MX2007014598A

MX2007014598A - Composiciones y metodos para tratar condiciones relacionadas con senalizacion de efrina con cupredoxinas.

Info

Publication number: MX2007014598A
Application number: MX2007014598A
Authority: MX
Inventors: Ananda Chakrabarty; Tohru Yamada; Arsenio Fialho; Tapas Das Gupta; Anita Chaudhari; Yonghua Zhu
Original assignee: Univ Illinois
Priority date: 2005-05-20
Filing date: 2006-05-19
Publication date: 2008-02-07
Also published as: CA2608512A1; WO2007018671A2; AU2006277009A1; IL187138A0; WO2007018671A3; EP1888106A2; KR20080040631A; JP2008539795A; EP1888106A4; NO20076391L; BRPI0612424A2

Abstract

La presente invencion se refiere a composiciones y metodos de uso de cupredoxinas, y variantes, derivados y equivalentes estructurales de cupredoxinas que interfieren con el sistema de senalizacion de efrina en celulas mamiferas. Especificamente, la invencion se refiere a composiciones y metodos que usan cupredoxinas tales como azurina, rusticianina y plastocianina, y variantes, derivados y equivalentes estructurales del mismo, para tratar cancer en mamiferos.

Description

COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA TRATAR CONDICIONES RELACIONADAS CON SEÑALIZACIÓN DE EFRINA CON CUPREDOXINAS SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reivindica prioridad bajo la 35 U.S.C. §§ 119 y 120 para la Solicitud de Patente Provisional de EUA de Serie No. 60/764,749, presentada en febrero 3, 2006, la Solicitud de Patente Provisional de EUA de Serie No. 60/682,812, presentada en Mayo 20, 2005, y la solicitud de Patente de EUA No. 11/244,105, presentada en octubre 6, 2005, la cual reclama prioridad para la Solicitud de Patente Provisional de EUA de Serie No. 60/616,782, presentada en octubre 7, 2004, y para la Solicitud de Patente Provisional de EUA de Serie No. 60/680,500, presentada en mayo 13, 2005, y es una continuación en parte de la Solicitud de Patente de EUA de Serie Número 10/720,603, presentada en noviembre 11, 2003, la cual reivindica prioridad para la Solicitud de Patente Provisional de EUA de Serie No. 60/414,550, presentada en agosto 15, 2003, y la cual es una continuación en parte de la Solicitud de Patente Provisional de EUA de Serie Número 10/047,710, presentada en enero 15, 2002, la cual reivindica prioridad para la Solicitud de Patente Provisional de EUA de Serie No. 60/269,133, presentada en febrero 15, 2001. El contenido completo de estas solicitudes anteriores está incorporado completamente en la presente por referencia.

DECLARACIÓN DE INTERÉS GUBERNAMENTAL La materia objeto de esta invención se ha soportado mediante fondos de investigación de los Institutos Nacionales de Salud (NIH), Bethesda, Maryland, U.S.A., (Números de Fondos AI 16790-21, ES 04050-16, AI 45541, CA09432 and N01-CM97567) . El gobierno puede tener ciertos derechos en esta investigación.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona a cupredoxinas y su uso en funciones celulares que involucran efrinas y receptores de efrina. La invención también se relaciona a métodos de tratamiento de condiciones relacionadas con efrina. Más particularmente, la invención se relaciona al uso de una cupredoxina sustancialmente pura en métodos de crecimiento lento y metástasis de células de cáncer y condiciones patológicas, y específicamente aquellas relacionadas con señalización de efrina/receptor de efrina, además de otros métodos terapéuticos relacionados con señalización de efrina/receptor de efrina. La invención también se relaciona con variantes, derivados y equivalentes estructurales de cupredoxinas que retienen la capacidad de interferir con el sistema de señalización de efrina en células .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los receptores de efrina (receptores Eph) son una familia grande de cinasas de tirosina de receptor que regulan una multitud de procesos en el desarrollo de tejidos adultos mediante el enlace de una familia de ligandos llamados efriñas. Los receptores de Eph se dividen ya sea en el tipo A ó B con ligandos de efrina. Existen actualmente nueve miembros conocidos del tipo A, EphAl-8 y EphAlO, y cuatro miembros conocidos del tipo B, EphBl-4 y EphB6. En general, los receptores clase A preferentemente enlazan ligandos tipo A, mientras que los receptores clase B preferentemente enlazan ligandos tipo B. Los receptores de Eph son similares a otras cinasas de tirosina receptoras, con un dominio de expansión de transmembrana, con una región extracelular glicosilada comprendida de un dominio de enlace de ligando con porciones similares a inmunoglobulina, una región rica en cisteína y dos repeticiones de fibronectina tipo II. (Surawska y colaboradores, Cytokine & Growth Factor Reviews 15:419-433 (2004)). Los ligandos de efrina se dividen en la clase A y B dependiendo de su conservación de secuencia. Los ligandos de Efrin A son glicosilfosfatidilinisotol anclado y usualmente enlazado mediante receptores de tipo Eph-A, mientras que los ligandos de Efrén B contienen un dominio de transmembrana y una región citoplásmica corta y usualmente se enlazan mediante receptores tipo EphB. Id. El proceso de señalización inicia cuando el receptor de Eph se dimeriza con un ligando de efrina, que provoca que el receptor se vuelva fosforilado. Los agregados de complejos de Receptor de Eph de efrina se forman mediante agrupamiento de alto orden. La activación del receptor se cree que depende del grado de multimerización, pero no está limitada a la forma tetramérica conforme la fosforilación de receptor se observa en formas tanto de bajo como de alto orden. Dependiendo del estado de multimerización, los complejos de receptor de Eph distintos pueden inducir efectos biológicos. Además de la señalización hacia adelante" a través del receptor de Eph en las células de expresión del receptor, también existe señalización "hacia atrás" a través de la efrina en la célula que expresa efrina. Por ejemplo, la cola citoplásmica sobre las efrinas B se vuelven fosforiladas llevando a reclutamiento de efectores de señalización y una cascada de transducción de señal con la célula de señalización de efrina. Id. Las efrinas se conocen actualmente para tener roles en muchas interacciones de célula a célula, que incluyen encuentro de la trayectoria de axones, migración de célula neuronal, e interacciones en células endoteliales vasculares y epitelios especializados. (Flanagan & Vanderhaeghen, Annu. Rev. Neurosci. 21:309-345 (1998); Frisen et a-Z., EMBO J. 18:5159-5165 (1999)). Los receptores Eph también han sido implicados en una variedad de procesos patológicos, que incluyen progresión de tumor, formas patológicas de angiogénesis, dolor crónico que sigue al daño de tejido, inhibición de regeneración de nervio después de lesión de médula espinal, y malformaciones congénitas (Koolpe y colaboradores, J Biol Chem. 280:17301-17311 (2005)). Los receptores de Eph también se reportan para jugar un rol en el balance de la renovación de las células troncales contra la determinación y diferenciación del destino celular. Id. El receptor de Eph y la sobreexpresión de efrina pueden resultar en tumorigénesis, y se asocian con angiogénesis y metástasis en muchos tipos de cáncer humano, que incluyen cáncer de pulmón, mama y próstata, además de melanoma y leucemia. (Surawska y colaboradores, Cytokine & Growth Factor Reviews 15:419-433 (2004)). La sobreexpresión del receptor Eph se cree que no afecta la proliferación de células, pero cambia su comportamiento invasivo. De acuerdo con una teoría, en células malignas con niveles altos de EphA2, los receptores se deslocalizan, no pueden enlazar sus ligandos de efrina, y por lo tanto no se fosforilan, lo que resulta en adhesión de matriz extracelular incrementada y potencial metastático más alto. (Ruoslahti, Adv. Cáncer Res. 76:1-20 (1999)). La angiogénesis es la formación de vasos sanguíneos nuevos y capilares de vasculatura ya existente y es un proceso esencial para supervivencia y crecimiento de tumores. La evidencia existe que implica sobre-regulación de receptor Eph/efrina durante la invasión de vasos sanguíneos por tumores. (Surawska y colaboradores, (2004).) Las efrinas de tipo A en particular están asociadas con angiogénesis de tumor, y las proteínas de fusión de EphA2-Fc y EphA3-Fc disminuyeron la densidad vascular del tumor, el volumen del tumor y la proliferación celular, y también incrementaron apoptosis. (Brantley y colaboradores, Oncogenes 21:7011-7026 (2002)). La estructura de cristal del complejo efrinB2 de receptor de EphB2 indica que el autodominio de la topología de plegado de la efrina B2 es un barril de ocho hebras que es una variación en el pliegue del barril ß de clave griega, y comparte homología considerable con la familia de cupredoxina de proteínas que enlazan cobre, a pesar de que la efrina B2 no enlaza cobre. La principal diferencia entre la efrina y las proteínas múltiplos de cupredoxina es la longitud inusual de los circuitos G-HL y C-D de efrina que son parte de la dimerización y tetramerización de interfases de receptor de ligando, respectivamente. Estudios de cristalización además indican que el circuito G-HL está involucrado en enlace de receptor. (Himanen y colaboradores, Nature 414:933-938 (2001)). El dominio extracelular de efrina B2 de ratón también tiene una semejanza topológica con las nodulinas y fitocianinas de plantas. (Toth y colaboradores, Developmental Cell, 1:83-92 (2001)). Los reportes sobre regresión de cáncer en humanos y animales infectados con patógenos microbianos datan de más de 100 años, originándose con el reporte inicial de Coley. (Clin. Orthop. Relat. Res. 262:3-12 (1891)). Varios reportes subsiguientes han demostrado que los patógenos microbianos replican en sitios de tumor bajo condiciones hipóxicas y también estimulan el sistema inmune de los hospederos durante la infección, llevando a una inhibición de progresión de cáncer. (Alexandrof y colaboradores, Lancet 353:1689-1694 (1999); Paglia & Guz an, Cáncer Immunol. Immunother. 46:88-92 (1998); Pawelek y colaboradores, Cáncer Res. 57:4537-4544 (1997)). Los patógenos bacterianos tales como Pseudomonas aeruginosa y muchos otros producen un rango de factores de virulencia que permiten a la bacteria escapar de la defensa del hospedero y provocar la enfermedad. (Tang y colaboradores, Infect. I mun. 64:37-43 (1996); Clark y Bavoil, Methods in Enzymology, vol. 235, Bacterial Pathogenesis, Academic Press, Inc. San Diego Calif. (1994); Salyers y Whitt, Bacterial Pathogenesis: A Molecular Approach, ASM Press, Washington D.C. (1994)). Algunos factores de virulencia inducen apoptosis en células fagocíticas tales como macrófagos para defensa de hospederos trastocados. (Monack y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 94:10385-10390 (1997); Zychlinsky and Sansonetti, J. Clin. Investig. 100:493-495 (1997)). Dos proteínas por óxido-reducción elaboradas mediante P. aeruginosa, la azurina cupredoxina y la citocromo C551 (Cyt C551) , introducen células J774 y muestran actividad citotóxica importante hacia las células de cáncer humanas comparadas con células normales. (Zaborina y colaboradores, Microbiology 146:2521-2530 (2000)). La azurina también puede introducir células UISO-Mel-2 de melanoma humano o MCF-7 de cáncer de mama humano. (Yamada y colaboradores, PNAS 99:14098-14103 (2002); Punj y colaboradores , Oncogene 23:2367-2378 (2004); Yamada y colaboradores, Cell. Biol. 7:14181431 (2005)). Además, la azurina a partir de P. aeruginosa preferentemente entra a las células de sarcoma de célula de retículo de murino J774, forma un complejo y estabiliza la proteína de supresor de tumor p53, mejora la concentración intracelular de p53, e induce apoptosis. (Yamada y colaboradores, Infection and Immunity, 70:7054-7062 (2002)). La azurina también provoca un incremento importante de apoptosis en células de osteosarcoma humano en comparación con células . no cancerosas. (Ye y colaboradores, Ai Zheng 24:298-304 (2003)). El citocromo C551 (Cyt C551) a partir de P. aeruginosa mejora el nivel de proteína supresora de tumor pl6Ink a e inhibe la progresión del ciclo de la célula en células J774. (Hiraoka y colaboradores, PNAS 101:6427-6432 (2004)). Sin embargo, cuando las células de cáncer de colon, tales como las células HCT 116, ó las células H1299 de cáncer de pulmón crecieron en presencia de azurina de tipo silvestre o citocromo C551 tipo silvestre por 3 días, inhibieron el crecimiento de células HCT 116 en una concentración mucho menor (IC50 = 17 µg/ml para azurina; 12 µg/ml para Cyt C) que células H1299 (>20 µg/ml) . Id. Un cáncer es un tumor maligno de crecimiento potencialmente ilimitado. Principalmente es la replicación patogénica (una pérdida de control regulador normal) de varios tipos de células encontradas en el cuerpo humano. El tratamiento inicial de esta enfermedad es a menudo cirugía, tratamiento de radiación o la combinación de este tratamiento, pero la enfermedad recurrente localmente y metastática es frecuente. Los tratamientos quimioterapéuticos para algunos tipos de cáncer están disponibles pero ellos raras veces inducen regresión de tiempo prolongado. De ahí, que a menudo no son curativos. Comúnmente, los tumores y sus metástasis se vuelven refractarios a la quimioterapia, en un evento conocido como el desarrollo de resistencia multifármaco. En muchos casos, los tumores son resistentes inherentemente para algunas clases de agentes quimioterapéuticos. Además, los tratamientos amenazan células no cancerosas, son estresantes para el cuerpo humano, y producen muchos efectos colaterales. Por lo tanto son necesarios los agentes mejorados para prevenir la dispersión de células de cáncer.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con composiciones y métodos de uso de cupredoxinas, y variantes, derivados y equivalentes estructurales de cupredoxinas que interfieren con el sistema de señalización de afrina en células de mamíferos. Específicamente, la invención se relaciona con composiciones y métodos que usan cupredoxinas, tales como azurina y plastocianina, y variantes, derivados y equivalentes estructurales de éstos, para tratar el cáncer en mamíferos. Un aspecto de la invención se relaciona con un péptido aislado que es una variante, derivado o equivalente estructural de una cupredoxina, y que puede inhibir el crecimiento de cáncer en células mamíferas o tejidos. Este péptido puede ser una azurina, plastocianina, pseudoazurina, plastocianina, rusticianina o auracianina, y específicamente una azurina, plastocianina y rusticianina. En algunas modalidades, la cupredoxina es a partir de Pseudomonas aeruginosa, Thiobacillus ferrooxidans , Phormidium laminosum, Alcaligenes faecalis, Achromobacter xylosoxidan, Bordetella bronchiseptica , especies de Methylomonas, Neisseria meningi tídis, Neisseria gonorrhoeae, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas chlororaphis, Xylella fastidiosa, Cucumis sa tivus, Chloroflexus aurantiacus, Vibrio parahaemolyticus o Ulva pertusa , y específicamente Pseudomonas aeruginosa , Thiobacillus ferrooxidans , Phormidium laminosum o Ulva pertusa . El péptido aislado puede ser parte de SEQ ID NOS: 1-17 y 22-23. Adicionalmente, SEQ ID NOS: 1-17 y 22-23 pueden tener por lo menos alrededor de 90% de identidad de secuencia de aminoácidos para el péptido. En algunas modalidades, el péptido aislado puede tener una parte trunca de una cupredoxina. En modalidades específicas, el péptido es más que alrededor de 10 residuos y no más que alrededor de 100 residuos. El péptido puede comprender o, alternativamente, consistir de los residuos de azurina de P. aeruginosa 96-113, los residuos de azurina P. aeruginosa 88-113, los residuos de plastocianina de Ulva pertusa 70-84, los residuos de Ulva pertusa 57-98, o SEQ ID NOS: 22-30. En algunas modalidades el péptido aislado comprende residuos equivalentes de una cupredoxina objetivo como una región de una cupredoxina objeto seleccionada del grupo que consiste de residuos de azurina de P. aeruginosa 96-113, los residuos de azurina P. aeruginosa 88-113, los residuos de plastocianina de Ulva pertusa 70-84, los residuos de Ulva pertusa 57-98, o SEQ ID NOS: 22-30 Otro aspecto de la invención es una composición que comprende por lo menos una cupredoxina o variante, derivado o equivalente estructural de una cupredoxina que puede inhibir el crecimiento de cáncer en células mamíferas o tejidos en una composición. En algunas modalidades, la composición farmacéutica se formula para administración intravenosa. La cupredoxina puede ser a partir de Pseudomonas aeruginosa , Thiobacillus ferrooxidans, Phormidium laminosum, Alcaligenes faecalis, Achromobacter xylosoxidan, Bordetella bronchíseptica, especies de Methylomonas, Neisseria meningi tidis, Neisseria gonorrhoeae, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas chlororaphis, Xylella fastidiosa , Cucumis sa tivus, Chloroflexus aurantiacus, Vibrio parahaemolyticus o Ulva pertusa, y específicamente Pseudomonas aeruginosa, Thiobacillus ferrooxidans , Phormidium laminosum y Ulva pertusa . En algunas modalidades, la cupredoxina puede ser SEQ ID NOS: 1-17 y 22-23. Otro aspecto de la invención es un método para tratar a un paciente mamífero que sufre una condición patológica relacionada con el sistema de señalización de efrina o que sufre de cáncer, que comprende la administración al paciente de una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición que comprende por lo menos una cupredoxina, o variante, derivada o equivalente estructural de una cupredoxina en una composición farmacéutica. En algunas modalidades, el paciente está sufriendo de cistitis intestinal (IC) , lesiones asociadas con enfermedad de intestino inflamatorio (IBD), infecciones de VIH, enfermedad cardiovascular, trastornos del sistema nervioso central, enfermedades vasculares periféricas, enfermedades virales, degeneración del sistema nervioso central (enfermedad de Christopher Reeve) o enfermedad de Alzheimer. En otras modalidades, el paciente está sufriendo de un cáncer, tal como cáncer de mama, cáncer de hígado, cáncer gastrointestinal, neuroblastoma, cáncer neuronal, leucemia, linfoma, cáncer de próstata, cáncer pancreático, cáncer de pulmón, melanoma, cáncer de ovario, tumor del endometrio, coriocarcinoma, teratocarcinoma, cáncer de tiroides, todos los sarcomas que incluyen aquellos crecimientos de tejidos suaves y hueso, carcinomas renales, cáncer epidermoide o cáncer de pulmón de células no pequeñas. En algunas modalidades, el paciente es un humano. Otro aspecto de la invención es una composición que comprende por lo menos dos polipéptidos aislados que son una cupredoxina, o una variante, derivado o equivalente estructural de una cupredoxina puede inhibir el crecimiento de cáncer en células de mamíferos o tejidos. En algunas modalidades, la composición está en una composición farmacéutica. Otro aspecto de la invención es un kit que comprende una composición con por lo menos una cupredoxina, o variante, derivado o equivalente estructural de una cupredoxina en una composición farmacéutica en un frasco. El kit puede ser diseñado para administración intravenosa. Otro aspecto de la invención es un método, que comprende el contacto de las células de cáncer de mamífero con una cupredoxina, o variante, derivado o equivalente estructural de ésta; y medición del crecimiento de las células de cáncer. Las células de cáncer pueden ser de cáncer de mama, cáncer de hígado, cáncer gastrointestinal, neuroblastoma, cáncer neuronal, leucemia, linfoma, cáncer de próstata, cáncer pancreático, cáncer de pulmón, melanoma, cáncer de ovario, tumor del endometrio, coriocarcinoma, teratocarcinoma, cáncer de tiroides, todos los sarcomas que incluyen aquellos que crecen de tejidos suaves y hueso, carcinomas renales, cáncer epidermoide o cáncer de pulmón de células no pequeñas . En algunas modalidades, las células de cáncer están in vivo. Otro aspecto de la invención es un vector de expresión el cual codifica una variante, derivado o equivalente estructural de una cupredoxina la cual puede inhibir el crecimiento de cáncer en células de mamíferos o tejidos. Otro aspecto de la invención es un péptido aislado que es una variante, derivado o equivalente estructural de una cupredoxina; y que puede enlazar un receptor de efrina, tal como EphAl, EphA2, EphA3, EphA4, EphA5, EphA6, EphA7, EphA8, EphAlO, EphBl, EphB2, EphB3, EphB4 y EphB6. En algunas modalidades, el péptido también enlaza una efrina tal como efrina Al, efrina A2, efrina A3, efrina A4, efrina A5, efrina Bl, efrina B2, efrina B3 y efrina B4. En otras modalidades, el péptido aislado enlaza una efrina y su receptor, y específicamente Efrina2B y Eph2B. En un aspecto relacionado, un péptido aislado es una variante, derivado o equivalente estructural de una cupredoxina; y que puede enlazar una efrina, tal como efrina Al, efrina A2, efrina A3, efrina A4, efrina A5, efrina Bl, efrina B2, efrina B3 y efrina B4. Otro aspecto de la invención es un método que comprende la administración de una composición farmacéutica que contiene por lo menos una cupredoxina, o péptido de la invención a un paciente mamífero para guiar el crecimiento de los vasos sanguíneos en el paciente. Otro aspecto de la invención es un método que comprende la administración de una composición farmacéutica que contiene por lo menos una cupredoxina, o péptido de la invención a un paciente mamífero para disminuir el crecimiento de los vasos sanguíneos en el paciente. Otro aspecto de la invención es un método que comprende la administración de una composición farmacéutica que contiene por lo menos una cupredoxina, o péptido de la invención a un paciente mamífero para guiar el crecimiento de neuronas en el paciente. Otro aspecto de la invención es un método que comprende la administración de una composición farmacéutica que contiene por lo menos una cupredoxina, o péptido de la invención a un paciente mamífero para promover la osteogénesis en el paciente. Otro aspecto de la invención es un método que comprende la sustitución de una cantidad efectiva de una composición farmacéutica que contiene por lo menos una cupredoxina, o péptido de la invención a un paciente mamífero para una efrina en un método terapéutico que requiere el uso de efrina. Otro aspecto de la invención es un método que comprende la administración de una composición farmacéutica que contiene por lo menos una cupredoxina, o péptido de la invención a una célula mamífera para inhibir la actividad de un receptor de efrina asociado con la célula. Otro aspecto de la invención es un método que comprende la administración de una composición farmacéutica que contiene por lo menos una cupredoxina, o péptido de la invención para incrementar la actividad de un receptor de efrina asociado con la célula. Otro aspecto de la invención es un método que comprende la administración a un paciente humano que tiene un tejido que expresa un receptor de efrina, una composición farmacéutica que contiene por lo menos una cupredoxina, o péptido de la invención la cual comprende un derivado de cupredoxina, o una variante, derivado o equivalente estructural fusionada a un agente farmacéutico. En algunas modalidades, los tejidos que expresan un receptor de efrina es cáncer. Otro aspecto de la invención es un método para detectar tejidos con receptores de efrina los cuales tiene los pasos de administración a un paciente humano de una composición farmacéutica que contiene por lo menos una cupredoxina, o péptido de la invención fusionada a una sonda detectable y que detecta la distribución de la sonda dentro del paciente.

Estos y otros aspectos, ventajas, y características de la invención se volverán palpables a partir de las siguientes figuras y descripción detallada de las modalidades específicas .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS SECUENCIAS SEQ ID NO: 1. Secuencia de aminoácidos de azurina a partir de Pseudomonas aeruginosa . SEQ ID NO: 2. Secuencia de aminoácidos de plastocianina a partir de Phormidium laminosum . SEQ ID NO: 3. Secuencia de aminoácidos de rusticianina a partir de Thiobacillus ferrooxidans .

SEQ ID NO: 4. Secuencia de aminoácidos de pseudoazurina a partir de Achromobacter cycloclastes . SEQ ID NO: 5. Secuencia de aminoácidos de azurina a partir de Alcaligenes faecalis . SEQ ID NO: 6. Secuencia de aminoácidos de azurina a partir de Achromobacter xylosoxidans especies deni trificans I. SEQ ID NO: 7. Secuencia de aminoácidos de azurina a partir de Bordetella bronchiseptica . SEQ ID NO: 8. Secuencia de aminoácidos de azurina a partir de Methylomonas especie J. SEQ ID NO: 9. Secuencia de aminoácidos de azurina a partir de Neisseria meningi tidis Z2491 . SEQ ID NO: 10. Secuencia de aminoácidos de azurina a partir de Neisseria gonorrhoeae. SEQ ID NO: 11. Secuencia de aminoácidos de azurina a partir de Pseudomonas fluorescens . SEQ ID NO: 12. Secuencia de aminoácidos de azurina a partir de Pseudomonas chlororaphis . SEQ ID NO: 13. Secuencia de aminoácidos de azurina a partir de Xylella fastidiosa 9a5c. SEQ ID NO: 14. Secuencia de aminoácidos de estelacianina a partir de Cucumis sativus . SEQ ID NO: 15. Secuencia de aminoácidos de auracianina A a partir de Chloroflexus aurantiacus .

SEQ ID NO: 16. Secuencia de aminoácidos de auracianina B a partir de Chloroflexus aurantiacus . SEQ ID NO: 17. Secuencia de aminoácidos de proteína básica de pepino a partir de Cucumís sa tivus. SEQ ID NO: 18. Secuencia de aminoácidos de péptido de azurina de 18-mero, azurina de Pseudomonas aeruginosa a partir de los residuos 96-113. SEQ ID NO: 19. Secuencia de aminoácidos de azurina Pseudomonas aeruginosa a partir de residuos 88-113. SEQ ID NO: 20. Secuencia de aminoácidos de plastocianina de Ulva pertusa a partir de residuos 70-84. SEQ ID NO: 21. Secuencia de aminoácidos de azurina de Vijbrio parahaemolyticus . SEQ ID NO: 22. Secuencia de aminoácidos de plastocianina de Ulva pertusa . SEQ ID NO: 23. Secuencia de aminoácidos de ectodominio de EfrinaB2 a partir de humano. SEQ ID NO: 24. Secuencia de aminoácidos de región de rizo G-H de EfrinaB2 humano. SEQ ID NO: 25. Secuencia de aminoácidos de la región de azurina P. aeruginosa estructuralmente análoga a la región de rizo G-H de EfrinaB2. SEQ ID NO: 26. Secuencia de aminoácidos de la región de rusticianina de Thiobacillus (Acidithiobacillus) ferrooxidans estructuralmente análoga a la región de rizo G-H de EfrinaB2.

SEQ ID NO: 27. Secuencia de aminoácidos de la región de auracianina B de Chloroflexus aurantiacus estructuralmente análoga a la región de rizo G-H de EfrinaB2. SEQ ID NO: 28. Secuencia de aminoácidos de la región de plastocianina de Ulva pertusa estructuralmente análoga a la región de rizo G-H de EfrinaB2. SEQ ID NO: 29. Secuencia de aminoácidos de la región de proteína básica de pepino de Cucumis sativus estructuralmente análoga a la región de G-H de EfrinaB2. SEQ ID NO: 30. Secuencia de aminoácidos de la región de estelacianina de Cucumis sa tivus estructuralmente análoga a la región de rizo G-H de EfrinaB2. SEQ ID NO: 31. Secuencia de aminoácidos de residuos 69-138 de EfrinaB2 humano. SEQ ID NO: 32. Secuencia de aminoácidos de residuos 57-98 de plastocianina de Ulva pertusa . SEQ ID NO: 33. Secuencia de aminoácidos de residuos 68-138 de EfrinaB2 humano. SEQ ID NO: 34. Secuencia de aminoácidos de residuos 76-728 de azurina de P. aeruginosa azurina.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1. La Figura 1 representa una alineación estructural de azurina con efrinaB2. El circuito G-H de efrina B-2 (región que media interacción de alta afinidad con los receptores EphB) se indica por cuadros. 1JAG_A es la Secuencia de aminoácidos de azurina de Pseudomonas aeruginosa (SEQ ID NO: 1) . La 1KGY_E es la Secuencia de aminoácidos de ectodominio de efrinaB2 de humano (SEQ ID NO: 23) . Figura 2. La Figura 2 representa una alineación estructural de cupredoxinas con efrinaB2. El cuadro indica el rizo G-H de efrinaB2 (15aa), involucrado en enlace de receptor de Eph. Los residuos conservados se indican en oscuro y subrayados. Las letras mayúsculas son superposiciones. Los punteados están donde no existen alineaciones. La región de rizo G-H de EfrinaB2 es SEQ ID NO: 24. La región de azurina de P. aeruginosa estructuralmente análoga a la región de rizo de G-H de EfrinaB2 es SEQ ID NO: 25. La región de rusticianina de Thiobacillus (Acidi thiobacillus) ferrooxidans estructuralmente análoga a la región de rizo de G-H EfrinaB2 es SEQ ID NO: 26. La región de auracianina de Chloroflexus aurantiacus estructuralmente análoga a la región de rizo de G-H de EfrinaB2 es SEQ ID NO: 27. La región de plastocianina de Phormidi um laminosum estructuralmente análoga a la región de rizo de G-H de EfrinaB2 es SEQ ID NO: 28. La región de proteína básica de pepino de Cucumis sa tivus estructuralmente análoga a la región de rizo de G-H de EfrinaB2 es SEQ ID NO: 29. La región de estelacianina de Cucumis sativus estructuralmente análoga a la región de rizo de G-H de EfrinaB2 es SEQ ID NO: 30. Figura 3. La Figura 3 representa una comparación entre las estructuras del ectodominio efrinaB2 de humano (lkgy E) , plastocianina de Ulva pertusa (liuz), azurina de Pseudomonas aeruginosa (ljzg_A) y rusticianina de Thiobacillus (Acidi thiobacillus) ferrooxidans (lrcy) . En la Fig. 3A, la topología de cada proteína se muestra usando los dibujos TOPS. Los dibujos TOPS representan la estructura como una secuencia de elementos de estructura secundaria (SSEs) : hebras ß (representados como triángulos y las hélices (alfa y 310) (representados como círculos) , como están conectados en una secuencia de amino para terminación carboxilo, y sus posiciones y orientaciones espaciales relativas. La dirección de los elementos puede ser deducida a partir de las líneas de conexión. Las hebras "hacia arriba" están indicadas mediante triángulos que señalan hacia arriba y hebras "Descendentes" mediante triángulos que señalan hacia abajo. En la Fig. 3B, las fotografías fueron dibujadas usando el programa MolMol (Koradi y colaboradores, J. Mol. Graphics 14:51-55 (1996)). Figura 4. La Figura 4 representa unos sensogramas de resonancia de plasmón de superficie para la asociación de cupredoxinas con límite de Eph-Fc. Se representa el enlace selectivo de azurina (Fig. 4A) , plastocianina (Fig. 4B) , y rusticianina (Fig. 4C) con proteínas EphA-Fc y EphB-Fc. Figura 5. La Figura 5 detalla una representación esquemática de varios constructores de azurina truncados derivados de la azurina de longitud completa (SEQ ID N0:1). Los elementos de estructura secundaria se ilustran como flechas para láminas ß y hélices (alfa y 310) como rectángulos. Varios segmentos del gen que codifica la azurina de aminoácido 128 fueron fusionados en la terminación 3' del gen gst (que codifica transferasa de glutationa S) en estructura, clonado en E. coli, hiperexpresado y las proteínas de fusión purificadas como se describen anteriormente (Yamada y colaboradores, Cell Micro. 7:1418-1431 (2005)). Figura 6. La Figura 6 representa las afinidades de enlace relativo de azurina y fusiones de GST-Azu construidas selectivamente para EphB2-Fc determinadas en estudios de resonancia de plasmón de superficie. En la Fig. 6A, un experimento de separación por exclusión inicial se realizó para determinar las fuerzas de enlace relativas de azurina o GST-Azu en donde las trazas de SPR fueron registradas después de inyección de las cupredoxinas (100 nM) sobre chips de sensor CM5 modificados para EphB2-Fc. Notablemente, azurina, GST-Azu 88-113, y GST-Azu 36-128 enlazan más fuerte que el ligando nativo (efrinaB2-Fc) a EphB2-Fc. En la Fig. 6B, las curvas de afinidad de enlace para las interacciones de azurina, GST-Azu 88-113, efrinaB2-Fc, y GST-Azu 36-89 para EphB2-Fc inmovilizado después de titulación de concentraciones crecientes (0.05-100 nM) de las cupredoxinas. Las señales de resonancia de equilibrio (Req) fueron extrapoladas de los sensogramas individuales para construir las curvas. Las constantes de disociación de enlace (Kd) fueron calculadas (Tabla 6) después de establecer los datos para un modelo de enlace de Langmuir (1:1) que usa la ecuación Req = Rmax/(1 + Kd/C) y los ajustes de la curva se muestran conectando los puntos de datos en las curvas de titulación. Los conjuntos de datos cuantitativos de acuerdo con aquellos de la pantalla de enlace inicial. Figura 7. La Figura 7 representa las interacciones de enlace de azurina y GST-Azu con efrinaB2-Fc y EphB2-Fc determinado en titulaciones de enlace y ensayos de competición. En la Fig. 7A, las curvas de enlace de SPR para las interacciones de azurina y GST-Azu con efrinaB2-Fc para las cuales se determinaron las afinidades de enlace (Kd) como se describe previamente. En la Fig. 7B, los estudios de competición de enlace de SPR con EphB2-Fc inmovilizado sobre chips de sensor CM5. Figura 8. La Figura 8 representa la alineación estructural que comprende las terminaciones C de plastocianina de Ulva pertusa (1IUZ) y azurina de P. aeruginosa (1JZG_A) , (Fig. 8A y Fig. 8B respectivamente) con ectodominio de efrinaB2 humano (1KGY_E) como se computó por el algoritmo VAST. Los elementos de estructura secundarios superimpuestos se denotan mediante una letra mayúscula en negritas. Los punteados y las minúsculas están donde no existen alineaciones. Los elementos de la estructura secundaria de acuerdo con las estructuras se ilustran como flechas para láminas ß y rectángulos abiertos para 310 hélices. Los aminoácidos idénticos están indicados por un asterisco. Los aminoácidos resaltados en gris oscuro y gris claro en la secuencia de efrina B2 indican residuos involucrados en la interacción entre el receptor de efrinaB2 y EphB2 y en la dimerización de ligando respectivamente (Himanen y colaboradores, Nature 414:933-938 (2001); Toth y colaboradores, Dev. Cell. 1:83-92 (2001)). Los péptidos de plastocianina y azurina (llamados Pie 70-84 (SEQ ID NO: 20) y Azu 96-113 (SEQ ID NO: 18), respectivamente), que corresponden a la región de rizo G-H de efrinaB2, la cual es la región principal que media enlace de alta afinidad de las efrinas a los receptores Eph están encerrados y representados debajo de cada alineación. Las regiones de rizo G y H están marcadas con flechas delgadas en la parte superior de las secuencias de aminoácidos de efrinaB2. Los residuos de 1KGY_E 69-138 y 68-138 se encuentran en las SEQ ID NOS: 31 y 33, respectivamente Los residuos de 1IUZ 57-98 se . encuentran en SEQ ID NO: 32. Los residuos de 1JZG_A 76-128 se encuentran en SEQ ID NO: 34. Figura 9. La Figura 9 representa los efectos de los péptidos de cupredoxina en viabilidad de células de cáncer. En la Fig. 9A, el efecto de la azurina (Azu 96-113) y péptidos sintéticos de plastocianina (Pie 70-84) sobre la viabilidad de la célula de líneas de células de cáncer de Astrocitoma CCF-STTGl y Glioblastoma LN-229. En la Fig. 9B, el efecto de concentraciones diferentes de péptido sintético de plastocianina (Pie 70-84) en viabilidad de células de UISO-Mel-2 de Melanoma. La viabilidad celular fue determinada por ensayo de MTT como se describe en el Ejemplo 10. Las células de cáncer (2 x 104 células por pozo en placas de 96 pozos) fueron tratadas con péptidos sintéticos en concentraciones diferentes por 24 h a 37°C. Los datos se representan como el porcentaje de viabilidad celular comparada con aquella de control no tratada (100% de viabilidad) . En la Fig. 9C, la actividad citotóxica del péptido sintético Azu 96-113 hacia células Glioblastoma LN-229. Los efectos de citotoxicidad fueron determinados por ensayo de MTT. El cáncer (2 x 104 células por pozo en placas de 96 pozos) fue tratado con varias concentraciones de Azu 96-113 (10, 25, 50, 75, 100 µM) por 24 h a 37°C. El porcentaje de citotoxicidad se expresa como porcentaje de células muertas comparado con el de control no tratado (0% de citotoxicidad) . Figura 10. El efecto de GST-Azu 36-128 y GST-Azu 88-113 sobre la viabilidad de las células MCF-7. Los péptidos GST- Azu fueron agregados en concentraciones incrementadas (1.25, 6.25 y 12.5 µM) en placas de 96 pozos que contienen 8 x 103 células de cáncer por pozo, incubadas a 37 °C por 48 horas y subsiguientemente analizadas usando el ensayo de MTT. El GST y GST-Azu 36-89 en las mismas concentraciones y las células no tratadas fueron corridas en paralelo con GST-Azu 36-128 y GST-Azu 88-113 como controles.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Definiciones . Como se usa en la presente, el término "célula" incluye tanto el singular como el plural del término, a menos que específicamente se describa como una "célula sencilla". Como se usa en la presente, los términos "polipéptido", "péptido", y "proteína" se usan intercambiablemente para referirse a un polímero de residuos de aminoácido. Los términos aplican para polímeros de aminoácido en los cuales uno o más residuos de aminoácido son un análogo químico artificial de un aminoácido que ocurre naturalmente correspondiente. Los términos también aplican para polímeros de aminoácido que ocurren naturalmente. Los términos "polipéptido", "péptido", y "proteína" también son inclusive de modificaciones que incluyen, pero no se limitan a, glicosilación, Como se usa en la presente, unión de lípido, sulfatación, gamma-carboxilación de residuos de ácido glutámico, hidroxilación y ADP-ribosilación. Se apreciará que los polipéptidos no siempre son completamente lineales. Por ejemplo, los polipéptidos pueden ser ramificados como un resultado de ubiquitinación y pueden ser circulares (con o sin ramificación) , generalmente como un resultado de eventos de post-traducción, que incluyen el evento de procesamiento natural y eventos llevados a cabo por manipulación humana lo cual no ocurre naturalmente. Los polipéptidos circulares, ramificados y circulares ramificados pueden ser sintetizados mediante procesos naturales sin traducción y mediante métodos completamente sintéticos adicionales. Además, esta invención contempla el uso de ambas variantes de proteína de la invención, de terminación de amino que contienen metionina y con menos metionina. Como se usa en la presente, el término "condición patológica" incluye desviaciones anatómicas y fisiológicas del normal que constituye una deficiencia del estado normal del animal viviente o una de sus partes, que interrumpe o modifica el desempeño de las funciones corporales, y es una respuesta a varios factores (como mala nutrición, peligros industriales, o clima) , a agentes infecciosos específicos (como gusanos, protozoarios parasíticos, bacterias, o virus), a defectos inherentes del organismo (como anomalías genéticas), o para combinaciones de estos factores.

Como se usa en la presente, el término "condición" incluye desviaciones anatómicas y fisiológicas de las normales que constituyen una deficiencia del estado normal del animal viviente o una de sus partes, que interrumpe o modifica el desempeño de las funciones corporales. Como se usa en la presente, el término "inhibir crecimiento de célula" significa la disminución o cesar la división de células y/o expansión de células. Este término también incluye la inhibición del desarrollo celular o incrementa la muerte celular. Como se usa en la presente, el térmj-no "que sufre de" incluye la exhibición actual de los síntomas de una condición patológica, que tiene una condición patológica aún con síntomas observables, en la recuperación de una condición patológica, y recuperado de una condición patológica. Como se usa en la presente, el término "tratamiento" incluye la prevención, disminución, detención, o inversión del progreso o severidad de la condición o síntomas asociados con una condición que se trata. Como tal, el término "tratamiento" incluye administración médica, terapéutica, y/o profiláctica, como sea apropiada. Una "cantidad terapéuticamente efectiva" es una cantidad efectiva para prevenir o disminuir el desarrollo, o para aliviar parcial o totalmente los síntomas existentes en una condición particular para la cual el sujeto se trata. La determinación de una cantidad terapéuticamente efectiva está dentro de la capacidad de aquellos expertos en la técnica. Como se usa en la presente, el término "deficiente en expresión del gen supresor del tumor p53" se refiere a una célula que tiene un gen supresor de tumor de p53 que se inactiva, muta, pierde o es subproducto. Por ejemplo, una deficiencia tal puede ocurrir como un resultado de aberraciones genéticas dentro del gen p53 o debido a razones epigénicas tales como hipermetilación de residuos C en la dirección 5' de las islas CG de los genes de supresor de tumor o interacción con oncogenes virales y celulares. El término "sustancialmente puro", cuando se usa para modificar el término "cupredoxina", como se usa en la presente, se refiere a una cupredoxina, por ejemplo, una cupredoxina aislada del medio de crecimiento o contenidos celulares, en una forma sustancialmente libre, o no adulterada por, otras proteínas y/o compuestos inhibidores activos. El término "sustancialmente puro" se refiere a un factor en una cantidad de por lo menos alrededor de 75%, en peso seco, de fracción aislada, o por lo menos "75% sustancialmente puro". Más específicamente, el término "sustancialmente puro" se refiere a un compuesto de por lo menos alrededor de 85%, en peso seco, de compuesto activo, o por lo menos "85% sustancialmente puro". Más específicamente, el término "sustancialmente puro" se refiere a un compuesto de por lo menos alrededor de 95%, en peso seco, de compuesto activo, o por lo menos "95% sustancialmente puro". La cupredoxina sustancialmente pura se puede usar en combinación con uno o más compuestos sustancialmente puros diferentes o cupredoxinas aisladas. Las frases "aislada", "purificada", o "pura biológicamente" se refieren a material el cual es sustancialmente o esencialmente libre de componentes los cuales normalmente acompañan el material como se encuentra en su estado nativo. Así, los péptidos aislados de acuerdo con la invención preferiblemente no contienen materiales normalmente asociados con los péptidos en su ambiente in situ. Una región "aislada" se refiere a una región que no incluye la secuencia total del polipéptido de la cual fue derivada la región. Un ácido nucleico, proteína, o fragmento respectivo de éstos "aislado" ha sido removido sustancialmente de su ambiente in vivo tal que puede ser manipulado por el técnico especializado, tal como pero no limitado a secuenciamiento de nucleótido, digestión de restricción, mutagénesis dirigida a sitio, y subclonación dentro de vectores de expresión para un fragmento de ácido nucleico además que obtiene la proteína o fragmento de proteína en cantidades sustancialmente puras. El término "variante" como se usa en la presente con respecto a un péptido, se refiere a variantes de Secuencia de aminoácidos las cuales pueden tener aminoácidos sustituidos, eliminados, o insertados en comparación con el polipéptido de tipo silvestre. Las variantes pueden ser truncamientos del péptido de tipo silvestre. Así, un péptido variante puede ser hecho por manipulación de genes que codifican el polipéptido. Una variante puede ser hecha mediante alteración de la composición básica o características del polipéptido, pero no menos que algunas de sus actividades fundamentales. Por ejemplo, una "variante" de azurina puede ser una azurina mutada que mantiene su capacidad para inhibir el crecimiento de células de cáncer de mamíferos. En algunos casos, un péptido variante se sintetiza con aminoácidos no naturales, tales como residuos de e- (3, 5-dinitrobenzoil) -Lys. (Ghadiri & Fernholz, J. Am. Chem. Soc. , 112:9633-9635 (1990)). En algunas modalidades, la variante tiene no más que 20, 19, 18, 17 ó 16 aminoácidos reemplazados, eliminados o insertados comparados con el péptido de tipo silvestre. En algunas modalidades, la variante tiene no más que 15, 14, 13, 12 ú 11 aminoácidos sustituidos, eliminados o insertados en comparación con el péptido de tipo silvestre. En algunas modalidades, la variante tiene no más que 10, 9, 8 ó 7 aminoácidos sustituidos, eliminados o insertados en comparación con el péptido de tipo silvestre. En algunas modalidades, la variante tiene no más que 6 aminoácidos sustituidos, eliminados o insertados en comparación con el péptido de tipo silvestre. En algunas modalidades, la variante tiene no más que 5 ó 4 aminoácidos sustituidos, eliminados o insertados en comparación con el péptido de tipo silvestre. En algunas modalidades, la variante tiene no más que 3, 2 ó 1 aminoácidos sustituidos, eliminados o insertados en comparación con el péptido de tipo silvestre. El término "aminoácido", como se usa en la presente, significa una porción de aminoácido que comprende cualquier residuo de aminoácido que ocurre naturalmente, o que no ocurre naturalmente o sintético, esto es, cualquier porción que comprende por lo menos un carboxilo y por lo menos un residuo amino directamente ligado por uno, dos, tres o más átomos de carbono, comúnmente un (a) átomo de carbono. El término "derivado" como se usa en la presente con respecto a un péptido se refiere a un péptido que se deriva del péptido sujeto. Una derivación incluye modificaciones químicas del péptido tal que el péptido todavía mantiene alguna de sus actividades fundamentales. Por ejemplo, un "derivado" de azurina puede ser una azurina modificada químicamente que mantiene su capacidad para inhibir el crecimiento de las células de cáncer mamíferas. Las modificaciones químicas de interés incluyen, pero no se limitan a, amidación, acetilación, sulfatación, modificación con polietilén glicol (PEG), fosforilación o glicosilación del péptido. Además, un péptido derivado puede ser una fusión de un polipéptido o fragmento de éste a un compuesto químico, tal como, pero no limitado a, otro péptido, molécula de fármaco u otro agente terapéutico o farmacéutico o una sonda detectable. El término "por ciento (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" se define como el porcentaje de residuos de aminoácido en un polipéptido que son idénticos con los residuos de aminoácido en una secuencia candidata cuando las dos secuencias están alineadas. Para determinar el % de identidad de aminoácido, las secuencias están alineadas y si es necesario se introducen espacios para lograr el máximo % de identidad de secuencia; no están consideradas sustituciones conservadoras como parte de la identidad de secuencia. Los procedimientos de alineación de secuencia de aminoácidos para determinar el por ciento de identidad son bien conocidos por aquellos de experiencia en la técnica. A menudo el software de computadoras disponible públicamente como software BLAST, BLAST2, ALIGN2 o Megalign (DNASTAR) se usa para alinear secuencias de péptido. En una modalidad específica, Blastp (disponible del National Center for Biotechnology Information, Bethesda MD) se usa con los parámetros por omisión del filtro de complejidad grande, eseperado 10, tamaño de palabra 3, existencia 11 y extensión 1. Cuando las secuencias de aminoácido están alineadas, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos A, con, o contra una secuencia de aminoácidos B (la cual puede alternativamente ser fraseada como una secuencia de aminoácidos A dada que tiene o comprende un cierto % de identidad de secuencia de aminoácidos, con o contra una secuencia de aminoácidos B dada) puede ser calculada como: % de identidad de secuencia de aminoácidos = X/Y*100 Donde X es el número de residuos de aminoácido registrados como coincidencias idénticas por la alineación del programa o del algoritmo de alineación de secuencia de A y B y Y es el número total de residuos de aminoácido en B. Si la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de secuencia de aminoácidos A hasta B no será igual al % de identidad de secuencia de aminoácidos de B hasta A. Cuando se compara las secuencias más grandes con secuencias más cortas, la secuencia más corta será la secuencia "B". Por ejemplo, cuando se comparan los péptidos trucados con el péptido de tipo silvestre que corresponde, el péptido truncado será la secuencia "B".

General . Algunos aspectos de la presente invención proporcionan composiciones y métodos que usan cupredoxinas que tienen similitud estructural a efrina para interferir con el sistema de señalización de efrina en varias células y tejidos de mamíferos, y también inhiben el crecimiento de las células de cáncer de mamíferos. Específicamente, la presente invención proporciona composiciones y métodos que usan cupredoxinas y variantes, derivados y equivalentes estructurales de éstos, para interferir con el sistema de señalización de efrina, y también inhibe el crecimiento de células de cáncer de mamíferos in Vitro e in vivo. Los inventores descubrieron previamente que los organismos patogénicos secretan factores citotóxicos independientes de ATP, por ejemplo proteínas de óxido reducción tales como azurina a partir de P. aeruginosa , y que tales factores provocan la muerte de células J774 por apoptosis, particularmente en células de cáncer. También fue conocido que la azurina tiene un dominio desde alrededor de 50-70 residuos de aminoácido que facilita la proteína para entrar preferentemente dentro de las células de cáncer para inducir citotoxicidad. Sorpresivamente, los inventores han descubierto ahora que un dominio de terminación C se encuentra en azurinas y otras cupredoxinas que muestran una similitud estructural a las efrinas. Ver, Ejemplos 2, 5 y 9. También es sabido ahora que la azurina y plastocianina, y regiones particulares de estos péptidos que son homólogos estructuralmente al rizo de G-H efrina, enlaza competitivamente a receptores de efrina en una relación de 1:1. Ver, Ejemplos 6-8. La azurina de P. aeruginosa , en particular enlaza a los receptores de efrina EphB2 y EphA6. Ver, Ejemplo 6. La plastocianina Phormidium laminosum muestra especificidad para enlace de los receptores de efrina EphAl, A3 y B2, y para una extensión menor de receptores de efrina EphA2 y A6. Ver, Ejemplo 6. Finalmente, la rusticianina muestra enlace débil a los receptores de efrina EphA8 y Bl. Ver, Ejemplo 6. Ahora también se sabe que 88-113 residuos de aminoácido de región de azurina, los cuales contienen la homología estructural a la región de rizo G-H de efrina, enlaza al receptor de efrina EphB2. Ver, Ejemplo 7. Finalmente, ahora se sabe que la azurina y la región de 88-113 de azurina enlaza a efrinaB2 además del receptor de efrina EphB2, y puede competir con efrinaB2 para su receptor, EphB2. Ver, Ejemplo 8. Los inventores también han descubierto que las cupredoxinas con regiones que tienen similitud estructural a las regiones de rizo de G-H de efrina inhiben el crecimiento de células de cáncer de mamíferos in Vitro. En general, la plastocianina de Phormidium laminosum, la rusticianina de Thiobacillus ferrooxidans y la azurina de P. aeruginosa inhiben el crecimiento in Vitro de células de melanoma humano Mel-2 y células de cáncer de mama humano MCF-7 en un ensayo de azul -de tripano. Ver, Ejemplo 4. Además, la región de residuo 88-113 de azurina ahora se sabe que inhibe el crecimiento celular de células de cáncer de mama MCF-7. Ver, Ejemplo 10. Finalmente, un péptido de azurina 18-mer y un péptido de plastocianina de Ulva pe-rtusa 15-mer que corresponden a la región de semejanza estructural a la región de rizo de G-H de efrinaB2 son conocidos ahora por inhibir el crecimiento de células de cáncer de mama humano MCF-7, células de astrocitoma de tumor de cerebro CCF-STTGl y células de glioblastoma LN-229 in Vitro. Ver, Ejemplos 3 y 9.

Sorpresivamente, las cupredoxinas con semejanza estructural al rizo G-H de efrinaB2 también afectan el desarrollo relacionado con efrina in vivo. Es sabido a partir de estudios in vivo de desarrollo relacionado con efrina en C. elegans, que la rusticianina de cupredoxina interfiere con la formación del músculo de cola mientras que la azurina de cupredoxina previene el desarrollo embriónico, para procesos de desarrollo relacionados con efrina. Ver, Ejemplo 1. Ahora se hace palpable que además de la azurina, la rusticianina y plastocianina de cupredoxinas también comparten una homología estructural con las regiones G y H de efrinaB2. Ver, Ejemplos 2 y 5. Además, se sabe que la azurina y la estelacianina de fotocianinas y la proteína básica de pepino también comparten una homología estructural importante con las efrinas. Debido a la conservación estructural en la familia de cupredoxinas de proteínas en general, se predice que muchas otras cupredoxinas y proteínas similares a cupredoxina también exhiben una homología estructural importante para efrinas. Ver, Ejemplo 2. Por lo tanto se contempla que las proteínas de la familia de cupredoxina en general se pueden usar para tratar las condiciones relacionadas con señalización de efrina y cáncer, usando las composiciones y métodos de la invención. Las cupredoxinas específicas de interés incluyen, pero no se limitan a, azurina, rusticianina, plastocianina, estelacianina, auracianina, pseudoazurina y proteína básica de pepino. Las secuencias de proteína ejemplar se encuentran en la presente como plastocianina (SEQ ID NOS: 2 y 22), rusticianina {SEQ ID NO: 3), pseudoazurina (SEQ ID NO: 4), estelacianina (SEQ ID NO: 14), auracianina (SEQ ID NOS: 15 y 16), y proteína básica de pepino (SEQ ID NO: 17). Como se usa en la presente, el término "cupredoxina" se refiere a cualquier miembro de la familia de cupredoxinas de proteínas, que incluyen proteínas similares a cupredoxina, tales como Laz de Neisseria . Las azurinas son particularmente específicas, y las secuencias de proteína ejemplares de estas cupredoxinas se encuentran en la presente, pero no se limitan, a aquellas aisladas de Pseudomonas aeruginosa (SEQ ID NO: 1) ; Alcaligenes faecalis (SEQ ID NO: 5) ,• Achromobacter xylosoxidans especies denitrificans I (SEQ ID NO: 6) ; Bordetella bronchiseptica (SEQ ID NO: 1 ) ; Methylomonas especie J (SEQ ID NO: 8); Neisseria meningi tidis (SEQ ID NO: 9 ) ; Neisseria gonnorrhoeae (SEQ ID NO: 10), Pseudomonas fluorescens (SEQ ID NO: 11) / Pseudomonas chlororaphis (SEQ ID NO: 12); Xylella fastidiosa 9a5c (SEQ ID NO: 13) y Vibrio parahaemolyticus (SEQ ID NO: 21) . En una modalidad más específica, la azurina es de Pseudomonas aeruginosa . En otras modalidades específicas, la cupredoxina es plastocianina (SEQ ID NOS: 2 y 22), rusticianina (SEQ ID NO: 3), pseudoazurina (SEQ ID NO: 4), estelacianina (SEQ ID NO: 14), auracianina (SEQ ID NOS: 15 y 16) , y proteína básica de pepino (SEQ ID NO: 17). En algunas modalidades, las cupredoxinas tienen una estructura de barril beta de clave griega. La estructura de barril beta de clave griega es un múltiplo de proteína bien conocido. Ver, por ejemplo, Zhang & Kim ( Proteins 40:409-419 (2000) ) . La topología de clave griega fue nombrada después de un patrón que fue común en cerámica griega. Tiene tres hebras beta arriba y abajo conectadas por horquillas, las cuales están seguidas por una conexión más grande a una cuarta hebra beta, la cual se encuentra adyacente a la primera hebra beta. En una modalidad específica, las cupredoxinas y variantes, derivados y equivalentes estructurales de cupredoxinas comprenden por lo menos una estructura de barril beta de clave griega. En otra modalidad específica, las cupredoxinas y variantes, derivados y equivalentes estructurales de cupredoxinas comprenden una estructura de clave griega de por lo menos 4 hebras beta. En otra modalidad más específica, las cupredoxinas y variantes, derivados y equivalentes estructurales de las cupredoxinas comprenden una estructura Greek Key de por lo menos ocho hebras beta. En otra modalidad específica, la cupredoxina y variantes, derivados y equivalentes estructurales de cupredoxina comprenden más de una estructura de barril de beta de clave griega.

Composiciones de la Invención. La invención proporciona péptidos que son variantes, derivados y equivalentes estructurales de cupredoxina. En algunas modalidades, el péptido está sustancialmente puro. En otras modalidades, el péptido está en una composición que comprende, consiste o esencialmente consiste del péptido. En otras modalidades, el péptido se aisla. En algunas modalidades, el péptido es menos que una cupredoxina de longitud completa, y mantiene alguna de las características funcionales de la cupredoxina. En algunas modalidades, el péptido mantiene la capacidad para interferir con la señalización de efrina en células y tejidos de mamífero, y/o inhibe el crecimiento de células de cáncer de mamífero. En otra modalidad específica, el péptido no genera una respuesta inmune en un mamífero, y más específicamente en un humano.

La invención también proporciona composiciones que comprenden por lo menos uno, por lo menos dos o por lo menos tres cupredoxinas, o variantes, derivados y equivalentes estructurales de cupredoxina. La invención también proporciona composiciones que comprenden por lo menos una, por lo menos dos, o por lo menos tres cupredoxinas o variantes, derivados y equivalentes estructurales de cupredoxinas en una composición farmacéutica. Debido a la alta homología estructural entre las cupredoxinas, se contempla que otras cupredoxinas de la familia serán capaces de interferir con la señalización de efrina y específicamente inhibir el crecimiento de cáncer en células y tejido de mamíferos. En algunas modalidades, la cupredoxina es, pero no se limita a, azurina, pseudoazurina, plastocianina, pseudoazurina, rusticianina o auracianina. En modalidades particularmente específicas, la azurina se deriva de Pseudomonas aeruginosa, Alcaligenes faecalis, Achromobacter xylosoxidans especies deni trificans I, Bordetella bronchiseptica, especies de Methylomonas, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas chlororaphis, Xylella fastidiosa 9a5 o Vibrio parahaemolyticus . En una modalidad muy específica, la azurina es de Pseudomonas aeruginosa . En otras modalidades específicas la cupredoxina es una plastocianina, y más específicamente una plastocianina derivada de Phormidium laminosum o Ulva pertusa . En otras modalidades específicas, la cupredoxina en una rusticianina, y más específicamente una rusticianina derivada de Thiobacillus ferrooxidans. En otras modalidades específicas, la cupredoxina comprende una secuencia de aminoácidos que es SEQ ID NO: 1-17, 21-22. La invención proporciona variantes de secuencia de aminoácidos de una cupredoxina la cual tiene aminoácidos sustituidos, eliminados, o insertados comparados con el polipéptido de tipo silvestre. Las variantes de la invención pueden ser truncamientos del polipéptido de tipo silvestre. Como se usa en la presente, una "truncamiento" de un polipéptido es el péptido que resulta de la remoción de por lo menos un residuo de aminoácido de por lo menos una terminación de la secuencia de polipéptido. En algunas modalidades, el péptido trunco resulta de por lo menos la remoción de por lo menos un residuo de aminoácido, por lo menos cinco residuos de aminoácido, por lo menos 10 residuos de aminoácido, por lo menos 50 residuos de aminoácido, o alrededor de 100 residuos de aminoácido en total de cualquiera de ambas terminaciones de la secuencia de polipéptido. En algunas modalidades, la composición comprende un péptido que consiste de una región de una cupredoxina que es menor que el polipéptido de tipo silvestre de longitud completa. En algunas modalidades, la composición comprende un péptido que consiste de más que alrededor de 10 residuos, más que alrededor de 15 residuos o más que alrededor de 20 residuos de una cupredoxina truncada. En algunas modalidades, la composición comprende un péptido que consiste de no más que alrededor de 100 residuos, no más que alrededor de 50 residuos, no más que alrededor de 40 residuos o no más que alrededor de 30 residuos de una cupredoxina truncada. En algunas modalidades, la variante es un péptido al cual una cupredoxina, y más específicamente para SEQ ID NOS: 1-17, 21-22 tiene por lo menos alrededor de 90% de identidad de secuencia de aminoácidos, por lo menos alrededor de 95% de identidad de secuencia de aminoácidos o por lo menos alrededor de 99% de identidad de secuencia de aminoácidos. En modalidades específicas, la variante de cupredoxina comprende residuos de azurina de P. aeruginosa 96-113 (SEQ ID NO: 18), 88-113 (SEQ ID NO: 19) ó SEQ ID NO: 25. En otras modalidades, la variante de cupredoxina consiste de residuos de azurina de P. aeruginosa 96-113 (SEQ ID NO: 18), 88-113 (SEQ ID NO: 19) ó SEQ ID NO: 25. En otras modalidades específica, la variante de cupredoxina comprende los residuos de Ulva pertusa 70-84 (SEQ ID NO: 20), residuos de Ulva pertusa 57-98 (SEQ ID NO: 32), o secuencia de Ulva pertusa SEQ ID NO: 28. En otras modalidades específicas, la variante de cupredoxina consiste de residuos de Ulva pertusa 70-84 (SEQ ID NO: 20), residuos de Ulva pertusa 57-98 (SEQ ID NO: 32), ó secuencia de Ulva pertusa SEQ ID NO: 28. En otras modalidades específicas, la variante de cupredoxina comprende la secuencia de rusticianina de Thiobacillus ferrooxidans SEQ ID NO: 26, auracianina de Chloroflexus aurantiacus (SEQ ID NO: 27), secuencias de Cucumis sativus SEQ ID NOS: 29 y 30. En otras modalidades específicas, la variante de cupredoxina consiste de secuencia de rusticianina de Thiobacillus ferrooxidans SEQ ID NO: 26, auracianina Chloroflexus aurantiacus (SEQ ID NO: 27), secuencias Cucumis sa tivus SEQ ID NOS: 29 y 30. En otras modalidades específicas, la variante consiste de los residuos equivalentes a las secuencias truncadas anteriores de otra cupredoxina. También se contempla que otras variantes de cupredoxina pueden ser diseñadas para tener una actividad similar a cualquiera de las variantes antes mencionadas. Para hacer esto, la Secuencia de aminoácidos de cupredoxina sujeto será alineada a la secuencia de cupredoxina objetivo, tal como aquella que contiene las variantes truncadas anteriores, usando BLAST, BLAST2, ALIGN2 o Megalign (D ASTAR) , los residuos relevantes de la variante truncada localizada en la secuencia de cupredoxina objetivo, y los residuos equivalentes encontrados en la secuencia de cupredoxina sujeto, y la variante truncada equivalente diseñada de esa manera. Las variantes también incluyen péptidos hechos con aminoácidos sintéticos que no ocurren naturalmente. Por ejemplo, aminoácidos que no ocurren naturalmente pueden ser integrados en el péptido variante para extender u optimizar la vida media de la composición en la corriente sanguínea. Las variantes incluyen, pero no se limitan a D, L-péptidos (diastereómero), (Futaki y colaboradores, J. Biol. Chem. 276(8) :5836-40 (2001); Papo y colaboradores, Cáncer Res. 64 (16) :5779-86 (2004); Miller y colaboradores, Biochem. Pharmacol. 36 (1) : 169-76, (1987)); péptidos que contienen aminoácidos inusuales (Lee y colaboradores, J. Pept. Res. 63(2): 69-84 (2004)), y aminoácido no natural que contiene olefina seguido por unión de hidrocarburo (Schafmeister y colaboradores , J. Am. Chem. Soc. 122:5891-5892 (2000); Walenski y colaboradores, Science 305:1466-1470 (2004)). Y péptidos que comprenden residuos de e- (3, 5-dinitrobenzoil) -Lys. En otras modalidades, el péptido de la invención es un derivado de una cupredoxina. Los derivados son modificaciones químicas del péptido tal que el péptido todavía mantiene alguna de sus actividades fundamentales. Por ejemplo, un "derivado" de azurina puede ser una azurina modificada químicamente que mantiene su capacidad para interferir con la señalización de efrina, y específicamente inhibir el crecimiento de cáncer en células y tejidos de mamíferos. Las modificaciones químicas de interés incluye, pero no se limitan a, amidación, acetilación, sulfatación, modificación con polietilén glicol (PEG), fosforilación y glicosilación del péptido. Ademas, un péptido derivado puede ser una fusión de una cupredoxina, una variante, derivado o equivalente estructural de ésta para un compuesto químico, tal como pero sin limitación a, otro péptido, molécula de fármaco u otro agente terapéutico o farmacéutico o una sonda detectable. Los derivados de interés incluyen modificaciones químicas mediante las cuales la vida media en la corriente sanguínea del los péptidos y composiciones de la invención pueden ser extendidas u optimizadas, tal como mediante varios métodos bien conocidos por aquellos en la técnica, que incluyen pero no se limitan a, péptidos circularizados (Monk y colaboradores, BioDrugs 19 (4) : 261-78, (2005); DeFreest y colaboradores, J. Pept. Res. 63(5): 409-19 (2004)), modificaciones de terminación N- y C- (Labrie y colaboradores, Clin. Invest. Med. 13(5):275-8, (1990)), y aminoácido no natural que contiene olefina seguido por unión de hidrocarburo (Schafmeister y colaboradores, J. Am. Chem. Soc. 122:5891-5892 (2000); Walenski y colaboradores , Science 305:1466-1470 (2004)). Se observa que los péptidos de la invención pueden ser una variante, derivado y/o equivalente estructural de una cupredoxina. Por ejemplo, los péptidos pueden ser un truncamiento de azurina que ha sido PEGilado, produciendo así tanto una variante como un derivado. En una modalidad, los péptidos de la invención se sintetizan con aminoácidos no naturales a,a-disubstituidos que contienen extensiones laterales que portan olefina, seguido por una "unión" de hidrocarburo completo mediante metátesis de olefina catalizada con rutenio. (Scharmeister y colaboradores, J. Am. Chem. Soc. 122:5891-5892 (2000); Walensky y colaboradores, Science 305:1466-1470 (2004)). Adicionalmente, los péptidos que son equivalentes estructurales de azurina pueden ser fusionados a otros péptidos, produciendo así un péptido que es tanto un equivalente estructural como un derivado. Estos ejemplos son meramente para ilustrar y no para limitar la invención. Las variantes, derivados o equivalentes estructurales de cupredoxina pueden o no estar enlazados a cobre. En otra modalidad, el péptido es un equivalente estructural de una cupredoxina. Ejemplos de estudios que determinan la homología estructural importante entre cupredoxina y otras proteínas incluyen a Toth y colaboradores, (Developmental Cell 1:82-92 (2001)). Específicamente, la homología estructural importante entre una cupredoxina y el equivalente estructural se determina mediante el uso del algoritmo VAST. (Gibrat y colaboradores, Curr Opin Struct Biol 6:377-385 (1996); Madej y colaboradores, Proteins 23:356-3690 (1995)). En modalidades específicas, el valor de VAST p de una comparación estructural de una cupredoxina para el equivalente estructural es menor que alrededor de 10~3, menos que alrededor de 10"5, o menos que alrededor de 10~7. En otras modalidades, la homología estructural importante entre una cupredoxina y el equivalente estructural se determina mediante el uso del algoritmo DALÍ (Holm & Sander, J. Mol. Biol. 233:123-138 (1993)). En modalidades específicas, el registro DALÍ Z para una comparación estructural de forma de par es por lo menos alrededor de 3.5, por lo menos alrededor de 7.0, o por lo menos alrededor de 10.0. Ejemplos de estas determinaciones se encuentran en los Ejemplos 2 y 9. En algunas modalidades, la cupredoxina, o variante, derivado o equivalente estructural de ésta tiene algunas de las características funcionales de la azurina de P. aeruginosa, plastocianina de ¡72va pertusa, plastocianina de Phormidium laminosum o rusticianina de Thiobacill us ferrooxidans rusticianina. En una modalidad específica, la cupredoxina, o variante, derivado o equivalente estructural de ésta inhibe interferencias con el sistema de señalización de efrina, y/o inhibe el crecimiento de cáncer en células y tejidos de mamíferos. La inhibición del crecimiento de células o tejidos de cáncer de mamífero puede o no estar relacionada con cualquier interferencia con el sistema de señalización de efrina mediante la cupredoxina, o variante, derivado o equivalente estructural de ésta. Los métodos que determinan si la cupredoxina, o variante, derivado o equivalente estructural de ésta interfiere con la señalización de efrina son bien conocidos en la técnica, e incluyen la determinación de si la cupredoxina, o variante, derivado o equivalente estructural de ésta enlaza a un componente de la vía de señalización de efrina, tal como, pero no limitado a, una efrina y/o un receptor de efrina. El sistema de señalización de efrina en su amplitud incluye la efrina y receptor de efrina asociado, y cualquiera de las moléculas (o "componentes") requeridos para transmitir la señal tanto hacia delante como hacia atrás. En una visión menor, el sistema de señalización de efrina incluye solamente la efrina y receptor de efrina relacionado responsable de la señalización. El término "interferir" cuando se usa en el contexto del sistema de señalización de efrina puede resultar ya sea en un incremento o decremento de la señalización de efrina asociada, en alguna o en ambas de las direcciones "hacia delante" y "hacia atrás". Los métodos para medir la interferencia en el sistema de señalización de efrina son bien conocidos en la técnica. Un método para determinar la interferencia de señalización de efrina es el enlace o competencia del péptido a o con una efrina o receptor de efrina, u otro componente de 1 sistema de señalización de efrina, como se muestra en los Ejemplos 6-8. Los sistemas in vivo se pueden usar, tal como el C. elegans en donde ahora se sabe que las cupredoxinas pueden interferir con señalización de efrina para alterar la formación de músculo de cola y desarrollo embriónico, como se describe en el Ejemplo 1. Otros métodos incluyen, pero no se limitan, el ensayo de fosforilación de receptor de Eph en Himanen y colaboradores , (Nat. Neurosci. 7:501-509 (2004)) y Koolpe y colaboradores, (J. Biol. Chem. 280:17301-17311 (2005)). Debido a que se sabe que las cupredoxinas y variantes de cupredoxinas pueden, entre otras cosas, interferir con la señalización de efrina e inhibir el crecimiento de cáncer en células y tejidos de mamíferos, ahora es posible diseñar variantes, derivados y equivalentes estructurales de cupredoxinas que retienen esta actividad, por ejemplo. Tales variantes, derivados y equivalentes estructurales se pueden hacer mediante, por ejemplo, la creación de una #biblioteca" de varias variantes, derivados y equivalentes estructurales, y luego evaluar cada una para actividad anti-cáncer, por ejemplo, usando uno de muchos métodos conocidos en la técnica tal como los métodos ejemplares en los Ejemplos 3, 8 y 10. Se contempla que las variantes, derivados y equivalentes estructurales de cupredoxinas con actividad anti-cáncer se pueden usar en los métodos de la invención, en lugar de o además de las cupredoxinas. En otras modalidades, la cupredoxina, o variante, derivado o equivalente estructural de ésta puede tener una homología estructural importante con una efrina. En una modalidad específica, las cupredoxinas y variantes y derivados de cupredoxina tienen una homología estructural importante alrededor de la región de rizo de G-H de efrina. Ejemplos de estudios que determinan la homología estructural importante entre cupredoxinas y efrinas incluyen Toth y colaboradores, (Developmental Cell 1:82-92 (2001)) y el Ejemplo 2 en la presente. Específicamente, la homología estructural importante entre una cupredoxina y una efrina se determina mediante el uso del algoritmo VAST. (Gibrat y colaboradores, Curr Opin Struct Biol 6:377-385 (1996); Madej y colaboradores, Proteins 23:356-3690 (1995)). En modalidades específicas, el valor de VAST p de una comparación estructural de una cupredoxina a una efrina es menos que alrededor de 10~3, menos que alrededor de 10~5, o menos que alrededor de 10"7. En otras modalidades, la homología estructural importante entre una cupredoxina y una efrina se determina mediante el uso del algoritmo DALÍ (Holm & Sander, J. Mol. Biol. 233:123-138 (1993)). En modalidades específicas, el registro de DALÍ Z para una comparación estructural en forma de par es por lo menos alrededor de 3.5, por lo menos alrededor de 7.0, o por lo menos alrededor de 10.0. En otra modalidad, la cupredoxina, o variante, derivado o equivalente estructural de ésta enlaza ya sea a una efrina y/o un receptor de Eph. Se sabe que varias cupredoxinas tienen una región en el C terminal que es estructuralmente similar al ectodominio de efrinaB2. Ver Ejemplos 2, 5 y 9. En una modalidad específica, la cupredoxina, o variante, derivado o equivalente estructural de ésta enlaza a una efrina. En una modalidad específica particular, la efrina es, pero no se limita a, efrinaAl, efrinaA2, efrinaA3, efrinaA4, efrinaA5, efrinaBl, efrinaB2, efrinaB3 y efrinaB4. En una modalidad específica particular, la efrina es, pero no se limita a, efrinaBl, efrinaB2, efrinaB3 y efrinaB4. En otra modalidad específica, la cupredoxina, o variante, derivado o equivalente estructural de ésta enlaza a un receptor de Eph. En modalidades particularmente específicas, el receptor Eph es, pero no se limita a, EphAl, EphA2, EphA3, EphA4, EphA5, EphA6, EphA7, EphA8, EphAlO, EphBl, EphB2, EphB3, EphB4 y EphB6. En algunas modalidades, la cupredoxina, o variante, derivado o equivalente estructural de ésta enlaza a ambos, una efrina y un receptor de efrina. En algunas modalidades, la cupredoxina, o variante, derivado o equivalente estructural de ésta enlaza a una efrina y su receptor, específicamente EfrinaB2 y EphB2. Los métodos para determina el enlace de proteínas a otras proteínas son bien conocidos en la técnica. Ejemplos de métodos que determinan el enlace a receptores Eph incluyen los Ejemplos 6-8, además de Koolpe y colaboradores, (J. Biol. Chem. 280:17301-17311 (2005)) y Himanen y colaboradores, (Nat. Neurosci. 7:501-509 (2004)). En algunas modalidades específicas, la cupredoxina, o variante, derivado o equivalente estructural induce apoptosis en una célula de cáncer de mamífero, más específicamente una célula J774. La capacidad de una cupredoxina u otro polipéptido para inducir apoptosis puede ser observada por microscopía con focal ApoAlert de mitosensor que usa un MITOSENSOR™ APOLERT™ Mitochondrial Membrane Sensor kit (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, California, U.S.A.), mediante la medición de la actividad de caspasa-8, caspasa-9 y caspasa-3 usando el método descrito en Zou y colaboradores , ( J. Biol . Chem . 274: 11549-11556 (1999)), y mediante la detección de fragmentación de ADN nuclear inducido por apoptosis usando, por ejemplo, el kit de fragmentación de ADN de APOLERT™ (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, California, U.S.A.). En otra modalidad específica, la cupredoxina, o variante, derivado o equivalente estructural de ésta induce disminución del crecimiento celular en una célula de cáncer de mamífero, más específicamente una célula J774. La disminución del crecimiento celular puede ser determinado mediante la medición de la extensión de inhibición del progreso del ciclo de la célula, así como mediante el método encontrado en Yamada y colaboradores, (PNAS 101:4770-4775 (2004)). En otra modalidad específica, la cupredoxina, o variante, derivado o equivalente estructural de ésta inhibe el progreso de ciclo de la célula en una célula de cáncer de mamífero, más específicamente una célula J774.

Cupredoxinas Estas proteínas de cobre azul pequeñas (cupredoxinas) son proteínas de transferencia de electrón (10-20 kDa) que participa en cadenas de transferencia de electrón bacterial o son de función no conocida. El ion de cobre se enlaza únicamente mediante la matriz de proteína. Un arreglo de plano trigonal irregular espacial o dos ligandos de histidina y uno de cisteína alrededor del cobre da incremento a las propiedades electrónicas muy peculiares del sitio de metal y un color azul intenso. Un sinnúmero de cupredoxinas han sido caracterizadas cristalográficamente en resolución media a alta. Las cupredoxinas en general tienen una homología de secuencia baja pero homología estructural alta. (Gough & Clothia, Structure 12:917-925 (2004); De Rienzo y colaboradores, Protein Science 9:1439-1454 (2000)). Por ejemplo, la Secuencia de aminoácidos de azurina es 31% idéntica a aquella de auracianina B, 16.3% para aquella de rusticianina, 20.3% para aquella de plastocianina, y 17.3% para aquella de pseudoazurina. Ver, Tabla 1. Sin embargo, la semejanza estructural de estas proteínas es más pronunciada.

El valor de VAST p para la comparación de la estructura de azurina a auracianina B es 10"7'4, azurina para rusticianina es 10~5, azurina para plastocianina es 10~5"6, y azurina para psuedoazurina es 10"4'1. Todas las cupredoxinas poseen un múltiplo de barril beta o pliegue de intercalado beta de clave griega de ocho hebras y tiene una arquitectura de sitio altamente conservada. (De Rienzo y colaboradores, Protein Science 9:1439-1454 (2000)). Un parche hidrofóbico prominente, debido a la presencia de muchos residuos alifáticos de cadena muy larga tales como metioninas y leucinas, está presente alrededor del sitio de cobre en azurinas, amicianinas, plastocianinas cianobacteriales, proteína básica de pepino y a una extensión menor, pseudoazurina y plastocianinas eucarióticas. Id. Los parches hidrofóbicos también se encuentran para una extensión menor en sitios de cobre de estelacianina y rusticianina, pero tiene diferentes características. Id.

Tabla 1. Alineación de secuencias y estructura de azurina (1JZG) de P. aeruginosa a otras proteínas usando el algoritmo VAST. PDB Longitud d? % de Valor Registro3 RMSD4 Descripción Alineación1 identidad P2 aa 1AOZ A 2 82 18.3 10 e-7 12.2 1. .9 Ascorbato oxidasa 1QHQ A 113 31 10e-7.4 12.1 1. . 9 Au-racianina B 1V54 B 1 79 20.3 10e-6.0 11.2 2 . . 1 Citocromo c oxidasa 1GY2 A 92 16.3 10e-5.0 11.1 1. 8 Rusticianina 3MSP A 74 8.1 10e-6.7 10.9 2. ,5 Proteina de Esperma Principal Móvil5 1IUZ 74 20.3 10e-5.6 10.3 2. . 3 Plastocianina 1KGY E 90 5.6 10e-4.6 10.1 3. . 4 Efrinb2 1PMY 75 17.3 10e-4.1 9.8 2. . 3 Pseudoazurina •""Longitud Alineada: El número de pares equivalentes de átomos C-alfa superimpuestos entre las dos estructuras, esto es cuantos residuos se han usado para calcular la superposición 3D. 2VAL P: El valor VAST p es una medida de la importancia de la comparación, expresada como una probabilidad. Por ejemplo, si el valor p es 0.001, luego las posibilidades son de 1000 a 1 contra observar una coincidencia de esta calidad por mera casualidad. El valor p de VAST se ajusta para los efectos de comparaciones múltiples al usar la suposición de que hay 500 tipos independientes y no relacionados de dominios en la base de datos MMDB. El valor p mostrado corresponde así al valor p para la comparación de pares de cada par de dominio, dividido por 500. 3Registro: El registro de similitud-estructura VAST.

Este número se refiere al número de elementos de estructura secundaria sobrepuestos y la calidad de esa superposición.

Los registros mayores de VAST se correlacionan con mayor similitud. 4RMSD: La superposición de raíz cuadrática media residual en Angstroms. Este número se calcula después de la superposición óptima de dos estructuras, como la raíz cuadrada de las distancias cuadráticas medias entre los átomos C alfa equivalentes. Observar las escalas del valor RMSD con el grado de alineaciones estructurales y que este tamaño debe tomarse en cuenta cuando se usa RMSD como un descriptor de la similitud estructural global. 5 La proteína principal de esperma de C. elegans demostró ser un antagonista de efrina en la maduración de oocitos (Kuwabara, 2003 "The multifaceted C. elegans major sperm protein: an ephrin signalling antagonist in oocyte maturation" Genes and Development, 17:155-161.

Azurina Las azurinas son proteínas que contienen cobre de 128 residuos de aminoácidos las cuales pertenecen a la familia de las cupredoxinas involucradas en la transferencia de electrones en determinadas bacterias. Las azurinas incluyen aquellas de P. aeruginosa (PA) (SEQ ID NO: 1), A. xylosoxidans, y A. deni trificans . (Murphy et al . , J. Mol. Biol. 315:859-871 (2002)). La identidad de la secuencia de aminoácidos entre las azurinas varía entre 60-90%, estas proteínas mostraron una fuerte homología estructural. Todas las azurinas tienen un intercalado ß característico con una porción clave con porción clave griega y el átomo de cobre sencillo se coloca siempre en la misma región de la proteína. Además, las azurinas poseen un parche hidrofóbico esencialmente neutro que rodea el sitio del cobre. Id.

Plastocianinas Las plastocianinas son proteínas solubles de cianobacterias, algas y plantas que contienen una molécula de cobre por molécula y son azules en su forma oxidada. Se presentan en el cloroplasto, donde funcionan como portadores de electrones. Desde la determinación de la estructura de la plastocianina poplar en 1978, la estructura de las plastocianinas de algas ( Scenedesmus, Enteromorpha , Chlamydomonas) y plantas (habichuela verde) se ha determinado ya sea por métodos cristalográficos o RMN, y la estructura poplar se ha refinado hasta una resolución de 1.33 Á. SEQ ID NO: 2 muestra la secuencia de aminoácidos de plastocianina de Phormidium laminosum, una cianobacteria termofílica. SEQ ID NO: 22 muestra la secuencia de aminoácidos de plastocianina de Ulva petrusa .

A pesar de la divergencia de secuencias entre las plastocianinas de algas y plantas vasculares (por ejemplo, 62% de identidad de secuencia entre la Chlamydomonas y las proteínas poplares) , se conservan las estructuras tridimensionales (por ejemplo, desviación de 0.76 Á rms en las posiciones C alfa entre la Chlamydomonas y las proteínas Poplar) . Los aspectos estructurales incluyen un sitio de enlace al cobre tetrahédrico distorsionado en un extreme de un barril beta antiparalelo de ocho hebras, un parche pronunciado negativa, y una superficie hidrofóbica plana. El sitio del cobre se optimiza por su función de transferencia de electrones, y se proponen los parches negativos e hidrofóbicos para involucrarse en el reconocimiento de compañeros de reacción fisiológicos. Los experimentos de modificación química, reticulado, y mutagénesis dirigida al sitio han confirmado la importancia de los parches hidrofóbicos y negativos en las interacciones de enlace con el citocromo f, y validado el modelo de trayectorias de transferencia de electrones funcionalmente importantes que involucran la plastocianina. Una trayectoria supuesta de transferencia de electrones es relativamente corta (aproximadamente 4 Á) e involucra el ligando de cobre expuesto al solvente His-87 en el parche hidrofóbico, mientras que el otro es más extenso (aproximadamente 12-15 Á) e involucra el residuo casi conservado Tyr-83 en el parche negativo. (Redinbo et al . , J. Bioenerg. Biomembr. 26:49-66 (1994) ) .

Rusticianinas Las rusticianinas son polipéptidos de cadena sencilla que contienen cobre azul, obtenidas de un Thiobacillus (ahora llamado Acidi thiobacillus) . La estructura de cristales en rayos X de la forma oxidada de una cupredoxina rusticianina altamente oxidante y extremadamente estable de Thiobacill us ferrooxidans (SEQ ID NO: 3) se ha determinado por difracción anómala de longitud de onda múltiple y refinada a una resolución de 1.9Á. Las rusticianinas están compuestas de un pliegue de núcleo de intercalado beta compuestos de una lámina b de seis y siete hebras. Como otras cupredoxinas, el ion de cobre se coordina por un grupo de cuatro residuos conservados (His 85, Cysl38, Hisl43, Metl48) configurados en un tetrahedro distorsionado. (Walter et al . , J. Mol. Biol. 263:730-51 (1996)).

Pseudoazurinas Las pseudoazurinas son una familia de un polipéptido de cadena sencilla que contiene cobre azul. La secuencia de aminoácidos de pseudoazurina obtenida de Achromobacter cycloclastes se muestra en SEQ ID NO: 4. El análisis de estructura de rayos X de pseudoazurina muestra que tiene una estructura similar a las azulinas aunque hay una baja homología de secuencias entre estas proteínas. Existen dos diferencias principales entre la estructura global de las pseudoazurinas y las azurinas. Hay una extensión de la terminación carboxi en las pseudoazurinas, con relación a las azurinas, que consiste de dos hélices alfa. En la región del péptido medio las azurinas contienen un rizo extendido, acortado en las pseudoazurinas, lo cual forma una extensión que contiene una hélice corta . Las únicas diferencias importantes en el sitio del átomo de cobre son la conformación de la cadena lateral MET y la extensión del enlace del cobre Met-S, la cual es significativamente más corta en la pseudoazurina que en la azurina.

Fitocianinas Las proteínas que se identifican como fitocianinas incluyen, pero no se limitan a, proteína básica del pepino, estelacianina, avicianina, umecianina, una cupredoxina de la cascara del pepino, una proteína supuesta de cobre azul en la vaina de los guisantes, y una proteína de cobre azul de la Arabídopsis thaliana . En todos, excepto en la proteína básica del pepino y la proteína de la vaina de los guisantes, el ligando axial de metionina que se encuentra normalmente en los sitios de cobre azul, se reemplaza por glutamina.

Auracianina Tres proteínas pequeñas ed cobre azul, designadas como auracianina A, auracianina B-l, y auracianina B-2 se han aislado de la bacteria fotosintética mejoradora de flujo verde termofílica Chloroflexus aurantiacus . Las dos formas B son glicoproteínas y tienen casi propiedades idénticas una con la otra, pero son diferentes de la forma A. La electroforesis con gel de dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida demuestra masas moleculares de monómero aparentes como 14 (A), 18 (B-2), y 22 (B-l) kDa. La secuencia de aminoácidos de auracianina A se ha determinado y demostrado que la auracianina A es un polipéptido de 139 residuos. (Van Dreissche et al ; . Protein Science 8:947-957 (1999).) His58, Cysl23, Hisl28, y Metl32 están espaciados en una forma que se espera si son los ligandos de metal conservados evolutivos como en las proteínas conocidas de cobre pequeño plastocianina y azurina. La predicción de la estructura secundaria también indica que la auracianina tiene una estructura general de barril beta similar a aquella de azulina de Pseudomonas aeruginosa y plastocianina de las hojas poplares. Sin embargo, la auracianina parece tener características de secuencias de ambas clases de secuencia de proteína de cobre pequeña. La similitud global con una secuencia de consenso de azurina es aproximadamente la misma como aquella con una secuencia de consenso de plastocianina, en particular 30.5%. La región en la secuencia de la terminal N, 1^18 de auracianina es notablemente rica en glicina e hidroxi aminoácidos. Id. Ver la secuencia ejemplar de aminoácidos SEQ ID NO: 15 para la cadena A de auracianina de Chloroflexus aurantiacus (No. Acceso al Banco de Datos de Proteínas NCBI, AAM12874). La molécula de auracianina B tiene un pliegue estándar de cupredoxina. La estructura de cristal de auracianina B de Chloroflexus aurantiacus se ha estudiado. (Bond et al . , J. Mol. Biol. 306:47-67 (2001); los contenidos de la cual se incorporan para todos los propósitos como referencia.) Con la excepción de una hebra adicional en la terminal N, la molécula es muy similar a aquella de la cupredoxina bacteriana, azurina. Como en otras cupredoxinas, uno de los ligandos de Cu se encuentra en la hebra 4 del polipéptido, y los otros tres se encuentran a lo largo de un rizo grande entre las hebras 7 y 8. La geometría del sitio Cu se discute con referencia al espaciamiento de aminoácidos entre los últimos tres ligandos. El dominio de enlace de Cu caracterizado cristalográficamente de auracianina B se extiende probablemente de forma lateral al costado periplásmico de la membrana citoplásmica por una cola en la terminal N que muestra una identidad de secuencia importante con extensiones laterales conocidas en diversas otras proteínas de transferencia de electrones asociadas con membranas. Las secuencias de aminoácidos de las formas B, se presentan en McManus et al . (J Biol Chem. 267:6531-6540 (1992).). Ver la secuencia ejemplar de aminoácidos SEQ ID NO: 16 para la cadena B de auracianina de Chloroflexus aurantiacus (No. Acceso al Banco de Datos de Proteínas NCBI 1QHQA) .

Estelacianina Las estelacianinas son una subclase de fitocianinas, una familia en particular de las cupredoxinas de plantas. Una secuencia ejemplar de una estelacianina se incluye en la presente como SEQ ID NO: 14. La estructura de cristal de umecianina, una estelacianina de la raíz de rábano gigante (Koch et al . , J. Am . Chem . Soc. 127:158-166 (2005)), y la estelacianina del pepino (Hart el al . , Protein Science 5:2175-2183 (1996)), también se conoce. La proteína tiene un pliegue general similar a otras fitocianinas. La estructura terciaria del ectodominio de la proteína de efrina B2 lleva una similitud importante a la estelacianina. (Toth et al . , Developmental Cell 1:83-92 (2001).) Una secuencia ejemplar de aminoácidos de una estelacianina se encuentra en el Centro Nacional para el Banco de Datos de Proteínas para Información de Biotecnología como No. De Acceso 1JER, SEQ ID NO: 14.

Proteina básica del pepino Una secuencia ejemplar de aminoácidos de una proteína básica del pepino se incluye en la presente como SEQ ID NO: 17. La estructura de cristal de la proteína básica de pepino (CBP), una proteína de cobre azul de tipo 1, se ha refinado a una resolución de 1.8 A. La molécula se asemeja a otras proteínas de cobre azul al tener una estructura de barril beta de clave griega, excepto que el barril está abierto en un lado y se describe mejor como un "intercalado beta" o "taco beta". (Guss et al . , J. Mol. Biol. 262:686-705 (1996).) La estructura terciaria del ectodominio de la proteína de efrina B2 lleva una alta similitud (desviación rms de 1.5Á para los 50 carbonos a) a la proteína básica del pepino. (Toth et al . , Developmental Cell 1:83-92 (2001).) El átomo de Cu tiene la co-ordinación normal de NNSS' del cobre azul con longitudes de enlace Cu-N(His39) = 1.93 Á, Cu-S(Cys79) = 2.16 Á, Cu-N(His84) = 1.95 Á, Cu-S(Met89) = 2.61 Á. Una ligadura de bisulfuro, (Cys52) -S-S- (Cys85) , parece jugar un papel importante en la estabilización de la estructura molecular. El pliegue de polipéptido es típico de una sub-familia de proteínas de cobre azul (fitocianinas) así como un alérgeno de la ambrosía Ra3, que no es de metaloproteína con el cual CBP tiene un alto grado de identidad de secuencia. Las proteínas actualmente identificables como fitocianinas son CBP, estelacianina, mavicianina, umecianina, una cupredoxina de la cascara del pepino, una proteína supuesta de cobre azul en las vainas ed los guisantes, y una proteína de cobre azul de Arabidopsis thaliana . En todos excepto en CBP y la proteína de la vaina de los guisantes, el ligando axial de metionina que se encuentra normalmente en los sitios de cobre azul se reemplaza por glutamina. Una secuencia ejemplar para la proteína básica del pepino se encuentra en el Acceso al Banco de Datos de Proteínas NCBI No. 2CBP, SEQ ID NO: 17.

Métodos de la Invención Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de una o más cupredoxinas y variantes, derivados y equivalentes estructurales de las mismas en un método para tratar a un paciente mamífero que padece tal condición patológica. Más específicamente, la condición se refiere al sistema de señalización de efrina. Adicionalmente, el paciente mamífero puede estar padeciendo cáncer. En general, se sabe ahora que las cupredoxinas y variantes, derivados y equivalentes estructurales de las mismas interferirán con la actividad del sistema de señalización de efrina en una célula o tejido. Además, se sabe ahora que las cupredoxinas y variantes, derivados y equivalentes estructurales de las mismas inhibirán el crecimiento de cáncer en las células y tejidos. En modalidades específicas, la célula o el tejido es de un mamífero. En modalidades más específicas, la célula es humana. En algunas modalidades, la célula no es humana. En una modalidad, la cupredoxina y variantes, derivados y equivalentes estructurales se administran a una célula para inhibir la actividad de un receptor de la efrina en la superficie de la célula. En otra modalidad, la cupredoxina y variante, derivado o equivalente estructural del mismo se administra para incrementar la actividad de un receptor de la efrina en la superficie de la célula. En otras modalidades específicas, la cupredoxina, variantes y derivados de cupredoxina inhiben y/o incrementan la señalización de efrina delantera y/o posterior. Además, es posible por ejemplo, inhibir una señal delantera mientras se incrementa una señal posterior. La condición patológica padecida por el paciente mamífero es específicamente una que se se refiere a la actividad del sistema de señalización de efrina. Se aprecia ahora que las cupredoxinas comprenden una cierta homología estructural con las efrinas, y también puede actuar como efrinas in vivo en relación con el sistema de señ lización de efrina. Se contempla que las cupredoxinas pueden usarse para tratar condiciones patológicas que se refieren al sistema de señalización de efrina. En modalidades específicas, la condición patológica se acompaña por un a concentración más alta a la normal o más baja que la concentración normal de un componente del sistema de señalización de efrina. En otras modalidades específicas, los resultados de la condición patológicos de una sobreexpresión o expresión reducida de un componente del sistema de señalización de efrina. En otras modalidades específicas, la condición patológica resulta de la producción excesiva o falta de producción de un componente del sistema de señalización de efrina. En otras modalidades específicas, la condición patológica provoca una sobreexpresión o expresión reducida de un componente del sistema de señalización de efrina. En otra modalidad específica, la condición patológica causa producción excesiva o falta de producción de un componente del sistema de señalización de efrina. Un "componente" del sistema de señalización de efrina incluye cualquier molécula que transmite o causa que se transmita una señal que resulta del enlace de la efrina que enlaza a un receptor de efrina. En modalidades más específicas, el componente es una efrina o un receptor de efrina. Adicionalmente, la condición patológica puede acompañarse por una distribución anormal ya sea intracelular, intercelular, o de tejido específico, de un componente del sistema de señalización de efrina. En una modalidad específica, el receptor del efrina se encuentra en una concentración superior en la superficie de una célula o células. En una modalidad más específica, un receptor de efrina se sobreregula o subregula en un tejido. En otra modalidad más específica, una efrina se sobreregula o subregula en un tejido. En otro aspecto de la invención, la cupredoxina, o variante, derivado o equivalente estructural de la misma se administra a una patente con cáncer. En algunas modalidades, el paciente es mamífero, y específicamente humano. En otras modalidades, el paciente no es humano. Mientras no se limite el mecanismo de acción de este método de tratamiento, muchos cánceres son asociados con concentraciones aumentadas o disminuidas de componentes del sistema de señalización de efrina. Muchas efrinas y receptores Eph han demostrado ser sobreregulados o subregulados en los tumores, particularmente en las etapas más agresivas del progreso del tumor. Por ejemplo, la EphA2 se sobreregula en el cáncer de mama, hígado y de próstata, y glioblastoma, cáncer de células escamosas del esófago, cáncer ovárico y melanoma. En una modalidad específica, el cáncer es asociado con el receptor EphA2 sobreregulado. Sin embargo, se sabe que en muchos cánceres, componentes diferentes del sistema de señalización de efrina se sobreregulan o subregulan, en particular, las efrinas y receptores Eph. Ejemplos de expresión anormal de efrinas y receptores de efrina en varios tumores son bien conocidos en el arte, y se describe en Surawska et al. (Cytokine & Growth Factor Reviews 15:419-433 (2004)). En otras modalidades, el cáncer no está asociado con las cantidades anormales de componentes o actividades del sistema de señalización de efrina. En modalidades específicas, el cáncer es, pero no se limita a, cáncer de mama, cáncer de hígado, cáncer gastrointestinal, neuroblastoma, cáncer neuronal, leucemia, linfoma, cáncer de próstata, cáncer pancreático, cáncer pulmonar, melanoma, cáncer ovárico, tumor del endometrio, coriocarcinoma, teratocarcinoma, cáncer tiroideo, todos los sarcomas que incluyen aquéllos que surgen de los tejidos suaves y óseos, carcinomas renales, cáncer epidermoide y cáncer pulmonar de células no pequeñas. En una modalidad específica, el cáncer es deficiente en la expresión del gen supresor del tumor p53. En otras modalidades, el cáncer tiene varios atributos relacionados con la fase del crecimiento del tumor. Una etapa temprana en el desarrollo del tumor es la vascularización dónde las arterias se reclutan para que proporcionen el tumor con sangre. Mientras no se limite el mecanismo de funcionamiento en cualquier otra forma, se sabe que el sistema de señalización de efrina se refiere a la angiogénesis. En una modalidad, el cáncer es uno en el que se asocia la angiogénesis. Otra fase de desarrollo del tumor es la metástasis, dónde el tumor forma una metástasis que está definida como los injertos del tumor discontinuos con el tumor primario. Mientras no se limiten los mecanismos de funcionamiento en cualquier otra forma, se piensa que la metástasis también se refiere al sistema de señalización de efrina. En una modalidad, el cáncer es pre-metastático. En otra modalidad, el cáncer es metastático. El método para medir un efecto de un compuesto en la angiogénesis se conoce bien en el arte. Los métodos específicos para medir la angiogénesis incluyen, pero no se limitan a, los ensayos encontrados en los siguientes artículos, los contenidos que se incorporan para todos los propósitos mediante la referencia: Daniel et al, Kidney Int. Suppl. 57:S73- S81 (1996); Myers et al, J.Cell Biol. 148:343-351 (2000); Pandey et al, Science 268:567-569 (1995); Brantley et al, Oncogene 21:7011-7026 (2002). Existen muchas condiciones patológicas además de los tumores que están asociadas con la trayectoria de señalización de efrina. Por ejemplo, formas patológicas de la angiogénesis (Adams & Klein, Trends Cardiov. Medicine 10:183-188 (2000); Brantley-Sieders & Chen, Angiogenesis 7:17-28 (2004); Noren et al, Proc. Nati. Acad. ScL USA 101:5583-558 (2004).), dolor crónico que sigue al daño del tejido (Battaglia, et al., NatNeurosci. 6:339-340 (2003))., inhibición de la regeneración del nervio después de la lesión de la médula espinal (Goldscmit et al, J. , Neurosci. 6:339-340 (2003))., y las malformaciones congénitas humanas (Twigg et al. Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 101:8652-8657 (2004); Wieland et al., Am. J. Hum. Genet. 74:1209-1215 (2004))., y modalidades específicas de la invención usan cupredoxina, o variantes, derivados o equivalentes estructurales de la misma para tratar estas condiciones patológicas. En las modalidades específicas, la condición patológica es cistitis intersticial (Cl) , lesiones asociadas con la enfermedad del intestino inflamatoria (IBD) , infección por VIH, enfermedad cardiovascular, trastornos del sistema nervioso central, enfermedades vasculares periféricas, enfermedades virales, degeneración del sistema nervioso central (enfermedad de Christopher Reeve) y enfermedad del Alzheimer. Para la metodología relacionada con el tratamiento de pacientes con cistitis intersticial y la enfermedad del intestino inflamatoria, ver por ejemplo, la Solicitud de patente americana Publicación 20050049176 (publicada el 3 de marzo de 2005, los contenidos de la cual están incorporados para todos los propósitos mediante esta referencia.). Para la metodología relacionada con la inhibición o estímulo de la angiogénesis, ver por ejemplo, la Publicación de la Solicitud de patente americana No. 20040136983 (publicada el 15 de julio de 2004, los contenidos que están incorporado para todos los propósitos mediante esta referencia.). Para la metodología relacionada con las terapias para la osteogénesis, ver por ejemplo, la Publicación de la Solicitud de patente americana No. 20040265808 (publicada el 15 de julio de 2004, los contenidos que están incorporado para todos los propósitos mediante esta referencia.). La cupredoxina o variante, derivado o equivalente estructural de cupredoxina puede administrarse al paciente mediante muchas rutas y en muchos regímenes que se conocerán bien a aquéllos en el arte. En las modalidades específicas, la cupredoxina, variante o derivado de cupredoxina se administra intravenosamente, intramuscularmente, hipodérmicamente o mediante la inyección en un tumor. En una modalidad específica, la cupredoxina, variante, derivado o equivalente estructural de cupredoxina se administra intravenosamente. En las modalidades particularmente específicas, la cupredoxina, variante o derivados de la misma se administra con quimioterapia a los pacientes con cáncer o que están recuperándose de cáncer. Además de las condiciones patológicas, la cupredoxina o variantes, derivados o equivalentes estructurales de cupredoxina pueden usarse en métodos terapéuticos relacionados con otras condiciones padecidas por un paciente. Tales condiciones pueden ser el resultado de accidentes que dañan el sistema nervioso o vascular, recuperación de otras terapias, como la cirugía, y condiciones relacionadas con la vejez, entre otros. En una modalidad, el paciente requiere el crecimiento o recrecimiento de los vasos sanguíneos y la cupredoxina o variantes, derivados o equivalentes estructurales de cupredoxina se administran para guiar el crecimiento de los vasos sanguíneos. En otra modalidad, el paciente requiere de una disminución en el crecimiento de los vasos sanguíneos y la cupredoxina o variantes, derivados o equivalentes estructurales de cupredoxina se administran para inhibir el crecimiento de los vasos sanguíneos. En otra modalidad, la cupredoxina o variantes, derivados o equivalentes estructurales de cupredoxina se administran a un paciente que necesita de la generación de la neurona o regeneración para guiar el crecimiento de neuronas. En otra modalidad, se administran la cupredoxina o variantes, derivados o equivalentes estructurales de cupredoxina a un paciente para promover la osteogénesis. Otro aspecto de la invención, es un método para detectar células que despliegan receptores de Efrina específicos in vivo. Se sabe ahora que las cupredoxinas contienen una región de homología estructural alta para la efrina B2 y otras efrinas, esas cupredoxinas pueden enlazarse con la especificidad a los receptores de efrina in vitro. Por consiguiente, las cupredoxinas localizarán a la superficie de células que expresan receptores de efrina. De acuerdo con algunas modalidades, las cupredoxinas o derivados de las variantes o equivalentes estructurales de cupredoxinas pueden usarse para localizar estas células que expresan al receptor Eph y los tejidos entre las células que expresan al receptor sin Eph o tejidos. Además, las cupredoxinas o derivados de las variantes o equivalentes estructurales de cupredoxinas que despliegan una preferencia de enlace de un tipo particular de receptor Eph puede usarse para localizar células o tejidos que expresan específicamente ese tipo de receptor Eph. En una modalidad, las cupredoxinas o variantes o derivados de las mismas se enlazan a una sonda perceptible y administrada a un paciente humano, y la localización de la sonda detectable se mide en el paciente para determinar la localización de células o tejidos que expresan al receptor Eph. En una modalidad particularmente específica, la célula es una célula de cáncer. La sonda perceptible puede ser una de muchas actualmente conocidas en el arte. Las sondas de interés específico, incluyen pero no se limitan a, sondas fluorescentes, sondas radiactivas, yodo, gadolinio y oro. En otra modalidad de la invención, las cupredoxinas o variantes derivadas o equivalentes estructurales de cupredoxinas se enlazan a un fármaco y se administra a un paciente humano para suministrar el fármaco a las células o tejidos que expresan el receptor Eph. En otra modalidad específica, el tejido es un tumor. En una modalidad particularmente específica, la célula es una célula de cáncer. El fármaco puede ser cualquier clase de compuesto químico que tiene un efecto en una célula que expresa receptores Eph. El fármaco puede ser un compuesto orgánico e inorgánico, que incluye pero que no se limita a péptido, molécula de ADN, molécula de ARN, una composición farmacéutica y derivados de cualquiera de estos. En las modalidades específicas, el fármaco es una toxina tal como la exotoxina A de Pseudomonas dominio III, o un compuesto químico tal como el taxol, u otro fármaco que mata a las células del cáncer. Pueden administrarse una cupredoxina o variantes, derivados o equivalentes estructurales de cupredoxina a una célula o a un paciente humano administrando un ADN que contiene una región de codificación que codifica a la cupredoxina o variantes, derivados o equivalentes estructurales enlazados operablemente a una región del promotor que se expresa en la célula deseada o tejido del paciente humano. En una modalidad específica, un ADN que codifica a una cupredoxina o variantes, derivados o equivalentes estructurales de cupredoxina se administra a un paciente para tratar una condición moderada al tratamiento con cupredoxina o variantes, derivados o equivalentes estructurales de cupredoxina. Los vectores apropiados y métodos para administrarlos a las células y a los pacientes humanos son bien conocidos en el arte. Las metodologías para expresar las proteínas extranjeras en los sujetos humanos son bien conocidas en el arte y pueden adaptarse para expresar una cupredoxina o variantes, derivados o equivalentes estructurales de cupredoxina en los pacientes. Protocolos ejemplares se encuentran en las siguientes patentes americanas, entre otras fuentes: la Pat. americana. No. 6,339,068, emitida el 15 de enero de 2002; Pat americana. No. 6,867,000, emitido el 15 de marzo de 2005; Pat. americano. No. 6,821,957, emitida el 23 de noviembre de 2004; Pat americana. No. 6,821,955, emitida el 23 de noviembre de 2004, Pat. Americana No. 6,562,376, emitida el 13 de mayo de 2003; los contenidos de todas se encuentran incorporados para todos los propósitos mediante esta referencia. En modalidades más específicas, el ADN que codifica a una cupredoxina o variantes, derivados o equivalentes estructurales de cupredoxina se inyecta en el tumor de un paciente que padece de cáncer. En modalidades más específicas, el ADN que codifica a una cupredoxina o variantes, derivados o equivalentes estructurales de cupredoxina se inyecta en un tumor de un paciente que padece cáncer. En algunas modalidades, la composición farmacéutica se administra al paciente mediante inyección intravenosa, inyección intramuscular, inyección hipodérmica, inhalación, administración tópica, parche transdérmico, supositorio, u oral, y específicamente, inyección intravenosa. La composición farmacéutica puede administrarse simultáneamente al paciente o dentro de 1 minuto a 1 semana o más de la administración de otro fármaco conocido para tratar condiciones patológicas específicas relacionadas con la efrina o cáncer. La composición farmacéutica puede administrarse aproximadamente al mismo tiempo como otro fármaco anti-cáncer.

Composiciones Farmacéuticas que comprenden Cupredoxinas y Variantes, Derivados y Equivalentes Estructurales de Cupredoxinas . Las composiciones farmacéuticas que comprenden al menos una cupredoxina o variantes, derivados o equivalentes estructurales de cupredoxina pueden fabricarse de cualquier manera convencional, por ejemplo, mezclado convencional, disolución, granulado, preparación mediante grageas, emulsificación, encapsulado, atrapado, o procesos de liofilización. Las cupredoxinas o variantes substancialmente puras, derivados o equivalentes estructurales de cupredoxinas pueden combinarse fácilmente con un portador farmacéuticamente aceptable bien conocido en el arte. Tales portadores permiten formular la preparación como una tableta, pildora, grageas, cápsula, líquido, gel, jarabe, mezcla acuosa, suspensión, y similares. Excipientes adecuados pueden incluir también por ejemplo, rellenos y preparaciones de celulosa. Otros excipientes pueden incluir por ejemplo, agentes saborizantes, agentes colorantes, anti-pegajosidad, espesantes, y otros aditivos aceptables, adyuvantes, o aglutinantes. La metodología General en las Formas de dosificación farmacéuticas se encuentra en Ansel et ah, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (Lippencott Williams & Wiikins, Baltimore MD (1999)). La composición que comprende una cupredoxina, o variantes, derivados o equivalentes estructurales de las mismas usada en la invención pueden administrarse en una variedad de formas, que incluyen mediante inyección {por ejemplo, intradérmica, hipodérmica, intramuscular, intraperitoneal y similares) , por inhalación, mediante administración tópica, por supositorios, usando un parche transdérmica o por la boca. La información General sobre los sistemas de administración del fármaco puede encontrarse en Ansel et al.. En algunas modalidades, la composición que comprende una cupredoxina, o variantes, derivados o equivalentes estructurales de las mismas pueden formularse y usarse directamente como inyectables, para inyección hipodérmica e intravenosa, entre otros. La composición que comprende una cupredoxina, o variantes, derivados o equivalentes estructurales de las mismas también pueden tomarse oralmente después de mezclarse con agentes proteccionistas tales como glicoles de polipropileno o agentes de revestimiento similares.

Cuando la administración es mediante inyección, la cupredoxina, o variantes, derivados o equivalentes estructurales pueden formularse en las soluciones acuosas, específicamente en soluciones amortiguadoras fisiológicamente compatibles tales como la solución de Hanks, solución de Ringer o una solución amortiguadora fisiológica. La solución puede contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilización y/o dispersión. Alternativamente, la cupredoxina, o variantes, derivados o equivalentes estructurales de las mismas pueden estar en forma pulverizada para la constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua libre de pirógeno estéril, antes de su uso. En algunas modalidades, la composición farmacéutica no comprende un adyuvante o cualquier otra sustancia agregada para reforzar la contestación inmune estimulada por el péptido. En algunas modalidades, la composición farmacéutica comprende una sustancia que inhibe una respuesta inmune al péptido. Cuando la administración es mediante fluidos intravenosos, los fluidos intravenosos para usarse en la administración de la cupredoxina, o variantes, derivados o equivalentes estructurales de las mismas pueden estar compuestos de cristaloides o coloides. Los cristaloides como se usan en la presente son soluciones acuosas de sales minerales u otras moléculas solubles en agua. Los coloides como se usan en la presente contienen moléculas insolubles más grandes, como la gelatina. Los fluidos intravenosos pueden ser estériles. Los fluidos cristaloides que pueden usarse para la administración intravenosa incluyen pero no se limitan a, solución salina normal (una solución de cloruro de sodio a una concentración del 0.9%), lactato de Ringer o solución de Ringer y una solución de 5% de dextrosa en agua algunas veces llamada D5W, como se describe en la Tabla 2.

Tabla 2. Composición de Soluciones Cristaloides Comunes. * lactato de Ringer también tiene lactato 28 mmol/L, 4 mmol/L K+ y 3 mmol/L Ca2+. Cuando la administración es mediante inhalación, la cupredoxina, o variantes, derivados o equivalentes estructurales puede suministrarse en la forma de un rocío en aerosol a partir de un paquete presurizado o un nebulizador con el uso de un propulsor conveniente, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, anhídrido carbónico u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación puede determinarse proporcionando una válvula para suministrar una cantidad medida. Las cápsulas y cartuchos de por ejemplo, gelatina, para usarse en un inhalador o dosificador pueden formularse para que contengan una mezcla de polvo de proteínas y una base de polvo adecuado tal como la lactosa o almidón. Cuando la administración es mediante administración tópica, la cupredoxina, o variantes, derivados o equivalentes estructurales pueden formularse como soluciones, geles, ungüentos, cremas, jaleas, suspensiones, y similares, como se conocen bien en el arte. En algunas modalidades, la administración es por medio de un parche transdérmica. Cuando la administración es mediante supositorios (por ejemplo, rectal o vaginal), las cupredoxinas o variantes, derivados y equivalentes estructurales de las mismas, las composiciones también pueden formularse en composiciones que contienen bases de supositorio convencionales. Cuando la administración es oral, una - cupredoxina, o variantes, derivados o equivalentes estructurales pueden formularse fácilmente combinando la cupredoxina, o variantes, derivados o equivalentes estructurales de las mismas con portadores farmacéuticamente aceptables bien conocidos en el arte. Puede emplearse un portador sólido, tal como manitol, lactosa, estearato magnésico, y similares; tales portadores permiten cupredoxinas y variantes, derivados y equivalentes estructurales de las mismas para formularse como tabletas, pildoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, mezclas acuosas, suspensiones y similares, para la ingestión oral por un sujeto a ser tratado. Para las formulaciones sólidas orales tales como, por ejemplo, polvos, cápsulas y tabletas, los excipientes adecuados incluyen los rellenos tales como los azúcares, preparación de celulosa, agentes de granulación y agentes de enlace. Otros portadores adecuados, bien conocidos en el arte, también incluyen portadores multivalentes, tales como los polisacáridos capsulares bacterianos, un dextrano o un vector genéticamente diseñado. Además, las formulaciones de liberación sostenida que incluyen una cupredoxina, o variantes, derivados o equivalentes estructurales de las mismas permiten la liberación de cupredoxina, variante, derivado o equivalentes estructurales de las mismas durante períodos prolongados de tiempo, tal que sin la formulación de liberación sostenida, la cupredoxina, o variantes, derivados o equivalentes estructurales de las mismas se anularía a partir de un sistema del sujeto y/o degradado mediante por ejemplo, las proteasas e hidrólisis simple antes de extraer o mejorar el efecto terapéutico.

La vida media en el torrente sanguíneo de las composiciones de la invención pueden extenderse o perfeccionarse bien mediante varios métodos conocidos por aquéllos en el arte, que incluyen pero que no se limitan a, péptidos circulares (Monk et al, BioDrugs 19 (4) : 261-78, (2005); DeFreest et al., J. Pept. Res. 63(5):409-19 (2004))., D,L-péptidos (diastereómero), (Futaki et al, J. Biol. Chem. Feb 23;276(8) :5836-40 (2001); Papo et al, Cáncer Res. 64 (16) :5779-86 (2004); Miller et al, Biochem. Pharmacol. 36 (1) : 169-76, (1987)).; péptidos que contienen aminoácidos inusuales (Lee et al, J. Pept. Res. 63 (2): 69-84 (2004))., modificaciones en el N y C terminal (Labrie et al, Clin. Invest. Med. 13(5):275-8, (1990))., y encadenamiento de hidrocarburos (Schafineister et al, J. Am. Chem. Soc. 122:5891-5892 (2000); Walenski et al, Science 305:1466-1470 (2004)). De particular interés son la d-isomerización (substitución) y modificación de estabilidad del péptido vía la substitución D o substitución de aminoácidos L. En varias modalidades, la composición farmacéutica incluye portadores y excipientes (que incluyen pero no se limita a soluciones amortiguadoras, hidratos de carbono, manitol, proteínas, polipéptidos o aminoácidos como glicina, antioxidantes, bacteriostatos, agentes quelantes, agentes de suspensión, agentes espesantes y/o conservadores) , agua, aceites, soluciones salinas, soluciones de dextrosa y glicerol, otras sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables requeridas para condiciones fisiológicas aproximadas, tales como agentes de amortiguación, agentes de ajuste de la tonicidad, agentes humectantes y similares. Se reconocerá que, mientras cualquier portador adecuado conocido por aquellos expertos en el arte pueda emplearse para administrar las composiciones de esta invención, el tipo de portador variará, dependiendo del modo de administración. También pueden encapsularse los compuestos dentro de los liposomas usando una tecnología muy conocida. También pueden emplearse microesferas biodegradables como portadores para las composiciones farmacéuticas de esta invención. Se describen microesferas biodegradables adecuadas por ejemplo, en la Patente americana Nos. 4,897,268; 5,075,109; 5,928,647; 5,811,128; 5,820,883; 5,853,763; 5,814,344 y 5,942,252. Las composiciones farmacéuticas pueden esterilizarse mediante técnicas de esterilización bien conocidas convencionales o pueden ser filtradas por esterilización. Las soluciones acuosas resultantes pueden empaquetarse para usarse como es, o- liofilizada, la preparación liofilizada se combina con una solución estéril previo a la administración.

Administración de Cupredoxinas . La cupredoxina, o variantes, derivados o equivalentes estructurales de las mismas pueden administrarse formuladas como composiciones farmacéuticas y pueden administrarse mediante cualquier ruta adecuada, por ejemplo, mediante administración oral, bucal, inhalación, sublingual, rectal, vaginal, transuretral, nasal, tópico, percutánea, es decir, transdérmica o parenteral (incluyendo la intravenosa, intramuscular, hipodérmico e intracoronaria) . Las formulaciones farmacéuticas de las mismas pueden administrarse en cualquier cantidad eficaz para lograr su propósito intencional. Más específicamente, la composición se administra en una cantidad terapéuticamente eficaz. En modalidades específicas, la cantidad terapéuticamente eficaz generalmente es de aproximadamente 0.01-20 mg/día/kg de peso corporal. Los compuestos que comprenden la cupredoxina, o variantes, derivados o equivalentes estructurales son útiles para el tratamiento de una condición relacionada con la señalización de la efrina, o cáncer en las células y tejido mamíferos, solo o en combinación con otros agentes activos. La dosificación apropiada variará por supuesto, dependiendo de por ejemplo, el compuesto de cupredoxina, o variantes, derivados o equivalentes estructurales de las mismas empleados, la hospedera, el modo de administración y la naturaleza y severidad de las condiciones a ser tratadas. Sin embargo, en general se indican resultados satisfactorios en humanos para ser obtenidos en dosificaciones diarias de aproximadamente 0.01-20 mg/kg de peso corporal. Una dosificación diaria indicada en los humanos se encuentra en el rango de aproximadamente 0.7 mg hasta aproximadamente 1400 mg de un compuesto de cupredoxina, o variantes, derivados o equivalentes estructurales de las mismas administrado convenientemente, por ejemplo, en dosis diarias, dosis semanales, dosis mensuales, y/o en dosificaciones continuas. Las dosis diarias pueden estar en dosificaciones discretas de 1 a 12 veces por día. Alternativamente, pueden administrarse las dosis cada dos días, cada tercer día, cada cuatro días, cada cinco días, cada seis días, toda la semana, y semejantemente en incrementos diarios de hasta 31 días o más. Alternativamente, la dosificación puede ser continua mediante parches, i.v. administración y similares. El método de introducir cupredoxinas y/o variantes, derivados o equivalentes estructurales de las mismas a pacientes es, en algunas modalidades, la co-administración con otros fármacos conocidos para tratar condiciones patológicas específicas relacionadas con la señalización de la efrina o cáncer, u otras condiciones o enfermedades. Tales métodos son muy conocidos en el arte. En una modalidad específica, la cupredoxina y/o variantes, derivados o equivalentes estructurales de la misma es parte de un cóctel o codosificación que la contiene o con otras condiciones patológicas relacionadas con la señalización a la efrina o cáncer. Los fármacos de interés incluyen aquéllos usados para tratar una enfermedad del intestino inflamatoria, infección por VIH, enfermedades virales, enfermedad cardiovascular, enfermedades vasculares periféricas, trastornos del sistema nervioso central, degeneración del sistema nervioso central y enfermedad de Alzheimer. Las fármacos para tratar con la enfermedad del intestino inflamatorio, incluye, pero no se limita a, aminosalicilatos, tales como, sulfasalazina (Azulfidine®) , olsalazina (Dipentum®) , Tablalamine (Asacol,® Pentasa®) , y balsalazida (Colazal®) ; corticosteroides, como, prednisona, Medrol®, metilprednisolona, hidrocortisona, Budesonido (Entocort CEE) ; inmunomoduladores, como, azatioprina (Imuran®) , 6-mercaptopurina (6-MP, Purinethol®) y ciclosporina A (Sandimmune®, Neoral®) ; antibióticos, tales como, metronidazol (Flagyl®) y ciprofloxacino (Cipro®) ; terapias biológicas, tales como infliximab (Remicade®) ; y terapias misceláneas, tales como tacrolimus (FK506) y mofetil micofenolato. Los fármacos para tratar la infección de VIH incluyen, pero no se limita a, inhibidores de la transcriptasa inversa: AZT (zidovudina [Retrovir®] ) , ddC (zalcitabina [Hivid®] , dideoxiinosina) , d4T (stavudina [Zerit®]), y 3TC (lamivudina [Epivir®] ) , no inhibidores de transcriptasa inversos sin nucleosidos (NNRTIS) : delavirdina (Rescriptor®) y nevirapina (Viramune®) , inhibidores de la proteasa: ritonavir (Norvir®), una combinación lopinavir y ritonavir (Kaletra®) , saquinavir (Invirase®), sulfato de indinavir (Crixivan®), amprenavir (Agenerase®) , y nelfinavir (Viracept®) . Los fármacos para tratar enfermedades virales incluyen, pero no se limita a, aciclovir, globulina inmune a la varicela zoster (VZIG®) , peginterferon, ribavirina, aciclovir (Zovirax®) , valaciclovir (Valtrex®) , famciclovir (Famvir®) , amantadina, rimantadina, zanamivir, oseltamivir, e interferón alfa. Los fármacos para tratar los trastornos cardiovasculares incluyen, pero no se limitan a, anticoagulantes, agentes antiplaqueta, agentes trombolíticos, bloques adrenérgicos, estimulantes adrenérgicos, bloques adrenérgicos alfa/beta, angiotensina que convierte a los inhibidores de la enzima (ACE) , angiotensina que convierte a los inhibidores de enzimas (ACE) con bloques de canal de calcio, angiotensiná que convierte a los inhibidores de enzimas (ACE) con diuréticos-, antagonistas del receptor de angiotensina II, bloques de canal de calcio, diuréticos (incluyendo inhibidores de la anhidrasa carbónica, diuréticos de asa, diuréticos escasos en potasio, tiazidas y diuréticos relacionados, vasodilatadores, vasopresores, etc., Los fármacos para tratar la enfermedad vascular periférica incluyen, pero no se limitan a, pentoxifilina (Trental®) , un derivado de metilxantina oral, y cilostazol (Pletal®), un inhibidor de fosfodiesterasa III; terapia antiplaquetas/antitrombótica como la aspirina; los anticoagulantes como la heparina y warfarin® (Coumadin®) ; los fármacos que reducen el colesterol, como, niacina, estatinas, fibratos, tabletas lopid® (gemfibrozil; Parke-Davis) ; tabletas tricor (fenofibrato; Abbott) secuestrantes del ácido de la bilis, tabletas colestid® (clorhidrato de colestipol micronizado; Pharmacia y Upjohn) ; tabletas welchol® (clorhidrato de colesevelam; Sankyo) ; bloques de canal de calcio; vitaminas y suplementos dietéticos, como, folato, B- 6, B-12, L-arginina y ácidos grasos omega-3; e inhibidores HMG-COA Reductasa, como, tabletas advicor® (Niacin/Lovastatin; Kos) ; tabletas de liberación prolongada altocor® (lovastatin; laboratorios Andryx) ; cápsulas lescol® (sodio de fluvastatina; Novartis & Reliant) ; tabletas lipitor® (atorvastatin; Parke-Davis y Pfizer) ; tabletas mevacor® (lovastatin; Merck); tabletas pravachol® (sodio de Pravastatina; Bristol-Myers Squibb) pravigard® tabletas PAC (Aspirina amortiguada y Sodio de Pravastatina; Bristol-Myers Squibb) ; tabletas zocor® (Simvastatin; Merck) ; agentes de ácidos nicotinicos, tales como tabletas advicor® (Niacin/Lovastatin; Kos (también listadas como un inhibidor HMG-COA Reductasa)).; niaspan® (niacina; Kos); y agentes misceláneos, tales como tabletas zetia® (ezetimibe; Merck/Schering Plough) . Los fármacos para tratar los trastornos del sistema nervioso central incluyen, pero no se limitan a, agentes psicoterapéuticos, tales como varias preparaciones de benzodiazepina y combinaciones, agentes anti-ansiedad, antidepresivos (que incluyen inhibidores de Oxidasa monoamina (MAOI), inhibidores de reabsorción de serotonina selectivos (SSRIs) , antidepresivos tricíclicos), agentes anti-maniacos, agentes anti-pánico, agentes antipsicóticos, psicoestimulantes, y agentes que dirigen los trastornos obsesivo-compulsivos; preparaciones para la migraña, tales como agentes de bloqueo beta adrenérgicos, agonistas del receptor de serotonina e isomethepteno así como preparaciones de migraña misceláneas que incluyen los ingredientes activos en las tabletas depakote® (sodio de Divalproex; Abbott) y tabletas para la migraña excedrin® (acetaminofenol; Productos BMS) ; sedativos e hipnóticos; anticonvulsivos y fármacos pimozide®. Los fármacos para tratar la enfermedad de Parkinson incluyen, pero no se limitan a, agentes anticolinérgicos, inhibidores de catecol-o-metiltransferasa, agentes de dopamina e inhibidores de oxidasa de monoamina (MAO) .

Los fármacos para tratar los trastornos de degeneración del SNC incluyen lo siguiente: Fármacos para tratar la Esclerosis múltiple, pero que no se limita a, ingredientes activos en avonex® (interferón beta-la; Neurología de Biogen); Betaseron® para la inyección de SC (forma modificada del Interferón beta-Ib; Berlex) ; Copaxone® para la inyección (Acetato de Glatiramer; Teva Neuroscience) ; suspensión inyectable depo-medrol® (acetato de Metilprednisolona; Pharmacia & Upjohn) ; Novantrone® para la inyección concentrada (Mitoxantrona suministrada como clorhidrato de mitoxantrona; Serono) ; solución oral Orapred® (solución oral de fosfato de sodio de prednisolona; Ascent) ; e inyección de Rebif® (interferón beta-la; Pfizer & Serono) . Los fármacos para tratar la Enfermedad de Huntington incluyen, pero no se limitan a, tranquilizantes tales como clonazepam (Klonopin®) ; f'ramacos antipsicóticos como haloperidol (Haldol®) y clozapina (Clozaril®) ; fluoxetina (Prozac®, Sarafem®) , sertralina (Zoloft®), nortriptilina (Aventyl®, Pamelor®) , y litio (Eskalith®, Lithobid®) . Los fármacos para tratar la enfermedad de Alzheimer incluyen, pero no se limitan a, tabletas aricept® (Clorhidrato de Donepezil; Eisai o Pfizer) ; cápsulas exelon® (rivastigmina (como la sal de tartrato de hidrógeno) ; Novartis) ; solución oral exelon® (tartrato de rivastigmina; Novartis); solución oral reminyl® (hidrobromuro de nivalina; Janssen) o tabletas reminyl® (hidrobromuro de nivalina; Janssen) . El método para introducir compuestos que comprenden una cupredoxina, o variante, derivativos o equivalentes estructuralmente de las mismas para los pacientes es en algunas modalidades, la coadministración con otros impulsores conocidos para tratar el cáncer. Tales métodos son bien conocidos en el arte. En una modalidad específica, los compuestos que contienen una cupredoxina, o variante, derivados o equivalentes estructuralmente de las mismas son parte de un cóctel o co-dosificación que contienen otros fármacos para tratar el cáncer. Tales impulsores incluyen por ejemplo, aquéllos listados en la presente y específicamente 5-fluorouracil, Interferón a, Metotrexato; Tamoxifen; y Vincristina. Los ejemplos anteriores sólo se proporcionan para ilustración, muchos otros de tales compuestos se conocen por aquellos experimentados en el arte. Otros fármacos adecuados para tratar el cáncer incluyen, pero no se limitan a, agentes de alquilación tales como las mostazas de nitrógeno, sulfonatos de alquilo, nitrosoureas, e'tileniminas, y triazenos; antimetabolitos tales como antagonistas de folato, análogos de purina, y análogos de pirimidina; antibióticos como las antraciclinas, bleomicinas, mitomicinas, dactinomicinas y plicamicina; enzimas tales como L-asparaginasa; inhibidores de la transferasa de la proteína farnesilo, inhibidores de la 5 alfa-reductasa, inhibidores de la 17.beta-hidroxiesteroide deshidrogenasa tipo 3; agentes hormonales tales como los glucocorticoides, estrógenos/antiestrógenos, andrógenos/antiandrógenos, progestinas, y antagonistas de la hormona que libera a la hormona de luteinización, acetato de octreotido; agentes que interrumpen a los microtúbulos, tales como ecteinascidinas o sus análogos y derivados; agentes que estabilizan a los microtúbulos tales como los taxanos, por ejemplo, paclitaxel (Taxol®) , docetaxel (Taxotere®) , y sus análogos, y epotilonas, como epotilonas A-F y sus análogos; productos derivados de plantas y sus análogos, tales como los alcaloides de vinca, epipodofilotoxinas, taxanos; e inhibidores de la topiosomerasa; inhibidores de la transferasa de prenil-proteína; y agentes misceláneos tales como la hidroxiurea, procarbazina, mitotano, hexametilmelamina, complejos de coordinación de platino tales como cisplatina y carboplatina; y otros agentes usados como anti-cáncer y agentes citotóxicos como los modificadores de respuesta biológicos, factores de crecimiento, moduladores inmunes y anticuerpos monoclonales. También pueden usarse los compuestos de la invención junto con la terapia de radiación y cirugía. Ejemplos representativos de esta clase de agentes anti-cáncer y citotóxicos incluyen pero no se limitan a clorhidrato de mecloretamina, ciclofosfamida, cloraminofeno, melfalan, ifosfamida, busulfan, carmustina, lomustina, semustina, estreptozocina, tiotepa, dacarbazina, metotrexato, tioguanina, mercaptopurina, fludarabina, pentastatina, cladribin, citarabina, fluorouracil, clorhidrato de doxorubicina, daunorubicina, idarubicina, sulfato de bleomicina, mitomicina C, actinomicina D, safracinas, saframicinas, quinocarcinas, discodermolidas, vincristina, vinblastina, tartrato de vinorelbina, etopósido, fosfato de etoposido, teniposido, paclitaxel, tamoxifen, estramustina, sodio fosfato de estramustina, flutamida, buserelin, leuprolida, pteridinas, diyneses, levamisol, aflacon, interferón, interleucinas, aldesleukin, filgrastim, sargramostim, rituximab, BCG, tretinoina, clorhidrato del irinotecan, betametosona, clorhidrato de gemcitabina, altretamina, y topoteca y cualquier análogo o derivados de las mismas. Los miembros preferidos de esta clases incluyen, pero, no se limitan a, paclitaxel, cisplatina, carboplatina, doxorubicina, carminomicina, daunorubicina, aminopterina, metotrexato, metopterina, mitomicina C, ecteinascidina 743, o pofiromicina, 5-fluorouracilo, 6-mercaptopurina, gemcitabina, arabinosida de citosina, podofilotoxina o derivados de podofilotoxina como etoposido, fosfato de etoposido o teniposido, melfalan, vinblastina, vincristina, leurosidina, vindesina y leurosina. Ejemplos de agentes anti-cáncer y otros agentes citotóxicos útiles para co-administrar con las composiciones de la invención incluyen los siguientes: derivados de epotilona como se encuentran en la Patente Alemana No. 4138042.8; WO 97/19086, WO 98/22461, WO 98/25929, WO 98/38192, WO 99/01124, WO 99/02224, WO 99/02514, WO 99/03848, WO 99/07692, WO 99/27890, WO 99/28324, WO 99/43653, WO 99/54330, WO 99/54318, WO 99/54319, WO 99/65913, WO 99/67252, WO 99/67253 y la WO 00/00485; inhibidores de quinasa dependientes de la ciclina se encuentran en la WO 99/24416 (también ver la Pat Americana. No. 6,040,321); e inhibidores de transferasa de la proteína de prenilo como se encuentra en la WO 97/30992 y WO 98/54966; y agentes tales como los descritos genéricamente y específicamente en la patente americana. No. 6,011,029 (compuestos en los que la patente americana puede emplearse junto con cualquier modulador NHR (que incluyen pero no se limitan a, aquéllos de la presente invención) tales como los moduladores AR, moduladores ER, con moduladores LHRH, o con técnicas quirúrgicas, especialmente en el tratamiento del cáncer) . La formulación exacta, vía de administración, y dosificación se determina mediante la asistencia del médico en vista de la condición del paciente. Puede ajustarse la cantidad de dosificación e intervalos individualmente para proporcionar niveles en plasma de la cupredoxina activa, o variantes, derivados o equivalentes estructurales de las mismas que es suficiente para mantener efecto terapéutico. Generalmente, la cupredoxina deseada, o variantes, derivados o equivalentes estructurales se administra en una mezcla con un portador farmacéutico seleccionado con respecto a la ruta propuesta de administración y práctica farmacéutica estándar. En un aspecto, la cupredoxina, o variantes, derivados o equivalentes estructurales de las mismas se suministra como ADN tal que el polipéptido se genere in situ. En una modalidad, el ADN se encuentra "desnudo, " como se describe por ejemplo, en Ulmer et al, (Science 259:1745-1749 (1993)). y revisada por Cohén (Science 259:1691-1692 (1993)). La absorción del ADN desnudo puede incrementarse cubriendo el ADN sobre un portador, por ejemplo, mediante cuentas biodegradables que se transportan eficazmente en las células. En tales métodos, el ADN puede estar presente dentro de cualquiera de una variedad de sistemas de administración conocidos por aquéllos de habilidad ordinaria en el arte, que incluyen los sistemas de expresión de ácidos nucleicos, sistemas de expresión bacterianos y virales. Las técnicas para incorporar ADN en tales sistemas de expresión son bien conocidos por aquellos con habilidad ordinaria en el arte.

Por ejemplo, Ver la WO90/11092, WO93/24640, WO 93/17706, y Pat americana. No. 5,736,524. Los vectores, usados para transferir el material genético de organismo a organismo, pueden dividirse en dos clases generales: vectores de clonación que se replican en el plásmido o fago con regiones que son esencial para la propagación en una célula hospedera apropiada y en la que el ADN extranjero puede insertarse; el ADN extranjero se replica y se propaga como si fuera un componente del vector. Un vector de expresión (como un plásmido, levadura, o genoma del virus animal) se usa para introducir el material genético extranjero en una célula hospedera o tejido para transcribir y traducir el ADN extranjero, tal como el ADN de una cupredoxina. En los vectores de expresión, el ADN introducido se enlaza operablemente a los elementos tales como los promotores que señalan a la célula hospedera para transcribir altamente el ADN insertado. Algunos promotores son excepcionalmente útiles, como promotores inducibles que controlan la transcripción del gen en respuesta a los factores específicos. La cupredoxina y variantes, derivados o equivalentes estructurales- de las mismas enlazados operablemente al polinucleótido para que un promotor inducible pueda controlar la expresión de la cupredoxina y/o citocromo c y variantes y derivados de las mismas en respuesta a factores específicos. Ejemplos de promotores inducibles clásicos incluyen aquéllos que son sensibles al interferón a, choque por calor, iones metálicos pesados, y esteroides tales como los glucocorticoides (Kaufman, Methods Enzymol. 185:487-511 (1990)) y tetraciclina. Otros promotores inducibles deseables incluyen aquéllos que no son endógenos a las células en las que el constructo se introduce, pero, son sensibles a esas células cuando el agente de inducción se suministra exógenamente. En general, los vectores de expresión útiles son a menudo plásmidos. Sin embargo, se contemplan otras formas de vectores de expresión, tales como los vectores virales (por ejemplo, la replicación de retrovirus defectivos, adenovirus y virus asociados con el adeno) . La elección del vector se dicta mediante el organismo o células que se usan y el destino deseado del vector. En general, los vectores comprenden secuencias de señal, orígenes de repetición, genes marcadores, sitios de polienlaces, elementos de mejora, promotores, y secuencias de terminación de la transcripción.

Kits que comprenden Cupredoxina, o variantes, derivados o equivalentes estructurales de las mismas. En un aspecto, la invención proporciona kits que contienen uno o más de los siguientes en un paquete o recipiente: (1) una composición biológicamente activa que comprende al menos una cupredoxina, o variantes, derivados o equivalentes estructurales de las mismas; (2) una composición biológicamente activa que comprende un fármaco coadministrado; (3) un excipiente farmacéuticamente aceptable; (4) un vehículo para la administración, tal como una jeringa; (5) instrucciones para la administración. Las modalidades en las que dos o más de componentes (1) - (5) se encuentra en el mismo empaquetamiento o recipiente también se contemplan. El fármaco co-administrado puede seleccionarse previamente a partir de aquéllos mencionados. Cuando un kit se proporciona, pueden empaquetarse los componentes diferentes de la composición en los recipientes separados y pueden mezclarse inmediatamente antes de su uso. Tal empaquetamiento de los componentes por separado puede permitir el almacenamiento a largo plazo sin perder las funciones de los componentes activos. Pueden suministrarse los reactivos incluidos en los kits en los recipientes de cualquier clase tal que la vida de los diferentes componentes se conserve y no se absorban o alteren por los materiales del recipiente. Por ejemplo, las ampolletas de vidrio selladas pueden contener cupredoxina liofilizada y variantes, derivados o equivalentes estructurales de las mismas, o soluciones amortiguadoras que se han empaquetado bajo un gas neutral no reactivo tal como el nitrógeno. Las ampolletas pueden consistir de cualquier material adecuado, tal como el vidrio, polímeros orgánicos, tales como policarbonato, poliestireno, etc., cerámica, metal o cualquier otro material típicamente empleado para mantener reactivos similares. Otros ejemplos de recipientes adecuados incluyen botellas simples que pueden fabricarse a partir de substancias similares tales como las ampolletas, y sobres que pueden comprender interiores laminados en línea tales como aluminio o una aleación. Otros recipientes incluyen tubos de ensayo, ampolletas, frascos, botellas, jeringas, o similares. Los recipientes pueden tener un puerto de acceso estéril, tal como una botella que tiene un tapón que puede agujerearse mediante una aguja de inyección hipodérmica. Otros recipientes pueden tener dos compartimientos que están separados por una membrana fácilmente removible que luego de la remoción permite a los componentes mezclarse. Las membranas removibles pueden ser de vidrio, plástico, caucho, etc. , También pueden suministrase kits con materiales de instrucciones. Pueden imprimirse instrucciones en papel u otros substratos, y/o puede proporcionarse mediante un medio legible electrónico tales como un disco flexible, CD-ROM, DVD-ROM, disco en formato comprimible Zip, vídeo, cásete, dispositivo de memoria instantánea etc. No pueden asociarse las instrucciones detalladas físicamente con el kit; en cambio, un usuario puede .dirigirse a un sitio web del Internet especificado por el fabricante o distribuidor del kit, o proporcionado como correo electrónico.

Modificación de Cupredoxina y Variantes, Derivados o Equivalentes estructurales de las mismas. Una cupredoxina, o variantes, derivados o equivalentes estructurales de las mismas pueden modificarse químicamente, o genéticamente alterados para producir variantes y derivados como se explicó anteriormente. Tales variantes y derivados pueden ser sintetizados mediante técnicas estándar. Además de las variantes alélicas que ocurren naturalmente de la cupredoxina, los cambios pueden ser introducidos mediante mutación en la secuencia que codifica a la cupredoxina, que incurre en alteraciones en las secuencias del aminoácido de la cupredoxina codificada que no altera significativamente la capacidad de la cupredoxina para interferir con la señalización de la efrina o inhibir el crecimiento del cáncer. Un residuo del aminoácido "no esencial" es un residuo que puede alterarse de las secuencias del tipo salvaje de la cupredoxina sin alterar la actividad biológica, considerando que un "residuo de aminoácidos esencial" se requiere para tal actividad biológica. Por ejemplo, los residuos del aminoácido que se conservan entre las cupredoxinas se pronostican para ser particularmente no posibles de alteración, y por lo tanto "esencial".

Los aminoácidos para los cuales las substituciones conservativas que no cambian la actividad del polipéptido se pueden elaborar y son bien conocidos en el arte. Las substituciones conservadoras útiles se muestran en la Tabla 3, "Substituciones Preferidas". Las substituciones conservativas por medio de las cuales un aminoácido de una clase se reemplaza con otro aminoácido del mismo tipo caen dentro del alcance de la invención por lo que la substitución no altera materialmente la actividad biológica del compuesto. Tabla 3. Substituciones preferidas.

Las sustituciones no conservativas que afectan (1) la estructura de la distribución del polipéptido, tal como una conformación de hoja ß o a helicoidal, (2) la carga, (3) hidrofobicidad, o (4) el volumen de la cadena lateral del sitio objetivo puede modificar la función del factor citotóxico. Los residuos son divididos en grupos basados en propiedades de cadena lateral como se denota en la Tabla . Las sustituciones no conservativas traen consigo el intercambio de un miembro de una de estas clases para otra clase. Pueden introducirse las sustituciones en los sitios de substitución conservativa o más específicamente en los sitios no conservados.

Tabla 4. Clases de aminoácidos Los polipéptidos variantes pueden utilizarse mediante el uso de métodos conocidos en el arte tales como mutagénesis mediada por los oligonucleótidos (dirigida en el sitio) , escaneo por alanina y mutagénesis por PCR. La mutagénesis dirigida en el sitio (Carretero, Biochem J. , 237:1-7 (1986); Zoller y Smith, Methods Enzymol. 154:329-350 (1987)), mutagénesis de cásete, mutagénesis de selección por restricción (Wells et ah, Gene 34:315-323 (1985)) u otras técnicas conocidas pueden realizarse en el ADN clonado para producir el ADN de la variante de cupredoxina. También pueden usarse mutaciones conocidas de cupredoxinas para crear una cupredoxina variante a ser usada en los métodos de la invención. Por ejemplo, se sabe que los Cl 12D y mutantes M44KM64E de azurina de Pseudomonas aeruginosa tienen actividad citotóxica y de detención de crecimiento que es diferente de la azurina nativa, y tal actividad alterada puede ser útil en los métodos del tratamiento de la presente invención. Una modalidad de los métodos de la invención utiliza cupredoxinas y variantes y derivados de la misma que retienen la capacidad para interferir con la señalización de la efrina o inhibir el crecimiento del cáncer en las células de mamífero. En otra modalidad, los métodos de la presente invención utilizan variantes de cupredoxina tales como el mutante M44KM64E, que tienen la capacidad para provocar la detención del • crecimiento celular. Una comprensión más completa de la presente invención puede ser obtenida mediante la referencia a los siguientes ejemplos específicos. Los Ejemplos se describen solamente para los propósitos de ilustración y no pretenden limitar el alcance de la invención. Se contemplan cambios en la forma de substitución de equivalentes como las circunstancias que pueden sugerir o pueden ser convenientes. Aunque las condiciones específicas han sido empleadas en la presente, tales condiciones pretenden ser descriptivas y no con propósitos limitantes. Las modificaciones y variaciones de la invención como se establecieron anteriormente pueden hacerse sin apartarse del espíritu y alcance, y, por consiguiente, únicamente tales limitaciones deben imponerse como se indica en las reivindicaciones anexas.

EJEMPLOS Ejemplo 1: Estudios in vivo del desarrollo de C. elegans. Algunas efrinas son conocidas en la Caenorhabdi tis elegans para involucrarse en la formación del músculo en la cola y el desarrollo embrionario. Los experimentos preliminares indican esas interferencias de rusticianina con la formación de músculo de la cola (causando parálisis de la cola) mientras la azurina previene el nacimiento del bebé (desarrollo embrionario) . En estos experimentos, los genes de azurina y genes de rusticianina se hiperexpresaron en la E. coli . Un control de la E. coli sin azurina o genes de rusticianina se mantuvieron. Cuando los gusanos de C. elegans se alimentaron con el control de la JE. coli hasta 3 días, estos eran saludables y produjeron bebés. Cuando la C. elegans se alimentó con E. coli que expresa azurina, parecían saludables pero produjeron muy pocos bebés. Cuando C. elegans se alimentó con E. coli que expresa rusticianina aproximadamente 30% podrían únicamente mover sólo sus cabezas o partes superiores de sus cuerpos pero no sus colas o la parte inferior de su cuerpo, demostrando así una parálisis.

Ejemplo 2: Análisis de los vecinos estructurales de Azurina. El análisis de la estructura de la proteína vecina se determinó mediante la comparación directa de estructuras de proteínas en 3 dimensiones en la Base de datos de modelación Molecular con el algoritmo de la Herramienta de Búsqueda de Alineación del Vector (VAST) (Gibrat et al, Curr Opin Struct Biol 6:377 - 385 (1996);. Madej et al, Proteínas 23:356-3690 (1995)). La Base de Datos de Modelación Molecular contiene los datos experimentales de las determinaciones de la estructura cristalográfica y NMR y se mantiene por el Centro Nacional para la Información de la Biotecnología (Bethesda, MD, EE.UU.). Un programa que realiza el análisis de la estructura de la proteína vecina VAST está .disponible a través del Centro Nacional para la Información de la Biotecnología. La Azurina mostró una superposición estructural significativa (valor Vast P: 10 e -4.6; la longitud de Alineación: 90 aa;% la Identidad: 6) (Fig. 1), superposición estructural con el MMDB (Base de Datos de Modelación Molecular) entrada 1 KGY E (estructura cristalina del complejo EphB2-EfrinaB2) . La alineación de la superposición de azurina con la estructura cristalina referida se refiere a la cadena E (138 aa) , una proteína denominada Efrina (Efrina-B2) . Este análisis computacional está de acuerdo con los datos estructurales publicados en Himanen et al. {Nature, vol 414: 933-938 (2001) ) . El análisis VAST indica además que las cupredoxinas, auracianina, plastocianina, proteína básica de pepino y estelacianina también muestra una homología estructural significativa en la efrinaB2 en la región de vuelta G-H (Fig. 2) Ejemplo 3: Eficacia de los péptidos sintéticos derivados de azurina y plastocianina. Se ha analizado la eficacia de los péptidos sintéticos derivados de azurina y plastocianina que son estructuralmente similares al rizo de efrina humana B-2 G-H humano. Un péptido de 18-mer azurina con la siguiente secuencia se ha sintetizado mediante técnicas estándar: TFDVSKLKEGEQYMFFCT SEQ ID NO:: 18 Las células del cáncer de mama MCF-7 se incubaron en placas de 16 pozos con 5 y 50 ug/ml del péptido de azurina 18-mer para O, 24, 48 y 72 horas después de que el número de células MCF -7 se contaron en un contador coulter. El péptido se vio a 50 ug/ml para inhibir el crecimiento celular MCF-7 mediante 50% en 48 a 72 horas, comparado con las células sin el tratamiento del péptido sintético. La magnitud de inhibición del crecimiento celular fue de aproximadamente 25% en 5 ug/ml del péptido sintético de 18-mer comparado con un control no tratado. Este experimento muestra que el péptido sintético diseñado solamente en su similitud estructural a la efrina B-2 inhibe la progresión celular del cáncer promovida por la efrina B-2.

Ejemplo 4: Medición in vitro del efecto de cupredox naas en el crecimiento de células Mel-2 y MCF-7. El crecimiento de células tratadas con la cupredoxinas se midió usando una placa de 16 pozos. Las células Mel-2 o células MCF-7 (5 x 105 células por pozo) se permitió adherir a las placas de múltiples pozos (16 pozos, en este caso durante 24 horas. Después de la adherencia, el medio de crecimiento se vació con sifón fuera. El PBS (solución salina amortiguada con fosfato) o varias cupredoxinas/citocromos en concentraciones de 0.1 a 10 uM se agregaron en PBS a los pozos que contienen los medios de crecimiento recientes y el crecimiento de las células de cáncer se continuó durante 24, 48 y 72 horas. Después del período de incubación, el azul de tfipano se agregó al cultivo y el número de células flotantes muertas se contaron. Ambas células vivas y muertas flotantes se contaron para determinar el IC50 en varias dosis de la cupredoxina. La IC50 es la concentración de proteína que inhibe el crecimiento del cultivo celular mediante el 50%. En 500,000 células por pozo en las 24 horas de crecimiento, bastantes células estuvieron presentes para el conteo reproducible. En los cultivos de las células de control menos cupredoxinas, así como en el desarrollo de células, estas tuvieron menos espacio para adherirse al fondo del pozo, empezaron a morirse y se volvieron células flotantes. En los cultivos de la célula tratados con rusticianina o tratados con plastocianina, las células también se sobredesarrollaron en el área de superficie del pozo y empezaron a morir y flotaron pero su numero fue menor que el control. Sin embargo, en los cultivos de las células tratadas con azurina, ambos crecimientos de la línea celular Mel - 2 y MCF-7 se inhibieron provocando poco flotamiento de las células.

Ejemplo 5: Simi itud Estructural entre el Ectodominio de la EfrinaB2 y Cupredoxinas. Las similitudes estructurales entre el ectodominio de la efrinaB2 y las cupredoxinas se determinaron usando VAST y los logaritmos DALÍ (Holm y Sander., J. , Mol. Biol. 233:123-138 (1993); Gibrat et al., Curr Opm. Biol. 6"377-385 (1996)). respectivamente disponibles a través del Instituto Nacional Americano de Salud y el Instituto de Bioinformática Europeo.

Las alineaciones de secuencia en pares basadas en la estructura se calcularon usando el algoritmo VAST. Los diagramas estructurales de la proteína se realizan en dos dimensiones usando dibujos animados TOPS (Topología de la Estructura de la Proteína) (Torrance et al, Bioinformatics 21:2537-2538 (2005)). Las valoraciones de las estructuras se realizaron usando el programa Mol Mol (Koradi et al, J. , Mol.

. Graphics 14:51-55 (1996)). Se encontraron varios homólogos con ambos programas (datos no mostrados) , incluso un subconjunto pequeño de proteínas de cupredoxina monoméricas, plastocianina, azurina y rusticianina. Específicamente, la comparación estructural entre el ectodominio de efrinaB2 y estas tres cupredoxinas (que se eligieron como proteínas representativas de la familia de la cupredoxina) , con tal de que VAST y las alineaciones DALÍ con registros bastante similares y significativos, respectivamente en el rango de 11.0 a 9.7 (fuera de un máximo posible de 15.7) y 6.7 a 6.4 registros DALÍ Z < 2.0 son estructuralmente disímiles (Tabla 5). La mayoría de la conservación estructural existente entre el ectodominio de la efrinaB2 y plastocianina, se sobrepuso con una desviación media cuadrática de la raíz (r.m.s.d.) de 1.8 UN (calculada sobre 67 átomos de Ca estructuralmente equivalentes) (Tabla 5) . En contraste, la azurina, plastocianina y rusticianina exhiben una identidad de secuencia primaria más débil (menos de 10%) con el ectodominio de la efrinaB2 (Tabla 5) .

Tabla 5 Similitud estructural del ectodominio B2 de efrina humano para los tres miembros (plastocianina, azurina y rusticianina) del monodominio de la familia de la cupredoxina. a- registro VAST - El registro de similitud de estructura VAST; este número se relaciona al número de elementos de estructura secundaria superimpuestos y la calidad de esa superposición . Los registros VAST superiores correlacionados con la similitud más alta. b- registro DALÍ Z- Los registros Z se calculan usando las comparaciones en pares de la estructura de ectodominio de efrina con otras estructuras en la base de datos DALÍ. El registro Z más alto, es menos probable de que la similitud entre las estructuras 3D es aleatoria (pares con Z < 2.0 son estructuralmente disimilares) . c-RMSD- la desviación media de la raíz cuadrada de los residuos de la estructura en ángstrom entre las partes alineadas del par de estructuras. La figura 3 muestra las ilustraciones TOPS (A) y las figuras (B) MolMol de la efrina B2 de ectodominio y cada una de las tres cupredoxinas bajo un estudio. La descripción topológica demostró que las proteínas adoptan la forma de intercalado de dos hojas ß que forma el registro del pliegue con clave griega y muestra la similitud estructural notable en el forma del número y orientación de las hebras ß; 1KGY_E (efrinaB2) , 1IUZ (plastocianina) e IJZG_A (azurina) (Fig. 3). En contraste, el número y arreglo de hélices a son mucho menos conservadas. En JZG A, la estructura helicoidal es única comparada con las otras proteínas representadas en la presente. Como puede esperarse para las proteínas con tamaños diferentes, las vueltas que conectan los elementos de estructura secundaria mostraron diferencias en las longitudes y sus conformaciones. La IRCY (rusticianina) tiene homología estructural más baja, con diferencias sustanciales en las longitudes de los elementos de estructura secundarios compartidos (SSEs) y la presencia de SSEs no compartidos.

Ejemplo 6: Análisis de las interacciones del Receptor de Cupredoxina Eph-Fc mediante Resonancia de Plasmon en la super icie. Las interacciones específicas de los receptores Eph con las cupredoxinas se determinaron mediante el análisis de resonancia de plasmón en la superficie (SPR) . El CCF-STTGl Astrocitoma humano, Glioblastoma LN 229 y células MCF-7 (cáncer de mama) se cultivaron en un medio RPMI 1640 que contenía 2 mm de L-glutamina, 10 mm de Hepes, 10% (vol/vol) de FBS inactivado por calor, 100 unidades/ml de penicilina y 100 ug/ml de estreptomicina a 37°C en un incubador humidificador con 5% de C02 como se describió anteriormente (Yamada et al, Cell Microbiol 7:1418-1431 (2005); Hiraoka, Proc. Nati. Acad. ScL USA 101: 6427 - 6432 (2004)). Las células del melanoma humano de UISO-Mel-2 (Yamada et al, Proc. Nati. Acad. ScL USA 99:14098-14103 (2002)). Se cultivaron en MEM con el medio Hanks suplementado con 10% FBS. La Escherichia coli JM109 y BL21 (DE3) se usó como cepas hospederas para la hiperproducción de azurina, rusticianina y plastocianina. La azurina y rusticianina se purificaron como se describió anteriormente (Yamada et al, Proc. Nati. Acad. USA 99:14098-14103.(2002); Yamada et al., Cell Cycle 3:1182- 1187 (2004)). Se han informado la construcción y purificación de los derivados de la fusión de la azurina GST (Yamada et al, Cell Microbiol. 7:1418-1431 (2005)). La purificación y expresión de plastocianina de Phormidium laminosum se llevó a cabo esencialmente como se describió anteriormente (Schlarb et al, Gen 234:275-283 (1999))., excepto que la cepa BL21(DE3)Cd+(RIL) de la E. coli se usó en lugar de BL21(DE3). La concentración de proteína totalmente oxidada se determinó espectrofotométricamente en 598 nm, usando un coeficiente de extinción de 4700 M^Cpf1. Las proteínas de fusión Fc del ectodominio Eph y las efrinas se compraron como polvos liofilizados de los Sistemas R & D, Minneapolis, MN. Todos los otros químicos usados para la resonancia de plasmón de superficie y experimentos de crecimiento se compraron de Biacore AB Internacional o Sigma y fueron de calidad analítica alta. Las interacciones de la proteína - proteína directa entre las cupredoxinas o péptidos GST con Eph-Fc o efrinaB2 - Fc se determinaron con un sistema de biosensor Biacore X (Biacore AB) que se basa en la tecnología de resonancia de plasmón de superficie (SPR) . En la inmovilización de experimentos de separación por exclusión inicial de azurina, rusticianina, o plastocianina para un solo canal en el chip del sensor CM5 se logró usando el procedimiento de acoplamiento de amina. Las inyecciones secuenciales de N-hidroxisuccinimida/N- (3-dmetilamino?ropi 1) -N-etilcarbodiimida (0.05M/0.2M, 35 µL) , proteínas de cupredoxina (255 µM, 50 µL) , etanolamina IM (50 µL, pH 8.8), y 100 mM de NaOH (10 µL) enlazado covalentemente a las proteínas para los chips del sensor CM5 con incrementos en las señales de resonancia de 300 RU. Los experimentos de enlace se condujeron vía las inyecciones secuenciales de 100 nM de proteínas Eph-Fc en la solución amortiguadora de ejecución HBS-EP (0.01 M HEPES, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mm EDTA, 0.005% v/v Tensoactivo P20) sobre las superficies del sensor en proporciones de flujo de 5 y 30 µL/min durante 2.3 min (inyección de 70 µL) con inyecciones intermedias de 100 mm NaOH (pulsación 10 µL) para regenerar la superficie de la cupredoxina-CM5. Todos los experimentos de enlace se ejecutan contra una superficie del sensor Au desnudo CM5 (canal negativo) para corregir el enlace no específico. Las selecciones rápidas de enlace se realizaron en chips de sensor modificados con cupredoxina con una inyección secuencial de 100 nM de receptores Eph-Fc en una proporción de flujo de 30 µL/min sobre 2.3 min. Las curvas representan el inicio de la fase de asociación para las interacciones de Eph-Fc con azurina, plastocianina, y rusticianina. Se tomaron afinidades de enlace relativas como una función de las resonancias de saturación (Req) que varían de 79 RU para el enlace de rusticianina en EphBl-Fc o EphA8-Fc para 1248 RU para azurina que enlaza a EphB2-Fc. El enlace de selección cruzada de las cupredoxinas al EphA específico y las proteínas del receptor EphB son notables con las mejores interacciones que ocurren entre la cupredoxina y EphB. Los sensogramas de SPR para enlazar cupredoxinas inmovilizadas con Eph-Fc indicaron un reconocimiento selectivo entre estos dos subconjuntos de proteínas (Fig. 4A-C) . En estas mediciones, las concentraciones Eph-Fc se mantuvieron constantes en 100 nM para que las diferencias en el grado de asociación expresada en términos de Req reflejen las diferencias en afinidades entre las proteínas del receptor Eph-Fc y cupredoxinas. La azurina demostró la afinidad más alta para EphB2-Fc y A6 y también un firme enlace A4 y A7 (Fig. 4A) . Por otra parte, la plastocianina mostró selectividad para EphAl-Fc, A3 y B2 y, a un grado menor A2 y A6 (Fig. 4B) . Por último, la rusticianina reconocieron EphA8-Fc, y Bl, pero sólo débil (Fig. 4C) . Las interacciones asociativas de azurina con EphB2-Fc y EphA6-Fc fueron las más altas con valores Req 1248 y 1200 RU respectivamente.

Ejemplo 7: Análisis de las Afinidades de enlace de Azurina y péptidos GST - Azu con Mediciones de Enlace EphB2-Fc - SPR. Las afinidades de enlace de azurina y péptidos GST-azu con las mediciones de enlace EphB2-Fc-SPR se realizaron con azurina o péptidos GST-Azu usando el EphB2-Fc inmovilizado para evaluar la afinidad de enlace relativa de la azurina de longitud completa o sus diversos dominios para el receptor EphB2-Fc. Se inyectaron Azurina o péptidos GST-Azu en concentraciones crecientes (0.05-100 nM) para EphB2-Fc o los chips CM5 modificados con efrinaB2-Fc con 100 mm de NaOH de pulsos entre las inyecciones. Los datos se fijaron a un modelo de enlace Langmuir (1:1) [Req = Rmax/(1 + Kd/C) para extrapolar el equilibrio las constantes de enlace (Kd) . La estrategia experimental para elucidar el determinante estructural de azurina para el enlace EphB2-Fc se muestra en la Fig. 5 que describe el mapa de los parámetros primarios/secundarios estructurales de azurina y los constructos GST-Azu como se describió antes (Yamada et al.,. Cell Microbiol 7:1418-1431 (2005)). En particular, el GST-Azu 88-113 es coincidente con la región de vuelta GH de efrina B2 (ligando nativo) y por consiguiente su eficacia de enlace con EphB2-Fc fue de interés particular. Las mediciones de enlace inicial de azurina y varios constructos GST-Azu (todos a 100 nM) para EphB2-Fc reveló su afinidad relativa: es decir, azurina > GST-Azu 88-113 > GST-Azu 36-128 > efrinaB2-Fc > GST-Azu 36-89» GST (Fig. 6A) . La azurina y azurina etiquetada con GST demostró afinidades comparables (no se muestran datos) . Para cuantificar las afinidades de enlace, los valores de respuesta de saturación (Req) para azurina o GST- Azu se midieron como una función de sus concentraciones (0-100 nM) (Fig. 6B) . Los datos de enlace se fijaron a una ecuación de enlace (1:1) Langmuir simple para determinar las constantes de disociación de equilibrio (Kd) . Notablemente, la azurina (Kd = 6 nM) y GST-Azu 88-113 (Kd =12 nM) tuvieron afinidades altas de de 5 y 2.5 pliegues respectivamente, para EphB2-Fc en lugar de su ligando de efrinaB2-Fc nativa (Kd = 30 nM) . También, GST-Azu 36-128 (Tabla 6) mostró afinidad ligeramente superior (Kd = 23 nM) que la efrinaB2-Fc (Kd = 30 nM) . En contraste, GST-Azu 36-89 y GST exhibieron un enlace despreciable (Tabla 6) . Estos datos indican la importancia de la región Azu 88-113 de azurina para la interacción EphB2-Fc de afinidad alta. La región Azu 88-113 consiste en el dominio GH de vuelta dominio que es estructuralmente homólogo a la vuelta GH encontrada en la efrinaB2.

Tabla 6. Afinidades de enlaces relativas de azurina y constructos GST-Azu con EphB2-Fc.

Las resistencias de enlace relativas de azurina y constructos GST-Azu con EphB2 - Fc se determinaron en experimentos de titulación de enlace SPR y el conjunto de datos extrapolados se resumieron en al presente y se compararon con el enlace del ligando de efrinaB2-Fc nativo y GST. Se generaron los datos de un experimento de separación por exclusión luego de la inyección de 100 nM analítica a las superficies del sensor y las señales de saturación (Req) se listaron en las unidades de resonancia. La saturación en el enlace se logró en cada punto de titulación en las curvas de enlace descritas en la Figura 6b y estos valores se perfilaron contra [analítico] se usaron para calcular las constantes de disociación de equilibrio (Kd) . Los valores Kd fueron de 6 a 61 nM para las interacciones de azurina y GST-Azu mientras EphB2-Fc con el ligando nativo tuvo una afinidad de enlace intermedia dentro de este rango.

Ejemplo 8: Análisis de Estudios de Enlace de Competición para Azurina /GST-Azu y EfrinaB2-Fc con EíphB2-Fc Para entender bien los efectos fisiológicos para el enlace EphB2-Fc de azurina de alta afinidad se realizó además de las mediciones de enlace. Las titulaciones del enlace de competición se realizaron de manera similar a los estudios constantes de enlace excepto que la efrinaB2-Fc (246 nM) + competidor [azurina o GST-Azu (0-1020 nM) ] se inyectó sobre la superficie del sensor EphB2-Fc CM5. Las muestras de azurina + efrinaB2-Fc se añadieron a diferentes concentraciones de azurina (0-1020 nM, [efrinaB2-Fc] es 246 nM) a la superficie del sensor y los datos se perfilaron como una proporción de resonancias, % de respuesta total [Req (azurina+efrinaB2-Fc) / (Req/ (efrinaB2 - Fc)).]. GST-Azu 88-113 y GST-Azu 36-89 se titularon con efrinaB2-Fc para inmovilizar EphB2-Fc y se analizaron de una manera similar. Los datos de competición sugieren una estequiometría 1:1 de enlace entre la azurina y GST-Azu 88-113 con EphB2-Fc inmovilizada. Primero se midió el enlace de azurina y los constructos GST-Azu para el ligando EphB2-Fc, efrinaB2-Fc. La Fig. 7A muestra de hecho que la azurina enlaza a la efrinaB2-Fc con afinidad alta (Kd = 8.5 + 0.8 NM) , reflejando las similitudes estructurales entre estas dos proteínas (Tabla 5) . La afinidad relativamente alta de GST-Azu 88-113 (Kd = 39 + 6.5 nM) para la efrinaB2-Fc indica que la región entre 88 y 113 también es responsable del enlace de la efrinaB2-Fc. En contraste, GST y GST-Azu 36-89 no mostraron ninguna interacción significativa con la efrinaB2-Fc. Tomado juntos, estos datos indican que la azurina puede enlazarse con afinidad alta para ambas EphB2-Fc y efrinaB2-Fc vía su región de vuelta GH (88-113) .

Para probar además esta noción, se realizó un análisis SPR de enlace de efrinaB2-Fc a EphB2-Fc inmovilizado sobre un chip del sensor CM5 después de que la efrinaB2-Fc se incubó con concentraciones variantes de azurina y constructos GST-Azu. La fig. 7B muestra la inhibición de la efrinaB2-Fc ( [efrinaB2-Fc] = 246 nM) ligando a EphB2-Fc mediante 0-1020 nM de azurina, GST-Azu 88-113, y GST-Azu 36-89, respectivamente. La inhibición se expresa en términos del % de respuesta total (= [eq de R (azurina + efrinaB2-Fc) /Req (solo efrinaB2-Fc) ] * 100). Los perfiles de inhibición indican un enlace disminuido de la proteína total para EphB2-Fc inmovilizado cuando la efrinaB2-Fc se preincuba con azurina o GST-Azu 88-113, con azurina que es un inhibidor más potente que el GST-Azu 88-113. La preincubación de azurina o GST-Azu 88-113 con la efrinaB2-Fc redujeron el enlace de la proteína total en la superficie hasta en un 60%. GST-Azu 36-89, por otro lado, no afectó el enlace de la proteína total (Fig. 7B) , y esto es consistente con su enlace débil ya sea para la efrinaB2-Fc o EphB2-Fc. Parece que la azurina (o GST-Azu 88 - 113) forma un complejo estequiométrico con la efrinaB2-Fc debido a que la inhibición máxima se logró con una proporción de 1 a 1 de efrinaB2-Fc y azurina (o GST-Azu 88-113) . El hecho de que la inhibición por azurina o GST-Azu 88-113 niveles fuera del 40 a 50% indican que el complejo putativo de azurina-efrinaB2-Fc tiene poca afinidad por el receptor EphB2-Fc. Colectivamente, estos datos de enlace indican que la azurina tiene afinidad alta por la efrinaB2-Fc y EphB2-Fc y que pueden interferir con la efrinaB2-Fc-EphB2-Fc que se enlaza mediante un mecanismo dual de secuestro del ligando y ocupación del receptor.

Ejemplo 9: Análisis de Actividad Citotóxica de Péptidos Azu 96-113 y Plc70-84 Sintéticos y Varias Lineas Celulares de Cáncer Hacia Derivados de Fusión GST-Azu. Luego de la alineación de la secuencia basada en la estructura de azurina y plastocianina con el ectodominio de efrinaB2 humano, se diseñaron los péptidos que corresponden a la región de vuelta G-H de efrinaB2 (llamada Azu 96-113 (SEQ ID NO: 18) y Pie 70-84 (SEQ ID NO: 20)), la cual es la región principal que media el enlace de afinidad alta de las efrinas a los receptores Eph (Himanen et al, Nature 414:933-938 (2001); Toth et al, Dev. Cell. 1:83-92 (2001)). En la Fig. 8, la superimposición estructural de los segmentos C terminal del ectodominio de la efrinaB2, puede verse la azurina y la plastocianina. la alineación de la secuencia basada estructuralmente en la azurina y la plastocianina con el ectodominio de la efrinaB2 humana se usó para diseñar péptidos basados en la región que media el enlace de afinidad alta del receptor de la efrinaB2 al receptor EphB2 (hebra G hebra H vuelta- del ectodominio de la efrinaB2-Fc) de azurina, principalmente Azu 96-113 (96-TFDVSKLKEGEQYMFFCT -113) y plastocianina, principalmente Pie 70-84 (70-VRKLSTPGVYGVYCE-84) (Fig. 8). Los péptidos se compraron de la Corporación GenScript (Piscataway, NJ) como 99% puro. Estos se purificaron mediante cromatografía líquida de alta presión de fase inversa y su identidad se verificó mediante espectrometría de masa. Los péptidos se disolvieron en una solución salina amortiguada con fosfato (PBS) (Ix) y se almacenó en alícuotas a -20 °C hasta su uso. Para ver si tales dominios de azurina también pueden jugar un papel como antagonistas a la señalización de Eph en la progresión del cáncer, se realizaron ensayos MTT cuantitativos en una variedad de líneas celulares de cáncer normalmente conocidas por hiperexpresar los ligandos de receptores EphB/efrina. Durante una incubación de 24 h. a 37 °C, los péptidos de vuelta G-H de azurina y plastocianina a 75 µM mostraron una inducción de muerte celular en el astrocitoma de los tumores del cerebro CCF- STTG1 y glioblastoma LN-229 (Fig. 9A) . El péptido de la plastocianina Pie 70-84 mostró una actividad citotóxica algo superior a la del péptido de azurina Azu 96-113. Para determinar si tal citotoxicidad es dependiente de la dosis y eficaz para otras líneas celulares del cáncer, se evaluaron los efectos de varias concentraciones de estos péptidos en el melanoma (Fig. 9B) o células del glioblastoma (Fig. 9C) . En ambos casos, las concentraciones del péptido crecientes llevaron al incremento de la citotoxicidad (Fig. 9B y 9C) .

Ejemplo 10: Análisis de la Capacidad de Péptidos de Fusión GST-Azu para inducir la Muerte Celular en Células MCF-7 de Cáncer de mama. Se ha probado la capacidad de los péptidos de fusión GST-Azu de inducir la muerte celular en células MCF-7 de cáncer de mama. Para las mediciones de la citotoxicidad de los péptidos sintéticos de la azurina y plastocianina, se dirigió el ensayo de bromuro de 3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il-2,5-difenil tetrazolio) (MTT) (Sigma) (Mosmann, J. Immunol . Methods 65:55- 63 (1983)). Aproximadamente 2 x 104 células por pozo se sembraron en placas de cultivo de 96 pozos en 100 µl del medio RPMI 1640. Después del crecimiento durante toda la noche, el sobrenadante se removió y el nuevo medio que contenía los péptidos sintéticos de azurina o plastocianina en varias concentraciones especificadas se añadieron a las células adjuntas. Después de un tratamiento a 24 o 48 horas, 10 µl de 5 mg/ml de la solución MTT se agregó al cultivo y se incubó durante 1 hora a 37 °C. La reacción MTT se terminó mediante la adición de 40 mm de HCl en isopropanol. El formazan MTT formado se midió espectrofotométricamente como se describió anteriormente (Mosmann, 1983) . Las células de control no tratadas se compararon con las células tratadas para determinar la viabilidad y por consiguiente para una medida de la citotoxicidad. Hubo una citotoxicidad muy pequeña (Fig. 10) activada por GST o proteína de fusión similar GST-Azu 36-89 al control (sin el tratamiento de la proteína) . Sin embargo, la GST - Azu 36-128 o GST-Azu 88-113, que alberga la región de la azurina capaz de interferir en el enlace de la efrinaB2/EphB2, mostró una citotoxicidad significativa en una dosis de manera dependiente que confirma el papel de la región Azu 88-113 región activando la muerte celular de MCF- 7.

Ejemplo 11 : Tratamiento de Pacientes que Padecen de una Condición Patológica Relacionada con la Señalización de Efrina. Un ensayo clínico de la Fase I/II de un compuesto de la cupredoxina (fármaco de Estudio) se realiza en pacientes que padecen del cáncer. Específicamente, el compuesto de la cupredoxinaa es Pie 70-84 (SEQ ID NO: 20) . Cuarenta y nueve pacientes adultos con cánceres histológicamente verificados de mama, colon y melanoma que demuestran una progresión clínica y radiográfica o recurrencia, que sigue al tratamiento adecuado mediante un régimen y fármacos quimioterapéuticos aceptados por FDA actualmente disponibles, se matriculan en un estudio prospectivo de etiqueta abierta administrando el Fármaco de Estudio. Para ser elegible en la matriculación del estudio, todos los pacientes demuestran un incremento en el volumen del tumor mesurable después de la realización del curso aceptado mediante los regímenes de la quimioterapia. La evidencia de los depósitos metastáticos persistentes y/o aumento continúo en tamaño o volumen deben ser histológicamente establecidos. Esta prueba histológica puede obtenerse mediante una biopsia de aspiración de aguja fina (FNA) . El programa del tratamiento se instituye después de obtener el consentimiento informado de todos los pacientes de acuerdo con la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Illinois, Chicago y el FDA. Los pacientes no tendrán la enfermedad de manera intercurrente tal como otra malignidad, historia de malignidad previa, discrasias sanguíneas, diabetes dependiente de la insulina u otras enfermedades cardiovasculares serias que podrían interferir en la evaluación apropiada de los efectos de la terapia propuesta. El trabajo sanguíneo en la línea base (Conteo de Sangre Completos [CBC] y Química del Suero) incluyen los estudios de la función del hígado (LFT) se realiza previo a la iniciación de la terapia. Todos los pacientes elegibles no deben recibir ninguna quimioterapia de cáncer concurrentemente durante el período del ensayo. Los fármacos de estudio se administran mediante una inyección intravenosa diaria de una preparación farmacéuticamente aceptable del Fármaco de Estudio durante 12 semanas y los sujetos se observarán para cualquier toxicidad limitante de la dosis. Habrá 7 niveles de dosis al inicio con 10 mg/kg/día y se aumentarán por 5 mg/kg/día hasta una dosis máxima de 50 mg/kg/día. Se grabará la eficacia de cada nivel de dosis en los 7 pacientes con cáncer avanzado (mama, colon, y melanoma) . La respuesta se estima midiendo el tumor mesurable en 2 dimensiones (a y b) . 1) La desaparición total de los tumores metastáticos objetivo se considera como una respuesta completa (CR) ; 2) Una reducción del 75% se considera excelente, respuesta parcial (PR) ; y 3) . Una respuesta buena (PR) es una reducción del tratamiento posterior en tamaño mediante un 50%. 4) la reducción del 25% en tamaño se considera como una enfermedad estable (SD) y 5) < 25% se considera como sin respuesta (NR) . Los pacientes que demuestran una progresión de la enfermedad tienen su tratamiento interrumpido pero se continuará durante las 12 semanas adicionales. La desaparición total, y cualquier reducción en tamaño de los tumores metastáticos objetivo indicará que el tratamiento de azurina es eficaz para tratar el cáncer. Otras indicaciones en las que el tratamiento con Pie 70-84 es eficaz es una proporción de disminución en la aparición de nuevos tumores metastáticos y una disminución en la angiogénesis asociada con los tumores.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un péptido aislado, caracterizado porque es una variante, derivado o equivalente estructural de una cupredoxina, y que puede inhibir el crecimiento de células de cáncer en mamíferos.

2. El péptido aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la cupredoxina se selecciona del grupo que consiste de azurina, plastocianina, pseudoazurina, plastocianina, rusticianina y auracianina.

3. El péptido aislado de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la cupredoxina se selecciona del grupo que consiste de azurina, plastocianina y rusticianina.

4. El péptido aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la cupredoxina es de un organismo seleccionado del grupo que consiste de Pseudomonas aeruginosa, Thiobacillus ferrooxidans, Phormidium laminosum, Alcaligenes faecalis, Achromobacter xylosoxidan, Bordetella bronchiseptica, especie Methylomonas, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas chlororaphis, Xylella fastidiosa, Cucumis sativus, Chloroflexus aurantiacus, Vibrio parahaemolyticus y Ulva pertusa .

5. El péptido aislado de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque es de un organismo seleccionado del grupo que consiste de Pseudomonas aeruginosa, Thiobacillus ferrooxidans, Phormidium laminosum y Ulva pertusa .

6. El péptido aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque es parte de un péptido seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NOS: 1-17 y 22-23.

7. El péptido aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOS: 1-17 y 22-23 tiene al menos alrededor de 90% de identidad de secuencia de aminoácidos.

8. El péptido aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque es un truncamiento de una cupredoxina.

9. El péptido aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el péptido tiene más de alrededor de 10 residuos y no más de alrededor de 100 residuos.

10. El péptido aislado de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el péptido comprende una región de una cupredoxina seleccionada del grupo que consiste de los residuos de azurina de P. aeruginosa 96-113, residuos de azurina de P. aeruginosa 88-113, residuos de plastocianina de ÍJl a pertusa 70-84, y residuos de Ulva pertusa 57-98, y SEQ ID NOS: 22-30.

11. El péptido aislado de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el péptido consiste de una región de una cupredoxina seleccionada del grupo que consiste de residuos de azurina de P. aeruginosa 96-113, residuos de azurina de P. aeruginosa 88-113, residuos de plastocianina de Ulva pertusa 70-84, residuos de CJlva pertusa 57-98, y SEQ ID NOS: 22-30.

12. El péptido aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el péptido comprende residuos equivalentes de una cupredoxina sujeto como una región de una cupredoxina objeto seleccionada del grupo que consiste de residuos de azurina de P. aeruginosa 96-113, residuos de azurina de P. aerugínosa de 88-113, residuos de plastocianina 70-84 de Ulva pertusa, residuos 57-98 de Ulva pertusa, y SEQ ID NOS: 22-30.

13. Una composición, caracterizada porque comprende al menos una cupredoxina, o péptido de la reivindicación 1 en una composición farmacéutica.

14. La composición de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque la composición farmacéutica se formula para administración intravenosa.

15. La composición de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque la cupredoxina es de un organismo seleccionado del grupo que consiste de Pseudomonas aeruginosa, Thíobacillus ferrooxidans, Phormidium laminosum, Alcaligenes faecalis, Achromobacter xylosoxidan, Bordetella bronchiseptica, especie Methylomonas, Neísseria meníngitidis, Neisseria gonorrhoeae, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas chlororaphis, Xylella fastidiosa, Cucumis sa tivus,

Chloroflexus aurantiacus, Vibrio parahaemolyticus y Ulva pertusa . 16. La composición de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque la cupredoxina es de un organismo seleccionado del grupo que consiste de Pseudomonas aeruginosa, Thiobacillus ferrooxidans, Phormídium laminosum y Ulva pertusa .

17. La composición de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque la cupredoxina se selecciona del grupo que consiste de SEQ ID NOS: 1-17 y 22-23.

18. Un método para tratar a un paciente mamífero que padece de una condición patológica relacionada con el sistema de señalización de efrina o que padece de cáncer, caracterizado porque comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición de conformidad con la reivindicación 13.

19. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el paciente que padece de un trastorno patológico seleccionado del grupo que consiste de cistitis intersticial (IC) , lesiones asociadas con la enfermedad inflamatoria del intestino (IBD), infección por VIH, enfermedad cardiovascular, trastornos del sistema nervioso central, enfermedades vasculares periféricas, enfermedades virales, degeneración del sistema nervioso central (enfermedad de Christopher Reeve) y enfermedad de Alzheimer.

20. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el paciente que padece de un cáncer seleccionado del grupo que consiste de cáncer de mama, cáncer de hígado, cáncer gastrointestinal, neuroblastoma, cáncer neuronal, leucemia, linfoma, cáncer de próstata, cáncer pancreático, cáncer de pulmón, melanoma, cáncer ovárico, tumor del endometrio, coriocarcinoma, teratocarcinoma, cáncer de tiroides, todos los sarcomas incluyendo aquellos que aparecen de los tejidos suaves y el hueso, carcinomas renales, cáncer epidermoide y cáncer de pulmón de célula no pequeña .

21. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el paciente es humano.

22. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la composición se administra por un modo seleccionado del grupo que consiste de inyección intravenosa, inyección intramuscular, inyección subcutánea, inhalación, administración tópica, parche transdérmico, supositorio, y oral.

23. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el modo de administración es por inyección intravenosa.

24. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la composición se administra dentro de 0 minutos a 1 semana de la administración de otro fármaco conocido para tratar la condición patológica o el cáncer.

25. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque la composición se administra a alrededor de del mismo tiempo que otro fármaco anti-cáncer.

26. Una composición caracterizada porque comprende al menos dos polipéptidos aislados seleccionados del grupo que consiste de una cupredoxina, y un péptido aislado de conformidad con la reivindicación 1.

27. La composición de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada porque está en una composición farmacéutica.

28. Un kit caracterizado porque comprende la composición de conformidad con la reivindicación 13 en un vial.

29. El kit de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el kit se diseña para administración intravenosa.

30. Un método, caracterizado porque comprende poner en contacto las células de cáncer de mamífero con la composición de conformidad con la reivindicación 13; y medir el crecimiento de las células de cáncer.

31. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque las células de cáncer se seleccionan del grupo que consiste de cáncer de mama, cáncer de hígado, cáncer gastrointestinal, neuroblastoma, cáncer neuronal, leucemia, linfoma, cáncer de próstata, cáncer pancreático, cáncer de pulmón, melanoma, cáncer ovárico, tumor del endometrio, coriocarcinoma, teratocarcinoma, cáncer de tiroides, todos los sarcomas incluyendo aquellos que aparecen de los tejidos suaves y el hueso, carcinomas renales, cáncer epidermoide y cáncer de pulmón de célula no pequeña.

32. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque las células de cáncer están in vivo.

33. Un vector de expresión, caracterizado porque codifica el péptido de la reivindicación 1.

34. Un péptido aislado caracterizado porque es una variante, derivado o equivalente estructural de una cupredoxina; y que enlaza a un receptor de efrina.

35. El péptido aislado de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque el receptor de efrina se selecciona del grupo que consiste de EphAl, EphA2, EphA3, EphA4, EphA5, EphA6, EphA7, EphAd, EphAlO, EphBl, EphB2, EphB3, EphB4 y EphB6

36. El péptido aislado de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque también se enlaza a una efrina.

37. El péptido aislado de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque la efrina se selecciona del grupo que consiste de efrina Al, efrina A2, efrina A3, efrina A4, efrina A5, efrina Bl, efrina B2, efrina B3 y efrina B4.

38. El péptido aislado de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque enlaza a una efrina y su receptor.

39. El péptido aislado de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque enlaza a Efrina 2B y Eph2B.

40. Un péptido aislado que es una variante, derivado o equivalente estructural de una cupredoxina; y caracterizado porque se enlaza a una efrina seleccionada del grupo que consiste de efrina Al, efrina A2, efrina A3, efrina A4, efrina A5, efrina Bl, efrina B2, efrina B3 y efrina B4.

41. Un método caracterizado porque comprende administrar la composición de conformidad con la reivindicación 13 a un paciente mamífero para guiar el crecimiento de los vasos sanguíneos en el paciente.

42. Un método caracterizado porque comprende administrar la composición de conformidad con la reivindicación 13 a un paciente mamífero para disminuir el crecimiento de los vasos sanguíneos en el paciente.

43. Un método caracterizado porque comprende administrar la composición de conformidad con la reivindicación 13 a un paciente mamífero para guiar el crecimiento de las neuronas en el paciente.

44. Un método caracterizado porque comprende administrar la composición de conformidad con la reivindicación 13 a un paciente mamífero para promover la osteogénesis en el paciente.

45. Un método caracterizado porque comprende administrar una cantidad efectiva de la composición de conformidad con la reivindicación 13 a un paciente mamífero en lugar de efrina, en un método terapéutico que requiere el uso de la efrina.

46. Un método caracterizado porque comprende poner en contacto la composición de conformidad con la reivindicación 13 a una célula de mamífero para inhibir la actividad de un receptor de efrina asociado con la célula.

47. Un método caracterizado porque comprende poner en contacto la composición de conformidad con la reivindicación 13 a una célula de mamífero para incrementar la actividad de un receptor de efrina asociado con la célula.

48. Un método caracterizado porque comprende administrar a un paciente humano que tiene un tejido que expresa un receptor de efrina, la composición de conformidad con la reivindicación 13 la cual comprende un derivado de cupredoxina, o una variante, derivado o equivalente estructural fusionado a un agente farmacéutico.

49. El método de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque el tejido es cáncer.

50. Un método para detectar tejidos con receptores de efrina en un paciente mamífero caracterizado porque comprende las etapas de: (a) administrar al paciente la composición de conformidad con la reivindicación 13 la cual comprende un derivado de cupredoxina, o una variante, derivado o equivalente estructural fusionado a una sonda detectable; y (b) detectar la distribución de la sonda dentro del paciente.