댄스 ssp.데니트리피칸스 I(Achromobacter xylosoxidans ssp . denitrificans I), 보르텔라 브론키셉티가(Bordetella bronchiseptica), 메틸로모나스 sp.(Methylomonas sp .), 수막염균, 임균, 슈도모나스 형광균(Pseudomonas fluorescens), 슈도모나스 클로라피스(Pseudomonas chlororaphis), 자일렐라 파스티디오사(Xylella fastidiosa), 울바 페르투시스(Ulva pertussis) 또는 장염비브리오균(Vibrio parahaemolyticus)으로부터 유래된다. 구체적인 실시예에서, 아주린은 녹농균으로부터 유래된다.

본 발명은 야생형 큐프레독신 또는 CARD-함유 단백질과 비교할 때 대체된, 결손된 또는 삽입된 아미노산을 갖는 큐프레독신 또는 CARD-함유 단백질의 아미노산 서열 변이체인 세포독성 펩타이드를 제공한다. 본 발명의 변이체는 야생형 단백질의 절단일 수 있다. 일부 실시예에서, 본 발명의 세포독성 펩타이드는 전체 길이의 야생형 폴리펩타이드보다 적은 큐프레독신 또는 CARD-함유 단백질의 영역을 포함한다.

또한, 본 발명의 세포독성 펩타이드는 자연적으로 발생하지 않는 합성 아미노산으로 구성되는 펩타이드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 비-천연적으로 발생하는 아미노산은 혈류에서 조성물의 반감기를 연장하거나 최적화하기 위하여 질병예방 물질 안에 포함시킬 수 있다. 이러한 질병예방 물질은 D,L-펩타이드 (부분입체이성질체), (예를 들어, Futaki 등, J. Biol. Chem. 276(8):5836-40 (2001); Papo 등, Cancer Res. 64(16):5779-86 (2004); Miller 등, Biochem. Pharmacol. 36(1): 169-76, (1987); 특이한 아미노산을 함유하는 펩타이드(예를 들어 Lee 등, J. Pept. Res. 63(2):69-84 (2004)), 올레핀-함유 비-천연 아미노산에 이어 탄화수소 스테이플링(stapling)(예를 들어, Schafmeister 등, J. Am. Chem. Soc. 122:5891-5892 (2000); Walenski 등, Science 305:1466-1470 (2004)), 및 ε-(3,5-dinitrobenzoyl)-Lys 잔기를 포함하는 펩타이드를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

다른 실시예에서, 본 발명의 세포독성 펩타이드는 큐프레독신 또는 CARD-함유 단백질의 유도체이다. 큐프레독신 또는 CARD-함유 단백질의 유도체는 펩타이드의 화학적 변형이어서, 펩타이드는 이의 기능적 활성의 일부를 여전히 함유한다. 예를 들어, 아주린, Laz 또는 Pa-CARD의 "유도체"는 암세포, 구체적으로 백혈병 및/또는 난소 암세포를 죽이는 능력을 보유하는 화학적으로 변형된 단백질일 수 있다. 또 다른 유도체는 혈류에서 반감기를 증가시키거나 최적화시키는 것일 수 있다. 화학적 변형은 미국특허 출원번호 12/389,120에서 개시된 것을 포함하지만 이에 제한되지 않으며, 상기 공개문헌은 본 명세서에 전체가 참조로 포함된다.

일부 실시예에서, 세포독성 펩타이드는 펩타이드의 가수분해를 감소시키는 방법, 펩타이드의 탈아미드화를 감소시키는 방법, 산화를 감소시키는 방법, 펩타이드의 면역원성을 감소시키고/감소시키거나 구조적 안정성을 증가시키는 방법을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 방법을 사용하여 변형될 수 있다. 본 명세서에서 참조로써 설명되거나 포함된 두 개 이상의 변형체는 하나의 변형된 큐프레독신 유래 펩타이드에 결합 될 뿐만 아니라 당해 분야의 통상의 기술자에게 잘 알려진 약물 동력학 성질을 개선하기 위해 다른 변형을 갖는 본 명세서에서 설명된 하나 이상의 변형체와 결합될 수 있다. 이러한 변이체 및 유도체를 설계하기 위한 수많은 방법은 당해 분야에 잘 알려져 있다.

사용방법

본 발명은 포유류, 특히 인간의 암세포, 특히 백혈병 및/또는 난소암 세포를 죽이는 방법을 제공한다. 방법은 암세포, 또는 변이체, 유도체, 절단, 또는 이의 구조적 동등체에 대하여 세포독성 효과를 갖는 단리된 펩타이드와 암세포를 접촉시키는 단계를 포함한다. 단리된 펩타이드는, 본 명세서에서 설명되는 큐프레독신 또는 CARD-함유 단백질일 수 있다. 일 실시예에서, 단리된 펩타이드는 아주린이다. 또 다른 실시예에서, 단리된 펩타이드는 Laz이다. 또 다른 실시예에서, 단리된 펩타이드는 Pa-CARD이다. 추가적인 실시예에서, 단리된 펩타이드는 Laz의 H.8영역을 포함하는 융합 단백질이다. 이러한 또 다른 실시예에서, 융합단백질은 H.8-Azu이다. 또 다른 이러한 실시예에서, 융합 단백질은 Azu-H.8이다. 세포독성 펩타이드는 암세포에 단독으로 투여되거나 본 명세서에서 설명된 또 다른 세포독성 물질과 함께 투여될 수 있거나, Laz의 H.8영역이 함께 투여될 수 있다. 일부 실시예에서, 세포독성 펩타이드는 Laz의 H.8영역과 동시에 또는 거의 동시에 투여된다. 다른 실시예에서, 세포독성 펩타이드는 서열번호:24를 포함하는 서열과 동시에 또는 거의 동시에 투여된다.

또한, 본 발명은 암세포 또는 변이체, 유도체, 절단, 또는 이의 구조적 동등체에 대하여 세포독성 효과를 갖는 단리된 펩타이드를 환자에게 투여함으로써, 암을 앓는 포유류 환자를 치료하는 방법 또는 그렇지 않으면 포유류 환자의 암세포를 죽이는 방법을 제공한다. 단리된 펩타이드는 본 명세서에서 설명된 큐프레독신 또는 CARD-함유 단백질일 수 있다. 일 실시예에서, 단리된 펩타이드는 아주린이다. 또 다른 실시예에서, 단리된 펩타이드는 Laz이다. 또 다른 실시예에서, 단리된 펩타이드는 Pa-CARD이다. 추가적인 실시예에서, 단리된 펩타이드는 Laz의 H.8영역을 포함하는 융합 단백질이다. 이러한 일 실시예에서, 융합단백질은 H.8-Azu이다. 또 다른 이러한 실시예에서, 융합 단백질은 Azu-H.8이다. 세포독성 펩타이드는 암세포에 단독으로 투여되거나 본 명세서에서 설명된 또 다른 세포독성 물질과 함께 투여될 수 있거나, Laz의 H.8영역이 함께 투여될 수 있다. 일부 실시예에서, 세포독성 펩타이드는 Laz의 H.8영역과 동시에 또는 거의 동시에 투여된다. 다른 실시예에서, 세포독성 펩타이드는 서열번호:24를 포함하는 서열과 동시에 또는 거의 동시에 투여된다.

또한, 본 발명은 하나 이상의 세포독성 펩타이드를 백혈병 및/또는 난소암 세포에 투여함으로써, 세포 분화를 통해 백혈병 및/또는 난소암 세포의 죽음을 유도하는 방법을 제공한다. 세포독성 펩타이드는 본 명세서에서 설명된 큐프레독신 또는 CARD-함유 단백질일 수 있다. 일 실시예에서, 세포독성 펩타이드는 아주린이다. 또 다른 실시예에서, 세포독성 펩타이드는 Laz이다. 또 다른 실시예에서, 세포독성 펩타이드는 융합 단백질 H.8-Azu이다. 또 다른 이러한 실시예에서, 세포독성 펩타이드는 융합 단백질 Azu-H.8이다.

또한, 본 발명은 하나 이상의 세포독성 펩타이드를 백혈병 및/또는 난소암 세포에 투여함으로써, 백혈병 및/또는 난소암세포에 선택적으로 진입하여 그 안에서 세포독성 효과를 갖는 방법을 제공한다. 세포독성 펩타이드는 본 명세서에서 설명된 큐프레독신 또는 CARD-함유 단백질일 수 있다. 일 실시예에서, 세포독성 펩타이드는 아주린이다. 또 다른 실시예에서, 세포독성 펩타이드는 Laz이다. 또 다른 실시예에서, 세포독성 펩타이드는 Pa-CARD이다. 추가적인 실시예에서, 세포독성 펩타이드는 Laz의 H.8영역을 포함하는 융합 단백질이다. 이러한 일 실시예에서, 융합 단백질은 H.8-Azu이다. 또 다른 이러한 실시예에서, 융합 단백질은 Azu-H.8이다.

본 발명은 G2/M기에서 세포 주기 정지를 유발함으로써 백혈병 및/또는 난소암 세포을 죽이는 방법을 더 포함하며, 상기 방법은 하나 이상의 세포독성 펩타이드를 투여하는 단계를 포함한다. 추가적인 실시예에서, 세포독성 펩타이드는 세포에서 Wee1 단백질을 안정화하고/안정화하거나 Wee1 단백질의 수준을 증가시키며, 상기 세포는 세포질에서 및/또는 세포의 핵을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 또 다른 실시예에서,세포독성 펩타이드는 인산화된 AKT-Ser-473를 격감시킨다. 또 다른 실시예에서, 세포독성 펩타이드는 Wee1 단백질의 수준을 안정화/증가시킬 뿐만 아니라 인산화된 ATK-Ser-473을 격감시킨다. 추가적인 실시예에서, 세포독성 펩타이드는 아주린이다. 또 다른 실시예에서, 세포독성 펩타이드는 Laz이다. 또다른 실시예에서, 세포독성 펩타이드는 Pa-CARD이다. 또 다른 실시예에서, 세포독성 펩타이드는 하나 이상의 융합 단백질 H.8-Azu 및 Azu-H.8이다.

세포독성 펩타이드 및 발현 벡터를 암호화하는 핵산

또 다른 양태에서, 본 발명은 본 명세서에서 설명된 세포독성 펩타이드 및 변이체, 유도체, 및/또는 이의 구조적 동등체를 암호화하는 핵산 분자를 제공한다. 본 발명에 따른 핵산 분자는 당해 분야에 알려진 기술을 조합하여 제조될 수 있다. 이러한 핵산에서 사용된 암호화 서열은 특정 펩타이드를 암호화하는 자가 게놈 DNA에서 발견되는 것일 수 있거나, 알려진 코돈으로부터 설계될 수 있다. 또한, 이러한 암호화 서열은 교대의 코돈 선호도 및 펩타이드가 발현될 수 있는 유기체의 선호되는 코돈 선호도를 고려하여 설계될 수 있다. 세포독성 펩타이드에 대한 핵산 서열은 화학적 합성 또는 복제에 의해 개별적으로 제조될 수 있다. 이후에, 핵산 서열은 관심있는 핵산 분자를 제공하기 위하여 리가아제로 함께 연결될 수 있다.

유기체에서 유기체로 유전 물질을 실어 나르기 위해 사용되는 벡터는 두 개의 일반적인 부류로 나뉠 수 있다: 복제 벡터는 외래 DNA가 삽입될 수 있는 적절한 숙주 세포에서의 증식에 필수적인 영역을 갖는 플라스미드 또는 파지(phage)를 복제한다; 외래 DNA가 마치 벡터의 구성 성분인 것처럼 복제되고 증식된다. 발현 벡터(예, 플라스미드, 효모 또는 동물 바이러스 게놈)는 외래 DNA를 전사하고 번역하기 위하여 숙주 세포 또는 조직 안으로 외래 유전자 물질을 주입하는데에 사용되며, 상기 외래 DNA는 Laz, 아주린, Pa-CARD, H.8-Azu 또는 Azu-H.8과 같은 세포독성 펩타이드의 DNA이다. 발현 벡터에서, 도입된 DNA는 삽입된 DNA를 고도로 전사하도록 숙주 세포에 신호를 보내는 프로모터와 같은 물질에 실시가능하게 연결된다. 일부 프로모터는 특별히 유용하며, 예를 들어 유도성 프로모터는 특정 인자에 반응하여 유전자 전사를 제어한다. 세포독성 펩타이드 및 이의 변이체와 유도체를 유도성 프로모터에 실시가능하게 연결하는 것은 특정 인자에 반응하여 세포독성 펩타이드 및 이의 변이체와 유도체의 발현을 제어할 수 있다. 전형적인 유도성 프로모터의 예는 알파-인터페론, 열충격, 중금속이온 및 글루코코르티코이드(Kaufman, Methods Enzymol. 185:487-511(1990))와 테트라시클린과 같은 스테로이드에 영향을 받는 것을 포함한다. 다른 소정의 유도성 프로모터는 구조물이 도입되는 세포에 내생하지 않지만, 유도 물질이 외부에서 공급되면 이러한 세포에서 반응하는 것을 포함한다. 일반적으로, 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드이다. 반면에, 바이러스성 벡터(예, 복제결함 리트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-연관 바이러스)와 같은 발현 벡터의 다른 형태가 예상된다.

벡터 선택은 사용되는 유기체 또는 세포 그리고 원하는 벡터의 운명에 의해 좌우된다. 일반적으로, 벡터는 신호 서열, 복제 원점, 표지 유전자, 폴리링커 부위, 증폭자 요소, 프로모터 및 전사 종결 서열을 포함한다.

세포독성 펩타이드를 포함하는 약학 조성물

또한, 본 발명은 큐프레독신 또는 CARD-함유 단백질, 또는 변이체, 유도체, 절단, 또는 큐프레독신 또는 CARD-함유 단백질의 구조적 동등체인 세포독성 펩타이드 중 적어도 하나를 포함하는 조성물을 제공하며, 특히, 단독으로 또는 다른 세포독성 물질 중 적어도 하나를 함께 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 구체적인 실시예에서, 약학 조성물은 특정 투여 방식을 위해 설계되며, 상기 투여 방식은 예를 들어, 경구, 복강 내 또는 정맥 내 투여가 있지만 이에 제한되지 않는다. 이러한 조성물은 물에 수화될 수 있거나, 차후의 수화를 위해(예, 동결 건조에 의해) 건조될 수 있다. 이러한 조성물은 물 외에 알콜과 같은(이에 제한되지 않음) 용매 형태일 수 있다.

세포독성 펩타이드를 함유하는 본 발명의 약학 조성물은 임의의 종래의 방식, 예를 들어, 종래의 혼합, 용해, 과립화, 드라제-제조(dragee-making), 에멀젼화, 캡슐화, 포괄화(entrapping) 또는 동결건조 과정으로 제조될 수 있다. 세포독성 펩타이드는 당해 분야에 잘 알려진 약학적으로 허용되는 담체와 손쉽게 혼합될 수 있다. 이러한 담체는 제제를 정제, 환약, 드라제, 캡슐, 액체, 겔, 시럽, 슬러리(slurry), 현탁액 등으로 제형화할 수 있도록 한다. 또한, 적합한 부형제는 예를 들어, 필러 및 셀룰로오스 제제를 포함할 수 있다. 다른 부형제는 예를 들어, 방향제, 착색제, 비점착제, 증점제, 및 다른 허용가능한 첨가제, 보조제 또는 바인더를 포함할 수 있다.

다양한 실시예에서, 조성물은 담체 및 부형제(완충제, 탄수화물, 만니톨, 단백질, 폴리펩타이드 또는 글리신과 같은 아미노산, 항산화제, 세균 발육 저지제, 킬레이트화제, 서스펜션화제, 증점제 및/또는 방부제), 물, 오일, 식명수, 수성 덱스트로오스 및 생리학적 조건과 비슷하게 하기 위해 필요한 글리세롤 용액, 완충제, 등장화제, 습윤제 등과 같은 다른 약학적으로 허용되는 보조제를 포함한다. 당해 분야의 통상의 기술자에게 알려진 임의의 적합한 담체는 본 발명의 조성물을 투여하기 위해 활용될 수 있는 반면에, 담체의 유형은 투여의 방식에 따라 각기 다를 것이라고 인식될 것이다. 또한, 화합물은 잘 알려진 기술을 사용하여 리포솜 내에 캡슐화될 수 있다. 또한, 생분해성 마이크로스피어는 본 발명의 조성물에 대한 담체로서 활용될 수 있다. 예를 들어, 적합한 생분해성 마이크로스피어는 미국특허 제4,897,268호, 제5,075,109호, 제5,928,647호, 제5,811,128호, 제5,820,883호, 제5,853,763호, 제5,814,344호 및 제5,942,252호에서 보여진다. 본 명세서에서 사용되는 "화합물"은 본 발명의 펩타이드, 아미노산 서열, 카르고 화합물과 복합체 및 핵산을 포함한다.

본 명세서에 개시된 세포독성 펩타이드 및 핵산을 투여하기 위하여 약학 조성물을 제조하는데에 사용하기 위한 정맥 내 유체(intravenous fluid)는 결정질 또는 콜로이드로 구성될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 결정질은 무기 염(mineral salt) 또는 다른 수용성 분자의 수용액이다. 본 명세서에서 사용되는 콜로이드는 젤라틴과 같은 거대 불수용성 분자를 함유한다. 정맥 내 유체는 멸균될 수 있다.

정맥 내 투여를 위해 사용될 수 있는 결정질 유체는 표 1에서 설명되는 것처럼, 보통의 식염수(0.9 % 농도의 염화나트륨 용액), 링거 젖산 또는 링거액 및 D5W라고 가끔 불리는 물 중의 5 % 덱스트로오스의 용액을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

공통의 결정질 용액의 조성비
용액	다른 이름	[ Na + ]	[ Cl - ]	[포도당]
D5W	5% 덱스트로오스	0	0	252
2/3 & 1/3	3.3% 덱스트로오스/0.3% 식염수	51	51	168
반-보통의 식염수	0.45% NaCl	77	77	0
보통의 식염수	0.9% NaCl	154	154	0
링거 젖산*	링거액	130	109	0

* 링거 젖산은 28 mmol/L 젖산, 4 mmol/L K⁺ 및 3 mmol/L Ca^{2 +}를 또 갖는다.

본 발명의 조성물의 혈류에서의 반감기는 당해 분야의 통상의 기술자에게 잘 알려진 몇몇의 방법에 의해 연장되거나 최적화될 수 있으며, 이러한 조성물은 고리화된 펩타이드(Monk 등, BioDrugs 19(4):261-78, (2005); DeFreest 등, J. Pept. Res. 63(5):409-19 (2004)), D,L-peptides (diastereomer), (Futaki 등, J. Biol. Chem. Feb 23;276(8):5836-40 (2001); Papo 등, Cancer Res. 64(16):5779-86 (2004); Miller 등, Biochem. Pharmacol. 36(l):169-76, (1987)); 특이한 아미노산을 함유하는 펩타이드(Lee 등, J. Pept. Res. 63(2):69-84 (2004)), 및 N- 및 C-말단 변형을 포함하지만 이에 제한되지 않는다(Labrie 등, Clin. Invest. Med. 13(5):275-8, (1990)). 특히 관심있는 것은 D-치환 또는 L-아미노산 치환을 통한 D-이성질화(치환) 및 펩타이드 안정성의 변형이다.

투여가 주사에 의하는 경우에, 조성물은 수용액으로 제형화 될 수 있으며, 바람직하게는 행크스 용액(hanks solution), 링거액과 같은 생리학적으로 양립될 수 있는 완충제 또는 생리 식염 완충액으로 제형화 될 수 있다. 용액은 서스펜션화제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제형화제(formulatory agent)를 함유할 수 있다. 대안적으로, 조성물은 사용하기 전에 적합한 담체, 예를 들어 멸균 주사용 증류수를 구성하기 위한 분말 형태일 수 있다.

투여가 흡입에 의하는 경우에, 조성물은 적합한 추진제의 사용과 함께 가압된 팩(pack) 또는 분무기 연무로부터의 에어로졸 스프레이의 형태로 전달될 수 있으며, 상기 적합한 추진제의 예로는 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 가스가 있다. 가압된 에어로졸의 경우에, 투여량 단위는 계량된 양을 전달하기 위하여 밸브를 제공함으로써 결정될 수 있다. 흡입기 또는 취입기에서 사용하기 위한 예를 들어, 젤라틴의 캡슐 및 카트리지는 단백질 및 적합한 분말 베이스(base)(예, 락토오스 또는 전분)의 분말 믹스를 함유하여 제형화될 수 있다.

투여가 국부 투여에 의하는 경우에, 조성물은 용액, 겔, 연고, 크림, 현탁액 등으로 제형화 될 수 있으며, 이는 당해 분야에서 잘 알려져 있다. 일부 실시예에서, 투여는 경피 패치의 방식에 의한다. 투여가 좌약에 의하는 경우에(예, 직장 또는 질), 조성물은 종래의 좌약 베이스를 함유하는 조성물로 제형화 될 수도 있다. 투여가 경구적인 경우에, 조성물은 당해 분야에서 잘 알려진 약학적으로 허용가능한 담체와 결합하여 손쉽게 제형화 될 수 있다. 만니톨, 락토오스, 마그네슘 스테아레이트 등과 같은 고형 담체는 활용될 수 있으며; 치료를 받는 피험자에 의해 경구 섭취를 위하여 이러한 담체는 케모탁신이 정제, 환약, 드라제, 캡슐, 액체, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁액 등으로 제형화 될 수 있도록 한다. 예를 들어, 분말, 캡슐 및 정제와 같은 경구 고형 제형을 위하여, 적합한 부형제는 당, 셀룰로오스 제제, 과립화제와 같은 필러 및 결합제를 포함한다.

또한, 당해 분야에서 잘 알려진 다른 편리한 담체는 세균성 협막다당, 덱스트란 또는 유전자 변형된 벡터와 같은 다가(multivalent) 담체를 포함한다. 게다가, 조성물을 포함하는 서방형 제형은 오랜 기간 동안 조성물의 방출을 가능하게 하고, 만일 서방형 제형이 아니면, 조성물은 치료적 효과를 유도하거나 향상시키기 이전에 피험자의 시스템으로부터 제거되며, 및/또는 단백질 가수분해 효소 및 단순한 가수분해에 의해 분해된다.

세포독성 펩타이드를 포함하는 키트

또 다른 양태에서, 본 발명은 상자(package) 또는 컨테이너(container) 안에 다음 중 하나 이상을 함유하는 키트를 제공한다: (1) 본 명세서에서 설명된 하나 이상의 세포독성 펩타이드를 포함하는 시약; (2) 약학적으로 허용가능한 보조제 또는 부형제를 함유하는 시약; (3) 주사기와 같은 투여를 위한 담체; (4) 투여를 위한 설명서. 두 개 이상의 구성성분 (1)-(4)가 동일한 컨테이너에서 발견되는 실시예가 또한 예상된다. 다른 실시예에서, 키트의 구성 성분은 하나 이상의 추가의 세포독성 물질을 포함할 수도 있다. 또 다른 실시예에서, 시약은 정맥 내 투여를 위해 제형화 되고/제형화 되거나 투여의 담체는 정맥 내 투여에 적절하다.

키트가 공급되는 경우에, 조성물의 다른 구성성분은 분리된 컨테이너에 포장되고 사용 직전에 혼합된다. 구성성분의 이러한 포장은 활성 성분의 기능을 잃지 않고 오랜 기간 동안 별도로 저장을 가능하게 할 수 있다.

키트에 포함된 시약은 상이한 구성성분의 수명이 보존되고 컨테이너의 물질에 의해 흡수되거나 변화되지 않도록 임의의 종류의 컨테이너에 공급될 수 있다. 예를 들어, 밀봉된 유리 앰플은 동결 건조된 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오티드, 또는 질소와 같은 중성 비활성 기체 하에서 포장되었던 완충액을 함유할 수 있다. 앰플은 유리, 폴리카보네이트, 폴리스티렌 등과 같은 유기 폴리머, 세라믹, 금속 또는 유사한 시약을 보유하기 위해 일반적으로 이용되는 임의의 다른 물질과 같은 임의의 적합한 물질로 구성될 수 있다. 적합한 컨테이너의 다른 예는 앰플과 유사한 물질, 및 알루미늄 또는 합금과 같은 호일이 깔린 내부를 포함할 수 있는 봉투(envelopes)로 만들어질 수 있는 단순한 병을 포함한다. 다른 컨테이너는 시험관, 유리병, 플라스크, 병, 주사기 등을 포함한다. 컨테이너는 피하 주사 바늘에 의해 뚫릴 수 있는 스토퍼(stopper)를 갖는 병과 같은 멸균 접근 포트를 가질 수 있다. 다른 컨테이너는 제거시에 구성성분이 혼합될 수 있도록 하는 손쉽게 제거가능한 막에 의해 분리되는 두 개의 칸을 가질 수 있다. 제거가능한 막은 유리, 플라스틱, 고무 등일 수 있다.

또한, 키트는 교육용 자료와 함께 공급될 수 있다. 설명서는 종이 또는 다른 기판상에 인쇄될 수 있고/있거나 플로피 디스크, CD-ROM, DVD-ROM, Zip 디스크, 비디오테이프, 오디오테이프, 플래시 메모리 장치 등과 같은 전자 장비로 읽을 수 있는 매체로서 제공될 수 있다. 구체적인 설명서는 키트와 물리적으로 관련되지 않을 수 있으며; 대신에, 사용자는 키트의 제조자 또는 배급자에 의해 명시되는 인터넷 웹 사이트로 보내질 수 있거나, 또는 전자 메일로 공급된다.

본 발명의 더 완벽한 이해는 이어지는 구체적인 실시예를 참조하여 얻어질 수 있다. 실시예는 예시의 목적으로만 설명되고, 본 발명의 범위를 제한하기 위한 의도가 아니다. 형태의 변화 및 등가물의 치환은 방편을 제안하거나 제시할 수 있는 상황으로 고려된다. 구체적인 용어가 본 명세서에서 이용됐음에도 불구하고, 이러한 용어는 기술적인 의미로 생각되고 제한하기 위한 목적은 아니다. 상기 기술된 본 발명의 변형 및 변이는 본 발명의 사상 및 범위로부터 벗어나지 않고 이루어질 수 있고, 그러므로 첨부된 실시예로 보여지듯이 이러한 제한만 받아들여져야 할 것이다.

실시예

Laz 및 H.8- 아주린 융합 유전자의 복제 및 발현

임균으로부터 유래된 laz 유전자를 이의 알려진 서열(서열번호:1)에 기초하여 복제했다(도 1a). paz의 5'-말단 중의 H.8 에피토프 유전자가 H.8-paz(도 1c)를 생산하도록 또는 paz의 3'-말단 중의 H.8 에피토프 유전자가 paz-H.8(도 1d)를 생성하도록 프레임(frame)을 복제하기 위하여 paz로 일컬어지는(도 1b) 녹농균 아주린 유전자(서열번호:2) 및 임균으로부터 유래된 laz 중 H.8 에피토프의 서열을 사용했으며, 이는 하기에서 설명된다.

세포주 및 시약. 인간 암세포, 균주 및 플라스미드는 표 2에 나열된다. 인간 유방암 MCF-7 세포 및 뇌 종양 LN-229 세포는 시카고에 있는 일리노이 주립 대학교(UIC)의 외과종양학부의 보존 배양 무리로부터 유래된다. 2 mM L-글루타민, 0.1 mM MEM 필수 아미노산을 함유하는 이글스 염(Eagle's salt)과 함께 MEM에서 세포를 배양했고, 10 %의 열-비활성 소태아혈청, 100 단위/ml 페니실린 및 100 μg/ml의 스트렙토마이신을 세포에 공급했다. 37 ℃, 5 % CO₂에서 세포를 성장시켰다(Yamada, 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:14098-14103 (2002); Punj, 등, Oncogene 23:2367-2378 (2004)).

암세포, 균주 및 유전자 구조체
세포/균주/플라스미드	관련 특징	참조문헌
LN-229	인간 뇌 교아종	Ishii, 등, Brain Pathol. 9:469-479 (1999)
MCF-7	인간 유방 선암	Soule, 등, J. Natl. Cancer. Inst. 51:1409-1416 (1973); Punj, 등, Oncogene 23:2367-2378 (2004)
녹농균 PAO1	기본 유기 영양, FP-(성 인자 마이너스)	Hollo way, 등, Microbiol. Rev. 43:73-102 (1979)
대장균 JM109	복제 및 아주린 발현 균주	Yanisch-Perron, 등, Gene 33:103-119 (1985)
대장균 BL21(DE3)	GST 발현 균주	Novagen
임균 F62	DNA 단리를 위해 사용된 기본 유기 영양	American Type Culture Collection
pUC18	일반 복제 벡터, Apr	Yanisch-Perron, 등, id.
pUC19	일반 복제 벡터, Apr	Yanisch-Perron, 등, id.
pUC18-laz	pUC18로 복제된 임균 F62의 게놈 DNA로부터의 하나의 1 kb의 PCR 단편	본원
pUC19-paz	HindIII 및 pstI으로 복제된 녹농균 PAO1로부터의 하나의 0.55 kb의 PCR 단편은 pUC19, Apr을 절단했다	Yamada, 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:14098-14103 (2002); Yamada, 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:4770-4775 (2004)
pUC18-H.8-paz	녹농균 PAO1, Apr로부터의 임균 및 아주린으로부터 유래된 H.8을 암호화하는 융합 플라스미드	본원
pUC19-paz-H.8	녹농균 PAO1으로부터 유래된 아주린 및 임균, Apr로부터 유래된 H.8을 암호화하는 융합 플라스미드	본원
pGEX-5X-3	GST 유전자 융합 벡터, Apr	Amersham
pET29a	대장균 발현 벡터, Kmr	Novagen
pET29a-gst	gst 유전자, Kmr을 함유하는 pET29a 유도체	본원
pET29a-H.8-gst	H.8-gst 유전자, Kmr을 함유하는 pET29a 유도체	본원
pGEX-5X-3-H.8	H.8-암호화 영역, Apr을 함유하는 pGEX-5X-3 유도체	본원
pET29a-gst-H.8	gst-H.8 유전자, Kmr을 함유하는 pET29a 유도체	본원

* Ap, 암피실린; Km, 카나마이신; GST, 글루타티온 S-전이효소.

paz 및 laz 유전자의 복제 및 발현. 아주린 유전자의 복제 및 과다발현이 설명되었다(Yamada, 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:14098-14103 (2002); Punj, 등, Oncogene 23:2367-2378 (2004)). 임균의 Laz-암호화 유전자(laz)를 임균 균주 F62의 게몬 DNA를 주형 DNA로 하여 PCR로 증폭시켰다. 사용된 정방향 및 역방향 프라이머는 5'-CCGGAATTCCGGCAGGGATGTTGTAAATATCCG-3' (서열번호:4) 및 5'-GGGGTACCGCCGTGGCAGGCATACAGCATTTCAATCGG-3' (서열번호:5)이었으며, EcoRI 및 KpnI 부위 중 부가적으로 도입된 제한 부위는 각각 밑줄 그었다. EcoRI 및 KpnI로 절단되는 1.0 kb의 증폭된 DNA단편을 pUC18 벡터의 상응하는 부위 안에 삽입했고(Yanisch-Perron, 등, Gene 33:103-119 (1985)), 그 결과 발현 플라스미드 pUC18-laz를 수득하기 위하여 lac 프로모터의 하류에 laz 유전자를 배치했다(표 2, 도 1).

PCR은 pUC19-paz 및 pUC18-laz를 주형으로 하여 임균 Laz의 융합 H.8 및 녹농균(Paz)의 아주린을 발현하는 플라스미드를 제조했다. H.8-Paz 융합에 대하여, pUC18-laz를 주형 및 프라이머로 하여 3.1 kb 단편을 증폭했으며, 5'-(인산화)GGCAGCAGGGGCTTCGGCAGCATCTGC-3' (서열번호:6) 및 5'-CTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCG-S' (서열번호:7), 여기서 SalI 부위는 밑줄 그었다. PCR은 0.4 kb 단편을 증폭했으며 pUC19-paz를 주형 및 프라이머로 하여 얻어졌다.

5'-(인산화)GCCGAGTGCTCGGTGGACATCCAGG-3' (서열번호:8) 및 5'-TACTCGAGTCACTTCAGGGTCAGGGTG-3' (서열번호:9), 여기서 XhoI 부위는 밑줄 그었다. 발현 플라스미드인 pUC18-H.8-paz를 수득하기 위해, pUC18-laz로부터 PCR 단편을 절단시키는 SalI 및 pUC-19-paz로부터 PCR 단편을 절단시키는 XhoI를 복제했다(표 2, 도 1).

Paz-H.8 융합에 대하여, 3.3 kb 단편을 pUC19-paz를 주형 및 프라이머로 하여 증폭했으며, 5'-CTTCAGGGTCAGGGTGCCCTTCATC-3' (서열번호:10) 및 5'-CTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCG-3' (서열번호:11), 여기서 BamHI 부위는 밑줄 그었다. 0.13 kb 단편을 pUC18-laz를 주형 및 프라이머로 하여 증폭했으며, 5'-(인산화)TGCTCTCAAGAACCTGCCGCGCCTGC-3' (서열번호:12) 및 5'-TAGGATCC TTAGGCAGCAGGGGCTTCGGCAGCATCTGC-3' (서열번호:13), 여기서 BamHI 부위는 밑줄 그었고, 세균성 유전자 종결 코돈에 상응하는 부가적으로 도입된 TTA는 이탤릭체로 쓰여졌다. 발현 플라스미드인 pUC19-paz-H.8을 수득하기 위해 PCR 단편을 절단시키는 두 개의 BamHI를 복제했다(표 2).

아주린 및 이의 유도체 유전자의 발현을 위해 숙주 균주로서 대장균 JM109를 사용했다. 37 ℃ 조건에서 16시간 동안 100 μg/ml의 암피실린, 0.1 mM IPTG 및 0.5 mM의 CuSO₄를 함유하는 2 X YT 배지에 재조합 대장균 균주를 배양하여 아주린 단백질을 생산했다.

융합 GST 단백질에 대한 플라스미드 구조. pGEX-5X-3(GE Healthcare Bio-Sciences Corp., Piscataway, NJ)을 주형 DNA로 하여 PCR로 글루타티온 S-전이효소 (GST)-암호화 유전자를 증폭했다. 사용된 정방향 및 역방향 프라이머는 5'-CGAGCTCATGTCCCCTATACTAGGTTATTGG-3' (서열번호:14) 및 5'-CCCAAGCTT TCAGGGGATCCCACGACCTTCGATCAGATCC-3' (서열번호:15)이며, 여기서 SacI 및 HindIII의 부가적으로 도입된 제한 부위는 각각 밑줄 그었고 세균성 유전자 종결 코돈에 상응하는 부가적으로 도입된 TCA는 각각 이탤릭체로 쓰여졌다. 발현 플라스미드 pET29a-gst를 수득하기 위하여, SacI 및 HindIII로 절단되는 1.0 kb의 증폭된 DNA 단편을 pET29a 벡터의 상응하는 부위 안에 삽입했다(표 2).

H.8-GST 융합에 대하여, laz의 신호 펩타이드 및 H.8-암호화 영역을 pUC18-laz를 주형 DNA로 하여 PCR로 증폭했다. 사용된 정방향 및 역방향 프라이머는 5'-GGAATTCATATGAAAGCTTATCTGGC-3' (서열번호:16) 및 5'-CCGGAATTCGGCAGCAGGGGCTTCGGC-3' (서열번호:17)이며, 여기서 NdeI 및 EcoRI 부위의 부가적으로 도입된 제한 부위는 각각 밑줄 그었다. 발현 플라스미드 pET29a-H.8-gst를 수득하기 위하여, NdeI 및 EcoRI로 절단되는 0.14 kb의 증폭된 DNA 단편을 pET29a-gst 벡터의 상응하는 부위 안에 삽입했다(표 2).

GST-H.8 융합에 대하여, H.8-암호화 영역을 pUC18-laz를 주형 DNA로 하여 PCR로 증폭했다. 사용된 정방향 및 역방향 프라이머는 5'-CGGGATCCCCTGCTCTCAAGAACCTGCCGCGCC-3' (서열번호:18) 및 5'-CGGAATTC TTAGGCAGCAGGGGCTTCGGCAGCATCTGCAGG-3' (서열번호:19), 여기서 BamHI 및 EcoRI 부위의 부가적으로 도입된 제한 부위는 밑줄 그었고 도입된 세균성 유전자 종결 코돈 TTA는 이탤릭체로 쓰여졌다. pGEX-5X-3-H.8을 수득하기 위하여, BamHI 및 EcoRI로 절단되는 0.14 kb의 증폭된 DNA 단편을 pGEX-5X-3 벡터의 상응하는 부위 안에 삽입했다. 이후에, GST-H.8 융합 영역을 pGEX-5X-3-H.8을 주형 DNA로 하여 PCR로 증폭했다. 사용된 정방향 및 역방향 프라이머는 5'-CGAGCTCATGTCCCCTATACTAGGTTATTGG-3' (서열번호:20) 및 5'-CCGCTCGAG TCAGGCAGCAGGGGCTTCGGCAG-3' (서열번호:21)이며, 여기서 SacI 및 XhoI 부위의 부가적으로 도입된 제한 부위는 밑줄 그었고 도입된 세균성 유전자 종결 코돈 TCA는 이탤릭체로 쓰여졌다. pET29a-gst-H.8을 수득하기 위하여, SacI 및 XhoI로 절단되는 1.1 kb의 증폭된 DNA 단편을 pET29a 벡터의 상응하는 부위 안에 삽입했다(표 2).

gst 및 이의 융합 유도체의 발현을 위한 숙주 균주로서 대장균 BL21(DE3)을 사용했다. 이러한 플라스미드를 포함하는 대장균 균주를 IPTG의 존재하에서 성장시켰고, 세포를 용해시켰고, 단백질을 아주린에서 설명된 것처럼 정제했으며(Yamada, 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:14098-14103 (2002); Punj, 등, Oncogene 23:2367-2378 (2004); Yamada, 등, Cell. Microbiol. 7:1418-1431 (2005)), 단백질(약 17 kDa)을 함유하는 H.8이 이전에 언급한 것처럼, 변칙적인 이동을 보여주었음에도 불구하고, 다양한 아주린 유도체는 단일 성분으로서 SDS-PAGE 상으로 이동했다(Cannon 등, id .; Fisette 등, id .).

H.8은 교모세포종에 대하여는 녹농균 아주린의 세포독성을 향상시키지만 유방암 세포에 대해서는 세포독성을 향상시키지 않는다

암세포에 대한 Paz의 우선적인 진입(Yamada, 등, Cell. Microbiol. 7:1418-1431 (2005)) 및 이의 세포독성, 인간 흑색종(Yamada, 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:14098-14103 (2002)) 및 유방암(Punj, 등, Oncogene 23:2367-2378 (2004))에 대한 Paz의 시험관 내 및 생체 내에서의 세포 독성 모두는 보고되었다. 미국특허 출원번호 12/338,480을 참조하고, 상기 공개 문헌은 본 명세서에 전체가 참조로 포함된다. 반면에, 교모세포종과 같은 뇌 종양에 대하여 Paz 또는 Laz가 효과가 없다는 것은 알려져 있다. 여기서는, 교모세포종(LN-229 세포주) 및 유방암(MCF-7 세포주) 세포 모두에 대한 Paz, Laz, H.8-Paz(Paz의 N-말단 중의 H.8 에피토프) 및 Paz-H.8(Paz의 C-말단 중의 H.8 에피토프)의 효과를 연구했다.

단백질의 제조. 녹농균의 아주린(Paz), 임균의 Laz, Paz-H.8 및 H.8-Paz를 앞서 설명한 바와 같이 정제했다(Yamada, 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:14098-14103 (2002); Punj, 등, Oncogene 23:2367-2378 (2004); Yamada, 등, Cell. Microbiol. 7:1418-1431 (2005)). 모든 재조합 GST 융합 유도체를 이전에 설명된 것처럼 정제했다(Yamada, 등, Cell. Microbiol. 7 : 1418- 1431 (2005)). 화학적으로 합성된 39-아미노산 H.8 펩타이드를 구매했다.

세포독성 측정. 암세포에 대하여 세포독성을 알아내기 위하여 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일-2,5-디페닐)테트라졸리움 브로마이드(MTT)측정을 수행했다. 37 ℃, 5 % CO₂에서 세포(웰 당 5 x 10³)를 배지의 100:1 중의 96-웰 배양 플레이트 안에 심었다. 밤새도록 배양한 후에, 상청액을 제거했고, 지정된 다양한 농도의 단백질을 함유하는 신선한 배지를 부착된 세포에 첨가했다. 10 μl의 5 mg/ml MTT(Sigma-Aldrich, St. Louis MO) 용액을 배영에 첨가하고 37 ℃에서 2시간 동안 배양함으로써 살아있는 세포의 수를 MTT 측정으로 알아내기 이전에 이러한 세포를 지정된 다양한 시간 동안 배양했다. 40 mM HCl 100 μl를 이소프로판올에 첨가함으로써 MTT 반응을 종료했다. Mosmann에 의해 설명된 방법에 따른 분광학적 방법으로 MTT 포르마잔의 형성을 측정했다(J. Immunol. Methods 65:55-63 (1983)).

합성 H.8 펩타이드는 교모세포종 LN-229(도 2a) 또는 유방암 MCF-7(도 2b) 세포 중 어느 하나에 대하여 매우 적은 세포독성을 가졌다. 아주린(paz)의 효과는 투여량에 의존적이었고, 교모세포종(도 2a)에서 비록 적었지만, 아주린 농도를 10 μM 내지 40 μM로 증가시키면서 세포독성을 증가시켰지만 유방암(도 2b) 세포에서는 효과가 없었다. 세포독성은 6시간의 배양기간이 지난 후에 매우 미미하게 증가했다. 주목할 만한 것은 교모세포종 및 유방암 세포에서 Paz, Paz-H.8, H.8-Paz 및 Laz의 세포독성의 차이였다. Paz, Paz-H.8, H.8-Paz 및 Laz가 MCF-7 세포에서 상이한 기간의 배양 동안 어떤 투여량에서도 필수적으로 동일한 세포독성을 가졌으며(도 2b), Paz는 교모세포종 세포에 대하여 Paz-H.8, H.8-Paz 및 Laz보다 훨씬 적은 세포독성을 가졌고, 특히 더 짧은 배양기간(6시간)에서 그러했다. 따라서, H.8 부분은 자체의 세포독성이 부족하지만, H.8 부분은 Paz의 세포독성을 향상시키는 것으로 보여졌고, 이는 단지 교모세포종에 대하여서 그러하고 유방암 세포에 대해서는 그러하지 않다.

Paz 또는 Laz 에 있는 H.8 에피토프는 교모세포종 세포에서 아주린의 흡수를 가능하게 한다

Paz에 비해 교모세포종 세포에 대하여 Paz-H.8, H.8-Paz 및 Laz의 향상된 세포독성은, 만일 H.8 부분이 교모세포종 세포에서 아주린의 흡수를 어떻게 가능하게 했는지에 대한 궁금증을 제기했다. 교모세포종 및 유방암 세포 안으로 이러한 단백질의 내재화를 알아내기 위하여 Alexa fluor^® 568-표지된 적색 형광 단백질(Invitrogen-Molecular Probes Corp., Carlsbad CA)를 사용했다. 이 기술은 MCF-7 세포에서 아주린의 내재화를 증명하기 위하여 이미 사용되었다(Punj, 등, Oncogene 23:2367-2378 (2004); Yamada, 등, Cell. Microbiol. 7:1418-1431 (2005)).

공초점 현미경. 현미경용 시료를 제조하기 위해, 37 ℃, 5 % CO₂ 하에서 세포를 커버글라스 상에서 밤새도록 배양했다. 미리 가온된 37 ℃의 신선한 배지를 적색 형광-표지(Alexa fluor^® 568) 아주린 또는 GST 융합 유도체와 함께 혼합했고, 표시된 시간 동안 세포와 함께 배양했다. 세포를 PBS로 세퍽했고, -20 ℃에서 5분 동안 메탄올로 고정했다. PBS로 3회 세척하고 핵을 염색(VECTASHIELD^®, Vector Laboratories, Burlingame CA)하기 위하여 1.5 mg/ml의 4,6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)을 함유하는 마운팅 배지를 첨가한 후에, Carl Zeiss LSM510 공초점 레이저 현미경을 사용하여 사진을 찍었다(Yamada, 등, Cell. Microbiol. 7:1418-1431 (2005)).

아주린(Paz) Paz-H.8, H.8-Paz 및 Laz보다 감소된 효과를 갖도록 내재화 되었으며, 이는 교모세포종 LN-229 세포에서 Paz 진입에 대한 장벽을 증명한다(도 3a 및 4a). 이와 대조적으로, 이전에 보고된 바와 같이, Paz는 유방암 세포 MCF-7 세포에서 Paz-H.8, H.8-Paz 또는 Laz(도 3b 및 4b)와 동일하거나 어떤 이유로 더 높은 효과를 갖도록 효과적으로 내재화되었다(Puηj, 등, Oncogene 23:2367-2378 (2004); Yamada, 등, Cell. Microbiol. 7:1418-1431 (2005)). LN-229 세포에서 Laz 진입의 투여량 의존은 37 ℃에서 30분의 배양기간 동안 약 16 μM의 최적 농도를 보여주었으며(도 3c 및 4c), 이 이상의 추가적인 증대는 없었다(데이터 미도시). 10 μM 농도에서, 대량의 Laz가 약 10 내지 20분에 LN-229 세포에 내재화되었으며(도 3d 및 4d), Paz의 내재화는 이러한 조건 하에서 최소화되었고(도 3e), 이는 Paz 내재화가 LN-229 세포에서 선천적으로 효과적이지 않다는 것을 시사한다. LN-229세포에서 Laz의 내재화와 유사하지만 이와 대조적으로 Paz와는 다른, Paz-H.8 및 H.8-Paz의 현저한 내재화는 Paz의 N-말단 또는 C-말단 중 어느 부분에서 H.8 부분의 상대적 위치가 교모세포종 세포에서 Paz 부분의 내재화를 촉진하는 능력에 영향을 미치지 않는다는 것을 시사한다고 보여졌다.

H.8 부분은 교모세포종에서 Paz 진입을 촉진하지만 유방암 세포에서는 촉진하지 않는다

Laz에서와 같이 H.8 에피토프가 Paz의 일부이어야 할 필요가 있는지 또는 교모세포종 세포 안으로 Paz의 진입을 촉진하기 위해 홀로 기능할 수 있는지를 알아내기 위하여, 다양한 H.8 융합 단백질을 사용할 뿐만 아니라 H.8을 단독으로 사용했다. 39-아미노산 합성 H.8 부분과 같은 소 펩타이드가 용액에서 낮은 안정성을 갖기 때문에, 우리는 Paz-H.8 또는 H.8-Paz와 유사한 H.8 부분을 갖는 글루타티온 S-전이효소(GST) 융합물을 제조하였으며, H.8은 GST의 N-말단에 포함되었거나(H.8-GST) 또는 GST의 C-말단에 포함되었다(GST-H.8). GST 융합 펩타이드의 제조는 실시예 1에서 설명된다.

적색 형광을 띠는 Alexa fluor^® 568-콘쥬게이션된 Paz를 미표지된 합성 H.8 펩타이드, GST, GST-H.8 및 H.8-GST 융합 단백질과 함께 분리하여 배양했으며, 대조군으로서 인산-완충 식염수(PBS)와 함께 배양했고, 37 ℃에서 30분 동안 배양 후에 LN-229 세포에서 20 μM Paz 혼합물의 내재화를 결정했다. Paz와 함께 분리하여 도입되는 경우에, 합성 H.8 펩타이드는 PBS(도 5e), GST(도 5b) 또는 GST-H.8(도 5c)에 비해 Paz 내재화(도 5a)를 향상시켰다. 형광의 정량화는 H.8 펩타이드가 Paz 진입을 2.1배 촉진시킨다는 것을 보여주었다. 반면에, H.8-GST의 존재는 Paz의 내재화를 현저히 증가(3배 이상)시켰다(도 5d). 다른 한편으로는, GST-H.8은 온화한 촉진만을 보였다(도 5c). Paz 자체는 교모세포종 세포에서 매우 느리게 진입했으며(도 5e), 이는 뇌 종양암에서 진입이 H.8에 의해 매개된다는 것을 보여준다. H.8 단독으로 교모세포종 세포에 진입하지 않지만(도 3a), Paz의 내재화를 촉진하는 H.8의 능력은 뇌 종양암 안으로 단백질의 진입을 가능하게 하는 H.8의 능력을 나타낸다(도 5a).

교모세포종 세포 중의 H.8- GST 의 존재하에서 Paz 의 향상된 내재화는 이러한 세포에서 보다 높은 세포독성을 초래한다

우리는 20 μM의 Paz의 부존재 또는 존재 하에서 합성 H.8 펩타이드, GST, GST-H.8 및 H.8-GST 단백질(각각 20 μM)을 LN-229 세포와 함께 24시간 동안 배양한 후에 MTT 측정에 의해 독자 생존 가능한 교모세포종 세포를 측정함으로써 세포독성의 정도를 측정했다. Paz의 부존재하에서, H.8 펩타이드, GST 또는 GST 융합 단백질 중 어떤 것도 현저한 세포독성을 보여주지 않았다(도 5f, -Paz). 20 μM Paz의 존재하에서, 이 자체만으로는 H.8 펩타이드 또는 PBS의 존재하에서 낮은 세포독성을 보여주었으며(도 5f, +Paz), GST 자체로 또는 GST-H.8이 세포독성의 일부 향상을 보여주었지만(도 5f, +Paz) 세포독성의 상당한 향상은 H.8-GST의 존재하에서만 관찰되었다(도 5f, +Paz). 종합하면, 이러한 데이터는 Paz와 같은 단백질의 일부로서 H.8 부분이 있거나 Paz와 같은 단백질의 존재하에서 H.8 부분은 이러한 세포 안으로 Paz의 수송을 가능하게 하며, 결과적으로 세포독성을 향상시켰다.

H.8은 BBB 의 교차를 매개하여 뇌에 진입을 가능하게 한다

교모세포종 LN-229 세포에 융합 또는 개개의 단백질의 향상된 내재화를 가능하게 하는 H.8 에피토프의 능력(도 3a, 4a 및 5d)은 H.8-Paz 또는 Laz의 N-말단의 일부분으로 H.8이 BBB의 교차를 촉진하여 말초 순환에서 뇌 세정맥으로 이러한 단백질의 수송을 가능하게 하는지 여부에 대한 궁금증을 제기한다.

Odyssey ^® 측정. 제조업자에 의해 권고 되는 조건 하에서 IRDye^® 800CW(LI-COR Biosciences, Lincoln, Nebraska)를 사용하여 모든 단백질을 표지했다. IRDye^® 800CW와 콘쥬게이션된 500 μg의 Paz, H.8-Paz 및 Laz를 누드 마우스의 복강 내로 주입하였다. 24시간 후에, 마우스를 죽였고, 뇌를 꺼냈고, 뇌 영상을 LI-COR Odyssey® Infrared Imaging System(84 μm 해상도, 1 mm 오프셋)으로 탐지했다. 이후에, 마우스의 뇌를 수평으로 절단했고, 표지된 단백질의 존재를 탐지하기 위하여 두측 중뇌 영역 영상을 찍었다.

아주린 단백질에서 형광성의 정량. 형광성의 정량은 다음과 같이 Adobe^® Photoshop^®을 사용하여 측정되었다: 하나의 세포를 Photoshop^®의 Lasso Tool로 선택했고, 영상 메뉴의 적색 히스토그램으로부터 평균값을 얻었다. 하나의 표본에 대하여 적어도 세 개의 다른 세포를 측정했고 표준편차를 계산했다.

IRDye^® 800CW(LI-COR Bioscience)로 표지된 500 μg의 Paz, H.8-Paz 및 Laz 단백질을 살아있는 누드 마우스 안에 복강 내로 주입했다. 24시간 후에, 마우스를 죽였고, 뇌를 단리했으며, LI-COR Odyssey® Infrared Imaging System를 사용하여 영상을 찍었다. Paz의 적은 양이 뇌 세정맥 안으로 진입하는 반면에, 더 많은 Laz가 진입한다는 것을 발견했고, 특히 H.8-Paz(4배 이상)는 이러한 조건 하에서 뇌 안에서 검출되었으며, 이는 뇌 안으로 융합 단백질의 진입을 가능하게 하는 H.8 에피토프의 명백한 역할을 보여준다.

H.8 에피토프가 N-말단에 존재하는 경우에, H.8 에피토프는 주변 세포질 단백질의 세균 표면 발현을 허용한다

Laz 중의 H.8 에피토프의 N-말단 국부화가 이의 표면 발현에 기여하는지를 조사하기 위하여, 실시예 1에서 설명된 바와 같이, H.8 융합 유도체를 GST(도 5) 및 Paz(도 2 및 도 3a/b 및 도 4a/b)의 N-말단 및 C-말단에서 제조했다.

대장균에서 표면-노출 단백질의 국부화 . pET29a-gst, pET29a-H.8.gst 또는 pET29a-gst-H.8을 포함하는 대장균 균주 BL12(DE3) 및 pUC19-paz, pUC19-paz-H.8, pUC18-H.8-paz 또는 pUC18-laz를 포함하는 대장균 균주 JM109를 0.4 mM의 이소프로필 β-D-티오갈락토시드(IPTG)와 함께 37 ℃에서 배양했다. 이러한 세균 배양 각각 1 ml씩을 원심분리했고, 그 결과물로 펠렛을 수집했다. PBS로 2회 세척한 후에, GST 유도체에 대한 항-GST 항체(1:2000) 또는 아주린 유도체에 대한 항-아주린 항체(1:500)을 함유하는 1 % FBS-PBS 1 ml를 첨가했다. 세포 현탁액을 얼음 상에서 1시간 동안 배양한 이후에, PBS로 2회 세척했다. GST 유도체에 대한 FITC-콘쥬게이션된 항-래빗 IgG 또는 아주린 유도체에 대한 FITC-콘쥬게이션된 항-래빗 항체를 가했고, 얼음 상에서 30분 동안 배양했다. 결합되지 않은 항체를 제거하기 위하여, 세포를 PBS로 2회 세척했고, 얼음 상에서 에탄올로 고정했다. 이후에, DAPI로 처리된 대장균 표본을 공초점 현미경으로 관찰했다.

H.8 융합 단백질을 정제했다(도 1e 및 도 7a). GST의 세포 국부화 뿐만 아니라, N- 및 C-말단(H.8-GST 및 GST-H.8)에서 두 개의 H.8 융합물의 국부화는 도 7b에서 보여진다. 항-GST 항체를 사용하여 웨스턴 블롯팅에 의해 검출하는 경우에, 세 개의 단백질 모두는 대장균에서 과다발현되었고, 대장균의 전혈 용해물에 존재한다. 주변 세포질 분획을 대장균 및 확인된 세 개의 단백질의 존재로부터 단리하는 경우에, GST 및 GST-H.8 단백질은 현저항 양이 검출되었지만(도 7b, 주변 세포질 분획 하에서 레인 1 및 3), 매우 적은 양의 H.8-GST(도 7b, 주변 세포질 분획 하에서 레인 2)는 이러한 주변 세포질 분획에서 검출될 수 있다.

H.8-GST 융합 단백질의 나머지가 대장균 세포의 표면에 수송될 수 있는 지를 조사하기 위하여, 세 개의 단백질을 과다발현하는 세포를 성장시키고 채취했으며, 세척했고, 임의의 표면-노출 GST에 결합하도록 항-GST 항체로 처리했고, 다시 세척했고, FITC-콘쥬게이션된 이차 항체로 처리했다. 만일 GST가 표면이 노출되었다면, 항-GST 항체는 이에 결합할 것이며, 이후에 FITC-콘쥬게이션된 이차 항체에 의해 검출될 수 있다. 물론, H.8-GST를 포함하는 대장균 세포만이 녹색 형광을 발생시키는 FITC를 보였으며(도 7c, H.8-GST), 이는 GST의 N-말단에 H.8 에피토프의 존재가 세포 표면으로의 수송을 촉진한다는 것을 시사한다. GST의 C-말단에 H.8 부분(GST-H.8) 뿐만 아니라 GST 자체의 존재는 어떠한 표면 발현도 갖지 않는 주변 세포질 및 세포 내에 대체로 남아 있었다(도 7c, GST 및 GST-H.8).

상술한 바와 동일한 기술을 사용하여, H.8-Paz 및 Laz 둘 모두가 표면 발현을 보이는 반면에, Paz 및 Paz-H.8는 세포 내에 남아 있다는 것을 알아냈으며(도 7d, Paz 및 Paz-H.8), 이는 어쩌면, 지질화를 위한 유리 시스테인을 필요하는 N-말단에서 H.8의 존재가 외막을 통하여 표면에 도달하기 위한 융합 단백질의 수송에 중요하다는 것을 확인해 주었다.

백혈병 연구를 위하여 아주린 , Laz 및 Pa - CARD 펩타이드의 제조

야생형(wt) 아주린 및 돌연변이 아주린을 문헌[Yamada T 등, Proc Natl Acad Sci USA 99:14098-103 (2002)] 및 문헌[Punj V 등, Oncogene 23:2367-78 (2004)]에서 설명된 바와 같이 정제했다. Laz를 문헌[Hong CS 등, Cell Cycle 5:1633-41 (2006)]에서 설명된 바와 동일한 방법을 사용하여 정제했다. 간단히 말해서, 대장균 중의 pUC18 벡터를 사용하여 Laz를 발현했다. 세포를 24시간 동안 배양했고, 원심분리하여 침전시켰고, 주변 세포질 분획의 단리를 위하여 용해시키기 이전에 PBS로 2회 세척했다. 주변 세포질 분획은 단백질 정제를 위한 Q 세파로오스 교환을 위해 수집된다. 분획은 농축되고 정제된 단백질의 단리를 위해 FPLC에서 작동된다.

Pa - CARD 의 복제, 발현 및 정제. 녹농균 ADI로부터 유래된 용해성 아르기닌 디아미나아제 및 카스파아제 보강 도메인(CARD)-함유 도메인의 높은 수준의 발현을 위해서, N82 말단 영역에서 SUMO 융합 단백질을 갖는 pET-SUMO 발현 벡터를 사용했다. ADI 유전자의 CARD 모티프를 pET-SUMO 벡터(Invitrogen)로 복제하기 위하여, 하기의 프라이머 쌍을 갖는 녹농균의 임상 단리주의 게놈 DNA로부터 상기 유전자를 증폭했다: 정방향: 5'-ATGCACAATCTGCTGACCGAGACCATCCAG- 3' (서열번호:28) 및 역방향: 5'-TCAGGTCGAGGAGCCGTGGTCCTTGTC-3' (서열번호:29). PCR 산물을 pET-SUMO TA 복제 벡터 안에 직접적으로 결합했다. 그 결과의 발현 벡터는 서열이 확인되었고, 대장균 90 균주 BL21(DE3)로 변형되었다.

밤새도록, 배양은 37 ℃, 50 μg/ml의 카나마이신을 함유하는 LB 배지에서 성장했다. OD₅₉₅nm에서, 대략 0.5, 0.5 mM의 최종 농도를 갖는 IPTG를 배양에 첨가했고 37 ℃에서 5시간 동안 배양했다. 15분 동안 5000 rpm으로 원심분리하여 세포를 수집했다. 50 mM Tris-Cl, 100 mM의 NaCl 및 25 %(w/v) 수크로오스를 함유하는 용해 버퍼(pH 8.0)로 세포 펠렛을 용해시켰다. 용해 버퍼를 첨가한 후에, 20 mg/ml의 리소자임을 세포 현탁액에 첨가했고 4 ℃에서 20분 동안 배양했다. Triton X-100 [최종농도 0.01 %(v/v)]를 첨가했고 5분 동안 배양했다. 100 μl의 DNA 분해효소 및 RNA 분해효소를 500 ml 배양 당 첨가했고 37 ℃에서 30분간 배양했다. 세포 현탁액을 15,000 rpm으로 37 ℃에서 35분간 원심분리했다. 상청액을 기평형된 1 ml Ni-NTA 컬럼 상에 적가했다. 적가 후에, 컬럼을 완충액(50 mM Tris-Cl, 300 mM NaCl, 10% 글리세롤, 10 mM 이미다졸)으로 세척했다. SUMO-CARD를 용출 완충액(20 mM Tris-Cl, 150 mM NaCl, pH 8.0)에서 50-500 mM 이미다졸의 25 ml 단계적 증감률로 용출했다. 정제된 SUMO-CARD 분획을 모았고, SUMO 단백질 분해효소 절단을 위해 완충액(20 mM Tris-Cl, 150 mM NaCl, pH 8.0)과 교환했다. 이후에, SUMO-CARD 단백질을 1.5 내지 2 ml 까지 농축했다. 그 다음에, DTT를 1 mM의 최종농도가 되도록 첨가했다. SUMO 단백질 분해효소를 첨가한 후에, 절단된 혼합물을 30 ℃에서 2 내지 3시간 동안 배양했고, Pa-CARD라고 불리는 CARD 폴리펩타이드를 니켈 수지를 사용하여 정제했다. 최종 단백질 농도를 BSA를 표준으로 사용하여 단백질 시약(Pierce)로 측정했다. CARD 도메인이 유래되는 녹농균의 ADI 효소를 동일한 과정(PaADI)을 이용하여 SUMO-ADI 융합 단백질로부터 정제했다.

세포 배양. 모든 세포주를 RPMI 1640 배지에서 배양했으며, 상기 배지에는 10 % 소태아혈청(FBS), 2 % 페니실린/스트렙토마이신 및 2 % 글루타민(Gibco/Life Technologies Inc.)가 공급되었다. 모든 세포를 습한 37 ℃ 배양기에서 5 % CO₂ 환경에서 성장시켰다.

세포독성 측정. 문헌[Yamada T 등, Proc Natl Acad Sci USA 99:14098-103 (2002)] 및 문헌[Punj V 등, Oncogene 23:2367-78 (2004)]에서 설명되는 wt 및 돌연변이 아주린의 세포독성의 측정을 위하여 MTT[3-(4,5-디메틸티아졸-2일-2,5-테트라졸리움 브로마이드)]측정을 사용했다. 간단히 말해면, 수용성 테트라졸리움 염,[3-(4,5-디메틸티아졸-2일-2,5-테트라졸리움 브로마이드)]는 온전한 미토콘드리아 탈수소효소에 의해 수불용성 포르마잔으로 대사되지 않는다. 그 다음에, 포르마잔은 2-프로판올 + 40 mM HCl을 첨가하고 1시간 동안 배양함으로써 용해된다. 3 x 10⁴ 세포를 다양한 농도의 아주린, Laz 또는 Pa-CARD로 처리했으며, 뿐만 아니라 양성 대조군으로서 5-aza-2-디옥시시티딘(DAC)로 처리했다. 세포의 생존 능력을 포르마잔의 형성에 기초하여 추산했으며, 상기 포르마잔의 형성은 570 nm 광학 밀도에 의해 분광학적으로 검출되었다.

세포 주기 분석. HL60 및 K562 세포(24-웰 플레이트 중의 웰 당 3 x 10⁵ 세포가 심어짐)를 야생형 아주린, Pa-CARD 또는 Laz(5 및 10 μM)로 48시간 동안 처리했다. 세포를 PBS로 2회 세척했고 24시간 동안 -20 ℃에서 70 % 에탄올로 고정했다. 고정된 세포를 PBS로 2회 세척했고, 20 μg/ml의 RNA 분해효소 A를 함유하는 PBS 중의 프로피디움 요오드 50 μg/ml로 30분 동안 어둠속에서 염색했고, 유세포분석기(Becton Dickinson)로 분석했다. 세포 주기의 다른 단계에서 세포의 비율을 MODFIT LT 소프트웨어로 알아냈다.

웨스턴 블롯팅 . 면역 블롯팅에 대하여, 세포질 및 핵 분획을 완전 단백질 분해 효소 및 인산 가수분해효소 억제제(Sigma)와 함께 제조자의 설명에 따라 NE-PER 추출 시약(Pierce)을 사용하여 단리했다. 세포 용해물 중 단백질의 농도를 Bradfodr Bio-Rad 측정법을 사용하여 측정했다. 세포 용해 단백질을 SDS-PAGE를 통해 분리했고, 면역 블롯팅을 위하여 PVDF 막으로 전환했다. 막을 5 % 탈지한 분유(Difco)를 함유하는 Tris-완충 식염수(0.15 M NaCl, 0.05 M Tris-HCl [pH 8.0], 0.05% Tween 20)로 차단했고, 온화하게 교반하며 1차 항체(TBST에 희석이 권고 됨, 5 % 탈지 분유)와 함께 4 ℃에서 밤새도록 배양했다. TBST로 각각 5분간 3회 세척한 후에, Zymed Laboratories(San Francisco, CA)(TBST 중의 1:3000, 5 % 탈지분유)로부터의 겨자무과산화효소-표지된 염소 항-래빗 또는 래빗 항-마우스 항체로 1시간 동안 실온에서 조사했다. 부가적인 세척 단계 후에, 막을 화학 발광의 기질과 함께 1분 동안 실온에서 배양했다. 각각의 항체 배양 사이에서 결합된 항체를 제거하기 위하여, 막을 제조자의 설명에 따라 회복 웨스턴 블롯 스트리핑 완충액(Restore Western blot stripping buffer)(Pierce)에서 배양했고, 재조사했다. 항-B-액틴은 Sigma로부터 구입했다. AKT, Wee1 및 항-포스포-AKT-S 473 항체는 Cell Signaling Technology(Beverly, MA)로부터 구입했다. 2차 항체, 겨자무과산화효소-표지된 염소 항-래빗 또는 래빗 항-마우스는 Zymed Laboritories(San Francisco, CA)로부터 구입했다.

공초점 현미경. 아주린 및 Laz 단백질을 형광성 화학물질인 AlexaFluor 568(분자 탐침)과 콘쥬게이션 시켰고, HL60, K562 또는 정상 말초혈 단핵 세포와 함께 1시간 동안 배양했다. 세포 안으로 형광이 화학적으로 표지된 펩타이드 또는 단백질의 진입을 공초점 현미경(모델명 LC510, Carl Zeiss)으로 관찰했으며, 이는 문헌[Yamada T 등, Cell Microbiol. 7:1418-31 (2005)]에서 설명된다.

백혈병 세포에 대한 아주린 및 Laz 의 효과

세균성 단백질 Laz 및 아주린을 세포에서 세포독성을 유발함으로써 두개의 백혈병 세포주, HL60, AML 세포주 및 K562, CML 세포주의 생존능력을 감소시키는 능력을 조사했다. Laz 또는 아주린을 10 μM로 처리한 지 24시간, 48시간 및 72시간 후에 MTT가 자주색의 포르마잔 산물로 대사적으로 감소하는 능력에 의해 세포주 HL60 및 K562의 생존능력을 측정했다(도 1a 및 1b). 10 μM의 단백질은 높은 세포독성을 나타내고 90 %를 넘는 세포 생존능력으로 감소시키는 것으로 판명되었다. Laz는 아주린 성분을 갖는 나이세리아 단백질이며, 상기 아주린 성분은 녹농균 아주린과 실질적으로 서열 동일성을 갖지만, H8 에피토프라고 불리는 39개의 아미노산 펩타이드를 부가적으로 갖는다.

이런 H8 에피토프가 아주린의 항암 활성을 조절하는지를 알아내기 위하여, H.8 에피토프를 녹농균 아주린의 N- 및 C-말단에서 복제했으며, 이는 H8-아주린(H8-Azu) 및 Azu-H8을 제공한다(Hong CS 등, Cell Cycle 5:1633-41 (2006)). 또한, 이러한 두 개의 Laz-유사 단백질을 백혈병 세포주에 대하여 조사했다. 보다 낮은 유효량을 알아내기 위하여, K562 세포를 다양한 농도의 단백질을 3.75 nM의 최종농도로 그리고 그 이상으로 처리하는 반면에, HL60 세포는 1 내지 10 μM 최종 농도로 처리했다. 모든 세균성 단백질은 두 개의 백혈병 세포주에서 투여량 의존성 세포독성 효과를 보였다. 현저한 세포 생존 능력 감소가 나노몰(nM) 단백질 농도에서도 관찰되었고, 5 μM의 단백질의 경우에서 생존 능력의 최고 감소가 관찰되었다. 이런 세포독성 효과는 HL60 및 K562 세포 둘 모두에서 세포독성 효과를 미치는 모든 단백질로 처리한 지 24시간 후에 더 명백해졌다(도 8a 및 8b).

또한, Laz 및 아주린의 세포독성 효과를 알려진 백혈병 약물, 5-aza-2'-디옥시시티딘(DAC)과 비교했다. 5-Aza-2'-디옥시시티딘은 DNA 과메틸화에 의해 사일런스되는(silenced) 종양 억제 유전자를 재활성화함으로써 기능하는 DNA 메틸화 억제제이다. 종양 억제 유전자의 재활성화는 세포 주기 정지 및 세포사멸을 가져온다. 세균성 단백질 각각의 생존능력 감소 효과는 DAC보다 현저하게 더 좋다(도 8c 및 8d). 아주린 또는 Laz는 정상 세포에 대하여 세포독성이 없고 암세포에는 세포독성이 있다. 또한, 이런 세포독성은 펩타이드 자체 때문이지 내독소와 같은 세포의 오염 물질 때문이 아니라는 것을 보여주었다.

Laz 및 아주린에 의해 유도되는 세포 죽음의 가능한 메커니즘을 식별하기 위한 노력에 있어서, 분명한 총 형태학적 변화를 형광 현미경을 통해 살펴보았다. 변화는 세포 괴사, 세포사멸 및 세포 분화 사이에 구별을 돕기 위해 살피는 것이며, 궁극적으로 세포 죽음을 가져오는 과정을 살피는 것이다. 과립화 또는 세포의 확장과 같은 변화는 급성 골수성 및 만성 골수성 백혈병 세포에 대한 경우 모두에서 가능한 분화 또는 괴사 및 궁극적인 세포 죽음의 지표이다. 형광 현미경의 결과는 Laz 및 아주린이 10 μM 농도로 배양 210 한 지 48시간 후에 HL60 및 K562에서 세포 분화를 유발할 수 있다는 것을 보여준다.

HL60 및 K562 세포 안으로 Laz 및 아주린의 진입

HL60 및 K562 세포에 진입하는 아주린 및 Laz의 능력을 공초점 현미경 및 AlexaFluor 568-콘쥬게이션된 적색 형광 아주린 또는 Laz를 사용하여 조사했다. 이러한 두 개의 단백질은 정상 PBMCs에 진입하지 않는 것으로 보여졌지만(도 10a 및 10b, 패널 1), K562(도 10c 및 10d, 패널 1) 및 HL60 세포(도 10e 및 10f, 패널 1) 둘 모두 안으로 Laz 및 아주린의 현저한 진입이 있다는 것을 보여주었다. 아주린은 더 적은 진입을 보였다(도 10d 및 10f, 패널 1). 1.0 내지 2.5 μM의 아주린의 세포독성 수준(도 8c 및 8d)은 HL60 또는 K562 세포에서의 진입 수준과 관련될 수도 있다.

H8-콘쥬게이션된 아주린, Azu-H8 및 H8-Azu의 진입을 조사했으며, 이들은 아주린과 유사하거나 어느 정도 더 높은 세포독성을 보여주었으며, 특히 1.0 내지 2.5 μM과 같은 저농도에서 그러했지만, Laz와 비슷한 세포독성을 보여주었다(도 8c 및 8d). Azu-H8 및 H8-Azu 둘 모두는 아주린보다 더 높은 진입 수준을 보였으며, 이는 K562 세포에서 Laz의 진입수준과 비슷했으며(도 10, 패널 2), 이는 백혈병 세포에서 아주린 또는 Laz의 진입을 허용함에 있어서 H8-에피토프의 역할을 보여준다.

Laz 는 Wee1 단백질 수준을 증가시키고 인산화된 AKT 를 감소시킴으로써 K562 에서 세포 주기 정지를 초래한다

세포 주기 진행에 대하여 Laz, 아주린 및/또는 5-aza-2-디옥시시티딘(DAC)의 효과를 유세포분석기를 사용하여 K562세포에서 평가했으며, 이들은 매우 민감한 것 같다. K562 세포 주기 정지에 대한 Laz, 아주린 및 DAC의 효과를 관찰했다(도 11). Laz, 아주린 및 DAC는 K562 세포를 G2/M에서 정지시킬 수 있다. G2/M기에서 세포 주기 정지는 종종 세포사멸 및 세포 죽음의 유도를 가져오며, 이는 아주린 및 Laz에서 관찰되었었다. Laz 및 아주린과 같은 단백질은 백혈병 세포에서 G2 세포 주기 조절자의 수준 및/또는 활성에 영향을 미칠 수 있다.

Wee1 및 인산화된 AKT를 포함하는 G2 정지를 매개하는 세포 주기의 조절자에 대한 Laz의 효과를 분석했다. Wee1 단백질은 G2/M기에서 세포 주기 정지의 매개자로 알려져 있다. 많은 바이러스성 단백질은 생체 내에서 상호작용하고 Wee1 활성에 영향을 미침으로써 G2기에서 세포 주기를 정지시킬 수 있다고 이해되어왔다. K562 세포를 10 μM Laz로 처리하는 것은 Wee1이 효과를 끼치는 것으로 알려진 세포질 및 핵(도 12) 모두에서 Wee1 단백질 수준의 증가를 가져온다. K562 세포와 대조적으로, HL60 세포는 Wee1 단백질의 현저히 감소된 수준을 보였다. 세린 473에서 AKT의 인산화를 억제함으로써 AKT 활성도 G2/M 세포 주기와 연관된다. 또한, 인산화된 AKT 세린 473의 수준의 감소에 의해 증명되는 바와 같이, Laz 처리는 HL60 세포에서 AKT 활성의 현저한 감소를 가져왔다(도 12). 흥미롭게도, AKT-P-Ser 473 수준의 감소는 K562 세포에서보다 HL60 세포에서 더 두드러진 반면에, Laz에 의한 핵 Wee1 단백질 수준의 변화는 K562 세포에서 더 두드러졌다.

Pa - CARD , 항암 세균성 단백질은 백혈병 세포에 대하여 활성을 가진다

마이코플라스마 아르기니니 ADI는 G1/S기에서 성장을 멈추게 하여 세포사멸을 가져옴으로써 배양된 인간 림프 백혈병 세포의 증식을 억제한다고 보고되었다(Gong H 등, Leukemia 14:826-9 (2000)). ADI는 아르기닌을 감소시키고, 아르기닌을 시트룰린 및 암모니아로 전환함으로써 ADI의 기능을 발휘하는 것으로 여겨진다. 포유류 세포가 시트룰린으로부터 다시 재합성될 수 있기 때문에, 아르기닌은 비-필수적 아미노산이다. 반면에, 간세포 암종, 흑색종 또는 신세포암과 같은 특정 암은 생체 내에서 아르기니노숙신산 합성효소, 시트룰린으로부터 아르기닌을 합성하기 위해 필요한 효소를 발현하지 않으며, ADI 작용에 의해 아르기닌 부족에 유독 민감한 이러한 암세포를 만들었다.

마이코플라스마 아르기니니 ADI의 흥미로운 특성은 포유류의 CARD 단백질에 대하여 N-말단 부분의 인식할 수 있는 구조적 유사성이다. 진핵세포, 주로 포유류의 CARD 단백질은 단백질-단백질 상호작용 모티프인 카스파아제 보강 도메인이라고 불리는 도메인을 보유한다. CARD-함유 단백질에서 CARD 도메인의 존재는 CARD-CARD 상호작용을 통해 복합체의 형성을 가능하게 하며, NF-kβ 또는 세포 죽음을 가져오는 과정에 의해 매개되는 세포 신호전달의 활성/억제를 가져온다. 카스파아제와 같은 CARD-함유 단백질은 세포사멸의 유도에 수반될 뿐만 아니라 전염증성 시토핀 생산에도 수반된다. 따라서, 카스파아제 1과 같은 카스파아제는 세포로부터 활성화된 형태로 방출되도록 IL-1B와 같은 시토킨의 단백질 가수 분해 과정에 수반된다. IL-1B가 혈관생성을 촉진하고 수많은 종양에서 과다생성되기 때문에, 카스파아제 1과 같은 CARD-함유 단백질은 억제제 발달을 위한 주요한 목표물이 항암제로서 고려된다.

마이코플라스마 아르기니니 및 녹농균으로부터 유래된 ADI의 유전자 서열 및 결정 구조(각각 Ma-ADI 및 PA-ADI로 불림)는 알려져 있고, N-말단에 있는 공통의 CARD 모티프와 약 27 % 서열 동일성을 보여준다(도 13a). ADI는 디메틸아르기닌 디메틸아미노히드롤라아제(DDAH) 및 아르기닌:글리신 아미디노트랜스퍼라아제(AGAT)와 같은 다른 과의 구성원과 유사한 구아니디니움 탄소 원자에서 친핵성 치환 반응을 촉진하는 능력을 갖는 구아니딘-변형 효소(GME) 상과의 구성원이다. 반면에, GME 상과 구성원의 구조적 특징의 정렬은 오직 ADI에서만 CARD 모티프의 존재를 보여주고, 다른 구성원에서는 보여주지 않으며(도 13a), 이는 이와 연관된 잠재적인 항암제 역할의 영향과 함께 ADI에 의해 CARD 도메인의 보강을 보여준다.

CARD(아미노산 75-225)의 구조적 특징을 갖는 녹농균 ADI로부터의 영역을 플라스미드 pET-SUMO로부터의 SUMO 부분을 갖는 뼈대에 복제하였고, 이는 SUMO-CARD 융합 단백질이 생기게 한다. 이런 융합 단백질을 Ni-NTA 컬럼을 사용하여 정제했고, CARD 폴리펩타이드를 동종의 17 kDA 단백질로 단리했다(도 13b). 이후에, 녹농균 ADI N-말단 CARD 도메인뿐만 아니라 녹농균으로부터의 ADI(Pa-ADI, 46 kDA, 도 13b)로부터 유래되기 때문에 Pa-CARD라고 불리는 단백질의 활성을 고형 종양 세포주, 섬유육종 HT-1080, 유방암 MCF-7 및 백혈병 세포주 HL-60을 사용하여 알아냈다.

Pa-CARD는 HT-1080, MCF-7 및 백혈병 HL60 뿐만 아니라 다른 암에 대하여 현저한 세포독성 활성을 가졌지만, 정상 섬유아세포 및 MCF-10A와 같은 정상 유방 세포에서는 적은 세포독성을 가졌다(데이터 미도시). 마이코플라스마 아르기니니 ADI는 세포 주기 정지를 유도함으로써 인간 백혈병 세포 증식을 억제한다고 보고되었고, 암세포에서 세포 주기 정지를 유도하는 Pa-CARD의 능력도 측정되었다. Laz 및 아주린에서 이미 보고된 바와 같이(도 11), Pa-CARD는 세포 주기의 현저한 정지를 보여주었다(데이터 미도시). Laz와 유사하게, Pa-CARD는 K562의 핵 분획에서 Wee1 단백질 수준을 향상시켰지만, HL60 세포에서 이러한 활성을 보여주지 않았다(도 12). 반면에, HL60 세포의 핵 분획에서, 그리고 K562 및 HL60의 세포질 분획에서, Pa-CARD는 AKT-P-S473 수준을 현저히 감소시켰으며(도 12), 이는 HL60 세포에서 Pa-CARD에 의한 세포 주기 정지의 초기 모드가 AKT의 473 세린 인산화의 감소를 통해 매개될 수도 있다는 것을 시사하는 반면에, AKT의 세포질 473 세린 인산화가 어느 정도 영향을 미침에도 불구하고, K562 세포에서 이러한 효과는 핵 Wee1 단백질 수준의 향상을 통해 최초 매개된다. Laz 이러한 효과를 매개하는 Pa-CARD 처럼 보이며(K562에서 핵 Wee1의 향상 및 HL60 세포에서 세포질 AKT-S473의 감소), 이는 공통의 작용 방식을 시사한다.

난소암 연구를 위한 물질 및 방법

화학물질, 시약 및 세포 배양: MTT(3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움브로마이드) 및 프로피디움 아이오다이드를 Sigma로부터 구입했다. 기염색된 겔을 Biorad로부터 얻었다. pET SUMO 키트 및 SUMO 단백질 분해효소를 Invitron으로부터 구입했다. 인간 암 및 정상 세포주 SK-OV3, HOSE6-3, MCF-7 및HT1080 세포 모두는 시카고에 있는 일리노이주 대학(UIC)의 외과종양학부의 보존 배양 무리로부터 얻었다. 세포를 2 mM L-글루타민, 0.1 mM MEM 필수 아미노산을 함유하는 이글스 염과 함께 MEM에서 배양했고, 10 %의 열-비활성 소태아혈청, 100 단위/ml 페니실린 및 100 μg/ml의 스트렙토마이신을 세포에 공급했다. 37 ℃, 5 % CO₂에서 세포를 성장시켰다.

복제, 발현 및 단백질의 정제: 본 명세서의 실시예 8에서 설명된 바와 같이 수행되었다.

MTT -세포독성 측정: 암세포에 대한 세포독성을 알아내기 위하여, 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일-2,5-디페닐)테트라졸리움 브로마이드(MTT) 측정을 실시예 8에서 설명된 바와 같이 수행했다.

카스파아제 -3/7 활성 측정: 문헌[Yamada, T. 등. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 2002, 99, 14098-14103]에서 설명되는 바와 같이 카스파아제-Glo 3/7(Promega) 시약을 사용하여 96-웰 플레이트에서 시험을 수행했다.

유세포분석기에 의한 세포 주기 정지: SKOV3 세포를 웰 당 2 ml 부피 중 웰 당 10⁶ 세포를 6개 웰 플레이트에 심었다. 세포 펠릿(>1 x 10⁶ 세포)를 채취했고, 1 ml의 70 % 에탄올로 4 ℃에서 60분 동안 고정했고, 1 ml의 PBS로 세척하고, 0.5 mg의 RNA 분해효소 A(Sigma)를 함유하는 400 □L의 PBS에 재현탁했다. 온화한 혼합후에, 100 μL의 부분 표본 프로피디움 아이오다이드(1 g/L PBS)(Sigma)를 첨가했다. 세포를 어둠속 실온에서 15분 동안 배양한 후에 유세포분석을 위해 4 ℃에서 어둠속에 두었다. 각각의 시료에 대하여, 적어도 1 x 104 세포를 Becton-Dickinson FACS Calibur 유세포 분석기를 사용하여 DNA 함량을 분석했다. 서브-G1, G1, S 및 G2-M에서 세포의 분포를 Multi Cycle AV 소프트웨어를 사용하여 알아냈다.

TLR 경로 및 NF - kB 신호전달 유전자의 마이크로어레이: SKOV3 세포(웰 당 2 ml 부티 중의 웰 당 100,000 세포)를 6 웰 플레이트에 심었다. 이어서 단백질로 처리하고, 세포를 용해 완충액으로 채취했다. 시료를 톨(toll) 유사 수용체 유전자 및 NK-kB 신호전달 유전자의 마이크로어레이를 위하여 Superarray Biosciences로 보냈다.

TUNEL 측정: 이 기술은 문헌[Yamada, T. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 2002, 99, 14098-14103]에서 설명되는 바와 같이 말단 디옥시뉴클레오티딜 전이효소를 사용하여 DNA 단편의 3' 말단에서 형광성-dUTP를 포함함으로써 단편화된 DNA를 함유하는 핵을 식별한다.

ADI 는 추정 CARD -유사 도메인을 갖는다

2차 구조 비교는 Pa-ADI와 Ma-ADI 간에 27 % 서열 동일성을 보여주었다. MolMol 프로그램 및 VAST 알고리즘을 사용하여, 구조적 배열은 Pa-ADI 및 Ma-ADI에서 추정 CARD-유사 도메인 및 촉매 도메인 모두의 존재를 명백히 보여준다(도 14a 및 14b). Pa-ADI 및 Ma-ADI 둘 모두는 디메틸아르기닌 디메틸아미노가수분해효소(DDAH) 및 아르기닌:글리신 아미디노전이효소(AGAT) 단백질을 구성원으로 하는 구아닌-변형 효소 상과의 모든 단백질에 존재하는 5개의 ββαβ-서브유닛을 특징으로 한다(도 14b). 반면에, DDAH 및 AGAT와 다르게, Pa-ADI 및 Ma-ADI 둘 모두는 전형적인 "클립-온-팬(Clip-on-fan)"을 제공하는 제 1 및 제 2 ββαβ-서브유닛 사이에 정확히 삽입된 독특한 85개의 잔기인 5-알파 나선 번들(bundle) 도메인을 갖는다(도 14b 및 14c). 이 영역은 포유류 CARD-함유 단백질과 유사한 구조를 나타내는 영역이다. CARD-유사 도메인이 Pa-ADI 및 Ma-ADI에 만 존재하고 다른 구성원에는 존재하지 않기 때문에(도 14b), 다른 과의 구성원에 의하지 않고 ADI에 의한 CARD 도메인의 보강은 ADI의 독특한 항암 성질을 제공할 것으로 예상된다.

Pa - CARD 는 항암 활성을 갖는다

포유류 단백질을 함유하는 CARD는 헬리카아제, 키나아제 및 카스파아제 활성과 같은 다양한 기능을 가진다. CARD 도메인 자체는 CARD-CARD 상호작용을 통해 더 큰 단백질 복합체로 형성을 매개하는 것을 제외하고 어떤 다른 활성을 가지지 않는다고 알려져 있다. 가령, 세균이 이의 생존과 증식을 위한 원천과 동일한 신체 내의 영양에 대하여 암세포와 경쟁하는 것으로 가정하면, 아마도 세포 성장에 개입하기 위하여, 세균은 포유류의 원천으로부터 CARD 도메인을 얻는 것이 가능할 것이다. 이러한 가설을 조사하기 위하여, Pa-ADI(아미노산 75-255)로부터의 소수성 포켓을 갖는 추정 CARD 도메인을 복제했고 정제했고, 항암제로서의 기능뿐만 아니라 임의의 잠재적인 ADI-유사 활성에 대하여 조사했다. 아미노산 75-255 뿐만 아니라 전체 길이 ADI 단백질을 포함하는 Pa-ADI의 유전자 서열은 플라스미드 pET-SUMO(Invitrogen)로부터의 SUMO 부분을 뼈대로 복제했으며, 이는 실시예 8에서 설명되는 바와 같이 SUMOCARD 융합 및 SUMO-ADI 단백질이 생기게 한다. 이러한 재조합 단백질을 Ni-NTA 컬럼을 사용하여 한번에 정제했으며, 이후에 SUMO 단백질 가수분해 효소로 쪼갰다. 이러한 두 개의 세균 단백질의 동종성 및 SDS-PAGE 이주 패턴은 도 15a에서 보여진다. 예상과 같이, 정제된 Pa-ADI는 Mw 46kDa의 단일 밴드로 이주한 반면에, Pa-CARD는 17 kDa 단백질로 이주했다.

이러한 두 개의 단백질의 아르기닌 디이미나아제 활성을 다음으로 알아냈다. 예상과 같이, Pa-ADI는 강력한 효소 활성을 보인 반면에, Pa-ADI의 촉매 삼합체 중 중요한 아미노산인 Cys-406 및 His-278가 없기 때문에 Pa-CARD는 이러한 활성을 갖지 않았다(도 15b). 마이코플라스마 아르기니니 ADI(Ma-ADI)는 항암 활성의 존재가 Pa-ADI 또는 Pa-CARD에서 평가되지 않았음에도 불구하고 항암 활성을 가진다고 알려져 있다. Pa-ADI 및 Pa-CARD의 성장 억제 활성을 섬유육종 HT-1080, 유방암 MCF-7 및 난소암 SKOV-3과 같은 인간 암세포에 대하여 확인했다(도 16a). Pa-ADI 및 Pa-CARD 둘 모두는 모든 암세포 유형에 대하여 현저한 억제 활성을 보였다. 가장 흥미로운 것은, Pa-CARD가 이러한 암세포에 대하여 Pa-ADI보다 더 높은 성장 억제 활성을 가진다는 것이다(도 16a). Pa-ADI 및 Pa-CARD가 난소암 SKOV-3 세포에 대하여 어느 정도 높은 활성을 보였기 때문에, Pa-CARD(도 16b) 및 Pa-ADI(도 16c)의 다양한 농도에서의 세포독성을 이러한 세포에서 배양시간에 따른 기능을 알아냈다. 세포독성 활성은 24시간의 배양 동안에 명백했고, 활성은 48시간의 배양 동안에 높은 농도로(10 내지 20 μM) 현저히 증가했다. 또한, Pa-CARD는 농도 시간 의존 방식에서 Pa-ADI에 비해 더 높은 세포독성을 보였다.

Pa - CARD 는 정상 세포에 대하여 매우 작은 억제 효과를 보였다

난소암 SKOV-3 및정상 난소 HOSE6-3 세포 둘 모두에 대하여 Pa-ADI 및 Pa-CARD의 20 μM 농도에서 세포독성을 조사했다. 아주린이 다양한 암에 대하여 항암 효과를 가지지만 정상 세포에는 진입할 수 없고 정상 세포에 대하여 적은 세포독성을 보여주기 때문에, 20 μM의 아주린을 본 연구에서 대조군으로서 첨가했다. 항암제로 알려진 '시스플라틴'(cis-디아민디클로로플라티늄(II); CDDP)를 양성 대조군으로 사용했다. HOSE6-3 정상 난소 및 SKOV-3 난소암 세포에 대하여 이러한 물질의 세포독성은 도 17a에서 보여진다. Pa-ADI 및 Pa-CARD 둘 모두는 SKOV-3에 대하여 현저한 세포독성을 가지지만, 정상 난소 세포에 대하여는 매우 적은 세포독성을 가진다. 또한, 아주린은 유사한 세포 죽음 프로파일을 보였다. Pa-CARD 및 아주린은 정상 HOSE6-3에 대하여, 흔히 사용되는 약물인 시스플라틴 보다 적은 세포독성을 보였다. 나아가, Pa-CARD 및 시스플라틴으로 처리된 SKOV-3 세포는 이들을 각각 처리했을 때보다 어느 정도 더 높은 세포독성 효과를 보이며(도 17b), 일부 부가적인 효과를 보인다.

Pa - CARD 는 카스파아제 활성을 통해 암세포에서 세포사멸을 유도한다

Pa-CARD에 의해 유도되는 세포 죽음의 본질을 알아내기 위하여, 그리고 아주린 및 Laz와 같은 다른 세균 단백질이 카스파아제 활성을 통해 암세포에서 세포사멸을 유도하는 것으로 알려져 있기 때문에, 난소암 SKOV-3 및 정상 난소 HOSE6-3 세포 모두에서 Pa-CARD, Pa-ADI 및 아주린에 의한 세포사멸의 유도 정도를 Cell Death Detection Fluorescein Kit(Roche)를 당소에서 사용하여 TUNEL 측정에 의해 알아냈다. SKOV-3 또는 HOSE6-3 세포를 DNA 분해효소 I로 처리했으며, 필수적으로 모든 세포는 녹색으로 형광을 냈다(양성 대조군, 도 18). SKOV-3 세포 및 HOSE6-3 세포 모두를 10 μM의 Pa-CARD, Pa-ADI 및 아주린으로 처리하는 경우에, 향상된 세포사멸은 SKOV-3 세포에서 선택적으로 분명히 보였다. 또한, SKOV-3 세포를 PaCARD로 처리하는 경우에 Pa-ADI 및 아주린으로 처리하는 경우에 비해 세포사멸의 최고 퍼센트를 관찰했다. 세포사멸 세포는 이들의 부착 성질을 위태롭게 하는 경향이 있기 때문에, 소수의 세포는 보다 높은 퍼센트의 세포사멸 세포가 미끄러져 보여진다(도 18). HOSE-6-3 세포는 모든 조건 하에서 오직 소수의 세포만 형광 녹색을 띠었으며(도 18), 이는 Pa-CARD가 주로 암세포에서 세포사멸 세포의 죽음을 유도하고 정상세포에서는 유도하지 않는다는 것을 확인해준다. 소혈청알부민(BSA)으로 처리하거나 단백질로 처리하지 않은 것은(대조군) 세포에서 매우 소수의 녹색 형광을 띠고 많은 청색(비 세포사멸 세포)을 띠는 세포를 보였으며, 이는 암 또는 정상 세포가 Pa-CARD, PA-ADI 또는 아주린으로 처리하지 않는 한 많은 세포사멸을 자발적으로 겪지 않는다는 것을 보여준다.

Pa-CARD가 카스파아제 3 활성을 통해 난소암 세포에서 세포 죽음을 유도하지만 정상 난소 세포에서는 유도하지 않는지를 알아내기 위하여, SKOV-3 및 HOSE6-3 세포에서 카스파아제 3/카스파아제 7의 수준을 Pa-ADI, Pa-CARD, 시스플라틴 및 아주린의 존재 또는 부존재 하에서 측정했다. 카스파아제 효소 활성을 카스파아제-Glo TM 3/7 측정 키트(Promega)를 사용하여 알아냈다. Pa-ADI 및 PA-CARD를 10 μM 과 20 μM의 두 개의 다른 농도로 사용했다. Pa-ADI 및 Pa-CARD 둘 모두는 투여량 의존 방식으로 카스파아제 3/7 활성을 유도했지만, 이는 오직 난소암 SKOV-3 세포에서만 이었다. 정상 난소 세포 HOSE6-3에서는 매우 적은 활성을 보였다(도 19).

Pa - CARD 는 G2 /M기에서 세포 주기를 억제한다

미코플라스마 아르기니니 ADI(Ma-ADI)는 간세포암의 성장을 억제하고 세포 주기 정지를 유도하고 백혈병 세포에서 세포사멸을 유도한다고 이미 증명되었다. 카스파아제 활성을 통한 세포사멸의 유도는 간암, 백혈병 및 다른 암을 포함하는 암의 G2/M기에서 세포 주기 정지에 의해 매개 된다는 것이 종종 알려진다.

Pa-ADI 및 Pa-CARD로 처리되거나 처리되지 않는 암세포에서 G1, S 및 G2기의 수준을 조사했다. SKOV-3 세포가 10 μM 농도의 Pa-ADI로 24시간 동안 처리되는 경우에, G1기에서 세포는 86.0 %에서 69.1 %로 떨어졌으며, 반면에 S 및 G2기 에서 세포는 7.9 %에서 19.7 %로 그리고 6.1 %에서 11.2 %로 각각 상승했다. 반면에, 유사한 조건 하에서 Pa-CARD로 처리하는 경우에, G1기에서 세포 수준은 86.0 %에서 19.1 %로 떨어졌고, 반면에 S 및 G2기에서 세포 수준은 7.9 %에서 43.5 %로 그리고 6.1 %에서 37.4 %로 각각 상승했으며(데이터 미도시), 이는 Pa-CARD가 G2/M기에서 세포 주기를 크게 억제했다는 것을 명백히 보여준다.

Pa - CARD 는 NF - kB 신호전달 경로 유전자의 발현을 조절한다

SKOV-3 세포에서 Pa-CARD의 효과를 NF-kB 신호전달 경로에서 수반되는 몇몇의 유전자의 발현을 측정함으로써 조사했다. 목표는 Pa-CARD 단백질로 처리한 이후에 SKOV-3 세포의 운명을 결정하는 필수적인 역할을 담당할 수 있는 후보 유전자(candidate gene)를 식별하는 것이었다. 본 연구를 위하여, SKOV-3 세포를 48 시간 동안 Pa-CARD 및 아주린 각각 10 μM과 함께 배양했고, 대조군을 어떤 처리도 하지 않고 배양했다. 정량 실시간 PCR 마이크로어레이를 수행하기 위해 총 RNA를 단리했다. 배수 규제(fold regulation)를 하우스키핑 유전자(housekeeping gene)의 발현으로 정상화(normalizing)하여 계산했다. 대조군 수준의 2배 이상의 차이만 보고된다.

유전자의 발현 프로파일에서 눈에 띄는 관찰은, SKOV-3 세포가 Pa-CARD로 처리되는 경우에 아주린에 비해 톨-유사 수용체(TLRs)를 포함하는 NF-kB 경로의 대부분의 유전자의 전체적인 상향 조절이었다(표 3). 이는 SKOV-3 세포에서 Pa-CARD 포유류 CARD 상호작용 때문이다. 포유류 CARD-함유 단백질은 NK-kB 신호전달 경로를 조절하는 것으로 알려져 있고, Pa-CARD와의 어떠한 상호작용도 관찰되는 것처럼 유전자 발현 프로파일을 변화시킬 것으로 보인다. 다른 한편으로, 아주린은 p53 및 수용체 티로신 키나아제와 단백질-단백질 상호작용을 통해 암세포 성장을 억제하지만, NF-kB 경로의 조절을 통해서는 암세포 성장을 억제하지 않는 것으로 알려져 있다. 따라서, 이러한 두 개의 세균성 항암 단백질은 두 가지의 다른 작용 방식을 가진다.

SKOV-3 세포에서 PA-CARD에 의한 유전자의 가장 현저한 상향 조절은 과립대식세포집락자극인자수용체(GM-CSF)로도 알려진, 집락자극인자 CSF2를 암호화하는 유전자의 발현에서 55배의 증가를 수반한다. 또한, IL-12 유전자의 발현은 이러한 조건 하에서 약 3배 정도 촉진된다(표 3). 웨스턴 블롯팅 데이터(미도시)는 이러한 조건 하에서 GM-CSF의 과다 생산(약 5배)을 확인해 주었다. GM-CSF가 아마도 세포로부터 나오는 분비가능한 단백질이기 때문에 그 수준은 55배 증가보다 작았다. Pa-CARD 처리 과정에서 상향조절되는 발현의 다른 시토킨은 IL-2, IL-8, IL-10, IL-1 알파 및 IL-1 베타이다(표 3).

표 3. 실시간 PCR 마이크로어레이를 사용하여 톨-유사 수용체( TLR ) 및 NF - kB 경로 유전자의 mRNA 수준의 측정

SKOV-3 세포를 48시간 동안 CARD 및 아주린 각각 10 μM과 함께 배양했다. 대조군으로서, 하나의 SKOV-3 세포 표본을 처리하지 않았다. 배양 후에, 세포를 채취하였고, 총 RNA를 추출했다. 표본을 실시간 PCR 마이크로어레이 분석(Superarray Bioscience)을 사용하여 분석했다. 결과를 하우스키핑 유전자에 대하여 정상화했다. 두꺼운 글씨체의 값은 배수 증가 통제를 나타내고 *로 표시된 숫자는 처리되지 않은 대조군 표본에 대하여 하향 조절된 것을 나타낸다. 감소된 발현은 마이너스 표시로 나타낸다.

유전자 기호	배수 증가 또는 감소 통제
	CARD /대조군	아주린 /대조군
NF - Kb 경로 - 배수 통제
CSF2	55.72	9.19
CSF3	2.46	1.07
IFNβ1	2.30	-2.30*
IFNγ	2.46	1.07
IL10	2.46	1.07
IL12α	2.83	2.00
IL1α	10.56	-1.62
IL1β	25.99	2.14
IL2	2.46	1.07
IL8	3.25	1.87
NF-κB2	5.28	1.07
NF-κBIL1	5.66	-1.15
CCL2	-17.15*	-2.00
MAP3K1	-2.14*	-1.00
MAP4K4	6.06	1.74
RELA	2.30	-1.32
TNFRSF1A	2.46	1.15
톨-유사 수용체, 어댑터 & TLR 상호작용 단백질-배수 통제
TLR1	2.14	-1.07
TLR10	2.46	1.07
TLR3	4.92*	-1.07
TLR6	6.06	1.74
TLR7	2.46	1.07
TLR8	2.46	1.07
TLR9	3.25	1.07
LY86	-2.14*	-4.92*
TICAM2	2.64	-1.15
BTK	2.46	1.07
CD14	4.00	1.52
HSPA1A	2.64	1.32
TLR 반응기-배수 통제
EIF2AK2	1.23	1.07
IRAK1	2.64	-1.32
IRAK2	2.83	1.23
PPARA	3.73	-2.00
UBE2V1	-3.48*	-1.00
MAP3K7IP1	2.14	-1.15

SEQUENCE LISTING <110> CDG THERAPEUTICS, INC. <120> COMPOSITIONS AND METHODS TO PREVENT AND/OR TREAT CANCER WITH PA-CARD <130> 14PR-153232-148485 <140> PCT/US10/024904 <141> 2010-02-22 <150> 61/179,435 <151> 2009-05-19 <150> 61/154,236 <151> 2009-02-20 <160> 29 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1140 <212> DNA <213> Neisseria gonorrhoeae <400> 1 ctggcaggct tgacgcttcg atacgctctg tttcggtcag gctggtcccg aaaccggaaa 60 aaccgccgaa aaccaatacc ctgcatttga gtaaggctgc gctggagagt ttcggttcgg 120 cggcggcaaa gttggaaaaa cggcatcccg aattggcgga ggcattggca aacttggtta 180 gaaggcatgg cgcataaaat gtatacggga atttgtgtaa acatccgtta atattaagaa 240 gtaaaggata atgggtctaa tactaaagaa ataggttcgg ggtaaaattg ccccttttaa 300 agtaaacgat tgtaaacttg cagacaggct ttgatttcaa atgaaatttg tagcaaaatg 360 ccgccccgaa acatctgttt gtgcaacgcg gcggaatctt tttcaaggtt ttgttaatgg 420 cggttgcact ttgatttctg taaaaccgaa tattatttta tcgattggag atttaccatg 480 aaagcttatc tggctctgat ttctgccgcc gttatcggtt tggctgcctg ctctcaagaa 540 cctgccgcgc ctgctgccga ggcaactcct gctgctgaag cacccgcttc cgaagcgcct 600 gccgccgaag ctgctcctgc agatgctgcc gaagcccctg ctgccggcaa ttgtgcggca 660 actgtcgaat ccaacgacaa tatgcagttc aacaccaaag acatccaagt cagcaaagca 720 tgtaaagagt ttaccatcac tctgaaacat accggtacgc aacccaaagc cagcatgggt 780 cacaaccttg tgattgccaa agctgaagac atggacggcg tatttaaaga cggcgtaggt 840 gctgccgata ccgactatgt caaacctgac gatgcgcgcg ttgttgccca caccaaactg 900 atcggcggcg gcgaagagtc ttccctgact ctggatcctg ccaaattggc tgacggcgac 960 tacaaatttg cctgcacttt cccgggtcac ggtgctttga tgaacggcaa agtgactttg 1020 gtcgattaat ccgcttaaag tctcaaaaga cggacagcct gctttgtgca ggctgtttta 1080 ttataaaatg actgcttgaa aagtgccccg ttgagaacga aaacatgaat ccgtttgaaa 1140 <210> 2 <211> 540 <212> DNA <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 2 ctttttcatg cagcggatcg ctcgcgcatc acttcagggt cagggtgccc ttcatcagcg 60 cggagtggcc cgggaaggtg cagaagaaca tgtactgctc gccttccttc agcttggaga 120 cgtcgaaggt caccgagtcc ttctcgcccg agccgatcag cttggtgtgg gcgatgacac 180 ggctgtcgtc gggcttcagg taatccttgt ccaggccgga agccatgccg tcggtgacca 240 cgccctgcat gtcggcggcg gtgctcagta cccagttgtg gcccatgacg ttcttcggca 300 ggttgccggg gtgggacagg ttgacggtga actgcttgca gctcttgtcg acggtgatgg 360 cattggtgtt gaactgcatc tggtcgttac cctggatgtc caccgagcac tcggcagcca 420 gcagtggcgc actgagcagg gacagcaggg ataccgcagc gagtttacgt agcatggagc 480 agcctcctag gcaggttggg cgatgaatcc tgaaagagca gactgcccga tcgggcaccg 540 <210> 3 <211> 117 <212> DNA <213> Neisseria gonorrhoeae <400> 3 tgctctcaag aacctgccgc gcctgctgcc gaggcaactc ctgccggtga agcacccgct 60 tccgaagcgc ctgccgccga agctgctcct gcagatgctg ccgaagcccc tgctgcc 117 <210> 4 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 4 ccggaattcc ggcagggatg ttgtaaatat ccg 33 <210> 5 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 5 ggggtaccgc cgtggcaggc atacagcatt tcaatcgg 38 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 6 ggcagcaggg gcttcggcag catctgc 27 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 7 ctgcaggtcg actctagagg atcccg 26 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 8 gccgagtgct cggtggacat ccagg 25 <210> 9 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 9 tactcgagtc acttcagggt cagggtg 27 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 10 cttcagggtc agggtgccct tcatc 25 <210> 11 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 11 ctgcaggtcg actctagagg atcccg 26 <210> 12 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 12 tgctctcaag aacctgccgc gcctgc 26 <210> 13 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 13 taggatcctt aggcagcagg ggcttcggca gcatctgc 38 <210> 14 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 14 cgagctcatg tcccctatac taggttattg g 31 <210> 15 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 15 cccaagcttt caggggatcc cacgaccttc gatcagatcc 40 <210> 16 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 16 ggaattcata tgaaagctta tctggc 26 <210> 17 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 17 ccggaattcg gcagcagggg cttcggc 27 <210> 18 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 18 cgggatcccc tgctctcaag aacctgccgc gcc 33 <210> 19 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 19 cggaattctt aggcagcagg ggcttcggca gcatctgcag g 41 <210> 20 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 20 cgagctcatg tcccctatac taggttattg g 31 <210> 21 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 21 ccgctcgagt caggcagcag gggcttcggc ag 32 <210> 22 <211> 166 <212> PRT <213> Neisseria gonorrhoeae <400> 22 Cys Ser Gln Glu Pro Ala Ala Pro Ala Ala Glu Ala Thr Pro Ala Gly 1 5 10 15 Glu Ala Pro Ala Ser Glu Ala Pro Ala Ala Glu Ala Ala Pro Ala Asp 20 25 30 Ala Ala Glu Ala Pro Ala Ala Gly Asn Cys Ala Ala Thr Val Glu Ser 35 40 45 Asn Asp Asn Met Gln Phe Asn Thr Lys Asp Ile Gln Val Ser Lys Ala 50 55 60 Cys Lys Glu Phe Thr Ile Thr Leu Lys His Thr Gly Thr Gln Pro Lys 65 70 75 80 Ala Ser Met Gly His Asn Leu Val Ile Ala Lys Ala Glu Asp Met Asp 85 90 95 Gly Val Phe Lys Asp Gly Val Gly Ala Ala Asp Thr Asp Tyr Val Lys 100 105 110 Pro Asp Asp Ala Arg Val Val Ala His Thr Lys Leu Ile Gly Gly Gly 115 120 125 Glu Glu Ser Ser Leu Thr Leu Asp Pro Ala Lys Leu Ala Asp Gly Asp 130 135 140 Tyr Lys Phe Ala Cys Thr Phe Pro Gly His Gly Ala Leu Met Asn Gly 145 150 155 160 Lys Val Thr Leu Val Asp 165 <210> 23 <211> 128 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 23 Ala Glu Cys Ser Val Asp Ile Gln Gly Asn Asp Gln Met Gln Phe Asn 1 5 10 15 Thr Asn Ala Ile Thr Val Asp Lys Ser Cys Lys Gln Phe Thr Val Asn 20 25 30 Leu Ser His Pro Gly Asn Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Trp 35 40 45 Val Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met 50 55 60 Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp Ser Arg Val 65 70 75 80 Ile Ala His Thr Lys Leu Ile Gly Ser Gly Glu Lys Asp Ser Val Thr 85 90 95 Phe Asp Val Ser Lys Leu Lys Glu Gly Glu Gln Tyr Met Phe Phe Cys 100 105 110 Thr Phe Pro Gly His Ser Ala Leu Met Lys Gly Thr Leu Thr Leu Lys 115 120 125 <210> 24 <211> 39 <212> PRT <213> Neisseria gonorrhoeae <400> 24 Cys Ser Gln Glu Pro Ala Ala Pro Ala Ala Glu Ala Thr Pro Ala Gly 1 5 10 15 Glu Ala Pro Ala Ser Glu Ala Pro Ala Ala Glu Ala Ala Pro Ala Asp 20 25 30 Ala Ala Glu Ala Pro Ala Ala 35 <210> 25 <211> 5 <212> PRT <213> Neisseria gonorrhoeae <400> 25 Ala Ala Glu Ala Pro 1 5 <210> 26 <211> 408 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 26 Met Ser Thr Glu Lys Thr Lys Leu Gly Val His Ser Glu Ala Gly Lys 1 5 10 15 Leu Arg Lys Val Met Val Cys Ser Pro Gly Leu Ala His Gln Arg Leu 20 25 30 Thr Pro Ser Asn Cys Asp Glu Leu Leu Phe Asp Asp Val Ile Trp Val 35 40 45 Asn Gln Ala Lys Arg Asp His Phe Asp Phe Val Thr Lys Met Arg Glu 50 55 60 Arg Gly Ile Asp Val Leu Glu Met His Asn Leu Leu Thr Glu Thr Ile 65 70 75 80 Gln Asn Pro Glu Ala Leu Lys Trp Ile Leu Asp Arg Lys Ile Thr Ala 85 90 95 Asp Ser Val Gly Leu Gly Leu Thr Ser Glu Leu Arg Ser Trp Leu Glu 100 105 110 Ser Leu Glu Pro Arg Lys Leu Ala Glu Tyr Leu Ile Gly Gly Val Ala 115 120 125 Ala Asp Asp Leu Pro Ala Ser Glu Gly Ala Asn Ile Leu Lys Met Tyr 130 135 140 Arg Glu Tyr Leu Gly His Ser Ser Phe Leu Leu Pro Pro Leu Pro Asn 145 150 155 160 Thr Gln Phe Thr Arg Asp Thr Thr Cys Trp Ile Tyr Gly Gly Val Thr 165 170 175 Leu Asn Pro Met Tyr Trp Pro Ala Arg Arg Gln Glu Thr Leu Leu Thr 180 185 190 Thr Ala Ile Tyr Lys Phe His Pro Glu Phe Ala Asn Ala Glu Phe Glu 195 200 205 Ile Trp Tyr Gly Asp Pro Asp Lys Asp His Gly Ser Ser Thr Leu Glu 210 215 220 Gly Gly Asp Val Met Pro Ile Gly Asn Gly Val Val Leu Ile Gly Met 225 230 235 240 Gly Glu Arg Ser Ser Arg Gln Ala Ile Gly Gln Val Ala Gln Ser Leu 245 250 255 Phe Ala Lys Gly Ala Ala Glu Arg Val Ile Val Ala Gly Leu Pro Lys 260 265 270 Ser Arg Ala Ala Met His Leu Asp Thr Val Phe Ser Phe Cys Asp Arg 275 280 285 Asp Leu Ile Val Pro Phe Ser Leu Arg Pro Asp Pro Ser Ser Pro Tyr 290 295 300 Gly Met Asn Ile Arg Arg Glu Glu Lys Thr Phe Leu Glu Val Val Ala 305 310 315 320 Glu Ser Leu Gly Leu Lys Lys Leu Arg Val Val Glu Thr Gly Gly Asn 325 330 335 Ser Phe Ala Ala Glu Arg Glu Gln Trp Asp Asp Gly Asn Asn Val Val 340 345 350 Cys Leu Glu Pro Gly Val Val Val Gly Tyr Asp Arg Asn Thr Tyr Thr 355 360 365 Asn Thr Leu Leu Arg Lys Ala Gly Val Glu Val Ile Thr Ile Ser Ala 370 375 380 Ser Glu Leu Gly Arg Gly Arg Gly Gly Gly His Cys Met Thr Cys Pro 385 390 395 400 Ile Val Arg Asp Pro Ile Asp Tyr 405 <210> 27 <211> 151 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 27 Leu Leu Thr Glu Thr Ile Gln Asn Pro Glu Ala Leu Lys Trp Ile Leu 1 5 10 15 Asp Arg Lys Ile Thr Ala Asp Ser Val Gly Leu Gly Leu Thr Ser Glu 20 25 30 Leu Arg Ser Trp Leu Glu Ser Leu Glu Pro Arg Lys Leu Ala Glu Tyr 35 40 45 Leu Ile Gly Gly Val Ala Ala Asp Asp Leu Pro Ala Ser Glu Gly Ala 50 55 60 Asn Ile Leu Lys Met Tyr Arg Glu Tyr Leu Gly His Ser Ser Phe Leu 65 70 75 80 Leu Pro Pro Leu Pro Asn Thr Gln Phe Thr Arg Asp Thr Thr Cys Trp 85 90 95 Ile Tyr Gly Gly Val Thr Leu Asn Pro Met Tyr Trp Pro Ala Arg Arg 100 105 110 Gln Glu Thr Leu Leu Thr Thr Ala Ile Tyr Lys Phe His Pro Glu Phe 115 120 125 Ala Asn Ala Glu Phe Glu Ile Trp Tyr Gly Asp Pro Asp Lys Asp His 130 135 140 Gly Ser Ser Thr Leu Glu Gly 145 150 <210> 28 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 28 atgcacaatc tgctgaccga gaccatccag 30 <210> 29 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 29 tcaggtcgag gagccgtggt ccttgtc 27

Claims (47)

1. 카스파아제(caspase) 보강(CARD)-유사 도메인을 포함하는, 암세포를 죽일 수 있는 단리된 펩타이드.
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 단리된 펩타이드는 세균으로부터 유래된 것을 특징으로 하는 단리된 펩타이드.
3. 제 2 항에 있어서,
   상기 세균은 녹농균인 것을 특징으로 하는 단리된 펩타이드.
4. 제 1 항에 있어서,
   상기 단리된 펩타이드는 Pa-CARD인 것을 특징으로 하는 단리된 펩타이드.
5. 제 1 항에 있어서,
   상기 단리된 펩타이드는 서열번호:27을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 펩타이드.
6. 제 5 항에 있어서,
   상기 단리된 펩타이드는 서열번호:27로 구성되는 것을 특징으로 하는 단리된 펩타이드.
7. 제 1 항에 있어서,
   상기 암은 백혈병, 난소암, 섬유육종 및 유방암으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 단리된 펩타이드.
8. 제 1 항에 있어서,
   상기 단리된 펩타이드는 혈류 내 반감기를 연장하거나 최적화하기 위해 화학적으로 변형된 것을 특징으로 하는 단리된 펩타이드.
9. 제 1 항의 단리된 펩타이드, Laz, H8-Azu 및 Azu-H8로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질과 암세포를 접촉하게 함으로써 상기 암세포를 죽이는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제 9 항에 있어서,
    상기 암세포는 백혈병, 섬유육종, 난소암 및 유방암으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제 9 항에 있어서,
    암세포를 죽일 수 있는 하나 이상의 세포독성 물질과 상기 암세포를 접촉시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
12. 제 11 항에 있어서,
    상기 하나 이상의 세포독성 물질은 시스플라틴, Gleevec®, 레티노산, 5'-aza-2'-디옥시시티딘 및 삼산화 비소로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
13. 제 12 항에 있어서,
    상기 하나 이상의 세포독성 물질은 시스플라틴인 것을 특징으로 하는 방법.
14. 제 11 항에 있어서,
    상기 암세포는 하나 이상의 단백질과 거의 동시에 하나 이상의 세포독성 물질과 접촉되는 것을 특징으로 하는 방법.
15. 제 1 항의 단리된 펩타이드, Laz, H8-Azu 및 Azu-H8로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 암으로 고통받는 포유류 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
16. 제 15 항에 있어서,
    상기 암은 백혈병, 섬유육종, 난소암 및 유방암으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
17. 제 15 항에 있어서,
    암세포를 죽일 수 있는 하나 이상의 세포독성 물질을 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
18. 제 17 항에 있어서,
    하나 이상의 세포독성 물질은 시스플라틴, Gleevec®, 레티노산, 5'-aza-2'-디옥시시티딘 및 삼산화 비소로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
19. 제 18 항에 있어서,
    하나 이상의 세포독성 물질은 시스플라틴인 것을 특징으로 하는 방법.
20. 제 17 항에 있어서,
    하나 이상의 세포독성 물질은 하나 이상의 단백질과 거의 동시에 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
21. Laz의 H.8 영역을 포함하는 아주린 및 펩타이드와 백혈병 세포를 접촉시켜서 상기 백혈병 세포를 죽이는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
22. 제 21 항에 있어서,
    백혈병 세포는 Laz의 H.8 영역을 포함하는 아주린 및 펩타이드와 동시에 또는 거의 동시에 접촉되는 것을 특징으로 하는 방법.
23. Laz의 H.8 영역을 포함하는 아주린 및 펩타이드를 백혈병으로 고통받는 포유류 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
24. 제 23 항에 있어서,
    Laz의 H.8 영역을 포함하는 상기 아주린 및 펩타이드는 동시에 또는 거의 동시에 환자에게 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
25. Laz, 아주린, H.8-Azu, Azu-H.8 및 제 1 항의 단리된 펩타이드로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질과 백혈병 세포를 접촉시킴으로써 상기 백혈병 세포에서 세포 분화를 유도하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
26. Laz, 아주린, H.8-Azu, Azu-H.8 및 제 1 항의 단리된 펩타이드로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질과 암세포를 접촉시킴으로써 상기 암세포에 선택적으로 진입하는 단계를 포함하며, 상기 암세포는 백혈병 세포 및 난소암 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
27. Laz, 아주린, H.8-Azu, Azu-H.8 및 제 1 항의 단리된 펩타이드로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질과 암세포를 접촉시킴으로써 상기 암세포에서 세포 주기 정지를 유도하는 단계를 포함하는 방법.
28. 제 27 항에 있어서,
    상기 암세포는 백혈병 세포, 세포육종 세포, 유방암 및 난소암 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
29. 제 27 항에 있어서,
    상기 단백질은 상기 암세포 중의 Wee1 단백질 수준을 증가시키는 것을 특징으로 하는 방법.
30. 제 27 항에 있어서,
    상기 단백질은 인산화된 AKT-Ser-473의 감소를 유발하는 것을 특징으로 하는 방법.
31. 제 27 항에 있어서,
    상기 단백질 모두는 암세포 중의 Wee1 단백질 수준을 증가시키고 인산화된 AKT-Ser-473의 감소를 유발하는 것을 특징으로 하는 방법.
32. 제 1 항의 펩타이드와 암세포의 접촉에 의한 카스파아제 3 활성을 통해 암세포에서 세포 사멸을 유도하는 단계를 포함하는 방법.
33. 제 32 항에 있어서,
    상기 암세포는 난소암 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
34. 제 1 항의 펩타이드와 암세포를 접촉시킴으로써 상기 암세포에서 NF-kB 신호전달 경로 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
35. 제 34 항에 잇어서,
    상기 암세포는 난소암 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
36. 제 1 항의 단리된 펩타이드를 암호화하는 발현 벡터.
37. 제 36 항에 있어서,
    제 4 항의 단리된 펩타이드를 암호화하는 발현 벡터.
38. 제 1 항의 단리된 펩타이드를 포함하는 약학 조성물.
39. 제 38 항에 있어서,
    약학적으로 허용가능한 캐리어를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
40. 제 38 항에 있어서,
    아주린, Laz, H.8-Azu 및 Azu-H.8로 구성된 군으로부터 선택되는 단백질을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
41. 제 38 항에 있어서,
    암세포를 죽일 수 있는 하나 이상의 세포독성 물질을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
42. 제 38 항에 있어서,
    상기 약학적으로 허용가능한 캐리어는 정맥 내 주사에 적절한 것인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
43. 제 38 항의 약학 조성물을 백혈병으로 고통받는 환자에게 치료적 유효량 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
44. 제 43 항에 있어서,
    상기 약학 조성물은 정맥 내, 국부, 피하, 근육 내, 경구로 구성된 군으로부터 선택되는 방식으로 환자에게 투여되고, 종양 안에 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
45. 제 38 항의 약학 조성물을 포함하는 키트.
46. 제 1 항의 단리된 펩타이드를 암호화하는 핵산 분자.
47. 제 4 항의 단리된 펩타이드를 암호화하는 핵산 분자.

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