JP2018127496A - Xten共役組成物およびそれを製造する方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は、伸長組換えポリペプチド(XTEN)組成物、XTENおよび薬理学的に活性なペイロードへの共役に有用な架橋剤に結合したXTENを含む共役組成物、高度に精製されたXTENを製造する方法、XTENリンカーおよびXTENペイロードの共役体を製造する方法、ならびにXTEN−架橋剤およびXTENペイロードの組成物を使用する方法に関する。本発明は、この必要性に取り組み、関連した利点を提供する。本明細書に開示される組成物および方法は、治療薬として有用であるだけでなく、候補治療薬の前臨床および臨床開発のための研究ツールとしても特に有用である。
【選択図】図1
Description
本出願は、2012年2月27日に出願された米国仮特許出願第61/634,312号、2012年6月18日に出願された米国仮特許出願第61/690,187号、および2012年10月4日に出願された米国特許出願第61/709,942号に対する優先権の利益を主張し、これらの出願は、参照により本明細書に組み込まれる。
Q、superQ−650M、およびporos Dからなる群から選択することができる。前述の方法の別の実施形態において、XTENは、表6に記載される配列の群から選択される配列に対して少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の配列同一性を有する。前述の方法の別の実施形態において、得られたXTENフラグメントは、表2または3に記載される配列の群から選択される配列に対して少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の配列同一性を有する。別の実施形態において、本発明は、前述の方法実施形態のプロセスによって製造されるXTEN組成物を提供する。
本発明は、例えば、以下の項目も提供する。
(項目1)
XTEN配列の実質的に均質な集団を含む組成物を産生する方法であって、
a. 表6に記載される配列の群から選択されるアミノ酸配列であって、少なくとも1つの切断配列を含む、アミノ酸配列を有する少なくとも1つのポリペプチドを含む組成物を提供することと、
b. 前記ポリペプチド組成物を、前記切断配列を切断するのに有効な条件下で、トリプシンで処置することと、を含み、
得られたXTEN配列の実質的に均質な集団中の個別の配列の少なくとも95%、96%、97%、98%、または99%が、同一配列長を有する、方法。
(項目2)
a. 前記XTEN配列を、クロマトグラフィー基質の上に、前記XTEN配列を捕捉するのには有効であるが、プロテアーゼにはそうでない条件下で吸着させることと、
b. 前記XTEN配列を溶離することと、
c. 前記XTEN配列を回収することと、をさらに含み、前記集団の個別の分子の少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%が、同一配列長を有する、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記クロマトグラフィー基質が、アニオン交換基質である、項目2に記載の方法。
(項目4)
前記アニオン交換基質が、macrocap Q、capto Q、superQ−650M、およびporos Dからなる群から選択される、項目3に記載の方法。
(項目5)
前記XTEN配列が、表6に記載されるアミノ酸配列の群から選択される配列に対して少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の配列同一性を有する、項目1〜4のいずれか1項に記載の方法。
(項目6)
前記XTEN配列が、表2または3に記載されるアミノ酸配列の群から選択される配列に対して少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の配列同一性を有する、項目1〜5のいずれか1項に記載の方法。
(項目7)
項目1〜6のいずれか1項に記載の方法によって産生される、組成物。
(項目8)
伸長組換えポリペプチド(XTEN)を含むポリペプチドの実質的に均質な集団を含む組成物であって、前記集団中の個別のポリペプチド分子の少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、または95%が、同一配列長を有する、組成物。
(項目9)
前記XTENが、
a. 前記XTENが、約36〜約3000個のアミノ酸残基を含むことと、
b. グリシン(G)、アラニン(A)、セリン(S)、トレオニン(T)、グルタミン酸塩(E)、およびプロリン(P)残基の合計が、前記XTENの全アミノ酸残基の約90%超を構成することと、
c. 前記XTEN配列が、(i)前記XTEN配列が、前記アミノ酸がセリンでない限り同一である3個の隣接するアミノ酸を含有しないか、(ii)前記XTEN配列の少なくとも約80%が、非重複配列モチーフからなり、前記配列モチーフのそれぞれが約9個〜約14個のアミノ酸残基を含み、いずれの2個の隣接するアミノ酸残基も、前記配列モチーフのそれぞれにおいて2回を超えて発生しないか、または(iii)前記XTEN配列が、10未満の部分列スコアを有するように、実質的に非反復的であることと、
d. 前記XTEN配列が、GORアルゴリズムによって決定される90%を超えるランダムコイル形成を有することと、
e. 前記XTEN配列が、Chou−Fasmanアルゴリズムによって決定される2%未満のαらせんおよび2%のβシートを有することと、
f. 前記XTEN配列が、TEPITOPEアルゴリズムによって分析されるとき、予測されたT細胞エピトープを欠き、前記XTEN配列内のエピトープについての前記TEPITOPEアルゴリズム予測は、−9のスコアに基づくことと、を特徴とする、項目8に記載の組成物。
(項目10)
前記XTENが、表2、表3、表4、および表22〜25に記載される配列からなる群から選択される配列に対して少なくとも約90%、または少なくとも約91%、または少なくとも約92%、または少なくとも約93%、または少なくとも約94%、または少なくとも約95%、または少なくとも約96%、または少なくとも約97%、または少なくとも約98%、または少なくとも約99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む、項目8に記載の組成物。
(項目11)
第1の親和性タグをさらに含む、項目8に記載の組成物。
(項目12)
前記第1の親和性タグが、疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)基質、カチオン交換基質、アニオン交換基質、固定化金属イオン親和性クロマトグラフィー(IMAC)基質、および固定化抗体基質からなる群から選択されるクロマトグラフィー基質に対する結合親和性を有する、項目11に記載の組成物。
(項目13)
前記第1の親和性タグが、表7に記載される配列からなる群から選択される、項目11に記載の組成物。
(項目14)
ヘルパー配列をさらに含む、項目11〜13のいずれか1項に記載の組成物。
(項目15)
前記ヘルパー配列が、表10に記載される配列からなる群から選択される配列に対して少なくとも約90%、または少なくとも約91%、または少なくとも約92%、または少なくとも約93%、または少なくとも約94%、または少なくとも約95%、または少なくとも約96%、または少なくとも約97%、または少なくとも約98%、または少なくとも約99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む、項目14に記載の組成物。
(項目16)
前記ヘルパー配列が、
a. KNPEQAEEQX1EET(式中、X1が、独立して、SまたはRである)、b. ANPEQAEEQX1EET(式中、X1が、独立して、SまたはRである)、c. KNPEQAEEQAEEQX1EET(式中、X1が、独立して、SまたはRである)、
d. KX2X3EQAEEQAEEQX1EET(式中、X1が、独立して、SまたはRであり、X2が、独立して、KまたはNであり、X3が、独立して、K、N、T、Q、H、P、E、D、A、R、またはSである)、
e. KX2(X3)10QX1EET(式中、X1が、独立して、SまたはRであり、X2が、独立して、KまたはNであり、X3が、独立して、K、N、T、Q、H、P、E、D、A、R、またはSである)、
f. KX2(X3)7AEEQX1EET(式中、X1が、独立して、SまたはRであり、X2が、独立して、KまたはNであり、X3が、独立して、K、N、T、Q、H、P、E、D、A、R、またはSである)、
g. KX2X3EQE(X3)3AEEQREET(式中、X2が、独立して、KまたはNであり、X3が、独立して、K、N、T、Q、H、P、E、D、A、R、またはSである)、
h. KX2X3EQE(X3)3AEE(X3)5(式中、X2が、独立して、KまたはNであり、X3が、独立して、K、N、T、Q、H、P、E、D、A、R、またはSである)、
i. KKQEQEKEQAEEQ(X4X5)2REET(式中、X4が、独立して、AまたはSであり、X5が、独立して、K、Q、またはEである);KKQEQEKEQAEEQ(X4X5)4REET(式中、X4が、独立して、AまたはSであり、X5が、独立して、K、Q、またはEである)、
j. KKQEQEKEQAEEQ(Z)4REET(式中、Zが、任意の天然に存在するLアミノ酸である)、
k. KX2(X3)n(式中、nが、10〜40の整数であり、X2が、独立して、KまたはNであり、X3が、独立して、K、N、T、Q、H、P、E、D、A、R、またはSである)、
l. (X3)n(式中、nが、10〜50の整数であり、X3が、独立して、K、N、T、Q、H、P、E、D、A、R、またはSである)、
m. KX2QEQEKEQAEEQ(X4X5)nX1EET(式中、nが、ゼロまたは1〜10の整数であり、X1が、独立して、SまたはRであり、X2が、独立して、KまたはNであり、X4が、独立して、AまたはSであり、X5が、独立して、K、Q、またはEである)、
n. KX2(X3)n(X4X5)mX1EET(式中、nが、5〜20の整数であり、mが、ゼロまたは1〜10の整数であり、X1が、独立して、SまたはRであり、X2が、独立して、KまたはNであり、X3が、独立して、K、N、T、Q、H、P、E、D、A、R、またはSであり、X4が、独立して、AまたはSであり、X5が、独立して、K、Q、またはEである)、
o. KX2(X3)n(Z)mX1EET(式中、nが、5〜20の整数であり、mが、ゼロまたは1〜10の整数であり、X1が、独立して、SまたはRであり、X2が、独立して、KまたはNであり、X3が、独立して、K、N、T、Q、H、P、E、D、A、R、またはSであり、Zが、任意の天然に存在するLアミノ酸である)からなる群から選択される、項目14に記載の組成物。
(項目17)
第1の切断配列をさらに含み、前記第1の切断配列が、表8および表9に記載される配列からなる群から選択される、項目11〜16のいずれか1項に記載の組成物。
(項目18)
前記組成物が、式I:
a. HSが、前記ヘルパー配列であり、
b. AT1が、前記第1の親和性タグであり、
c. CS1が、前記第1の切断配列であり、
d. XTENが、前記伸長組換えポリペプチドである、項目17に記載の組成物。
(項目19)
第2の切断配列をさらに含み、前記第1および前記第2の切断配列が、同じプロテアーゼによって切断されることができ、前記組成物が、式II:
a. HSが、ヘルパー配列であり、
b. AT1が、前記第1の親和性タグであり、
c. CS1が、前記第1の切断配列であり、
d. CS2が、前記第2の切断配列であり、
e. XTENが、前記伸長組換えポリペプチドである、項目17に記載の組成物。
(項目20)
前記第1の親和性タグが、配列RPRPRPRPRPRPRまたはHHHHHHを含む、項目18または項目19に記載の組成物。
(項目21)
第2の親和性タグおよび第2の切断配列をさらに含み、前記第2の親和性タグが、前記第1の親和性タグとは異なるクロマトグラフィー基質に対する結合親和性を有し、前記クロマトグラフィー基質が、HIC基質、カチオン交換基質、アニオン交換基質、IMAC基質、および固定化抗体基質からなる群から選択され、前記第1および前記第2の切断配列が、同じプロテアーゼによって切断されることができる、項目11〜17のいずれか1項に記載の組成物。
(項目22)
前記第2の親和性タグが、前記第1の親和性タグとは異なり、前記第2の親和性タグが、表7に記載される配列の群から選択される、項目21に記載の組成物。
(項目23)
前記組成物が、式III:
a. HSが、前記ヘルパー配列であり、
b. AT1が、前記第1の親和性タグであり、
c. CS1が、前記第1の切断配列であり、
d. CS2が、前記第2の切断配列であり、
e. XTENが、前記伸長組換えポリペプチドであり、
f. AT2が、前記第2の親和性タグである、項目21または項目22に記載の組成物。
(項目24)
前記第1の親和性タグが、前記配列RPRPRPRPRPRPRを含み、前記第2の親和性タグが、前記配列HHHHHHを含む、項目23に記載の組成物。
(項目25)
前記第1の親和性タグが、前記配列HHHHHHを含み、前記第2の親和性タグが、前記配列RPRPRPRPRPRPRを含む、項目23に記載の組成物。
(項目26)
a. ポリペプチドをコードするベクターを含む宿主細胞を、発酵反応において、前記宿主細胞の粗発現産物の成分として前記ポリペプチドを発現するのに有効な条件下で培養することであって、前記コードされたポリペプチドが、XTENと、第1の切断配列と、第1の親和性タグとを含む、培養することと、
b. 前記粗発現産物の前記ポリペプチドを、第1のクロマトグラフィー基質の上に、前記第1の親和性タグを前記第1のクロマトグラフィー基質の上に捕捉するのに有効な条件下で吸着させることと、
c. 前記ポリペプチドを溶離することと、
d. 前記集団の前記ポリペプチドの少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、または95%が、同一配列長を有する、前記ポリペプチドを回収することと、を含むプロセスによって得られたポリペプチドの実質的に均質な集団を含む、組成物。
(項目27)
前記第1のクロマトグラフィー基質が、HIC基質、カチオン交換基質、アニオン交換基質、およびIMAC基質からなる群から選択される、項目26に記載の組成物。
(項目28)
前記親和性タグが、表7に記載される親和性タグからなる群から選択される、項目26に記載の組成物。
(項目29)
前記第1のクロマトグラフィー基質が、カチオン交換であり、前記第1の親和性タグが、前記配列RPRPRPRPRPRPRを含む、項目27に記載の組成物。
(項目30)
前記第1のクロマトグラフィー基質が、IMACであり、前記第1の親和性タグが、前記配列HHHHHHHHを含む、項目27に記載の組成物。
(項目31)
前記ベクターが、項目11〜19のいずれか1項に記載のポリペプチドをコードする、項目26に記載の組成物。
(項目32)
前記ベクターが、第2の切断配列および第2の親和性タグをさらにコードし、前記第1および前記第2の切断配列が、同じプロテアーゼによって切断されることができ、前記第2の親和性タグが、前記第1の親和性タグとは異なる第2のクロマトグラフィー基質に対する結合親和性を有し、前記組成物が、
a. 前記ポリペプチドを、第2のクロマトグラフィー基質の上に、前記第2の親和性タグを前記第2のクロマトグラフィー基質の上に捕捉するのに有効な条件下で吸着させることと、
b. 前記ポリペプチドを溶離することと、
c. 前記集団の前記ポリペプチドの少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、または95%が、同一配列長を有する、前記ポリペプチドを回収することと、をさらに含むプロセスによって得られる、項目26〜28のいずれか1項に記載の組成物。
(項目33)
前記ベクターが、項目23に記載のポリペプチドをコードする、項目32に記載の組成物。
(項目34)
前記第1のクロマトグラフィー基質が、前記第2のクロマトグラフィー基質とは異なり、前記第1および前記第2のクロマトグラフィー基質のそれぞれが、独立して、HIC、カチオン交換、アニオン交換、およびIMACからなる群から選択される、項目32に記載の組成物。
(項目35)
前記第1のクロマトグラフィー基質が、カチオン交換であり、前記第1の親和性タグが、前記配列RPRPRPRPRPRPRを含み、前記第2のクロマトグラフィー基質が、IMACであり、前記第1の親和性タグが、前記配列HHHHHHHHを含む、項目32に記載の組成物。
(項目36)
前記第1のクロマトグラフィー基質が、IMACであり、前記第1の親和性タグが、前記配列HHHHHHHHを含み、前記第2のクロマトグラフィー基質が、カチオン交換であり、前記第1の親和性タグが、前記配列RPRPRPRPRPRPRを含む、項目32に記載の組成物。
(項目37)
前記プロセスが、
a. 前記組成物を、前記切断配列(複数可)を切断するのに有効な条件下で、プロテアーゼで処置し、それにより前記XTENを前記親和性タグ(複数可)から遊離させることと、
b. 前記XTENを、クロマトグラフィー基質の上に、前記XTENを捕捉するのには有効であるが、前記親和性タグ(複数可)または前記プロテアーゼにはそうではない条件下で吸着させることと、
c. 前記XTENを溶離することと、
d. 前記XTENを回収することと、をさらに含み、XTENの前記個別の分子の少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、または95%が、同一配列長を有する、項目23〜28または32〜34のいずれか1項に記載の組成物。
(項目38)
前記切断配列(複数可)が、表9のプロテアーゼからなる群から選択されるプロテアーゼによって切断されることができる、項目37に記載の組成物。
(項目39)
前記切断配列(複数可)が、トリプシンによって切断されることができ、前記配列が、表8に記載される配列からなる群から選択され、前記プロテアーゼが、トリプシンである、項目38に記載の組成物。
(項目40)
前記クロマトグラフィー基質が、アニオン交換である、項目37または38に記載の組成物。
(項目41)
前記アニオン交換クロマトグラフィー基質が、macrocap Q、capto Q、superQ−650M、およびporos Dからなる群から選択される、項目40に記載の組成物。
(項目42)
前記プロセスが、
a. 前記組成物を、前記切断配列(複数可)を切断するのに有効な条件下で、プロテアーゼで処置し、それにより前記XTENを前記親和性タグ(複数可)から遊離させることと、
b. 前記プロテアーゼを、クロマトグラフィー基質の上に、前記プロテアーゼを捕捉するのには有効であるが、前記XTENにはそうではない条件下で吸着させることと、
c. 前記XTENを溶離液から回収することと、をさらに含み、XTENの前記個別の分子の少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、または95%が、同一配列長を有する、項目23〜28または32〜34のいずれか1項に記載の組成物。
(項目43)
前記切断配列(複数可)が、表9のプロテアーゼからなる群から選択されるプロテアーゼによって切断されることができる、項目42に記載の組成物。
(項目44)
前記切断配列(複数可)が、トリプシンによって切断されることができ、前記配列が、表8に記載される配列からなる群から選択され、前記プロテアーゼが、トリプシンである、項目42または項目43に記載の組成物。
(項目45)
前記クロマトグラフィー基質が、カチオン交換基質、HIC基質、またはIMAC基質のうちの1つ以上である、項目42〜44のいずれか1項に記載の組成物。
(項目46)
XTEN配列を含む組成物であって、前記XTEN配列が、トリプシンによって切断されことができる1つ以上の切断配列をさらに含み、前記切断配列の全てを切断するのに有効な条件下で、トリプシンを用いた処置が、XTENフラグメントの調製物をもたらし、各XTENフラグメントが、前記調製物中のあらゆる他のフラグメントに対して少なくとも約95%、96%、97%、98%、または99%の配列同一性を有する、組成物。
(項目47)
前記切断配列が、配列SASRSAまたはSASKSAに対して少なくとも86%の配列同一性を有するか、または同一である、項目46に記載の組成物。
(項目48)
前記切断配列が、配列RXまたはKXを含み、式中、Xが、プロリン以外の任意のLアミノ酸である、項目46に記載の組成物。
(項目49)
前記組成物が、表6に記載される配列の群から選択される前記配列に対して少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有する、項目46に記載の組成物。
(項目50)
XTEN配列を宿主細胞中で産生するための方法であって、a)前記XTEN配列と、b)ヘルパー配列とを含むポリペプチドをコードするベクターを含む宿主細胞を、発酵反応において、粗発現産物の成分として前記ポリペプチドを発現するのに有効な条件下で、約2グラム/リットル(g/L)、または約3g/L、または約4g/L、または約5g/L、または約6g/L、または約7g/Lを超える前記ポリペプチドの濃度で培養することを含む、方法。
(項目51)
XTEN配列を宿主細胞中で産生するための方法であって、a)前記XTEN配列と、b)ヘルパー配列とを含むポリペプチドをコードするベクターを含む宿主細胞を、発酵反応において、粗発現産物の成分として前記ポリペプチドを発現するのに有効な条件下で、約10ミリグラム/グラムを超える乾燥重量宿主細胞(mg/g)濃度、または少なくとも約15mg/g、もしくは少なくとも約20mg/g、もしくは少なくとも約25mg/g、もしくは少なくとも約30mg/g、もしくは少なくとも約40mg/g、もしくは少なくとも約50mg/gの前記ポリペプチドの濃度で培養することを含む、方法。
(項目52)
XTEN配列を宿主細胞中で産生するための方法であって、a)前記XTEN配列と、b)ヘルパー配列とを含むポリペプチドをコードするベクターを含む宿主細胞を、発酵反応において、粗発現産物の成分として前記ポリペプチドを発現するのに有効な条件下で、約10ミリグラム/グラムを超える乾燥重量宿主細胞(mg/g)濃度、または少なくとも約250マイクロモル/L、もしくは約300マイクロモル/L、もしくは約350マイクロモル/L、もしくは約400マイクロモル/L、もしくは約450マイクロモル/L、もしくは約500マイクロモル/Lの前記ポリペプチドの濃度で培養することを含む、方法。
(項目53)
前記発酵反応が、600nmの波長で少なくとも130の光学密度に到達するときに、前記濃度が測定される、項目50〜52のいずれか1項に記載の方法。
(項目54)
前記発現されたポリペプチドの前記ヘルパー配列が、前記ポリペプチドのN末端に存在し、前記配列が、表10に記載される配列からなる群から選択される配列に対して少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、または95%の配列同一性を有するか、または同一である、項目50〜52のいずれか1項に記載の方法。
(項目55)
前記ベクターが、項目14〜17のいずれか1項に記載のポリペプチドをコードする、項目54に記載の方法。
(項目56)
a. 前記宿主細胞発酵反応混合物の前記粗発現産物を回収することと、
b. 前記粗発現産物の前記ポリペプチドを、第1のクロマトグラフィー基質の上に、前記ポリペプチドの前記第1の親和性タグを前記クロマトグラフィー基質の上に捕捉するのに有効な条件下で吸着させることであって、前記第1のクロマトグラフィー基質が、HIC基質、カチオン交換基質、アニオン交換基質、およびIMAC基質からなる群から選択される、吸着させることと、
c. 前記XTEN配列を溶離および回収することと、をさらに含み、前記ポリペプチドの少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、または95%が、同一配列長を有する、項目55に記載の方法。
(項目57)
前記ベクターが、項目21〜23のいずれか1項に記載のポリペプチドをコードする、項目50〜52のいずれか1項に記載の方法。
(項目58)
a. 前記宿主細胞発酵反応混合物の前記粗発現産物を回収することと、
b. 前記ポリペプチドを、第1のクロマトグラフィー基質の上に、前記ポリペプチドの前記第1の親和性タグを前記クロマトグラフィー基質の上に捕捉するのに有効な条件下で吸着させることであって、前記第1のクロマトグラフィー基質が、HIC基質、カチオン交換基質、アニオン交換基質、およびIMAC基質からなる群から選択される、吸着させることと、
c. 前記ポリペプチドを溶離することと、
d. 前記ポリペプチドを、第2のクロマトグラフィー基質の上に、前記ポリペプチドの前記第2の親和性タグを前記クロマトグラフィー基質の上に捕捉するのに有効な条件下で吸着させることであって、前記第2のクロマトグラフィー基質が、HIC基質、カチオン交換基質、アニオン交換基質、およびIMAC基質からなる群から選択される、吸着させることと、
e. 前記ポリペプチドを溶離することと、
f. 前記XTEN配列を回収することと、をさらに含み、前記ポリペプチドの少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、または95%が、同一配列長を有する、項目57に記載の方法。
(項目59)
a. 前記ポリペプチドを、前記切断配列を切断するのに有効な条件下で、プロテアーゼで処置し、それにより前記XTENを前記ポリペプチドから遊離させることと、
b. 前記XTENを、アニオンクロマトグラフィー基質の上に、前記XTENを捕捉するのに有効な条件下で吸着させることと、
c. 前記XTENを溶離することと、
d. 前記XTENを回収することと、をさらに含み、前記個別のXTEN分子の少なくとも90%、または少なくとも91%、または少なくとも92%、または少なくとも93%、または少なくとも94%、または少なくとも95%が、同一配列長を有する、項目56または項目58に記載の方法。
(項目60)
前記アニオンクロマトグラフィー基質が、macrocap Q、capto Q、superQ−650M、およびporos Dからなる群から選択される、項目59に記載の方法。
(項目61)
前記プロテアーゼがトリプシンであり、前記配列が、表8に記載される配列からなる群から選択される、項目59または項目60に記載の方法。
(項目62)
a. 前記ポリペプチドを、前記切断配列(複数可)を切断するのに有効な条件下で、プロテアーゼで処置し、それにより前記XTENを前記ポリペプチドから遊離させることと、
b. 前記プロテアーゼを、クロマトグラフィー基質の上に、前記プロテアーゼを捕捉するのには有効であるが、前記XTENにはそうではない条件下で吸着させることと、
c. 前記溶離液中の前記XTENを回収することと、をさらに含み、前記XTENの少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、または95%が、同一配列長を有する、項目56または項目58に記載の方法。
(項目63)
前記プロテアーゼがトリプシンであり、前記配列が、表8に記載される配列からなる群から選択される、項目62に記載の方法。
(項目64)
前記クロマトグラフィー基質が、HIC基質、カチオン交換基質、およびIMAC基質のうちの1つ以上である、項目62または項目63に記載の方法。
(項目65)
上に固定化された実質的に同一のポリペプチドの集団を含む、固体支持体であり、前記固体支持体が、クロマトグラフィー基質を含み、前記固定化されたポリペプチドが、それぞれ、XTEN、第1の親和性タグ、および第2の親和性タグを含み、
a. 前記第1の親和性タグが、前記XTENの前記N末端における切断配列によって、前記XTENに接合され、
b. 前記第2の親和性タグが、前記XTENの前記C末端における切断配列によって、前記XTENに接合され、
c. 前記第2の親和性タグが、前記第1の親和性タグとは異なり、
d. 前記クロマトグラフィー基質が、双方にではないが、前記第1または前記第2の親和性タグのいずれかに結合することができ、
e. 前記固定化ポリペプチド分子の少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、または95%が、同一配列長を有する、固体支持体。
(項目66)
前記固定化ポリペプチド分子が、項目21〜25のいずれか1項に記載のポリペプチドを含む、項目65に記載の固定支持体。
(項目67)
前記切断配列が、配列SASRSAまたはSASKSAに対して少なくとも86%の配列同一性を有するか、または同一である、項目65または項目66に記載の固定支持体。(項目68)
前記切断配列が、配列RXまたはKXを含み、式中、Xが、プロリン以外の任意のLアミノ酸である、項目65または項目66に記載の固体支持体。
(項目69)
前記固体支持体が、HICクロマトグラフィー樹脂、カチオン交換樹脂、アニオン交換クロマトグラフィー樹脂、およびIMACクロマトグラフィー樹脂からなる群から選択される、項目65〜68のいずれか1項に記載の固体支持体。
(項目70)
前記第1の親和性タグが、前記配列RPRPRPRPRPRPRを含み、前記第2の親和性タグが、前記配列HHHHHHを含む、項目69に記載の組成物。
(項目71)
前記第1の親和性タグが、前記配列HHHHHHを含み、前記第2の親和性タグが、前記配列RPRPRPRPRPRPRを含む、項目69に記載の組成物。
(項目72)
少なくとも第1の架橋剤の1つ以上の分子に共有結合したXTENを含む共役組成物であって、前記架橋剤が、表13に記載される架橋剤、表15に記載されるアルキン反応物、および表15に記載されるアジド反応物からなる群から選択され、前記XTENが、項目37に記載のXTEN、項目42に記載のXTEN、項目7に記載のXTEN、表2に記載される配列、および表3に記載される配列からなる群から選択される、共役組成物。(項目73)
前記第1の架橋剤が、
a. 前記XTENのN末端アミノ酸残基のαアミノ基、
b. 前記XTENの各リジン残基のεアミノ基、
c. 前記XTENの各システイン残基のチオール基、からなる群から選択される場所で、前記少なくとも第1のXTENに共役される、項目72に記載の共役組成物。
(項目74)
前記XTENが、表2および表3に記載される配列からなる群から選択される配列に対して少なくとも約90%、または少なくとも約91%、または少なくとも約92%、または少なくとも約93%、または少なくとも約94%、または少なくとも約95%、または少なくとも約96%、または少なくとも約97%、または少なくとも約98%、または少なくとも約99%、または100%の配列同一性を有する、項目72または項目73に記載の共役組成物。
(項目75)
前記XTENが、AE144、AE288、AE432、AE576、AE864、セグメント174、セグメント175、セグメント176、セグメント177、セグメント186、セグメント187、セグメント188、セグメント189、セグメント190、セグメント191、セグメント192、セグメント193、セグメント194、セグメント195、セグメント196、セグメント197、セグメント198、およびセグメント199からなる群から選択され、前記架橋剤が、前記XTENの前記N末端アミノ酸の前記αアミノ基に共役される、項目74に記載の共役組成物。
(項目76)
前記XTENが、表3に記載されるセグメント174、セグメント175、セグメント176、セグメント177、セグメント186、セグメント187、セグメント188、セグメント189、セグメント190、セグメント191、セグメント192、セグメント193、セグメント194、セグメント195、セグメント196、セグメント197、セグメント198、およびセグメント199からなる群から選択され、前記架橋剤が、前記XTENの各システイン残基の前記チオール基に共役される、項目74に記載の共役組成物。
(項目77)
前記第1の架橋剤が、N−マレイミド、ヨードアセチル試薬、ピリジルジスルフィド試薬、ビニルスルホン試薬、3−プロパルギルオキシプロパン酸、(オキシエチル)n−アセチレン(nが1〜10)、ジベンジルシクロオクチン(DBCO)、シクロオクチン(COT)、3−アジド−プロピオン酸、6−アジド−ヘキサン酸、および(オキシエチル)n−アジド(nが1〜10)からなる群から選択される、項目72〜76のいずれか1項に記載の共役体。
(項目78)
前記第1の架橋剤が、前記XTENの各システイン残基の前記チオール基に共役され、前記共役体が、前記XTENの前記N末端アミノ酸の前記αアミノ基に共役された第2の架橋剤をさらに含み、前記架橋剤が、表13に記載される架橋剤、表15に記載のアルキン反応物、および表15に記載のアジド反応物からなる群から選択される、項目76に記載の共役組成物。
(項目79)
式V:
の構成を有し、式中、独立して、各発生に対し、
a. CL1が、前記XTENのシステイン残基に共役された前記第1の架橋剤であり、b. CL2が、前記N末端においてXTENに共役された前記第2の架橋剤であり、
c. xが、1〜約10の整数であり、
d. yが整数1であるが、但し、x+y>2を条件とし、
e. XTENが、x個のシステイン残基を含むシステイン操作されたXTENである、項目78に記載の共役組成物。
(項目80)
各第1の架橋剤に共役された第1のペイロードの単一原子残基をさらに含み、前記残基が、炭素、窒素、酸素、および硫黄からなる群から選択される、項目72〜77のいずれか1項に記載の共役組成物。
(項目81)
前記単一原子残基の前記第1のペイロードが、表6、7、18、および21に記載されるペイロードからなる群から選択される、項目80に記載の共役組成物。
(項目82)
各第1の架橋剤に共役された表6、7、18、および21に記載されるペイロードからなる群から選択されるペイロードをさらに含む、項目72〜77のいずれか1項に記載の共役組成物。
(項目83)
第1の架橋剤のそれぞれに共役された第1のペイロードの単一原子残基であって、炭素、窒素、酸素、および硫黄からなる群から選択される残基と、前記第2の架橋剤に共役された第2のペイロードの単一原子残基であって、炭素、窒素、酸素、および硫黄からなる群から選択される残基と、をさらに含む、項目78または項目79に記載の共役組成物。(項目84)
前記単一原子残基の前記第1のペイロードが、表6、7、18、および21に記載されるペイロードからなる群から選択され、前記単一原子残基の前記第2のペイロードが、前記第1のペイロードとは異なるペイロードであり、表6、7、18、および21に記載されるペイロードからなる群から選択される、項目83に記載の共役組成物。
(項目85)
前記第1の架橋剤のそれぞれに共役された第1のペイロードであって、表6、7、18、および21に記載されるペイロードからなる群から選択される、第1のペイロードと、前記第2の架橋剤に共役された前記第1のペイロードとは異なる第2のペイロードであって、表6、7、18、および21に記載されるペイロードからなる群から選択される、第2のペイロードと、をさらに含む、項目78または項目79に記載の共役組成物。
(項目86)
前記第1の架橋剤のそれぞれに共役された第1のペイロードであって、表21の薬物部分からなる群から選択される、第1のペイロードと、前記第2の架橋剤に共役された前記第1のペイロードとは異なる第2のペイロードであって、表21の標的部分からなる群から選択される、第2のペイロードと、をさらに含む、項目78または項目79に記載の共役組成物。
(項目87)
前記第2のペイロードが、表15の反応物からなる群から選択される、アルキン反応物とアジド反応物との反応によって共役された前記第2の架橋剤によって、前記XTENの前記N末端に結合される、項目85または項目86に記載の共役組成物。
(項目88)
少なくとも第1および第2のXTENを含む、共役組成物であって、前記XTENが、同じであるか、または異なり、それぞれが項目37に記載のXTEN、項目42に記載のXTEN、項目7に記載のXTEN、および表3に記載される配列からなる群から選択され、前記第1および前記第2のXTENが、前記第1および前記第2のXTENの前記N末端によって、表15の反応物からなる群から選択されるアルキン反応物とアジド反応物との反応によって形成された架橋剤を用いて互いに共役される、共役組成物。
(項目89)
前記第1のXTENおよび前記第2のXTENが異なり、それぞれが独立して、表3に記載される配列の群から選択される配列に対して少なくとも約90%、または少なくとも約91%、または少なくとも約92%、または少なくとも約93%、または少なくとも約94%、または少なくとも約95%、または少なくとも約96%、または少なくとも約97%、または少なくとも約98%、または少なくとも約99%、または100%の配列同一性を有する、項目88に記載の共役組成物。
(項目90)
前記第1のXTENが、表3に記載されるセグメント174、セグメント175、セグメント176、セグメント177、セグメント186、セグメント187、セグメント188、セグメント189、セグメント190、セグメント191、セグメント192、セグメント193、セグメント194、セグメント195、セグメント196、セグメント197、セグメント198、およびセグメント199からなる配列の群から選択される配列に対して少なくとも約90%、または少なくとも約91%、または少なくとも約92%、または少なくとも約93%、または少なくとも約94%、または少なくとも約95%、または少なくとも約96%、または少なくとも約97%、または少なくとも約98%、または少なくとも約99%、または100%の配列同一性を有し、前記第2のXTENが、表3に記載されるセグメント174、セグメント175、セグメント176、セグメント177、セグメント186、セグメント187、セグメント188、セグメント189、セグメント190、セグメント191、セグメント192、セグメント193、セグメント194、セグメント195、セグメント196、セグメント197、セグメント198、およびセグメント199からなる配列の群から選択される異なる配列に対して少なくとも約90%、または少なくとも約91%、または少なくとも約92%、または少なくとも約93%、または少なくとも約94%、または少なくとも約95%、または少なくとも約96%、または少なくとも約97%、または少なくとも約98%、または少なくとも約99%、または100%の配列同一性を有する、項目89に記載の共役組成物。
(項目91)
前記第1のXTENおよび前記第2のXTENが、同じであり、それぞれが、表3に記載される配列の群から選択される配列に対して少なくとも約90%、または少なくとも約91%、または少なくとも約92%、または少なくとも約93%、または少なくとも約94%、または少なくとも約95%、または少なくとも約96%、または少なくとも約97%、または少なくとも約98%、または少なくとも約99%、または100%の配列同一性を有する、項目88に記載の共役組成物。
(項目92)
前記第1のXTENおよび前記第2のXTENが、それぞれ、表3に記載されるセグメント174、セグメント175、セグメント176、セグメント177、セグメント186、セグメント187、セグメント188、セグメント189、セグメント190、セグメント191、セグメント192、セグメント193、セグメント194、セグメント195、セグメント196、セグメント197、セグメント198、およびセグメント199からなる配列の群から選択される配列に対して少なくとも約90%、または少なくとも約91%、または少なくとも約92%、または少なくとも約93%、または少なくとも約94%、または少なくとも約95%、または少なくとも約96%、または少なくとも約97%、または少なくとも約98%、または少なくとも約99%、または100%の配列同一性を有する、項目91に記載の共役組成物。
(項目93)
前記第1および前記第2のXTENが、それぞれ、1つ以上のシステイン残基を含み、前記第1のXTENの各システイン残基に共役された第1の架橋剤と、前記第2のXTENの各システイン残基に共役された第2の架橋剤と、をさらに含み、前記第1および前記第2の架橋剤が、独立して、表13に記載される架橋剤からなる群から選択される、項目88〜92のいずれか1項に記載の共役組成物。
(項目94)
前記第1および前記第2のXTENが、それぞれ、1つ以上のリジン残基を含み、前記共役体の第1および/または前記第2のXTENの各リジン残基に共役された架橋剤をさらに含み、前記架橋剤が、表13に記載される架橋剤からなる群から選択される、項目88〜92のいずれか1項に記載の共役組成物。
(項目95)
前記第1のXTENの各架橋剤に共役された第1のペイロードの単一原子残基をさらに含み、前記残基が、炭素、窒素、酸素、および硫黄からなる群から選択され、前記第2のXTENの各架橋剤に共役された第2のペイロードの単一原子残基であって、前記残基が、炭素、窒素、酸素、および硫黄からなる群から選択される、項目93または項目94に記載の共役組成物。
(項目96)
前記単一原子残基の前記第1のペイロードが、表6、7、18、および21に記載されるペイロードからなる群から選択され、前記単一原子残基の前記第2のペイロードが、前記第1のペイロードとは異なるペイロードであり、表6、7、18、および21に記載されるペイロードからなる群から選択される、項目95に記載の共役組成物。
(項目97)
前記第1のXTENの各架橋剤に共役された第1のペイロードをさらに含み、前記第1のペイロードが、表6、7、18、および21に記載されるペイロードからなる群から選択され、前記第1のペイロードとは異なる第2のペイロードをさらに含み、前記第2のペイロードが、表6、7、18、および21に記載されるペイロードからなる群から選択される、項目93または項目94に記載の共役組成物。
(項目98)
前記第1のXTENの各架橋剤に共役された第1のペイロードをさらに含み、前記第1のペイロードが、表18に記載される標的部分からなる群から選択され、前記第1のペイロードとは異なる第2のペイロードをさらに含み、前記第2のペイロードが、表18に記載される毒素の群から選択される、項目93または項目94に記載の共役組成物。
(項目99)
前記第1のXTENの各架橋剤に共役された第1のペイロードをさらに含み、前記第1のペイロードが、表21に記載される標的部分からなる群から選択され、前記第1のペイロードとは異なる第2のペイロードをさらに含み、前記第2のペイロードが、表21に記載される毒素の群から選択される、項目93または項目94に記載の共役組成物。
(項目100)
前記第1のXTENが、表3のセグメント176であり、前記第2のXTENが、表3に記載されるセグメント176およびセグメント177からなる群から選択される、項目99に記載の共役組成物。
(項目101)
少なくとも第1のXTEN、第2のXTEN、および第3のXTENを含む、共役組成物であって、前記XTENが、それぞれ、独立して、項目37に記載のXTEN、項目42に記載のXTEN、項目7に記載のXTEN、および表3に記載の配列からなる群から選択され、前記第1および前記第2および前記第3のXTENが、表13または表14に記載される三価架橋剤からなる群から選択される三価架橋剤を使用し、前記N末端で互いに共役される、共役組成物。
(項目102)
前記三価架橋剤が、トリス−(2−マレイミドエチル)アミン(TMEA)およびアミン反応性トリス−(スクシンイミジルアミノトリアセテート(TSAT)からなる群から選択される、項目100に記載の共役組成物。
(項目103)
前記第1、前記第2、および前記第3のXTENが、同一であり、それぞれが、表3に記載されるセグメント174、セグメント175、セグメント176、セグメント177、セグメント186、セグメント187、セグメント188、セグメント189、セグメント190、セグメント191、セグメント192、セグメント193、セグメント194、セグメント195、セグメント196、セグメント197、セグメント198、およびセグメント199からなる群から選択される配列に対して少なくとも約90%、または少なくとも約91%、または少なくとも約92%、または少なくとも約93%、または少なくとも約94%、または少なくとも約95%、または少なくとも約96%、または少なくとも約97%、または少なくとも約98%、または少なくとも約99%、または100%の配列同一性を有する、項目100〜102のいずれか1項に記載の共役組成物。
(項目104)
前記第1および前記第2のXTENが、同じであり、それぞれが、表3に記載されるセグメント174、セグメント175、セグメント176、セグメント177、セグメント186、セグメント187、セグメント188、セグメント189、セグメント190、セグメント191、セグメント192、セグメント193、セグメント194、セグメント195、セグメント196、セグメント197、セグメント198、およびセグメント199からなる群から選択される配列に対して少なくとも約90%、または少なくとも約91%、または少なくとも約92%、または少なくとも約93%、または少なくとも約94%、または少なくとも約95%、または少なくとも約96%、または少なくとも約97%、または少なくとも約98%、または少なくとも約99%、または100%の配列同一性を有し、前記第3のXTENが、前記第1および前記第2のXTENとは異なり、表3に記載されるセグメント174、セグメント175、セグメント176、セグメント177、セグメント186、セグメント187、セグメント188、セグメント189、セグメント190、セグメント191、セグメント192、セグメント193、セグメント194、セグメント195、セグメント196、セグメント197、セグメント198、およびセグメント199からなる群から選択される配列に対して少なくとも約90%、または少なくとも約91%、または少なくとも約92%、または少なくとも約93%、または少なくとも約94%、または少なくとも約95%、または少なくとも約96%、または少なくとも約97%、または少なくとも約98%、または少なくとも約99%、または100%の配列同一性を有する、項目100〜102のいずれか1項に記載の共役組成物。
(項目105)
前記共役体が、前記第1のXTENの各システイン残基に共役された第1の架橋剤と、前記第2のXTENの各システイン残基に共役された第2の架橋剤と、前記第3のXTENの各システイン残基に共役された第3の架橋剤と、をさらに含み、前記架橋剤が、表13に記載される架橋剤からなる群から選択される、項目103または項目104に記載の共役組成物。
(項目106)
式XII:
a. 3xCLが、前記三価架橋剤であり、
b. CL1が、XTEN1に共役された前記第1の架橋剤であり、
c. CL2が、XTEN2に共役された前記第2の架橋剤であり、
d. CL3が、XTEN3に共役された前記第3の架橋剤であり、
e. xが、1〜約10の整数であり、
f. yが、1〜約10の整数であり、
g. zが、1〜約10の整数であるが、但し、x+y>3を条件とし、
h. XTEN1が、前記第1のXTENであり、
i. XTEN2が、前記第2のXTENであり、
j. XTEN3が、前記第3のXTENである、項目105に記載の共役組成物。
(項目107)
a. 前記第1のXTENの各第1の架橋剤に共役された第1のペイロードの単一原子残基であって、炭素、窒素、酸素、および硫黄からなる群から選択される、残基と、
b. 前記第2のXTENの各第2の架橋剤に共役された第2のペイロードの単一原子残基であって、炭素、窒素、酸素、および硫黄からなる群から選択される、残基と、
c. 前記第3のXTENの各第3の架橋剤に共役された第3のペイロードの単一原子残基であって、炭素、窒素、酸素、および硫黄からなる群から選択される、残基と、をさらに含む、項目105または項目106に記載の共役組成物。
(項目108)
a. 表6、7、18、および21に記載されるペイロードからなる群から選択される、前記第1のXTENの各第1の架橋剤に共役された第1のペイロードと、
b. 表6、7、18、および21に記載されるペイロードからなる群から選択される、前記第2のXTENの各第2の架橋剤に共役された第2のペイロードと、
c. 表6、7、18、および21に記載されるペイロードからなる群から選択される、前記第3のXTENの各第3の架橋剤に共役された第3のペイロードと、をさらに含む、項目105または項目106に記載の共役組成物。
(項目109)
前記第1のペイロードが、標的に対する特異的結合親和性を持つ標的部分であり、前記標的部分が、表17〜19および21に記載される標的部分からなる群から選択され、前記第2および前記第3のペイロードが、同じであり得るか、または異なり得る薬物であり、前記薬物が、表6、表18、および表21に記載される薬物からなる群から選択される、項目108に記載の共役組成物。
(項目110)
前記標的部分が、LHRHおよび葉酸からなる群から選択され、前記薬物が、ドキソルビシン、パクリタキセル、オーリスタチン、モノメチルオーリスタチンE(MMAE)、モノメチルオーリスタチンF、メイタンシン、ドラスタチン、カリケアミシン、ビンカアルカロイド、カンプトテシン、ミトマイシンC、エポチロン、hTNF、I1−12、ボルテゾミブ、ランピルナーゼ、スードモナス、エキソトキシン、SN−38、およびラケルマイシンからなる群から選択される、項目109に記載の共役組成物。
(項目111)
前記標的部分、および前記薬物部分が、表21に記載される共役体1〜290のうちのいずれか1つに対応する、項目108に記載の共役組成物。
(項目112)
前記共役体が、前記XTEN、前記標的部分、および表21の共役体71に対応する前記薬物部分を有する、項目111に記載の共役組成物。
(項目113)
少なくとも第1および第2および第3および第4のXTENを含む共役組成物であって、前記XTENが、項目37に記載のXTEN、項目42に記載のXTEN、項目7に記載のXTEN、および表3に記載される配列からなる群から選択され、前記XTENが、同じであり得るか、または異なり得、前記第1および前記第2および前記第3および前記第4のXTENが、四価架橋剤を使用し、前記N末端によって互いに共役され、前記四価架橋剤が、四価マレイミドクラスターである、共役組成物。
(項目114)
前記第1、前記第2、前記第3、および前記第4のXTENが、同じであり、それぞれが、表3に記載される、セグメント174、セグメント175、セグメント176、セグメント177、セグメント186、セグメント187、セグメント188、セグメント189、セグメント190、セグメント191、セグメント192、セグメント193、セグメント194、セグメント195、セグメント196、セグメント197、セグメント198、およびセグメント199からなる群から選択される配列に対して少なくとも約90%、または少なくとも約91%、または少なくとも約92%、または少なくとも約93%、または少なくとも約94%、または少なくとも約95%、または少なくとも約96%、または少なくとも約97%、または少なくとも約98%、または少なくとも約99%、または100%の配列同一性を有する、項目113に記載の共役組成物。
(項目115)
前記第1および前記第2のXTENが、同じであり、それぞれが、表3に記載されるセグメント174、セグメント175、セグメント176、セグメント177、セグメント186、セグメント187、セグメント188、セグメント189、セグメント190、セグメント191、セグメント192、セグメント193、セグメント194、セグメント195、セグメント196、セグメント197、セグメント198、およびセグメント199からなる群から選択される配列に対して少なくとも約90%、または少なくとも約91%、または少なくとも約92%、または少なくとも約93%、または少なくとも約94%、または少なくとも約95%、または少なくとも約96%、または少なくとも約97%、または少なくとも約98%、または少なくとも約99%、または100%の配列同一性を有し、前記第3および前記第4のXTENが、同じであるが、前記第1および前記第2のXTENとは異なり、それぞれが、表3に記載されるセグメント174、セグメント175、セグメント176、セグメント177、セグメント186、セグメント187、セグメント188、セグメント189、セグメント190、セグメント191、セグメント192、セグメント193、セグメント194、セグメント195、セグメント196、セグメント197、セグメント198、およびセグメント199からなる群から選択される配列に対して少なくとも約90%、または少なくとも約91%、または少なくとも約92%、または少なくとも約93%、または少なくとも約94%、または少なくとも約95%、または少なくとも約96%、または少なくとも約97%、または少なくとも約98%、または少なくとも約99%、または100%の配列同一性を有する、項目113のいずれか1項に記載の共役組成物。
(項目116)
前記共役体が、前記第1のXTENの各システイン残基に共役された第1の架橋剤と、前記第2のXTENの各システイン残基に共役された第2の架橋剤と、前記第3のXTENの各システイン残基に共役された第3の架橋剤と、前記第4のXTENの各システイン残基に共役された第4の架橋剤と、をさらに含み、各架橋剤が、表13に記載される架橋剤からなる群から選択される、項目114または項目115に記載の共役組成物。
(項目117)
式XIV
a. 4xCLが、前記四価架橋剤であり、
b. CL1が、XTEN1に共役された前記第1の架橋剤であり、
c. CL2が、XTEN2に共役された前記第2の架橋剤であり、
d. CL3が、XTEN3に共役された前記第3の架橋剤であり、
e. CL4が、XTEN4に共役された前記第4の架橋剤であり、
f. vが、1〜約10の整数であり、
g. xが、1〜約10の整数であり、
h. yが、1〜約10の整数であり、
i. zが、1〜約10の整数であるが、但し、x+y>4を条件とし、
j. XTEN1が、前記第1のXTENであり、
k. XTEN2が、前記第2のXTENであり、
l. XTEN3が、前記第3のXTENであり、
m. XTEN4が、前記第4のXTENである、項目116のいずれか1項に記載の共役組成物。
(項目118)
a. 前記第1のXTENの各第1の架橋剤に共役された第1のペイロードの単一原子残基であって、炭素、窒素、酸素、および硫黄からなる群から選択される、残基と、
b. 前記第2のXTENの各第2の架橋剤に共役された第2のペイロードの単一原子残基であって、炭素、窒素、酸素、および硫黄からなる群から選択される、残基と、
c. 前記第3のXTENの各第3の架橋剤に共役された第3のペイロードの単一原子残基であって、炭素、窒素、酸素、および硫黄からなる群から選択される、残基と、
d. 前記第4のXTENの各第4の架橋剤に共役された第4のペイロードの単一原子残基であって、炭素、窒素、酸素、および硫黄からなる群から選択される、残基と、をさらに含む、項目116または項目117に記載の共役組成物。
(項目119)
a. 表6、7、18、および21に記載されるペイロードからなる群から選択される、前記第1のXTENの各第1の架橋剤に共役された第1のペイロードと、
b. 表6、7、18、および21に記載されるペイロードからなる群から選択される、前記第2のXTENの各第2の架橋剤に共役された第2のペイロードであって、前記第1のペイロードと同じであるか、または異なる、ペイロードと、
c. 表6、7、18、および21に記載されるペイロードからなる群から選択される、前記第3のXTENの各第3の架橋剤に共役された第3のペイロードであって、前記第1または前記第2のペイロードと同じであるか、または異なる、ペイロードと、
d. 表6、7、18、および21に記載されるペイロードからなる群から選択される、前記第4のXTENの各第4の架橋剤に共役された第4のペイロードであって、前記第1または前記第2または前記第3のペイロードと同じであるか、または異なる、ペイロードと、をさらに含む、項目116または項目117に記載の共役組成物。
(項目120)
前記第1のペイロードが、標的に対する特異的結合親和性を持つ標的部分であり、前記標的部分が、表17〜19および21に記載される標的部分からなる群から選択され、前記第2、第3、および第4のペイロードのうちの少なくとも他の1つが、薬物であり、前記薬物が、表6、表18、および表21に記載される薬物からなる群から選択される、項目119に記載の共役組成物。
(項目121)
前記標的部分が、LHRHおよび葉酸からなる群から選択され、前記薬物が、ドキソルビシン、パクリタキセル、オーリスタチン、メイタンシン、ドラスタチン、カリケアミシン、ビンカアルカロイド、カンプトテシン、ミトマイシンC、エポチロン、hTNF、I1−12、ボルテゾミブ、ランピルナーゼ、スードモナス、エキソトキシン、SN−38、およびラケルマイシンからなる群から選択される、項目120に記載の共役組成物。
(項目122)
前記第1のペイロードが、標的に対する特異的結合親和性を持つ標的部分であり、前記標的部分が、表17〜19および21に記載される標的部分からなる群から選択され、前記第2、第3、および第4のペイロードのうちの少なくとも他の1つが、薬物であり、前記薬物が、表6、表18、および表21に記載される薬物からなる群から選択され、前記XTEN、前記標的部分、および前記薬物部分が、表21に記載される共役体1〜290のうちのいずれか1つに対応する、項目119に記載の共役組成物。
(項目123)
式XVI:
a. 3xCLが、前記三価架橋剤であり、
b. CL1が、XTEN1に共役された前記第1の架橋剤であり、
c. CL2が、XTEN2に共役された前記第2の架橋剤であり、
d. xが、1〜約10の整数であり、
e. yが整数1〜約10であるが、但し、x+y>2を条件とし、
f. XTEN1が、前記第1のXTENであり、
g. XTEN2が、前記第2のXTENであり、
h. XTEN3が、前記第3のXTENであり、前記XTENが、表2に記載される配列からなる群から選択される、項目101に記載の共役組成物。
(項目124)
a. 前記第1のXTENの各第1の架橋剤に共役された第1のペイロードの単一原子残基であって、炭素、窒素、酸素、および硫黄からなる群から選択される、残基と、
b. 前記第2のXTENの各第2の架橋剤に共役された第2のペイロードの単一原子残基であって、炭素、窒素、酸素、および硫黄からなる群から選択される、残基と、をさらに含む、項目123に記載の共役組成物。
(項目125)
a. 表6、7、18、および21に記載されるペイロードからなる群から選択される、前記第1のXTENの各第1の架橋剤に共役された第1のペイロードと、
b. 表6、7、18、および21に記載されるペイロードからなる群から選択される、前記第2のXTENの各第2の架橋剤に共役された第2のペイロードであって、前記第1のペイロードと同じであるか、または異なる、ペイロードと、をさらに含む、項目123に記載の共役組成物。
(項目126)
前記第1のペイロードが、標的に対する特異的結合親和性を持つ標的部分であり、前記標的部分が、表17〜19および21に記載される標的部分からなる群から選択され、前記第2のペイロードが、同じであり得るか、または異なり得る薬物であり、前記薬物が、表6、表18、および表21に記載される薬物からなる群から選択される、項目125に記載の共役組成物。
(項目127)
前記標的部分が、LHRHおよび葉酸からなる群から選択され、前記薬物が、ドキソルビシン、パクリタキセル、オーリスタチン、モノメチルオーリスタチンE(MMAE)、モノメチルオーリスタチンF、メイタンシン、ドラスタチン、カリケアミシン、ビンカアルカロイド、カンプトテシン、ミトマイシンC、エポチロン、hTNF、I1−12、ボルテゾミブ、ランピルナーゼ、スードモナス、エキソトキシン、SN−38、およびラケルマイシンからなる群から選択される、項目126に記載の共役組成物。
(項目128)
前記第1のペイロードが、表11の薬物および表12のタンパク質からなる群から選択され、前記第2のペイロードが、前記第1のペイロードとは異なり、表11の薬物および表12のタンパク質からなる群から選択される、項目125に記載の共役組成物。
(項目129)
前記第1のペイロードおよび前記第2のペイロードが、同一であり、表11の薬物および表12のタンパク質からなる群から選択される、項目125に記載の共役組成物。
(項目130)
式XXVII:
a. 3xCLが、前記三価架橋剤であり、
b. CL1が、XTEN1に共役された前記第1の架橋剤であり、
c. xが、1〜約10の整数であり、
d. XTEN1が、前記第1のXTENであり、前記XTENが、表3に記載される配列からなる群から選択され、
e. XTEN2が、前記第2のXTENであり、前記XTENが、表2に記載される配列からなる群から選択され、
f. XTEN3が、前記第3のXTENであり、前記XTENが、表2に記載される配列からなる群から選択される、項目101に記載の共役組成物。
(項目131)
前記第1のXTENの各第1の架橋剤に共役された第1のペイロードの単一原子残基をさらに含み、前記残基が、炭素、窒素、酸素、および硫黄からなる群から選択される、項目130に記載の共役組成物。
(項目132)
表6、7、18、および21に記載されるペイロードからなる群から選択される、前記第1のXTENの各第1の架橋剤に共役された第1のペイロードをさらに含む、項目130に記載の共役組成物。
(項目133)
多量体分岐XTEN分子を含む組成物であって、前記組成物の溶液が、同じアミノ酸数および同じモル濃度を有する対応する直線XTENを含む溶液よりも低い粘度を有する、組成物。
(項目134)
前記XTEN分子が、三量体、四量体、または五量体構成を有する、項目133に記載の組成物。
(項目135)
前記XTEN分子が、表2および表3に記載される配列からなる群から選択される、項目133に記載の組成物。
(項目136)
前記溶液の前記粘土が、≧100mg/mlの多量体XTENを含む溶液中で、≧100mg/mlの等モル濃度の前記対応する直線XTENを含む溶液と比較して、少なくとも5、6、7、8、9、または10cPだけ減少する、項目133〜135のいずれか1項に記載の組成物。
(項目137)
表52に記載される配列の群から選択される配列に対して少なくとも約90%、または少なくとも約91%、または少なくとも約92%、または少なくとも約93%、または少なくとも約94%、または少なくとも約95%、または少なくとも約96%、または少なくとも約97%、または少なくとも約98%、または少なくとも約99%、または100%の配列同一性を有する、ポリペプチド。
(項目138)
項目85〜87、97〜99、108〜112、118〜122、125〜127、129、または132のいずれか1項に記載の前記共役体と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
(項目139)
表16に記載される状態の群から選択される状態の処置のための項目138に記載の薬学的組成物。
(項目140)
対象の処置のための薬学的計画において使用するための、前記計画が、前記薬学的組成物を含む、項目138に記載の薬学的組成物。
(項目141)
前記薬学的計画が、表16に記載される状態の群から選択される状態を有する対象において、有益な効果を達成するために必要とされる薬学的組成物の量を決定するステップをさらに含む、項目140に記載の薬学的組成物。
(項目142)
前記対象を処置するための前記薬学的計画が、前記薬学的組成物を2つ以上の連続用量で前記対象に有効な量で投与することを含み、前記投与が、未処置の対象と比較して、前記状態と関連付けられた少なくとも1つ、2つ、または3つのパラメータの少なくとも10%、または20%、または30%、または40%、または50%、または60%、または60%、または70%、または80%、または90%超の改善をもたらす、項目141に記載の薬学的組成物。
(項目143)
表16に記載される状態の群から選択される状態の処置のための薬剤の調製において使用するための、項目85〜87、97〜99、108〜112、118〜122、125〜127、129、または132のいずれか1項に記載の共役体。
(項目144)
XTENに結合されたペイロードの組合せを治療薬として選択する方法であって、
a. 複数のXTEN配列を含むXTENのライブラリーを提供することであって、前記XTEN配列のそれぞれが、少なくとも第1のペイロード、および前記第1のペイロードとは異なる少なくとも第2のペイロードに共役される、提供することと、
b. 前記ライブラリーから、(1)前記第1のペイロード単独に共役されたXTEN配列、および(2)前記第2のペイロード単独に共役されたXTEN配列のものと比較して、改善されたインビトロまたはインビボパラメータを呈する場合に、XTEN配列を治療薬として選択することと、を含む、方法。
(項目145)
前記第1のペイロードおよび第2のペイロードが、共通の疾患を寛解させるために治療上有効である、項目144に記載の方法。
(項目146)
前記第1の薬物および第2の薬物が、共通の疾患の異なる症状を処置するために治療上有効である、項目144に記載の方法。
(項目147)
前記共通の疾患が、癌、癌の支持療法、心血管、中枢神経系、内分泌疾患、消化管、血液学的、HIV感染、ホルモン疾患、炎症、自己免疫疾患、感染症、代謝疾患、筋骨格系疾患、腎臓学的障害、眼科疾患、疼痛、および呼吸器から選択される、項目145または項目146に記載の方法。
(項目148)
前記第1のペイロードおよび第2のペイロードが、共通の生物学的経路を介して、それらの治療効果を媒介する、項目144に記載の方法。
(項目149)
前記第1のペイロードおよび第2のペイロードが、表6、表18、および表21に記載される薬物からなる群から選択される、異なる薬物である、項目144に記載の方法。
(項目150)
前記第1のペイロードおよび第2のペイロードが、表7、表18、および表21に記載されるタンパク質からなる群から選択される、異なる生物学的に活性なタンパク質である、項目144に記載の方法。
(項目151)
前記第1のペイロードが、表6、表18、および表21に記載される薬物からなる群から選択される薬物であり、前記第2のペイロードが、表7、表18、および表21に記載されるタンパク質からなる群から選択される生物学的に活性なタンパク質である、項目144に記載の方法。
(項目152)
SASRSAまたはSASXSA(Xが、RまたはKである)から選択される配列を有する、タンパク質分解切断部位を介して、親和性精製タグに結合される伸長組換えポリペプチド(XTEN)を含む、単離されたポリペプチド。
(項目153)
SASRSAまたはSASXSA(Xが、RまたはKである)から選択される配列を有する、タンパク質分解切断部位を介して、そのN末端で第1の親和性精製タグに結合され、SASRSAまたはSASXSA(Xが、RまたはKである)から選択される配列を有する、タンパク質分解切断部位を介して、そのC末端で第2の親和性精製タグに結合される、伸長組換えポリペプチド(XTEN)を含む、ポリペプチド。
(項目154)
図117に記載される構造を有する組成物。
(参照による組み込み)
本明細書に記載される全ての刊行物、特許および特許出願は、各個別の刊行物、特許、または特許出願が、明確かつ個別に参照により組み込まれることが示されているのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
定義
本出願の文脈において、以下の用語は、別段の指定が無い限り、それらに帰する意味を有する。
I). 一般的技法
本発明の実践は、別途指示が無い限り、当該技術分野の範囲内である、免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノミクス、および組換えDNAの従来技法を採用する。Sambrook,J.et al.,″Molecular Cloning:A Laboratory Manual,″3rd edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001、″Current protocols in molecular biology″,F.M.Ausubel,et al.eds.,1987、the series ″Methods in Enzymology,″Academic Press,San
Diego,CA.、″PCR 2:a practical approach″,M.J.MacPherson,B.D.Hames and G.R.Taylor eds.,Oxford University Press,1995、″Antibodies,a laboratory manual″Harlow,E.and Lane,D.eds.,Cold Spring Harbor Laboratory,1988,″Goodman & Gilman‘s The Pharmacological Basis of Therapeutics,″11th Edition,McGraw−Hill,2005、およびFreshney,R.I.,″Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique,″4th edition,John Wiley & Sons,Somerset,NJ,2000(これらの内容は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる)を参照されたい。
Lennoxブロスである。LBブロスは、ペプトン(カゼインの酵素消化産物)、酵母抽出物、および塩化ナトリウムを含む。いくつかの実施形態において、抗生物質を含む選択的培地が使用される。この培地において、その抗生物質への抵抗性を有する所望の細胞のみが成長する。
II). XTENタンパク質ポリマーおよび共役組成物
本発明は、部分的に、伸長組換えポリペプチド(XTEN)を含む、実質的に均質の組成物に関する。第1の態様において、本発明は、長さが実質的に均一のXTEN組成物を提供する。そのような組成物は、XTEN−架橋剤の中間体およびXTEN−ペイロード組成物を創製するための試薬共役パートナーとして有用である。さらに、本発明の目的は、実質的に均質なXTEN組成物を創製するための方法を提供することである。本発明は、そのような実質的に均質なXTEN組成物を高収率で創製するための方法も提供する。
1. XTEN:伸長組換えポリペプチド
一態様において、本発明は、直接または架橋剤反応物を介してのいずれかで、1つ以上のペイロードに結合し、XTEN−ペイロード複合体をもたらすための共役パートナーとして有用な実質的に均質なXTENポリペプチド組成物を提供する。
1. 非反復的配列
特に、対象の共役組成物の実施形態に含まれる対象のXTEN配列は、実質的に非反復的であることが企図される。一般に、反復アミノ酸配列は、コラーゲンおよびロイシンジッパー等の天然反復配列によって例示されるように、凝集するか、または高次構造を形成する傾向がある。これらの反復アミノ酸は、結晶または偽晶構造をもたらす接触を形成する傾向もあり得る。対照的に、非反復的配列が凝集する傾向が低いことは、そうでなければ配列が反復する場合に凝集する可能性がある比較的低周波の電荷アミノ酸を持つ長配列XTENの設計を可能にする。対象XTENの非反復性は、以下の特徴のうちの1つ以上を評価することによって観察され得る。一実施形態において、実質的に非反復的なXTEN配列は、アミノ酸がセリンでない限り、同一アミノ酸型である配列中に3個の隣接するアミノ酸を有さず、この場合、3個以下の隣接するアミノ酸はセリン残基である。別の実施形態において、以下により完全に記載されるように、実質的に非反復的なXTEN配列は、その配列の80〜99%が9〜14個のアミノ酸残基のモチーフからなり、これらのモチーフは、グリシン(G)、アラニン(A)、セリン(S)、トレオニン(T)、グルタミン酸塩(E)およびプロリン(P)から選択される3、4、5、または6種のアミノ酸で構成され、いずれか1つのモチーフにおけるいずれか2つの隣接するアミノ酸残基の配列は、その配列モチーフにおいて2回を超えて反復しない。
2. 例示的な配列モチーフ
本発明は、複数単位のより短い配列、またはモチーフを含む共役パートナーとして使用されるXTENを包含し、モチーフのアミノ酸配列は、実質的に非反復的である。非反復特性は、図18〜19に示されるように、XTEN配列を形成するために多量体化される配列モチーフのライブラリーを使用する「構築ブロック」アプローチを使用しても満たされ得る。XTEN配列がわずか4つの異なる種の配列モチーフの複数単位からなり得るが、これらのモチーフ自体は、一般に非反復アミノ酸配列からなるため、全体XTEN配列は、配列を実質的に非反復的にするように設計される。
3. システインおよびリジン操作されたXTEN配列
別の態様において、本発明は、定義された数の組み込まれたシステインまたはリジン残基を持つXTEN、それぞれ「システイン操作されたXTEN」および「リジン操作されたXTEN」を提供する。本発明の目的は、システインのチオール基またはリジンのεアミノ基と、XTEN骨格に共役されるペイロードまたは架橋剤上の反応基との間の共役を許すように、定義された数のシステインおよび/またはリジン残基を持つXTENを提供することである。前述の一実施形態において、本発明のXTENは、約1〜約100個のリジン残基、または約1〜約70個のリジン残基、または約1〜約50個のリジン残基、または約1〜約30個のリジン残基、または約1〜約20個のリジン残基、または約1〜約10個のリジン残基、または約1〜約5個のリジン残基、または1〜約3個のリジン残基、または代替として、単一リジン残基のみを有する。前述の別の実施形態において、本発明のXTENは、約1〜約100個のシステイン残基、または約1〜約70個のシステイン残基、または約1〜約50個のシステイン基、または約1〜約30個のシステイン残基、または約1〜約20個のシステイン残基、または約1〜約10個のシステイン残基、または約1〜約5個のシステイン残基、または1〜約3個のシステイン残基、または代替として、単一システイン残基のみを有する。前述の別の実施形態において、本発明のXTENは、約1〜約10個のリジン残基、および約1〜約10個のシステイン残基を有する。前述のリジンおよび/またはシステイン含有XTENを使用して、XTEN、任意の架橋剤、プラス対象における状態の処置において有用なペイロードを含む共役体を構築することができ、XTEN成分に結合されたペイロード剤の分子の最大数は、リジン、システイン、またはXTENに組み込まれた反応性側基(例えば、末端アミノまたはチオール)を持つ他のアミノ酸の数によって決定される。
GGSPAGSCTSP
GASASCAPSTG
TAEAAGCGTAEAA
GPEPTCPAPSG
GGSPAGSKTSPGASASKAPSTG
しかしながら、本発明は、XTENに組み込むための、表5および表11に示されるもの等の異なる長さのモチーフを企図する。
4. 配列の長さ
別の態様において、本発明は、組成物に組み込むための可変長のXTENを提供し、このXTEN配列(複数可)の長さは、組成物中で達成される特性または機能に基づいて選択される。意図される特性または機能に応じて、XTEN−ペイロード共役体は、短いか、中間長のXTEN、またはより長いXTEN配列、あるいは担体として機能し得る短い、中間、またはより長いXTENの多量体を含む。限定することが意図されないが、XTENまたはXTENのフラグメントは、約6〜約99個のアミノ酸残基の短いセグメント、約100〜約399個のアミノ酸残基の中間長、および約400〜約1000個および最大約3000個のアミノ酸残基のより長い長さを含む。したがって、対象の共役体に組み込むための共役パートナーとして利用されるXTENは、約6、または約12、または約36、または約40、または約48、または約72、または約96、または約144、または約288、または約400、または約432、または約500、または約576、または約600、または約700、または約800、または約864、または約900、または約1000、または約1500、または約2000、または約2500、または最大約3000個のアミノ酸残基の長さを持つXTENまたはXTENのフラグメントを包含する。他の場合、XTEN配列は、約6〜約50、約50〜約100、約100〜150、約150〜250、約250〜400、約400〜約500、約500〜約900、約900〜1500、約1500〜2000、または約2000〜約3000個のアミノ酸残基の長さであり得る。対象のXTEN−ペイロード共役体に組み込まれるXTENの正確な長さは、共役体の生物学的活性に悪影響を及ぼすことなく変動し得る。一実施形態において、XTENのうちの1つ以上は、XTENファミリー配列のうちの1つ、例えば、AD、AE、AF、AG、AM、AQ、BC、またはBDから選択され得る。いくつかの実施形態において、対象の共役体を形成するために利用されるXTENは、表2、表3、および表22〜25の配列のうちのいずれか1つから選択されるXTENを含み、直接または本明細書に開示される架橋剤を介して、ペイロード成分に結合され得る。他の実施形態において、対象の共役体を形成するために利用される1つ以上のXTENは、個別に、相当する長さの配列と最適に整列されるとき、表2、3、22〜25から選択されるXTEN、またはそのフラグメントと比較して、少なくとも約80%の配列同一性、または代替として81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するXTEN配列を含む。いくつかの実施形態において、対象の共役体は、2、3、4、またはそれ以上のXTEN配列を含み、そのXTEN配列中の残基の累積長は、約100超〜約3000、または約400〜約2000、または約800〜1000個のアミノ酸残基であり、XTENは、同一であり得るか、または配列または長さが異なり得る。本明細書において使用される場合、複数のXTENが共役体に組み込まれるとき、累積長は、アミノ酸残基にその全長を包含することが意図される。
5. XTEN前駆体からのXTENセグメント
別の態様において、本発明は、より長い「ドナー」XTEN配列から短長または中間長のXTENを創製するための方法を提供し、より長いドナーXTEN配列は、N末端またはC末端で切断されるか、またはセグメントは、切断配列を含むXTENのタンパク質分解によって形成され、それにより短長または中間長のXTENをもたらす。非限定例において、864個のアミノ酸残基のAG864配列を切断して、144個の残基を持つAG144、288個の残基を持つAG288、576個の残基を持つAG576、または他の中間長さを生じさせることができ、一方、AE864配列を切断して、複数のAE144配列、288個の残基を持つAE288配列、または576個の残基を持つAE576、または他のより短い長さか、もしくは中間長を生じさせることができる。同様に、より長い「ドナー」配列をコードするDNAは、短長または中間長のXTENとの共役において使用するために意図されるシステインまたはリジン残基を組み込むように操作することができる。そのような手法は、本明細書に記載されるXTEN実施形態のうちのいずれか、または表2、3、21、および22に列挙される配列のうちのいずれかとともに利用し、所望の長さのXTENをもたらすことができる。
他の実施形態において、XTENポリペプチドは、正味電荷を持つアミノ酸残基の組込みによって付与され、XTEN配列中に低パーセンテージの疎水性アミノ酸を含有するか、または含有しない、非構造化特徴を有する。全体正味電荷および正味電荷密度は、XTEN配列中の正または負のいずれかの電荷アミノ酸の含有量を修正することによって制御され、正味電荷は、典型的に、対向する電荷を持つ残基によって相殺されるそれらの残基を超えて、電荷状態に寄与するポリペプチド中のアミノ酸のパーセンテージとして表される。いくつかの実施形態において、共役体のXTENの正味電荷密度は、+0.1以上、または−0.1以下の電荷/残基であり得る。本明細書におけるタンパク質またはペプチドの「正味電荷密度」とは、正味電荷をタンパク質中のアミノ酸の総数で割ったものを意味する。他の実施形態において、XTENの正味電荷は、約0%、約1%、約2%、約3%、約4%、約5%、約6%、約7%、約8%、約9%、約10%、約11%、約12%、約13%、約14%、約15%、約16%、約17%、約18%、約19%、または約20%以上であり得る。正味電荷に基づいて、いくつかのXTEHは、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、またはさらに6.5の等電点(pI)を有する。一実施形態において、XTENは、1.5〜4.5の等電点を有し、生理的条件下で正味の負電荷を担持する。
7. 低い免疫原性
別の態様において、本発明は、低程度の免疫原性を有するか、または実質的に非免疫原性であるXTEN組成物を提供する。いくつかの因子は、XTEN(例えば、非反復配列)の低い免疫原性、非構造化構造、高程度の可溶性、低程度の自己凝集またはその欠失、配列内の低程度のタンパク質分解部位またはその欠失、およびXTEN配列中の低程度のエピトープまたはその欠失に寄与し得る。
8. 増加した流体力学半径
別の態様において、融合パートナーとして有用な対象XTENは、XTENを有しないペイロードと比較して、対応する見掛けの分子量の増加をXTEN−ペイロード組成物に付与する特性である、高い流体力学半径を有する。実施例26に詳述されるように、治療タンパク質配列へのXTENの結合は、XTENに結合されていない治療タンパク質と比較して、増加した流体力学半径、増加した見掛けの分子量、および増加した見掛けの分子量因子を有し得る組成物をもたらす。例えば、長い半減期が所望される治療適用において、高い流体力学半径を持つ1つ以上のXTENがペイロードに共役される組成物は、共役体の流体力学半径を、約3〜5nm(約70kDaの見掛けの分子量に対応する)の糸球体細孔径を超えて有効に拡大することができ(Caliceti.2003.Pharmacokinetic and biodistribution properties of poly(ethylene glycol)−protein conjugates.Adv Drug Deliv Rev 55:1261−1277)、対応する終末相半減期の増加を伴う循環タンパク質の腎クリアランスの低減、および他の強化された薬物動態特性をもたらす。タンパク質の流体力学半径は、その分子量によるとともに、形状またはコンパクト性を含む、その構造によって付与される。特定の理論に拘束されないが、XTENは、XTENに組み込まれた電荷残基の個別の電荷間の静電反発によるとともに、二次構造を付与する可能性を欠く配列中の特定のアミノ酸によって付与される固有の柔軟性に起因して、オープン構造を採用することができる。XTENポリペプチドのオープンな伸長された非構造化構造は、典型的な球状タンパク質等の二次または三次構造を有する、相当する配列長および/または分子量のポリペプチドと比較して、より大きな比例流体力学半径を有する。流体力学半径を決定するための方法は、米国特許第6,406,632号および同第7,294,513号に記載されるように、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)の使用によって、当該技術分野において周知である。実施例26は、XTEN長の増加が、流体力学半径、見掛けの分子量、および/または見掛けの分子量因子の比例増加をもたらし、したがって、XTEN−ペイロードを見掛けの分子量または流体力学半径の所望のカットオフ値に調整することを許すことを実証する。したがって、ある実施形態において、XTEN−ペイロードは、得られた共役体が、少なくとも約5nm、または少なくとも約8nm、または少なくとも約10nm、または約12nm、または約15nm、または約20nm、または約30nm以上の流体力学半径を有することができるように、XTENによって構成され得る。前述の実施形態において、XTEN−ペイロード共役体中のXTENによって付与される大きな流体力学半径は、得られた共役体のクリアランスの低減、終末相半減期の増加、および平均滞留時間の増加をもたらすことができる。実施例に記載されるように、XTEN含有組成物の分子量が、サイズ排除クロマトグラフィー分析に由来するとき、低程度の二次構造に起因するXTENのオープン構造は、それらが組み込まれる共役体の見掛けの分子量の増加をもたらす。一実施形態において、本発明は、見掛けの分子量の増加が、以下により完全に記載されるように、直鎖状様式で、または三量体もしくは四量体分岐構造としてのいずれかでの所与の長さの単一XTENの結合のみならず、比例的に短い長さの2、3、4個またはそれ以上のXTENの結合によって達成され得るという発見を利用する。いくつかの実施形態において、ペイロードおよび1つ以上のXTENを含むXTENは、少なくとも約400kD、または少なくとも約500kD、または少なくとも約700kD、または少なくとも約1000kD、または少なくとも約1400kD、または少なくとも約1600kD、または少なくとも約1800kD、または少なくとも約2000kDの見掛けの分子量を呈する。したがって、XTEN−ペイロード共役体は、その共役体の実際の分子量よりも約1.3倍大きいか、または約2倍大きいか、または約3倍大きいか、または約4倍大きいか、または約8倍大きいか、または約10倍大きいか、または約12倍大きいか、または約15倍、または約20倍大きい見掛けの分子量を呈する。一実施形態において、本明細書に開示される実施形態の単離されたXTEN−ペイロード複合体は、約1.3、または約2、または約3、または約4、または約5、または約6、または約7、または約8、または約10、または約15よりも大きい生理的条件下で、見掛けの分子量因子を呈する。別の実施形態において、XTEN−ペイロードは、生理的条件下で、共役体の実際の分子量に対して約3〜約20、または約5〜約15、または約8〜約12、または約9〜約10の見掛けの分子量因子を有する。一般に、対象XTEN−ペイロード共役体の増加した見掛けの分子量は、因子の組合せによって組成物の薬物動態特性(活性クリアランスの低減、腎クリアランスの低減、ならびに毛細血管および静脈接合を通じた損失の低減を含む)を強化する。
9. 組成物および実質的に均質な調製物としてXTENを精製する方法
本発明の目的は、XTENの組成物、および本明細書に記載されるXTENの長さおよび組成物の高レベルの純度および長さの均一性を持つXTENを含む調製物を製造する方法を提供することである。
10. XTENの増加した発現のための組成物
別の態様において、本発明は、XTENをコードするポリ核酸配列を含む構築物、および対照共役体において使用するためにXTENを製造する方法を提供し、追加のコードポリヌクレオチドヘルパー配列は、XTENをコードするポリヌクレオチドの5’端に付加されるか、またはXTENをコードする配列の5’端に結合された親和性タグをコードする配列の5’端に付加され、細菌等の形質転換された宿主細胞中のXTENまたは親和性タグポリペプチドに結合された切断配列を持つXTENの発現を強化および促進する。そのようなコードされたヘルパー配列の例は、表10および実施例に提供される。一実施形態において、本発明は、表7に記載される配列の群から選択される第1の親和性タグのN末端に結合され、順に、本明細書に記載される切断配列に結合されるか、または表2および3に記載される配列の群から選択される配列に対して少なくとも約90%、または少なくとも約91%、または少なくとも約92%、または少なくとも約93%、または少なくとも約94%、または少なくとも約95%、または少なくとも約96%、または少なくとも約97%、または少なくとも約98%、または少なくとも約99%の配列同一性を有するXTENのN末端に直接結合されるかのいずれかである、表10から選択される配列に対して少なくとも約80%、または少なくとも約90%、または少なくとも約95%、または少なくとも約96%、または少なくとも約97%、または少なくとも約98%、または少なくとも約99%の配列同一性を有するヘルパー配列を含むポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド配列構築物を提供する。本発明は、高い発現レベルでポリペプチドおよびXTENの実質的に均質な調製物を産生するための方法において有用な構築物をコードする発現ベクターを提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、XTENと、第1および第2の親和性タグと、ヘルパー配列とを含むポリペプチドの実質的に均質な集団を産生するための方法を提供し、この方法は、発酵反応において、XTENを含むポリペプチドをコードするベクターと、第1および第2の親和性タグとを含む宿主細胞を、ポリペプチドを発現するのに有効な条件下で培養することを含み、発酵反応が600nmの波長で少なくとも130の光学密度に到達するとき、約2g/L超、または約3g/L超、または約4g/L超、または約5g/L超、または6g/L超、または約7グラム/リットル(7g/L)超のポリペプチドが、宿主細胞の粗発現産物の成分として産生されるようにする。一実施形態において、本方法は、ポリペプチドの第1の親和性タグをクロマトグラフィー基質の上に捕捉するのに有効な条件下で、ポリペプチドを第1のクロマトグラフィー基質の上に吸着させるステップと、ポリペプチドを溶出および回収するステップと、ポリペプチドの第2の親和性タグをクロマトグラフィー基質の上に捕捉するのに有効な条件下で、ポリペプチドを第2のクロマトグラフィー基質の上に吸着させるステップと、ポリペプチドを溶出するステップと、実質的に均質なポリペプチド調製物を回収するステップと、をさらに含む。前述の方法の一実施形態において、ベクターは、コードされたポリペプチドのN末端においてヘルパー配列をコードするヌクレオチドをさらに含み、ヘルパー配列は、表10に記載される配列に対し少なくとも80%、または少なくとも90%、または少なくとも95%の配列同一性を有する。他の実施形態において、本発明は、XTENと、第1および第2の親和性タグと、ヘルパー配列とを含むポリペプチドの実質的に均質な集団を産生するための方法を提供し、この方法は、発酵反応において、発酵反応が600nmの波長で少なくとも130の光学密度に到達するときに、約10ミリグラム/グラムを超える乾燥重量宿主細胞濃度(mg/g)、または少なくとも約250マイクロモル/L、または約300マイクロモル/L、または約350マイクロモル/L、または約400マイクロモル/L、または約450マイクロモル/L、または約500マクロモル/Lの該ポリペプチドの濃度で、ポリペプチド産物を発現するのに有効な条件下で、XTENと第1および第2の親和性タグとを含むポリペプチドをコードするベクターを含む宿主細胞を培養することを含む。前述の一実施形態において、この方法は、ポリペプチドの第1の親和性タグをクロマトグラフィー基質の上に捕捉するのに有効な条件下で、第1のクロマトグラフィー基質の上にポリペプチドを吸着させるステップと、ポリペプチドを溶出および回収するステップと、ポリペプチドの第2の親和性タグをクロマトグラフィー基質の上に捕捉するのに有効な条件下で、ポリペプチドを第2のクロマトグラフィー基質の上に吸着させるステップと、ポリペプチドを溶出するステップと、実質的に均質なポリペプチド調製物を回収するステップと、をさらに含む。前述の方法の一実施形態において、ベクターは、コードされたポリペプチドのN末端においてヘルパー配列をコードするヌクレオチドをさらに含み、ヘルパー配列は、表10に記載される配列に対し少なくとも80%、または少なくとも90%、または少なくとも95%の配列同一性を有する。他の実施形態において、本発明は、XTENと、第1および第2の親和性タグと、ヘルパー配列とを含むポリペプチドの実質的に均質な集団を産生するための方法を提供し、この方法は、発酵反応において、発酵反応が600nmの波長で少なくとも130の光学密度に到達するときに、約10ミリグラム/グラムを超える乾燥重量宿主細胞濃度(mg/g)、または少なくとも約15mg/g、または少なくとも約20mg/g、または少なくとも約25mg/g、または少なくとも約30mg/g、または少なくとも約40mg/g、または少なくとも約50mg/gの該ポリペプチドの濃度で、ポリペプチド産物を発現するのに有効な条件下で、XTENと第1および第2の親和性タグとを含むポリペプチドをコードするベクターを含む宿主細胞を培養することを含む。前述の一実施形態において、本方法は、ポリペプチドの第1の親和性タグをクロマトグラフィー基質の上に捕捉するのに有効な条件下で、ポリペプチドを第1のクロマトグラフィー基質の上に吸着させるステップと、ポリペプチドを溶出および回収するステップと、ポリペプチドの第2の親和性タグをクロマトグラフィー基質の上に捕捉するのに有効な条件下で、ポリペプチドを第2のクロマトグラフィー基質の上に吸着させるステップと、ポリペプチドを溶出するステップと、実質的に均質なポリペプチド調製物を回収するステップと、をさらに含む。前述の方法の一実施形態において、ベクターは、コードされたポリペプチドのN末端においてヘルパー配列をコードするヌクレオチドをさらに含み、このヘルパー配列は、表10に記載される配列に対し少なくとも80%、または少なくとも90%、または少なくとも95%の配列同一性を有する。別の実施形態において、このパラグラフの前述の方法の構築物は、親和性タグとXTENとの間のプロテアーゼ切断配列をコードするヌクレオチドをさらに含み、この方法は、調製物の回収されたポリペプチドが、限定されないが、トリプシン等の切断配列を切断することができるプロテアーゼで処置され、それによりXTENをポリペプチドから放出することと、XTENが、XTENを捕捉するのに有効な条件下で、クロマトグラフィー基質の上に吸着されることと、XTENが、実質的に均質なXTENとして溶出および回収されることと、を提供する。
本発明は、1つ以上のペイロード分子に結合されたXTEN共役体に部分的に関する。XTENは、生物学的に活性なペプチド、タンパク質、ポリマー、薬理学的に活性な小分子、ポリ核酸、標的ペプチドおよびタンパク質、標的小分子、抗体および抗体フラグメント、および撮像小分子ペイロード、ならびに2、3、4、またはそれ以上の種類のペイロードを持つ組成物をもたらす、これらの種類のペイロードの組合せを含む、広範なペイロード分子に結合され得ることが企図される。本発明は、必要とする対象に体外から投与された治療的および診断的ペイロード、ならびに治療成分および標的成分を含み得るペイロードの組合せの終末相半減期を増加させることにおける長年の必要性に対応する。
1. ペイロードとしての薬物
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される対象XTEN、XTEN−架橋剤、またはXTEN−クリック化学反応物への共役のための薬物ペイロードは、本明細書に記載されるか、または表11のペイロードから選択される1つ以上の薬剤、またはその薬学的に許容される塩、酸、または誘導体もしくはアゴニストである。一実施形態において、薬物は、本明細書に記載される対象XTEN、XTEN−架橋剤、またはXTEN−クリック化学反応物に共役するための反応基を導入するように誘導体化される。別の実施形態において、共役のための薬物は、限定されないが、バリン−シトルリン−PAB等の切断可能なリンカーを導入するように誘導体化され、リンカーは、対象に投与した後の循環または細胞内プロテアーゼによって切断されることができ、それによって薬物を共役体から遊離させる。
別の態様において、本発明は、ペイロードが、ペプチドまたはポリペプチドのいずれかとして、生物学的に活性なタンパク質である、XTEN−ペイロード組成物を提供する。XTEN−ペイロード共役体のいくつかの実施形態において、ペイロードは、1つ以上のXTENに結合された融合タンパク質として組換え的に発現され得る任意の薬理学的に活性なペプチドまたはポリペプチドである。XTEN−ペイロード共役体の他の実施形態において、ペイロードは、1つ以上のXTENに共役され得る任意の薬理学的に活性なペプチドまたはポリペプチドである。共役体は、本明細書において以下に記載されるような構成であり得る。例示的なペプチドまたはポリペプチドペイロードは、類似体、アゴニスト、アンタゴニスト、阻害剤、および異性体を包含することを意味する。対象ペプチドおよびタンパク質は、合成、半合成、組換え、天然、グリコシル化、および非グリコシル化形態、ならびに得られた変異タンパク質が、親または天然タンパク質の活性の一部分を保持する限り、それらの生物学的に活性なフラグメント、配列変異体、種、変異体、ホモログ、および突然変異を包含することが理解されるであろう。
対象組成物中のペイロードとして特異的に企図されるタンパク質性化合物は、以下のペプチドおよびタンパク質である。
study of continuous infusion cilengitide in patients with solid tumors.Invest New Drugs(2012)30:604)、治療薬としてのその有用性は限定される。
gut hormone,PYY 3−36.Endocrinology(2011)152(12):4630−4640)、典型的に、1日3回鼻腔内経路によって投与されるため、治療薬としてのその有用性は限定される。
in compensated heart failure:a safety,tolerability,and pharmacodynamic trial.J Card Fail.2009;15:182−190)、治療薬としての非修飾タンパク質の有用性は限定される。
acid and insulin secretion in man.Eur J
Clin Invest.(1988)18(5):499−503.)、治療薬としての非修飾タンパク質の有用性は限定される。
partial hepatectomy.Hepatology.(1996)24(2):361−366)、治療薬としての非修飾タンパク質の有用性は限定される。
effects.Gut(1978)19:1049−1053)、治療薬としての非修飾タンパク質の有用性は限定される。
mature chondrocytes and their progenitors.Osteoarthritis Cartilage(2002)10:308−320)。
Human Endostatin in Patients With Advanced Solid Tumors.J.Clin.Oncol.(2003)21:223−231)、非修飾形態でのその有用性は限定される。
Hemost,22:393;Ichinose A,1996,Semin Thromb Hemost,22:385)。FXIIIAは、血友病および関連する凝固障害、先天性FXIII欠乏、および慢性肝疾患に起因する後天性FXIII欠乏、炎症性腸疾患、および術後出血を処置することにおいて使用されるか、または使用について考慮されている。
4. ペイロードとしての核酸
本発明は、XTEN共役体中のペイロードとしての核酸の使用も企図する。一実施形態において、本発明は、XTEN−ペイロード共役体を提供し、ペイロードは、アプタマー、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム核酸、RNA干渉核酸、およびアンチジーン核酸からなる群から選択される。治療薬として使用されるそのような核酸は、当該技術分野において既知である(Edwin Jarald,Nucleic acid drugs:a novel approach.African Journal of
Biotechnology Vol.3(12):662−666,2004;Joanna B.Opalinska.Nucleic−acid therapeutics:basic principles and recent applications.Nature Reviews Drug Discovery 1:503−514,2002)。
IV). XTEN架橋剤およびXTEN−ペイロード共役体、ならびにそのような共役体を製造する方法
本発明は、部分的に、本明細書に記載されるように、ペイロードが共役される共役パートナーとして有用なXTEN−架橋剤共役組成物の高度に精製された調製物に関する。本発明は、XTEN−架橋剤共役パートナーを使用して、1つ以上のXTENに結合されたペイロードの高度に精製された調製物にも関する。本発明は、本明細書に記載されるXTENのいずれかとペイロードとの結合により形成されるXTEN−ペイロード共役体を製造する、組成物および方法、ならびにXTENを架橋剤と共役することにより形成される組成物を製造する反応組成物および方法、または本明細書に記載される他の化学的方法を包含する。特に、「XTEN−ペイロード」および「XTEN−架橋剤」という用語は、反応物共役パートナーの共役後に残る結合された反応産物(架橋剤、クリック化学反応物、または本明細書に記載される他の方法の反応産物を含む)を包含することが意図される。
1. 共役のための架橋剤およびアジド/アルキンクリック化学反応物
別の態様において、本発明は、XTEN−ペイロード共役組成物を調製するために利用され得るXTEN−架橋剤共役体をもたらす、架橋剤に共役されたXTENに関する。特に、本明細書に記載されるXTEN−架橋剤共役パートナーは、少なくとも1つのチオール、アミノ、カルボキシル、アルデヒド、もしくはアルコールを担持するペイロード剤または表面、または当該技術分野において既知の通り、本明細書に記載される成分間の反応に使用可能であり、適切な任意の他の反応基への共役に有用である。
Chem.5:126−132;Greenwood et al(1994)Therapeutic Immunology 1:247−255;Tu et al(1999)Proc.Natl.Acad.Sci USA 96:4862−4867;Kanno et al(2000)J.of Biotechnology,76:207−214;Chmura et al(2001)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 98(15):8480−8484;米国特許第6,248,564号)。
a three−carbon bridge.(2007)Bioconjugate Chem.18,61−76;Brocchini S.et al.Disulfide bridge based PEGylation of proteins.(2008)Advanced Drug Delivery Reviews 60,3−12)。最初に、リンカーは、アミン特異的4−[2,2−ビス[p−トリルスルホニル)メチル]アセチル)安息香酸−NHSエステルとして合成される。この分子は、XTEN−ビス(スルホン)を生じるXTENのアミノ基に共有結合され得る。後者の分子の50mMリン酸ナトリウム緩衝液中(pH7.8)のインキュベーションは、トルエンスルフィン酸の排除をもたらし、XTEN−α、β−不飽和β’−モノスルホンを生成する。得られた分子は、ジスルフィド架橋含有ペイロードと部位特異的に反応する。第1のステップにおいて、ジスルフィド架橋は、還元により2つのチオールに変換される。第2のステップにおいて、XTEN−モノスルホンは、2つのシステインをビスアルキル化し、化学的に安定な3炭素架橋をもたらす。同じα、β不飽和β’−モノスルホンは、ジスルフィド架橋に由来する2つのチオール基への共役のみならず、ポリヒスチジンタグへの共役にも使用することができる(Cong Y.et al.Site−specific PEGylation at histidine tags.(2012)Bioconjugate Chem.23,248−263)。
strategy for degradable polymers.(2008)Chem Commun(Camb).41,5158−5160)。少なくとも1つの分子は、1つの遊離チオール基を含む必要があるため、ペイロードがシステインを含有しない場合は、システイン操作されたXTENを利用することができる。代替として、チオール基は、2−イミノチオラン(Traut試薬)、SATA(N−スクシンイミジルS−アセチルチオ酢酸塩)、SATP(N−スクシンイミジルS−アセチルチオプロピオン酸塩)、SAT−PEO4−Ac(N−スクシンイミジルS−アセチル(チオテトラエチレングリコール))、SPDP(N−スクシンイミジル3−(2−ピリジルジチオ)プロピロン酸塩)、LC−SPDP(スクシンイミジル6−(3’−[2−ピリジルジチオ]プロピオンアミド)ヘキサン酸塩)等のチオール化試薬を使用する、XTENまたはペイロードペプチド/タンパク質のいずれかのN末端α−アミノ基またはリジンε−アミノ基の化学修飾により導入され得る。そのような方法は、当該技術分野において既知である(Carlsson J.et al.(1978)Biochem.J.173,723−737;Wang D.et al.(1997)Bioconjug.Chem.8,878−884;Traut R.R.et al.(1973)Biochemistry12(17),3266−3273;Duncan,R.J.S.et.al.(1983)Anal.Biochem.132.68−73;米国特許第5,708,146号)。チオール−マイケル付加反応の第2の成分は、(メタ)アクリレート、マレイミド、α、β−不飽和ケトン、フマル酸エステル、アクリロニトリル、ケイ皮酸塩、およびクロトン酸塩における電子欠乏炭素−炭素二重結合を持つ試薬を必要とする。N−マレイミドは、スルフヒドリル反応官能基として一般に使用され、市販のヘテロ二官能性架橋剤、例えば、AMAS(N−(α−マレイミドアセトキシ)−スクシンイミドエステル)、BMPS(N−((β−マレイミドプロピルオキシ)スクシンイミドエステル)および上述されるその他を使用し、N末端α−アミノ基またはLys ε−アミノ基修飾を介してペイロードタンパク質またはXTEN分子に導入することができる。遊離チオールおよびマレイミド部分を含有する得られた2つの分子は、それぞれ、穏やかな条件下で安定した共有結合を創製し、マレイミドにより結合されたXTEN−ペイロードをもたらす。
ction as a biomolecule labeling strategy
for M(CO)3(M=Re,99mTc)radiopharmaceuticals.(2011)Chem.Commun.47,12846−12848)。例えば、XTENは、アルデヒド基を有するペイロードと混合され、所望のXTEN−ペイロード共役体を生じる、ヒドラジンまたはヒドラジドを有するように修飾され得る。一実施形態において、本発明は、α−N末端アミノ基に導入された少なくとも1つのヒドラジンまたはヒドラジドを持つXTENを提供するか、または代替として1つ以上のリジンε−アミノ基は、それが安定している見なされるため、標的ペイロードへの共役のための試薬として適切なXTENを提供するように修飾される。芳香族ヒドラジンおよび芳香族アルデヒドから形成された、得られたビス‐アリールヒドラゾンは、92℃および2.0〜10.0の広いpH値に対し安定である(Solulink,Inc.,Protein−Protein Conjugation Kit,Technical Manual,Catalog# S−9010−1)。反応における脱離基は水であり、結合を安定化するために還元剤(例えば、シアノボロヒドリド)を必要としない。ヒドラジン/ヒドラジドまたはアルデヒド部分で修飾された分子は、水性環境において良好な安定性を有し、特別な処理要件なしに活性状態を維持する。XTEN分子のアミノ基(複数可)は、NHS−エステル/ヒドラジド、例えば、SANH(スクシンイミジル4−ヒドラジノニコチン酸アセトンヒドラゾン)、C6−SANH(C6−スクシンイミジル4−ヒドラジノニコチン酸アセトンヒドラゾン)、SHTH(スクシンイミジル4−ヒドラジドテレフタル酸塩酸塩)により修飾される。典型的な反応において、タンパク質は、修飾緩衝液(100mMリン酸塩、150mM NaCl、pH7.4)中の1〜5mg/ml溶液として調製し、修飾剤は、5〜20倍モル過剰で付加し、反応は、室温で2時間実行する。別個に、ペイロード分子は、同様の条件下で、NHS−エステル/アルデヒドSFB(スクシンイミジル4‐ホルミル安息香酸塩)またはC6−SFB(C6−スクシンイミジル4‐ホルミル安息香酸塩)で修飾される。次いで、双方の修飾分子は、共役緩衝液(100mMリン酸塩、150mM NaCl、pH6.0)中に脱塩される。得られた成分は、1モル等量の限定タンパク質、および豊富に使用することができる1.5〜2モル等量のタンパク質を使用して一緒に混合される。100mMリン酸塩、150mM NaCl、pH6.0中の100mMアニリンの触媒緩衝液を付加し、アニリンの最終濃度を10mMに調整し、反応を室温で2時間実行する。
or three fragments.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82,8279−8283)
さらに他の実施形態において、本発明は、XTEN−架橋剤およびXTENペイロード共役体を提供し、共役は、直交タンパク質ライゲーションにより行われ、図12に示されるように、初期化学選択的捕捉の後に、分子内アシル再配置が続く。化学選択的捕捉は、N末端アミンで近位に配置された求核剤または求電子剤、およびC末端カルボキシルエステルで近位に位置する別の適合する求核剤または求電子剤も必要とする。この実施形態において、XTENは、図12のタンパク質1またはタンパク質2のいずれかとして機能し得ることが特に企図される。したがって、代替実施形態において、XTENは、適切な試薬と反応してC末端上でチオエステルを産生するか、またはN末端上のシステインを導入して、代替XTEN−架橋剤組成物を産生することができる。前述のXTEN−架橋剤共役体を使用してXTEN−ペイロードを製造することにおいて、エステルまたはチオエステルを形成する求核剤および求電子剤の対の化学選択的捕捉は、それぞれの反応物のN末端アミノ基およびC末端エステルをそのような近位に持ち込み、アミド結合を形成するように同時分子内アシル転移を許す。ほとんどの直交ライゲーション反応は、側鎖基の保護を必要とせず、生体環境に適合する穏やかな条件下で起こる(Tam J.P.,Xu J.,Eom K.D.Methods and strategies of peptide ligation.(2001)Biopolymers(Peptide Science)60,194−205)。
Y.−A.;Liu C.F.;Shao,J.Peptide synthesis
using unprotected peptides through orthogonal coupling methods.(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 92,12485−12489;Johnson,E.C.B.;Kent,S.B.H.J.Insights into the mechanism and catalysis of the native chemical ligation reaction.(2006)J.Am.Chem.Soc.128,6640−6646;Kent S.B.(2009)Total chemical synthesis of proteins.(2009)Chem.Soc.Rev.38:338−351)。NCL反応におけるC末端成分の第1アミノ酸(図12にタンパク質2として示される)は、システインである。そのようなタンパク質は、第1の位置にシステインを持つXTEN、またはペプチド/タンパク質ペイロードを含む、従来の組換えタンパク質生合成により調製された任意の他のタンパク質であり得る。N末端成分(図13にペイロードとして示される)は、化学合成によりC末端チオエステルとして調製される。チオエステル合成方法の例は、当該技術分野において既知および使用可能であり、例えば、Li X.,Kawakami T.,Aimoto S.,Direct preparation of peptide thioesters using an Fmoc solid−phase method.(1998)Tetrahedron Lett.,39,8660−8672)、Ingenito R.,Bianchi E.,Fattori D.,Pessi A.Solid−phase synthesis of peptide C−terminal thioesters by Fmoc/tBu chemistry.(1999)J.Am.Chem.Soc.,121,11369−11374)、Sewing A.,Hilvert D.Fmoc−compatible solid−phase peptide synthesis of long C−terminal peptide thioesters.(2001)Angew.Chem.Int.Ed.40,3395−3398、Brask J.,Albericio F.,Jensen K.J.,Fmoc solid−phase synthesis of peptide thioesters by masking as trithioorthoesters.(2003)Org.Lett.,2003,5,2951−2953、Ollivier N.,Behr J.−B.,El−Mahdi O.,Blanpain
A.,Melnyk O.Fmoc−solid−phase synthesis of peptide thioesters using an intramolecular N,S−acyl shift.(2005)Org.Lett.,7,2647−2650に記載されるものである。通常、α−アルキルチオエステルは、調製および貯蔵の容易さに起因して好ましい。しかしながら、それらはむしろ未反応であるため、ライゲーション反応は、チオール付加物を用いた原位置トランスチオエステル化により触媒され、最も一般的なチオール触媒は、2−メルカプトエタンスルホン酸塩(MESNa)または4−メルカプトフェニル酢酸(MPAA)である。化学共役は、典型的に、数時間のうちに高収率で完了する。20個の天然アミノ酸は全てN末端成分の最終残基として適しているが、グリシンおよびヒスチジンに対し、最高のライゲーション率が報告されており、表2の例示的なXTENは、ほぼ全てがグリシンN末端ポリペプチドであるため、XTENはこの反応に対し特に適している(Hackeng T.M.et al.Protein synthesis by native chemical ligation:expanded scope by using straightforward methodology.(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96,10068−10073)。この共役方法の他の実施形態において、直交ライゲーション反応は、(1)N末端BrAlaまたはN末端アジリジンを持つC末端チオ酸(Tam J.P.;Lu Y.−A.;Liu C.F.;Shao,J.Peptide synthesis using unprotected peptides through orthogonal coupling methods.(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,92,12485−12489)、(2)N末端シス−ペルチオエステルを持つC末端チオ酸(Liu,C.F.,Rao,C.,Tam,J.P.(1996)Tetrahedron Lett.,37,933−936)、(3)N末端ホモシステインを持つC末端チオエステル(Tam J.P.,Yu Q.Methionine ligation strategy
in the biomimetic synthesis of parathyroid hormones.(1998)Biopolymers 46(5),319−327)、および(4)C末端チオ酸およびN末端ヒス(Zhang L.,Tam J.P.(1997)Tetrahedron.Lett.38,3−6)を含む。この方法において、化学合成によるC末端チオエステルの調製は、NCL反応におけるN末端成分のサイズを制約する。しかしながら、発現タンパク質ライゲーション(EPL)法の使用は、化学合成の必要性により課されるペプチドα−チオエステルのサイズ制限を克服する(Muir T.W.;Sondhi D.;Cole P.A.Expressed protein ligation:a general method for protein engineering.(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95,6705−6710;Muir T.W.Semisynthesis of proteins by expressed protein ligation.(2003)Annu.Rev.Biochem.72,249−289)。EPL法は、タンパク質スプライシングに基づき、このプロセスでは、タンパク質が分子内再配置を受け、内部配列(インテイン)の突出および側部配列(エクステイン)の接合をもたらす。後者のプロセスは、エステルまたはチオエステル中間体の形成を必要とする。本発明を実践する際に、市販の大腸菌タンパク質発現ベクターは、インテイン−キチン結合ドメイン(CBD)配列と融合されたフレーム内で発現した、XTEN等の関心対象のタンパク質を産生するのを可能にする。この方法において、図13に示されるように、前駆体タンパク質のインテイン部分の第1のシステイン残基の側鎖が、直ぐ上流の残基(つまり、例えば、XTENの最終残基)のペプチド結合を球核的に攻撃し、直鎖状チオエステル中間体を形成するとき、融合タンパク質は、N−Sシフトを受ける。化学ライゲーションステップは、タンパク質をチオフェノール(またはMESNaおよびMPAA等の他のチオール触媒)、およびシステイン含有合成ペプチドまたはタンパク質でインキュベートすることにより開始される。これは、例えば、XTENタンパク質の高反応性フェニルα−チオエステル誘導体の原位置生成をもたらし、次いで、合成ペプチド/タンパク質ペイロードと急速に結紮して、所望のXTEN−ペイロード共役体をもたらす。別の実施形態において、XTEN−チオエステル中間体は、20mM Na−HEPES(pH8.5)、50〜1000mM NaCl、および1mM EDTA(任意)中の50mM 2−メルカプトエタンスルホン酸(MESNa)により切断することができ、得られたMESNaタグの付いたタンパク質は、精製され、5mM ビス−トリス(pH6.5)、250mM NaCl中−80℃で、上述される共役におけるN末端成分として、NCL反応のXTEN−架橋剤共役体として使用するまで貯蔵することができる。C末端成分は、N末端システインを持つ天然または合成のいずれかのペプチド/タンパク質を持つペイロードであり得る。
thioester and azide.(2000)Org.Lett.2,1939−1941)。代わりに、N末端タンパク質1は、ジフェニルホスフィンメタンチオールを使用し、C末端チオエステルとして調製されるが(図14参照)、C末端タンパク質2は、ジアゾ転移反応を介して生成され得るN末端アジドとして調製される(Cavender C.J.;Shiner V.J.,Jr.(1972)J.Org.Chem.22,3567−3569;Lundquist J.T.,IV,Pelletier J.C.Improved solid−phase peptide synthesis method utilizing alpha−azide−protected amino acids.(2001)Org.Lett.3,781−783)。ホスフィン残基は、タンパク質2のアジドと反応し、窒素の排除後にイミノホスホランを形成する(シュタウディンガー反応)。その高度に求核性の窒素原子を持つ、得られたイミノホスホランは、アザ−イリドとして見なすこともできる。次いで、アザ−イリドの求核性窒素原子は、タンパク質1のカルボニル基を攻撃し、チオエステルを切断する。特に、XTENまたはペイロードのいずれかは、この反応においてタンパク質1またはタンパク質2のいずれかであり得ることが意図される。再配置されたXTEN−ペイロード産物の加水分解は、最終的に天然アミドを産生し、ホスフィン成分をホスフィン(V)オキシドとして遊離させる。ビス(p−ジメチルアミノエチルフェニル)ホスフィノメタンチオール、ジフェニルホスフィンメタンチオールの水溶性変異体は、水中の等モル基質の急速なライゲーションを媒介する(Tam,A.;Soellner,M.B.;Raines,R.T.Water−soluble phosphinothiols for traceless Staudinger ligation and integration with Expressed Protein Ligation.(2007)J.Am.Chem.Soc.,129,1142111−430)。
gels with factor XIIIa.(1999)Bioconjug.Chem.10(1):75−81)、および組織トランスグルタミナーゼである(Collier J.H.,Messersmith P.B.Enzymatic modification of self−assembled peptide structures with tissue transglutaminase.(2003)Bioconjug.Chem.14(4),748−755;Davis N.E.,Karfeld−Sulzer L.S.,Ding S.,Barron A.E.Synthesis and characterization of a new
class of cationic protein polymers for multivalent display and biomaterial applications.(2009)Biomacromolecules 10(5),1125−1134)。グルタミン基質配列GQQQLは、組織トランスグルタミナーゼに対し高い特異性を有することが知られている(Hu B.H.,Messersmith
P.B.Rational design of transglutaminase
substrate peptides for rapid enzymatic formation of hydrogels.(2003)J.Am.Chem.Soc.125(47),14298−14299)。組織トランスグルタミナーゼ配列特異性は、アシルドナー(グルタミン)に対するよりもアシル受容体(リジン)に対して低いストリンジェンシーであった(Greenberg C.S.,Birckbichler P.J.,Rice R.H.Transglutaminases:multifunctional cross−linking enzymes that stabilize tissues.(1991)FASEB J.1991,5,3071−3077)。
proteins with LPxTG−like sorting motifs.(2005)J.Bacteriol.187,4928−4934)。高レベルのトランスアシル化は、ソルターゼ切断部位を、基質のC末端(Popp M.W.,Antos J.M.,Grotenbreg G.M.,Spooner E.,Ploegh H.L.Sortagging:A versatile method for protein labeling.(2007)Nat.Chem.Biol.311,707−708)および柔軟なループ内(Popp M.W.,Artavanis−Tsakonas K.,Ploegh H.L.Substrate filtering by the active−site crossover loop in UCHL3 revealed by sortagging and gain−of−function mutations.(2009)J.Biol.Chem.284(6),3593−3602)の双方に配置することにより達成することができる。C末端において標識されたタンパク質の場合、最小のLPETGタグ中のグリシンは、C末端に配置されないことが重要であり、少なくとも1つのさらなるC末端アミノ酸とのペプチド結合中に存在しなければならない。さらに、より良好な結合は、追加のグリシンを切断部位のC末端に付加することにより達成され、LPETGGを生じる(Pritz S.,Wolf Y.,Kraetke O.,Klose J.,Bienert M.,Beyermann M.Synthesis of biologically active peptide nucleic acid−peptide conjugates by sortase−mediated ligation.(2007)J.Org.Chem.72,3909−3912;Tanaka T.,Yamamoto T.,Tsukiji S.,Nagamune T.Site−specific protein modification on living cells catalyzed by sortase.(2008)Chembiochem 95,802−807)。ソルターゼ媒介性トランスペプチド化に適合する求核剤は、遊離アミノ末端を持つ、長く伸びたグリシン残基の単一構造要件を有する。良好なトランスペプチド化は、1〜5個のグリシンをどこかに含有する求核剤を用いて達成することができるが、好適な実施形態において、最大反応率は、2個または3個のグリシンが存在するときに得られる。
et al.(2004)Bioconjugate Chemistry 15(4),765−773の共役方法に従い、求電子性官能基(例えば、マレイミドまたはα−ハロカルボニル)を持つ薬物−リンカー化合物または架橋剤試薬と反応する。システイン残基への架橋剤または薬物の共役は、典型的に、pH6〜9の適切な緩衝液中、4℃〜25℃の範囲の温度で最長約16時間起こる。代替として、システイン残基は誘導体化され得る。適切な誘導体化剤および方法は、当該技術分野において周知である。例えば、システイニル残基は、最も一般的に、ヨード酢酸またはヨードアセトアミド等のα−ハロ酢酸塩(および対応するアミン)と反応し、カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を生じる。システイニル残基も、ブロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−(4−イミドゾイル)プロピオン酸、クロロアセチルリン酸塩、N−アルキルマレイミド、3−ニトロ−2−ピリジルジスルフィド、メチル2−ピリジルジスルフィド、p−クロロメルクリ安息香酸塩、2−クロロメルクリ−4−ニトロフェノール、またはクロロ−7−ニトロベンゾ−2−オキサ−1,3−ジアゾールとの反応によって誘導体化される。
of molecules,particles,and cells in solid tumors.(1999)Ann.Rev.Biomed.Eng.1,241−263;Mukherjee S.,Ghosh R.N.,Maxfield F.R.Endocytosis.(1997)Physiol.Rev.77(3),759−803)。XTEN−ペイロードの細胞取り込み時に、ペイロードは、エンドソーム中の低いpH値(pH5.0〜6.5)およびリソソーム(pH4.5〜5.0)、ならびにリソソーム酵素(例えば、エステラーゼおよびプロテアーゼ)によって放出され得る。酸感受性架橋剤の例は、チオール担持担体に結合され得る6−マレイミドドカプロイルヒドラゾンである。ヒドラゾンリンカーは、5未満のpH値で急速に切断され、共役体の内在化に続いて、酸性pHのエンドソームおよびリソソーム中のペイロードの放出を可能にする(Trail P.A.et al.Effect of linker variation on the stability,potency,and efficacy of carcinoma−reactive BR64−doxorubicin immunoconjugates.(1997)Cancer Res.57(1),100−105;Kratz F. et al. Acute and repeat−dose toxicity studies of the(6−maleimidocaproyl)hydrazone derivative of doxorubicin(DOXO−EMCH),an albumin−binding prodrug of the anticancer agent doxorubicin.(2007)Hum.Exp.Toxicol.26(1),19−35)。臨床的に承認されたmAb−薬物共役体、ゲムツズマブオゾガマイシン(Mylotarg(商標))は、細胞毒性抗生物質剤カリケアマイシンに化学的に結合されたCD33に対するヒト化mAb P67.6を含有する薬物−抗体共役体である。抗体と薬物との間のリンカーは、2つの不安定な結合(ヒドラゾンおよび立体障害のジスルフィド)を組み込む。酸感受性ヒドラゾン結合は、実際の切断部位であることが示された(Jaracz S.,Chen J.,Kuznetsova L.V.,Ojima I.Recent
advances in tumor−targeting anticancer drug conjugates.(2005)Bioorg.Med.Chem.13(17),5043−5054)。
P.A.et al.Phase I clinical and pharmacokinetic study of PK1[N−(2−hydroxypropyl)methacrylamide copolymer doxorubicin]:first member of a new class of chemotherapeutic agents−drug−polymer conjugates.(1999)Clin.Cancer Res.5(1),83−94)。開発の臨床段階に到達したペプチドリンカーとの担体−薬物共役体の他の例は、巨大分子白金錯体である。2つのHPMA系薬物候補は、HPMAコポリマー骨格からなり、複雑なアミノマロン酸白金錯体は、カテプシンB切断可能なペプチドスペーサーGlyPheLeuGlyまたはトリペプチドスペーサーGlyGlyGlyを通じて結合された(Rademaker−Lakhai J.M. et al.A Phase I and pharmacological study of the platinum polymer AP5280 given as an intravenous infusion once every 3 weeks in patients with solid tumors.(2004)Clin.Cancer Res.10(10),3386−3395;Sood P. et al.Synthesis and characterization of AP5346,a novel polymer−linked diaminocyclohexyl platinum chemotherapeutic agent.(2006) Bioconjugate Chem.17(5),1270−1279)。
2. 単量体XTEN−架橋剤、およびXTEN−ペイロード構成
別の態様において、本発明は、XTEN−架橋剤共役体、および単一XTENを持つXTEN−ペイロード共役体を提供し、共役体は異なる構成で設計される。そのような共役体の例示的な構成は以下の通りである。
3. 二量体、三量体、四量体、および多量体構成のXTEN−架橋剤およびXTEN−ペイロード共役体
一態様において、本発明は、異なる数のXTENまたはXTEN−ペイロード共役パートナーが、数値的に定義された構成(例えば、二量体、三量体、四量体、または多量体)で、リンカーにより接合される共役体を提供する。本明細書において使用される場合、「前駆体」は、共役反応において反応物として使用され、中間体または最終組成物をもたらす成分を含むことが意図され、任意の長さのXTENセグメント(表2および3のXTEN、または上記の様々な式で表されるXTENを含む)、XTEN−架橋剤、XTEN−ペイロード−架橋剤セグメント、反応基を持つペイロード、リンカー、および本明細書に記載される他のそのような成分が挙げられるが、これらに限定されない。
4. 4つ以上のXTEN−ペイロードを持つ多価構成
表3のXTENを使用するとき、組成物は、システインまたはリジン操作された骨格に結合され、「くし形」多価構成をもたらすか、または図7に示されるように、複数の分岐前駆体を結合して「デンドリマー」構成を製造する、4つ以上のXTEN−ペイロード分子を含有することが企図される。一実施形態において、多価構成共役体は、システインまたはリジン操作されたXTENを、システインまたはリジン操作されたXTENとの反応(図24に例示される)に適切なリンカーを含むXTEN−ペイロードと反応させることによって創製され、最終産物をもたらす。別の実施形態において、多価構成共役体は、システインまたはリジン操作されたXTENを、システインまたはリジン操作されたXTENに結合されたリンカーとの反応に適切な第1級もしくはεアミノ基またはシステインを含むXTEN−ペイロードを持つリンカーと反応させることによって創製され、最終産物をもたらす。これらの実施形態において、最終産物の原子価は、反応性アミノ酸またはリンカーにかかわらず、XTENに組み込まれた反応基の数によって制御される。さらに、最終産物は、そのリガンドとの相互作用を改善するXTEN末端の近く、または分岐点の近くのいずれかにペイロードを配置して、ペイロードを遮断し、リガンドとの相互作用の程度を低減するように設計できることが企図される。
5. 単量体XTEN骨格上の二重特異性ペイロード構成
別の態様において、本発明は、図27Aに示されるように、単一のシステインおよびリジン操作されたXTEN骨格に結合され、二価共役体をもたらす、2つの異なるペイロード分子を含有する共役体を提供する。一実施形態において、二価構成共役体は、表3に具体的に提供されるもの等の操作されたXTENを、システイン操作されたXTENとの反応に適切なリンカーを含む第1のXTEN−ペイロードと反応させることに続いて、リジン操作されたXTENとの反応に適切なリンカーを含む第2のXTEN−ペイロードとの第2の反応によって創製され、最終産物をもたらす。ペイロードの数および位置は、決定的な反応性チオールまたはアミノ基の配置とともに、操作されたXTENの設計により制御される。一実施形態において、二価共役体は、第1のペイロードの単一分子と、リンカーによってシステイン−リジン操作されたXTENに結合された第2のペイロードの単一分子と、を含む。別の実施形態において、二価共役体は、第1のペイロードの1個、または2個、または3個、または4個、または5個の分子と、リンカーによってシステイン−リジン操作されたXTENに結合された第2のペイロードの単一分子と、を含む。別の実施形態において、二価共役体は、第1のペイロードの1個、または2個、または3個、または4個、または5個の分子と、リンカーによってシステイン−リジン操作されたXTENに結合された第2のペイロードの1個、または2個、または3個、または4個、または5個の分子と、を含む。
6. スペーサーおよび遊離基を持つXTEN−架橋剤およびXTEN−ペイロード共役体
別の態様において、本発明は、組成物の官能性または特性を組み込むか、もしくは強化するように、または組成物の組立てもしくは製造の補助として設計される、XTENに組み込まれるか、またはそれに隣接した1つ以上のスペーサーとともに構成されたXTEN−架橋剤およびXTEN−ペイロード共役体を提供する。そのような特性としては、限定されないが、ペイロードの放出を許す、タンパク質分解的に切断されることができる配列、または不安定な官能基の包含が挙げられるか、またはスペーサーをXTEN配列とペイロード成分との間に導入し、ペイロード成分が、その標的リガンドと適切に相互作用し得るように、立体障害を減少させることができる。
7. XTEN−ペイロード構成のライブラリー
別の態様において、本発明は、XTEN−ペイロード前駆体のライブラリー、そのライブラリーを作製する方法、および図34〜35に示されるように、ペイロードの最適な組合せならびに最適な比率を達成するために、ライブラリー前駆体を組合せ手法で合わせる方法を提供する。一実施形態において、本発明は、XTEN−ペイロード前駆体のライブラリーを創製するように、本明細書に記載されるものを含む、所与のペイロードの1個、または2個、または3個、または4個、または5個、または6個、または7個、または8個、または9個、または10個、あるいはそれ以上の分子にそれぞれ結合された個別のXTENライブラリーを提供する。この方法において、結合される一連のXTEN−ペイロード前駆体は、リンカーにさらに共役され、次いで、共役を生じさせる条件下でリンカーと反応することができる他のXTEN−ペイロード前駆体と後次に混合および反応し、XTENに結合されたペイロードの様々な順列および比率のライブラリーをもたらす。次いで、そのようなライブラリーは、最適な応答を提供する組成物を決定するために、所与の臨床適応(例えば、癌、代謝性障害、糖尿病)におけるパラメータを評価するために適したインビトロまたはインビボアッセイにおいてスクリーニングされる。例示的な一実施形態において、ペイロード前駆体の1つのカテゴリーは、表20の腫瘍関連抗原に対し結合親和性を持つ、ペプチド(例えば、表17の標的化部分)等の様々な標的分子を含み、前駆体の第2のカテゴリーは、細胞毒性薬または表9から選択される薬物等の1つ以上の薬物である。結合される前駆体の各カテゴリーは、リンカーにさらに共役され、図36に示されるように、共役を生じさせる条件下でリンカーと反応することができる他のXTEN−ペイロード前駆体と後次に混合および反応し、互いに異なる比率の様々な標的化部分および薬物順列のライブラリーをもたらす。XTEN−ペイロード共役体は、1つのペイロード:別のペイロードの固定比を許すように設計され、例えば、2つの異なるペイロードの場合、1:1、または1:1.5、または1:2、または1:3、または2:3、または1:4、または1:5、または1:9である。同様の比率範囲は、3つ、4つ、5つ、またはそれ以上のペイロードを含むライブラリー共役体に適用される。
8. 標的化部分に結合されたXTEN−ペイロードの共役体
別の態様において、本発明は、標的化部分に結合された1つ以上のXTEN−ペイロード組成物を含む、共役組成物を提供する。対象の標的組成物は、細胞、組織、または器官への治療的または毒性ペイロードの選択的送達が所望される、多様な状態の処置における使用を見出す。本発明は、抗体、抗体フラグメント、および抗体模倣体を含む(限定されないが、表17に記載されるものを含む)、対象の組成物における使用のための他用な標的化部分、ならびに疾患または代謝性もしくは生理学的異常と関連付けられたリガンドまたは受容体を結合することができるペプチドおよび小分子を企図する。一実施形態において、本発明は、少なくとも1つのXTENに結合された表17、18、または21からの少なくとも1つの標的化部分を含む共役体を提供する。別の実施形態において、本発明は、少なくとも2つ、または3つ、または4つのXTENのそれぞれに結合された表17、18、または21からの少なくとも1つの標的化部分を含む共役体を提供する。別の実施形態において、本発明は、少なくとも1つのXTENに結合された表17、18、または21からの少なくとも1つの標的化部分と、少なくとも1つのXTENに結合された表11、表12、表18、または表21に記載されるペイロードからなる群から選択される少なくとも1つの薬物または生物学的ペイロードと、を含む共役体を提供する。一実施形態において、本発明は、標的化部分−XTEN−薬物共役組成物を提供し、この組成物は、標的細胞上のリガンドまたは受容体に選択的に送達され、次いで、図37に示されるように、細胞の中に内在化されることができ、薬物成分に対し、当該技術分野において既知の薬理学的効果をもたらす。
本発明は、本開示のXTEN−ペイロード共役体を含む薬学的組成物を提供する。一実施形態において、薬学的組成物は、表21に記載される共役体からなる群から選択される共役体と、少なくとも1つの薬学的に許容される担体と、を含む。一実施形態において、薬学的組成物は、表2および3に記載される配列の群から選択される配列に対して少なくとも約80%、または少なくとも約90%、または少なくとも約91%、または少なくとも約92%、または少なくとも約93%、または少なくとも約94%、または少なくとも約95%、または少なくとも約96%、または少なくとも約97%、または少なくとも約98%、または少なくとも約99%、または100%の配列同一性を有する、少なくとも第1のXTEN配列を含む共役体を含み、この組成物のXTEN配列は、実質的に均質な長さであり、XTENは、表11、12、18、19、および21に記載されるペイロードの群から選択される、少なくとも第1のペイロードに共役され、組成物は、少なくとも1つの薬学的に許容される担体をさらに含む。一実施形態において、本発明は、本明細書に記載される実施形態のうちのいずれかのTEN−ペイロード共役体と、少なくとも1つの薬学的に許容される担体と、を含む、薬学的組成物を提供する。
VI). 処置方法
本発明は、対象における疾患を処置する方法を提供し、有効な量の前述の実施形態のうちのいずれかのXTEN−ペイロード共役体を、処置を必要とする対象に投与することを含む。一実施形態において、XTEN−ペイロードは、表11、12、18、19、および21から選択される単一種のペイロードを含む。別の実施形態において、XTEN−ペイロードは、表11、12、18、19、および21から選択される2種のペイロードを含む。別の実施形態において、XTEN−ペイロードは、1つのペイロードが表11、12、および18から選択される2種のペイロードを含み、第2のペイロードは、表20の標的への結合親和性を持つ標的化部分であるか、または表18、19、もしくは21のうちのいずれか1つの標的化部分である。別の実施形態において、XTEN−ペイロードは、表11、12、18、19、および21から選択される3種以上のペイロードを含む。この方法において、共役体のペイロードは、当該技術分野において有益な効果を有することが知られているものであるか、または特定の疾患もしくは状態を持つ対象に投与されるときに、疾患標的に対する親和性を有するものである。一実施形態において、組成物のペイロード(複数可)は、共通の生物学的経路を介して、それらの治療効果を媒介する。このパラグラフの前述の実施形態において、この方法は、癌、癌の支持療法、心血管、中枢神経系、内分泌疾患、消化管、泌尿生殖器、血液学的、HIV感染、ホルモン疾患、炎症、自己免疫疾患、感染症、代謝疾患、筋骨格系疾患、腎臓学的障害、眼科疾患、疼痛、および呼吸器から選択される疾患を処置または改善または予防することにおいて有用である。さらなる特殊性に応じて、疾患は、表16から選択される。
VII). 共役キット
別の態様において、本発明は、XTEN−架橋剤共役組成物の使用を促進するためのキットを提供する。一実施形態において、このキットは、製剤中のXTEN−架橋剤と、容器と、その容器上またはそれと関連付けられたラベルと、を含む。前述の実施形態において、XTEN−架橋剤は、本明細書に記載される実施形態のうちのいずれか1つであり得る。容器は、ペイロードに結合するための共役反応における使用に適した緩衝液中、定義された濃度でXTEN−架橋剤を保持する。
VIII). 薬学的キット
別の態様において、本発明は、共役組成物の使用を促進するためのキットを提供する。このキットは、本明細書に提供される薬学的組成物と、容器と、その容器上またはそれと関連付けられたラベルまたは添付文書と、を含む。適切な容器としては、例えば、ガラスまたはプラスチック等の多様な材料から形成される、例えば、瓶、小瓶、シリンジ等が挙げられる。容器は、対象を処置するために有効な製剤として薬学的組成物を保持し、無菌のアクセスポートを有し得る(例えば、容器は、静脈内の溶液袋、または皮下注射針によって貫通可能な留め具を有する小瓶であってもよい)。添付文書は、薬物の承認された適応、再構成のための指示、および/または承認された適応に使用するための薬物の投与、適切な投与量および安全情報、ならびに薬物のロットおよび有効期限を特定する情報を列挙することができる。前述の別の実施形態において、キットは、薬学的組成物に適した希釈液を担持することができる第2容器を含むことができ、その使用は、対象に送達される適切な濃度を使用者に提供する。別の実施形態において、キットは、少なくとも第1の容器中に、第1の容器と、疾患を持つ対象の処置において投与するのに十分な量の共役組成物薬と、一定量の薬学的に許容される担体、対象に送達される適切な濃度の薬学的組成物を使用者に提供する、対象の組成物に適した希釈液を担持することができる第2の容器とを、薬物および保管および取扱い条件を特定するラベル、および/または薬物の承認された適応、再構成のための指示、および/または承認された適応の処置に使用するための薬物の投与、適切な投与量および安全情報、ならびに薬物のロットおよび有効期限を特定する情報のシートと一緒に含む。
IX). 本発明の核酸配列
本発明は、共役体のポリペプチド成分をコードするポリ核酸分子に相補的な共役体および配列のポリペプチド成分をコードする単離されたポリ核酸を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、本明細書に記載される共役体実施形態のうちのいずれかのXTENをコードするポリ核酸、またはそのポリ核酸の相補体を提供する。一実施形態において、ポリ核酸は、表2および3に記載されるXTENからなる群から選択されるXTEN、またはそのポリ核酸の相補体をコードする。
以下の実施例は、36個のアミノ酸のモチーフ配列をコードするコドン最適化遺伝子の集合の構築について説明する。最初のステップとして、pETベクターに基づいてスタッファーベクターpCW0359が構築され、T7プロモーターを含む。pCW0359は、セルロース結合ドメイン(CBD)、およびTEVプロテアーゼ認識部位に続いて、BsaI、BbsI、およびKpnI部位に隣接するスタッファー配列をコードする。BsaIおよびBbsI部位を、それらが消化後に適合する突出を生成するように挿入した。スタッファー配列の後に、GFP遺伝子およびHisタグの切断異形が続く。スタッファー配列は、終止コドンを含有し、したがってスタッファープラスミドpCW0359を担持する大腸菌細胞は、非蛍光コロニーを形成する。このスタッファーベクターpCW0359は、BsaIおよびKpnIで消化され、スタッファーセグメントを除去し、得られたベクターフラグメントは、アガロースゲル精製によって単離された。配列は、指定されたXTEN_AD36であり、ADファミリーのモチーフを反映する。そのセグメントは、アミノ酸配列[X]3を有し、式中、Xは、配列:GESPGGSSGSES、GSEGSSGPGESS、GSSESGSSEGGP、またはGSGGEPSESGSSを持つ12merペプチドである。以下のホスホリル化合成オリゴヌクレオチド対をアニールすることによって挿入を得た。
AD1for: AGGTGAATCTCCDGGTGGYTCYAGCGGTTCYGARTC
AD1rev: ACCTGAYTCRGAACCGCTRGARCCACCHGGAGATTC
AD2for: AGGTAGCGAAGGTTCTTCYGGTCCDGGYGARTCYTC
AD2rev: ACCTGARGAYTCRCCHGGACCRGAAGAACCTTCGCT
AD3for: AGGTTCYTCYGAAAGCGGTTCTTCYGARGGYGGTCC
AD3rev: ACCTGGACCRCCYTCRGAAGAACCGCTTTCRGARGA
AD4for: AGGTTCYGGTGGYGAACCDTCYGARTCTGGTAGCTC
ホスホリル化オリゴヌクレオチド3KpnIstopperFor:AGGTTCGTCTTCACTCGAGGGTAC、および非ホスホリル化オリゴヌクレオチドpr_3KpnIstopperRev:CCTCGAGTGAAGACGAもアニールした。アニールしたオリゴヌクレオチド対をライゲーションしたところ、可変長を持つ産物の混合物をもたらし、これは1つのBbsI/KpnIセグメントにライゲーションされた可変数の12mer反復を表す。36個のアミノ酸長に対応する産物は、調製アガロースゲル電気泳動によって混合物から単離され、BsaI/KpnI消化されたスタッファーベクターpCW0359にライゲーションされた。得られたライブラリー(LCW0401と指定される)中のクローンの大部分は、誘導後に緑色蛍光を示し、これは、XTEN_AD36の配列が、枠内でGFP遺伝子とライゲーションされていたこと、およびXTEN_AD36の大部分の配列が、良好な発現レベルを有したことを示す。
36アミノ酸長のXTEN配列をコードするコドンライブラリーを構築した。XTEN配列は、XTEN_AE36と指定した。そのセグメントは、アミノ酸配列[X]3を有し、式中、Xは、配列:GSPAGSPTSTEE、GSEPATSGSETP、GTSESATPESGP、またはGTSTEPSEGSAPを持つ12merペプチドである。以下のホスホリル化合成オリゴヌクレオチド対をアニールすることによって挿入を得た。
AE1for: AGGTAGCCCDGCWGGYTCTCCDACYTCYACYGARGA
AE1rev: ACCTTCYTCRGTRGARGTHGGAGARCCWGCHGGGCT
AE2for: AGGTAGCGAACCKGCWACYTCYGGYTCTGARACYCC
AE2rev: ACCTGGRGTYTCAGARCCRGARGTWGCMGGTTCGCT
AE3for: AGGTACYTCTGAAAGCGCWACYCCKGARTCYGGYCC
AE3rev: ACCTGGRCCRGAYTCMGGRGTWGCGCTTTCAGARGT
AE4for: AGGTACYTCTACYGAACCKTCYGARGGYAGCGCWCC
AE4rev: ACCTGGWGCGCTRCCYTCRGAMGGTTCRGTAGARGT
ホスホリル化オリゴヌクレオチド3KpnIstopperFor:AGGTTCGTCTTCACTCGAGGGTAC、および非ホスホリル化オリゴヌクレオチドpr_3KpnIstopperRev:CCTCGAGTGAAGACGAもアニールした。アニールしたオリゴヌクレオチド対をライゲーションしたところ、可変長を持つ産物の混合物をもたらし、これは1つのBbsI/KpnIセグメントにライゲーションされた可変数の12mer反復を表す。36個のアミノ酸長に対応する産物は、調製アガロースゲル電気泳動によって混合物から単離され、BsaI/KpnI消化されたスタッファーベクターpCW0359にライゲーションされた。得られたライブラリー(LCW0402と指定される)中のクローンの大部分は、誘導後に緑色蛍光を示し、これは、XTEN_AE36の配列が、枠内でGFP遺伝子とライゲーションされていたこと、およびXTEN_AE36の大部分の配列が、良好な発現を示すことを示す。
36アミノ酸長の配列をコードするコドンライブラリーを構築した。配列は、XTEN_AF36と指定した。そのセグメントは、アミノ酸配列[X]3を有し、式中、Xは、配列:GSTSESPSGTAP、GTSTPESGSASP、GTSPSGESSTAP、またはGSTSSTAESPGPを持つ12merペプチドである。以下のホスホリル化合成オリゴヌクレオチド対をアニールすることによって挿入を得た。
AF1for: AGGTTCTACYAGCGAATCYCCKTCTGGYACYGCWCC
AF1rev: ACCTGGWGCRGTRCCAGAMGGRGATTCGCTRGTAGA
AF2for: AGGTACYTCTACYCCKGAAAGCGGYTCYGCWTCTCC
AF2rev: ACCTGGAGAWGCRGARCCGCTTTCMGGRGTAGARGT
AF3for: AGGTACYTCYCCKAGCGGYGAATCTTCTACYGCWCC
AF3rev: ACCTGGWGCRGTAGAAGATTCRCCGCTMGGRGARGT
AF4for: AGGTTCYACYAGCTCTACYGCWGAATCTCCKGGYCC
AF4rev: ACCTGGRCCMGGAGATTCWGCRGTAGAGCTRGTRGA
ホスホリル化オリゴヌクレオチド3KpnIstopperFor:AGGTTCGTCTTCACTCGAGGGTAC、および非ホスホリル化オリゴヌクレオチドpr_3KpnIstopperRev:CCTCGAGTGAAGACGAもアニールした。アニールしたオリゴヌクレオチド対をライゲーションしたところ、可変長を持つ産物の混合物をもたらし、これは1つのBbsI/KpnIセグメントにライゲーションされた可変数の12mer反復を表す。36個のアミノ酸長に対応する産物は、調製アガロースゲル電気泳動によって混合物から単離され、BsaI/KpnI消化されたスタッファーベクターpCW0359にライゲーションされた。得られたライブラリー(LCW0403と指定される)中のクローンの大部分は、誘導後に緑色蛍光を示し、これは、XTEN_AF36の配列が、枠内でGFP遺伝子とライゲーションされていたこと、およびXTEN_AF36の大部分の配列が、良好な発現を示すことを示す。
36アミノ酸長の配列をコードするコドンライブラリーを構築した。配列は、XTEN_AG36と指定した。そのセグメントは、アミノ酸配列[X]3を有し、式中、Xは、配列:GTPGSGTASSSP、GSSTPSGATGSP、GSSPSASTGTGP、またはGASPGTSSTGSPを持つ12merペプチドである。以下のホスホリル化合成オリゴヌクレオチド対をアニールすることによって挿入を得た。
AG1for: AGGTACYCCKGGYAGCGGTACYGCWTCTTCYTCTCC
AG1rev: ACCTGGAGARGAAGAWGCRGTACCGCTRCCMGGRGT
AG2for: AGGTAGCTCTACYCCKTCTGGTGCWACYGGYTCYCC
AG2rev: ACCTGGRGARCCRGTWGCACCAGAMGGRGTAGAGCT
AG3for: AGGTTCTAGCCCKTCTGCWTCYACYGGTACYGGYCC
AG3rev: ACCTGGRCCRGTACCRGTRGAWGCAGAMGGGCTAGA
AG4for: AGGTGCWTCYCCKGGYACYAGCTCTACYGGTTCTCC
AG4rev: ACCTGGAGAACCRGTAGAGCTRGTRCCMGGRGAWGC
ホスホリル化オリゴヌクレオチド3KpnIstopperFor:AGGTTCGTCTTCACTCGAGGGTAC、および非ホスホリル化オリゴヌクレオチドpr_3KpnIstopperRev:CCTCGAGTGAAGACGAもアニールした。アニールしたオリゴヌクレオチド対をライゲーションしたところ、可変長を持つ産物の混合物をもたらし、これは1つのBbsI/KpnIセグメントにライゲーションされた可変数の12mer反復を表す。36個のアミノ酸長に対応する産物は、調製アガロースゲル電気泳動によって混合物から単離され、BsaI/KpnI消化されたスタッファーベクターpCW0359にライゲーションされた。得られたライブラリー(LCW0404と指定される)中のクローンの大部分は、誘導後に緑色蛍光を示し、これは、XTEN_AG36の配列が、枠内でGFP遺伝子とライゲーションされていたこと、およびXTEN_AG36の大部分の配列が、良好な発現を示すことを示す。
XTEN_AE864は、XTEN_AE36からAE72、144、288、576、および864への連続二量体化から構築した。XTEN_AE72セグメントの集合は、XTEN_AE36の37個の異なるセグメントから構築した。37個の異なる36−アミノ酸セグメントを全て内包する大腸菌の培養物を混合し、プラスミドを単離した。このプラスミドプールをBsaI/Ncolで消化し、小さなフラグメントを挿入として生成した。同じプラスミドプールをBbsI/Ncolで消化し、大きなフラグメントをベクターとして生成した。これらの挿入およびベクターフラグメントをライゲーションして長さを2倍にし、ライゲーション混合物をBL21Gold(DE3)細胞に形質転換してXTEN_AE72のコロニーを得た。
数回の連続二量体化を使用して、実施例1に列挙されるXTEN_AD36のセグメントから始まるXTEN_AG864配列の集合を組み立てた。これらの配列は、実施例3に記載の通り組み立てた。XTEN_AG864からのいくつかの単離体を評価したところ、生理学的条件下で良好な発現および優れた可溶性を示すことが見出された。XTEN_AG864の全長クローンは、優れた可溶性を有し、カニクイザルにおいて60時間を超える半減期を示した。
1つのシステインを含有するアミノ酸配列GGSPAGSCTSPをコードするシステイン島(CysIsland)は、アニールしたオリゴによってCBD−スタッファー−GFPベクターに導入し、CBD−CysIsland−GFPを得た(CysIslandは、制限部位BsaIおよびBbsIに隣接する)。CBD−スタッファー−GFPベクターは、CBDとスタッファーとの間にTEVプロテアーゼ認識部位を持つNovagenに由来するpET30である。構築体は、CBD−スタッファー−GFPベクター中のスタッファーを、XTEN_AE288およびXTEN_AE576をコードする遺伝子と置き換えることによって以前に生成された。CBD−XTEN_AE288−GFPのプラスミドをBsaI/Ncolで消化し、小さなフラグメントを挿入として生成した。CBD−CysIsland−GFPのプラスミドをBbsI/Ncolで消化し、大きなフラグメントをベクターとして生成した。これらの挿入およびベクターフラグメントをライゲーションし、ライゲーション混合物をBL21−Gold(DE3)細胞に電気穿孔して、CBD−CysIsland−XTEN_AE288−GFPの形質転換体を得た。同様に、CBD−CysIsland−XTEN_AE288−GFPのプラスミドをBsaI/Ncolで消化し、小さなフラグメントを挿入として生成した。CBD−XTEN_AE576−GFPのプラスミドをBbsI/Ncolで消化し、大きなフラグメントをベクターとして生成した。これらの挿入およびベクターフラグメントをライゲーションし、ライゲーション混合物をBL21−Gold(DE3)細胞に電気穿孔して、CBD−XTEN_AE576−CysIsland−XTEN_AE288−GFPの形質転換体を得た。最後に、CBD−XTEN_AE576−CysIsland−XTEN_AE288−GFPのプラスミドをBbsI/HindIIIで消化してGFPを除去し、終止コドンに対しアニールしたオリゴとライゲーションし、ライゲーション混合物をBL21−Gold(DE3)細胞に電気穿孔して、表26に列挙されるDNAおよびコードされたアミノ酸配列を有するCBD−XTEN_AE576−CysIsland−XTEN_AE288の形質転換体を得た。追加の構築体は、複数の挿入を含む、所与の位置に適切な制限部位の選択によって、XTEN配列内の異なる位置に挿入されたシステインを用いて創製することができる。この方法を利用して、リジンをコードするコドンを、オリゴヌクレオチド中のシステインをコードするものと置換することによって、リジン操作されたXTENを創製することもできる。
一対のプライマーは、配列GRATAEAAGCGTAEAAの制限部位BamHIおよびシステイン島1をXTEN_AE432−1のN末端に、および配列TAEAAGの部分的システイン島2および制限部位BbSlをXTEN_AE432−1のC末端に導入するように設計された。第2のプライマー対は、配列GCGTAEAAの制限部位BsaIおよび部分的システイン島2をXTEN_AE432−2のN末端に、および8xHisタグ(H8)を持つ配列TAEAAGCGTAEAARのシステイン島4および制限部位HindIIIをXTEN_AE432−2のC末端に導入するように設計された。XTEN_AE432−1は、1〜432アミノ酸配列を含有し、XTEN_AE432−2は、XTEN_AE864遺伝子によってコードされた433〜864アミノ酸配列を有する。これらの2つのプライマー対を使用して、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって、それぞれXTEN_AE432−1およびXTEN_AE432−遺伝子を増幅させた。適正サイズのPCR産物をゲル精製し、それぞれ制限酵素BamHI/BbsIおよびBsaI/HindIIIでライゲーションのための挿入として消化した。宛先ベクターである、pET30の誘導体(Novagen)は、隣接する制限部位BamHIおよびHindIIIを持つCBD(セルロース結合ドメイン)−スタッファーを含む。宛先ベクターを制限酵素BamHI/HindIIIで消化してスタッファーを除去し、ベクターとして調製した。このベクターを、上記XTEN_AE432−1のBamHI/BbsIで消化されたPCR産物、およびXTEN_AE432−2のBsaI/HindIIIで消化されたPCRとライゲーションした。ライゲーション混合物は、大腸菌の上位10個のコンピテント細胞に形質転換した。DNAミニプレップによって軽質転換体をスクリーニングし、DNA配列決定によって所望の構築体を確認した。したがって、最終プラスミドは、T7プロモーターの制御下で、CBD−システイン島1−XTEN_AE432−システイン島2−XTEN_AE432−システイン島3−H8遺伝子を生じる。DNA配列およびタンパク質配列は、表27に提供される。
一対のプライマーは、制限部位BamHIおよびアミノ酸配列GRGSPをXTEN_AE432−1のN末端に、およびアミノ酸配列TAEAAGおよび制限部位BbsIをXTEN_AE432−1のC末端に導入するように設計された。第2のプライマー対は、制限部位BsaIおよびGKPGTAEAAの統合されたリジンを持つアミノ酸配列をXTEN_AE432−2のN末端に、および8xHisタグ(H8)を持つGKATの統合されたリジンを持つアミノ酸配列および制限部位HindIIIをXTEN_AE432−2のC末端に導入するように設計された。XTEN_AE432−1は、1〜432アミノ酸配列を含有し、XTEN_AE432−2は、XTEN_AE864遺伝子によってコードされた433〜864アミノ酸配列を有する。これらの2つのプライマー対を使用して、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって、それぞれXTEN_AE432−1およびXTEN_AE432−2遺伝子を増幅させた。適正サイズのPCR産物をゲル精製し、それぞれ制限酵素BamHI/BbsIおよびBsaI/HindIIIでライゲーションのための挿入として消化した。隣接する制限部位BamHI/HindIIIを持つCBD(セルロース結合ドメイン)−スタッファーの宛先ベクターであるpET30(Novagen)の誘導体を、制限酵素BamHI/HindIIIで消化してスタッファーを除去し、ベクターとして調製した。このベクターを、上記のXTEN_AE432−1のBamHI/BbsIで消化されたPCR産物、およびXTEN_AE432−2のBsaI/HindIIIで消化されたPCRとライゲーションする。ライゲーション混合物は、大腸菌の上位10個のコンピテント細胞に形質転換した。DNAミニプレップによって形質転換体をスクリーニングし、DNA配列決定によって所望の構築体を確認した。したがって、最終プラスミドは、T7プロモーターの制御下で、CBD−GRGSP−XTEN_AE432−TAEAAGKPGTAEAA−XTEN_AE432−GKAT−H8遺伝子を生じる。DNA配列およびタンパク質配列は、表28に提供される。
T7/lacプロモーターの制御下でCBD−TEV部位−XTEN_AE864を発現するプラスミドpCW1054、T7/lacプロモーターの制御下でCBD−TEV部位−XTEN_AE864−GFPを発現するpLCW0968.003、およびPhoAプロモーターの制御下でCBD−TEV部位−XTEN_AE864−GFPを発現するpLCW0970.030を、大腸菌BL21 DE3および大腸菌BL21 DE3 rne−131の双方において形質転換した(Lopez,P.J.,et al.(1999)Mol.Microbiol.33,188−199)。rne−131変異は、RNase Eの3’エンドリボヌクレアーゼ的活性を妨害する(Kido,M.,et al.(1996)Journal of Bacteriology,178:3917−3925)。単一コロニーを選抜し、適切な選択的抗生物質を含有する2mLのLBブロス培地に播種することによって、6つの形質転換体の全ての種培養物を調製した。種培養物を終夜成長させ、0.5mLを使用して、pCW1054およびpLCW0968.003を含有する細胞には25mLの2xYTブロス、pLCW0970.030を含有する細胞には25mLのPhoA誘導ブロス(Amunixレシピ136−1)を4重複で播種した。培養物を37℃で3時間振動させた。次いで、全ての培養物に対して温度を26℃に低減し、pCW1054およびpLCW0968.003タンパク質を含有する細胞に対し、1.0mMの最終濃度でIPTGを用いて発現を誘導した。pLCW070.030中のPhoAプロモーターの誘導は、培養培地からのリン酸塩が枯渇すると自己誘導される。次いで、培養物を26℃で終夜振動させた。各培養物の試料を溶解し、InvitrogenからのNuPAGE 4〜12%のビス−トリスゲルを使用し、製造者の仕様に従い、クマシー染色を用いて20μlの各溶解物を非還元SDS−PAGEに共した。結果(図43)は、CBD−TEV部位−XTEN_AE864−GFPまたはCBD−TEV部位−XTEN_AE864のいずれかが、T7/lacプロモーターの制御下で発現されるとき、組換えタンパク質の収率は、大腸菌BL21 DE3細胞と比較して、BL21 DE3 rne−131中で著しく高いことを示した。細胞は、蛍光プレートリーダーを使用し、GFP蛍光についても測定した。結果(図44)は、PhoAプロモーターの制御下でのCBD−TEV部位−XTEN_AE864−GFPの大腸菌BL21 DE3細胞における発現は、T7/lacプロモーターの制御下でのCBD−TEV部位−XTEN_AE864−GFPの発現よりもほぼ3倍多いことを示した。大腸菌BL21 DE3 rne−131において、T7/lacおよびPhoAプロモーターの双方は、同様レベルの発現を生じた。したがって、Rnase E 3’リボエンドヌクレアーゼ的活性の阻害時にのみ、T7/lac誘導は、PhoA誘導を使用して得られるものに類似する力価を生じる。同様に、翻訳に対して、より速い速度のT7 RNAP転写(Studier,W.,et al.(1986)Journal
of Molecular Biology 189:113−130)は、エンドヌクレアーゼ的攻撃の影響を受け易い核酸mRNAをもたらすが、転写が天然の大腸菌RNAポリメラーゼIIによって媒介されるPhoA誘導の場合、転写速度は、翻訳速度と密接に結合し、エンドヌクレアーゼ的攻撃からmRNAを保護する。
一対のプライマーAE278BsaIfor−AACGおよびAE278−RH8HindIIIrevを使用して、PCR産物XTEN_AE278を得るために、XTEN_AE864_003を含有するプラスミドをPCRした。適正サイズのバンドのゲル精製に続いて、XTEN_AE278−R−H8の挿入としてBsaI/HindIIIを用いて消化を行った。N末端−RP11−R−AE432_3Cys−R−H8(構築体AC763)の遺伝子をコードするプラスミドpCW1161の消化をBsaI/HindIIIで行い、AE432_3Cys−R−H8のフラグメントを除去し、大きなフラグメントをベクターとしてゲル精製した。ベクターの挿入とのライゲーションを行い、それを使用してBL21コンピタント細胞を形質転換し、N末端−RP11−R−AE288−R−H8の構築体を得た。2つのトリプシン消化部位(R、アルギニン)間のXTENの長さを、XTEN_AE278にいくつかの隣接するアミノ酸を足すことによって計算したところ、ちょうど288個のアミノ酸に相当した。したがって、構築体は、トリプシン消化によるN末端−RP11タグおよびC末端8xHisタグの除去後、前駆体N末端−RP11−R−AE288−R−H8(以下の表29の配列)を産生し、1xアミノ−XTEN288(表3のセグメント178、共役のためのN末端アミノ基を持つ)を生成するように設計する。
1.1.N末端−RP11−AE864−GFPおよびMalEss−AE48−RP11−AE864をコードする構築体の設計および構築
Ishihama Y.et al,BMC Genomics 2008,9:102に記載される高度に発現した天然の大腸菌タンパク質の群を使用し、最初の20個のN末端アミノ酸(表30のカラム3)の一覧を生成し、少なくとも11個のアミノ酸(表30のカラム4)を含有するヘルパー配列を創製するための候補を生成するために、疎水性アミノ酸F、I、W、L、V、M、Cをアラニンもしくはセリンに変換するか、または削除した。比較目的で、Amunix(AC616)において構築された十分に発現した構築体からの既知のCBD配列の最初の20個のアミノ酸も対照として含まれた。
スタッファー−RP5forとスタッファー−RP5revP、RP6−SASRSAforPとRP6−SASRSArev、L2forとL2rev、L3forとL3rev、L4forとL4rev、L5forとL5rev、L6forとL6rev、L7forとL7rev、L8forとL8rev、L9forとL9rev、L10forとL10rev、L11forとL11rev、L12forとL12rev、およびL13forとL13revのDNAオリゴヌクレオチド対(表31)は、Elim Biopharm(Hayward,CA)において合成され、各対を上記の通りアニールし(セクション1)、二本鎖DNAを生成した。
プラスミドpSD0107〜pSD0118で形質転換された大腸菌宿主を振動フラスコ中で発現させ、C末端GFP受容体からの蛍光を測定することによって、それぞれの発現レベルを評価した。つまり、終夜培養物を各構築体に対し、SB培地(12.5μg/mLテトラシクリンを含む)中で成長させた後、それを使用して、12.5μg/mLテトラシクリンを含むPhoAリン酸塩枯渇自己誘導培地の200mLの培養物を播種した(各構築体に対し3つの振動フラスコを成長させた)。26℃で48時間、225rmpで成長させた後、100μlのアリコートを各培養物から採取し、蛍光プレートリーダーを用いて、励起波長395nmおよび放出波長510nmでGFP発現レベルを測定した。各振動フラスコに対し2つの測定値を取った。試験した構築体の中で、pSD0116が最高の蛍光シグナルを有し、pSD0114が続いたが(図81)、これら2つの構築体の発現レベルは、LCW0970.030(pLCW970)陽性対照よりも著しく低かった。
ライブラリーLCW1159は、一般に、LCW1157およびLCW1158よりも高い発現を有したため、次のライブラリー設計は、LCW1159に基づき、N末端ヘルパードメインコード領域内により多くの変異体を導入した。このライブラリーからの合計672個のクローン(理論的多様性55296)をスクリーニングし、ライブラリーLCW1157〜1159と同じ方法で再試験した。LCW1159.004よりも高い(前回のスクリーニングから最高の)発現を持つクローンを観測した(図85)。最高発現クローンであるLCW1163.029は、LCW1159.004から40%の改善を達成したが、その発現レベルは、CBD対照よりも27%低かった。高発現および低発現クローンの配列を分析し、発現に好適なヌクレオチドを特定してまとめた(表34参照)。位置の大部分は、より高い発現のためのコドンAの選好を示したが、Cを選好するものもある。
同時に、ライブラリーLCW1160からの168個のコロニー(N末端ヘルパードメインの無いRP11タグのコード領域を変化させるライブラリー(総理論的多様性8.8X1012))をスクリーニングし、分析した。しかしながら、このライブラリーは、一般に非常に低い発現レベルを有し(図86)、高発現を持つ1つの異常値は、プラスミドミニプレップおよびDNA配列決定分析を行った後、切断RP11タグをコードすることが見出された。これらの実験条件下でのライブラリーのスクリーニング結果は、N末端ヘルパーが、高い発現レベルを達成することが必要であることを強く示唆する。
より多くのN末端ライブラリー(LCW1171、LCW1172、LCW1203、およびLCW1204)を、上述されるものと同じ方法でスクリーニングし、分析した。LCW1171および1172は同様に設計されたが、LCW1171は、ヘルパー配列において、LCW1172よりも多くのアミノ酸変化を許した。スクリーニング結果は、LCW1171が、一般に、LCW1172よりもはるかに低い発現レベルを有したことを示した(図94AおよびB)。LCW1203および1204は、同様に設計され、LCW1171および1172と比較して、ヘルパー配列の異なる領域をランダム化することに重点を置く。LCW1204は、LCW1203よりも多くのアミノ酸変更を許し、一般に、LCW1203よりも低い発現をもたらした(図94CおよびD)。これらの結果は、発現レベルが、ヘルパードメイン配列中のアミノ酸変化に敏感であることを示唆する。
3つの新たなN末端ライブラリー(LCW1208、LCW1209、およびLCW1210)を設計し、N末端ヘルパー配列のさらなる伸長の効果を調査した(表35)。LCW1208およびLCW1210は、さらに4個の残基をヘルパードメインに導入したが、LCW1209は、さらに8個の残基を導入した。スクリーニング結果は、LCW1209が最高の発現を有し、LCW1208、次いでLCW1210が続くという一般的な傾向を示し(図95)、ヘルパー配列により多くのアミノ酸を追加する有益な効果を確認した。
ヘルパー_LCW1159.004−RP11−AE288−His8(AC767)、ヘルパー_LCW1172.033−RP11−AE576−His8(AC780)、およびヘルパー_LCW1172.033−RP11−AE864−His8(AC786)をコードするプラスミドを担持する大腸菌BL21を、大腸菌BL21株に形質転換した。3つの株のそれぞれに対し、3回の10L発酵を実行した。グリセロールストックを使用し、10μg/mLのテトラシクリンを含有する125mLのLBブロス培地を播種した。次いで、種培養物を37℃で終夜振動させた。種培養物を使用し、B.Braun Biostat Bコントローラを備える10Lガラス被覆容器中に、20gの硫酸アンモニウム、10.4gのリン酸カリウム二塩基性無水物、5gのクエン酸ナトリウム二水和物、4.6gのリン酸ナトリウム一塩基性一水和物、106gのNZ BL4ダイズペプトン(Kerry Bioscience #5X00043)、54gの酵母抽出物(Teknova #Y9020)、3.6Lの水、0.05mLのポリプロピレングリコール、5.2mLのトレース要素溶液(Amunixレシピ、144−1)、35mLの1M硫酸マグネシウム、および4mLのカナマイシン(50mg/mL)を含有する4Lの発酵バッチ培地を播種した。発酵制御設定は、pH=6.9+/−0.1、dO2=10%、攪拌棒のみモードで125〜1180rpmの範囲の溶解酸素カスケード、90%酸素の5リットル/分の気流、初期温度37℃、塩基制御13%水酸化アンモニウム、および酸対照無しであった。6時間の培養後、70%グリセロールフィードは、40g/時間の速度で開始した。50+/−10ODのOD600に到達する培養時に、培養温度を26℃に低下させ、54mLの1M硫酸マグネシウムを添加し、10g/Lの硫酸塩アンモニウム、26g/Lのリン酸カリウム二塩基性無水物、2g/Lのクエン酸ナトリウム二水和物、13g/Lリン酸ナトリウム一塩基性一水和物、15g/Lリン酸カリウム一塩基性無水物、0.08%トレース要素からなる塩フィードを33g/Lの速度で開始し、6時間継続した。64〜70時間の総発酵実行時間後、培養物を遠心分離によって採取し、湿潤重量で1.6〜2.3キログラムの細胞ペレットを生じた。ペレットは、今後の使用まで−80℃で凍結保存した。力価分析の場合、実行された発酵の終了時に、0.2mL容量の全体ブロス試料を凍結し、次いで解凍した後、0.2mLの水を添加して、宿主タンパク質を溶解および凝集し、試料を85℃で15分間、次いで4℃で15分間インキュベートした後、20,000gで10分間遠心分離した。得られた凝集可溶性溶解物を、C18逆相HPLCによってアッセイし、ヘルパー−RP11−XTEN−His8を表すピークに対応するA214吸光領域を、精製された参照基準と比較した。次に、乾燥細胞重量(DCW)を決定するために、細胞のアリコートをペレットで取り、上澄みを破棄した。細胞ペレットを水で1回洗浄し、次いで80℃のオーブンで3日間乾燥させた。細胞ペレットを含有する管を計量し、管の重量を測定重量から差し引き、残りの重量を各試料の初期容量(0.0002L)で割ってDCWを得た。発酵成長、力価分析、および乾燥細胞重量の結果は、以下の表37に要約される。96ウェルプレートスクリーニングアッセイにおいて、N末端ヘルパーを持たないRP11−XTEN−His8構築体のライブラリーである、LCW1160をスクリーニングしたとき(実施例12、図86)、LCW1160.006の発現レベル、最高発現構築体は、LCW1159.004またはLCW1172.033の発現のわずか50%であり、ヘルパー配列を持つ構築体であった。したがって、N末端ヘルパー配列を持つXTEN構築体は、ヘルパー配列を有しないXTEN構築体と比較して、著しく高い発現力価をもたらすことが予想される。
1.発現、溶解、および清澄化
実施例10に記載されるライブラリーメンバーLCW1159.004からのN末端ヘルパー配列を持ち、それぞれN末端およびC末端でXTENに結合された2つの親和性タグを持つ、融合タンパク質MKNPEQAEEQAEEQREET−RP11−SASRSA−XTEN_AE432(C12,C217,C422)−SASRSA−His(8)]は、本明細書に記載される条件を使用し、4L発酵槽を用いて大腸菌中で発現させた。成長後、細胞を遠心分離によって採取し、使用するまで−80℃で冷凍した。細胞ペレットを溶解緩衝液(20mM リン酸ナトリウム、50mM NaCl、2mM EDTA pH8.0、細胞ペースト1g当たり3mLの緩衝液)中に再懸濁した。APVホモジナイザーに3回、830〜900バールの圧力で通すことによって細胞を溶解した。溶解緩衝液(細胞ペースト1グラム当たり1mLの緩衝液)を追跡として使用し、ホモジナイザーから滞留量を回収した。均質化した溶解物を85℃の水浴中で20分間インキュベートし、続いて氷水浴中で20分間急速冷却した。加熱および冷却処理後、溶解物を11000RPMで90分間、SORVALL遠心分離器内で遠心分離した。遠心分離後、上澄みを2つのCUNO Bio cap 25(BC0025L90SP08A)フィルターに通して濾過した。清澄化した上澄みを4℃で終夜保管した。
IMAC親和性クロマトグラフィーは、XTENを正常なC末端Hisタグと結合するための捕捉ステップとして使用した。つまり、クロマトグラフィーカラムBPG140/12(GE Life Sciences)に、2000mLのToyopearl IMAC 650M樹脂(TOSOH Biosciences)を充填した。2カラム容量(CV)の平衡緩衝液(20mM リン酸ナトリウム、500mM NaCl、pH8.0)でカラムを平衡化した。清澄化した細胞溶解物を、5M NaClストック溶液を使用して最終NaCl濃度500mMに調整し、次いでIMAC樹脂の上に負荷した。2カラム容量の平衡緩衝液、次いで2カラム容量の20mMリン酸ナトリウム、500mM
NaCl、5mMイミダゾール、pH8.0に続いて、2カラム容量の20mMリン酸ナトリウム、5mMイミダゾール、pH8.0でカラムを洗浄し、塩を除去した。2カラム容量の20mMリン酸ナトリウム、100mMイミダゾール、pH8.0で溶出を行った。フロースルー、洗浄、および溶出分画を、非還元4〜12%ビス−トリスSDS−PAGE/クマシー染色によって分析し、所望の産物を持つ分画をプールした。
カチオン交換クロマトグラフィーを研摩ステップとして使用し、産物のN末端完全性を保証した。産物に対するその優れた能力および選択性に起因して、いくつかのカチオン交換培地の中からMacroCap SP樹脂(GE Life Sciences)を選択した。1000mLのMacroCap SP樹脂をBPG100/13(GE Life Sciences)クロマトグラフィーカラムに充填し、20mMリン酸ナトリウム、pH8.0、20mM NaClで平衡化した。IMACプールをカラムの上に負荷し、樹脂を2カラム容量の20mMリン酸ナトリウム、50mM NaCl、pH8.0、および2カラム容量の20mMリン酸ナトリウム、pH8.0、150mM NaClで洗浄した。タンパク質を、20mMリン酸ナトリウム(pH8.0)中、5カラム容量の直線勾配150〜500mM NaClで溶出した。分画を回収し、4〜12%ビス−トリスSDS/PAGEによって分析した。次のステップのために、所望の産物を持つ分画を合わせた。
SP溶出プールのトリプシン(Sigma、ウシ膵臓からのトリプシン)消化は、1:200m/mの酵素/タンパク質比で、37℃で終夜行った。
トリプシン消化後、Macrocap Qクロマトグラフィーを使用し、切断されたタグを最終産物から分離した。BPG100/19カラム(GE Life Sciences)に、1500mLカラム容量のMacrocap Q樹脂(GE Life Sciences)を充填した。トリプシン消化したMacrocap SP溶出プールを80℃で15分間、20mM DTTおよび2mM EDTAでインキュベートし、ジスルフィド結合を低減し、トリプシンを不活性化した。冷却したタンパク質溶液を、Milli−Q水で5mS/cm以下の導電性に希釈し、20mM HEPES、50mM NaCl、pH7.0で平衡化されたMacrocap Qカラムの上に負荷した。2カラム容量の20mM HEPES、50mM NaCl、pH7.0、次いで2カラム容量の20mM HEPES、2mM TCEP、150mM NaCl、pH7.0でカラムを洗浄した。タンパク質は、20カラム容量の20mM HEPES、pH7.0中、線形勾配150mM NaCl〜500mM NaClで溶出した。分画は、SDS−PAGE/銀染色によって分析した。
選択したMacroCap Q分画を合わせ、10KD Pellicon mini(Millipore)を使用し、20psi未満のフィード圧、8psi未満の残余分で濃縮し、続いて20mM HEPES、50mM NaCl、pH7.0を用いた10X透析濾過によって5mg/mL超の最終タンパク質濃度を達成した。
1つのバッチ(バッチ1)は、上記のような3つの精製ステップを通じて精製された。別のバッチ(バッチ2)は、同じ発酵材料から精製されたが、MacroCap SP研摩ステップは省略された。XTENの切断種は、バッチ1のMacroCap Q溶出分画中のSDS−PAGE/銀染色によって検出されたが(図87A)、バッチ1のMacroCap Q溶出分画は、本質的に切断を含まなかった(図87B)。これらの結果は、用いられた条件下で、RP11タグに基づくMacroCap SPステップが、N末端完全性および全体的な産物品質を保証するために必須であることを支持する。
以下のプライマー5Afor&CI1BbsIrev−TGGC、CI1BsaIfor−TGGC&CI2−AE38BbsIrev、およびCI2−AE38BsaIfor&AatIICI3−2Pのセットを使用し、それぞれAE−CI1、CI1−2、およびCI2−3のPCR産物を得るために、XTEN_AE432(C422)を含有するプラスミドpCW1164をPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)させた。CI1、2、および3は、同じアミノ酸配列TAEAAGCGTAEAAを有するが、異なるコドン使用頻度を持つシステイン島1、2、および3として指定された。PCR産物のゲル精製を行い、適正サイズのバンドを得て、これらを、挿入としてそれぞれ制限酵素SbfI/BbsI、BsaI/BbsI、およびBsaI/AatIIで消化した。N末端−RP11−R−XTEN_AE432(C422)−R−H8の遺伝子をコードするプラスミドpCW1164の消化をSbfI/AatIIで行い、XTEN_AE432内の約290個のアミノ酸のフラグメントを除去し、ベクターとしての残りの大きなフラグメント上でゲル精製を行った。上記のPCR産物の3つの挿入とのベクターのライゲーションを行い、それを使用してBL21コンピタント細胞を形質転換し、N末端−RP11−R−XTEN_AE432(C319,C370,C422)−R−H8構築体を得た。プライマーCI1BsaIfor−TGGC&AatIICI3−2Pを用いてPCRをこの構築体上で行い、長さ約360bpのPCR産物を得た。適正サイズのバンドのゲル精製を行い、続いて3つのシステイン島を含有する挿入XTEN_AE120−3Cysとして、BsaI/AatIIで消化した。
プライマーPhoAfor&RP11−SASRSABsaIrevAGGTを使用し、N末端−RP11タグを含有するプラスミドをPCRして、N末端−RP11−RのPCR産物を得た。適正サイズのバンドのゲル精製を行い、第1の挿入としてNdeI/BsaIを用いて消化した。別のPCRは、プライマーAE432BsaIforAGGT&AE432_001BbsIrev−AACGを用いて、XTEN_AE864_003を含有するプラスミド上で行い、XTEN_AE432のPCR産物を得た。適正サイズのバンド上でゲル精製を行い、第2の挿入としてBsaI/BbsIを用いて消化した。実施例10からの構築体N末端−RP11−R−AE432_9Cys−R−H8の消化をNdeI/BsaIで行って、N末端−RP11−Rフラグメントを除去し、ゲル精製を行って、大きなフラグメントをベクターとして得た。上記の第1および第2の挿入とのベクターのライゲーションを行い、その産物を使用して、BL21コンピタント細胞を形質転換し、構築体N末端−RP11−R−XTEN_AE864(C444,C495,C546,C597,C649,C700,C751,C802,C854)−R−H8を得た。得られた構築体は、前駆体N末端−RP11−R−AE864_9Cys−R−H8を産生するように設計され(以下、表39の配列)、この産物は、トリプシン消化によるN末端−RP11タグおよびC末端8xHisタグの除去後に、1xアミノ,9−チオ−XTEN864を生成した。得られた産物は、共役のためのXTEN864配列中にN末端アミノ基および9個のシステインを含有する(セグメント175)。
種培養物は、共役タンパク質配列に適切なXTENを含有するプラスミドを担持する大腸菌のグリセロールストックを50μg/mLカナマイシンを含有する125mLのLBブロス培地に播種することによって調製した。次いで、培養物を37℃で終夜振動させた。種培養物を使用し、B.Braun Biostat Bコントローラを備える5Lガラス被覆容器中に、12.5gの硫酸アンモニウム、15gのリン酸カリウム二塩基性無水物、2.5gのクエン酸ナトリウム二水和物、8.5gのリン酸ナトリウム一塩基性一水和物、50gのNZ BL4ダイズペプトン(Kerry Bioscience #5X00043)、25gの酵母抽出物(Teknova #Y9020)、1.8L水、0.5mLのポリプロピレングリコール、2.5mLのトレース要素溶液(Amunixレシピ144−1)、17.5mLの1M硫酸マグネシウム、および2mLカナマイシン(50mg/mL)の2Lの発酵バッチ培地を播種した。発酵制御設定は、pH=6.9+/−0.1、dO2=10%、攪拌棒のみモードで125〜1180rpmの範囲の溶解酸素カスケード、90%酸素の5リットル/分の気流、初期温度37℃、塩基制御13%水酸化アンモニウム、および酸対照無しであった。6時間の培養後、50%グルコースフィードは、30g/時間の速度で開始した。20時間の培養後、25mLの1M硫酸マグネシウム、および3mLの1M IPTGを添加した。45時間の総発酵実行時間後、培養物を遠心分離によって採取し、全ての構築体に対し、湿潤重量で0.45〜1.1キログラムの細胞ペレットを生じた。ペレットは、今後の使用まで−80℃で凍結保存した。発酵の複数の時点で培養試料を取り、細胞を溶解させた後、細胞残屑を加熱および急速冷却で凝結させ、清澄化した可溶性溶解物を遠心分離によって調製し、InvitrogenからのNuPAGE 4〜12%ビス−トリスゲルを使用し、製造者の仕様に従い、クマシー染色を用いて、通常の非還元SDS−PAGEによって分析した。発酵実行時間の関数としてのXTEN融合タンパク質の蓄積の例は、図45に示される。結果は、XTEN融合タンパク質構築体が、1g/L超の力価を持つ発酵スケールで発現し、約160kDaの見掛け分子量を持つことを示した(注記:実際の分子量は100kDaである)。SDS−PAGEにおいて観察された移動は、他のXTEN含有融合タンパク質に対して観察されたものに相当した。
この実施例は、単一システイン残基を含むシステイン操作されたXTENの精製について説明する。
1.清澄化
発酵からの20gmの細胞ペーストを、100mLの20mMリン酸ナトリウム、pH8.0(溶解緩衝液)中に再懸濁した。細胞溶解物は、ホモジナイザーにおいて3回、800〜900バールで均質化した。50mLの溶解緩衝液を追跡として使用し、ホモジナイザーから滞留量を回収した。均質化した溶解物を85℃の水浴中で20分間インキュベートし、続いて氷水浴中で20分間急速冷却した。加熱および冷却処理後、溶解物を11000RPMで90分間、SORVALL遠心分離器内で遠心分離した。遠心分離後、上澄みを2つのCUNO Bio cap 25(BC0025L90SP08A)フィルターに通して濾過した。フィルターを40mLの溶解緩衝液で追跡した。清澄化した材料の最終容量は230mLであった。清澄化した上澄みを4℃で終夜保管した。
疎水性相互作用クロマトグラフィーを第1のステップとして使用し、XTENの疎水性CBDタグを用いて、N末端無傷タンパク質の捕捉を保証した。Toyopearl Phenyl 650M(Part#0014783,TOSOH Bioscience)を使用して、XK16を15cm床高(30mLカラム容量)まで充填した。このクロマトグラフィーは、AKTA FPLC(GE Biosciences)を使用して行った。Toyopearl Phenyl樹脂は、負荷する前に、2カラム容量の20mMリン酸ナトリウム、1M硫酸ナトリウム、pH8.0で平衡化した。HIC負荷は、上記清澄化した溶解物に対し1M濃度まで硫酸ナトリウムを添加することによって調製した(最終容量約250mL)。試料は、HIC樹脂の上に(約4mg/mL樹脂負荷)2mL/分で負荷した。負荷は、UV215が安定するまで約9カラム容量の平衡緩衝液(20mMリン酸ナトリウム、1M硫酸ナトリウム、pH8.0)で追跡することによって完了させた。タンパク質は、100% B(20mMリン酸ナトリウム、pH8.0)でステップ溶出した。合計7カラム容量の溶出緩衝液を適用し、完全な溶出を確認する(図46)。
IMAC親和性クロマトグラフィーは、XTENの無傷C末端Hisタグに結合するための捕捉ステップとして使用した。クロマトグラフィーカラムXK26を、Toyopearl IMAC 650M(Part#0014907,TOSOH Biosciences)で、15cm床高(85mLカラム容量)まで充填した。2カラム容量の20mMリン酸ナトリウム、10mMイミダゾール、0.25M NaCl、pH8.0(平衡緩衝液)でカラムを平衡化した。5M NaClをHIC溶出プールに添加することによってIMAC負荷を調製し、最終容量0.25MのNaClを製造した。試料は、IMAC樹脂の上に流量4mL/分で負荷した。負荷は、2カラム容量の平衡緩衝液によって完了させた。樹脂を2カラム容量の20mMリン酸ナトリウム、10mMイミダゾール、pH8.0で洗浄し、塩を除去した。緩衝液A(20mMリン酸ナトリウム、10mMイミダゾール、pH8.0)、および緩衝液B(20mMリン酸ナトリウム、200mMイミダゾール、pH8.0)を用いて、7カラム容量の0〜100%B、続いて2CVの100%Bの線形溶出を行った。イミダゾールの存在は、AKTA FPLCを用いてUV215吸光度を3500mAu以上に維持したため、溶出ピークは観察されなかった。フロースルー、洗浄、および溶出分画は、4〜12%ビス−トリス非還元SDS−PAGEゲルによって分析した(図48)。ゲルは、宿主細胞タンパク質および切断されたXTEN種の良好な除去を示す(図48A)。第2のゲルに基づいて(図48B)、分画C5、C6、およびC7をプールした。IMAC溶出プール中に合計70mgのタンパク質が推定された。
IMAC溶出プールのトリプシン消化は、1:200m/mの比で行った。0.35mgのウシ膵臓トリプシン(Sigma、カタログ#T1426)を、70mgのタンパク質(IMAC溶出プール)で終夜、37℃でインキュベートした。非還元4〜12%ビス−トリスSDS−PAGE分析を行い、CBDタグの切断が、図49に示されるように完了したことを確認した。
トリプシン消化後、MacroCap Qクロマトグラフィーを使用し、切断されたタグを分離した。XK 16カラムを、MacroCap Q(GE Life Sciences、カタログ#17−5469−02)で18cm床高まで充填した。トリプシン消化したIMAC溶出プールを37℃で1時間、2mM TCEPでインキュベートし、MacroCap Qカラム上に負荷する前に、XTENの二量体を還元した。カラムは、20mM HEPES、pH7.0で平衡化した。試料は、4mL/分で負荷した(約2mg/mL樹脂負荷)。カラム負荷は、追加の2カラム容量の20mM HEPES、2mM TCEP、pH7.0で完了した。カラムを、2カラム容量の20mM HEPES、2mM TCEP、150mM NaCl、pH7.0で洗浄した。20mM HEPES、2mM TCEP、pH7.0緩衝液中150mM NaCl〜500mM NaClの線形勾配溶出を、20カラム容量以上行った。TCEPの存在に起因して、全体クロマトグラフィー中に高レベルのUV215が観察されたが(図50)、22〜30mS/cmの溶出ピークが観察された。SDS−PAGE、銀染色、およびC18 RP−HPLCによって、全ての試料を分析した。フロースルーにおいて、切断されたCBDの除去が観察され(図51A)、一方、溶出分画E11、E12、F12、F11、F10・・・F6の中の溶出分画において、XTENのごくわずかなバンドが観察された(図51B)。XTENの切断種の分離は、早期溶出分画E11、E12、F12、およびF11において、銀染色によって、主なXTENポリペプチドよりも速く移動する種として観察された(図51C)。上記の結果に基づき、溶出分画をC18 RP−HPLCによってさらに分析した。図52は、RP−HPLC分析のスタック化クロマトグラフィープロファイルを示す。早期溶出分画は、切断された種の著しい存在を示す、広い先導肩部を有した。またこれらの早期分画(E12、F12、およびF11)は、タンパク質分解タグで富化された。上記分析に基づき、溶出分画F10、F9、F8、F7、およびF6をプールした。C18 RP−HPLCによって、溶出プールを再度分析した(図53)。精製されたタンパク質は、97.5%の純度であることが見出された。
Amicon Ultracel−15(MWCO 10k)遠心分離デバイスを使用して、上記MacroCap Qプールを5mLに濃縮し、続いて20mM HEPES
pH7.0を用いた7X透析濾過によって、8.13mg/mLの最終タンパク質濃度に濃縮した。20gmの細胞ペレットから合計43mgのタンパク質が精製された。3ステップクロマトグラフィーの全体回収は、約33%と推定された。
アミノ−XTENの精製は、本質的に、1つのシステインを含有する1xチオール−XTENの精製について記載される通り行った(詳細は実施例15参照)。発酵からの20gmの細胞ペーストを、100mLの20mM リン酸ナトリウム、pH8.0(溶解緩衝液)中で均質化し、熱処理して、遠心分離および濾過によって清澄化した。疎水性相互作用クロマトグラフィーを第1のステップとして使用し、N末端無傷タンパク質を捕捉した(図54)。分画E2、E3、およびE4をさらなる処理のためにプールした。IMAC親和性クロマトグラフィーは、XTENの無傷C末端Hisタグに結合するための捕捉ステップとして使用した(図55)。分画E2およびE3をプールした。IMAC溶出プールのトリプシン消化は、1:200m/mの比で終夜、37℃で行った。トリプシン消化後、MacroCap Qクロマトグラフィーを使用し、切断されたタグを分離した。分画は、SDS−PAGEに続いて、銀染色(図56)およびC18 RP−HPLC(図57)によって分析した。上記分析に基づき、溶出分画C10、C11、およびC12をプールした。C18 RP−HPLCによって、溶出プールを再度分析した(図58)。タンパク質は、98%超の純度であることが見出された。Amicon Ultracel−15(MWCO 10k)遠心分離デバイスを使用して、MacroCap Qプールを3000RPMで5mLに濃縮し、続いて20mM HEPES pH7.0を用いた7X透析濾過によって、5.35mg/mLの最終タンパク質濃度に濃縮した。
上記の発現ベクターを使用して、2タグ付きXTENタンパク質を構築し、融合タンパク質を以下のアミノ酸配列または成分:MKIKTGARILALSALTTMMFSASALAAPTTAGAG−Tag−XTEN_AE869(Am1)−RHHHHHHHHでコードし、式中、MKIKTGARILALSALTTMMFSASALAは、宿主細胞周辺質に発現および輸送されたポリペプチドから切断されるMalE認識配列であり、APTTAGAGはスペーサーであり、Tagは、以下に由来する(括弧内の配列が続くタグ名):RP5(RPRPRPRPRPGR);RP7(RPRPRPRPRPRPRPGR);KP5(KPKPKPKPKPGR);RP9(RPRPRPRPRPRPRPRPRPGR);RP11(RPRPRPRPRPRPRPRPRPRPRPGR);P5K4P9(RPRPKPRPKPRPKPRPKPGR);およびR6K5P11(RPRPKPRPKPRPKPRPKPRPKPGR)。タグを持つ構築体の全ての変化形を製造し、実施例15に記載される方法を使用して、タンパク質を大腸菌中で発現させた。SDS−PAGE/クマシー染色分析のために、可溶性抽出物を宿主細胞から調製した。分析によって、N末端タグ長およびアミノ酸組成物は、RP7、RP9、RP11、およびR6K5P11タグを持つ構築体の発現について、タンパク質発現に顕著に影響しなかった(図59参照)。RP5、RP7、RP9、およびRP11タグを持つ発現タンパク質を、MacroCap SP樹脂への結合についてさらに試験した。より長いタグを持つタンパク質は、カチオン交換樹脂により効率的に結合し、よりストリンジェントな洗浄条件下で結合されたままであった。したがって、RP11タグは、カチオン交換クロマトグラフィーを使用し、XTENの精製のためのN末端タグとして選択された。追加の実験は、RP11−XTEN−His8ポリペプチドが、発酵槽中で効率的に発現したことを示し、発現したタンパク質の大部分は、細胞ペレット分画中に見出された(図60)。
1.発現
1xアミノ−XTENのRP11−XTEN−His8前駆体は、記載される4L発酵反応を使用し、形質転換された大腸菌中の発現によって産生された。細胞を遠心分離によって採取し、使用するまで−80℃で冷凍した。
25gmの細胞ペーストを、75mLの20mMリン酸ナトリウム、pH8.0、50mM NaCl、2mM EDTA中に再懸濁した。再懸濁されたペーストを、800〜900バールで3回ホモジナイザーに通すことによって、溶解を行った。ホモジネートを85℃の水浴中で15分間保持した後、氷/水浴を使用し、温度が10℃以下に低下するまで急速に冷却した。次いで、処理されたホモジネートを、10,000rpmでSLA−3000ローターにおいて60分間遠心分離した。上澄みを回収し、0.22μmボトルトップフィルターを使用して濾過した。
カチオン交換クロマトグラフィーを捕捉ステップとして使用し、産物のN末端完全性を保証した。産物に対するその優れた能力および選択性に起因して、いくつかのカチオン交換培地の中からMacroCap SP樹脂(GE Healthcare)を選択した。20mLのMacroCap SPカラムをRedi−Sepハウジングに充填し、20mMリン酸ナトリウム(pH8.0)、20mM NaCl緩衝液で平衡化した。溶解物を重力によってカラムの上に負荷した。3カラム容量(CV)の20mMリン酸ナトリウム、pH8.0、100mM NaClを洗浄ステップとして適用した後、タンパク質を3CVの20mMリン酸ナトリウム、pH8.0、500mM NaClでステップ溶出した。溶出のために半CV分画(10mL)を回収し、4〜12%ビス−トリスSDS/PAGEによって分析した(図61)。後次のクロマトグラフィーステップのために、溶出分画2〜4を合わせた。
20mLのToyoPearl AF−キレートカラムを、Redi−Sepカラムハウジングに充填し、100mM硫酸ニッケルを装入した。カラムを20mMリン酸ナトリウム、pH8.0、500mM NaClで平衡化した後、MacroCap SPプールを重力によってカラムの上に負荷した。20mMリン酸ナトリウム(pH8.0)、500mM NaCl、5mMイミダゾール緩衝液に続いて、20mMリン酸ナトリウム(pH8.0)、5mMイミダゾールを使用し、2つの洗浄ステップを適用した。次いで、20mMリン酸ナトリウム、100mMイミダゾールを使用して、産物をカラムから溶出し、4CVの溶出に対して半CV(10mL)分画を回収した。各ステップからの試料を、4〜12%ビス−トリスSDS/PAGEによって審査した(図62)。ゲルに基づいて、溶出2および3をさらなる処理のためにプールした。全体収率は30%であった。
IMACプールのトリプシン消化は、1:200および1:500m/mの比で、1mg/mLのウシトリプシン(Sigma、カタログ#T1426、ウシ膵臓からのトリプシン)をIMACプールに添加することによって行った。反応混合物を37℃で終夜保持し、消化の完了は、MALDI−TOF質量分析によって確認した。消化前および消化後試料を、4〜12%ビス−トリスSDS/PAGEによって分析し、クマシー染色および銀染色の双方によって染色した(図63)。クマシー染色されたゲル上の、よりかすかな染色、ならびに消化後試料の分子量の移行は、消化前試料と比較したとき、NおよびC末端タグの双方の良好な除去を示す。銀染色されたゲルは、消化後に均質なバンドを示し、試料中の切断種の不在を示唆し、RP11/H8 2タグ系および精製方法が、均質な最終XTEN産物を提供するという結論を支持する。
1.発現
それぞれNおよびC末端でXTENに結合された2つの親和性タグを持つ融合タンパク質RP11−XTEN−His8は、記載される条件を使用し、4L発酵反応を使用して大腸菌中で発現させた。
成長後、細胞を遠心分離によって採取し、使用するまで−80℃で冷凍した。細胞ペレットを溶解緩衝液(20mM リン酸ナトリウム、50mM NaCl、2mM EDTA pH8.0、細胞ペースト1g当たり3mLの緩衝液)中に再懸濁した。APVホモジナイザーに3回、830〜900バールの圧力で通すことによって細胞を溶解した。溶解緩衝液(細胞ペースト1グラム当たり1mLの緩衝液)を追跡として使用し、ホモジナイザーから滞留量を回収した。均質化した溶解物を85℃の水浴中で20分間インキュベートし、続いて氷水浴中で20分間急速冷却した。加熱および冷却処理後、溶解物を11000RPMで90分間、SORVALL遠心分離器内で遠心分離した。遠心分離後、上澄みを2つのCUNO Bio cap 25(BC0025L90SP08A)フィルターに通して濾過した。清澄化した上澄みを4℃で終夜保管した。
IMAC親和性クロマトグラフィーは、XTENを正常なC末端Hisタグと結合するための捕捉ステップとして使用した。つまり、クロマトグラフィーカラムBPG140/12(GE Life Sciences)に、2000mLのToyopearl IMAC 650M樹脂(TOSOH Biosciences)を充填した。2カラム容量(CV)の平衡緩衝液(20mM リン酸ナトリウム、500mM NaCl、pH8.0)でカラムを平衡化した。澄化した細胞溶解物を、5M NaClストック溶液を使用して最終NaCl濃度500mMに調整し、次いでIMAC樹脂の上に負荷した。2カラム容量の平衡緩衝液、次いで2カラム容量の20mMリン酸ナトリウム、500mM NaCl、5mMイミダゾール、pH8.0に続いて、2カラム容量の20mMリン酸ナトリウム、5mMイミダゾール、pH8.0でカラムを洗浄し、塩を除去した。2カラム容量の20mMリン酸ナトリウム、100mMイミダゾール、pH8.0で溶出を行った。フロースルー、洗浄、および溶出分画は、非還元4〜12%ビス−トリスSDS−PAGE/クマシー染色によって分析し、所望の産物を持つ分画をプールした。
カチオン交換クロマトグラフィーを研摩ステップとして使用し、産物のN末端完全性を保証した。産物に対するその優れた能力および選択性に起因して、いくつかのカチオン交換培地の中からMacroCap SP樹脂(GE Life Sciences)を選択した。1000mLのMacroCap SP樹脂をBPG100/13(GE Life Sciences)クロマトグラフィーカラムに充填し、20mMリン酸ナトリウム、pH8.0、20mM NaClで平衡化した。IMACプールをカラムの上に負荷し、樹脂を2カラム容量の20mMリン酸ナトリウム、50mM NaCl、pH8.0、および2カラム容量の20mMリン酸ナトリウム、pH8.0、150mM NaClで洗浄した。タンパク質を、20mMリン酸ナトリウム(pH8.0)中、5カラム容量の直線勾配150〜500mM NaClで溶出した。分画を回収し、4〜12%ビス−トリスSDS/PAGEによって分析した。次のステップのために、所望の産物を持つ分画を合わせた。
SP溶出プールのトリプシン(Sigma,ウシ膵臓からのトリプシン)消化は、1:200m/mの酵素/タンパク質比で終夜、37℃で行った。
トリプシン消化後、Macrocap Qクロマトグラフィーを使用し、切断されたタグを最終産物から分離した。BPG100/19カラム(GE Life Sciences)に、1500mLカラム容量のMacrocap Q樹脂(GE Life Sciences)を充填した。トリプシン消化したMacrocap SP溶出プールを80℃で15分間、20mM DTTおよび2mM EDTAでインキュベートし、ジスルフィド結合を低減し、トリプシンを不活性化した。冷却したタンパク質溶液を、Milli−Q水で5mS/cm以下の導電性に希釈し、20mM HEPES、50mM NaCl、pH7.0で平衡化されたMacrocap Qカラムの上に負荷した。2カラム容量の20mM HEPES、50mM NaCl、pH7.0、次いで2カラム容量の20mM HEPES、2mM TCEP、150mM NaCl、pH7.0でカラムを洗浄した。タンパク質は、20カラム容量の20mM HEPES、pH7.0中、線形勾配150mM NaCl〜500mM NaClで溶出した。分画を、SDS−PAGE/銀染色によって分析した。
選択したMacroCap Q分画を合わせ、10KD Pellicon mini(Millipore)を20psi未満のフィード圧、8psi未満の残余分で濃縮し、続いて20mM HEPES、50mM NaCl、pH7.0を用いた10X透析濾過によって5mg/mL超の最終タンパク質濃度を達成した。
1つのバッチ(バッチ1)は、上記のような3つの精製ステップを通じて精製された。別のバッチ(バッチ2)は、同じ発酵材料から精製されたが、MacroCap SP研摩ステップは省略された。XTENの切断種は、バッチ2のMacroCap Q溶出分画中のSDS−PAGE/銀染色(図87A)によって検出され、バッチ1のMacroCap Q溶出分画は、本質的に切断を含まなかった(図87B)。これらの結果は、用いられた条件下で、RP11タグに基づくMacroCap SPステップが、N末端完全性および全体的な産物品質を保証するために必須であること、ならびにRP11/H8
2タグ系および精製方法が、均質な最終XTEN産物を提供することを支持する。
3x−チオール−XTEN(XTEN_AE905(Am1,C8,C453,C898,セグメント174))システイン操作されたXTENセグメントは、20mM HEPES、pH7.0、50mM NaCl中の193μM(16mg/mL)溶液として反応のために調製した。DBCO−マレイミド(Click Chemistry Tools,Inc.、カタログ#A108)を、DMF中に溶解し、最終濃度50mMにした。3xチオール−XTEN(5.1mg、320μl)のアリコートを、10mMの新鮮な再構築DTTを用いて、70℃で20分間還元した。タンパク質試料を、水で600μlの総容量に希釈した。1200μlの100%アセトニトリルを添加し、混合液を13,000rpmで5分間遠心分離した。上澄みを除去し、1000μlの80%アセトニトリルを添加し、混合液を13,000で1分間遠心分離した。洗浄ステップを再度繰り返した。ペレットを、300μlの100mM HEPES、pH7.0中に溶解した。DMF中7.7μlの50mM DBCO−Mal溶液を添加し(1:6モル比の3xチオール−XTEN:DBCO−マレイミド)、25℃で2時間インキュベートした。C18 RP−HPLC分析によって、修飾の完了を監視した(図64A)。タンパク質混合液を、1.6mL Toyopearlブチルカラムを使用し、疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)によって精製した。溶出は、20mMリン酸塩(pH7.0)緩衝液中30カラム容量の下降勾配(1.05M〜0.3M)硫酸アンモニウムを用いて0.5mL/分の流量で行った(図64B)。C18 RP−HPLCによって、クロマトグラフィー分画を分析した(図64C)。
トリプシン消化
XTEN_AE870_Am1,C1の二重タグ付加(CBD/His8)前駆体は、CBD配列の存在に起因して、クマシーで十分に染色する一方、XTEN_AE870_Am1,C1の非タグ付加異形は、クマシーで十分に染色しないが、銀染色によって検出することができる。したがって、トリプシン消化の完全性は、クマシー染色(図65A)および銀染色(図65B)技法双方を使用して監視した。XTEN_AE870_Am1,C1の二重タグ付加前駆体は、20mMリン酸緩衝液(pH8)中、異なる比率のウシトリプシンおよびプロテオミクス等級のブタトリプシン(陽性対照)で消化した。37℃で終夜のインキュベーションは、残留するクマシー染色された160kDaバンドの二重タグ付加前駆体の検出に基づいて、25℃で終夜のインキュベーションよりもさらに完全な消化を許した(図65A:全ての比率は、トリプシン:基質の質量/質量比を指す)。図65Bは、1:100、1:200、および1:500の比率が、ウシトリプシンで消化し、1:100がブタトリプシンで消化して、XTEN前駆体の効率的な消化をもたらすことを示す。
1:200比率のウシトリプシン:二重タグ付加前駆体(質量/質量)を、37℃で終夜の消化に使用した。図66Aは、二重タグ付加前駆体の消化産物への90%超の変換を示す。これは、消化後の約160kDaにおけるクマシー染色されたバンドの消失、および20kDa CBDフラグメントの出現によって実証された。
最終製剤化XTEN調製物中の残留トリプシン活性の存在を試験するために、タンパク質試料を10:1質量/質量比で合成[G2]GLP2ペプチドと混合した。消化の陽性対照は、[G2]GLP2ペプチドおよびウシトリプシンを含有し、陰性対照は、[G2]GLP2ペプチドのみを含有した。全ての試料を37℃で終夜インキュベートした。インキュベーション後、試料を1% TFAで急冷し、Phenomenex Jupiter C18 5μm 300A分析カラムを使用し、C18 RP−HPLC分析に供した。緩衝液Aは、0.1% TFA、99.9% HPLC等級H2Oを含有し、緩衝液Bは、0.1% TFA、99.9% HPLC等級アセトニトリルを含有した。5%B〜50%Bの勾配を使用し、45分の溶出時間にわたって分析を行った。図67は、XTEN_AE869(Am1,C2)最終調整物中の残留トリプシン活性のRP−HPLC分析の結果を示す。図67Aは、無傷GLP2ペプチドを示す(保持時間41分)。図67Bは、2つの特徴的なトリプシンフラグメントを持つGLP2ペプチドのトリプシン消化を示す(保持時間33.5分および34分)。図67Cは、GLP2ペプチドが、XTENを用いた終夜のインキュベーション後に無傷のままであり、トリプシンフラグメントが観察されなかったことを示す。この結果は、最終MacroCap Q精製調製物が、残留トリプシン活性を含有しないことを示す。
プラスミド上にAC292を含有する大腸菌を、2xYT中で終夜、飽和まで成長させ、次いで、200mLのこの培養物を使用して、ウェーブバッグ中25L培養物の2xYT培地に播種した。双方の培養物は、50μg/mLカナマイシンの存在下で存在した。第2の培養物を約1.0のOD600まで37℃で成長させ、26℃に冷却して、12mLの1M IPTGで終夜誘導した。細胞ペレットを、4000rpmで20分間のSLA−3000ローター回転で採取した。細胞ペレット(184g)を、736mLの20mMトリス(pH6.8)、50mM NaCl中に再懸濁した。再懸濁した細胞を、20,000psiでマイクロフルイダイザーを用いて溶解し、次いで75℃に15分間加熱した後、氷上で30分間急速冷却した。次いで、溶解物を遠心分離によって清澄化した。次いで、清澄化した溶解物をDE52カラムの上に負荷し、予めNaOHで衛生化し、20mMトリス(pH6.8)、50mM NaClで平衡化した。5カラム容量の20mMトリス(pH6.8)、50mM NaCl、5カラム容量の20mMトリス(pH6.8)、150mM NaClでカラムを洗浄し、5カラム容量の20mMトリス(pH6.8)、250mM NaClで溶出した。次いで、プールした溶出分画をmacrocapQカラムの上に負荷し、予めNaOHで衛生化し、20mMトリス(pH6.8)、50mM NaClで平衡化した。9カラム容量の20mMトリス(pH6.8)、50mM NaCl、9カラム容量の20mMトリス(pH6.8)、100mM NaClでカラムを洗浄し、9カラム容量の20mMトリス(pH6.8)、250mM NaClで溶出した。プールした溶出分画を15%w/v硫酸ナトリウムに調整した後、オクチルセファロースFFカラムの上に負荷し、予めNaOHで衛生化して、トリスpH7.5で平衡化した。4カラム容量の20mMトリス(pH7.5)、15%w/v硫酸ナトリウムでカラムを洗浄し、4カラム容量の20mMトリス(pH6.8)、4カラム容量の20mMトリス(pH7.5)、5%w/v硫酸ナトリウムで溶出した。試料を4℃で貯蔵し、ロット#AP197を得た。次いで、精製したシステイン操作されたXTENは、表11の薬物等のペイロードとの共役に適した反応物として機能し、XTEN−薬物共役体をもたらすことができる。
1xアミノ−XTEN(XTEN_AE869(Am1))を、20mM HEPES、pH7.0、50mM NaCl中の67μM(5.35mg/mL)として調製した。Sulfo−SMCC(Thermo Scientific、カタログ#22322)を、DMSO中の10mM溶液として新たに調製した。10mgのアミノ−XTEN(1.87mL)を15モル過剰のスルホ−SMCC(18.7μl)と混合し、25℃で1時間インキュベートした。Amicon Ultra−15,MWCO 5k遠心分離装置を使用し、遠心分離濾過によって過剰な架橋剤を除去した。1.8mL容量の反応混合物を、8mLの20mM HEPES pH7.0、50mM NaClと混合し、Sorvall RT6000遠心分離機中で3000rpm、4℃で20分間遠心分離した。この手順を2回以上繰り返した。回収された残余分の最終容量は1.8mLであった。GLP2−Cysペプチド(CSBio,カスタム合成)を20mM HEPES pH7.0、50mM NaCl中に溶解し、最終濃度3mg/mLにした。N−マレイミド−XTENを、2.3倍モル過剰のGLP2−Cysペプチドと混合し、25℃で1時間インキュベートした。C18 RP−HPLCによって、修飾の完了を監視した。20μgのタンパク質試料は、Phenomenex Jupiter C18 5μM 300A 4.6mmx150mmカラム上に負荷した。タンパク質は、0.1%トリフルオロ酢酸中の5〜50%勾配のアセトニトリルで溶出され、214nmでの吸光度によって検出された。本質的に、全てのN−マレイミド−XTENは、HPLCおよびエレクトロスプレー質量分析によって実証されるように、GLP2−Cys−XTEN共役体に変換された(NanoSep 3K Omega遠心分離装置(Pall Corp.)を使用して脱塩された100μgタンパク質試料上で行われた試料のESI−MS分析)。50%アセトニトリル、0.5%ギ酸中のタンパク質溶液は、流量10μl/分で高分解能質量分析計に注入した。スペクトルは、800〜1600amu範囲内で得られ、Bayesianタンパク質再構築ソフトウェアを使用して、ゼロ電荷スペクトルに再構築された(図68)。未反応のXTENおよびGLP2ペプチドを、連続アニオン交換(MacroCap Q)および疎水性相互作用(Toyopearl Phenyl)クロマトグラフィーによって共役体から分離した。RP−HPLCおよびMS分析の結果は、反応物および最終産物の高い収率および純度を実証した(図68)。
1xチオール−XTEN(XTEN_AE880(Am1,C8)(セグメント181)は、20mM HEPES、pH7.0、50mM NaCl中の122μM(9.84mg/mL)溶液として調製した。GLP2−N−マレイミドペプチド(CSBio,カスタム合成)をDMSO中に溶解し、最終濃度3mg/mLにした。1xチオール−XTEN(900μl中8.8mg)を、3倍モル過剰のGLP2−N−Malペプチドと混合し、25℃で1時間インキュベートした。修飾の完了および得られた共役を、C18
RP−HPLC(20μgのタンパク質試料を、Phenomenex Jupiter C18 5μM 300A 4.6mmx150mmカラム上に負荷した。タンパク質は、0.1%トリフルオロ酢酸中の5〜50%勾配のアセトニトリルで溶出され、214nmでの吸光度によって検出された)およびエレクトロスプレーイオン化質量分析(試料のESI−MS分析は、NanoSep 3K Omega遠心分離装置(Pall Corp.)を使用して脱塩された100μgタンパク質試料上で行われた)によって監視した。50%アセトニトリル、0.5%ギ酸中のタンパク質溶液は、流量10μl/分で高分解能質量分析計に注入した。スペクトルは、800〜1600amu範囲内で得られ、Bayesianタンパク質再構築ソフトウェアを使用して、ゼロ電荷スペクトルに再構築された。分析の結果は、図69に示される。 GLP2−XTEN共役体は、移動相として0.1% TFA中5〜50%勾配のアセトニトリルを使用し、分取C4 RP−HPLC(Vydac Protein C4 5μ 300A 10mmx250mmカラム)によって精製された(図70A参照)。最終HPLC精製されたGLP2−XTEN共役体は、Phenomenex Jupiter C18 5μM 300A 4.6mm x 150mmカラムを使用して分析した(図70B参照)。精製されたGLP2−XTEN共役体の収量は6.2mg(70%)であった。
1xチオール−XTEN(XTEN_AE880(Am1,C8)(セグメント181)を、20mM HEPES、pH7.0、50mM NaCl中の150μM(12mg/mL)溶液として調製した。DBCO−マレイミド(Click Chemistry Tools,Inc.、カタログ#A108)をDMFに溶解し、最終濃度50mMにした。容量200μl(2.4mg)の1xチオール−XTENを、1Mストック溶液を使用し、100mM HEPES、pH7.0に調整した。DMF中1.2μl容量の50mM DBCO−Malをタンパク質溶液に添加し(1:2モル比の1xチオール−XTEN:DBCO−マレイミド試薬)、25℃で1時間インキュベートした。C18 RP−HPLCによって、修飾の完了を監視した(図71A)。タンパク質混合液は、1.6mL Toyopearlブチルカラムを使用し、疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)によって精製した。溶出は、20mMリン酸塩(pH7.0)緩衝液中30カラム容量の下降勾配(1.05M〜0.3M)硫酸アンモニウムを用いて0.5mL/分の流量で行った(図71B)。C18 RP−HPLCによって、クロマトグラフィー分画を分析した(図71C)。
この実施例は、1つはペイロードAを持ち、1つはペイロードBを持つ、2つの異なるXTEM−ペイロード前駆体をN〜N末端構成で結合し、二重特異性共役体をもたらすことによるXTEN−ペイロード組成物の創製について説明する。
一特異性XTEN−ペイロード前駆体は、C末端に単一システインを含有する、例えば、AE144〜AE890の範囲の長さのXTEN分子に結合されたペイロードAのN末端融合として調製される(実施例25に記載される通り調製および精製される)。精製された前駆体を、20mM HEPES、pH7.0、50mM NaCl中で製剤化する。トリス−(2−マレイミドエチル)アミン(TMEA,Thermo Scientific、カタログ#33043)を、DMSOまたはDMF中に溶解する。前駆体(4〜6モル過剰の架橋剤)およびTMEA試薬を混合し、25℃で1時間インキュベートする。C4もしくはC18 RP−HPLC、またはサイズ排除クロマトグラフィーによって、修飾の完了を監視する。得られた三価ペイロードA−XTEN共役体を、疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)、アニオン交換クロマトグラフィー、または分取C4−C18 RP−HPLCによって、タンパク質反応物または部分的産物混合物から精製する。
AC272、ロット#AP197に由来する精製タンパク質は、FITCマレイミドで標識された。5mM TCEPを用いて室温で1時間インキュベートすることによって、試料を還元した。次いで、DG−10カラムを使用して、試料をPBS中に脱塩した。25倍モル過剰のDMSO中FITC−マレイミドを添加し、室温で2時間インキュベートすることによって、試料を標識した。DMSO濃度が総溶媒の5%未満であるように、容積を調整することに留意されたい。2mM DTTを添加することによって反応を急冷し、次いで、試料をTEVプロテアーゼで終夜消化した。試料を20mMトリス(pH7.5)で2倍に希釈し、macrocapQカラムの上に負荷し、NaOHで予め衛生化して、20mMトリス(pH7.5)で平衡化した。5カラム容量の20mMトリス(pH7.5)、135mM NaCl、5カラム容量の20mMトリス(pH7.5)、175mM NaClでカラムを洗浄し、5カラム容量の20mMトリス(pH7.5)、250mM NaClで溶出した。次いで、プールした溶出分画をTEVを用いて60時間、4℃で消化し、消化を完了させた。次いで、消化した試料を、予めNaOHで衛生化し、20mMトリス(pH7.5)、135mM NaClで平衡化した1mLのペルロザカラムの上に2回通過させた。任意の遊離FITCを除去するために、次いで、10,000MWCO膜を使用し、20mMトリス(pH7.5)、135mM NaClに対して試料を透析した。SECカラム中のOD214タンパク質シグナルおよびOD495FITCシグナルの共移動は、XTENの標識との良好な共役を示し、最小の遊離色素汚染を伴う(図72B)。良好な共役は、SDS PAGE中のFITC蛍光を持つ、明らかに大きなMWのタンパク質によっても示される(図72A)。
GFP(AC219)は、GFPリジンに連結するためのアミン反応基と、AC292中のXTENに操作された遊離システインに連結するためのシステイン反応基を有する二官能性架橋剤によって、XTENに化学的に架橋された。GFPは、室温で2時間インキュベートすることによって、二官能性架橋剤スルホ−SMCCで標識された。タンパク質を、DG−10カラムを使用し、遊離スルホ−SMCCを除去することによって、PBS中に脱塩した。AC272、ロット#AP197に由来する精製タンパク質を還元し、DG−10カラム上のPBS中に脱塩し、標識化GFPと混合して架橋を可能にした。架橋反応を、添加された2mM DTTで急冷し、TEVを添加して、4℃で終夜のインキュベーションにおいてCBDドメインを除去した。翌日、追加のTEVを添加し、4℃でさらに60時間のインキュベーションによって消化を完了させた。TEV消化に続いて、試料を20mMトリス(pH7.5)中100mLに希釈し、macrocapQカラムの上に負荷し、NaOHで予め衛生化して、20mMトリス(pH7.5)で平衡化した。5カラム容量の20mMトリス(pH7.5)、5カラム容量の20mMトリス(pH7.5)、50mM NaCl、5カラム容量の20mMトリス(pH7.5)、100mM NaCl、5カラム容量の20mMトリス(pH7.5)、150mM NaCl、5カラム容量の20mMトリス(pH7.5)、200mM NaCl、5カラム容量の20mMトリス(pH7.5)、250mM NaCl、5カラム容量の20mMトリス(pH7.5)、300mM NaCl、および5カラム容量の20mMトリス(7.5)、500mM NClでカラムを洗浄した。ピーク溶出分画をプールし、4℃で貯蔵した。架橋は、SECカラム中のOD214タンパク質シグナルおよびOD395 GFPシグナルの共遊走によって確認され、SEC出力は、図73にオーバーレイとして示される。
上記実施例に記載されるように調製されたGFP−XTENおよびFITC−XTEN架橋された共役体の薬物動態を、カニクイザルにおいて試験した。GFP−XTENおよびFITC−XTENを、2mg/kg、およびそれぞれ0.77および0.68mLの投与量で雄のカニクイザルIVに投与した。血液試料(1.0mL)を事前冷却したヘパリン化管に、投与前、2時間、4時間、8時間、24時間、48時間、72時間、96時間、120時間、168時間、216時間、264時間、336時間、388時間、432時間、504時間の時点で採取し、血漿中に処理した。GFP−XTENの場合は、捕捉および検出の双方のために、FITC−XTENの場合は、抗XTEN捕捉および抗FITC検出のために、抗XTEN抗体を使用して、ELISAアッセイによって定量化を行った。フィットに含まれる全ての時点で、WinNonLinにおいて、非コンパートメント解析を行い、PKパラメータを決定した。薬物動態結果は、表40および図74に要約される。データは、XTENが、類似するサイズのペイロードへの遺伝的融合に相当する方法で化学的に共役される分子の半減期を延長し得ることを示す。
1xアミノ,3xチオール−XTEN432(XTEN_AE432(Am1,C12,C217,C422))のアリコートを、20mM HEPES、pH7.0、50mM NaCl中の196μM(7.7mg/mL)溶液として調製した。図88Aは、タンパク質のC18 RP−HPLCおよびESI−MS分析を示す。2,2’−ジピリジルジスルフィド(DPD,Sigma、カタログ#D5767)を、ジメチルホルムアミド(DMF)中に溶解し、最終濃度100mMにした。4mLの1xアミノ,3xチオール−XTEN432溶液を、0.2mLの1M HEPES、pH8.0と混合してpHを約7.5に調整し、78μlのDPD溶液と混合した(10xモル過剰タンパク質)。反応混合液を25℃で2時間インキュベートし、反応の産物をC18 RP−HPLCによって分析した(図88B)。DBCO−スルホ−NHS(Click Chemistry Tools,Inc.、カタログ#A124)を、無水DMF中に溶解し、最終濃度10mMにした。0.865mLのDBCO−スルホ−NHS溶液をタンパク質溶液に添加した(11xモル過剰タンパク質)。反応混合液を25℃で2時間インキュベートし、反応の産物をC18 RP−HPLCによって分析した(図88C)。1Mエタノールアミン溶液(pH8.0)を添加して最終濃度50mMにし、未反応のDBCO−スルホ−NHSを急冷した。反応混合液を25℃で2時間、次いで4℃で終夜インキュベートした。500mM Bond−Breaker(商標)TCEP溶液(Thermo Scientific、カタログ#77720)を添加し、最終濃度20mMにした。反応混合液を25℃で1時間インキュベートし、反応の産物をC18 RP−HPLCによって分析した(図88D)。0.01% TFAを用いて反応混合液を15mLに希釈し、10% TFA溶液を使用してpHを約3に調整した。タンパク質溶液を、分取C4 RP−HPLCカラムVydac C4 250x22mm(Grace Davison Discovery Sciences、カタログ#214TP1022)上に負荷した。タンパク質は、0.01% TFA中の1200mL線形5〜50%勾配のアセトニトリルを用いて、15mL/分の流量で溶出した。1xDBCO,3xチオール−XTEN432を含有する分画を、1M HEPES、pH8で約pH7に調整し、真空蒸発によって濃縮した。D−Lys(LHRH−Mal)のε−アミノ基において3−マレイミドプロピオン酸で修飾されたGlp−His−Trp−Ser−Tyr−D−Lys−Leu−Arg−Pro−Gly−NH2ペプチドは、CSBio Co.(Menlo Park,CA)によって合成された。ペプチドを、無水DMF中の最終濃度25mg/mLに溶解し、5xモル過剰タンパク質で1xDBCO,3xチオール−XTEN432溶液に添加した。反応混合液を25℃で1時間インキュベートし、反応の産物をC18 RP−HPLCによって分析した(図88E)。0.01% TFAを用いて反応混合液を15mLに希釈し、10% TFA溶液を使用してpHを約3に調整した。タンパク質溶液を、分取C4 RP−HPLCカラムVydac C4 250x22mm上に負荷した。タンパク質は、0.01% TFA中の1200mL線形5〜50%勾配のアセトニトリルを用いて、15mL/分の流量で溶出した。1xDBCO,3xLHRH−XTEN432を含有する分画を、1M HEPES、pH8で約pH7に調整し、真空蒸発によって2mLに濃縮して、最終産物を得た。
融合タンパク質1xアミノ,3xチオール−XTEN432(XTEN_AE432(Am1,C12,C217,C422))のアリコートを、20mM HEPES、pH7.0、50mM NaCl中の196μM(7.7mg/mL)溶液として調製した。図89Aは、タンパク質のC18 RP−HPLCおよびESI−MS分析を示す。MA6−Val−Cit−PAB−MMAE(MMAE−Mal、Concortis Biosystems,Inc.によるカスタム合成)を、ジメチルスルホキシド(DMSO)中に溶解し、最終濃度1mg/mLにした。2.2mL容量の1xアミノ,3xチオール−XTEN432溶液を、2.5mLのMMAE−Malと混合した(3.5xモル過剰タンパク質)。反応混合液を25℃で1時間インキュベートし、反応の産物をC18 RP−HPLCによって分析した(図89B)。アジド−PEG4−NHSエステル(Click Chemistry Tools,Inc.、カタログ#A103)を、無水DMF中に溶解し、最終濃度500mMにした。反応混合液(4.7mL)を、0.235mLの1M HEPES、pH8.0、および9.75μlの500mMアジド−PEG4−NHSと混合した(10xモル過剰タンパク質)。反応混合液を25℃で2時間インキュベートし、反応の産物をC18 RP−HPLCによって分析した(図89C)。0.01% TFAを用いて共役混合液を15mLに希釈し、10% TFA溶液を使用してpHを約3に調整した。タンパク質溶液を、分取C4 RP−HPLCカラムVydac C4 250x22mm(Grace Davison Discovery Sciences、カタログ#214TP1022)の上に負荷した。タンパク質は、0.01% TFA中の1200mL線形5〜50%勾配のアセトニトリルを用いて、15mL/分の流量で溶出した。1xアジド,3xMMAE−XTEN432を含有する分画を、1M HEPES、pH8で約pH7に調整し、真空蒸発によって濃縮して、最終産物を得た。
融合タンパク質1xDBCO,3xLHRH−XTEN432のアリコートを、20mM HEPES、pH7.0中の143μM(6.26mg/mL)溶液として調製した。1xアジド,3xMMAE−XTEN432を、20mM HEPES、pH7.0中の135μM(5.90mg/mL)溶液として調製した。2つのタンパク質反応物を溶液中で混合し、1.1モル過剰の1xDBCO,3xLHRH−XTEN432を得た。反応混合液を25℃で終夜インキュベートした。クリック化学反応の完了は、SDS−PAGE(図90A)およびRP−HPLC(図90B)によって分析した。0.01% TFAを用いて共役混合液を15mLに希釈し、10% TFA溶液を使用してpHを約3に調整した。タンパク質溶液を、分取C4 RP−HPLCカラムVydac C4 250x10mm(Grace Davison Discovery Sciences、カタログ#214TP510)の上に負荷した。タンパク質は、0.01% TFA中の180mL線形5〜50%勾配のアセトニトリルを用いて、2mL/分の流量で溶出した。3xLHRH,3xMMAE−XTEN432を含有する分画を、1M HEPES、pH8で約pH7に調整し、真空蒸発によって濃縮して、最終産物を得た。
融合タンパク質1xアミノ,3xチオール−XTEN905(XTEN_AE905(Am1,C8,C453,C898,セグメント174))のアリコートを、20mM HEPES、pH7.0、50mM NaCl中の131μM(10.9mg/mL)溶液として調製した。図91Aは、タンパク質のC18 RP−HPLCおよびESI−MS分析を示す。2,2’−ジピリジルジスルフィド(DPD,Sigma、カタログ#D5767)を、ジメチルホルムアミド(DMF)中に溶解し、最終濃度100mMにした。1xアミノ,3xチオール−XTEN905溶液を、1M HEPES、pH8.0と混合してpHを約7.5に調整し、DPD溶液と混合した(10xモル過剰タンパク質)。反応混合液を25℃で2時間インキュベートし、反応の産物をC18 RP−HPLCによって分析した(図91B)。DBCO−スルホ−NHS(Click Chemistry Tools,Inc.、カタログ#A124)を、無水DMF中に溶解し、最終濃度10mMにした。DBCO−スルホ−NHS溶液をタンパク質溶液に添加した(10xモル過剰タンパク質)。反応混合液を25℃で2時間インキュベートし、反応の産物をC18 RP−HPLCによって分析した(図91C)。1Mエタノールアミン(pH8.0)を添加して最終濃度50mMにし、未反応のDBCO−スルホ−NHSを急冷した。反応混合液を25℃で2時間、次いで4℃で終夜インキュベートした。500mM Bond−Breaker(商標)TCEP溶液(Thermo Scientific、カタログ#77720)を添加し、最終濃度20mMにした。反応混合液を25℃で1時間インキュベートし、反応の産物をC18 RP−HPLCによって分析した(図91D)。0.01% TFAを用いて反応混合液を15mLに希釈し、10% TFA溶液を使用してpHを約3に調整した。タンパク質溶液を、分取C4 RP−HPLCカラムVydac C4 250x22mm(Grace Davison Discovery
Sciences、カタログ#214TP1022)の上に負荷した。タンパク質は、0.01% TFA中の1200mL線形5〜50%勾配のアセトニトリルを用いて、15mL/分の流量で溶出した。1xDBCO,3xチオール−XTEN905を含有する分画を、1M HEPES、pH8で約pH7に調整し、真空蒸発によって濃縮した。MA6−Val−Cit−PAB−MMAE(MMAE−Mal,Concortis Biosystems,Inc.によるカスタム合成)をジメチルスルホキシド(DMSO)中に溶解し、最終濃度1mg/mLにした。1xDBCO,3xチオール−XTEN905溶液を、3.5xモル過剰のMMAE−Malと混合した。反応混合液を25℃で1時間インキュベートし、反応の産物をC18 RP−HPLCによって分析した。Glp−His−Trp−Ser−Tyr−D−Lys−Leu−Arg−Pro−Gly−NH2ペプチドを、D−Lys(LHRH−Mal)のε−アミノ基においてアジド−ヘキサン酸で修飾した(LHRH−Mal,CS Bio Co.,Menlo Park,CAによるカスタム合成)ペプチドを、無水DMF中の最終濃度25mg/mLに溶解し、1.5〜5xモル過剰タンパク質で1xDBCO,3xMMAE−XTEN905溶液に添加した。反応混合液を25℃でインキュベートし、反応の産物をC18 RP−HPLCによって分析した。0.01% TFAを用いて反応混合液を15mLに希釈し、10% TFA溶液を使用してpHを約3に調整した。タンパク質溶液を、分取C4 RP−HPLCカラムVydac C4 250x22mm上に負荷した。タンパク質は、0.01% TFA中の1200mL線形5〜50%勾配のアセトニトリルを用いて、15mL/分の流量で溶出した。1xDBCO,3xLHRH−XTEN432を含有する分画を、1M HEPES、pH8で約pH7に調整し、真空蒸発によって濃縮して、最終産物を得た。
融合タンパク質1xアミノ,3xチオール−XTEN432(XTEN_AE432(Am1,C12,C217,C422))のアリコートを、20mM HEPES、pH7.0、50mM NaCl中の203μM(8.0mg/mL)溶液として調製した。図107Aは、タンパク質のC18 RP−HPLCおよびESI−MS分析を示す。葉酸塩−γ−アミノペンチル−マレイミド(FA(γ)−Mal,CPC Scientificによるカスタム合成)を、ジメチルスルホキシド(DMSO)中に溶解し、最終濃度21mg/mL(9.8mM)にした。1.1mL容量の1xアミノ,3xチオール−XTEN432溶液を、0.08mLのFA(γ)−Malと混合した(3.5xモル過剰タンパク質)。反応混合液を25℃で2時間インキュベートし、反応の産物をC18 RP−HPLCによって分析した(図107B)。反応混合液のpHは、0.06mLの1M HEPES、pH8.0緩衝液で調製した。DBCO−スルホ−NHS(Click Chemistry Tools,Inc.、カタログ#A124)を、無水DMF中に溶解し、最終濃度50mMにした。0.53mLのDBCO−スルホ−NHS溶液をタンパク質溶液に添加した(11xモル過剰タンパク質)。反応混合液を25℃で2時間インキュベートし、反応の産物をC18 RP−HPLCによって分析した(図107C)。1Mエタノールアミン(pH8.0)の溶液を添加して最終濃度50mMにし、未反応のDBCO−スルホ−NHSを急冷した。反応混合液を25℃で2時間、次いで4℃で終夜インキュベートした。0.01% TFAを用いて反応混合液を15mLに希釈し、10% TFA溶液を使用してpHを約3に調整した。タンパク質溶液を、分取C4 RP−HPLCカラムVydac C4 250x10mm(Grace Davison
Discovery Sciences、カタログ#214TP510)上に負荷した。タンパク質は、0.01% TFA中の180mL線形5〜50%勾配のアセトニトリルを用いて、2mL/分の流量で溶出した。1xDBCO,3xFA(γ)−XTEN432を含有する分画を、1M HEPES、pH8で約pH7に調整し、真空蒸発によって濃縮して、最終産物を得た。
融合タンパク質1xDBCO,3xFA(γ)−XTEN432のアリコートを、20mM HEPES、pH7.0中の191μM(8.8mg/mL)溶液として調製した。1xアジド,3xMMAE−XTEN432を、20mM HEPES、pH7.0中の242μM(11.1mg/mL)溶液として調製した。2つのタンパク質反応物を溶液中で混合し、1.1モル過剰の1xDBCO,3xFA(γ)−XTEN432を得た。反応混合液を25℃で終夜インキュベートした。クリック化学反応の完了は、RP−HPLC(図108)によって分析した。0.01% TFAを用いて共役混合液を15mLに希釈し、10% TFA溶液を使用してpHを約3に調整した。タンパク質溶液を、分取C4 RP−HPLCカラムVydac C4 250x10mm(Grace Davison Discovery Sciences、カタログ#214TP510)の上に負荷した。タンパク質は、0.01% TFA中の180mL線形5〜50%勾配のアセトニトリルを用いて、2mL/分の流量で溶出した。3xFA(γ),3xMMAE−XTENを含有する分画を、1M HEPES、pH8で約pH7に調整し、真空蒸発によって濃縮して、最終産物を得た。サイズ排除クロマトグラフィー(SEC−HPLC)(図109A)、RP−HPLC(図109B)、およびESI−MS(図109C)によって、最終産物を分析した。
線状および分岐XTEN(後者は三量体または四量体構成として)の粘度は、様々な種類の粘度計および血流計を使用して測定することができる。例えば、Miller,M.A.,et al.(2010)Langmuir,26:1067に記載されるように、30G針を通じてシリンジの中に1mLの液体を引き込むために必要な時間を測定することができる。XTENの単量体線状構成と、三量体または四量体構成とを粘土について比較するために、等モル量のXTENアミノ酸成分を有する構築体を調製し、次いで、溶液をそれぞれ20、50、100mg/mLで固定された等しいタンパク質濃度で製造する。次いで、Millerの方法を使用し、これらの溶液を評価する。この方法を使用して、既知の基準でデータを取得し、標準曲線を調整した後、XTEN溶液を測定する。結果は、同様のモル量を持つXTENの等モル溶液の粘度は、分岐の増加に伴って著しく減少し、3アームのXTEN288の共役体は、それらが等数のアミノ酸を有するとしても、等濃度の線状XTEN864と比較して、著しく低い粘度を有することを示すことが予想される。同様に、4アームのXTEN216を持つ構成は、3アームのXTEN288との共役体よりもさらに低い粘度を有することが予想される。
融合タンパク質1xアミノ,3xチオール−XTEN432(XTEN_AE432(Am1,C12,C217,C422))のアリコートを、20mM HEPES、pH7.0、50mM NaCl中の196μM(7.7mg/mL)溶液として調製する。パクリタキセル−Mal(PTX−Mal)は、無水コハク酸を持つパクリタキセルの修飾に続いて、アミノエチルマレイミドとの共役によってカスタム合成される。PTX−Malを、ジメチルホルムアミド(DMF)中に溶解し、3.5〜5xモル過剰でタンパク質に添加する。反応混合液を25℃で1〜2時間インキュベートし、反応の産物をC18
RP−HPLCによって分析した。スルホ−SMCC(Thermo Scientific、カタログ#22122)を、無水DMF中に溶解して、最終濃度50mMにし、10xモル過剰タンパク質でタンパク質溶液に添加する。反応混合液を25℃で2時間インキュベートし、反応の産物をC18 RP−HPLCによって分析する(図92参照)。0.01% TFAを用いて反応混合液を15mLに希釈し、10% TFA溶液を使用してpHを約3に調整する。タンパク質溶液を、分取C4 RP−HPLCカラムVydac C4 250x22mm(Grace Davison Discovery Sciences、カタログ#214TP1022)上に負荷する。タンパク質は、0.01% TFA中の1200mL線形5〜50%勾配のアセトニトリルを用いて、15mL/分の流量で溶出する。1xMal,3xPTX−XTEN432を含有する分画を、1M HEPES、pH8で約pH7に調整し、真空蒸発によって濃縮した。ハーセプチン(トラスツズマブ,Roche)抗体を、指示に従い、水中で再構築し、5mM EDTAを含有するPBS(pH7.2)に緩衝液を交換する。DTTを、タンパク質溶液に添加して最終濃度1〜10mMにし、37℃で5〜30分間インキュベートする。ゲル濾過またはカットオフ膜濾過によって、過剰なDTTを除去する。1xMal,3xPTX−XTEN432を添加し、3〜4xモル過剰の抗体を部分的に還元する。反応混合液を25℃で1時間インキュベートし、反応の最終産物をSDS−PAGEおよびサイズ排除クロマトグラフィーによって、非還元および還元条件下で分析した。
融合タンパク質1xアミノ−XTEN869(XTEN_AE869(Am1))のアリコートを、20mM HEPES、pH7.0、50mM NaCl中の164μM(13.1mg/mL)溶液として調製した。1/20容量の1M HEPES、pH8をタンパク質溶液に添加し、タンパク質溶液のpHを約7.5に調整した。N−スクシンイミジルヨード酢酸塩(SIA,Thermo Scientific、カタログ#22349)を、無水ジメチルホルムアミド(DMF)中に溶解して、最終濃度100mMにし、10xモル過剰タンパク質で添加した。反応混合液を25℃で1時間インキュベートし、反応の産物をC18 RP−HPLCによって分析する(図93A)。Vivaspin 500超遠心分離装置(5,000 MWCO,VivaScience、カタログ#VS0112)を使用し、緩衝液交換によって、過剰なSIAを除去した。ヨードアセチル基によるN末端アミノ基の修飾は、修飾されたXTENの保持時間を変えなかったため(図93A)、共有結合的修飾は、ESI−MSによって確認された(図93B)。また、IA−XTEN共役体は、システイン含有ペプチドHCKFWW(Bachem、カタログ#H−3524)と効率的に反応した(図93C)。
LHRH−XTEN−薬物共役体を、インビトロ活性および選択性について評価する。各LHRH−XTEN−薬物共役体、その対応する非標的化XTEN−薬物分子、およびそのそれぞれの遊離薬物対照を、CellTiter−Glo抗増殖アッセイにおいて、表41に列挙されるLHRH受容体陽性および陰性細胞系の一団に対して試験する。最適な細胞密度およびインキュベーション時間を含む適切なアッセイ条件は、それぞれの遊離薬物を対照として使用して決定する。LHRH−XTEN−薬物共役体は、以下のように試験する。ログ相中の細胞を収集し、計数して、96ウェルマイクロタイターアッセイプレートに既定の細胞密度でプレートに置く。粘着性の細胞は、5% CO2の雰囲気下、37℃で終夜のインキュベーションによって、プレートに付着することが許される。LHRH−XTEN−薬物共役体および対応する対照は、適切な用量範囲希釈を使用して重複で導入し、プレートをさらに2〜5日間インキュベートする。適切なインキュベーション期間後、CellTiter−Glo試薬を各ウェルに添加し、軌道攪拌器上で2分間混合する。次いで、プレートを90xgで遠心分離し、室温でさらに10分間インキュベートして、蛍光シグナルを安定化する。次いで、蛍光シグナルを照度計上で読み取り、IC50(半最大阻害性濃度)の値を、GraphPad Prismまたは相当するソフトウェアで計算する。IC50値の定量的比較は、LHRH受容体陽性細胞系対陰性細胞系に対する細胞成長阻害および選択性の構築体活性のランク付けを可能にする。 これらの結果は、LHRH−XTEN−薬物共役体が、LHRH受容体陰性細胞上ではなく、LHRH受容体陽性細胞上で高度に選択的な強力な殺傷を示すという所見を支持することが予想される。これは、遊離薬物部分とは異なり、それによってLHRH受容体陽性細胞系と陰性細胞系との間に細胞毒性の差は予想されない。XTEN−薬物対照は、不良な細胞毒性活性を生じることが予想される。 対照に対して好ましい活性および細胞系選択性を持つLHRH−XTEN−薬物共役体は、アッセイにおいて遊離競合LHRHペプチドの付加によってLHRH受容体の関連についてさらに検証され、障害されたLHRH−XTEN−薬物細胞毒性をもたらし、構築体の選択的活性についてさらに検証する。
葉酸塩−XTEN−薬物共役体は、最初に、インビトロ活性および選択性スクリーニングに供される。各葉酸塩−XTEN−薬物共役体、その対応する非標的化XTEN−薬物分子、およびそれぞれの遊離薬物対照を、CellTiter−Glo抗増殖アッセイにおいて、表42に列挙される葉酸塩受容体陽性および陰性細胞系の一団に対して試験する。培養培地は、高い葉酸含有量を含むため、細胞は成長し、アッセイは、5〜10%熱不活性化ウシ胎仔血清(FCS)を含有する無葉酸培地中、37℃、5% CO2雰囲気下で行った(熱不活性化FCSは、葉酸塩受容体を発現する細胞が生存および増殖するのに十分な内因性レベルの葉酸を含有する)。最適な細胞密度およびインキュベーション時間を含む適切なアッセイ条件は、5〜10% FCSを含有する無葉酸培地を使用し、それぞれの遊離薬物を対照として使用して決定する。葉酸塩−XTEN−薬物共役体は、以下のように試験する。ログ相中の細胞を収集し、計数して、96ウェルマイクロタイターアッセイプレートに既定の細胞密度でプレートに置く。粘着性の細胞は、37℃、5% CO2で終夜のインキュベーションによって、プレートに付着することが許される。葉酸塩−XTEN−薬物共役体および対応する対照は、適切な用量範囲希釈を使用して重複で導入し、プレートをさらに2〜5日間インキュベートする。適切なインキュベーション期間後、CellTiter−Glo試薬を各ウェルに添加し、軌道攪拌器上で2分間混合する。次いで、プレートを90xgで遠心分離し、室温でさらに10分間インキュベートして、蛍光シグナルを安定化する。次いで、蛍光シグナルを照度計上で読み取り、IC50(半最大阻害性濃度)の値を、GraphPad Prismまたは相当するソフトウェアで計算する。IC50値の定量的比較は、葉酸塩受容体陽性細胞系対陰性細胞系に対する細胞成長
阻害および選択性の構築体活性のランク付けを可能にする。 これらの結果は、葉酸塩−XTEN−薬物共役体が、葉酸塩受容体陰性細胞上ではなく、葉酸塩受容体陽性細胞上で高度に選択的な強力な殺傷を示すという所見を支持することが予想される。これは、遊離薬物部分とは異なり、それによって葉酸塩受容体陽性細胞系と陰性細胞系との間に細胞毒性の差は予想されない。XTEN−薬物対照は、不良な細胞毒性活性を生じることが予想される。 対照に対して好ましい活性および細胞系選択性を持つ葉酸塩−XTEN−薬物共役体は、アッセイにおいて遊離競合葉酸の付加によって葉酸塩受容体の関連についてさらに検証され、障害された葉酸塩−XTEN−薬物細胞毒性を実証し、構築体の選択的活性についてさらに検証する。
安定性の測定として、LHRH−XTEN−薬物共役体を、独立して、健常なヒト、カニクイザル、およびマウス血漿中、37℃で最大2週間インキュベートし、一定間隔でアリコートを除去し、分析まで−80℃で貯蔵する。LHRH−XTEN−薬物共役体の安定性は、放出された遊離薬物の量、またはLHRH−XTEN−薬物共役体の経時的な完全性のいずれかによって評価することができる。遊離薬物は、RP−HPLCおよび/またはLC−MS/MSで定量化されるが、無傷LHRH−XTEN−薬物共役体の量は、XTEN/薬物および/またはLHRH/薬物ELISAを使用して決定される。
安定性の測定として、葉酸塩−XTEN−薬物共役体を、独立して、健常なヒト、カニクイザル、およびマウス血漿中、37℃で最大2週間インキュベートし、一定間隔でアリコートを除去し、分析まで−80℃で貯蔵する。葉酸塩−XTEN−薬物共役体の安定性を、遊離薬物の量、または葉酸塩−XTEN−薬物共役体の経時的な完全性のいずれかによって評価する。遊離薬物は、HPLCおよび/またはLC−MS/MSで定量化されるが、無傷の葉酸塩−XTEN−薬物共役体の量は、XTEN/薬物および/または葉酸塩/薬物ELISAを使用して決定される。
Cy5.5蛍光タグ付加LHRH−XTEN分子を代理として使用し、LHRH−XTEN−薬物共役体の標的化および生体内分布効率を調査する。インビボに続いてエクスビボで、IVIS 50光学撮像システム(Caliper Life Sciences,Hopkinton,MA)を用いる蛍光撮像を使用し、LHRH受容体陽性腫瘍細胞の皮下成長異種移植片を担持するヌードマウスにおいて実験を行う。つまり、LHRH受容体陽性腫瘍細胞を担持する雌nu/nuマウスに、高用量または低用量のLHRH−XTEN−Cy5.5、および対応する用量の非標的化Cy5.5タグ付加XTEN対照の単一静脈注射を付与する。注射前、次いで注射後約8、24、48、および72時間に、生きた麻酔下動物上で、IVIS 50光学撮像システムを使用して全身走査を得る。72時間の最後の時点で動物全体の蛍光の分布を測定した後、腫瘍、ならびに肝臓、肺、心臓、脾臓、および腎臓を含む健常な器官を切除し、それらの蛍光を撮像システムによって登録および処理する。蛍光剤の波長を一致させるように、Cy5.5励起(615〜665nm)および放出(695〜770nm)フィルターを選択する。CCDチップの小/中ビニングを使用し、画像において各マウスの観察可能なシグナルから少なくとも数千カウントを得るように、およびCCDチップの飽和を避けるように、露出時間を最適化する。定量化のための画像を正規化するために、Cy5.5スペクトル領域に対して背景励起および放出フィルターを使用し、背景蛍光画像を得る。蛍光の強度は、異なる色として表され(青色は最低強度を反映し、赤色は最高強度を示す)、得られた画像を使用し、共役体および対照の取り込みを評価する。
Cy5.5蛍光タグ付加葉酸塩−XTEN分子を代理として使用し、葉酸塩−XTEN−薬物共役体の標的化および生体内分布効率を調査する。インビボに続いてエクスビボで、IVIS 50光学撮像システム(Caliper Life Sciences,Hopkinton,MA)を用いる蛍光撮像を使用し、葉酸塩受容体陽性腫瘍細胞の皮下成長異種移植片を担持するヌードマウスにおいて実験を行う。培養培地は、高い葉酸塩含有量を含むため、これらのマウスに移植される葉酸塩受容体陽性腫瘍細胞は、抗生物質を持たない5〜10%熱不活性化FCSを含有する無葉酸塩細胞培養培地中で成長される。同様に、通常の齧歯類食餌は、高濃度の葉酸を含有するため、この研究に使用されるヌードマウスは、血清葉酸塩濃度を低減するように、腫瘍移植前の2週間、および撮像分析期間の間、葉酸塩を含まない食餌で維持される。
LHRH−XTEN−薬物構築体のインビボ薬物動態を、マウス、ラット、カニクイザル、およびイヌを使用し、タンパク質組成物の標準方法を使用して評価する。LHRH−XTEN−薬物構築体の組成物は、インビボ投与に適合する水性緩衝液(例えば、リン酸塩緩衝生理食塩水、トリス緩衝生理食塩水、またはHepes緩衝生理食塩水)中に提供される。組成物を適切な用量で、複数の経路を介して、最も好ましくは静脈内または皮下経路を介して投与する。血液試料を、0.08〜504時間の範囲の適切な時点で採取し、血漿中に処理する。血漿試料を、ELISA、HPLC、および/またはLC−MS/MSを含む多様な方法のうちの1つによって、LHRH−XTEN−薬物共役体の濃度について分析する。ELISA分析は、LHRH−XTEN−薬物共役体の2つの成分、例えば、XTEN/LHRH、XTEN/薬物部分、LHRH/薬物部分、および/またはXTEN/XTENの組合せを認識することができるサンドウィッチELISA形式を使用して行う。典型的に、LHRH−XTEN−薬物共役体の1つの成分を認識する抗体は、96ウェルマイクロタイタープレートのウェル上にコーティングされる。ウェルをブロックして洗浄し、次いで、血清安定性試料を異なる希釈でウェルに添加し、コーティングされた抗体による共役体の捕捉を可能にする。次いで、ウェルを広く洗浄し、結合されたタンパク質を、第2のLHRH−XTEN−薬物共役成分に対するビオチニル化抗体または適切な二次抗体のいずれかを使用して検出する。次いで、ウェルを再度洗浄した後、ストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ(ビオチニル化検出抗体に相補的)または二次抗体−ホースラディッシュペルオキシダーゼ(非ビオチニル化検出抗体に相補的)を添加する。適切なインキュベーションおよび最終洗浄ステップ後、テトラメチルベンジジン(TMB)基質を添加し、プレートを450nMで読み取る。次いで、共役体の濃度を、各時点に対し、測色反応をLHRH−XTEN−薬物較正曲線と比較することによって計算する。薬物動態パラメータを、WinNonLinソフトウェアパッケージを使用して計算する。
葉酸塩−XTEN−薬物構築体のインビボ薬物動態を、マウス、ラット、カニクイザル、およびイヌを使用し、タンパク質組成物の標準方法を使用して評価する。通常の餌は、高濃度の葉酸を含有するため(約6mg/kgマウス食餌)、葉酸塩共役体の薬物動態研究に使用される動物は、研究開始前の2週間、および研究期間の間、葉酸塩を含まない食餌で維持される。組成物を適切な用量で、複数の経路を介して、最も好ましくは静脈内または皮下経路を介して投与する。血液試料を、0.08〜504時間の範囲の適切な時点で採取し、血漿中に処理する。血漿試料を、ELISA、HPLC、および/またはLC−MS/MSを含む多様な方法のうちの1つによって、LHRH−XTEN−薬物共役体の濃度について分析する。
LHRH−XTEN−薬物共役体は、LHRH受容体陽性腫瘍細胞に対する非常に強力な毒素の標的送達のために意図される。そのようにして、LHRH−XTEN−薬物構築体のインビボ薬物動態活性を、ヌードマウスに移植されたヒト腫瘍細胞発現LHRH受容体を使用して評価することができる。
葉酸塩−XTEN−薬物共役体は、葉酸塩受容体陽性腫瘍細胞に対する毒素成分の標的送達のために意図される。葉酸塩−XTEN−薬物構築体のインビボ薬物動態活性を、ヌードマウス上のヒト腫瘍細胞発現葉酸塩受容体異種移植片を使用して評価する。有効性研究を開始する前に、ヌードマウスにおける初期評価を実行し、葉酸塩−XTEN−薬物候補の最大耐用量(MTD)を確立する。次いで、研究期間の間に動物によって耐容される最高用量であるMTDを使用して、標準異種移植モデルにおける有効性および毒性研究の用量範囲を計算する。通常の齧歯類食餌は、高濃度の葉酸を含有するため(6mg/kg食餌)、これらの研究に使用されるマウスは、研究開始前の2週間、および研究期間の間、葉酸塩を含まない食餌で維持される。MTD実験を1群当たり5匹のマウスを用いて実行し、様々な用量レベル、間隔、および期間で葉酸塩−XTEN−薬物共役体の静脈内投与を評価する。必要とされる開始MTD用量および用量群の数は、科学的文献、標的化葉酸塩部分に関する知識、共役される薬物部分の性質、密接に関連する化合物の毒素学的特性、および初期薬物動態研究からのデータに基づく(上記PK実施例参照)。体重の低減、食餌および水の消費、ならびに立毛、円背、行動パターン、呼吸パターン、振戦、けいれん、衰弱、および自傷の兆候等の標準MTDパラメータを、注意深く、毎日監視する。許容されない毒性を引き起こさない葉酸塩−XTEN−薬物の最高用量は、MTDとして指定される。
標的化学療法は、全身化学療法の有効性を高め、副作用を低減することを目的とする近代的手法である。LHRHは、生殖器官において機能するペプチドである。その受容体は、特に、ある腫瘍上に集中するが、ほとんどの正常組織中では発現しないため、LHRH受容体は、悪性腫瘍の選択的崩壊のための理想的な標的である。実際に、乳癌の約52%、卵巣癌および子宮内膜癌の約80%、および前立腺癌の約85%の検体は、LHRH受容体を介して標的可能である。注目すべきは、LHRH依存性治療は、三重陰性乳房腫瘍に対して特に有用であり、エストロゲンもしくはプロゲステロン受容体またはHER2を過剰発現しないため、多くの使用可能な標的薬物での処置に適していない。進行した子宮内膜癌、卵巣癌、または前立腺癌の患者は、これらの悪性腫瘍が、再発しやすい、および/または現行の処置に対して耐性であり得るため、特に不良な転帰を有することが多い。LHRHの1つ以上のコピーを担持するXTENを3つ以上の薬物分子を担持するXTENに融合し、標的ペプチド−薬物共役体を創製することは、治療指数および半減期を大幅に改善することが予想され、これがMTDをはるかに下回るレベルでの投薬を可能にし、投与頻度および費用を低減する(用量当たりに必要な薬物を低減する)。
標的化学療法は、全身化学療法の有効性を高め、副作用を低減することを目的とする近代的手法である。葉酸としても知られる葉酸塩、ビタミンB9は、ある生物学的経路における共因子として、ヌクレオチド生合成および機能のために全ての生細胞が必要とする重要な栄養素である。葉酸塩受容体は、急速に分裂する悪性腫瘍、特に卵巣癌および非小細胞肺癌を処置するための治療開発の焦点である。葉酸塩受容体の発現は、正常な卵巣においてごくわずかであるが、上皮卵巣癌の約90%は、多くの肺腺癌と同様に、葉酸塩受容体を過剰発現し、それによって、行われる治療の可能性を開く。葉酸塩の1つ以上のコピーを担持するXTENを3つ以上の薬物分子を担持するXTENに融合し、標的ペプチド−薬物共役体を創製することは、治療指数を改善することが予想され、延長された半減期は、 最大耐用量(MTD)をはるかに下回るレベルでの投薬を可能にし、投与頻度および費用を低減する(用量当たりに必要な薬物を低減する)。
GFPのN末端に融合されたXTEN_AE864を含有する融合タンパク質を、37℃で最長7日間、サル血漿およびラット腎臓溶解物中でインキュベートした。図76に示されるように、0時点、1日目、および7日目に試料を抽出し、SDS PAGEに続いて、ウェスタン分析を使用する検出、およびGFPに対する抗体を用いた検出によって分析した。XTEN_AE864の配列は、血漿中7日間にわたってごくわずかな分解の兆候を示した。しかしながら、XTEN_AE864は、3日間にわたってラット腎臓溶解物中で急速に分解された。融合タンパク質のインビボ安定性を、血漿試料中で試験し、GFP_AE864を、免疫沈降させ、SDS PAGEによって上記のように分析した。注入後7日間までに採取された試料は、分解の兆候をほとんど示さなかった。これらの結果は、血清プロテアーゼに起因する分解に対するaaT−XTENの耐性を実証し、これはaaT−XTEN融合タンパク質の薬物動態特性の強化の要因である。
XTEN_AE864−Ex4は、円偏光二色性分光によって二次構造の程度を評価した。CD分光は、Jasco Peltier温度コントローラ(TPC−348WI)を備えたJasco J−715(Jasco Corporation,Tokyo,Japan)分光偏光計上で行った。タンパク質の濃度は、20mMリン酸ナトリウム(pH7.0)、50mM NaCl中で0.2mg/mLに調整した。光学経路長0.1cmのHELLMA石英セルを使用して実験を行った。5℃、25℃、45℃、および65℃でCDスペクトルを取得し、Windows(登録商標)用J−700異形1.08.01(Build 1)Jascoソフトウェアを使用して処理した。CD測定を行う前に5分間、各温度で試料を平衡化した。1nmの帯域幅および2秒の時間定数を使用し、100nm/分の走査速度で300nm〜185nmの全てのスペクトルを重複して記録した。図77に示されるCDスペクトルは、安定した二次構造の証拠を示さず、非構造化ポリペプチドと一致する。
XTENが可溶性および安定性という物理化学的特性を強化する能力を評価するために、グルカゴン+短長XTENの融合タンパク質を調製し、評価した。被験物質は、中性pHのトリス緩衝生理食塩水中で調製し、Gcg−XTEN溶液の特性化を、逆相HPLCおよびサイズ排除クロマトグラフィーによって行い、タンパク質が溶液中で均質および非凝集であることを確認した。データは、表43に提示される。比較目的で、同じ緩衝液中の非修飾グルカゴンの可溶性限界を、60μM(0.2mg/mL)で測定し、結果は、負荷されたXTENの全長に対して実質的な可溶性の増加が得られたことを実証する。重要なことに、ほとんどの場合において、グルカゴン−XTEN融合タンパク質は、標的濃度を達成するように調製され、所与の構築体の最大可溶性限界を決定するように評価されなかった。しかしながら、AF−144XTENに結合されたグルカゴンの場合、可溶性の限界は決定され、XTENに結合されていないグルカゴンと比較して、60倍の可溶性の増加が達成されたという結果を伴う。さらに、グルカゴン−AF144を安定性について評価したところ、冷蔵条件下で少なくとも6ヶ月間、および37℃で約1ヶ月間、液体製剤中で安定することが見出された(データ図示せず)。
サイズ排除クロマトグラフィー分析は、様々な治療タンパク質、および漸増する長さの非構造化組換えタンパク質を含有する融合タンパク質上で行った。例示的なアッセイは、TSKGel−G4000 SWXL(7.8mm x 30cm)カラムを使用し、1mg/mL濃度の40μgの精製グルカゴン融合タンパク質を、20mMリン酸塩(pH6.8)、114mM NaCl中0.6mL/分の流量で分離した。クロマトグラムプロファイルは、OD214nmおよびOD280nmを使用して監視した。全てのアッセイのカラム較正は、BioRadからのサイズ排除較正標準を使用して行い、マーカーは、サイログロブリン(670 kDa)ウシγ−グロブリン(158 kDa)、トリオボアルブミン(44 kDa)、ブタミオグロブリン(17 kDa)、およびビタミンB12(1.35 kDa)を含む。グルカゴン−Y288、グルカゴン−Y144、グルカゴン−Y72、グルカゴン−Y36の代表的なクロマトグラフプロファイルは、図78にオーバーレイとして示される。データは、各化合物の分子量が、付着したXTEN配列の長さに比例することを示す。しかしながら、データは、各構築体の見掛けの分子量が、球状タンパク質に対して予想されるよりも著しく大きいことも示す(同じアッセイにおいて実行された標準タンパク質との比較で示される)。評価された全ての構築体のSEC分析に基づいて、見掛けの分子量、見掛けの分子量因子(計算された分子量に対する見掛けの分子量の比として表される)、および流体力学半径(RH(nm))が表44に示される。結果は、576個以上のアミノ酸の異なるXTENの組込みが、約339〜760kDaの融合タンパク質に対して見掛けの分子量を付与すること、および864個以上のアミノ酸のXTENが、約800kDAを超える見掛けの分子量を付与することを示す。実際の分子量に対する見掛けの分子量の比例増加の結果は、いくつかの異なるモチーフファミリー、すなわち、AD、AE、AF、AG、およびAMからのXTENで創製された融合タンパク質の場合と一致し、少なくとも4倍の増加、および約17倍も高い比率を伴う。さらに、様々なペイロード(およびY288に融合されたグルカゴンの場合は288個の残基)を持つ融合タンパク質への576個以上のアミノ酸を持つXTEN融合パートナーの組込みは、7nm以上の流体力学半径をもたらし、約3〜5nmの糸球体孔サイズをはるかに超える。したがって、成長およびXTENを含む融合タンパク質は、低減した腎クリアランスを有し、終末相半減期の増加に寄与し、対応する非融合生物学的ペイロードタンパク質に対して治療効果または生物学的効果を改善することが予想される。
アミノ酸配列は、周知のChou−Fasmanアルゴリズム(Chou,P.Y.,et al.(1974)Biochemistry,13:222−45)およびGarnier−Osguthorpe−Robson、または「Gor」方法(Garnier J,Gibrat JF,Robson B.(1996).GOR method for predicting protein secondary structure from amino ashid sequence.Methods Enzymol 266:540−553)等の、あるコンピュータプログラムまたはアルゴリズムを介して、二次構造について評価することができる。所与の配列について、これらのアルゴリズムは、いくつかの二次構造が存在するか、または全く存在しないかを予測することができ、例えば、αらせんまたはβシートを形成する配列の残基の総数および/またはパーセンテージ、またはランダムコイル形成をもたらすことが予測される配列の残基のパーセンテージとして表される。
ポリペプチドアミノ酸配列は、より短い部分列が全体ポリペプチド内で出現する回数を定量化することによって、反復性について評価することができる。例えば、200アミノ酸残基のポリペプチドは、192個の重複する9アミノ酸部分列(または9−mer「枠」)を有するが、固有の9−mer部分列の数は、その配列内の反復性の量に依存する。本分析において、異なる配列を、ポリマー部分の最初の200アミノ酸全体の各3アミノ酸枠に対する全ての固有3−mer部分列発生を合計し、200アミノ酸配列内の固有の3−mer部分列の絶対数で割ることによって、反復性について評価した。得られた部分列スコアは、ポリペプチド内の反復性の程度の反映である。
9merペプチド配列のTEPITOPEスコアは、Sturniolo[Sturniolo,T.,et al.(1999)Nat Biotechnol,17:555]によって記載されるポケット電位を付加することによって計算することができる。本実施例において、別個のテピトープスコアを、個別のHLA対立遺伝子に対して計算した。表47は、一例として、白人集団において高頻度で発生する、HLA*0101Bのポケット電位を示す。配列P1−P2−P3−P4−P5−P6−P7−P8−P9を持つペプチドのTEPITOPEスコアを計算するために、表47の対応する個別のポケット電位を付加した。配列FDKLPRTSGを持つ9merペプチドのHLA*0101Bスコアは、0、−1.3、0、0.9、0、−1.8、0.09、0、0の合計である。
組換えGLP2−2G−XTENは、Alters,S.et al.(2012)GLP2−2G−XTEN:a pharmaceutical protein with improved serum half−life and efficacy in a rat Crohn’s disease model.PLoS One;7(11):e50630に記載の通り調製した。共役体GLP2−2G−XTENは、実施例26に記載の通り調製し(図68)、分取RP−HPLCによって精製した(図70)。EMD Millipore ChemiSCREENヒト組換えGLP−2グルカゴンファミリー受容体カルシウム最適化された安定した細胞系を使用し、製造者の指示に従ってGPCR Ca2+フラックス動員活性アッセイを行った結果を図110に提示する。組換えおよび共役GLP2−2G−XTENの双方を、8点3倍連続希釈用量反応曲線として描いた。それぞれのY軸RFUを持つ4PL回帰プロットを使用して、用量反応曲線を適合し、データを、X軸上の濃度に対する絶対最大RFUのパーセンテージとして表した。組換えGLP2−2G−XTENおよび共役GLP2−2G−XTENの双方は、それぞれ423nMおよび529nMの予測されたEC50電位値を持つ、用量依存性アゴニスト活性を呈した。
等濃度の組換えGLP2−2G−XTENおよび共役GLP2−2G−XTENを、独立して、それぞれラット、カニクイザル、およびヒト血漿中にスパイクさせた。試料を、37℃で最長10日間インキュベートし、アリコートを適切な時間間隔で除去して、分析まで−80℃で貯蔵した。様々な種の共役されたGLP2−2G−XTENの血漿安定性を、それぞれの血漿マトリックスにおいて行われた抗XTEN/GLP2 ELISA上の組換えGLP2−2G−XTENの血漿安定性と比較した。抗XTEN/GLP2 ELISAは、捕捉抗体としての抗XTENマウス抗体、検出抗体としてのビオチニル化抗ヒトGLP2抗体からなる。図111に示されるように、共役GLP2−2G−XTENのヒト血漿におけるインビトロ安定性は、240時間を超える計算された安定性半減期を有する組換えGLP2−2G−XTENのそれに相当する。同様のインビトロ安定性は、ラットおよびカニクイザル血漿における2つのGLP2−2G−XTENタンパク質を用いても観察された(データ図示せず)。
雌SD株ラット(200〜220g)を、それぞれ3匹の動物群にランダムに割り当てた。組換えGLP−2G−XTENおよび共役GLP2−2G−XTENは、2mg/kgの皮下注射により各動物に投与された。血液試料(0.2mL)を事前冷却したヘパリン化マイクロタイター管に、投与前、試験化合物投与後0.08時間、4時間、8時間、24時間、48時間、72時間、96時間、120時間、および168時間に採取した。次いで、血液を血漿に処理し、分析まで−80℃で即時に貯蔵した。捕捉抗体として抗XTENマウス抗体を使用し、検出抗体としてビオチニル化抗ヒトGLP2抗体を使用する抗XTEN/GLP2 ELISAを使用して、血漿試料を分析した。関連組換えGLP2−2G−XTENまたは共役GLP2−2G−XTENを、それぞれELISA較正標準として使用し、ELISAを行った(図112)。組換えGLP2−2G−XTEN(36(±7)時間)および共役GLP2−2G−XTEN(37(±7)時間)の計算された半減期は、同様であることが見出された。
三量体XTEN共役体は、以下の手順によって調製した。1つの内部システイン残基を持つXTENタンパク質1xアミノ,1xチオール−XTEN432(XTEN_AE432(Am1,C422))のアリコートを、20mM HEPES、pH7.0、50mM NaCl中の587μM(23.23mg/mL)溶液として調製した。トリス−[2−マレイミドエチル]アミン(TMEA,Thermo Scientific、カタログ#33043)を、無水DMF中に溶解し、最終濃度10mMにした。TMEAをタンパク質溶液に添加し、XTENのチオール基に結合した(リンカー上の5xモル過剰のタンパク質)。反応混合液を25℃で2時間インキュベートし、反応の産物をSEC−HPLCによって分析した(Phenomenex BioSep−SEC−s4000
600 x 7.80mm、緩衝液:50mMリン酸ナトリウム(pH6.5)、300mM NaCl、流量0.5mL/分、70分間の定組成溶出)。線状XTEN_432、XTEN_864、およびXTEN_1296(それぞれ432個、864個、および1296個のアミノ酸を有する)を同条件下で分析し、反応産物を特定した(図113)。ピーク1は、28分でXTEN_1296と同時に溶出し、XTEN_432の三量体として特定された。ピーク2は、30.5分でXTEN_864と同時に溶出し、XTEN_432の二量体として特定された。ピーク3は、35分でXTEN_432と同時に溶出し、XTEN_432前駆体として特定された。三量体XTEN共役体、および二量体XTEN共役体の収率は、それぞれ19%および36%であった。三量体共役体3xXTEN_432および線状分子XTEN_1296に対する本質的に同一の保持時間は、XTENタンパク質の見掛けの分子量および流体力学半径は、その幾何学構成に依存しないことを示唆する。
三量体XTEN共役体は、以下の手順によって調製した。
タンパク質1xアミノ−XTEN288(XTEN_AE288(Am1))のアリコートを、20mM HEPES、pH7.0、50mM NaCl中の758μM(20mg/mL)溶液として調製した。2mLのタンパク質を、無水DMF中に溶解された0.1mLの1M HEPES、pH8.0および0.152mLの50mM DBCO−スルホ−NHS(Click Chemistry Tools、カタログ#A124)と混合し、DBCO基をXTENのN末端アミノ基に結合した。反応混合液を25℃で2時間インキュベートし、分析的RP−HPLCによって分析した(図114A)。0.01% TFAを用いて反応混合液を15mLに希釈し、10% TFA溶液を使用してpHを約3に調整した。タンパク質溶液を、2つの等分量に分割し、各分画を分取C4 RP−HPLCカラムVydac C4 250x10mm(Grace Davison
Discovery Sciences、カタログ#214TP510)上に負荷した。タンパク質は、0.01% TFA中の180mL線形5〜50%勾配のアセトニトリルを用いて、2mL/分の流量で溶出した。1xDBCO−XTEN288を含有する分画を、1M HEPES、pH8で約pH7に調整し、真空蒸発によって濃縮した。
トリス(2−アミノエチル)アミン(TAEA,Sigma Aldrich、カタログ#225630)を、無水DMF中に溶解し、最終濃度200mMにした。アジド−PEG4−NHSエステル(Click Chemistry Tools、カタログ#AZ103)を、無水DMF中に溶解し、最終濃度1Mにした。アジド−PEG4−NHSを、5倍モル過剰でトリス(2−アミノエチル)アミンと混合し、25℃で1時間インキュベートした。3xアジド−PEG4−TAEAを、C18 RP−HPLCを使用し、Phenomenex Jupiter C18 5u 300A 150x4.60mmカラム、緩衝液A水中の0.1% TFA、緩衝液Bアセトニトリル中の0.1% TFA、流量1mL/分、勾配5〜50%Bで45分以内に精製した。クロマトグラフィーのピークを回収し、MALDI−TOF MSおよびESI−MSによって分析して、966Daの分子量を持つ産物を検出した。3xアジド−PEG4−TAEAを、33分の保持時間を持つピークとして特定した(図114B)。1M HEPES、pH8.0を使用して分画を中和し、真空蒸発によって濃縮した。
1xDBCO−XTEN288を、20mM HEPES、pH7.0、50mM NaCl中の7.85mg/mL(293μM)溶液として調製した。3xアジド−PEG4−TAEAを、RP−HPLC精製し、同じ緩衝液中で製剤化した。合成されたリンカーの濃度は決定されず、1xDBCO−XTEN288および3xアジド−PEG4−TAEAを、様々な比率で経験的に混合し、25℃で4時間インキュベートした。SEC−HPLC(Phenomenex BioSep−SEC−s4000 600x7.80mm、緩衝液:50mMリン酸ナトリウム(pH6.5)、300mM NaCl、流量0.5mL/分、70分間の定組成溶出)を使用し、共役産物を分析した。線状XTEN_288、XTEN_576、およびXTEN_864を同条件下で分析し、反応産物を特定した(図115)。ピーク1は、30.5分でXTEN_864と同時に溶出し、XTEN_288の三量体として特定された。ピーク2は、34分でXTEN_576と同時に溶出し、XTEN_288の二量体として特定された。ピーク3は、39分でXTEN_288と同時に溶出し、XTEN_288前駆体として特定された。ピーク4は、低分子量化合物に対応し、XTEN種の定量化に含まれなかった。最適化タンパク質/リンカー比での三量体XTEN共役体の収率は、57%であった。三量体共役体3xXTEN_288および線状分子XTEN_864に対する本質的に同一の保持時間は、XTENタンパク質の見掛けの分子量および流体力学半径は、その幾何学構成に依存しないことを示唆する。
葉酸塩受容体を担持する細胞を選択的に標的および殺傷する能力を評価した。被験物質の遊離MMAE、非標的化3xMMAE−XTEN共役体(毒素に結合されたXTEN)、および葉酸塩受容体標的3xFA(γ)、3xMMAE−XTEN共役体を、葉酸塩受容体陽性KB細胞系を使用し、CellTiter−Glo抗増殖アッセイにおいて評価した。培養培地は、高い葉酸含有量を含むため、KB細胞を、10%熱不活性化ウシ胎仔血清を含む無葉酸培地中、37℃、5% CO2下で細胞生存性実験の開始前に少なくとも7日間成長させた。この培地は、実験の実行にも利用した。つまり、1ウェル当たり10,000個のKB細胞を、96ウェルマイクロタイターアッセイプレートの上に置いた。KB細胞は、37℃、5% CO2で終夜のインキュベーションによって、プレートに付着することが許された。次いで、消費された培地を除去し、葉酸競合体を含有するように指定されたウェルは、葉酸を含有するアッセイ培地を受容したが、葉酸競合体を有するように指定されないウェルは、アッセイ培地のみを受容した。プレートを30分間、37℃、5% CO2でインキュベートした後、アッセイ培地を吸引し、プレートをアッセイ培地で洗浄した。次いで、遊離MMAE、3xMMAE−XTEN、および3xFA(γ),3xMMAE−XTENを、葉酸競合体の存在または不在下で、適切な用量範囲で添加した。次いで、プレートを2〜4時間、37℃、5% CO2でインキュベートした。次いで、培地を除去し、プレートを洗浄して、新鮮な培地を導入し、プレートをさらに48〜72時間インキュベートのを許した。適切なインキュベーション期間後、CellTiter−Glo試薬を添加し、プレートを照度計上で読み取った。4パラメータ論理曲線適合を使用し、GraphPad Prismを使用して、各被験物質のIC50を決定した。
標的葉酸塩−XTEN−薬物共役体を使用して、葉酸塩受容体を担持する細胞を選択的に標的および殺傷する能力は、インビトロベースのスクリーニングおよび選択性アッセイを使用して評価される。
標的LHRH−XTEN−薬物共役体を使用して、LHRH受容体を担持する細胞を選択的に標的および殺傷する能力は、インビトロベースのスクリーニングおよび選択性アッセイを使用して評価される。各LHRH−XTEN−薬物共役体、その対応する非標的化XTEN−薬物分子、およびそれぞれの遊離薬物対照を、CellTiter−Glo抗増殖アッセイにおいて、LHRH受容体陽性および陰性細胞系の一団に対して試験する。細胞系の選択は、提案された臨床適用との関連性に基づき、MCF−7、MDA−MB−231、HCC1806、HCC1937、OV−1063、EFO−21、EFO−27、NIH:OVCAR−3、BG−1、HEC−1A、HEC−1B、Ishikawa、KLE、AN−3−CA、MiaPaCa、Panc−1、ラットDunning R−3327−H、PC−82、MDA−PCa−2b、C4−2(LNCaPの誘導体)、A549、A2780、UCI−107、SK−OV−3、SW 626、MFE−296を含む。最適な細胞密度およびインキュベーション時間を含む適切なアッセイ条件は、それぞれの遊離薬物を対照として使用して事前決定する。LHRH−XTEN−薬物共役体は、以下のように試験する。ログ相中の細胞を収集し、計数して、96ウェルマイクロタイターアッセイプレートに既定の細胞密度でプレートに置く。粘着性の細胞は、37℃、5% CO2で終夜のインキュベーションによって、プレートに付着することが許される。LHRH−XTEN−薬物共役体および対応する対照は、用量範囲内で重複で導入し、プレートをさらに2〜5日間インキュベートする。適切なインキュベーション期間後、CellTiter−Glo試薬を各ウェルに添加し、軌道攪拌器上で2分間混合する。次いで、プレートを90xgで遠心分離し、室温でさらに10分間インキュベートして、蛍光シグナルを安定化する。次いで、蛍光シグナルを照度計上で読み取り、IC50(半最大阻害性濃度)を、GraphPad Prismまたは相当するソフトウェアで計算する。IC50の定量的比較は、LHRH受容体陽性細胞系対陰性細胞系に対する細胞成長阻害および選択性の化合物活性のランク付けを可能にする。
安定性の測定として、LHRH−XTEN−薬物共役体を、独立して、健常なヒト、カニクイザル、および齧歯類血漿中、37℃で最大2週間インキュベートし、一定間隔でアリコートを除去し、分析まで−80℃で貯蔵する。LHRH−XTEN−薬物共役体の安定性を、遊離薬物の量、またはLHRH−XTEN−薬物共役体の経時的な完全性のいずれかによって評価することができる。遊離薬物は、RP−HPLCおよび/またはLC−MS/MSで定量化されるが、無傷のLHRH−XTEN−薬物共役体の量は、XTEN/薬物および/またはLHRH/薬物ELISAによって決定される。RP−HPLC分析の場合、血漿試料を、アセトニトリルまたはアセトン等の有機溶媒で処理し、タンパク質を沈殿させる。可溶性分画を真空下で蒸発させ、負荷溶液中に再溶解し、RP−HPLCによって分析する。検体は、特定の薬物に特異的な波長での紫外線吸収によって検出される。例えば、ドキソルビシンは、480nmで検出される。較正標準は、既知の量の遊離薬物を対応する血漿型に添加することによって調製され、実験試料と並行して処理される。LC−MS/MS分析の場合、血漿試料を、アセトニトリルまたはアセトン等の有機溶媒で処理し、タンパク質を沈殿させる。可溶性分画を真空下で蒸発させ、負荷溶液中に再溶解し、RP−HPLCによって分析する。検体は、三連四重極型質量分析計によってインライン検出され、定量化される。親イオン−娘イオン対は、各薬物に対して実験的に決定される。較正標準は、既知の量の遊離薬物を対応する血漿型に添加することによって調製され、実験試料と並行して処理される。定量的ELISAの場合、ELISA中のLHRH−XTEN−薬物共役体に最適な濃度の抗体は、十字交差連続希釈分析を使用して決定される。共役体の1つの成分を認識する適切な捕捉抗体は、4℃で終夜のインキュベーションによって、96ウェルマイクロタイタープレートの上にコーティングされる。ウェルをブロックして洗浄し、血清安定性試料を、それぞれ異なる希釈でウェルに添加し、コーティングされた抗体によるLHRH−XTEN−薬物共役体の最適な捕捉を可能にする。洗浄後、共役体の別の成分を認識する検出抗体を添加し、プレート上に捕捉された共役体への結合を可能にする。次いで、ウェルを再度洗浄した後、ストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ(検出抗体のビオチニル化異形に相補的)または二次抗体−ホースラディッシュペルオキシダーゼ(検出抗体の非ビオチニル化異形に相補的)を添加する。適切なインキュベーションおよび最終洗浄ステップ後、テトラメチルベンジジン(TMB)基質を添加し、プレートを450nMで読み取る。次いで、無傷共役体の濃度を、各時点に対し、測色反応を関連血漿型のLHRH−XTEN−薬物で調製された較正曲線と比較することによって計算する。次いで、ヒト、カニクイザル、およびマウス血清中の共役体のt1/2を、ログ濃度対時間の線形回帰分析を使用して定義する。
安定性の測定として、葉酸塩−XTEN−薬物共役体を、独立して、健常なヒト、カニクイザル、および齧歯類血漿中、37℃で最大2週間インキュベートし、一定間隔でアリコートを除去し、分析まで−80℃で貯蔵する。葉酸塩−XTEN−薬物共役体の安定性を、遊離薬物の量、または葉酸塩−XTEN−薬物共役体の経時的な完全性のいずれかによって評価することができる。遊離薬物の存在は、上記の関連セクションに記載される、HPLC、LC−MS/MSおよび/または抗増殖アッセイで定量化される。無傷の葉酸塩−XTEN−薬物共役体の量は、XTEN/薬物および/または葉酸塩/薬物ELISAによって決定される。RP−HPLC分析の場合、血漿試料を、アセトニトリルまたはアセトン等の有機溶媒で処理し、タンパク質を沈殿させる。可溶性分画を真空下で蒸発させ、負荷溶液中に再溶解し、RP−HPLCによって分析する。検体は、特定の薬物に特異的な波長での紫外線吸収によって検出される。例えば、ドキソルビシンは、480nmで検出される。較正標準は、既知の量の遊離薬物を対応する血漿型に添加することによって調製され、実験試料と並行して処理される。LC−MS/MS分析の場合、血漿試料を、アセトニトリルまたはアセトン等の有機溶媒で処理し、タンパク質を沈殿させる。可溶性分画を真空下で蒸発させ、負荷溶液中に再溶解し、RP−HPLCによって分析する。検体は、三連四重極型質量分析計によってインライン検出され、定量化される。親イオン−娘イオン対は、各薬物に対して実験的に決定される。較正標準は、既知の量の遊離薬物を対応する血漿型に添加することによって調製され、実験試料と並行して処理される。脱共役遊離薬物の存在の検出方法として抗増殖アッセイを使用するとき、葉酸塩受容体陽性または陰性細胞系を用いることができる。受容体陽性細胞系において評価を行うときは、葉酸阻害剤を添加し、受容体陰性細胞系において行うときは不要である。いずれかの受容体細胞型において、脱共役遊離薬物の濃度を増加させることは、細胞毒性の増加に寄与する。定量的ELISAの場合、ELISA中の葉酸塩−XTEN−薬物共役体に最適な濃度の抗体は、十字交差連続希釈分析を使用して決定される。共役体の一成分を認識する適切な捕捉抗体を、4℃で終夜のインキュベーションによって、96ウェルマイクロタイタープレートの上にコーティングする。ウェルをブロックして洗浄し、血清安定性試料を、それぞれ異なる希釈でウェルに添加し、コーティングされた抗体による葉酸塩−XTEN−薬物共役体の最適な捕捉を可能にする。洗浄後、共役体の別の成分を認識する検出抗体を添加し、プレート上に捕捉された共役体への結合を可能にする。次いで、ウェルを再度洗浄した後、ストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ(検出抗体のビオチニル化異形に相補的)または二次抗体−ホースラディッシュペルオキシダーゼ(検出抗体の非ビオチニル化異形に相補的)を添加する。適切なインキュベーションおよび最終洗浄ステップ後、テトラメチルベンジジン(TMB)基質を添加し、プレートを450nMで読み取る。次いで、無傷共役体の濃度を、各時点に対し、測色反応を関連血漿型の葉酸塩−XTEN−薬物で調製された較正曲線と比較することによって計算する。次いで、ヒト、カニクイザル、およびマウス血清中の共役体のt1/2を、ログ濃度対時間の線形回帰分析を使用して定義する。
Cy5.5蛍光タグ付加LHRH−XTEN分子を代理として使用し、LHRH−XTEN−薬物共役体の標的化および生体内分布効率を調査する。インビボに続いてエクスビボで、IVIS 50光学撮像システム(Caliper Life Sciences,Hopkinton,MA)を用いる蛍光撮像を使用し、LHRH受容体陽性腫瘍細胞の皮下成長異種移植片を担持するヌードマウスにおいて実験を行う。つまり、LHRH受容体陽性腫瘍細胞を担持する雌nu/nuマウスに、高用量または低用量のLHRH−XTEN−Cy5.5、および対応する用量の非標的化Cy5.5タグ付加XTEN対照の単一静脈注射を付与する。注射前、次いで注射後約8、24、48、および72時間に、生きた麻酔下動物上で、IVIS 50光学撮像システムを使用して全身走査を得る。72時間の最後の時点で動物全体の蛍光の分布を測定した後、腫瘍、ならびに肝臓、肺、心臓、脾臓、および腎臓を含む健常な器官を切除し、それらの蛍光を撮像システムによって登録および処理する。蛍光剤の波長を一致させるように、Cy5.5励起(615〜665nm)および放出(695〜770nm)フィルターを選択する。CCDチップの小/中ビニングを使用し、画像において各マウスの観察可能なシグナルから少なくとも数千カウントを得るように、およびCCDチップの飽和を避けるように、露出時間を最適化する。定量化のための画像を正規化するために、Cy5.5スペクトル領域に対して背景励起および放出フィルターを使用し、背景蛍光画像を得る。蛍光の強度は、異なる色によって表され、青色は最低強度を反映し、赤色は最高強度を示す。
Cy5.5蛍光タグ付加葉酸塩−XTEN分子を代理として使用し、葉酸塩−XTEN−薬物共役体の標的化および生体内分布効率を調査する。インビボに続いてエクスビボで、IVIS 50光学撮像システム(Caliper Life Sciences,Hopkinton,MA)を用いる蛍光撮像を使用し、葉酸塩受容体陽性腫瘍細胞の皮下成長異種移植片を担持するヌードマウスにおいて実験を行う。培養培地は、高い葉酸塩含有量を含むため、これらのマウスに移植される葉酸塩受容体陽性腫瘍細胞は、抗生物質を持たない5〜10%熱不活性化FCSを含有する無葉酸塩細胞培養培地中で成長される。同様に、通常の齧歯類食餌は、高濃度の葉酸を含有するため、この研究に使用されるヌードマウスは、血清葉酸塩濃度を低減するように、腫瘍移植前の2週間、および撮像分析期間の間、葉酸塩を含まない食餌で維持される。葉酸塩受容体陽性腫瘍細胞を担持する雌nu/nuマウスに、高用量または低用量の葉酸塩−XTEN−Cy5.5、および対応する用量の非標的化Cy5.5タグ付加XTEN対照の単一静脈注射を付与する。注射前、次いで注射後約8、24、48、および72時間に、生きた麻酔下動物上で、IVIS 50光学撮像システムを使用して全身走査を得る。72時間の最後の時点で動物全体の蛍光の分布を測定した後、腫瘍、ならびに肝臓、肺、心臓、脾臓、および腎臓を含む健常な器官を切除し、それらの蛍光を撮像システムによって登録および処理する。蛍光剤の波長を一致させるように、Cy5.5励起(615〜665nm)および放出(695〜770nm)フィルターを選択する。CCDチップの小/中ビニングを使用し、画像において各マウスの観察可能なシグナルから少なくとも数千カウントを得るように、およびCCDチップの飽和を避けるように、露出時間を最適化する。定量化のための画像を正規化するために、Cy5.5スペクトル領域に対して背景励起および放出フィルターを使用し、背景蛍光画像を得る。蛍光の強度は、異なる色によって表され、青色は最低強度を反映し、赤色は最高強度を示す。
LHRH−XTEN−薬物構築体のインビボ薬物動態を、タンパク質組成物の標準方法を使用して評価する。薬物動態は、複数の種において評価されるが、マウス、ラット、カニクイザル、およびイヌは、ヒト薬物動態を予測することにおける共通使用に起因して好適である。LHRH−XTEN−薬物構築体の組成物は、インビボ投与に相当する水性緩衝液(例えば、リン酸緩衝生理食塩水、トリス緩衝生理食塩水、またはHepes緩衝生理食塩水)中に提供される。組成物を適切な用量で、複数の経路を介して、最も好ましくは静脈内または皮下経路を介して投与する。血液試料を、0.08〜504時間の範囲の適切な時点で採取し、血漿中に処理する。次いで、血漿試料を、ELISA、HPLC、および/またはLC−MS/MSを含む多様な方法のうちの1つによって、LHRH−XTEN−薬物共役体の濃度について分析する。ELISA分析は、LHRH−XTEN−薬物共役体の2つの成分、例えば、XTEN/LHRH、XTEN/薬物部分、LHRH/薬物部分、および/またはXTEN/XTENの組合せを認識することができるサンドウィッチELISA形式を使用して行う。典型的に、LHRH−XTEN−薬物共役体の1つの成分を認識する抗体は、96ウェルマイクロタイタープレートのウェル上にコーティングされる。ウェルをブロックして洗浄し、次いで、血清安定性試料を、それぞれ異なる希釈でウェルに添加し、コーティングされた抗体による共役体の捕捉を可能にする。次いで、ウェルを広く洗浄し、結合されたタンパク質を、第2のLHRH−XTEN−薬物共役成分に対するビオチニル化抗体または適切な二次抗体のいずれかを使用して検出する。次いで、ウェルを再度洗浄した後、ストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ(ビオチニル化検出抗体に相補的)または二次抗体−ホースラディッシュペルオキシダーゼ(非ビオチニル化検出抗体に相補的)を添加する。適切なインキュベーションおよび最終洗浄ステップ後、テトラメチルベンジジン(TMB)基質を添加し、プレートを450nMで読み取る。次いで、共役体の濃度を、各時点に対し、測色反応をLHRH−XTEN−薬物較正曲線と比較することによって計算する。薬物動態パラメータを、WinNonLinソフトウェアパッケージを使用して計算する。RP−HPLC分析の場合、血漿試料を、アセトニトリルまたはアセトン等の有機溶媒で処理し、タンパク質を沈殿させる。可溶性分画を真空下で蒸発させ、負荷溶液中に再溶解し、RP−HPLCによって分析する。検体は、特定の薬物に特異的な波長での紫外線吸収によって検出される。例えば、ドキソルビシンは、480nmで検出される。較正標準は、既知の量の遊離薬物を対応する血漿型に添加することによって調製され、実験試料と並行して処理される。LC−MS/MS分析の場合、血漿試料を、アセトニトリルまたはアセトン等の有機溶媒で処理し、タンパク質を沈殿させる。可溶性分画を真空下で蒸発させ、負荷溶液中に再溶解し、RP−HPLCによって分析する。検体は、三連四重極型質量分析計によってインライン検出され、定量化される。親イオン−娘イオン対は、各薬物に対して実験的に決定される。較正標準は、既知の量の遊離薬物を対応する血漿型に添加することによって調製され、実験試料と並行して処理される。これらの結果は、LHRHおよび薬物部分へのXTENの添加が、終末相半減期を著しく増加させ、XTENに結合されていない薬物部分を標的化する薬物動態特性を強化するという所見を支持することが予想される。これは、順に、そのような共役体の、より頻繁でない、より便利な投与計画になる。
葉酸塩−XTEN−薬物構築体のインビボ薬物動態を、タンパク質組成物の標準方法を使用して評価する。薬物動態は、複数の種において評価されるが、マウス、ラット、カニクイザル、およびイヌは、ヒト薬物動態を予測することにおける共通使用に起因して好適である。通常の餌は、高濃度の葉酸を含有するため(例えば、6mg/kgマウス食餌)、葉酸塩共役体の薬物動態研究に使用される動物は、研究開始前の2週間、および研究期間の間、葉酸塩を含まない食餌で維持される。葉酸塩−XTEN−薬物構築体の組成物は、インビボ投与に適合する水性緩衝液(例えば、リン酸塩緩衝生理食塩水、トリス緩衝生理食塩水、またはHepes緩衝生理食塩水)中に提供される。組成物を適切な用量で、複数の経路を介して、最も好ましくは静脈内または皮下経路を介して投与する。血液試料を、0.08〜504時間の範囲の適切な時点で採取し、血漿中に処理する。次いで、血漿試料を、ELISA、HPLC、および/またはLC−MS/MSを含む多様な方法のうちの1つによって、葉酸塩−XTEN−薬物共役体の濃度について分析する。ELISA分析は、葉酸塩−XTEN−薬物共役体の2つの成分、例えば、XTEN/葉酸塩、XTEN/薬物部分、葉酸塩/薬物部分、および/またはXTEN/XTENの組合せを認識することができるサンドウィッチELISA形式を使用して行う。典型的に、葉酸塩−XTEN−薬物共役体の1つの成分を認識する抗体は、96ウェルマイクロタイタープレートのウェル上にコーティングされる。ウェルをブロックして洗浄し、次いで、血清安定性試料を異なる希釈でウェルに添加し、コーティングされた抗体による共役体の捕捉を可能にする。次いで、ウェルを広く洗浄し、結合されたタンパク質を、第2のLHRH−XTEN−薬物共役成分に対するビオチニル化抗体または適切な二次抗体のいずれかを使用して検出する。次いで、ウェルを再度洗浄した後、ストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ(ビオチニル化検出抗体に相補的)または二次抗体−ホースラディッシュペルオキシダーゼ(非ビオチニル化検出抗体に相補的)を添加する。適切なインキュベーションおよび最終洗浄ステップ後、テトラメチルベンジジン(TMB)基質を添加し、プレートを450nMで読み取る。次いで、共役体の濃度を、各時点に対し、測色反応を葉酸塩−XTEN−薬物較正曲線と比較することによって計算する。薬物動態パラメータを、WinNonLinソフトウェアパッケージを使用して計算する。RP−HPLC分析の場合、血漿試料を、アセトニトリルまたはアセトン等の有機溶媒で処理し、タンパク質を沈殿させる。可溶性分画を真空下で蒸発させ、負荷溶液中に再溶解し、RP−HPLCによって分析する。検体は、特定の薬物に特異的な波長での紫外線吸収によって検出される。例えば、ドキソルビシンは、480nmで検出される。較正標準は、既知の量の遊離薬物を対応する血漿型に添加することによって調製され、実験試料と並行して処理される。LC−MS/MS分析の場合、血漿試料を、アセトニトリルまたはアセトン等の有機溶媒で処理し、タンパク質を沈殿させる。可溶性分画を真空下で蒸発させ、負荷溶液中に再溶解し、RP−HPLCによって分析する。検体は、三連四重極型質量分析計によってインライン検出され、定量化される。親イオン−娘イオン対は、各薬物に対して実験的に決定される。較正標準は、既知の量の遊離薬物を対応する血漿型に添加することによって調製され、実験試料と並行して処理される。これらの結果は、葉酸塩および薬物部分へのXTENの添加が、終末相半減期を著しく増加させ、XTENに結合されていない薬物部分を標的化する薬物動態特性を強化するという所見を支持することが予想される。これは、順に、そのような共役体の、より頻繁でない、より便利な投与計画になる。
LHRH−XTEN−薬物共役体は、LHRH受容体陽性腫瘍細胞に対する非常に強力な毒素の標的送達のために意図される。そのようにして、LHRH−XTEN−薬物構築体のインビボ薬物動態活性を、ヌードマウスに移植されたヒト腫瘍細胞発現LHRH受容体を使用して評価することができる。有効性研究を開始する前に、ヌードマウスにおける初期評価を実行し、LHRH−XTEN−薬物候補の最大耐用量(MTD)を確立する。次いで、研究期間の間に動物によって耐容される最高用量であるMTDを使用して、標準異種移植モデルにおける有効性および毒性研究の用量範囲を計算する。つまり、MTD実験を1群当たり5匹のマウスを用いて実行し、様々な用量レベル、間隔、および期間でLHRH−XTEN−薬物共役体の静脈内投与を評価する。必要とされる開始MTD用量および用量群の数は、科学的文献、標的化LHRH部分に関する知識、共役される薬物部分の性質、密接に関連する化合物の毒素学的特性、および初期薬物動態研究からのデータに基づく(上記参照)。体重の低減、食餌および水の消費、ならびに立毛、円背、行動パターン、呼吸パターン、振戦、けいれん、衰弱、および自傷の兆候等の標準MTDパラメータを、毎日監視する。許容されない毒性を引き起こさないLHRH−XTEN−薬物の最高用量は、MTDとして指定される。 腫瘍異種移植研究は、3〜4投与レベルのLHRH−XTEN−薬物共役体を含み、MTD研究の結果に依存し、他のパラメータは、選択された腫瘍細胞系に依存する。実施例69は、異種移植研究において使用することができる腫瘍系の例を記載する。したがって、関連ヒト腫瘍系からの適切な数のLHRH受容体陽性細胞を皮下注射し、腫瘍を形成させて、そのサイズをキャリパーで測定し、容量を0.5xLxW2として計算し、式中、Lは、最長軸の測定値(ミリメートル)であり、WはLに垂直な軸の測定値(ミリメートル)である。所望のサイズ範囲の腫瘍体積を含むマウスを8〜10匹の動物群にランダム化することに続いて、媒体対照、遊離薬物対照、およびLHRH−XTEN−薬物共役体を、選択された用量および間隔で静脈内投与する。腫瘍成長の停止または後退は、腫瘍サイズおよび体積を、選択された時点でキャリパーを用いて測定することによって決定される。体重および食物消費を1〜2日毎に測定し、全体的な毒性を評価する。動物の生存を毎日監視する。研究の終了時に、全ての動物を犠牲死させ、主要臓器に関して臨床病理および組織病理を行う。標的細胞毒素は、悪性細胞の選択的排除に対して最も有望な戦略の一つである。これらの結果は、LHRH−XTEN−薬物共役体が、強力な有効性および低い全身毒性によって提示されるように、優れた治療指数を生じるという所見を支持することが予想される。対照的に、等モル用量で投与された非LHRH標的遊離薬物は、あまり強力ではないばかりか、さらに高度に毒性である。媒体対照は、未制御の腫瘍成長および深刻な毒性を示すことが予想される。
葉酸塩−XTEN−薬物共役体は、葉酸塩受容体陽性腫瘍細胞に対する非常に強力な毒素の標的送達のために意図される。そのように、葉酸塩−XTEN−薬物構築体のインビボ薬物動態活性を、ヌードマウス上のヒト腫瘍細胞発現葉酸塩受容体異種移植片を使用して評価する。有効性研究を開始する前に、ヌードマウスにおける初期評価を実行し、葉酸塩−XTEN−薬物候補の最大耐用量(MTD)を確立する。次いで、研究期間の間に動物によって耐容される最高用量であるMTDを使用して、標準異種移植モデルにおける有効性および毒性研究の用量範囲を計算する。通常の齧歯類食餌は、高濃度の葉酸を含有するため(6mg/kg食餌)、これらの研究に使用されるマウスは、研究開始前の2週間、および研究期間の間、葉酸塩を含まない食餌で維持される。MTD実験を1群当たり5匹のマウスを用いて実行し、様々な用量レベル、間隔、および期間で葉酸塩−XTEN−薬物共役体の静脈内投与を評価する。必要とされる開始MTD用量および用量群の数は、科学的文献、標的化葉酸塩部分に関する知識、共役される薬物部分の性質、密接に関連する化合物の毒素学的特性、および初期薬物動態研究からのデータに基づく(上記参照)。体重の低減、食餌および水の消費、ならびに立毛、円背、行動パターン、呼吸パターン、振戦、けいれん、衰弱、および自傷の兆候等の標準MTDパラメータを、毎日監視する。許容されない毒性を引き起こさない葉酸塩−XTEN−薬物の最高用量は、MTDとして指定される。腫瘍異種移植研究は、3〜4投与レベルの葉酸塩−XTEN−薬物共役体を含み、MTDの結果に依存し、他のパラメータは、選択された腫瘍細胞系に依存する。実施例69は、異種移植研究において使用することができる腫瘍系の例を記載する。葉酸塩含有量を低減するために、ヌードマウス上に移植される葉酸塩受容体陽性腫瘍細胞は、抗生物質を持たない5〜10%熱不活性化ウシ胎仔血清を含有する無葉酸塩細胞培養培地中で成長される。同様に、血清葉酸濃度を低減するために、異種移植研究に使用されるマウスは、研究開始前の2週間、および研究期間の間、葉酸塩を含まない食餌で維持される。関連系からの適切な数の葉酸塩受容体陽性細胞を皮下注射し、腫瘍を形成させて、そのサイズをキャリパーで測定し、容量を0.5xLxW2として計算し、式中、Lは、最長軸の測定値(ミリメートル)であり、WはLに垂直な軸の測定値(ミリメートル)である。所望のサイズ範囲の腫瘍体積を含むマウスを8〜10匹の動物群にランダム化することに続いて、媒体対照、遊離薬物対照、および葉酸塩−XTEN−薬物を、選択された用量および間隔で静脈内投与する。腫瘍成長の停止または後退は、腫瘍サイズおよび体積を、選択された時点でキャリパーを用いて測定することによって決定される。体重および食物消費を1〜2日毎に測定し、全体的な毒性を評価する。動物の生存を毎日監視する。研究の終了時に、全ての動物を犠牲死させ、主要臓器に関して臨床病理および組織病理を行う。標的細胞毒素は、悪性細胞の選択的排除に対して最も有望な戦略の一つである。標的化学療法葉酸塩−XTEN−薬物共役体は、葉酸塩受容体陽性腫瘍上の遊離細胞毒性薬物単独よりも有効であり、毒性が低いことが予想される。
標的化学療法は、全身化学療法の有効性を高め、副作用を低減することを目的とする近代的手法である。ホジキンリンパ腫および全身性未分化大細胞リンパ腫に対して認可されたブレンツキシマブ ベドチン(Brentuximab vedotin(Adcentris))は、有効な毒素標的療法の主な例である。LHRHは、生殖器官において機能するペプチドである。その受容体は、特に、ある腫瘍上に集中するが、ほとんどの正常組織中では発現しないため、LHRH受容体は、悪性腫瘍の選択的崩壊のための理想的な標的である。実際に、乳癌の約52%、卵巣癌および子宮内膜癌の約80%、および前立腺癌の約85%は、LHRH受容体を介して標的可能である。注目すべきは、LHRH依存性治療は、三重陰性乳房腫瘍に対して特に有用であり、エストロゲンもしくはプロゲステロン受容体またはHER2を過剰発現しないため、多くの使用可能な標的薬物での処置に適していない。進行した子宮内膜癌、卵巣癌、または前立腺癌の患者は、これらの悪性腫瘍が、再発しやすい、および/または現行の処置に対して耐性であり得るため、特に不良な転帰を有することが多い。これを支持して、AEZS−108、LHRHの標的ドキソルビシン類似体を用いた臨床研究は、これらの癌種のそれぞれが、LHRHを用いた治療の影響を受け易いことを示す。葉酸塩の1つ以上のコピーを担持するXTENを3つ以上の薬物分子を担持するXTENに融合し、標的ペプチド−薬物共役体を創製することは、治療指数および半減期を大幅に改善することが予想され、これがMTDをはるかに下回るレベルでの投薬を可能にし、投与頻度および費用を低減する(用量当たりに必要な薬物を低減する)。
標的化学療法は、全身化学療法の有効性を高め、副作用を低減することを目的とする近代的手法である。ホジキンリンパ腫および全身性未分化大細胞リンパ腫に対して認可されたブレンツキシマブ ベドチン(Brentuximab vedotin(Adcentris))は、有効な毒素標的療法の主な例である。葉酸としても知られる葉酸塩、ビタミンB9は、ある生物学的経路における共因子として、ヌクレオチド生合成および機能のために全ての生細胞が必要とする重要な栄養素である。急速な細胞分裂および成長を補助することにおいて特に重要である。そのように、葉酸塩受容体は、急速に分裂する悪性腫瘍、特に卵巣癌および非小細胞肺癌を処置するための治療開発の焦点である。いくつかの卵巣腫瘍型は、手術および白金を用いた化学療法の初期成功後に発生する可能性があり、その再生は、使用可能な治療に耐性となり得る。葉酸塩受容体の発現は、正常な卵巣においてごくわずかであるが、上皮卵巣癌の約90%は、多くの肺腺癌と同様に、葉酸塩受容体を過剰発現し、それによって、行われる治療の可能性を開く。これを支持して、EC−145、葉酸塩の標的ビンカアルカロイド類似体を用いた臨床研究は、白金耐性卵巣癌および非小細胞肺癌が、葉酸塩を用いた治療の影響を受け易いことを示す。葉酸塩の1つ以上のコピーを担持するXTENを3つ以上の薬物分子を担持するXTENに融合し、標的ペプチド−薬物共役体を創製することは、治療指数および半減期を大幅に改善することが予想され、これが最大耐用量(MTD)をはるかに下回るレベルでの投薬を可能にし、投与頻度および費用を低減する(用量当たりに必要な薬物を低減する)。
Claims (18)
- 伸長組換えポリペプチド(XTEN(登録商標))を含む組成物であって、該XTEN(登録商標)が、GGSPAGSCTSP、GASASCAPSTG、TAEAAGCGTAEAA、およびGPEPTCPAPSGから選択される配列を含み、該XTEN(登録商標)が、表3に記載の配列と少なくとも90%の配列同一性を示す、組成物。
- 前記XTEN(登録商標)が、第1の架橋剤の分子に共役され、該第1の架橋剤が、表13に記載の架橋剤、表15に記載のアルキン反応物、または表15に記載のアジド反応物である、請求項1に記載の組成物。
- 前記第1の架橋剤の分子が、
a.前記XTEN(登録商標)のN末端アミノ酸残基のαアミノ基で、または
b.前記XTEN(登録商標)のシステイン残基のチオール基で、
前記XTEN(登録商標)に共役される、請求項2に記載の組成物。 - 前記第1の架橋剤が、N−マレイミド、ヨードアセチル試薬、ピリジルジスルフィド試薬、3−プロパルギルオキシプロパン酸、(オキシエチル)n−アセチレン(nが1〜10)、ジベンジルシクロオクチン(DBCO)、シクロオクチン(COT)、3−アジド−プロピオン酸、6−アジド−ヘキサン酸、および(オキシエチル)n−アジド(nが1〜10)からなる群から選択される、請求項2に記載の組成物。
- 前記第1の架橋剤の分子が、前記XTEN(登録商標)のシステイン残基のチオール基に共役され、前記XTEN(登録商標)が、前記XTEN(登録商標)のN末端アミノ酸のαアミノ基で第2の架橋剤の分子に共役され、該第2の架橋剤が、表13に記載の架橋剤、表15に記載のアルキン反応物、または表15に記載のアジド反応物である、請求項3に記載の組成物。
- 前記XTEN(登録商標)が、前記第1の架橋剤の1つ以上の分子に共役され、前記第1の架橋剤の1つ以上の分子が、前記XTEN(登録商標)の各システイン残基に共役される、請求項2に記載の組成物。
- 前記組成物が、第1のペイロードをさらに含み、該第1のペイロードが、該第1のペイロードの単一原子を介して前記第1の架橋剤の分子に共役され、該単一原子が、炭素、窒素、酸素、および硫黄からなる群から選択される、請求項2に記載の組成物。
- 前記第1のペイロードが、表11、12、18および21に記載のペイロードからなる群から選択される、請求項7に記載の組成物。
- 前記組成物が、第2のペイロードをさらに含み、該第2のペイロードが、前記XTEN(登録商標)のN末端に共役された第2の架橋剤の分子に連結され、該第2の架橋剤が、表15に記載のアルキン反応物またはアジド反応物である、請求項7に記載の組成物。
- 前記第2のペイロードが、表18および21に記載の標的化部分からなる群から選択される、請求項9に記載の組成物。
- 前記XTEN(登録商標)が、セグメント172、セグメント173、セグメント174、セグメント175、セグメント176、セグメント177、セグメント181、セグメント184、セグメント185、セグメント187、セグメント188、セグメント189、セグメント190、およびセグメント191からなる群から選択される、請求項1に記載の組成物。
- 前記XTEN(登録商標)が、前記XTEN(登録商標)のシステイン残基のチオール基で第1の架橋剤の分子に共役される、請求項11に記載の組成物。
- 前記XTEN(登録商標)が、第1の架橋剤の1以上の分子に共役され、該第1の架橋剤の1以上の分子が、前記XTEN(登録商標)の各システイン残基に共役される、請求項11に記載の組成物。
- 前記第1の架橋剤が、表13に記載の架橋剤、表15に記載のアルキン反応物、または表15に記載のアジド反応物である、請求項12または請求項13に記載の組成物。
- 前記組成物が、第1のペイロードをさらに含み、該第1のペイロードが、該第1のペイロードの単一原子を介して前記第1の架橋剤の分子に共役され、該単一原子が、炭素、窒素、酸素、および硫黄からなる群から選択される、請求項14に記載の組成物。
- 前記第1のペイロードが、表11、12、18および21に記載のペイロードからなる群から選択される、請求項15に記載の組成物。
- 前記組成物が、第2のペイロードをさらに含み、該第2のペイロードが、前記XTEN(登録商標)のN末端に共役された第2の架橋剤の分子に連結され、該第2の架橋剤が、表15に記載のアルキン反応物またはアジド反応物である、請求項15に記載の組成物。
- 前記第2のペイロードが、表18および21に記載の標的化部分からなる群から選択される、請求項17に記載の組成物。
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