CN113646008A - pHLIP®肽介导的细胞表面的表位束缚 - Google Patents
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Abstract
Description
相关申请
本申请请求依据35 U.S.C.§119(e)于2019年1月28日提交的美国临时申请第62/797,899号的权益,其整体内容通过引用并入本文中。
联邦资助研究的声明
本发明在美国国立卫生研究院的国立普通医学科学研究所授予R01 GM073857的政府资助下完成。美国政府享有本发明的特定权利。
作为引用并入的序列表
名称为“040984-512001WO_SL.txt”的序列表的文字文件的内容为2020年1月28日建立的,且其大小为222字节,其整体通过引用并入本文中。
技术领域
本发明关于免疫治疗。
背景技术
抗体治疗基于信号传送的改变、细胞凋亡的促进、生长因子的隔离(sequestration)、免疫系统的激活以及以抗体-药物接合物(ADC)的药物递送。抗体通过识别细胞所暴露的特定信号传送分子(表位)找到其等靶向细胞。表位接合及/或吸引内源性(天然)抗体、外源性抗体、施用至身体的ADC或于接种疫苗的过程中产生(制造)的抗体。此外,细胞因子为可根据其等特征、浓度和局部环境激活或抑制免疫反应的小免疫调节蛋白质。众多高度特异性的人源化单克隆抗体,例如曲妥珠单抗(trastuzumab)(赫赛汀,Herceptin),以及抗体-细胞因子融合蛋白已发展且于临床使用(或临床试验),其靶向于病变组织中相较于正常组织中更丰富的表位。然而,其等的使用受限于(1)于许多癌症中缺乏足够数量(或任何数量)的可接近表位;以及(2)由选择未呈现适当表位的表达突变体而出现抗性。
发明内容
本发明提供一种现有治疗方法的限制的解决方案,通过使用将所需表位定位于例如肿瘤或发炎组织的病变组织的细胞表面上。将所述表位定位于细胞表面上(例如,优先于病变组织中)为很大的优点,且增强免疫系统或内源性抗体的细胞的募集,以及增强开发的单克隆抗体,例如,曲妥珠单抗(赫赛汀)、抗体-药物接合物及疫苗接种过程中产生的抗体的用途。本发明还提供增加于细胞表面的特定表位的任何数量的组合物及方法,用于免疫调节及免疫细胞、抗体与ADC的有效结合。
本文提供以例如蛋白质、肽或小分子表位的表位修饰靶向细胞的组合物及方法,其可(1)招募免疫细胞(或外源性工程化T细胞及NK细胞)、(2)招募内源性抗体、(3)增强施用至身体内的外源性抗体或ADC的使用,以及(4)增强导致细胞死亡的疫苗接种过程中产生(制造)的抗体的使用。
肿瘤的特征为肿瘤微环境(TME)的pH值低于周围组织,因为代谢作用伴随着它们快速且不受控制的细胞增殖,导致肿瘤细胞及/或与肿瘤相关或浸润肿瘤的巨噬细胞出现酸性流。此外,由于所述流及膜电位,相较于相同组织类型的正常组织,癌细胞表面的细胞外pH值为最低(意指所述pH值于细胞膜附近区域或者pH值即于细胞膜附近所测量的),且显著低于肿瘤中的整体细胞外pH值(与细胞膜一定距离的pH值)。即使于良好灌流的肿瘤范围中,低pH值区域持续存在于所述癌细胞表面。
低pH插入肽为一种水溶性膜肽,其于中性pH下与细胞膜微弱地相互作用,不会插入脂双层;然而,于微酸pH下,插入细胞膜中,及如果其够长且非环状,能形成稳定的穿膜α螺旋。除了以低pH(<7.0)为特征的肿瘤细胞外,肿瘤肿块内的免疫细胞亦以低pH(<7.0)为特征。举例而言,肿瘤肿块的环境中的细胞,例如,巨噬细胞,亦以低pH为特征。
通过将或等效物结合(连接及/或接合)至表位,可以特异性靶向细胞且以表位修饰发炎组织中的肿瘤细胞,以识别或招募血液中循环的内源性(天然)免疫细胞或抗体,促进或增强施用至体内的外源性工程化T细胞及NK细胞或抗体或ADC,或者于疫苗接种过程中产生的抗体的结合,从而促进细胞杀伤。此方法的显著优点为本文描述的构建体由于表位靶向递送至细胞表面,故对病患几乎没有副作用。所述表位可为哺乳动物来源、病毒来源或细菌来源。
因此,本发明的特征为一种包括接合至包含至少4个氨基酸的pH-触发膜肽的组合物。举例而言,所述肽可为线形肽或环状肽,例如,如PCT专利申请第PCT/US2017/023458号所描述者。所述表位通过选择性地定位于靶向病变组织中的细胞表面,以介导或增强免疫细胞(淋巴细胞)的募集和接着、抗体的结合,以及诱导主要于病变组织(肿瘤)中的细胞杀伤。所述组合物包括接合至的表位,且所述靶向细胞表面的表位。
因此,于个体中引起抗肿瘤反应的方法包括向例如人类个体的个体施用构建体,其包括通过不可裂解连接子化合物连接至一种或更多肽的抗体或淋巴细胞招募分子,其中,所述构建体增加病变细胞的表面上的免疫细胞或抗体招募分子的量,例如,所述病变细胞包括肿瘤细胞。
于一些实施例中,所述抗体招募分子包括表位,例如,具有小于500氨基酸的长度的表位(例如,肽表位)。举例而言,所述肽表位包括位于5至20个氨基酸之间的长度,例如,5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。于一些实施例中,所述肽表位为人类表皮生长因子2(HER2)肽,例如,选自由QVSHWVSGLAEGSFG(SEQ ID NO:1)、LSHTSGRVEGSVSLL(SEQ ID NO:2)及QMWAPQWGPD(SEQ ID NO:3)所组成群组的HER2肽。
HER2的人类氨基酸序列提供于下且通过引用并入本文中(NCBI GenBank NP_001005862.1或UniProt P04626)。
(SEQ ID NO:__)
HER2的例示性标志残基、结构域及片段包括但不限于残基22至143(受体L结构域)、残基159至308(弗林(furin)样结构域)或611至654(Erb2(受体酪氨酸-蛋白激酶)的跨膜结构域)。HER2蛋白的片段(例如,肽或表位)小于全长蛋白质的长度,例如,片段的长度为至少3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200或更多个残基,但如上述HER2的情况中小于1225个残基。此外,HER2可包括信号序列(melaalcrwglllallppgaastqvctgtd SEQ ID NO:516,其经切割以形成成熟蛋白质)。
所述人类HER2核酸序列提供于下且通过引用并入本文中(起始及终止密码子为底线;NCBI GenBank;NM_001005862.2)。
(SEQ ID NO:514)
HER2的例示性标志残基、结构域及片段包括但不限于残基57至4254(编码区域)、残基4767至4772(聚A信号序列)、4787(聚A位点)或4872(聚A位点)。
于其它实施例中,所述肽(表位肽)包括哺乳动物的肽、病毒的肽或细菌的肽。例如,所述肽选自由MASMTGGQQMG(SEQ ID NO:4)-衍生自T7主要衣壳蛋白的T7肽;EQKLISEEDL(SEQ ID NO:5)-衍生自c-Myc的Myc肽;YPYDVPDYA(SEQ ID NO:6)-衍生自血凝素的血凝素(HA)肽;YTDIEMNRLGK(SEQ ID NO:7)-衍生自水泡性口炎病毒糖蛋白的水泡病毒(VSV-G)肽;KETAAAKFERQHMDS(SEQ ID NO:8)-衍生自胰核糖核酸酶A的S肽;GKPIPNPLLGLDST(SEQID NO:9)-衍生自猿猴病毒5副粘病毒的P及V蛋白的V5肽;DYKDDDDK(SEQ ID NO:10)-FLAG合成肽;GAPVPYPDPLEPR(SEQ ID NO:11)-E合成肽;HHHHHH(SEQ ID NO:12)-组氨酸合成肽;TKENPRSNQEESYDDNES(SEQ ID NO:13)–NE-标记(tag)合成肽;WSHPQFEK(SEQ ID NO:14)-由链霉亲合素所识别的合成肽;PDRVRAVSHWSS(SEQ ID NO:15)-衍生自β-连环蛋白且针对结合至Spot-标记纳米抗体的更高亲和力进行优化的肽;及YTDIEMNRLGK(SEQ ID NO:7)-水泡性口炎病毒(VSV)合成肽所组成的群组。
于一些实施例中,所述免疫细胞(例如,淋巴细胞)招募分子包括细胞因子蛋白或细胞因子蛋白表位。举例而言,所述细胞因子蛋白小于200个氨基酸。于其它实施例中,所述细胞因子蛋白高达350个氨基酸。例示性细胞因子蛋白表位包括白细胞介素2(IL-2)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素-7(IL-7)、白细胞介素-12(IL-12)、肿瘤坏死因子(TNF)或包括α-趋化因子或CXC趋化因子以及β-趋化因子或CC趋化因子的趋化因子,其中,CXC代表Cys-X-Cys基序,其中,CC代表靠近其等氨基末端的Cys-Cys基序。
例示性趋化因子包括人类蛋白表位C-X-C基序趋化因子10(CXCL10)或干扰素γ诱导蛋白10(IP-10)(UniProt P02778或NP_001556.2,通过引用并入本文中),以及例示性序列包括氨基酸序列:
(SEQ ID NO:514)
CXCL10的例示性标志残基、结构域及片段包括但不限于残基1至21(信号肽)、残基22至98(成熟肽)。CXCL10蛋白的片段(例如,肽或表位)小于全长蛋白的长度,例如,片段的长度至少3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100或更多个残基,但如于上述CXCL10的情况下小于108个残基。
人类CXCL10核酸序列提供于下且通过引用并入本文中(起始即终止密码子为底线;NCBI GenBank:NM_001565.4)。
(SEQ ID NO:517)
CXCL10的例示性标志残基、结构域及片段包括但不限于残基67至129(信号肽)、残基130至360(成熟肽)或残基67至363(编码区域)。
CXCL9的人类氨基酸序列提供于下且通过引用并入本文中(NCBI GenBank NP_002407.1或UniProt Q07325):
(SEQ ID NO:518)
CXCL9的例示性标志残基、结构域及片段包括但不限于残基1至22(信号肽)或残基23至125(成熟肽)。CXCL蛋白的片段(例如,肽或表位)小于全长蛋白的长度,例如,片段的长度至少3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100或更多个残基,但如于上述CXCL9的情况下小于125个残基。
人类CXCL9核酸序列提供于下且通过引用并入本文中(起始及终止密码子为底线;NCBI GenBank:NM_002416.3)。
SEQ ID NO:519
CXCL9的例示性标志残基、结构域及片段包括但不限于残基61至126(信号肽)或残基127至435(成熟肽)。
CXCL11的人类核酸序列提供于下且通过引用并入本文中(NCBI GenBank NP_005400.1或UniProt O14625):
(SEQ ID NO:520)
CXCL11的例示性标志残基、结构域及片段包括但不限于残基1至21(信号肽)、残基22至94(成熟肽)或残基28至90(趋化因子-CXC结构域)。CXCL11蛋白的片段(例如,肽或表位)小于全长蛋白的长度,例如,片段的长度至少3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、75或更多个残基,但如于上述CXCL11的情况下小于94个残基。
人类CXCL11核酸序列提供于下且通过引用并入本文中(起始及终止密码子为底线;NCBI GenBank:NM_005409.5)
SEQ ID NO:521
CXCL11的例示性标志残基、结构域及片段包括但不限于残基84至146(信号肽)或残基147至365(成熟肽)。
肿瘤坏死因子(TNF)的人类氨基酸序列提供于下且通过引用并入本文中(NCBIGenBank NP_000585.2或UniProt P01375):
(SEQ ID NO:522)
TNF的例示性标志残基、结构域及片段包括但不限于残基1至35(细胞质结构域)、残基36至56(螺旋跨膜结构域)及残基57至233(细胞外结构域)。TNF蛋白的片段(例如,肽或表位)小于全长蛋白的长度,例如,片段的长度至少3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200或更多个残基,但如于上述TNF的情况下小于233个残基。
人类TNF核酸序列提供于下且通过引用并入本文中(起始及终止密码子为底线;NCBI GenBank:NM_000594.4)。
SEQ ID NO:523
TNF的例示性标志残基、结构域及片段包括但不限于残基280至285(TNF结构域)或残基458至1678(外显子)。
IL-2的人类氨基酸序列提供于下且通过引用并入本文中(NCBI GenBank NP_000577.1或UniProt P60568)
(SEQ ID NO:__)
IL-2的例示性标志残基、结构域及片段包括但不限于残基1至20(信号肽)、残基21至153(成熟肽)或残基23(糖基化位点)。IL-2蛋白的片段(例如,肽或表位)小于全长蛋白的长度,例如,片段的长度至少3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、153或更多个残基,但如于上述IL-2的情况下小于153个残基。
人类IL-2核酸序列提供于下且通过引用并入本文中(起始及终止密码子为底线;NCBI GenBank:NM_000586.4)
IL-2的例示性标志残基、结构域及片段包括但不限于残基286至345(信号肽)、残基346至744(成熟肽)或残基286至747(编码区域)。
IL-6的人类氨基酸序列提供于下且通过引用并入本文中(NCBI GenBank NP_000591.1或UniProt P05231)。
(SEQ ID NO:__)
IL-6的例示性标志残基、结构域及片段包括但不限于残基1至29(信号肽)、残基30至212(成熟肽)或残基73(糖基化位点)。IL-6蛋白的片段(例如,肽或表位)小于全长蛋白的长度,例如,片段的长度至少3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200或更多个残基,但如于上述IL-6的情况下小于212个残基。
人类IL-6核酸序列提供于下且通过引用并入本文中(起始及终止密码子为底线;NCBI GenBank:NM_000600.5)
(SEQ ID NO:__)
IL-6的例示性标志残基、结构域及片段包括但不限于残基64至150(信号肽)、残基151至699(成熟肽)或64至702(编码区域)。
IL-7的人类氨基酸序列提供于下且通过引用并入本文中(NCBI GenBank NP_000871.1或UniProt P13232)
(SEQ ID NO:__)
IL-7的例示性标志残基、结构域及片段包括但不限于残基1至25(信号肽)、残基26至177(成熟肽)或残基95(糖基化位点)。IL-7蛋白的片段(例如,肽或表位)小于全长蛋白的长度,例如,片段的长度至少3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、150或更多个残基,但如于上述IL-7的情况下小于177个残基。
人类IL-7核酸序列提供于下且通过引用并入本文中(起始及终止密码子为底线;NCBI GenBank:NM_000880.4)
IL-7例示性标志残基、结构域及片段包括但不限于残基542至616(信号肽)、残基617至1072(成熟肽)或542至1075(编码区域)。
IL-12α亚基的人类氨基酸序列提供于下且通过引用并入本文中(UniProtP29459)。
(SEQ ID NO:493)
IL-12α亚基的例示性标志残基、结构域及片段包括但不限于残基1至22(信号肽)或残基23至219(成熟肽)。IL-12α亚基的片段(例如,肽或表位)小于全长蛋白的长度,例如,片段的长度至少3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200或更多个残基,但如于上述IL-12的情况下小于219个残基。
人类IL-12α亚基核酸序列提供于下且通过引用并入本文中(起始及终止密码子为底线;NCBI GenBank:AF101062.1)
(SEQ ID NO:__)
IL-12α亚基的例示性标志残基、结构域及片段包括但不限于残基1至762(编码区域)或残基1至203(白细胞介素结合区域)。
IL-12β亚基的人类氨基酸序列提供于下且通过引用并入本文中(UniProtP29460)。
(SEQ ID NO:524)
IL-12β亚基的例示性标志残基、结构域及片段包括但不限于残基1至22(信号肽)或残基23至328(成熟肽)。IL-12β亚基的片段(例如,肽或表位)小于全长蛋白的长度,例如,片段的长度至少3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200或更多个残基,但如于上述IL-12β亚基的情况下小于328个残基。
人类IL-12β亚基核酸序列提供于下且通过引用并入本文中(起始及终止密码子为粗体及底线;NM_002187.3)
SEQ ID NO:525
IL-12β亚基的例示性标志残基、结构域及片段包括但不限于残基57至122(信号肽)或残基123至1040(成熟蛋白)。
于本发明的其它方面中,本文描述的方法包括施用包含连接至一种或多种肽的抗体招募分子的构建体。举例而言,所述抗体招募分子包括表位,包括例如小分子(或者,“小分子抗原”)。例如,所述小分子表位包括二-硝基苯基(DNP)基团或其衍生物。如本文中所用,术语“DNP”及“2,4-DNP”可互换地指2,4-二硝基苯酚、其盐、溶剂化物或加合物。
于实施例中,所述小分子表位包括O-(2,4-二硝基苯基)羟基胺(结构提供如下):
于实施例中,本申请的组合物包括经修饰的DNP,例如,接合至可用于本申请中的聚乙二醇者。于本申请的组合物中的所述DNP、DNP衍生物或其盐可具有200Da至1,000Da或200Da至500Da的范围内的分子量。
于一些实施例中,所述DNP衍生物可为经例如烷基基团、亚烷基基团、杂烷基基团、环烷基基团、芳基基团或其任合组合所取代的。
亦于本发明内的为一种于个体中引起抗肿瘤反应的组合物,包括通过不可裂解连接子化合物连接至一种或更多肽的抗体或免疫细胞招募分子。本文亦提供促进免疫反应的方法。举例而言,所述方法包括施用包括表位的组合物,所述表位包含至少4个接合至肽的氨基酸。所述肽将表位定位于病变组织中的靶向细胞的表面,以主要于病变组织中诱导免疫反应。举例而言,假设所述表位为肽,其可添加于pHLIP肽的非插入端的扩增。此外,所述表位接着与内源性或外源性免疫细胞、例如于个体的体内中既有的抗体和蛋白质的内源性抗体及蛋白质或施用至体内的外源性抗体或于疫苗接种过程中产生的抗体交互作用,接着诱导免疫反应。本文亦提供以ADC促进细胞毒性药物的递送的方法,以诱导细胞杀伤。又,所述表位与施用至体内的ADC交互作用,接着诱导细胞杀伤。
此外,本文提供治疗具有天然酸性细胞外环境的病变组织或具有相对于个体的正常生理pH值的人工诱导酸性细胞外环境的组织的方法。举例而言,所述组合物招募所述个体的免疫细胞、内源性抗体及诱导免疫反应的蛋白,从而治疗所述个体中的病变组织。所述免疫反应可包括例如,补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞介导细胞毒性(ADCC)的起始或者细胞因子或促进T细胞或NK细胞反应的发炎介质的释放。所述免疫反应可包括例如T细胞及NK细胞的归巢及其等的激活。亦如上所述,所述组合物促进抗体-药物接合物与靶向组织中的细胞的结合,因此促进细胞杀伤。
亦于本发明内的为一种增强(增加)个体中的免疫反应的方法,包括向所述个体施用组合物,其包括连接至如上所述的肽的表位。于一些实施例中,所述组合物使用本领域已知的方法施用,例如,所述组合物直接注射至肿瘤肿块。或者,所述组合物为全身施用。
本文提供的制剂可包括表位-连接子-肽,其中,“肽”为肽。亦提供适合静脉内、皮下、动脉内、腹膜内、脑内、脑室内、鞘内、心内、海绵体内、骨内、眼内或玻璃体内施用的制剂。于一些实施例中,制剂用于肌内、皮内、经皮、经粘膜、病灶内、皮下、局部、表皮、羊膜外、阴道内、膀胱内、鼻或口服施用。本主题亦包括膀胱内灌注的制剂。于一些实施例中,所述制剂用于癌症治疗(例如,实体肿瘤)。
本文提供于个体中治疗癌症或发炎的方法,包括向所述个体施用有效量的连接至表位的pH-触发化合物(肽)(“构建体”),其接着由递送至细胞的表面。举例而言,所述癌症包括实体肿瘤。癌症的非限制性实例包括结肠癌、前列腺癌、乳癌、膀胱癌、肺癌、皮肤癌、肝癌、骨癌、卵巢癌、胃癌、胰脏癌、睾丸癌及脑癌。
相较于健康组织,所述组合物优先靶向病变组织,从而最小化健康组织的损伤。举例来说,所述组合物选择性促进例如肿瘤细胞的病变组织中的细胞杀伤。
本文所包括的药物组合物包括连接至表位的pH-触发肽以及药学上可接受的载体。
如本文中所用,当“有效”指化合物的含量时是指,当以本申请的方法使用时,足以产生所需反应,而不具有与合理的益处/风险比相称的过度的不良副作用(例如,毒性、刺激或过敏反应)的化合物的量。
于一些实施例中,个体为哺乳动物。于特定实施例中,所述哺乳动物为啮齿动物(例如,小鼠或大鼠)、灵长类动物(例如,黑猩猩、大猩猩、猴子、长臂猿、狒狒)、牛、骆驼、狗、猫、马、羊驼(llama)、绵羊、山羊或猪。于优选实施例中,所述个体为人类。
于一些实施例中,所述外源性细胞或单克隆抗体或抗体-药物接合物于所述表位肽构建体的施用期间或之后施用至所述个体。于一些实施例中,所述个体包括如对于所述肽构建体的表位的既有内源性抗体或免疫细胞。或者,所述个体不包括对于由所述构建体所递送的表位的现有抗体(于初始施用的时间)。于所述实施例中,个体可使用表位免疫以产生抗体反应,且接着向所述个体施用-表位构建体。于所述实施例中,所述构建体于以未与接合的形式的抗原表位的施用后施用所述构建体。
本文揭示的每个实施例预期适用于每个其它公开的实施例,故本文描述的各种元素的所有组合均于本发明的范围内。
由以下优选实施例的描述以及自权利要求书,本发明的其它特征及优点为显而易见。除非另外定义,本文使用的所有技术及科学用语具有与本发明所属领域技术人员所通常理解的相同意义,虽然本发明的实施或测试中可以使用相近或等于本文所述的那些方法和材料,但下文描述合适的方法和材料。
附图说明
图5B为通过束缚至细胞表面的两个表位以结合一个抗体分子的两头的示意图。结果为,靶向细胞经表位及内源性(天然)抗体、外源性抗体、施用至体内的ADC及疫苗接种过程产生(制造)的抗体所修饰,结合至所述靶向细胞以促进细胞杀伤。
图6绘示得自肿瘤球状体的荧光(647nm)图像,其经抗-DNP荧光抗体、DAPI或与DNP-PEG12-构建体预混的抗-DNP荧光抗体处理,接着洗涤及成像(上图),以及先经DNP-DNP-PEG4-或DNP-PEG12-处理,洗涤,接着以抗DNP荧光抗体处理,之后洗涤并成像球状体(下图)。
具体实施方式
表位结合及/或吸引外源性免疫细胞(T细胞或NK细胞)或外源性开发的单克隆抗体或于表位-化合物的施用期间或之后施用至体内的抗体-药物接合物,以及选择性促进细胞杀伤同时避开正常组织。这些表位中包括开发的单克隆抗体。
表位结合及/或吸引内源性(天然)免疫细胞(淋巴细胞)或已存在于血液中的内源性抗体,以及选择性启动特定免疫反应,以攻击肿瘤同时避开正常组织。于这些表位中为有关动物细胞及细菌的表面的表位。于许多情况中,人类已经开发血流中的抗体,其识别所述表位。根据本文所述的方法递送的表位亦可结合/吸引内源性抗体,其于疫苗接种过程中产生(制造)。所述表位(任何接种疫苗所使用的抗原分子)连接(接合)至肽且递送至肿瘤,以于靶向组织内促进免疫反应,例如,通过使用利用产生针对病毒表面表位的抗体流感疫苗。于一些实施例中,个体使用所选择的抗原免疫,接着通过肽靶向的抗原,其靶向肿瘤细胞。
修饰酸性病变细胞
酸性病变细胞,例如,使用表位-肽组合物靶向癌细胞,通过反应细胞表面酸度、插入癌细胞膜以及于细胞表面定位/放置于特定表位,使所述肽靶向肿瘤,以诱导且促进细胞反应,包括免疫刺激及细胞增殖的抑制。所述免疫刺激导致细胞毒性及酸性病变细胞的死亡。
治疗使用的例示性组合物的代表显示于图1至4中。所述组合物包括肽(或接合物,其中,所述肽连接至表位,以于病变细胞的表面递送/定位)。本文描述的肽及美国专利第9,814,781号及第9,289,508号(通过引用并入本文)以及美国专利公开第20180117183号、第20180064648号、第20180221500号、第20180117183号、第20180064648号、第20160256560号、第20150191508号、第20150051153号、第20120142042号、第20120039990号及第20080233107号,以及PCT专利申请第PCT/US2017/023458号(环肽),通过引用将其各自并入本文中。
例示性组合物包括下式:
表位–连接子–肽
所述“表位”可包括肽、蛋白或其片段,或例如有机分子的小分子,通过吸引内源性(既有的)免疫细胞或抗体、外源性(如同基于被动抗体的免疫疗法所施用)工程化免疫细胞或纯化抗体、施用至人类的ADC或接种疫苗过程产生的抗体,以诱导免疫反应或促进细胞杀伤。
“肽”为肽(非限制性实例为包括序列AXDDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWA(SEQ ID NO:18)或AXDQDNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWA(SEQ ID NO:__)的肽),其中,“X”为官能性基团,例如,出于接合目的,选自赖氨酸(Lys)、半胱氨酸(Cys)或含叠氮氨基酸。于一些情况中,“肽”为接合物,其中,所述肽与药物分子连接以细胞内递送。
“连接子”包括共价键或化学连接子,或者肽的膜非插入侧翼区域的延伸。假设所述表位为肽或蛋白,其可构建为所述肽的延伸,且可不需要连接子。连接子的非限制性实例为具有200Da至20kDa尺寸的聚乙二醇(PEG)。延伸的非限制性实例为聚甘氨酸多肽。表位亦通过不可裂解连接与肽连接。
连接子的非限制性实例为具有高分子量的粘蛋白结构域,大部分人类的上皮组织所产生的高度糖基化蛋白(糖接合物)。于其它实施例中,所述连接子可包括生物聚合物,包括例如纤维素、淀粉或甲壳素。
例示性组合物包括下式:
表位2–连接子2–Pept
所述“表位”可包括肽、蛋白或其片段,或例如有机分子的小分子,通过吸引内源性(既有的)免疫细胞或抗体、外源性(如同基于被动抗体的免疫疗法所施用)工程化免疫细胞或纯化抗体、施用至人类的ADC或接种疫苗过程产生的抗体,以诱导免疫反应或促进细胞杀伤。
“肽”为肽(非限制性实例为包括序列AX(Z)nXPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWA(SEQ ID NO:__)的肽),其中,大写“X”表示任何氨基酸残基,且可包括赖氨酸(Lys)、半胱氨酸(Cys)或含叠氮氨基酸。所述X可用于与另一单体的接合。“Z”表示任何氨基酸残基,且n可为位于且包括1至10之间的任何整数(例如,1≤n≤10)。举例而言,(Z)n可为QDNDQN(SEQ ID NO:__)或包括D、E、N或Q的极性氨基酸残基的任何组合。
如果化合物的log P小于-0.4,所述化合物的特征为极性。所述表位化合物可具有中等疏水性。极性:LogP<-0.4;中等疏水性:2.5<LogP<-0.4;以及疏水性:LogP>2.5。表位的极性及/或疏水性使用本领域已知的方法进行测量,例如,通过测定LogP,其中,P为辛醇-水分配系数。将物质溶解于辛醇-水混合物中,混合并达到平衡。接着测量物质于每个(或一个)相的数量。测量本身可为本领域中已知的多种方法,例如,通过测量吸光度或使用NMR、HPLC或其它已知方法测定数量。如本文中所述,举例而言,中等疏水性定义为具有2.5至-0.4的范围内的LogP值的分子,具有很多实例。
连接子为连接子,其中,所述连接子为聚乙二醇,PEG。举例而言,式PEGm,包括“m”可为位于且包括12及24之间的任何整数(例如,12≤m≤PEG12-24聚合物)。每个“–”可为共价键。
当表位通过PEG12-24连接子接合至所述肽,以及6至8个残基定位于表位-PEG与所述肽的接合之间时,表位之间的距离可为5至25nm之间的范围。或者,距离可为10nm或10至15nm,其对应抗体的两个抗原结合位点结合位点之间的典型距离。
表位的非限制性实例如下:
肽抗原,例如,具有小于50个氨基酸残基的长度的肽,例如,具有大于5且小于20、小于15、小于10或小于8个氨基酸残基的肽抗原。
HER2(亦称为受体酪氨酸-蛋白激酶erbB-2或人类表皮生长因子2)
跨膜酪氨酸基梅受体的HER2家族由4个成员组成,BER1至HER4。HER2为配体-孤儿受体,其表达于许多人类肿瘤中且于20至30%的乳癌中过度表达。通过形成异源二聚体,HER2放大HER家族的其它受体所提供的信号。HER2于HER信号传送网络中的作用导致癌症治疗的抗-HER2单克隆抗体(MAb)的开发。特别而言,人源化Mab曲妥珠单抗(赫赛汀)或赫赛汀-药物接合物具有针对HER2-过表达人类乳癌肿瘤细胞的抗肿瘤活性,且广泛用于具有HER2过表达乳癌的女性的治疗。曲妥珠单抗的主要作用之一为通过ADC的使用以诱导抗体依赖性细胞毒性或促进细胞杀伤。此外,曲妥珠单抗诱导HER2受体下行调节、抑制关键的信号传送途径(即,ras-Raf-MAPK及PI3K/Akt)以及通过诱导p27/Cdk2复合物的形成阻挡细胞周期进程,抑制HER2裂解,于抗体诱导的受体下行调节之前,这也可能有助于其於一些癌症中的抗肿瘤活性。曲妥珠单抗的限制在于其活性主要受限于具有最高HER2过表达水平的乳癌。
如上所述,针对HER2受体的人源化抗体已开发于治疗HER2阳性乳癌。然而,并非所有乳癌均为HER2-阳性,有些为HER2阴性,且于一些情况中,HER2-阳性肿瘤可能于治疗期间转化为HER2阴性肿瘤。此外,许多其它肿瘤为HER2阴性。本文所述的构建体/接合物以HER2表位修饰所有癌细胞(不论组织或器官),以增强抗体治疗。有用的表位包括受体结合位点的小肽模拟物或蛋白-肽融合构建体,其中,所述蛋白类似于受体的整个细胞外结构域或其部分。
HER2模拟肽的非限制性实施例,其显示结合至抗-HER-2单克隆抗体的高亲和力。曲妥珠单抗(赫赛汀)包括下列肽:
QVSHWVSGLAEGSFG(SEQ ID NO:1)
LSHTSGRVEGSVSLL(SEQ ID NO:2)
QMWAPQWGPD(SEQ ID NO:3)
所述构建体可用于以HER2表位修饰所有癌细胞,以增强抗体治疗。有用的表位包括受体结合位点的小肽模拟物或蛋白-肽融合构建体,其中,所述蛋白类似于受体的整个细胞外结构域或其部分。额外的策略包括使用肽以定位使用ADC治疗的表位,其中一些已被批准于临床使用,包括曲妥珠单抗emtansine,与细胞毒性maytansinois药物(DM1或美登素(mertansine))接合的抗-HER2抗体,所述细胞毒性maytansinois药物为一种有效的微管蛋白抑制剂。通过靶向已经使用中的表位,或者通过发展针对新表位的ADC,ADC的有效用途显著扩展。其它单克隆抗体开发于癌症治疗。
除了抗-HER2抗体,针对目前临床用于癌症治疗的不同受体的单克隆抗体的非限制性实例包括daratumumab(结合CD38–分化簇38);dinutuximab(结合至糖脂GD2-神经节苷脂);贝伐珠单抗(bevacizumab)(结合至VEGF-A–血管内皮生长因子);西妥昔單抗(cetuximab)、necitumumab及帕尼單抗(panitumumab)(结合至EGFR–表皮生长因子);elotuzumab(结合至CD319–分化簇319)、necitumumab(结合EGFR)、雷莫芦单抗(ramucirumab)(结合至VEGFR2)。表位-构建体可发展为用于所有这些抗体及其等药物接合物。
肽表位的其它实施例
MASMTGGQQMG(SEQ ID NO:4):衍生自T7主要衣壳蛋白的T7肽;
EQKLISEEDL(SEQ ID NO:5):衍生自c-Myc的Myc肽;
YPYDVPDYA(SEQ ID NO:6):衍生自血凝素的血凝素(HA)肽;
YTDIEMNRLGK(SEQ ID NO:7):衍生自水泡性口炎病毒糖蛋白的水泡病毒(VSV-G)肽;
KETAAAKFERQHMDS(SEQ ID NO:8):衍生自胰核糖核酸酶A的S肽;
GKPIPNPLLGLDST(SEQ ID NO:9):衍生自猿猴病毒5副粘病毒的P及V蛋白的V5肽;
PDRVRAVSHWSS(SEQ ID NO:15):衍生自β-连环蛋白且针对结合至Spot-标记纳米抗体的更高亲和力进行优化的肽;
DYKDDDDK(SEQ ID NO:10):FLAG合成肽;
GAPVPYPDPLEPR(SEQ ID NO:_):E合成肽;
HHHHHH(SEQ ID NO:12):组氨酸合成肽;
TKENPRSNQEESYDDNES(SEQ ID NO:13):NE合成肽;
WSHPQFEK(SEQ ID NO:14):由链霉亲合素所识别的合成肽;
YTDIEMNRLGK(SEQ ID NO:7):水泡性口炎病毒(VSV)合成肽。
除了肽表位以外,较大的含表位细胞因子蛋白亦可用于制备本文所述的组合物。细胞因子为5至20kDa之间的小蛋白,其为免疫调节作用。于细胞因子蛋白中为IL-17、TNF、CXCL及CCL趋化因子。
编码CXCL10趋化因子的核酸序列及蛋白质抗原的核苷酸序列揭示于下:
ccagtctcagcaccatgaatcaaactgccattctgatttgctgccttatctttctgactctaagtggcattcaaggagtacctctctctagaactgtacgctgtacctgcatcagcattagtaatcaacctgttaatccaaggtctttagaaaaacttgaaattattcctgcaagccaattttgtccacgtgttgagatcattgctacaatgaaaaagaagggtgagaagagatgtctgaatccagaatcgaaggccatcaagaatttactgaaagcagttagcaaggaaaggtctaaaagatctcct
SEQ ID NO:498
CXCL 10的氨基酸序列提供如下。
mnqtailicc lifltlsgiq gvplsrtvrc tcisisnqpv nprsleklei
ipasqfcprv eiiatmkkkg ekrclnpesk aiknllkavs kerskrsp(SEQ ID NO:514)
小分子抗原或表位
小分子抗原为其特征为分子量小于2000道尔顿者。例如,所述小分子抗原的分子量优选小于1000道尔顿,更优选小于600道尔顿,例如,化合物为小于500道尔顿、400道尔顿、300道尔顿、200道尔顿或100道尔顿。一些小分子抗原的特征为其等结合至许多正常人类(或特征为具有病理性肿瘤的人类)的血液或血清内的内源性抗体。
例示性小分子表位描述于下。
二-硝基苯基(DNP)
DNP的抗体(O-(2,4-二硝基苯基)羟基胺,显示于下)已于正常人类血清的IgG部分中所识别。
因此,结合内源性抗体的另一小分子抗原为二硝基苯基(DNP)及其衍生物。例如,N-(4-二甲基氨基-3,5-二硝基苯基)马来酰亚胺显示于下:
或者,DNP-PEG4-NHS(1-(2,4-二硝基苯基氨基)-3,6,9,12-四氧十五烷酸琥珀酰亚胺酯)显示于下:
DNP为低分子量的抗原,以其结合正常人类血清中的抗体的能力而闻名。抗体与递送至肿瘤或其它病变酸性细胞表面的DNP的结合导致抗原标记的靶向细胞的细胞毒性。所述DNP招募内源性抗体,例如,于施用本文所述的肽构建体之前存在于个体中的抗体。
连接子
于示意结构中,表位–连接子–肽:
连接子可为相对小的,例如,仅有几个原子,形成相当大的极性(或中等疏水性)的聚合物或通过例如甘氨酸残基(聚-Gly)的氨基酸添加延长肽的N-末端。于一些实施例中,连接子可为膜非插入肽序列的部分,例如,具有聚-Gly基序者。于一些实施例中,连接子可为PEG聚合物。聚合物或延伸的目的为将表位定位于细胞的表面,以增强抗体或蛋白质与表位结合的通道。连接子的非限制性实例为200Da至高达20kDa之间的尺寸的PEG聚合物。
于一些实施例中,可使用下列连接子及其等的衍生物:N-α-马来酰亚胺基乙酸羟基琥珀酰亚胺酯(AMAS);N-γ-马来酰亚胺基丁酰基羟基琥珀酰亚胺酯(GMBS);N-β-马来酰亚胺基丙基羟基琥珀酰亚胺酯(BMPS);N-ε-马来酰亚胺基己酰基羟基琥珀酰亚胺酯(EMCS);m-马来酰亚胺基苯甲酰基-n-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS);3-(溴乙酰胺)丙酸琥珀酰亚胺酯(SBAP);(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸琥珀酰亚胺酯(SIAB);N-ε-马来酰亚胺基己酸(EMCA);琥珀酰亚胺基4-(n-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧基-(6-氨基己酸酯)(LC-SMCC);碘乙酸琥珀酰亚胺酯(SIA);(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸琥珀酰亚胺酯(SIAB);4-(p-马来酰亚胺苯基)丁酸琥珀酰亚胺酯(SMPB);6-((β-马来酰亚胺基丙酰胺基)己酸琥珀酰亚胺酯(SMPH);3-炔丙基氧基丙酸、琥珀酰亚胺酯(炔烃,琥珀酰亚胺酯);1,4-双马来酰亚胺丁烷(BMB);双马来酰亚胺己烷(BMH);双马来酰亚胺乙烷(BMOE);三(2-马来酰亚胺乙基)胺(TMEA);N-β-马来酰亚胺基丙酸酰肼(BMPH);N-ε-马来酰亚胺基己酸酰肼(EMCH);N-κ-马来酰亚胺十一烷酸酰肼(KMUH);4-(4-n-马来酰亚胺苯基)丁酸酰肼(MBPH);或者p-马来酰亚胺苯基异氰酸酯(PMPI)。
CX3CL1的粘液素结构域及编码CX3CL1的粘液素结构域的核酸序列描述于下:
aatggcggcaccttcgagaagcagatcggcgaggtgaagcccaggaccacccctgccgccgggggaatggacgagtctgtggtcctggagcccgaagccacaggcgaaagcagtagcctggagccgactccttcttcccaggaagcacagagggccctggggacctccccagagctgccgacgggtgtgactggttcctcagggaccaggctccccccgacgccaaaggctcaggatggagggcctgtgggcacggagcttttccgagtgcctcccgtctccactgccgccacgtggcagagttctgctccccaccaacctgggcccagcctctgggctgaggcaaagacctctgaggccccgtccacccaggacccctccacccaggcctccactgcgtcctccccagccccagaggagaatgctccgtctgaaggccagcgtgtgtggggtcaggggcagagccccaggccagagaactctctggagcgggaggagatgggtcccgtgccagcgcacacggatgccttccaggactgggggcctggcagcatggcccacgtctctgtggtccctgtctcctcagaagggacccccagcagggagccagtggcttcaggcagctggacccctaaggctgaggaacccatccatgccaccatggacccccagaggctgggcgtccttatcactcctgtccctgacgcccaggctgccacccggaggcag
SEQ ID NO:500
人类CX3CL1蛋白的粘液素-结构域的序列(UniProt P78423或NP_002987.1)显示于下(这些为来自人类CX3CL1蛋白的残基111至141):
SEQ ID NO:526
全长CXCL1氨基酸序列描述如下(NP_002987.1),且通过引用并入本文中。
SEQ ID NO:527
CXCL1的例示性标志残基、结构域及片段包括但不限于残基1至24(信号肽)、残基25至397(成熟肽)或残基111至141(如上所述)。CXCL1蛋白的片段(例如,肽或表位)小于全长蛋白质的长度,例如,片段的长度为至少3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200或更多个残基,但小于例如于上述CXCL1的情况下为397个残基。
于示意结构中,表位-连接子-肽:
肽为包括Var3序列AXDDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWA(SEQ ID NO:__)或AXDQDNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWA(SEQ ID NO:__)的肽,其中,X为接合目的的官能性基团,选自赖氨酸(Lys)、半胱氨酸(Cys)或含叠氮氨基酸或其它。肽膜非插入N-末端侧翼序列可经延伸。举例而言,所述肽分享序列WRAYLDLLFPTDTLLLDLLW(SEQ ID NO:112)。
所述延伸的非限制性实例可为聚-Gly基序或AX(Z)nXPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWA,其中,“Z”表示任何氨基酸残基,以及n为位于且包括1至10之间的任何整数(例如,1≤n≤10)。此外,(Z)n可为QDNDQN(SEQ ID NO:__)或NENENN(SEQ ID NO:528)或NDNDNN(SEQ IDNO:529)或NDNDNDN(SEQ ID NO:530),极性残基D、E、N或Q的任何组合。
野生型(WT)肽的实例为AXEQNPIYWARYADWLFTTPLLLLDLALLVDADEGT(SEQID NO:20),其中,X为接合目的的官能性基团,选自赖氨酸(Lys)、半胱氨酸(Cys)或含叠氮氨基酸或其它,以及其中,AEQNPIY(SEQ ID NO:__)代表侧翼序列,WARYADWLFTTPLLLLDLALLV(SEQ ID NO:21)代表膜插入序列,以及DADEGT代表侧翼序列。
“Ac”意指乙酰化N-末端
“Am”意指酰胺化C-末端
表3:包括L-异构体、D-异构体、α-异构体、β-异构体、乙二醇-及甲基-修饰的编码及例示性非编码的氨基酸。
表4:包含L-异构体、D-异构体、α-异构体和β-异构体的可质子化残基的非限制性实例及其取代。
表5:编码氨基酸的实例
亦可使用环肽将表位递送至靶向细胞(肿瘤细胞或其它病变组织/细胞)的细胞表面。环肽为包括圆形几何或结构者。举例而言,肽的整个结构为环形或所述结构的部分为环形。例如,于后者情况下,所述肽包含环状部分和线性(或尾部)部分。于不同实施例中,pH触发肽包括至少4个氨基酸,其中,(a)所述肽的至少4个氨基酸中的至少2个为非极性氨基酸,(b)所述肽的至少4个氨基酸中的至少1个为可质子化氨基酸,以及(c)相较于pH8.0,所述肽于pH 5.0时对膜脂双层具有较高的亲和力。所述肽描述于国际专利申请第PCT/US2017/023458号(国际专利公开第WO2017/165452A1号,通过引用并入本文中)。
例示性环肽描述及显示如下。于本文的序列开头的小写“c”表示环肽(例如,如于c[(WE)3WC]中)(SEQ ID NO:1),以及小写“l”表示线肽(例如,于l(CW(EW)4中)(SEQID NO:188)。于包含尾部的环状结构的情况下,化合物的环状部分于括号内,且尾部于括号之后(于其右侧)。举例而言,于化合物c[E5K]W5C中,c[E5K]为环肽部分,以及W5C为肽尾部部分。于另一实施例中,于c[E5K]W4C中,所述环肽部分为c[E5K],以及所述肽尾部部分为W4C。
关于环肽,括号内的氨基酸可以以括号中所列由左至右的顺序或以任何顺序存在。举例而言,环肽c[X2Y2]可具有对应线性序列:XXYY、XYXY、YXXY、XYYX或YXYX。于一些情况中,例示性环肽的对应线性序列的多个实施例列于表3中。
表8提供肽序列的概要。
<u>肽</u> | <u>序列</u> | <u>线性序列</u> | <u>SEQ ID NO</u> |
1 | c[(WE)<sub>3</sub>WC] | WEWEWEWC | 228 |
2 | c[(WE)<sub>4</sub>WC] | WEWEWEWEWC | 229 |
3 | c[(WE)<sub>5</sub>WC] | WEWEWEWEWEWC | 230 |
4 | c[(LE)<sub>4</sub>WC] | LELELELEWC | 231 |
5 | c[E<sub>4</sub>W<sub>5</sub>C] | EEEEWWWWWC | 232 |
6 | l(CW(EW)<sub>4</sub>) | CWEWEWEWEW | 233 |
7 | c[R<sub>4</sub>W<sub>5</sub>C] | RRRRWWWWWC | 234 |
于第二栏中(“序列”,小写“c”表示环肽,以及小写“l”表示线肽)。
表9提供肽序列的额外非限制实施例。
为制备修饰病变细胞的细胞表面的构建物或组合物,可使用本领域已知的多种方法,例如:
实施例
以下提供实例以促进本发明的更完整理解。以下实例说明制造和实施本发明的例示性方法。然而,本发明的范围不限于这些实例中所公开的具体实施方案,因为可使用替代方法以得到相似的结果,这些实例仅作为说明的目的。
用于与DNP-马来酰亚胺接合的研究中所使用具有单个Cys残基的肽为下列:((SEQ ID NO:__)。用于与DNP-PEG4-NHS及DNP-PEG12-NHS接合的研究中所使用具有单个Lys残基及乙酰化N-末端的肽为下列:(SEQ ID NO:__))。通过固相合成制备肽。使用反相HPLC(RP-HPLC)进行连接反应和纯化过程(梯度:水及具有0.05%三氟乙酸(TFA)的乙腈),接着冷冻干燥。所述构建体的纯度及特性分别通过分析RP-HPLC及表面增强激光解吸电离飞行时间质谱(SELDI-TOF)质谱所建立。使用肽消光系数于280nm的吸光度计算构建体浓度。
诱导免疫反应的关键为将表位适当定位于肿瘤细胞的表面,此于3-D肿瘤癌细胞(肿瘤球状体)的培养得到验证。简而言之,通过溶解于pH7.4的PBS中以制备2%琼脂糖溶液。将150μL的溶液移入48孔平底组织培养板的每个孔中。于琼脂糖凝胶充分沉淀后(~1小时),每孔加入150μL的DMEM,辅以10%FBS及环丙沙星HCl。将盖板于37℃和5%CO2的湿润气氛中置于细胞培养箱中24小时。第二天,自琼脂糖层移除多余的培养基。将于200μL的含有2%基质胶的DMEM中的HeLa细胞(10,000个细胞)加入每个孔中,且培育3至4天以形成球状体。基质胶于冰上溶解过夜,并以2.5%的浓度加入冰冷的DMEM中(加入孔中,最终浓度为2%)。接着,将混合物加热至37℃,并与细胞合并。肿瘤球状体于50μL的PBS缓冲液(pH 6.0至6.5,含有0至2μM DNP-DNP-PEG4-或DNP-PEG12-)中于5%CO2的湿润气氛中于37℃下培育30分钟。于处理后,于1mL PBS中洗涤球状体数次。接着,以647nm荧光染料标记的抗DNP抗体于pH 7.4下处理球状体,接着洗涤。球状体亦使用DAPI染色以标记细胞核。
图7中所呈现的图像为高倍率下所得到的,以证明来自抗体的荧光信号与来自DAPI的荧光信号一致,DAPI染色细胞核中的DNA。3-D肿瘤球状体中具有多个焦平面,DAPI信号与647nm荧光的焦点不同,但是可以清楚地观察到抗体荧光和DAPI荧光之间的重叠。
为了确立生物效应,以5μM DNP-DNP-PEG4-或DNP-PEG12-于PBS pH 6.5中处理肿瘤球状体1小时,洗涤,接着与抗DNP抗体或人类IgM抗体于PBS pH7.4中培育1小时。之后,加入含有活性补体及碘化丙啶(PI)的人类血清,清洗并成像球状体。细胞不可渗透的PI染料仅染色具有受损膜的死亡(或濒死)细胞。因此,图8上的红色存在表明细胞的质膜经补体介导的攻击所破坏且细胞为垂死的。
为了增强抗体的性能并增强免疫反应,重要的为促进IgG的两头与连接到同一肽的2个表位的结合(参见,例如图5B)。具有2个Lys残基(粗体及底线)的肽((SEQ ID NO:__))与过量NHS-PEG12-马来酰亚胺及NHS-PEG24-马来酰亚胺连接子接合,纯化以及,pHLIP-(PEG12)2与HA肽表位(YPYDVPDYAGGGCA(SEQ ID NO:__))结合。及HA肽通过固相合成以制备。使用反相HPLC(RP-HPLC)进行连接反应和纯化过程(梯度:水及具有0.05%TFA的乙腈,接着冷冻干燥)。所述构建体的纯度及特性分别通过分析RP-HPLC及表面增强激光解吸电离飞行时间质谱(SELDI-TOF)质谱所建立。于280nm的吸光度测量构建体的浓度。
PEG12及PEG24分别于5nm及10nm伸展,PEG与结合的点之间的六个残基(QNDDQN(SEQ ID NO:__))提供几纳米的额外空间,例如,自5至25nm,或自约10至15nm。因此,因为头之间的距离为10至15nm,单个构建体上的两个表位结合Ig抗体的两头。
表达及纯化具有2种不同标记(His及cMyc)的两种融合蛋白:
mnqtailicclifltlsgiqgvplsrtvrctcisisnqpvnprslekleiipasqfcprveiiatmkkkgekrclnpeskaiknllkavskerskrspgtfekqigevkprttpaaggmdesvvlepeatgesssleptpssqeaqralgtspelptgvtgssgtrlpptpkaqdggpvgtelfrvppvstaatwqssaphqpgpslwaeaktseapstqdpstqastasspapeenapsegqrvwgqgqsprpenslereemgpvpahtdafqdwgpgsmahvsvvpvssegtpsrepvasgswtpkaeepihatmdpqrlgvlitpvpdaqaatrrqeqkliseedleqkliseedladdqnpwrayldllfptdtllldllw
SEQ ID NO:531
mnqtailicclifltlsgiqgvplsrtvrctcisisnqpvnprslekleiipasqfcprveiiatmkkkgekrclnpeskaiknllkavskerskrspgtfekqigevkprttpaaggmdesvvlepeatgesssleptpssqeaqralgtspelptgvtgssgtrlpptpkaqdggpvgtelfrvppvstaatwqssaphqpgpslwaeaktseapstqdpstqastasspapeenapsegqrvwgqgqsprpenslereemgpvpahtdafqdwgpgsmahvsvvpvssegtpsrepvasgswtpkaeepihatmdpqrlgvlitpvpdaqaatrrqhhhhhhaddqnpwrayldllfptdtllldllw
SEQ ID NO:532
两种融合蛋白均已pH 6.0至6.5的HeLa或HeLa-GFP癌细胞处理,接着洗涤并涂布装载有红色荧光染料DiI(1,1’-双十八烷基-3,3,3’,3’-四甲基吲哚羰花青)的NK细胞30分钟,接着轻轻洗涤。通过分析分别来自癌细胞和免疫NK细胞的绿色和红色荧光信号,于荧光显微镜下比较NK细胞与经CXCL10趋化因子修饰的结构及未经修饰的癌细胞的结合和接着。
本发明的特征为于个体中引起免疫反应的组合物及方法,通过向所述个体施用包括抗体招募分子或免疫细胞招募分子的构建体。所述抗体招募分子或免疫细胞招募分子连接至一种或更多肽,以及其中,所述构建体称增加病变细胞的表面上的抗体招募分子或免疫细胞招募分子的量。
举例而言,所述组合物包括式:
表位–连接子–Pept
其中,“表位”为抗体或免疫细胞招募分子;
AXDDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLW(SEQ ID NO:__)或
AXDQDNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLW(SEQ ID NO:__),其中,“X”为官能性基团,选自赖氨酸、半胱氨酸或含叠氮氨基酸;
其中,每个“–”为共价键;
于一些实施例中,所述构建体包括抗体招募分子;于其它实施例中,所述构建体包括免疫细胞招募分子。任选地,所述构建体包括抗体招募分子或免疫细胞招募分子两者。
表位1–连接子–Pept–连接子–表位1
其中,“表位1”为抗体招募分子;
其中,“连接子”为聚乙二醇连接子;
Ac-AKQNDDQNKPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWA(SEQ ID NO:__)或
Ac-AKQNDNDNKPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWA(SEQ ID NO:__)或
ACQNDDQNCPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWA(SEQ ID NO:__)或
ACQNDNDNCPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWA(SEQ ID NO:__)
其中,每个“–”为共价键。
如上所述,例示性招募分子包括一种或更多种表位。举例而言,所述表位包括具有小于50个氨基酸的长度的肽。
根据权利要求1所述的方法,其中,所述抗体招募分子或免疫细胞招募分子包括表位。于实例中,所述表位包括具有小于50个氨基酸的长度的肽,例如,所述表位包括位于5至20个氨基酸之间的长度。例示性表位包括HA表位。举例而言,所述肽包括YPYDVPDYA(SEQ IDNO:)的氨基酸序列。表位的额外实例包括QVSHWVSGLAEGSFG(SEQ ID NO:)、LSHTSGRVEGSVSLL(SEQ ID NO:)、QMWAPQWGPD(SEQ ID NO:);MASMTGGQQMG(SEQ ID NO:4);EQKLISEEDL(SEQ ID NO:5);YTDIEMNRLGK(SEQ ID NO:7);KETAAAKFERQHMDS(SEQ ID NO:8);GKPIPNPLLGLDST(SEQ ID NO:9);DYKDDDDK(SEQ ID NO:10);GAPVPYPDPLEPR(SEQ IDNO:11);HHHHHH(SEQ ID NO:12);TKENPRSNQEESYDDNES(SEQ ID NO:13);WSHPQFEK(SEQ IDNO:14);或PDRVRAVSHWSS(SEQ ID NO:15)。
于实例中,表位包括具有200或更少个氨基酸的长度的蛋白表位。举例而言,所述蛋白表位包括细胞因子,例如,白细胞介素(IL),如IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-12或IL-17。于一些具体实施例中,所述细胞因子包括肿瘤坏死因子(TNF)。于一些实施例中,所述细胞因子包括趋化因子(CXC)。趋化因子的实例包括CXCL9、CXCL10或CXCL11。举例而言,所述趋化因子包括CXCL10,其包括氨基酸序列:
MNQTAILICCLIFLTLSGIQGVPLSRTVRCTCISISNQPVNPRSLEKLEIIPASQFCPRVEIIATMKKKGEKRCLNPESKAIKNLLKAVSKERSKRSP(SEQ ID NO:)。
于另一实施例中,所述表位包括小分子。举例而言,所述小分子包括二硝基苯基(DNP)或其衍生物。
所述方法可用于于受试者中引起免疫反应的方法。此临床有益效果为通过增加病变细胞表面上的抗体募集分子或免疫细胞募集分子的量的构建体所实现的。例如,病变细胞包括肿瘤细胞。于另一实施例中,病变细胞包括发炎组织中的细胞。
亦于本发明内的为一种组合物,包括通过不可裂解连接子化合物连接至一种或更多的肽的抗体或免疫细胞招募分子。一种包括连接至一种或更多的肽的表位的组合物,其中,所述表位为蛋白表位且为所述肽的非插入端的延伸,亦于本发明中。举例而言,所述肽的非插入端还包括氨基酸延伸,其中,所述延伸包括蛋白表位。于另一方面中,本发明涵盖一种组合物,包括连接至一种或更多的肽的表位,其中,所述表位及所述肽为单一融合构建体的部分。
于所述方法或组合物中,所述构建体包括表位–连接子–肽的式,其中,肽为肽,包括序列AXDDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWA(SEQ ID NO:__)或AXDQDNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWA(SEQ ID NO:__),其中,“X”为选自赖氨酸、半胱氨酸或含叠氮氨基酸的官能性基团,其中,连接子为连接子或所述肽的延伸,以及其中,每个“–”为共价键。
例示性组合物包括表位–连接子–肽的式,其中,肽为包括序列AXDDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWA(SEQ ID NO:__)或AXDQDNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWA(SEQ ID NO:__)的肽,其中,X为选自赖氨酸、半胱氨酸或含叠氮氨基酸的官能性基团,以及其中,连接子为连接子或为所述肽的延伸,以及其中,每个“–”为共价键。于一些实施例中,两种表位连接至单个肽。
如上所述,所述构建体可包括表位2–连接子2–肽的式,其中,肽为包括序列AX(Z)nXPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWA(SEQ ID NO:__)的肽,其中,X为选自赖氨酸、半胱氨酸、含叠氮氨基酸或其它的官能性基团,其中,Z包括表示任何氨基酸残基,其中,n为位于1及10之间的任何整数,其中,连接子为连接子或为所述肽的延伸,以及其中,每个“–”为共价键。于另一实施例中,所述组合物或构建体包括表位2–连接子2–Pept的式,其中,“Pept”为包括序列AX(Z)nXPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWA(SEQ ID NO:__)的肽,其中,X为选自赖氨酸、半胱氨酸、含叠氮氨基酸或其它的官能性基团,其中,Z包括表示任何氨基酸残基,其中,n为位于1及10之间的任何整数,其中,连接子为连接子或为所述肽的延伸,以及其中,每个“–”为共价键。
一种诱导个体中的病变组织中的免疫反应的方法亦于本发明中,所述方法包括向个体施用一种包括表位及肽的组合物。举例而言,所述个体包括实体肿瘤,或者所述个体包括发炎组织。所述组合物或构建体以各种临床可接受的方法施用,例如,所述组合物直接注射至病变组织肿瘤肿块。于另一实施例中,所述组合物为全身施用。所述方法与众多优点相关,例如,所述组合物于引起或促进抗原特异性(表位特异性)免疫反应的生物效应至少20%大于不存在所述组合物下所递送者。所述反应可至少25、50、75、95%或甚至2倍、3倍、5倍、10倍或更多大于不存在所述组合物或构建体下所递送者。另一显著优点为,相较于健康组织,所述组合物优先靶向病变组织,从而最小化所述健康组织的损伤。
于一实例中,所述组合物包括表位–连接子–Pept的式
其中,“表位”为抗体或免疫细胞招募分子;
其中,“Pept”为包括序列AXDDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLW(SEQ ID NO:__)或
其中,“–”为共价键。
抗体招募
其中,“表位1”为抗体招募分子;
其中,“连接子”为聚乙二醇连接子;
其中,“Pept”为包括序列Ac-AKQNDDQNKPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWA(SEQ ID NO:__)或
Ac-AKQNDNDNKPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWA(SEQ ID NO:__)或
ACQNDDQNCPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWA(SEQ ID NO:__)或
其中,每个“–”为共价键。
举例而言,一种包括具有小于50个氨基酸的长度的肽的表位,例如,位于5至20个氨基酸之间的长度。例示性表位包括HA肽,例如,所述肽包括YPYDVPDYA(SEQ ID NO:)的氨基酸序列。
其它表位包括下列肽:QVSHWVSGLAEGSFG(SEQ ID NO:)、LSHTSGRVEGSVSLL(SEQ IDNO:)、QMWAPQWGPD(SEQ ID NO:);MASMTGGQQMG(SEQ ID NO:4);EQKLISEEDL(SEQ ID NO:5);KETAAAKFERQHMDS(SEQ ID NO:8);GKPIPNPLLGLDST(SEQ ID NO:9);DYKDDDDK(SEQ ID NO:10);GAPVPYPDPLEPR(SEQ ID NO:11);HHHHHH(SEQ ID NO:12);TKENPRSNQEESYDDNES(SEQID NO:13);WSHPQFEK(SEQ ID NO:14);及/或PDRVRAVSHWSS(SEQ ID NO:15)。
于一些实施例中,所述表位包括小分子,例如,二硝基苯基(DNP)或其衍生物。
免疫细胞招募
于一些实施例中,所述表位为免疫细胞招募分子。例如招募免疫细胞的例示性组合物包括表位2–Pept的式,
其中,“表位2”为免疫细胞招募分子;
其中,“–”为共价键。于所述实施例中,所述表位包括具有350或更少个氨基酸的长度的蛋白表位。例示性蛋白表位包括细胞因子。举例而言,所述细胞因子包括白细胞介素(IL),例如,IL-2、IL-6、IL-7或IL-12。于其它实施例中,所述细胞因子包括肿瘤坏死因子(TNF)。
于一些实施例中,所述细胞因子包括趋化因子,例如,CXCL9、CXCL10或CXCL11。举例而言,趋化因子包括CXCL10,其包括氨基酸序列:
MNQTAILICCLIFLTLSGIQGVPLSRTVRCTCISISNQPVNPRSLEKLEIIPASQFCPRVEIIATMKKKGEKRCLNPESKAIKNLLKAVSKERSKRSP(SEQ ID NO:)。
于一些方面中,本发明的特征为包括表位的组合物、构建体及方法,其中,肽的膜非插入端还包括氨基酸延伸。举例而言,所述组合物包括表位及包括融合蛋白的肽。例如,融合蛋白包括表位及肽。于其它实施例中,组合物包括通过不可裂解连接子化合物连接至一种或更多肽的表位。
可使用各种连接子。举例而言,所述连接子为化学聚合物,例如,聚乙二醇。于其它实施例中,所述连接子为生物聚合物。例示性连接子包括粘液素结构域、葡聚糖、纤维素、甲壳素或淀粉。
治疗方法
所述个体使用各种临床可接受的程序进行治疗,例如,所述组合物直接注射至病变组织肿瘤肿块。于另一实施例中,所述组合物为全身施用。如上所述,所述方法的优点为所述组合物的生物效应至少20%或更多大于所述组合物不存在下所递送者。有助于临床安全性和有效性的另一优点为,相较于健康组织,所述组合物优先靶向病变组织,从而最小化健康组织的损害。
促进个体中的免疫反应的例示性方法通过向个体施用上述组合物及构建体以实施。所述方法包括,例如,导致,将表位放置于肿瘤细胞或个体中的发炎组织中的细胞上。肿瘤细胞表面或发炎组织中的细胞的表面上的表位的量或浓度增加会导致更强烈的免疫反应,例如,抗体结合或免疫细胞结合,且接着杀死和/或清除病变(或者其它不想要的)细胞。例如,病变细胞包括肿瘤细胞或发炎组织中的细胞。
一般定义
除非另外明确定义,本文中所用的所有技术及科学术语应视为与本领域技术人员(例如,细胞培养、分子遗传学和生物化学)所一般理解的意义相同。
如本文中所用,术语“约”于数值或范围的内容中意指所记载或请求的数值或范围的±10%,除非内容中要求更限定的范围。
于上述说明及权利要求书中,例如“至少一者”或“一或更多”的短语出现后有元素或特征的连接列表。术语“及/或”自可出现于两种或更多元素或特征的列表中。除非与其所使用的内容另外隐含或明确矛盾,所述短语意指任何单独列出的元素或特征,或与任何所述元素或特征与任何其它所述元素或特征的组合。举例来说,短语“A及B的至少一者”、“A及B的一者或更多”及“A及/或B”各自意指“A单独、B单独或A及B一起”。类似的解释亦适用于包含三个或更多项目的列表。例如,短语“A、B及C的至少一者”、“A、B及C的一者或更多”及“A、B及/或C”各自意指“A单独、B单独、C单独、A及B一起、A及C一起、B及C一起或A和B及C一起”。此外,于上述及权利要求书所用术语“基于”意指“至少部分基于”,使未记载的特征或元素亦为允许的。
应理解,提供参数范围下,本发明亦提供所述范围内的所有整数及其十分之一。举例而言,“0.2至5mg”为0.2mg、0.3mg、0.4mg、0.5mg、0.6mg等,直到且包括5.0mg。
小分子为质量小于2000道尔顿的化合物。所述小分子的分子量优选小于1000道尔顿,更优选小于600道尔顿,例如,所述化合物小于500道尔顿、400道尔顿、300道尔顿、200道尔顿或100道尔顿。
如本文中所用,“分离的”或“纯化的”核酸分子、多核苷酸、多肽或蛋白质实质上不具有其它细胞物质,或通过重组技术生产的培养基,或化学合成的化学前驱物或其他化学物。纯化的化合物为目标化合物的重量(干燥重量)的至少60%。优选地,制剂为目标化合物的重量的至少75%,更优选至少90%,最优选至少99%。举例而言,纯化的化合物为所需化合物的重量的至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、98%、99%或100%(w/w)。通过任何合适的标准方法测量纯度,例如,通过柱色谱、薄层色谱或高效液相色谱(HPLC)分析。纯化或分离的多核苷酸(核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA))或不含氨基酸序列的多肽,或于其天然存在状态下位于其侧翼的核酸序列。纯化亦定义施用至人类个体为安全的无菌程度,例如,缺乏传染性或毒性剂。纯化或分离的多核苷酸(核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA))于其天然存在的状态下不含位于其侧翼的基因或序列。纯化或分离的多肽于其天然存在的状态下不含位于其侧翼的氨基酸或序列。
类似地,“实质上纯的”是指已经与天然伴随的组分分离的核苷酸或多肽。通常,当核苷酸和多肽以重量计为至少60%、70%、80%、90%、95%或甚至99%时,其等实质上为纯的,不含蛋白质以及与其等自然结合的天然存在的有机分子。
除非另外说明,术语“烷基”本身或作为另一取代基的部分意指非环直链或支链烃或其组合,其可为完全饱和、单不饱和或多不饱和,且可包括二价和多价基团,具有指定的碳原子数(亦即,C1至C10意指一至十个碳)。饱和烃基团包括但不限于例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、t-丁基、异丁基、仲丁基、(环己基)甲基、如正戊基、正己基、正庚基、正辛基等同系物和异构体及等等。不饱和烷基基团为具有一个或更多双键或叁键者,例示性不饱和烷基基团包括但不限于乙烯基、2-丙烯基、巴豆基(crotyl)、2-异戊烯基、2-(丁二烯基)、2,4-戊二烯基、3-(1,4-戊二烯基)、乙炔基、1-和3-丙炔基、3-丁炔基和更高的同系物及异构体。烷氧基为通过氧连接子(-O-)连接至分子其它部分的烷基。
除非另外说明,术语“亚烷基”本身或作为另一取代基的部分意指衍生自烷基的二价基团,例示但不限于-CH2CH2CH2CH2-。典型地,烷基(或亚烷基)基团可具有1至24个碳原子。“较低烷基”或“较低亚烷基”为较短链烷基或亚烷基基团,通常具有八个或更少个碳原子。
除非另外说明,术语“杂烷基”本身或其与另一术语的结合意指稳定的直链或支链烃或其组合,由至少一个碳原子及至少一个杂原子(例如,选自由O、N、P、S、Se及Si所组成的群组,以及其中,氮、硒及硫原子可任选地经氧化,且氮杂原子可任选地经季铵化)所组成。所述杂原子O、N、P、S、Se及Si可置于杂烷基的任何内部位置或烷基与分子其余部分相连的位置。实例包括但不限于:-CH2-CH2-O-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2、-S(O)-CH3、-CH2-CH2-S(O)2-CH3、-CH=CH-O-CH3、-Si(CH3)3、-CH2-CH=N-OCH3、-CH=CH-N(CH3)-CH3、-O-CH3、-O-CH2-CH3及-CN。最多两个杂原子可为连续,例如,举例而言,-CH2-NH-OCH3。
相似地,除非另外说明,术语“杂亚烷基”本身或作为另一取代基的部分意指衍生自杂烷基的二价基团,例示但不限于-CH2-CH2-S-CH2-CH2-及-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-。对于杂亚烷基基团,杂原子亦可占据链末端的一者或两者(例如,亚烷基氧基、亚烷基二氧基、亚烷基氨基、亚烷基二氨基及等等)。更进一步地,对于亚烷基及杂亚烷基连接基团,连接基团的式的书写方向不暗示连接基团的方向。举例而言,式-C(O)2R’-表示-C(O)2R’-及-R’C(O)2-两者。如上所述,如本文中所用的杂烷基基团包括通过杂原子连接到分子其余部分的那些基团,例如,-C(O)R’、-C(O)NR’、-NR’R”、-OR’、-SeR’、-SR’及/或-SO2R’。当记载“杂烷基”,接着记载特定的杂烷基,例如-NR’R”等时,应理解术语杂烷基和-NR’R”并非多余或相互排斥的。相较于此,列举特定的杂烷基是为了更清楚。因此,术语“杂烷基”于本文中不应被解释为排除特定的杂烷基,例如-NR’R”或等等。
除非另外说明,术语“环烷基”及“杂环烷基”本身或其与其它术语的结合意指“烷基”及“杂烷基”分别的环状版本。此外,对于杂环烷基,杂原子可占据杂环与分子其余部分相连的位置。环烷基的实例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、1-环己烯基、3-环己烯基、环庚基等。例示性杂环烷基包括但不限于1(1,2,5,6-四氢吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-吗啉基、3-吗啉基、四氢呋喃-2-基、四氢呋喃-3-基、四氢噻吩-2-基、四氢噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基及等等。“环亚烷基”及“杂环亚烷基”本身及作为另一取代基的部分意指分别衍生自环烷基及杂环烷基的二价基团。
除非另外说明,术语“芳基”意指多不饱和芳族烃取代基,其可为单环或稠合在一起(亦即,稠合环芳基)或共价连接的多环(优选1至3个环)。稠合环芳基指稠合在一起的多个环,其中,所述稠合环的至少一者为芳基环。术语“杂芳基”指含有自一至四个杂原子(例如,选自由N、O、及S所组成的群组,以及其中,氮及硫原子可任选地经氧化,且氮杂原子可任选地经季铵化)的芳基基团(或环)。因此,术语“杂芳基”包括稠合环杂芳基基团(亦即,多个稠合在一起的环,其中,所述稠合环的至少一者为杂芳香环)。5,6-稠合环杂亚芳基指稠合在一起的两个环,其中,一个环具有5员,另一个环具有6员,以及其中,至少一个环为杂芳环。类似地,6,6-稠合环杂亚芳基指稠合在一起的两个环,其中,一个环具有6员且另一个环具有6员,以及其中,至少一个环为杂芳环。6,5-稠合环杂亚芳基指稠合在一起的两个环,其中,一个环具有6员且另一个环具有5员,以及其中,至少一个环为杂芳环。杂芳基基团可通过碳或杂原子连接到分子其余部分。芳基及杂芳基基团的非限制性实例包括苯基、1萘基、2-萘基、4-联苯、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-恶唑基、4-恶唑基、2-苯基-4-恶唑基、5-恶唑基、3-异恶唑基、4-异恶唑基、5-异恶唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2苯并咪唑基、5-吲哚基、1-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹恶啉基、5-喹恶啉基和3-喹啉基及6-喹啉基。上述每个芳基和杂芳基环系统的取代基选自下述可接受的取代基的群组。“亚芳基”和“杂亚芳基”,单独或作为另一取代基的一部分,分别意指衍生自芳基和杂芳基的二价基团。
稠环杂环烷基-芳基为与杂环烷基稠合的芳基。稠环杂环烷基-杂芳基为与杂环烷基稠合的杂芳基。稠环杂环烷基-环烷基为与环烷基稠合的杂环烷基。稠环杂环烷基-杂环烷基为与另一个杂环烷基稠合的杂环烷基。稠环杂环烷基-芳基、稠环杂环烷基-杂芳基、稠环杂环烷基-环烷基或稠环杂环烷基-杂环烷基可各自独立地未经取代或经一个或更多个本文所述的取代基取代。螺环为两个或更多个环,其中,相邻的环通过单个原子连接。螺环内的各个环可为相同或不同。螺环中的单个环可经取代或未经取代,且可与一组螺环内的其它单个环具有不同的取代基。当不是螺环的一部分时,螺环内单个环的可能取代基为同一环的可能取代基(例如,环烷基或杂环烷基环的取代基)。螺环可为经取代或未经取代的环烷基、经取代或未经取代的环亚烷基、经取代或未经取代的杂环烷基或经取代或未经取代的杂环亚烷基,且螺环基团内的单个环可为前一列表的任一者,包括具有一种类型的所有环(例如,所有环均为经取代的杂环亚烷基,其中,每个环可为经相同或不相同取代的杂环亚烷基)。当提及螺环系统时,杂环螺环指螺环,其中,至少一个环为杂环,以及其中,每个环可为不同的环。当提及螺环系统时,经取代的螺环是指至少一个环经取代且每个取代基可任选地为不同。
每个上述术语(例如,“烷基”、“杂烷基”、“芳基”及“杂芳基”)包括所指基团的经取代或未经取代的形式。
与“包含”、“含有”或“特征在于”同义的过渡性术语“包括”是包括性或开放式,且不排除附加的、未记载的元素或方法步骤。相较于此,过渡性短语“由……组成”排除权利要求的范围中未指定的任何元素、步骤或成分。过渡短语“基本上由……组成”将权利要求的范围限制为特定的材料或步骤“以及不会实质性影响所请求保护的发明的基本及新颖特征者”。
本文所用术语“受试者”、“患者”、“个体”等的目的并非限制性,且通常可以互换使用。换言之,描述为“患者”的个体不一定具有特定疾病,而可能仅为寻求医疗建议。
如本文所用,除非上下文另有明确规定,否则单数形式“一”及“所述”包括复数的提及。因此,例如,对“疾病”、“疾病状态”或“核酸”的提及是对一个或多个所述实施例的提及,且包括本领域技术人员已知的其等同物等等。
如本文中所用,“治疗”包括例如疾病进展的抑制、复原或停滞。治疗亦包括预防或改善所述疾病的任何症状。如本文所用,“抑制”个体中的疾病进展或疾病并发症是指预防或减少个体中的疾病进展及/或疾病并发症。
如本文中所用,与疾病相关的“症状”包括与疾病相关的任何临床或实验室表现,且不限于个体所能感觉到或观察到者。
如本文中所用,当指治疗化合物的量时,“有效”是指当以本公开的方式使用时,化合物的量足以产生所需的治疗反应而不具有与合理的效益/风险比相称的过度不良副作用(例如毒性、刺激和过敏反应)。
如本文中所用,“药学上可接受的”载体或赋形剂是指适用于人类及/或动物而不具有与合理的效益/风险比相称的过度不良副作用(例如毒性、刺激和过敏反应)。其可为例如药学上可接受的溶剂、悬浮剂或媒介物,用于将本发明化合物递送至所述个体。
表位为抗原的分子区域,能够引发免疫反应以及与所述反应所产生的特定抗体或免疫细胞结合。表位亦称为抗原决定簇。例如,表位为抗体所结合或免疫细胞所结合的抗原分子的一部分。
如本文中所用,术语“癌症”是指于哺乳动物中发现的所有类型的癌症、肿瘤或恶性肿瘤,包括白血病、淋巴癌、黑色素瘤、神经内分泌肿瘤、癌及肉瘤。可使用本文提供的化合物、药物组合物或方法治疗的例示性癌症包括淋巴瘤(皮肤T细胞淋巴癌)、肉瘤、膀胱癌、骨癌、脑肿瘤、子宫颈癌、结肠癌、食道癌、胃癌、头颈癌、肾癌、骨髓瘤、甲状腺癌、白血病、前列腺癌、乳癌(例如,三阴性、ER阳性、ER阴性、化疗耐药、赫赛汀耐药、HER2阳性、阿霉素(doxorubicin)耐药、它莫西芬(tamoxifen)耐药、导管癌、小叶癌(原发性、转移性)、卵巢癌、胰脏癌、肝癌(例如,肝细胞癌)、肺癌(例如,非小细胞肺癌、鳞状细胞肺癌、腺癌、大细胞肺癌、小细胞肺癌、类癌、肉瘤)、多形性胶质母细胞瘤、胶质瘤、黑色素瘤、前列腺癌、去势抗性前列腺癌、乳癌、三阴性乳癌、胶质母细胞瘤、卵巢癌、肺癌、鳞状细胞癌(例如头、颈或食道)、结直肠癌、白血病、急性髓性白血病、淋巴瘤、B细胞淋巴瘤或多发性骨髓瘤。另外的例子包括甲状腺癌、内分泌系统癌、脑癌、乳腺癌、子宫颈癌、结肠癌、头颈癌、食道癌、肝癌、肾癌、肺癌、非小细胞肺癌、黑色素瘤、间皮瘤、卵巢癌、肉瘤、胃癌、子宫癌或髓母细胞瘤、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤、多形性胶质母细胞瘤、卵巢癌、横纹肌肉瘤、原发性血小板增多症、原发性巨球蛋白血症、原发性脑瘤、癌症、恶性胰腺胰岛素瘤、恶性类癌、尿路膀胱癌、癌前皮肤病变、睾丸癌、淋巴癌、甲状腺癌、神经母细胞瘤、食道癌、泌尿生殖道癌、恶性高钙血症、子宫内膜癌、肾上腺皮质癌、内分泌或外分泌胰脏肿瘤、甲状腺髓肿瘤、甲状腺髓样癌、黑色素瘤、结直肠癌、乳头状甲状腺癌、肝细胞癌、乳头Paget’s病、叶状肿瘤、小叶癌、导管癌、胰腺星状细胞癌、肝星状细胞癌或前列腺癌。
“小分子”可广泛地指具有低分子量化合物(例如,分子量小于约2,000Da或小于约1,000Da)的有机、无机或有机金属化合物。小分子可具有小于约2,000Da的分子量、小于约1,500Da的分子量、小于约1,000Da的分子量、小于约900Da的分子量、小于约800Da的分子量、小于约700Da的分子量、小于约600Da的分子量、小于约500Da的分子量、小于约400Da的分子量、小于约300Da的分子量、小于约200Da的分子量、小于约100Da的分子量或小于约50Da的分子量。
小分子为有机的或无机的。例示性有机小分子包括但不限于脂肪烃、醇、醛、酮、有机酸、酯、单糖和二糖、芳香烃、氨基酸及脂质。例示性无机小分子包括微量矿物质、离子、自由基及代谢物。或者,可将小分子合成性工程化为由片段、小部分或更长的氨基酸链所组成,以填充酶的结合口袋。通常,小分子小于一千道尔顿。
如本文中所用,术语“立体异构体”指由具有相同键序但具有不可互换的不同原子三维排列的相同原子所组成的化合物。所述三维结构称为构型。如本文中所用,术语“对映异构体”是指两个立体异构体,彼此为不可重叠的镜像。如本文中所用,术语“旋光异构体”等于术语“对映异构体”。如本文中所用,术语“非对映异构体”是指两个立体异构体非镜像且不可重叠。术语“外消旋物”、“外消旋混合物”或“外消旋体”是指等份对映异构体的混合物。术语“手性中心”是指连接四个不同基团的碳原子。选择合适的手性柱、洗脱液及实现一对对映异构体的分离所需的条件为使用标准技术的本领域技术人员已知的(参见,例如,Jacques,J.等人“Enantiomers,Racemates,and Resolutions”,John Wiley and Sons,Inc.1981)。
如本文中所用,“药学上可接受的”载体或赋形剂是指适用于人类及/或动物而不具有与合理的效益/风险比相称的过度不良副作用(例如毒性、刺激和过敏反应)。其可为例如药学上可接受的溶剂、悬浮剂或媒介物,用于将本发明化合物递送至所述个体。
以下提供实例以加速更完整的理解本发明。以下实施例说明制备和实施本发明的例示性方式。然而,本发明的范围不限于这些实施例中公开的具体实施例,这些实施例仅为说明的目的,因为可以使用替代方法得到相似结果。
通过于比较窗中内比较两个最佳比对的序列确定“序列同一性百分比”,其中,与参考序列(不包括添加或删除)相比,于比较窗口中的多核苷酸或多肽序列部分可包含添加或删除(例如,空位),以实现两个序列的最佳比对。通过确定两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数量,得到匹配位置的数量,将匹配位置的数量除以比较窗口中的位置总数,并将结果乘以100以得到序列同一性的百分比。
在两个或更多核酸或多肽序列的内容中,术语“相同”或“同一性”百分比是指当使用序列比较算法或通过手动比对和目视检查,于比较窗口或指定区域上进行比较和比对以获得最大对应时,两个或更多相同或具有特定百分比的氨基酸残基或核苷酸的序列或子序列为相同(例如,于指定区域,例如,整个多肽序列或其单结构域的50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多的同一性)。至少约80%相同的序列称为“实质上相同”。在一些实施例中,两个序列是100%相同的。在特定实施例中,两个序列于序列的一者的整个长度上为100%相同的(例如,于序列具有不同长度的情况下,两个序列中较短的一者)。在各种实施例中,同一性可指测试序列的互补。于一些实施例中,同一性存在于至少约10至约100、约20至约75、约30至约50个氨基酸或核苷酸长度的区域。在特定实施例中,同一性存在于至少约50个氨基酸长度的区域,或更优选地为100至500、100至200、150至200、175至200、175至225、175至250、200至225、200至250个或更多个氨基酸的长度的区域。
对于序列比较,通常一个序列做为参考序列,与测试序列进行比较。于各种实施例中,当使用序列比较算法时,将测试和参考序列输入电脑,如果需要,指定子序列坐标,并且指定序列算法程式参数。优选地,可以使用预设程式参数,或者可以指定替代参数。接着,序列比较算法根据程式参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
“比较窗口”是指多个连续位置中的任何一个的片段(例如,至少约10至约100、约20至约75、约30至约50、100至500、100至200、150至200、175至200、175至225、175至250、200至225、200至250),其中,于最佳比对两个序列后,可以将序列与具有相同数量连续位置的参考序列进行比较。于各种实施例中,比较窗口为两个比对序列的一者或两者的全长。于一些实施例中,所比较的两个序列包含不同的长度,且比较窗口是两个序列中较长或较短序列的全长。用于比较的序列比对方法为本领域中已知的。用于比较的序列的最佳比对可通过,例如,通过Smith&Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源性算法;通过Needleman&Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源性比对算法;通过Pearson&Lipman,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)的相似方法的寻找;通过这些算法的计算机化实现(GAP,BESTFIT,FASTA及TFASTAin the Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,Wis.),或通过手动比对和目视检查(参见,例如,Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等人编辑,1995增刊))进行。
于各种实施例中,适合确定序列同一性百分比及序列相似度的算法为BLAST及BLAST 2.0算法,其分别描述于Altschul等人,Nuc.Acids Res.25:3389-3402(1977)及Altschul等人,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)。可以使用BLAST及BLAST 2.0与本文所述的参数以确定核酸和蛋白质的序列同一性百分比。如本领域已知,执行BLAST分析的软件可通过國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information)公开取得。此算法首先通过识别查询序列中长度为W的短词以识别高得分序列对(HSP),当与数据库序列中相同长度的词对齐时,这些词匹配或满足一些正值阈值分数T。T被称为邻域词得分阈值(Altschul等人,supra)。这些最初的邻域词命中作为启动搜索以找到包含其等的更长HSP的种子。单词命中沿着每个序列在两个方向上扩展,只要累积对齐分数可以增加。对于核苷酸序列,使用参数M(一对匹配残基的奖励分数;总是>0)及N(错配残基的惩罚分数;总是<0)计算累积分数。对于氨基酸序列,使用分数矩阵计算累积分数。在以下情况下,单词命中于每个方向的扩展将停止:累积对齐分数从其最大实现值下降数量X;由于一个或多个负分数残基比对的累积,累积分数变为零或更低;或到达任一序列的末端。BLAST算法参数W、T及X确定比对的敏感度及速度。BLASTN程式(针对核苷酸序列)使用预设字长(W)为11,期望值(E)为10,M=5,N=-4以及两条链的比较。对于氨基酸序列,BLASTP程式使用预设字长为3、期望值(E)为10以及BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff&Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915(1989))、比对(B)为50,期望值(E)为10,M=5,N=-4以及两条链的比较。
其它实施例
虽然本发明已经结合其详细说明进行描述,但前述说明的目的在于说明而非限制本发明的范围,本发明的范围由所附权利要求书的范围所限定。其它方面、优点及修饰落于以下权利要求的范围内。
于本文提及的专利及科学文献确立本领域技术人员可取得的知识。本文中引用的所有美国专利及公开或未公开的美国专利申请均通过引用并入本文中。本文中引用的所有已公开的外国专利和专利申请均通过引用并入本文中。由本文引用的登录号所表示的Genbank及NCBI提交物通过引用并入本文中。本文中引用的所有其它已公开的参考文献、文件、原稿及科学文献均通过引用并入本文中。
虽然本发明已经具体展示及描述其优选实施例,但本领域技术人员将理解,于不脱离所附的权利要求书所涵盖的本发明的范围下,可以于形式及细节进行各种改变。
Claims (42)
2.根据权利要求1所述的方法,其中,所述抗体招募分子或所述免疫细胞招募分子包括表位。
4.根据权利要求1所述的方法,其中,所述构建体包括抗体招募分子。
6.根据权利要求1所述的方法,其中,所述构建体包括表位1-连接子-Pept-连接子-表位1的式,
其中,“表位1”为抗体招募分子;
其中,“连接子”为聚乙二醇连接子;
其中,“Pept”为包括序列
c-AKQNDDQNKPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWA(SEQ ID NO:__)或
Ac-AKQNDNDNKPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWA(SEQ ID NO:__)或
ACQNDDQNCPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWA(SEQ ID NO:__)或
其中,每个“-”为共价键。
7.根据权利要求2所述的方法,其中,所述表位包括具有小于50个氨基酸的长度的肽。
8.根据权利要求1所述的方法,其中,所述病变细胞包括肿瘤细胞。
9.根据权利要求1所述的方法,其中,所述病变细胞包括发炎组织中的细胞。
10.根据权利要求1所述的方法,其中,所述抗体招募分子或免疫细胞招募分子包括表位。
11.根据权利要求2所述的方法,其中,所述表位包括具有小于50个氨基酸的长度的肽。
12.根据权利要求2所述的方法,其中,所述表位包括位于5至20个氨基酸之间的长度。
13.根据权利要求2所述的方法,其中,所述表位为HA肽。
14.根据权利要求12所述的方法,其中,所述肽包括YPYDVPDYA(SEQ ID NO:)的氨基酸序列。
15.根据权利要求2所述的方法,其中,所述表位选自由QVSHWVSGLAEGSFG(SEQ IDNO:)、LSHTSGRVEGSVSLL(SEQ ID NO:)、QMWAPQWGPD(SEQ ID NO:);MASMTGGQQMG(SEQ IDNO:4);EQKLISEEDL(SEQ ID NO:5);YTDIEMNRLGK(SEQ ID NO:7);KETAAAKFERQHMDS(SEQ IDNO:8);GKPIPNPLLGLDST(SEQ ID NO:9);DYKDDDDK(SEQ ID NO:10);GAPVPYPDPLEPR(SEQ IDNO:11);HHHHHH(SEQ ID NO:12);TKENPRSNQEESYDDNES(SEQ ID NO:13);WSHPQFEK(SEQ IDNO:14);及PDRVRAVSHWSS(SEQ ID NO:15)所组成的群组。
16.根据权利要求2所述的方法,其中,所述表位包括具有200或更少的氨基酸的长度的蛋白表位。
17.根据权利要求16所述的方法,其中,所述蛋白表位包括细胞因子。
18.根据权利要求17所述的方法,其中,所述细胞因子包括白细胞介素(IL)。
19.根据权利要求18所述的方法,其中,所述白细胞介素(IL)包括IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-12及IL-17。
20.根据权利要求17所述的方法,其中,所述细胞因子包括肿瘤坏死因子(TNF)。
21.根据权利要求17所述的方法,其中,所述细胞因子包括趋化因子(CXC)。
22.根据权利要求21所述的方法,其中,所述趋化因子为CXCL9、CXL10或CXL11。
23.根据权利要求21所述的方法,其中,所述趋化因子包括CXCL10,其包含氨基酸序列:MNQTAILICCLIFLTLSGIQGVPLSRTVRCTCISISNQPVNPRSLEKLEIIPASQFCPRVEIIATMKKKGEKRCLNPESKAIKNLLKAVSKERSKRSP(SEQ ID NO:)。
24.根据权利要求2所述的方法,其中,所述表位包括小分子。
25.根据权利要求24所述的方法,其中,所述小分子包括二硝基苯基(DNP)或其衍生物。
28.根据权利要求27所述的组合物,其中,所述延伸包括肽表位。
36.根据权利要求35所述的方法,其中,所述个体包括实体肿瘤。
37.根据权利要求35所述的方法,其中,所述个体包括发炎组织。
38.根据权利要求35所述的方法,其中,所述组合物直接注射至病变组织肿瘤肿块。
39.根据权利要求35所述的方法,其中,所述组合物为全身施用。
40.根据权利要求35所述的方法,其中,所述组合物的生物效应至少20%大于所述组合物不存在下所递送者。
41.根据权利要求35所述的方法,其中,相较于健康组织,所述组合物优先靶向病变组织,以最小化所述健康组织的损害。
42.一种于个体中促进免疫反应的方法,包括向个体施用根据权利要求1所述的组合物,其中,所述方法包括所述表位于肿瘤细胞上或者所述个体的发炎组织中的细胞的放置。
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