KR20210108941A - Afp 항원 인식을 위한 고친화력 t 세포 수용체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 FMNKFIYEI-HLA A0201 복합체에 결합하는 특성을 갖는 T 세포 수용체(TCR)에 관한 것이고, 상기 FMNKFIYEI-HLA A0201 복합체에 대한 상기 TCR의 결합 친화력은 FMNKFIYEI-HLA A0201 복합체에 대한 야생형 TCR의 결합 친화력의 적어도 2배이다. 본 발명은 이러한 TCR과 치료제의 융합 분자를 더 제공한다. 이러한 TCR은 FMNKFIYEI-HLA A0201 복합체를 제시하는 종양 세포를 표적화하기 위해 단독으로 사용될 수 있거나 치료제와 병용될 수 있다.

Description

AFP 항원 인식을 위한 고친화력 T 세포 수용체
본 발명은 생물 공학 기술 분야에 관한 것으로서, 보다 구체적으로, AFP 단백질로부터 유래된 폴리펩티드를 인식할 수 있는 T 세포 수용체(T cell receptor, TCR)에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 수용체의 제조 및 용도에 관한 것이다.
특이적 방식으로 항원을 인식할 수 있는 분자 유형은 두 가지일 뿐이다. 그 중 하나는 면역글로불린 또는 항체이고, 다른 하나는 T 세포 수용체(TCR)로, α 쇄/β 쇄 또는 γ 쇄/δ 쇄의 이종 이량체 형태로 존재하는 세포막 표면에 있는 당 단백질이다. 면역계의 TCR 스펙트럼의 구성은 흉선에서 V(D)J를 통해 재조합된 다음, 양성 및 음성 선택에 의해 생성된다. 말초 환경에서, TCR은 주조직적합 유전자 복합체-펩티드 복합체(pMHC)에 대한 T 세포의 특이적 식별을 매개하므로, 면역계의 세포 면역 기능에 아주 중요하다.
TCR은 주조직적합 유전자 복합체(MHC)에 존재하는 특이성 항원 펩티드를 제시하는 유일한 수용체로, 이러한 외인성 또는 내인성 펩티드는 세포에 이상이 발생하는 유일한 징후일 수 있다. 면역계에서, 항원에 대해 특이적인 TCR과 pMHC 복합체의 결합을 통해 T 세포와 항원 제시 세포(APC) 사이의 직접적인 물리적 접촉을 유발한 다음, T 세포와 APC의 다른 세포막 표면 분자가 상호 작용함으로써, 상이한 항원에 대해 특이적인 T 세포가 표적 세포에 대해 면역 효과를 발휘하도록, 일련의 후속적인 세포 신호 전달 및 다른 생리적 반응을 일으킨다.
TCR에 대응되는 MHC 클래스 I 및 클래스 II 분자 리간드도 면역글로불린 슈퍼 패밀리의 단백질이지만 항원 제시에 대해 특이적이고, 대상체마다 MHC가 상이함으로써, 단백질 항원에서 상이한 짧은 펩티드를 각자의 APC 세포 표면에 제시할 수 있다. 인간 MHC는 일반적으로 HLA 유전자 또는 HLA 복합체라고 한다.
α 태아단백질이라고도 알려진 AFP(αFetoprotein)는 배아 발달 과정에서 발현되는 단백질이며 배아 혈청의 주요 성분이다. 발달 과정에서, AFP는 난황낭 및 간에서 상대적으로 높은 발현 수준을 보이며 이 후에 억제된다. 간세포 암종에서, AFP의 발현이 활성화된다(Butterfield et al. J Immunol., 2001, Apr 15; 166(8):5300-8). AFP가 세포내에서 생성된 후, 소분자 폴리펩티드로 분해되고, MHC(주조직적합 유전자 복합체) 분자와 결합하여 복합체를 형성하여 세포 표면에 제시된다. FMNKFIYEI는 AFP 항원으로부터 유래된 짧은 펩티드로, AFP 관련 질환 치료의 표적이다.
따라서, FMNKFIYEI-HLA A0201 복합체는 종양 세포의 마커를 표적화할 수 있는 TCR을 제공한다. FMNKFIYEI-HLA A0201 복합체에 결합할 수 있는 TCR은 종양 치료에 대해 높은 응용 가치를 가지고 있다. 예를 들어, 상기 종양 세포 마커를 표적화할 수 있는 TCR은 표적 세포에 세포 독성제 또는 면역 자극제를 전달하는데 사용되거나 T 세포에 형질전환되어 상기 TCR을 발현하는 T 세포가 종양 세포를 파괴할 수 있도록 하므로, 입양 면역 요법이라고 하는 치료 과정에서 환자에게 제공된다. 전자의 목적에 있어서, 이상적인 TCR은 높은 친화력을 가짐으로써, 상기 TCR이 표적화되는 세포에 오랫동안 머무를 수 있도록 한다. 후자의 목적에 있어서, 중간 친화력 TCR을 사용하는 것이 바람직하다. 따라서, 본 기술분야의 통상의 기술자는 종양 세포 마커를 표적화하기 위해 상이한 목적으로 사용될 수 있는 TCR을 개발하기 위해 노력하였다.
본 발명의 목적은 FMNKFIYEI-HLA A0201 복합체에 대해 고친화력을 갖는 TCR을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 유형의 TCR의 제조 방법 및 상기 유형의 TCR의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 제1 양태에 따르면, FMNKFIYEI-HLA A0201 복합체에 결합하는 활성을 갖는 T 세포 수용체(TCR)를 제공한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 T 세포 수용체(TCR)는 FMNKFIYEI-HLA A0201 복합체에 결합하는 활성을 가지고, 상기 T 세포 수용체는 TCR α 쇄 가변 영역 및 TCR β 쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 TCR α 쇄 가변 영역은 3개의 CDR 영역을 포함하고, 상기 TCR α 쇄 가변 영역의 3개의 CDR 영역의 기준 서열은 하기와 같고:
CDR1α: TSINN
CDR2α: IRSNERE
CDR3α: ATDPRTGANSKLT; 또한 하나 이상의 하기 돌연변이를 포함하고/거나:
Figure pct00001
상기 TCR β 쇄 가변 영역은 3개의 CDR 영역을 포함하고, 상기 TCR β 쇄 가변 영역의 3개의 CDR 영역의 기준 서열은 하기와 같고:
CDR1β: SEHNR
CDR2β: FQNEAQ
CDR3β: ASEGLAYEQY; 또한 하나 이상의 하기 돌연변이를 포함한다:
Figure pct00002
다른 바람직한 예에서, 상기 TCR α 쇄 가변 영역의 3개의 CDR 영역에서의 돌연변이 개수는 1개 내지 8개이고/거나, 상기 TCR β 쇄 가변 영역의 3개의 CDR 영역에서의 돌연변이 개수는 1개 내지 8개이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 TCR α 쇄의 CDR 영역의 돌연변이 개수는 3개, 4개, 5개, 6개, 7개 또는 8개일 수 있다.
다른 바람직한 예에서, 상기 TCR β 쇄의 CDR 영역의 돌연변이 개수는 4개, 5개, 6개, 7개 또는 8개일 수 있다.
다른 바람직한 예에서, 상기 TCR과 FMNKFIYEI-HLA A0201 복합체의 친화력은 야생형 TCR의 적어도 2배이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 TCR은 FMNKFIYEI-HLA A0207 복합체에 결합할 수도 있다.
다른 바람직한 예에서, 상기 TCR의 α 쇄 가변 영역은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 90 %의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고/거나; 상기 TCR의 β 쇄 가변 영역은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 90 %의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 TCR α 쇄 가변 영역의 돌연변이 부위는 CDR3α의 제7 부위 및/또는 제8 부위를 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 TCR α 쇄 가변 영역의 3개의 CDR의 돌연변이는 하기 군을 포함하고/거나:
Figure pct00003
상기 TCR β 쇄 가변 영역의 3개의 CDR의 돌연변이는 하기 군을 포함한다:
Figure pct00004
다른 바람직한 예에서, 상기 TCR은 TCR α 쇄 가변 영역 및 TCR β 쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 TCR α 쇄 가변 영역은 CDR1α, CDR2α, 및 CDR3α를 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 TCR은 TCR α 쇄 가변 영역 및 TCR β 쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 TCR α 쇄 가변 영역은 CDR1α, CDR2α 및 CDR3α를 포함하고, 여기서, CDR1α의 아미노산 서열은 TSINN, TPISS, TDIYK, TAVDS, TEISS 및 TDVSS로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 TCR은 TCR α 쇄 가변 영역 및 TCR β 쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 TCR α 쇄 가변 영역은 CDR1α, CDR2α 및 CDR3α를 포함하고, 여기서 CDR2α의 아미노산 서열은 IRSNERE이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 CDR1α는 서열 T[1αX1][1αX2][1αX3][1αX4]를 포함하고, 여기서, [1αX1], [1αX2], [1αX3], [1αX4]는 각각 독립적으로 임의의 천연 아미노산 잔기로부터 선택된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 [1αX1]은 S 또는 D 또는 P 또는 A 또는 E이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 [1αX2]는 I 또는 V이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 [1αX3]은 N 또는 S 또는 Y 또는 D이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 [1αX4]는 N 또는 S 또는 K이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 [1αX1]은 S 또는 D 또는 P 또는 A 또는 E이고, [1αX2]는 I 또는 V이며, [1αX3]은 N 또는 S 또는 Y 또는 D이고, [1αX4]는 N 또는 S 또는 K이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 CDR1α는 TSINN, TPISS, TDIYK, TAVDS, TEISS 및 TDVSS로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 CDR3α는 서열 ATDP[3αX1][3αX2][3αX3][3αX4][3αX5][3αX6]KLT를 포함하고, 여기서, [3αX1], [3αX2], [3αX3], [3αX4], [3αX5], [3αX6]은 각각 독립적으로 임의의 천연 아미노산 잔기로부터 선택된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 TCR은 TCR α 쇄 가변 영역 및 TCR β 쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 TCR α 쇄 가변 영역은 CDR1α, CDR2α 및 CDR3α를 포함하고, CDR3α는 서열 ATDP[3αX1][3αX2][3αX3][3αX4][3αX5][3αX6]KLT를 포함하고, 여기서, [3αX1], [3αX2], [3αX3], [3αX4], [3αX5] 및 [3αX6]은 각각 독립적으로 임의의 천연 아미노산 잔기로부터 선택된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 [3αX1]은 R 또는 A 또는 S 또는 D 또는 E 또는 Q 또는 V 또는 T이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 [3αX2]는 T 또는 M 또는 R 또는 L 또는 A 또는 N 또는 S이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 [3αX3]은 G 또는 A 또는 Q 또는 S 또는 E 또는 N이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 [3αX4]는 A 또는 S 또는 G 또는 P 또는 W이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 [3αX5]는 N 또는 S 또는 T이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 [3αX6]은 S 또는 A 또는 N 또는 T 또는 P이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 [3αX1]은 R 또는 A 또는 S 또는 D 또는 E 또는 Q 또는 V 또는 T이고, [3αX2]는 T 또는 M 또는 R 또는 L 또는 A 또는 N 또는 S이며, [3αX3]은 G 또는 A 또는 Q 또는 S 또는 E 또는 N이고, [3αX4]는 A 또는 S 또는 G 또는 P 또는 W이며, [3αX5]는 N 또는 S 또는 T이고, [3αX6]은 S 또는 A 또는 N 또는 T 또는 P이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 CDR3α는 ATDPSMSPNSKLT, ATDPSLSPNSKLT 및 ATDPSLQSNSKLT로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 TCR은 TCR α 쇄 가변 영역 및 TCR β 쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 TCR β 쇄 가변 영역은 CDR1β, CDR2β 및 CDR3β를 포함하고, 여기서, 상기 CDR3β는 서열 ASEGLAYEQY를 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 CDR1β는 서열 [1βX1][1βX2][1βX3][1βX4]R을 포함하고, 여기서, [1βX1], [1βX2], [1βX3], [1βX4]는 각각 독립적으로 임의의 천연 아미노산 잔기로부터 선택된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 [1βX1]은 S 또는 A 또는 Q 또는 G이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 [1βX2]는 E 또는 G 또는 T 또는 R 또는 L이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 [1βX3]은 H 또는 W 또는 R이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 [1βX4]는 N 또는 A 또는 P이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 CDR2β는 서열 F[2βX1][2βX2][2βX3][2βX4][2βX5]를 포함하고, 여기서, [2βX1], [2βX2], [2βX3], [2βX4], [2βX5]는 각각 독립적으로 임의의 천연 아미노산 잔기로부터 선택된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 [2βX1]은 Q 또는 H이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 [2βX2]는 N 또는 G이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 [2βX3]은 E 또는 D이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 [2βX4]는 A 또는 M 또는 L이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 [2βX5]는 Q 또는 E이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 CDR2β는 FQGDME, FQGDLE 및 FHGDLE로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 TCR은 TCR α 쇄 가변 영역 및 TCR β 쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 TCR β 쇄 가변 영역은 CDR1β, CDR2β 및 CDR3β를 포함하고, 여기서, 상기 CDR2β의 아미노산 서열은 FQGDME, FQGDLE 및 FHGDLE로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 TCR의 TCR α 쇄 가변 영역이 상이할 경우, CDR1α: TSINN; CDR2α: IRSNERE; 및 CDR3α: ATDPRTGANSKLT와 같은 CDR을 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 TCR의 TCR β 쇄 가변 영역이 상이할 경우, CDR1β: SEHNR; CDR2β: FQNEAQ; 및 CDR3β: ASEGLAYEQY와 같은 CDR을 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 돌연변이는 α 쇄 및/또는 β 쇄 가변 영역의 하나 또는 복수 개의 CDR 영역에서 발생된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 돌연변이는 α 쇄의 CDR1 및/또는 CDR3에서 발생되고/거나, 상기 돌연변이는 β 쇄의 CDR1 및/또는 CDR2에서 발생된다.
본 발명의 바람직한 예에서, 상기 TCR과 FMNKFIYEI-HLA A0201 복합체의 친화력은 야생형 TCR의 적어도 2배이고; 바람직하게, 적어도 5배이며; 더 바람직하게, 적어도 10배이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 TCR과 FMNKFIYEI-HLA A0201 복합체의 친화력은 야생형 TCR의 적어도 50배이고; 바람직하게, 적어도 100배이며; 더 바람직하게, 적어도 500배이고; 가장 바람직하게, 적어도 1000배이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 TCR과 FMNKFIYEI-HLA A0201 복합체의 친화력은 야생형 TCR의 적어도 104배이고; 바람직하게, 적어도 105배이며; 더 바람직하게, 적어도 106배이고;
구체적으로, FMNKFIYEI-HLA A0201 복합체에 대한 상기 TCR의 해리 평형 상수는 KD≤20 μM이며;
다른 바람직한 예에서, FMNKFIYEI-HLA A0201 복합체에 대한 상기 TCR의 해리 평형 상수는 5 μM≤KD≤10 μM이고; 바람직하게, 0.1 μM≤KD≤1 μM이며; 더 바람직하게, 1 nM≤KD≤100 nM이고;
다른 바람직한 예에서, FMNKFIYEI-HLA A0201 복합체에 대한 상기 TCR의 해리 평형 상수는 100 pM≤KD≤1000 pM이며; 바람직하게, 10 pM≤KD≤100 pM이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 TCR은 하기 군으로부터 선택되는 CDR을 구비한다:
Figure pct00005
다른 바람직한 예에서, 상기 TCR은 용해 가능하다.
다른 바람직한 예에서, 상기 TCR은 αβ 이종 이량체 TCR 또는 단일 쇄 TCR이다.
다른 바람직한 예에서, 본 발명에 따른 TCR은 αβ 이종 이량체 TCR이고, 바람직하게, 상기 TCR은 α 쇄 불변 영역 서열 TRAC*01 및 β 쇄 불변 영역 서열 TRBC1*01 또는 TRBC2*01을 가진다. 상기 TCR의 α 쇄 가변 영역은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 90 %; 바람직하게, 적어도 92 %; 더 바람직하게, 적어도 94 %(예를 들어, 적어도 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %의 서열 상동성일 수 있음)의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고/거나; 상기 TCR의 β 쇄 가변 영역은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 90 %, 바람직하게, 적어도 92 %; 더 바람직하게, 적어도 94 %(예를 들어, 적어도 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %의 서열 상동성일 수 있음)의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 TCR은 (i) 막관통 영역을 제외한 전부 또는 부분 TCR α 쇄, 및 (ii) 막관통 영역을 제외한 전부 또는 부분 TCR β 쇄를 포함하고, 여기서, (i) 및 (ii)는 모두 TCR 쇄의 가변 영역 및 적어도 일부분의 불변 영역을 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 TCR은 αβ 이종 이량체 TCR이고, 상기 TCR의 α 쇄 가변 영역과 β 쇄 불변 영역 사이에 인공 쇄 간 이황화 결합이 포함된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 TCR의 α 쇄 가변 영역과 β 쇄 불변 영역 사이에 인공 쇄 간 이황화 결합을 형성하는 시스테인 잔기는 하기로부터 선택되는 하나 이상의 군의 부위를 치환하되, 상기 부위는,
TRAV의 제46 부위 아미노산 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손 1의 제60 부위 아미노산;
TRAV의 제47 부위 아미노산 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손 1의 제61 부위 아미노산;
TRAV의 제46 부위 아미노산 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손 1의 제61 부위 아미노산; 또는
TRAV의 제47 부위 아미노산 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손 1의 제60 부위 아미노산이다.
다른 바람직한 예에서, α 쇄 가변 영역과 β 쇄 불변 영역 사이에 인공 쇄 간 이황화 결합이 포함되는 TCR은 α 쇄 가변 영역 및 β 쇄 가변 영역 및 막관통 영역을 제외한 전부 또는 부분 β 쇄 불변 영역을 포함하지만, α 쇄 불변 영역을 포함하지 않으며, 상기 TCR의 α 쇄 가변 영역과 β 쇄는 이종 이량체를 형성한다.
다른 바람직한 예에서, α 쇄 가변 영역과 β 쇄 불변 영역 사이에 인공 쇄 간 이황화 결합이 포함되는 TCR은 (i) 막관통 영역을 제외한 전부 또는 부분 TCR α 쇄, 및 (ii) 막관통 영역을 제외한 전부 또는 부분 TCR β 쇄를 포함하고, 여기서, (i) 및 (ii)는 모두 TCR 쇄의 가변 영역 및 적어도 일부분의 불변 영역을 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 TCR은 αβ 이종 이량체 TCR이고, 이는 (i) 막관통 영역을 제외한 전부 또는 부분 TCR α 쇄, 및 (ii) 막관통 영역을 제외한 전부 또는 부분 TCR β 쇄를 포함하고, 여기서, (i) 및 (ii)는 모두 TCR 쇄의 가변 영역 및 적어도 일부분의 불변 영역을 포함하고, α 쇄 불변 영역과 β 쇄 불변 영역 사이에 인공 쇄 간 이황화 결합이 포함된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 TCR의 α 쇄 불변 영역과 β 쇄 불변 영역 사이에 인공 쇄 간 이황화 결합이 포함된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 TCR α와 β 쇄의 불변 영역 사이에 인공 쇄 간 이황화 결합을 형성하는 시스테인 잔기는 하기로부터 선택되는 하나 이상의 군의 부위를 치환하되, 상기 부위는,
TRAC*01 엑손 1의 Thr48 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손 1의 Ser57;
TRAC*01 엑손 1의 Thr45 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손 1의 Ser77;
TRAC*01 엑손 1의 Tyr10 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손 1의 Ser17;
TRAC*01 엑손 1의 Thr45 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손 1의 Asp59;
TRAC*01 엑손 1의 Ser15 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손 1의 Glu15;
TRAC*01 엑손 1의 Arg53 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손 1의 Ser54;
TRAC*01 엑손 1의 Pro89 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손 1의 Ala19; 및
TRAC*01 엑손 1의 Tyr10 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손 1의 Glu20이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 TCR은 단일 쇄 TCR이다.
다른 바람직한 예에서,상기 TCR은 α 쇄 가변 영역 및 β 쇄 가변 영역으로 구성된 단일 쇄 TCR이고, 상기 TCR은 α 쇄 가변 영역 및 β 쇄 가변 영역으로 구성된 단일 쇄 TCR이고, 상기 α 쇄 가변 영역 및 β 쇄 가변 영역은 플렉서블 짧은 펩티드 서열(linker)에 의해 연결된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 TCR α 쇄 가변 영역 및/또는 β 쇄 가변 영역의 소수성 코어가 돌연변이된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 소수성 코어가 돌연변이된 TCR은 α 가변 영역 및 β 가변 영역으로 구성된 단일 쇄 TCR이고, 상기 α 가변 영역 및 β 가변 영역은 플렉서블 짧은 펩티드 서열(linker)에 의해 연결된다.
다른 바람직한 예에서, 본 발명의 상기 TCR은 단일 쇄 TCR이고, 상기 TCR의 α 쇄 가변 영역은 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 85 %, 바람직하게, 적어도 90 %; 더 바람직하게, 적어도 92 %; 가장 바람직하게, 적어도 94 %(예를 들어, 적어도 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %의 서열 상동성일 수 있음)의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고/거나; 상기 TCR의 β 쇄 가변 영역은 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 85 %, 바람직하게, 적어도 90 %; 더 바람직하게, 적어도 92 %; 가장 바람직하게, 적어도 94 %(예를 들어, 적어도 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %의 서열 상동성일 수 있음)의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 TCR의 α 쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 9-35, 51-77 및 91-92로부터 선택되고/거나; 상기 TCR의 β 쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 36-46, 78-88 및 93-101로부터 선택된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 TCR은 하기 군으로부터 선택된다:
Figure pct00006
다른 바람직한 예에서, 상기 TCR은 하기 군으로부터 선택된다:
Figure pct00007
다른 바람직한 예에서, 상기 TCR의 α 쇄 및/또는 β 쇄의 C- 또는 N-말단에는 접합체가 결합되어 있다.
다른 바람직한 예에서, 상기 TCR에 결합하는 접합체는 검출 가능한 마커, 치료제, PK 변형 부분 또는 이들의 임의의 조합이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 TCR에 결합하는 치료제는 상기 TCR의 α 또는 β 쇄의 C- 또는 N-말단에 연결된 항-CD3 항체이다.
본 발명의 바람직한 실시형태에서, 상기 T 세포 수용체(TCR)는 FMNKFIYEI-HLA A2 복합체에 결합하는 활성을 가지고, TCR α 쇄 가변 영역 및 TCR β 쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 TCR은 서열번호 1로 표시되는 α 쇄 가변 영역에서 돌연변이되고, 상기 돌연변이된 아미노산 잔기 부위는 28S, 29I, 30N, 31N, 94R, 95T, 96G, 97A, 98N 및 99S 중 하나 또는 복수 개를 포함하고, 여기서, 아미노산 잔기 번호는 서열번호 1로 표시되는 번호를 사용하고/거나; 상기 TCR은 서열번호 2로 표시되는 β 쇄 가변 영역에서 돌연변이되고, 상기 돌연변이된 아미노산 잔기 부위는 27S, 28E, 29H, 30N, 50Q, 51N, 52E, 53A 및 54Q 중 하나 또는 복수 개를 포함하고, 여기서, 아미노산 잔기 번호는 서열번호 2로 표시되는 번호를 사용하고;
바람직하게, 돌연변이 후의 상기 TCR α 쇄 가변 영역은, 28D 또는 28P 또는 28A 또는 28E; 29V; 30S 또는 30Y 또는 30D; 31S 또는 31K; 94A 또는 94S 또는 94V 또는 94D 또는 94E 또는 94Q 또는 94T; 95M 또는 95R 또는 95L 또는 95A 또는 95N 또는 95S; 96A 또는 96Q 또는 96S 또는 96E 또는 96N; 97S 또는 97G 또는 97P 또는 97W; 98S 또는 98T; 및 99A 또는 99N 또는 99T 또는 99P로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 복수 개의 아미노산 잔기를 포함하고, 여기서, 아미노산 잔기 번호는 서열번호 1로 표시되는 번호를 사용하고/거나; 돌연변이 후의 상기 TCR β 쇄 가변 영역은, 하나 또는 복수 개의 아미노산 잔기 27A 또는 27Q 또는 27G; 28G 또는 28T 또는 28R 또는 28L; 29W 또는 29R; 30A 또는 30P; 50H; 51G; 52D; 53M 또는 53L; 및 54E로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 복수 개의 아미노산 잔기를 포함하고, 여기서, 아미노산 잔기 번호는 서열번호 2로 표시되는 번호를 사용한다.
본 발명의 제2 양태에 따르면, 적어도 2개의 TCR 분자를 포함하는 다가 TCR 복합체를 제공하고, 그 중 하나 이상의 TCR 분자는 본 발명의 제1 양태에 따른 TCR이다.
본 발명의 제3 양태에 따르면, 본 발명의 제1 양태에 따른 TCR 분자 또는 본 발명의 제2 양태에 따른 다가 TCR 복합체를 코딩하는 핵산 서열 또는 이의 상보성 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다.
본 발명의 제4 양태에 따르면, 본 발명의 제3 양태에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명의 제5 양태에 따르면, 본 발명의 제4 양태에 따른 벡터를 포함하거나, 게놈에 통합된 외인성인 본 발명의 제3 양태에 따른 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
본 발명의 제6 양태에 따르면, 본 발명의 제1 양태에 따른 TCR을 발현하는 단리된 세포를 제공한다.
본 발명의 제7 양태에 따르면, 약학적으로 허용 가능한 담체, 및 본 발명의 제1 양태에 따른 TCR, 또는 본 발명의 제2 양태에 따른 TCR 복합체, 또는 본 발명의 제6 양태에 따른 세포를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 제8 양태에 따르면, 치료를 필요로 하는 대상체에 적당량의 본 발명의 제1 양태에 따른 TCR, 또는 본 발명의 제2 양태에 따른 TCR 복합체, 또는 본 발명의 제6 양태에 따른 세포, 또는 본 발명의 제7 양태에 따른 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 질환의 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 제9 양태에 따르면, 종양을 치료하는 약물을 제조하기 위한 본 발명의 제1 양태에 따른 TCR, 또는 본 발명의 제2 양태에 따른 TCR 복합체, 또는 본 발명의 제6 양태에 따른 세포의 용도를 제공하되, 바람직하게, 상기 종양은 간암이다.
본 발명의 제10 양태에 따르면, 종양을 치료하는 약물로 사용되는 본 발명의 제1 양태에 따른 TCR, 또는 본 발명의 제2 양태에 따른 TCR 복합체, 또는 본 발명의 제6 양태에 따른 세포를 제공하되, 바람직하게, 상기 종양은 간암이다.
본 발명의 제11 양태에 따르면, (i) 본 발명의 제1 양태에 따른 TCR을 발현하기 위해 본 발명의 제5 양태에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 (ii) 상기 TCR을 단리하거나 정제하는 단계를 포함하는 본 발명의 제1 양태에 따른 T 세포 수용체의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 범위 내에서, 본 발명의 상기 각 기술특징과 아래(예를 들어, 실시예)에서 구체적으로 설명된 각 기술특징 사이는 서로 조합되어, 새로운 또는 바람직한 기술적 해결수단을 구성할 수 있음을 이해해야 한다. 편폭의 제한으로 인해 여기서 더 이상 일일히 설명하지 않도록 한다.
도 1a 및 도 1b는 각각 FMNKFIYEI-HLA A0201 복합체에 특이적으로 결합할 수 있는 야생형 TCR α 및 β 쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 2a 및 도 2b는 각각 본 발명에서 구축한 단일 쇄 주형 TCR의 α 쇄 가변 영역의 아미노산 서열 및 β 쇄 가변 영역의 아미노산 서열이다.
도 3a 및 도 3b는 각각 본 발명에서 구축한 단일 쇄 주형 TCR의 α 쇄 가변 영역의 DNA 서열 및 β 쇄 가변 영역의 DNA 서열이다.
도 4a 및 도 4b는 각각 본 발명에서 구축한 단일 쇄 주형 TCR의 플렉서블 짧은 펩티드 서열(linker)의 아미노산 서열 및 뉴클레오티드 서열이다.
도 5(1) 내지 5(27)은 각각 FMNKFIYEI-HLA A0201 복합체에 대해 고친화력을 갖는 단일 쇄 TCR의 α 쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 나타내고, 돌연변이된 잔기는 밑줄을 그어 표시한다.
도 6(1) 내지 6(11)은 각각 FMNKFIYEI-HLA A0201 복합체에 대해 고친화력을 갖는 단일 쇄 TCR의 β 쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 나타내고, 돌연변이된 잔기는 밑줄을 그어 표시한다.
도 7a 및 도 7b는 각각 본 발명에서 구축한 단일 쇄 주형 TCR의 아미노산 서열 및 DNA 서열이다.
도 8a 및 도 8b는 각각 본 발명의 가용성 참조 TCR α 및 β 쇄의 아미노산 서열을 나타내고, 돌연변이 후의 시스테인 잔기는 볼드체 문자로 표시한다.
도 9(1) 내지 9(29)는 각각 FMNKFIYEI-HLA A0201 복합체에 대해 고친화력을 갖는 이종 이량체 TCR의 α 쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 나타내고, 돌연변이된 잔기는 밑줄을 그어 표시한다.
도 10(1) 내지 10(20)은 각각 FMNKFIYEI-HLA A0201 복합체에 대해 고친화력을 갖는 이종 이량체 TCR의 β 쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 나타내고, 돌연변이된 잔기는 밑줄을 그어 표시한다.
도 11a 및 도 11b는 각각 FMNKFIYEI-HLA A0201 복합체에 특이적으로 결합할 수 있는 야생형 TCR α와 β 쇄의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 12는 가용성 참조 TCR, 즉 야생형 TCR과 FMNKFIYEI-HLA A0201 복합체의 결합 곡선이다.
도 13a 및 13b는 본 발명의 고친화력 TCR로 형질감염된 효과기 세포의 활성화 기능 실험 결과이다.
도 14a 및 14b는 본 발명의 고친화력 TCR로 형질감염된 효과기 세포의 살해 기능 실험 결과이다.
도 15a, 15b, 15c, 15d, 15e, 15f 및 15g는 본 발명의 고친화력 TCR과 항-CD3 항체의 융합 단백질의 기능 검증-활성화 실험 결과이다.
도 16은 본 발명의 고친화력 TCR과 항-CD3 항체의 융합 단백질의 기능 검증-살해 실험 결과이다.
도 17a 및 도 17b는 각각 FMNKFIYEI-HLA A0201 복합체에 특이적으로 결합할 수 있는 야생형 TCR α 및 β 쇄의 세포외 아미노산 서열을 나타낸다.
본 발명은 광범위하고 깊은 연구를 통해 FMNKFIYEI 짧은 펩티드(AFP 단백질로부터 유래됨)를 인식하는 고친화력 T 세포 수용체(TCR)를 얻고, 상기 FMNKFIYEI 짧은 펩티드는 펩티드-HLA A2 복합체의 형태로 제시된다. 상기 고친화력 TCR은 이의 α 쇄 가변 영역의 3개의 CDR 영역:
CDR1α: TSINN
CDR2α: IRSNERE
CDR3α: ATDPRTGANSKLT에서 돌연변이되고/거나; 이의 β 쇄 가변 영역의 3개의 CDR 영역:
CDR1β: SEHNR
CDR2β: FQNEAQ
CDR3β: ASEGLAYEQY에서 돌연변이되고; 또한, 돌연변이 후 상기 FMNKFIYEI-HLA A0201 복합체에 대한 본 발명의 TCR의 친화력 및/또는 결합 반감기는 야생형 TCR의 적어도 2배이다.
본 발명을 설명하기 전에, 본 발명은 상기 구체적인 방법 및 실험 조건이 변경될 수 있으므로 이러한 방법 및 조건에 한정되지 않음을 이해해야 한다. 또한, 본문에서 사용된 용어의 목적은 구체적인 실시형태를 설명하기 위한 것일 뿐 한정을 의도하는 것이 아니며 본 발명의 범위는 첨부된 청구범위에 의해서만 한정됨을 이해해야 한다.
달리 정의되지 않은 한, 본문에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 모두 본 발명이 속하는 분야의 통상의 기술자가 이해하는 것과 동일한 의미를 가진다.
본 발명의 실시 또는 시험에서 본 발명에서의 유사하거나 등가적인 임의의 방법 및 재료를 사용할 수 있지만, 본문은 여기서 바람직한 방법 및 재료를 예를 든다.
용어
T 세포 수용체(T cell receptor, TCR)
국제 면역 유전학 정보 시스템(international Immunogenetics information system, IMGT)을 적용하여 TCR을 설명할 수 있다. 천연 αβ 이종 이량체 TCR은 α 쇄 및 β 쇄를 가진다. 광의적으로 말하면, 각 쇄는 가변 영역, 연결 영역 및 불변 영역을 포함하고, β 쇄는 일반적으로 가변 영역과 연결 영역 사이에 짧은 가변 영역을 더 포함하지만, 상기 가변 영역은 연결 영역의 일부분으로 간주된다. 특수한 IMGT의 TRAJ 및 TRBJ를 통해 TCR의 연결 영역을 결정하고, IMGT의 TRAC 및 TRBC를 통해 TCR의 불변 영역을 결정한다.
각 가변 영역은 프레임워크 서열에 키메라인 3개의 CDR(상보성 결정 영역),즉 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. IMGT 명명법에서, TRAV 및 TRBV의 상이한 번호는 각각 상이한 Vα의 유형 및 Vβ의 유형을 의미한다. IMGT 시스템에서, α 쇄 불변 영역은 부호 TRAC*01을 가지되, 여기서, "TR"은 T 세포 수용체 유전자를 의미하고; "A"는 α 쇄 유전자를 의미하고; C는 불변 영역을 의미하고; "*01"은 대립 유전자 1을 의미한다. β 쇄 불변 영역은 부호 TRBC1*01 또는 TRBC2*01을 가지되, 여기서, "TR"은 T 세포 수용체 유전자를 의미하고; "B"는 β 쇄 유전자를 의미하고; C는 불변 영역을 의미하고; "*01"은 대립 유전자 1을 의미한다. α 쇄의 불변 영역은 유일하게 결정되고, β 쇄의 형태에 2개의 가능한 불변 영역 유전자“C1" 및 "C2"가 존재한다. 본 기술분야의 통상의 기술자는 공개된 IMGT 데이터베이스를 통해 TCR α 및 β 쇄의 불변 영역 유전자 서열을 획득할 수 있다.
TCR의 α 및 β 쇄는 일반적으로 각각 2개의 "도메인”, 즉 가변 영역 및 불변 영역을 갖는 것으로 간주된다. 따라서, 본 발명의 명세서 및 청구범위에서, "TCR α 쇄 가변 영역”은 연결된 TRAV 및 TRAJ 영역을 의미하고, 마찬가지로, "TCR β 쇄 가변 영역”은 연결된 TRBV 및 TRBD/TRBJ 영역을 의미한다. TCR α 쇄 가변 영역의 3개의 CDR은 각각 CDR1α, CDR2α 및 CDR3α이고, TCR β 쇄 가변 영역의 3개의 CDR은 각각 CDR1β, CDR2β 및 CDR3β이다. 발명의 TCR 가변 영역의 프레임워크 서열은 뮤린 또는 인간 유래일 수 있고, 바람직하게, 인간 유래이다. TCR의 불변 영역은 세포내 부분, 막관통 영역 및 세포외 부분을 포함한다. 가용성 TCR을 얻기 위해, TCR과 FMNKFIYEI-HLA A2 복합체 사이의 친화력을 측정하고, 본 발명의 TCR은 바람직하게 막관통 영역을 포함하지 않는다. 더 바람직하게, 본 발명의 TCR의 아미노산 서열은 TCR의 세포외 아미노산 서열을 의미한다.
도 11a 및 11b에 도시된 바와 같이, 본 발명에서의 "야생형 TCR"의 α 쇄의 아미노산 서열 및 β 쇄의 아미노산 서열은 각각 서열번호 89 및 서열번호 90이다. 도 17a 및 17b에 도시된 바와 같이, 본 발명에서의 "야생형 TCR"의 α 및 β 쇄의 세포외 아미노산 서열은 각각 서열번호 102 및 서열번호 103이다. 도 8a 및 8b에 도시된 바와 같이, 본 발명에서의 "참조 TCR"의 α 쇄의 아미노산 서열 및 β 쇄의 아미노산 서열은 각각 서열번호 49 및 서열번호 50이다. 도 1a 및 1b에 도시된 바와 같이, 본 발명에서, FMNKFIYEI-HLA A0201 복합체에 결합할 수 있는 야생형 TCR의 α와 β 쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 각각 서열번호 1 및 서열번호 2이다. 본 발명에서, 용어 "본 발명의 폴리펩티드”, "본 발명의 TCR", "본 발명의 T 세포 수용체”는 호환하여 사용할 수 있다.
천연 쇄 간 이황화 결합과 인공 쇄 간 이황화 결합
천연 TCR의 막-근위 영역 Cα와 Cβ 쇄 사이에 한 군의 이황화 결합이 존재하는데, 이는 본 발명에서 "천연 쇄 간 이황화 결합”이라고 한다. 본 발명에서, 천연 쇄 간 이황화 결합과 위치가 다른 인공적으로 도입된 쇄 간 공유 이황화 결합을 "인공 쇄 간 이황화 결합”이라고 한다.
설명의 편의를 위해, 본 발명에서 TRAC*01과 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 아미노산 서열의 위치 번호는 N-말단에서 C-말단으로의 순서로 순차적으로 넘버링되는데, 예를 들어, TRBC1*01 또는 TRBC2*01에서, N-말단에서 C-말단으로의 순서로 60번째 아미노산이 P(프롤린)이면, 본 발명에서 이를 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손 1의 Pro60으로 표시할 수 있고, 이를 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손 1의 제60 부위 아미노산으로 표시할 수도 있으며, 또한 TRBC1*01 또는 TRBC2*01에서, N-말단에서 C-말단으로의 순서로 61번째 아미노산이 Q(글루타민)이면, 본 발명에서 이를 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손 1의 Gln61로 표시할 수 있고, 이를 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손 1의 제61 부위 아미노산으로 표시할 수도 있으며, 다른 것들도 이러한 방식으로 표시한다. 본 발명에서, 가변 영역 TRAV와 TRBV의 아미노산 서열의 위치 번호는 IMGT에서 나열된 위치에 따라 넘버링된다. TRAV에서의 어느 아미노산이 IMGT에서 나열된 위치 번호가 46이면, 본 발명에서 이를 TRAV 제46 부위 아미노산으로 표시하고, 다른 것들도 이러한 방식으로 표시한다. 본 발명에서, 다른 아미노산의 서열 위치 번호에 대해 특수하게 설명되었으면, 특수한 설명에 따른다.
종양
용어 "종양”은 유형 또는 침입 감염 단계와 관계없이 모든 유형의 암세포 성장 또는 암 유발 과정, 전이성 조직 또는 악성 형질전환 세포, 조직 또는 기관을 포함한다. 종양의 실시예는 비제한적으로 고형 종양, 연조직 종양 및 전이성 병변을 포함한다. 고형 종양의 실시예는 육종, 폐편평 세포 암종 및 암과 같은 상이한 기관 시스템의 악성 종양을 포함한다. 예를 들어, 감염된 전립선, 폐, 유방, 림프, 위장(예를 들어, 결장) 및 비뇨 생식기(예를 들어, 신장, 상피 세포), 인두이다. 폐편평 세포 암종은 다양한 결장암, 직장암, 신세포암, 간암, 폐의 비소세포암, 소장암 및 식도암과 같은 악성 종양을 포함한다. 상기 암의 전이성 병변은 마찬가지로 본 발명의 방법 및 조성물을 사용하여 치료 및 예방할 수 있다.
발명의 상세한 설명
공지된 바와 같이, TCR의 α 쇄 가변 영역 및 β 쇄 가변 영역은 각각 3개의 CDR을 포함하고, 항체의 상보성 결정 영역과 유사하다. CDR3과 항원의 짧은 펩티드는 상호 작용하고, CDR1 및 CDR2와 HLA는 상호 작용한다. 따라서, TCR 분자의 CDR은 이와 항원의 짧은 펩티드-HLA 복합체의 상호 작용을 결정한다. 항원의 짧은 펩티드 FMNKFIYEI 및 HLA A0201 복합체(즉, FMNKFIYEI-HLA A0201 복합체)에 결합할 수 있는 야생형 TCR의 α 쇄 가변 영역의 아미노산 서열 및 β 쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 각각 서열번호 1 및 서열번호 2이고, 상기 서열은 본 발명자가 최초로 발견한 것이다. 이는 하기와 같은 CDR 영역을 구비한다.
α 쇄 가변 영역 CDR:
CDR1α: TSINN
CDR2α: IRSNERE
CDR3α: ATDPRTGANSKLT; 및
β 쇄 가변 영역 CDR:
CDR1β: SEHNR
CDR2β: FQNEAQ
CDR3β: ASEGLAYEQY.
본 발명은 상기 CDR 영역에 돌연변이 선별을 진행하여 FMNKFIYEI-HLA A0201 복합체와의 친화력이 야생형 TCR과 FMNKFIYEI-HLA A0201 복합체의 친화력의 적어도 2배인 고친화력 TCR을 얻는다.
본 발명은 FMNKFIYEI-HLA A0201 복합체에 결합하는 활성을 갖는 T 세포 수용체(TCR)를 제공한다.
상기 T 세포 수용체는 TCR α 쇄 가변 영역 및 TCR β 쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 TCR α 쇄 가변 영역은 3개의 CDR 영역을 포함하고, 상기 TCR α 쇄 가변 영역의 3개의 CDR 영역의 기준 서열은 하기와 같고:
CDR1α: TSINN
CDR2α: IRSNERE
CDR3α: ATDPRTGANSKLT; 또한 하나 이상의 하기 돌연변이를 포함하고/거나:
Figure pct00008
상기 TCR β 쇄 가변 영역은 3개의 CDR 영역을 포함하고, 상기 TCR β 쇄 가변 영역의 3개의 CDR 영역의 기준 서열은 하기와 같고:
CDR1β: SEHNR
CDR2β: FQNEAQ
CDR3β: ASEGLAYEQY; 또한 하나 이상의 하기 돌연변이를 포함한다:
Figure pct00009
본 발명의 바람직한 실시형태에서, 본 발명에 따른 T 세포 수용체(TCR)는 TCR α 쇄 가변 영역 및 TCR β 쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 TCR α 쇄 가변 영역은 CDR1α, CDR2α, 및 CDR3α를 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 CDR1α는 서열 T[1αX1][1αX2][1αX3][1αX4]를 포함하고, 여기서, [1αX1], [1αX2], [1αX3], [1αX4]는 각각 독립적으로 임의의 천연 아미노산 잔기로부터 선택된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 [1αX1]은 S 또는 D 또는 P 또는 A 또는 E이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 [1αX2]는 I 또는 V이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 [1αX3]은 N 또는 S 또는 Y 또는 D이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 [1αX4]는 N 또는 S 또는 K이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 [1αX1]은 S 또는 D 또는 P 또는 A 또는 E이고, [1αX2]는 I 또는 V이며, [1αX3]은 N 또는 S 또는 Y 또는 D이고, [1αX4]는 N 또는 S 또는 K이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 CDR1α는 TSINN, TPISS, TDIYK, TAVDS, TEISS 및 TDVSS로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 TCR은 TCR α 쇄 가변 영역 및 TCR β 쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 TCR α 쇄 가변 영역은 CDR1α, CDR2α 및 CDR3α를 포함하고, 여기서 CDR2α의 아미노산 서열은 IRSNERE이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 TCR은 TCR α 쇄 가변 영역 및 TCR β 쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 TCR α 쇄 가변 영역은 CDR1α, CDR2α 및 CDR3α를 포함하고, CDR3α는 서열 ATDP[3αX1][3αX2][3αX3][3αX4][3αX5][3αX6]KLT를 포함하고, 여기서, [3αX1], [3αX2], [3αX3], [3αX4], [3αX5] 및 [3αX6]은 각각 독립적으로 임의의 천연 아미노산 잔기로부터 선택된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 [3αX1]은 R 또는 A 또는 S 또는 D 또는 E 또는 Q 또는 V 또는 T이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 [3αX2]는 T 또는 M 또는 R 또는 L 또는 A 또는 N 또는 S이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 [3αX3]은 G 또는 A 또는 Q 또는 S 또는 E 또는 N이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 [3αX4]는 A 또는 S 또는 G 또는 P 또는 W이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 [3αX5]는 N 또는 S 또는 T이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 [3αX6]은 S 또는 A 또는 N 또는 T 또는 P이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 [3αX1]은 R 또는 A 또는 S 또는 D 또는 E 또는 Q 또는 V 또는 T이고, [3αX2]는 T 또는 M 또는 R 또는 L 또는 A 또는 N 또는 S이며, [3αX3]은 G 또는 A 또는 Q 또는 S 또는 E 또는 N이고, [3αX4]는 A 또는 S 또는 G 또는 P 또는 W이며, [3αX5]는 N 또는 S 또는 T이고, [3αX6]은 S 또는 A 또는 N 또는 T 또는 P이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 CDR3α는 ATDPSMSPNSKLT, ATDPSLSPNSKLT 및 ATDPSLQSNSKLT로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시형태에서, 상기 TCR은 TCR α 쇄 가변 영역 및 TCR β 쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 TCR β 쇄 가변 영역은 CDR1β, CDR2β 및 CDR3β를 포함하고, 여기서, 상기 CDR3β는 서열 ASEGLAYEQY를 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 CDR1β는 서열 [1βX1][1βX2][1βX3][1βX4]R을 포함하고, 여기서, [1βX1], [1βX2], [1βX3], [1βX4]는 각각 독립적으로 임의의 천연 아미노산 잔기로부터 선택된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 [1βX1]은 S 또는 A 또는 Q 또는 G이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 [1βX2]는 E 또는 G 또는 T 또는 R 또는 L이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 [1βX3]은 H 또는 W 또는 R이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 [1βX4]는 N 또는 A 또는 P이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 CDR2β는 서열 F[2βX1][2βX2][2βX3][2βX4][2βX5]를 포함하고, 여기서, [2βX1], [2βX2], [2βX3], [2βX4], [2βX5]는 각각 독립적으로 임의의 천연 아미노산 잔기로부터 선택된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 [2βX1]은 Q 또는 H이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 [2βX2]는 N 또는 G이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 [2βX3]은 E 또는 D이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 [2βX4]는 A 또는 M 또는 L이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 [2βX5]는 Q 또는 E이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 CDR2β는 FQGDME, FQGDLE 및 FHGDLE로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 TCR은 TCR α 쇄 가변 영역 및 TCR β 쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 TCR β 쇄 가변 영역은 CDR1β, CDR2β 및 CDR3β를 포함하고, 여기서 상기 CDR2β의 아미노산 서열은 FQGDME, FQGDLE 및 FHGDLE로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 TCR의 TCR α 쇄 가변 영역이 상이할 경우, CDR1α: TSINN; CDR2α: IRSNERE; 및 CDR3α: ATDPRTGANSKLT와 같은 CDR을 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 TCR의 TCR β 쇄 가변 영역이 상이할 경우, CDR1β: SEHNR; CDR2β: FQNEAQ; 및 CDR3β: ASEGLAYEQY와 같은 CDR을 포함한다.
보다 상세하게, 상기 TCR α 쇄 CDR 영역의 돌연변이 개수는 3개, 4개, 5개, 6개, 7개 또는 8개일 수 있고/거나; 상기 TCR β 쇄 CDR 영역의 돌연변이 개수는 4개, 5개, 6개, 7개 또는 8개일 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 TCR은 αβ 이종 이량체 TCR이고, 상기 TCR의 α 쇄 가변 영역은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 90 %; 바람직하게, 적어도 92 %; 더 바람직하게, 적어도 94 %(예를 들어, 적어도 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %의 서열 상동성일 수 있음)의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고/거나; 상기 TCR의 β 쇄 가변 영역은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 90 %, 바람직하게, 적어도 92 %; 더 바람직하게, 적어도 94 %(예를 들어, 적어도 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %의 서열 상동성일 수 있음)의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
또한, 본 발명에 따른 TCR은 단일 쇄 TCR이고, 상기 TCR의 α 쇄 가변 영역은 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 85 %, 바람직하게, 적어도 90 %; 더 바람직하게, 적어도 92 %; 가장 바람직하게, 적어도 94 %(예를 들어, 적어도 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %의 서열 상동성일 수 있음)의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고/거나; 상기 TCR의 β 쇄 가변 영역은 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열 적어도 85 %, 바람직하게, 적어도 90 %; 더 바람직하게, 적어도 92 %; 가장 바람직하게, 적어도 94 %(예를 들어, 적어도 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %의 서열 상동성일 수 있음)의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
바람직하게, 상기 TCR은 (i) 막관통 영역을 제외한 전부 또는 부분 TCR α 쇄, 및 (ii) 막관통 영역을 제외한 전부 또는 부분 TCR β 쇄를 포함하고, 여기서, (i) 및 (ii)는 모두 TCR 쇄의 가변 영역 및 적어도 일부분의 불변 영역을 포함한다.
본 발명에서, 야생형 TCR α 쇄 가변 영역의 서열번호 1의 3개의 CDR, 즉 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 서열번호 1의 제27-31 부위, 제49-55 부위 및 제90-10 부위에 위치한다. 따라서, 아미노산 잔기 번호는 서열번호 1로 표시되는 번호를 사용하고, 28S는 CDR1α의 제2 부위 S이고, 29I는 CDR1α의 제3 부위 I이며, 30N은 CDR1α의 제4 부위 N이고, 31N은 CDR1α의 제5 부위 N이며, 94R은 CDR3α의 제5 부위 R이고, 95T는 CDR3α의 제6 부위 T이며, 96G는 CDR3α의 제7 부위 G이고, 97A는 CDR3α의 제8 부위 A이며, 98N은 CDR3α의 제9 부위 N이고, 99S는 CDR3α의 제10 부위 S이다.
마찬가지로, 본 발명에서, 야생형 TCR β 쇄 가변 영역의 서열번호 2의 3개의 CDR, 즉 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 서열번호 2의 제27-31 부위, 제49-54 부위 및 제93-102 부위에 위치한다. 따라서, 아미노산 잔기 번호는 서열번호 2로 표시되는 번호를 사용하고, 27S는 CDR1β의 제2 부위 S이고, 28E는 CDR1β의 제2 부위 E이며, 29H는 CDR1β의 제3 부위 H이고, 30N은 CDR1β의 제4 부위 N이며, 50Q는 CDR2β의 제2 부위 Q이고, 51N은 CDR2β의 제3 부위 N이며, 52E는 CDR2β의 제4 부위 E이고, 53A는 CDR2β의 제5 부위 A이며, 54Q는 CDR2β의 제6 부위 Q이다.
본 발명은, FMNKFIYEI-HLA A0201 복합체에 결합하는 특성을 가지고, α 쇄 가변 영역 및 β 쇄 가변 영역을 포함하는 TCR을 제공하되, 상기 TCR은 서열번호 1로 표시되는 α 쇄 가변 영역에서 돌연변이되고, 상기 돌연변이된 아미노산 잔기 부위는 28S, 29I, 30N, 31N, 94R, 95T, 96G, 97A, 98N 및 99S 중 하나 또는 복수 개를 포함하고, 여기서, 아미노산 잔기 번호는 서열번호 1로 표시되는 번호를 사용하고/거나; 상기 TCR은 서열번호 2로 표시되는 β 쇄 가변 영역에서 돌연변이되고, 상기 돌연변이된 아미노산 잔기 부위는 27S, 28E, 29H, 30N, 50Q, 51N, 52E, 53A 및 54Q중 하나 또는 복수 개를 포함하고, 여기서, 아미노산 잔기 번호는 서열번호 2로 표시되는 번호를 사용하고;
바람직하게, 돌연변이 후의 상기 TCR α 쇄 가변 영역은, 하나 또는 복수 개의 아미노산 잔기: 28D 또는 28P 또는 28A 또는 28E; 29V; 30S 또는 30Y 또는 30D; 31S 또는 31K, 94A 또는 94S 또는 94V 또는 94D 또는 94E 또는 94Q 또는 94T, 95M 또는 95R 또는 95L 또는 95A 또는 95N 또는 95S, 96A 또는 96Q 또는 96S 또는 96E 또는 96N, 97S 또는 97G 또는 97P 또는 97W, 98S 또는 98T, 99A 또는 99N 또는 99T 또는 99P로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 복수 개의 아미노산 잔기를 포함하고, 여기서, 아미노산 잔기 번호는 서열번호 1로 표시되는 번호를 사용하고/거나; 돌연변이 후의 상기 TCR β 쇄 가변 영역은, 27A 또는 27Q 또는 27G, 28G 또는 28T 또는 28R 또는 28L, 29W 또는 29R, 30A 또는 30P, 50H, 51G, 52D, 53M 또는 53L, 54E로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 복수 개의 아미노산 잔기를 포함하고, 아미노산 잔기 번호는 서열번호 2로 표시되는 번호를 사용한다.
보다 구체적으로, α 쇄 가변 영역 중 상기 돌연변이된 구체적인 형태는 S28D/P/A/E, I29V, N30S/Y/D, N31S/K, R94A/S/V/D/E/Q/T, T95M/R/L/A/N/S, G96A/Q/S/E/N, A97S/G/P/W, N98S/T, S99A/N/T/P 중 하나 이상의 군을 포함하고; β 쇄 가변 영역 중 상기 돌연변이된 구체적인 형태는 S27A/Q/G, E28G/T/R/L, H29W/R, N30A/P, Q50H, N51G, E52D, A53M/L, Q54E 중 하나 이상의 군을 포함한다.
본 기술분야의 통상의 기술자가 숙지하는 부위 지정 돌연변이의 방법에 따라, 야생형 TCR α 쇄 불변 영역 TRAC*01 엑손 1의 Thr48을 시스테인으로 돌연변이시키고, β 쇄 불변 영역 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손 1의 Ser57을 시스테인으로 돌연변이시켜, 가용성 참조 TCR을 얻되, 이의 아미노산 서열은 각각 도 8a 및 8b에 도시된 바와 같고, 돌연변이 후의 시스테인 잔기는 볼드체 문자로 표시한다. 상기 시스테인 치환은 참조 TCR의 α와 β 쇄의 불변 영역 사이에서 인공 쇄 간 이황화 결합을 형성할 수 있도록 하여, 더욱 안정적인 가용성 TCR을 형성함으로써, TCR과 FMNKFIYEI-HLA A2 복합체 사이의 결합 친화력 및/또는 결합 반감기를 보다 편리하게 평가할 수 있다. TCR 가변 영역의 CDR 영역이 이와 pMHC 복합체 사이의 친화력을 결정하므로, 상기 TCR 불변 영역의 시스테인 치환은 TCR의 결합 친화력 및/또는 결합 반감기에 대해 영항을 미치지 않음을 이해해야 한다. 따라서, 본 발명에서, 측정된 참조 TCR과 FMNKFIYEI-HLA A0201 복합체 사이의 결합 친화력은 야생형 TCR과 FMNKFIYEI-HLA A0201 복합체 사이의 결합 친화력으로 간주된다. 마찬가지로, 본 발명의 TCR과 FMNKFIYEI-HLA A0201 복합체 사이의 결합 친화력이 참조 TCR과 FMNKFIYEI-HLA A0201 복합체 사이의 결합 친화력의 적어도 10배인 것으로 측정되면, 본 발명의 TCR과 FMNKFIYEI-HLA A0201 복합체 사이의 결합 친화력이 야생형 TCR과 FMNKFIYEI-HLA A0201 복합체 사이의 결합 친화력의 적어도 10배인 것과 동등하다.
임의의 적합한 방법으로 결합 친화력(해리 평형 상수 KD와 반비례됨) 및 결합 반감기(T1/2로 표시함)를 측정할 수 있는데, 예를 들어 표면 플라스몬 공명 기술을 사용하여 측정할 수 있다. TCR의 친화력이 2배로 증가되면 KD는 절반으로 감소된다. T1/2는 In2를 해리율(Koff)로 나누어 계산된다. 따라서, T1/2가 2배 증가되면 Koff는 절반으로 감소된다. 바람직하게, 동일한 실험 방안으로 주어진 TCR의 결합 친화력 또는 결합 반감기 횟수를 측정하는데, 예를 들어, 3번 또는 그 이상으로 측정하여 결과의 평균값을 취한다. 바람직한 실시형태에서, 본문의 실시예에서의 표면 플라스몬 공명(BIAcore) 방법을 사용하여 온도가 25 ℃이고 PH 값이 7.1 ~ 7.5인 조건에서 가용성 TCR의 친화력을 측정한다. 상기 방법으로 검출한 결과, FMNKFIYEI-HLA A2 복합체에 대한 참조 TCR의 해리 평형 상수 KD는 4.3E-05M, 즉 43 μM이면, 본 발명에서도 FMNKFIYEI-HLA A2 복합체에 대한 야생형 TCR의 해리 평형 상수 KD가 43 μM인 것으로 간주한다. TCR의 친화력이 2배 증가되면 KD는 절반으로 감소되므로, FMNKFIYEI-HLA A2 복합체에 대한 고친화력 TCR의 해리 평형 상수 KD가 4.3E-06M, 즉 4.3 μM인 것으로 측정되면, FMNKFIYEI-HLA A2 복합체에 대한 상기 고친화력 TCR의 친화력이 FMNKFIYEI-HLA A2 복합체에 대한 야생형 TCR의 친화력의 10배임을 설명한다. 본 기술분야의 통상의 기술자는 KD 값 단위 간의 환산 관계, 즉 1 M = 106 μM, 1 μM = 1000 nM, 1 nM = 1000 pM을 잘 알고 있다.
본 발명의 바람직한 예에서, 상기 TCR과 FMNKFIYEI-HLA A0201 복합체의 친화력은 야생형 TCR의 적어도 2배이고; 바람직하게, 적어도 5배이며; 더 바람직하게, 적어도 10배이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 TCR과 FMNKFIYEI-HLA A0201 복합체의 친화력은 야생형 TCR의 적어도 50배이고; 바람직하게, 적어도 100배이며; 더 바람직하게, 적어도 500배이고; 가장 바람직하게, 적어도 1000배이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 TCR과 FMNKFIYEI-HLA A0201 복합체의 친화력은 야생형 TCR의 적어도 104배이고; 바람직하게, 적어도 105배이며; 더 바람직하게, 적어도 106배이고;
구체적으로, FMNKFIYEI-HLA A0201 복합체에 대한 상기 TCR의 해리 평형 상수는 KD≤20 μM이고;
다른 바람직한 예에서, FMNKFIYEI-HLA A0201 복합체에 대한 상기 TCR의 해리 평형 상수는 5 μM≤KD≤10 μM이며; 바람직하게, 0.1 μM≤KD≤1 μM이고; 더 바람직하게, 1 nM≤KD≤100 nM이며;
다른 바람직한 예에서, FMNKFIYEI-HLA A0201 복합체에 대한 상기 TCR의 해리 평형 상수는 100 pM≤KD≤1000 pM이고; 바람직하게, 10 pM≤KD≤100 pM이다.
중합 효소 연쇄 반응(PCR), 제한 효소 기반 클로닝 또는 결찰-독립 클로닝(LIC) 방법을 포함하지만 이에 한정되지 않는 임의의 적합한 방법으로 돌연변이를 진행할 수 있다. 많은 표준 분자 생물학 교과서에서 이러한 방법을 자세히 설명하였다. 중합 효소 연쇄 반응(PCR) 돌연변이 유도 및 제한 효소 기반 클로닝에 대한 자세한 내용은 "Sambrook 및 Russell, (2001) 분자 클로닝 실험 지침서(Molecular Cloning-A Laboratory Manual)(제3판) CSHL 출판사”를 참조할 수 있다. LIC 방법의 많은 정보는 (Rashtchian,(1995)Curr Opin Biotechnol 6(1):30-6)을 참조할 수 있다.
본 발명의 TCR을 생산하는 방법은 이러한 TCR을 나타내는 파지 입자의 다양한 라이브러리로부터 FMNKFIYEI-HLA-A2 복합체에 대해 고친화력을 갖는 TCR을 선별할 수 있지만 이에 한정되지 않는데, 예를 들어, 문헌(Li, et al(2005)Nature Biotech 23(3):349-354)에 기재된 바와 같다.
야생형 TCR α 및 β 쇄 가변 영역 아미노산을 발현하는 유전자 또는 약간 변형된 야생형 TCR의 α 및 β 쇄 가변 영역 아미노산을 발현하는 유전자는 모두 주형 TCR의 제조에 사용될 수 있음을 이해해야 한다. 그런 다음, 상기 주형 TCR의 가변 영역을 코딩하는 DNA에 본 발명의 고친화력 TCR을 생산하는데 필요한 변화를 도입한다.
본 발명의 고친화력 TCR은 α 쇄 가변 영역의 아미노산 서열 서열번호 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 91, 92 중 하나 및/또는 β 쇄 가변 영역의 아미노산 서열 서열번호 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101 중 하나를 포함한다. 따라서, 야생형 TCR의 α 쇄 가변 영역의 아미노산 서열(서열번호 1)을 포함하는 TCR α 쇄는 서열번호 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101 중 하나를 포함하는 TCR β 쇄와 조합되어 이종 이량체 TCR 또는 단일 쇄 TCR 분자를 형성할 수 있다. 또는, 야생형 TCR의 β 가변 영역의 아미노산 서열(서열번호 2)을 포함하는 TCR β 쇄는 서열번호 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 91, 92 중 하나를 포함하는 TCR α 쇄와 조합되어 이종 이량체 TCR 또는 단일 쇄 TCR 분자를 형성할 수 있다. 또는, TCR α 쇄 가변 영역의 아미노산 서열 서열번호 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 91, 92 중 하나를 포함하는 TCR α 쇄는 TCR β 쇄 가변 영역의 아미노산 서열 서열번호 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101 중 하나를 포함하는 TCR β 쇄와 조합되어 이종 이량체 TCR 또는 단일 쇄 TCR 분자를 형성할 수 있다. 본 발명에서, 이종 이량체 TCR 분자를 형성하는 α 쇄 가변 영역 및 β 쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 바람직하게 하기 표 1로부터 선택된다.
TCR 번호 α 쇄 가변 영역의 서열
서열번호 		β 쇄 가변 영역의 서열
서열번호
1 54 2
2 52 2
3 51 2
4 53 2
5 55 2
6 56 2
7 57 2
8 58 2
9 59 2
10 60 2
11 61 2
12 62 2
13 63 2
14 1 78
15 64 79
16 65 80
17 66 81
18 67 81
19 68 81
20 68 80
21 69 79
22 70 82
23 71 79
24 71 83
25 72 84
26 73 83
27 74 85
28 68 86
29 75 82
30 66 84
31 68 79
32 72 87
33 76 79
34 72 81
35 74 88
36 77 84
37 1 93
38 1 94
39 1 95
40 1 96
41 1 97
42 1 98
43 1 99
44 1 100
45 91 101
46 92 101
본 발명의 목적에 기반해 보면, 본 발명의 TCR은 하나 이상의 TCR α 및/또는 TCR β 쇄 가변 영역을 갖는 부분이다. 이들은 일반적으로 TCR α 쇄 가변 영역 및 TCR β 쇄 가변 영역을 동시에 포함한다. 이들은 αβ 이종 이량체 또는 단일 쇄 형태 또는 다른 임의의 안정하게 존재할 수 있는 형태일 수 있다. 입양 면역 요법에서, αβ 이종 이량체 TCR의 전장 쇄(세포질 및 막관통 영역을 포함)을 형질감염시킬 수 있다. 본 발명의 TCR은 치료제를 항원 제시 세포로 전달하는 표적화제로 사용될 수 있거나, 다른 분자와 결합하여 이중 기능성 폴리펩티드를 제조하여 효과기 세포를 표적화할 수 있는데, 이런 경우 TCR은 바람직하게 용해 가능한 형태이다.
안정성에 있어서, 특허 문헌 PCT/CN2015/093806에 기재된 가와 같이, 선행기술에서 TCR의 α와 β 쇄 불변 영역 사이에 인공 쇄 간 이황화 결합을 도입하여 용해 가능하고 안정한 TCR 분자를 얻을 수 있는 것을 공개하였다. 따라서, 본 발명의 TCR은 이의 α와 β 쇄 불변 영역의 잔기 사이에 인공 쇄 간 이황화 결합을 도입한 TCR일 수 있다. 시스테인 잔기는 상기 TCR의 α와 β 쇄 불변 영역 사이에서 인공 쇄 간 이황화 결합을 형성한다. 시스테인 잔기는 천연 TCR에서 적합 부위의 다른 아미노산 잔기를 치환하여 인공 쇄 간 이황화 결합을 형성할 수 있다. 예를 들어, TRAC*01 엑손 1의 Thr48을 치환하고 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손 1의 Ser57을 치환하여 이황화 결합을 형성한다. 시스테인 잔기를 도입하여 이황화 결합을 형성하는 다른 부위는 TRAC*01 엑손 1의 Thr45 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손 1의 Ser77; TRAC*01 엑손 1의 Tyr10 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손 1의 Ser17; TRAC*01 엑손 1의 Thr45 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손 1의 Asp59; TRAC*01 엑손 1의 Ser15 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손 1의 Glu15; TRAC*01 엑손 1의 Arg53 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손 1의 Ser54; TRAC*01 엑손 1의 Pro89 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손 1의 Ala19; 또는 TRAC*01 엑손 1의 Tyr10 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손 1의 Glu20일 수도 있다. 즉 시스테인 잔기는 상기 α와 β 쇄 불변 영역 중 어느 한 군의 부위를 치환한다. 본 발명의 TCR 불변 영역의 하나 또는 복수 개의 C-말단에서 최대 15개, 또는 최대 10개, 또는 최대 8개 또는 더 적은 아미노산을 절단하여, 이가 시스테인 잔기를 포함하지 않도록 하여 천연 쇄 간 이황화 결합을 결실시키는 목적에 도달할 수 있고, 천연 쇄 간 이황화 결합을 형성하는 시스테인 잔기를 다른 아미노산으로 돌연변이시켜 상기 목적에 도달할 수도 있다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 TCR은 이의 α와 β 쇄 불변 영역의 잔기 사이에 도입된 인공 쇄 간 이황화 결합을 포함할 수 있다. 불변 영역 사이에 상술한 도입된 인공 이황화 결합이 포함 또는 불포함되고, 본 발명의 TCR은 모두 불변 영역 서열 및 TRBC1 또는 TRBC2 불변 영역 서열을 포함할 수 있음에 유의해야 한다. TCR의 TRAC 불변 영역 서열 및 TRBC1 또는 TRBC2 불변 영역 서열은 TCR에 존재하는 천연 쇄 간 이황화 결합을 통해 연결될 수 있다.
이 밖에, 안정성에 있어서, 특허 문헌 PCT/CN2016/077680에서는 또한 TCR의 α 쇄 가변 영역과 β 쇄 불변 영역 사이에 인공 쇄 간 이황화 결합을 도입하여 TCR의 안정성을 현저히 향상시킬 수 있는 것을 공개하였다. 따라서, 본 발명의 고친화력 TCR의 α 쇄 가변 영역과 β 쇄 불변 영역 사이에 인공 쇄 간 이황화 결합이 포함될 수도 있다. 구체적으로, 상기 TCR의 α 쇄 가변 영역과 β 쇄 불변 영역 사이에 인공 쇄 간 이황화 결합을 형성하는 시스테인 잔기는 TRAV의 제46 부위 아미노산 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손 1의 제60 부위 아미노산; TRAV의 제47 부위 아미노산 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손 1의 제61 부위 아미노산; TRAV의 제46 부위 아미노산 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손 1의 제61 부위 아미노산; 또는 TRAV의 제47 부위 아미노산 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손 1의 제60 부위 아미노산을 치환한다. 바람직하게, 이러한 TCR은 (i) 막관통 영역을 제외한 전부 또는 부분 TCR α 쇄, 및 (ii) 막관통 영역을 제외한 전부 또는 부분 TCR β 쇄를 포함할 수 있고, 여기서, (i) 및 (ii)는 모두 TCR 쇄의 가변 영역 및 적어도 일부분의 불변 영역을 포함하고, α 쇄와 β 쇄는 이종 이량체를 형성한다. 더 바람직하게, 이러한 TCR은 α 쇄 가변 영역 및 β 쇄 가변 영역 및 막관통 영역을 제외한 전부 또는 부분 β 쇄 불변 영역을 포함할 수 있지만, α 쇄 불변 영역을 포함하지 않으며, 상기 TCR의 α 쇄 가변 영역과 β 쇄는 이종 이량체를 형성한다.
안정성에 대한 다른 양태에서, 본 발명의 TCR은 이의 소수성 코어 영역에서 돌연변이되는 TCR을 더 포함하되, 이러한 소수성 코어 영역의 돌연변이는 바람직하게 본 발명의 TCR의 안정성을 향상시킬 수 있는 돌연변이이며, 공개 번호가 WO2014/206304인 특허 문헌에서 기재된 바와 같다. 이러한 TCR은 이의 가변 영역 소수성 코어 위치(즉 α 및/또는 β 쇄) 가변 영역 아미노산의 제11, 13, 19, 21, 53, 76, 89, 91, 94 부위, 및/또는 α 쇄 J 유전자(TRAJ) 짧은 펩티드 아미노산 위치의 마지막 제3, 5, 7 부위, 및/또는 β 쇄 J 유전자(TRBJ) 짧은 펩티드 아미노산 위치의 마지막 제2, 4, 6 부위에서 돌연변이될 수 있되, 여기서, 아미노산 서열의 위치 번호는 국제 면역 유전학 정보 시스템(IMGT)에 나열된 위치에 따라 넘버링된다. 본 기술분야의 통상의 기술자는 상기 국제 면역 유전학 정보 시스템을 잘 알고 있고, 상기 데이터베이스에 따라 IMGT에서의 상이한 TCR의 아미노산 잔기의 위치 번호를 얻을 수 있다.
보다 구체적으로, 본 발명에서 소수성 코어 영역에서 돌연변이를 발생하는 TCR은 플렉서블 펩티드 쇄에 의해 연결되는 TCR의 α와 β 쇄의 가변 영역으로 구성된 고안정성 단일 쇄 TCR일 수 있다. TCR 가변 영역의 CDR 영역은 이와 짧은 펩티드-HLA 복합체 사이의 친화력을 결정하고, 소수성 코어의 돌연변이는 TCR을 더 안정화시킬 수 있지만, 이와 짧은 펩티드-HLA 복합체 사이의 친화력에 영향주지 않는다. 본 발명에서 플렉서블 펩티드 쇄는 TCR α와 β 쇄 가변 영역을 연결하는 임의의 적합한 펩티드 쇄일 수 있다. 본 발명의 실시예 1에서 구축한, 고친화력 TCR을 선별하기 위한 주형 쇄는 소수성 코어 돌연변이를 포함한 상기 고안정성 단일 쇄 TCR이다. 안정성이 높은 TCR을 사용함으로써, TCR과 FMNKFIYEI-HLA-A0201 복합체 사이의 친화력을 더 편리하게 평가할 수 있다.
상기 단일 쇄 주형 TCR의 α 쇄 가변 영역 및 β 쇄 가변 영역의 CDR 영역과 야생형 TCR의 CDR 영역은 완전히 같다. 즉 α 쇄 가변 영역의 3개의 CDR은 각각 CDR1α: TSINN, CDR2α: IRSNERE이고, CDR3α: ATDPRTGANSKLT이고, β 쇄 가변 영역의 3개의 CDR은 각각 CDR1β: SEHNR, CDR2β: FQNEAQ, CDR3β: ASEGLAYEQY이다. 상기 단일 쇄 주형 TCR의 아미노산 서열(서열번호 47) 및 뉴클레오티드 서열(서열번호 48)은 각각 도 7a 및 7b에 도시된 바왁 같다. 이로써 FMNKFIYEI-HLA A0201 복합체에 대해 고친화력을 갖는, α 쇄 가변 영역 및 β 쇄 가변 영역으로 구성된 단일 쇄 TCR을 선별한다.
본 발명에서, 단일 쇄 주형 TCR α 쇄 가변 영역의 서열번호 3의 3개의 CDR, 즉 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 서열번호 3의 제27-31 부위, 제49-55 부위 및 제90-102 부위에 위치한다. 따라서, 아미노산 잔기 번호는 서열번호 3으로 표시되는 번호를 사용하고, 28S는 CDR1α의 제2 부위 S이며, 29I는 CDR1α의 제3 부위 I이고, 30N은 CDR1α의 제4 부위 N이며, 31N은 CDR1α의 제5 부위 N이고, 94R은 CDR3α의 제5 부위 R이며, 95T는 CDR3α의 제6 부위 T이고, 96G는 CDR3α의 제7 부위 G이며, 97A는 CDR3α의 제8 부위 A이고, 98N은 CDR3α의 제9 부위 N이며, 99S는 CDR3α의 제10 부위 S이다.
마찬가지로, 본 발명에서, 단일 쇄 주형 TCR β 쇄 가변 영역의 서열번호 4의 3개의 CDR, 즉 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 서열번호 2의 제27-31 부위, 제49-54 부위 및 제93-102 부위에 위치한다. 따라서, 아미노산 잔기 번호는 서열번호 4로 표시되는 번호를 사용하고, 27S는 CDR1β의 제2 부위 S이며, 28E는 CDR1β의 제2 부위 E이고, 29H는 CDR1β의 제3 부위 H이며, 30N은 CDR1β의 제4 부위 N이고, 50Q는 CDR2β의 제2 부위 Q이며, 51N은 CDR2β의 제3 부위 N이고, 52E는 CDR2β의 제4 부위 E이며, 53A는 CDR2β의 제5 부위 A이고, 54Q는 CDR2β의 제6 부위 Q이다.
본 발명의 FMNKFIYEI-HLA-A0201 복합체에 대해 고친화력을 갖는 αβ 이종 이량체는 선별된 고친화력 단일 쇄 TCR의 α와 β 쇄 가변 영역의 CDR 영역을 야생형 TCR α 쇄 가변 영역(서열번호 1)과 β 쇄 가변 영역(서열번호 2)의 대응되는 위치로 전이시켜 획득된다. 또 다른 부분은 선별된 CDR 영역의 돌연변이 부위에 따라 인공 조합을 진행하여 획득된 것이다.
본 발명의 고친화력 TCR은 α 쇄 가변 영역의 아미노산 서열 서열번호 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 및 35 중 하나 및/또는 β 쇄 가변 영역의 아미노산 서열 서열번호 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45 및 46 중 하나를 더 포함한다. 따라서, 상기 주형 쇄인 고안정성 단일 쇄 TCR α 쇄 가변 영역(서열번호 3)은 아미노산 서열이 서열번호 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45 또는 46인 TCR β 쇄 가변 영역과 조합되어 상기 단일 쇄 TCR 분자를 형성할 수 있다. 또는, 상기 주형 쇄인 고안정성 단일 쇄 TCR β 쇄 가변 영역(서열번호 4)은 아미노산 서열이 서열번호 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 또는 35인 TCR α 쇄 가변 영역과 조합되어 상기 단일 쇄 TCR 분자를 형성할 수 있다. 또는, TCR α 쇄 가변 영역의 서열번호 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 및 35 중 하나는 TCR β 쇄 가변 영역의 서열번호 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45 및 46 중 하나와 조합되어 상기 단일 쇄 TCR 분자를 형성한다. 본 발명에서, 고친화력 단일 쇄 TCR 분자의 α 쇄 가변 영역과 β 쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 바람직하게 하기 표 2로부터 선택된다.
TCR 번호 α 쇄 가변 영역의 서열
서열번호 		β 쇄 가변 영역의 서열
서열번호
s-1 12 4
s-2 10 4
s-3 9 4
s-4 11 4
s-5 13 4
s-6 14 4
s-7 15 4
s-8 16 4
s-9 17 4
s-10 18 4
s-11 19 4
s-12 20 4
s-13 21 4
s-14 3 36
s-15 22 37
s-16 23 38
s-17 24 39
s-18 25 39
s-19 26 39
s-20 26 38
s-21 27 37
s-22 28 40
s-23 29 37
s-24 29 41
s-25 30 42
s-26 31 41
s-27 32 43
s-28 26 44
s-29 33 40
s-30 24 42
s-31 26 37
s-32 30 45
s-33 34 37
s-34 30 39
s-35 32 46
s-36 35 42
본 발명의 TCR은 다가 복합체의 형태로 제공될 수도 있다. 본 발명의 다가 TCR 복합체는 2개, 3개, 4개 또는 그 이상의 TCR가 서로 결합되어 형성된 폴리머를 포함하는데, 예를 들어, p53의 사량체화 도메인을 사용하여 4합체를 생성할 수 있거나, 복수 개의 본 발명의 TCR과 다른 분자를 결합하여 복합체를 형성할 수 있다. 본 발명의 TCR 복합체는 체외 또는 체내에서 특정 항원을 제시하는 세포를 추적하거나 표적화하는데 사용될 수 있고, 이러한 적용을 통해 다른 다가 TCR 복합체의 중간체를 생성하는데에도 사용될 수 있다.
본 발명의 TCR은 단독으로 사용될 수 있거나, 공유 또는 다른 방식으로, 바람직하게 공유 방식으로 접합체와 조합될 수 있다. 접합체는 검출 가능한 마커(진단 목적을 위해, 여기서, 상기 TCR이 FMNKFIYEI-HLA-A2 복합체를 제시하는 세포의 존재를 검출하는데 사용됨), 치료제, PK(단백질 키나제) 변형된 부분 또는 이러한 물질의 임의의 조합 또는 결합을 포함한다.
진단 목적으로 사용되는 검출 가능한 마커는 형광 또는 발광 마커, 방사성 마커, MRI(자기 공명 영상) 또는 CT(전자 컴퓨터 X-ray 단층 촬영 기술) 조영제, 또는 검출 가능한 산물 생성 가능 효소를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 TCR과 결합 또는 커플링될 수 있는 치료제는 1. 방사성 핵종(Koppe 등, 2005, 암 전이 검토(Cancer metastasis reviews)24, 539); 2. 생물독(Chaudhary 등, 1989, 자연(Nature)339, 394; Epel 등, 2002, 암 면역학 및 면역 요법(Cancer Immunology and Immunotherapy)51, 565); 3. IL-2 등 사이토카인(Gillies 등, 1992, 미국국립과학원회보(PNAS)89, 1428; Card 등, 2004, 암 면역학 및 면역 요법(Cancer Immunology and Immunotherapy) 53, 345; Halin 등, 2003, 암 연구(Cancer Research)63, 3202); 4. 항체 Fc 단편(Mosquera 등, 2005, 면역학 저널(The Journal Of Immunology) 174, 4381); 5. 항체 scFv 단편(Zhu 등, 1995, 국제 암 저널(International Journal of Cancer)62, 319); 6. 금 나노입자/나노로드(Lapotko 등, 2005, 암 저널(Cancer letters)239, 36; Huang 등, 2006, 미국화학회지(Journal of the American Chemical Society)128, 2115); 7. 바이러스 입자(Peng 등, 2004, 유전자 치료(Gene therapy) 11, 1234); 8. 리포솜(Mamot 등, 2005, 암 연구(Cancer research)65, 11631); 9. 자기 나노입자; 10. 전구 약물 활성화 효소(예를 들어, DT-디아퍼라아제(DTD) 또는 비페닐 가수분해 효소 유사 단백질(BPHL)); 11. 화학요법제(예를 들어, 시스플라틴) 또는 임의의 형태의 나노입자 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 TCR에 결합하는 항체 또는 이의 단편은 항-T 세포 또는 NK-세포 결정 항체, 예를 들어 항-CD3 또는 항-CD28 또는 항-CD16 항체를 포함하고, 상기 항체 또는 이의 단편과 TCR의 결합은 효과기 세포를 표적화하여 표적 세포를 더 잘 표적화할 수 있다. 하나의 바람직한 실시형태는 본 발명의 TCR과 항-CD3 항체 또는 상기 항-CD3 항체의 기능 단편 또는 변이체가 결합하는 것이다. 구체적으로, 본 발명의 TCR과 항-CD3 단일 쇄 항체의 융합 분자는 서열번호 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 91, 92로 이루어진 군으로부터 선택되는 TCR α 쇄 가변 영역의 아미노산 서열, 및 서열번호 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101로 이루어진 군으로부터 선택되는 TCR β 쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 TCR을 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 본 발명의 핵산 분자는 DNA 형태 또는 RNA 형태일 수 있다. DNA는 코딩 쇄 또는 비 코딩 쇄일 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 TCR을 코딩하는 핵산 서열은 본 발명의 도면에 도시된 핵산 서열과 동일하거나 축퇴된 변이체일 수 있다. "축퇴된 변이체"의 의미를 예를 들어 설명하면, 본 명세서에서 사용된 "축퇴된 변이체"는 서열번호 47을 갖는 단백질 서열을 코딩하지만 서열번호 48의 서열과 차이가 있는 핵산 서열을 의미한다.
본 발명의 핵산 분자 전장 서열 또는 이의 단편은 일반적으로 PCR 증폭법, 재조합법 또는 인공 합성 방법에 의해 얻을 수 있지만 이에 한정되지 않는다. 현재 본 발명의 TCR(또는 이의 단편, 또는 이의 유도체)을 코딩하는 DNA 서열은 화학적 합성을 통해 완전히 얻을 수 있다. 그런 다음 상기 DNA 서열을 기존의 다양한 DNA 분자(또는 예를 들어 벡터) 및 본 기술분야에 알려진 세포에 도입할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 벡터, 및 본 발명의 벡터 또는 코딩 서열을 사용하여 유전자 공학을 통해 생성된 숙주 세포를 포함한다.
본 발명은 본 발명의 TCR을 발현하는 단리된 세포, 특히 T 세포를 더 포함한다. 본 발명의 고친화력 TCR을 코딩하는 DNA 또는 RNA로 T 세포를 형질감염시키는데 적합한 방법은 다양하다(예를 들어, Robbins 등., (2008)J. Immunol.180:6116-6131). 본 발명의 고친화력 TCR을 발현하는 T 세포는 입양 면역 용법에 사용될 수 있다. 본 기술분야의 통상의 기술자는 입양 면역 용법을 진행하는 많은 적합한 방법(예를 들어, Rosenberg 등., (2008)Nat Rev Cancer8(4): 299-308)을 알 수 있다.
본 발명은 약학적으로 허용 가능한 담체 및 본 발명의 TCR, 또는 본 발명의 TCR 복합체, 또는 본 발명의 TCR을 제시하는 세포를 포함하는 약학 조성물을 더 제공한다.
본 발명은 치료를 필요로 하는 대상체에 적당량의 본 발명의 TCR, 또는 본 발명의 TCR 복합체, 또는 본 발명의 TCR을 제시하는 세포, 또는 본 발명의 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 질환의 치료 방법을 더 제공한다.
본문에서 아미노산 명칭은 국제적으로 통용되는 단일 영문 문자로 표기하고, 이와 대응되는 아미노산 명칭의 3개의 영문 문자 약어는 각각 Ala(A), Arg(R), Asn(N), Asp(D), Cys(C), Gln(Q), Glu(E), Gly(G), His(H), Ile(I), Leu(L), Lys(K), Met(M), Phe(F), Pro(P), Ser(S), Thr(T), Trp(W), Tyr(Y), Val(V)임을 이해해야 한다.
본 발명에서, Pro60 또는 60P는 모두 제60 부위 프롤린을 의미한다. 이 밖에, 본 발명에서의 돌연변이의 구체적인 형태의 표현 방식은 하기와 같은 바, 예컨대 "T27G"는 제27 부위의 T가 G에 의해 치환됨을 의미하고, 마찬가지로, "I29A/V"는 제29 부위의 I가 A에 의해 치환되거나 V에 의해 치환됨을 의미한다. 다른 것들도 이러한 방식으로 표기한다.
본 기술분야에서, 성능이 근접하거나 가까운 아미노산으로 치환할 경우, 일반적으로 단백질의 기능을 개변시키지 않는다. C 말단 및/또는 N 말단에 하나 또는 복수 개의 아미노산을 추가해도 일반적으로 단백질의 구조 및 기능을 개변시키지 않는다. 따라서, 본 발명의 TCR은 본 발명의 TCR을 최대 5개, 바람직하게 최대 3개, 더 바람직하게 최대 2개, 가장 바람직하게 1개의 아미노산(특히, CDR 영역 밖에 위치한 아미노산)을 더 포함하고, 성질이 유사하거나 근접한 아미노산에 의해 치환되어도 그 기능적 TCR을 유지할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 TCR로부터 약간 변형된 TCR을 포함한다. 변형된(보통 1 차 구조를 변경하지 않고) 형태는 아세틸화 또는 카르복실화와 같은 본 발명의 TCR의 화학적으로 유도된 형태를 포함한다. 변형은 또한 본 발명의 TCR의 합성 및 가공 또는 추가적인 가공 단계에서 TCR을 생성하기 위해 진행되는 글리코실화 변형과 같은 글리코실화를 포함한다. 이러한 변형은 TCR을 글리코실화를 수행하는 효소(예를 들어, 포유동물 글리코실라제 또는 데글리코실라제)에 노출시킴으로써 달성될 수 있다. 변형된 형태는 또한 인산화된 아미노산 잔기(예를 들어, 포스포티로신, 포스포세린, 포스포트레오닌)를 갖는 서열을 포함한다. 또한 단백질 가수분해에 대한 내성을 개선하거나 용해도를 최적화하기 위해 수정된 TCR을 포함한다.
본 발명의 TCR, TCR 복합체, 또는 본 발명의 TCR로 형질감염된 T 세포는 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 약학 조성물로 제공될 수 있다. 본 발명의 TCR, 다가 TCR 복합체 또는 세포는 일반적으로 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 멸균 약학 조성물의 일부로 제공된다. 상기 약학 조성물은 임의의 적합한 형태(환자에게 필요한 투여 방법에 의해 결정됨)일 수 있다. 일반적으로 밀봉된 용기에 단위 투여 제형으로 제공될 수 있으며, 키트의 일부로 제공될 수 있다. 이러한 키트(필수는 아님)에는 사용 설명서가 포함되어 있다. 복수의 상기 단위 제형을 포함할 수 있다,
또한, 본 발명의 TCR은 단독으로 사용하거나 다른 치료제(예를 들어, 동일한 약학 조성물로 조제함)와 결합 또는 커플링될 수 있다.
약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 용어 "약학적으로 허용 가능한 담체"는 치료제의 투여에 사용되는 담체를 의미한다. 상기 용어는 자체적으로 상기 조성물을 투여받은 대상체에게 유해한 항체의 생성을 유도하지 않고 투여 후 과도한 독성을 갖지 않는 약제학적 담체를 의미한다. 이들 담체는 본 기술분야의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다. 약학적으로 허용 가능한 부형제에 대한 충분한 논의는 Remington 's Pharmaceutical Sciences(Mack Pub. Co., N.J. 1991)에서 찾을 수 있다. 이러한 담체에는 식염수, 완충액, 포도당, 물, 글리세린, 에탄올, 보조제 및 이들의 조합이 포함된다(이에 한정되지 않음).
치료성 조성물의 약학적으로 허용 가능한 담체는 물, 식염수, 글리세린 및 에탄올과 같은 액체를 포함할 수 있다. 이 밖에 이러한 담체에는 습윤제 또는 유화제, pH 완충 물질 등 보조성 물질도 존재할 수 있다.
일반적으로, 치료성 조성물은 액체 용액 또는 현탁액과 같은 주사 가능한 형태로 제조될 수 있고, 또한 주사 전에 용액 또는 현탁액, 액체 담체로 조제되기에 적합한 고체 형태로 제조될 수 있다.
일단 본 발명의 조성물이 조제되면, 이는 안구 내, 근육 내, 정맥 내, 피하, 피내 또는 국소 투여를 포함하는 (그러나 이에 한정되지 않는) 통상적인 경로에 의해 투여될 수 있으며, 바람직하게는 비경구 투여는 피하, 근육 내 또는 정맥 내를 포함한다. 예방 또는 치료할 대상체는 동물, 특히 인간일 수 있다.
본 발명의 약학 조성물을 실제 치료에 사용하는 경우, 사용 상황에 따라 다양한 제형의 약학 조성물을 사용할 수 있다. 바람직하게는 주사제, 경구제 등이 예시될 수 있다.
이들 약학 조성물은 통상적인 방법에 따라 혼합, 희석 또는 용해시켜 조제될 수 있으며, 때때로 부형제, 붕해제, 결합제, 윤활제, 희석제, 완충제, 등장화제(isotonicities), 방부제, 습윤제, 유화제, 분산제, 안정제 및 공용매와 같은 적합한 약물 첨가제를 첨가하고, 상기 조제 과정은 제형에 따라 통상적인 방식으로 수행될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 또한 서방성 제형의 형태로 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 TCR은 서방성 중합체를 담체로 하여 알약 또는 마이크로 캡슐에 혼입된 후, 상기 알약 또는 마이크로 캡슐을 치료하고자 하는 조직에 외과적으로 이식할 수 있다. 서방형 중합체의 예로서, 에틸렌-비닐아세테이트 공중합체, 폴리히드로메타아크릴레이트(polyhydrometaacrylate), 폴리아크릴아미드, 폴리비닐피롤리돈, 메틸셀룰로오스, 젖산 중합체, 젖산-글리콜산 공중합체 등일 수 있고, 바람직하게는 젖산 중합체 및 젖산-글리콜산 공중합체와 같은 생분해성 중합체로 예시될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물을 실제 치료에 사용하는 경우, 유효 성분으로 본 발명의 TCR 또는 TCR 복합체 또는 본 발명의 TCR을 제시하는 세포는 치료할 각 환자의 체중, 연령, 성별 및 증상 정도에 따라 합리적으로 결정될 수 있고, 의사가 최종적으로 합리적인 복용량을 결정한다.
본 발명의 주요 장점은 하기와 같다.
(1) 상기 FMNKFIYEI-HLA-A2 복합체에 대한 본 발명의 TCR의 친화력 및/또는 결합 반감기는 야생형 TCR의 적어도 2배이고, 바람직하게, 적어도 10배이다.
(2) 상기 FMNKFIYEI-HLA-A2 복합체에 대한 본 발명의 TCR의 친화력 및/또는 결합 반감기는 야생형 TCR의 적어도 100배이고, 바람직하게, 적어도 1000배이며, 더 바람직하게, 104-107배일 수 있다.
(3) 본 발명의 고친화력 TCR을 형질도입하는 효과기 세포는 표적 세포에 대해 아주 강한 살해 작용을 가진다.
아래, 구체적인 실시예와 결부시켜 본 발명을 더 설명한다. 이러한 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위를 한정하지 않음을 이해해야 한다. 하기 실시예에서 구체적인 조건을 주명하지 않은 실험 방법은 일반적으로 (Sambrook 및 Russell 등, 분자 클로닝 실험 지침서(Molecular Cloning-A Laboratory Manual)(제3 판) (2001)CSHL 출판사)에 기재된 조건과 같은 통상적인 조건, 또는 제조업체에서 권장하는 조건을 따를 수 있다. 달리 설명되지 않은 한, 백분율 및 부수는 중량에 따라 계산된다.
재료 및 방법
본 발명의 실시예에서 사용되는 실험 재료는 특별한 설명이 없는 한 모두 시판 경로를 통해 얻을 수 있고, 여기서, 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli, E.coli) DH5α는 Tiangen에서 구매하였으며, E.coli BL21(DE3)은 Tiangen에서 구매하였고, E.coli Tuner(DE3)는 Novagen에서 구매하였으며, 플라스미드 pET28a는 Novagen에서 구매하였다.
실시예 1. 소수성 코어가 돌연변이된 안정성 단일 쇄 TCR 주형 쇄의 생성
본 발명은 부위 결정 돌연변이 방법을 이용하여 특허 문헌 WO2014/206304에 기재된 방법으로 하나의 플렉서블 짧은 펩티드 서열(linker)로 TCR α와 β 쇄 가변 영역을 연결하여 구성된 안정성 단일 쇄 TCR 분자를 구축하였는 바, 이의 아미노산 및 DNA 서열은 각각 서열번호 47 및 서열번호 48로, 도 7a 및 도 7b에 도시된 바와 같다. 상기 단일 쇄 TCR 분자를 주형으로 하여 고친화력 TCR 분자를 선별하였다. 상기 주형 쇄의 α 가변 영역(서열번호 3) 및 β 가변 영역(서열번호 4)의 아미노산 서열은 도 2a 및 2b에 도시된 바와 같고; 이에 대응되는 DNA 서열은 각각 서열번호 5 및 6으로, 도 3a 및 3b에 도시된 바와 같고; 플렉서블 짧은 펩티드 서열(linker)의 아미노산 서열 및 DNA 서열은 각각 서열번호 7 및 8로, 도 4a 및 4b에 도시된 바와 같다.
주형 쇄를 지닌 표적 유전자를 NcoI 및 NotI로 이중 효소 절단한 후, NcoI 및 NotI로 이중 효소 절단한 pET28a 벡터에 연결하였다. 연결 산물을 E.coli DH5α로 형질전환하고, 카나마이신이 포함된 LB 플레이트에 코팅하고, 37 ℃에서 거꾸로 놓고 하룻밤 배양하고, PCR 선별을 위해 양성 클론을 선택하고, 양성 재조합을 시퀀싱하고, 서열이 정확한 것으로 결정되면 발현을 위해 재조합 플라스미드를 추출하여 E.coli BL21(DE3)로 형질전환한다.
실시예 2. 실시예 1에서 구축한 안정성 단일 쇄 TCR의 발현, 리폴딩 및 정제
실시예 1에서 제조한, 재조합 플라스미드 pET28a-주형 쇄가 포함된 BL21(DE 3) 콜로니를 카나마이신이 포함된 LB 배지에 접종하고, 37 ℃에서 0.6-0.8의 OD600까지 배양하고, IPTG를 최종 농도가 0.5 mM이 되도록 넣었다. 37 ℃에서 4 시간 동안 계속하여 배양하였다. 5000 rpm에서 15 분 동안 원심분리하여 세포 침전물을 얻고, Bugbuster Master Mix(Merck)로 세포 침전물을 용해하고, 6000 rpm에서 15 분 동안 원심분리하여 봉입체를 회수한 다음 Bugbuster(Merck)로 세척하여 세포 조각 및 막 성분을 제거하고, 6000 rpm에서 15 분 동안 원심분리하여 봉입체를 수집하였다. 봉입체를 완충액(pH 8.0인 20 mM의 Tris-HCl, 8 M의 요소)에 용해시키고, 고속으로 원심분리하여 불용성 물질을 제거하고, 상청액을 BCA 방법으로 정량화한 다음 분리 포장하여 -80 ℃에서 보관하여 나중에 사용하였다.
5 mg의 용해된 단일 쇄 TCR 봉입체 단백질에 2.5 mL의 완충액(6 M의 Gua-HCl, pH 8.1인 50 mM의 Tris-HCl, 100 mM의 NaCl, 10 mM의 EDTA)을 넣은 다음 DTT를 최종 농도가 10 mM이 되도록 넣고, 37 ℃에서 30 분 동안 처리하였다. 주사기를 사용하여 125 mL의 리폴딩 완충액(pH 8.1인 100 mM의 Tris-HCl, 0.4 M의 L-아르기닌, 5 M의 요소, 2 mM의 EDTA,6.5 mM의 β-메르캅토에틸아민(β-mercapthoethylamine), 1.87 mM의 시스타민(Cystamine))에 상기 처리된 단일 쇄 TCR을 적가하고, 4 ℃에서 10분 동안 교반한 다음, 리폴딩액을 컷오프량이 4 kDa인 셀룰로오스 막 투석 백에 넣고, 투석 백을 1 L의 사전 냉각된 물에 넣어 4 ℃에서 천천히 하룻밤 교반하였다. 17시간 후, 투석액을 1 L의 사전 냉각된 완충액(pH 8.0인 20 mM의 Tris-HCl)으로 교체하고, 4 ℃에서 계속하여 8시간 동안 투석한 다음, 투석액을 동일한 신선한 완충액으로 교체하여 계속하여 하룻밤 투석하였다. 17시간 후, 샘플을 0.45 μm의 여과막으로 여과하고, 진공 탈기한 후 음이온 교환 칼럼(HiTrap Q HP, GE Healthcare)을 통과시키며, pH 8.0인 20 mM의 Tris-HCl로 조제된 0-1 M의 NaCl 선형 구배 용출액으로 단백질을 정제하고, 수집된 용출 성분을 SDS-PAGE로 분석하고, 단일 쇄 TCR을 포함한 성분을 농축한 후 겔 여과 컬럼(Superdex 75 10/300, GE Healthcare)으로 추가적으로 정제하고, 목표 성분도 SDS-PAGE로 분석하였다.
BIAcore 분석에 사용된 용출 성분은 겔 여과법으로 순도에 대해 추가적으로 시험하였다. 조건은 다음과 같은 바, 크로마토그래피 컬럼 Agilent Bio SEC-3(300A, φ7.8Х300 mm)을 사용하고, 이동상은 150 mM의 인산염 완충액이며, 유속은 0.5 mL/min이고, 컬럼 온도는 25 ℃이며, UV 검출 파장은 214 nm이다.
실시예 3. 결합 표징
BIAcore 분석
BIAcore T200 실시간 분석 시스템으로 TCR 분자와 FMNKFIYEI-HLA-A0201 복합체의 결합 활성을 검출하였다. 항-스트렙트아비딘 항체(GenScript)를 커플링 완충액(10 mM의 아세트산 나트륨 완충액, pH 4.77)에 넣은 다음, 항체를 사전에 EDC 및 NHS로 활성화된 CM5 칩에 흐르게 하여 항체를 칩 표면에 고정시킨 다음, 에탄올아민의 염산 용액으로 반응되지 않은 활성화 표면을 차단하여 커플링 과정을 완성하고, 커플링 수준은 약 15000 RU이다. 조건은 온도가 25 ℃이고 pH 값이 7.1-7.5인 것이다.
저농도의 스트렙트아비딘을 항체에 의해 피복된 칩 표면에 흐르게 한 다음, FMNKFIYEI-HLA-A0201 복합체를 검출 통로에 흐르게 하고, 다른 통로는 참조 통로로 사용하고, 0.05 mM의 비오틴을 10 μL/min의 유혹으로 2분 동안 칩에 흐르게 하고, 스트렙트아비딘이 남아있는 결합 부위를 차단하였다. 단일 순환 동력학 분석 방법으로 이의 친화력을 측정하고, HEPES-EP 완충액(10 mM의 HEPES, 150 mM의 NaCl, 3 mM의 EDTA,0.005 % P20, pH 7.4)으로 TCR을 몇 개의 상이한 농도로 희석하고, 30 μL/min의 유속으로 칩 표면을 순차적으로 흐르게 하되, 매 번 샘플의 결합 시간은 120 s이고, 마지막 샘플링이 종료된 후 이가 600초 동안 해리되도록 한다. 매 번 측정이 종료된 후 pH 1.75인 10 mM의 Gly-HCl로 칩을 재생시켰다. BIAcore Evaluation 소프트웨어를 이용하여 동력학 파라미터를 계산하였다.
상기 FMNKFIYEI-HLA-A0201 복합체의 제조 과정은 하기와 같다.
a. 정제
중쇄 또는 경쇄의 발현을 유도하는 100 ml의 E.coli 균액을 수집하여, 4 ℃, 8000 g에서 10분 동안 원심분리한 후 10 ml의 PBS로 균체를 한 번 세척한 후, 5 ml의 BugBuster Master Mix Extraction Reagents(Merck)로 강렬하게 진탕하여 균체를 재부유시키고, 실온에서 20분 동안 회전 배양한 후, 4 ℃, 6000 g에서 15분 동안 원심분리하고, 상청액을 제거하고, 봉입체를 수집하였다.
상기 봉입체를 5 ml의 BugBuster Master Mix에 재부유하고, 실온에서 5분 동안 회전 배양하고; 10배로 희석한 30 ml의 BugBuster를 넣고, 균일하게 혼합하고, 4 ℃, 6000 g에서 15분 동안 원심분리하고; 상청액을 제거하고, 10배로 희석한 30 ml의 BugBuster를 넣고 봉입체를 재부유시키고, 균일하게 혼합하고, 4 ℃, 6000 g에서 15분 동안 원심분리하되, 두 번 반복하고, pH 8.0인 30 ml의 20 mM의 Tris-HCl을 넣고 봉입체를 재부유시키며, 균일하게 혼합하고, 4 ℃, 6000 g에서 15분 동안 원심분리하고, 마지막으로 20 mM의 Tris-HCl, 8 M의 요소로 봉입체를 용해시키고, SDS-PAGE로 봉입체의 순도를 검출하고, BCA 키트로 농도를 측정하였다.
b. 리폴딩
합성된 짧은 펩티드 FMNKFIYEI(Beijing SBS Genetech Co.,Ltd.)를 DMSO에 농도가 20 mg/ml가 되도록 용해시켰다. 경쇄 및 중쇄의 봉입체를 8 M의 요소, pH 8.0인 20 mM의 Tris, 10 mM의 DTT로 용해시키고, 리폴딩 전에 3 M의 구아니딘 염산, 10 mM의 아세트산 나트륨, 10 mM EDTA를 넣고 추가적으로 변성시켰다. 25 mg/L(최종 농도)의 FMNKFIYEI 펩티드를 리폴딩 완충액(0.4 M의 L-아르기닌, pH 8.3인 100 mM의 Tris, 2 mM의 EDTA, 0.5 mM의 산화성 글루타티온, 5 mM의 환원성 글루타티온, 0.2 mM의 PMSF, 4 ℃까지 냉각시킴)에 넣은 다음, 20 mg/의 경쇄 및 90 mg/L의 중쇄(최종 농도, 중쇄는 3번 나누어 넣되, 8시간/번 넣음)를 순차적으로 넣고, 4 ℃에서 적어도 3일 동안 리폴딩하여 완성하고, SDS-PAGE로 리폴딩의 성공 여부를 검출하였다.
c. 리폴딩 후 정제
10부피의 pH 8.0인 투석용 20 mM의 Tris를 사용하여 리폴딩 완충액을 교체하고 완충액을 적어도 두 번 교체하여 용액의 이온 강도를 충분히 감소시킨다. 투석 후 단백질 용액을 0.45 μm의 셀룰로오스 아세테이트 여과막으로 여과한 다음, HiTrap Q HP(GE 제너럴 일렉트릭사) 음이온 교환 컬럼(5 ml의 베드 부피)에 로딩하였다. Akta 정제기(GE 제너럴 일렉트릭사)를 사용하여, pH 8.0인 20 Mm의 Tris로 조제한 0-400 mM의 NaCl 선형 구배액으로 단백질을 용출하고, pMHC는 약 250 mM의 NaCl에서 용출하고, 피크 성분을 수집하고, SDS-PAGE로 순도를 검출하였다.
d. 비오틴화
정제된 pMHC 분자를 Millipore 한외 여과 튜브로 농축하는 동시에 완충액을 pH 8.0인 20 mM의 Tris로 교체한 다음, 비오틴화 시약 pH 8.3인 0.05 M의 비신(Bicine), 10 mM의 ATP, 10 mM의 MgOAc, 50 μM의D-비오틴(D-Biotin), 100 μg/ml의 BirA 효소(GST-BirA)를 넣고, 혼합물을 실온에서 하룻밤 배양하고, SDS-PAGE로 비오틴화 완료 여부를 검출하였다.
e. 정제 및 비오틴화된 복합체
Millipore 한외 여과 튜브를 사용하여 비오틴화 마킹된 pMHC 분자를 1 ml로 농축하고 겔 여과 크로마토그래피를 이용하고 Akta 정제기(GE 제너럴 일렉트릭사)를 사용하여 비오틴화된 pMHC를 정제하고, 여과된 PBS 사전 균형 HiPrepTM 16/60 S200 HR 컬럼(GE 제너럴 일렉트릭사)으로 1 ml의 농축된 비오틴화된 pMHC 분자를 로딩한 후, 1 ml/min의 유속으로 PBS로 용출시켰다. 비오틴화된 pMHC 분자는 약 55 ml에서 단일 피크로 용출되었다. 단백질 함유 성분을 합하고 Millipore 한외 여과 튜브로 농축하고, 단백질 농도를 BCA 방법(Thermo)으로 측정하고, 프로테아제 억제제 칵테일(cocktail, Roche)을 넣어 비오틴화된 pMHC 분자를 -80 ℃에서 분리 포장하여 보관하였다.
실시예 4. 고친화력 단일 쇄 TCR의 생성
파지 디스플레이 기술은 고친화력 변이체를 선별하기 위해 TCR 고친화력 변이체 라이브러리를 생성하는 수단이다. Li 등((2005)Nature Biotech 23(3):349-354)에서 설명된 TCR 파지 디스플레이 및 선별 방법을 실시예 1에서의 단일 쇄 TCR 주형에 적용하였다. 상기 주형 쇄의 CDR 영역을 돌연변이시켜 고친화력 TCR의 라이브러리를 구축하여 패닝하였다. 몇 차례의 패닝을 거친 후 파지 라이브러리와 대응되는 항원은 특이적으로 결합하고, 여기서 단일 클론을 선택하여 서열 분석을 진행한다.
실시예 3에서의 BIAcore 방법으로 TCR 분자와 FMNKFIYEI-HLA-A0201 복합체의 상호 작용을 분석하고, 친화력 및/또는 결합 반감기가 야생형 TCR의 적어도 2배인 고친화력 TCR을 선별하고, 선별된 고친화력 TCR이 FMNKFIYEI-HLA-A0201 복합체에 결합하는 해리 평형 상수 KD는 야생형 TCR이 FMNKFIYEI-HLA-A0201 복합체에 결합하는 해리 평형 상수 KD의 절반인 바, 결과는 아래 표 3과 같다. 상기 방법을 이용하여 가용성 참조 TCR과 FMNKFIYEI-HLA-A0201 복합체의 상호 작용의 KD값이 43 μM인 것으로 검출였고, 그 상호 작용 곡선은 도 12에 도시된 바와 같고, 즉 야생형 TCR과 FMNKFIYEI-HLA-A0201 복합체의 상호 작용의 KD 값도 43 μM, 즉 4.3E-05M이다.
구체적으로, 서열번호 1로 표시되는 번호를 사용한 고친화력 TCR 돌연변이체의 α 쇄 가변 영역은 28S, 29I, 30N, 31N, 94R, 95T, 96G, 97A, 98N 및 99S 중 하나 또는 복수 개의 부위의 아미노산에서 돌연변이되거나, 서열번호 2로 표시되는 번호를 사용한 고친화력 고친화력 TCR 돌연변이체는 27S, 28E, 29H, 30N, 50Q, 51N, 52E, 53A 및 54Q 중 하나 또는 복수 개의 부위의 아미노산에서 돌연변이되었다.
보다 구체적으로, 서열번호 1로 표시되는 번호를 사용한 고친화력 TCR의 α 쇄 가변 영역은 28D 또는 28P 또는 28A 또는 28E, 29V, 30S 또는 30Y 또는 30D, 31S 또는 31K, 94A 또는 94S 또는 94V 또는 94D 또는 94E 또는 94Q 또는 94T, 95M 또는 95R 또는 95L 또는 95A 또는 95N 또는 95S, 96A 또는 96Q 또는 96S 또는 96E 또는 96N, 97S 또는 97G 또는 97P 또는 97W, 98S 또는 98T, 99A 또는 99N 또는 99T 또는 99P로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 복수 개의 아미노산 잔기를 포함하고/거나; 서열번호 2로 표시되는 번호를 사용한 고친화력 TCR의 β 쇄 가변 영역은 27A 또는 27Q 또는 27G, 28G 또는 28T 또는 28R 또는 28L, 29W 또는 29R, 30A 또는 30P, 50H, 51G, 52D, 53M 또는 53L, 54E로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 복수 개의 아미노산 잔기를 포함한다.
고친화력 단일 쇄 TCR의 α 쇄 가변 영역(서열번호 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 및 35) 및 β 쇄 가변 영역(서열번호 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45 및 46)의 구체적인 아미노산 서열은 각각 도 5(1) 내지 5(27) 및 도 6(1) 내지 6(11)에 도시된 바와 같다.
단일 쇄 TCR 번호 단일 쇄 TCR가변 영역(서열번호)
α β		 KD(M)
s-1 12 4 2.53E-08
s-2 10 4 2.11E-05
s-3 9 4 8.87E-08
s-4 11 4 2.04E-06
s-5 13 4 5.46E-06
s-6 14 4 1.90E-07
s-7 15 4 1.01E-06
s-8 16 4 4.11E-08
s-9 17 4 2.57E-07
s-10 18 4 1.56E-06
s-11 19 4 2.96E-08
s-12 20 4 8.60E-09
s-13 21 4 5.72E-08
s-14 3 36 2.26E-06
s-15 22 37 2.01E-09
s-16 23 38 3.14E-09
s-17 24 39 3.88E-09
s-18 25 39 2.82E-09
s-19 26 39 2.35E-09
s-20 26 38 1.91E-09
s-21 27 37 1.75E-09
s-22 28 40 1.44E-09
s-23 29 37 1.59E-09
s-24 29 41 3.65E-09
s-25 30 42 2.43E-09
s-26 31 41 2.72E-09
s-27 32 43 2.33E-09
s-28 26 44 1.95E-09
s-29 33 40 2.07E-09
s-30 24 42 3.46E-09
s-31 26 37 1.91E-09
s-32 30 45 3.51E-09
s-33 34 37 2.47E-09
s-34 30 39 2.40E-09
s-35 32 46 2.12E-09
s-36 35 42 3.40E-09
실시예 5. 고친화력 αβ 이종 이량체 TCR의 생성
실시예 4에서 선별한 고친화력 단일 쇄 TCR의 CDR 영역 돌연변이를 αβ 이종 이량체 TCR의 가변 영역의 대응되는 부위에 도입하고, BIAcore를 통해 이와 FMNKFIYEI-HLA-A0201 복합체의 친화력을 검출하였다. 상기 CDR 영역 고친화력 돌연변이점의 도입은 본 기술분야의 통상의 기술자가 잘 알고 있는 부위 결정 돌연변이 방법을 사용하였다. 상기 야생형 TCR의 α 쇄 및 β 쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 각각 도 1a(서열번호 1) 및 1b(서열번호 2)에 도시된 바와 같다.
TCR과 FMNKFIYEI-HLA A0201 복합체 사이의 결합 친화력 및/또는 결합 반감기를 편리하게 평가하도록 보다 안정적인 가용성 TCR을 얻기 위해, αβ 이종 이량체 TCR은 α 및 β 쇄의 불변 영역에 각각 하나의 시스테인 잔기를 도입하여 인공 쇄 간 이황화 결합을 형성한 TCR일 수 있음에 유의해야 하고, 본 실시예에서 시스테인 잔기를 도입한 후 TCR α와 β 쇄의 아미노산 서열은 각각 도 8a(서열번호 49) 및 8b(서열번호 50)에 도시된 바와 같고, 도입된 시스테인 잔기는 볼드체 문자로 표시한다.
"분자 클로닝 실험 지침서”(Molecular Cloning a Laboratory Manual)(제3 판, Sambrook 및 Russell)에서 설명된 표준 방법을 통해 발현될 TCR α 및 β 쇄의 세포외 서열 유전자를 합성한 후 각각 발현 벡터 pET28a+(Novagene)에 삽입하고, 업스트림 및 다운스트림의 클론 부위는 각각 NcoI 및 NotI이다. CDR 영역의 돌연변이는 본 기술분야의 통상의 기술자가 잘 알고 있는 중첩PCR(overlap PCR)을 통해 도입하였다. 단편 삽입은 시퀀싱을 통해 확인하였다.
실시예 6. αβ 이종 이량체 TCR의 발현, 리폴딩 및 정제
TCR α 쇄와 β 쇄의 발현 벡터는 각각 화학적 형질전환법을 통해 발현 세균 BL21(DE3)로 형질전환되었고, 세균을 LB 배양액으로 성장시키며, OD600 = 0.6에서 최종 농도가 0.5 mM인 IPTG로 유도하고, TCR의 α 및 β 쇄 발현 후 형성된 봉입체를 BugBuster Mix(Novagene)로 추출하고, BugBuster 용액으로 여러 번 반복 세척하고, 봉입체를 최종적으로 6 M의 구아니딘 염산, 10 mM의 디티오트레이톨(DTT), 10 mM의 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 20 mM의 Tris(pH 8.1)에 용해시켰다.
용해된 TCR α 및 β 쇄를 1:1의 질량비로 5 M의 요소, 0.4 의 아르기닌, 20 mM의 Tris(pH 8.1), 3.7 mM의 시스타민(cystamine), 6.6 mM의 β-메르캅토에틸아민(β-mercapoethylamine)(4 ℃)에 신속하게 혼합하고, 최종 농도는 60 mg/mL이다. 혼합 후 용액을 10배 부피의 탈이온수에 넣고 투석(4 ℃)하고, 12시간 후, 탈이온수를 완충액(20 mM의 Tris, pH 8.0)으로 교체하여 계속하여 4 ℃에서 12시간 동안 투석하였다. 투석이 끝난 후의 용액을 0.45 μM의 여과막으로 여과한 후, 음이온 교환 칼럼(HiTrap Q HP, 5 ml, GE Healthcare)을 통해 정제하였다. 용출 피크에 리폴딩이 성공한 α 및 β 이량체가 함유된 TCR은 SDS-PAGE 겔로 확인하였다. 그 후, TCR은 겔 여과 크로마토그래피(HiPrep 16/60, Sephacryl S-100 HR, GE Healthcare)를 통해 추가적으로 정제하였다. 정제된 TCR의 순도를 SDS-PAGE로 측정한 결과 90 %이고, 농도는 BCA 방법으로 결정하였다.
실시예 7. BIAcore 분석 결과
실시예 3에 따른 방법으로, 고친화력 CDR 영역을 도입한 αβ 이종 이량체 TCR과 FMNKFIYEI-HLA-A0201 복합체의 친화력을 검출하였다.
고친화력 단일 쇄 TCR α와 β 쇄에서 선별한 CDR 영역을 각각 야생형 TCR α 쇄 가변 영역의 서열번호 1 및 β 쇄 가변 영역의 서열번호 2의 대응되는 위치에 전이시켜 αβ 이종 이량체 TCR을 형성하고; 이 밖에, 선별된 CDR 영역의 돌연변이 부위를 인공적으로 조합하여 αβ 이종 이량체 TCR을 형성하고, 얻은 새로운 TCR α 및 β 쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 각각 도 9(1) 내지 9(29) 및 도 10(1) 내지 10(20)에 도시된 바와 같다. TCR 분자의 CDR 영역이 이와 대응되는 pMHC 복합체의 친화력을 결정하므로, 본 기술분야의 통상의 기술자는 고친화력 돌연변이점을 도입한 αβ 이종 이량체 TCR도 FMNKFIYEI-HLA-A0201 복합체에 대해 고친화력을 가짐을 예측할 수 있다. 실시예 5에 따른 방법을 이용하여 발현 벡터를 구축하고, 실시예 6에 따른 방법을 이용하여 고친화력 돌연변이가 도입된 상기 αβ 이종 이량체 TCR에 대해 발현, 리폴딩 및 정제를 진행한 다음, BIAcore T200을 이용하여 이와 FMNKFIYEI-HLA-A0201 복합체의 친화력을 측정하였으며, 그 결과는 아래 표 4와 같다.
TCR 번호 α 쇄 가변 영역의 서열
서열번호 		β 쇄 가변 영역의 서열
서열번호 		KD(M)
1 54 2 6.3E-07
2 52 2 1.6E-06
3 51 2 6.2E-07
4 53 2 3.5E-07
5 55 2 1.4E-06
6 56 2 9.04E-07
7 57 2 4.65E-07
8 58 2 1.41E-06
9 59 2 2.34E-07
10 60 2 3.99E-07
11 61 2 7.87E-07
12 62 2 5.39E-07
13 63 2 9.99E-07
14 1 78 2.96E-06
15 64 79 1.66E-10
16 65 80 1.61E-10
17 66 81 1.67E-10
18 67 81 1.18E-10
19 68 81 1.70E-10
20 68 80 1.38E-10
21 69 79 8.22E-11
22 70 82 8.67E-11
23 71 79 7.26E-11
24 71 83 7.89E-11
25 72 84 7.46E-11
26 73 83 8.98E-11
27 74 85 1.50E-10
28 68 86 7.67E-11
29 75 82 8.54E-11
30 66 84 9.74E-11
31 68 79 7.45E-11
32 72 87 4.99E-11
33 76 79 3.42E-11
34 72 81 4.47E-11
35 74 88 1.31E-09
36 77 84 1.68E-10
37 1 93 1.90E-05
38 1 94 5.50E-06
39 1 95 3.30E-07
40 1 96 1.10E-05
41 1 97 1.40E-05
42 1 98 1.20E-05
43 1 99 1.6E-06
44 1 100 2.3E-06
45 91 101 6.20E-11
46 92 101 1.70E-10
표 4로부터 알 수 있는 바, CDR 영역 돌연변이점이 도입된 αβ 이종 이량체 TCR은 FMNKFIYEI-HLA-A0201 복합체에 대한 고친화력을 유지하였다. 상기 이종 이량체 TCR의 친화력은 FMNKFIYEI-HLA-A0201 복합체에 대한 야생형 TCR의 친화력의 적어도 2배이다.
실시예 8. 항-CD3 항체와 고친화력 단일 쇄 TCR의 융합체의 발현, 리폴딩 및 정제
본 발명의 고친화력 단일 쇄 TCR 분자와 항-CD3 항체의 단일 쇄 분자(scFv)를 융합하여 융합 분자를 구축하였다. 중첩(overlap) PCR 방법을 통해 프라이머를 설계하고, 항-CD3 항체 및 고친화력 단일 쇄 TCR 분자의 유전자를 연결하고, 중간의 짧은 링커(linker)를 GGGGS로 설계하고, 융합 분자의 유전자 단편에 제한 엔도뉴클레아제 부위 NcoⅠ 및 NotⅠ를 가지도록 하였다. PCR 증폭 산물을 NcoⅠ 및 NotⅠ로 이중 효소 절단하고, NcoⅠ 및 NotⅠ로 이중 효소 절단된 pET28a 벡터에 연결하였다. 연결 산물을 E.coli DH5α 컴피턴트 세포에 형질전환하고, 카나마이신이 포함된 LB 플레이트에 코팅하고, 37 ℃에서 거꾸로 놓고 하룻밤 배양하고, PCR 선별을 위해 양성 클론을 선택하고, 양성 재조합을 시퀀싱하고, 서열이 정확한 것으로 결정되면 발현을 위해 재조합 플라스미드를 추출하여 E.coli BL21(DE3) 컴피턴트 세포에 형질전환한다.
융합 단백질의 발현
표적 유전자가 함유된 발현 플라스미드를 대장균 균주 BL21(DE3)에 형질전환하고, LB 플레이트(50 μg/ml의 카나마이신)에 코팅하여 37 ℃에서 하룻밤 배양하였다. 다음날, 클론을 선택하여 10 ml의 LB 액체 배지(50 μg/ml의 카나마이신)에 접종하여 2-3시간 동안 배양하고, 1:100의 부피 비율로 1 L의 LB 배지(50 μg/ml의 카나마이신)에 접종하여 OD600가 0.5-0.8이 되도록 계속하여 배양한 다음, 최종 농도가 0.5 mM인 IPTG로 표적 단백질의 발현을 유도하였다. 4시간 동안 유도한 후, 6000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 세포를 얻었다. PBS 완충액으로 균체를 한 번 세척하고, 균체를 분리 포장하고, 200 ml의 세균 배양물에 상당한 균체를 5 ml의 BugBuster Master Mix(Novagen)로 세균을 용해시키며, 6000 g에서 15분 동안 원심분리하여 봉입체를 수집하였다. 다음, 세척제로 4번 세척하여 세포 조각 및 막 성분을 제거하였다. 그 다음, PBS와 같은 완충액으로 봉입체를 세척하여 세척제 및 염을 제거하였다. 마지막으로, 봉입체를 8 M의 요소가 함유된 Tris 완충 용액으로 용해시키고, 봉입체의 농도를 측정하고, 분리 포장하여 -80 ℃에서 냉동 보관하였다.
융합 단백질의 재폴딩
-80 ℃의 초저온 냉장고에서 약 10 mg의 봉입체를 꺼내 해동하고, 디티오트레이톨(DTT)을 최종 농도가 10 mM이 되도록 넣으며, 37 ℃에서 30분 내지 1시간 동안 배양하여 이황화 결합이 완전히 열리도록 확보하였다. 다음, 봉입체 샘플 용액을 각각 4 ℃에서 사전 냉각된 200 ml의 재폴딩 완충액(pH 8.1인 100 mM의 Tris, 400 mM의 L-아르기닌, 2 mM의 EDTA, 5 M의 요소, 6.5 mM의 β-메르캅토에틸아민, 1.87 mM의 시스타민)에 적가하고, 4 ℃에서 약 30분 동안 천천히 교반하였다. 8배 부피로 사전 냉각된 H2O로 리폴딩 용액을 16-20시간 동안 투석하였다. 다음, 8배 부피의 pH 8.0인 10 mM의 Tris로 2번 투석하고, 4 ℃에서 계속하여 약 8시간 투석하고, 투석 후 샘플을 여과한 후 정제하였다.
융합 단백질의 첫 번째 정제 단계
투석된 재폴딩물(pH 8.0인 10 mM의 Tris)을 POROS HQ/20 음이온 교환 크로마토그래피 프리팩 칼럼(Applied Biosystems)에 통과시키고, AKTA 정제기(GE Healthcare)에서 0-600 mM의 NaCl을 사용하여 구배 용출하였다. 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색한 SDS-PAGE를 통해 각 성분을 분석한 다음 합하였다.
융합 단백질의 두 번째 정제 단계
첫 번째 정제 단계에서 합한 샘플 용액을 농축하여 이번 정제 단계에 제공하고, PBS 완충액에서 사전 균형된 Superdex 75 10/300 GL 겔 여과 크로마토그래피프리팩 칼럼(GE Healthcare)을 이용하여 융합 단백질을 정제하고, 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색한 SDS-PAGE를 통해 피크의 성분을 분석한 다음 합하였다.
실시예 9. 항-CD3 항체와 고친화력 αβ 이종 이량체 TC의 융합체의 발현, 리폴딩 및 정제
항-CD3의 단일 쇄 항체(scFv)와 αβ 이종 이량체 TCR을 융합하여 융합 분자를 제조하였다. 항-CD3의 scFv와 TCR의 β 쇄를 융합하되, 상기 TCR β 쇄는 임의의 상기 고친화력 αβ 이종 이량체 TCR의 β 쇄 가변 영역을 포함할 수 있으며, 융합 분자의 TCR α 쇄는 임의의 상기 고친화력 αβ 이종 이량체 TCR의 α 쇄 가변 영역을 포함할 수 있다.
융합 분자 발현 벡터의 구축
1. α 쇄 발현 벡터의 구축
αβ 이종 이량체 TCR의 α 쇄를 지닌 표적 유전자를 NcoⅠ 및 NotⅠ로 이중 효소 절단하고, NcoⅠ 및 NotⅠ로 이중 효소 절단된 pET28a 벡터에 연결하였다. 연결 산물을 E.coli DH5α로 형질전환하고, 카나마이신이 포함된 LB 플레이트에 코팅하고, 37 ℃에서 거꾸로 놓고 하룻밤 배양하고, PCR 선별을 위해 양성 클론을 선택하고, 양성 재조합을 시퀀싱하고, 서열이 정확한 것으로 결정되면 발현을 위해 재조합 플라스미드를 추출하여 E.coli Tuner(DE3)로 형질전환한다.
2. 항-CD3(scFv)-β 쇄 발현 벡터의 구축
중첩(overlap) PCR 방법을 통해 프라이머를 설계하고, 항-CD3 scFv 및 고친화력 이종 이량체 TCR β 쇄 유전자를 연결하고, 중간의 짧은 링커(linker)를 GGGGS로 설계하고, 항-CD3의 scFv와 고친화력 이종 이량체 TCR β 쇄의 융합 단백질의 유전자 단편에 제한 엔도뉴클레아제 부위 NcoⅠ(CCATGG) 및 NotⅠ(GCGGCCGC)을 가지도록 하였다. PCR 증폭 산물을 NcoⅠ 및 NotⅠ로 이중 효소 절단하고, NcoⅠ 및 NotⅠ로 이중 효소 절단된 pET28a 벡터에 연결하였다. 연결 산물을 E.coli DH5α 컴피턴트 세포에 형질전환하고, 카나마이신이 포함된 LB 플레이트에 코팅하고, 37 ℃에서 거꾸로 놓고 하룻밤 배양하고, PCR 선별을 위해 양성 클론을 선택하고, 양성 재조합을 시퀀싱하고, 서열이 정확한 것으로 결정되면 발현을 위해 재조합 플라스미드를 추출하여 E.coli Tuner(DE3) 컴피턴트 세포에 형질전환한다.
융합 단백의 발현, 리폴딩 및 정제
발현 플라스미드를 E.coli Tuner(DE3) 컴피턴트 세포에 형질전환하고, LB 플레이트(50 μg/ml의 카나마이신)에 코팅하여 37 ℃에서 하룻밤 배양하였다. 다음날, 클론을 선택하여 10 ml의 LB 액체 배지(50 μg/ml의 카나마이신)에 접종하여 2-3시간 동안 배양하고, 1:100의 부피 비율로 1 L의 LB 배지에 접종하여 OD600가 0.5-0.8이 되도록 계속하여 배양하고, 최종 농도가 1 mM인 IPTG로 표적 단백질의 발현을 유도하였다. 4시간 동안 유도한 후, 6000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 세포를 얻었다. PBS 완충액으로 균체를 한 번 세척하고, 균체를 분리 포장하고, 200 mL의 세균 배양물에 상당한 균체를 5 mL의 BugBuster Master Mix(Merck)로 세균을 용해시키며, 6000 g에서 15분 동안 원심분리하여 봉입체를 수집하였다. 다음, 세척제로 4번 세척하여 세포 조각 및 막 성분을 제거하였다. 그 다음, PBS와 같은 완충액으로 봉입체를 세척하여 세척제 및 염을 제거하였다. 마지막으로, 봉입체를 6 M의 구아니딘 염산, 10 mM의 디티오트레이톨(DTT), 10 mM의 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), pH 8.1인 20 mM의 Tris가 함유된 완충 용액으로 용해시키고, 봉입체의 농도를 측정하고, 분리 포장하여 -80 ℃에서 냉동 보관하였다.
용해된 TCR α 쇄 및 항-CD3(scFv)-β 쇄를 2:5의 질량비로 5 M의 요소(urea), 0.4 M의 L-아르기닌(L-arginine), pH 8.1인 20 mM의 Tris, 3.7 mM의 시스타민, 6.6 mM의 β-메르캅토에틸아민(4 ℃)에 신속하게 혼합하고, α 쇄 및 항-CD3 (scFv)-β 쇄의 최종 농도는 각각 0.1 mg/mL, 0.25 mg/mL이다.
혼합 후 용액을 10배 부피의 탈이온수에 넣고 투석(4 ℃)하고, 12시간 후, 탈이온수를 완충액(10 mM의 Tris, pH 8.0)으로 교체하여 계속하여 4 ℃에서 12시간 동안 투석하였다. 투석이 끝난 후의 용액을 0.45 μM의 여과막으로 여과한 후, 음이온 교환 칼럼(HiTrap Q HP 5 ml, GE healthcare)을 통해 정제하였다. 용출 피크에 리폴딩이 성공한 TCR α 쇄 항-CD3(scFv)-β 쇄 이량체가 함유된 TCR은 SDS-PAGE 겔로 확인하였다. 그 후, TCR 융합 분자는 크기배제 크로마토그래피(S-100 16/60, GE healthcare)를 통해 추가적으로 정제하고, 음이온 교환 칼럼(HiTrap Q HP 5ml, GE healthcare)을 통해 재차 정제하였다. 정제된 TCR 융합 분자의 순도를 SDS-PAGE로 측정한 결과 90 %이고, 농도는 BCA 방법으로 측정하였다.
실시예 10. 본 발명의 고친화력 TCR로 형질감염된 효과기 세포의 활성화 기능 실험
본 실시예는 본 발명의 고친화력 TCR로 형질감염된 효과기 세포가 표적 세포에 대해 아주 좋은 특이적 활성을 작용을 가짐을 검증하였다.
ELISPOT 실험을 통해 세포에서의 본 발명의 고친화력 TCR의 기능 및 특이성을 검출하였다. 본 기술분야의 통상의 기술자는 ELISPOT 실험을 이용하여 세포 기능을 검출하는 방법을 잘 알고 있다. 본 실시예의 IFN-γ ELISPOT 실험에서 건강한 지원자의 혈액에서 단리된 CD8+ T 세포를 렌티바이러스를 통해 본 발명의 고친화력 TCR로 형질감염시킨 것을 효과기 세포로 사용하였다.
본 발명의 TCR을 랜덤으로 선택하여 두 군으로 나누어 실험하였고, 상기 TCR 및 이의 번호는 표 4로부터 획득하였다.
첫 번째 군은 TCR3(α 쇄 가변 영역의 서열번호 51, β 쇄 가변 영역의 서열번호 2), TCR2(α 쇄 가변 영역의 서열번호 52, β 쇄 가변 영역의 서열번호 2), TCR4(α 쇄 가변 영역의 서열번호 53, β 쇄 가변 영역의 서열번호 2) 및 TCR1(α 쇄 가변 영역의 서열번호 54, β 쇄 가변 영역의 서열번호 2)이고, 대조군 효과기 세포는 WT-TCR(야생형 TCR의 형질 감염) 및 A6(본 발명 이외의 다른 TCR의 형질 감염)으로 표기된다. 표적 세포주는 HepG2, Huh-7, Huh-1, HCCC9810 및 SK-HEP-1 세포이다. 여기서, 표적 세포주 HepG2는 관련 항원을 발현하고 유전자형도 양성 세포주에 부합되며, Huh-7, Huh-1, HCCC9810 및 SK-HEP-1은 음성 세포주를 대조군으로 사용하였다.
두 번째 군은 TCR7(α 쇄 가변 영역의 서열번호 57, β 쇄 가변 영역의 서열번호 2), TCR11(α 쇄 가변 영역의 서열번호 61, β 쇄 가변 영역의 서열번호 2) 및 TCR13(α 쇄 가변 영역의 서열번호 63, β 쇄 가변 영역의 서열번호 2)이다. 대조군 효과기 세포는 WT-TCR(야생형 TCR의 형질 감염) 및 A6(본 발명 이외의 다른 TCR의 형질 감염)으로 표기된다. 표적 세포주는 HCCC9810-AFP, PLCPRF5-A2, SNU398 및 HCCC9810이고, 여기서, 표적 세포주 HCCC9810-AFP 및 PLCPRF5-A2는 관련 항원을 발현하고 유전자형도 양성 세포주에 부합되며, SNU398 및 HCCC9810은 음성 세포주이고, 대조군으로 사용하였다.
먼저 ELISPOT 플레이트를 준비하였다. ELISPOT 플레이트를 에탄올로 활성화 코팅을 진행하고, 4 ℃에서 하룻밤 지냈다. 실험 1일째에, 코팅액을 제거하고, 세척하여 차단하고, 실온에서 2시간 동안 배양하고, 차단액을 제거하고, 효과기 세포의 경우 배지를 1Х104개 세포/ml로 조정하고, 각 표적 세포주의 경우 배지를 2Х105개 세포/ml로 조정하는 순서로 실험의 각 성분을 ELISPOT 플레이트에 넣었다. 균일하게 혼합한 후 100 μL의 표적 세포(즉 20000개 세포/웰), 100 μL의 효과기 세포(즉 1000개 세포/웰)를 대응되는 웰에 넣고, 2개의 중복 웰을 설정하였다. 하룻밤 배양하였다(37 ℃, 5 % CO2). 실험 2일째에, 플레이트를 세척하고 2차 검출 및 발색을 진행하고, 플레이트를 건조시킨 다음, 면역 스팟 플레이트 리더(ELISPOT READER system; AID20사)를 이용하여 막에 형성된 스팟을 계수하였다.
첫 번째 군 및 두 번째 군의 실험 결과는 각각 도 13a 및 13b에 도시된 바와 같이, 본 발명의 고친화력 TCR로 형질감염된 효과기 세포는 음성 표적 세포에 대해 활성화 작용이 거의 없고, 양성 표적 세포에 대해 아주 좋은 특이적 활성화 작용이 있으며, 그 효과는 야생형 TCR로 형질감염된 효과기 세포보다 훨씬 우수하였다.
실시예 11. 본 발명의 고친화력 TCR로 형질감염된 효과기 세포의 살해 기능 실험
본 실시예에서는 비 방사성 세포 독성 실험을 통해 LDH의 방출을 측정함으로써, 본 발명의 TCR로 형질도입된 세포의 사멸 기능을 검증하였다. 상기 실험은 세포 용해 후 방출되는 젖산 탈수소 효소(LDH)를 정량적으로 측정하는 51Cr 방출 세포 독성 실험에 대한 비색 대안 실험이다. 30 분간 커플링된 효소 반응을 통해 배지에 방출된 LDH를 검출하고, 효소 반응에서 LDH는 테트라졸륨염(INT)을 적색 포르마잔(formazan)으로 전환시킬 수 있다. 생성된 적색 산물의 양은 용해된 세포 수에 정비례한다. 표준 96웰 플레이트 리더를 사용하여 490 nm 가시광 흡수 데이터를 수집할 수 있다.
본 기술분야의 통상의 기술자는 LDH의 방출 실험을 이용하여 세포 기능을 검출하는 방법을 잘 알고 있다. 본 실시예의 LDH 실험에서 건강한 지원자의 혈액에서 단리된 PBL 세포를 렌티바이러스를 통해 TCR로 형질감염시킨 것을 효과기 세포로 사용하였다. 표적 세포주는 HepG2, HCCC9810 및 SNU-398이고, 여기서, HepG2는 양성 표적 세포주로서, HCCC9810 및 SNU-398은 음성 표적 세포주로서, 대조군으로 사용하였다.
본 발명의 TCR을 랜덤으로 선택하여 두 군으로 나누어 실험하였고, 상기 TCR 및 이의 번호는 표 4로부터 획득하였다. 첫 번째 군은 TCR3(α 쇄 가변 영역의 서열번호 51, β 쇄 가변 영역의 서열번호 2), TCR2(α 쇄 가변 영역의 서열번호 52, β 쇄 가변 영역의 서열번호 2) 및 TCR1(α 쇄 가변 영역의 서열번호 54, β 쇄 가변 영역의 서열번호 2)이고; 두 번째 군은 TCR7(α 쇄 가변 영역의 서열번호 57, β 쇄 가변 영역의 서열번호 2) 및 TCR13(α 쇄 가변 영역의 서열번호 63, β 쇄 가변 영역의 서열번호 2)이다. 대조군 효과기 세포는 WT-TCR(야생형 TCR의 형질 감염) 및 A6(본 발명 이외의 다른 TCR의 형질 감염)으로 표기된다.
먼저 LDH 플레이트를 준비하였다. 실험 1일째에, 효과기 세포의 경우 배지를 3 Х 105개 세포/ml로 조정하고, 각 표적 세포주의 경우 배지를 3Х 105개 세포/ml로 조정하는 순서로 실험의 각 성분을 플레이트에 넣었다. 균일하게 혼합한 후 100 μL의 표적 세포(즉 30000개 세포/웰), 100 μL의 효과기 세포(즉 30000개 세포/웰)를 대응되는 웰에 넣고, 3개의 중복 웰을 설정하였다. 동시에 효과기 세포 자발적 웰, 표적 세포 자발적 웰, 표적 세포 최대 웰, 부피 교정 대조 웰 및 배지 백그라운드 웰 모두 200 μL로 설정하였다. 하룻밤 배양하였다(37 ℃, 5 % CO2). 실험 2일째에, 발색을 검출하고, 반응이 종료된 후 마이크로 플레이트 리더(Bioteck)를 사용하여 490 nm에서 흡광도를 기록하였다.
첫 번째 군 및 두 번째 군의 실험 결과는 각각 도 14a, 14b에 도시된 바와 같이, 본 발명의 TCR로 형질도입된 표적 세포는 아주 강한 살해 작용을 가지지만, 관련 항원을 발현하지 않는 표적 세포에 대해 살해 작용이 거의 없고, 다른 TCR로 형질도입된 세포는 관련 항원을 발현하는 표적 세포에 대해 살해 작용이 없다.
실시예 12. 본 발명의 고친화력 TCR과 항-CD3 항체의 융합 단백질의 기능 검증-활성화 실험
본 실시예는 본 발명의 고친화력 TCR과 항-CD3 항체의 융합 단백질은 효과기 세포를 재표적화할 수 있고 아주 좋은 활성화 작용을 가지도록 할 수 있음을 검증하였다.
본 기술분야의 통상의 기술자는 ELISPOT 실험을 이용하여 세포 기능을 검출하는 방법을 잘 알고 있다. 본 실시예의 IFN-γ ELISPOT 실험에서 사용된 효과기 세포는 건강한 지원자의 혈액에서 단리된 CD8+ T 세포이고, 표적 세포주는 HEPG2, HCCC9810 및 SNU-398이며, 여기서, HEPG2는 양성 표적 세포주이고, HCCC9810 및 SNU-398은 음성 표적 세포주이다. 본 발명의 고친화력 TCR을 랜덤으로 선택하여 실시예 9에 따라 융합 단백질을 제조하였으며, 구체적으로, 선택되는 고친화력 TCR 및 이의 번호는 표 4로부터 획득하였는 바, 각각 TCR21(α 쇄 가변 영역의 서열번호 69, β 쇄 가변 영역의 서열번호 79), TCR24(α 쇄 가변 영역의 서열번호 71, β 쇄 가변 영역의 서열번호 83), TCR25(α 쇄 가변 영역의 서열번호 72, β 쇄 가변 영역의 서열번호 84), TCR17(α 쇄 가변 영역의 서열번호 66, β 쇄 가변 영역의 서열번호 81), TCR23(α 쇄 가변 영역의 서열번호 71, β 쇄 가변 영역의 서열번호 79), TCR33(α 쇄 가변 영역의 서열번호 76, β 쇄 가변 영역의 서열번호 79) 및 TCR34(α 쇄 가변 영역의 서열번호 72, β 쇄 가변 영역의 서열번호 81)이다.
먼저 ELISPOT 플레이트를 준비하였다. ELISPOT 플레이트를 에탄올로 활성화 코팅을 진행하고, 4 ℃에서 하룻밤 지냈다. 실험 1일째에, 코팅액을 제거하고, 세척하여 차단하고, 실온에서 2시간 동안 배양하고, 차단액을 제거하고, 실험의 각 성분을 ELISPOT 플레이트에 넣었다. 표적 세포는 20000개 세포/ml이고, 효과기 세포는 4000개 세포/ml이며, 융합 단백질의 농도는 0.04 μM이고, 하나씩 10배의 구배로 희석하되, 총 6개의 농도 구배로 희석하였다. 2개의 중복 웰을 설정하였다. 하룻밤 배양하였다(37 ℃, 5 % CO2). 실험 2일째에, 플레이트를 세척하고 2차 검출 및 발색을 진행하고, 플레이트를 건조시킨 다음, 면역 스팟 플레이트 리더(ELISPOT READER system; AID20사)를 이용하여 막에 형성된 스팟을 계수하였다.
실험 결과는 도 15a, 도 15b, 도 15c, 도 15d, 도 15e, 도 15f 및 도 15g에 도시된 바와 같고, 결과는 본 발명의 고친화력 TCR과 항-CD3 항체의 융합 단백질은 효과기 세포를 재표적화할 수 있으며, 효과기 세포는 양성 표적 세포에 대해 아주 강한 활성화 작용을 보이지만, 효과기 세포는 음성 표적 세포에 대해서는 거의 활성화 작용이 없고 아주 좋은 특이성을 보여줌을 설명한다.
실시예 13. 본 발명의 고친화력 TCR과 항-CD3 항의 융합 단백질의 기능 검증-살해 실험
본 실시예에서는 비 방사성 세포 독성 실험을 통해 살해 작용을 검증하였다. 상기 실험은 세포 용해 후 방출되는 젖산 탈수소 효소(LDH)를 정량적으로 측정하는 51Cr 방출 세포 독성 실험에 대한 비색 대안 실험이다. 30 분간 커플링된 효소 실험을 통해 배양 상청액에 방출된 LDH를 검출하고, 이는 테트라졸륨염(INT)을 적색 포르마잔 산물로 전환시킬 수 있다. 형성된 색상량은 용해된 세포 수에 정비례한다. 표준 96웰 플레이트 리더를 사용하여 490 nm의 흡광도 데이터를 수집하였다.
본 실험에서 사용된 표적 세포주는 HEPG2, HCCC9810 및 SNU-398이고, 여기서, HEPG2는 양성 표적 세포주이며, HCCC9810 및 SNU-398은 음성 표적 세포주이다. 효과기 세포는 CD8 양성 T 세포이다. 본 발명의 고친화력 TCR을 랜덤으로 선택하고, 표 4로부터 상기 TCR 및 이의 번호는 TCR23(α 쇄 가변 영역의 서열번호 71, β 쇄 가변 영역의 서열번호 79)임을 알 수 있다. 실시예 9에 따라 융합 단백질을 제조하였으며, 실험 배지를 통해 상이한 농도(10-13-10-8M)로 희석하였다. 50 μl의 표적 세포, 5Х104개 세포/웰; 100 μl의 효과기 세포, 5Х104개 세포/웰; 50 μl 융합 단백질의 순서로 실험의 각 성분을 플레이트의 각 웰에 넣었다.
표적 세포 자발적 방출; 200 μl의 표적 세포만 존재; 표적 세포 최대 방출; 200 μl의 표적 세포만 존재하는 몇 개의 대조군을 제조하였다. 배지 대조군은 200 μl의 배지만 존재하는 것이고; 부피 교정 대조군은 200 μl의 배지 및 20 μl의 세포 용해액이다. 모든 웰은 1식 3부로 제조하되, 최종 부피는 200 μl이다. 250Х g에서 플레이트를 4분 동안 원심분리한 다음, 37 ℃에서 20시간 동안 배양하였다. 20 μl의 용해 용액을 표적 세포 최대 방출 재조 홀 및 부피 교정 대조 홀에 넣고, 45분 후 상청액을 수집하였다. 250Х g에서 플레이트를 4분 동안 원심분하였다. 실험 플레이트의 각 웰의 50 μl의 상청액을 평평한 바닥 96웰 Nunc Vlnxisorb 플레이트의 대응되는 웰에 옮겼다. 실험 완충액(12 m1)을 이용하여 기질 혼합물을 재구축하였다. 다음, 50 μl의 재구축된 기질 혼합물을 플레이트의 각 웰에 넣었다. 플레이트에 알루미늄 호일을 덮고, 실온에서 30분 동안 배양하였다. 50 μl의 정지 용액을 플레이트의 각 웰에 넣어 반응을 정료시킨다. 정지 용액을 넣은 후 1시간 내에 Elisa 플레이트 리더를 사용하여 490 nm의 흡광도를 기록하였다.
실험 결과는 도 16에 도시된 바와 같이, 본 발명의 고친화력 TCR과 항-CD3 항체의 융합 단백질은 효과기 세포를 재표적화할 수 있고, 양성 표적 세포를 살해하지만, 음성 표적 세포에 대해 살해 작용이 없고 우수한 특이성을 보여준다.
본 발명에서 언급한 모든 문헌은 각 문헌이 단독으로 참조로서 본 발명에 인용되는 것과 같이 모두 참조로서 본 발명에 인용된다. 이 밖에, 본 발명의 상기 내용을 열독한 후, 본 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명에 대해 다양한 변형 또는 수정을 진행할 수 있고, 이러한 등가 형태는 마찬가지로 본 발명에 첨부된 특허청구범위에 한정된 범위에 속함을 이해해야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> XLIFESC, LTD. <120> HIGH AFFINITY T CELL RECEPTOR FOR RECOGNIZING AFP ANTIGEN <130> P2019-1610 <140> PCT/CN2019/106816 <141> 2019-09-19 <150> CN 201811109677.3 <151> 2018-09-21 <160> 103 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 113 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 폴리펩티드 <400> 1 Ser Gln Gln Gly Glu Glu Asp Pro Gln Ala Leu Ser Ile Gln Glu Gly 1 5 10 15 Glu Asn Ala Thr Met Asn Cys Ser Tyr Lys Thr Ser Ile Asn Asn Leu 20 25 30 Gln Trp Tyr Arg Gln Asn Ser Gly Arg Gly Leu Val His Leu Ile Leu 35 40 45 Ile Arg Ser Asn Glu Arg Glu Lys His Ser Gly Arg Leu Arg Val Thr 50 55 60 Leu Asp Thr Ser Lys Lys Ser Ser Ser Leu Leu Ile Thr Ala Ser Arg 65 70 75 80 Ala Ala Asp Thr Ala Ser Tyr Phe Cys Ala Thr Asp Pro Arg Thr Gly 85 90 95 Ala Asn Ser Lys Leu Thr Phe Gly Lys Gly Ile Thr Leu Ser Val Arg 100 105 110 Pro <210> 2 <211> 112 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 폴리펩티드 <400> 2 Asp Thr Gly Val Ser Gln Asp Pro Arg His Lys Ile Thr Lys Arg Gly 1 5 10 15 Gln Asn Val Thr Phe Arg Cys Asp Pro 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ccgcgccatc tgagcgttaa acgtggccag aatgttaccc tgcgctgtga tccgattagt 480 gaacataatc gtctgtattg gtatcgtcag accccgggtc agggtccgga atttctgacc 540 tattttcaga atgaagcaca gctggaaaaa agccgtctgc tgagtgatcg ttttagcgcc 600 gaacgtccga aaggcagttt tagtaccctg gaaattcagc gcgtggaacc gggtgacagc 660 gcaatgtatc tgtgcgccag cgaaggtctg gcctatgaac agtattttgg cccgggtacc 720 cgcctgaccg ttacc 735 <210> 49 <211> 208 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 폴리펩티드 <400> 49 Met Ser Gln Gln Gly Glu Glu Asp Pro Gln Ala Leu Ser Ile Gln Glu 1 5 10 15 Gly Glu Asn Ala Thr Met Asn Cys Ser Tyr Lys Thr Ser Ile Asn Asn 20 25 30 Leu Gln Trp Tyr Arg Gln Asn Ser Gly Arg Gly Leu Val His Leu Ile 35 40 45 Leu Ile Arg Ser Asn Glu Arg Glu Lys His Ser Gly Arg Leu Arg Val 50 55 60 Thr Leu Asp Thr Ser Lys Lys Ser Ser Ser Leu Leu Ile Thr Ala Ser 65 70 75 80 Arg Ala Ala Asp Thr Ala Ser Tyr Phe Cys Ala Thr Asp Pro Arg Thr 85 90 95 Gly Ala Asn Ser Lys Leu Thr Phe Gly Lys Gly Ile Thr Leu Ser Val 100 105 110 Arg Pro Asp Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val 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Val Ser Gln Asp Pro Arg His Lys Ile Thr Lys Arg Gly 1 5 10 15 Gln Asn Val Thr Phe Arg Cys Asp Pro Ile Ala Gly His Ala Arg Leu 20 25 30 Tyr Trp Tyr Arg Gln Thr Leu Gly Gln Gly Pro Glu Phe Leu Thr Tyr 35 40 45 Phe Gln Gly Asp Leu Glu Leu Glu Lys Ser Arg Leu Leu Ser Asp Arg 50 55 60 Phe Ser Ala Glu Arg Pro Lys Gly Ser Phe Ser Thr Leu Glu Ile Gln 65 70 75 80 Arg Thr Glu Gln Gly Asp Ser Ala Met Tyr Leu Cys Ala Ser Glu Gly 85 90 95 Leu Ala Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Thr 100 105 110 <210> 83 <211> 112 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 폴리펩티드 <400> 83 Asp Thr Gly Val Ser Gln Asp Pro Arg His Lys Ile Thr Lys Arg Gly 1 5 10 15 Gln Asn Val Thr Phe Arg Cys Asp Pro Ile Gly Thr Trp Pro Arg Leu 20 25 30 Tyr Trp Tyr Arg Gln Thr Leu Gly Gln Gly Pro Glu Phe Leu Thr Tyr 35 40 45 Phe Gln Gly Asp Leu Glu Leu Glu Lys Ser Arg Leu Leu Ser Asp Arg 50 55 60 Phe Ser Ala Glu Arg Pro Lys Gly Ser Phe Ser Thr Leu Glu Ile Gln 65 70 75 80 Arg Thr Glu Gln Gly Asp Ser Ala Met Tyr Leu Cys Ala Ser Glu Gly 85 90 95 Leu Ala Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Thr 100 105 110 <210> 84 <211> 112 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 폴리펩티드 <400> 84 Asp Thr Gly Val Ser Gln Asp Pro Arg His Lys Ile Thr Lys Arg Gly 1 5 10 15 Gln Asn Val Thr Phe Arg Cys Asp Pro Ile Gly Arg Trp Pro Arg Leu 20 25 30 Tyr Trp Tyr Arg Gln Thr Leu Gly Gln Gly Pro Glu Phe Leu Thr Tyr 35 40 45 Phe Gln Gly Asp Leu Glu Leu Glu Lys Ser Arg Leu Leu Ser Asp Arg 50 55 60 Phe Ser Ala Glu Arg Pro Lys Gly Ser Phe Ser Thr Leu Glu Ile Gln 65 70 75 80 Arg Thr Glu Gln Gly Asp Ser Ala Met Tyr Leu Cys Ala Ser Glu Gly 85 90 95 Leu Ala Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Thr 100 105 110 <210> 85 <211> 112 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 폴리펩티드 <400> 85 Asp Thr Gly Val Ser Gln Asp Pro Arg His Lys Ile Thr Lys Arg Gly 1 5 10 15 Gln Asn Val Thr Phe Arg Cys Asp Pro Ile Gln Gly His Ala Arg Leu 20 25 30 Tyr Trp Tyr Arg Gln Thr Leu Gly Gln Gly Pro Glu Phe Leu Thr Tyr 35 40 45 Phe Gln Gly Asp Leu Glu Leu Glu Lys Ser Arg Leu Leu Ser Asp Arg 50 55 60 Phe Ser Ala Glu Arg Pro Lys Gly Ser Phe Ser Thr Leu Glu Ile Gln 65 70 75 80 Arg Thr Glu Gln Gly Asp Ser Ala Met Tyr Leu Cys Ala Ser Glu Gly 85 90 95 Leu Ala Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Thr 100 105 110 <210> 86 <211> 112 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 폴리펩티드 <400> 86 Asp Thr Gly Val Ser Gln Asp Pro Arg His Lys Ile Thr Lys Arg Gly 1 5 10 15 Gln Asn Val Thr Phe Arg Cys Asp Pro Ile Ala Arg His Ala Arg Leu 20 25 30 Tyr Trp Tyr Arg Gln Thr Leu Gly Gln Gly Pro Glu Phe Leu Thr Tyr 35 40 45 Phe Gln Gly Asp Leu Glu Leu Glu Lys Ser Arg Leu Leu Ser Asp Arg 50 55 60 Phe Ser Ala Glu Arg Pro Lys Gly Ser Phe Ser Thr Leu Glu Ile Gln 65 70 75 80 Arg Thr Glu Gln Gly Asp Ser Ala Met Tyr Leu Cys Ala Ser Glu Gly 85 90 95 Leu Ala Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Thr 100 105 110 <210> 87 <211> 112 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 폴리펩티드 <400> 87 Asp Thr Gly Val Ser Gln Asp Pro Arg His Lys Ile Thr Lys Arg Gly 1 5 10 15 Gln Asn Val Thr Phe Arg Cys Asp Pro Ile Gly Leu Trp Pro Arg Leu 20 25 30 Tyr Trp Tyr Arg Gln Thr Leu Gly Gln Gly Pro Glu Phe Leu Thr Tyr 35 40 45 Phe Gln Gly Asp Leu Glu Leu Glu Lys Ser Arg Leu Leu Ser Asp Arg 50 55 60 Phe Ser Ala Glu Arg Pro Lys Gly Ser Phe Ser Thr Leu Glu Ile Gln 65 70 75 80 Arg Thr Glu Gln Gly Asp Ser Ala Met Tyr Leu Cys Ala Ser Glu Gly 85 90 95 Leu Ala Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Thr 100 105 110 <210> 88 <211> 112 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 폴리펩티드 <400> 88 Asp Thr Gly Val Ser Gln Asp Pro Arg His Lys Ile Thr Lys Arg Gly 1 5 10 15 Gln Asn Val Thr Phe Arg Cys Asp Pro Ile Gln Gly Arg Ala Arg Leu 20 25 30 Tyr Trp Tyr Arg Gln Thr Leu Gly Gln Gly Pro Glu Phe Leu Thr Tyr 35 40 45 Phe Gln Gly Asp Met Glu Leu Glu Lys Ser Arg Leu Leu Ser Asp Arg 50 55 60 Phe Ser Ala Glu Arg Pro Lys Gly Ser Phe Ser Thr Leu Glu Ile Gln 65 70 75 80 Arg Thr Glu Gln Gly Asp Ser Ala Met Tyr Leu Cys Ala Ser Glu Gly 85 90 95 Leu Ala Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Thr 100 105 110 <210> 89 <211> 254 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 폴리펩티드 <400> 89 Ser Gln Gln Gly Glu Glu Asp Pro Gln Ala Leu Ser Ile Gln Glu Gly 1 5 10 15 Glu Asn Ala Thr Met Asn Cys Ser Tyr Lys Thr Ser Ile Asn Asn Leu 20 25 30 Gln Trp Tyr Arg Gln Asn Ser Gly Arg Gly Leu Val His Leu Ile Leu 35 40 45 Ile Arg Ser Asn Glu Arg Glu Lys His Ser Gly Arg Leu Arg Val Thr 50 55 60 Leu Asp Thr Ser Lys Lys Ser Ser Ser Leu Leu Ile Thr Ala Ser Arg 65 70 75 80 Ala Ala Asp Thr Ala Ser Tyr Phe Cys Ala Thr Asp Pro Arg Thr Gly 85 90 95 Ala Asn Ser Lys Leu Thr Phe Gly Lys Gly Ile Thr Leu Ser Val Arg 100 105 110 Pro Asp Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser 115 120 125 Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln 130 135 140 Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys 145 150 155 160 Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val 165 170 175 Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn 180 185 190 Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys 195 200 205 Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn 210 215 220 Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val 225 230 235 240 Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser 245 250 <210> 90 <211> 291 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 폴리펩티드 <400> 90 Asp Thr Gly Val Ser Gln Asp Pro Arg His Lys Ile Thr Lys Arg Gly 1 5 10 15 Gln Asn Val Thr Phe Arg Cys Asp Pro Ile Ser Glu His Asn Arg Leu 20 25 30 Tyr Trp Tyr Arg Gln Thr Leu Gly Gln Gly Pro Glu Phe Leu Thr Tyr 35 40 45 Phe Gln Asn Glu Ala Gln Leu Glu Lys Ser Arg Leu Leu Ser Asp Arg 50 55 60 Phe Ser Ala Glu Arg Pro Lys Gly Ser Phe Ser Thr Leu Glu Ile Gln 65 70 75 80 Arg Thr Glu Gln Gly Asp Ser Ala Met Tyr Leu Cys Ala Ser Glu Gly 85 90 95 Leu Ala Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Thr 100 105 110 Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro 115 120 125 Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu 130 135 140 Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn 145 150 155 160 Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys 165 170 175 Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu 180 185 190 Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys 195 200 205 Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp 210 215 220 Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg 225 230 235 240 Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser 245 250 255 Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala 260 265 270 Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asp 275 280 285 Ser Arg Gly 290 <210> 91 <211> 113 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 폴리펩티드 <400> 91 Ser Gln Gln Gly Glu Glu Asp Pro Gln Ala Leu Ser Ile Gln Glu Gly 1 5 10 15 Glu Asn Ala Thr Met Asn Cys Ser Tyr Lys Thr Ser Ile Asn Asn Leu 20 25 30 Gln Trp Tyr Arg Gln Asn Ser Gly Arg Gly Leu Val His Leu Ile Leu 35 40 45 Ile Arg Ser Asn Glu Arg Glu Lys His Ser Gly Arg Leu Arg Val Thr 50 55 60 Leu Asp Thr Ser Lys Lys Ser Ser Ser Leu Leu Ile Thr Ala Ser Arg 65 70 75 80 Ala Ala Asp Thr Ala Ser Tyr Phe Cys Ala Thr Asp Pro His Trp Ser 85 90 95 Thr Asn Ser Lys Leu Thr Phe Gly Lys Gly Ile Thr Leu Ser Val Arg 100 105 110 Pro <210> 92 <211> 113 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 폴리펩티드 <400> 92 Ser Gln Gln Gly Glu Glu Asp Pro Gln Ala Leu Ser Ile Gln Glu Gly 1 5 10 15 Glu Asn Ala Thr Met Asn Cys Ser Tyr Lys Thr Asp Ile Ala Ser Leu 20 25 30 Gln Trp Tyr Arg Gln Asn Ser Gly Arg Gly Leu Val His Leu Ile Leu 35 40 45 Ile Arg Ser Asn Glu Arg Glu Lys His Ser Gly Arg Leu Arg Val Thr 50 55 60 Leu Asp Thr Ser Lys Lys Ser Ser Ser Leu Leu Ile Thr Ala Ser Arg 65 70 75 80 Ala Ala Asp Thr Ala Ser Tyr Phe Cys Ala Thr Asp Pro His Trp Ser 85 90 95 Thr Asn Ser Lys Leu Thr Phe Gly Lys Gly Ile Thr Leu Ser Val Arg 100 105 110 Pro <210> 93 <211> 112 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 폴리펩티드 <400> 93 Asp Thr Gly Val Ser Gln Asp Pro Arg His Lys Ile Thr Lys Arg Gly 1 5 10 15 Gln Asn Val Thr Phe Arg Cys Asp Pro Ile Val Asp Asn Ala Arg Leu 20 25 30 Tyr Trp Tyr Arg Gln Thr Leu Gly Gln Gly Pro Glu Phe Leu Thr Tyr 35 40 45 Phe Gln Asn Glu Ala Gln Leu Glu Lys Ser Arg Leu Leu Ser Asp Arg 50 55 60 Phe Ser Ala Glu Arg Pro Lys Gly Ser Phe Ser Thr Leu Glu Ile Gln 65 70 75 80 Arg Thr Glu Gln Gly Asp Ser Ala Met Tyr Leu Cys Ala Ser Glu Gly 85 90 95 Leu Ala Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Thr 100 105 110 <210> 94 <211> 112 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 폴리펩티드 <400> 94 Asp Thr Gly Val Ser Gln Asp Pro Arg His Lys Ile Thr Lys Arg Gly 1 5 10 15 Gln Asn Val Thr Phe Arg Cys Asp Pro Ile Leu Gly His Ala Arg Leu 20 25 30 Tyr Trp Tyr Arg Gln Thr Leu Gly Gln Gly Pro Glu Phe Leu Thr Tyr 35 40 45 Phe Gln Asn Glu Ala Gln Leu Glu Lys Ser Arg Leu Leu Ser Asp Arg 50 55 60 Phe Ser Ala Glu Arg Pro Lys Gly Ser Phe Ser Thr Leu Glu Ile Gln 65 70 75 80 Arg Thr Glu Gln Gly Asp Ser Ala Met Tyr Leu Cys Ala Ser Glu Gly 85 90 95 Leu Ala Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Thr 100 105 110 <210> 95 <211> 112 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 폴리펩티드 <400> 95 Asp Thr Gly Val Ser Gln Asp Pro Arg His Lys Ile Thr Lys Arg Gly 1 5 10 15 Gln Asn Val Thr Phe Arg Cys Asp Pro Ile Gly Trp Trp Pro Arg Leu 20 25 30 Tyr Trp Tyr Arg Gln Thr Leu Gly Gln Gly Pro Glu Phe Leu Thr Tyr 35 40 45 Phe Gln Asn Glu Ala Gln Leu Glu Lys Ser Arg Leu Leu Ser Asp Arg 50 55 60 Phe Ser Ala Glu Arg Pro Lys Gly Ser Phe Ser Thr Leu Glu Ile Gln 65 70 75 80 Arg Thr Glu Gln Gly Asp Ser Ala Met Tyr Leu Cys Ala Ser Glu Gly 85 90 95 Leu Ala Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Thr 100 105 110 <210> 96 <211> 112 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 폴리펩티드 <400> 96 Asp Thr Gly Val Ser Gln Asp Pro Arg His Lys Ile Thr Lys Arg Gly 1 5 10 15 Gln Asn Val Thr Phe Arg Cys Asp Pro Ile Ser Glu His Asn Arg Leu 20 25 30 Tyr Trp Tyr Arg Gln Thr Leu Gly Gln Gly Pro Glu Phe Leu Thr Tyr 35 40 45 Phe Gln Gly Glu Leu Gln Leu Glu Lys Ser Arg Leu Leu Ser Asp Arg 50 55 60 Phe Ser Ala Glu Arg Pro Lys Gly Ser Phe Ser Thr Leu Glu Ile Gln 65 70 75 80 Arg Thr Glu Gln Gly Asp Ser Ala Met Tyr Leu Cys Ala Ser Glu Gly 85 90 95 Leu Ala Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Thr 100 105 110 <210> 97 <211> 112 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 폴리펩티드 <400> 97 Asp Thr Gly Val Ser Gln Asp Pro Arg His Lys Ile Thr Lys Arg Gly 1 5 10 15 Gln Asn Val Thr Phe Arg Cys Asp Pro Ile Ser Glu His Asn Arg Leu 20 25 30 Tyr Trp Tyr Arg Gln Thr Leu Gly Gln Gly Pro Glu Phe Leu Thr Tyr 35 40 45 Phe Gln Gly Asp Met Gln Leu Glu Lys Ser Arg Leu Leu Ser Asp Arg 50 55 60 Phe Ser Ala Glu Arg Pro Lys Gly Ser Phe Ser Thr Leu Glu Ile Gln 65 70 75 80 Arg Thr Glu Gln Gly Asp Ser Ala Met Tyr Leu Cys Ala Ser Glu Gly 85 90 95 Leu Ala Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Thr 100 105 110 <210> 98 <211> 112 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 폴리펩티드 <400> 98 Asp Thr Gly Val Ser Gln Asp Pro Arg His Lys Ile Thr Lys Arg Gly 1 5 10 15 Gln Asn Val Thr Phe Arg Cys Asp Pro Ile Ser Glu His Asn Arg Leu 20 25 30 Tyr Trp Tyr Arg Gln Thr Leu Gly Gln Gly Pro Glu Phe Leu Thr Tyr 35 40 45 Phe Gln Gly Asp Leu Gln Leu Glu Lys Ser Arg Leu Leu Ser Asp Arg 50 55 60 Phe Ser Ala Glu Arg Pro Lys Gly Ser Phe Ser Thr Leu Glu Ile Gln 65 70 75 80 Arg Thr Glu Gln Gly Asp Ser Ala Met Tyr Leu Cys Ala Ser Glu Gly 85 90 95 Leu Ala Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Thr 100 105 110 <210> 99 <211> 112 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 폴리펩티드 <400> 99 Asp Thr Gly Val Ser Gln Asp Pro Arg His Lys Ile Thr Lys Arg Gly 1 5 10 15 Gln Asn Val Thr Phe Arg Cys Asp Pro Ile Ser Glu His Asn Arg Leu 20 25 30 Tyr Trp Tyr Arg Gln Thr Leu Gly Gln Gly Pro Glu Phe Leu Thr Tyr 35 40 45 Phe His Tyr Thr Ala Gln Leu Glu Lys Ser Arg Leu Leu Ser Asp Arg 50 55 60 Phe Ser Ala Glu Arg Pro Lys Gly Ser Phe Ser Thr Leu Glu Ile Gln 65 70 75 80 Arg Thr Glu Gln Gly Asp Ser Ala Met Tyr Leu Cys Ala Ser Glu Gly 85 90 95 Leu Ala Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Thr 100 105 110 <210> 100 <211> 112 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 폴리펩티드 <400> 100 Asp Thr Gly Val Ser Gln Asp Pro Arg His Lys Ile Thr Lys Arg Gly 1 5 10 15 Gln Asn Val Thr Phe Arg Cys Asp Pro Ile Ser Glu His Asn Arg Leu 20 25 30 Tyr Trp Tyr Arg Gln Thr Leu Gly Gln Gly Pro Glu Phe Leu Thr Tyr 35 40 45 Phe Ala Trp Glu Ala Gln Leu Glu Lys Ser Arg Leu Leu Ser Asp Arg 50 55 60 Phe Ser Ala Glu Arg Pro Lys Gly Ser Phe Ser Thr Leu Glu Ile Gln 65 70 75 80 Arg Thr Glu Gln Gly Asp Ser Ala Met Tyr Leu Cys Ala Ser Glu Gly 85 90 95 Leu Ala Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Thr 100 105 110 <210> 101 <211> 112 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 폴리펩티드 <400> 101 Asp Thr Gly Val Ser Gln Asp Pro Arg His Lys Ile Thr Lys Arg Gly 1 5 10 15 Gln Asn Val Thr Phe Arg Cys Asp Pro Ile Gly Trp Trp Pro Arg Leu 20 25 30 Tyr Trp Tyr Arg Gln Thr Leu Gly Gln Gly Pro Glu Phe Leu Thr Tyr 35 40 45 Phe Gln Gly Glu Leu Gln Leu Glu Lys Ser Arg Leu Leu Ser Asp Arg 50 55 60 Phe Ser Ala Glu Arg Pro Lys Gly Ser Phe Ser Thr Leu Glu Ile Gln 65 70 75 80 Arg Thr Glu Gln Gly Asp Ser Ala Met Tyr Leu Cys Ala Ser Glu Gly 85 90 95 Leu Ala Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Thr 100 105 110 <210> 102 <211> 207 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 폴리펩티드 <400> 102 Ser Gln Gln Gly Glu Glu Asp Pro Gln Ala Leu Ser Ile Gln Glu Gly 1 5 10 15 Glu Asn Ala Thr Met Asn Cys Ser Tyr Lys Thr Ser Ile Asn Asn Leu 20 25 30 Gln Trp Tyr Arg Gln Asn Ser Gly Arg Gly Leu Val His Leu Ile Leu 35 40 45 Ile Arg Ser Asn Glu Arg Glu Lys His Ser Gly Arg Leu Arg Val Thr 50 55 60 Leu Asp Thr Ser Lys Lys Ser Ser Ser Leu Leu Ile Thr Ala Ser Arg 65 70 75 80 Ala Ala Asp Thr Ala Ser Tyr Phe Cys Ala Thr Asp Pro Arg Thr Gly 85 90 95 Ala Asn Ser Lys Leu Thr Phe Gly Lys Gly Ile Thr Leu Ser Val Arg 100 105 110 Pro Asp Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser 115 120 125 Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln 130 135 140 Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys 145 150 155 160 Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val 165 170 175 Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn 180 185 190 Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser 195 200 205 <210> 103 <211> 242 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 폴리펩티드 <400> 103 Asp Thr Gly Val Ser Gln Asp Pro Arg His Lys Ile Thr Lys Arg Gly 1 5 10 15 Gln Asn Val Thr Phe Arg Cys Asp Pro Ile Ser Glu His Asn Arg Leu 20 25 30 Tyr Trp Tyr Arg Gln Thr Leu Gly Gln Gly Pro Glu Phe Leu Thr Tyr 35 40 45 Phe Gln Asn Glu Ala Gln Leu Glu Lys Ser Arg Leu Leu Ser Asp Arg 50 55 60 Phe Ser Ala Glu Arg Pro Lys Gly Ser Phe Ser Thr Leu Glu Ile Gln 65 70 75 80 Arg Thr Glu Gln Gly Asp Ser Ala Met Tyr Leu Cys Ala Ser Glu Gly 85 90 95 Leu Ala Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Thr 100 105 110 Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro 115 120 125 Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu 130 135 140 Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn 145 150 155 160 Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys 165 170 175 Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu 180 185 190 Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys 195 200 205 Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp 210 215 220 Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg 225 230 235 240 Ala Asp

Claims (41)

  1. FMNKFIYEI-HLA A0201 복합체에 결합하는 활성을 갖는 T 세포 수용체(TCR)로서,
    상기 T 세포 수용체는 TCR α 쇄 가변 영역 및 TCR β 쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 TCR α 쇄 가변 영역은 3개의 CDR 영역을 포함하고, 상기 TCR α 쇄 가변 영역의 3개의 CDR 영역의 기준 서열은 하기와 같고:
    CDR1α: TSINN
    CDR2α: IRSNERE
    CDR3α: ATDPRTGANSKLT;
    또한 하나 이상의 하기 돌연변이를 포함하고/거나:
    Figure pct00010

    상기 TCR β 쇄 가변 영역은 3개의 CDR 영역을 포함하고, 상기 TCR β 쇄 가변 영역의 3개의 CDR 영역의 기준 서열은 하기와 같고:
    CDR1β: SEHNR
    CDR2β: FQNEAQ
    CDR3β: ASEGLAYEQY;
    또한 하나 이상의 하기 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는, T 세포 수용체:
    Figure pct00011
  2. 제1항에 있어서,
    상기 TCR α 쇄 가변 영역의 3개의 CDR 영역에서의 돌연변이 개수는 3개 내지 8개이고/거나, 상기 TCR β 쇄 가변 영역의 3개의 CDR 영역에서의 돌연변이 개수는 4개 내지 8개인 것을 특징으로 하는, T 세포 수용체.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 T 세포 수용체와 FMNKFIYEI-HLA A0201 복합체의 친화력은 야생형 TCR의 2배 이상인 것을 특징으로 하는, T 세포 수용체.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 TCR α 쇄 가변 영역은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 90 % 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고/거나; 상기 TCR β 쇄 가변 영역은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 90 % 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, T 세포 수용체.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 TCR α 쇄 가변 영역의 돌연변이 부위는 CDR3α의 제7 부위 및/또는 제8 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는, T 세포 수용체.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 TCR α 쇄 가변 영역의 돌연변이는 하기 군을 포함하고/거나:
    Figure pct00012

    상기 TCR β 쇄 가변 영역의 돌연변이는 하기 군을 포함하는 것을 특징으로 하는, T 세포 수용체:
    Figure pct00013
  7. 제1항에 있어서,
    상기 T 세포 수용체는 TCR α 쇄 가변 영역 및 TCR β 쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 TCR α 쇄 가변 영역은 CDR1α, CDR2α 및 CDR3α를 포함하고, 상기 CDR1α의 아미노산 서열은 TSINN, TPISS, TDIYK, TAVDS, TEISS 및 TDVSS로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, T 세포 수용체.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 T 세포 수용체는 TCR α 쇄 가변 영역 및 TCR β 쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 TCR α 쇄 가변 영역은 CDR1α, CDR2α 및 CDR3α를 포함하고, 상기 CDR2α의 아미노산 서열은 IRSNERE인 것을 특징으로 하는, T 세포 수용체.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 T 세포 수용체는 TCR α 쇄 가변 영역 및 TCR β 쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 TCR α 쇄 가변 영역은 CDR1α, CDR2α 및 CDR3α를 포함하고, 상기 CDR3α는 서열 ATDP[3αX1][3αX2][3αX3][3αX4]NSKLT를 포함하고, [3αX1], [3αX2], [3αX3] 및 [3αX4]는 각각 독립적으로 임의의 천연 아미노산 잔기로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, T 세포 수용체.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 [3αX1]은 R 또는 A 또는 S 또는 D 또는 E 또는 Q 또는 V 또는 T인 것을 특징으로 하는, T 세포 수용체.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 [3αX2]는 T 또는 M 또는 R 또는 L 또는 A 또는 N 또는 S인 것을 특징으로 하는, T 세포 수용체.
  12. 제9항에 있어서,
    상기 [3αX3]은 G 또는 A 또는 Q 또는 S 또는 E 또는 N인 것을 특징으로 하는, T 세포 수용체.
  13. 제9항에 있어서,
    상기 [3αX4]는 A 또는 S 또는 G 또는 P 또는 W인 것을 특징으로 하는, T 세포 수용체.
  14. 제9항에 있어서,
    상기 CDR3α는 ATDPSMSPNSKLT, ATDPSLSPNSKLT 및 ATDPSLQSNSKLT로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, T 세포 수용체.
  15. 제1항에 있어서,
    상기 T 세포 수용체는 TCR α 쇄 가변 영역 및 TCR β 쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 TCR β 쇄 가변 영역은 CDR1β, CDR2β 및 CDR3β를 포함하고, 상기 CDR2β는 FQGDME, FQGDLE 및 FHGDLE로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, T 세포 수용체.
  16. 제1항에 있어서,
    상기 T 세포 수용체는 TCR α 쇄 가변 영역 및 TCR β 쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 TCR β 쇄 가변 영역은 CDR1β, CDR2β 및 CDR3β를 포함하고, 상기 CDR3β의 아미노산 서열은 ASEGLAYEQY인 것을 특징으로 하는, T 세포 수용체.
  17. 제1항에 있어서,
    상기 T 세포 수용체는 하기 CDR로 이루어진 군으로부터 선택되는 CDR을 포함하는 것을 특징으로 하는, T 세포 수용체:
    Figure pct00014
  18. 제1항에 있어서,
    상기 T 세포 수용체는 용해 가능한 것을 특징으로 하는, T 세포 수용체.
  19. 제1항에 있어서,
    상기 T 세포 수용체는 αβ 이종 이량체 TCR 또는 단일 쇄 TCR이고, 바람직하게는 상기 T 세포 수용체는 α 쇄 불변 영역 서열 TRAC*01 및 β 쇄 불변 영역 서열 TRBC1*01 또는 TRBC2*01을 포함하는 것을 특징으로 하는, T 세포 수용체.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 T 세포 수용체는 (i) 막관통 영역을 제외한 전부 또는 부분 TCR α 쇄, 및 (ii) 막관통 영역을 제외한 전부 또는 부분 TCR β 쇄를 포함하고, (i) 및 (ii)는 모두 TCR 쇄의 가변 영역 및 적어도 일부분의 불변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, T 세포 수용체.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 T 세포 수용체의 α 쇄 가변 영역과 β 쇄 불변 영역 사이에 인공 쇄 간 이황화 결합이 포함되는 것을 특징으로 하는, T 세포 수용체.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 T 세포 수용체의 α 쇄 가변 영역과 β 쇄 불변 영역 사이에 인공 쇄 간 이황화 결합을 형성하는 시스테인 잔기는 하기로부터 선택되는 아미노산의 하나 이상의 군을 치환하는 것을 특징으로 하는 T 세포 수용체:
    TRAC*01 엑손 1의 Thr48 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손 1의 Ser57;
    TRAC*01 엑손 1의 Thr45 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손 1의 Ser77;
    TRAC*01 엑손 1의 Tyr10 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손 1의 Ser17;
    TRAC*01 엑손 1의 Thr45 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손 1의 Asp59;
    TRAC*01 엑손 1의 Ser15 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손 1의 Glu15;
    TRAC*01 엑손 1의 Arg53 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손 1의 Ser54;
    TRAC*01 엑손 1의 Pro89 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손 1의 Ala19; 및
    TRAC*01 엑손 1의 Tyr10 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01 엑손 1의 Glu20.
  23. 제1항에 있어서,
    상기 TCR α 쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 51 내지 77, 91 및 92로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나; 상기 TCR β 쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 78 내지 88 및 93 내지 101로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, T 세포 수용체.
  24. 제1항에 있어서,
    상기 T 세포 수용체는 하기 TCR로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, T 세포 수용체:
    Figure pct00015
  25. 제1항에 있어서,
    상기 T 세포 수용체는 단일 쇄 TCR인 것을 특징으로 하는, T 세포 수용체.
  26. 제1항에 있어서,
    상기 T 세포 수용체는 α 쇄 가변 영역 및 β 쇄 가변 영역으로 구성된 단일 쇄 TCR이고, 상기 α 쇄 가변 영역 및 β 쇄 가변 영역은 플렉서블 짧은 펩티드 서열(flexible short peptide sequence: linker)에 의해 연결되는 것을 특징으로 하는, T 세포 수용체.
  27. 제1항에 있어서,
    상기 TCR α 쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 9 내지 35로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나; 상기 TCR β 쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 36 내지 46으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, T 세포 수용체.
  28. 제1항에 있어서,
    상기 T 세포 수용체는 하기 TCR로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, T 세포 수용체:
    Figure pct00016
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 T 세포 수용체의 α 쇄 및/또는 β 쇄의 C- 또는 N-말단에는 접합체가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는, T 세포 수용체.
  30. 제29항에 있어서,
    상기 T 세포 수용체에 결합하는 접합체는 검출 가능한 마커, 치료제, PK 변형 부분 또는 이들의 임의의 조합인 것을 특징으로 하는, T 세포 수용체.
  31. 제30항에 있어서,
    상기 T 세포 수용체에 결합하는 치료제는 상기 T 세포 수용체의 α 쇄 또는 β 쇄의 C- 또는 N-말단에 연결된 항-CD3 항체인 것을 특징으로 하는, T 세포 수용체.
  32. 2개 이상의 T 세포 수용체 분자를 포함하고, 그 중 하나 이상의 T 세포 수용체 분자는 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 T 세포 수용체인 것을 특징으로 하는, 다가 T 세포 수용체 복합체.
  33. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 T 세포 수용체를 코딩하는 핵산 서열 또는 이의 상보성 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
  34. 제33항에 따른 핵산 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  35. 제34항에 따른 벡터를 포함하거나, 게놈에 통합된 외인성인 제33항에 따른 핵산 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
  36. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 T 세포 수용체를 발현하는 것을 특징으로 하는 단리된 세포.
  37. 약학적으로 허용 가능한 담체, 및 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 T 세포 수용체, 제32항에 따른 T 세포 수용체 복합체, 또는 제36항에 따른 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  38. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 T 세포 수용체, 제32항에 따른 T 세포 수용체 복합체, 제36항에 따른 세포, 또는 제37항에 따른 약학 조성물을 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 질환의 치료 방법.
  39. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 T 세포 수용체, 제32항에 따른 T 세포 수용체 복합체, 또는 제36항에 따른 세포의 용도로서,
    상기 용도는 종양을 치료하는 약물을 제조하기 위한 것이고, 바람직하게는 상기 종양은 간암인 것을 특징으로 하는, 용도.
  40. 종양을 치료하는 약물로 사용되고, 바람직하게는 상기 종양은 간암인 것을 특징으로 하는 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 T 세포 수용체, 제32항에 따른 T 세포 수용체 복합체, 또는 제36항에 따른 세포.
  41. (i) 제35항에 따른 숙주 세포를 배양하여 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 T 세포 수용체를 발현하는 단계; 및
    (ii) 상기 T 세포 수용체를 단리하거나 정제하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는, 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 T 세포 수용체의 제조 방법.
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