JP2020114234A - Ｘｔｅｎ共役組成物およびそれを製造する方法 - Google Patents

Ｘｔｅｎ共役組成物およびそれを製造する方法 Download PDF

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Abstract

【課題】ＸＴＥＮ共役組成物およびそれを製造する方法の提供。【解決手段】ＸＴＥＮ配列の実質的に均質な集団を含む組成物を産生する方法であって、ａ．特定の配列の群から選択されるアミノ酸配列であって、少なくとも１つの切断配列を含む、アミノ酸配列を有する少なくとも１つのポリペプチドを含む組成物を提供することと、ｂ．前記ポリペプチド組成物を、前記切断配列を切断するのに有効な条件下で、トリプシンで処置することと、を含み、得られたＸＴＥＮ配列の実質的に均質な集団中の個別の配列の少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％が、同一配列長を有する、方法。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１２年２月２７日に出願された米国仮特許出願第６１／６３４，３１２
号、２０１２年６月１８日に出願された米国仮特許出願第６１／６９０，１８７号、およ
び２０１２年１０月４日に出願された米国特許出願第６１／７０９，９４２号に対する優
先権の利益を主張し、これらの出願は、参照により本明細書に組み込まれる。
治療薬の半減期を延長することは、治療用タンパク質であるか、ペプチドであるか、ま
たは小分子であるかにかかわらず、しばしば治療薬自体に対して特別な製剤化または修飾
を必要とする。ＰＥＧ化、治療薬への抗体フラグメントまたはアルブミン分子の添加等の
従来の修飾方法は、多数の重大な欠点を抱えている。これらの修飾された形態は、大規模
に調製されることができるが、これらの従来の方法は、一般に、高い商品価格、複雑な製
造プロセス、および最終製品の低い純度に悩まされる。しばしば、標的実体を均質に精製
することは、不可能ではないにしても困難である。これは、同じ数または質量のポリエチ
レングリコールを担持するＰＥＧ化剤の均質な集団を生成するために、反応自体を精密に
制御することができないＰＥＧ化の場合に特に真である。さらに、これらのＰＥＧ化剤の
代謝は、深刻な副作用を有し得る。例えば、ＰＥＧ化タンパク質は、動物モデルにおいて
腎尿細管空胞化を引き起こすことが観察されている（Ｂｅｎｄｅｌｅ，Ａ．，Ｓｅｅｌｙ
，Ｊ．，Ｒｉｃｈｅｙ，Ｃ．，Ｓｅｎｎｅｌｌｏ，Ｇ．＆ Ｓｈｏｐｐ，Ｇ．Ｓｈｏｒｔ
ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ：ｒｅｎａｌ ｔｕｂｕｌａｒ ｖａｃｕｏｌａｔｉｏｎ
ｉｎ ａｎｉｍａｌｓ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｇｌ
ｙｃｏｌ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｓｃｉ．１９９
８．４２，１５２−１５７）。腎臓から除去されたＰＥＧ化タンパク質またはそれらの代
謝物は、腎臓内に蓄積し、正常な糸球体ろ過を干渉するＰＥＧ水和物の形成を引き起こし
得る。さらに、動物およびヒトは、ＰＥＧに対する抗体を製造するように誘導され得る（
Ｓｒｏｄａ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｒｅｐｅａｔｅｄ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ＰＥＧ
−ＰＥ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｇｅｎｅｒａｔｅ ａｎｔｉ−ＰＥＧ ａｎｔｉｂｏｄｉ
ｅｓ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．２００５．１０，３７−４７）。
したがって、妥当な価格で延長した半減期特性を持つ高度に純粋な形態の治療薬の産生
に有用な代替の組成物および方法に対する相当の必要性が残る。
Ｂｅｎｄｅｌｅ，Ａ．，Ｓｅｅｌｙ，Ｊ．，Ｒｉｃｈｅｙ，Ｃ．，Ｓｅｎｎｅｌｌｏ，Ｇ．＆ Ｓｈｏｐｐ，Ｇ．Ｓｈｏｒｔ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ：ｒｅｎａｌ ｔｕｂｕｌａｒ ｖａｃｕｏｌａｔｉｏｎ ｉｎ ａｎｉｍａｌｓ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｇｌｙｃｏｌ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｓｃｉ．１９９８．４２，１５２−１５７ Ｓｒｏｄａ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｒｅｐｅａｔｅｄ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ＰＥＧ−ＰＥ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｇｅｎｅｒａｔｅ ａｎｔｉ−ＰＥＧ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．２００５．１０，３７−４７
本発明は、この必要性に取り組み、関連した利点を提供する。本明細書に開示される組
成物および方法は、治療薬として有用であるだけでなく、候補治療薬の前臨床および臨床
開発のための研究ツールとしても特に有用である。いくつかの態様において、本発明は、
部分的に、１つまたは複数の単純ステップで均質に精製され得る、および／または広範な
共役方法を使用する、反応基とペイロードペプチド、タンパク質、および小分子との化学
的共役の影響を受け易い伸長組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ）試薬を生成することにより
、この必要性に取り組む。ＸＴＥＮ試薬の使用は、非共役産物と比較して、高均質性、高
可溶性、長期安定性、および強化された終末相半減期を含む１つ以上の態様において優れ
ている、ＸＴＥＮ結合した薬剤の高収率産物を生成する。
本発明は、部分的に、１つ以上のペイロードの薬理学的または生物学的に活性な薬剤に
結合し、ＸＴＥＮ−ペイロード組成物をもたらすための共役パートナーとして有用な実質
的に均質の伸長組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ）を含む新規の組成物に関する。一態様に
おいて、本発明は、直接または架橋剤を介してのいずれかで、１つ以上のペイロードに共
有結合し、１、２、３、またはそれ以上の種のペイロードの１、２、３、４、５、６、７
、８、９、または１０個以上の分子を含むＸＴＥＮ−ペイロード組成物をもたらすために
操作されたＸＴＥＮを提供する。強化された薬物動態特性を含む強化された薬学的特性を
持つ組成物として、関心対象のペイロード薬を用いて共役体を創製する際に使用するため
の、そのように操作されたＸＴＥＮポリペプチドを提供することが、本発明の目的である
。本発明は、得られたＸＴＥＮ−ペイロード共役体が高程度の純度を有するように、１つ
以上のペイロードに結合されたＸＴＥＮを含む共役体を調製するために有用である、長さ
および配列において実質的に均質なＸＴＥＮを提供する。高純度のそのような共役体は、
１つ以上のペイロードが、状態の予防、処置、または改善において有用性を有する医学的
状態を有する対象に対して、薬学的組成物を調製する際に有用である。
第１の態様において、本発明は、ＸＴＥＮ−架橋剤の中間体およびＸＴＥＮ−ペイロー
ド組成物を創製するための共役パートナーとして有用な実質的に均質なＸＴＥＮポリペプ
チド組成物を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、伸長組換えポリペプチ
ド（ＸＴＥＮ）を含むポリペプチドの実質的に均質な集団を提供し、当該集団中の個別の
ポリペプチド分子の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、または９５％
は、同一配列長を有する。前述の一実施形態において、ＸＴＥＮは、全ＸＴＥＮアミノ酸
残基が、少なくとも３６〜約３０００個のアミノ酸残基であることと、グリシン（Ｇ）、
アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸塩（Ｅ）およびプロリ
ン（Ｐ）残基の合計が、ＸＴＥＮの全アミノ酸残基の約９０％超を占めることと、ＸＴＥ
Ｎ配列が、（ｉ）ＸＴＥＮ配列が、アミノ酸がセリンでない限り同一である３個の隣接す
るアミノ酸を含有しないか、（ｉｉ）ＸＴＥＮ配列の少なくとも約８０％、または約９０
％、または約９５％が、非重複配列モチーフからなり、配列モチーフのそれぞれが、約９
〜約１４個のアミノ酸残基を含み、いずれの２つの隣接するアミノ酸残基も、配列モチー
フのそれぞれにおいて２回を超えて発生しないか、または（ｉｉｉ）ＸＴＥＮ配列が、１
０未満の部分列スコアを有するように、実質的に非反復的であることと、ＸＴＥＮ配列が
、ＧＯＲアルゴリズムによって決定される９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９
５％、９６％、９７％、９８％を超えるか、または９９％を超えるランダムコイル形成を
有することと、ＸＴＥＮ配列が、２％、または３％、または４％、または５％未満のαら
せんを有することと、ＸＴＥＮ配列が、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズムによって決
定される２％、または３％、または４％、または５％未満のβシートを有することと、Ｘ
ＴＥＮ配列が、ＴＥＰＩＴＯＰＥアルゴリズムによって分析されるとき、予測されたＴ細
胞エピトープを欠き、ＸＴＥＮ配列内のエピトープについてのＴＥＰＩＴＯＰＥアルゴリ
ズム予測が、−８、または−９、または−１０のスコアに基づくことと、を特徴とする。
前述の別の実施形態において、ＸＴＥＮは、表２、表３、表４、および表２２〜２５に記
載される配列からなる群から選択される配列に対して少なくとも約９０％、または少なく
とも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくと
も約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも
約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％、または１００％の配
列同一性を有する配列を含む。
他の実施形態において、実質的に均質なＸＴＥＮポリペプチド組成物は、１つ以上の親
和性タグを含む。一実施形態において、本発明は、第１の親和性タグを含む実質的に均質
なＸＴＥＮポリペプチド組成物を提供し、この第１の親和性タグは、疎水性相互作用クロ
マトグラフィー（ＨＩＣ）、カチオン交換、アニオン交換、固定化金属イオン親和性クロ
マトグラフィー（ＩＭＡＣ）、および固定化抗体からなる群から選択されるクロマトグラ
フィー基質に対する結合親和性を有する。前述の一実施形態において、第１の親和性タグ
は、表７に記載される配列からなる群から選択される配列に対して少なくとも約９０％、
９１％、９２％、９３％、９４％、または少なくとも約９５％の配列同一性を有する。前
述のＸＴＥＮおよび親和性タグの別の実施形態において、組成物は、１つ以上のヘルパー
配列をさらに含む。一実施形態において、ヘルパー配列は、表１０に記載される配列から
なる群から選択される配列に対して少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、ま
たは少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、また
は少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または
少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％、または１００％の配列同一性を有する
配列を含む。別の実施形態において、ヘルパー配列は、ＫＮＰＥＱＡＥＥＱＸ１ＥＥＴ（
式中、Ｘ１が、独立して、ＳまたはＲである）；ＡＮＰＥＱＡＥＥＱＸ１ＥＥＴ（式中、
Ｘ１が、独立して、ＳまたはＲである）；ＫＮＰＥＱＡＥＥＱＡＥＥＱＸ１ＥＥＴ（式中
、Ｘ１が、独立して、ＳまたはＲである）；ＫＸ２Ｘ３ＥＱＡＥＥＱＡＥＥＱＸ１ＥＥＴ
（式中、Ｘ１が、独立して、ＳまたはＲであり、Ｘ２が、独立して、ＫまたはＮであり、
Ｘ３が、独立して、Ｋ、Ｎ、Ｔ、Ｑ、Ｈ、Ｐ、Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｒ、またはＳである）；ＫＸ
２（Ｘ３）１０ＱＸ１ＥＥＴ（式中、Ｘ１が、独立して、ＳまたはＲであり、Ｘ２が、独
立して、ＫまたはＮであり、Ｘ３が、独立して、Ｋ、Ｎ、Ｔ、Ｑ、Ｈ、Ｐ、Ｅ、Ｄ、Ａ、
Ｒ、またはＳである）；ＫＸ２（Ｘ３）７ＡＥＥＱＸ１ＥＥＴ（式中、Ｘ１が、独立して
、ＳまたはＲであり、Ｘ２が、独立して、ＫまたはＮであり、Ｘ３が、独立して、Ｋ、Ｎ
、Ｔ、Ｑ、Ｈ、Ｐ、Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｒ、またはＳである）；ＫＸ２Ｘ３ＥＱＥ（Ｘ３）３Ａ
ＥＥＱＲＥＥＴ（式中、Ｘ２が、独立して、ＫまたはＮであり、Ｘ３が、独立して、Ｋ、
Ｎ、Ｔ、Ｑ、Ｈ、Ｐ、Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｒ、またはＳである）；ＫＸ２Ｘ３ＥＱＥ（Ｘ３）３
ＡＥＥ（Ｘ３）５（式中、Ｘ２が、独立して、ＫまたはＮであり、Ｘ３が、独立して、Ｋ
、Ｎ、Ｔ、Ｑ、Ｈ、Ｐ、Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｒ、またはＳである）；ＫＫＱＥＱＥＫＥＱＡＥＥ
Ｑ（Ｘ４Ｘ５）２ＲＥＥＴ（式中、Ｘ４が、独立して、ＡまたはＳであり、Ｘ５が、独立
して、Ｋ、Ｑ、またはＥである）；ＫＫＱＥＱＥＫＥＱＡＥＥＱ（Ｘ４Ｘ５）４ＲＥＥＴ
（式中、Ｘ４が、独立して、ＡまたはＳであり、Ｘ５が、独立して、Ｋ、Ｑ、またはＥで
ある）；ＫＫＱＥＱＥＫＥＱＡＥＥＱ（Ｚ）４ＲＥＥＴ（式中、Ｚが、任意の天然に存在
するＬアミノ酸である）；ＫＸ２（Ｘ３）ｎ（式中、ｎが、１０〜４０の整数であり、Ｘ
２が、独立して、ＫまたはＮであり、Ｘ３が、独立して、Ｋ、Ｎ、Ｔ、Ｑ、Ｈ、Ｐ、Ｅ、
Ｄ、Ａ、Ｒ、またはＳである）；（Ｘ３）ｎ（式中、ｎが、１０〜５０の整数であり、Ｘ
３が、独立して、Ｋ、Ｎ、Ｔ、Ｑ、Ｈ、Ｐ、Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｒ、またはＳである）；ＫＸ２
ＱＥＱＥＫＥＱＡＥＥＱ（Ｘ４Ｘ５）ｎＸ１ＥＥＴ（式中、ｎが、ゼロまたは１〜１０の
整数であり、Ｘ１が、独立して、ＳまたはＲであり、Ｘ２が、独立して、ＫまたはＮであ
り、Ｘ４が、独立して、ＡまたはＳであり、Ｘ５が、独立して、Ｋ、Ｑ、またはＥである
）；ＫＸ２（Ｘ３）ｎ（Ｘ４Ｘ５）ｍＸ１ＥＥＴ（式中、ｎが、５〜２０の整数であり、
ｍが、ゼロまたは１〜１０の整数であり、Ｘ１が、独立して、ＳまたはＲであり、Ｘ２が
、独立して、ＫまたはＮであり、Ｘ３が、独立して、Ｋ、Ｎ、Ｔ、Ｑ、Ｈ、Ｐ、Ｅ、Ｄ、
Ａ、Ｒ、またはＳであり、Ｘ４が、ＡまたはＳであり、Ｘ５が、独立して、Ｋ、Ｑ、また
はＥである）；およびＫＸ２（Ｘ３）ｎ（Ｚ）ｍＸ１ＥＥＴ（式中、ｎが、５〜２０の整
数であり、ｍが、ゼロまたは１〜１０の整数であり、Ｘ１が、独立して、ＳまたはＲであ
り、Ｘ２が、独立して、ＫまたはＮであり、Ｘ３が、独立して、Ｋ、Ｎ、Ｔ、Ｑ、Ｈ、Ｐ
、Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｒ、またはＳであり、Ｚが、任意の天然に存在するＬアミノ酸である）、
ならびに最適に整列されたときに前述の少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、ま
たは９９％の配列同一性を示す任意の配列相同体からなる群から選択される。
前述の実質的に均質なＸＴＥＮ、親和性タグ、およびヘルパー配列組成物の他の実施形
態において、組成物は、第１の切断配列をさらに含む。所望される場合、切断配列は、表
８および表９に記載される配列からなる群から選択される。前述の一実施形態において、
組成物は、式Ｉ：
の構成を有し、式中、ＨＳは、ヘルパー配列であり、ＡＴ１は、第１の親和性タグであり
、ＣＳ１は、第１の切断配列であり、ＸＴＥＮは、伸長組換えポリペプチドである。前述
の組成物の別の実施形態において、組成物は、第２の切断配列をさらに含む。所望される
場合、第１および第２の切断配列は、同じプロテアーゼによって切断されることができ、
組成物は、式ＩＩ：
の構成を有し、式中、ＨＳは、ヘルパー配列であり、ＡＴ１は、第１の親和性タグであり
、ＣＳ１は、第１の切断配列であり、ＣＳ２は、第２の切断配列であり、ＸＴＥＮは、伸
長組換えポリペプチドである。前述の組成物の別の実施形態において、第１の親和性タグ
は、配列ＲＰＲＰＲＰＲＰＲＰＲＰＲ、ＨＨＨＨＨＨ、または当該技術分野において既知
であるか、もしくは本明細書に開示される任意の親和性タグを含む。
実質的に均質なＸＴＥＮ組成物の他の実施形態において、組成物は、第１および第２の
親和性タグと、第１および第２の切断配列と、ヘルパー配列とを含み、第２の親和性タグ
は、第１の親和性タグとは異なり、第１の親和性タグとは異なるクロマトグラフィー基質
に対する結合親和性を有し、クロマトグラフィー基質は、ＨＩＣ、カチオン交換、アニオ
ン交換、ＩＭＡＣ、および固定化抗体からなる群から選択され、第１および第２の切断配
列は、同じプロテアーゼによって切断されることができ、第２の親和性タグは、表７に記
載される配列からなる群から選択される配列に対して少なくとも約９０％、９１％、９２
％、９３％、９４％、または少なくとも約９５％の配列同一性を有する。前述の組成物の
一実施形態において、組成物は、式ＩＩＩ：
の構成を有し、式中、ＨＳは、ヘルパー配列であり、ＡＴ１は、第１の親和性タグであ
り、ＣＳ１は、第１の切断配列であり、ＣＳ２は、第２の切断配列であり、ＸＴＥＮは、
伸長組換えポリペプチドであり、ＡＴ２は、第２の親和性タグである。前述の組成物の別
の実施形態において、第１の親和性タグは、配列ＲＰＲＰＲＰＲＰＲＰＲＰＲを含み、第
２の親和性タグは、配列ＨＨＨＨＨＨを含む。前述の組成物の別の実施形態において、第
１の親和性タグは、配列ＨＨＨＨＨＨを含み、第２の親和性タグは、配列ＲＰＲＰＲＰＲ
ＰＲＰＲＰＲを含む。前述の組成物の別の実施形態において、第１の親和性タグは、配列
ＲＰＲＰＲＰＲＰＲＰＲＰＲＰＲＰＲＰＲＰＲＰＲを含み、第２の親和性タグは、配列Ｈ
ＨＨＨＨＨＨＨを含む。
別の態様において、本発明は、プロセスによって得られるポリペプチドの実質的に均質
な集団を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態において、組成物は、ポリペプチド
をコードするベクターを含む宿主細胞を、発酵反応において、宿主細胞の粗発現産物によ
ってポリペプチドを発現するのに有効な条件下で培養することであって、コードされたポ
リペプチドが、ＸＴＥＮと、第１の切断配列と、第１の親和性タグとを含む、培養するこ
とと、粗発現産物のポリペプチドを、第１のクロマトグラフィー基質の上に、第１の親和
性タグを第１のクロマトグラフィー基質の上に捕捉するのに有効な条件下で吸着させるこ
とと、ポリペプチドを溶離することと、ポリペプチドを回収することと、を含むプロセス
によって得られる。いくつかの実施形態において、得られた集団のポリペプチドの少なく
とも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、または９５％は、同一配列長を有する。
前述の組成物の一実施形態において、第１のクロマトグラフィー基質は、ＨＩＣ、カチオ
ン交換、アニオン交換、およびＩＭＡＣからなる群から選択される。前述の組成物の別の
実施形態において、親和性タグは、表７の親和性タグからなる群から選択される。前述の
組成物の別の実施形態において、第１のクロマトグラフィー基質は、カチオン交換であり
、第１の親和性タグは、配列ＲＰＲＰＲＰＲＰＲＰＲＰＲを含む。前述の組成物の別の実
施形態において、第１のクロマトグラフィー基質は、ＩＭＡＣであり、第１の親和性タグ
は、配列ＨＨＨＨＨＨＨＨを含む。前述の組成物の一実施形態において、コードベクター
は、少なくとも親和性タグと、少なくとも第１の切断配列と、ヘルパー配列と、任意に第
２の切断配列と、を含む本明細書に記載されるＸＴＥＮ実施形態のいずれかをコードする
。前述の組成物の別の実施形態において、ベクターは、第２の切断配列および第２の親和
性タグをさらにコードし、第１および第２の切断配列は、同じプロテアーゼによって切断
されることができ、第２の親和性タグは、第１の親和性タグとは異なる第２のクロマトグ
ラフィー基質に対する結合親和性を有し、組成物は、ポリペプチドを、第２のクロマトグ
ラフィー基質の上に、第２の親和性タグを第２のクロマトグラフィー基質の上に捕捉する
のに有効な条件下で吸着させることと、ポリペプチドを溶離することと、ポリペプチドを
回収することと、をさらに含むプロセスによって得られ、集団のポリペプチドの少なくと
も９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、または９５％は、同一配列長を有する。前
述の一実施形態において、第１のクロマトグラフィー基質は、第２のクロマトグラフィー
基質とは異なり、第１および第２のクロマトグラフィー基質のそれぞれは、独立して、Ｈ
ＩＣ、カチオン交換、アニオン交換、およびＩＭＡＣからなる群から選択される。前述の
組成物の別の実施形態において、第１のクロマトグラフィー基質は、カチオン交換であり
、第１の親和性タグは、配列ＲＰＲＰＲＰＲＰＲＰＲＰＲまたはＲＰＲＰＲＰＲＰＲＰＲ
ＰＲＰＲＰＲＰＲＰＲＰＲを含み、第２のクロマトグラフィー基質は、ＩＭＡＣであり、
第１の親和性タグは、配列ＨＨＨＨＨＨＨＨまたはＨＨＨＨＨＨＨＨを含む。前述の組成
物の別の実施形態において、第１のクロマトグラフィー基質は、ＩＭＡＣであり、第１の
親和性タグは、配列ＨＨＨＨＨＨＨＨまたはＨＨＨＨＨＨＨＨを含み、第２のクロマトグ
ラフィー基質は、カチオン交換であり、第１の親和性タグは、配列ＲＰＲＰＲＰＲＰＲＰ
ＲＰＲまたはＲＰＲＰＲＰＲＰＲＰＲＰＲＰＲＰＲＰＲＰＲＰＲを含む。別の実施形態に
おいて、第１の親和性タグまたは第１および第２の親和性タグを含む前述の組成物は、組
成物を、切断配列（複数可）を切断するのに有効な条件下で、プロテアーゼで処置し、そ
れによりＸＴＥＮを親和性タグ（複数可）から遊離させることと、ＸＴＥＮを、クロマト
グラフィー基質の上に、ＸＴＥＮを捕捉するのには有効であるが、親和性タグ（複数可）
またはプロテアーゼにはそうではない条件下で吸着させることと、ＸＴＥＮを溶離するこ
とと、ＸＴＥＮを回収することと、によってさらに処置される。得られた組成物中のＸＴ
ＥＮの個別の分子の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、または９５％
は、同一配列長を有する。前述の組成物の一実施形態において、切断配列（複数可）は、
表９のプロテアーゼからなる群から選択されるプロテアーゼによって切断されることがで
きる。前述の組成物の別の実施形態において、切断配列（複数可）は、トリプシンによっ
て切断されることができ、プロテアーゼは、トリプシンである。前述の組成物の別の実施
形態において、クロマトグラフィー基質は、アニオン交換である。アニオン交換基質は、
ｍａｃｒｏｃａｐ Ｑ、ｃａｐｔｏ Ｑ、ｓｕｐｅｒＱ−６５０Ｍ、およびｐｏｒｏｓ
Ｄからなる群から選択される基質であり得る。代替として、１つの親和性タグまたは２つ
の親和性タグを含む前述の組成物は、組成物を、切断配列（複数可）を切断するのに有効
な条件下で処置し、それによりＸＴＥＮを１つまたは２つの親和性タグから遊離させるこ
とと、プロテアーゼを、クロマトグラフィー基質の上に、プロテアーゼおよび親和性タグ
を捕捉するのには有効であるが、ＸＴＥＮにはそうではない条件下で吸着させることと、
ＸＴＥＮを溶離液から回収することと、によってさらに処置される。いくつかの実施形態
において、得られた溶離液のＸＴＥＮの個別の分子の少なくとも９０％、９１％、９２％
、９３％、９４％、または９５％は、同一配列長を有する。前述の組成物の一実施形態に
おいて、切断配列（複数可）は、表９のプロテアーゼからなる群から選択されるプロテア
ーゼによって切断されることができる。前述の組成物の別の実施形態において、切断配列
（複数可）は、トリプシンによって切断されることができ、利用されるプロテアーゼは、
トリプシンである。クロマトグラフィー基質は、カチオン交換、ＨＩＣ、またはＩＭＡＣ
のうちの１つ以上から選択することができる。
別の態様において、本発明は、部分的に、等しい長さおよび配列のＸＴＥＮセグメント
に切断され得るポリペプチド組成物に関する。一実施形態において、本発明は、ＸＴＥＮ
配列を含む組成物を提供し、このＸＴＥＮ配列は、トリプシンによって切断されことがで
きる１つ以上の切断配列をさらに含み、切断配列の全てを切断するのに有効な条件下で、
トリプシンを用いた処置が、ＸＴＥＮフラグメントの調製物をもたらし、各ＸＴＥＮフラ
グメントが、調製物中のあらゆる他のフラグメントに対して少なくとも約９９％の配列同
一性を有する。組成物の一実施形態において、切断配列は、配列ＳＡＳＲＳＡまたはＳＡ
ＳＫＳＡに対して少なくとも８６％の配列同一性を有するか、または同一である。組成物
の別の実施形態において、切断配列は、配列ＲＸまたはＫＸを含み、式中、Ｘは、プロリ
ン以外の任意のＬアミノ酸である。前述の組成物の一実施形態において、ＸＴＥＮ組成物
は、表６に記載される配列の群から選択される配列に対して少なくとも約９０％、９１％
、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％
の配列同一性を有する。
別の態様において、本発明は、部分的に、実質的に等しい長さおよび配列のＸＴＥＮフ
ラグメントを産生するための方法に関する。一実施形態において、本発明は、ＸＴＥＮの
実質的に均質な集団を産生する方法を提供し、この方法は、表６に記載される配列の群か
ら選択される配列を含むポリペプチドの集団を、実質的に均質なＸＴＥＮ集団をもたらす
切断配列（複数可）の全てを切断するのに有効な条件下で、トリプシンで処置することを
含み、ＸＴＥＮフラグメントの個別の分子の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％
、９４％、または９５％は、同一配列長を有する。前述の方法の一実施形態において、こ
の方法は、ＸＴＥＮフラグメントを、クロマトグラフィー基質の上に、ＸＴＥＮフラグメ
ントを捕捉するのには有効であるが、プロテアーゼにはそうではない条件下で吸着させる
ことと、ＸＴＥＮフラグメントを溶離することと、ＸＴＥＮフラグメントを回収すること
と、をさらに含み、集団の個別の分子の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９
４％、または９５％は、同一配列長を有する。前述の方法の一実施形態において、クロマ
トグラフィー基質は、アニオン交換である。基質は、ｍａｃｒｏｃａｐ Ｑ、ｃａｐｔｏ
Ｑ、ｓｕｐｅｒＱ−６５０Ｍ、およびｐｏｒｏｓ Ｄからなる群から選択することがで
きる。前述の方法の別の実施形態において、ＸＴＥＮは、表６に記載される配列の群から
選択される配列に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％
、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。前述の方法の別の実施
形態において、得られたＸＴＥＮフラグメントは、表２または３に記載される配列の群か
ら選択される配列に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５
％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。別の実施形態におい
て、本発明は、前述の方法実施形態のプロセスによって製造されるＸＴＥＮ組成物を提供
する。
別の態様において、本発明は、部分的に、ＸＴＥＮを高い発現収率で宿主細胞から産生
するための方法に関する。いくつかの実施形態において、本発明は、ＸＴＥＮ配列と、ヘ
ルパー配列とを含むポリペプチドをコードするベクターを含む宿主細胞を、発酵反応にお
いて、粗発現産物の成分としてポリペプチドを発現するのに有効な条件下で、約２グラム
／リットル（ｇ／Ｌ）、または約３ｇ／Ｌ、または約４ｇ／Ｌ、または約５ｇ／Ｌ、また
は約６ｇ／Ｌ、または約７ｇ／Ｌを超えるポリペプチドの濃度で培養することを含む、方
法を提供する。前述の方法の一実施形態において、前述の発現収率は、発酵反応が、６０
０ｎｍの波長で少なくとも１００、または少なくとも１３０、または少なくとも１５０の
光学密度に到達するときに達成される。別の実施形態において、本発明は、ＸＴＥＮと、
ヘルパー配列とを含むポリペプチドをコードするベクターを含む宿主細胞を、発酵反応に
おいて、粗発現産物の成分としてポリペプチドを発現するのに有効な条件下で、約１０ミ
リグラム／グラムを超える乾燥重量宿主細胞（ｍｇ／ｇ）濃度、または少なくとも約１５
ｍｇ／ｇ、もしくは少なくとも約２０ｍｇ／ｇ、もしくは少なくとも約２５ｍｇ／ｇ、も
しくは少なくとも約３０ｍｇ／ｇ、もしくは少なくとも約４０ｍｇ／ｇ、もしくは少なく
とも約５０ｍｇ／ｇのポリペプチドの濃度で培養することを含む、方法を提供する。前述
の方法の一実施形態において、前述の高収率の発現は、発酵反応が、６００ｎｍの波長で
少なくとも１００、または少なくとも１３０、または少なくとも１５０の光学密度に到達
するときに達成される。別の実施形態において、本発明は、ＸＴＥＮ配列と、ヘルパー配
列とを含むポリペプチドをコードするベクターを含む宿主細胞を、発酵反応において、粗
発現産物の成分としてポリペプチドを発現するのに有効な条件下で、約１０ミリグラム／
グラムを超える乾燥重量宿主細胞（ｍｇ／ｇ）濃度、または少なくとも約２５０マイクロ
モル／Ｌ、もしくは約３００マイクロモル／Ｌ、もしくは約３５０マイクロモル／Ｌ、も
しくは約４００マイクロモル／Ｌ、もしくは約４５０マイクロモル／Ｌ、もしくは約５０
０マイクロモル／Ｌのポリペプチドの濃度で培養することを含む、方法を提供する。前述
の方法の一実施形態において、前述の発現収率は、発酵反応が、６００ｎｍの波長で少な
くとも１００、または少なくとも１３０、または少なくとも１５０の光学密度に到達する
ときに達成される。前述の方法の一実施形態において、発現されたポリペプチドのヘルパ
ー配列は、ポリペプチドのＮ末端に存在し、このヘルパー配列は、表１０に記載される配
列からなる群から選択される配列に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％
、９４％、または９５％の配列同一性を有するか、または同一である。前述の方法の別の
実施形態において、発現ベクターは、第１の親和性タグ、およびその親和性タグとＸＴＥ
Ｎとの間の切断配列をさらにコードし、この方法は、宿主細胞発酵反応混合物の粗発現産
物を回収することと、粗発現産物のポリペプチドを、第１のクロマトグラフィー基質の上
に、ポリペプチドの第１の親和性タグをクロマトグラフィー基質の上に捕捉するのに有効
な条件下で吸着させることであって、第１のクロマトグラフィー基質が、ＨＩＣ、カチオ
ン交換、アニオン交換、およびＩＭＡＣからなる群から選択される、吸着させることと、
ポリペプチドを溶離および回収することと、をさらに含み、ポリペプチドの少なくとも９
０％、９１％、９２％、９３％、９４％、または９５％は、同一配列長を有する。前述の
方法の別の実施形態において、発現ベクターは、第１の親和性タグ、およびその第１のタ
グとは異なる第２の親和性タグ、ならびに各親和性タグとＸＴＥＮとの間の切断配列をさ
らにコードし、この方法は、宿主細胞発酵反応混合物の粗発現産物を回収することと、ポ
リペプチドを、第１のクロマトグラフィー基質の上に、そのペプチドの第１の親和性タグ
をクロマトグラフィー基質の上に捕捉するのに有効な条件下で吸着させることであって、
第１のクロマトグラフィー基質が、ＨＩＣ、カチオン交換、アニオン交換、およびＩＭＡ
Ｃからなる群から選択される、吸着させることと、ポリペプチドを溶離することと、ポリ
ペプチドを、第２のクロマトグラフィー基質の上に、そのポリペプチドの第２の親和性タ
グをクロマトグラフィー基質の上に捕捉するのに有効な条件下で吸着させることであって
、第２のクロマトグラフィー基質が、ＨＩＣ、カチオン交換、アニオン交換、およびＩＭ
ＡＣからなる群から選択される、吸着させることと、ポリペプチドを溶離することと、ポ
リペプチドを回収することと、をさらに含み、ポリペプチドの少なくとも９０％、９１％
、９２％、９３％、９４％、または９５％は、同一配列長を有する。前述の方法の一実施
形態において、この方法は、ポリペプチドを、切断配列（複数可）を切断するのに有効な
条件下で、プロテアーゼで処置し、それによりＸＴＥＮをポリペプチドから遊離させるこ
とと、ＸＴＥＮを、アニオンクロマトグラフィー基質の上に、ＸＴＥＮを捕捉するのに有
効な条件下で吸着させることと、ＸＴＥＮを溶離することと、ＸＴＥＮを回収することと
、をさらに含み、個別のＸＴＥＮ分子の少なくとも９０％、または少なくとも９１％、ま
たは少なくとも９２％、または少なくとも９３％、または少なくとも９４％、または９５
％は、同一配列長を有する。前述の方法において、アニオン交換基質は、ｍａｃｒｏｃａ
ｐ Ｑ、ｃａｐｔｏ Ｑ、ｓｕｐｅｒＱ−６５０Ｍ、およびｐｏｒｏｓ Ｄからなる群か
ら選択することができる。 前述の方法の一実施形態において、切断配列は、トリプシン
によって切断されることができ、プロテアーゼは、トリプシンである。 前述の方法の別
の実施形態において、この方法は、ポリペプチドを 、切断配列（複数可）を切断するの
に有効な条件下で、プロテアーゼで処置し、それによりＸＴＥＮをポリペプチドから遊離
させることと、プロテアーゼを、クロマトグラフィー基質の上に、プロテアーゼおよび親
和性タグを捕捉するのには有効であるが、ＸＴＥＮにはそうではない条件下で吸着させる
ことと、溶離液中のＸＴＥＮを回収することと、をさらに含み、ＸＴＥＮの少なくとも９
０％、９１％、９２％、９３％、９４％、または９５％は、同一配列長を有する。前述の
方法の一実施形態において、切断配列は、トリプシンによって切断されることができ、利
用されるプロテアーゼは、トリプシンである。プロテアーゼおよび親和性タグを捕捉する
ための前述の方法において、クロマトグラフィー基質は、ＨＩＣ、カチオン交換、および
ＩＭＡＣのうちの１つ以上から選択することができる。
別の態様において、本発明は、部分的に、上に固定化された実質的に同一のＸＴＥＮポ
リペプチド分子の集団を含む固体支持体に関する。一実施形態において、本発明は、上に
固定化された実質的に同一のポリペプチド分子の集団を含む固体支持体を提供し、この固
体支持体は、クロマトグラフィー基質と、固定化ポリペプチド（それぞれが、ＸＴＥＮと
、第１の親和性タグと、第２の親和性タグと、を含む）とを含み、第１の親和性タグは、
ＸＴＥＮのＮ末端で切断配列によってＸＴＥＮに接合され、第２の親和性タグは、Ｃ末端
における切断配列によってＸＴＥＮに接合され、第２の親和性タグは、第１の親和性タグ
とは異なり、クロマトグラフィー基質は、双方にではないが、第１または第２の親和性タ
グのいずれかに結合することができ、固定化ポリペプチド分子の少なくとも９０％、９１
％、９２％、９３％、９４％、または９５％が、同一配列長を有する。 表２、表３、表
４、および表２２〜２５に記載される配列からなる群から選択される配列に対して少なく
とも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくと
も約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも
約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約
９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含むＸＴＥＮの一実施形態において
、第１および第２の親和性タグは、それぞれ、独立して、表７に記載される配列からなる
群から選択される配列に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、
または少なくとも約９５％の配列同一性を有し、切断配列は、表８および表９に記載され
る配列からなる群から選択される。前述の一実施形態において、切断配列は、配列ＳＡＳ
ＲＳＡまたはＳＡＳＫＳＡに対して少なくとも約８６％の配列同一性を有するか、または
同一である。前述の一実施形態において、切断配列は、配列ＲＸまたはＫＸを含み、式中
、Ｘは、プロリン以外の任意のＬアミノ酸である。前述の一実施形態において、固体支持
体が、ＨＩＣクロマトグラフィー樹脂、カチオン交換樹脂、アニオン交換クロマトグラフ
ィー樹脂、およびＩＭＡＣクロマトグラフィー樹脂からなる群から選択される。前述の一
実施形態において、第１の親和性タグは、配列ＲＰＲＰＲＰＲＰＲＰＲＰＲまたはＲＰＲ
ＰＲＰＲＰＲＰＲＰＲＰＲＰＲＰＲＰＲＰＲを含み、第２の親和性タグは、配列ＨＨＨＨ
ＨＨまたはＨＨＨＨＨＨＨＨを含む。前述の別の実施形態において、第１の親和性タグは
、配列ＨＨＨＨＨＨまたはＨＨＨＨＨＨＨＨを含み、第２の親和性タグは、配列ＲＰＲＰ
ＲＰＲＰＲＰＲＰＲまたはＲＰＲＰＲＰＲＰＲＰＲＰＲＰＲＰＲＰＲＰＲＰＲを含む。
別の態様において、本発明は、部分的に、架橋剤に共役されたＸＴＥＮの組成物に関す
る。いくつかの実施形態において、本発明は、少なくとも第１の架橋剤の１つ以上の分子
に共有結合される、本明細書に記載されるＸＴＥＮのいずれかの組成物を提供し、架橋剤
は、表１３に記載される架橋剤、表１５に記載されるアルキン反応物、および表１５に記
載されるアジド反応物からなる群から選択される。共役組成物の一実施形態において、第
１の架橋剤は、ＸＴＥＮのＮ末端アミノ酸残基のαアミノ基、ＸＴＥＮの各リジン残基の
εアミノ基、およびＸＴＥＮの各システイン残基のチオール基からなる群から選択される
場所において、少なくとも第１のＸＴＥＮに共役される。所望される場合、この実施形態
におけるＸＴＥＮは、表２および表３に記載される配列の群から選択される配列に対して
少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少
なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少な
くとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なく
とも約９９％、または１００％の配列同一性を有する。共役組成物の別の実施形態におい
て、ＸＴＥＮは、ＡＥ１４４、ＡＥ２８８、ＡＥ４３２、ＡＥ５７６、ＡＥ８６４、セグ
メント１７４、セグメント１７５、セグメント１７６、セグメント１７７、セグメント１
８６、セグメント１８７、セグメント１８８、セグメント１８９、セグメント１９０、セ
グメント１９１、セグメント１９２、セグメント１９３、セグメント１９４、セグメント
１９５、セグメント１９６、セグメント１９７、セグメント１９８、およびセグメント１
９９からなる群から選択され、架橋剤は、ＸＴＥＮのＮ末端アミノ酸のαアミノ基に共役
される。共役組成物の別の実施形態において、ＸＴＥＮは、表３に記載されるセグメント
１７４、セグメント１７５、セグメント１７６、セグメント１７７、セグメント１８６、
セグメント１８７、セグメント１８８、セグメント１８９、セグメント１９０、セグメン
ト１９１、セグメント１９２、セグメント１９３、セグメント１９４、セグメント１９５
、セグメント１９６、セグメント１９７、セグメント１９８、およびセグメント１９９か
らなる群から選択され、架橋剤は、ＸＴＥＮの各システイン残基のチオール基に共役され
る。共役組成物の別の実施形態において、第１の架橋剤は、Ｎ−マレイミド、ヨードアセ
チル、ピリジルジスルフィドおよびビニルスルホン、３−プロパルギルオキシプロパン酸
、（オキシエチル）ｎ−アセチレン（ｎは１〜１０）、ジベンジルシクロオクチン（ＤＢ
ＣＯ）、シクロオクチン（ＣＯＴ）、３−アジド−プロピオン酸、６−アジド−ヘキサン
酸、および（オキシエチル）ｎ−アジド（ｎは１〜１０）からなる群から選択される。こ
のパラグラフの前述の実施形態において、共役体は、式ＩＶ：
の構成を有し、式中、独立して、各発生に対し、ＣＬ１は、架橋剤であり、ｘは、１〜約
１００、または１〜約５０、または１〜約４０、または１〜約２０、または１〜約１０、
または１〜約５の整数であるか、または９であるか、または３であるか、または２である
か、または１である。所望される場合、この実施形態におけるＸＴＥＮは、表２および３
に記載される配列の群から選択される配列に対して少なくとも約８０％、または少なくと
も約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも
約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約
９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９
９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。式ＩＶの共役体の一実施形態に
おいて、ＣＬ１は、表１３から選択される架橋剤である。ＸＴＥＮ−架橋剤共役組成物の
他の実施形態において、組成物は、各第１の架橋剤に共役された第１のペイロードの単一
原子残基をさらに含み、残基は、炭素、窒素、酸素、および硫黄からなる群から選択され
る。前述の一実施形態において、単一原子残基の第１のペイロードは、表１１、１２、１
８、および２１に記載されるペイロードからなる群から選択することができる。ＸＴＥＮ
−架橋剤共役組成物の他の実施形態において、組成物は、各第１の架橋剤に共役された表
１１および１２に記載されるペイロードからなる群から選択されるペイロードをさらに含
む。
ＸＴＥＮ−架橋剤共役組成物の他の実施形態において、本発明は、第１の架橋剤の１つ
以上の分子および第２の架橋剤の１つ以上の分子に共有結合された本明細書に記載される
実施形態のＸＴＥＮの組成物を提供し、第１の架橋剤は、ＸＴＥＮの各システイン残基の
チオール基、またはＸＴＥＮの各リジン残基のεアミノ基のいずれかに共役され、第２の
架橋剤は、ＸＴＥＮのＮ末端アミノ酸のαアミノ基に共役され、各架橋剤は、独立して、
表１３に記載される架橋剤、表１５のアルキン反応物、および表１５のアジド反応物から
なる群から選択される。前述の実施形態において、組成物は、式Ｖ：
の構成を有し、式中、独立して、各発生に対し、ＣＬ１は、ＸＴＥＮのシステイン残基に
共役された第１の架橋剤であり、ＣＬ２は、Ｎ末端においてＸＴＥＮに共役された第２の
架橋剤であり、ｘは、１〜約１０の整数であり、ｙは、整数１であるが、但し、ｘ＋ｙ＞
２を条件とし、ＸＴＥＮは、ｘ個のシステイン残基を含むシステイン操作されたＸＴＥＮ
、またはｘ個のリジン残基を含むリジン操作されたＸＴＥＮのいずれかである。ＸＴＥＮ
−架橋剤共役組成物の別の実施形態において、組成物は、第１の架橋剤のそれぞれに共役
された第１のペイロードの単一原子残基であって、炭素、窒素、酸素、および硫黄からな
る群から選択される残基と、第２の架橋剤のそれぞれに共役された第２のペイロードの単
一原子残基であって、炭素、窒素、酸素、および硫黄からなる群から選択される残基と、
をさらに含む。前述の一実施形態において、単一原子残基の第１のペイロードは、表１１
、１２、１８、および２１に記載されるペイロードからなる群から選択することができ、
単一原子残基の第２のペイロードは、独立して、表１１、１２、１８、および２１に記載
されるペイロードからなる群から選択することができる。ＸＴＥＮ−架橋剤−ペイロード
残基組成物のいくつかの実施形態において、組成物は、式ＶＩ：
の構成を有し、式中、独立して、各発生に対し、ＰＲ１は、ペイロードの単一原子残基で
あり、残基は、炭素、窒素、酸素、および硫黄からなる群から選択され、ＣＬ１は、架橋
剤であり、ｘは、１〜約１００、または１〜約５０、または１〜約４０、または１〜約２
０、または１〜約１０、または１〜約５の整数であるか、または３であるか、または２で
あるか、または１である。所望される場合、この実施形態におけるＸＴＥＮは、表２およ
び３に記載される配列の群から選択される配列に対して少なくとも約８０％、または少な
くとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なく
とも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくと
も約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも
約９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。式ＶＩの共役体の一実施形
態において、ペイロードの単一原子残基は、表１１、１２、１８、１９、および２１に記
載されるペイロードからなる群から選択されるペイロードに由来する。式ＶＩの共役体の
一実施形態において、ＣＬ１は、表１３から選択される架橋剤である。式ＶＩの共役体の
一実施形態において、各架橋剤は、ＸＴＥＮのシステイン硫黄に結合される。式ＶＩの共
役体の別の実施形態において、各架橋剤は、ＸＴＥＮのリジンεアミノ基に結合される。
式ＶＩの共役体の別の実施形態において、ｘは１であり、架橋剤は、ＸＴＥＮのＮ末端ア
ミノ基に結合される。式ＶＩの共役体の別の実施形態において、ＣＬ１は、表１５から選
択される第１および第２のクリック化学反応物の反応産物である。別の実施形態において
、本発明は、式ＶＩの共役体の調製物を提供し、この共役体の調製物のＸＴＥＮ分子の少
なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少な
くとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なく
とも約９５％は、同一配列長を有する。ＸＴＥＮ−架橋剤共役組成物の他の実施形態にお
いて、組成物は、第１の架橋剤のそれぞれに共役された第１のペイロードであって、表１
１、１２、１８、および２１に記載されるペイロードからなる群から選択されるペイロー
ドと、第２の架橋剤に共役された第１のペイロードとは異なる第２のペイロードであって
、表１１、１２、１８、および２１に記載されるペイロードからなる群から選択される第
２のペイロードと、をさらに含む。ＸＴＥＮ−架橋剤−ペイロード共役組成物の一実施形
態において、組成物は、第１の架橋剤のそれぞれに共役された第１のペイロードであって
、表２１の薬物部分からなる群から選択されるペイロードと、第２の架橋剤に共役された
第１のペイロードとは異なる第２のペイロードであって、表２１の標的部分からなる群か
ら選択される第２のペイロードと、を含む。第１および第２のペイロードを持つＸＴＥＮ
−架橋剤−ペイロード共役組成物の一実施形態において、単一の第２のペイロードは、表
１５の反応物からなる群から選択されるアルキン反応物とアジド反応物との反応によって
共役された第２の架橋剤によって、ＸＴＥＮのＮ末端に結合される。ＸＴＥＮ−架橋剤−
ペイロード組成物のいくつかの実施形態において、組成物は、式ＶＩＩ：
の構成を有し、式中、独立して、各発生に対し、Ｐ１は、表１１、１２、１８、１９、お
よび２１に記載されるペイロードからなる群から選択されるペイロードであり、ＣＬ１は
、架橋剤であり、ｘは、１〜約１００、または１〜約５０、または１〜約４０、または１
〜約２０、または１〜約１０、または１〜約５の整数であるか、または９であるか、また
は３であるか、または２であるか、または１であり、ＸＴＥＮは、表２および３に記載さ
れる配列の群から選択される配列に対して少なくとも約８０％、または少なくとも約９０
％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％
、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、
または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％、ま
たは１００％の配列同一性を有する配列である。式ＶＩＩの共役体の一実施形態において
、ＣＬ１は、表１３から選択される架橋剤である。式ＶＩＩの共役体の一実施形態におい
て、各架橋剤は、ＸＴＥＮのシステイン硫黄に結合される。式ＶＩＩの共役体の別の実施
形態において、各架橋剤は、ＸＴＥＮのリジンεアミノ基に結合される。式ＶＩＩの共役
体の別の実施形態において、ｘは１であり、架橋剤は、ＸＴＥＮのＮ末端アミノ基に結合
される。一実施形態において、式ＶＩＩの共役体は、表２１に記載される共役体からなる
群から選択される。式ＶＩＩの共役体の別の実施形態において、ＣＬ１は、表１５から選
択される第１および第２のクリック化学反応物の反応産物である。特定の成分を使用して
ＸＴＥＮ−架橋剤に共役されたペイロードを含む前述の実施形態の組成物が、反応物の反
応産物を表し、したがって反応物の精密な組成物とは異なることは、当業者によって理解
されるであろう。別の実施形態において、本発明は、式ＶＩＩの共役体の調製物を提供し
、この共役体の調製物のＸＴＥＮ分子の少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％
、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、
または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％は、同一配列長を有する。
別の態様において、本発明は、部分的に、互いに共役された第１および第２のＸＴＥＮ
の組成物に関する。いくつかの実施形態において、共役組成物は、第１および第２のＸＴ
ＥＮを含み、ＸＴＥＮは同じであるか、または異なり、それぞれ、独立して、表３に記載
される配列の群から選択される配列に対して少なくとも約９０％、または少なくとも約９
１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４
％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％
、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％、または１００％の配列同一性
を有し、第１および第２のＸＴＥＮは、この第１および第２のＸＴＥＮのＮ末端によって
、表１５の反応物からなる群から選択されるアルキン反応物とアジド反応物との反応によ
って形成された架橋剤を用いて互いに共役され、二量体ＸＴＥＮ共役体をもたらす。二量
体ＸＴＥＮ組成物の一実施形態において、第１のＸＴＥＮのそれぞれの個別の分子の少な
くとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、または９５％が、同一配列長を有し、
第２のＸＴＥＮのそれぞれの個別の分子の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、
９４％、または９５％が、同一配列長を有する。二量体ＸＴＥＮ共役体の一実施形態にお
いて、第１のＸＴＥＮは、表３に記載されるセグメント１７４、セグメント１７５、セグ
メント１７６、セグメント１７７、セグメント１８６、セグメント１８７、セグメント１
８８、セグメント１８９、セグメント１９０、セグメント１９１、セグメント１９２、セ
グメント１９３、セグメント１９４、セグメント１９５、セグメント１９６、セグメント
１９７、セグメント１９８、およびセグメント１９９からなる配列の群から選択される配
列に対して少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％
、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、
または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、ま
たは少なくとも約９９％、または１００％の配列同一性を有し、第２のＸＴＥＮは、表３
に記載されるセグメント１７４、セグメント１７５、セグメント１７６、セグメント１７
７、セグメント１８６、セグメント１８７、セグメント１８８、セグメント１８９、セグ
メント１９０、セグメント１９１、セグメント１９２、セグメント１９３、セグメント１
９４、セグメント１９５、セグメント１９６、セグメント１９７、セグメント１９８、お
よびセグメント１９９からなる配列の群から選択される異なる配列に対して少なくとも約
９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９
３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６
％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％
、または１００％の配列同一性を有する。二量体ＸＴＥＮ共役体の別の実施形態において
、第１のＸＴＥＮおよび第２のＸＴＥＮは、同じであり、それぞれが、表３に記載される
配列の群から選択される配列に対して少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、
または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、ま
たは少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、また
は少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％、または１００％の配列同一性を有す
る。二量体ＸＴＥＮ共役体の別の実施形態において、第１のＸＴＥＮおよび第２のＸＴＥ
Ｎは、同じであり、それぞれが、表３に記載されるセグメント１７４、セグメント１７５
、セグメント１７６、セグメント１７７、セグメント１８６、セグメント１８７、セグメ
ント１８８、セグメント１８９、セグメント１９０、セグメント１９１、セグメント１９
２、セグメント１９３、セグメント１９４、セグメント１９５、セグメント１９６、セグ
メント１９７、セグメント１９８、およびセグメント１９９からなる配列の群から選択さ
れる配列に対して少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約
９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９
５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８
％、または少なくとも約９９％、または１００％の配列同一性を有する。二量体ＸＴＥＮ
共役体の別の実施形態において、第１および第２のＸＴＥＮは、それぞれ、１つ以上のシ
ステイン残基を含み、第１のＸＴＥＮの各システイン残基に共役された第１の架橋剤と、
第２のＸＴＥＮの各システイン残基に共役された第２の架橋剤と、をさらに含み、第１お
よび第２の架橋剤は、独立して、表１３に記載される架橋剤からなる群から選択される。
二量体ＸＴＥＮ共役体の別の実施形態において、第１および第２のＸＴＥＮは、それぞれ
、１つ以上のリジン残基を含み、共役体の第１および第２のＸＴＥＮの各リジン残基に共
役された架橋剤をさらに含み、この架橋剤は、表１３に記載される架橋剤からなる群から
選択される。架橋剤に共役された二量体ＸＴＥＮの別の実施形態において、共役体は、第
１のＸＴＥＮの各架橋剤に共役された第１のペイロードの単一原子残基をさらに含み、こ
の残基は、炭素、窒素、酸素、および硫黄からなる群から選択され、および第２のＸＴＥ
Ｎの各架橋剤に共役された第２のペイロードの単一原子残基をさらに含み、この残基は、
炭素、窒素、酸素、および硫黄からなる群から選択される。前述の実施形態において、単
一原子残基の第１のペイロードは、表１１、１２、１８、および２１に記載されるペイロ
ードからなる群から選択することができ、単一原子残基の第２のペイロードは、第１のペ
イロードとは異なるペイロードであり、表１１、１２、１８、および２１に記載されるペ
イロードからなる群から選択することができる。二量体ＸＴＥＮ−架橋剤−ペイロード残
基組成物のいくつかの実施形態において、組成物は、式Ｘ
の構成を有し、式中、独立して、各発生に対し、ＰＲ１は、第１のペイロードの単一原子
残基であり、この残基は、炭素、窒素、酸素、および硫黄からなる群から選択され、ＰＲ
２は、第２のペイロードの単一原子残基であり、この残基は、炭素、窒素、酸素、および
硫黄からなる群から選択され、ＣＬ１は、架橋剤であり、ｘは、１〜約１００、または１
〜約５０、または１〜約４０、または１〜約２０、または１〜約１０、または１〜約５の
整数であるか、または９であるか、または３であるか、または２であるか、または１であ
り、ＣＬ２は、ＣＬ１とは異なる架橋剤であり、ｙは、１〜約１００、または１〜約５０
、または１〜約４０、または１〜約２０、または１〜約１０、または１〜約５の整数であ
るか、または９であるか、または３であるか、または２であるか、または１であるが、但
し、ｘ＋ｙ＞２を条件とし、２ｘＣＬは、代替として、二価架橋剤または表１５から選択
される第１および第２のクリック化学反応物の反応産物であり、ＸＴＥＮ１は、表２およ
び３に記載される配列の群から選択される配列に対して少なくとも８０％、または少なく
とも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくと
も約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも
約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約
９９％、または１００％の配列同一性を有するポリペプチドであり、ＸＴＥＮ２は、表２
および３に記載される配列の群から選択される配列に対して少なくとも８０％、または少
なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少な
くとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なく
とも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくと
も約９９％、または１００％の配列同一性を有するポリペプチドである。式Ｘの共役体の
一実施形態において、ＣＬ１およびＣＬ２は、それぞれ、表１３に記載される架橋剤の群
から選択される。式Ｘの共役体の別の実施形態において、ｘは１であり、ＣＬ１は、ＸＴ
ＥＮのＮ末端アミノ基に結合される。式Ｘの共役体の別の実施形態において、ＣＬ１は、
表１５から選択される第１および第２のクリック化学反応物の反応産物である。式Ｘの共
役体の別の実施形態において、Ｃ２は、表１５から選択される第１のアジドおよび第２の
アルキンクリック化学反応物の反応産物である。式Ｘの共役体の別の実施形態において、
各ＣＬ１は、ＸＴＥＮ１のシステイン硫黄に結合され、各ＣＬ２は、ＸＴＥＮ２のシステ
イン硫黄に結合される。式Ｘの共役体の別の実施形態において、各ＣＬ１は、ＸＴＥＮ１
のリジンεアミノ基に結合され、各ＣＬ２は、ＸＴＥＮ２のリジンεアミノ基に結合され
る。式Ｘの共役体の別の実施形態において、各ＣＬ１は、ＸＴＥＮ１のシステイン硫黄に
結合され、各ＣＬ２は、ＸＴＥＮ２のリジンεアミノ基に結合される。式Ｘの共役体の別
の実施形態において、 ＸＴＥＮ１およびＸＴＥＮ２は、同一である。式Ｘの共役体の別
の実施形態において、 ＸＴＥＮ１およびＸＴＥＮ２は、異なる。別の実施形態において
、本発明は、式Ｘの共役体の調製物を提供し、この共役体の調製物のＸＴＥＮ分子の少な
くとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なく
とも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくと
も約９５％は、同一配列長を有する。 架橋剤に共役された二量体ＸＴＥＮの別の実施形
態において、組成物は、第１のＸＴＥＮの各架橋剤に共役された第１のペイロードをさら
に含み、この第１のペイロードは、表１１、１２、１８、および２１に記載されるペイロ
ードからなる群から選択され、第１のペイロードとは異なる第２のペイロードをさらに含
み、この第２のペイロードは、第２のＸＴＥＮの各架橋剤に共役され、第２のペイロード
は、表１１、１２、１８、および２１に記載されるペイロードからなる群から選択される
。架橋剤に共役された二量体ＸＴＥＮの別の実施形態において、組成物は、第１のＸＴＥ
Ｎの各架橋剤に共役された第１のペイロードをさらに含み、第１のペイロードは、表１８
または表２１に記載される標的部分からなる群から選択され、第１のペイロードとは異な
る第２のペイロードをさらに含み、この第２のペイロードは、第２のＸＴＥＮの各架橋剤
に共役され、第２のペイロードは、表１８または表２１に記載される毒素の群から選択さ
れる。架橋剤に共役された二量体ＸＴＥＮ、ならびに第１および第２のペイロードの別の
実施形態において、第１のＸＴＥＮは、表３に記載されるセグメント１７６であり、第２
のＸＴＥＮは、表３に記載されるセグメント１７６およびセグメント１７７からなる群か
ら選択される。二量体ＸＴＥＮ−架橋剤−ペイロード組成物のいくつかの実施形態におい
て、組成物は、式ＸＩ
の構成を有し、式中、独立して、各発生に対し、Ｐ１は、表１１、１２、１８、１９、お
よび２１に記載されるペイロードの群から選択される第１のペイロードであり、Ｐ２は、
表１１、１２、１８、１９、および２１に記載されるペイロードの群から選択され、Ｐ１
とは異なる第２のペイロードであり、ＣＬ１は、架橋剤であり、ｘは、１〜約１００、ま
たは１〜約５０、または１〜約４０、または１〜約２０、または１〜約１０、または１〜
約５の整数であるか、または９であるか、または３であるか、または２であるか、または
１であり、ＣＬ２は、ＣＬ１とは異なる架橋剤であり、ｙは、１〜約１００、または１〜
約５０、または１〜約４０、または１〜約２０、または１〜約１０、または１〜約５の整
数であるか、または９であるか、または３であるか、または２であるか、または１である
が、但し、ｘ＋ｙ＞２を条件とし、２ｘＣＬは、代替として、二価架橋剤、または表１５
から選択される第１および第２のクリック化学反応物の反応産物であり、ＸＴＥＮ１は、
表２および３に記載される配列の群から選択される配列に対して少なくとも８０％、また
は少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または
少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少
なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少な
くとも約９９％、または１００％の配列同一性を有する第１の実質的に均質なＸＴＥＮで
あり、ＸＴＥＮ２は、表２および３に記載される配列の群から選択される配列に対して少
なくとも８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なく
とも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくと
も約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも
約９８％、または少なくとも約９９％、または１００％の配列同一性を有する第１の実質
的に均質なＸＴＥＮである。式ＸＩの共役体の一実施形態において、ＣＬ１およびＣＬ２
は、それぞれ、表１３に記載される架橋剤の群から選択される。式ＸＩの共役体の別の実
施形態において、ｘは１であり、ＣＬ１は、ＸＴＥＮのＮ末端アミノ基に結合される。式
ＸＩの共役体の別の実施形態において、ＣＬ１は、表１５から選択される第１および第２
のクリック化学反応物の反応産物である。式ＸＩの共役体の別の実施形態において、Ｃ２
は、表１５から選択される第１および第２のクリック化学反応物の反応産物である。式Ｘ
Ｉの共役体の別の実施形態において、各ＣＬ１は、ＸＴＥＮ１のシステイン硫黄に結合さ
れ、各ＣＬ２は、ＸＴＥＮ２のシステイン硫黄に結合される。式ＸＩの共役体の別の実施
形態において、各ＣＬ１は、ＸＴＥＮ１のリジンεアミノ基に結合され、各ＣＬ２は、Ｘ
ＴＥＮ２のリジンεアミノ基に結合される。式ＸＩの共役体の別の実施形態において、各
ＣＬ１は、ＸＴＥＮ１のシステイン硫黄に結合され、各ＣＬ２は、ＸＴＥＮ２のリジンε
アミノ基に結合される。式ＸＩの共役体の別の実施形態において、ＸＴＥＮ１およびＸＴ
ＥＮ２は、同一である。式ＸＩの共役体の別の実施形態において、ＸＴＥＮ１およびＸＴ
ＥＮ２は、異なる。一実施形態において、式ＸＩの共役体は、表２１に記載される共役体
からなる群から選択される。別の実施形態において、本発明は、式ＸＩの共役体の調製物
を提供し、この共役体の調製物のＸＴＥＮ１およびＸＴＥＮ２分子それぞれの少なくとも
約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約
９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９
５％は、同一配列長を有する。
別の態様において、本発明は、部分的に、互いに共役され、三量体共役組成物をもたら
す、第１および第２および第３のＸＴＥＮの組成物に関する。いくつかの実施形態におい
て、共役組成物は、第１および第２および第３のＸＴＥＮを含み、ＸＴＥＮは、同じであ
り得るか、または異なり得、第１および第２および第３のＸＴＥＮは、表１３または表１
４に記載される三価架橋剤からなる群から選択される三価架橋剤を使用して、Ｎ末端によ
って互いに共役される。三量体共役体の一実施形態において、第１および第２および第３
のＸＴＥＮは、同一であるか、または異なり、それぞれが、表２または表３のいずれかに
記載される配列の群から選択される配列に対して少なくとも約９０％、または少なくとも
約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約
９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９
７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％、または１００％の配列同
一性を有する。三量体共役体の別の実施形態において、第１および第２および第３のＸＴ
ＥＮは、同一であるか、または異なり、第１のＸＴＥＮのそれぞれの個別の分子の少なく
とも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、または９５％は、同一配列長を有し、第
２のＸＴＥＮのそれぞれの個別の分子の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９
４％、または９５％は、同一配列長を有し、第３のＸＴＥＮのそれぞれの個別の分子の少
なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、または９５％は、同一配列長を有す
る。三量体共役体の別の実施形態において、三価架橋剤は、トリス−（２−マレイミドエ
チル）アミン（ＴＭＥＡ）およびアミン反応性トリス−（スクシンイミジルアミノトリア
セテート（ＴＳＡＴ）からなる群から選択される。三量体共役体の別の実施形態において
、第１および第２および第３のＸＴＥＮは、同一であり、それぞれが、表３に記載される
セグメント１７４、セグメント１７５、セグメント１７６、セグメント１７７、セグメン
ト１８６、セグメント１８７、セグメント１８８、セグメント１８９、セグメント１９０
、セグメント１９１、セグメント１９２、セグメント１９３、セグメント１９４、セグメ
ント１９５、セグメント１９６、セグメント１９７、セグメント１９８、およびセグメン
ト１９９からなる群から選択される配列に対して少なくとも約９０％、または少なくとも
約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約
９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９
７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％、または１００％の配列同
一性を有する。三量体共役体の別の実施形態において、第１および第２および第３のＸＴ
ＥＮは、同一であり、それぞれが、表３に記載されるセグメント１７４、セグメント１７
５、セグメント１７６、セグメント１７７、セグメント１８６、セグメント１８７、セグ
メント１８８、セグメント１８９、セグメント１９０、セグメント１９１、セグメント１
９２、セグメント１９３、セグメント１９４、セグメント１９５、セグメント１９６、セ
グメント１９７、セグメント１９８、およびセグメント１９９からなる群から選択される
配列に対して少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２
％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％
、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、
または少なくとも約９９％、または１００％の配列同一性を有し、また第３のＸＴＥＮは
、第１および第２のＸＴＥＮとは異なり、表３に記載されるセグメント１７４、セグメン
ト１７５、セグメント１７６、セグメント１７７、セグメント１８６、セグメント１８７
、セグメント１８８、セグメント１８９、セグメント１９０、セグメント１９１、セグメ
ント１９２、セグメント１９３、セグメント１９４、セグメント１９５、セグメント１９
６、セグメント１９７、セグメント１９８、およびセグメント１９９からなる群から選択
される配列に対して少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも
約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約
９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９
８％、または少なくとも約９９％、または１００％の配列同一性を有する。三量体共役体
の別の実施形態において、各ＸＴＥＮは、少なくとも第１のシステイン残基を含み、共役
体は、第１のＸＴＥＮの各システイン残基に共役された第１の架橋剤と、第２のＸＴＥＮ
の各システイン残基に共役された第２の架橋剤と、第３のＸＴＥＮの各システイン残基に
共役された第３の架橋剤と、をさらに含み、この架橋剤は、表１３に記載される架橋剤か
らなる群から選択される。三量体共役体のいくつかの実施形態において、組成物は、式Ｘ
ＩＩ：
の構成を有し、式中、独立して、各発生に対し、３ｘＣＬは、三価架橋剤であり、ＣＬ１
は、ＸＴＥＮ１に共役された第１の架橋剤であり、ＣＬ２は、ＸＴＥＮ２に共役された第
２の架橋剤であり、ＣＬ３は、ＸＴＥＮ３に共役された第３の架橋剤であり、ｘは、１〜
約１０の整数であり、ｙは、１〜約１０の整数であり、ｚは、１〜約１０の整数であるが
、但し、ｘ＋ｙ＞３を条件とし、ＸＴＥＮ１は、第１のＸＴＥＮであり、ＸＴＥＮ２は、
第２のＸＴＥＮであり、ＸＴＥＮ３は、第３のＸＴＥＮである。三量体共役体の別の実施
形態において、共役体は、第１のＸＴＥＮの各第１の架橋剤に共役された第１のペイロー
ドの単一原子残基であって、炭素、窒素、酸素、および硫黄からなる群から選択される残
基と、第２のＸＴＥＮの各第２の架橋剤に共役された第２のペイロードの単一原子残基で
あって、炭素、窒素、酸素、および硫黄からなる群から選択される残基と、第３のＸＴＥ
Ｎの各第３の架橋剤に共役された第３のペイロードの単一原子残基であって、炭素、窒素
、酸素、および硫黄からなる群から選択される残基と、をさらに含む。三量体共役組成物
の別の実施形態において、組成物は、表１１、１２、１８、および２１に記載されるペイ
ロードからなる群から選択される第１のＸＴＥＮの各第１の架橋剤に共役された第１のペ
イロードと、表１１、１２、１８、および２１に記載されるペイロードからなる群から選
択される第２のＸＴＥＮの各第２の架橋剤に共役された第２のペイロードであって、第１
のペイロードと同じであるか、または異なるペイロードと、表１１、１２、１８、および
２１に記載されるペイロードからなる群から選択される第３のＸＴＥＮの各第３の架橋剤
に共役された第３のペイロードであって、第１または第２のペイロードと同じであるか、
または異なるペイロードと、をさらに含む。三量体ＸＴＥＮ−ペイロード共役組成物の一
実施形態において、第１のペイロードは、標的に対する特異的結合親和性を持つ標的部分
であり、この標的部分は、表１７〜１９および２１に記載される標的部分からなる群から
選択され、第２および第３のペイロードは、同じであり得るか、または異なり得る薬物で
あり、この薬物は、表１１、表１８、および表２１に記載される薬物からなる群から選択
される。第１のペイロードが、標的に対する特異的結合親和性を持つ標的部分であり、第
２のペイロードおよび第３のペイロードが、薬物である、三量体ＸＴＥＮ−ペイロード共
役組成物の一実施形態において、標的部分は、ＬＨＲＨおよび葉酸塩からなる群から選択
され、薬物は、ドキソルビシン、パクリタキセル、オーリスタチン、モノメチルオーリス
タチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルオーリスタチンＦ、メイタンシン、ドラスタチン、カ
リケアミシン、ビンカアルカロイド、カンプトテシン、ミトマイシンＣ、エポチロン、ｈ
ＴＮＦ、Ｉ１−１２、ボルテゾミブ、ランピルナーゼ、スードモナス、エキソトキシン、
ＳＮ−３８、およびラケルマイシンからなる群から選択される。第１のペイロードが、標
的に対する特異的結合親和性を持つ標的部分であり、第２のペイロードおよび第３のペイ
ロードが、薬物である三量体ＸＴＥＮ−ペイロード共役組成物の一実施形態において、標
的部分および薬物部分は、表２１に記載される共役体１〜２９０のいずれか１つに対応す
る。第１のペイロードが、標的に対する特異的結合親和性を持つ標的部分であり、第２の
ペイロードおよび第３のペイロードが、薬物である三量体ＸＴＥＮ−ペイロード共役組成
物の別の実施形態において、共役体は、表２１の共役体７１に対応するＸＴＥＮと、標的
部分と、薬物部分と、を有する。三量体ＸＴＥＮ−ペイロード共役組成物の別の実施形態
において、組成物は、式ＸＩＩＩ
の構成を有し、式中、独立して、各発生に対し、３ｘＣＬは、表１３および１４に記載さ
れる三価架橋剤の群から選択される三価架橋剤であり、Ｐ１は、第１のＸＴＥＮの各架橋
剤に共役され、表１１、１２、１８、および２１に記載されるペイロードからなる群から
選択され、Ｐ２は、第２のＸＴＥＮの各架橋剤に共役された第２のペイロードであり、表
１１、１２、１８、および２１に記載されるペイロードからなる群から選択され、このペ
イロードは、第１のペイロードと同じであるか、または異なり、Ｐ３は、第３のＸＴＥＮ
の各架橋剤に共役された第３のペイロードであり、表１１、１２、１８、および２１に記
載されるペイロードからなる群から選択され、このペイロードは、第１または第２のペイ
ロードと同じであるか、または異なり、ＣＬ１は、第１の架橋剤であり、ｘは、１〜約１
００、または１〜約５０、または１〜約４０、または１〜約２０、または１〜約１０、ま
たは１〜約５の整数であるか、または９であるか、または３であるか、または２であるか
、または１であり、ＣＬ２は、第２の架橋剤であり、ｙは、１〜約１００、または１〜約
５０、または１〜約４０、または１〜約２０、または１〜約１０、または１〜約５の整数
であるか、または９であるか、または３であるか、または２であるか、または１であり、
ｚは、１〜約１００、または１〜約５０、または１〜約４０、または１〜約２０、または
１〜約１０、または１〜約５の整数であるか、または９であるか、または３であるか、ま
たは２であるか、または１であるが、但し、ｘ＋ｙ＋ｚ＞３を条件とし、ＸＴＥＮ１は、
表２および３に記載される配列の群から選択される配列に対して少なくとも８０％、また
は少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または
少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少
なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少な
くとも約９９％、または１００％の配列同一性を有する第１のＸＴＥＮであり、 ＸＴＥ
Ｎ２は、表２および３に記載される配列の群から選択される配列に対して少なくとも８０
％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％
、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、
または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、ま
たは少なくとも約９９％、または１００％の配列同一性を有する第２のＸＴＥＮであり、
ＸＴＥＮ３は、表２および３に記載される配列の群から選択される配列に対して少なくと
も８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約
９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９
５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８
％、または少なくとも約９９％、または１００％の配列同一性を有する第３のＸＴＥＮで
あり、ＸＴＥＮ１、ＸＴＥＮ２、およびＸＴＥＮ３は、同じであるか、または異なるＸＴ
ＥＮ配列である。いくつかの実施形態において、式ＸＩＩＩの共役体は、第１のペイロー
ドをさらに含み、このペイロードは、標的に対する特異的結合親和性を持つ標的部分であ
り、この標的部分は、表１７〜１９および２１に記載される標的部分からなる群から選択
され、ペイロードの少なくとも他の１つは薬物であり、この薬物は、表１１、表１９、お
よび表２１に記載される薬物からなる群から選択される。前述の一実施形態において、標
的部分は、ＬＨＲＨまたは葉酸であり、薬物は、ドキソルビシン、パクリタキセル、オー
リスタチン、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルオーリスタチンＦ、
メイタンシン、ドラスタチン、カリケアミシン、ビンカアルカロイド、カンプトテシン、
ミトマイシンＣ、エポチロン、ｈＴＮＦ、Ｉ１−１２、ボルテゾミブ、ランピルナーゼ、
スードモナス、エキソトキシン、ＳＮ−３８、およびラケルマイシンからなる群から選択
される。三量体ＸＴＥＮ共役組成物の別の実施形態において、組成物は、式ＸＩＶ：
の構成を有し、式中、独立して、各発生に対し、３ｘＣＬは、三価架橋剤であり、ＣＬ１
は、ＸＴＥＮ１に共役された第１の架橋剤であり、ＣＬ２は、ＸＴＥＮ２に共役された第
２の架橋剤であり、ｘは、１〜約１０の整数であり、ｙは、１〜約１０の整数であるが、
但し、ｘ＋ｙ＞２を条件とし、ＸＴＥＮ１は、第１のＸＴＥＮであり、ＸＴＥＮ２は、第
２のＸＴＥＮであり、ＸＴＥＮ３は、第３のＸＴＥＮであり、ＸＴＥＮは、表２に記載さ
れる配列からなる群から選択される。式ＸＶＩの三量体ＸＴＥＮ共役組成物の一実施形態
において、組成物は、第１のＸＴＥＮの各第１の架橋剤に共役された第１のペイロードの
単一原子残基であって、炭素、窒素、酸素、および硫黄からなる群から選択される残基と
、第２のＸＴＥＮの各第２の架橋剤に共役された第２のペイロードの単一原子残基であっ
て、炭素、窒素、酸素、および硫黄からなる群から選択される残基と、をさらに含む。式
ＸＶＩの三量体ＸＴＥＮ共役組成物の別の実施形態において、組成物は、表１１、１２、
１８、および２１に記載されるペイロードからなる群から選択される第１のＸＴＥＮの各
第１の架橋剤に共役された第１のペイロードと、表１１、１２、１８、および２１に記載
されるペイロードからなる群から選択される第２のＸＴＥＮの各第２の架橋剤に共役され
た第２のペイロードであって、第１のペイロードと同じであるか、または異なるペイロー
ドと、をさらに含む。前述の一実施形態において、第１のペイロードは、標的に対する特
異的結合親和性を持つ標的部分であり、この標的部分は、表１７〜１９および２１に記載
される標的部分からなる群から選択され、第２のペイロードは、表６、表１８、および表
２１に記載される薬物からなる群から選択される薬物である。前述の別の実施形態におい
て、第１のペイロードは、ＬＨＲＨおよび葉酸塩からなる群から選択される標的部分であ
り、第２のペイロードは、ドキソルビシン、パクリタキセル、オーリスタチン、モノメチ
ルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルオーリスタチンＦ、メイタンシン、ドラス
タチン、カリケアミシン、ビンカアルカロイド、カンプトテシン、ミトマイシンＣ、エポ
チロン、ｈＴＮＦ、Ｉ１−１２、ボルテゾミブ、ランピルナーゼ、スードモナス、エキソ
トキシン、ＳＮ−３８、およびラケルマイシンからなる群から選択される薬物である。前
述の一実施形態において、第１のペイロードは、表１１の薬物および表１２のタンパク質
からなる群から選択される薬物であり、第２のペイロードは、第１のペイロードとは異な
り、表１１の薬物および表１２のタンパク質からなる群から選択される。前述の別の実施
形態において、第１のペイロードおよび前記第２のペイロードは、同一であり、表１１の
薬物および表１２のタンパク質からなる群から選択される。三量体ＸＴＥＮ共役組成物の
別の実施形態において、組成物は、式ＸＶ：
の構成を有し、式中、独立して、各発生に対し、３ｘＣＬは、ＸＴＥＮ１と、ＸＴＥＮ２
と、ＸＴＥＮ３とを結合する三価架橋剤であり、ＣＬ１は、ＸＴＥＮ１に共役された第１
の架橋剤であり、ｘは、１〜約１０の整数であり、ＸＴＥＮ１は、第１のＸＴＥＮであり
、ＸＴＥＮは、表３に記載される配列からなる群から選択され、ＸＴＥＮ２は、第２のＸ
ＴＥＮであり、ＸＴＥＮは、表２に記載される配列からなる群から選択され、ＸＴＥＮ３
は、第３のＸＴＥＮであり、ＸＴＥＮは、表２に記載される配列からなる群から選択され
る。式ＸＶＩＩとして構成された三量体ＸＴＥＮ共役組成物の一実施形態において、組成
物は、第１のＸＴＥＮの各第１の架橋剤に共役された第１のペイロードの単一原子残基を
さらに含み、この残基は、炭素、窒素、酸素、および硫黄からなる群から選択される。式
ＸＶＩＩとして構成された三量体ＸＴＥＮ共役組成物の一実施形態において、組成物は、
表１１、１２、１８、および２１に記載されるペイロードからなる群から選択される第１
のＸＴＥＮの各第１の架橋剤に共役された第１のペイロードをさらに含む。
別の態様において、本発明は、部分的に、互いに共役され、四量体共役組成物をもたら
す、第１、第２、第３、および第４のＸＴＥＮの組成物に関する。いくつかの実施形態に
おいて、共役組成物は、第１および第２および第３および第４のＸＴＥＮを含み、ＸＴＥ
Ｎは、表３に記載される配列からなる群から選択され、ＸＴＥＮは、同じであり得るか、
または異なり得、第１および第２および第３および第４のＸＴＥＮは、四量体架橋剤を使
用してＮ末端によって互いに共役され、この四量体架橋剤は、四価マレイミドクラスター
である。四量体共役体の一実施形態において、第１および第２および第３および第４のＸ
ＴＥＮは、同一であるか、または異なり、それぞれが、表２または表３のいずれかに記載
される配列の群から選択される配列に対して少なくとも約９０％、または少なくとも約９
１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４
％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％
、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％、または１００％の配列同一性
を有する。四量体共役体の別の実施形態において、第１および第２および第３のＸＴＥＮ
は、同一であるか、または異なり、第１のＸＴＥＮのそれぞれの個別の分子の少なくとも
９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、または９５％は、同一配列長を有し、第２の
ＸＴＥＮのそれぞれの個別の分子の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％
、または９５％は、同一配列長を有し、第３のＸＴＥＮのそれぞれの個別の分子の少なく
とも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、または９５％は、同一配列長を有し、第
４のＸＴＥＮのそれぞれの個別の分子の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９
４％、または９５％は、同一配列長を有する。四量体共役体の別の実施形態において、第
１、第２、第３、および第４のＸＴＥＮは、同じであり、それぞれが、表３に記載される
、セグメント１７４、セグメント１７５、セグメント１７６、セグメント１７７、セグメ
ント１８６、セグメント１８７、セグメント１８８、セグメント１８９、セグメント１９
０、セグメント１９１、セグメント１９２、セグメント１９３、セグメント１９４、セグ
メント１９５、セグメント１９６、セグメント１９７、セグメント１９８、およびセグメ
ント１９９からなる群から選択される配列に対して少なくとも約９０％、または少なくと
も約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも
約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約
９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％、または１００％の配列
同一性を有する。四量体共役体の別の実施形態において、第１および第２のＸＴＥＮは、
同じであり、それぞれが、表３に記載されるセグメント１７４、セグメント１７５、セグ
メント１７６、セグメント１７７、セグメント１８６、セグメント１８７、セグメント１
８８、セグメント１８９、セグメント１９０、セグメント１９１、セグメント１９２、セ
グメント１９３、セグメント１９４、セグメント１９５、セグメント１９６、セグメント
１９７、セグメント１９８、およびセグメント１９９からなる群から選択される配列に対
して少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、また
は少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または
少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少
なくとも約９９％、または１００％の配列同一性を有し、第３および第４のＸＴＥＮは、
同じであるが、第１および第２のＸＴＥＮとは異なり、それぞれが、表３に記載されるセ
グメント１７４、セグメント１７５、セグメント１７６、セグメント１７７、セグメント
１８６、セグメント１８７、セグメント１８８、セグメント１８９、セグメント１９０、
セグメント１９１、セグメント１９２、セグメント１９３、セグメント１９４、セグメン
ト１９５、セグメント１９６、セグメント１９７、セグメント１９８、およびセグメント
１９９からなる群から選択される配列に対して少なくとも約９０％、または少なくとも約
９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９
４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７
％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％、または１００％の配列同一
性を有する。四量体共役体の別の実施形態において、各ＸＴＥＮは、少なくとも第１のシ
ステイン残基を含み、共役体は、第１のＸＴＥＮの各システイン残基に共役された第１の
架橋剤と、第２のＸＴＥＮの各システイン残基に共役された第２の架橋剤と、第３のＸＴ
ＥＮの各システイン残基に共役された第３の架橋剤と、第４のＸＴＥＮの各システイン残
基に共役された第４の架橋剤と、をさらに含み、各架橋剤は、表１３に記載される架橋剤
からなる群から選択される。四量体共役組成物のいくつかの実施形態において、組成物は
、式ＸＶＩ
の構成を有し、式中、独立して、各発生に対し、４ｘＣＬは、四価架橋剤であり、ＣＬ１
は、ＸＴＥＮ１に共役された第１の架橋剤であり、ＣＬ２は、ＸＴＥＮ２に共役された第
２の架橋剤であり、ＣＬ３は、ＸＴＥＮ３に共役された第３の架橋剤であり、ＣＬ４は、
ＸＴＥＮ４に共役された第４の架橋剤であり、ｖは、１〜約１０の整数であり、 ｘは、
１〜約１０の整数であり、ｙは、１〜約１０の整数であり、ｚは、１〜約１０の整数であ
るが、但し、ｘ＋ｙ＋ｚ＞４を条件とし、ＸＴＥＮ１は、第１のＸＴＥＮであり、ＸＴＥ
Ｎ２は、第２のＸＴＥＮであり、ＸＴＥＮ３は、第３のＸＴＥＮであり、ＸＴＥＮ３は、
第４のＸＴＥＮである。四量体共役組成物の別の実施形態において、組成物は、第１のＸ
ＴＥＮの各第１の架橋剤に共役された第１のペイロードの単一原子残基であって、炭素、
窒素、酸素、および硫黄からなる群から選択される残基と、第２のＸＴＥＮの各第２の架
橋剤に共役された第２のペイロードの単一原子残基であって、炭素、窒素、酸素、および
硫黄からなる群から選択される残基と、第３のＸＴＥＮの各第３の架橋剤に共役された第
３のペイロードの単一原子残基であって、炭素、窒素、酸素、および硫黄からなる群から
選択される残基と、第４のＸＴＥＮの各第４の架橋剤に共役された第４のペイロードの単
一原子残基であって、炭素、窒素、酸素、および硫黄からなる群から選択される残基と、
をさらに含む。四量体共役組成物の別の実施形態において、組成物は、表１１、１２、１
８、および２１に記載されるペイロードからなる群から選択される第１のＸＴＥＮの各第
１の架橋剤に共役された第１のペイロードと、表１１、１２、１８、および２１に記載さ
れるペイロードからなる群から選択される第２のＸＴＥＮの各第２の架橋剤に共役された
第２のペイロードであって、第１のペイロードと同じであるか、または異なるペイロード
と、表１１、１２、１８、および２１に記載されるペイロードからなる群から選択される
第３のＸＴＥＮの各第３の架橋剤に共役された第３のペイロードであって、第１または第
２のペイロードと同じであるか、または異なるペイロードと、表１１、１２、１８、およ
び２１に記載されるペイロードからなる群から選択される第４のＸＴＥＮの各第４の架橋
剤に共役された第４のペイロードであって、第１または第２または第３のペイロードと同
じであるか、または異なるペイロードと、をさらに含む。四量体ＸＴＥＮ−ペイロード共
役組成物の一実施形態において、第１のペイロードは、標的に対する特異的結合親和性を
持つ標的部分であり、この標的部分は、表１７〜１９および２１に記載される標的部分か
らなる群から選択され、第２、第３、および第４のペイロードのうちの少なくとも他の１
つは、薬物であり、この薬物は、表１１、表１８、および表２１に記載される薬物からな
る群から選択される。四量体ＸＴＥＮ−ペイロード共役組成物の一実施形態において、第
１のペイロードは、標的部分であり、この標的部分は、ＬＨＲＨおよび葉酸からなる群か
ら選択され、第２、第３、および第４のペイロードのうちの少なくとも１つは、ドキソル
ビシン、パクリタキセル、オーリスタチン、メイタンシン、ドラスタチン、カリケアミシ
ン、ビンカアルカロイド、カンプトテシン、ミトマイシンＣ、エポチロン、ｈＴＮＦ、Ｉ
１−１２、ボルテゾミブ、ランピルナーゼ、スードモナス、エキソトキシン、ＳＮ−３８
、およびラケルマイシンからなる群から選択される薬物である。四量体ＸＴＥＮ−ペイロ
ード共役組成物の別の実施形態において、第１のペイロードは、標的に対する特異的結合
親和性を持つ標的部分であり、この標的部分は、表１７〜１９および２１に記載される標
的部分からなる群から選択され、第２、第３、および第４のペイロードのうちの少なくと
も他の１つは、薬物であり、この薬物は、表１１、表１８、および表２１に記載される薬
物からなる群から選択され、ＸＴＥＮ、標的部分、および薬物部分は、表２１に記載され
る共役体１〜２９０のうちのいずれか１つに対応する。
別の態様において、本発明は、部分的に、分岐様式で構成された多量体ＸＴＥＮ分子を
含む組成物に関し、この組成物の溶液は、減少した粘度を有する。一実施形態において、
本発明は、分岐様式（例えば、三量体様式）で一緒に結合された少なくとも３個のＸＴＥ
Ｎフラグメントを有する多量体ＸＴＥＮを含む溶液を含む組成物を提供し、溶液の粘度は
、≧１００、１３０、または１５０ｍｇ／ｍｌの等モル濃度の対応する直鎖状ＸＴＥＮを
含有する溶液と比較して、≧１００、１３０、または１５０ｍｇ／ｍｌの三量体ＸＴＥＮ
調製物を含有する溶液中で少なくとも５、６、７、８、９、または１０ｃＰだけ減少する
。別の実施形態において、本発明は、分岐様式（例えば、四量体様式）で一緒に結合され
た少なくとも４個のＸＴＥＮフラグメントを有する多量体ＸＴＥＮを含む溶液を含む組成
物を提供し、この組成物は、同数のアミノ酸および同じモル濃度を有する対応する直鎖状
ＸＴＥＮを含む溶液未満の粘度を有し、溶液の粘度は、≧１００、１３０、または１５０
ｍｇ／ｍｌの等モル濃度の対応する直鎖状ＸＴＥＮを含有する溶液と比較して、≧１００
、１３０、または１５０ｍｇ／ｍｌの三量体ＸＴＥＮ調製物を含有する溶液中で少なくと
も５、６、７、８、９、または１０ｃＰだけ減少する。別の実施形態において、本発明は
、分岐様式（例えば、五量体様式）で一緒に結合された少なくとも５個のＸＴＥＮフラグ
メントを有する多量体ＸＴＥＮを含む溶液を含む組成物を提供し、この組成物は、同数の
アミノ酸および同じモル濃度を有する対応する直鎖状ＸＴＥＮを含む溶液未満の粘度を有
し、溶液の粘度は、≧１００、１３０、または１５０ｍｇ／ｍｌの等モル濃度の対応する
直鎖状ＸＴＥＮを含有する溶液と比較して、≧１００、１３０、または１５０ｍｇ／ｍｌ
の三量体ＸＴＥＮ調製物を含有する溶液中で少なくとも５、６、７、８、９、または１０
ｃＰだけ減少する。このパラグラフの前述の実施形態において、多量体構成の個別のＸＴ
ＥＮは、表２および表３に記載される配列からなる群から選択される。
別の実施形態において、本発明は、表５２に記載される配列の群から選択される配列に
対して少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、ま
たは少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、また
は少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または
少なくとも約９９％、または１００％の配列同一性を有するポリペプチドの組成物を提供
する。
別の実施形態において、本発明は、本明細書に記載されるＸＴＥＮ−ペイロード共役体
の実施形態のうちのいずれか１つ、および薬学的に許容される担体の共役体を含む、薬学
的組成物を提供する。一実施形態において、前述の薬学的組成物は、表１６に記載される
状態の群から選択される状態の処置において有用性を有する。別の実施形態において、前
述の薬学的組成物は、対象の処置のための薬学的計画において使用するための有用性を有
し、当該計画は、薬学的組成物を含む。別の実施形態において、前述の薬学的計画は、表
１６に記載される状態の群から選択される状態を有する対象において、有益な効果を達成
するために必要とされる薬学的組成物の量を決定するステップをさらに含む。別の実施形
態において、対象を処置するために使用される薬学的計画は、薬学的組成物を２つ以上の
連続用量で対象に有効な量で投与することを含み、この投与は、未処置の対象と比較して
、状態と関連付けられた少なくとも１つ、２つ、または３つのパラメータの少なくとも１
０％、または２０％、または３０％、または４０％、または５０％、または６０％、また
は７０％、または８０％、または９０％超の改善をもたらす。
別の実施形態において、本発明は、表１６に記載される状態の群から選択される状態の
処置のための薬剤の調製において使用するための、本明細書に記載されるＸＴＥＮ−ペイ
ロード共役体の実施形態のうちのいずれか１つの共役体を提供する。
いくつかの実施形態において、本発明は、ＸＴＥＮに結合されたペイロードの組合せを
治療薬として選択する方法を提供し、この方法は、複数のＸＴＥＮ配列を含むＸＴＥＮの
ライブラリーを提供することであって、当該ＸＴＥＮ配列のそれぞれが、少なくとも第１
のペイロードおよび第１のペイロードとは異なる少なくとも第２のペイロードに共役され
る、提供することと、当該ライブラリーから、（１）第１のペイロード単独に共役された
ＸＴＥＮ配列、および（２）第２のペイロード単独に共役されたＸＴＥＮ配列のものと比
較して、改善されたインビトロまたはインビボパラメータを呈する場合に、ＸＴＥＮ配列
を治療薬として選択することと、を含む。本方法の一実施形態において、第１のペイロー
ドおよび第２のペイロードは、共通の疾患（例えば、第１および第２のペイロードの双方
が標的にする疾患）を改善するために治療上有効である。本方法の一実施形態において、
第１の薬物および第２の薬物は、共通の疾患の異なる症状を処置するために治療上有効で
ある。本方法の一実施形態において、共通の疾患は、癌、癌の支持療法、心血管、中枢神
経系、内分泌疾患、消化管、尿生殖器、血液学的、ＨＩＶ感染、ホルモン疾患、炎症、自
己免疫疾患、感染症、代謝疾患、筋骨格系疾患、腎臓学的障害、眼科疾患、疼痛、および
呼吸器から選択される。本方法の一実施形態において、第１のペイロードおよび第２のペ
イロードは、共通の生物学的経路を介して、それらの治療効果を媒介する。本方法の一実
施形態において、第１のペイロードおよび第２のペイロードは、表１１、表１８、および
表２１に記載される薬物からなる群から選択される、異なる薬物である。本方法の一実施
形態において、第１のペイロードおよび第２のペイロードは、表１２、表１８、および表
２１に記載されるタンパク質からなる群から選択される、異なる生物学的に活性なタンパ
ク質である。本方法の一実施形態において、第１のペイロードは、表１１、表１８、およ
び表２１に記載される薬物からなる群から選択される薬物であり、第２のペイロードは、
表１２、表１８、および表２１に記載されるタンパク質からなる群から選択される生物学
的に活性なタンパク質である。
別の実施形態において、本発明は、ＳＡＳＲＳＡまたはＳＡＳＸＳＡ（Ｘが、Ｒまたは
Ｋである）から選択される配列を有する、タンパク質分解切断部位を介して、親和性精製
タグに結合される伸長組換えポリペプチドを含む、単離されたポリペプチドを提供する。
別の実施形態において、本発明は、ＳＡＳＲＳＡまたはＳＡＳＸＳＡ（Ｘが、Ｒまたは
Ｋである）から選択される配列を有する、タンパク質分解切断部位を介して、そのＮ末端
で第１の親和性精製タグに結合され、ＳＡＳＲＳＡまたはＳＡＳＸＳＡ（Ｘが、Ｒまたは
Ｋである）から選択される配列を有する、タンパク質分解切断部位を介して、そのＣ末端
で第２の親和性精製タグに結合される、ＸＴＥＮを含むポリペプチドを含む、単離された
ポリペプチドを提供する。
別の態様において、本発明は、対象における状態を、ＸＴＥＮ−ペイロード共役組成物
で処置する方法に関する。一実施形態において、本発明は、対象における状態を処置する
方法を提供し、有効な量の本明細書に記載されるＸＴＥＮ−ペイロードの実施形態のうち
のいずれか１つの共役体を、処置を必要とする対象に投与することを含む。別の実施形態
において、本発明は、対象における状態を処置する方法を提供し、有効な量の表２１に記
載される共役体からなる群の共役体を、処置を必要とする対象に投与することを含む。こ
のパラグラフの前述の実施形態において、処置される状態としては、表１３に記載される
状態が挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態において、本発明は、治療計
画において使用するための、本明細書に記載されるＸＴＥＮ−ペイロード共役体の実施形
態のうちのいずれか、および薬学的に許容される担体の共役体を含む、薬学的組成物を提
供し、この計画は、薬学的組成物の２つ以上の連続用量を投与することを含む。
一実施形態において、本発明は、表１６に記載される状態の群から選択される状態の処
置のための薬剤の調製のための、本明細書に記載されるＸＴＥＮ−ペイロードの実施形態
のうちのいずれか１つの共役体の使用を提供する。別の実施形態において、本発明は、表
１６に記載される群から選択される状態の処置のための薬学的組成物を提供し、有効な量
の本明細書に記載されるＸＴＥＮ−ペイロードの実施形態のうちのいずれか１つの共役体
を含む。
別の実施形態において、本発明は、図１１７に記載される構造を有する組成物を提供す
る。
本発明は、例えば、以下の項目も提供する。
（項目１）
ＸＴＥＮ配列の実質的に均質な集団を含む組成物を産生する方法であって、
ａ． 表６に記載される配列の群から選択されるアミノ酸配列であって、少なくとも１つ
の切断配列を含む、アミノ酸配列を有する少なくとも１つのポリペプチドを含む組成物を
提供することと、
ｂ． 前記ポリペプチド組成物を、前記切断配列を切断するのに有効な条件下で、トリプ
シンで処置することと、を含み、
得られたＸＴＥＮ配列の実質的に均質な集団中の個別の配列の少なくとも９５％、９６％
、９７％、９８％、または９９％が、同一配列長を有する、方法。
（項目２）
ａ． 前記ＸＴＥＮ配列を、クロマトグラフィー基質の上に、前記ＸＴＥＮ配列を捕捉す
るのには有効であるが、プロテアーゼにはそうでない条件下で吸着させることと、
ｂ． 前記ＸＴＥＮ配列を溶離することと、
ｃ． 前記ＸＴＥＮ配列を回収することと、をさらに含み、前記集団の個別の分子の少な
くとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、ま
たは９９％が、同一配列長を有する、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記クロマトグラフィー基質が、アニオン交換基質である、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記アニオン交換基質が、ｍａｃｒｏｃａｐ Ｑ、ｃａｐｔｏ Ｑ、ｓｕｐｅｒＱ−６
５０Ｍ、およびｐｏｒｏｓ Ｄからなる群から選択される、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記ＸＴＥＮ配列が、表６に記載されるアミノ酸配列の群から選択される配列に対して
少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８
％、または９９％の配列同一性を有する、項目１〜４のいずれか１項に記載の方法。
（項目６）
前記ＸＴＥＮ配列が、表２または３に記載されるアミノ酸配列の群から選択される配列
に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７
％、９８％、または９９％の配列同一性を有する、項目１〜５のいずれか１項に記載の方
法。
（項目７）
項目１〜６のいずれか１項に記載の方法によって産生される、組成物。
（項目８）
伸長組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ）を含むポリペプチドの実質的に均質な集団を含む
組成物であって、前記集団中の個別のポリペプチド分子の少なくとも９０％、９１％、９
２％、９３％、９４％、または９５％が、同一配列長を有する、組成物。
（項目９）
前記ＸＴＥＮが、
ａ． 前記ＸＴＥＮが、約３６〜約３０００個のアミノ酸残基を含むことと、
ｂ． グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン
酸塩（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）残基の合計が、前記ＸＴＥＮの全アミノ酸残基の約９
０％超を構成することと、
ｃ． 前記ＸＴＥＮ配列が、（ｉ）前記ＸＴＥＮ配列が、前記アミノ酸がセリンでない限
り同一である３個の隣接するアミノ酸を含有しないか、（ｉｉ）前記ＸＴＥＮ配列の少な
くとも約８０％が、非重複配列モチーフからなり、前記配列モチーフのそれぞれが約９個
〜約１４個のアミノ酸残基を含み、いずれの２個の隣接するアミノ酸残基も、前記配列モ
チーフのそれぞれにおいて２回を超えて発生しないか、または（ｉｉｉ）前記ＸＴＥＮ配
列が、１０未満の部分列スコアを有するように、実質的に非反復的であることと、
ｄ． 前記ＸＴＥＮ配列が、ＧＯＲアルゴリズムによって決定される９０％を超えるラン
ダムコイル形成を有することと、
ｅ． 前記ＸＴＥＮ配列が、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズムによって決定される２
％未満のαらせんおよび２％のβシートを有することと、
ｆ． 前記ＸＴＥＮ配列が、ＴＥＰＩＴＯＰＥアルゴリズムによって分析されるとき、予
測されたＴ細胞エピトープを欠き、前記ＸＴＥＮ配列内のエピトープについての前記ＴＥ
ＰＩＴＯＰＥアルゴリズム予測は、−９のスコアに基づくことと、を特徴とする、項目８
に記載の組成物。
（項目１０）
前記ＸＴＥＮが、表２、表３、表４、および表２２〜２５に記載される配列からなる群
から選択される配列に対して少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少
なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少な
くとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なく
とも約９８％、または少なくとも約９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を
含む、項目８に記載の組成物。
（項目１１）
第１の親和性タグをさらに含む、項目８に記載の組成物。
（項目１２）
前記第１の親和性タグが、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）基質、カチオ
ン交換基質、アニオン交換基質、固定化金属イオン親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ
）基質、および固定化抗体基質からなる群から選択されるクロマトグラフィー基質に対す
る結合親和性を有する、項目１１に記載の組成物。
（項目１３）
前記第１の親和性タグが、表７に記載される配列からなる群から選択される、項目１１
に記載の組成物。
（項目１４）
ヘルパー配列をさらに含む、項目１１〜１３のいずれか１項に記載の組成物。
（項目１５）
前記ヘルパー配列が、表１０に記載される配列からなる群から選択される配列に対して
少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少
なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少な
くとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なく
とも約９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む、項目１４に記載の組成
物。
（項目１６）
前記ヘルパー配列が、
ａ． ＫＮＰＥＱＡＥＥＱＸ１ＥＥＴ（式中、Ｘ１が、独立して、ＳまたはＲである）、
ｂ． ＡＮＰＥＱＡＥＥＱＸ１ＥＥＴ（式中、Ｘ１が、独立して、ＳまたはＲである）、
ｃ． ＫＮＰＥＱＡＥＥＱＡＥＥＱＸ１ＥＥＴ（式中、Ｘ１が、独立して、ＳまたはＲで
ある）、
ｄ． ＫＸ２Ｘ３ＥＱＡＥＥＱＡＥＥＱＸ１ＥＥＴ（式中、Ｘ１が、独立して、Ｓまたは
Ｒであり、Ｘ２が、独立して、ＫまたはＮであり、Ｘ３が、独立して、Ｋ、Ｎ、Ｔ、Ｑ、
Ｈ、Ｐ、Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｒ、またはＳである）、
ｅ． ＫＸ２（Ｘ３）１０ＱＸ１ＥＥＴ（式中、Ｘ１が、独立して、ＳまたはＲであり、
Ｘ２が、独立して、ＫまたはＮであり、Ｘ３が、独立して、Ｋ、Ｎ、Ｔ、Ｑ、Ｈ、Ｐ、Ｅ
、Ｄ、Ａ、Ｒ、またはＳである）、
ｆ． ＫＸ２（Ｘ３）７ＡＥＥＱＸ１ＥＥＴ（式中、Ｘ１が、独立して、ＳまたはＲであ
り、Ｘ２が、独立して、ＫまたはＮであり、Ｘ３が、独立して、Ｋ、Ｎ、Ｔ、Ｑ、Ｈ、Ｐ
、Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｒ、またはＳである）、
ｇ． ＫＸ２Ｘ３ＥＱＥ（Ｘ３）３ＡＥＥＱＲＥＥＴ（式中、Ｘ２が、独立して、Ｋまた
はＮであり、Ｘ３が、独立して、Ｋ、Ｎ、Ｔ、Ｑ、Ｈ、Ｐ、Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｒ、またはＳで
ある）、
ｈ． ＫＸ２Ｘ３ＥＱＥ（Ｘ３）３ＡＥＥ（Ｘ３）５（式中、Ｘ２が、独立して、Ｋまた
はＮであり、Ｘ３が、独立して、Ｋ、Ｎ、Ｔ、Ｑ、Ｈ、Ｐ、Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｒ、またはＳで
ある）、
ｉ． ＫＫＱＥＱＥＫＥＱＡＥＥＱ（Ｘ４Ｘ５）２ＲＥＥＴ（式中、Ｘ４が、独立して、
ＡまたはＳであり、Ｘ５が、独立して、Ｋ、Ｑ、またはＥである）；ＫＫＱＥＱＥＫＥＱ
ＡＥＥＱ（Ｘ４Ｘ５）４ＲＥＥＴ（式中、Ｘ４が、独立して、ＡまたはＳであり、Ｘ５が
、独立して、Ｋ、Ｑ、またはＥである）、
ｊ． ＫＫＱＥＱＥＫＥＱＡＥＥＱ（Ｚ）４ＲＥＥＴ（式中、Ｚが、任意の天然に存在す
るＬアミノ酸である）、
ｋ． ＫＸ２（Ｘ３）ｎ（式中、ｎが、１０〜４０の整数であり、Ｘ２が、独立して、Ｋ
またはＮであり、Ｘ３が、独立して、Ｋ、Ｎ、Ｔ、Ｑ、Ｈ、Ｐ、Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｒ、または
Ｓである）、
ｌ． （Ｘ３）ｎ（式中、ｎが、１０〜５０の整数であり、Ｘ３が、独立して、Ｋ、Ｎ、
Ｔ、Ｑ、Ｈ、Ｐ、Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｒ、またはＳである）、
ｍ． ＫＸ２ＱＥＱＥＫＥＱＡＥＥＱ（Ｘ４Ｘ５）ｎＸ１ＥＥＴ（式中、ｎが、ゼロまた
は１〜１０の整数であり、Ｘ１が、独立して、ＳまたはＲであり、Ｘ２が、独立して、Ｋ
またはＮであり、Ｘ４が、独立して、ＡまたはＳであり、Ｘ５が、独立して、Ｋ、Ｑ、ま
たはＥである）、
ｎ． ＫＸ２（Ｘ３）ｎ（Ｘ４Ｘ５）ｍＸ１ＥＥＴ（式中、ｎが、５〜２０の整数であり
、ｍが、ゼロまたは１〜１０の整数であり、Ｘ１が、独立して、ＳまたはＲであり、Ｘ２
が、独立して、ＫまたはＮであり、Ｘ３が、独立して、Ｋ、Ｎ、Ｔ、Ｑ、Ｈ、Ｐ、Ｅ、Ｄ
、Ａ、Ｒ、またはＳであり、Ｘ４が、独立して、ＡまたはＳであり、Ｘ５が、独立して、
Ｋ、Ｑ、またはＥである）、
ｏ． ＫＸ２（Ｘ３）ｎ（Ｚ）ｍＸ１ＥＥＴ（式中、ｎが、５〜２０の整数であり、ｍが
、ゼロまたは１〜１０の整数であり、Ｘ１が、独立して、ＳまたはＲであり、Ｘ２が、独
立して、ＫまたはＮであり、Ｘ３が、独立して、Ｋ、Ｎ、Ｔ、Ｑ、Ｈ、Ｐ、Ｅ、Ｄ、Ａ、
Ｒ、またはＳであり、Ｚが、任意の天然に存在するＬアミノ酸である）からなる群から選
択される、項目１４に記載の組成物。
（項目１７）
第１の切断配列をさらに含み、前記第１の切断配列が、表８および表９に記載される配
列からなる群から選択される、項目１１〜１６のいずれか１項に記載の組成物。
（項目１８）
前記組成物が、式Ｉ：

の構成を有し、式中、
ａ． ＨＳが、前記ヘルパー配列であり、
ｂ． ＡＴ１が、前記第１の親和性タグであり、
ｃ． ＣＳ１が、前記第１の切断配列であり、
ｄ． ＸＴＥＮが、前記伸長組換えポリペプチドである、項目１７に記載の組成物。
（項目１９）
第２の切断配列をさらに含み、前記第１および前記第２の切断配列が、同じプロテアー
ゼによって切断されることができ、前記組成物が、式ＩＩ：

の構成を有し、式中、
ａ． ＨＳが、ヘルパー配列であり、
ｂ． ＡＴ１が、前記第１の親和性タグであり、
ｃ． ＣＳ１が、前記第１の切断配列であり、
ｄ． ＣＳ２が、前記第２の切断配列であり、
ｅ． ＸＴＥＮが、前記伸長組換えポリペプチドである、項目１７に記載の組成物。
（項目２０）
前記第１の親和性タグが、配列ＲＰＲＰＲＰＲＰＲＰＲＰＲまたはＨＨＨＨＨＨを含む
、項目１８または項目１９に記載の組成物。
（項目２１）
第２の親和性タグおよび第２の切断配列をさらに含み、前記第２の親和性タグが、前記
第１の親和性タグとは異なるクロマトグラフィー基質に対する結合親和性を有し、前記ク
ロマトグラフィー基質が、ＨＩＣ基質、カチオン交換基質、アニオン交換基質、ＩＭＡＣ
基質、および固定化抗体基質からなる群から選択され、前記第１および前記第２の切断配
列が、同じプロテアーゼによって切断されることができる、項目１１〜１７のいずれか１
項に記載の組成物。
（項目２２）
前記第２の親和性タグが、前記第１の親和性タグとは異なり、前記第２の親和性タグが
、表７に記載される配列の群から選択される、項目２１に記載の組成物。
（項目２３）
前記組成物が、式ＩＩＩ：

の構成を有し、式中、
ａ． ＨＳが、前記ヘルパー配列であり、
ｂ． ＡＴ１が、前記第１の親和性タグであり、
ｃ． ＣＳ１が、前記第１の切断配列であり、
ｄ． ＣＳ２が、前記第２の切断配列であり、
ｅ． ＸＴＥＮが、前記伸長組換えポリペプチドであり、
ｆ． ＡＴ２が、前記第２の親和性タグである、項目２１または項目２２に記載の組成物
。
（項目２４）
前記第１の親和性タグが、前記配列ＲＰＲＰＲＰＲＰＲＰＲＰＲを含み、前記第２の親
和性タグが、前記配列ＨＨＨＨＨＨを含む、項目２３に記載の組成物。
（項目２５）
前記第１の親和性タグが、前記配列ＨＨＨＨＨＨを含み、前記第２の親和性タグが、前
記配列ＲＰＲＰＲＰＲＰＲＰＲＰＲを含む、項目２３に記載の組成物。
（項目２６）
ａ． ポリペプチドをコードするベクターを含む宿主細胞を、発酵反応において、前記宿
主細胞の粗発現産物の成分として前記ポリペプチドを発現するのに有効な条件下で培養す
ることであって、前記コードされたポリペプチドが、ＸＴＥＮと、第１の切断配列と、第
１の親和性タグとを含む、培養することと、
ｂ． 前記粗発現産物の前記ポリペプチドを、第１のクロマトグラフィー基質の上に、前
記第１の親和性タグを前記第１のクロマトグラフィー基質の上に捕捉するのに有効な条件
下で吸着させることと、
ｃ． 前記ポリペプチドを溶離することと、
ｄ． 前記集団の前記ポリペプチドの少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４
％、または９５％が、同一配列長を有する、前記ポリペプチドを回収することと、を含む
プロセスによって得られたポリペプチドの実質的に均質な集団を含む、組成物。
（項目２７）
前記第１のクロマトグラフィー基質が、ＨＩＣ基質、カチオン交換基質、アニオン交換
基質、およびＩＭＡＣ基質からなる群から選択される、項目２６に記載の組成物。
（項目２８）
前記親和性タグが、表７に記載される親和性タグからなる群から選択される、項目２６
に記載の組成物。
（項目２９）
前記第１のクロマトグラフィー基質が、カチオン交換であり、前記第１の親和性タグが
、前記配列ＲＰＲＰＲＰＲＰＲＰＲＰＲを含む、項目２７に記載の組成物。
（項目３０）
前記第１のクロマトグラフィー基質が、ＩＭＡＣであり、前記第１の親和性タグが、前
記配列ＨＨＨＨＨＨＨＨを含む、項目２７に記載の組成物。
（項目３１）
前記ベクターが、項目１１〜１９のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする、
項目２６に記載の組成物。
（項目３２）
前記ベクターが、第２の切断配列および第２の親和性タグをさらにコードし、前記第１
および前記第２の切断配列が、同じプロテアーゼによって切断されることができ、前記第
２の親和性タグが、前記第１の親和性タグとは異なる第２のクロマトグラフィー基質に対
する結合親和性を有し、前記組成物が、
ａ． 前記ポリペプチドを、第２のクロマトグラフィー基質の上に、前記第２の親和性タ
グを前記第２のクロマトグラフィー基質の上に捕捉するのに有効な条件下で吸着させるこ
とと、
ｂ． 前記ポリペプチドを溶離することと、
ｃ． 前記集団の前記ポリペプチドの少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４
％、または９５％が、同一配列長を有する、前記ポリペプチドを回収することと、をさら
に含むプロセスによって得られる、項目２６〜２８のいずれか１項に記載の組成物。
（項目３３）
前記ベクターが、項目２３に記載のポリペプチドをコードする、項目３２に記載の組成
物。
（項目３４）
前記第１のクロマトグラフィー基質が、前記第２のクロマトグラフィー基質とは異なり
、前記第１および前記第２のクロマトグラフィー基質のそれぞれが、独立して、ＨＩＣ、
カチオン交換、アニオン交換、およびＩＭＡＣからなる群から選択される、項目３２に記
載の組成物。
（項目３５）
前記第１のクロマトグラフィー基質が、カチオン交換であり、前記第１の親和性タグが
、前記配列ＲＰＲＰＲＰＲＰＲＰＲＰＲを含み、前記第２のクロマトグラフィー基質が、
ＩＭＡＣであり、前記第１の親和性タグが、前記配列ＨＨＨＨＨＨＨＨを含む、項目３２
に記載の組成物。
（項目３６）
前記第１のクロマトグラフィー基質が、ＩＭＡＣであり、前記第１の親和性タグが、前
記配列ＨＨＨＨＨＨＨＨを含み、前記第２のクロマトグラフィー基質が、カチオン交換で
あり、前記第１の親和性タグが、前記配列ＲＰＲＰＲＰＲＰＲＰＲＰＲを含む、項目３２
に記載の組成物。
（項目３７）
前記プロセスが、
ａ． 前記組成物を、前記切断配列（複数可）を切断するのに有効な条件下で、プロテア
ーゼで処置し、それにより前記ＸＴＥＮを前記親和性タグ（複数可）から遊離させること
と、
ｂ． 前記ＸＴＥＮを、クロマトグラフィー基質の上に、前記ＸＴＥＮを捕捉するのには
有効であるが、前記親和性タグ（複数可）または前記プロテアーゼにはそうではない条件
下で吸着させることと、
ｃ． 前記ＸＴＥＮを溶離することと、
ｄ． 前記ＸＴＥＮを回収することと、をさらに含み、ＸＴＥＮの前記個別の分子の少な
くとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、または９５％が、同一配列長を有する
、項目２３〜２８または３２〜３４のいずれか１項に記載の組成物。
（項目３８）
前記切断配列（複数可）が、表９のプロテアーゼからなる群から選択されるプロテアー
ゼによって切断されることができる、項目３７に記載の組成物。
（項目３９）
前記切断配列（複数可）が、トリプシンによって切断されることができ、前記配列が、
表８に記載される配列からなる群から選択され、前記プロテアーゼが、トリプシンである
、項目３８に記載の組成物。
（項目４０）
前記クロマトグラフィー基質が、アニオン交換である、項目３７または３８に記載の組
成物。
（項目４１）
前記アニオン交換クロマトグラフィー基質が、ｍａｃｒｏｃａｐ Ｑ、ｃａｐｔｏ Ｑ
、ｓｕｐｅｒＱ−６５０Ｍ、およびｐｏｒｏｓ Ｄからなる群から選択される、項目４０
に記載の組成物。
（項目４２）
前記プロセスが、
ａ． 前記組成物を、前記切断配列（複数可）を切断するのに有効な条件下で、プロテア
ーゼで処置し、それにより前記ＸＴＥＮを前記親和性タグ（複数可）から遊離させること
と、
ｂ． 前記プロテアーゼを、クロマトグラフィー基質の上に、前記プロテアーゼを捕捉す
るのには有効であるが、前記ＸＴＥＮにはそうではない条件下で吸着させることと、
ｃ． 前記ＸＴＥＮを溶離液から回収することと、をさらに含み、ＸＴＥＮの前記個別の
分子の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、または９５％が、同一配列
長を有する、項目２３〜２８または３２〜３４のいずれか１項に記載の組成物。
（項目４３）
前記切断配列（複数可）が、表９のプロテアーゼからなる群から選択されるプロテアー
ゼによって切断されることができる、項目４２に記載の組成物。
（項目４４）
前記切断配列（複数可）が、トリプシンによって切断されることができ、前記配列が、
表８に記載される配列からなる群から選択され、前記プロテアーゼが、トリプシンである
、項目４２または項目４３に記載の組成物。
（項目４５）
前記クロマトグラフィー基質が、カチオン交換基質、ＨＩＣ基質、またはＩＭＡＣ基質
のうちの１つ以上である、項目４２〜４４のいずれか１項に記載の組成物。
（項目４６）
ＸＴＥＮ配列を含む組成物であって、前記ＸＴＥＮ配列が、トリプシンによって切断さ
れことができる１つ以上の切断配列をさらに含み、前記切断配列の全てを切断するのに有
効な条件下で、トリプシンを用いた処置が、ＸＴＥＮフラグメントの調製物をもたらし、
各ＸＴＥＮフラグメントが、前記調製物中のあらゆる他のフラグメントに対して少なくと
も約９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する、組成物。
（項目４７）
前記切断配列が、配列ＳＡＳＲＳＡまたはＳＡＳＫＳＡに対して少なくとも８６％の配
列同一性を有するか、または同一である、項目４６に記載の組成物。
（項目４８）
前記切断配列が、配列ＲＸまたはＫＸを含み、式中、Ｘが、プロリン以外の任意のＬア
ミノ酸である、項目４６に記載の組成物。
（項目４９）
前記組成物が、表６に記載される配列の群から選択される前記配列に対して少なくとも
約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％
、または１００％の配列同一性を有する、項目４６に記載の組成物。
（項目５０）
ＸＴＥＮ配列を宿主細胞中で産生するための方法であって、ａ）前記ＸＴＥＮ配列と、
ｂ）ヘルパー配列とを含むポリペプチドをコードするベクターを含む宿主細胞を、発酵反
応において、粗発現産物の成分として前記ポリペプチドを発現するのに有効な条件下で、
約２グラム／リットル（ｇ／Ｌ）、または約３ｇ／Ｌ、または約４ｇ／Ｌ、または約５ｇ
／Ｌ、または約６ｇ／Ｌ、または約７ｇ／Ｌを超える前記ポリペプチドの濃度で培養する
ことを含む、方法。
（項目５１）
ＸＴＥＮ配列を宿主細胞中で産生するための方法であって、ａ）前記ＸＴＥＮ配列と、
ｂ）ヘルパー配列とを含むポリペプチドをコードするベクターを含む宿主細胞を、発酵反
応において、粗発現産物の成分として前記ポリペプチドを発現するのに有効な条件下で、
約１０ミリグラム／グラムを超える乾燥重量宿主細胞（ｍｇ／ｇ）濃度、または少なくと
も約１５ｍｇ／ｇ、もしくは少なくとも約２０ｍｇ／ｇ、もしくは少なくとも約２５ｍｇ
／ｇ、もしくは少なくとも約３０ｍｇ／ｇ、もしくは少なくとも約４０ｍｇ／ｇ、もしく
は少なくとも約５０ｍｇ／ｇの前記ポリペプチドの濃度で培養することを含む、方法。
（項目５２）
ＸＴＥＮ配列を宿主細胞中で産生するための方法であって、ａ）前記ＸＴＥＮ配列と、
ｂ）ヘルパー配列とを含むポリペプチドをコードするベクターを含む宿主細胞を、発酵反
応において、粗発現産物の成分として前記ポリペプチドを発現するのに有効な条件下で、
約１０ミリグラム／グラムを超える乾燥重量宿主細胞（ｍｇ／ｇ）濃度、または少なくと
も約２５０マイクロモル／Ｌ、もしくは約３００マイクロモル／Ｌ、もしくは約３５０マ
イクロモル／Ｌ、もしくは約４００マイクロモル／Ｌ、もしくは約４５０マイクロモル／
Ｌ、もしくは約５００マイクロモル／Ｌの前記ポリペプチドの濃度で培養することを含む
、方法。
（項目５３）
前記発酵反応が、６００ｎｍの波長で少なくとも１３０の光学密度に到達するときに、
前記濃度が測定される、項目５０〜５２のいずれか１項に記載の方法。
（項目５４）
前記発現されたポリペプチドの前記ヘルパー配列が、前記ポリペプチドのＮ末端に存在
し、前記配列が、表１０に記載される配列からなる群から選択される配列に対して少なく
とも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、または９５％の配列同一性を有するか
、または同一である、項目５０〜５２のいずれか１項に記載の方法。
（項目５５）
前記ベクターが、項目１４〜１７のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする、
項目５４に記載の方法。
（項目５６）
ａ． 前記宿主細胞発酵反応混合物の前記粗発現産物を回収することと、
ｂ． 前記粗発現産物の前記ポリペプチドを、第１のクロマトグラフィー基質の上に、前
記ポリペプチドの前記第１の親和性タグを前記クロマトグラフィー基質の上に捕捉するの
に有効な条件下で吸着させることであって、前記第１のクロマトグラフィー基質が、ＨＩ
Ｃ基質、カチオン交換基質、アニオン交換基質、およびＩＭＡＣ基質からなる群から選択
される、吸着させることと、
ｃ． 前記ＸＴＥＮ配列を溶離および回収することと、をさらに含み、前記ポリペプチド
の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、または９５％が、同一配列長を
有する、項目５５に記載の方法。
（項目５７）
前記ベクターが、項目２１〜２３のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする、
項目５０〜５２のいずれか１項に記載の方法。
（項目５８）
ａ． 前記宿主細胞発酵反応混合物の前記粗発現産物を回収することと、
ｂ． 前記ポリペプチドを、第１のクロマトグラフィー基質の上に、前記ポリペプチドの
前記第１の親和性タグを前記クロマトグラフィー基質の上に捕捉するのに有効な条件下で
吸着させることであって、前記第１のクロマトグラフィー基質が、ＨＩＣ基質、カチオン
交換基質、アニオン交換基質、およびＩＭＡＣ基質からなる群から選択される、吸着させ
ることと、
ｃ． 前記ポリペプチドを溶離することと、
ｄ． 前記ポリペプチドを、第２のクロマトグラフィー基質の上に、前記ポリペプチドの
前記第２の親和性タグを前記クロマトグラフィー基質の上に捕捉するのに有効な条件下で
吸着させることであって、前記第２のクロマトグラフィー基質が、ＨＩＣ基質、カチオン
交換基質、アニオン交換基質、およびＩＭＡＣ基質からなる群から選択される、吸着させ
ることと、
ｅ． 前記ポリペプチドを溶離することと、
ｆ． 前記ＸＴＥＮ配列を回収することと、をさらに含み、前記ポリペプチドの少なくと
も９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、または９５％が、同一配列長を有する、項
目５７に記載の方法。
（項目５９）
ａ． 前記ポリペプチドを、前記切断配列を切断するのに有効な条件下で、プロテアーゼ
で処置し、それにより前記ＸＴＥＮを前記ポリペプチドから遊離させることと、
ｂ． 前記ＸＴＥＮを、アニオンクロマトグラフィー基質の上に、前記ＸＴＥＮを捕捉す
るのに有効な条件下で吸着させることと、
ｃ． 前記ＸＴＥＮを溶離することと、
ｄ． 前記ＸＴＥＮを回収することと、をさらに含み、前記個別のＸＴＥＮ分子の少なく
とも９０％、または少なくとも９１％、または少なくとも９２％、または少なくとも９３
％、または少なくとも９４％、または少なくとも９５％が、同一配列長を有する、項目５
６または項目５８に記載の方法。
（項目６０）
前記アニオンクロマトグラフィー基質が、ｍａｃｒｏｃａｐ Ｑ、ｃａｐｔｏ Ｑ、ｓ
ｕｐｅｒＱ−６５０Ｍ、およびｐｏｒｏｓ Ｄからなる群から選択される、項目５９に記
載の方法。
（項目６１）
前記プロテアーゼがトリプシンであり、前記配列が、表８に記載される配列からなる群
から選択される、項目５９または項目６０に記載の方法。
（項目６２）
ａ． 前記ポリペプチドを、前記切断配列（複数可）を切断するのに有効な条件下で、プ
ロテアーゼで処置し、それにより前記ＸＴＥＮを前記ポリペプチドから遊離させることと
、
ｂ． 前記プロテアーゼを、クロマトグラフィー基質の上に、前記プロテアーゼを捕捉す
るのには有効であるが、前記ＸＴＥＮにはそうではない条件下で吸着させることと、
ｃ． 前記溶離液中の前記ＸＴＥＮを回収することと、をさらに含み、前記ＸＴＥＮの少
なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、または９５％が、同一配列長を有す
る、項目５６または項目５８に記載の方法。
（項目６３）
前記プロテアーゼがトリプシンであり、前記配列が、表８に記載される配列からなる群
から選択される、項目６２に記載の方法。
（項目６４）
前記クロマトグラフィー基質が、ＨＩＣ基質、カチオン交換基質、およびＩＭＡＣ基質
のうちの１つ以上である、項目６２または項目６３に記載の方法。
（項目６５）
上に固定化された実質的に同一のポリペプチドの集団を含む、固体支持体であり、前記
固体支持体が、クロマトグラフィー基質を含み、前記固定化されたポリペプチドが、それ
ぞれ、ＸＴＥＮ、第１の親和性タグ、および第２の親和性タグを含み、
ａ． 前記第１の親和性タグが、前記ＸＴＥＮの前記Ｎ末端における切断配列によって、
前記ＸＴＥＮに接合され、
ｂ． 前記第２の親和性タグが、前記ＸＴＥＮの前記Ｃ末端における切断配列によって、
前記ＸＴＥＮに接合され、
ｃ． 前記第２の親和性タグが、前記第１の親和性タグとは異なり、
ｄ． 前記クロマトグラフィー基質が、双方にではないが、前記第１または前記第２の親
和性タグのいずれかに結合することができ、
ｅ． 前記固定化ポリペプチド分子の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４
％、または９５％が、同一配列長を有する、固体支持体。
（項目６６）
前記固定化ポリペプチド分子が、項目２１〜２５のいずれか１項に記載のポリペプチド
を含む、項目６５に記載の固定支持体。
（項目６７）
前記切断配列が、配列ＳＡＳＲＳＡまたはＳＡＳＫＳＡに対して少なくとも８６％の配
列同一性を有するか、または同一である、項目６５または項目６６に記載の固定支持体。
（項目６８）
前記切断配列が、配列ＲＸまたはＫＸを含み、式中、Ｘが、プロリン以外の任意のＬア
ミノ酸である、項目６５または項目６６に記載の固体支持体。
（項目６９）
前記固体支持体が、ＨＩＣクロマトグラフィー樹脂、カチオン交換樹脂、アニオン交換
クロマトグラフィー樹脂、およびＩＭＡＣクロマトグラフィー樹脂からなる群から選択さ
れる、項目６５〜６８のいずれか１項に記載の固体支持体。
（項目７０）
前記第１の親和性タグが、前記配列ＲＰＲＰＲＰＲＰＲＰＲＰＲを含み、前記第２の親
和性タグが、前記配列ＨＨＨＨＨＨを含む、項目６９に記載の組成物。
（項目７１）
前記第１の親和性タグが、前記配列ＨＨＨＨＨＨを含み、前記第２の親和性タグが、前
記配列ＲＰＲＰＲＰＲＰＲＰＲＰＲを含む、項目６９に記載の組成物。
（項目７２）
少なくとも第１の架橋剤の１つ以上の分子に共有結合したＸＴＥＮを含む共役組成物で
あって、前記架橋剤が、表１３に記載される架橋剤、表１５に記載されるアルキン反応物
、および表１５に記載されるアジド反応物からなる群から選択され、前記ＸＴＥＮが、項
目３７に記載のＸＴＥＮ、項目４２に記載のＸＴＥＮ、項目７に記載のＸＴＥＮ、表２に
記載される配列、および表３に記載される配列からなる群から選択される、共役組成物。
（項目７３）
前記第１の架橋剤が、
ａ． 前記ＸＴＥＮのＮ末端アミノ酸残基のαアミノ基、
ｂ． 前記ＸＴＥＮの各リジン残基のεアミノ基、
ｃ． 前記ＸＴＥＮの各システイン残基のチオール基、からなる群から選択される場所で
、前記少なくとも第１のＸＴＥＮに共役される、項目７２に記載の共役組成物。
（項目７４）
前記ＸＴＥＮが、表２および表３に記載される配列からなる群から選択される配列に対
して少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、また
は少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または
少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少
なくとも約９９％、または１００％の配列同一性を有する、項目７２または項目７３に記
載の共役組成物。
（項目７５）
前記ＸＴＥＮが、ＡＥ１４４、ＡＥ２８８、ＡＥ４３２、ＡＥ５７６、ＡＥ８６４、セ
グメント１７４、セグメント１７５、セグメント１７６、セグメント１７７、セグメント
１８６、セグメント１８７、セグメント１８８、セグメント１８９、セグメント１９０、
セグメント１９１、セグメント１９２、セグメント１９３、セグメント１９４、セグメン
ト１９５、セグメント１９６、セグメント１９７、セグメント１９８、およびセグメント
１９９からなる群から選択され、前記架橋剤が、前記ＸＴＥＮの前記Ｎ末端アミノ酸の前
記αアミノ基に共役される、項目７４に記載の共役組成物。
（項目７６）
前記ＸＴＥＮが、表３に記載されるセグメント１７４、セグメント１７５、セグメント
１７６、セグメント１７７、セグメント１８６、セグメント１８７、セグメント１８８、
セグメント１８９、セグメント１９０、セグメント１９１、セグメント１９２、セグメン
ト１９３、セグメント１９４、セグメント１９５、セグメント１９６、セグメント１９７
、セグメント１９８、およびセグメント１９９からなる群から選択され、前記架橋剤が、
前記ＸＴＥＮの各システイン残基の前記チオール基に共役される、項目７４に記載の共役
組成物。
（項目７７）
前記第１の架橋剤が、Ｎ−マレイミド、ヨードアセチル試薬、ピリジルジスルフィド試
薬、ビニルスルホン試薬、３−プロパルギルオキシプロパン酸、（オキシエチル）ｎ−ア
セチレン（ｎが１〜１０）、ジベンジルシクロオクチン（ＤＢＣＯ）、シクロオクチン（
ＣＯＴ）、３−アジド−プロピオン酸、６−アジド−ヘキサン酸、および（オキシエチル
）ｎ−アジド（ｎが１〜１０）からなる群から選択される、項目７２〜７６のいずれか１
項に記載の共役体。
（項目７８）
前記第１の架橋剤が、前記ＸＴＥＮの各システイン残基の前記チオール基に共役され、
前記共役体が、前記ＸＴＥＮの前記Ｎ末端アミノ酸の前記αアミノ基に共役された第２の
架橋剤をさらに含み、前記架橋剤が、表１３に記載される架橋剤、表１５に記載のアルキ
ン反応物、および表１５に記載のアジド反応物からなる群から選択される、項目７６に記
載の共役組成物。
（項目７９）
式Ｖ：
の構成を有し、式中、独立して、各発生に対し、
ａ． ＣＬ１が、前記ＸＴＥＮのシステイン残基に共役された前記第１の架橋剤であり、
ｂ． ＣＬ２が、前記Ｎ末端においてＸＴＥＮに共役された前記第２の架橋剤であり、
ｃ． ｘが、１〜約１０の整数であり、
ｄ． ｙが整数１であるが、但し、ｘ＋ｙ＞２を条件とし、
ｅ． ＸＴＥＮが、ｘ個のシステイン残基を含むシステイン操作されたＸＴＥＮである、
項目７８に記載の共役組成物。
（項目８０）
各第１の架橋剤に共役された第１のペイロードの単一原子残基をさらに含み、前記残基
が、炭素、窒素、酸素、および硫黄からなる群から選択される、項目７２〜７７のいずれ
か１項に記載の共役組成物。
（項目８１）
前記単一原子残基の前記第１のペイロードが、表６、７、１８、および２１に記載され
るペイロードからなる群から選択される、項目８０に記載の共役組成物。
（項目８２）
各第１の架橋剤に共役された表６、７、１８、および２１に記載されるペイロードから
なる群から選択されるペイロードをさらに含む、項目７２〜７７のいずれか１項に記載の
共役組成物。
（項目８３）
第１の架橋剤のそれぞれに共役された第１のペイロードの単一原子残基であって、炭素
、窒素、酸素、および硫黄からなる群から選択される残基と、前記第２の架橋剤に共役さ
れた第２のペイロードの単一原子残基であって、炭素、窒素、酸素、および硫黄からなる
群から選択される残基と、をさらに含む、項目７８または項目７９に記載の共役組成物。
（項目８４）
前記単一原子残基の前記第１のペイロードが、表６、７、１８、および２１に記載され
るペイロードからなる群から選択され、前記単一原子残基の前記第２のペイロードが、前
記第１のペイロードとは異なるペイロードであり、表６、７、１８、および２１に記載さ
れるペイロードからなる群から選択される、項目８３に記載の共役組成物。
（項目８５）
前記第１の架橋剤のそれぞれに共役された第１のペイロードであって、表６、７、１８
、および２１に記載されるペイロードからなる群から選択される、第１のペイロードと、
前記第２の架橋剤に共役された前記第１のペイロードとは異なる第２のペイロードであっ
て、表６、７、１８、および２１に記載されるペイロードからなる群から選択される、第
２のペイロードと、をさらに含む、項目７８または項目７９に記載の共役組成物。
（項目８６）
前記第１の架橋剤のそれぞれに共役された第１のペイロードであって、表２１の薬物部
分からなる群から選択される、第１のペイロードと、前記第２の架橋剤に共役された前記
第１のペイロードとは異なる第２のペイロードであって、表２１の標的部分からなる群か
ら選択される、第２のペイロードと、をさらに含む、項目７８または項目７９に記載の共
役組成物。
（項目８７）
前記第２のペイロードが、表１５の反応物からなる群から選択される、アルキン反応物
とアジド反応物との反応によって共役された前記第２の架橋剤によって、前記ＸＴＥＮの
前記Ｎ末端に結合される、項目８５または項目８６に記載の共役組成物。
（項目８８）
少なくとも第１および第２のＸＴＥＮを含む、共役組成物であって、前記ＸＴＥＮが、
同じであるか、または異なり、それぞれが項目３７に記載のＸＴＥＮ、項目４２に記載の
ＸＴＥＮ、項目７に記載のＸＴＥＮ、および表３に記載される配列からなる群から選択さ
れ、前記第１および前記第２のＸＴＥＮが、前記第１および前記第２のＸＴＥＮの前記Ｎ
末端によって、表１５の反応物からなる群から選択されるアルキン反応物とアジド反応物
との反応によって形成された架橋剤を用いて互いに共役される、共役組成物。
（項目８９）
前記第１のＸＴＥＮおよび前記第２のＸＴＥＮが異なり、それぞれが独立して、表３に
記載される配列の群から選択される配列に対して少なくとも約９０％、または少なくとも
約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約
９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９
７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％、または１００％の配列同
一性を有する、項目８８に記載の共役組成物。
（項目９０）
前記第１のＸＴＥＮが、表３に記載されるセグメント１７４、セグメント１７５、セグ
メント１７６、セグメント１７７、セグメント１８６、セグメント１８７、セグメント１
８８、セグメント１８９、セグメント１９０、セグメント１９１、セグメント１９２、セ
グメント１９３、セグメント１９４、セグメント１９５、セグメント１９６、セグメント
１９７、セグメント１９８、およびセグメント１９９からなる配列の群から選択される配
列に対して少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％
、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、
または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、ま
たは少なくとも約９９％、または１００％の配列同一性を有し、前記第２のＸＴＥＮが、
表３に記載されるセグメント１７４、セグメント１７５、セグメント１７６、セグメント
１７７、セグメント１８６、セグメント１８７、セグメント１８８、セグメント１８９、
セグメント１９０、セグメント１９１、セグメント１９２、セグメント１９３、セグメン
ト１９４、セグメント１９５、セグメント１９６、セグメント１９７、セグメント１９８
、およびセグメント１９９からなる配列の群から選択される異なる配列に対して少なくと
も約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも
約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約
９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９
９％、または１００％の配列同一性を有する、項目８９に記載の共役組成物。
（項目９１）
前記第１のＸＴＥＮおよび前記第２のＸＴＥＮが、同じであり、それぞれが、表３に記
載される配列の群から選択される配列に対して少なくとも約９０％、または少なくとも約
９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９
４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７
％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％、または１００％の配列同一
性を有する、項目８８に記載の共役組成物。
（項目９２）
前記第１のＸＴＥＮおよび前記第２のＸＴＥＮが、それぞれ、表３に記載されるセグメ
ント１７４、セグメント１７５、セグメント１７６、セグメント１７７、セグメント１８
６、セグメント１８７、セグメント１８８、セグメント１８９、セグメント１９０、セグ
メント１９１、セグメント１９２、セグメント１９３、セグメント１９４、セグメント１
９５、セグメント１９６、セグメント１９７、セグメント１９８、およびセグメント１９
９からなる配列の群から選択される配列に対して少なくとも約９０％、または少なくとも
約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約
９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９
７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％、または１００％の配列同
一性を有する、項目９１に記載の共役組成物。
（項目９３）
前記第１および前記第２のＸＴＥＮが、それぞれ、１つ以上のシステイン残基を含み、
前記第１のＸＴＥＮの各システイン残基に共役された第１の架橋剤と、前記第２のＸＴＥ
Ｎの各システイン残基に共役された第２の架橋剤と、をさらに含み、前記第１および前記
第２の架橋剤が、独立して、表１３に記載される架橋剤からなる群から選択される、項目
８８〜９２のいずれか１項に記載の共役組成物。
（項目９４）
前記第１および前記第２のＸＴＥＮが、それぞれ、１つ以上のリジン残基を含み、前記
共役体の第１および／または前記第２のＸＴＥＮの各リジン残基に共役された架橋剤をさ
らに含み、前記架橋剤が、表１３に記載される架橋剤からなる群から選択される、項目８
８〜９２のいずれか１項に記載の共役組成物。
（項目９５）
前記第１のＸＴＥＮの各架橋剤に共役された第１のペイロードの単一原子残基をさらに
含み、前記残基が、炭素、窒素、酸素、および硫黄からなる群から選択され、前記第２の
ＸＴＥＮの各架橋剤に共役された第２のペイロードの単一原子残基であって、前記残基が
、炭素、窒素、酸素、および硫黄からなる群から選択される、項目９３または項目９４に
記載の共役組成物。
（項目９６）
前記単一原子残基の前記第１のペイロードが、表６、７、１８、および２１に記載され
るペイロードからなる群から選択され、前記単一原子残基の前記第２のペイロードが、前
記第１のペイロードとは異なるペイロードであり、表６、７、１８、および２１に記載さ
れるペイロードからなる群から選択される、項目９５に記載の共役組成物。
（項目９７）
前記第１のＸＴＥＮの各架橋剤に共役された第１のペイロードをさらに含み、前記第１
のペイロードが、表６、７、１８、および２１に記載されるペイロードからなる群から選
択され、前記第１のペイロードとは異なる第２のペイロードをさらに含み、前記第２のペ
イロードが、表６、７、１８、および２１に記載されるペイロードからなる群から選択さ
れる、項目９３または項目９４に記載の共役組成物。
（項目９８）
前記第１のＸＴＥＮの各架橋剤に共役された第１のペイロードをさらに含み、前記第１
のペイロードが、表１８に記載される標的部分からなる群から選択され、前記第１のペイ
ロードとは異なる第２のペイロードをさらに含み、前記第２のペイロードが、表１８に記
載される毒素の群から選択される、項目９３または項目９４に記載の共役組成物。
（項目９９）
前記第１のＸＴＥＮの各架橋剤に共役された第１のペイロードをさらに含み、前記第１
のペイロードが、表２１に記載される標的部分からなる群から選択され、前記第１のペイ
ロードとは異なる第２のペイロードをさらに含み、前記第２のペイロードが、表２１に記
載される毒素の群から選択される、項目９３または項目９４に記載の共役組成物。
（項目１００）
前記第１のＸＴＥＮが、表３のセグメント１７６であり、前記第２のＸＴＥＮが、表３
に記載されるセグメント１７６およびセグメント１７７からなる群から選択される、項目
９９に記載の共役組成物。
（項目１０１）
少なくとも第１のＸＴＥＮ、第２のＸＴＥＮ、および第３のＸＴＥＮを含む、共役組成
物であって、前記ＸＴＥＮが、それぞれ、独立して、項目３７に記載のＸＴＥＮ、項目４
２に記載のＸＴＥＮ、項目７に記載のＸＴＥＮ、および表３に記載の配列からなる群から
選択され、前記第１および前記第２および前記第３のＸＴＥＮが、表１３または表１４に
記載される三価架橋剤からなる群から選択される三価架橋剤を使用し、前記Ｎ末端で互い
に共役される、共役組成物。
（項目１０２）
前記三価架橋剤が、トリス−（２−マレイミドエチル）アミン（ＴＭＥＡ）およびアミ
ン反応性トリス−（スクシンイミジルアミノトリアセテート（ＴＳＡＴ）からなる群から
選択される、項目１００に記載の共役組成物。
（項目１０３）
前記第１、前記第２、および前記第３のＸＴＥＮが、同一であり、それぞれが、表３に
記載されるセグメント１７４、セグメント１７５、セグメント１７６、セグメント１７７
、セグメント１８６、セグメント１８７、セグメント１８８、セグメント１８９、セグメ
ント１９０、セグメント１９１、セグメント１９２、セグメント１９３、セグメント１９
４、セグメント１９５、セグメント１９６、セグメント１９７、セグメント１９８、およ
びセグメント１９９からなる群から選択される配列に対して少なくとも約９０％、または
少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少
なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少な
くとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％、または１００
％の配列同一性を有する、項目１００〜１０２のいずれか１項に記載の共役組成物。
（項目１０４）
前記第１および前記第２のＸＴＥＮが、同じであり、それぞれが、表３に記載されるセ
グメント１７４、セグメント１７５、セグメント１７６、セグメント１７７、セグメント
１８６、セグメント１８７、セグメント１８８、セグメント１８９、セグメント１９０、
セグメント１９１、セグメント１９２、セグメント１９３、セグメント１９４、セグメン
ト１９５、セグメント１９６、セグメント１９７、セグメント１９８、およびセグメント
１９９からなる群から選択される配列に対して少なくとも約９０％、または少なくとも約
９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９
４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７
％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％、または１００％の配列同一
性を有し、前記第３のＸＴＥＮが、前記第１および前記第２のＸＴＥＮとは異なり、表３
に記載されるセグメント１７４、セグメント１７５、セグメント１７６、セグメント１７
７、セグメント１８６、セグメント１８７、セグメント１８８、セグメント１８９、セグ
メント１９０、セグメント１９１、セグメント１９２、セグメント１９３、セグメント１
９４、セグメント１９５、セグメント１９６、セグメント１９７、セグメント１９８、お
よびセグメント１９９からなる群から選択される配列に対して少なくとも約９０％、また
は少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または
少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少
なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％、または１０
０％の配列同一性を有する、項目１００〜１０２のいずれか１項に記載の共役組成物。
（項目１０５）
前記共役体が、前記第１のＸＴＥＮの各システイン残基に共役された第１の架橋剤と、
前記第２のＸＴＥＮの各システイン残基に共役された第２の架橋剤と、前記第３のＸＴＥ
Ｎの各システイン残基に共役された第３の架橋剤と、をさらに含み、前記架橋剤が、表１
３に記載される架橋剤からなる群から選択される、項目１０３または項目１０４に記載の
共役組成物。
（項目１０６）
式ＸＩＩ：

の構成を有し、式中、独立して、各発生に対し、
ａ． ３ｘＣＬが、前記三価架橋剤であり、
ｂ． ＣＬ１が、ＸＴＥＮ１に共役された前記第１の架橋剤であり、
ｃ． ＣＬ２が、ＸＴＥＮ２に共役された前記第２の架橋剤であり、
ｄ． ＣＬ３が、ＸＴＥＮ３に共役された前記第３の架橋剤であり、
ｅ． ｘが、１〜約１０の整数であり、
ｆ． ｙが、１〜約１０の整数であり、
ｇ． ｚが、１〜約１０の整数であるが、但し、ｘ＋ｙ＞３を条件とし、
ｈ． ＸＴＥＮ１が、前記第１のＸＴＥＮであり、
ｉ． ＸＴＥＮ２が、前記第２のＸＴＥＮであり、
ｊ． ＸＴＥＮ３が、前記第３のＸＴＥＮである、項目１０５に記載の共役組成物。
（項目１０７）
ａ． 前記第１のＸＴＥＮの各第１の架橋剤に共役された第１のペイロードの単一原子残
基であって、炭素、窒素、酸素、および硫黄からなる群から選択される、残基と、
ｂ． 前記第２のＸＴＥＮの各第２の架橋剤に共役された第２のペイロードの単一原子残
基であって、炭素、窒素、酸素、および硫黄からなる群から選択される、残基と、
ｃ． 前記第３のＸＴＥＮの各第３の架橋剤に共役された第３のペイロードの単一原子残
基であって、炭素、窒素、酸素、および硫黄からなる群から選択される、残基と、をさら
に含む、項目１０５または項目１０６に記載の共役組成物。
（項目１０８）
ａ． 表６、７、１８、および２１に記載されるペイロードからなる群から選択される
、前記第１のＸＴＥＮの各第１の架橋剤に共役された第１のペイロードと、
ｂ． 表６、７、１８、および２１に記載されるペイロードからなる群から選択される、
前記第２のＸＴＥＮの各第２の架橋剤に共役された第２のペイロードと、
ｃ． 表６、７、１８、および２１に記載されるペイロードからなる群から選択される、
前記第３のＸＴＥＮの各第３の架橋剤に共役された第３のペイロードと、をさらに含む、
項目１０５または項目１０６に記載の共役組成物。
（項目１０９）
前記第１のペイロードが、標的に対する特異的結合親和性を持つ標的部分であり、前記
標的部分が、表１７〜１９および２１に記載される標的部分からなる群から選択され、前
記第２および前記第３のペイロードが、同じであり得るか、または異なり得る薬物であり
、前記薬物が、表６、表１８、および表２１に記載される薬物からなる群から選択される
、項目１０８に記載の共役組成物。
（項目１１０）
前記標的部分が、ＬＨＲＨおよび葉酸からなる群から選択され、前記薬物が、ドキソル
ビシン、パクリタキセル、オーリスタチン、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、
モノメチルオーリスタチンＦ、メイタンシン、ドラスタチン、カリケアミシン、ビンカア
ルカロイド、カンプトテシン、ミトマイシンＣ、エポチロン、ｈＴＮＦ、Ｉ１−１２、ボ
ルテゾミブ、ランピルナーゼ、スードモナス、エキソトキシン、ＳＮ−３８、およびラケ
ルマイシンからなる群から選択される、項目１０９に記載の共役組成物。
（項目１１１）
前記標的部分、および前記薬物部分が、表２１に記載される共役体１〜２９０のうちの
いずれか１つに対応する、項目１０８に記載の共役組成物。
（項目１１２）
前記共役体が、前記ＸＴＥＮ、前記標的部分、および表２１の共役体７１に対応する前
記薬物部分を有する、項目１１１に記載の共役組成物。
（項目１１３）
少なくとも第１および第２および第３および第４のＸＴＥＮを含む共役組成物であって
、前記ＸＴＥＮが、項目３７に記載のＸＴＥＮ、項目４２に記載のＸＴＥＮ、項目７に記
載のＸＴＥＮ、および表３に記載される配列からなる群から選択され、前記ＸＴＥＮが、
同じであり得るか、または異なり得、前記第１および前記第２および前記第３および前記
第４のＸＴＥＮが、四価架橋剤を使用し、前記Ｎ末端によって互いに共役され、前記四価
架橋剤が、四価マレイミドクラスターである、共役組成物。
（項目１１４）
前記第１、前記第２、前記第３、および前記第４のＸＴＥＮが、同じであり、それぞれ
が、表３に記載される、セグメント１７４、セグメント１７５、セグメント１７６、セグ
メント１７７、セグメント１８６、セグメント１８７、セグメント１８８、セグメント１
８９、セグメント１９０、セグメント１９１、セグメント１９２、セグメント１９３、セ
グメント１９４、セグメント１９５、セグメント１９６、セグメント１９７、セグメント
１９８、およびセグメント１９９からなる群から選択される配列に対して少なくとも約９
０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３
％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％
、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％、
または１００％の配列同一性を有する、項目１１３に記載の共役組成物。
（項目１１５）
前記第１および前記第２のＸＴＥＮが、同じであり、それぞれが、表３に記載されるセ
グメント１７４、セグメント１７５、セグメント１７６、セグメント１７７、セグメント
１８６、セグメント１８７、セグメント１８８、セグメント１８９、セグメント１９０、
セグメント１９１、セグメント１９２、セグメント１９３、セグメント１９４、セグメン
ト１９５、セグメント１９６、セグメント１９７、セグメント１９８、およびセグメント
１９９からなる群から選択される配列に対して少なくとも約９０％、または少なくとも約
９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９
４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７
％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％、または１００％の配列同一
性を有し、前記第３および前記第４のＸＴＥＮが、同じであるが、前記第１および前記第
２のＸＴＥＮとは異なり、それぞれが、表３に記載されるセグメント１７４、セグメント
１７５、セグメント１７６、セグメント１７７、セグメント１８６、セグメント１８７、
セグメント１８８、セグメント１８９、セグメント１９０、セグメント１９１、セグメン
ト１９２、セグメント１９３、セグメント１９４、セグメント１９５、セグメント１９６
、セグメント１９７、セグメント１９８、およびセグメント１９９からなる群から選択さ
れる配列に対して少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約
９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９
５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８
％、または少なくとも約９９％、または１００％の配列同一性を有する、項目１１３のい
ずれか１項に記載の共役組成物。
（項目１１６）
前記共役体が、前記第１のＸＴＥＮの各システイン残基に共役された第１の架橋剤と、
前記第２のＸＴＥＮの各システイン残基に共役された第２の架橋剤と、前記第３のＸＴＥ
Ｎの各システイン残基に共役された第３の架橋剤と、前記第４のＸＴＥＮの各システイン
残基に共役された第４の架橋剤と、をさらに含み、各架橋剤が、表１３に記載される架橋
剤からなる群から選択される、項目１１４または項目１１５に記載の共役組成物。
（項目１１７）
式ＸＩＶ

の構成を有し、式中、独立して、各発生に対し、
ａ． ４ｘＣＬが、前記四価架橋剤であり、
ｂ． ＣＬ１が、ＸＴＥＮ１に共役された前記第１の架橋剤であり、
ｃ． ＣＬ２が、ＸＴＥＮ２に共役された前記第２の架橋剤であり、
ｄ． ＣＬ３が、ＸＴＥＮ３に共役された前記第３の架橋剤であり、
ｅ． ＣＬ４が、ＸＴＥＮ４に共役された前記第４の架橋剤であり、
ｆ． ｖが、１〜約１０の整数であり、
ｇ． ｘが、１〜約１０の整数であり、
ｈ． ｙが、１〜約１０の整数であり、
ｉ． ｚが、１〜約１０の整数であるが、但し、ｘ＋ｙ＞４を条件とし、
ｊ． ＸＴＥＮ１が、前記第１のＸＴＥＮであり、
ｋ． ＸＴＥＮ２が、前記第２のＸＴＥＮであり、
ｌ． ＸＴＥＮ３が、前記第３のＸＴＥＮであり、
ｍ． ＸＴＥＮ４が、前記第４のＸＴＥＮである、項目１１６のいずれか１項に記載の共
役組成物。
（項目１１８）
ａ． 前記第１のＸＴＥＮの各第１の架橋剤に共役された第１のペイロードの単一原子残
基であって、炭素、窒素、酸素、および硫黄からなる群から選択される、残基と、
ｂ． 前記第２のＸＴＥＮの各第２の架橋剤に共役された第２のペイロードの単一原子残
基であって、炭素、窒素、酸素、および硫黄からなる群から選択される、残基と、
ｃ． 前記第３のＸＴＥＮの各第３の架橋剤に共役された第３のペイロードの単一原子残
基であって、炭素、窒素、酸素、および硫黄からなる群から選択される、残基と、
ｄ． 前記第４のＸＴＥＮの各第４の架橋剤に共役された第４のペイロードの単一原子残
基であって、炭素、窒素、酸素、および硫黄からなる群から選択される、残基と、をさら
に含む、項目１１６または項目１１７に記載の共役組成物。
（項目１１９）
ａ． 表６、７、１８、および２１に記載されるペイロードからなる群から選択される、
前記第１のＸＴＥＮの各第１の架橋剤に共役された第１のペイロードと、
ｂ． 表６、７、１８、および２１に記載されるペイロードからなる群から選択される、
前記第２のＸＴＥＮの各第２の架橋剤に共役された第２のペイロードであって、前記第１
のペイロードと同じであるか、または異なる、ペイロードと、
ｃ． 表６、７、１８、および２１に記載されるペイロードからなる群から選択される、
前記第３のＸＴＥＮの各第３の架橋剤に共役された第３のペイロードであって、前記第１
または前記第２のペイロードと同じであるか、または異なる、ペイロードと、
ｄ． 表６、７、１８、および２１に記載されるペイロードからなる群から選択される、
前記第４のＸＴＥＮの各第４の架橋剤に共役された第４のペイロードであって、前記第１
または前記第２または前記第３のペイロードと同じであるか、または異なる、ペイロード
と、をさらに含む、項目１１６または項目１１７に記載の共役組成物。
（項目１２０）
前記第１のペイロードが、標的に対する特異的結合親和性を持つ標的部分であり、前記
標的部分が、表１７〜１９および２１に記載される標的部分からなる群から選択され、前
記第２、第３、および第４のペイロードのうちの少なくとも他の１つが、薬物であり、前
記薬物が、表６、表１８、および表２１に記載される薬物からなる群から選択される、項
目１１９に記載の共役組成物。
（項目１２１）
前記標的部分が、ＬＨＲＨおよび葉酸からなる群から選択され、前記薬物が、ドキソル
ビシン、パクリタキセル、オーリスタチン、メイタンシン、ドラスタチン、カリケアミシ
ン、ビンカアルカロイド、カンプトテシン、ミトマイシンＣ、エポチロン、ｈＴＮＦ、Ｉ
１−１２、ボルテゾミブ、ランピルナーゼ、スードモナス、エキソトキシン、ＳＮ−３８
、およびラケルマイシンからなる群から選択される、項目１２０に記載の共役組成物。
（項目１２２）
前記第１のペイロードが、標的に対する特異的結合親和性を持つ標的部分であり、前記
標的部分が、表１７〜１９および２１に記載される標的部分からなる群から選択され、前
記第２、第３、および第４のペイロードのうちの少なくとも他の１つが、薬物であり、前
記薬物が、表６、表１８、および表２１に記載される薬物からなる群から選択され、前記
ＸＴＥＮ、前記標的部分、および前記薬物部分が、表２１に記載される共役体１〜２９０
のうちのいずれか１つに対応する、項目１１９に記載の共役組成物。
（項目１２３）
式ＸＶＩ：

の構成を有し、式中、独立して、各発生に対し、
ａ． ３ｘＣＬが、前記三価架橋剤であり、
ｂ． ＣＬ１が、ＸＴＥＮ１に共役された前記第１の架橋剤であり、
ｃ． ＣＬ２が、ＸＴＥＮ２に共役された前記第２の架橋剤であり、
ｄ． ｘが、１〜約１０の整数であり、
ｅ． ｙが整数１〜約１０であるが、但し、ｘ＋ｙ＞２を条件とし、
ｆ． ＸＴＥＮ１が、前記第１のＸＴＥＮであり、
ｇ． ＸＴＥＮ２が、前記第２のＸＴＥＮであり、
ｈ． ＸＴＥＮ３が、前記第３のＸＴＥＮであり、前記ＸＴＥＮが、表２に記載される配
列からなる群から選択される、項目１０１に記載の共役組成物。
（項目１２４）
ａ． 前記第１のＸＴＥＮの各第１の架橋剤に共役された第１のペイロードの単一原子残
基であって、炭素、窒素、酸素、および硫黄からなる群から選択される、残基と、
ｂ． 前記第２のＸＴＥＮの各第２の架橋剤に共役された第２のペイロードの単一原子残
基であって、炭素、窒素、酸素、および硫黄からなる群から選択される、残基と、をさら
に含む、項目１２３に記載の共役組成物。
（項目１２５）
ａ． 表６、７、１８、および２１に記載されるペイロードからなる群から選択される、
前記第１のＸＴＥＮの各第１の架橋剤に共役された第１のペイロードと、
ｂ． 表６、７、１８、および２１に記載されるペイロードからなる群から選択される、
前記第２のＸＴＥＮの各第２の架橋剤に共役された第２のペイロードであって、前記第１
のペイロードと同じであるか、または異なる、ペイロードと、をさらに含む、項目１２３
に記載の共役組成物。
（項目１２６）
前記第１のペイロードが、標的に対する特異的結合親和性を持つ標的部分であり、前記
標的部分が、表１７〜１９および２１に記載される標的部分からなる群から選択され、前
記第２のペイロードが、同じであり得るか、または異なり得る薬物であり、前記薬物が、
表６、表１８、および表２１に記載される薬物からなる群から選択される、項目１２５に
記載の共役組成物。
（項目１２７）
前記標的部分が、ＬＨＲＨおよび葉酸からなる群から選択され、前記薬物が、ドキソル
ビシン、パクリタキセル、オーリスタチン、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、
モノメチルオーリスタチンＦ、メイタンシン、ドラスタチン、カリケアミシン、ビンカア
ルカロイド、カンプトテシン、ミトマイシンＣ、エポチロン、ｈＴＮＦ、Ｉ１−１２、ボ
ルテゾミブ、ランピルナーゼ、スードモナス、エキソトキシン、ＳＮ−３８、およびラケ
ルマイシンからなる群から選択される、項目１２６に記載の共役組成物。
（項目１２８）
前記第１のペイロードが、表１１の薬物および表１２のタンパク質からなる群から選択
され、前記第２のペイロードが、前記第１のペイロードとは異なり、表１１の薬物および
表１２のタンパク質からなる群から選択される、項目１２５に記載の共役組成物。
（項目１２９）
前記第１のペイロードおよび前記第２のペイロードが、同一であり、表１１の薬物およ
び表１２のタンパク質からなる群から選択される、項目１２５に記載の共役組成物。
（項目１３０）
式ＸＸＶＩＩ：

の構成を有し、式中、独立して、各発生に対し、
ａ． ３ｘＣＬが、前記三価架橋剤であり、
ｂ． ＣＬ１が、ＸＴＥＮ１に共役された前記第１の架橋剤であり、
ｃ． ｘが、１〜約１０の整数であり、
ｄ． ＸＴＥＮ１が、前記第１のＸＴＥＮであり、前記ＸＴＥＮが、表３に記載される配
列からなる群から選択され、
ｅ． ＸＴＥＮ２が、前記第２のＸＴＥＮであり、前記ＸＴＥＮが、表２に記載される配
列からなる群から選択され、
ｆ． ＸＴＥＮ３が、前記第３のＸＴＥＮであり、前記ＸＴＥＮが、表２に記載される配
列からなる群から選択される、項目１０１に記載の共役組成物。
（項目１３１）
前記第１のＸＴＥＮの各第１の架橋剤に共役された第１のペイロードの単一原子残基を
さらに含み、前記残基が、炭素、窒素、酸素、および硫黄からなる群から選択される、項
目１３０に記載の共役組成物。
（項目１３２）
表６、７、１８、および２１に記載されるペイロードからなる群から選択される、前記
第１のＸＴＥＮの各第１の架橋剤に共役された第１のペイロードをさらに含む、項目１３
０に記載の共役組成物。
（項目１３３）
多量体分岐ＸＴＥＮ分子を含む組成物であって、前記組成物の溶液が、同じアミノ酸数
および同じモル濃度を有する対応する直線ＸＴＥＮを含む溶液よりも低い粘度を有する、
組成物。
（項目１３４）
前記ＸＴＥＮ分子が、三量体、四量体、または五量体構成を有する、項目１３３に記載
の組成物。
（項目１３５）
前記ＸＴＥＮ分子が、表２および表３に記載される配列からなる群から選択される、項
目１３３に記載の組成物。
（項目１３６）
前記溶液の前記粘土が、≧１００ｍｇ／ｍｌの多量体ＸＴＥＮを含む溶液中で、≧１０
０ｍｇ／ｍｌの等モル濃度の前記対応する直線ＸＴＥＮを含む溶液と比較して、少なくと
も５、６、７、８、９、または１０ｃＰだけ減少する、項目１３３〜１３５のいずれか１
項に記載の組成物。
（項目１３７）
表５２に記載される配列の群から選択される配列に対して少なくとも約９０％、または
少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少
なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少な
くとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％、または１００
％の配列同一性を有する、ポリペプチド。
（項目１３８）
項目８５〜８７、９７〜９９、１０８〜１１２、１１８〜１２２、１２５〜１２７、１
２９、または１３２のいずれか１項に記載の前記共役体と、薬学的に許容される担体とを
含む、薬学的組成物。
（項目１３９）
表１６に記載される状態の群から選択される状態の処置のための項目１３８に記載の薬
学的組成物。
（項目１４０）
対象の処置のための薬学的計画において使用するための、前記計画が、前記薬学的組成
物を含む、項目１３８に記載の薬学的組成物。
（項目１４１）
前記薬学的計画が、表１６に記載される状態の群から選択される状態を有する対象にお
いて、有益な効果を達成するために必要とされる薬学的組成物の量を決定するステップを
さらに含む、項目１４０に記載の薬学的組成物。
（項目１４２）
前記対象を処置するための前記薬学的計画が、前記薬学的組成物を２つ以上の連続用量
で前記対象に有効な量で投与することを含み、前記投与が、未処置の対象と比較して、前
記状態と関連付けられた少なくとも１つ、２つ、または３つのパラメータの少なくとも１
０％、または２０％、または３０％、または４０％、または５０％、または６０％、また
は６０％、または７０％、または８０％、または９０％超の改善をもたらす、項目１４１
に記載の薬学的組成物。
（項目１４３）
表１６に記載される状態の群から選択される状態の処置のための薬剤の調製において使
用するための、項目８５〜８７、９７〜９９、１０８〜１１２、１１８〜１２２、１２５
〜１２７、１２９、または１３２のいずれか１項に記載の共役体。
（項目１４４）
ＸＴＥＮに結合されたペイロードの組合せを治療薬として選択する方法であって、
ａ． 複数のＸＴＥＮ配列を含むＸＴＥＮのライブラリーを提供することであって、前記
ＸＴＥＮ配列のそれぞれが、少なくとも第１のペイロード、および前記第１のペイロード
とは異なる少なくとも第２のペイロードに共役される、提供することと、
ｂ． 前記ライブラリーから、（１）前記第１のペイロード単独に共役されたＸＴＥＮ配
列、および（２）前記第２のペイロード単独に共役されたＸＴＥＮ配列のものと比較して
、改善されたインビトロまたはインビボパラメータを呈する場合に、ＸＴＥＮ配列を治療
薬として選択することと、を含む、方法。
（項目１４５）
前記第１のペイロードおよび第２のペイロードが、共通の疾患を寛解させるために治療
上有効である、項目１４４に記載の方法。
（項目１４６）
前記第１の薬物および第２の薬物が、共通の疾患の異なる症状を処置するために治療上
有効である、項目１４４に記載の方法。
（項目１４７）
前記共通の疾患が、癌、癌の支持療法、心血管、中枢神経系、内分泌疾患、消化管、血
液学的、ＨＩＶ感染、ホルモン疾患、炎症、自己免疫疾患、感染症、代謝疾患、筋骨格系
疾患、腎臓学的障害、眼科疾患、疼痛、および呼吸器から選択される、項目１４５または
項目１４６に記載の方法。
（項目１４８）
前記第１のペイロードおよび第２のペイロードが、共通の生物学的経路を介して、それ
らの治療効果を媒介する、項目１４４に記載の方法。
（項目１４９）
前記第１のペイロードおよび第２のペイロードが、表６、表１８、および表２１に記載
される薬物からなる群から選択される、異なる薬物である、項目１４４に記載の方法。
（項目１５０）
前記第１のペイロードおよび第２のペイロードが、表７、表１８、および表２１に記載
されるタンパク質からなる群から選択される、異なる生物学的に活性なタンパク質である
、項目１４４に記載の方法。
（項目１５１）
前記第１のペイロードが、表６、表１８、および表２１に記載される薬物からなる群か
ら選択される薬物であり、前記第２のペイロードが、表７、表１８、および表２１に記載
されるタンパク質からなる群から選択される生物学的に活性なタンパク質である、項目１
４４に記載の方法。
（項目１５２）
ＳＡＳＲＳＡまたはＳＡＳＸＳＡ（Ｘが、ＲまたはＫである）から選択される配列を有
する、タンパク質分解切断部位を介して、親和性精製タグに結合される伸長組換えポリペ
プチド（ＸＴＥＮ）を含む、単離されたポリペプチド。
（項目１５３）
ＳＡＳＲＳＡまたはＳＡＳＸＳＡ（Ｘが、ＲまたはＫである）から選択される配列を有
する、タンパク質分解切断部位を介して、そのＮ末端で第１の親和性精製タグに結合され
、ＳＡＳＲＳＡまたはＳＡＳＸＳＡ（Ｘが、ＲまたはＫである）から選択される配列を有
する、タンパク質分解切断部位を介して、そのＣ末端で第２の親和性精製タグに結合され
る、伸長組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ）を含む、ポリペプチド。
（項目１５４）
図１１７に記載される構造を有する組成物。
特に、共役体の実施形態は、本明細書に開示される特性のうちの１つ以上、またはそれ
らの任意の組合せを呈することができると企図される。さらに、本明細書に開示されるＸ
ＴＥＮ組成物のうちのいずれかは、本明細書に開示される方法のうちのいずれかにおいて
利用されることができる。
（参照による組み込み）
本明細書に記載される全ての刊行物、特許および特許出願は、各個別の刊行物、特許、
または特許出願が、明確かつ個別に参照により組み込まれることが示されているのと同程
度に、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明の特徴および利点は、例示の実施形態について記載する以下の詳細な説明および
添付の図面を参照することによりさらに説明され得る。
ペイロードとの共役に適したＸＴＥＮの概略図を示す。（図１Ａ）非修飾ＸＴＥＮを示す。（図１Ｂ）チオール側鎖を持つ内部システインを含むシステイン操作されたＸＴＥＮを示し、その下は、反応性Ｎ末端アミノ基を持つＸＴＥＮであり、その下は、チオール反応基を持つＮ末端システインを含むＸＴＥＮである。（図１Ｃ）複数の内部システインを持つシステイン操作されたＸＴＥＮを示す。（図１Ｄ）チオール側鎖持つ内部システインを含むシステイン操作されたＸＴＥＮ、および反応性Ｎ末端アミノ基の２つの変化形を示し、一番下は、内部システインおよび内部リジンを持つシステインおよびリジン操作されたＸＴＥＮを示す。 ＮＨＳ−エステルおよびそれらの水溶性類似体（スルホ−ＮＨＳ−エステル）を利用し、第１級アミノ基と反応させて安定したアミドＸＴＥＮ−ペイロード産物を生じる共役反応を示す。 チオール基およびＮ−マレイミドを利用する共役反応を示す。マレイミド基は、反応混合物のｐＨがｐＨ６．５〜７．５であるとき、スルフヒドリル基と特異的に反応し、可逆的ではない安定したチオエーテル結合を形成する。 ハロアセチルを利用する共役反応を示す。最も一般的に使用されるハロアセチル試薬は、生理的ｐＨでスルフヒドリル基と反応するヨードアセチル基を含有する。ヨードアセチル基とスルフヒドリルとの反応は、ヨードのチオールとの求核置換によって進行し、ＸＴＥＮ−ペイロード中で安定したチオエーテル結合を産生する。 ピリジルジスリフィドを利用する共役反応を示す。ピリジルジスルフィドは、広いｐＨ範囲（最適ｐＨは４〜５）にわたってスルフヒドリル基と反応し、ＸＴＥＮをペイロードに結合するジスルフィド結合を形成する。 ゼロ長架橋剤を利用する共役反応を示し、これらの架橋剤を使用して、１つの分子のカルボキシル官能基（例えば、ペイロード）を別の分子の第１級アミン（例えば、ＸＴＥＮ）に直接共役する。 デンドリマーを含む多官能性（または多価）のＸＴＥＮ前駆体の異なる構成を示す。三官能性リンカーの非限定例は、「Ｙ型」スルフヒドリル反応性（ＴＭＥＡ）（トリス−（２−マレイミドエチル）アミン）およびアミン反応性ＴＳＡＴ（トリス（スクシンイミジルアミノトリアセテート）である。反応性部分の任意の組合せは、直鎖状（「くし形」構成を形成する）または分岐（「デンドリマー」構成を形成する）のいずれかの足場ポリマーを使用して、多価表示のために設計され得る。 図示されるように、１，４−二置換−１，２，３−トリアゾールを形成するために、アルキンのアジドへのヒュスゲン１，３−双極性環状付加を利用する共役反応を示す。 チオール−エン反応と呼ばれる遊離ラジカル反応、またはチオールマイケル付加と呼ばれるアニオン性反応によって進行し得るチオ−エン系クリック化学を使用する共役反応を示す。 ヒドラジドとアルデヒドとの間の反応に基づくクリック化学を利用し、例示されるＸＴＥＮ−ペイロード中のヒドラゾン結合をもたらす共役反応を示す。 アミド結合の形成をもたらす、Ｃ末端アシルアジドと第１級アミノ基との間の反応を示す。 Ｃ末端チオエステルを求電子剤として、Ｎ末端システインを求核剤として必要とする、天然型化学的ライゲーション（Ｎａｔｉｖｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｌｉｇａｔｉｏｎ（ＮＣＬ））を利用する共役反応を示す。この反応の結果は、ＸＴＥＮ−ペイロード組成物のライゲーション部位における天然アミド結合である。 発現タンパク質ライゲーション（ＥＰＬ）法を利用する共役反応を示す。このＥＰＬ法は、タンパク質スプライシングに基づき、これはタンパク質が分子内分子内転移を受けて、内部配列（インテイン（ｉｎｔｅｉｎ））の突出および外側配列（エクステイン（ｅｘｔｅｉｎ））の接合をもたらすプロセスである。この方法において、融合タンパク質は、前駆体タンパク質のインテイン部分の第１のシステイン残基の側鎖が、すぐ上流の残基（つまり、例えば、ＸＴＥＮの最終残基）のペプチド結合を求核的に攻撃するときに、Ｎ−Ｓシフトを受け、直鎖状チオエステル中間体を創製し、ＸＴＥＮ−架橋剤とペイロードとの間のアミド結合を形成するための再配置が続く。 天然型化学的ライゲーション（ＮＣＬ）等のトレースレス（ｔｒａｃｅｌｅｓｓ）シュタウディンガーライゲーションを利用し、ライゲーション部位において天然型アミド結合をもたらす共役反応を示す。 酵素ライゲーションを利用する共役反応を示す。トランスグルタミナーゼは、ペイロードペプチドまたはタンパク質のグルタミンのγ−カルボキシアミド基と、リジン操作されたＸＴＥＮ中のリジンのεアミノ基（またはＮ末端アミノ基）との間のイソペプチド結合の形成を触媒し、それによりＸＴＥＮとペイロードとの間の分子間または分子内架橋を創製する酵素である。 黄色ブドウ球菌からのソルターゼＡトランスペプチダーゼ酵素を利用して、タンパク質１のトレオニン残基とグリシン残基との間の短い５アミノ酸認識配列ＬＰＸＴＧの切断を触媒し、後次にアシルフラグメントをタンパク質１のＮ末端オリゴグリシン求核剤に移すように、酵素的に創製されたＸＴＥＮ−ペイロード組成物を示す。オリゴグリシンを含有するようにタンパク質２を官能化することによって、２つのタンパク質の酵素共役は、部位特異的様式で達成され、所望のＸＴＥＮ−ペイロード組成物をもたらす。 ペイロードまたはＸＴＥＮ反応物に結合するように、反応物として使用される様々なＸＴＥＮ−架橋剤前駆体セグメントを示す。（図１７Ａ）１Ｂが、右側の前駆体の残りの反応基を表すことを示すよう意図される。（図１７Ｂ）ＸＴＥＮに共役された複数（左）または単一（右）のペイロードＡ分子を持つ類似の反応性前駆体を示す。 ペイロードまたは他のＸＴＥＮ反応物に結合するように反応物として使用される、架橋剤の２つの反応基または組み込まれたアミノ酸の反応基を用いたＸＴＥＮ−架橋剤前駆体セグメントの例示的な置換を示す。１Ｂおよび２Ｂは、他の図面において、１と１、および２と２等の同様に番号付けられた反応基と反応する反応基を表す。 図面の他の場所に示される構成について、様々な反応物および命名の例を示すことが意図される。（図１９Ａ）それぞれがＮ末端上に異なる反応基を持つ、反応性ＸＴＥＮセグメント前駆体の様々な形態を示す。（図１９Ｂ）２、３、または４個の反応基を持つ様々な架橋剤を示す。最初の例において、二価架橋剤は、「２」および「１」によって表される２つの異なる型の反応基と反応する、ヘテロ官能性リンカーである。三価および四価架橋剤の場合において、それぞれは、「１」によって表されるたった１つの型の反応基と反応する。（図１９Ｃ）２つのＸＴＥＮセグメント前駆体の反応産物の命名を示す。上のバージョンにおいて、１Ａは１Ｂと反応して、Ｎ末端で結合された二量体ＸＴＥＮを創製し、１ＡＲ−１ＢＲによって示される架橋剤の残基を有するが、下のバージョンも、Ｎ末端で結合された二量体ＸＴＥＮであり、２ＡＲ−２ＢＲによって示される架橋剤の残基を有する。 様々なＸＴＥＮ前駆体セグメントの創製を示す。（図２０Ａ）ＸＴＥＮポリペプチドを製造するステップを示し、２Ｂ−１Ａ反応基を持つ架橋剤とのＮ末端の反応に続いて、１Ａは、Ｎ末端１Ｂ（例えば、αアミノ酸）と反応して、反応基２Ｂを持つＸＴＥＮ前駆体２を創製する。（図２０Ｂ）ＸＴＥＮ前駆体４をもたらす、２Ａ反応基を持つ２つの架橋剤の、ＸＴＥＮの２Ｂ反応基への連続付加を示し、次いで、架橋剤の反応性１Ｂと１Ａとの間のＮ末端において架橋剤と反応し、反応基４Ｂおよび３Ｂを持つＸＴＥＮ前駆体５をもたらす。そのような場合、ＸＴＥＮ前駆体５は、２つの異なるペイロードまたはＸＴＥＮとの反応物として機能し得る。 多量体共役体の例を示す。（図２１Ａ）共役されたペイロードＡを持つＸＴＥＮの３つの分子が、三量体架橋剤にどのように共役され得、３つのＡペイロードを持つ三量体ＸＴＥＮ−ペイロード共役体をもたらすかを示す。（図２１Ｂ）ペイロードＡを持つポリペプチドの３つの分子が、三量体架橋剤にどのように共役され得、Ａペイロードを持つ３つのポリペプチドを持つ三量体ＸＴＥＮ−ペイロード共役体をもたらすかを示す。 単一システインを持つＸＴＥＮ前駆体を起源とし得る、多量体ＸＴＥＮ共役体の例を示す。ＸＴＥＮ前駆体中のアミノ基は、反応基２Ｂとして作用し、チオール基は、反応基１Ｂとして作用する。ＸＴＥＮ前駆体は、基１Ｂと反応することができる架橋剤を使用して架橋され得る。架橋剤の原子価は、得られる中間体の原子価を制御する。この架橋された中間体は、アミノ基と反応して共役結合２Ａ−ＢＲを形成することができる、反応基２Ａを担持するペイロードと反応することができる。（図２２Ａ）単一チオール基を持つＸＴＥＮ前駆体である。（図２２Ｂ）二価共役体である。（図２２Ｃ）三量体共役体である。（図２２Ｄ）四量体共役体である。 単一システインを持つＸＴＥＮ前駆体を起源とし得る、多量体ＸＴＥＮ共役体の例を示す。ＸＴＥＮ前駆体中のアミノ基は、反応基１Ｂとして作用し、チオール基は、反応基２Ｂとして作用する。ＸＴＥＮ前駆体は、基１Ｂと反応することができる架橋剤を使用して架橋され得る。架橋剤の原子価は、得られる中間体の原子価を制御する。この架橋された中間体は、チオール基と反応して共役結合２Ａ−ＢＲを形成することができる、反応基２Ａを担持するペイロードと反応することができる。（図２３Ａ）ＸＴＥＮのＣ末端の近くに位置するチオール基を示す。結果として、ペイロードは、最終の三量体共役体の遠位端に位置する。（図２３Ｂ）ＸＴＥＮのＮ末端の近くに位置するチオール基を示す。結果として、ペイロードは、ＸＴＥＮによるペイロード遮蔽の増加をもたらす、最終の三量体共役体の遠位端に位置する。 「くし形」構成の創製の例を示す。（図２４Ａ）リンカー反応基１Ａを含む、ＸＴＥＮ−ペイロード前駆体である。このペイロードは、組換え技術によってＸＴＥＮに融合することができるか、または共役することができる。（図２４Ｂ）くし形様架橋剤を持つＸＴＥＮ前駆体を示す。これは、複数の反応基Ｂを担持するＸＴＥＮであり得る。（図２４Ｃ）５つのペイロードＡを持つ「くし形」構成の最終産物を示す。原子価は、くし形様前駆体中の反応基の数によって制御される。 ２つのペイロードとの二重特異性共役体の様々な構成を示す。（図２５Ａ）２つのペイロードのそれぞれの１つの分子を持つ構成を示すが、図２５Ｂは、一方または双方のペイロードの複数コピーを持つ様々な構成を示す。 高い原子価を持つ共役体の様々な例を示す。ペイロードの共役部位は、群化（図２６Ａ）または散在（図２６Ｂ）することができる。 アミノ基およびチオール基の双方を担持するＸＴＥＮ前駆体からの二重特異性共役体の調製を示し、多くの化学反応を使用することができ、ペイロード付加の順序は異なり得る。リンカー共役体を前駆体として生成することができる。（図２７Ａ）２つの異なるペイロードが付着する単一ＸＴＥＮ前駆体の創製を示す。（図２７Ｂ）２つのＸＴＥＮ前駆体分子から開始するセグメント手法を示す。この手法は、同じ型のリンカー化学反応を使用して、双方のペイロードをＸＴＥＮに共役することを許す。この場合、この図は、ペイロードが共役される基としてチオールを示し、次いで各セグメントのＮ末端は、頭−頭セグメント共役を可能にするように架橋剤で修飾され、二量体二重特異性共役体の最終産物をもたらす。 抗体、ＸＴＥＮ、およびペイロードを合わせる、多量体共役体の例を示す。そのような構築物は、異なる原子価を有し、ＸＴＥＮが切断可能なリンカーを有することができ、ＸＴＥＮが組成物に対する可溶性を提供することができ、ＩｇＧ当たりの薬物負荷の調整を可能にすることができ、製造を簡素化するためにＸＴＥＮを薬物と事前共役することができるという、多くの利点を提供することができる。（図２８Ａ）ヒンジ領域内のＣｙｓ残基においてＩｇＧに共役される２つのＸＴＥＮを示す。（図２８Ｂ）ヒンジ領域内のＣｙｓを使用してＩｇＧに共役される４つのＸＴＥＮを示す。（図２８Ｃ）ヒンジの外側で共役されたＸＴＥＮを示す。これは、Ｃｙｓを挿入して共役部位を制御すること、またはＬｙｓ側鎖へのランダム共役によって行うことができる。 抗体、ＸＴＥＮ、およびペイロードを合わせる、共役体の構築の例を示す。この抗体は、１つまたは複数の反応基１Ｂを有することができる。ＸＴＥＮは、１つまたは複数のペイロードＡに共役することができる。さらに、ＸＴＥＮは、抗体上の反応基１Ｂと選好的に反応する反応基１Ａを担持することができる。抗体中の反応基１Ｂの位置は、抗体に共役されるＸＴＥＮの数および位置を制御し、最終産物をもたらす。 標的部分、ＸＴＥＮ、およびペイロードを含む共役体の例を示す。標的部分は、ペプチド、ペプトイド、または受容体リガンドであり得る。（図３０Ａ）１ｘ（１ｘ３）共役体を示す。（図３０Ｂ）１ｘ２（１ｘ３）共役体を示す。（図３０Ｃ）３ｘ１（１ｘ３）共役体を示す。 複数の異なる標的部分、ＸＴＥＮ、およびペイロードを含む共役体の例を示す。標的部分は、ペプチド、ペプトイド、受容体リガンドであり得る。 標的部分、ＸＴＥＮ、および複数の異なるペイロードを含む共役体の例を示す。 組合せＸＴＥＮ共役体の例を示す。ペイロードＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤは、ＸＴＥＮ前駆体上の反応基２Ｂと反応する反応基２Ａを担持する。次のステップにおいて、ペイロードＥおよびＦは、ＸＴＥＮ上の反応基１Ｂと反応する反応基１Ａを担持し、二重特異性共役体の異なる置換のライブラリーをもたらす。この場合、反応基１Ｂおよび２Ｂは、それぞれチオール基およびアミノ基である。 組合せＸＴＥＮ共役体ライブラリーの創製の例を示す。ペイロードＡ、Ｂ、Ｃは、反応基１Ａを担持するＸＴＥＮに共役され、ＸＴＥＮ前駆体セグメントの１つのセットをもたらす。ペイロードＥ、Ｆ、およびＧは、反応基１Ｂを担持するＸＴＥＮに共役され、ＸＴＥＮ前駆体セグメントの第２のセットをもたらす。これらのセグメントは、組合せ共役に供され、次いで反応物から精製される。これは、インビトロおよびインビボ試験に即時に供され得る、組合せ産物の形成を可能にする。この場合、反応基１Ａおよび１Ｂは、二重特異性架橋剤を持つか、または持たないＸＴＥＮのαアミノ基である。一実施例において、１Ａはアジドであり、１Ｂはアルキンであるか、またはその逆であるが、ペイロードは、ＸＴＥＮ中のチオール基を介してＸＴＥＮに付着する。 ２つのペイロード間の比率を最適化する、組合せＸＴＥＮ共役体ライブラリーの創製の例を示す。各ライブラリーメンバーは、異なる比率のペイロードＡおよびペイロードＥを担持する。 標的部分およびペイロードの組合せを創製する、組合せＸＴＥＮ共役体ライブラリーの創製の例を示す。標的部分１、２、および３は、反応基１Ａを担持するＸＴＥＮに共役される。ペイロードＥ、Ｆ、およびＧは、反応基１Ｂを担持するＸＴＥＮに共役される。これらのセグメントは組合せ共役に供され、組合せ産物の形成を可能にし、各ライブラリーメンバーは、標的部分およびペイロードを含む。ペイロードおよび共役基を担持する全てのＸＴＥＮセグメントは、インビトロおよびインビボ試験に即時に供され得る組合せ産物として精製することができる。 腫瘍細胞等の標的細胞の表面に対して選択的に作用する、標的部分およびペイロードを含むＸＴＥＮ共役体の例を示す。二量体ＸＴＥＮ共役体の特定の設計は、ＬＨＲＨおよびドキソルビシンを含む。この共役体は、多くの癌細胞上で過剰発現するＬＨＲＨ受容体に結合する。受容体結合は、内在化に続いてタンパク質分解、および細胞に対して毒性のドキソルビシンの細胞内遊離をもたらす。 ＸＴＥＮの組立て、産生、および評価における代表的なステップの概略的フローチャートである。 融合タンパク質をコードするＸＴＥＮポリヌクレオチド構築物の組立てにおける代表的なステップの概略的フローチャートである。個別のオリゴヌクレオチド５０１は、１２アミノ酸モチーフ（「１２−ｍｅｒ」）等の配列モチーフ５０２にアニールされ、ライブラリーからの追加の配列モチーフに結紮されて、所望の長さのＸＴＥＮ５０４を包含するプールを創製すると同時に、より低い濃度のＢｂｓＩ、およびＫｐｎＩ制限部位５０３を含有するオリゴに結紮される。得られたライゲーション産物のプールは、ゲル精製され、所望の長さのＸＴＥＮを持つバンドが切断され、ストッパー配列５０５を持つ単離されたＸＴＥＮ遺伝子をもたらす。ＸＴＥＮ遺伝子は、スタッファーベクターにクローン化される。この場合、ベクターは、任意のＣＢＤ配列５０６およびＧＦＰ遺伝子５０８をコードする。次いで、ＢｂｓＩ／ＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化が行われ、５０７および５０８を除去し、終止コドンを配置する。次いで、得られた産物は、ＢｓａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化されたベクターにクローン化され、ＸＴＥＮをコードする遺伝子５００をもたらす。 ＸＴＥＮをコードする遺伝子の組立て、その発現、ペイロードとの共役、およびＸＴＥＮ−ペイロードとしての回収、ならびに候補産物としてのその評価における代表的なステップの概略的フローチャートである。 図４２に示される方法を使用して、精製のために最適化されたＮもしくはＣ末端タグ、またはＮおよびＣ末端配列のいずれかを持つ一般化ＸＴＥＮを示す。 この例示の実施形態では、２つのタグを持つＸＴＥＮの精製のための一般化スキームを示し、第１のタグ、次いで第２のタグを捕捉するための２ステップ精製方法を利用して、切断ＸＴＥＮを発酵から除去することができ、高度に精製された標的ＸＴＥＮ実体をもたらす。 実施例１０に記載されるように、振とうフラスコ培養物からの大腸菌ＢＬ２１ ＤＥ３ｒｎｅ−１３１および大腸菌ＢＬ２１ ＤＥ３細胞に発現されたＣＢＤ−ＴＥＶ部位−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４およびＣＢＤ−ＴＥＶ部位−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４−ＧＦＰ構築物のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。ＭＷマーカーを持つゲルレーン試料および構築物から発現されたタンパク質は、１）ＭＷマーカー；２〜５）大腸菌ＢＬ２１ ＤＥ３中でＣＢＤ−ＴＥＶ部位−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４−ＧＦＰ融合タンパク質を発現する、４つの独立したフラスコからの溶解物；６〜９）大腸菌ＢＬ２１ ＤＥ３ｒｎｅ−１３１中でＣＢＤ−ＴＥＶ部位−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４−ＧＦＰ融合タンパク質を発現する、４つの独立したフラスコからの溶解物；１０〜１３）大腸菌ＢＬ２１ ＤＥ３中でＣＢＤ−ＴＥＶ部位−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４融合タンパク質を発現する、４つの独立したフラスコからの溶解物；１４〜１７）大腸菌ＢＬ２１ ＤＥ３ｒｎｅ−１３１中でＣＢＤ−ＴＥＶ部位−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４融合タンパク質を発現する、４つの独立したフラスコからの溶解物である。全長タンパク質スポットは、外枠内に出現する。より低い分子量のバンドは、宿主細胞タンパク質である。 実施例１０に記載されるように、振とうフラスコ培養物からの大腸菌ＢＬ２１ ＤＥ３ｒｎｅ−１３１および大腸菌ＢＬ２１ ＤＥ３細胞中で発現されたＣＢＤ−ＴＥＶ部位−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４−ＧＦＰの相対ＧＦＰ蛍光を示す。 実施例１７に記載されるように、大腸菌発酵において発現されたＣＢＤ−Ｒ−Ｃ−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４−ＲＨ８（ＥＣ６８２）およびＣＢＤ−Ｒ−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４−ＲＨ８（ＥＣ６８３）構築物のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。ＭＷマーカーを持つゲルレーン試料および構築物から発現されたタンパク質は、１）ＭＷマーカー；播種後２）１６時間、３）２４時間、４）４０時間、５）４５時間の時点における大腸菌発酵＃ＥＣ６８２浄化された可溶性溶解物；播種後６）１６時間、７）２４時間、８）４０時間、９）４５時間の時点における大腸菌発酵＃ＥＣ６８３浄化された可溶性溶解物；１０）１マイクログラム、１１）２マイクログラム、および１２）４マイクログラムの精製されたＣＢＤ−Ｒ−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４−ＲＨ８参照基準である。大腸菌発酵浄化された可溶性溶解物の場合、各レーンは、３マイクロリットルの発酵槽培養物を表す。全長タンパク質スポットは、外枠内に出現する。より低い分子量のバンドは、宿主細胞タンパク質である。 実施例１８に記載されるように、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ Ｐｈｅｎｙｌ ６５０Ｍ疎水性相互作用クロマトグラフィーのトレース出力を示す。 図面に示されるように、また実施例１８に記載されるように、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ Ｐｈｅｎｙｌ ６５０Ｍ疎水性相互作用クロマトグラフィー画分の非還元４〜１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。レーン当たりの材料は、レーン１：マーカー；レーン２：ロード７．５μｌ；レーン３：フロースルー１；レーン４：フロースルー２；レーン５：溶出画分Ｅ１；レーン６：溶出画分Ｅ２；レーン７：溶出画分Ｅ３；レーン８：溶出画分Ｅ４；レーン９：溶出画分Ｅ５；レーン１０：溶出画分Ｅ６；レーン１１：溶出画分Ｅ７；レーン１２：溶出画分Ｅ８である。 実施例１８に記載されるように、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＩＭＡＣクロマトグラフィーフロースルー、洗浄（図４８Ａ）、および溶出画分（図４８Ｂ）（非還元）の非還元４〜１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。 実施例１８に記載されるトリプシン消化ＩＭＡＣプールの非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。 実施例１８に記載されるＭａｃｒｏＣａｐ Ｑクロマトグラフィーの溶出プロファイルを示す。 実施例１８に記載されるように、ＭａｃｒｏＣａｐ Ｑ溶出画分の４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。（図５１Ａ）フロースルー、クマシー染色。（図５１Ｂ）溶出画分、クマシー染色。（図５１Ｃ）溶出画分、銀染色。 実施例１８に記載されるように、ＭａｃｒｏＣａｐ Ｑ溶出画分のＣ１８ ＲＰ−ＨＰＬＣ分析からのトレースを示す。 実施例１８に記載されるように、ＭａｃｒｏＣａｐ Ｑ溶出プールのＣ１８ ＲＰ−ＨＰＬＣからのトレースを示す。 実施例１９に記載されるように、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ Ｐｈｅｎｙｌ ６５０Ｍ疎水性相互作用クロマトグラフィー画分の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。 実施例１９に記載されるように、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＩＭＡＣクロマトグラフィー画分の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。 実施例１９に記載されるように、ＭａｃｒｏＣａｐ Ｑ溶出画分の非還元４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／銀染色分析を示す。 実施例１９に記載されるように、ＭａｃｒｏＣａｐ Ｑ溶出画分のＣ１８ ＲＰ−ＨＰＬＣ分析からのトレースを示す。 実施例１９に記載されるＭａｃｒｏＣａｐ Ｑ溶出プールのＣ１８ ＲＰ−ＨＰＬＣ分析からのトレースを示す。 実施例２０に記載されるように、大腸菌における発現後の実験タグを持つＸＴＥＮ構築物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。可溶性溶解物は、３６μｌの細胞培養懸濁液に等しいレーン当たりに負荷される量で、４〜１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓポリアクリルアミドゲル上に負荷した。ゲルは、標準方法を使用し、クマシーブルーで染色した。 実施例２０に記載されるように、大腸菌中で発現されたＲＰ１１−ＸＴＥＮ−Ｈｉｓ８構築物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。熱処理された可溶性溶解物は、それぞれ１または２μｌの細胞培養懸濁液に等しい量で、４〜１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓポリアクリルアミドゲル上に負荷した。ゲルは、クマシーブルーで染色した。ゲルは、発現されたＲＰ１１−ＸＴＥＮ−Ｈｉｓ８タンパク質の本質的に全てが、ペレット画分中で見出されたことを実証する。 実施例２１に記載されるＲＰ１１−ＸＴＥＮ−Ｈｉｓ８ポリペプチドのＭａｃｒｏＣａｐ ＳＰ精製のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。画分は、４〜１２％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥに続いて、クマシー染色によって分析された。 実施例２１に記載されるＲＰ１１−ＸＴＥＮ−Ｈｉｓ８ポリペプチドのＩＭＡＣ精製のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。画分は、４〜１２％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥに続いて、クマシー染色によって分析された。 実施例２１に記載される２つのクロマトグラフィーステップ（ＳＰ＋ＩＭＡＣ）によって精製されたＲＰ１１−ＸＴＥＮ−Ｈｉｓ８タンパク質のトリプシン消化のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。調製物は、４〜１２％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥに続いて、クマシー染色（図６３Ａ）および銀染色（図６３Ｂ）によって分析した。 実施例２３に記載される３ｘチオール−ＸＴＥＮへのＤＢＣＯ−Ｍａｌの共役反応の分析の結果を示す。（図６４Ａ）反応混合物のＣ１８ ＲＰ−ＨＰＬＣ分析を示す。２０μｇのタンパク質試料は、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｃ１８ ５μＭ ３００Ａ ４．６ｍｍｘ１５０ｍｍカラム上に負荷した。タンパク質は、０．１％トリフルオロ酢酸中の５〜５０％勾配のアセトニトリルで溶出した。（図６４Ｂ）ＤＢＣＯ−ＸＴＥＮ反応産物のＨＩＣ精製を示す。（図６４Ｃ）ＨＩＣ精製されたＤＢＣＯ−ＸＴＥＮ反応産物のＣ１８ ＲＰ−ＨＰＬＣ分析を示す。 実施例２４に記載されるように、二重タグ付加された前駆体ＸＴＥＮのトリプシン切断からの結果を示す。（図６５Ａ）レーン当たり２μｇで負荷されたタンパク質試料の４〜１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ ＳａｆｅＳｔａｉｎで染色した。（図６５Ｂ）レーン当たり０．５μｇで負荷されたタンパク質試料の４〜１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルは、Ｐｉｅｒｃｅ銀染色キットで染色した。 実施例２４に記載されるように、トリプシン消化された二重タグ付加前駆体のＭａｃｒｏＣａｐ Ｑ精製のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す。（図６６Ａ）レーン当たり３μｇで負荷されたタンパク質試料の４〜１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ ＳａｆｅＳｔａｉｎで染色した。（図６６Ｂ）レーン当たり０．５μｇで負荷されたタンパク質試料の４〜１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルは、Ｐｉｅｒｃｅ銀染色キットで染色した。（図６６Ｃ）レーン当たり０．５μｇで負荷されたタンパク質試料の４〜１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルは、Ｐｉｅｒｃｅ銀染色キットで染色した。 残留トリプシン活性についてのＣ１８ ＲＰ−ＨＰＬＣ試験の結果を示す。（図６７Ａ）無傷形態の合成［Ｇ２］ＧＬＰ２ペプチドの分析のトレース出力である。（図６７Ｂ）ウシトリプシンで消化された合成［Ｇ２］ＧＬＰ２ペプチドの分析のトレース出力である。（図６７Ｃ）実施例２４に記載されるように、［Ｇ２］ＧＬＰ２でスパイクされ、３７℃で終夜インキュベートされたＸＴＥＮ＿ＡＥ８６９＿Ａｍ１，Ｃ２の分析のトレース出力である。 実施例２６に記載されるように、ＧＬＰ２−Ｃｙｓペプチドおよび１ｘアミノ−ＸＴＥＮからのＧＬＰ２−ＸＴＥＮ共役体の調製を示す。２０μｇのタンパク質試料は、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｃ１８ ５μＭ ３００Ａ ４．６ｍｍｘ１５０ｍｍカラム上に負荷した。タンパク質は、０．１％トリフルオロ酢酸中の５〜５０％勾配のアセトニトリルで溶出され、２１４ｎｍでの吸光度によって検出された（左パネルＡ〜Ｃ）。１００μｇのタンパク質試料は、ＮａｎｏＳｅｐ ３Ｋ Ｏｍｅｇａ遠心装置（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐ．）を使用して脱塩した。５０％アセトニトリル、０．５％ギ酸中のタンパク質溶液は、流量１０μｌ／分で高分解能質量分析計に注入した。ＥＳＩ−ＭＳスペクトルは、８００〜１６００ａｍｕ（原子質量単位）範囲内で得られ、Ｂａｙｅｓｉａｎタンパク質再構築ソフトウェアを使用して、ゼロ電荷スペクトルに再構築された（右パネルＡ〜Ｃ）。（図６８Ａ）：最初の１ｘアミノ−ＸＴＥＮタンパク質。（図６８Ｂ）：１ｘアミノ−ＸＴＥＮとスルホ−ＳＭＣＣ架橋剤との間の反応の産物。（図６８Ｃ）：ＧＬＰ２−ＣｙｓとＮ−Ｍａｌ−ＸＴＥＮとの間の反応後の精製されたＧＬＰ２−ＸＴＥＮ共役体。 実施例２７に記載されるように、ＧＬＰ２−Ｍａｌペプチドおよび１ｘチオール−ＸＴＥＮからのＧＬＰ２−ＸＴＥＮ共役体の調製を示す。２０μｇのタンパク質試料は、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｃ１８ ５μＭ ３００Ａ ４．６ｍｍｘ１５０ｍｍカラム上に負荷した。タンパク質は、０．１％トリフルオロ酢酸中の５〜５０％勾配のアセトニトリルで溶出され、２１４ｎｍでの吸光度によって検出された（左パネルＡ、Ｂ）。１００μｇのタンパク質試料は、ＮａｎｏＳｅｐ ３Ｋ Ｏｍｅｇａ遠心装置（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐ．）を使用して脱塩した。５０％アセトニトリル、０．５％ギ酸中のタンパク質溶液は、流量１０μｌ／分で高分解能質量分析計に注入した。ＥＳＩ−ＭＳスペクトルは、８００〜１６００ａｍｕ範囲内で得られ、Ｂａｙｅｓｉａｎタンパク質再構築ソフトウェアを使用して、ゼロ電荷スペクトルに再構築された（右パネルＡ、Ｂ）。（図６９Ａ）：最初の１ｘチオール−ＸＴＥＮタンパク質。（図６９Ｂ）：ＧＬＰ２−Ｍａｌと１ｘチオール−ＸＴＥＮとの間の反応の産物。 実施例２７に記載されるように、分取Ｃ４ ＲＰ−ＨＰＬＣを使用して、ＧＬＰ２−ＸＴＥＮの精製の結果を示す。（図７０Ａ）分取ＲＰ−ＨＰＬＣのクロマトグラフィープロファイルを示す。５６〜６２分で画分を回収し、真空下で蒸発させた。（図７０Ｂ）精製されたＧＬＰ２−ＸＴＥＮについてのＣ１８ ＲＰ−ＨＰＬＣによる分析を示す。 実施例２８に記載されるように、１ｘチオール−ＸＴＥＮへのＤＢＣＯ−Ｍａｌの共役の結果を示す。（図７１Ａ）反応混合物のＣ１８ ＲＰ−ＨＰＬＣ分析を示す。２０μｇのタンパク質試料は、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｃ１８ ５μＭ ３００Ａ ４．６ｍｍｘ１５０ｍｍカラム上に負荷した。タンパク質は、０．１％トリフルオロ酢酸中の５〜５０％勾配のアセトニトリルで溶出した。（図７１Ｂ）ＤＢＣＯ−ＸＴＥＮのＨＩＣ精製を示す。（図７１Ｃ）ＨＩＣ精製されたＤＢＣＯ−ＸＴＥＮのＣ１８ ＲＰ−ＨＰＬＣ分析を示す。 実施例３１に記載されるように、架橋されたＦＩＴＣと共役されたＸＴＥＮの分析アッセイの結果を示す。（図７２Ａ）ＦＩＴＣ含有共役種の大きな見掛けのＭＷを示すように、紫外線ライトボックスによって撮像され、ＳＥＣカラム中のＯＤ２１４（タンパク質シグナル）およびＯＤ４９５（ＦＩＴＣシグナル）におけるＳＥＣによっても検出されたゲル中の共遊走を示し、最小の遊離染料汚染を伴うＸＴＥＮの良好な標識化を示す。ＭＷ標準後のレーン別（左から右）の材料は、標識されたＦＩＴＣ−ＣＬ−ＣＢＤ−ＸＴＥＮ、標識されたＦＩＴＣ−ＣＬ−ＸＴＥＮ、精製されたＦＩＴＣ−ＣＬ−ＸＴＥＮ、精製されたＦＩＴＣ−ＣＬ−ＸＴＥＮ、および精製されたＦＩＴＣ−ＣＬ−ＸＴＥＮである。ゲルは、紫外線ライトボックスによって撮像され、ＦＩＴＣ含有種のＦＩＴＣ見掛けのＭＷを示す。（図７２Ｂ）ＯＤ２１４およびＯＤ４９５において検出された材料の出力の重複を示す、ＦＩＴＣ共役ＸＴＥＮのＳＥＣ分析の結果、および見掛けの大きな分子量も示す。 実施例３２に記載されるように、ＸＴＥＮおよび遊離ＧＦＰに架橋されたＧＦＰの共役体のピーク溶出画分のＳＥＣ分析の結果を示す。架橋は、ＳＥＣカラム中のＯＤ２１４タンパク質シグナルおよびＯＤ３９５ ＧＦＰシグナルの共遊走によって確認された。 実施例３３に記載されるように、カニクイザルにおいて試験されたＧＦＰ−Ｘ−ＸＴＥＮおよびＦＩＴＣ−Ｘ−ＸＴＥＮの薬物動態アッセイの結果を示す。 実施例３３に記載されるように、可変長の非構造化ポリペプチドに結合されたＧＦＰの異なる組成物の単一用量が、皮下または静脈内のいずれかで投与された後のカニクイザルにおける薬物動態プロファイル（血漿濃度）を示す。組成物は、ＧＦＰ−Ｌ２８８、ＧＦＰ−Ｌ５７６、ＧＦＰ−ＸＴＥＮ＿ＡＦ５７６、ＧＦＰ−Ｙ５７６、およびＸＴＥＮ＿ＡＤ８３６−ＧＦＰであった。血液試料は、注入後の様々な時点で分析され、血漿中のＧＦＰ濃度は、捕捉の場合はＧＦＰに対するポリクローナル抗体を使用するＥＬＩＳＡによって、検出の場合は同じポリクローナル抗体のビオチニル化調製によって測定された。結果は、投与後の時間（ｈ）に対する血漿濃度として提示され、特に、ＸＴＥＮ＿ＡＤ８３６−ＧＦＰの半減期の大幅な増加を示し、この組成物は、最長のＸＴＥＮ配列長を持つ。最短の配列長を持つ構築物、ＧＦＰ−Ｌ２８８は、最短の半減期を有した。 ＧＦＰのＮ末端に融合されたＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４の融合タンパク質の安定性研究からの試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。実施例５５に記載されるように、ＧＦＰ−ＸＴＥＮは、カニクイザル血漿およびラット腎溶解物中で最長７日間、３７℃でインキュベートした。さらに、カニクイザルに投与されたＧＦＰ−ＸＴＥＮも評価した。試料は、０日目、１日目、および７日目に抽出し、ＳＤＳ ＰＡＧＥに続いて、ウェスタン分析を使用する検出、およびＧＦＰに対する抗体を用いた検出によって分析した。 実施例５６に記載されるように行われた、Ｅｘ４−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４の近紫外線円二色性スペクトルを示す。 実施例５８に記載されるように、保持容量に対する吸光度としてのグラフ出力とともに、既知の分子量のタンパク質標準に対して測定されたグルカゴン−ＸＴＥＮ構築物試料のサイズ除外クロマトグラフィー分析の結果を示す。グルカゴン−ＸＴＥＮ構築物は、１）グルカゴン−Ｙ２８８、２）グルカゴンＹ−１４４、３）グルカゴン−Ｙ７２、および４）グルカゴン−Ｙ３６である。結果は、を示す。 アルゴリズムＳｅｇＳｃｏｒｅの論理フローチャートの概略図である（実施例５９）。この図において、以下の凡例が適用される：ｉ、ｊ−配列全体を通過する制御ループにおいて使用されるカウンター；ＨｉｔＣｏｕｎｔ−この変数は、部分列がブロック内で同一部分列に何回遭遇するかを記録するカウンターである；ＳｕｂＳｅｑＸ−この変数は、冗長性についてチェックされる部分列を保持する；ＳｕｂＳｅｑＹ−この変数は、ＳｕｂＳｅｑＸがチェックされる部分列を保持する；ＢｌｏｃｋＬｅｎ−この変数は、ブロックのユーザーが決定した長さを保持する；ＳｅｇＬｅｎ−この変数は、セグメントの長さを保持する。このプログラムは、長さ３、４、５、６、７、８、９、および１０の部分列に対してスコアを生成するようにハードコードされ、Ｂｌｏｃｋ−この変数は、文字列の長さＢｌｏｃｋＬｅｎを保持する。この文字列は、入力ＸＴＥＮ配列からの文字からなり、ｉカウンターの位置によって決定され、ＳｕｂＳｅｑＬｉｓｔ−これは、生成された部分列スコアの全てを保持する一覧である。 反復性を決定するための、１１個のアミノ酸の仮説ＸＴＥＮに対するアルゴリズムＳｅｇＳｃｏｒｅの適用を表す。Ｎ個のアミノ酸からなるＸＴＥＮ配列は、長さＳのＮ−Ｓ＋１部分列に分割される（この場合、Ｓ＝３）。全ての部分列のペアワイズ比較が行われ、同一配列の平均数を計算し、この場合、１．８９の部分列スコアをもたらす。 実施例１２に記載されるように、ＲＰ１１クローン（ｐＳＤ０１０７〜ｐＳＤ０１１８）の蛍光シグナルを測定するためのアッセイの結果を提供する。１つの陽性対照（ｐＬＣＷ９７０）および２つの陰性対照（ｐＢｒ３２２およびｐＬＣＷ９７０＋１０ｍＭリン酸塩）を含めた。ＧＦＰ発現レベルは、構築物当たり２〜３個の振とうフラスコからの試料を使用して測定した。 ライブラリーＬＣＷ１１５７〜１１５９のスクリーニング結果を示す。（図８２Ａ〜Ｃ）実施例１２に記載されるように、ＬＣＷ１１５７〜１１５９の蛍光ヒストグラムを提供し、各発光シグナル領域に対して特定されたコロニーの数を示す。図面において、陰性対照（黒色矢印）および正のｐＳＤ０１１６（白色矢印）の平均蛍光読み取りが標示される。（図８２Ｄ〜Ｆ）選択クローンの元の試験と、再試験における蛍光読み取り間の相関を提供する。 ライブラリーＬＣＷ１１５７〜１１５９のスクリーニング結果を示す。（図８２Ａ〜Ｃ）実施例１２に記載されるように、ＬＣＷ１１５７〜１１５９の蛍光ヒストグラムを提供し、各発光シグナル領域に対して特定されたコロニーの数を示す。図面において、陰性対照（黒色矢印）および正のｐＳＤ０１１６（白色矢印）の平均蛍光読み取りが標示される。（図８２Ｄ〜Ｆ）選択クローンの元の試験と、再試験における蛍光読み取り間の相関を提供する。 実施例１２に記載されるように、非還元条件下での上位８つの発現構築物産物および対照のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す。所望の全長タンパク質最終産物ＲＰ１１−ＸＴＥＮ−ＧＦＰは、矢印によって示され、より高いバンドは、タンパク質の二量体である。レーン：１〜８：上位８つの発現構築物（再試験の蛍光読み取りに基づく、高位から低位への発現レベル）、１．ＬＣＷ１１５９．００４、２．ＬＣＷ１１５９．００６、３．ＬＣＷ１１５８．００４、４．ＬＣＷ１１５７．０４０、５．ＬＣＷ１１５８．００３、６．ＬＣＷ１１５７．０３９、７．ＬＣＷ１１５７．０２５、８．ＬＣＷ１１５７．０３８、Ｃ１−Ｃ３：対照：Ｃ１．ｐＳＤ０１１４、Ｃ２．ｐＳＤ０１１６、Ｃ３．ｐＣＷ１１４６（陰性対照）。 実施例１２に記載されるように、非還元条件下での上位４つの発現構築物産物のＭａｃｒｏＣａｐ ＳＰ捕捉効率のＳＤＳ−ＰＡＧＥ評価を示す。レーン１〜４：ＬＣＷ１１５９．００４の負荷、フロースルー、洗浄、および溶出。２．レーン５〜８：ＬＣＷ１１５９．００６の負荷、フロースルー、洗浄、および溶出。レーン９〜１２：ＬＣＷ１１５８．００４の負荷、フロースルー、洗浄、および溶出。１３〜１６：ＬＣＷ１１５７．０４０の負荷、フロースルー、洗浄、および溶出。レーン１７〜２０ １〜４：陰性対照の負荷、フロースルー、洗浄、および溶出。標示されていないレーンは、分子量標準である。 実施例１２に記載されるように、再試験における上位４つの発現産物および対照の蛍光シグナルとの比較で、ライブラリーＬＣＷ１１６３スクリーニング結果の要約を示す。各試料は、４つの複製を有し、４つの個別のドットによって図中に表される。 実施例１２に記載されるように、ライブラリーＬＣＷ１１６０スクリーニング結果の要約を示す。各蛍光シグナル領域に対して特定されたコロニーの数を示す、ＬＣＷ１１５７〜１１５９の蛍光ヒストグラム。陰性対照（黒色矢印）、ｐＳＤ０１１６（白色矢印）、およびＬＣＷ１１５９．００４（スクリーニングＬＣＷ１１５７〜１１５９からの高発現候補、灰色矢印）の平均蛍光読み取りが、図中に標示される。 実施例１４に記載されるように、ＭａｃｒｏＣａｐ Ｑ画分の４〜１２％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／銀染色分析を示す。（図８７Ａ）：バッチ２、レーン１：分子量標準；レーン２〜５：それぞれＭａｃｒｏＣａｐ Ｑフロースルー画分１〜４；レーン６〜１６：それぞれＭａｃｒｏＣａｐ Ｑ溶出画分１〜１１。（図８７Ｂ）：バッチ１、レーン１：分子量標準；レーン２〜６：それぞれＭａｃｒｏＣａｐ Ｑフロースルー画分１〜５；レーン７〜１６：それぞれＭａｃｒｏＣａｐ Ｑ溶出画分１〜１０。 実施例３４に記載されるように、１ｘＤＢＣＯ、３ｘＬＨＲＨ−ＸＴＥＮの調製中の中間体および最終産物の分析からの結果を示す。 実施例３５に記載されるように、Ｃ１８−ＲＰ−ＨＰＬＣおよび質量分析によって分析された１ｘアジド、３ｘＭＭＡＥ−ＸＴＥＮに対する共役体の調製からの反応混合物の分析結果を示す。（図８９Ａ）最初の１ｘアミノ、３ｘチオール−ＸＴＥＮ反応物の分析である。（図８９Ｂ）ＭＭＡＥ−マレイミドを用いたタンパク質修飾の分析であり、ＭＭＡＥ−Ｍａｌを用いた３つのシステインの修飾に対応する質量増加を示す。（図８９Ｃ）アジド−ＰＥＧ４−ＮＨＳエステルを用いたタンパク質修飾の分析を示し、アジド−ＰＥＧ４部分の単一付加に対応する質量増加を伴う。 実施例３６に記載されるように、３ｘＬＨＲＨ、３ｘＭＭＡＥ−ＸＴＥＮの共役体中の反応産物の分析を示す。（図９０Ａ）：クリック共役体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。０．５μｇのタンパク質は、１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ＮｕＰＡＧＥミニゲル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上のレーンごとに負荷した。このゲルは、Ｐｉｅｒｃｅ銀染色キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，カタログ＃２４６１２）で染色した。レーン１、１ｘアジド、３ｘＭＭＡＥ−ＸＴＥＮ；レーン２、１ｘＤＢＣＯ、３ｘＬＨＲＨ−ＸＴＥＮ；レーン３、クリック化学反応の産物。共役産物バンドは、矢印によって示される。（図９０Ｂ）：クリック共役反応物および産物−（１）１ｘＤＢＣＯ、３ｘＬＨＲＨ−ＸＴＥＮ；（２）１ｘアジド、３ｘＭＭＡＥ−ＸＴＥＮ；（３）クリック化学反応の産物のＣ４ ＲＰ−ＨＰＬＣ分析。 実施例３７に記載されるように、１ｘＬＨＲＨ、３ｘＭＭＡＥ−ＸＴＥＮの共役体の調製中の反応のフローチャートを示す。（図９１Ａ）：最初の１ｘアミノ、３ｘチオール−ＸＴＥＮ；（図９１Ｂ）：２，２’−ジピリジルジスルフィドを用いたタンパク質修飾；（図９１Ｃ）：ＤＢＣＯ−スルホ−ＮＨＳを用いたタンパク質修飾；（図９１Ｄ）：ＴＣＥＰを用いたシステインの脱保護；（図９１Ｅ）ＭＭＡＥ−Ｍａｌを用いた３つのシステインの修飾；（９１Ｆ）：Ｎ末端ＤＢＣＯへのＬＨＲＨ−アジドの共役。 実施例４１に記載されるように、１ｘＭａｌ、３ｘＰＴＸ−ＸＴＥＮ反応物の共役体の調製中の反応のフローチャートを示す。（図９２Ａ）：最初の１ｘアミノ、３ｘチオール−ＸＴＥＮ；（図９２Ｂ）：ＰＴＸ−Ｍａｌを用いたタンパク質修飾；（図９２Ｃ）スルホ−ＳＭＣＣを用いたタンパク質修飾。 実施例４２に記載されるように、ヨードアセチル−ＸＴＥＮの調製からの反応混合物の分析結果を示す。（図９３Ａ）：１０ｘ過剰のＳＩＡを用いたインキュベーション前後にＣ１８−ＲＰ−ＨＰＬＣによって分析された１ｘアミノ−ＸＴＥＮ。（図９３Ｂ）：ＳＩＡを用いて修飾された１ｘアミノ−ＸＴＥＮのＥＳＩ−ＭＳ分析。（図９３Ｃ）：Ｃ１８ ＲＰ−ＨＰＬＣ−下プロファイル−ＨＣＫＦＷＷペプチドによって分析された試料。中間プロファイル−ＩＡ−ＸＴＥＮ。上プロファイル−５ｘ過剰のＨＣＫＦＷＷペプチドとのＩＡ−ＸＴＥＮの反応。 実施例１４に記載されるように、ライブラリーＬＣＷ１１７１、１１７２、１２０３、および１２０４のスクリーニング結果を示す。（図９４Ａ〜Ｄ）：ＬＣＷ１１７１、１１７２、１２０３、１２０４の蛍光ヒストグラムであり、各蛍光シグナル領域に対して特定されたコロニーの数を示す；ＬＣＷ１１７１〜１１７２をスクリーニングしたときの陰性対照（黒色矢印）およびｐＳＤ０１１６（白色矢印）の平均蛍光読み取りは、図９４ＡおよびＢに標示され、ＬＣＷ１２０３〜１２０４をスクリーニングしたときの陰性対照（黒色矢印）、ｐＳＤ０１１６（白色矢印）、およびＣＢＤ対照（灰色矢印）の平均蛍光読み取りは、図９４ＣおよびＤに標示される。 実施例１２に記載されるように、ライブラリーＬＣＷ１２０８〜１２１０をスクリーニングした結果を示す。（図９５Ａ〜Ｃ）：ＬＣＷ１２０８〜１２１０の蛍光ヒストグラムであり、各蛍光シグナル領域に対して特定されたコロニーの数を示し、陰性対照（黒色矢印）およびＣＢＤ対照（灰色矢印）の平均蛍光読み取りが図中に標示される。 同一の長さおよび配列のＸＴＥＮの３つの反復コピーを含有する前駆体からのＸＴＥＮセグメントの産生を示す。図９６Ａにおいて、ＸＴＥＮ前駆体は、同一のプロテアーゼ切断部位に隣接するＸＴＥＮの３つの同一コピーを含む。図９６Ｂにおいて、ＸＴＥＮ前駆体は、全長前駆体分子の精製を促進するように、ＮおよびＣ末端親和性精製タグをさらに含む。前駆体の精製に続いて、ＸＴＥＮからタグを遊離するように組み込まれた切断配列の全てに作用するプロテアーゼによって切断され、続いて精製してＸＴＥＮの個別の単位を分離し、長鎖前駆体分子から短長および中間長のＸＴＥＮの高収率産生を促進する。 三量体分岐ＸＴＥＮ−ペイロード共役体の異なる実施形態を示し、示される全ての共役体は、そのＮ末端アミノ基、およびＣ末端の近くに位置する官能基（例えば、システインのチオール）への共役を介して、同一のＸＴＥＮ分子から調製することができる。（図９７ＡおよびＢ）単一ペイロード分子を有する共役体を示し、図９７Ａでは、ペイロードにごく接近して共役されたＸＴＥＮの全てを持つ４アーム架橋剤を使用し、他の分子とのペイロード相互作用の重大な遮蔽をもたらす。（図９７Ｂ）ペイロードがその構成の遠位端で分岐される単一ＸＴＥＮアームに共役され、図９７Ａの構成と比較して、低減したペイロード遮蔽をもたらす構成を示す。（図９７Ｃ）増加親和性または増加した能力をもたらすことができる２つのペイロードを持つ共役体を示す。（図９７ＤおよびＥ）能力および／または親和性をさらに増加させる３つの同一のペイロードを持つ構成を示す。（図９７Ｆ）高親和性結合または相互作用のために、１つのペイロードＡおよびペイロードＢの２つの同一コピーを持つ構成を示す。（図９７Ｇ）単一ＸＴＥＮ共役体への３つの異なる機能の包含を可能にする、３つの異なるペイロードを持つ構成を示す。 分岐ＸＴＥＮと単一ペイロード分子との間の共役体の合成のためのスキームを示す。最初に、ＸＴＥＮ中のチオール基は、ヨードアセトアミドとの反応によってブロックされる（代替として、チオール基を欠くＸＴＥＮを使用して合成を開始することができる）。次に、ＤＢＣＯ基は、ＸＴＥＮのαアミノ基に付加され、次いで、１つのヨードアセチル基および３つのアジド基を含む四官能性架橋剤と反応する。次に、得られたＸＴＥＮは、遊離チオール基を担持するペイロードと反応し、最終ＸＴＥＮ−ペイロード共役体をもたらす。 分岐ＸＴＥＮと単一ペイロード分子との間の共役体の合成のためのスキームを示す。中間体は、２つのアジド官能基および１つのＮＨＳ官能基を含むＸＴＥＮを三官能性リンカーと反応させることに続いて、マレイミド化学を介して、ペイロードＡをチオール基に付加することによって産生される（これら２つのステップの順序は、逆にすることができる）。第２の中間体は、ＸＴＥＮを、ヨードアセトアミドを持つシステインと反応させて遊離チオール基をブロックすることに続いて、ＮＨＳ活性化を介して、ＤＢＣＯをαアミノ基に付加することによって産生される（これら２つのステップの順序は、逆にすることができる）。後次に、２つの中間体分子は、クリック化学反応を使用して共役され、最終ＸＴＥＮ−ペイロード共役体をもたらす。 １つの分岐ＸＴＥＮおよび２つの同一ペイロード分子を有する共役体の合成のためのスキームを示す。中間体は、ＮＨＳ化学を介して、ＤＢＣＯ基をＸＴＥＮのαアミノ基に付加することによって産生される。第２の中間体は、ヨードアセトアミドを持つＸＴＥＮの遊離チオール基をブロックすることに続いて、三官能性架橋剤（２つのＮ−マレイミド基およびＮＨＳによって活性化される１つのカルボキシル基）をαアミノ基に付加することによって産生される（これら２つのステップの順序は、逆にすることができる）。２つの中間体は反応して分岐共役体をもたらし、次いで、２つのペイロードＡ分子は、クリック化学反応を介して付加され、最終産物ＸＴＥＮ−ペイロード共役体をもたらす。 １つの分岐ＸＴＥＮおよび３つの同一ペイロード分子を有する共役体の合成のためのスキームを示す。中間体は、ＮＨＳ化学を介して、ＤＢＣＯ基をＸＴＥＮのαアミノ基に付加することによって産生される。別の中間体は、Ｎ−マレイミド官能基を介して、ペイロードＡをＸＴＥＮのチオール基に共役することによって産生される。３つの分子は、３つのアジド官能基を含む三官能性架橋剤を介して一緒に結合され、最終ＸＴＥＮ−ペイロード共役体をもたらす。 １つの分岐ＸＴＥＮおよび３つの同一ペイロード分子を有する共役体の合成のためのスキームを示す。中間体は、Ｎ−マレイミド化学を介して、ＤＢＣＯ基をＸＴＥＮ Ａのチオール基に付加することによって産生される。次のステップにおいて、ペイロードＡは、ＮＨＳ化学を介してＸＴＥＮ中間体のαアミノ基に共役される。３つの分子は、３つのアジド官能基を含む三官能性架橋剤を介して結合され、最終ＸＴＥＮ−ペイロード共役体をもたらす。 共役体当たり１つの分岐ＸＴＥＮ、および２つのペイロードＡ、および１つのペイロードＢ分子を有する共役体の合成のためのスキームを示す。中間体は、Ｎ−マレイミド官能基を使用して、ペイロードＡをＸＴＥＮのチオール基に付加することに続いて、三官能性架橋剤（２つのアジド基およびＮＨＳによって活性化される１つのカルボキシル基）をαアミノ基に付加することによって産生される（これら２つのステップの順序は、逆にすることができる）。第２の中間体は、ＮＨＳ活性化を介して、ＤＢＣＯをＸＴＥＮのαアミノ基に付加することに続いて、Ｎ−マレイミド基を使用して、ペイロードＢをＸＴＥＮの遊離チオール基に付加することによって産生される（これら２つのステップの順序は、逆にすることができる）。第２の中間体の２つの分子は、第１の中間体の１つの分子と反応して、最終ＸＴＥＮ−ペイロード共役体を形成する。 １つの分岐ＸＴＥＮおよび３つの異なるペイロードを有する共役体の合成のためのスキームを示す。中間体は、Ｎ−マレイミド官能基を使用して、ペイロードＡをＸＴＥＮ上のチオール基に付加することに続いて、三官能性架橋剤（１つのアジド基、１つのＮ−マレイミド基、およびＮＨＳによって活性化される１つのカルボキシル基）をαアミノ基に付加することによって産生される（これら２つのステップの順序は、逆にすることができる）。第２の中間体は、ＮＨＳ化学を介して、ペイロードＢをＸＴＥＮのαアミノ基に付加することによって産生される。第３の中間体は、ＮＨＳ活性化を介して、ＤＢＣＯをＸＴＥＮのαアミノ基に付加することに続いて、Ｎ−マレイミド基を使用して、ペイロードＣをＸＴＥＮの遊離チオール基に付加することによって産生される（これら２つのステップの順序は、逆にすることができる）。３つの中間体は、互いに反応して、最終ＸＴＥＮ−ペイロード共役体を形成する。 二量体または四量体分岐ＸＴＥＮおよびペイロードＡ分子を有する共役体の合成のためのスキームを示す。中間体は、Ｎ−マレイミド官能基を使用して、ＤＢＣＯをＸＴＥＮのチオール基に付加することに続いて、ＮＨＳを使用して、ペイロードＡをＸＴＥＮのアミノ基に付加することによって産生される（これら２つのステップの順序は、逆にすることができる）。後次に、中間体は、アジド架橋剤の付加によって多量体化される。二価架橋剤の使用は、二量体構成を生じ、四価架橋剤は、四量体構成の最終産物を生じる。 １つの分岐ＸＴＥＮおよび３つの異なるペイロードを有する共役体の合成のためのスキームを示す。中間体は、Ｎ−マレイミド官能基を使用して、ペイロードＡをＸＴＥＮのチオール基に付加することに続いて、三官能性架橋剤（１つのアジド基、１つのＮ−マレイミド基、およびＮＨＳによって活性化される１つのカルボキシル基）をαアミノ基に付加することによって産生される（これら２つのステップの順序は、逆にすることができる）。第２の中間体は、Ｎ−マレイミド官能基を介して、ペイロードＢをＸＴＥＮの遊離チオール基に付加することによって産生される。第３の中間体は、ＮＨＳ活性化を介して、ＤＢＣＯをＸＴＥＮのαアミノ基に付加することに続いて、Ｎ−マレイミド基を使用して、ペイロードＣを遊離チオール基に付加することによって産生される（これら２つのステップの順序は、逆にすることができる）。３つの中間体は、互いに反応して、最終ＸＴＥＮ−ペイロード共役体を形成する。 実施例３８に記載されるように、Ｃ１８−ＲＰ−ＨＰＬＣおよび質量分析によって分析された１ｘＤＢＣＯ、３ｘＦＡ（γ）−ＸＴＥＮに対する共役体の調製からの反応混合物の分析結果を示す。（図１０７Ａ）最初の１ｘアミノ、３ｘチオール−ＸＴＥＮ反応物の分析である。（図１０７Ｂ）葉酸−γ−マレイミドを用いたタンパク質修飾の分析であり、ＦＡ（γ）−Ｍａｌを用いた３つのシステインの修飾に対応する質量増加を示す。（図１０７Ｃ）ＤＢＣＯ−スルホ−ＮＨＳエステルを用いたタンパク質修飾の分析を示し、ＤＢＣＯ部分の単一付加に対応する質量増加を伴う。 実施例３９に記載されるように、クリック共役反応物および産物３ｘＦＡ（γ）、３ｘＭＭＡＥ−ＸＴＥＮのＣ４ ＲＰ−ＨＰＬＣ分析を示す。（１）１ｘＤＢＣＯ、３ｘＦＡ（γ）−ＸＴＥＮ；（２）１ｘアジド、３ｘＭＭＡＥ−ＸＴＥＮ；（３）クリック化学反応の産物。 実施例３９に記載されるように、分取ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製された最終３ｘＦＡ（γ）、３ｘＭＭＡＥ−ＸＴＥＮ産物の分析を示す。（図１０９Ａ）サイズ除外クロマトグラフィー分析を示す（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ ＢｉｏＳｅｐ−ＳＥＣ−ｓ４０００ ６００ｘ７．８０ｍｍカラム、５０ｍＭ リン酸ナトリウム ｐＨ６．５、３００ｍＭ ＮａＣｌ緩衝液、流量０．５ｍｌ／分、定組成溶離７０分）。（図１０９Ｂ）ＲＰ−ＨＰＬＣ分析を示す（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｃ１８ ５μＭ ３００A １５０ｘ４．６０ｍｍカラム、緩衝液Ａ：Ｈ２Ｏ中０．１％ ＴＦＡ、緩衝液Ｂ：ＣＡＮ中０．１％ ＴＦＡ、流量１ｍｌ／分、４５分で勾配５％〜５０％Ｂ）。図３Ｃは、ＥＳＩ−ＭＳ分析を示す（ＱＳＴＡＲ−ＸＬ、計算されたＭＷ ８５，０８５．４ Ｄａ、実験的ＭＷ ８５，０９１ Ｄａ）。 実施例６２に記載されるように行われる、組換えＧＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮ（黒塗りの正方形）および共役体ＧＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮ（黒塗りの丸）のＧＰＣＲ Ｃａ２＋動員活性の結果を示す。 実施例６３に記載されるように行われる、３７℃で様々な時点での組換えＧＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮ（黒塗りの正方形）および共役体ＧＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮ（黒塗りの三角形）のインビトロヒト血漿安定性の結果を示す。 実施例６４に記載されるように行われる、ラットにおける組換えＧＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮ（黒塗りの正方形）および共役体ＧＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮ（黒塗りの三角形）の薬物動態プロファイルの結果を示す。 （図１１３Ａ）トリス−［２−マレイミドエチル］アミンと１ｘアミノ、１ｘチオール−ＸＴＥＮ４３２との間の反応産物のＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析を示す。図１１３Ａ−共役混合物：ピーク１−三量体ＸＴＥＮ、ピーク２−二量体ＸＴＥＮ、ピーク３−未反応の単量体ＸＴＥＮ；図１１３Ｂ−直鎖状ＸＴＥＮ＿１２９６対照；図１１３Ｃ−直鎖状ＸＴＥＮ＿８６４対照；図１１３Ｄ−直鎖状ＸＴＥＮ＿４３２対照。 （図１１４Ａ）実施例６５に記載されるように、１ｘアミノ−ＸＴＥＮ＿２８８に対するＤＢＣＯ−スルホ−ＮＨＳ共役のＣ１８ ＲＰ−ＨＰＬＣ分析を示す。未反応のＸＴＥＮは、１９分で溶出した。１ｘＤＢＣＯ−ＸＴＥＮ＿２８８は、２７分で溶出した。ＤＢＣＯ−スルホ−ＮＨＳ試薬およびその加水分解の産物は、それぞれ４１．５分および３８．５分で溶出した。（図１１４Ｂ）トリス（２−アミノエチル）アミンに対するアジド−ＰＥＧ４−ＮＨＳエステル共役のＣ１８ ＲＰ−ＨＰＬＣ分析を示す。３ｘアジド−ＰＥＧ４−ＴＡＥＡは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳおよびＥＳＩ−ＭＳによって、９６６ ＤａのＭＷを持つ産物として特定された。 実施例６６に記載されるように、３ｘアジド−ＰＥＧ４−ＴＡＥＡと１ｘＤＢＣＯ−ＸＴＥＮ＿２８８との間の反応産物のＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析を示す：（トレースＡ）共役混合物：ピーク１−三量体ＸＴＥＮ、ピーク２−二量体ＸＴＥＮ、ピーク３−未反応の単量体ＸＴＥＮ、ピーク４−低分子量化合物；（トレースＢ）直鎖状ＸＴＥＮ＿８６４対照；（トレースＣ）直鎖状ＸＴＥＮ５７６対照；（トレースＤ）直鎖状ＸＴＥＮ＿２８８対照。 実施例６９に記載されるように、ＫＢ細胞上の３ｘＦＡ（γ）、３ｘＭＭＡＥ−ＸＴＥＮの選択的細胞毒性を実証する殺細胞アッセイの結果を示す。阻害性用量反応曲線は、ＫＢ細胞上の葉酸競合体の存在下（黒塗りの三角形）および不在下（黒塗りの正方形）での遊離ＭＭＡＥ（黒塗りの円）、３ｘＭＭＡＥ−ＸＴＥＮ（黒塗りの逆三角形）、および３ｘＦＡ（γ）、３ｘＭＭＡＥ−ＸＴＥＮの群について示される。 ＸＴＥＮ−ペイロード共役体３ｘＦＡ（γ）、３ｘＭＭＡＥ−ＸＴＥＮの構造を示す。（図１１７Ａ）アジド１−アジド−３，６，９，１２−テトラオキサペンタデカン−１５−ｏｉｃ酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、およびアルキン６−（１１，１２−ジデヒドロジベンゾ［ｂ，ｆ］アゾシン−５（６Ｈ）−イル）−６−オキソヘキサン酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（またはＮ−ヒドロキシスルホンスクシンイミド）エステルの反応によって結合された２つのＸＴＥＮを示す。（図１１７Ｂ）葉酸塩−γ−アミノペンチル−マレイミドを用いて修飾されたＣｙｓのＸ残基を示す。（図１１７Ｃ）マレイミドカプロイル−バリン−シトルリン−ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル−モノメチルオーリスタチンＥで修飾されたＣｙｓのＺ残基を示す。 ＸＴＥＮ−ペイロード共役体３ｘＦＡ（γ）、３ｘＭＭＡＥ−ＸＴＥＮの構造を示す。（図１１７Ａ）アジド１−アジド−３，６，９，１２−テトラオキサペンタデカン−１５−ｏｉｃ酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、およびアルキン６−（１１，１２−ジデヒドロジベンゾ［ｂ，ｆ］アゾシン−５（６Ｈ）−イル）−６−オキソヘキサン酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（またはＮ−ヒドロキシスルホンスクシンイミド）エステルの反応によって結合された２つのＸＴＥＮを示す。（図１１７Ｂ）葉酸塩−γ−アミノペンチル−マレイミドを用いて修飾されたＣｙｓのＸ残基を示す。（図１１７Ｃ）マレイミドカプロイル−バリン−シトルリン−ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル−モノメチルオーリスタチンＥで修飾されたＣｙｓのＺ残基を示す。 ＸＴＥＮ−ペイロード共役体３ｘＦＡ（γ）、３ｘＭＭＡＥ−ＸＴＥＮの構造を示す。（図１１７Ａ）アジド１−アジド−３，６，９，１２−テトラオキサペンタデカン−１５−ｏｉｃ酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、およびアルキン６−（１１，１２−ジデヒドロジベンゾ［ｂ，ｆ］アゾシン−５（６Ｈ）−イル）−６−オキソヘキサン酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（またはＮ−ヒドロキシスルホンスクシンイミド）エステルの反応によって結合された２つのＸＴＥＮを示す。（図１１７Ｂ）葉酸塩−γ−アミノペンチル−マレイミドを用いて修飾されたＣｙｓのＸ残基を示す。（図１１７Ｃ）マレイミドカプロイル−バリン−シトルリン−ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル−モノメチルオーリスタチンＥで修飾されたＣｙｓのＺ残基を示す。
本発明の実施形態について記載する前に、そのような実施形態が、単なる例として提供
されること、および本明細書に記載される本発明の実施形態に対する種々の代替手段が、
本発明の実施において採用され得ることを理解されたい。ここで、当業者は、多数の変化
形、変更、および置換を本発明から逸脱することなく想定するであろう。
別段に定義されない限り、本明細書に使用される全ての技術および科学用語は、本発明
が属する当該技術分野の当業者によって広く理解される意味を有する。本明細書に記載の
方法および物質と同様もしくは同等の方法および物質を本発明の実践または試験において
使用することができるが、適切な方法および物質は、以下に説明される。対立する場合は
、定義を含む特許明細書が優先する。さらに、材料、方法、および実施例は、単なる例示
であり、制限的であることを意図しない。ここで、当業者は、多数の変化形、変更、およ
び置換を本発明から逸脱することなく想定するであろう。
定義
本出願の文脈において、以下の用語は、別段の指定が無い限り、それらに帰する意味を
有する。
本明細書および請求項全体で使用される場合、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」と
いう用語は、その後に上限が特異的に記述される例を除いて、「少なくとも１つ」、「少
なくとも第１の」「１つ以上の」または「複数の」参照される成分またはステップを意味
するという意味で使用される。したがって、「ペイロード」とは、本明細書において使用
される場合、「少なくとも第１のペイロード」を意味するが、複数のペイロードを含む。
組合せの動作制限およびパラメータは、任意の単一薬剤の量と同様に、本開示に照らして
当業者には既知となるであろう。
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、本明細書にお
いて、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために同義に使用される。ポリマーは、直
鎖状または分岐であり得、修飾されたアミノ酸を含み得、非アミノ酸によって妨害され得
る。本用語は、修飾された（例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、ア
セチル化、リン酸化、または標識成分との接合等の任意の他の操作）アミノ酸ポリマーも
包含する。
本明細書において使用される場合、「アミノ酸」という用語は、天然および／もしくは
非天然アミノ酸、または合成アミノ酸のいずれかを指し、ＤまたはＬ光学異性体の双方、
およびアミノ酸類似体、およびペプチド模倣体を含むが、これらに限定されない。標準の
１文字または３文字コードを使用して、アミノ酸を指定する。
「薬理学的に活性な」薬剤としては、対象に送達されることが所望される、物質または
混合物の任意の薬物、化合物、組成物（例えば、治療薬、診断薬、または薬物送達剤）が
挙げられ、インビボまたはインビトロで実証することができる、多くの場合は有益ないく
らかの薬理学的効果を提供するか、または提供することが予想される。そのような薬剤と
しては、ペプチド、タンパク質、炭水化物、核酸、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、
および小分子合成化合物、またはそれらの類似体が挙げられる。
「天然Ｌアミノ酸」という用語は、グリシン（Ｇ）、プロリン（Ｐ）、アラニン（Ａ）
、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、メチオニン（Ｍ）、システイン
（Ｃ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、ヒスチジン
（Ｈ）、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、グルタミン（Ｑ）、アスパラギン（Ｎ）、グ
ルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン酸（Ｄ）、セリン（Ｓ）、およびトレオニン（Ｔ）のＬ
光学異性体形態を意味する。
「非天然に存在する」という用語は、配列に適用される場合、および本明細書において
使用される場合、哺乳類において見出される野生型または天然に存在する配列の対応物（
ｃｏｕｎｔｅｒｐａｒｔ）を有しないか、相補的でないか、または高程度の相同性を有し
ないポリペプチドまたはポリヌクレオチオド配列を意味する。例えば、非天然に存在する
ポリペプチドまたはフラグメントは、適切に整列されるとき、天然配列と比較して、９９
％以下、９８％、９５％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、またはさらにそれ
以下のアミノ酸配列同一性を共有し得る。
「親水性」および「疎水性」という用語は、基質が水に対して有する親和性の程度を指
す。親水性物質は、水に対する強い親和性を有し、水中に溶解するか、水と混合するか、
または水によって湿潤される傾向があるが、疎水性物質は、水に対する親和性を欠き、水
に反発し、吸収しない傾向があり、また水中に溶解しないか、水と混合しないか、または
水によって湿潤されない傾向がある。アミノ酸は、それらの疎水性に基づいて特徴付ける
ことができる。多数のスケールが開発されている。一例は、Ｌｅｖｉｔｔ，Ｍ，ｅｔ ａ
ｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ（１９７６）１０４：５９によって開発されたスケールであ
り、Ｈｏｐｐ，ＴＰ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（
１９８１）７８：３８２４に列挙されている。「親水性アミノ酸」の例は、アルギニン、
リジン、トレオニン、アラニン、アスパラギン、およびグルタミンである。特に興味深い
のは、親水性アミノ酸、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩、およびセリン、およびグリ
シンである。「疎水性アミノ酸」の例は、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン
、メチオニン、ロイシン、イソロイシン、およびバリンである。
「フラグメント」は、生物学的に活性なタンパク質に適用されるとき、治療的および／
または生物学的活性の少なくとも一部分を保持する、生物学的に活性なタンパク質の切断
形態である。「変異体」は、生物学的に活性なタンパク質に適用されるとき、生物学的に
活性なタンパク質の治療的および／または生物学的活性の少なくとも一部分を保持する、
天然の生物学的に活性なタンパク質に対して配列相同性を持つタンパク質である。例えば
、変異体タンパク質は、参照の生物学的に活性なタンパク質と比較して、少なくとも７０
％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％
のアミノ酸配列同一性を共有し得る。本明細書において使用される場合、「生物学的に活
性なタンパク質変異体」という用語は、例えば、部位特異的突然変異誘導、コードする遺
伝子の合成によって意図的に修飾されるか、または偶発的に突然変異を通じて修飾され、
活性を保持するタンパク質を含む。
「配列変異体」という用語は、１つ以上のアミノ酸挿入、欠失、または置換によって、
それらの天然または元の配列と比較して修飾されたポリペプチドを意味する。挿入は、タ
ンパク質のいずれか、または双方の末端に位置し得、および／またはアミノ酸配列の内部
領域内に位置付けられ得る。非限定例は、生物学的に活性なペイロードタンパク質の配列
内のＸＴＥＮ配列の挿入である。別の非限定例は、異なるアミノ酸を持つＸＴＥＮ中のア
ミノ酸の置換である。欠失変異体において、本明細書に記載されるように、ポリペプチド
中の１つ以上のアミノ酸残基が除去される。したがって、欠失変異体は、ペイロードポリ
ペプチド配列の全てのフラグメントを含む。置換変異体において、ポリペプチド中の１つ
以上のアミノ酸残基が除去され、代替残基で置換される。一態様において、これらの置換
は性質上保守的であり、この型の保守的置換は、当該技術分野において周知である。
「部分」という用語は、より大きな組成物の成分を意味するか、または薬物分子の官能
基またはより大きなポリペプチドに接合された標的ペプチド等のより大きな組成物に組み
込まれることが意図される。
本明細書において使用される場合、「末端ＸＴＥＮ」は、ペイロードがペプチドまたは
ポリペプチドであるとき、ペイロードのＮ末端またはＣ末端に融合されているか、または
その中にあるＸＴＥＮ配列を指す。
「ＸＴＥＮ遊離部位」という用語は、プロテアーゼによって認識および切断され得、Ｘ
ＴＥＮ−ペイロードポリペプチドからのＸＴＥＮまたはＸＴＥＮの一部分の遊離をもたら
す、ＸＴＥＮ−ペイロード中の切断配列を指す。本明細書において使用される場合、「哺
乳類プロテアーゼ」は、通常、哺乳類の体液、細胞、または組織中に存在するプロテアー
ゼを意味する。ＸＴＥＮ遊離部位は、様々な哺乳類プロテアーゼ（「ＸＴＥＮ遊離プロテ
アーゼ」として知られる）、例えば、トリプシン、ＦＸＩａ、ＦＸＩＩａ、カリクレイン
、ＦＶＩＩＩａ、ＦＶＩＩＩａ、ＦＸａ、ＦＩＩａ（トロンビン）、エラスターゼ−２、
ＭＭＰ−１２、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ−１７、ＭＭＰ−２０、または対象中に存在する任意
のプロテアーゼによって切断されるように操作され得る。定義された切断部位を認識する
ことができる他の同等プロテアーゼ（内因性または外因性）を利用することができる。切
断部位は、利用されるプロテアーゼに対して調整および適合することができる。
「〜の中で」という用語は、第２のポリペプチドに結合される第１のポリペプチドを指
すとき、第１または第２のポリペプチドのＮ末端を、それぞれ第２または第１のポリペプ
チドのＣ末端に接続する結合、ならびに第２のポリペプチドの配列への第１のポリペプチ
ドの挿入を包含する。例えば、ＸＴＥＮがペイロードポリペプチド「の中で」結合される
とき、ＸＴＥＮは、Ｎ末端、Ｃ末端に結合され得るか、またはペイロードポリペプチドの
任意の２つのアミノ酸の間に挿入され得る。
「活性」は、本明細書に提供されるＸＴＥＮ−ペイロード組成物の形態（複数可）に適
用されるとき、インビトロ、エクスビボ、もしくはインビボアッセイによって測定される
か、または臨床効果によって測定されるかにかかわらず、受容体結合、アンタゴニスト活
性、アゴニスト活性、細胞もしくは生理反応、または当該技術分野において一般に知られ
ているペイロードに対する効果を含むが、これらに限定されない作用または効果を指す。
本明細書において使用される場合、「ＥＬＩＳＡ」という用語は、本明細書に記載され
るように、または他の方法で既知であるように、当該技術分野において酵素結合した免疫
吸着アッセイを指す。
「宿主細胞」は、本明細書に記載されるもの等の対象ベクターに対する受容体であり得
るか、または受容体であった個別の細胞または細胞培養物を含む。宿主細胞は、単一宿主
細胞の子孫を含む。この子孫は、天然、偶発的、または意図的な突然変異に起因して、必
ずしも元の親細胞に対して（形態学的または全ＤＮＡ相補体のゲノム的に）完全に同一で
ある必要はない。宿主細胞は、本発明のベクターとインビボで形質転換された細胞を含む
。
「単離された」とは、本明細書に開示される様々なポリペプチドを説明するために使用
されるとき、その天然環境の成分から特定および分離された、および／または回収された
ポリペプチドを意味する。その天然環境の汚染物質成分は、典型的に、ポリペプチドの診
断的または治療的使用を干渉する材料であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク性ま
たは非タンパク性溶質を含み得る。当業者には明らかであるように、非天然に存在するポ
リヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはそれらのフラグメ
ントは、それをその天然に存在する対応物と区別するために、「単離」を必要としない。
さらに、「濃縮された」、「分離された」または「希釈された」ポリヌクレオチド、ペプ
チド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはそれらのフラグメントは、その天然に存
在する対応物と区別することができ、容量当たりの分子濃度または数が、一般に、その天
然に存在する対応物よりも大きい。一般に、組換え手段によって製造され、宿主細胞中に
発現したポリペプチドは、「単離されている」と見なされる。
「単離された」核酸は、特定され、それが通常、ポリペプチドをコードする核酸の天然
源中で関連付けられる、少なくとも１つの汚染物質核酸分子核酸分子から分離される。例
えば、単離されたポリペプチドをコードする核酸分子は、それが天然にで見出される形態
または状況以外で存在する。したがって、単離されたポリペプチドをコードする核酸分子
は、それが天然細胞中に存在するとき、特定のポリペプチドをコードする核酸分子と区別
される。しかしながら、単離されたポリペプチドをコードする核酸分子は、通常ポリペプ
チドを発現する細胞に含有されるポリペプチドをコードする核酸分子を含み、例えば、こ
の核酸分子は、天然細胞のそれとは異なる染色体または染色体外位置に存在する。
「キメラ」タンパク質は、天然に存在するものとは異なる配列中の位置に少なくとも１
つの領域を含む、少なくとも１つの融合ポリペプチドを含有する。これらの領域は、通常
、別個のタンパク質中に存在し得、一緒に融合ポリペプチド中に運び込まれるか、または
それらは、通常、同じタンパク質中に存在し得るが、融合ポリペプチド中に新たな配列で
配置される。キメラタンパク質は、例えば、化学合成によるか、またはペプチド領域が所
望の関係でコードされる、ポリヌクレオチドを作成および翻訳することによって作成され
得る。
「融合された」および「融合」は、本明細書において同義に使用され、２つ以上のペプ
チドまたはポリペプチド配列を、組換え手段によって一緒に接合することを指す。
「操作可能に結合された」とは、結合されるＤＮＡ配列が連続し、読み取り相にあるか
、またはインフレームであることを意味する。「インフレーム融合」は、元のＯＲＦの正
しいリーディングフレームを維持する様式で、連続する長いＯＲＦを形成するための２つ
以上のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の接合を指す。例えば、促進剤または強
化剤は、ポリペプチド配列の転写に影響を及ぼす場合、ポリペプチドのコード配列に操作
可能に結合される。したがって、得られた組換え融合タンパク質は、元のＯＲＦによって
コードされるポリペプチドに対応する２つ以上のセグメント（これらのセグメントは、通
常、天然にそのように接合されない）を含有する単一タンパク質である。
「架橋する」、「共役する」、「結合」、「結合する」、および「に接合される」は、
本明細書において同義に使用され、化学反応による２つの異なる分子の共有結合を指す。
架橋は、以下により完全に記載されるように、１つ以上の化学反応において起こり得る。
本明細書において使用される場合、「共役パートナー」という用語は、共役反応におい
て結合され得るか、または結合される個別の成分を指す。
「共役体」という用語は、共役パートナー同士を共有結合する結果として形成された異
種分子、例えば、ＸＴＥＮ分子に共有結合された生物学的に活性なペイロード、または反
応性ＸＴＥＮに共有結合されたＸＴＥＮ分子または架橋剤を指す。
「架橋剤」および「リンカー」は、同義に、それらの最も広義の文脈において使用され
、２つ以上の実体を共有結合するために使用される化学的実体を意味する。例えば、架橋
剤は、実体が本明細書において定義されるとき、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上のＸ
ＴＥＮを接合するか、またはペイロードをＸＴＥＮに接合する。架橋剤としては、小分子
ゼロ長、ホモまたはヘテロ二官能性、および多官能性架橋剤化合物の反応産物、２つのク
リック化学反応物の反応産物が挙げられるが、これらに限定されない。架橋剤が、反応物
の架橋後に残る共有結合された反応産物を指し得ることは、当業者によって理解されるで
あろう。架橋剤は、まだ反応していないが、別の実体と反応することができる、１つ以上
の反応物を含むこともできる。
ポリペプチドの文脈において、「直鎖状配列」または「配列」は、配列中で互いに隣接
する残基が、ポリペプチドの一次構造において連続する、カルボキシル末端方向へのアミ
ノのポリペプチド中のアミノ酸の順序である。「部分配列」は、追加の残基を一方向また
は双方向に含むことが知られているポリペプチドの部分の直鎖状配列である。
「異種」とは、比較される実体の残りとは遺伝子型が異なる実体に由来することを意味
する。例えば、その天然コード配列から除去され、天然配列以外のコード配列に操作可能
に結合される高グリシン配列は、異種高グリシン配列である。「異種」という用語は、ポ
リヌクレオチド、ポリペプチドに適用されるとき、そのポリヌクレオチドまたはポリペプ
チドが、比較される実体の残りのものとは遺伝子型が異なる実体に由来することを意味す
る。
「ポリヌクレオチド」、「核酸」、および「オリゴヌクレオチド」という用語は、同義
に使用される。それらは、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態、デオキシリボヌク
レオチドもしくはリボヌクレオチドのいずれか、またはそれらの類似体を指す。ポリヌク
レオチドは、任意の３次元構造を有し得、既知または未知の任意の機能を行い得る。以下
は、ポリヌクレオチドの非限定例：遺伝子または遺伝子フラグメントのコードまたは非コ
ード領域、結合分析から定義された遺伝子座（複数可）、エクソン、イントロン、メッセ
ンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、
ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任
意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、およびプ
ライマーである。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体
等の修飾ヌクレオチドを含んでよい。存在する場合、ヌクレオチド構造への修飾は、ポリ
マーの組立て前または後に付与され得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分に
より中断され得る。ポリヌクレオチドは、例えば標識成分との共役により、重合化後にさ
らに修飾され得る。
「ポリヌクレオチドの相補体」という用語は、完全な忠実度を持つ参照配列とハイブリ
ダイズすることができるように、参照配列と比較して、相補的な塩基配列および逆配向を
有するポリヌクレオチド分子を示す。
「組換え」とは、ポリヌクレオチドに適用されるとき、このポリヌクレオチドが、クロ
ーニング、制限、および／またはライゲーションステップを含み得る組換えステップの様
々な組合せ、および宿主細胞中に組換えタンパク質の発現をもたらす他の手順の産物であ
ることを意味する。
「遺伝子」および「遺伝子フラグメント」という用語は、本明細書において同義に使用
される。それらは、転写および翻訳された後に特定のタンパク質をコードすることができ
る少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含有するポリヌクレオチドを指す。
遺伝子または遺伝子フラグメントは、ポリヌクレオチドが、コード領域全体またはそのセ
グメントを被覆し得る、少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含有する限り
、ゲノムまたはｃＤＮＡであり得る。「融合遺伝子」は、一緒に結合される少なくとも２
つの異種ポリヌクレオチドからなる遺伝子である。
「相同性」または「相同の」または「配列同一性」は、２つ以上のポリヌクレオチド配
列間、または２つ以上のポリペプチド配列間の配列類似性または互換性を指す。Ｂｅｓｔ
Ｆｉｔ等のプログラムを使用して、２つの異なるアミノ差配列間の配列同一性、類似性ま
たは相同性を決定するとき、デフォルト設定が使用され得るか、または同一性、類似性、
または相同性スコアを最適化するために、ｂｌｏｓｕｍ４５またはｂｌｏｓｕｍ８０等の
適切なスコアリングマトリックスが選択され得る。好ましくは、相同性であるポリヌクレ
オチドは、本明細書に定義されるように、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズす
るものであり、それらの配列と比較して、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０
％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましく
は９７％、より好ましくは９８％、さらにより好ましくは９９％の配列同一性を有する。
相同性であるポリペプチドは、好ましくは、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８
０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５〜
９９％同一である配列同一性を有する。
「ライゲーション」は、ポリ核酸に適用されるとき、２つの核酸フラグメントまたは遺
伝子間にホスホジエステル結合を創製し、それらを一緒に結合するプロセスを指す。ＤＮ
Ａフラグメントまたは遺伝子を一緒に結紮するために、ＤＮＡの末端は、互いに適合しな
ければならない。場合によって、末端は、エンドヌクレアーゼ消化後に直接適合する。し
かしながら、最初に、一般にエンドヌクレアーゼ消化後に産生される交差式末端を平滑末
端に変換し、それらをライゲーションのために適合させることが必要であり得る。
「ストリンジェントな条件」または「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件
」という用語は、ポリヌクレオチドが、他の配列よりも（例えば、バックグラウンドの少
なくとも２倍）検出可能に高度にその標的配列にハイブリダイズする条件への言及を含む
。一般に、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、部分的に、洗浄ステップが
実行される温度および塩濃度を参照して表現される。典型的に、ストリンジェントな条件
は、塩の濃度が、約１．５Ｍ未満のナトリウムイオン、典型的に、ｐＨ７．０〜８．３で
約０．０１〜１．０Ｍナトリウムイオン濃度（または他の塩）であるものであり、温度は
、短いポリヌクレオチド（例えば、約１０〜５０ヌクレオチド）については、少なくとも
約３０℃であり、長いポリヌクレオチド（例えば、５０ヌクレオチドを上回る）について
は、少なくとも約６０℃であり、例えば、「ストリンジェントな条件」は、５０％ホルム
アミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ ＳＤＳ中３７℃でのハイブリダイゼーション、および０
．１ｘＳＳＣ／１％ＳＤＳ中６０℃〜６５℃でそれぞれ１５分間、３回の洗浄を含み得る
。代替として、約６５℃、６０℃、５５℃、または４２℃の温度が使用されてもよい。Ｓ
ＳＣ濃度は、約０．１〜２ｘＳＳＣで変動し得、ＳＤＳは、約０．１％で存在する。その
ような洗浄温度は、典型的に、定義されたイオン強度およびｐＨでの特定の配列に対する
熱融点よりも低い約５℃〜２０℃であるように選択される。Ｔｍは、標的配列の５０％が
完全に一致したプローブにハイブリダイズする（定義されたイオン強度およびｐＨでの）
温度である。核酸ハイブリダイゼーションのＴｍおよび条件を計算するための等式は、周
知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，″Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，″３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２００１において見
出すことができる。典型的に、ブロッキング試薬を使用して、非特異的ハイブリダイゼー
ションをブロックする。そのようなブロッキング試薬は、例えば、せん断および変性した
サケ精子ＤＮＡを約１００〜２００μｇ／ｍｌ含む。約３５〜５０ｖ／ｖ％の濃度のホル
ムアミド等の有機溶媒は、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリダイゼーション等の特定の状況下で使
用されてもよい。これらの洗浄条件に関する有用な変化形は、当業者に容易に明白となる
であろう。
「同一性パーセント」、「配列同一性のパーセンテージ」、および「％同一性」という
用語は、ポリヌクレオチド配列に適用されるとき、標準化アルゴリズムを使用して整列さ
れた少なくとも２つのポリヌクレオチド配列間の残基一致のパーセンテージを指す。その
ようなアルゴリズムは、２つの配列間の整列を最適化するために、標準化および再現可能
な方法で、比較される配列にギャップを挿入し得るため、これら２つの配列のより有意義
な比較を達成する。同一性パーセントは、定義されたポリヌクレオチド配列全体の長さに
わたって測定され得るか、またはより短い長さにわたって、例えば、より大きな定義され
たポリヌクレオチド配列から取られたフラグメント、例えば、少なくとも４５、少なくと
も６０、少なくとも９０、少なくとも１２０、少なくとも１５０、少なくとも２１０、ま
たは少なくとも４５０個の連続した残基のフラグメントの長さにわたって測定され得る。
そのような長さは、単なる例示であり、本明細書において、表、図面、または配列一覧に
示される配列によって支持される任意のフラグメント長を使用して、同一性のパーセンテ
ージが測定され得る長さを記載してもよいことが理解される。配列同一性のパーセンテー
ジは、比較ウィンドウ上の２つの最適に整列された配列を比較することと、一致した位置
（同一残基が双方のポリペプチド配列中に発生する）の数を決定することと、一致した位
置の数を比較ウィンドウ（すなわち、ウィンドウサイズ）内の位置の総数で割ることと、
その結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算される。
異なる長さの配列が比較されるとき、最短の配列は、比較ウィンドウの長さを定義する。
配列同一性を計算するとき、同類置換は考慮されない。
「パーセント（％）配列同一性」は、本明細書において特定されるポリペプチド配列に
関して、最大パーセントの配列同一性を達成するために、必要ならば、配列を整列させ、
ギャップを導入した後、第２の参照ポリペプチド配列またはその一部分のアミノ酸残基と
同一であるクエリー配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義され、任意の同類
置換は配列同一性の一部として考慮せず、それにより最適な整列をもたらす。アミノ酸配
列の同一性パーセントを決定することを目的とする整列は、当該技術分野の範囲内の様々
な方法で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ
（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア等の一般に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用
して達成することができる。当業者は、整列を測定するための適切なパラメータを決定す
ることができ、比較される配列の全長にわたって最適な整列を達成するために必要な任意
のアルゴリズムを含む。同一性パーセントは、定義されたポリペプチド配列全体の長さに
わたって測定され得るか、またはより短い長さにわたって、例えば、より大きな定義され
たポリペプチド配列から取られたフラグメント、例えば、少なくとも１５、少なくとも２
０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも７０、または少なく
とも１５０個の連続した残基のフラグメントの長さにわたって測定され得る。そのような
長さは、単なる例示であり、本明細書において、表、図面、または配列一覧に示される配
列によって支持される任意のフラグメント長を使用して、同一性のパーセンテージが測定
され得る長さを記載してもよいことが理解される。
ポリヌクレオチド配列の文脈において使用される「反復性」は、例えば、所与の長さの
同一ヌクレオチド配列の頻度等の配列における内部相同性の程度を指す。反復性は、例え
ば、同一配列の頻度を分析することによって測定することができる。
「ベクター」は、好ましくは、適切な宿主において自己複製する核酸分子であり、宿主
細胞の中および／または間に挿入された核酸分子を移動させる。この用語は、主に細胞へ
のＤＮＡまたはＲＮＡの挿入のために機能するベクター、主にＤＮＡまたはＲＮＡの複製
のために機能するベクターの複製、およびＤＮＡまたはＲＮＡの転写および／または翻訳
のために機能する発現ベクターを含む。上記機能のうちの複数を提供するベクターも含ま
れる。「発現ベクター」は、適切な宿主細胞に導入されたときに、ポリペプチド（複数可
）に転写および翻訳され得るポリヌクレオチドである。「発現系」は、通常、所望の発現
産物を生じるように機能し得る、発現ベクターからなる適切な宿主細胞を含意する。
「血清分解抵抗性」は、ポリペプチドに適用されるとき、ポリペプチドが血液またはそ
の成分中で分解に耐える能力を指し、典型的に血清または血漿中にプロテアーゼを必要と
する。血清分解抵抗性は、タンパク質をヒト（または必要に応じてマウス、ラット、サル
）血清または血漿と、典型的に数日間（例えば、０．２５、０．５、１、２、４、８、１
６日間）、典型的に約３７℃で合わせることによって測定することができる。これらの時
点の試料は、ウェスタンブロットアッセイ上で実行することができ、タンパク質は、抗体
で検出される。抗体は、タンパク質中のタグに対するものであり得る。タンパク質のサイ
ズが注入されたタンパク質のサイズと同一である、ウェスタン上でタンパク質が単一バン
ドを示す場合、分解は発生しなかった。この例示的な方法において、タンパク質の５０％
が分解される時点は、ウェスタンブロットまたは同等の手技によって判断されるように、
タンパク質の血清分解半減期または「血清半減期」である。
「ｔ１／２」、「半減期」、「終末相半減期」、「消失半減期」、および「循環半減期
」という用語は、本明細書において同義に使用され、本明細書において使用される場合、
ｌｎ（２）／Ｋｅｌとして計算された終末相半減期を意味する。Ｋｅｌは、時間曲線に対
するログ濃度の終末相線形部分の線形回帰によって計算された終末相消失速度定数である
。半減期は、典型的に、生体中に沈着した投与物質の量の半分が、正常な生物学的プロセ
スによって代謝または消失されるのに必要とされる時間を指す。
「活性クリアランス」とは、タンパク質が、濾過以外によって循環から除去される機構
を意味し、細胞、受容体によって媒介される循環からのタンパク質の除去、代謝、または
分解を含む。
「見掛けの分子量因子」および「見掛けの分子量」は、特定のアミノ酸またはポリペプ
チド配列によって提示される見掛けの分子量の相対増減の尺度を指す関連用語である。見
掛けの分子量は、球状タンパク質標準と比較することによって、サイズ排除クロマトグラ
フィー（ＳＥＣ）または類似の方法を使用して決定され、「見掛けのｋＤ」単位で測定さ
れる。見掛けの分子量因子は、見掛けの分子量と実際の分子量との間の比率であり、後者
は、アミノ酸組成物に基づいて、その組成物中のアミノ酸の各型の計算された分子量を加
算することによって、またはＳＤＳ電気泳動ゲル中の分子量標準との比較からの推定によ
って予測される。代表的なタンパク質について、見掛けの分子量および見掛けの分子量因
子の双方の決定は、実施例に記載される。
「流体力学半径」または「ストーク半径」という用語は、それが溶液中を動く本体であ
り、その溶液の粘度によって抵抗されると想定することによって測定された溶液中の分子
の有効半径（Ｒｈ（ｎｍ））である。本発明の実施形態において、ＸＴＥＮポリペプチド
の流体力学半径測定値は、より直感的な尺度である「見掛けの分子量因子」と相関する。
タンパク質の「流体力学半径」は、水溶液中のその拡散速度、ならびに高分子のゲル中を
移動する能力に影響を及ぼす。タンパク質の流体力学的半径は、その分子量によって、な
らびに形状およびコンパクト性を含むその構造によって決定される。流体力学半径を決定
するための方法は、当該技術分野において周知であり、例えば、米国特許第６，４０６，
６３２号および同第７，２９４，５１３号に記載されるように、サイズ排除クロマトグラ
フィー（ＳＥＣ）の使用による。大部分のタンパク質は、タンパク質が最小の流体力学半
径を有し得る、最もコンパクトな３次元構造である球状構造を有する。いくつかのタンパ
ク質は、ランダムかつオープンな非構造化、または「直鎖状」構造を採用し、結果として
、類似の分子量の典型的な球状タンパク質と比較して、はるかに大きな流体力学半径を有
する。
「生理的条件」は、生きた宿主中の一式の条件、ならびに生きた対象のそれらの条件を
模倣する、温度、塩濃度、ｐＨを含むインビトロ条件を指す。インビトロアッセイで使用
するための多くの生理的に関連した条件が確立された。一般に、生理的緩衝液は、生理的
濃度の塩を含有し、約６．５〜約７．８、好ましくは約７．０〜約７．５の範囲の中性ｐ
Ｈに調整される。多様な生理的緩衝液は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２００１）に列挙されて
いる。生理的に関連する温度は、約２５℃〜約３８℃、好ましくは、約３５℃〜約３７℃
の範囲である。
「ペイロードの単一原子残基」とは、対象のＸＴＥＮまたはＸＴＥＮ−リンカー組成物
との反応後、ＸＴＥＮに化学的に結合されるペイロードの原子、典型的に硫黄、酸素、窒
素、または炭素原子を意味する。例えば、ペイロードの原子残基は、ペイロード中のシス
テインチオール反応基の硫黄残基、ペプチドまたはポリペプチドまたは小分子ペイロード
のアミノ反応基の窒素分子、ペプチド、タンパク質もしくは小分子、または合成有機薬物
の炭素もしくは酸素残基、または反応性カルボキシルもしくはアルデヒド基であり得る。
「反応基」は、第２の反応基に結合され得る化学構造である。反応基の例は、アミノ基
、カルボキシル基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基、アルデヒド基、アジド基である
。いくつかの反応基は、活性化され、直接または架橋剤を通じてのいずれかで、第２の反
応基との共役を促進することができる。本明細書において使用される場合、反応基は、化
学反応に関与する能力を有する限り、ＸＴＥＮ、架橋剤、アジド／アルキンクリック化学
反応物、またはペイロードの一部であり得る。一旦反応すると、共役結合は、ペイロード
または架橋剤またはＸＴＥＮ反応物の残基を結合する。
「制御放出剤」、「徐放剤」、「デポー製剤」、および「持続放出剤」は、ポリペプチ
ドが薬剤の不在下で投与されるときの放出期間に対して、本発明のポリペプチドの放出期
間を延長することができる薬剤を指すように同義に使用される。本発明の異なる実施形態
は、異なる放出速度を有し得、異なる治療量をもたらす。
「ペイロード」という用語は、本明細書において使用される場合、対象に投与されると
きに、生物学的、薬理学的、または治療的活性または有益な効果を有するか、またはイン
ビトロで実証され得る、物質の任意のタンパク質、ペプチド配列、小分子、薬物、または
組成物を指す。ペイロードは、撮像またはインビボ診断目的で使用され得る分子も含む。
ペイロードの例としては、サイトカイン、酵素、ホルモン、血液凝固因子、および成長因
子、化学療法薬、抗ウイルス化合物、毒素、抗癌薬物、放射活性化合物、および造影剤、
ならびに標的ペプチド、タンパク質、抗体、抗体フラグメント、または受容体もしくはリ
ガンドに結合するために使用される化合物が挙げられるが、これらに限定されない。
「抗原」、「標的抗原」、および「免疫原」という用語は、抗体フラグメントまたは抗
体フラグメント系治療薬が結合するか、またはそれに対して特異性を有する、構造または
結合決定基を指すように、本明細書において同義に使用される。
「アンタゴニスト」という用語は、本明細書において使用される場合、本明細書に開示
される天然ポリペプチドの生物活性を部分的または完全にブロック、阻害、または中和す
る任意の分子を含む。ポリペプチドのアンタゴニストを特定するための方法は、天然ポリ
ペプチドを候補アンタゴニスト分子と接触させることと、通常、その天然ポリペプチドと
関連付けられる１つ以上の生物活性における検出可能な変化を測定することと、を含み得
る。本発明の文脈において、アンタゴニストは、タンパク質、核酸、炭水化物、抗体、ま
たは生物学的に活性なタンパク質の効果を減少させる任意の他の分子を含み得る。
「定義された媒体」は、その媒体の成分が既知であるように、培養物中の細胞の生存お
よび／または成長に必要な栄養およびホルモン要件を含む培地を指す。伝統的に、合成培
地は、成長および／または生存に必要な栄養および成長因子の付加によって製剤化された
。典型的に、合成培地は、以下のカテゴリーのうちの１つ以上から少なくとも１つの成分
を提供する：ａ）全ての必須アミノ酸（通常、２０個のアミノ酸プラスシステインの基本
セット）；ｂ）エネルギー源（通常、グルコース等の炭水化物の形態）；ｃ）ビタミンお
よび／または低濃度で必要とされる他の有機化合物；ｄ）遊離脂肪酸；およびｅ）微量元
素（微量元素は、無機化合物または典型的に非常に低濃度で必要とされる天然に存在する
元素であり、通常、マイクロモル範囲内である）として定義される。合成培地は、以下の
カテゴリーのうちのいずれかからの１つ以上の成分で任意に補足されてもよい：ａ）１つ
以上の分裂促進剤；ｂ）塩および緩衝剤（例えば、カルシウム、マグネシウム、およびリ
ン酸塩）；ｃ）ヌクレオチドおよび塩基（例えば、アデノシンおよびチミジン、ヒポキサ
ンチン）；ｄ）タンパク質および組織加水分解産物。
「アゴニスト」という用語は、最も広義に使用され、本明細書に開示される天然ポリペ
プチドの生物活性を模倣する任意の分子を含む。適切なアゴニスト分子としては、特に、
天然ポリペプチド、ペプチド、小有機分子等のアゴニスト抗体もしくは抗体フラグメント
、フラグメント、またはアミノ酸配列の変化形が挙げられる。天然ポリペプチドのアゴニ
ストを特定するための方法は、天然ポリペプチドを候補アゴニスト分子と接触させること
と、通常、その天然ポリペプチドと関連付けられる１つ以上の生物活性における検出可能
な変化を測定することと、を含み得る。
「阻害定数」または「Ｋｉ」は、同義に使用され、酵素−阻害剤錯体の解離定数、また
は酵素に対する阻害剤の結合親和性の逆数を意味する。
本明細書において使用される場合、「処置」または「処置する」または「緩和する」ま
たは「改善する」は、同義に使用され、薬物または生物製剤を投与して、治療的利点を達
成すること、既存の状態を治癒するか、または重症度を低減すること、または予防的利点
を達成すること、状態の発生を予防するか、または発症の可能性もしくは重症度を低減す
ることを意味する。治療的利点とは、対象が依然として基礎疾患に苦しめられることがあ
っても、改善がその対象で観察されるような、処置される基礎疾患、またはその基礎疾患
と関連付けられる生理的症状のうちの１つ以上の根絶もしくは改善を意味する。
「治療効果」または「治療的利点」は、本明細書において使用される場合、生理的効果
を指し、ヒトまたは他の動物における疾患の軽減、改善、もしくは予防、または生物学的
に活性なタンパク質が有する抗原エピトープに対する抗体の産生を誘導する能力以外の、
本発明のポリペプチドの投与によって生じる、他の方法でヒトもしくは動物の身体的もし
くは精神的健康を強化することが挙げられるが、これらに限定されない。予防的利点のた
めに、疾患の診断がなされていない場合でさえも、組成物が特定の疾患、その疾患の状態
もしくは症状（例えば、診断された血友病Ａ対象における出血）を発症する危険性のある
対象に、またはこの疾患の生理的症状のうちの１つ以上を報告する対象に投与され得る。
「治療上有効な量」および「治療上有効な用量」という用語は、本明細書において使用
される場合、単独またはポリペプチド組成物の一部としてのいずれかで、薬物または生物
学的に活性なタンパク質の量を指し、１回または反復投与で対象に投与されるとき、病態
または状態の任意の症状、態様、測定されたパラメータ、または特徴に対して任意の検出
可能な有益効果を有することができる。そのような効果は、絶対的に有益である必要はな
い。治療上有効な量の決定は、特に本明細書に提供される詳細な開示に照らして、十分に
当業者の能力の範囲内である。
「治療上有効な用量計画」という用語は、本明細書において使用される場合、単独また
はポリペプチド組成物の一部としてのいずれかで、生物学的に活性なタンパク質の複数用
量（すなわち、２または３）を連続投与するためのスケジュールを指し、これらの用量は
、病態または状態の任意の症状、態様、測定されるパラメータ、または特徴に対して持続
的な有益効果をもたらすように、治療上有効な量で付与される。
Ｉ）． 一般的技法
本発明の実践は、別途指示が無い限り、当該技術分野の範囲内である、免疫学、生化学
、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノミクス、および組換えＤＮＡの従来技
法を採用する。Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，″Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，″３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２００１、″Ｃ
ｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ″，Ｆ
．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，１９８７、ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ ″Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，″Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ．、″ＰＣＲ ２：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ″，
Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｇ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ
ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９５、″Ａｎｔｉｂ
ｏｄｉｅｓ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ″Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．ａｎｄ Ｌ
ａｎｅ，Ｄ．ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
，１９８８，″Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ‘ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏ
ｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，″１１ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏ
ｎ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，２００５、およびＦｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．，″Ｃｕｌ
ｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔ
ｅｃｈｎｉｑｕｅ，″４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，
Ｓｏｍｅｒｓｅｔ，ＮＪ，２０００（これらの内容は、参照によりそれら全体が本明細書
に組み込まれる）を参照されたい。
宿主細胞は、多様な培地中で培養され得る。Ｈａｍ’ｓ Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ）、Ｍｉ
ｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ，Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１
６４０（Ｓｉｇｍａ）、およびＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’
ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ，Ｓｉｇｍａ）等の市販の培地は、真核細胞を培養するのに
適している。さらに、動物細胞は、血清を欠くが、ホルモン、成長因子、または特定の細
胞型の生存および／または成長に必要な任意の他の因子で補足された、定義された培地中
で成長することができる。細胞生存を支持する合成培地は、生存率、形態、代謝能力、お
よび潜在的に、細胞が分化する能力を維持するが、細胞成長を促進する合成培地は、細胞
増殖または増加に必要な全ての化学物質を提供する。哺乳類細胞の生存および成長をイン
ビトロで支配する一般的パラメータは、当該技術分野において十分に確立されている。異
なる細胞培養系中で制御され得る物理化学的パラメータは、例えば、ｐＨ、ｐＯ２、温度
、および浸透圧である。細胞の栄養要件は、通常、最適環境を提供するように開発された
標準培地製剤中で提供される。栄養素は、いくつかのカテゴリー：アミノ酸およびそれら
の誘導体、炭水化物、糖、脂肪酸、複合脂質、核酸誘導体、およびビタミンに分割され得
る。細胞代謝を維持するための栄養素は別として、大部分の細胞は、無血清培中で増殖す
るために、地以下の群：ステロイド、プロスタグランジン、成長因子、下垂体ホルモン、
およびペプチドホルモンのうちの少なくとも１つからの１つ以上のホルモンも必要とする
（Ｓａｔｏ，Ｇ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．ｉｎ ″Ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ
Ｈｏｒｍｏｎａｌｌｙ Ｄｅｆｉｎｅｄ Ｍｅｄｉａ″，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，１９８２）。ホルモンに加えて、細胞は、インビトロ
での生存および成長のために、トランスフェリン（血漿鉄輸送タンパク質）、セルロプラ
スミン（銅輸送タンパク質）、および高密度リポタンパク質（脂質担体）等の輸送タンパ
ク質を必要とし得る。最適ホルモンまたは輸送タンパク質のセットは、各細胞型に対し異
なる。これらのホルモンまたは輸送タンパク質の大部分は、体外から付加されているか、
またはまれに、特定の因子を必要としない変異細胞株が認められている。当業者であれば
、必要以上の実験なしに細胞培養物を維持するために必要な他の因子について知っている
であろう。
原核宿主細胞の成長のための成長培地は、栄養素ブロス（液体栄養培地）またはＬＢ培
地（Ｌｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ）を含む。適切な培地としては、合成培地および天然培
地が挙げられる。一般に、培地は、細菌成長に必要なグルコース等の炭素源、水、および
塩を含有する。培地は、アミノ酸および窒素の供給源、例えば、牛肉または酵母抽出物（
天然培地中）または既知の量のアミノ酸（合成培地中）を含んでもよい。いくつかの実施
形態において、成長培地は、ＬＢブロス、例えば、ＬＢ ＭｉｌｌｅｒブロスまたはＬＢ
Ｌｅｎｎｏｘブロスである。ＬＢブロスは、ペプトン（カゼインの酵素消化産物）、酵
母抽出物、および塩化ナトリウムを含む。いくつかの実施形態において、抗生物質を含む
選択的培地が使用される。この培地において、その抗生物質への抵抗性を有する所望の細
胞のみが成長する。
ＩＩ）． ＸＴＥＮタンパク質ポリマーおよび共役組成物
本発明は、部分的に、伸長組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ）を含む、実質的に均質の組
成物に関する。第１の態様において、本発明は、長さが実質的に均一のＸＴＥＮ組成物を
提供する。そのような組成物は、ＸＴＥＮ−架橋剤の中間体およびＸＴＥＮ−ペイロード
組成物を創製するための試薬共役パートナーとして有用である。さらに、本発明の目的は
、実質的に均質なＸＴＥＮ組成物を創製するための方法を提供することである。本発明は
、そのような実質的に均質なＸＴＥＮ組成物を高収率で創製するための方法も提供する。
第２の態様において、本発明は、ＸＴＥＮを提供する。例えば、１つ以上のペイロード
共役パートナーに結合することができ、ペイロード−ＸＴＥＮ共役体をもたらすＸＴＥＮ
は、直接または架橋剤もしくはアジド／アルキン反応物を介してのいずれかで、ペイロー
ドに結合するために、定義された数の反応性アミノ酸を組み込むように特異的に操作され
る。本発明は、強化された薬物動態および薬理学的特性を含む、強化された薬学的特性を
持つ組成物として、関心対象のペイロード薬を用いて共役体を創製する際に使用するため
の、そのように操作されたＸＴＥＮポリマーを形成する方法も提供する。
別の態様において、本発明は、反応共役パートナーとして、単量体および多量体構成で
、定義された数の架橋剤またはアジド／アルキン反応物を含む実質的に均質なＸＴＥＮポ
リマーと、そのような反応物の調製方法とを提供する。架橋剤またはアジド／アルキン反
応物を含むＸＴＥＮ誘導体は、ペイロード剤の共役における反応物として使用され、所望
の物理的、薬学的、および薬理学的特性を提示するＸＴＥＮ−ペイロード共役体をもたら
す。
別の態様において、本発明は、ＸＴＥＮ−ペイロードの組成物を提供し、１つ以上のＸ
ＴＥＮは、異なるペイロードの組合せを含む、１つ以上のペイロードに、定義された数で
、単量体または多量体構成のいずれかで化学的に結合され、強化された薬学的、薬物動態
、および薬理学的特性を持つ組成物を提供する。そのようなペイロードに結合されたその
ような組成物は、対象に投与されたとき、そのペイロードの薬理学的または生物学的効果
に起因して、疾患または状態の予防、処置、または改善における有用性を有し得る。
１． ＸＴＥＮ：伸長組換えポリペプチド
一態様において、本発明は、直接または架橋剤反応物を介してのいずれかで、１つ以上
のペイロードに結合し、ＸＴＥＮ−ペイロード複合体をもたらすための共役パートナーと
して有用な実質的に均質なＸＴＥＮポリペプチド組成物を提供する。
ＸＴＥＮは、生理的条件下で低次構造を有するか、または二次もしくは三次構造を有し
ない、非天然に存在する、実質的に非反復的な配列を持つポリペプチドである。ＸＴＥＮ
は、典型的に、約３６個〜約３０００個のアミノ酸を有し、それらのうちの大半または全
体は、小さな親水性アミノ酸である。本明細書において使用される場合、「ＸＴＥＮ」は
、全抗体または抗体フラグメント（例えば、単鎖抗体およびＦｃフラグメント）を特異的
に除外する。ＸＴＥＮポリペプチドは、それらが様々な役割を果たす共役パートナーとし
ての有用性を有し、ペイロードに結合されたとき、ある望ましい特性を付与する。得られ
たＸＴＥＮ−ペイロード共役体は、強化された特性、例えば、ＸＴＥＮに結合されていな
い対応するペイロードと比較して、強化された薬物動態、生理化学的、薬理学的、および
薬学的特性を有し、そのペイロードが当該技術分野において使用されることが知られてい
る、ある状態の処置においてそれらを有用にする。
ＸＴＥＮの非構造化特徴および生理化学的特性は、部分的に、４〜６種の親水性アミノ
酸に不均衡に制限された全体アミノ酸組成物、定量可能な非反復的設計におけるアミノ酸
の結合、およびＸＴＥＮポリペプチドの長さに由来する。ＸＴＥＮに共通するが、天然ポ
リペプチドには共通しない有利な特徴において、本明細書に開示されるＸＴＥＮの特性は
、完全な一級アミノ酸配列に結び付けられず、表２の種々の例示的な配列によって明らか
となるように、長さの可変範囲内で、類似する特徴を有し、それらの多くは実施例に記述
される。したがって、ＸＴＥＮは、タンパク質よりも非タンパク質性親水性ポリマーに似
た特性を有する。本発明のＸＴＥＮは、以下の有利な特性：配座的柔軟性、二次構造の低
減または欠失、高程度の水溶性、高程度のプロテアーゼ抵抗性、低い免疫原性、哺乳類受
容体への低結合、定義された程度の電荷、および増加した流体力学的（またはストーク）
半径のうちの１つ以上を提示し、これらの特性は、それらを共役パートナーとして特に有
用にする、ある親水性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）に類似する。
対象の共役体のＸＴＥＮ成分（複数可）は、ポリマーの伸長された長さにかかわらず、
生理的条件下で変性したペプチド配列のように動作するよう設計される。「変性した」と
は、ペプチド骨格の大きな配座的自由度によって特徴付けられる、溶液中のペプチドの状
態を説明する。大部分のペプチドおよびタンパク質は、高濃度の変性剤の存在下、または
上昇温度で、変性構造を採用する。変性構造のペプチドは、例えば、特徴的な円二色作用
（ＣＤ）スペクトルを有し、ＮＭＲによって決定されるように、長距離に及ぶ相互作用の
欠失によって特徴付けられる。「変性構造」および「非構造化構造」は、本明細書におい
て同義に使用される。いくつかの実施形態において、本発明は、生理的条件下で、主とし
て二次構造を欠く変性配列に似ている、ＸＴＥＮ配列を提供する。他の例において、ＸＴ
ＥＮ配列は、生理的条件下で、実質的に二次構造を欠く。「主として欠く」とは、この文
脈で使用される場合、本明細書に記載される手段によって測定または決定されるように、
ＸＴＥＮ配列のＸＴＥＮアミノ酸残基の５０％未満が、二次構造に寄与することを意味す
る。「実質的に欠く」とは、この文脈で使用される場合、本明細書に記載される方法によ
って測定または決定されるように、ＸＴＥＮ配列のＸＴＥＮアミノ酸残基の少なくとも約
６０％、または約７０％、または約８０％、または約９０％、または約９５％、または約
９７％、または少なくとも約９９％が、二次構造に寄与しないことを意味する。
対象のＸＴＥＮの物理化学的特性を決定するための多様な方法およびアッセイは、当該
技術分野において既知である。そのような特性としては、二次または三次構造、可溶性、
タンパク質凝集、安定性、絶対および見掛けの分子量、純度および均一性、溶解特性、汚
染および水含有量が挙げられるが、これらに限定されない。そのような特性を測定する方
法としては、分析的遠心分離、ＥＰＲ、ＨＰＬＣ−イオン交換、ＨＰＬＣ−サイズ除外ク
ロマトグラフィー（ＳＥＣ）、ＨＰＬＣ−逆相、光散乱、キャピラリー電気泳動、円二色
法、示差走査熱量計、蛍光、ＨＰＬＣ−イオン交換、ＨＰＬＣ−サイズ除外、ＩＲ、ＮＭ
Ｒ、ラマン分光法、屈折計法、および紫外線／可視分光法が挙げられる。特に、二次構造
は、例えば、「遠紫外線」スペクトル領域（１９０〜２５０ｎｍ）内の円二色性分光法に
よって、分光高度的に測定することができる。二次構造要素、例えば、αらせんおよびβ
シートは、それぞれがＣＤスペクトルの特徴的な形状および大きさをもたらし、これらの
構造要素の欠失も同様である。二次構造は、米国特許出願公開第２００３０２２８３０９
Ａ１号に記載されるように、周知のＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズム（Ｃｈｏｕ，Ｐ
．Ｙ．，ｅｔ ａｌ．（１９７４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１３：２２２−４５）お
よびＧａｒｎｉｅｒ−Ｏｓｇｕｔｈｏｒｐｅ−Ｒｏｂｓｏｎアルゴリズム（「Ｇｏｒアル
ゴリズム」）（Ｇａｒｎｉｅｒ Ｊ，Ｇｉｂｒａｔ ＪＦ，Ｒｏｂｓｏｎ Ｂ．（１９９
６），ＧＯＲ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｃ
ｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｆｒｏｍ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃ
ｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ２６６：５４０−５５３）等のあるコンピュータ
プログラムまたはアルゴリズムを介して、ポリペプチド配列について予測することもでき
る。所与の配列について、これらのアルゴリズムは、いくつかの二次構造が存在するか、
または全く存在しないかを予測することができ、例えば、αらせんまたはβシートを形成
する配列の残基の総数および／またはパーセンテージ、またはランダムコイル形成（二次
構造を欠く）をもたらすことが予測される配列の残基のパーセンテージとして表される。
ポリペプチド配列は、例えば、ワールドワイドウェブｆａｓｔａ．ｂｉｏｃｈ．ｖｉｒｇ
ｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ２／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ．ｃｇｉ？ｒｍ＝ｍｉｓ
ｃ１上のサイトを使用するＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズム、およびｎｐｓａ−ｐｂ
ｉｌ．ｉｂｃｐ．ｆｒ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｎｐｓａ＿ａｕｔｏｍａｔ．ｐｌ？ｐａｇｅ＝
ｎｐｓａ＿ｇｏｒ４．ｈｔｍｌにおけるＧｏｒアルゴリズム（いずれも２０１２年９月５
日にアクセスされた）を使用して、分析することができる。追加の方法は、Ａｒｎａｕ，
ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔ Ｅｘｐｒ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆ（２００６）４８，１−１３に
開示されている。
一実施形態において、対象の共役体中で使用されるＸＴＥＮ配列は、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓ
ｍａｎアルゴリズムによって決定されるように、０％〜約５％未満の範囲のαらせんパー
センテージを有する。別の実施形態において、ＸＴＥＮ配列は、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ
アルゴリズムによって決定されるように、０％〜約５％未満の範囲のβシートパーセンテ
ージを有する。一実施形態において、共役体のＸＴＥＮ配列は、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ
アルゴリズムによって決定されるように、０％〜約５％未満の範囲のαらせんパーセンテ
ージ、および０％〜約５％未満の範囲のβシートパーセンテージを有する。一実施形態に
おいて、共役体のＸＴＥＮ配列は、約２％未満のαらせんパーセンテージ、および約２％
未満のβシートパーセンテージを有する。共役組成物のＸＴＥＮ配列は、ＧＯＲアルゴリ
ズムによって決定されるように、高程度のランダムコイルパーセンテージを有する。いく
つかの実施形態において、ＸＴＥＮ配列は、ＧＯＲアルゴリズムによって決定されるよう
に、少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくと
も約９１％、より好ましくは少なくとも約９２％、より好ましくは少なくとも約９３％、
より好ましくは少なくとも約９４％、より好ましくは少なくとも約９５％、より好ましく
は少なくとも約９６％、より好ましくは少なくとも約９７％、より好ましくは少なくとも
約９８％、および最も好ましくは少なくとも約９９％のランダムコイルを有する。一実施
形態において、共役組成物のＸＴＥＮ配列は、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズムによ
って決定されるように、０％〜約５％未満の範囲のαらせんパーセンテージ、および０％
〜約５％未満の範囲のβシートパーセンテージを有し、ＧＯＲアルゴリズムによって決定
されるように、少なくとも約９０％のランダムコイルを有する。別の実施形態において、
開示される組成物のＸＴＥＮ配列は、約２％未満のαらせんパーセンテージ、および約２
％未満のβシートパーセンテージを有し、ＧＯＲアルゴリズムによって決定されるように
、少なくとも約９０％のランダムコイルを有する。別の実施形態において、組成物のＸＴ
ＥＮ配列は、円二色法によって測定されるように、実質的に二次構造を欠いている。
共役組成物を形成するために使用されるペイロードに結合されるＸＴＥＮの選択基準は
、一般に、ＸＴＥＮの物理化学的特性および配座構造の属性に関し、順に、それを使用し
て、強化された薬学的、薬理学的、および薬物動態特性を組成物に付与する。
１． 非反復的配列
特に、対象の共役組成物の実施形態に含まれる対象のＸＴＥＮ配列は、実質的に非反復
的であることが企図される。一般に、反復アミノ酸配列は、コラーゲンおよびロイシンジ
ッパー等の天然反復配列によって例示されるように、凝集するか、または高次構造を形成
する傾向がある。これらの反復アミノ酸は、結晶または偽晶構造をもたらす接触を形成す
る傾向もあり得る。対照的に、非反復的配列が凝集する傾向が低いことは、そうでなけれ
ば配列が反復する場合に凝集する可能性がある比較的低周波の電荷アミノ酸を持つ長配列
ＸＴＥＮの設計を可能にする。対象ＸＴＥＮの非反復性は、以下の特徴のうちの１つ以上
を評価することによって観察され得る。一実施形態において、実質的に非反復的なＸＴＥ
Ｎ配列は、アミノ酸がセリンでない限り、同一アミノ酸型である配列中に３個の隣接する
アミノ酸を有さず、この場合、３個以下の隣接するアミノ酸はセリン残基である。別の実
施形態において、以下により完全に記載されるように、実質的に非反復的なＸＴＥＮ配列
は、その配列の８０〜９９％が９〜１４個のアミノ酸残基のモチーフからなり、これらの
モチーフは、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グル
タミン酸塩（Ｅ）およびプロリン（Ｐ）から選択される３、４、５、または６種のアミノ
酸で構成され、いずれか１つのモチーフにおけるいずれか２つの隣接するアミノ酸残基の
配列は、その配列モチーフにおいて２回を超えて反復しない。
ポリペプチドまたは遺伝子の反復性の程度は、コンピュータプログラムもしくはアルゴ
リズムによって、または当該技術分野において既知の他の手段によって測定することがで
きる。本発明に従い、ＸＴＥＮ等の特定のポリペプチドの反復性の程度を計算する際に使
用されるアルゴリズムが本明細書において開示され、アルゴリズムによって分析された配
列の例が提供される（以下の実施例参照）。一実施形態において、既定長のポリペプチド
の反復性は、等式Ｉによって示される式に従い計算することができる（以下、「部分列ス
コア」）。
「ＳｅｇＳｃｏｒｅ」と呼ばれるアルゴリズムは、前述の等式を適用して、ＸＴＥＮ等
のポリペプチドの反復性を定量化するように開発され、既定のアミノ酸長「ｎ」の配列が
、長さ「ｓ」の固有の部分列が設定された長さに出現する回数（「カウント」）を決定し
、その既定長の配列内の部分列の絶対数で割ることにより、反復性について分析される部
分列スコアを提供する。図７９は、ＳｅｇＳｃｏｒｅアルゴリズムの論理フローチャート
を示すが、図８０は、部分列スコアが、１１個のアミノ酸および３個のアミノ酸残基の部
分列長を持つ架空のＸＴＥＮに対しどのように派生するかの概略を描く。例えば、２００
個のアミノ酸残基の既定のポリペプチド長は、１９２個の重複する９アミノ酸部分列、お
よび１９８個の３−ｍｅｒ部分列を有するが、任意の所与のポリペプチドの部分列スコア
は、固有の部分列の絶対数、および各固有の部分列（異なるアミノ酸配列を意味する）が
、既定長の配列に出現する頻度に依存する。
本発明の文脈において、「部分列スコア」とは、累積ＸＴＥＮポリペプチドの２００個
の連続アミノ酸全体の各固有の３−ｍｅｒフレームの発生の合計を、２００個のアミノ酸
配列内の固有の３−ｍｅｒ部分列の絶対数で割ったものを意味する。反復および非反復的
ポリペプチドの２００個の連続アミノ酸に由来するそのような部分列スコアの例は、実施
例４５に提示される。一実施形態において、本発明は、１つのＸＴＥＮを含むＸＴＥＮ−
ペイロードを提供し、このＸＴＥＮは、１２未満、より好ましくは１０未満、より好まし
くは９未満、より好ましくは８未満、より好ましくは７未満、より好ましくは６未満、お
よびより好ましくは５未満の部分列スコアを有する。別の実施形態において、本発明は、
ＸＴＥＮを含むＸＴＥＮ−架橋剤共役体を提供し、このＸＴＥＮは、１０未満、より好ま
しくは９未満、より好ましくは８未満、より好ましくは７未満、より好ましくは６未満、
およびより好ましくは５未満の部分列スコアを有する。別の実施形態において、本発明は
、ＸＴＥＮを含むＸＴＥＮ−クリック化学共役体を提供し、このＸＴＥＮは、１０未満、
より好ましくは９未満、より好ましくは８未満、より好ましくは７未満、より好ましくは
６未満、およびより好ましくは５未満の部分列スコアを有する。さらに別の実施形態にお
いて、本発明は、少なくとも２つの結合されたＸＴＥＮを含むＸＴＥＮ共役体を提供し、
各個別のＸＴＥＮは、１０未満、または９未満、または８未満、または７未満、または６
未満、または５未満、またはそれ以下の部分列スコアを有する。さらに別の実施形態にお
いて、本発明は、少なくとも３つの結合されたＸＴＥＮを含むＸＴＥＮ共役組成物を提供
し、各個別のＸＴＥＮは、１０未満、または９未満、または８未満、または７未満、また
は６未満、または５未満、またはそれ以下の部分列スコアを有する。本明細書に記載され
るＸＴＥＮ組成物の実施形態において、１０以下（すなわち、９、８、７等）の部分列ス
コアを持つＸＴＥＮは、実質的に非反復的であるとして特徴付けられる。
一態様において、本発明のＸＴＥＮの非反復特徴は、絶対一次配列ではなく、ＸＴＥＮ
中で優位を占める特定型のアミノ酸と一緒に、ＸＴＥＮおよび得られたＸＴＥＮ−ペイロ
ード共役体の強化された物理化学的および生物学的特性のうちの１つ以上を付与する。こ
れらの強化された特性としては、ＸＴＥＮに共役されないペイロード、または反復配列を
有するタンパク質に共役されたペイロードと比較して、得られた共役体の宿主細胞中のよ
り高度なＸＴＥＮタンパク質の発現、ＸＴＥＮをコードする遺伝子のより優れた遺伝的安
定性、より高度な可溶性、より低い凝集傾向、および強化された薬物動態が挙げられる。
これらの強化された特性は、より効率的な製造、最終産物のより優れた均一性、より低い
製品コストを許し、および／または極めて高い、場合によっては１００ｍｇ／ｍｌを超え
るタンパク質濃度を含有する薬学的調製物を含むＸＴＥＮの製剤化を促進する。いくつか
の実施形態において、共役体のＸＴＥＮポリペプチド配列は、哺乳類に投与されるとき、
免疫原性を低減または実質的に消失させるために、低程度の内部反復性を有するよう設計
される。グリシン、セリン、およびグルタミン酸塩等の主に３個のアミノ酸のみに限定さ
れる短い反復したモチーフからなるポリペプチド配列は、これらの配列中に予測されるＴ
細胞エピトープの不在にもかかわらず、哺乳類に投与されるとき、比較的高い抗体滴定を
もたらし得る。タンパク質凝集体、架橋免疫原、および反復炭水化物を含む、反復したエ
ピトープを持つ免疫原が、高度に免疫原性であり、例えば、Ｂ細胞活性化を引き起こすＢ
細胞受容体の架橋をもたらすことが示されているように、これは、ポリペプチドの反復性
質によって引き起こされ得る（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｖ
ａｃｃｉｎｅ，２５：１６７６−８２、Ｙａｎｋａｉ，Ｚ．，ｅｔ ａｌ．（２００６）
Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ，３４５：１３６５−７１、Ｈ
ｓｕ，Ｃ．Ｔ．，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，６０：３７０１−５
）、Ｂａｃｈｍａｎｎ ＭＦ，ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９５）
２５（１２）：３４４５−３４５１）。
２． 例示的な配列モチーフ
本発明は、複数単位のより短い配列、またはモチーフを含む共役パートナーとして使用
されるＸＴＥＮを包含し、モチーフのアミノ酸配列は、実質的に非反復的である。非反復
特性は、図１８〜１９に示されるように、ＸＴＥＮ配列を形成するために多量体化される
配列モチーフのライブラリーを使用する「構築ブロック」アプローチを使用しても満たさ
れ得る。ＸＴＥＮ配列がわずか４つの異なる種の配列モチーフの複数単位からなり得るが
、これらのモチーフ自体は、一般に非反復アミノ酸配列からなるため、全体ＸＴＥＮ配列
は、配列を実質的に非反復的にするように設計される。
一実施形態において、ＸＴＥＮは、約３６超〜約３０００、または約１００〜約２００
０、または約１４４〜約１０００個のアミノ酸残基の実質的に非反復的な配列を有し、Ｘ
ＴＥＮ配列の少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０
％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または約９９％〜約１００
％は、非重複配列モチーフからなり、これらのモチーフのそれぞれは、約９〜３６個のア
ミノ酸残基を有する。本明細書において使用される場合、「非重複」とは、個別のモチー
フがアミノ酸残基を共有しないが、むしろ直鎖状様式で他のモチーフまたはアミノ酸残基
に融合されることを意味する。他の実施形態において、ＸＴＥＮ配列の少なくとも約８０
％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％
、または少なくとも約９７％、または約９９％〜約１００％は、非重複配列モチーフから
なり、これらのモチーフのそれぞれは、９〜１４個のアミノ酸残基を有する。さらに他の
実施形態において、ＸＴＥＮ配列の少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、ま
たは少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、また
は約９９％〜約１００％は、非重複配列モチーフからなり、これらのモチーフのそれぞれ
は、１２個のアミノ酸残基を有する。これらの実施形態において、配列モチーフは、実質
的に（例えば、９０％以上）または独占的に小さな親水性アミノ酸からなり、全体配列が
非構造化可撓性特徴を有するようにすることが好ましい。ＸＴＥＮに含まれるアミノ酸の
例は、例えば、アルギニン、リジン、トレオニン、アラニン、アスパラギン、グルタミン
、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩、セリン、およびグリシンである。一実施形態にお
いて、ＸＴＥＮ配列は、約３６〜約３０００、または約１００〜約２０００、または約１
４４〜約１０００個のアミノ酸残基の長さである、実質的に非反復的な配列に配置される
、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸塩
（Ｅ）、またはプロリン（Ｐ）から選択される４〜６種のアミノ酸を主に有する。いくつ
かの実施形態において、ＸＴＥＮ配列は、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ
）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸塩（Ｅ）、またはプロリン（Ｐ）からなる群から選
択される４、５、または６種のアミノ酸で形成される。いくつかの実施形態において、Ｘ
ＴＥＮは、約３６〜約１０００、または約１００〜約２０００、または約４００〜約３０
００個のアミノ酸残基の配列を有し、配列の少なくとも約８０％は、非重複配列モチーフ
からなり、モチーフのそれぞれは、９〜３６個のアミノ酸残基を有し、モチーフのそれぞ
れの少なくとも９０％、または少なくとも９１％、または少なくとも９２％、または少な
くとも９３％、または少なくとも９４％、または少なくとも９５％、または少なくとも９
６％、または少なくとも９７％、または１００％は、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、
セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸塩（Ｅ）およびプロリン（Ｐ）から選択
される、４〜６種のアミノ酸からなり、全長ＸＴＥＮのいずれか１つのアミノ酸型の含有
量は、３０％を超えない。他の実施形態において、ＸＴＥＮ配列の少なくとも約９０％は
、非重複配列モチーフからなり、モチーフのそれぞれは、９〜３６個のアミノ酸を有し、
これらのモチーフは、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ
）、グルタミン酸塩（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）から選択される４〜６種のアミノ酸か
らなり、全長ＸＴＥＮのいずれか１つのアミノ酸型の含有量は、４０％、または約３０％
、または２５％、または約１７％、または約１２％、または約８％を超えない。他の実施
形態において、ＸＴＥＮ配列の少なくとも約９０％は、非重複配列モチーフからなり、モ
チーフのそれぞれは、これらのモチーフは、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（
Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸塩（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）から選択される
４〜６種のアミノ酸からなる１２個のアミノ酸を有し、全長ＸＴＥＮのいずれか１つのア
ミノ酸型の含有量は、４０％、または約３０％、または２５％、または約１７％、または
約１２％、または約８％を超えない。さらに他の実施形態において、ＸＴＥＮ配列の少な
くとも約９０％、または約９１％、または約９２％、または約９３％、または約９４％、
または約９５％、または約９６％、または約９７％、または約９８％、または約９９％〜
約１００％は、非重複配列モチーフからなり、これらのモチーフのそれぞれは、グリシン
（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸塩（Ｅ）、お
よびプロリン（Ｐ）からからなる１２個のアミノ酸残基を有する。
いくつかの実施形態において、本発明は、約３６〜約１０００個のアミノ酸残基、また
は累積で約１００〜約３０００個のアミノ酸残基の１つ、または２つ、または３つ、また
は４つ以上の実質的に非反復的なＸＴＥＮ配列（複数可）を含むＸＴＥＮ−ペイロード、
ＸＴＥＮ−架橋剤、およびＸＴＥＮ−クリック化学反応物共役体を提供し、その配列の少
なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または約９１％、または約９２％、また
は約９３％、または約９４％、または約９５％、または約９６％、または約９７％、また
は約９８％、または約９９％〜約１００％は、表１のアミノ酸配列から選択される４つ以
上の非重複配列モチーフの複数単位からなり、全体配列は、実質的に非反復的なままであ
る。いくつかの実施形態において、ＸＴＥＮは、非重複配列モチーフを含み、配列の約８
０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または約９１％、または
約９２％、または約９３％、または約９４％、または約９５％、または約９６％、または
約９７％、または約９８％、または約９９％、または約１００％は、表１から選択される
単一モチーフファミリーから選択される非重複配列の複数単位からなり、ファミリー配列
をもたらす。ファミリーとは、モチーフに適用されるとき、ＸＴＥＮが表１からの単一モ
チーフカテゴリーから選択されるモチーフ、すなわち、ＡＤ、ＡＥ、ＡＦ、ＡＧ、ＡＭ、
ＡＱ、ＢＣ、またはＢＤを有することを意味する。他の実施形態において、ＸＴＥＮは、
所望の物理化学的特徴を達成するために選択される、表１のモチーフファミリーのうちの
２つ以上からのモチーフ配列の複数単位を含み、以下により完全に記載される、正味電荷
、親水性、二次構造の欠失、またはモチーフのアミノ酸組成によって付与され得る反復性
の欠失等の特性を含む。このパラグラフに記載される上記の実施形態において、ＸＴＥＮ
に組み込まれるモチーフまたはモチーフの部分は、本明細書に記載される方法を使用して
選択され、組み立てられて、約３６、約４２、約７２、約１４４、約２８８、約５７６、
約８６４、約１０００、約２０００〜約３０００個のアミノ酸残基、または任意の中間長
のＸＴＥＮを達成することができる。対象複合体に組み込むために有用なＸＴＥＮファミ
リー配列の非限定例は、表２に提示される。表２に対して記述される特定の配列は、表２
に記載される配列を有するが、ＡＥ１４４配列に関する一般化された言及は、例えば、１
４４個のアミノ酸残基を有する任意のＡＥ配列（例えば、ＡＥ１４４＿１Ａ、ＡＥ１４４
＿２Ａ等）を包含することが意図されるか、またはＡＧ１４４配列に関する一般化された
言及は、例えば、１４４個のアミノ酸残基を有する任意のＡＧ配列（例えば、ＡＧ１４４
＿１、ＡＧ１４４＿２、ＡＧ１４４＿Ａ、ＡＧ１４４＿Ｂ、ＡＧ１４４＿Ｃ等）を包含す
ることが意図される。
ＸＴＥＮが、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グ
ルタミン酸塩（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）から選択される４、５、または６種のアミノ
酸からなるそのアミノ酸の１００％未満、または表１からの配列モチーフ、または表２、
３、および２２〜２５のＸＴＥＮ配列からなる配列の１００％未満を有するいくつかの実
施形態において、ＸＴＥＮの他のアミノ酸残基は、他の１４の天然Ｌアミノ酸のいずれか
から選択されるが、ＸＴＥＮ配列が、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９
４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも約９９％親水性アミノ酸を含
有するように、親水性アミノ酸から選好的に選択される。個別のアミノ酸またはグリシン
（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸塩（Ｅ）およ
びプロリン（Ｐ）以外のアミノ酸の短い配列は、ＸＴＥＮに組み込まれ得、コードヌクレ
オチドによって制限部位の組込みを許す等の必要とされる特性を達成するか、またはペイ
ロード成分への結合もしくは切断配列の組込みを促進し得る。以下により完全に記載され
る例示的な一実施形態として、本発明は、１〜約２０、または１〜約１５、または１〜約
１０、または１〜５個のリジン残基を組み込むＸＴＥＮを提供し、反応性リジンは、本明
細書に記載されるように、架橋剤またはペイロードに結合するために利用される。以下に
より完全に記載される別の実施形態において、ＸＴＥＮは、１〜約２０、または１〜約１
５、または１〜約１０、または１〜５個のシステイン残基を組み込み、反応性システイン
は、本明細書に記載されるように、架橋剤またはペイロードに結合するために利用される
。別の実施形態において、ＸＴＥＮは、１〜約２０個のシステインおよびリジン残基を組
み込み、これらのリジンおよびシステインは、本明細書に記載されるように、異なる架橋
剤またはペイロードに結合するために利用される。別の実施形態において、ＸＴＥＮは、
プロリン残基が続かない１、２、３、４、５個、またはそれ以上のアルギニン残基を組み
込み、本明細書において以下により完全に記載される、ＸＴＥＮセグメントを形成するよ
うに、トリプシンによって切断され得る切断配列を提供する。グリシン（Ｇ）、アラニン
（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸塩（Ｅ）およびプロリン（Ｐ）
ではないＸＴＥＮアミノ酸は、ＸＴＥＮ配列全体に散在するか、配列モチーフ内またはそ
れらの間に位置するか、または例えば、Ｎ末端もしくはＣ末端、またはそれらの付近にあ
るＸＴＥＮ配列の１つ以上の短い伸長に濃縮されるかのいずれかである。疎水性アミノ酸
がポリペプチドに構造を与えるため、本発明は、共役構築物において利用されるＸＴＥＮ
中の疎水性アミノ酸の含有量は、典型的に、５％未満、または２％未満、または１％未満
の疎水性アミノ酸含有量である。ＸＴＥＮの構築においてあまり好まれない疎水性残基と
しては、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、ロイシン、イソロイシン、バリ
ン、およびメチオニンが挙げられる。さらに、以下のアミノ酸：メチオニン（酸化を回避
するため）、アスパラギン、およびグルタミン（脱アミド化を回避するため）の５％未満
、または４％未満、または３％未満、または２％未満、または１％未満を含有するか、ま
たは含有しないように、ＸＴＥＮ配列を設計することができる。他の実施形態において、
共役構築物において使用されるＸＴＥＮ成分中のメチオニンおよびトリプトファンのアミ
ノ酸含有量は、典型的に、５％未満、または２％未満、および最も好ましくは１％未満で
ある。他の実施形態において、対象のＸＴＥＮ共役体のＸＴＥＮは、正電荷を持つ１０％
未満のアミノ酸残基、または正電荷を持つ約７％未満、または約５％未満、または約２％
未満を有する配列を有し、メチオニンおよびトリプトファン残基の合計は、２％未満とな
り、アスパラギンおよびグルタミン残基の合計は、総ＸＴＥＮ配列の５％未満となる。
３． システインおよびリジン操作されたＸＴＥＮ配列
別の態様において、本発明は、定義された数の組み込まれたシステインまたはリジン残
基を持つＸＴＥＮ、それぞれ「システイン操作されたＸＴＥＮ」および「リジン操作され
たＸＴＥＮ」を提供する。本発明の目的は、システインのチオール基またはリジンのεア
ミノ基と、ＸＴＥＮ骨格に共役されるペイロードまたは架橋剤上の反応基との間の共役を
許すように、定義された数のシステインおよび／またはリジン残基を持つＸＴＥＮを提供
することである。前述の一実施形態において、本発明のＸＴＥＮは、約１〜約１００個の
リジン残基、または約１〜約７０個のリジン残基、または約１〜約５０個のリジン残基、
または約１〜約３０個のリジン残基、または約１〜約２０個のリジン残基、または約１〜
約１０個のリジン残基、または約１〜約５個のリジン残基、または１〜約３個のリジン残
基、または代替として、単一リジン残基のみを有する。前述の別の実施形態において、本
発明のＸＴＥＮは、約１〜約１００個のシステイン残基、または約１〜約７０個のシステ
イン残基、または約１〜約５０個のシステイン基、または約１〜約３０個のシステイン残
基、または約１〜約２０個のシステイン残基、または約１〜約１０個のシステイン残基、
または約１〜約５個のシステイン残基、または１〜約３個のシステイン残基、または代替
として、単一システイン残基のみを有する。前述の別の実施形態において、本発明のＸＴ
ＥＮは、約１〜約１０個のリジン残基、および約１〜約１０個のシステイン残基を有する
。前述のリジンおよび／またはシステイン含有ＸＴＥＮを使用して、ＸＴＥＮ、任意の架
橋剤、プラス対象における状態の処置において有用なペイロードを含む共役体を構築する
ことができ、ＸＴＥＮ成分に結合されたペイロード剤の分子の最大数は、リジン、システ
イン、またはＸＴＥＮに組み込まれた反応性側基（例えば、末端アミノまたはチオール）
を持つ他のアミノ酸の数によって決定される。
一実施形態において、本発明は、システイン操作されたＸＴＥＮを提供し、ＸＴＥＮの
１つ以上のアミノ酸をコードするヌクレオチドは、システインアミノ酸と置き換えられ、
システイン操作されたＸＴＥＮ遺伝子を形成する。別の実施形態において、本発明は、シ
ステイン操作されたＸＴＥＮを提供し、１つ以上のシステインアミノ酸をコードするヌク
レオチドは、ＸＴＥＮコード遺伝子に挿入され、システイン操作されたＸＴＥＮ遺伝子を
形成する。他の例において、１つ以上のシステインをコードするコドンを含む約９〜約１
４個のアミノ酸の１つ以上のモチーフをコードするオリゴヌクレオチドは、ＸＴＥＮモチ
ーフまたは全長ＸＴＥＮをコードする他のオリゴとフレーム内で結合され、システイン操
作されたＸＴＥＮ遺伝子を形成する。１つ以上のシステインが、ＸＴＥＮ遺伝子の形成中
にＸＴＥＮ配列に挿入される前述の一実施形態において、システインをコードするヌクレ
オチドは、ＸＴＥＮにおいて使用されるアミノ酸をコードするコドンに結合され、本明細
書に記載される方法を使用するか（実施例６１および図４０〜４１参照）、または標準分
子生物学技法によって、定義された位置にシステイン（複数可）を持つシステイン−ＸＴ
ＥＮモチーフを形成することができ、これらのモチーフは、全長システイン操作されたＸ
ＴＥＮをコードする遺伝子に後次に組み立てられる。そのような場合、例えば、単一シス
テインをコードするヌクレオチドが、表１から選択されるモチーフをコードするＤＮＡに
付加される場合、得られたモチーフは、１３個のアミノ酸を有するが、２つのシステイン
を組み込むことは、１４個のアミノ酸等を有するモチーフをもたらす。他の場合、システ
イン−モチーフは、デノボで形成することができ、システインをコードするヌクレオチド
を、ＸＴＥＮにおいて使用される１つ以上のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド（例
えば、Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｅ、Ｐ、Ａ）に定義された位置で結合することによって、既定長およ
び数のシステインアミノ酸であり得、コードするモチーフは、本明細書に記載され、図７
〜８に示されるように、他のＸＴＥＮをコードするモチーフ配列を用いて、全長ＸＴＥＮ
をコードする遺伝子にアニールすることによって後次に組み立てられる。リジン操作され
たＸＴＥＮが、本発明の複合体を形成するために利用される場合、上記の手法は、システ
インの代わりにリジンをコードするコドンを用いて行われる。したがって、前述によって
、約９〜１４個のアミノ酸残基を含み、１つ以上の反応性アミノ酸、すなわちシステイン
またはリジンを有し得る新たなＸＴＥＮモチーフを形成することができる。単一システイ
ンまたはリジンを含有する操作されたＸＴＥＮにおいて使用するのに適したモチーフの非
限定例は、以下の通りである。
ＧＧＳＰＡＧＳＣＴＳＰ
ＧＡＳＡＳＣＡＰＳＴＧ
ＴＡＥＡＡＧＣＧＴＡＥＡＡ
ＧＰＥＰＴＣＰＡＰＳＧ
ＧＧＳＰＡＧＳＫＴＳＰＧＡＳＡＳＫＡＰＳＴＧ
しかしながら、本発明は、ＸＴＥＮに組み込むための、表５および表１１に示されるもの
等の異なる長さのモチーフを企図する。
１つ以上のシステインおよび／またはリジモチーフを持つＸＴＥＮをコードする遺伝子
が、既存のＸＴＥＮモチーフまたはセグメントから構築されるような場合、遺伝子は、長
さの短いＸＴＥＮおよび長いＸＴＥＮの双方をコードする既存の「構築ブロック」ポリヌ
クレオチド（例えば、ＡＥ４８、ＡＥ１４４、ＡＥ２８８、ＡＥ４３２、ＡＥ５７６、Ａ
Ｅ８６４、ＡＭ４８、ＡＭ８７５、ＡＥ９１２、ＡＧ８６４）、またはシステインおよび
／またはリジンを含有するモチーフをコードするヌクレオチドとフレーム内で融合され得
る、実施例１〜４および表２２〜２５の３６’ｍｅｒをコードするヌクレオチドを結合す
ることによって設計および構築することができるか、または代替として、システインおよ
び／またはリジンをコードするヌクレオチドは、例えば、表４および５の島をコードする
ヌクレオチドを使用して、既存のＸＴＥＮ配列（以下および実施例においてより完全に記
載される）にＰＣＲされ、操作されたＸＴＥＮを構築することができ、反応性システイン
および／またはリジンは、所望の量で配列中の１つ以上の設計された位置に配置される。
そのように操作されたＸＴＥＮの非限定例は、表３に提供される。したがって、一実施形
態において、本発明は、最適に整列されたとき、表３から選択される配列または配列のフ
ラグメントに対して、少なくとも約８０％の配列同一性、または少なくとも約９０％、ま
たは約９１％、または約９２％、または約９３％、または約９４％、または約９５％、ま
たは約９６％、または約９７％、または約９８％、または約９９％の配列同一性を有する
か、または同一であるＸＴＥＮ配列を提供する。しかしながら、システインまたはリジン
残基を包含するＸＴＥＮを創製するためのシステインまたはリジン操作された方法の適用
は、正確な組成物、または前述の実施形態の組成物同一性の範囲に制約されることを意味
しない。当業者には理解されるように、ＸＴＥＮに組み込まれるシステインまたはリジン
残基の正確な位置および数は、記載されるように、本発明から逸脱することなく変動し得
る。
別の実施形態において、本発明は、リジン島として定義される、より長い配列の一部と
してリジンの挿入を提供する。リジン島の例は、表４に示される。ＸＴＥＮ中の全てのリ
ジン残基を同様または同一の配列と隣接させる利益は、それが各リジンに対し、より均一
の化学反応性をもたらすことである。別の利点は、ペプチドマッピングを行い、ペイロー
ド結合の程度を測定する能力に由来する。例としては、表４の島Ｉ＿Ｌ６、Ｉ＿Ｌ７、お
よびＩ＿Ｌ８が挙げられる。これらの島は、ＧｌｕＣプロテアーゼを使用してペプチドマ
ッピングを促進する、グルタミン酸塩残基を含む。別の実施形態において、本発明は、シ
ステイン島として定義される、より長い配列の一部としてシステインの挿入を提供する。
システイン島の例は、表５に示される。ＸＴＥＮ中の全てのシステイン残基を同様または
同一の配列と隣接させる利益は、それが各システインに対し、より均一の化学反応性をも
たらすことである。別の利点は、ペプチドマッピングを行い、ペイロード共役の程度を測
定する能力に由来する。例としては、表５の島Ｉ＿Ｃ４、Ｉ＿Ｃ７、Ｉ＿Ｃ８、およびＩ
＿Ｃ９が挙げられる。これらの島は、ＧｌｕＣプロテアーゼを使用してペプチドマッピン
グを促進する、グルタミン酸塩残基を含む。これらの島は、上記および実施例に記載され
るように、従来のＰＣＲ法によって既存のＸＴＥＮをコードする構築物に挿入することが
できる。これらの島をコードするオリゴヌクレオチドは、従来のＰＣＲ法によって既存の
ＸＴＥＮをコードする構築物に挿入することができる。例えば、既存の全長ＸＴＥＮ遺伝
子が、１つ以上の反応性システインまたはリジン残基をコードするヌクレオチドで修飾さ
れる一実施形態において、システインまたはリジンをコードし、ＸＴＥＮの１つ以上の短
い配列に対する部分的相同性を呈し、それにハイブリダイズすることができるオリゴヌク
レオチドを形成することができ、ＸＴＥＮ遺伝子の既存のコドンのシステインまたはリジ
ンコドンの組換え事象および置換をもたらす（一般方法の説明については、例えば、実施
例６および７を参照されたい）。例示的な一実施形態において、組換えは、Ｉ＿Ｃ１島の
アミノ酸配列ＧＧＳＰＡＧＳＣＴＳＰとの置換をもたらす。しかしながら、オリゴヌクレ
オチドは、システイン（またはリジン）をモチーフの異なる位置に配置するか、または第
２のシステイン（またはリジン）をモチーフに含むように設計することができる。システ
インまたはリジンをコードするオリゴヌクレオチドは、所与の配列セグメントに異なる地
点で、既知のＸＴＥＮ配列に沿ってハイブリダイズし、ＸＴＥＮをコードする遺伝子への
それらの挿入を許すように設計することができる。したがって、本発明は、複数のＸＴＥ
Ｎ遺伝子構築物が、ＸＴＥＮ配列内の異なる位置に挿入されるシステインまたはリジンを
用いて、ＸＴＥＮ配列内の制限部位の選択および所与の位置に適切であり、同じＸＴＥＮ
配列への複数の挿入をもたらす設計されたオリゴヌクレオチドの使用を含む、システイン
またはリジンをコードするオリゴヌクレオチドの設計によって形成され得ることを企図す
る。ＸＴＥＮの既知の配列を考慮して、１つ以上のそのようなオリゴヌクレオチドの設計
および選択、ならびに本発明の方法の適切な使用によって、全長ＸＴＥＮに挿入された置
換反応性システインまたはリジン残基の潜在的数を推定し、次いで、得られたＸＴＥＮ遺
伝子を配列決定することによって確認することができる。
ＸＴＥＮは、図１Ｄに示されるように、共役のためにリジンおよびシステイン残基の双
方を含むように設計することができる。これは、システインまたはリジンに付着した官能
基またはリンカーと反応するように調整された共役方法を使用して、２つの異なるペイロ
ードを同じＸＴＥＮポリマーに共役することを可能にする。そのような混合ペイロードは
、単一組成物中で対象に投与されるとき、付加的および／または相乗性薬理学的効果を有
することができる。代替として、混合ペイロードは、ファーマコフォアを対象における所
望の位置に送達するために、標的部分および活性ペイロードの組合せであり得る。リジン
およびシステイン残基の数および位置を制御することによって、共役されたペイロードの
数および位置を制御することができる。これは、得られたＸＴＥＮ−ペイロード共役体に
おけるペイロードの相対能力または選択性を調整することを可能にする。
本発明の設計、選択、および調製方法は、求電子性官能基と反応する、操作されたＸＴ
ＥＮの創製を可能にする。本明細書に提供される対象の共役体を製造する方法は、図１に
概略的に示されるように、指定された部位において定量化様式で付加されたリンカーまた
はペイロード分子を持つ、ＸＴＥＮ−ペイロード共役体、ＸＴＥＮ−架橋剤共役体、およ
びＸＴＥＮ−アジド／アルキン反応物共役体の形成を可能にする。ペイロード、架橋剤、
およびアジド／アルキン反応物は、部位特異的および効率的にＸＴＥＮのＮ末端もしくは
Ｃ末端、チオール反応性試薬を用いてシステイン操作されたＸＴＥＮに、またはアミン反
応性試薬を用いて本発明のリジン操作されたＸＴＥＮに、および以下により完全に記載さ
れるように、ＸＴＥＮのＮ末端におけるαアミノ基に結合され、次いで、精製され、例え
ば、実施例においてより具体的に記載される非限定方法を使用して、図４０に概略的に示
されるように特徴付けられる。
４． 配列の長さ
別の態様において、本発明は、組成物に組み込むための可変長のＸＴＥＮを提供し、こ
のＸＴＥＮ配列（複数可）の長さは、組成物中で達成される特性または機能に基づいて選
択される。意図される特性または機能に応じて、ＸＴＥＮ−ペイロード共役体は、短いか
、中間長のＸＴＥＮ、またはより長いＸＴＥＮ配列、あるいは担体として機能し得る短い
、中間、またはより長いＸＴＥＮの多量体を含む。限定することが意図されないが、ＸＴ
ＥＮまたはＸＴＥＮのフラグメントは、約６〜約９９個のアミノ酸残基の短いセグメント
、約１００〜約３９９個のアミノ酸残基の中間長、および約４００〜約１０００個および
最大約３０００個のアミノ酸残基のより長い長さを含む。したがって、対象の共役体に組
み込むための共役パートナーとして利用されるＸＴＥＮは、約６、または約１２、または
約３６、または約４０、または約４８、または約７２、または約９６、または約１４４、
または約２８８、または約４００、または約４３２、または約５００、または約５７６、
または約６００、または約７００、または約８００、または約８６４、または約９００、
または約１０００、または約１５００、または約２０００、または約２５００、または最
大約３０００個のアミノ酸残基の長さを持つＸＴＥＮまたはＸＴＥＮのフラグメントを包
含する。他の場合、ＸＴＥＮ配列は、約６〜約５０、約５０〜約１００、約１００〜１５
０、約１５０〜２５０、約２５０〜４００、約４００〜約５００、約５００〜約９００、
約９００〜１５００、約１５００〜２０００、または約２０００〜約３０００個のアミノ
酸残基の長さであり得る。対象のＸＴＥＮ−ペイロード共役体に組み込まれるＸＴＥＮの
正確な長さは、共役体の生物学的活性に悪影響を及ぼすことなく変動し得る。一実施形態
において、ＸＴＥＮのうちの１つ以上は、ＸＴＥＮファミリー配列のうちの１つ、例えば
、ＡＤ、ＡＥ、ＡＦ、ＡＧ、ＡＭ、ＡＱ、ＢＣ、またはＢＤから選択され得る。いくつか
の実施形態において、対象の共役体を形成するために利用されるＸＴＥＮは、表２、表３
、および表２２〜２５の配列のうちのいずれか１つから選択されるＸＴＥＮを含み、直接
または本明細書に開示される架橋剤を介して、ペイロード成分に結合され得る。他の実施
形態において、対象の共役体を形成するために利用される１つ以上のＸＴＥＮは、個別に
、相当する長さの配列と最適に整列されるとき、表２、３、２２〜２５から選択されるＸ
ＴＥＮ、またはそのフラグメントと比較して、少なくとも約８０％の配列同一性、または
代替として８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％
、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％
、または１００％の配列同一性を有するＸＴＥＮ配列を含む。いくつかの実施形態におい
て、対象の共役体は、２、３、４、またはそれ以上のＸＴＥＮ配列を含み、そのＸＴＥＮ
配列中の残基の累積長は、約１００超〜約３０００、または約４００〜約２０００、また
は約８００〜１０００個のアミノ酸残基であり、ＸＴＥＮは、同一であり得るか、または
配列または長さが異なり得る。本明細書において使用される場合、複数のＸＴＥＮが共役
体に組み込まれるとき、累積長は、アミノ酸残基にその全長を包含することが意図される
。
以下により完全に記載されるように、ＸＴＥＮ−ペイロード共役体が、ＸＴＥＮの長さ
を選択することにより設計される方法、および架橋剤反応物またはペイロードと結合させ
て、物理化学的特性（例えば、安定性または可溶性）を付与するか、またはＸＴＥＮ−ペ
イロード共役体が対象に投与されるとき、活性の標的半減期または保持をもたらす方法が
開示される。
ＸＴＥＮは、組成物中の担体として使用され、本発明は、非反復的、非構造化ポリペプ
チドの長さを増加することが、ＸＴＥＮの非構造化性質を強化し、それに対応して、ＸＴ
ＥＮ担体を含む構築物の物理化学的および薬物動態特性を強化するという発見を利用する
。一般に、共役体に組み込まれる約４００個の残基より長い累積長を持つ単量体として、
または多量体としてのＸＴＥＮは、より短い、例えば、約２８０個の残基より短い累積長
と比較して、より長い半減期をもたらす。実施例により完全に記載されるように、ＸＴＥ
Ｎの長さの比例的増加は、単一ファミリー配列モチーフ（表１の４つのＡＥモチーフ）の
反復順序によって形成される場合であっても、ＧＯＲアルゴリズムによって決定されるよ
うに、より短いＸＴＥＮ長と比較して、より高いパーセンテージのランダムコイル形成、
またはＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズムによって決定されるように、低減したαらせ
んもしくはβシートの含有量を持つ配列をもたらす。さらに、非構造化ポリペプチド融合
パートナーの長さを増加させることは、実施例に記載されるように、より短い配列長を持
つ非構造化ポリペプチドパートナーを持つポリペプチドと比較して、終末相半減期の不均
衡な増加を持つ構築物をもたらす。ＸＴＥＮが主に担体として機能するいくつかの実施形
態において、本発明は、２、３、４、またはそれ以上のＸＴＥＮを含むＸＴＥＮ共役組成
物を包含し、ＸＴＥＮタンパク質の累積ＸＴＥＮ配列長は、約１００、２００、４００、
５００、６００、８００、９００、または１０００〜約３０００個超のアミノ酸残基であ
り、この構築物は、ＸＴＥＮに結合されないペイロードと比較して、対照に投与されると
き、および相当する用量で投与されるときに、強化された薬物動態特性を呈する。前述の
一実施形態において、２つ以上のＸＴＥＮ配列は、それぞれ表２、表３、または表２２〜
２５のうちのいずれか１つから選択される配列に対して少なくとも約８０％、９０％、９
１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、または９８％以上の同一性を
呈し、担体配列（複数可）の残りがある場合は、少なくとも９０％の親水性アミノ酸を含
有し、全体配列の約２％未満は、疎水性または芳香族アミノ酸またはシステインからなる
。ＸＴＥＮ−ペイロード共役体の強化された薬物動態特性は、ＸＴＥＮに結合されないペ
イロードと比較して、以下により完全に記載される。
５． ＸＴＥＮ前駆体からのＸＴＥＮセグメント
別の態様において、本発明は、より長い「ドナー」ＸＴＥＮ配列から短長または中間長
のＸＴＥＮを創製するための方法を提供し、より長いドナーＸＴＥＮ配列は、Ｎ末端また
はＣ末端で切断されるか、またはセグメントは、切断配列を含むＸＴＥＮのタンパク質分
解によって形成され、それにより短長または中間長のＸＴＥＮをもたらす。非限定例にお
いて、８６４個のアミノ酸残基のＡＧ８６４配列を切断して、１４４個の残基を持つＡＧ
１４４、２８８個の残基を持つＡＧ２８８、５７６個の残基を持つＡＧ５７６、または他
の中間長さを生じさせることができ、一方、ＡＥ８６４配列を切断して、複数のＡＥ１４
４配列、２８８個の残基を持つＡＥ２８８配列、または５７６個の残基を持つＡＥ５７６
、または他のより短い長さか、もしくは中間長を生じさせることができる。同様に、より
長い「ドナー」配列をコードするＤＮＡは、短長または中間長のＸＴＥＮとの共役におい
て使用するために意図されるシステインまたはリジン残基を組み込むように操作すること
ができる。そのような手法は、本明細書に記載されるＸＴＥＮ実施形態のうちのいずれか
、または表２、３、２１、および２２に列挙される配列のうちのいずれかとともに利用し
、所望の長さのＸＴＥＮをもたらすことができる。
別の態様において、本発明は、ＸＴＥＮが均一長の２、３、４、５、または６個のより
短いＸＴＥＮに切断することによって処理され得るように、定義された間隔で配列内部に
組み込まれた切断配列を持つＸＴＥＮを提供する。図９６Ａに示されるように、単量体Ｘ
ＴＥＮは、２つの内部切断配列とともに設計され、全ての切断配列の切断をもたらすのに
有効な条件下、プロテアーゼで処置されるとき、均一長の３つのＸＴＥＮ配列をもたらす
。さらに、ＸＴＥＮは、得られたＸＴＥＮセグメントが、残りの切断配列を含めて、同一
アミノ酸配列も有するように、配列とともに設計される。一実施形態において、本発明は
、ＸＴＥＮ配列の内部に１、２、３、４、または５個のアルギニン（Ｒ）残基を含み、同
一のＸＴＥＮセグメントを架橋するＸＴＥＮ配列に沿って均一の間隔を置いて配置される
、定義された配列を持つＸＴＥＮを提供し、トリプシンを用いた処置は、同一の長さおよ
び配列を有するように、ＸＴＥＮセグメントへのＸＴＥＮの切断をもたらす。前述の実施
形態において、アルギニン残基は、隣接するＰ１’位にプロリン残基を有しない。したが
って、トリプシンを用いた前述の処置によって、１つの内部アルギニンを持つＸＴＥＮは
、２つの同一ＸＴＥＮセグメントをもたらし、２つの内部アルギニンを持つＸＴＥＮは、
３つの同一ＸＴＥＮセグメントをもたらす等である。別の実施形態において、前述の実施
形態の各アルギニンは、リジン残基で置換される。別の実施形態において、本発明は、Ｘ
ＴＥＮ配列の内部に１、２、３、４、または５個の切断配列を含み、ＸＴＥＮ配列に沿っ
て均一の間隔を置いて配置される、定義された配列を持つＸＴＥＮを提供し、各切断配列
は、ＳＡＳＲＳＡであり、トリプシンを用いた処置は、同一の長さおよび配列を有するよ
うに、ＸＴＥＮセグメントへのＸＴＥＮの切断をもたらす。別の実施形態において、本発
明は、表６に記載される配列の群から選択される配列に対して少なくとも約９０％、また
は少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または
少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少
なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性
を持つＸＴＥＮを提供する。別の実施形態において、表６に記載される配列の群から選択
される配列に対して少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも
約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約
９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９
８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を持つＸＴＥＮを提供し、このＸＴＥＮは
、第１および第２の親和性タグをさらに含み、各親和性タグは、それぞれＸＴＥＮのＮ末
端およびＣ末端の切断配列によってＸＴＥＮに結合され、各切断配列は、トリプシンによ
って切断されることができ、第１の親和性タグは、第２の親和性タグとは異なり、それぞ
れが、独立して、表７に記載される親和性タグからなる群から選択される。前述の実施形
態は、図９６Ｂに示され、２つの内部切断配列、およびそれぞれ切断配列によってＸＴＥ
Ｎに結合されるＮ末端およびＣ末端親和性タグを持つＸＴＥＮのプロテアーゼを用いた処
置は、均一長の３つのＸＴＥＮセグメントへの構築物の切断、および２つの親和性タグの
遊離をもたらし、得られた調製物は、後次に、本明細書において以下に記載されるように
、実質的に均質なＸＴＥＮに処理され得る。そのような均一な切断配列を含むＸＴＥＮの
変化形、および配列中のそれらの分布は、本発明によって企図される。
６． 正味電荷
他の実施形態において、ＸＴＥＮポリペプチドは、正味電荷を持つアミノ酸残基の組込
みによって付与され、ＸＴＥＮ配列中に低パーセンテージの疎水性アミノ酸を含有するか
、または含有しない、非構造化特徴を有する。全体正味電荷および正味電荷密度は、ＸＴ
ＥＮ配列中の正または負のいずれかの電荷アミノ酸の含有量を修正することによって制御
され、正味電荷は、典型的に、対向する電荷を持つ残基によって相殺されるそれらの残基
を超えて、電荷状態に寄与するポリペプチド中のアミノ酸のパーセンテージとして表され
る。いくつかの実施形態において、共役体のＸＴＥＮの正味電荷密度は、＋０．１以上、
または−０．１以下の電荷／残基であり得る。本明細書におけるタンパク質またはペプチ
ドの「正味電荷密度」とは、正味電荷をタンパク質中のアミノ酸の総数で割ったものを意
味する。他の実施形態において、ＸＴＥＮの正味電荷は、約０％、約１％、約２％、約３
％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％
、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、または約
２０％以上であり得る。正味電荷に基づいて、いくつかのＸＴＥＨは、１．０、１．５、
２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、またはさ
らに６．５の等電点（ｐＩ）を有する。一実施形態において、ＸＴＥＮは、１．５〜４．
５の等電点を有し、生理的条件下で正味の負電荷を担持する。
ヒトまたは動物における大部分の組織および表面は、正味の負電荷を有し、いくつかの
実施形態において、ＸＴＥＮ配列は、組成物を含有するＸＴＥＮと、血管、健常組織、ま
たは様々な受容体等の様々な表面との間の非特異的相互作用を最小化するために、正味の
負電荷を有するように設計される。特定の理論に拘束されないが、ＸＴＥＮは、個別に正
味の負電荷を担持し、ＸＴＥＮポリペプチドの配列全体に分散されるＸＴＥＮポリペプチ
ドの個別のアミノ酸間の静電反発に起因して、オープン構造を採用することができる。い
くつかの実施形態において、ＸＴＥＮ配列は、セリン、アラニン、トレオニン、プロリン
、またはグリシン等の他の非電荷残基によって分離される電荷残基の少なくとも９０％〜
９５％を用いて設計され、より均一な電荷の分配、より良好な発現または精製動作をもた
らす。ＸＴＥＮの伸長された配列長さにおける正味の負電荷のそのような均一分配は、ポ
リマーの非構造化構造にも寄与し、順に、流体力学半径の有効な増加をもたらすことがで
きる。好適な実施形態において、対象ＸＴＥＮの負電荷は、グルタミン酸残基の組込みに
よって付与される。一般に、グルタミン残基は、ＸＴＥＮ配列全体で均一に間隔を置いて
配置される。場合によっては、ＸＴＥＮは、２０ｋＤａのＸＴＥＮ当たり約１０〜８０、
または約１５〜６０、または約２０〜５０個のグルタミン残基を含有することができ、非
常に類似したｐＫａを有する電荷残基を持つＸＴＥＮをもたらし得、これが産物の電荷均
質性を増加させ、その等電点を鋭敏にすることができ、得られたＸＴＥＮ−ペイロードの
物理化学的特性を強化する故に、精製手順を簡素化する。例えば、負電荷を持つＸＴＥＮ
が所望される場合、ＸＴＥＮは、ＡＥファミリー配列から単独で選択され得、組み込まれ
たグルタミン酸に起因して、約１７％の正味電荷を有するか、または所望の程度の正味電
荷を提供するために、可変比率の表１のグルタミン酸含有モチーフを含むことができる。
ＡＥ ＸＴＥＮの非限定例としては、表２および２１のＡＥ３６、ＡＥ４２、ＡＥ１４４
、ＡＥ２８８、ＡＥ４３２、ＡＥ５７６、ＡＥ６２４、ＡＥ８６４、およびＡＥ９１２配
列、またはそれらのフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態に
おいて、表２または３のＸＴＥＮ配列は、所望の正味の負電荷を達成するために、追加の
グルタミン酸残基を含むように修飾することができる。したがって、一実施形態において
、本発明は、ＸＴＥＮ配列が、約１％、２％、４％、８％、１０％、１５％、１７％、２
０％、２５％、またはさらに約３０％のグルタミン酸を含有するＸＴＥＮを提供する。場
合によっては、ＸＴＥＮは、２０ｋＤａのＸＴＥＮ当たり約１０〜８０、または約１５〜
６０、または約２０〜５０個のグルタミン残基を含有することができ、非常に類似したｐ
Ｋａを有する電荷残基を持つＸＴＥＮをもたらし得、これが産物の電荷均質性を増加させ
、その等電点を鋭敏にすることができ、得られたＸＴＥＮ共役組成物の物理化学的特性を
強化する故に、精製手順を簡素化する。一実施形態において、本発明は、正味の負電荷を
達成するために、グルタミン酸に加えて、ＸＴＥＮへの最大５％のアスパラギン酸残基の
組込みを企図する。
特定の理論に拘束されないが、より高い正味の負電荷を持つＸＴＥＮ−ペイロード共役
体のＸＴＥＮは、血管、組織、または様々な受容体等の様々な負に電荷された表面との非
特異的相互作用をあまり有しないことが予想される。反対に、低い正味電荷を持つ（また
は持たない）ＸＴＥＮ−ペイロード共役体のＸＴＥＮは、血管系または組織中の関連付け
られた共役体の活性を増強することができる、より高程度の表面との相互作用を有すると
考えられる。
他の実施形態において、正味電荷が所望されない場合、ＸＴＥＮは、ＡＧ ＸＴＥＮ成
分、例えば、表１のＡＧモチーフ、または正味電荷を有しない表１のそれらのＡＭモチー
フ等から選択することができる。ＡＧ ＸＴＥＮの非限定例としては、表２および２２の
３６、４２、１４４、２８８、５７６、および８６４ ＡＧファミリー配列、またはそれ
らのフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態において、ＸＴ
ＥＮは、所与の使用に最適であると見なされる正味電荷を有するか、または所与の物理化
学的特性を維持するために、変化する比率のＡＥおよびＡＧモチーフを含むことができる
。
本発明の共役体のＸＴＥＮは、一般に、正に電荷されたアミノ酸を有しないか、または
低含有量で有する。いくつかの実施形態において、ＸＴＥＮは、正電荷を持つ約１０％未
満のアミン酸残基、または正電荷を持つ約７％未満、または約５％未満、または約２％未
満、または約１％未満のアミノ酸残基を有し得る。しかしながら、本発明は、リジンのε
アミンとＸＴＥＮ骨格に共役されるペイロードまたは架橋剤上の反応基との共役を許すよ
うに、リジン等の正電荷を持つ定義された数のアミノ酸が、ＸＴＥＮに組み込まれる、構
築物を企図する。前述の一実施形態において、対象の共役体のＸＴＥＮは、約１〜約１０
０個のリジン残基、または約１〜約７０個のリジン残基、または約１〜約５０個のリジン
残基、または約１〜約３０個のリジン残基、または約１〜約２０個のリジン残基、または
約１〜約１０個のリジン残基、または約１〜約５個のリジン残基、または１〜約３個のリ
ジン残基、または代替として、単一リジン残基のみを有する。前述のリジン含有ＸＴＥＮ
を使用して、ＸＴＥＮ、任意の架橋剤、プラス対象における状態の処置において有用なペ
イロードを含む共役体を構築することができ、ＸＴＥＮ成分に結合されたペイロード剤の
分子の最大数は、ＸＴＥＮに組み込まれた反応性側基（例えば、末端アミノ）を持つリジ
ンの数によって決定される。
７． 低い免疫原性
別の態様において、本発明は、低程度の免疫原性を有するか、または実質的に非免疫原
性であるＸＴＥＮ組成物を提供する。いくつかの因子は、ＸＴＥＮ（例えば、非反復配列
）の低い免疫原性、非構造化構造、高程度の可溶性、低程度の自己凝集またはその欠失、
配列内の低程度のタンパク質分解部位またはその欠失、およびＸＴＥＮ配列中の低程度の
エピトープまたはその欠失に寄与し得る。
構造的エピトープは、タンパク質抗原の複数の不連続アミノ酸配列で構成される、タン
パク質表面の領域によって形成される。タンパク質の正確な折り畳みは、これらの配列を
、十分に定義された安定した空間構成、または宿主液性免疫系によって「外来」として認
識され得るエピトープに持ち込み、そのタンパク質に対する抗体の産生または細胞媒介性
免疫反応の活性化をもたらす。後者の場合、個体におけるタンパク質への免疫反応は、そ
の個別のＨＬＡ−ＤＲアロタイプのペプチド結合特異性の機能である、Ｔ細胞エピトープ
認識によって大きく影響を受ける。Ｔ細胞の表面上の同種Ｔ細胞受容体によるＭＨＣクラ
スＩＩペプチド錯体の係合は、ＣＤ４分子等のある他の共受容体の架橋と一緒に、Ｔ細胞
内の活性化状態を誘導することができる。活性化は、Ｂ細胞等の他のリンパ球をさらに活
性化して抗体を産生するか、または全細胞性免疫反応としてＴキラー細胞を活性化させる
、サイトカインの放出をもたらす。
ペプチドが、ＡＰＣ（抗原提示細胞）の表面上の提示のために所与のＭＨＣクラスＩＩ
分子に結合する能力は、多数の因子、最も顕著にはその一次配列に依存する。一実施形態
において、より低程度の免疫原性は、抗原提示細胞における抗原処理に耐えるＸＴＥＮ配
列を設計することによって、および／またはＭＨＣ受容体に良好に結合しない配列を選択
することによって達成される。本発明は、ＭＨＣＩＩ受容体との結合を低減するとともに
、Ｔ細胞受容体または抗体結合のためのエピトープ形成を回避し、低程度の免疫原性をも
たらすように設計された実質的に非反復的なＸＴＥＮポリペプチドとのＸＴＥＮ−ペイロ
ード、ＸＴＥＮ−架橋剤、およびＸＴＥＮクリック化学反応物共役体を提供する。免疫原
性の回避は、ＸＴＥＮ配列の構造柔軟性の結果、すなわち、アミノ酸残基の選択および順
序による二次構造の欠失に少なくとも部分的に起因し得る。例えば、水溶液中、または構
造エピトープをもたらし得る生理的条件下で、小さく折り畳まれた構造を適合させる傾向
が低い配列が特に興味深い。従来の治療実践および投薬を使用して、ＸＴＥＮを含むポリ
ペプチドの投与は、一般に、ＸＴＥＮ配列に対する中和抗体の形成をもたらさず、共役体
中のペイロードの免疫原性も低減する。
一実施形態において、対象ポリペプチドにおいて利用されるＸＴＥＮ配列は、ヒトＴ細
胞によって認識されるエピトープを実質的に含まないことがある。免疫原性の低いタンパ
ク質を生成することを目的とするそのようなエピトープの消失は、以前に開示されており
、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、第ＷＯ９８／５２９７６号、第ＷＯ０２
／０７９２３２号、および第ＷＯ００／３３１７号を参照されたい。ヒトＴ細胞エピトー
プのアッセイが、説明されている（Ｓｔｉｃｋｌｅｒ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２００３）
Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２８１：９５−１０８）。Ｔ細胞エピトープまた
は非ヒト配列を生成せずに、オリゴマー化され得るペプチド配列が特に興味深い。これは
、Ｔ細胞エピトープの存在について、および６〜１５−ｍｅｒ、特にヒトではない９−ｍ
ｅｒ配列の発生について、これらの配列の直接反復を試験すること、次いで、エピトープ
配列を消失または破壊するようにＸＴＥＮ配列の設計を改変することによって達成される
。いくつかの実施形態において、ＸＴＥＮ配列は、ＭＨＣ受容体に結合することが予測さ
れるＸＴＥＮのエピトープ数の制限によって、実質的に非免疫原性である。ＭＨＣ受容体
に結合することができるエピトープの数の低減とともに、Ｔ細胞活性化ならびにＴ細胞ヘ
ルパー機能の可能性の同時低減、Ｂ細胞活性化または上方調節の低減、および抗体産生の
低減が存在する。低程度の予測されたＴ細胞エピトープは、実施例４６に示されるように
、例えば、ＴＥＰＩＴＯＰＥ（Ｓｔｕｒｎｉｏｌｏ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｎ
ａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１７：５５５−６１）等のエピトープ予測アルゴリズムに
よって決定することができる。タンパク質内の所与のペプチドフレームのＴＥＰＩＴＯＰ
Ｅスコアは、Ｓｔｕｒｎｉｏｌｏ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７：５５５）に開示されるように、複数の最も一般的なヒトＭ
ＨＣ対立遺伝子に対するそのペプチドフレームの結合のＫｄ（解離定数、親和性、オフレ
ート）のログである。スコアは、少なくとも２０ログ超、約１０〜約−１０の範囲であり
（１０ｅ１０Ｋｄ〜１０ｅ−１０Ｋｄの結合定数に対応する）、Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｆ等の
ＭＨＣ上のペプチドディスプレイ中にアンカー残基として機能する疎水性アミノ酸を回避
することによって低減される。いくつかの実施形態において、ＸＴＥＮ−ペイロード、Ｘ
ＴＥＮ−架橋剤、またはＸＴＥＮ−クリック化学反応物共役体に組み込まれるＸＴＥＮ成
分は、予測されたＴ細胞エピトープを、約−５、もしくは−６、もしくは−７、もしくは
−８、もしくは−９のＴＥＰＩＴＯＰＥ閾値スコアで、または−１０のＴＥＰＩＴＯＰＥ
スコアで有しない。本明細書において使用される場合、「−９」のスコアは、−５のスコ
アよりもストリンジェントなＴＥＰＩＴＯＰＥ閾値である。
８． 増加した流体力学半径
別の態様において、融合パートナーとして有用な対象ＸＴＥＮは、ＸＴＥＮを有しない
ペイロードと比較して、対応する見掛けの分子量の増加をＸＴＥＮ−ペイロード組成物に
付与する特性である、高い流体力学半径を有する。実施例２６に詳述されるように、治療
タンパク質配列へのＸＴＥＮの結合は、ＸＴＥＮに結合されていない治療タンパク質と比
較して、増加した流体力学半径、増加した見掛けの分子量、および増加した見掛けの分子
量因子を有し得る組成物をもたらす。例えば、長い半減期が所望される治療適用において
、高い流体力学半径を持つ１つ以上のＸＴＥＮがペイロードに共役される組成物は、共役
体の流体力学半径を、約３〜５ｎｍ（約７０ｋＤａの見掛けの分子量に対応する）の糸球
体細孔径を超えて有効に拡大することができ（Ｃａｌｉｃｅｔｉ．２００３．Ｐｈａｒｍ
ａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ ａｎｄ ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅ
ｓ ｏｆ ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）−ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｊｕ
ｇａｔｅｓ．Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ ５５：１２６１−１２７７）、対
応する終末相半減期の増加を伴う循環タンパク質の腎クリアランスの低減、および他の強
化された薬物動態特性をもたらす。タンパク質の流体力学半径は、その分子量によるとと
もに、形状またはコンパクト性を含む、その構造によって付与される。特定の理論に拘束
されないが、ＸＴＥＮは、ＸＴＥＮに組み込まれた電荷残基の個別の電荷間の静電反発に
よるとともに、二次構造を付与する可能性を欠く配列中の特定のアミノ酸によって付与さ
れる固有の柔軟性に起因して、オープン構造を採用することができる。ＸＴＥＮポリペプ
チドのオープンな伸長された非構造化構造は、典型的な球状タンパク質等の二次または三
次構造を有する、相当する配列長および／または分子量のポリペプチドと比較して、より
大きな比例流体力学半径を有する。流体力学半径を決定するための方法は、米国特許第６
，４０６，６３２号および同第７，２９４，５１３号に記載されるように、例えば、サイ
ズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）の使用によって、当該技術分野において周知である
。実施例２６は、ＸＴＥＮ長の増加が、流体力学半径、見掛けの分子量、および／または
見掛けの分子量因子の比例増加をもたらし、したがって、ＸＴＥＮ−ペイロードを見掛け
の分子量または流体力学半径の所望のカットオフ値に調整することを許すことを実証する
。したがって、ある実施形態において、ＸＴＥＮ−ペイロードは、得られた共役体が、少
なくとも約５ｎｍ、または少なくとも約８ｎｍ、または少なくとも約１０ｎｍ、または約
１２ｎｍ、または約１５ｎｍ、または約２０ｎｍ、または約３０ｎｍ以上の流体力学半径
を有することができるように、ＸＴＥＮによって構成され得る。前述の実施形態において
、ＸＴＥＮ−ペイロード共役体中のＸＴＥＮによって付与される大きな流体力学半径は、
得られた共役体のクリアランスの低減、終末相半減期の増加、および平均滞留時間の増加
をもたらすことができる。実施例に記載されるように、ＸＴＥＮ含有組成物の分子量が、
サイズ排除クロマトグラフィー分析に由来するとき、低程度の二次構造に起因するＸＴＥ
Ｎのオープン構造は、それらが組み込まれる共役体の見掛けの分子量の増加をもたらす。
一実施形態において、本発明は、見掛けの分子量の増加が、以下により完全に記載される
ように、直鎖状様式で、または三量体もしくは四量体分岐構造としてのいずれかでの所与
の長さの単一ＸＴＥＮの結合のみならず、比例的に短い長さの２、３、４個またはそれ以
上のＸＴＥＮの結合によって達成され得るという発見を利用する。いくつかの実施形態に
おいて、ペイロードおよび１つ以上のＸＴＥＮを含むＸＴＥＮは、少なくとも約４００ｋ
Ｄ、または少なくとも約５００ｋＤ、または少なくとも約７００ｋＤ、または少なくとも
約１０００ｋＤ、または少なくとも約１４００ｋＤ、または少なくとも約１６００ｋＤ、
または少なくとも約１８００ｋＤ、または少なくとも約２０００ｋＤの見掛けの分子量を
呈する。したがって、ＸＴＥＮ−ペイロード共役体は、その共役体の実際の分子量よりも
約１．３倍大きいか、または約２倍大きいか、または約３倍大きいか、または約４倍大き
いか、または約８倍大きいか、または約１０倍大きいか、または約１２倍大きいか、また
は約１５倍、または約２０倍大きい見掛けの分子量を呈する。一実施形態において、本明
細書に開示される実施形態の単離されたＸＴＥＮ−ペイロード複合体は、約１．３、また
は約２、または約３、または約４、または約５、または約６、または約７、または約８、
または約１０、または約１５よりも大きい生理的条件下で、見掛けの分子量因子を呈する
。別の実施形態において、ＸＴＥＮ−ペイロードは、生理的条件下で、共役体の実際の分
子量に対して約３〜約２０、または約５〜約１５、または約８〜約１２、または約９〜約
１０の見掛けの分子量因子を有する。一般に、対象ＸＴＥＮ−ペイロード共役体の増加し
た見掛けの分子量は、因子の組合せによって組成物の薬物動態特性（活性クリアランスの
低減、腎クリアランスの低減、ならびに毛細血管および静脈接合を通じた損失の低減を含
む）を強化する。
９． 組成物および実質的に均質な調製物としてＸＴＥＮを精製する方法
本発明の目的は、ＸＴＥＮの組成物、および本明細書に記載されるＸＴＥＮの長さおよ
び組成物の高レベルの純度および長さの均一性を持つＸＴＥＮを含む調製物を製造する方
法を提供することである。
組換えＸＴＥＮタンパク質、または通常、任意の球状タンパク質のような宿主細胞中に
ＸＴＥＮを含む組換え融合タンパク質の発現は、一部分が所望のタンパク質長の切断異形
である、異なる化合物の混合をもたらす。切断は、宿主細胞中の翻訳の早期終了、ｍＲＮ
Ａ不安定性、またはタンパク質分解の結果であり得る。球状タンパク質は、一般に、それ
らの３次元構造への効率的または完全な折り畳みを有するが、切断された異形は有しない
ため、典型的な精製および回収プロセスは、高レベルの産物均質性が球状タンパク質の所
与の調製において達成されるように、切断された異形を成功裏に分離および除去すること
ができる。しかしながら、ＸＴＥＮ等のタンパク質ポリマーは、それらの非構造化性質を
前提として、一般に３次元構造を欠くことにおいて固有である。上述の理由のうちの１つ
以上に起因して、全長ＸＴＥＮの均質な調製物を得ることは困難であった。これは、不完
全または切断されたＸＴＥＮ鎖が、それらの物理化学的特性において、ほんのわずかに所
望の全長配列と異なるためであり、球状タンパク質の精製に十分な伝統的プロセスは、全
長配列の実質的に均質な調製物を得るために、切断されたＸＴＥＮの発現産物からの除去
において有効ではない。ペイロードに結合されたＸＴＥＮを含む本発明の対象ＸＴＥＮは
、塩分別、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ヒドロキシ
アパタイト吸着クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、またはゲル電
気泳動等のタンパク質に使用される従来の手段によって中程度の均質性に精製され得るが
、これらの方法は単独で、ＸＴＥＮが配列長において実質的に均質である調製物をもたら
さない。
本明細書に提供される対象方法は、１つまたは複数の単純な精製ステップを介してＸＴ
ＥＮの実質的に均質な調製物の産生を許す。一実施形態において、本発明のそのような方
法のいずれかの実践は、融合タンパク質として、ＸＴＥＮのＮ末端およびＣ末端のいずれ
かまたは双方に位置する親和性タグをさらに含むように設計されたＸＴＥＮを利用するこ
とができ、発現された産物が、全長発現ポリペプチドを選択的に捕捉するための精製方法
に供され、それにより切断されたＸＴＥＮ副産物を除去することができる（図４１〜４２
参照）。ＸＴＥＮの末端に付加され得る親和性タグの非限定例は、表７に提示される。実
質的に均質なＸＴＥＮを達成するための設計、発現、および精製方法の非限定例は、実施
例に記載される。
いくつかの実施形態において、本発明は、ＸＴＥＮのＮ末端またはＣ末端のいずれかに
結合された１つの親和性タグ（例えば、限定されないが、表７のタグ）に直接融合された
ＸＴＥＮを持つ、実質的に均質なポリペプチド組成物を提供する。他の実施形態において
、本発明は、ＸＴＥＮのＮ末端またはＣ末端のいずれかに結合された切断配列によって、
１つの親和性タグ（例えば、限定されないが、表７のタグ）に直接融合されたＸＴＥＮを
持つ、実質的に均質なポリペプチド組成物を提供する。他の実施形態において、本発明は
、図４１に示されるように、ＸＴＥＮのＮ末端および／またはＣ末端に結合された１つま
たは２つの異なる親和性タグ（例えば、限定されないが、表７のタグ）に直接融合された
ＸＴＥＮを持つ、実質的に均質なポリペプチド組成物を提供する。他の実施形態において
、本発明は、１つまたは２つの切断配列（例えば、限定されないが、表８または表９の切
断配列）に融合され、順に、図４１に示されるように、ＸＴＥＮのＮ末端もしくはＣ末端
、またはＮ末端およびＣ末端の双方に結合された異なる親和性タグ（例えば、限定されな
いが、表７のタグ）にそれぞれ融合されたＸＴＥＮを持つ、実質的に均質なポリペプチド
組成物を提供する。さらに他の実施形態において、本発明は、タンパク質のＮ末端に融合
されたヘルパー配列（例えば、限定されないが、表１２の配列）をさらに含む、ＸＴＥＮ
のＮ末端および／またはＣ末端に結合された１つまたは２つの異なる親和性タグ（例えば
、限定されないが、表７のタグ）に直接融合されたＸＴＥＮを持つ実質的に均質なポリペ
プチド組成物を提供する。本明細書に記載されるタンパク質の文脈において使用される場
合、「実質的に均質な」とは、調製物のポリペプチド配列の少なくとも約８５％、または
少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少
なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、９６％、９
７％、９８％、９９％、またはさらにそれ以上が、同一の配列長を有することを意味する
。パーセント値は、ＨＰＬＣによって分析された調製物のクロマトグラムの面積パーセン
テージ、またはＳＤＳ−ＰＡＧＥ、もしくはタンパク質の純度を評価するために当該技術
分野において既知の他のそのような標準手順によって分析された調製物の走査の面積パー
センテージに基づく。
一実施形態において、本発明は、式Ｉ：
の構成を有する実質的に均質なポリペプチドを提供し、式中、ＨＳは、ヘルパー配列であ
り、ＡＴ１は、第１の親和性タグであり、ＣＳ１は、第１の切断配列であり、ＸＴＥＮは
、伸長組換えポリペプチドである。
別の実施形態において、本発明は、式ＩＩ：
の構成を有する実質的に均質なポリペプチドを提供し、式中、ＨＳは、ヘルパー配列であ
り、ＡＴ１は、第１の親和性タグであり、ＣＳ１は、第１の切断配列であり、ＣＳ２は、
第２の切断配列であり、ＸＴＥＮは、伸長組換えポリペプチドである。
別の実施形態において、組成物は、式ＩＩＩ：
の構成を有し、式中、ＨＳは、ヘルパー配列であり、ＡＴ１は、第１の親和性タグであり
、ＡＴ２は、第２の親和性タグであり、ＣＳ１は、第１の切断配列であり、ＣＳ２は、第
２の切断配列であり、ＸＴＥＮは、伸長組換えポリペプチドである。
親和性タグを含むポリペプチド構築物は、親和性タグに結合されていないＸＴＥＮと比
較して、親和性タグが結合するクロマトグラフィー基質の使用により、実質的に均質な長
さに精製されることができるという有利な特性を有する。いくつかの実施形態において、
精製の方法において使用されるクロマトグラフィー基質のカテゴリーは、表７に記載され
るクロマトグラフィー基質から選択され、表に示される対応する親和性タグに結合される
ＸＴＥＮの精製に利用される。当業者には理解されるように、クロマトグラフィー基質の
カテゴリーは、異なるマトリックスまたは樹脂に結合された異なる化学基を包含すること
ができ、例えば、アニオン交換基質は、樹脂に結合された第４級トリメチルアンモニウム
およびジエチルアミノエチルを含み、カチオン交換基質は、樹脂に結合されたスルホ、ま
たはスルホプロピル、またはカルボキシメチル、またはリン酸基を含み、ＨＩＣ基質は、
樹脂に結合されたエチル、イソプロピル、ブチル、フェニル、またはオクチル基を含み、
ＩＭＡＣ基質は、樹脂に結合されたイミノ二酢酸およびニトリロ酢酸基を含む。前述の基
質は、例示の目的で列挙され、本発明を実施するために用いられ得る基質の範囲を限定す
ることは意図されない。
いくつかの実施形態において、本発明は、プロテアーゼによって切断されることができ
る切断配列（例えば、限定されないが、表８の切断配列）によって第１の親和性タグ、ま
たは第１および第２の親和性タグを含むポリペプチドから調製された実質的に均質なＸＴ
ＥＮを提供し、この調製物は、プロテアーゼで処置され、切断配列を切断し、ポリペプチ
ドからＸＴＥＮを放出し、実質的に均質なＸＴＥＮを結合し、次いで溶出し、次いで回収
するためのクロマトグラフィーステップが続く。前述の一実施形態において、プロテアー
ゼはトリプシンであり、切断配列は、トリプシンによって切断されることができ、それら
の非限定例は、表１１および１５に列挙される。前述の別の実施形態において、プロテア
ーゼはＴＥＶであり、切断配列は、ＴＥＶによって切断されることができる。前述の別の
実施形態において、切断されたＸＴＥＮは、ＭａｃｏＣａｐ ＳＰクロマトグラフィー基
質に結合することに続いて、塩または緩衝溶液（例えば、限定されないが、リン酸ナトリ
ウム／ＮａＣｌ）を用いた溶出によって精製され、実質的に均質なＸＴＥＮをもたらす。
ＸＴＥＮおよび／またはＸＴＥＮを含むポリペプチドの文脈において使用される場合、「
実質的に精製された」調製物とは、所与の調製物の個別の分子の少なくとも約８５％、お
よびより好ましくは少なくとも約９０％、およびより好ましくは少なくとも約９１％、お
よびより好ましくは少なくとも約９２％、およびより好ましくは少なくとも約９３％、お
よびより好ましくは少なくとも約９４％、およびより好ましくは少なくとも約９５％、ま
たはそれ以上が、同一配列長、言い換えれば、同数のアミノ酸を有することを意味する。
長さの均質性のアッセイに利用され得る方法としては、質量分光法、サイズ排除クロマト
グラフィー／ＨＰＬＣ、またはＳＤＳ−ＰＡＧＥに続く銀染色が挙げられ、これらの方法
を個別に、または集合的に使用して、均質性の程度を定量化することができる。精製のた
めに最適化された親和性タグ配列を持つＸＴＥＮを含むポリペプチドの精製のための一般
化スキームは、図４１〜４２に示される。精製後、タグは、タンパク質分解的に切断され
得るか（図４１Ｂ）、または保持される（図４１Ｃ）。ＸＴＥＮは、図４２に示されるよ
うに、ＸＴＥＮの固有のアミノ酸組成物に起因して、汚染物質から精製され得る。
一実施形態において、本発明は、ＸＴＥＮを含むポリペプチドの実質的に精製された調
製物を産生する方法を提供し、ＸＴＥＮおよび第１の親和性タグをコードする遺伝子を設
計するステップと、配列を制御するために操作可能に連結されたコード遺伝子を含む宿主
細胞を形質転換するのに適した発現ベクターを形成するステップと、宿主細胞を発現ベク
ターで形質転換するステップと、結合された親和性タグを持つＸＴＥＮの発現に適した条
件下で宿主細胞を培養するステップと、粗発現産物を、親和性精製ステップを含む精製プ
ロセスに供するステップと（この粗発現産物は、第１の親和性タグに選択的に結合する第
１のクロマトグラフィー基質の上に負荷される）、クロマトグラフィー基質を洗浄し、こ
のクロマトグラフィー基質に結合されていない物質を溶出するステップと、保持されたタ
ンパク質を適切な条件下で溶出するステップと、溶出液を回収するステップとを含み、回
収されたポリペプチドは、実質的に均質な長さである。別の実施形態において、本発明は
、ＸＴＥＮを含むポリペプチドの実質的に均質な調製物を産生する方法を提供し、第１お
よび第２の親和性タグを含むＸＴＥＮをコードする遺伝子を設計するステップと、配列を
制御するために操作可能に結合されたコード遺伝子を含む宿主細胞を形質転換するのに適
した発現ベクターを形成するステップと、宿主細胞を発現ベクターで形質転換するステッ
プと、ポリペプチドの発現に適した条件下で宿主細胞を培養するステップと、粗発現産物
を、親和性精製ステップを含む精製プロセスに供するステップと（この溶解物は、第１の
親和性タグに選択的に結合する第１のクロマトグラフィー基質の上に負荷される）、クロ
マトグラフィー基質を洗浄し、このクロマトグラフィー基質に結合されていない物質を溶
出するステップと、保持されたタンパク質を適切な条件下で溶出するステップと、溶出液
を回収するステップと、第２の親和性タグを持つポリペプチドをクロマトグラフィー基質
の上に捕捉するのに有効な条件下で、回収されたＸＴＥＮポリペプチドを第２のクロマト
グラフィー基質の上に負荷するステップと、クロマトグラフィー基質を洗浄し、クロマト
グラフィー基質に結合されていない物質を溶出するステップと、第２の親和性タグを持つ
ＸＴＥＮポリペプチドを溶出するのに有効な条件下でＸＴＥＮポリペプチドを溶出するス
テップと、第１および第２の親和性タグを持つＸＴＥＮポリペプチドを含むポリペプチド
を含有する溶出液を回収するステップを含み、回収されたポリペプチドは、実質的に均質
な長さである。さらに別の実施形態において、本発明は、ＸＴＥＮを含むポリペプチドの
実質的に均質な調製物を産生する方法を提供し、コードされたＸＴＥＮのＮ末端に切断配
列によって結合された第１の親和性タグ、およびコードされたＸＴＥＮのＣ末端に切断配
列によって結合された第２の親和性タグを含むＸＴＥＮをコードする遺伝子を設計するス
テップと、配列を制御するために操作可能に結合されたコード遺伝子を含む宿主細胞を形
質転換するのに適した発現ベクターを形成するステップと、宿主細胞を発現ベクターで形
質転換するステップと、ポリペプチドの発現に適した条件下で宿主細胞を培養するステッ
プと、粗発現産物を、親和性精製ステップを含む精製プロセスに供するステップと（この
溶解物は、第１の親和性タグに選択的に結合する第１のクロマトグラフィー基質の上に負
荷される）、クロマトグラフィー基質を洗浄し、このクロマトグラフィー基質に結合され
ていない物質を溶出するステップと、保持されたタンパク質を適切な条件下で溶出し、溶
出液を回収するステップと、第２の親和性タグを持つポリペプチドをクロマトグラフィー
基質の上に捕捉するのに有効な条件下で、回収されたポリペプチドを第２のクロマトグラ
フィー基質の上に負荷するステップと、クロマトグラフィー基質を洗浄し、クロマトグラ
フィー基質に結合されていない物質を溶出するステップと、第２の親和性タグを持つポリ
ペプチドを溶出するのに有効な条件下でポリペプチドを溶出するステップと、次いで、回
収されたポリペプチドを、ポリペプチドからＸＴＥＮを放出するのに有効な条件下で、プ
ロテアーゼで処置し、ＸＴＥＮを捕捉することができるが、親和性タグを捕捉することは
できないクロマトグラフィー基質の上に物質を負荷するステップと、クロマトグラフィー
基質を洗浄し、このクロマトグラフィー基質に結合されていない物質を溶出するステップ
と、ＸＴＥＮを溶出するステップと、ＸＴＥＮポリペプチドを含有する溶出液を回収する
ステップとを含み、回収されたＸＴＥＮは、実質的に均質な長さである。このパラグラフ
に記載される前述の方法の一実施形態において、第１および第２の親和性タグは、表７に
記載される親和性タグの群から選択される。本方法の一実施形態において、融合タンパク
質としてＸＴＥＮに結合された第１の親和性タグは、配列ＲＰＲＰＲＰＲＰＲＰＲＰＲを
含み、ポリペプチドに結合するために使用されるクロマトグラフィー基質は、Ｍａｃｒｏ
Ｃａｐ ＳＰである。前述の方法の別の実施形態において、融合タンパク質としてＸＴＥ
Ｎの第１の末端に結合された第１の親和性タグは、配列ＲＰＲＰＲＰＲＰＲＰＲＰＲＰＲ
ＰＲＰＲＰＲＰＲを含み、ＸＴＥＮの第２の末端に結合された第２の親和性タグは、配列
ＨＨＨＨＨＨＨＨを含み、ポリペプチドに結合するために使用される第１のクロマトグラ
フィー基質は、ＭａｃｒｏＣａｐ ＳＰであり、ポリペプチドに結合するために使用され
る第２のクロマトグラフィー基質は、固定化金属イオンアフィニティー（ＩＭＡＣ）基質
である。前述の方法の別の実施形態において、融合タンパク質としてＸＴＥＮの第１の末
端に融合された切断配列に融合された第１の親和性タグは、配列ＲＰＲＰＲＰＲＰＲＰＲ
ＰＲまたはＲＰＲＰＲＰＲＰＲＰＲＰＲＰＲＰＲＰＲＰＲＰＲを含み、ＸＴＥＮの第２の
末端に融合された切断配列に融合された第２の親和性タグは、配列ＨＨＨＨＨＨまたはＨ
ＨＨＨＨＨＨＨを含み、ポリペプチドに結合するために使用される第１のクロマトグラフ
ィー基質は、ＭａｃｒｏＣａｐ ＳＰであり、ポリペプチドに結合するために使用される
第２のクロマトグラフィー基質は、固定化金属イオンアフィニティー（ＩＭＡＣ）基質で
あり、切断配列は、アルギニンまたはリジンを含み（限定されないが、表８および９の配
列を含む）、トリプシンによって切断され、Ｍａｃｒｏｃａｐ Ｑは、親和性タグから遊
離されるＸＴＥＮに結合するために使用されるクロマトグラフィー基質であるか、または
代替例において、遊離されたＸＴＥＮは、プロテアーゼ処置された調製物をカチオン交換
、ＨＩＣ、および／またはＩＭＡＣのうちの１つ以上に通すことによって切断産物および
プロテアーゼを捕捉する、フロースルーとして捕捉され、ＸＴＥＮがフロースルー中に残
り、次いで実質的に均質な調製物として回収される。
本方法のステップの順序および特定の条件が、ＸＴＥＮ−親和性タグポリペプチドの組
成物、ならびに切断された汚染物質の開始発現レベルおよび汚染の程度に応じて変化する
ことは、当業者によって理解されるであろう。例えば、あるＸＴＥＮ組成物とともに、Ｘ
ＴＥＮに結合された単一親和性タグを使用することは、ポリペプチド分子が実質的に均質
な長さである調製物を達成するのに十分である。そのような場合、一実施形態において、
単一親和性タグは、表７に記載される親和性タグから選択される。他のＸＴＥＮ組成物と
ともに、第１および第２の親和性タグを使用することは、ポリペプチド分子が実質的に均
質な長さである調製物を達成するのに十分であり、そのような場合、一実施形態において
、第１および第２の親和性タグは異なり、それぞれが表７に記載される親和性タグから選
択される。一旦、切断配列を含むポリペプチドが精製されると、回収されたポリペプチド
は、タンパク質分解によって実質的に処置され、１つまたは２つの親和性タグを放出する
ことができ、続いて、処置されたＸＴＥＮをクリマトグラフィー基質に通して、結合され
た親和性タグのないＸＴＥＮを回収することは、当業者によってさらに理解されるであろ
う。本方法の概略は図４２に示され、例示的な方法論は実施例に記載される。多くの異な
るプロテアーゼは、親和性タグをＸＴＥＮに結合する配列に応じて、末端精製タグの放出
に利用することができ、表９から選択されるプロテアーゼが挙げられるが、これに限定さ
れない。一実施形態において、プロテアーゼは、トリプシン、キモトリプシン、タバコエ
ッチモザイクウイルスプロテアーゼ（ＴＥＶ）、ＦＸａ、およびエンテロキナーゼからな
る群から選択される。別の実施形態において、ポリペプチドに組み込まれた切断配列は、
切断され得るアルギニン残基と、トリプシンで処置することによって除去される親和性タ
グとを含み、それにより、クロマトグラフィーによって、例えば、アニオン交換（限定さ
れないが、ＭａｃｒｏＣａｐ Ｑを含む）を使用する捕捉によって、実質的に精製された
形態で実質的に回収されるか、またはフロースルーとして回収されるＸＴＥＮを放出し、
非ＸＴＥＮ切断産物およびプロテアーゼは、ＨＩＣ、カチオン交換、またはＩＭＡＣクロ
マトグラフィーのうちの１つ以上によって捕捉され、実質的に均質なＸＴＥＮをフロース
ルー中に残す。
別の実施形態において、ＸＴＥＮは、末端に結合され、精製を促進するために使用され
る一方または双方の親和性タグが、最終産物の一部として残り、プロテアーゼ放出ステッ
プの要件を排除することができるように設計され得る。精製タグが薬物産物の一部として
残るように設計される場合、顕著な免疫反応を引き起こさないタグ配列が選択される。免
疫原性は、計算による予測アルゴリズムまたは実験的アッセイを使用して予測することが
できる。Ｔ細胞およびＢ細胞エピトープを回避する配列が好適である。捕捉を促進し、任
意に共役構築物と関連付けられたままであり得るＸＴＥＮ配列の末端に組み込まれる配列
の非限定例は、表７に提供される。
１０． ＸＴＥＮの増加した発現のための組成物
別の態様において、本発明は、ＸＴＥＮをコードするポリ核酸配列を含む構築物、およ
び対照共役体において使用するためにＸＴＥＮを製造する方法を提供し、追加のコードポ
リヌクレオチドヘルパー配列は、ＸＴＥＮをコードするポリヌクレオチドの５’端に付加
されるか、またはＸＴＥＮをコードする配列の５’端に結合された親和性タグをコードす
る配列の５’端に付加され、細菌等の形質転換された宿主細胞中のＸＴＥＮまたは親和性
タグポリペプチドに結合された切断配列を持つＸＴＥＮの発現を強化および促進する。そ
のようなコードされたヘルパー配列の例は、表１０および実施例に提供される。一実施形
態において、本発明は、表７に記載される配列の群から選択される第１の親和性タグのＮ
末端に結合され、順に、本明細書に記載される切断配列に結合されるか、または表２およ
び３に記載される配列の群から選択される配列に対して少なくとも約９０％、または少な
くとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なく
とも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくと
も約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有す
るＸＴＥＮのＮ末端に直接結合されるかのいずれかである、表１０から選択される配列に
対して少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、ま
たは少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、また
は少なくとも約９９％の配列同一性を有するヘルパー配列を含むポリペプチドをコードす
る、ポリヌクレオチド配列構築物を提供する。本発明は、高い発現レベルでポリペプチド
およびＸＴＥＮの実質的に均質な調製物を産生するための方法において有用な構築物をコ
ードする発現ベクターを提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、ＸＴＥＮと
、第１および第２の親和性タグと、ヘルパー配列とを含むポリペプチドの実質的に均質な
集団を産生するための方法を提供し、この方法は、発酵反応において、ＸＴＥＮを含むポ
リペプチドをコードするベクターと、第１および第２の親和性タグとを含む宿主細胞を、
ポリペプチドを発現するのに有効な条件下で培養することを含み、発酵反応が６００ｎｍ
の波長で少なくとも１３０の光学密度に到達するとき、約２ｇ／Ｌ超、または約３ｇ／Ｌ
超、または約４ｇ／Ｌ超、または約５ｇ／Ｌ超、または６ｇ／Ｌ超、または約７グラム／
リットル（７ｇ／Ｌ）超のポリペプチドが、宿主細胞の粗発現産物の成分として産生され
るようにする。一実施形態において、本方法は、ポリペプチドの第１の親和性タグをクロ
マトグラフィー基質の上に捕捉するのに有効な条件下で、ポリペプチドを第１のクロマト
グラフィー基質の上に吸着させるステップと、ポリペプチドを溶出および回収するステッ
プと、ポリペプチドの第２の親和性タグをクロマトグラフィー基質の上に捕捉するのに有
効な条件下で、ポリペプチドを第２のクロマトグラフィー基質の上に吸着させるステップ
と、ポリペプチドを溶出するステップと、実質的に均質なポリペプチド調製物を回収する
ステップと、をさらに含む。前述の方法の一実施形態において、ベクターは、コードされ
たポリペプチドのＮ末端においてヘルパー配列をコードするヌクレオチドをさらに含み、
ヘルパー配列は、表１０に記載される配列に対し少なくとも８０％、または少なくとも９
０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する。他の実施形態において、本発明は
、ＸＴＥＮと、第１および第２の親和性タグと、ヘルパー配列とを含むポリペプチドの実
質的に均質な集団を産生するための方法を提供し、この方法は、発酵反応において、発酵
反応が６００ｎｍの波長で少なくとも１３０の光学密度に到達するときに、約１０ミリグ
ラム／グラムを超える乾燥重量宿主細胞濃度（ｍｇ／ｇ）、または少なくとも約２５０マ
イクロモル／Ｌ、または約３００マイクロモル／Ｌ、または約３５０マイクロモル／Ｌ、
または約４００マイクロモル／Ｌ、または約４５０マイクロモル／Ｌ、または約５００マ
クロモル／Ｌの該ポリペプチドの濃度で、ポリペプチド産物を発現するのに有効な条件下
で、ＸＴＥＮと第１および第２の親和性タグとを含むポリペプチドをコードするベクター
を含む宿主細胞を培養することを含む。前述の一実施形態において、この方法は、ポリペ
プチドの第１の親和性タグをクロマトグラフィー基質の上に捕捉するのに有効な条件下で
、第１のクロマトグラフィー基質の上にポリペプチドを吸着させるステップと、ポリペプ
チドを溶出および回収するステップと、ポリペプチドの第２の親和性タグをクロマトグラ
フィー基質の上に捕捉するのに有効な条件下で、ポリペプチドを第２のクロマトグラフィ
ー基質の上に吸着させるステップと、ポリペプチドを溶出するステップと、実質的に均質
なポリペプチド調製物を回収するステップと、をさらに含む。前述の方法の一実施形態に
おいて、ベクターは、コードされたポリペプチドのＮ末端においてヘルパー配列をコード
するヌクレオチドをさらに含み、ヘルパー配列は、表１０に記載される配列に対し少なく
とも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する。
他の実施形態において、本発明は、ＸＴＥＮと、第１および第２の親和性タグと、ヘルパ
ー配列とを含むポリペプチドの実質的に均質な集団を産生するための方法を提供し、この
方法は、発酵反応において、発酵反応が６００ｎｍの波長で少なくとも１３０の光学密度
に到達するときに、約１０ミリグラム／グラムを超える乾燥重量宿主細胞濃度（ｍｇ／ｇ
）、または少なくとも約１５ｍｇ／ｇ、または少なくとも約２０ｍｇ／ｇ、または少なく
とも約２５ｍｇ／ｇ、または少なくとも約３０ｍｇ／ｇ、または少なくとも約４０ｍｇ／
ｇ、または少なくとも約５０ｍｇ／ｇの該ポリペプチドの濃度で、ポリペプチド産物を発
現するのに有効な条件下で、ＸＴＥＮと第１および第２の親和性タグとを含むポリペプチ
ドをコードするベクターを含む宿主細胞を培養することを含む。前述の一実施形態におい
て、本方法は、ポリペプチドの第１の親和性タグをクロマトグラフィー基質の上に捕捉す
るのに有効な条件下で、ポリペプチドを第１のクロマトグラフィー基質の上に吸着させる
ステップと、ポリペプチドを溶出および回収するステップと、ポリペプチドの第２の親和
性タグをクロマトグラフィー基質の上に捕捉するのに有効な条件下で、ポリペプチドを第
２のクロマトグラフィー基質の上に吸着させるステップと、ポリペプチドを溶出するステ
ップと、実質的に均質なポリペプチド調製物を回収するステップと、をさらに含む。前述
の方法の一実施形態において、ベクターは、コードされたポリペプチドのＮ末端において
ヘルパー配列をコードするヌクレオチドをさらに含み、このヘルパー配列は、表１０に記
載される配列に対し少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５
％の配列同一性を有する。別の実施形態において、このパラグラフの前述の方法の構築物
は、親和性タグとＸＴＥＮとの間のプロテアーゼ切断配列をコードするヌクレオチドをさ
らに含み、この方法は、調製物の回収されたポリペプチドが、限定されないが、トリプシ
ン等の切断配列を切断することができるプロテアーゼで処置され、それによりＸＴＥＮを
ポリペプチドから放出することと、ＸＴＥＮが、ＸＴＥＮを捕捉するのに有効な条件下で
、クロマトグラフィー基質の上に吸着されることと、ＸＴＥＮが、実質的に均質なＸＴＥ
Ｎとして溶出および回収されることと、を提供する。
ＩＩＩ）． ペイロード
本発明は、１つ以上のペイロード分子に結合されたＸＴＥＮ共役体に部分的に関する。
ＸＴＥＮは、生物学的に活性なペプチド、タンパク質、ポリマー、薬理学的に活性な小分
子、ポリ核酸、標的ペプチドおよびタンパク質、標的小分子、抗体および抗体フラグメン
ト、および撮像小分子ペイロード、ならびに２、３、４、またはそれ以上の種類のペイロ
ードを持つ組成物をもたらす、これらの種類のペイロードの組合せを含む、広範なペイロ
ード分子に結合され得ることが企図される。本発明は、必要とする対象に体外から投与さ
れた治療的および診断的ペイロード、ならびに治療成分および標的成分を含み得るペイロ
ードの組合せの終末相半減期を増加させることにおける長年の必要性に対応する。
本発明のＸＴＥＮへの結合において使用するための薬理学的に活性なペイロード剤の機
能別区分の非限定例は、以下のうちのいずれか１つ以上であり得る：睡眠薬および鎮静剤
、精神賦活剤、精神安定、呼吸器系薬、抗けいれん薬、筋弛緩薬、抗パーキンソン病薬（
ドーパミン拮抗薬）、鎮痛剤、抗炎症剤、抗不安薬（ａｎｘｉｏｌｙｔｉｃｓ）、食欲抑
制剤、抗片頭痛薬、筋収縮薬、抗感染薬（抗生物質、抗ウイルス薬、抗真菌薬、ワクチン
）、抗関節炎薬、抗マラリア薬、制吐薬、抗てんかん薬、気管支拡張剤、凝固因子、サイ
トカイン、ケモカイン、インターロイキン、成長因子、成長ホルモン、内分泌性ホルモン
、外分泌性ホルモン、インスリン、グルコース調節ペプチド、抗癌剤、抗血栓剤、降圧剤
、心臓脈管薬、抗不整脈薬、抗酸化薬、抗喘息薬、ホルモン剤（避妊薬を含む）、交感神
経様作用薬、利尿薬、脂質調節薬、抗アンドロゲン剤、抗寄生虫薬、抗凝固剤、新生物薬
、抗新生物薬、血糖降下薬、栄養剤および補給剤、成長補給剤、抗腸炎薬、ワクチン、抗
体、診断薬、造影剤、および放射性造影剤。
より具体的に、活性ペイロードは、多数の構造区分のうちの１つに分類され得、小分子
薬、生物学的に活性なタンパク質（ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、組換えタンパ
ク質、抗体、および糖タンパク質）、ステロイド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、
ポリヌクレオチド、脂肪、電解質等が挙げられるが、これらに限定されない。ＸＴＥＮ−
ペイロード共役組成物の場合、ペイロードは、適切に反応性の官能基（天然アミノ基、ス
ルフィドリル基、カルボキシル基、アルデヒド基、ケトン基、アルケン基、アルキン基、
アジド基、アルコール基、ヘテロシクルが挙げられるが、これらに限定されない）を有す
る薬理学的に活性な薬剤であり得るか、または代替として、本明細書に記載されるか、ま
たはそうでなければ、そのような反応基を共役するために当該技術分野において有用であ
ることが知られている共役方法のうちのいずれかを使用し、本発明のＸＴＥＮ、ＸＴＥＮ
−架橋剤、またはＸＴＥＮ−クリック化学反応物のいずれかに連結するために適した前述
の反応基のうちの少なくとも１つを含有するように修飾されることが特に企図される。特
定の官能部分およびそれらの反応性は、Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２ｎｄ
Ｅｄ．Ｔｈｏｍａｓ Ｓｏｒｒｅｌｌ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｂｏｏ
ｋｓ，Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ（２００５）に記載されている。さらに、反応基を含有する
か、または反応基を含有するように修飾された任意のペイロードは、ＸＴＥＮ、ＸＴＥＮ
−架橋剤、またはＸＴＥＮ−クリック化学反応物のいずれかが結合される共役後の残基も
含有することが理解されるであろう。
ＸＴＥＮポリマー、ＸＴＥＮ−架橋剤、またはＸＴＥＮ−クリック化学反応物のいずれ
かへの共有結合に適した例示的なペイロードとしては、生物学的に活性なタンパク質、お
よび活性を持つ薬理学的に活性な小分子薬が挙げられる。本発明の組成物に適した例示的
な薬物は、公式米国薬局方、公式米国ホメオパシー薬局方、または公式国民医薬品集、医
師用添付文書集（ＰＤＲ）、および米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって維持されるオレ
ンジブックに記載されるように見出され得る。好適な薬物は、必要な反応性官能基を有す
るもの、または共役のための反応性官能基を提供するように容易に誘導体化され得るもの
であり、ＸＴＥＮに共役されるとき、非共役ペイロードの薬理学的活性の少なくとも一部
を保持する。
１． ペイロードとしての薬物
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される対象ＸＴＥＮ、ＸＴＥＮ−架橋剤
、またはＸＴＥＮ−クリック化学反応物への共役のための薬物ペイロードは、本明細書に
記載されるか、または表１１のペイロードから選択される１つ以上の薬剤、またはその薬
学的に許容される塩、酸、または誘導体もしくはアゴニストである。一実施形態において
、薬物は、本明細書に記載される対象ＸＴＥＮ、ＸＴＥＮ−架橋剤、またはＸＴＥＮ−ク
リック化学反応物に共役するための反応基を導入するように誘導体化される。別の実施形
態において、共役のための薬物は、限定されないが、バリン−シトルリン−ＰＡＢ等の切
断可能なリンカーを導入するように誘導体化され、リンカーは、対象に投与した後の循環
または細胞内プロテアーゼによって切断されることができ、それによって薬物を共役体か
ら遊離させる。
２． ペイロードとしての生物学的に活性なタンパク質
別の態様において、本発明は、ペイロードが、ペプチドまたはポリペプチドのいずれか
として、生物学的に活性なタンパク質である、ＸＴＥＮ−ペイロード組成物を提供する。
ＸＴＥＮ−ペイロード共役体のいくつかの実施形態において、ペイロードは、１つ以上の
ＸＴＥＮに結合された融合タンパク質として組換え的に発現され得る任意の薬理学的に活
性なペプチドまたはポリペプチドである。ＸＴＥＮ−ペイロード共役体の他の実施形態に
おいて、ペイロードは、１つ以上のＸＴＥＮに共役され得る任意の薬理学的に活性なペプ
チドまたはポリペプチドである。共役体は、本明細書において以下に記載されるような構
成であり得る。例示的なペプチドまたはポリペプチドペイロードは、類似体、アゴニスト
、アンタゴニスト、阻害剤、および異性体を包含することを意味する。対象ペプチドおよ
びタンパク質は、合成、半合成、組換え、天然、グリコシル化、および非グリコシル化形
態、ならびに得られた変異タンパク質が、親または天然タンパク質の活性の一部分を保持
する限り、それらの生物学的に活性なフラグメント、配列変異体、種、変異体、ホモログ
、および突然変異を包含することが理解されるであろう。
生物学的に活性なタンパク質配列は、公的に入手可能なデータベース、特許、または参
照文献、および当該技術分野において周知である他のそのようなソースから入手すること
ができる。例えば、配列は、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ（
ＵｎｉＰｒｏｔ）／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔ
ｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＥＢＩ）、ＳＩＢ Ｓｗｉｓｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏ
ｆ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｒｅｓ
ｏｕｒｃｅ（ＰＩＲ）から入手することができる。Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔ
ｓ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（ＣＡＳ）レジストリー番号（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａ
ｌ Ｓｏｃｉｅｔｙにより公表される）および／またはＧｅｎＢａｎｋ受入番号（例えば
、ＡＡＡ−ＡＺＺ、ＨＡＡ−ＨＺＺ、ＪＡＡ−ＪＺＺ）、モデルタンパク質識別子は、Ｎ
ａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａ
ｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）ウェブページを通じて入手可能（ワールドワイドウェブｎｃｂｉ．
ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ上で入手可能）であり、関心対象のタンパク質のアミノ酸配列、
またはそのタンパク質のフラグメントもしくは変異体を含む、ＣＡＳレジストリーまたは
ＧｅｎＢａｎｋデータベースにおけるエントリーに対応する。本明細書に提供されるその
ような配列識別子の場合、これらのＣＡＳおよびＧｅｎＢａｎｋおよびＧｅｎＳｅｑ受入
番号ならびに引用されるジャーナル刊行物（例えば、ＰｕｂＭｅｄ ＩＤ番号（ＰＭＩＤ
））のそれぞれと関連付けられる要約ページは、特にそこに記載されるアミノ酸配列に関
して、それぞれ参照によりそれら全体が組み込まれる。
一実施形態において、ＸＴＥＮ−ペイロード組成物は、組換え形態であるか、または共
役形態であるかにかかわらず、表１２に記載されるペイロードから選択されるペプチドま
たはポリペプチドを含むが、これらに限定されない生物学的に活性なペプチドまたはタン
パク質、または生物学的に活性なタンパク質の活性の少なくとも一部分を保持するその配
列変異体の１つ以上の分子を含む。「配列変異体」とは、生物学的に活性なタンパク質が
、例えば、表１２に列挙される既知のペプチドまたはポリペプチドのそれに対し、最適に
整列されたとき、少なくとも約８０％、または９０％、または９１％、または９２％、ま
たは９３％、または９４％、または９５％、または９６％、または９７％、または９８％
、または９９％の配列同一性を呈することを意味する。
３． ペイロードとしての例示的な生物学的に活性なタンパク質
対象組成物中のペイロードとして特異的に企図されるタンパク質性化合物は、以下のペ
プチドおよびタンパク質である。
「Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド」または「ＣＮＰ」は、配列ＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤ
ＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣを有する２２個のアミノ酸ペプチドＣ型ナトリウム利尿ペプチド）
ＣＮＰ）に切断されるＮＰＰＣ遺伝子によってコードされるヒトタンパク質（ＵｎｉＰｒ
ｏｔ Ｎｏ．Ｐ２３５８２）、ならびに天然ペプチドの生物学的活性の少なくとも一部分
を有する種およびその合成変化形を意味する。ＣＮＰは、Ｂ型ナトリウム利尿受容体（Ｎ
ＰＲＢ）の選択的アゴニストであり、軟骨性骨成長の有能な刺激因子であることが報告さ
れている。ＣＮＰは、その受容体に結合し、細胞内シグナルを開始して、最終的に過剰活
性ＦＧＦＲ３経路を阻害する。ＣＮＰの使用は、軟骨発育不全症、一般形態の骨格異形成
症または短肢矮小発育症、および骨格発達に影響を及ぼす症候群（例えば、低軟骨形成症
［ＨＣＨ］、ＡＣＨ、致死性異形成症［ＴＤ］）、皮膚（上皮母斑症、脂漏性角化症、黒
色表皮腫を含む）、および癌（多発性骨髄腫［ＭＭ］、前立腺癌および膀胱癌、精上皮腫
）を含むＦＧＦＲ３変異によって引き起こされるヒト障害に対して示されている（Ｆｏｌ
ｄｙｎｏｖａ−Ｔｒａｎｔｉｒｋｏｖａ Ｓ．Ｈｕｍ Ｍｕｔａｔ．（２０１２）３３：
２９）。ＣＮＰ−２２の半減期は、２．６分であることが報告され、中性エンドペプチダ
ーゼによって急速に代謝され、クリアランス受容体によって取り除かれ（Ｐｒｉｃｋｅｔ
ｔ Ｔ．，２００４，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１０６：５３５）、それによ
りその有用性を限定する。
「黄体形成ホルモン放出ホルモン」または「ＬＨＲＨ」は、視索前視床下部前部におい
て、９２アミノ酸プレプロホルモンから配列ｐｙｒｏＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−
Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＮＨ２を有する直鎖状デカペプチド
最終産物に処理されるＧＮＲＨ１遺伝子によってコードされるヒトタンパク質（ＵｎｉＰ
ｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ０１１４８）、ならびに天然ペプチドの生物学的活性の少なくとも一部
分を有する種およびその合成変化形を意味する。ＬＨＲＨは、下垂体／性腺軸の調節、お
よびしたがって生殖において中心的役割を果たす。ＬＨＲＨは、下垂体性腺刺激細胞上の
高親和性受容体に対する結合、および後次のＦＳＨおよびＬＨの放出を通じてその効果を
発揮する。ＬＨＲＨは、視床下部および下垂体の外側にある器官において見出され、高パ
ーセンテージのある癌組織がＬＨＲＨ結合部位を有するため、および性ステロイドが乳癌
および前立腺癌の発達に関係していたため、ＬＨＲＨアゴニストによるホルモン療法は、
またはエストロゲン依存性乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、膀胱癌、およびアンドロゲン依存
性前立腺癌等の性ステロイド依存性状態の処置に対し承認されているか、または考慮され
ている。半減期は４分未満であることが報告されているため（Ｒｅｄｄｉｎｇ ＴＷ，ｅ
ｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ，Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ Ｅｘｃｒｅｔ
ｉｏｎ ｏｆ Ｔｒｉｔｉａｔｅｄ Ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇ Ｈｏｒｍｏｎｅ−Ｒｅｌ
ｅａｓｉｎｇ Ｈｏｒｍｏｎｅ（ＬＨ−ＲＨ）ｉｎ Ｍａｎ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃ
ｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．（１９７３）３７：６２６−６３１）、治療薬としてのその有
用性は限定される。
「シレンジタイド」とは、配列Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄｐｈｅ−ＮｍｅＶａｌまた
は化学名２−［（２Ｓ，５Ｒ，８Ｓ，１１Ｓ）−５−ベンジル−１１−｛３−［（ジアミ
ノメチリデン）アミノ］プロピル｝−７−メチル−３，６，９，１２，１５−ペンタオキ
ソ−８−（プロパン−２−イル）−１，４，７，１０，１３−ペンタアザシクロペンタデ
カン−２−イル］酢酸（ＣＡＳ Ｎｏ．１８８９６８−５１−６）を有する合成環状ＲＧ
Ｄペンタペプチドを意味する。シレンジタイドは、血管新生（新たな血管を形成する）に
おいて重要なαｖインテグリンに対し選択的である。そのようなリガンドの結合は、イン
テグリンを活性化し、腫瘍細胞浸潤、転移、増殖、生存および血管新生を調節する。した
がって、シレンジタイドの使用は、血管新生を阻害することによる膠芽腫の処置について
調査中である（Ｂｕｒｋｅ Ｐ，ｅｔ ａｌ．Ｃｉｌｅｎｇｉｔｉｄｅ ｔａｒｇｅｔｉ
ｎｇ ｏｆ αｖβ３ ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｙｎｅｒｇｉｚｅｓ
ｗｉｔｈ ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｔｏ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｅｆｆｉ
ｃａｃｙ ａｎｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｘｅｎｏ
ｇｒａｆｔｓ″．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（２００２）６２（１５）：４２６３−４２７２
）。シレンジタイドは、３〜５時間の短い半減期、および最大薬物濃度を１５ｍｇ／ｍｌ
に限定する不良な可溶性を有するため（Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ ＰＨ．Ａ ｐｈａｓｅ Ｉ
ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｉｎｆｕｓｉｏｎ ｃｉｌｅｎｇｉｔｉｄ
ｅ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｒｓ．Ｉｎｖｅｓｔ Ｎ
ｅｗ Ｄｒｕｇｓ（２０１２）３０：６０４）、治療薬としてのその有用性は限定される
。
「成長ホルモン放出ホルモン」または「ＧＨＲＨ」（成長ホルモン放出因子、ＧＲＦ、
ＧＨＲＦ、ソマトリベリン、またはソマトグリニンとしても知られる）は、配列ＹＡＤＡ
ＩＦＴＮＳＹＲＫＶＬＧＱＬＳＡＲＫＬＬＱＤＩＭＳＲＱＱＧＥＳＮＱＥＲＧＡＲＡＲＬ
を有する視床下部弓状核中で産生される４４アミノ酸ペプチドホルモン、ならびに生物学
的に活性な１〜２９アミノ酸切断ペプチドＹＡＤＡＩＦＴＮＳＹＲＫＶＬＧＱＬＳＡＲＫ
ＬＬＱＤＩＭＳＲを含む、天然ペプチドの生物学的活性の少なくとも一部分を有する種お
よびその合成変化形を意味する。ＧＨＲＨは、神経分泌神経末端から放出され、視床下部
−下垂体門脈系によって下垂体前葉に運ばれ、ＧＨＲＨ受容体に作用して、脈動的成長ホ
ルモン放出を刺激する。ＧＨＲＨ類似体テサモレリンは、高度に活性な抗レトロウイルス
療法下でのＨＩＶ患者のリポジストロフィーの処置について承認された薬物であり、悪液
質、成長ホルモン欠乏患者における腹部肥満、ある慢性疾患に関連した筋肉消耗、中度の
認知障害、および成長ホルモン欠乏患者における成長ホルモン置換での使用についても考
慮される。半減期は１５分未満であることが報告されているため（Ｃｈａｐｍａｎ ＩＭ
．Ｊ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ（１９９１）１２８：３６９−３７４）、治療薬としてのそ
の有用性は限定される。
「ペプチドＹＹ」および「ＰＹＹ」とは、ヒトペプチドＹＹポリペプチド（ＵｎｉＰｒ
ｏｔ Ｎｏ．Ｐ１００８２）、合成異形および種、ならびに成熟ＰＹＹの生物学的活性の
少なくとも一部分を有する非天然配列を意味する。本明細書において使用される場合、「
ＰＹＹ」は、ヒト全長３６アミノ酸ペプチドの主要形態、ＰＹＹ１−３６、およびＰＰ折
り畳み構造モチーフを有する優占循環形態ＰＹＹ３−３６（「ＰＹＹ３−３６」）の双方
を含む。ＰＹＹ３−３６は、配列ＩＫＰＥＡＰＧＥＤＡＳＰＥＥＬＮＲＹＹＡＳＬＲＨＹ
ＬＮＬＶＴＲＱＲＹ−ＮＨ２を有する。ＰＹＹは、食後のヒトの腸内で特殊化した内分泌
細胞（Ｌ細胞）によって産生され、胃の運動を阻害し、結腸中の水および電解質吸収を増
加させる。ＰＹＹは、膵臓分泌も抑制し得る。天然に存在するＰＹＹ３−３６は、非選択
的Ｙ１、Ｙ２、およびＹ５アゴニストである。本発明のＰＰＹ含有融合タンパク質は、糖
尿病のグルコース調節、インスリン抵抗障害、および肥満の処置における特定の使用を見
出し得る。ＰＹＹの類似体は、米国特許第５，６０４，２０３号、同第５，５７４，０１
０号、および同第７，１６６，５７５号に記載されるように調製された。半減期は１時間
未満であることが報告され（Ａｄｄｉｓｏｎ ＭＬ．Ａ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ｍｅｔａｌ
ｌｏｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｂｒｅａｋｄｏｗｎ ｏｆ ｔｈｅ
ｇｕｔ ｈｏｒｍｏｎｅ，ＰＹＹ ３−３６．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ（２０１１
）１５２（１２）：４６３０−４６４０）、典型的に、１日３回鼻腔内経路によって投与
されるため、治療薬としてのその有用性は限定される。
「レプチン」とは、Ｏｂ（Ｌｅｐ）遺伝子によってコードされる天然に存在するレプチ
ン（ＵｎｉｔＰｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ４１１５９）、合成異形および種、ならびに成熟レプチ
ンの生物活性の少なくとも一部分を有する非天然配列変化形を意味する。レプチンは、配
列ＶＰＩＱＫＶＱＤＤＴＫＴＬＩＫＴＩＶＴＲＩＮＤＩＳＨＴＱＳＶＳＳＫＱＫＶＴＧＬ
ＤＦＩＰＧＬＨＰＩＬＴＬＳＫＭＤＱＴＬＡＶＹＱＱＩＬＴＳＭＰＳＲＮＶＩＱＩＳＮＤ
ＬＥＮＬＲＤＬＬＨＶＬＡＦＳＫＳＣＨＬＰＷＡＳＧＬＥＴＬＤＳＬＧＧＶＬＥＡＳＧＹ
ＳＴＥＶＶＡＬＳＲＬＱＧＳＬＱＤＭＬＷＱＬＤＬＳＰＧＣを有し、残基９７と１４７と
の間にジスルフィド架橋を有する。レプチンは、食欲、代謝、および体重を含む、エネル
ギー摂取およびエネルギー消費を調節することにおいて主要な役割を果たす。本発明のレ
プチン含有ポリペプチドは、糖尿病のグルコース調節、インスリン抵抗障害、肥満、先天
性／後天性リポジストロフィー、ＨＡＡＲＴ誘導性リポジストロフィー、視床下部性無月
経の処置における特定の使用を見出し得る。レプチンは、米国特許第７，１１２，６５９
号に記載されるようにクローン化され、レプチン類似体およびフラグメントは、米国特許
第５，５２１，２８３号、米国特許第５，５３２，３３６号、第ＰＣＴ／ＵＳ９６／２２
３０８号、および第ＰＣＴ／ＵＳ９６／０１４７１号に記載されるようにクローン化され
た。市販の形態、メトレレプチンは、８〜３０分であると報告される半減期を有し（Ｋｌ
ｅｉｎ Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ ｌｅｐｔｉｎ ｐｒｏｄｕ
ｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｌａｓｍａ ｌｅｐｔｉｎ ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｉｎ ｈｕｍａ
ｎｓ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ（１９９６）４５：９８４−９８７）、現在のレプチン療法の大
部分は、１日当たり１回〜２回の投与を必要とするため、治療薬としてのその有用性が限
定される。
「プラムリンチド」とは、配列ＫＣＮＴＡＴＣＡＴＮＲＬＡＮＦＬＶＨＳＳＮＮＦＧＰ
ＩＬＰＰＴＮＶＧＳＮＴＹ−ＮＨ２を有する合成アミリン模倣体、およびプラムリンチド
または天然アミリンの生物学的活性の少なくとも一部分を有する配列変異体を意味する。
プラムリンチドは、ラットアミリン配列からのアミノ酸が、ヒトアミリン配列中のアミノ
酸と置換される配列を有する。アミリンは、典型的に１００インスリン：１アミリンのモ
ル比で、脈動的様式でインスリンと共放出される膵臓ｂ細胞によって分泌された３７ａａ
ペプチドである。アミリンは、胃内容排出、グルカゴン分泌を阻害し、飽満および食事終
了を促進するように機能する（Ｋｏｎｇ ＭＦ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｆｕｓｉｏｎ ｏｆ
ｐｒａｍｌｉｎｔｉｄｅ，ａ ｈｕｍａｎ ａｍｙｌｉｎ ａｎａｌｏｇｕｅ，ｄｅｌａ
ｙｓ ｇａｓｔｒｉｃ ｅｍｐｔｙｉｎｇ ｉｎ ｍｅｎ ｗｉｔｈ ＩＤＤＭ．Ｄｉａ
ｂｅｔｏｌｏｇｉａ．（１９９７）４０：８２−８８）。プラムリンチドは、Ｔ１Ｄおよ
びＴ２Ｄにおけるインスリン療法の補助剤として使用され、血糖制御の改善およびインス
リン要求性の低減を示し、体重の適度な低減も実証する（Ｎｅａｒｙ ＭＴ，Ｂａｔｔｅ
ｒｈａｍ ＲＬ．Ｇｕｔ ｈｏｒｍｏｎｅｓ：Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈ
ｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｏｂｅｓｉｔｙ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ＆ Ｔｈ
ｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（２００９）１２４：４４−５６）。プラムリンチドは、２０分で
あると報告される半減期を有し（ＭｃＱｕｅｅｎ，Ｊ．Ｐｒａｍｌｉｎｔｉｄｅ ａｃｅ
ｔａｔｅ．Ａｍ．Ｊ．Ｈｅａｌｔｈ−Ｓｙｓｔｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｙ（２００５）２２
：２３６３−２３７２）、１日２回〜３回の投与を必要とするため、治療薬としてのその
有用性が限定される。
「オキシトシン」とは、配列ＣＹＩＱＮＣＰＬＧ−ＮＨ２および残基１と６との間にジ
スルフィド架橋を有する哺乳類ホルモンペプチド（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ０１１７８
）、およびピトシン等の合成異形を意味する。オキシトシンは、主に脳内の神経修飾物質
として作用し、ヒト下垂体後葉によって放出され、離れて作用する唯一の既知のホルモン
である、バソプレッシンの構造に非常に類似した構造を有する。オキシトシンは、乳腺お
よび子宮において発現される特定の高親和性オキシトシン受容体によって媒介される子宮
収縮特性、したがって、分娩および授乳においてその役割を有する。本発明のオキシトシ
ン含有ポリペプチドは、自閉症、脆弱Ｘ症候群、慢性日常の頭痛、および男性不妊の処置
における特定の使用を見出し得る。
「リラクシン」とは、１８５アミノ酸前駆体タンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ０
４０９０）から形成されたジスルフィド架橋によって結合された２４および２９アミノ酸
の２つのペプチド鎖のヘテロ二量体であるタンパク質ホルモンを意味し、Ｂ鎖は配列ＤＳ
ＷＭＥＥＶＩＫＬＣＧＲＥＬＶＲＡＱＩＡＩＣＧＭＳＴＷＳを有し、Ａ鎖は配列ＱＬＹＳ
ＡＬＡＮＫＣＣＨＶＧＣＴＫＲＳＬＡＲＦＣを有し、Ｂ１０−Ａ１０とＢ２３−Ａ２４と
の間にジスルフィド架橋を有し、合成および組換え異形を含む。リラクシンは、女性では
月経周期および妊娠中の黄体によって、男性では前立腺によって産生される。リラキシン
は、妊娠に対する母としての生理的反応の多くを変性し、全身および腎血管拡張剤として
作用し、心保護剤および抗線維化剤である。リラキシンは、リラキシン受容体（ＧＰＣＲ
）に結合し、ｃＡＭＰを増加させ、ＰＫＣ、ＰＩ３ＫおよびエンドセリンＢ型受容体を活
性化して、一酸化窒素産生の増加をもたらし、リラキシン誘導性ＶＥＧＦ発現において役
割を果たし得る、ＭＡＰＫを活性化する。本発明のリラキシン含有ポリペプチドは、急性
非代償性心不全（ＡＤＨＦ）の処置における特定の使用を見出し得る。ヒトにおけるリラ
キシンの報告された半減期は１０分未満であるため（Ｄｓｃｈｉｅｔｚｉｇ Ｔ，ｅｔ
ａｌ．Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｒｅｌａｘｉｎ
ｉｎ ｃｏｍｐｅｎｓａｔｅｄ ｈｅａｒｔ ｆａｉｌｕｒｅ：ａ ｓａｆｅｔｙ，ｔ
ｏｌｅｒａｂｉｌｉｔｙ，ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃ ｔｒｉａｌ．Ｊ
Ｃａｒｄ Ｆａｉｌ．２００９；１５：１８２−１９０）、治療薬としての非修飾タンパ
ク質の有用性は限定される。
「センデリチド」および「ＣＤ−ＮＰ」とは、配列ＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳ
ＭＳＧＬＧＣＰＳＬＲＤＰＲＰＮＡＰＳＴＳＡを有し、残基６と２２との間にジスルフィ
ド架橋を持つ、ヒガシグリーンマンバ（Ｄｅｎｄｒｏａｓｐｉｓ ａｎｇｕｓｔｉｃｅｐ
ｓ）ナトリウム利尿ペプチド−（２４−３８）−ペプチドを持つヒトＣ型ナトリウム利尿
ペプチド−（３２−５３）−ペプチド（ＣＮＰ−２２）を意味する。キメラペプチドは、
受容体グアニリルシクラーゼ（ＧＣ）−ＡおよびＧＣ−Ｂの活性化を介して血管保護およ
びＲＡＡＳ抑制作用を有し、腎強化および心除荷を増強し得る一方で最小現の降圧効果を
有する。したがって、器官急性非代償性心不全（ＡＤＨＦ）および急性心筋梗塞（ＡＭＩ
）等の心腎臓疾患の処置における、特に「後急性」治療期間の間の使用を有し得る。
「ペギネサチド」または「ヘマチド」は、リジンにおいて分岐ポリエチレングリコール
と結合される、配列ＧｌｙＧｌｙＬｅｕＴｙｒＡｌａＣｙｓＨｉｓＭｅｔＧｌｙＰｒｏＩ
ｌｅＴｈｒ１ＮａｌＶａｌＣｙｓＧｌｎＰｒｏＬｅｕＡｒｇＳａｒＬｙｓを有する２つの
合成２１アミノ酸ペプチドからなるペプチドである。ペギネサチドは、エリスロポエチン
特性を有するエリスロポエチンの新規の類似体であり、透析を受けていない患者における
慢性腎疾患（ＣＫＤ）に起因する貧血の処置としての医学的用途に開発されている。
「オキシントモデュリン」または「ＯＸＭ」とは、ヒトオキシントモデュリン、成熟オ
キシントモデュリンの生物学的活性の少なくとも一部分を有する合成異形およびその配列
変異体を意味する。オキシントモデュリンは、配列ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＲ
ＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＴＫＲＮＲＮＮＩＡを有する３７アミノ酸ペプチドであり、結腸
中の腸Ｌ細胞から食後に産生され、グルカゴンの２９アミノ酸配列に続いて、８アミノ酸
カルボキシ末端伸長を含有する。オキシントモデュリンは、グルカゴン受容体およびＧＬ
Ｐ−１Ｒの双方におけるアゴニストであり、その食欲減退作用は、恐らく後者の受容体を
介して媒介される。ＯＸＭは、食欲を抑制することが発見された。本発明のＯＸＭ含有ポ
リペプチドは、糖尿病のグルコース調節、インスリン抵抗障害、肥満の処置における特定
の使用を見出し得、減量治療として使用することができる。天然のオキシントモデュリン
は、ヒト血漿中で約１２分の半減期を有することが報告されているため（交差反応グルカ
ゴンアッセイにより測定；Ｓｃｈｊｏｌｄａｇｅｒ ＢＴ．Ｏｘｙｎｔｏｍｏｄｕｌｉｎ
：ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｈｏｒｍｏｎｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｄｉｓｔａｌ ｇｕｔ
．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｇａｓｔｒｉｃ
ａｃｉｄ ａｎｄ ｉｎｓｕｌｉｎ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｉｎ ｍａｎ．Ｅｕｒ Ｊ
Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．（１９８８）１８（５）：４９９−５０３．）、治療薬とし
ての非修飾タンパク質の有用性は限定される。
「ＰＯＴ４」または「ＡＰＬ−１」とは、配列Ｈ−Ｉｌｅ−［Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｖａｌ
−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ］−Ｔｈｒ−ＮＨ
２を有する合成環状ペプチドを意味する。ＰＯＴ４は、コンプスタチンよりも強力なＣ３
補体阻害剤であり、天然Ｃ３の、その活性フラグメントＣ３ａおよびＣ３ｂへの切断を阻
害し、８時間の延長された循環インビボ半減期を有する。加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、発作
性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、喘息、およびＣＯＰＤ等の疾患におけるＶＥＧＦ等
の血管新生因子の炎症、損傷、および上方調節を回避するための使用について考慮される
。
「インターフェロン−λ」、「ＩＦＮ−λ」、「インターロイキン−２９」、および「
ＩＬ−２９」とは、配列ＧＰＶＰＴＳＫＰＴＴＴＧＫＧＣＨＩＧＲＦＫＳＬＳＰＱＥＬＡ
ＳＦＫＫＡＲＤＡＬＥＥＳＬＫＬＫＮＷＳＣＳＳＰＶＦＰＧＮＷＤＬＲＬＬＱＶＲＥＲＰ
ＶＡＬＥＡＥＬＡＬＴＬＫＶＬＥＡＡＡＧＰＡＬＥＤＶＬＤＱＰＬＨＴＬＨＨＩＬＳＱＬ
ＱＡＣＩＱＰＱＰＴＡＧＰＲＰＲＧＲＬＨＨＷＬＨＲＬＱＥＡＰＫＫＥＳＡＧＣＬＥＡＳ
ＶＴＦＮＬＦＲＬＬＴＲＤＬＫＹＶＡＤＧＮＬＣＬＲＴＳＴＨＰＥＳＴを有するＩＬ２９
遺伝子によってコードされるヒトインターロイキン（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｎｏ．Ｑ８ＩＵ５
４（２０−２００））、成熟ＩＬ−２９の生物学的活性の少なくとも一部分を有する組換
えおよび合成異形、およびその配列変異体を意味する。ＩＩＩ型インターフェロン、ＩＬ
−２９は、Ｉ型ＩＦＮ（ＩＦＮＡＲ１／ＩＦＮＡＲ２受容体錯体）とは異なるヘテロ二量
体受容体錯体（ＩＬ−１０Ｒ２およびＩＬ−２８Ｒα受容体鎖）を通じてシグナル伝達し
、抗ウイルス免疫において重要な役割を果たす。顕著に、ＩＬ−２９受容体は、肝細胞上
、ＨＣＶ感染の原発部位で高度に発現されるが、免疫または骨髄細胞上では著しく発現さ
れない。ペグ化異形は、５０〜７０時間の推定半減期を有する。
「インターフェロン−β」または「ＩＦＮ−β」とは、配列ＭＳＹＮＬＬＧＦＬＱＲＳ
ＳＮＦＱＣＱＫＬＬＷＱＬＮＧＲＬＥＹＣＬＫＤＲＭＮＦＤＩＰＥＥＩＫＱＬＱＱＦＱＫ
ＥＤＡＡＬＴＩＹＥＭＬＱＮＩＦＡＩＦＲＱＤＳＳＳＴＧＷＮＥＴＩＶＥＮＬＬＡＮＶＹ
ＨＱＩＮＨＬＫＴＶＬＥＥＫＬＥＫＥＤＦＴＲＧＫＬＭＳＳＬＨＬＫＲＹＹＧＲＩＬＨＹ
ＬＫＡＫＥＹＳＨＣＡＷＴＩＶＲＶＥＩＬＲＮＦＹＦＩＮＲＬＴＧＹＬＲＮを有するＩＦ
ＮＢ１遺伝子によってコードされるヒトタンパク質、ならびに成熟ＩＦＮ−βの生物学的
活性の少なくとも一部分を有する組換えおよび合成異形およびその配列変異体を意味する
。ＩＦＮ−βは、線維芽細胞およびマクロファージを含む様々な細胞型によって産生され
、ウイルス感染および他の生物学的誘導物質に応答する抗ウイルス、抗増殖、および免疫
調節活性を媒介する。ヒト細胞の表面上の特定の受容体へのＩＦＮ−βの結合は、細胞内
事象のカスケード反応を開始し、多数のインターフェロン誘導遺伝子産物、例えば、２’
，５’−オリゴアデニル酸シンセターゼ、β２−マイクログロブリン、およびネオプテリ
ンの発現をもたらす。これらの遺伝子産物は、臨床設定においてバイオマーカーとして日
常的に使用される。ＩＦＮ−βは、再発寛解型ＭＳ、二次進行性ＭＳ、一次進行性ＭＳ、
若年発症型ＭＳ、およびＭＳを示唆する最初のエピソードからなる症候群を含む、様々な
形態の多発性硬化症（ＭＳ）の処置において使用される。市販形態のＩＦＮ−βは、４〜
６７時間の報告された半減期を有し、頻繁な投与を必要とするため、治療薬としてのそれ
らの有用性は限定される。
「Ｃ−ペプチド」とは、配列ＥＡＥＤＬＱＶＧＱＶＥＬＧＧＧＰＧＡＧＳＬＱＰＬＡＬ
ＥＧＳＬＱを有するヒト膵臓タンパク質、および天然Ｃ−ペプチドの生物学的活性の少な
くとも一部分を有する組換えおよび合成異形およびその配列変異体を意味する。Ｃ−ペプ
チドは、Ｎ末端Ｂ鎖とＣ末端Ａ鎖との間に存在するプロインスリンの中間セグメントであ
り、成熟インスリンが形成および分泌されると、プレプロインスリンから切断される。循
環するＣ−ペプチドは、Ｇ−タンパク質に結合される可能性がある受容体に結合し、シグ
ナルは、ＭＡＰＫ、ＰＬＣγ、およびＰＫＣ等のＣａ２＋依存性細胞内シグナル伝達経路
を起動し、転写因子の範囲ならびにｅＮＯＳおよびＮａ＋Ｋ＋ＡＴＰａｓｅ活性の上方調
節をもたらす。Ｃ−ペプチドは、糖尿病性合併症および糖尿病性腎症における使用につい
て考慮される。報告された半減期は約３０分であるため（Ｍａｔｔｈｅｗｓ ＤＲ．Ｔｈ
ｅ ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ ｏｆ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｉｎｓｕｌｉｎ ａｎｄ Ｃ−
ｐｅｐｔｉｄｅ ｉｎ ｍａｎ ａｓｓｅｓｓｅｄ ｂｙ ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ
ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ（Ｏｘｆ）．（１９８５）２
３（１）：７１−７９）、治療薬としての非修飾タンパク質の有用性は限定される。
「グレリン」とは、配列ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＲＶＱＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ
を有するヒトホルモン、切断異形、天然の処理された２７または２８アミノ酸配列および
相同配列を含む、天然グレリンの生物学的活性の少なくとも一部分を有する組換えおよび
合成異形およびその配列変異体を意味する。グレリンは、飽満を誘導するか、または天然
の処理された２７または２８アミノ酸配列および相同配列を含む、成熟グレリンの生物学
的活性の少なくとも一部分を有する種および非天然配列変異体を誘導する。グレリンは、
主に、ヒト胃の基底部内膜のＰ／Ｄ１細胞、および空腹を刺激し、レプチンに対応するホ
ルモンであると見なされる膵臓のε細胞によって産生される。グレリンレベルは、食前に
増加し、食後に減少し、食物摂取の増加をもたらし、視床下部のレベルで及ぼされる作用
によって脂肪量を増加させることができる。グレリンは、成長ホルモンの放出も刺激する
。グレリンは、ｎ−オクタン酸によってセリン残基においてアシル化され、このアシル化
は、ＧＨＳ１ａ受容体への結合、ならびにグレリンのアゴニスト活性およびＧＨ放出能力
に不可欠である。本発明のグレリン含有ポリペプチドは、例えば、消化管運動障害におけ
るＧＩ管の運動を選択的に刺激するか、胃内容排出を加速させるか、または成長ホルモン
の放出を刺激するように、アゴニストとしての特定の使用を見出し得る。本発明は、アン
タゴニストとして作用する、グレリンの非アシル化形態および配列変異体も企図する。例
えば、米国特許第７，３８５，０２６号に記載される、配列置換または切断された変異体
を持つグレリン類似体は、グルコース恒常性改善、インスリン抵抗の処置、および肥満、
癌悪質液、術後腸閉塞、腸疾患、および消化管障害の処置のためのアンタゴニストとして
使用するためのＸＴＥＮに対する融合パートナーとして特定の使用を見出し得る。グレリ
ンの単離および特性化は報告されており（Ｋｏｊｉｍａ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｈｒｅｌ
ｉｎ ｉｓ ａ ｇｒｏｗｔｈ−ｈｏｒｍｏｎｅ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ａｃｙｌａｔｅ
ｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｆｒｏｍ ｓｔｏｍａｃｈ．Ｎａｔｕｒｅ．１９９９；４０２（６
７６２）：６５６−６６０）、合成類似体は、米国特許第６，９６７，２３７号に記載さ
れるように、ペプチド合成によって調製された。グレリンは１０〜３０分の報告された終
末相半減期を有するため（Ａｋａｍｉｚｕ Ｔ，ｅｔ ａｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅ
ｔｉｃｓ，ｓａｆｅｔｙ，ａｎｄ ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ａｎｄ ａｐｐｅｔｉｔｅ ｅ
ｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｇｈｒｅｌｉｎ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｙｏｕｎ
ｇ ｈｅａｌｔｈｙ ｓｕｂｊｅｃｔｓ．Ｅｕｒ Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ（２
００４）１５０（４）：４４７−４５５）、治療薬としての非修飾タンパク質の有用性は
限定され、天然オクタノイル側基の代わりにオクチル側基を持つ天然セリンアミノ酸を３
位置に持つ類似体は、追加の抵抗性をプロテアーゼに付与し得る。
「アクチビン結合タンパク質」または「ＦＳＨ抑制タンパク質（ＦＳＰ）」としても知
られる「フォリスタチン」は、ヒトにおいてＦＳＴ遺伝子によりコードされるタンパク質
を意味する。本明細書において使用される場合、「フォリスタチン」は、相同体、種変異
体、配列変異体、およびそのフラグメントを含む。ヒトにおける成熟タンパク質形態は、
３１５個のアミノ酸を有し、ＦＳ−３１５と称され、クローン化された（米国特許第５，
０４１，５３８号および同第５，１８２，３７５号）。フォリスタチンは、２つの潜在的
Ｎ−グリコシル化部位、Ａｓｎ９５およびＡｓｎ２５９を含有するが、これらの部位にお
ける変異に続いて、組換え産物を、それらがＦＳＨ分泌を阻害する能力、およびアクチビ
ンに結合する能力について検証することは、非変異組換えｈＦＳ−３１５として類似の特
定を有する各変異体をもたらしたことが実証され、フォリスタチン分子のグリコシル化が
、これらの機能に影響を及ぼさないことを示唆する（Ｉｎｏｕｙｅ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．
Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｆｏｌｌｉ
ｓｔａｔｉｎ．ＢＢＲＣ（１９９１）１７９（１）：３５２−３５８）。ブタフォリスタ
チンは、ＵｅｎｏらのＰＮＡＳ：ＵＳＡ ８４：８２８２−８２８６（１９８７）に開示
され、ウシフォリスタチンは、ＲｏｂｅｒｔｓｏｎらのＢｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ
．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１４９：７４４−７４９（１９８７）に開示されている。骨形
態形成タンパク質、およびアクチビンおよびミオスタチン等の成長／分化因子は、骨、軟
骨、腱／靭帯、筋肉、神経系、および様々な器官を含む、様々な組織の成長、形成、分化
、および維持を誘導する能力を有するため、フォリスタチンおよびフォリスタチンアゴニ
ストによるそれらの中性化は、治療的価値を有する（米国特許第５，５４５，６１６号、
同第５，０４１，５３８号、および第ＡＵ９６７５０５６号）。対象に投与されるフォリ
スタチンは循環から急速に排除され、ラットにおいて２時間余りの終末相半減期を有する
ため（Ｋｏｇｕｒｅ Ｋ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａ
ｔｉｏｎ ｏｆ ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ：ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｔｏ ｔｈｅ ｌｉｖｅ
ｒ ａｎｄ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｌｉｖｅｒ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｆｔｅｒ
ｐａｒｔｉａｌ ｈｅｐａｔｅｃｔｏｍｙ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．（１９９６）２４
（２）：３６１−３６６）、治療薬としての非修飾タンパク質の有用性は限定される。
「血管活性腸管ペプチド」および「ＶＩＰ」とは、配列ＨＳＤＡＶＦＴＤＮＹＴＲＬＲ
ＫＱＭＡＶＫＫＹＬＮＳＩＬＮ−ＮＨ２を有するＶＩＰ遺伝子残基によりコードされる２
８アミノ酸ペプチドホルモン（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ０１２８２（１２５−１５２）
）、および天然ＶＩＰの生物学的活性の少なくとも一部分を有する組換えおよび合成異形
、およびその配列変異体を意味する。ＶＩＰペプチドは、腸、膵臓、および脳内の視床下
部の視交叉上核を含む、多くの組織中で産生される。ＶＩＰは、心臓内の収縮性を刺激し
、血管拡張を引き起こし、グリコーゲン分解を増加させ、動脈血圧を低下させ、気管支、
胃、および胆嚢の平滑筋を弛緩させる。濃度の変化は、心筋線維症、心不全、心筋症、お
よび肺高血圧と関連付けられ、呼吸器系におけるその欠乏は、肺疾患の病原因子であると
見なされる（Ｓａｉｄ ＳＩ，２００７，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１１５：１２６０；
Ｓａｉｄ ＳＩ，２００８，Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，１１４４：１４８；Ｐｅ
ｔｋｏｖ Ｖ ｅｔ．ａｌ．，２００３，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，１１１：１３３
９）。ＶＩＰは、抵抗性高血圧、一次肺動脈高血圧（ＰＡＨ）、喘息、ＣＯＰＤ、糖尿病
、勃起不全、および女性の性的不全を処置することにおける使用について考慮される。そ
の半減期は約１分であることが報告されているため（Ｄｏｍｓｃｈｋｅ Ｓ，ｅｔ ａｌ
．Ｖａｓｏａｃｔｉｖｅ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｉｎ ｍａｎ：ｐｈ
ａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ，ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ａｎｄ ｃｉｒｃｕｌａｔｏｒｙ
ｅｆｆｅｃｔｓ．Ｇｕｔ（１９７８）１９：１０４９−１０５３）、治療薬としての非
修飾タンパク質の有用性は限定される。
「フゼオン」とは、ＣＤ４＋Ｔ細胞のＨＩＶの融合に関与するウイルスタンパク質であ
るＨＩＶのｇｐ４１に由来し、配列ＹＴＳＬＩＨＳＬＩＥＥＳＱＮＱＱＥＫＮＥＱＥＬＬ
ＥＬＤＫＷＡＳＬＷＮＷＦを有する、３６アミノ酸ペプチド、ならびに天然ｇｐ４１の結
合活性の少なくとも一部分を有する組換えおよび合成異形およびその配列変異体を意味す
る。フゼオンおよびその多量体または関連ペプチドとの共役体は、抵抗性形態のＨＩＶ感
染を処置することにおいて使用されるか、または使用について考慮されている。フゼオン
は、患者において３．８時間の半減期を有し、頻繁な注入投与を必要とするため、その有
用性は限定される。
「ＫＡＩ−４１６９」とは、腎疾患患者および骨障害（ＣＫＤ−ＭＢＤ）患者における
二次性副甲状腺機能亢進症（ＳＨＰＴ）の処置のためにＫＡＩ Ｐｈａｒｍａにより開発
中のヒト細胞表面カルシウム感知受容体（ＣａＳＲ）のペプチドアゴニストを意味する。
「パシレオチド」とは、クッシング病の処置に使用される、化学名［（３Ｓ，６Ｓ，９
Ｓ，１２Ｒ，１５Ｓ，１８Ｓ，２０Ｒ）−９−（４−アミノブチル）−３−ベンジル−１
２−（１Ｈ−インドール−３−イルメチル）−２，５，８，１１，１４，１７−ヘキサオ
キソ−１５−フェニル−６−［（４−フェニルメトキシフェニル）メチル］−１，４，７
，１０，１３，１６−ヘキサザビシクロ［１６．３．０］ヘニコサン−２０−イル］Ｎ−
（２−アミノエチル）カルバミン酸塩を有するソマトスタチン類似体を意味する。パシレ
オチドは、成長ホルモン、ＩＧＦ−１および副腎皮質刺激ホルモンの分泌を抑制する、ソ
マトスタチン−Ｒ−亜型Ｒ１、２、３、および５に対し高い結合親和性を持つ多重受容体
ソマトスタチン類似体である。クッシング病の処置に加えて、末端肥大症、神経内分泌疾
患、肝疾患、症候性多嚢胞肝疾患、神経内分泌腫瘍、リンパ脈管筋腫症、先天性インスリ
ン過剰症、再発性または進行性髄膜腫、および他の内分泌障害における使用についても考
慮される。市販の形態は、１２〜１７時間の報告された半減期を有するため（Ｐｅｔｅｒ
ｓｅｎｎ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｔｏｌｅｒａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｄｏｓｅ Ｐｒｏｐｏ
ｒｔｉｏｎａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｐａｓｉｒｅｏｔｉｄｅ
Ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ ａｓ ａ Ｓｉｎｇｌｅ Ｄｏｓｅ ｏｒ Ｔｗｏ Ｄｉｖ
ｉｄｅｄ Ｄｏｓｅｓ ｉｎ Ｈｅａｌｔｈｙ Ｍａｌｅ Ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ：Ａ
Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｅｎｔｅｒ，Ｏｐｅｎ−Ｌａｂｅｌ，Ａｓｃｅｎｄｉｎｇ−Ｄｏｓｅ
Ｓｔｕｄｙ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（２０１２）３４：６７７−
６８８）、その有用性は限定される。
「イリシン」とは、配列ＤＳＰＳＡＰＶＮＶＴＶＲＨＬＫＡＮＳＡＶＶＳＷＤＶＬＥＤ
ＥＶＶＩＧＦＡＩＳＱＱＫＫＤＶＲＭＬＲＦＩＱＥＶＮＴＴＴＲＳＣＡＬＷＤＬＥＥＤＴ
ＥＹＩＶＨＶＱＡＩＳＩＱＧＱＳＰＡＳＥＰＶＬＦＫＴＰＲＥＡＥＫＭＡＳＫＮＫＤＥＶ
ＴＭＫＥを有するＦＮＤＣ５遺伝子によりコードされるタンパク質の切断産物、および天
然イリシンの生物学的活性の少なくとも一部分を有する組換えおよび合成異形およびその
配列変異体を意味する。イリシンは、筋肉運動の有益な効果を媒介し、核受容体ＰＰＡＲ
Ａの活性化を通じてＵＣＰ１発現を上方調節することにより、白色脂肪組織の褐色化を誘
導する。軽度に増加したイリシンレベルは、エネルギー消費の増加、体重の減少、および
食事誘導性インスリン抵抗の改善をもたらすことが示された（Ｂｏｓｔｒｏｍ Ｐ，２０
１２，Ｎａｔｕｒｅ，４８１：４６３）。イリシンは、肥満、糖尿病、および代謝障害を
処置することにおける使用について考慮される。
「ＴＸＡ１２７」および「ＰａｎＣｙｔｅ」は、配列ＮＲＶＹＩＨＰを有するＴＸＡ１
２７を持つアンジオテンシン（１〜７）の類似体であり、ＰａｎＣｙｔｅは、第４および
第７の残基をそれぞれｄＡｌａおよびＡｌａと結合する環状類似体であり、分解に対して
さらに抵抗性があり、より長い半減期を有するという結果を伴う。これらの類似体は、Ｍ
ＡＳ受容体に結合し、骨髄中の早期造血前駆細胞を刺激し、血管拡張、抗栄養、抗線維化
、ナトリウム利尿、抗炎症、抗血栓作用も有する。化合物は、血液癌、例えば、急性骨髄
性白血病（ＡＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢
性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）
、または非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、および多発性骨髄腫のある患者に対する幹細胞
移植に続く血小板回収の加速における使用、ならびに肺線維症、急性肺傷害、肺動脈高血
圧、および腎臓と肝臓の線維症を処置することにおける使用について考慮される。
「インターロイキン−７」および「ＩＬ−７」とは、配列ＤＣＤＩＥＧＫＤＧＫＱＹＥ
ＳＶＬＭＶＳＩＤＱＬＬＤＳＭＫＥＩＧＳＮＣＬＮＮＥＦＮＦＦＫＲＨＩＣＤＡＮＫＥＧ
ＭＦＬＦＲＡＡＲＫＬＲＱＦＬＫＭＮＳＴＧＤＦＤＬＨＬＬＫＶＳＥＧＴＴＩＬＬＮＣＴ
ＧＱＶＫＧＲＫＰＡＡＬＧＥＡＱＰＴＫＳＬＥＥＮＫＳＬＫＥＱＫＫＬＮＤＬＣＦＬＫＲ
ＬＬＱＥＩＫＴＣＷＮＫＩＬＭＧＴＫＥＨを有するＩＬ７遺伝子によりコードされるヒト
インターロイキン（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ１３２３２（２６−１７７））、および天
然ＩＬ−７の生物学的活性の少なくとも一部分を有する組換えおよび合成異形およびその
配列変異体を意味する。ＩＬ−７ＩＬ−７は、ＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞の拡張を含む、リ
ンパ前駆細胞への多分化能（多能性）造血幹細胞の分化を刺激する。ＩＬ−７は、ＴＧＦ
−Ｂ拮抗作用を通じて抑制性／調節性Ｔ細胞およびＴ細胞アネルギーの産生を限定し、セ
ントラルメモリーＴ細胞の産生を支持する。ＩＬ−７は、ＨＩＶ、腫瘍学、移植、ＨＢＶ
およびＨＣＶ感染におけるリンパ球減少を処置すること、ならびに微小残存病変または進
行した腫瘍を処置することにおける使用について考慮され、免疫再構築または免疫療法の
強化において役割を有し得る。ヒトにおけるＩＬ−７の報告された半減期は約１０時間で
あるため（Ｓｐｏｒｔｅ’ｓ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｐｈａｓｅ Ｉ Ｓｔｕｄｙ ｏｆ Ｒ
ｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−７ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒ
ａｔｉｏｎ ｉｎ Ｓｕｂｊｅｃｔｓ ｗｉｔｈ Ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ Ｍａｌｉｇｎ
ａｎｃｙ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０１０；１６：７２７−７３５）、非修
飾形態でのその有用性は限定される。
「線維芽細胞成長因子１８」または「ＦＧＦ−１８」とは、配列ＥＥＮＶＤＦＲＩＨＶ
ＥＮＱＴＲＡＲＤＤＶＳＲＫＱＬＲＬＹＱＬＹＳＲＴＳＧＫＨＩＱＶＬＧＲＲＩＳＡＲＧ
ＥＤＧＤＫＹＡＱＬＬＶＥＴＤＴＦＧＳＱＶＲＩＫＧＫＥＴＥＦＹＬＣＭＮＲＫＧＫＬＶ
ＧＫＰＤＧＴＳＫＥＣＶＦＩＥＫＶＬＥＮＮＹＴＡＬＭＳＡＫＹＳＧＷＹＶＧＦＴＫＫＧ
ＲＰＲＫＧＰＫＴＲＥＮＱＱＤＶＨＦＭＫＲＹＰＫＧＱＰＥＬＱＫＰＦＫＹＴＴＶＴＫＲ
ＳＲＲＩＲＰＴＨＰＡを有するＦＧＦ１８遺伝子によりコードされるヒトタンパク質（Ｕ
ｎｉＰｒｏｔ Ｎｏ．Ｏ７６０９３（２８−２０７））、ならびに天然ＦＧＦ−１８の生
物学的活性の少なくとも一部分を有する組換えおよび合成異形およびその配列変異体を意
味する。ＦＧＦ−１８は、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）ファミリーのタンパク質メンバ
ーである。ＦＧＦファミリーメンバーは、広い分裂促進性および細胞生存活性を有し、胚
発育、細胞成長、形態形成、組織修復、腫瘍成長、および浸潤を含む、多様な生物学的プ
ロセスに関与する。このタンパク質は、ＰＣ１２細胞中で神経突起伸長を誘導できること
がインビトロで示された。ＦＧＦ−１８は、軟骨細胞および骨芽細胞（骨および軟骨を産
生および維持する細胞）の増殖を刺激し、その使用は、例えば、膝関節における軟骨の修
復および生成について考慮される（Ｅｌｌｓｗｏｒｔｈ ＪＬ．Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ
ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−１８ ｉｓ ａ ｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ ｆｏｒ
ｍａｔｕｒｅ ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏ
ｒｓ．Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ（２００２）１０：３０８−
３２０）。
「α−メラニン細胞刺激ホルモン」または「α−ＭＳＨ」は、ＡＣＴＨ（１〜１３）か
らタンパク質切断産物として生成された１３アミノ酸ペプチドであり、順に、配列Ｎ−Ａ
ｃ−ＳＹＳＭＧＦＲＷＧＬＰＶを有するプロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）の切断産
物、および天然α−ＭＳＨの生物学的活性の少なくとも一部分を有する、合成 異形およ
びその配列変異体である。α−ＭＳＨは、メラノコルチン受容体ＭＣ１、ＭＣ３、ＭＣ４
、およびＭＣ５の非選択的アゴニストであるが、ＭＣ２のではない（ＡＣＴＨに排他的で
ある）。α−ＭＳＨは、メラニン細胞を刺激し、光保護効果を有するメラニンを産生およ
び放出し、それは脳内でシグナルを送り、食欲および性的興奮に対する効果を有する。赤
芽球増殖性プロトポルフィリン症（ＥＰＰ、太陽に不耐）、非分節性白斑症（皮膚脱色）
、光線性角化症（ＡＫ、日光角化症、皮膚癌の前駆体）、多形性光発疹（ＰＬＥ／ＰＭＬ
Ｅ）、術後腎損傷、勃起不全、および性的不全を処置することにおける使用について考慮
される。その半減期はわずか数秒であるため、非修飾形態でのその有用性は限定される。
「エンドスタチン」とは、配列ＨＳＨＲＤＦＱＰＶＬＨＬＶＡＬＮＳＰＬＳＧＧＭＲＧ
ＩＲＧＡＤＦＱＣＦＱＱＡＲＡＶＧＬＡＧＴＦＲＡＦＬＳＳＲＬＱＤＬＹＳＩＶＲＲＡＤ
ＲＡＡＶＰＩＶＮＬＫＤＥＬＬＦＰＳＷＥＡＬＦＳＧＳＥＧＰＬＫＰＧＡＲＩＦＳＦＤＧ
ＫＤＶＬＲＨＰＴＷＰＱＫＳＶＷＨＧＳＤＰＮＧＲＲＬＴＥＳＹＣＥＴＷＲＴＥＡＰＳＡ
ＴＧＱＡＳＳＬＬＧＧＲＬＬＧＱＳＡＡＳＣＨＨＡＹＩＶＬＣＩＥＮＳＦＭＴＡＳＫを有
するＸＶＩＩＩ型コラーゲンに由来する、天然に存在する２０−ｋＤａ Ｃ末端フラグメ
ント（ＵｎｉＰｒｏｔ．Ｎｏ．Ｐ３９０６０（１５７２−１７５４））、ならびに天然エ
ンドスタチンの生物学的活性の少なくとも一部分を有する組換えおよび合成異形およびそ
の配列変異体を意味する。エンドスタチンは、血管新生阻害剤であり、塩基性線維芽細胞
成長因子（ｂＦＧＦ／ＦＧＦ−２）およびＶＥＧＦ等の成長因子の血管新生促進作用を緩
衝し得る。ある癌における使用について考慮される。その半減期は１３時間であるため（
Ｔｈｏｍａｓ，ＪＰ ｅｔ ａｌ．Ｐｈａｓｅ Ｉ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ
ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃ Ｓｔｕｄｙ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ
Ｈｕｍａｎ Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ Ｗｉｔｈ Ａｄｖａｎ
ｃｅｄ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｒｓ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．（２００３）２１：２
２３−２３１）、非修飾形態でのその有用性は限定される。
「ヒューマニン」とは、配列ＭＡＰＲＧＦＳＣＬＬＬＬＴＳＥＩＤＬＰＶＫＲＲＡを有
するＭＴ−ＲＮＲ２遺伝子によりコードされるペプチド（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｎｏ．Ｑ８Ｉ
ＶＧ９（１−２４））、ならびに天然ヒューマニンの生物学的活性の少なくとも一部分を
有する組換えおよび合成異形およびその配列変異体を意味する。ヒューマニンは、アルツ
ハイマー病（ＡＤ）、ＡＤ特異的傷害、プリオン誘導アポトーシス、および化学誘導神経
損傷と関連付けられる細胞死に対する神経保護において役割を有する（Ｈａｓｈｉｍｏｔ
ｏ，Ｙ，Ａ ｒｅｓｃｕｅ ｆａｃｔｏｒ ａｂｏｌｉｓｈｉｎｇ ｎｅｕｒｏｎａｌ
ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｂｙ ａ ｗｉｄｅ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｏｆ ｆａｍｉｌｉａ
ｌ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ‘ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ａβ．ＰＮＡＳ（
２００１）９８：６３３６−６３４１）。より最近では、ヒューマニンは、インスリン作
用の改善および血糖値の低下を助けることが発見された（Ｍｕｚｕｍｄａｒ ＲＨ，Ｈｕ
ｍａｎｉｎ：Ａ Ｎｏｖｅｌ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ Ｐｅｒｉｐ
ｈｅｒａｌ Ｉｎｓｕｌｉｎ Ａｃｔｉｏｎ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ（２００９）４：ｅ６３
３４）。ヒューマニンは、アルツハイマー病、糖尿病、および血管／心血管疾患を処置す
ることにおける使用について考慮される。
「グルカゴン」とは、配列ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭ
ＮＴを有するヒトグルカゴングルコース調節ペプチド、ならびに天然グルカゴンの生物学
的活性の少なくとも一部分を有する組換えおよび合成異形およびその配列変異体を意味す
る。「グルカゴン」という用語は、本明細書において使用される場合、グルカゴンのペプ
チド模倣体も含む。天然グルカゴンは、膵臓によって産生され、血糖値が過度に低下し始
めるときに放出され、肝臓が貯蔵されたグリコーゲンをグルコースに変換し、それを血流
中に放出するようにする。血液からグルコースを摂取するように体細胞にシグナルを送る
グルカゴンの作用はインスリンの作用と反対であるが、グルカゴンは、血流中に新たに入
手可能なグルコースが取り込まれ、インスリン依存性組織により使用され得るように、イ
ンスリンの放出も刺激する。本発明のグルカゴン含有ポリペプチドは、現存肝グリコーゲ
ン貯蔵を持つ個体の血糖値を増加させること、および糖尿病のグルコース恒常性を維持す
ることにおいて特定の使用を見出し得る。グルカゴンは、米国特許第４，８２６，７６３
号に開示されるようにクローン化された。
「グルカゴン様タンパク質−１」または「ＧＬＰ−１」とは、ヒトグルカゴン様ペプチ
ド−１、および天然ＧＬＰ−１の生物学的活性の少なくとも一部分を有するその配列変異
体を意味する。「ＧＬＰ−１」という用語は、配列ＨＤＥＦＥＲＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳ
ＳＴＬＥＧＱＡＡＬＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧ、ＧＬＰ−１（７−３７）、およびＧＬＰ−
１（７−３６）アミドを有するヒトＧＬＰ−１（１−３７）を含む。ＧＬＰ−１は、イン
スリン分泌を刺激するが、高血糖の期間中のみである。インスリンと比較したＧＬＰ−１
の安全性は、この特性、および分泌されるインスリンの量が高血糖の程度に比例するとい
う観察により強化される。ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨの生物学的半減期は、わずか３〜
５分である（米国特許第５，１１８，６６６号）。本発明のＧＬＰ−１含有ポリペプチド
は、糖尿病およびインスリン抵抗性障害のグルコース調節の処置において特定の使用を見
出し得る。ＧＬＰ−１は、米国特許第５，１１８，６６６号に記載されるようにクローン
化され、誘導体が調製された。
「グルカゴン様タンパク質−２」または「ＧＬＰ−２」とは、本明細書において集合的
に、配列ＨＡＤＧＳＦＳＤＥＭＮＴＩＬＤＮＬＡＡＲＤＦＩＮＷＬＩＱＴＫＩＴＤを有す
るヒトグルカゴン様ペプチド−２、ヒトＧＬＰ−２の種相同体、および限定されないが、
成熟配列の２位でアラニンと置換され、ＨＧＤＧＳＦＳＤＥＭＮＴＩＬＤＮＬＡＡＲＤＦ
ＩＮＷＬＩＱＴＫＩＴＤ（「２Ｇ」）をもたらすグリシン、ならびに２位でアラニンと置
換されるＶａｌ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、またはＩｌｅを持つ変異体等の変異
体を含む、成熟ＧＬＰ−２の生物学的活性の少なくとも一部分を有する非天然配列変異体
を意味する。ＧＬＰ−２または配列変異体は、米国特許第５，７８９，３７９号、同第５
，８３４，４２８号、同第５，９９０，０７７号、同第５，９９４，５００号、同第６，
１８４，２０１号、同第７，１８６，６８３号、同第７，５６３，７７０号、米国出願第
２００２００２５９３３号、および同第２００３０１６２７０３号に記載されるように、
単離、合成、特性化、またはクローン化された。
「インスリン」とは、ヒトインスリンまたは相同体、種変異体、またはその配列変異体
を意味し、限定されないが、５８０８Ｄａの分子量を持つ５１個のアミノ酸、および１１
０個のアミノ酸のプロインスリン前駆体からなる成熟ヒトインスリンタンパク質を含む。
前駆体タンパク質は、ジスルフィド結合により一緒に結合された配列ＧＩＶＥＱＣＣＴＳ
ＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮを持つＡ鎖、および配列ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬ
ＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴを持つＢ鎖を有する成熟インスリンに処理される。
「第ＸＩＩＩ因子Ａ鎖」、「ＦＸＩＩＩＡ」、または「Ｆ１３Ａ」とは、配列ＳＥＴＳ
ＲＴＡＦＧＧＲＲＡＶＰＰＮＮＳＮＡＡＥＤＤＬＰＴＶＥＬＱＧＶＶＰＲＧＶＮＬＱＥＦ
ＬＮＶＴＳＶＨＬＦＫＥＲＷＤＴＮＫＶＤＨＨＴＤＫＹＥＮＮＫＬＩＶＲＲＧＱＳＦＹＶ
ＱＩＤＦＳＲＰＹＤＰＲＲＤＬＦＲＶＥＹＶＩＧＲＹＰＱＥＮＫＧＴＹＩＰＶＰＩＶＳＥ
ＬＱＳＧＫＷＧＡＫＩＶＭＲＥＤＲＳＶＲＬＳＩＱＳＳＰＫＣＩＶＧＫＦＲＭＹＶＡＶＷ
ＴＰＹＧＶＬＲＴＳＲＮＰＥＴＤＴＹＩＬＦＮＰＷＣＥＤＤＡＶＹＬＤＮＥＫＥＲＥＥＹ
ＶＬＮＤＩＧＶＩＦＹＧＥＶＮＤＩＫＴＲＳＷＳＹＧＱＦＥＤＧＩＬＤＴＣＬＹＶＭＤＲ
ＡＱＭＤＬＳＧＲＧＮＰＩＫＶＳＲＶＧＳＡＭＶＮＡＫＤＤＥＧＶＬＶＧＳＷＤＮＩＹＡ
ＹＧＶＰＰＳＡＷＴＧＳＶＤＩＬＬＥＹＲＳＳＥＮＰＶＲＹＧＱＣＷＶＦＡＧＶＦＮＴＦ
ＬＲＣＬＧＩＰＡＲＩＶＴＮＹＦＳＡＨＤＮＤＡＮＬＱＭＤＩＦＬＥＥＤＧＮＶＮＳＫＬ
ＴＫＤＳＶＷＮＹＨＣＷＮＥＡＷＭＴＲＰＤＬＰＶＧＦＧＧＷＱＡＶＤＳＴＰＱＥＮＳＤ
ＧＭＹＲＣＧＰＡＳＶＱＡＩＫＨＧＨＶＣＦＱＦＤＡＰＦＶＦＡＥＶＮＳＤＬＩＹＩＴＡ
ＫＫＤＧＴＨＶＶＥＮＶＤＡＴＨＩＧＫＬＩＶＴＫＱＩＧＧＤＧＭＭＤＩＴＤＴＹＫＦＱ
ＥＧＱＥＥＥＲＬＡＬＥＴＡＬＭＹＧＡＫＫＰＬＮＴＥＧＶＭＫＳＲＳＮＶＤＭＤＦＥＶ
ＥＮＡＶＬＧＫＤＦＫＬＳＩＴＦＲＮＮＳＨＮＲＹＴＩＴＡＹＬＳＡＮＩＴＦＹＴＧＶＰ
ＫＡＥＦＫＫＥＴＦＤＶＴＬＥＰＬＳＦＫＫＥＡＶＬＩＱＡＧＥＹＭＧＱＬＬＥＱＡＳＬ
ＨＦＦＶＴＡＲＩＮＥＴＲＤＶＬＡＫＱＫＳＴＶＬＴＩＰＥＩＩＩＫＶＲＧＴＱＶＶＧＳ
ＤＭＴＶＴＶＱＦＴＮＰＬＫＥＴＬＲＮＶＷＶＨＬＤＧＰＧＶＴＲＰＭＫＫＭＦＲＥＩＲ
ＰＮＳＴＶＱＷＥＥＶＣＲＰＷＶＳＧＨＲＫＬＩＡＳＭＳＳＤＳＬＲＨＶＹＧＥＬＤＶＱ
ＩＱＲＲＰＳＭを有する凝固タンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ００４８８（２−７
３２））、および天然ＦＸＩＩＩＡの生物学的活性の少なくとも一部分を有する組換えお
よび合成異形およびその配列変異体を意味する。第ＸＩＩＩ因子は、凝固カスケードにお
ける最後の酵素であり、新たに形成される血栓中でフィブリン分子を互いに架橋するのに
関与する。フィブリンモノマー間に分子間共有結合を形成することにより、およびα−２
抗プラスミン、フィブリノゲン、フィブロネクチン、コラーゲン、および他のタンパク質
を架橋することにより、フィブリン塊の機械的強度を強化し、タンパク質分解から保護し
、細胞外マトリックスに対する安定性を提供する。血漿ＦＸＩＩＩは、一緒に非共有結合
され、フィブリノゲンに結合された２Ａサブユニットおよび２Ｂサブユニットからなるヘ
テロ四量体として循環する。Ａサブユニットの構造を安定化させ、Ａサブユニットをタン
パク質分解から保護すると考えられるＢサブユニットは、通常、遊離ＦＸＩＩＩ−Ｂサブ
ユニットとして血漿中に過剰に存在する。ＦＸＩＩＩ欠乏の患者の大部分は、ＦＸＩＩＩ
−Ａサブユニットに変異を有し、ＦＸＩＩＩ−Ｂサブユニットの変異を持つ患者の症例は
ほとんど報告されていない（Ｍｉｋｋｏｌａ，Ｈ，１９９６，Ｓｅｍｉｎ Ｔｈｒｏｍｂ
Ｈｅｍｏｓｔ，２２：３９３；Ｉｃｈｉｎｏｓｅ Ａ，１９９６，Ｓｅｍｉｎ Ｔｈｒ
ｏｍｂ Ｈｅｍｏｓｔ，２２：３８５）。ＦＸＩＩＩＡは、血友病および関連する凝固障
害、先天性ＦＸＩＩＩ欠乏、および慢性肝疾患に起因する後天性ＦＸＩＩＩ欠乏、炎症性
腸疾患、および術後出血を処置することにおいて使用されるか、または使用について考慮
されている。
「第Ｘ因子」または「ＦＸ」とは、配列ＧＲＰＬＨＬＶＬＬＳＡＳＬＡＧＬＬＬＬＧＥ
ＳＬＦＩＲＲＥＱＡＮＮＩＬＡＲＶＴＲＡＮＳＦＬＥＥＭＫＫＧＨＬＥＲＥＣＭＥＥＴＣ
ＳＹＥＥＡＲＥＶＦＥＤＳＤＫＴＮＥＦＷＮＫＹＫＤＧＤＱＣＥＴＳＰＣＱＮＱＧＫＣＫ
ＤＧＬＧＥＹＴＣＴＣＬＥＧＦＥＧＫＮＣＥＬＦＴＲＫＬＣＳＬＤＮＧＤＣＤＱＦＣＨＥ
ＥＱＮＳＶＶＣＳＣＡＲＧＹＴＬＡＤＮＧＫＡＣＩＰＴＧＰＹＰＣＧＫＱＴＬＥＲＲＫＲ
ＳＶＡＱＡＴＳＳＳＧＥＡＰＤＳＩＴＷＫＰＹＤＡＡＤＬＤＰＴＥＮＰＦＤＬＬＤＦＮＱ
ＴＱＰＥＲＧＤＮＮＬＴＲＩＶＧＧＱＥＣＫＤＧＥＣＰＷＱＡＬＬＩＮＥＥＮＥＧＦＣＧ
ＧＴＩＬＳＥＦＹＩＬＴＡＡＨＣＬＹＱＡＫＲＦＫＶＲＶＧＤＲＮＴＥＱＥＥＧＧＥＡＶ
ＨＥＶＥＶＶＩＫＨＮＲＦＴＫＥＴＹＤＦＤＩＡＶＬＲＬＫＴＰＩＴＦＲＭＮＶＡＰＡＣ
ＬＰＥＲＤＷＡＥＳＴＬＭＴＱＫＴＧＩＶＳＧＦＧＲＴＨＥＫＧＲＱＳＴＲＬＫＭＬＥＶ
ＰＹＶＤＲＮＳＣＫＬＳＳＳＦＩＩＴＱＮＭＦＣＡＧＹＤＴＫＱＥＤＡＣＱＧＤＳＧＧＰ
ＨＶＴＲＦＫＤＴＹＦＶＴＧＩＶＳＷＧＥＧＣＡＲＫＧＫＹＧＩＹＴＫＶＴＡＦＬＫＷＩ
ＤＲＳＭＫＴＲＧＬＰＫＡＫＳＨＡＰＥＶＩＴＳＳＰＬＫを有する凝固タンパク質（Ｕｎ
ｉＰｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ００７４２（２−４８８））、および天然ＦＸの生物学的活性の少
なくとも一部分を有する組換えおよび合成異形およびその配列変異体を意味する。第Ｘ因
子は、第ＩＸ因子（その共因子である第ＶＩＩＩ因子とともに、内因性Ｘａｓｅとして知
られる錯体を形成する）および第ＶＩＩ因子（その共因子である組織因子とともに、外因
性Ｘａｓｅとして知られる錯体を形成する）の双方により第Ｘａ因子に活性化される。第
Ｘ因子は、最終の共通（またはトロンビン）経路の最初のメンバーである。第Ｘ因子は、
第Ｘ因子欠乏、血友病ＡおよびＢ（ＦＶＩＩＩおよびＦＩＸ補充療法に対する阻害性抗体
を発育させているＦＶＩＩＩおよびＦＩＸ患者に起因してバイパス戦略を使用する）、経
口抗凝固剤過剰投与に起因する出血または原因不明の重篤な出血のある患者を処置するた
め、およびビタミンＫの欠失、アミロイド症、深刻な肝疾患、および抗凝固剤の使用（例
えば、ワルファリン）により引き起こされた後天性ＦＸ欠乏を発症する患者の緊急処置に
使用される。成熟第Ｘ因子の半減期は４０〜４５時間であるが、活性化第Ｘ因子（Ｆｘａ
）の血漿半減期は、１〜２分未満であり（（Ｂｕｎｃｅ ＭＷ，２００８，Ｂｌｏｏｄ，
１１７：２９０））、非修飾形態でのその有用性を限定し、抗トロンビンＩＩＩおよびＴ
ＦＰ１により急速に不活性化される。
４． ペイロードとしての核酸
本発明は、ＸＴＥＮ共役体中のペイロードとしての核酸の使用も企図する。一実施形態
において、本発明は、ＸＴＥＮ−ペイロード共役体を提供し、ペイロードは、アプタマー
、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム核酸、ＲＮＡ干渉核酸、およびアンチジ
ーン核酸からなる群から選択される。治療薬として使用されるそのような核酸は、当該技
術分野において既知である（Ｅｄｗｉｎ Ｊａｒａｌｄ，Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｄ
ｒｕｇｓ：ａ ｎｏｖｅｌ ａｐｐｒｏａｃｈ．Ａｆｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．３（１２）：６６２−６６６，２００４；Ｊｏ
ａｎｎａ Ｂ．Ｏｐａｌｉｎｓｋａ．Ｎｕｃｌｅｉｃ−ａｃｉｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉ
ｃｓ：ｂａｓｉｃ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｒｅｃｅｎｔ ａｐｐｌｉｃａｔｉ
ｏｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ １：５０３−
５１４，２００２）。
ＩＶ）． ＸＴＥＮ架橋剤およびＸＴＥＮ−ペイロード共役体、ならびにそのような共役
体を製造する方法
本発明は、部分的に、本明細書に記載されるように、ペイロードが共役される共役パー
トナーとして有用なＸＴＥＮ−架橋剤共役組成物の高度に精製された調製物に関する。本
発明は、ＸＴＥＮ−架橋剤共役パートナーを使用して、１つ以上のＸＴＥＮに結合された
ペイロードの高度に精製された調製物にも関する。本発明は、本明細書に記載されるＸＴ
ＥＮのいずれかとペイロードとの結合により形成されるＸＴＥＮ−ペイロード共役体を製
造する、組成物および方法、ならびにＸＴＥＮを架橋剤と共役することにより形成される
組成物を製造する反応組成物および方法、または本明細書に記載される他の化学的方法を
包含する。特に、「ＸＴＥＮ−ペイロード」および「ＸＴＥＮ−架橋剤」という用語は、
反応物共役パートナーの共役後に残る結合された反応産物（架橋剤、クリック化学反応物
、または本明細書に記載される他の方法の反応産物を含む）を包含することが意図される
。
いくつかの実施形態において、対象の共役体を形成するために利用されるＸＴＥＮは、
表２、表３、および表２２〜２５の配列のうちのいずれか１つから選択され、直接または
本明細書に開示される架橋剤を介して、ペイロード成分に結合され得るＸＴＥＮを含む。
他の実施形態において、対象の共役体を形成するために利用される１つ以上のＸＴＥＮは
、個別に、相当する長さの配列と最適に整列されるとき、表２、３、２２〜２５から選択
されるＸＴＥＮ、またはそのフラグメントと比較して、少なくとも約８０％の配列同一性
、または代替として８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％
、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％
、９９％、または１００％の配列同一性を有するＸＴＥＮ配列を含む。一実施形態におい
て、対象の共役体は、第１および第２のＸＴＥＮ配列を含む多量体であり、ＸＴＥＮは同
じであるか、または異なり、それぞれは、個別に、相当する長さの配列と最適に整列され
るとき、表２、３、２２〜２５から選択されるＸＴＥＮ、またはそのフラグメントと比較
して、少なくとも約８０％の配列同一性、または代替として８１％、８２％、８３％、８
４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９
４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する
ＸＴＥＮ配列を含む。別の実施形態において、対象の共役体は、第１、第２、および第３
のＸＴＥＮ配列を含む多量体であり、ＸＴＥＮは同じであるか、または異なり、それぞれ
は、個別に、相当する長さの配列と最適に整列されるとき、表２、３、２２〜２５から選
択されるＸＴＥＮ、またはそのフラグメントと比較して、少なくとも約８０％の配列同一
性、または代替として８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８
％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８
％、９９％、または１００％の配列同一性を有するＸＴＥＮ配列を含む。さらに別の実施
形態において、対象の共役体は、３、４、５、６、またはそれ以上のＸＴＥＮ配列を含む
多量体であり、ＸＴＥＮは同じであるか、または異なり、それぞれは、個別に、表２、３
、２２〜２５から選択されるＸＴＥＮ、またはそのフラグメントと比較して、少なくとも
約８０％の配列同一性、または代替として８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８
６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９
６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するＸＴＥＮ配列を含
む。これらの多量体共役体において、ＸＴＥＮ配列中の残基の累積長は、約２００超〜約
３０００個、または約４００〜約１０００個のアミノ酸残基であり、ＸＴＥＮは同一であ
り得るか、または配列もしくは長さが異なり得る。本明細書において使用される場合、累
積長は、複数のＸＴＥＮが共役体に組み込まれるとき、アミノ酸残基に全長を包含するこ
とが意図される。
一態様において、本発明は、小分子ペイロード薬物に共有結合され、ＸＴＥＮ−薬物共
役体（「ＸＴＥＮ−Ｄ」）をもたらす、ＸＴＥＮの組成物を提供する。別の態様において
、本発明は、生物学的に活性なタンパク質のペイロード（ペプチドまたはポリペプチドを
包含する）に共有結合され、ＸＴＥＮ−ペプチド／ポリペプチド共役体（「ＸＴＥＮ−Ｐ
」）をもたらす、ＸＴＥＮの組成物を提供する。別の態様において、本発明は、ペイロー
ドペプチドまたはポリペプチドに組換え的に結合され、ＸＴＥＮ−ペプチド／ポリペプチ
ド組換え融合タンパク質（「ＸＴＥＮ−ＰＲ」）をもたらす、１つ以上のＸＴＥＮの組成
物を提供する。別の態様において、本発明は、１つ以上の薬物、および生物学的に活性で
あり得るか、または標的部分であり得る１つ以上のタンパク質のペイロードに結合された
１つ以上のＸＴＥＮの組成物を提供する。特に、本発明は、ペイロード薬物および／また
はタンパク質の投与が、対象における疾患または状態の処置、改善、または予防に有用で
あることが当該技術分野において既知である、状態の処置に有用な単離されたＸＴＥＮ−
Ｄ、ＸＴＥＮ−Ｐ、ＸＴＥＮ−ＰＲ、およびＸＴＥＮ−Ｄ−Ｐ組成物を提供する。ＸＴＥ
Ｎ−Ｄ共役体は、一般に、以下の成分：１）ＸＴＥＮ；２）架橋剤；および３）ＸＴＥＮ
が、直接または本明細書に記載される市販の架橋剤等の架橋剤の使用によるか、またはク
リック化学反応物の使用によるかのいずれかで、化学的に共役されるペイロードのうちの
１つ以上を含むか、または場合によっては、本明細書に記載されるような架橋剤を使用せ
ずに、ＸＴＥＮ中の反応基とペイロードとの間の共役により形成され得る。ＸＴＥＮ−Ｐ
は、一般に、以下の成分：１）ＸＴＥＮ；２）架橋剤；および３）生物学的に活性なタン
パク質ペイロードのうちの１つ以上を含み、一般に、架橋剤またはクリック化学反応物を
使用する共役によっても形成される。ＸＴＥＮ−ＰＲ共役体は、一般に、以下の成分：１
）１つ以上のＸＴＥＮ；２）スペーサー配列、および３）ペイロードのうちの１つ以上を
含む。ＸＴＥＮ−Ｄ−Ｐは、一般に、以下の成分：１）ＸＴＥＮ；２）任意のリンカー；
３）生物学的に活性なタンパク質、および４）薬物のうちの１つ以上を含み、ペイロード
は、一般に、上述されるように、架橋剤またはクリック化学反応物を使用する共役により
形成される。しかしながら、前述の種類の組成物のいくつかの場合、組成物は、架橋剤を
使用せずに形成され得るが、但し、それらの組成物が他の方法で化学的に反応性であるこ
とを条件とする。
ペイロードへのＸＴＥＮの共役は、ＸＴＥＮに結合されないペイロードと比較して、得
られる組成物にいくつかの利点を付与する。以下により完全に記載されるように、強化さ
れた特徴の非限定例としては、全体可溶性および代謝安定性の増加、循環中のタンパク質
分解に対する感受性の低減、免疫原性の低減、皮下的または筋肉内投与されたときに吸収
率の低減、腎臓によるクリアランスの低減、基質との相互作用の強化、毒性の低減、ペイ
ロードの標的送達、および薬物動態特性の強化が挙げられる。ＸＴＥＮに結合されていな
いペイロードと比較して、強化された共役体の薬物動態特性としては、より長い終末相半
減期（例えば、２倍、３倍、４倍、またはそれ以上）、曲線下面積（ＡＵＣ）の増加（例
えば、２５％、５０％、１００％、またはそれ以上）、より低い分布容積、皮下または筋
肉内注入後のより遅い吸収（同様の経路により投与されなければならないペイロードの市
販形態と比較して利点）（Ｃｍａｘがより低くなり、順に、ペイロードの悪影響の低減を
もたらし、集合的に、対象に投与された共役組成物が治療的活性を提供する期間の増加を
もたらす）が挙げられる。いくつかの実施形態において、共役組成物は、投与されたＸＴ
ＥＮ−ペイロードが、皮下的または筋肉内投与されたときにデポーとして作用するように
、活性ペイロードの持続放出を許す切断配列（以下により完全に記載される）を含む。特
に、ＸＴＥＮ−ペイロード共役体は、本明細書に開示される改善された特性のうちの１つ
以上、またはそれらの任意の組合せを呈することができると企図される。これらの強化さ
れた特性の結果として、ＸＴＥＮ−ペイロード共役体は、ＸＴＥＮに結合されていない、
相当する様式で投与されるペイロードと比較して、少ない投薬頻度、より適合した投薬、
および／または毒性の低減を許す。そのようなＸＴＥＮ−ペイロード共役体は、本明細書
に記載されるように、必要とする対象へのペイロードの投与により影響されるか、改善さ
れるか、または予防されることが当該技術分野において知られている、ある状態を処置す
るための有用性を有する。
１． 共役のための架橋剤およびアジド／アルキンクリック化学反応物
別の態様において、本発明は、ＸＴＥＮ−ペイロード共役組成物を調製するために利用
され得るＸＴＥＮ−架橋剤共役体をもたらす、架橋剤に共役されたＸＴＥＮに関する。特
に、本明細書に記載されるＸＴＥＮ−架橋剤共役パートナーは、少なくとも１つのチオー
ル、アミノ、カルボキシル、アルデヒド、もしくはアルコールを担持するペイロード剤ま
たは表面、または当該技術分野において既知の通り、本明細書に記載される成分間の反応
に使用可能であり、適切な任意の他の反応基への共役に有用である。
別の態様において、本発明は、対象のＸＴＥＮ−ペイロード組成物を調製するために利
用され得る共役体をもたらす、ＸＴＥＮ−架橋剤反応物およびＸＴＥＮ−クリック化学ア
ジド／アルキン反応物の共役体を製造する方法に関する。特に、ＸＴＥＮ−架橋剤および
ＸＴＥＮ−アジド／アルキン反応物を製造するための本明細書に記載される方法は、ペイ
ロード剤または反応表面が、少なくとも１つのチオール、アミノ、カルボキシル、アルデ
ヒド、アルケン、アルキン、複素環、アルコール、または反応に使用可能な他の反応基を
担持する場合に有用である。
実質的に均質なＸＴＥＮの調製物を含む、ＸＴＥＮの例示的な実施形態は上述されてい
る。本発明は、ある望ましい薬物動態、化学的、および薬学的特性、特に以下に記載され
る他の特性を組成物に付与する「担体」として機能するように、ペイロードが共役され得
るプラットフォームとしてさらに機能するＸＴＥＮを提供する。他の実施形態において、
本発明は、発現ベクターに組み込まれ、対象のＸＴＥＮ−ペイロード組換え融合タンパク
質の発現および回収に適した宿主に組み込まれ得る、ペプチドまたはポリペプチドペロー
ドをコードする遺伝子に結合され得る、ＸＴＥＮをコードするポリヌクレオチドを提供す
る。
いくつかの実施形態において、本明細書において上述されるＸＴＥＮ成分は、架橋剤と
反応し得る定義された数の反応性アミノ酸残基を組み込むように操作されるか、またはペ
イロードへの共役に使用され得る反応基をさらに含有することができる。一実施形態にお
いて、本発明は、システイン操作されたＸＴＥＮを提供し、それぞれが反応性チオール基
を含有し、架橋剤に共役されて、ＸＴＥＮ−架橋剤共役体をもたらす。別の実施形態にお
いて、本発明は、リジン操作されたＸＴＥＮを提供し、それぞれが、正電荷の親水性εア
ミノ基を含有し、架橋剤に共役され、ＸＴＥＮ−架橋剤共役体をもたらす。システイン操
作されたＸＴＥＮの実施形態において、それぞれは、約１〜約１００個のシステインアミ
ノ酸、または１〜約５０個のシステインアミノ酸、または１〜約４０個のシステインアミ
ノ酸、または１〜約２０個のシステインアミノ酸、または１〜約１０個のシステインアミ
ノ酸、または１〜約５個のシステインアミノ酸、または９個のシステイン、または３個の
システイン、または共役に使用可能な単一のシステインアミノ酸を含む。リジン操作され
たＸＴＥＮの実施形態において、それぞれは、約１〜約１００個のリジンアミノ酸、また
は１〜約５０個のリジンアミノ酸、または１〜約４０個のリジンアミノ酸、または１〜約
２０個のリジンアミノ酸、または１〜約１０個のリジンアミノ酸、または１〜約５個のリ
ジンアミノ酸、または９個のシステイン、または３個のシステイン、または共役に使用可
能な単一のリジンアミノ酸を含む。別の実施形態において、操作されたＸＴＥＮは、前述
の数の範囲のシステイン残基およびリジン残基の双方を含む。
一般に、ＸＴＥＮシステインチオール基は、アミンまたはヒドロキシル基よりも求電子
性共役試薬に対してより反応性、すなわち、より求核性である。さらに、システイン残基
は、一般に、所与のタンパク質中により少数で見出されるため、同じタンパク質内に複数
の共役をもたらす可能性が低い。システイン残基は、遺伝子操作技術によりタンパク質に
導入され、リガンドへの共有結合を形成するか、または新たな分子内ジスルフィド結合を
創製した（Ｂｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１３：９６
４４−９６５０；Ｂｅｒｎｈａｒｄ ｅｔ ａｌ（１９９４）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ
Ｃｈｅｍ．５：１２６−１３２；Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ（１９９４）Ｔｈｅ
ｒａｐｅｕｔｉｃ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １：２４７−２５５；Ｔｕ ｅｔ ａｌ（１
９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９６：４８６２−４８６７；
Ｋａｎｎｏ ｅｔ ａｌ（２０００）Ｊ．ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，７６：２
０７−２１４；Ｃｈｍｕｒａ ｅｔ ａｌ（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ ９８（１５）：８４８０−８４８４；米国特許第６，２４８，５６４号）
。
一実施形態において、本発明は、架橋剤に共役されたシステイン操作されたＸＴＥＮを
含む単離された組成物を提供し、架橋剤は、スルフヒドリル反応性ホモ二官能性またはヘ
テロ二官能性架橋剤から選択される。別の実施形態において、本発明は、架橋剤に共役さ
れたリジン操作されたＸＴＥＮを含む単離された組成物を提供し、架橋剤は、アミン反応
性ホモ二官能性またはヘテロ二官能性架橋剤から選択される。架橋は、共有結合により２
つ以上の分子を化学的に結合するプロセスである。このプロセスは、タンパク質および他
の生体分子とのその併用を参照して、共役または生体共役とも呼ばれる。例えば、反応性
結合部位を遮断または曝露するか、機能を不活性化するか、または官能基を変更して架橋
のための新たな標的を形成するために、タンパク質を修飾して、Ｎ末端およびＣ末端、な
らびにタンパク質およびペプチド上のアミノ酸側鎖を改変することができる。
一態様において、本発明は、化学的に活性なアミノ酸残基またはそれらの誘導体（例え
ば、Ｎ末端αアミン基、リジンのεアミン基、システインのチオール基、Ｃ末端カルボキ
シル基、グルタミン酸およびアスパラギン酸のカルボキシル基）を使用して達成されるＸ
ＴＥＮポリマーへの部位特異的共役のための方法を提供する。第１級αおよびεアミノ基
との反応に適した官能基は、クロロシアヌル酸塩、ジクロロトレアジン、トレジレート、
ベンゾトリアゾール炭酸塩、ｐ−ニトロフェニル炭酸塩、トリクロロフェニル炭酸塩、ア
ルデヒド、混合無水物、カルボニルイミダゾール、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステ
ル、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステルである（Ｈａｒｒｉｓ，Ｊ．Ｍ．，Ｈ
ｅｒａｔｉ，Ｒ．Ｓ．Ｐｏｌｙｍ．Ｐｒｅｐｒ．（Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｄｉｖ．
Ｐｏｌｙｍ．Ｃｈｅｍ），３２（１），１５４−１５５（１９９１）；Ｈｅｒｍａｎ，Ｓ
．，ｅｔ ａｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．１９５，２０３−２０９（１
９９４）；Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ．ａｌ．Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌ
ｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ，５４，４５９−４７６（２００２））。Ｎ−ヒドロキシス
クシンイミドエステル（ＮＨＳ−エステルおよびそれらの可溶性類似体スルホ−ＮＨＳ−
エステル）は、一般にタンパク質共役に使用される（図２参照）。ＮＨＳ−エステルは、
生理的ｐＨで比較的効率的な結合を持つ第１級アミンとの反応時に、安定したアミド産物
を生じる。共役反応は、典型的に、５０〜２００ｍＭのリン酸塩、重炭酸塩／炭酸塩、Ｈ
ＥＰＥＳ、またはホウ酸塩緩衝液中（ｐＨ７〜９）、４℃〜室温で０．５〜２時間行われ
る。ＮＨＳ−エステルは、通常、タンパク質に対して２〜５０倍のモル過剰で使用される
。典型的に、試薬の濃度は、０．１〜１０ｍＭで変動し得るが、最適タンパク質濃度は、
５０〜１００μＭである。
別の方法において、ＸＴＥＮポリペプチドが単一Ｎ末端αアミノ基のみを有するならば
、ＸＴＥＮは、意図的に組み込まれたリジン残基の追加のεアミノ基（複数可）を含有す
るように操作することができ、それらの例示的な配列は表３に提供される。αおよびεア
ミノ基は、異なるｐＫａ値を有する（Ｎ末端アミノ酸のαアミノ基に対し約７．６〜８．
０、リジンのεアミノ基に対し約１０〜１０．５）。そのようなｐＫａ値の有意な差は、
アミノ基の選択的修飾に使用することができる。全ての第１級アミンの脱プロトン化は、
ｐＨ８．０を越えるｐＨで発生する。この環境において、異なるアミンの求核特性は、そ
れらの反応性を決定する。脱プロトン化されるとき、リジンの求核性の高いεアミノ基は
、一般に、αアミノ基よりも求電子剤に対して反応性が高い。一方、より低いｐＨ（例え
ばｐＨ６）で、より酸性のαアミノ基は、一般に、εアミノ基よりも脱プロトン化され、
反応の順序は逆である。例えば、ＦＤＡ認証薬物Ｎｅｕｌａｓｔａ（ペグフィルグランス
チム）は、２０ｋＤａ ＰＥＧ−アルデヒドの共有結合により修飾された顆粒球コロニー
刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）である。タンパク質のＮ末端アミノ酸の特異的修飾は、内部リジ
ンのεアミノ基と比較して、より低いｐＫａのαアミノ基を利用することにより達成され
た（Ｍｏｌｉｎｅａｕｘ，Ｇ．Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．１０，１２３５−１２４
４（２００４），米国特許第５，８２４，７８４号）。
システイン残基を含むＸＴＥＮポリペプチドは、本明細書に記載される組換え方法を使
用して（例えば、実施例参照）、または当該技術分野において既知の標準方法により遺伝
子的に操作され得る。チオール基への共役は、高度に特異的な反応を使用して実行するこ
とができ、架橋剤により接合された単一共役種の形成をもたらす。システインチオール基
との反応に適した官能基は、Ｎマレイミド、ハロアセチル、およびピリジルジスルフィド
である。マレイミド基は、反応混合物のｐＨがｐＨ６．５〜７．５であるとき、スルフヒ
ドリル基と特異的に反応し、可逆的ではない安定したチオエーテル結合を形成する（図３
参照）。中性ｐＨで、マレイミドは、アミンよりも１，０００倍速くスルフヒドリルと反
応するが、ｐＨが８．５を越えて上昇すると、反応は第１級アミンを好む。マレイミドは
、チロシン、ヒスチジン、またはメチオニンと反応しない。反応溶液の場合、チオールは
、それらが結合部位について競合するため、マレイミドと併用される反応緩衝液から排除
されなければならない。反応における過剰なマレイミドは、遊離チオールを付加すること
により反応の最後に急冷することができるが、ＥＤＴＡは、スルフヒドリルの参加を最小
化するように、結合緩衝液中に含めることができる。
別の実施形態において、本発明は、ＸＴＥＮのスルフヒドリル基またはペイロードを架
橋し、対象の共役体を調製するのに有用なハロアセチル試薬の使用を企図する。最も一般
に使用されるハロアセチル試薬は、生理的ｐＨでスルフヒドリル基と反応するヨードアセ
チル基を含有する。ヨードアセチル基とスルフヒドリルとの反応は、ヨードのチオールと
の求核置換によって進行し、安定したチオエーテル結合を産生する（図４参照）。ｐＨ８
．３でスルフヒドリル基の数をわずかに超えるヨードアセチル基を使用することは、スル
フヒドリル選択性を保証する。過剰のヨードアセチル基が使用される場合、ヨードアセチ
ル基は、他のアミノ酸と反応することができる。イミダゾールは、ｐＨ６．９〜７．０で
ヨードアセチル基と反応することができるが、インキュベーションは、１週間よりも長い
間進めなければならない。ヒスチジル側鎖アミノ基は、それぞれｐＨ５およびｐＨ７以上
で、ヨードアセチル基と非プロトン化形態で反応する。別の実施形態において、スルフヒ
ドリル基に有用な架橋剤は、ピリジルジスルフィドである。ピリジルジスルフィドは、広
いｐＨ範囲（最適ｐＨは４〜５）にわたってスルフヒドリル基と反応し、ＸＴＥＮをペイ
ロードに結合するジスルフィド結合を形成する（図５参照）。ジスルフィドとして、これ
らの試薬を使用して調製される共役体は切断可能である。反応中、ジスルフィド交換は、
分子の−ＳＨ基と２−ピリジルジチオール基との間で発生する。結果として、ピリジン−
２−チオンが放出される。これらの試薬は、架橋剤として、スルフヒドリル基をタンパク
質に導入するために使用することができる。ジスルフィド交換は、生理的ｐＨで行われ得
るが、反応速度が遅い。
活性合成ペプチドまたはポリペプチドを含むＸＴＥＮ−ペイロード共役体は、化学的に
活性なアミノ酸残基またはそれらの誘導体、例えば、Ｎ末端αアミノ基、リジンのεアミ
ノ基、システインのチオール基、Ｃ末端アミノ酸のカルボキシル基、アスパラギン酸また
はグルタミン酸のカルボキシル基を使用して調製することができる。各ペプチドは、第１
級アミノ酸配列にかかわらず、Ｎ末端αアミノ基を含有する。必要な場合、Ｎ末端αアミ
ノ基は、活性ペプチド／ポリペプチドの化学的合成時に、保護／ブロックされたままであ
り得る。合成ペプチド／ポリペプチドは、天然であり得るか、または共役のために特異的
に置換され得るかのいずれかである、追加のリジンのεアミノ基（複数可）を含有しても
よい。上記の通り、αおよびεアミノ基は、異なるｐＨで選択的に修飾され得る。合成ペ
プチド中のαまたはεアミノ基のいずれかを選択的に修飾するための別の手法は、二炭酸
ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（ＢＯＣ２）を用いたアミノ基の可逆的保護である。例えば、バプ
レオチドペプチド（合成ソマトスタチン類似体）の選択的ＢＯＣ保護は、ｐＨ６（α基保
護）またはｐＨ８．５（ε基保護）での修飾により達成される。次いで、残りの遊離アミ
ノ基は、ＰＥＧ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドまたはＰＥＧ−アルデヒドにより特異的
に修飾された。最後に、ＢＯＣ保護は、モノ修飾ペプチドに対する酸処理により除去され
た（Ｍｏｒｐｕｒｇｏ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ａｌｋｙｌａｔｉｏｎ
ａｎｄ Ａｃｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ α ａｎｄ ε Ａｍｉｎｏ Ｇｒｏｕｐｓ ｗｉ
ｔｈ ＰＥＧ ｉｎ ａ Ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ Ａｎａｌｏｇｕｅ：Ｔａｉｌｏｒ
ｅｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｆｏｒ Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ
．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．２００２．１３：１２３８−１２４３）。
システインは、概して、天然ペプチドおよびタンパク質配列中に、リジンよりも豊富に
含まれていないため、共役のための部位としてのシステインの使用は、反応中のＸＴＥＮ
−架橋剤分子への複数共役の可能性を低減する。共役時のペプチド／タンパク質脱活性化
の可能性も低減する。さらに、システイン部位への共役は、十分に定義された方法で実行
できる場合が多く、単一種ＸＴＥＮポリマー−ペプチドまたはＸＴＥＮポリマー−ポリペ
プチド共役体の形成をもたらす。場合によっては、システインは、共役されるペプチドの
アミノ酸配列中で不在であり得る。そのような場合、システイン残基は、標準方法を使用
して、組み換え的または合成的のいずれかで、ペプチドのＮ末端またはＣ末端に付加する
ことができる。代替として、選択されたアミノ酸は、システインに対し、化学的または遺
伝子的に修飾することができる。一例として、システインに対するセリン修飾は、保存的
変異であると見なされる。チオール基をシステイン欠失ペプチドに導入するための別の手
法は、２−イミノチオラン（Ｔｒａｕｔ試薬）、ＳＡＴＡ（Ｎ−スクシンイミジルＳ−ア
セチルチオ酢酸塩）、ＳＡＴＰ（Ｎ−スクシンイミジルＳ−アセチルチオプロピオン酸塩
）、ＳＡＴ−ＰＥＯ４−Ａｃ（Ｎ−スクシンイミジルＳ−アセチル（チオテトラエチレン
グリコール））、ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオ
ン酸塩）、ＬＣ−ＳＰＤＰ（スクシンイミジル６−（３’−［２−ピリジルジチオ］プロ
ピオンアミド）ヘキサン酸塩）等のチオール化試薬を使用する、リジンεアミノ基の化学
修飾である（以下により完全に記載される）。固有のチオール基は、一端ペプチドに導入
されると、上記の通り、Ｎ−マレイミド、ハロアセチル、およびピリジルジスルフィド等
のスルフヒドリル反応性を含む化合物により選択的に修飾することができる。
ＸＴＥＮポリペプチドとペプチド、タンパク質、または少分子薬ペイロードとの間の共
役は、当該技術分野において既知であり、使用可能な方法、例えば、Ｒ．Ｆ．Ｔａｙｌｏ
ｒ（１９９１）″Ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ．Ｆｕｎｄａｍｅｎｔ
ａｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ″，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ Ｉｎｃ．
，Ｎ．Ｙ．；Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）″Ｉｍｍｏｂｉｌ
ｉｚｅｄ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｌｉｇａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ″，Ａｃａｄｅｍｉ
ｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ；Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ（２００８）″Ｂｉ
ｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ″，２ｎｄ．ｅｄ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｉ
ｎｃ．，Ｓ．Ｓ．Ｗｏｎｇ（１９９１）″Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ″，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，
Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ．に記載される方法等に従い、市販のゼロ長、ホモまたはヘテロ二
官能性、および多官能性架橋剤化合物を含む、多様な結合化学により達成され得る。開示
の共役体を調製する際に使用するための適切な架橋剤は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、
Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＰｒｏｔｅｏＣｈｅｍ
、Ｇ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ等の企業から市販されている。架橋剤の好適な実施形態は
、チオール反応性官能基またはアミノ反応性官能基を含む。例示的な架橋剤の一覧は、表
１３に提供される。
架橋剤の非限定例は、ＡＢＨ（ｐ−アジドベンゾイルヒドラジド）、ＡＭＡＳ（Ｎ−（
α−マレイミドアセトキシ）−スクシンイミドエステル）、ＡＮＢ−ＮＯＳ（Ｎ−５−ア
ジド−２−ニトロベンジルオキシ−スクシンイミド）、ＡＰＤＰ（Ｎ−（４−［ｐ−アジ
ドサリチルアミド］ブチル）−３’−（２’−ピリジルジチオ）プロピオンアミド）、Ａ
ＳＢＡ（４−（ｐ−アジドサリチルアミド）−ブチルアミン）、ＢＡＳＥＤ（ビス（β−
［４−アジドサリチルアミド］エチル）ジスルフィド）、ＢＭＢ（１，４−ビス−マレイ
ミドブタン）、ＢＭＤＢ（１，４ビスマレイミジル−２，３−ジヒドロキシブタン）、Ｂ
ＭＨ（ビス−マレイミドヘキサン）、ＢＭＯＥ（ビス−マレイミドエタン）、ＢＭＰＨ（
Ｎ−（β−マレイミドプロピオン酸）ヒドラジド）、ＢＭＰＳ（Ｎ−（β−マレイミドプ
ロピルオキシ）スクシンイミドエステル）、ＢＭ（ＰＥＧ）２（１，８−ビス−マレイミ
ドジエチレン−グリコール）、ＢＭ（ＰＥＧ）３（１，１１−ビス−マレイミドトリエチ
レングリコール）、ＢＳ２Ｇ（ビス（スルホスクシンイミジル）グルタル酸塩）、ＢＳ３
（スルホ−ＤＳＳ）（ビス（スルホスクシンイミジル）スベル酸塩）、ＢＳ［ＰＥＧ］５
（ビス（ＮＨＳ）ＰＥＧ５）、ＢＳ（ＰＥＧ）９（ビス（ＮＨＳ）ＰＥＧ９）、ＢＳＯＣ
ＯＥＳ（ビス（２−［スクシンイミドキシカルボニルオキシ］エチル）スルホン）、Ｃ６
−ＳＡＮＨ（Ｃ６−スクシンイミジル４−ヒドラジノニコチン酸アセトンヒドラゾン）、
Ｃ６−ＳＦＢ（Ｃ６−スクシンイミジル４−ホルミル安息香酸塩）、ＤＣＣ（Ｎ，Ｎ−ジ
シクロヘキシルカルボジイミド）、ＤＦＤＮＢ（１−５−ジフルオロ−２，４−ジニトロ
ベンゼン）、ＤＭＡ（ジメチルアジプイミド酸塩）、ＤＭＰ（ジメチルピメルイミド酸塩
）、ＤＭＳ（ジメチルスベルイミド酸塩）、ＤＰＤＰＢ（１，４−ジ−（３’−［２’ピ
リジルジチオ］プロピオンアミド）ブタン）、ＤＳＧ（ジスクシンイミジルグルタル酸塩
）、ＤＳＰ（ジチオビス（スクシミジルプロピオン酸塩）、Ｌｏｍａｎｔ試薬）、ＤＳＳ
（ジスクシンイミジルスベル酸塩）、ＤＳＴ（ジスクシンイミジル酒石酸塩）、ＤＴＢＰ
（ジメチル３，３’−ジチオビスプロピオンイミド酸塩）、ＤＴＭＥ（ジチオビス−マレ
イミドエタン）、ＤＴＳＳＰ（スルホ−ＤＳＰ）（３，３’−ジチオビス（スルホスクシ
ンイミジルプロピオン酸塩））、ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）カルボジイミド塩酸塩）、ＥＧＳ（エチレングリコールビス（コハク酸スクシンイミ
ジル））、ＥＭＣＡ（Ｎ−ε−マレイミドカプロン酸）、ＥＭＣＨ（Ｎ−（ε−マレイミ
ドカプロン酸）ヒドラジド）、ＥＭＣＳ（Ｎ−（ε−マレイミドカプロイルオキシ）スク
シンイミドエステル）、ＧＭＢＳ（Ｎ−（γ−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミ
ドエステル）、ＫＭＵＡ（Ｎ−κ−マレイミドウンデカン酸）、ＫＭＵＨ（Ｎ−（κ−マ
レイミドウンデカン酸）ヒドラジド）、ＬＣ−ＳＤＡ（ＮＨＳ−ＬＣ−ジアジリン）、Ｌ
Ｃ−ＳＭＣＣ（スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カ
ルボキシ−（６−アミドカプロン酸塩））、ＬＣ−ＳＰＤＰ（スクシンイミジル６−（３
’−［２−ピリジルジチオ］プロピオンアミド）ヘキサン酸塩）、ＭＢＳ（ｍ−マレイミ
ドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、ＭＰＢＨ（４−（４−Ｎ−マ
レイミドフェニル）−酪酸ヒドラジド）、ＮＨＳ−ＡＳＡ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ジル−４−アジドサリチル酸）、ＰＤＰＨ（３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニルヒ
ドラジド）、ＰＭＰＩ（Ｎ−（ｐ−マレイミドフェニル）イソシアン酸塩）、ＳＡＤＰ（
スクシンイミジル（４−アジドフェニルジチオ）プロピオン酸塩）、ＳＡＥＤ（スクシミ
ジル２−［７−アジド−４−メチルクマリン−３−アセトアミド］エチル−１，３’−ジ
チオプロピオン酸塩）、ＳＡＮＤ（スクシンイミジル−２−（ｍ−アジド−ｏ−ニトロベ
ンズアミド）エチル１，３’−ジチオプロピオン酸塩）、ＳＡＮＨ（スクシンイミジル４
−ヒドラジノニコチン酸アセトンヒドラゾン）、ＳＡＮＰＡＨ（Ｎ−スクシンイミジル６
−（４’−アジド−２’−ニトロフェニルアミノ）ヘキサン酸塩）、ＳＡＳＤ（スクシン
イミジル−２−（ｐ−アジドサリチルアミド）エチル−１，３−ジチオプロピオン酸塩）
、ＳＢＡＰ（スクシンイミジル３−（ブロモアセトアミド）プロピオン酸塩）、ＳＤＡ（
ＮＨＳ−ジアジリン）、ＳＤＡＤ（ＮＨＳ−ＳＳ−ジアジリン）、ＳＦＡＤ（スクシンイ
ミジル（ペルフルオロアジドベンズアミド）エチル１，３’−ジチオプロピオン酸塩）、
ＳＦＢ（スクシンイミジル４−ホルミル安息香酸塩）、ＳＨＴＨ（スクシンイミジル４−
ヒドラジドテレフタル酸塩）、ＳＩＡ（Ｎ−スクシンイミジルヨード酢酸塩）、ＳＩＡＢ
（Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノ安息香酸塩）、ＳＭＰＢ（スクシ
ンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）酪酸塩）、ＳＭＣＣ（スクシンイミジル４−
（Ｎ−マレイミド−メチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸塩）、ＳＭ［ＰＥＧ］２（
ＮＨＳ−ＰＥＧ２−マレイミド）、ＳＭ［ＰＥＧ］４（ＮＨＳ−ＰＥＧ４−マレイミド）
、ＳＭ（ＰＥＧ）６（ＮＨＳ−ＰＥＧ６−マレイミド）、ＳＭ［ＰＥＧ］８（ＮＨＳ−Ｐ
ＥＧ８−マレイミド）、ＳＭ［ＰＥＧ］１２（ＮＨＳ−ＰＥＧ１２−マレイミド）、ＳＭ
（ＰＥＧ）２４（ＮＨＳ−ＰＥＧ２４−マレイミド）、ＳＭＰＢ（スクシンイミジル４−
（ｐ−マレイミド−フェニル）酪酸塩）、ＳＭＰＨ（スクシンイミジル−６−（β−マレ
イミドプロピオンアミド）ヘキサン酸塩）、ＳＭＰＴ（４−スクシンイミジルオキシカル
ボニル−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）トルエン）、ＳＰＢ（スクシンイミジル−
（４−ソラレン−８−イルオキシ）酪酸塩）、ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル３−（２
−ピリジルジチオ）プロピオン酸塩）、スルホ−ＤＳＴ（スルホジスクシンイミジル酒石
酸塩）、スルホ−ＥＧＳ（エチレングリコールビス（スルホ−スクシンイミジルコハク酸
塩））、スルホ−ＥＭＣＳ（Ｎ−（ε−マレイミドカプロイルオキシ）スルホスクシンイ
ミドエステル）、スルホ−ＧＭＢＳ（Ｎ−（γ−マレイミドブトリルオキシ）スルホスク
シンイミドエステル）、スルホ−ＨＳＡＢ（Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル−４
−アジド安息香酸塩）、スルホ−ＫＭＵＳ（Ｎ−（κ−マレイミドウンデカノイルオキシ
）スルホスクシンイミドエステル）、スルホ−ＬＣ−ＳＤＡ（スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ジ
アジリン）、スルホ−ＬＣ−ＳＭＰＴ（スルホスクシンイミジル６−（α−メチル−α−
［２−ピリジルジチオ］−トルアミド）ヘキサン酸塩）、スルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ（スル
ホスクシンイミジル６−（３’−［２−ピリジルジチオ］プロピオンアミド）ヘキサン酸
塩）、スルホ−ＭＢＳ（ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミ
ドエステル）、スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＡＳＡ（スルホスクシンイミジル（４−アジド−
サリチルアミド）ヘキサン酸塩）、スルホ−ＳＡＤＰ（スルホスクシンイミジル（４−ア
ジドフェニルジチオ）プロピオン酸塩）、スルホ−ＳＡＥＤ（スルホスクシンイミジル２
−［７−アジド−４−メチルクマリン−３−アセトアミド］エチル−１，３’−ジチオプ
ロピオン酸塩）、スルホ−ＳＡＮＤ（スルホスクシンイミジル−２−（ｍ−アジド−ｏ−
ニトロベンズアミド）エチル１，３’−ジチオプロピオン酸塩）、スルホ−ＳＡＮＰＡＨ
（スルホスクシンイミジル６−（４’−アジド−２’−ニトロフェニルアミノ）ヘキサン
酸塩）、スルホ−ＳＡＳＤ（スルホスクシンイミジル−２−（ｐ−アジドサリチルアミド
）エチル−１，３−ジチオプロピオン酸塩）、スルホ−ＳＤＡ（スルホ−ＮＨＳ−ジアジ
リン）、スルホ−ＳＤＡＤ（スルホ−ＮＨＳ−ＳＳ−ジアジリン）、スルホ−ＳＦＡＤ（
スルホスクシンイミジル（ペルフルオロアジドベンズアミド）エチル１，３’−ジチオプ
ロピオン酸塩）、スルホ−ＳＩＡＢ（スルホスクシンイミジル（４−ヨード−アセチル）
アミノ安息香酸塩）、スルホ−ＳＭＣＣ（スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミド
メチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸塩）、スルホ−ＳＭＰＢ（スルホスクシンイミ
ジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）酪酸塩）、ＴＨＰＰ（β−（トリス［ヒドロキシメ
チル］ホスフィン）プロピオン酸（ベタイン））、ＴＭＥＡ（トリス−（２−マレイミド
エチル）アミン）、ＴＳＡＴ（トリス−（スクシンイミジルアミノ三酢酸塩））である。
いくつかの実施形態において、架橋試薬を使用するＸＴＥＮ−ペイロード共役体は、非
天然スペーサーアームを導入する。しかしながら、天然ペプチド結合が好ましい場合、本
発明は、反応が、カルボン酸基の活性化を介して作用するゼロ長架橋剤を使用して実行さ
れ得ることを示す。その実施形態において、反応選択性を達成するために、第１のポリペ
プチドは、遊離Ｃ末端カルボキシル基のみを含有する必要があるが、全てのリジン、グル
タミン酸、およびアスパラギン酸側鎖は保護され、第２のペプチド／タンパク質Ｎ末端α
アミンは、唯一の使用可能な非保護アミノ基である必要がある（任意のリジン、アスパラ
ギン、またはグルタミンが保護されることを要する）。そのような場合、ＸＴＥＮ−ペイ
ロードまたはＸＴＥＮ−架橋剤中の第１のポリペプチドとしてグルタミン酸を含まない表
２のＸＴＥＮ ＡＧファミリー配列の使用が好ましい。したがって、一実施形態において
、本発明は、ＡＧ ＸＴＥＮ配列を含むＸＴＥＮ−架橋剤およびＸＴＥＮ−ペイロードを
提供し、これらの組成物は、ゼロ長架橋剤を使用してペイロードに共役される。実施形態
において利用される例示的なゼロ長架橋剤としては、限定されないが、ＤＣＣ（Ｎ，Ｎ−
ジシクロヘキシルカルボジイミド）およびＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミ
ノプロピル）カルボジイミド塩酸塩）が挙げられ、架橋剤を使用して、１つの分子のカル
ボキシル官能基を別の分子の第１級アミン、例えば、その官能基を持つペイロードに直接
共役する（図６参照）。スルホ−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド）および
ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）は、共役のための触媒として使用され、反応効
率を高める（Ｇｒａｂａｒｅｋ Ｚ，Ｇｅｒｇｅｌｙ Ｊ．Ｚｅｒｏ−ｌｅｎｇｔｈ ｃ
ｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ａｃ
ｔｉｖｅ ｅｓｔｅｒｓ．（１９９０）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８５（１），１３
１−１３５）。ＥＤＣは、カルボン酸基と反応し、カルボキシル基を活性化して、活性Ｏ
−アシルイソ尿素中間体を創製し、それが反応混合物中のアミノ基に結合するのを許す。
Ｏ−アシルイソ尿素中間体は、水溶液中で不安定であり、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
を使用して、中間体の安定性を増加させない２ステップ共役手順において効果をなくす。
この中間体は、第１級アミンと反応してアミド誘導体を形成する。架橋反応は、通常、ｐ
Ｈ４．５〜５で行われ、多くの適用に対しわずか数分を要する。しかしながら、反応の収
率は４．５〜７．５のｐＨにおいて同様である。ＥＤＣの加水分解は、結合中の競合反応
であり、温度、ｐＨ、および緩衝液組成に依存する。４−モルホリノエタンスルホン酸（
ＭＥＳ）は、有効なカルボジイミド反応緩衝剤である。リン酸緩衝液は、ＥＤＣの反応効
率を低減させるが、ＥＤＣの量を増加させることにより、低減された効率を補償すること
ができる。トリス、グリシン、および酢酸緩衝液は、共役緩衝液として使用されないこと
がある。
本発明は、３つのＸＴＥＮが三価架橋剤により結合され、三量体ＸＴＥＮ−架橋剤共役
体をもたらす、組成物も提供する。三量体架橋剤は、第３級アミン、三置換メタン、もし
くは１，３，５−三置換ベンゼン等の対称三価コア、またはＬｙｓＬｙｓジペプチドもし
くはＧｌｕＧｌｕジペプチドもしくはＡｓｐＡｓｐジペプチドもしくはＣｙｓＣｙｓＣｙ
ｓトリペプチド等の非対称三価分子を、スペーサーにより、標準共役技法を使用して、表
１４に記載される様々な反応性側基に接続することにより形成することができる。一実施
形態において、本発明は、３つのＸＴＥＮが、チオール反応性トリス−（２−マレイミド
エチル）アミン（ＴＭＥＡ）、アミン反応性トリス−（スクシンイミジルアミノトリアセ
テート）（ＴＳＡＴ）、および表１４に記載される架橋剤からなる群から選択される三価
架橋剤により共有結合される、組成物を提供する。
他の実施形態において、ＸＴＥＮおよびペイロードは、広範な架橋剤群を使用して共役
することができ、スペーサーアーム（直鎖状または分岐）およびタンパク質または他の分
子上の特定の官能基（例えば、第１級アミン、スルフヒドリル等）に付着することができ
る２つ以上の反応性末端からなるものを含む。直鎖状架橋剤は、ホモ二官能性またはヘテ
ロ二官能性であり得る。ホモ二官能性架橋剤は、１ステップ反応手順においてタンパク質
を架橋するために使用される２つの同一の反応基を有する。アミン反応性ホモ二官能性架
橋剤の非限定例は、ＢＳ２Ｇ（ビス（スルホスクシンイミジル）グルタル酸塩）、ＢＳ３
（スルホ−ＤＳＳ）（ビス（スルホスクシンイミジル）スベル酸塩）、ＢＳ［ＰＥＧ］５
（ビス（ＮＨＳ）ＰＥＧ５）、ＢＳ（ＰＥＧ）９（ビス（ＮＨＳ）ＰＥＧ９）、ＢＳＯＣ
ＯＥＳ（ビス（２−［スクシンイミドキシカルボニルオキシ］エチル）スルホン）、ＤＦ
ＤＮＢ（１−５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）、ＤＭＡ（ジメチルアジプイ
ミド酸塩）、ＤＭＰ（ジメチルピメルイミド酸塩）、ＤＭＳ（ジメチルスベルイミド酸塩
）、ＤＳＧ（ジスクシンイミジルグルタル酸塩）、ＤＳＰ（ジチオビス（スクシミジルプ
ロピオン酸塩）（Ｌｏｍａｎｔ試薬）、ＤＳＳ（ジスクシンイミジルスベル酸塩）、ＤＳ
Ｔ（ジスクシンイミジル酒石酸塩）、ＤＴＢＰ（ジメチル３，３’−ジチオビスプロピオ
ンイミド酸塩）、ＤＴＳＳＰ（スルホ−ＤＳＰ）（３，３’−ジチオビス（スルホスクシ
ンイミジルプロピオン酸塩））、ＥＧＳ（エチレングリコールビス（スクシンイミジルコ
ハク酸塩））、スルホ−ＥＧＳ（エチレングリコールビス（スルホ−スクシンイミジルコ
ハク酸塩））である。
追加として、組成物中およびＸＴＥＮ−ペイロードおよび／またはＸＴＥＮ−架橋剤組
成物を形成する方法に用いられるホモ二官能性架橋剤の例は、スルフヒドリル反応剤、例
えば、ＢＭＢ（１，４−ビス−マレイミドブタン）、ＢＭＨ（ビス−マレイミドヘキサン
）、ＢＭＤＢ（１，４ビスマレイミジル−２，３−ジヒドロキシブタン）、ＢＭＯＥ（ビ
ス−マレイミドエタン）、ＢＭ（ＰＥＧ）２（１，８−ビス−マレイミドジエチレン−グ
リコール）、ＢＭ（ＰＥＧ）３（１，１１−ビス−マレイミドトリエチレングリコール）
、ＤＰＤＰＢ（１，４−ジ−（３’−［２’ピリジルジチオ］プロピオンアミド）ブタン
）、ＤＴＭＥ（ジチオビス−マレイミドエタン）である。
ペイロードに対する後次共役のためのＸＴＥＮ−架橋剤共役体の形成、ならびにＸＴＥ
Ｎ−ペイロード共役体の形成の場合、逐次反応を制御することができるため、ヘテロ二官
能性架橋剤が好ましい。ヘテロ二官能性架橋剤は、２つの異なる反応基を有するため、組
成物中のそれらの使用は、逐次２ステップ共役を可能にする。ヘテロ二官能性試薬は、よ
り不安定な基を使用して、第１のタンパク質と反応する。一実施形態において、ＸＴＥＮ
中の反応基に対するヘテロ二官能性架橋剤の共役は、ＸＴＥＮ−架橋剤共役体をもたらす
。反応を完了し、過剰な未反応架橋剤を除去した後、修飾タンパク質（例えば、ＸＴＥＮ
−架橋剤）を、架橋剤の第２の反応群と相互作用するペイロードに付加することができ、
ＸＴＥＮ−ペイロード共役体をもたらす。最も一般に使用されるヘテロ二官能性架橋剤は
、一端にアミン反応基を含有し、もう一端にスルフヒドリル反応基を含有する。したがっ
て、これらの架橋剤は、システインもしくはリジン操作されたＸＴＥＮ、またはＸＴＥＮ
のＮ末端のαアミノ基との併用に適している。ヘテロ二官能性架橋剤の非限定例は、ＡＭ
ＡＳ（Ｎ−（α−マレイミドアセトキシ）−スクシンイミドエステル）、ＢＭＰＳ（Ｎ−
（β−マレイミドプロピルオキシ）スクシンイミドエステル）、ＥＭＣＳ（Ｎ−（ε−マ
レイミドカプロイルオキシ）スクシンイミドエステル）、ＧＭＢＳ（Ｎ−（γ−マレイミ
ドブチリルオキシ）スクシンイミドエステル）、ＬＣ−ＳＭＣＣ（スクシンイミジル４−
（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシ−（６−アミドカプロン酸塩
））、ＬＣ−ＳＰＤＰ（スクシンイミジル６−（３’−［２−ピリジルジチオ］プロピオ
ンアミド）ヘキサン酸塩）、ＭＢＳ（ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシ
ンイミドエステル）、ＳＢＡＰ（スクシンイミジル３−（ブロモアセトアミド）プロピオ
ン酸塩）、ＳＩＡ（Ｎ−スクシンイミジルヨード酢酸塩）、ＳＩＡＢ（Ｎ−スクシンイミ
ジル（４−ヨードアセチル）アミノ安息香酸塩）、ＳＭＰＢ（スクシンイミジル４−（ｐ
−マレイミドフェニル）酪酸塩）、ＳＭＣＣ（スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミド−
メチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸塩）、ＳＭ［ＰＥＧ］２（ＮＨＳ−ＰＥＧ２−
マレイミド）、ＳＭ［ＰＥＧ］４（ＮＨＳ−ＰＥＧ４−マレイミド）、ＳＭ（ＰＥＧ）６
（ＮＨＳ−ＰＥＧ６−マレイミド）、ＳＭ［ＰＥＧ］８（ＮＨＳ−ＰＥＧ８−マレイミド
）、ＳＭ［ＰＥＧ］１２（ＮＨＳ−ＰＥＧ１２−マレイミド）、ＳＭ（ＰＥＧ）２４（Ｎ
ＨＳ−ＰＥＧ２４−マレイミド）、ＳＭＰＢ（スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミド−
フェニル）酪酸塩）、ＳＭＰＨ（スクシンイミジル−６−（β−マレイミドプロピオンア
ミド）ヘキサン酸塩）、ＳＭＰＴ（４−スクシンイミジルオキシカルボニル−メチル−α
−（２−ピリジルジチオ）トルエン）、ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリ
ジルジチオ）プロピオン酸塩）、スルホ−ＥＭＣＳ（Ｎ−（ε−マレイミドカプロイルオ
キシ）スルホスクシンイミドエステル）、スルホ−ＧＭＢＳ（Ｎ−（γ−マレイミドブト
リルキシ）スルホスクシンイミドエステル）、スルホ−ＫＭＵＳ（Ｎ−（κ−マレイミド
ウンデカノイルオキシ）スルホスクシンイミドエステル）、スルホ−ＬＣ−ＳＭＰＴ（ス
ルホスクシンイミジル６−（α−メチル−α−［２−ピリジルジチオ］−トルアミド）ヘ
キサン酸塩）、スルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ（スルホスクシンイミジル６−（３’−［２−ピ
リジルジチオ］プロピオンアミド）ヘキサン酸塩）、スルホ−ＭＢＳ（ｍ−マレイミドベ
ンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル）、スルホ−ＳＩＡＢ（スルホ
スクシンイミジル（４−ヨード−アセチル）アミノ安息香酸塩）、スルホ−ＳＭＣＣ（ス
ルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸塩
）、スルホ−ＳＭＰＢ（スルホスクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）酪酸塩
）である。アミンおよびスルフヒドリル含有分子の共有結合を可能にするヘテロ二官能性
架橋剤の例は、スルホ−ＳＭＣＣ（スルホスルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミド
メチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸塩）である。スルホ−ＳＭＣＣは、水性緩衝液
中、最大１０ｍＭ濃度で調製され得るＳＭＣＣの水溶性類似体である。この架橋剤のスペ
ーサーアーム中のシクロヘキサン環は、この環を含有しない同様の試薬と比較して、マレ
イミド基の加水分解率を減少させる。この特徴は、ＳＭＣＣまたはスルホ−ＳＭＣＣを用
いてマレイミド活性化されたＸＴＥＮを凍結乾燥させ、スルフヒドリル含有分子への後の
共役のために貯蔵されるようにする。したがって、一実施形態において、本発明は、最適
に整列されたとき、表３から選択される配列もしくは配列のフラグメントに対し少なくと
も約８０％の配列同一性、または少なくとも約９０％、または約９１％、または約９２％
、または約９３％、または約９４％、または約９５％、または約９６％、または約９７％
、または約９８％、または約９９％の配列同一性を有するか、または同一であるＸＴＥＮ
を有するＸＴＥＮ−架橋剤を提供し、ＸＴＥＮ−架橋剤は、ＸＴＥＮのαアミノ基または
リジン操作されたＸＴＥＮのεアミンに結合されたスルホ−ＳＭＣＣの１つ以上の架橋剤
を有する。別の実施形態において、本発明は、最適に整列されたとき、表２から選択され
る配列もしくは配列のフラグメントに対し少なくとも約８０％の配列同一性、または約９
０％、または約９１％、または約９２％、または約９３％、または約９４％、または約９
５％、または約９６％、または約９７％、または約９８％、または約９９％の配列同一性
を有するか、または同一であるＸＴＥＮを有するＸＴＥＮ−架橋剤を提供し、ＸＴＥＮ−
架橋剤は、ＸＴＥＮのＮ末端のアミノ基に結合された１つのスルホ−ＳＭＣＣを有する。
前述のヘテロ二官能性架橋剤は、単一アミンおよび単一システインを介して２つの分子を
共役する。タンパク質中のジスルフィド架橋への部位特異的共役のために特別な種類の架
橋剤が開発された（Ｂａｌａｎ Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＥＧ
ｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄｓ ｕｓｉｎｇ
ａ ｔｈｒｅｅ−ｃａｒｂｏｎ ｂｒｉｄｇｅ．（２００７）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔ
ｅ Ｃｈｅｍ．１８，６１−７６；Ｂｒｏｃｃｈｉｎｉ Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｄｉｓｕｌｆ
ｉｄｅ ｂｒｉｄｇｅ ｂａｓｅｄ ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．
（２００８）Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ６０，
３−１２）。最初に、リンカーは、アミン特異的４−［２，２−ビス［ｐ−トリルスルホ
ニル）メチル］アセチル）安息香酸−ＮＨＳエステルとして合成される。この分子は、Ｘ
ＴＥＮ−ビス（スルホン）を生じるＸＴＥＮのアミノ基に共有結合され得る。後者の分子
の５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液中（ｐＨ７．８）のインキュベーションは、トルエン
スルフィン酸の排除をもたらし、ＸＴＥＮ−α、β−不飽和β’−モノスルホンを生成す
る。得られた分子は、ジスルフィド架橋含有ペイロードと部位特異的に反応する。第１の
ステップにおいて、ジスルフィド架橋は、還元により２つのチオールに変換される。第２
のステップにおいて、ＸＴＥＮ−モノスルホンは、２つのシステインをビスアルキル化し
、化学的に安定な３炭素架橋をもたらす。同じα、β不飽和β’−モノスルホンは、ジス
ルフィド架橋に由来する２つのチオール基への共役のみならず、ポリヒスチジンタグへの
共役にも使用することができる（Ｃｏｎｇ Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉ
ｃ ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ ａｔ ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ ｔａｇｓ．（２０１２）Ｂｉｏ
ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．２３，２４８−２６３）。
ＸＴＥＮ−架橋剤組成物を使用するスルホ−ＳＭＣＣとの共役は、通常、２ステッププ
ロセスで行われる。一実施形態において、アミン含有タンパク質は、例えば、リン酸緩衝
生理食塩水（ＰＢＳ＝１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７
．２）または相当するアミンおよびスルフヒドリルを含まない緩衝液（ｐＨ６．５〜７．
５）の共役緩衝液中で調製される。１〜５ｍＭまでＥＤＴＡを付加することは、二価金属
をキレート化し、それによりスルフヒドリル含有タンパク質中のジスルフィド形成を低減
する。アミン含有タンパク質の濃度は、使用される架橋剤モル過剰を決定する。一般に、
１ｍｇ／ｍｌ未満のタンパク質試料は、４０〜８０倍モル過剰を利用し、１〜４ｍｇ／ｍ
ｌのタンパク質試料は、２０倍モル過剰を利用し、５〜１０ｍｇ／ｍｌのタンパク質試料
は、架橋剤の５〜１０倍モル過剰を利用する。反応混合物（アミン含有タンパク質および
架橋剤）は、室温で３０分間、または４℃で２時間インキュベートされ、次いで、過剰な
架橋剤は、共役緩衝液と平衡化した脱塩カラムを使用して除去される。ＸＴＥＮ−架橋剤
を調製する場合、組成物はその時点で保持される。ＸＴＥＮ−架橋剤がペイロードに共役
される実施形態において、スルフヒドリル含有ペイロードおよびＸＴＥＮ−架橋剤共役体
は、最終共役体に望ましいモル比に対応するモル比で混合され（ＸＴＥＮの分子当たり１
つ以上のアミノ基に共役される予想架橋剤の数を考慮する）、ペイロード上に存在する単
一スルフヒドリル基と一致する。反応混合物は、室温で３０分間または４℃で２時間イン
キュベートされる。共役効率は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに続いてタンパク質染色によるか、適
切な分析クロマトグラフィー技法、例えば、逆相ＨＰＬＣまたはカチオン／アニオン交換
クロマトグラフィーにより推定することができる。
一実施形態において、本発明は、多価である架橋剤を使用して形成され、２、３、４、
５、６、またはそれ以上のＸＴＥＮを有する組成物をもたらす、ＸＴＥＮ−架橋剤共役組
成物を提供する。別の実施形態において、本発明は、多価である架橋剤を使用して形成さ
れ、１、２、３、４、５、６、またはそれ以上の異なるペイロードに結合された２、３、
４、５、６、またはそれ以上のＸＴＥＮを有する組成物をもたらす、ＸＴＥＮ−架橋剤−
ペイロード共役組成物を提供する。多価三官能性架橋剤の非限定例は、「Ｙ形」スルフヒ
ドリル反応性ＴＭＥＡ（トリス−（２−マレイミドエチル）アミン）およびアミン反応性
ＴＳＡＴ（トリス−（スクシンイミジルアミノ三酢酸塩）である。反応性部分の任意の組
合せは、多価組成物に対し、直鎖状または分岐のいずれかの足場ポリマーを使用して設計
され得る。図７に例が示され、構築物は、ホモまたはヘテロ官能性反応基の任意の組合せ
を有し得る。特に興味深いのは、図２１〜２３および９７〜１０５に概略的に示される三
量体構成、ならびに図２１および１０５〜１０６に示される四量体である。特定の理論に
拘束されないが、三官能性リンカーにより結合された３つのＸＴＥＮを有する共役組成物
は（順に、組み込まれたリジンまたはシステイン残基を介してＸＴＥＮに結合されたペイ
ロードを持つ）、一価ＸＴＥＮ−ペイロード組成物と比較して、構築物の各「アーム」に
対し比例的に短いＸＴＥＮを利用することができ、同数のペイロードが、組み込まれたシ
ステインもしくはリジン、または各ＸＴＥＮのＮ末端アミノ残基に結合され、得られた三
量体ＸＴＥＮ−ペイロード組成物は、単量体ＸＴＥＮ−ペイロード組成物に相当する見掛
けの分子量および流体力学半径を有するが、より低い粘度を有するため、小口径の針によ
る対象への組成物の投与を補助し、等数のＸＴＥＮアミノ酸を有する単量体ＸＴＥＮ−ペ
イロード組成物と比較して、組成物の低減した立体障害および増加した柔軟性に起因して
、ペイロードから等しいか、またはより優れた能力を提供する。
一実施形態において、本発明は、三価架橋剤により結合された３つのＸＴＥＮを含む組
成物を提供し、この組成物のタンパク質を約１００ｍｇ／ｍｌ含有する溶液は、等モル重
量および濃度の対応する直鎖状ＸＴＥＮよりも少なくとも約５ｃＰ、または約６ｃＰ、ま
たは約７ｃＰ、または約８ｃＰ、または約９ｃＰ、または約１０ｃＰ低い粘度を有する。
別の実施形態において、本発明は、四価架橋剤により結合された４つのＸＴＥＮを含む組
成物を提供し、この組成物のタンパク質を約１００ｍｇ／ｍｌ含有する溶液は、等モル重
量および濃度の対応する直鎖状ＸＴＥＮよりも少なくとも約５ｃＰ、または約６ｃＰ、ま
たは約７ｃＰ、または約８ｃＰ、または約９ｃＰ、または約１０ｃＰ低い粘度を有する。
多価架橋剤を使用してそのような組成物を製造する方法は、本明細書において上述され
るものに類似する反応条件を用いることができるが、例示的な方法および支持データは、
以下の実施例に提供される。追加として、多価架橋剤は、リジンオリゴマーの修飾により
容易に得ることができる。例えば、ペプチドＬｙｓ−Ｌｙｓは、各Ｌｙｓ残基において３
つのアミノ基、１つのαアミノ基、および２つのεアミノ基を含む。これらのアミノ基は
、１つのアミン反応基を有する二官能性架橋剤と反応させることにより、多くの他の反応
基に変換され得る。例えば、Ｌｙｓ−ＬｙｓのＤＢＣＯ−ＮＨＳ架橋剤との反応は、３個
のＤＢＣＯ基を担持する産物を生じる。Ｌｙｓ−ＬｙｓのＮＭａｌ−ＮＨＳ架橋剤との反
応は、３つのＮＭａｌ基を担持する産物を生じる。同様の方法で、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙ
ｓに基づく三価架橋剤、およびより長いリジンペプチドを使用することにより、より高原
子価の架橋剤を得ることができる。
架橋剤は、「ホモ二官能性」または「ヘテロ二官能性」のいずれかとして分類すること
ができ、ホモ二官能性架橋剤は、２つ以上の同一反応基を有し、１ステップ反応手順にお
いて、官能基等を含有する分子にランダムに結合または重合するために使用され、ヘテロ
二官能性架橋剤は、応答性標的官能基を有する分子の単一ステップ共役、または望ましく
ない重合または自己共役を最小限に抑える逐次（２ステップ）共役のいずれかを可能にす
る、異なる反応基を有する。ＸＴＥＮ架橋剤が調製され、逐次反応のための組成物として
単離される好適な実施形態において、ＸＴＥＮ−架橋剤は、後次反応に使用可能な少なく
とも１つの反応基をヘテロ二官能性架橋剤に結合される。
一実施形態において、本発明は、ジスルフィド結合を持つ切断可能な架橋剤を利用して
共役されるＸＴＥＮ架橋剤およびＸＴＥＮ−ペイロードを提供する。典型的に、切断は、
β−メルカプトエタノール、ＤＴＴ、ＴＣＥＰ等のジスルフィド結合還元剤により影響を
受けるが、特にそのような組成物は、内因性還元剤（例えば、システインおよびグルタチ
オン）を用いる条件により、徐放様式で内因的に切断可能であることが企図される。以下
は、そのような架橋剤の非限定例である：ＡＰＤＰ（Ｎ−（４−［ｐ−アジドサリチルア
ミド］ブチルｌ）−３’−（２’−ピリジルジチオ）プロピオンアミド）、ＢＡＳＥＤ（
ビス（β−［４−アジドサリチルアミド］エチル）ジスルフィド）、ＤＰＤＰＢ（１，４
−ジ−（３’−［２’ピリジルジチオ］プロピオンアミド）ブタン）、ＤＳＰ（ジチオビ
ス（スクシミジルプロピオン酸塩）（Ｌｏｍａｎｔ試薬）、ＤＴＢＰ（ジメチル３，３’
−ジチオビスプロピオンイミド酸塩）、ＤＴＭＥ（ジチオビス−マレイミドエタン）、Ｄ
ＴＳＳＰ（スルホ−ＤＳＰ）（３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオ
ン酸塩））、ＬＣ−ＳＰＤＰ（スクシンイミジル６−（３’−［２−ピリジルジチオ］プ
ロピオンアミド）ヘキサン酸塩）、ＰＤＰＨ（３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニル
ヒドラジド）、ＳＤＡＤ（ＮＨＳ−ＳＳ−ジアジリン）、ＳＭＰＴ（４−スクシンイミジ
ルオキシカルボニル−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）トルエン）、ＳＰＤＰ（Ｎ−
スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸塩）、スルホ−ＬＣ−ＳＭＰ
Ｔ（スルホスクシンイミジル６−（α−メチル−α−［２−ピリジルジチオ］−トルアミ
ド）ヘキサン酸塩）、スルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ（スルホスクシンイミジル６−（３’−［
２−ピリジルジチオ］プロピオンアミド）ヘキサン酸塩）、スルホ−ＳＡＥＤ（スルホス
クシミジル２−［７−アジド−４−メチルクマリン−３−アセトアミド］エチル−１，３
’−ジチオプロピオン酸塩）、スルホ−ＳＡＮＤ（スルホスクシンイミジル−２−（ｍ−
アジド−ｏ−ニトロベンズアミド）エチル１，３’−ジチオプロピオン酸塩）、スルホ−
ＳＤＡＤ（スルホ−ＮＨＳ−ＳＳ−ジアジリン）、スルホ−ＳＦＡＤ（スルホスクシンイ
ミジル（ペルフルオロアジドベンズアミド）エチル１，３’−ジチオプロピオン酸塩。別
の実施形態において、ＢＳＯＣＯＥＳ（ビス（２−［スクシンイミドキシカルボニルオキ
シ］エチル）スルホン）を含むＸＴＥＮ−ペイロード共役体は、アルカリン条件下で切断
され得る。別の実施形態において、ＤＳＴ（ジスクシンイミジル酒石酸塩）およびＢＭＤ
Ｂ（１，４ビスマレイミジル−２，３−ジヒドロキシブタン）を含むＸＴＥＮ−ペイロー
ド共役体は、過ヨウ素酸塩酸化により切断され得る。ＥＧＳ（エチレングリコールビス（
スクシンイミジルコハク酸塩））およびスルホ−ＥＧＳ（エチレングリコールビス（スル
ホ−スクシンイミジルコハク酸塩））は、ヒドロキシラミンにより切断されるが、活性ペ
イロードが共役体から放出されるように、内因的に切断されることが予想される。
一般に、上記の共役試薬は、架橋剤が、アミン、スルフヒドリル、およびカルボキシル
等の、そうでなければ安定した不活性基と反応性であると仮定する。他の実施形態におい
て、本発明は、生体高分子に対して安定および不活性であるが、一般に互いに対して高度
に反応性である２つの官能基を用いたＸＴＥＮおよびペイロードの別個の修飾に基づく、
共役の異なる手法を提供するいくつかの直交反応は、クリック化学の概念下で分類されて
おり、良好な安定性特性を有するＸＴＥＮ−アジド／アルキン反応物を提供し、したがっ
て、別個の反応におけるペイロードとの後次共役のための試薬として特に適している（Ｋ
ｏｌｂ Ｈ．Ｃ．，Ｆｉｎｎ Ｍ．Ｇ．，Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ Ｋ．Ｂ．Ｃｌｉｃｋ ｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ：ｄｉｖｅｒｓｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ
ａ ｆｅｗ ｇｏｏｄ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ．（２００１）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎ
ｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．４０（１１），２００４−２０２１）。一般に、クリック化学は、
（１）アルキン−アジド、（２）「ｅｎｅ」−チオール、および（３）アルデヒド−ヒド
ラジドを必要とする反応を含む反応概念として使用され、本発明の３つ全ての使用を企図
する。一例は、図８に示されるように、１，４−二置換−１，２，３−トリアゾールを形
成する、アジドへのアルキンのヒュスゲン１，３−双極性環状付加である。アジドおよび
アルキン部分は、Ｎ末端α−アミノ基、リジンのε−アミノ基、およびシステインのスル
フヒドリル基の化学修飾により、ペプチド／タンパク質もしくは薬物ペイロード、または
ＸＴＥＮに導入することができる。表１５は、共役組成物の製造における使用に企図され
るクリック化学反応物の非限定例を提供し、意図される共役体（およびＸＴＥＮまたはペ
イロード）の一成分は、表の反応物１と反応し、第２の成分（ペイロードまたはＸＴＥＮ
）は、表のアジド反応物２と反応する。例えば、１つの分子は、アミン反応性アルキン、
例えば、３−プロパルギルオキシプロパン酸、ＮＨＳエステル、アセチレン−ＰＥＧ４−
ＮＨＳエステル、ジベンジルシクロオクチン（ＤＢＣＯ）−ＮＨＳエステル、ＤＢＣＯ−
ＰＥＧ４−ＮＨＳエステル、シクロオクチン（ＣＯＴ）−ＰＥＧ２−ＮＨＳエステル、Ｃ
ＯＴ−ＰＥＧ３−ＮＨＳエステル、ＣＯＴ−ＰＥＧ４−ＮＨＳエステル、ＣＯＴ−ＰＥＧ
２−ペンタフルオロフェニル（ＰＦＰ）エステル、ＣＯＴ−ＰＥＧ３−ＰＦＰエステル、
ＣＯＴ−ＰＥＧ４−ＰＦＰエステル、ＢＣＯＴ−ＰＥＧ２−ＮＨＳエステル、ＢＣＯＴ−
ＰＥＧ３−ＮＨＳエステル、ＢＣＯＴ−ＰＥＧ４−ＮＨＳエステル、ＢＣＯＴ−ＰＥＧ２
−ＰＦＰエステル、ＢＣＯＴ−ＰＥＧ３−ＰＦＰエステル、ＢＣＯＴ−ＰＥＧ４−ＰＦＰ
エステルを使用し、アルキン部分で修飾される。あるいは、分子は、スルフヒドリル反応
性アルキン、例えば、アセチレン−ＰＥＧ４−マレイミド、ＤＢＣＯ−マレイミド、また
はＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−マレイミドで修飾される。第２の分子は、アジド−ＰＥＧ２−Ｎ
ＨＳエステル、アジド−ＰＥＧ３−ＮＨＳエステル、アジド−ＰＥＧ４−ＮＨＳエステル
、アジド−ＰＥＧ２−ＰＦＰエステル、アジド−ＰＥＧ３−ＰＦＰエステル、アジド−Ｐ
ＥＧ４−ＰＦＰエステル、またはアジド−ＰＥＧ４−マレイミドで修飾される。アジドお
よびアルキン部分は、同義に使用することができ、それらは、生体分子および水性環境に
対して生物学的に固有であり、安定し、かつ不活性である。混合されるとき、アジドおよ
びアルキン反応物は、任意の副反応なしに可逆的共有結合を形成する（Ｍｏｓｅｓ Ｊ．
Ｅ．ａｎｄ Ｍｏｏｒｈｏｕｓｅ Ａ．Ｄ．Ｔｈｅ ｇｒｏｗｉｎｇ ａｐｐｌｉｃａｔ
ｉｏｎｓ ｏｆ ｃｌｉｃｋ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．（２００７）Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒ
ｅｖ．３６，１２４９−１２６２；Ｂｒｅｉｎｂａｕｅｒ Ｒ．ａｎｄ Ｋｏｈｎ Ｍ．
Ａｚｉｄｅ−ａｌｋｙｎｅ ｃｏｕｐｌｉｎｇ：ａ ｐｏｗｅｒｆｕｌ ｒｅａｃｔｉｏ
ｎ ｆｏｒ ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．（２００３）ＣｈｅｍＢ
ｉｏＣｈｅｍ ４（１１），１１４７−１１４９；Ｒｏｓｔｏｖｔｓｅｖ Ｖ．Ｖ．，Ｇ
ｒｅｅｎ Ｌ．Ｇ．，Ｆｏｋｉｎ Ｖ．Ｖ．，Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ Ｋ．Ｂ．Ａ ｓｔｅ
ｐｗｉｓｅ Ｈｕｉｓｇｅｎ ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ：ｃｏｐｐ
ｅｒ（Ｉ）−ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｒｅｇｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ″ｌｉｇａｔｉｏｎ
″ ｏｆ ａｚｉｄｅｓ ａｎｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ａｌｋｙｎｅｓ．（２００２）Ａ
ｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ．４１（１４），２５９６−２５９９）。
一実施形態において、本発明は、第２のＸＴＥＮに共役された第１のＸＴＥＮを含む共役
体を提供し、第１のＸＴＥＮは、表１５からのアルキン反応物１に結合され、第２のＸＴ
ＥＮは、表１５からのアジド反応物２に結合され、次いで第１のＸＴＥＮおよび第２のＸ
ＴＥＮは、アルキン反応物１およびアジド反応物２を反応させるのに有効な条件下で結合
され、ＸＴＥＮ−ＸＴＥＮ共役体をもたらす。別の実施形態において、本発明は、ペイロ
ードに共役された第１のＸＴＥＮを含む共役体を提供し、ＸＴＥＮは、表１５からのアル
キン反応物１に結合され、ペイロードは、表１５からのアジド反応物２に結合され、次い
でＸＴＥＮおよびペイロードは、アルキン反応物１およびアジド反応物２を反応させるの
に有効な条件下で結合され、ＸＴＥＮ−ペイロード共役体をもたらす。別の実施形態にお
いて、本発明は、ペイロードに共役された第１のＸＴＥＮを含む共役体を提供し、ＸＴＥ
Ｎは、表１５からのアジド反応物２に結合され、ペイロードは、表１５からのアルキン反
応物１に結合され、次いでＸＴＥＮおよびペイロードは、アルキン反応物１およびアジド
反応物２を反応させるのに有効な条件下で結合され、ＸＴＥＮ−ペイロード共役体をもた
らす。前述の実施形態において、反応を生じさせる条件は、本明細書に記載されるもので
あるか、またはそのような反応物の共役について当該技術分野で既知の反応条件である。
本発明は、前述の共役体の様々な組合せ、例えば、ＸＴＥＮがクリック化学反応物により
結合され、１つのＸＴＥＮが、クリック化学を使用してＸＴＥＮに共役されたペイロード
の１つ以上の分子をさらに含むＸＴＥＮ−ＸＴＥＮ共役体、ＸＴＥＮがクリック化学反応
物により結合され、１つのＸＴＥＮが、クリック化学を使用してＸＴＥＮに共役された第
１のペイロードの１つ以上の分子をさらに含み、第２のＸＴＥＮが、クリック化学を使用
してＸＴＥＮに共役された第２のペイロードの１つ以上の分子をさらに含むＸＴＥＮ−Ｘ
ＴＥＮ共役体も企図する。これらの組合せに対する追加の変化形は、当業者には容易に明
らかとなるであろう。
いくつかの実施形態において、ＸＴＥＮ−ＸＴＥＮ共役体およびＸＴＥＮ−ペイロード
共役体は、チオール−エン反応と呼ばれる遊離基反応、またはチオールマイケル付加と呼
ばれるアニオン反応により進行するチオ−エン系クリック化学を使用して共役される（図
９参照）（Ｈｏｙｌｅ Ｃ．Ｅ．ａｎｄ Ｂｏｗｍａｎ Ｃ．Ｎ．Ｔｈｉｏｌ−ｅｎｅ
ｃｌｉｃｋ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．（２０１０）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．
４９，１５４０−１５７３）。特に、チオールマイケル付加は、ペイロードがタンパク質
であるＸＴＥＮ−ペイロード共役体により適していると考えられる（Ｐｏｕｎｄｅｒ Ｒ
．Ｊ．ｅｔ．ａｌ．Ｍｅｔａｌ ｆｒｅｅ ｔｈｉｏｌ−ｍａｌｅｉｍｉｄｅ ’Ｃｌｉ
ｃｋ’ ｒｅａｃｔｉｏｎ ａｓ ａ ｍｉｌｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｓａｔｉｏｎ
ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｄｅｇｒａｄａｂｌｅ ｐｏｌｙｍｅｒｓ．（２００８）
Ｃｈｅｍ Ｃｏｍｍｕｎ（Ｃａｍｂ）．４１，５１５８−５１６０）。少なくとも１つの
分子は、１つの遊離チオール基を含む必要があるため、ペイロードがシステインを含有し
ない場合は、システイン操作されたＸＴＥＮを利用することができる。代替として、チオ
ール基は、２−イミノチオラン（Ｔｒａｕｔ試薬）、ＳＡＴＡ（Ｎ−スクシンイミジルＳ
−アセチルチオ酢酸塩）、ＳＡＴＰ（Ｎ−スクシンイミジルＳ−アセチルチオプロピオン
酸塩）、ＳＡＴ−ＰＥＯ４−Ａｃ（Ｎ−スクシンイミジルＳ−アセチル（チオテトラエチ
レングリコール））、ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロ
ピロン酸塩）、ＬＣ−ＳＰＤＰ（スクシンイミジル６−（３’−［２−ピリジルジチオ］
プロピオンアミド）ヘキサン酸塩）等のチオール化試薬を使用する、ＸＴＥＮまたはペイ
ロードペプチド／タンパク質のいずれかのＮ末端α−アミノ基またはリジンε−アミノ基
の化学修飾により導入され得る。そのような方法は、当該技術分野において既知である（
Ｃａｒｌｓｓｏｎ Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９７８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１７３，７２３
−７３７；Ｗａｎｇ Ｄ．ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．８
，８７８−８８４；Ｔｒａｕｔ Ｒ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．（１９７３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ１２（１７），３２６６−３２７３；Ｄｕｎｃａｎ，Ｒ．Ｊ．Ｓ．ｅｔ．ａｌ．（
１９８３）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３２．６８−７３；米国特許第５，７０８，１
４６号）。チオール−マイケル付加反応の第２の成分は、（メタ）アクリレート、マレイ
ミド、α、β−不飽和ケトン、フマル酸エステル、アクリロニトリル、ケイ皮酸塩、およ
びクロトン酸塩における電子欠乏炭素−炭素二重結合を持つ試薬を必要とする。Ｎ−マレ
イミドは、スルフヒドリル反応官能基として一般に使用され、市販のヘテロ二官能性架橋
剤、例えば、ＡＭＡＳ（Ｎ−（α−マレイミドアセトキシ）−スクシンイミドエステル）
、ＢＭＰＳ（Ｎ−（（β−マレイミドプロピルオキシ）スクシンイミドエステル）および
上述されるその他を使用し、Ｎ末端α−アミノ基またはＬｙｓ ε−アミノ基修飾を介し
てペイロードタンパク質またはＸＴＥＮ分子に導入することができる。遊離チオールおよ
びマレイミド部分を含有する得られた２つの分子は、それぞれ、穏やかな条件下で安定し
た共有結合を創製し、マレイミドにより結合されたＸＴＥＮ−ペイロードをもたらす。
他の実施形態において、ＸＴＥＮ−ＸＴＥＮ共役体およびＸＴＥＮペイロード共役体は
、例えば、Ｇａｎｇｕｌｙらにより記載され、図１０に示されるように、ヒドラジドとア
ルデヒドとの間の反応に基づくクリック化学を利用して形成される（Ｇａｎｇｕｌｙ Ｔ
．ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｈｙｄｒａｚｉｄｅ/ｈｙｄｒａｚｏｎｅ ｃｌｉｃｋ ｒｅａ
ｃｔｉｏｎ ａｓ ａ ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｓｔｒａｔｅｇｙ
ｆｏｒ Ｍ（ＣＯ）３（Ｍ＝Ｒｅ，９９ｍＴｃ）ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃ
ａｌｓ．（２０１１）Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．４７，１２８４６−１２８４８）。例え
ば、ＸＴＥＮは、アルデヒド基を有するペイロードと混合され、所望のＸＴＥＮ−ペイロ
ード共役体を生じる、ヒドラジンまたはヒドラジドを有するように修飾され得る。一実施
形態において、本発明は、α−Ｎ末端アミノ基に導入された少なくとも１つのヒドラジン
またはヒドラジドを持つＸＴＥＮを提供するか、または代替として１つ以上のリジンε−
アミノ基は、それが安定している見なされるため、標的ペイロードへの共役のための試薬
として適切なＸＴＥＮを提供するように修飾される。芳香族ヒドラジンおよび芳香族アル
デヒドから形成された、得られたビス‐アリールヒドラゾンは、９２℃および２．０〜１
０．０の広いｐＨ値に対し安定である（Ｓｏｌｕｌｉｎｋ，Ｉｎｃ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ−
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ，Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ
，Ｃａｔａｌｏｇ＃ Ｓ−９０１０−１）。反応における脱離基は水であり、結合を安定
化するために還元剤（例えば、シアノボロヒドリド）を必要としない。ヒドラジン／ヒド
ラジドまたはアルデヒド部分で修飾された分子は、水性環境において良好な安定性を有し
、特別な処理要件なしに活性状態を維持する。ＸＴＥＮ分子のアミノ基（複数可）は、Ｎ
ＨＳ−エステル／ヒドラジド、例えば、ＳＡＮＨ（スクシンイミジル４−ヒドラジノニコ
チン酸アセトンヒドラゾン）、Ｃ６−ＳＡＮＨ（Ｃ６−スクシンイミジル４−ヒドラジノ
ニコチン酸アセトンヒドラゾン）、ＳＨＴＨ（スクシンイミジル４−ヒドラジドテレフタ
ル酸塩酸塩）により修飾される。典型的な反応において、タンパク質は、修飾緩衝液（１
００ｍＭリン酸塩、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）中の１〜５ｍｇ／ｍｌ溶液とし
て調製し、修飾剤は、５〜２０倍モル過剰で付加し、反応は、室温で２時間実行する。別
個に、ペイロード分子は、同様の条件下で、ＮＨＳ−エステル／アルデヒドＳＦＢ（スク
シンイミジル４‐ホルミル安息香酸塩）またはＣ６−ＳＦＢ（Ｃ６−スクシンイミジル４
‐ホルミル安息香酸塩）で修飾される。次いで、双方の修飾分子は、共役緩衝液（１００
ｍＭリン酸塩、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０）中に脱塩される。得られた成分は、
１モル等量の限定タンパク質、および豊富に使用することができる１．５〜２モル等量の
タンパク質を使用して一緒に混合される。１００ｍＭリン酸塩、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、
ｐＨ６．０中の１００ｍＭアニリンの触媒緩衝液を付加し、アニリンの最終濃度を１０ｍ
Ｍに調整し、反応を室温で２時間実行する。
別の実施形態において、ＸＴＥＮ−ペイロード共役体は、アルデヒドと第１級アミノ基
との間の反応に続いて、形成されたＳｃｈｉｆｆ塩基の水素化ホウ素ナトリウムまたはシ
アノ水素化ホウ素による還元により産生され得る。この方法の第１ステップとして、第１
級α−アミノ基を持つＸＴＥＮ、またはε−アミノ基を持つＬｙｓ含有ＸＴＥＮ等のＸＴ
ＥＮ分子は、０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２等の無アミ
ン結合緩衝液中の典型的なアミン−ＮＨＳ化学を使用し、ＮＨＳ−エステル／アルデヒド
ＳＦＢ（スクシンイミジル４‐ホルミル安息香酸塩）、Ｃ６−ＳＦＢ（Ｃ６−スクシンイ
ミジル４‐ホルミル安息香酸塩）、またはＳＦＰＡ（スクシンイミジル４‐ホルミルフェ
ノキシ酢酸塩）により修飾される。得られた修飾アルデヒド−ＸＴＥＮは、この時点でＸ
ＴＥＮ−架橋剤組成物として保持され得るか、またはＸＴＥＮ−ペイロード共役体を創製
するための試薬として使用され得るかのいずれかである。ＸＴＥＮ−ペイロードを製造す
るために、修飾されたアルデヒド−ＸＴＥＮは、反応性アミノ基を持つペイロード、およ
び２０〜１００ｍＭのシアノ水素化ホウ素等の軽度還元剤と混合される。反応混合物は、
室温で６時間または４℃で終夜インキュベートする。次いで、未反応アルデヒド基は、５
０〜５００ｍＭのトリス・ＨＣｌ、ｐＨ７．４および２０〜１００ｍＭのシアノ水素化ホ
ウ素ナトリウムでブロックされ、共役された精製ＸＴＥＮ−ペイロードの分離を許す。
他の実施形態において、本発明は、ペプチドまたはタンパク質ペイロードを含むＸＴＥ
Ｎペイロード共役体を提供し、ペイロードは、そのペイロードのペプチド／タンパク質Ｃ
末端アシルアジドの反応性に基づく化学ライゲーションを介して共役される。例として、
ペプチドまたはタンパク質が、ヒドロキシメチル安息香酸（ＨＭＢＡ）樹脂を用いた固相
ペプチド合成（ＳＰＰＳ）を使用して産生されるとき、最終ペプチドは、多様な求核性試
薬により樹脂から切断され、様々なＣ末端官能基を持つペプチドへのアクセスを付与する
ことができる。一実施形態において、本方法は、ペプチドまたはタンパク質ヒドラジドを
生じるペプチジル／タンパク質樹脂のヒドラジン分解を含む。次いで、希釈塩酸中の亜硝
酸ナトリウムまたはｔｅｒｔ−亜硝酸ブチルを用いる、得られたアシルヒドラジドのニト
ロソ化は、アシルアジドの形成をもたらす。得られたカルボニルアジド（またはアシルア
ジド）は、ＸＴＥＮの第１級アミンと反応して、安定したアミド結合を形成することがで
き、ＸＴＥＮ−ペイロード共役体をもたらす活性化カルボキシレート基（エステル）であ
る。代替実施形態において、第１級アミンは、ＸＴＥＮ Ｎ末端のα−アミンまたはＸＴ
ＥＮ配列中の操作されたリジン残基の１つ以上のε−アミンであり得る。共役反応におい
て、アジド官能基は、図１１に示されるように、離脱基である。アミン基との共役反応は
、電子欠乏カルボニル基における求核剤の攻撃により発生する（Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，
Ｊ．（１９７９）Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，
Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｖｏｌ．１，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ：Ｎ．Ｙ．；ｔｅｎ Ｋｏ
ｒｔｅｎａａｒ Ｐ．Ｂ．Ｗ．ｅｔ．ａｌ．Ｓｅｍｉｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｈｏｒ
ｓｅ ｈｅａｒｔ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｃ ａｎａｌｏｇｕｅｓ ｆｒｏｍ ｔｗｏ
ｏｒ ｔｈｒｅｅ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ．（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２，８２７９−８２８３）
さらに他の実施形態において、本発明は、ＸＴＥＮ−架橋剤およびＸＴＥＮペイロード
共役体を提供し、共役は、直交タンパク質ライゲーションにより行われ、図１２に示され
るように、初期化学選択的捕捉の後に、分子内アシル再配置が続く。化学選択的捕捉は、
Ｎ末端アミンで近位に配置された求核剤または求電子剤、およびＣ末端カルボキシルエス
テルで近位に位置する別の適合する求核剤または求電子剤も必要とする。この実施形態に
おいて、ＸＴＥＮは、図１２のタンパク質１またはタンパク質２のいずれかとして機能し
得ることが特に企図される。したがって、代替実施形態において、ＸＴＥＮは、適切な試
薬と反応してＣ末端上でチオエステルを産生するか、またはＮ末端上のシステインを導入
して、代替ＸＴＥＮ−架橋剤組成物を産生することができる。前述のＸＴＥＮ−架橋剤共
役体を使用してＸＴＥＮ−ペイロードを製造することにおいて、エステルまたはチオエス
テルを形成する求核剤および求電子剤の対の化学選択的捕捉は、それぞれの反応物のＮ末
端アミノ基およびＣ末端エステルをそのような近位に持ち込み、アミド結合を形成するよ
うに同時分子内アシル転移を許す。ほとんどの直交ライゲーション反応は、側鎖基の保護
を必要とせず、生体環境に適合する穏やかな条件下で起こる（Ｔａｍ Ｊ．Ｐ．，Ｘｕ
Ｊ．，Ｅｏｍ Ｋ．Ｄ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｏｆ ｐｅｐ
ｔｉｄｅ ｌｉｇａｔｉｏｎ．（２００１）Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ（Ｐｅｐｔｉｄｅ
Ｓｃｉｅｎｃｅ）６０，１９４−２０５）。
別の実施形態において、共役体は、求電子剤としてＣ末端チオエステル、および求核剤
としてＮ末端システインを必要とする天然型化学的ライゲーション（ＮＣＬ）として知ら
れる方法反応により形成することができる。この反応の結果は、ＸＴＥＮ−ペイロード共
役体のライゲーション部位における天然アミド結合である（Ｄａｗｓｏｎ Ｐ．Ｅ．，Ｍ
ｕｉｒ Ｔ．Ｗ．，Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ Ｉ．，Ｋｅｎｔ Ｓ．Ｂ．Ｓｙｎｔｈｅｓ
ｉｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ｎａｔｉｖｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｌｉｇａｔｉ
ｏｎ．（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６，７７６−７７９；Ｔａｍ Ｊ．Ｐ．；Ｌｕ
Ｙ．−Ａ．；Ｌｉｕ Ｃ．Ｆ．；Ｓｈａｏ，Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ
ｕｓｉｎｇ ｕｎｐｒｏｔｅｃｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｏｒｔｈ
ｏｇｏｎａｌ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｓ．（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ， ９２，１２４８５−１２４８９；Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｅ．Ｃ
．Ｂ．；Ｋｅｎｔ，Ｓ．Ｂ．Ｈ．Ｊ．Ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｍｅｃｈａ
ｎｉｓｍ ａｎｄ ｃａｔａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｎａｔｉｖｅ ｃｈｅｍｉｃａ
ｌ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ．（２００６）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．
１２８，６６４０−６６４６；Ｋｅｎｔ Ｓ．Ｂ．（２００９）Ｔｏｔａｌ ｃｈｅｍｉ
ｃａｌ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．（２００９）Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ
．Ｒｅｖ．３８：３３８−３５１）。ＮＣＬ反応におけるＣ末端成分の第１アミノ酸（図
１２にタンパク質２として示される）は、システインである。そのようなタンパク質は、
第１の位置にシステインを持つＸＴＥＮ、またはペプチド／タンパク質ペイロードを含む
、従来の組換えタンパク質生合成により調製された任意の他のタンパク質であり得る。Ｎ
末端成分（図１３にペイロードとして示される）は、化学合成によりＣ末端チオエステル
として調製される。チオエステル合成方法の例は、当該技術分野において既知および使用
可能であり、例えば、Ｌｉ Ｘ．，Ｋａｗａｋａｍｉ Ｔ．，Ａｉｍｏｔｏ Ｓ．，Ｄｉ
ｒｅｃｔ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅ ｔｈｉｏｅｓｔｅｒｓ ｕ
ｓｉｎｇ ａｎ Ｆｍｏｃ ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ ｍｅｔｈｏｄ．（１９９８）Ｔｅ
ｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，３９，８６６０−８６７２）、Ｉｎｇｅｎｉｔｏ Ｒ
．，Ｂｉａｎｃｈｉ Ｅ．，Ｆａｔｔｏｒｉ Ｄ．，Ｐｅｓｓｉ Ａ．Ｓｏｌｉｄ−ｐｈ
ａｓｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｔｈｉｏ
ｅｓｔｅｒｓ ｂｙ Ｆｍｏｃ／ｔＢｕ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．（１９９９）Ｊ．Ａｍ．
Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２１，１１３６９−１１３７４）、Ｓｅｗｉｎｇ Ａ．，Ｈｉｌ
ｖｅｒｔ Ｄ．Ｆｍｏｃ−ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ ｐｅｐｔｉ
ｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｌｏｎｇ Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ
ｔｈｉｏｅｓｔｅｒｓ．（２００１）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４０，３３
９５−３３９８、Ｂｒａｓｋ Ｊ．，Ａｌｂｅｒｉｃｉｏ Ｆ．，Ｊｅｎｓｅｎ Ｋ．Ｊ
．，Ｆｍｏｃ ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅ
ｔｈｉｏｅｓｔｅｒｓ ｂｙ ｍａｓｋｉｎｇ ａｓ ｔｒｉｔｈｉｏｏｒｔｈｏｅｓｔ
ｅｒｓ．（２００３）Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．，２００３，５，２９５１−２９５３、Ｏｌｌ
ｉｖｉｅｒ Ｎ．，Ｂｅｈｒ Ｊ．−Ｂ．，Ｅｌ−Ｍａｈｄｉ Ｏ．，Ｂｌａｎｐａｉｎ
Ａ．，Ｍｅｌｎｙｋ Ｏ．Ｆｍｏｃ−ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ
ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅ ｔｈｉｏｅｓｔｅｒｓ ｕｓｉｎｇ ａｎ ｉｎｔｒａｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｎ，Ｓ−ａｃｙｌ ｓｈｉｆｔ．（２００５）Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．，７，２
６４７−２６５０に記載されるものである。通常、α−アルキルチオエステルは、調製お
よび貯蔵の容易さに起因して好ましい。しかしながら、それらはむしろ未反応であるため
、ライゲーション反応は、チオール付加物を用いた原位置トランスチオエステル化により
触媒され、最も一般的なチオール触媒は、２−メルカプトエタンスルホン酸塩（ＭＥＳＮ
ａ）または４−メルカプトフェニル酢酸（ＭＰＡＡ）である。化学共役は、典型的に、数
時間のうちに高収率で完了する。２０個の天然アミノ酸は全てＮ末端成分の最終残基とし
て適しているが、グリシンおよびヒスチジンに対し、最高のライゲーション率が報告され
ており、表２の例示的なＸＴＥＮは、ほぼ全てがグリシンＮ末端ポリペプチドであるため
、ＸＴＥＮはこの反応に対し特に適している（Ｈａｃｋｅｎｇ Ｔ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｐ
ｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｂｙ ｎａｔｉｖｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｌｉｇａ
ｔｉｏｎ：ｅｘｐａｎｄｅｄ ｓｃｏｐｅ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｓｔｒａｉｇｈｔｆｏｒ
ｗａｒｄ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ．（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ９６，１００６８−１００７３）。この共役方法の他の実施形態において、
直交ライゲーション反応は、（１）Ｎ末端ＢｒＡｌａまたはＮ末端アジリジンを持つＣ末
端チオ酸（Ｔａｍ Ｊ．Ｐ．；Ｌｕ Ｙ．−Ａ．；Ｌｉｕ Ｃ．Ｆ．；Ｓｈａｏ，Ｊ．Ｐ
ｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｕｓｉｎｇ ｕｎｐｒｏｔｅｃｔｅｄ ｐｅｐｔｉ
ｄｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｓ．
（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２，１２４８５−１２
４８９）、（２）Ｎ末端シス−ペルチオエステルを持つＣ末端チオ酸（Ｌｉｕ，Ｃ．Ｆ．
，Ｒａｏ，Ｃ．，Ｔａｍ，Ｊ．Ｐ．（１９９６）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，
３７，９３３−９３６）、（３）Ｎ末端ホモシステインを持つＣ末端チオエステル（Ｔａ
ｍ Ｊ．Ｐ．，Ｙｕ Ｑ．Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｓｔｒａｔｅｇｙ
ｉｎ ｔｈｅ ｂｉｏｍｉｍｅｔｉｃ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｐａｒａｔｈｙｒ
ｏｉｄ ｈｏｒｍｏｎｅｓ．（１９９８）Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ４６（５），３１９
−３２７）、および（４）Ｃ末端チオ酸およびＮ末端ヒス（Ｚｈａｎｇ Ｌ．，Ｔａｍ
Ｊ．Ｐ．（１９９７）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ．Ｌｅｔｔ．３８，３−６）を含む。この
方法において、化学合成によるＣ末端チオエステルの調製は、ＮＣＬ反応におけるＮ末端
成分のサイズを制約する。しかしながら、発現タンパク質ライゲーション（ＥＰＬ）法の
使用は、化学合成の必要性により課されるペプチドα−チオエステルのサイズ制限を克服
する（Ｍｕｉｒ Ｔ．Ｗ．；Ｓｏｎｄｈｉ Ｄ．；Ｃｏｌｅ Ｐ．Ａ．Ｅｘｐｒｅｓｓｅ
ｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｉｇａｔｉｏｎ：ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ
ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５，６７０５−６７１０；Ｍｕｉｒ Ｔ．Ｗ．Ｓｅｍｉｓｙｎｔｈ
ｅｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｉ
ｇａｔｉｏｎ．（２００３）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２，２４９−２８９
）。ＥＰＬ法は、タンパク質スプライシングに基づき、このプロセスでは、タンパク質が
分子内再配置を受け、内部配列（インテイン）の突出および側部配列（エクステイン）の
接合をもたらす。後者のプロセスは、エステルまたはチオエステル中間体の形成を必要と
する。本発明を実践する際に、市販の大腸菌タンパク質発現ベクターは、インテイン−キ
チン結合ドメイン（ＣＢＤ）配列と融合されたフレーム内で発現した、ＸＴＥＮ等の関心
対象のタンパク質を産生するのを可能にする。この方法において、図１３に示されるよう
に、前駆体タンパク質のインテイン部分の第１のシステイン残基の側鎖が、直ぐ上流の残
基（つまり、例えば、ＸＴＥＮの最終残基）のペプチド結合を球核的に攻撃し、直鎖状チ
オエステル中間体を形成するとき、融合タンパク質は、Ｎ−Ｓシフトを受ける。化学ライ
ゲーションステップは、タンパク質をチオフェノール（またはＭＥＳＮａおよびＭＰＡＡ
等の他のチオール触媒）、およびシステイン含有合成ペプチドまたはタンパク質でインキ
ュベートすることにより開始される。これは、例えば、ＸＴＥＮタンパク質の高反応性フ
ェニルα−チオエステル誘導体の原位置生成をもたらし、次いで、合成ペプチド／タンパ
ク質ペイロードと急速に結紮して、所望のＸＴＥＮ−ペイロード共役体をもたらす。別の
実施形態において、ＸＴＥＮ−チオエステル中間体は、２０ｍＭ Ｎａ−ＨＥＰＥＳ（ｐ
Ｈ８．５）、５０〜１０００ｍＭ ＮａＣｌ、および１ｍＭ ＥＤＴＡ（任意）中の５０
ｍＭ ２−メルカプトエタンスルホン酸（ＭＥＳＮａ）により切断することができ、得ら
れたＭＥＳＮａタグの付いたタンパク質は、精製され、５ｍＭ ビス−トリス（ｐＨ６．
５）、２５０ｍＭ ＮａＣｌ中−８０℃で、上述される共役におけるＮ末端成分として、
ＮＣＬ反応のＸＴＥＮ−架橋剤共役体として使用するまで貯蔵することができる。Ｃ末端
成分は、Ｎ末端システインを持つ天然または合成のいずれかのペプチド／タンパク質を持
つペイロードであり得る。
さらに他の実施形態において、本発明は、ＸＴＥＮ−架橋剤およびＸＴＥＮ−ペイロー
ド共役体を提供し、ＸＴＥＮとペイロードとの間の共役は、天然型化学的ライゲーション
（ＮＣＬ）等のトレースレスシュタウディンガーライゲーションによって行われ、ライゲ
ーション部位において天然アミド結合をもたらす。この方法の利点において、システイン
は、ライゲーション接合部に必要とされない（Ｓａｘｏｎ，Ｅ．；Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，
Ｃ．Ｒ．；Ｂｅｒｔｏｚｚｉ，Ｃ．Ｒ．Ａ ″ｔｒａｃｅｌｅｓｓ″Ｓｔａｕｄｉｎｇｅ
ｒ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｈｅｍｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｓｙｎｔｈｅ
ｓｉｓ ｏｆ ａｍｉｄｅ ｂｏｎｄｓ．（２０００）Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２，２１４１
２１４３；Ｎｉｌｓｓｏｎ，Ｂ．Ｌ．；Ｋｉｅｓｓｌｉｎｇ，Ｌ．Ｌ．；Ｒａｉｎｅｓ，
Ｒ．Ｔ．Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ ｌｉｇａｔｉｏｎ：ａ ｐｅｐｔｉｄｅ ｆｒｏｍ ａ
ｔｈｉｏｅｓｔｅｒ ａｎｄ ａｚｉｄｅ．（２０００）Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２，１９
３９−１９４１）。代わりに、Ｎ末端タンパク質１は、ジフェニルホスフィンメタンチオ
ールを使用し、Ｃ末端チオエステルとして調製されるが（図１４参照）、Ｃ末端タンパク
質２は、ジアゾ転移反応を介して生成され得るＮ末端アジドとして調製される（Ｃａｖｅ
ｎｄｅｒ Ｃ．Ｊ．；Ｓｈｉｎｅｒ Ｖ．Ｊ．，Ｊｒ．（１９７２）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅ
ｍ．２２，３５６７−３５６９；Ｌｕｎｄｑｕｉｓｔ Ｊ．Ｔ．，ＩＶ，Ｐｅｌｌｅｔｉ
ｅｒ Ｊ．Ｃ．Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔ
ｈｅｓｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ａｌｐｈａ−ａｚｉｄｅ−ｐｒｏｔｅ
ｃｔｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ．（２００１）Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．３，７８１−７８
３）。ホスフィン残基は、タンパク質２のアジドと反応し、窒素の排除後にイミノホスホ
ランを形成する（シュタウディンガー反応）。その高度に求核性の窒素原子を持つ、得ら
れたイミノホスホランは、アザ−イリドとして見なすこともできる。次いで、アザ−イリ
ドの求核性窒素原子は、タンパク質１のカルボニル基を攻撃し、チオエステルを切断する
。特に、ＸＴＥＮまたはペイロードのいずれかは、この反応においてタンパク質１または
タンパク質２のいずれかであり得ることが意図される。再配置されたＸＴＥＮ−ペイロー
ド産物の加水分解は、最終的に天然アミドを産生し、ホスフィン成分をホスフィン（Ｖ）
オキシドとして遊離させる。ビス（ｐ−ジメチルアミノエチルフェニル）ホスフィノメタ
ンチオール、ジフェニルホスフィンメタンチオールの水溶性変異体は、水中の等モル基質
の急速なライゲーションを媒介する（Ｔａｍ，Ａ．；Ｓｏｅｌｌｎｅｒ，Ｍ．Ｂ．；Ｒａ
ｉｎｅｓ，Ｒ．Ｔ．Ｗａｔｅｒ−ｓｏｌｕｂｌｅ ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｈｉｏｌｓ ｆ
ｏｒ ｔｒａｃｅｌｅｓｓ Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ ｌｉｇａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｔ
ｅｇｒａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｉｇａｔｉｏｎ
．（２００７）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２９，１１４２１１１−４３０）。
別の実施形態において、本発明は、酵素的ライゲーションにより調製されたＸＴＥＮ−
ペイロード共役体を提供する。トランスグルタミナーゼは、ペイロードペプチドまたはタ
ンパク質のグルタミンのγ−カルボキシアミド基と、リジン操作されたＸＴＥＮ中のリジ
ンのε−アミノ基との間のイソペプチド結合の形成を触媒し、それにより、ＸＴＥＮとペ
イロードとの間に分子間または分子内架橋剤を創製し（図１５参照）、組成物をもたらす
酵素である（Ｌｏｒａｎｄ Ｌ，Ｃｏｎｒａｄ Ｓ．Ｍ．Ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａ
ｓｅｓ．（１９８４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．５８（１−２），９−３５）
。ライゲーションに対し成功裏に使用された酵素の非限定例は、第ＸＩＩＩａ因子（Ｓｃ
ｈｅｎｓｅ Ｊ．Ｃ．，Ｈｕｂｂｅｌｌ Ｊ．Ａ．Ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ ｅｘｏ
ｇｅｎｏｕｓ ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎｔｏ ｆｉｂｒｉｎ
ｇｅｌｓ ｗｉｔｈ ｆａｃｔｏｒ ＸＩＩＩａ．（１９９９）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．
Ｃｈｅｍ．１０（１）：７５−８１）、および組織トランスグルタミナーゼである（Ｃｏ
ｌｌｉｅｒ Ｊ．Ｈ．，Ｍｅｓｓｅｒｓｍｉｔｈ Ｐ．Ｂ．Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｍｏｄ
ｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｔｒｕ
ｃｔｕｒｅｓ ｗｉｔｈ ｔｉｓｓｕｅ ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ．（２００
３）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１４（４），７４８−７５５；Ｄａｖｉｓ Ｎ．Ｅ
．，Ｋａｒｆｅｌｄ−Ｓｕｌｚｅｒ Ｌ．Ｓ．，Ｄｉｎｇ Ｓ．，Ｂａｒｒｏｎ Ａ．Ｅ
．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｅｗ
ｃｌａｓｓ ｏｆ ｃａｔｉｏｎｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｆｏｒ
ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ ｄｉｓｐｌａｙ ａｎｄ ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ ａｐｐｌ
ｉｃａｔｉｏｎｓ．（２００９）Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ １０（５），１
１２５−１１３４）。グルタミン基質配列ＧＱＱＱＬは、組織トランスグルタミナーゼに
対し高い特異性を有することが知られている（Ｈｕ Ｂ．Ｈ．，Ｍｅｓｓｅｒｓｍｉｔｈ
Ｐ．Ｂ．Ｒａｔｉｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ
ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ
ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ．（２００３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓ
ｏｃ．１２５（４７），１４２９８−１４２９９）。組織トランスグルタミナーゼ配列特
異性は、アシルドナー（グルタミン）に対するよりもアシル受容体（リジン）に対して低
いストリンジェンシーであった（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ Ｃ．Ｓ．，Ｂｉｒｃｋｂｉｃｈｌ
ｅｒ Ｐ．Ｊ．，Ｒｉｃｅ Ｒ．Ｈ．Ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅｓ：ｍｕｌｔｉ
ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅｓ ｔｈａｔ ｓｔ
ａｂｉｌｉｚｅ ｔｉｓｓｕｅｓ．（１９９１）ＦＡＳＥＢ Ｊ．１９９１，５，３０７
１−３０７７）。
酵素的に形成されたＸＴＥＮ−ペイロード組成物の代替実施形態において、黄色ブドウ
球菌からのソルターゼＡトランスペプチダーゼ酵素を使用し、タンパク質１のトレオニン
残基とグリシン残基との間の短い５アミノ酸認識配列ＬＰＸＴＧの切断を触媒し、後次に
アシルフラグメントをタンパク質１のＮ末端オリゴグリシン求核剤に移す（図１６参照）
。タンパク質２を官能化してオリゴグリシンを含有することにより、２つのタンパク質を
部位特異的様式で酵素的に共役し、所望のＸＴＥＮ−ペイロード組成物をもたらすことが
可能である。ソルターゼ認識部位（ＬＰＸＴＧ）を担持する（ポリ）ペプチドは、標準分
子生物学クローニングプロトコルを使用して容易に製造することができる。この残基は、
一般にソルターゼＡの天然基質中に見出されるため、認識部位のＸ位においてグルタミン
酸を導入することは便利である（Ｂｏｅｋｈｏｒｓｔ Ｊ．，ｄｅ Ｂｅｅｎ Ｍ．Ｗ．
，Ｋｌｅｅｒｅｂｅｚｅｍ Ｍ．，Ｓｉｅｚｅｎ Ｒ．Ｊ．Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ｄ
ｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｅｌｌ ｗａｌｌ−ｂｏｕｎｄ
ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ ＬＰｘＴＧ−ｌｉｋｅ ｓｏｒｔｉｎｇ ｍｏｔｉｆｓ
．（２００５）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８７，４９２８−４９３４）。高レベルのト
ランスアシル化は、ソルターゼ切断部位を、基質のＣ末端（Ｐｏｐｐ Ｍ．Ｗ．，Ａｎｔ
ｏｓ Ｊ．Ｍ．，Ｇｒｏｔｅｎｂｒｅｇ Ｇ．Ｍ．，Ｓｐｏｏｎｅｒ Ｅ．，Ｐｌｏｅｇ
ｈ Ｈ．Ｌ．Ｓｏｒｔａｇｇｉｎｇ：Ａ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ
ｐｒｏｔｅｉｎ ｌａｂｅｌｉｎｇ．（２００７）Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．３１１
，７０７−７０８）および柔軟なループ内（Ｐｏｐｐ Ｍ．Ｗ．，Ａｒｔａｖａｎｉｓ−
Ｔｓａｋｏｎａｓ Ｋ．，Ｐｌｏｅｇｈ Ｈ．Ｌ．Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｆｉｌｔｅｒｉ
ｎｇ ｂｙ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｅ−ｓｉｔｅ ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ ｌｏｏｐ ｉｎ
ＵＣＨＬ３ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ ｓｏｒｔａｇｇｉｎｇ ａｎｄ ｇａｉｎ−ｏｆ
−ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．（２００９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８
４（６），３５９３−３６０２）の双方に配置することにより達成することができる。Ｃ
末端において標識されたタンパク質の場合、最小のＬＰＥＴＧタグ中のグリシンは、Ｃ末
端に配置されないことが重要であり、少なくとも１つのさらなるＣ末端アミノ酸とのペプ
チド結合中に存在しなければならない。さらに、より良好な結合は、追加のグリシンを切
断部位のＣ末端に付加することにより達成され、ＬＰＥＴＧＧを生じる（Ｐｒｉｔｚ Ｓ
．，Ｗｏｌｆ Ｙ．，Ｋｒａｅｔｋｅ Ｏ．，Ｋｌｏｓｅ Ｊ．，Ｂｉｅｎｅｒｔ Ｍ．
，Ｂｅｙｅｒｍａｎｎ Ｍ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ａ
ｃｔｉｖｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ−ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｎｊｕ
ｇａｔｅｓ ｂｙ ｓｏｒｔａｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｌｉｇａｔｉｏｎ．（２００７
）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．７２，３９０９−３９１２；Ｔａｎａｋａ Ｔ．，Ｙａｍａｍ
ｏｔｏ Ｔ．，Ｔｓｕｋｉｊｉ Ｓ．，Ｎａｇａｍｕｎｅ Ｔ．Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆ
ｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｎ ｌｉｖｉｎｇ ｃｅｌｌｓ
ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｂｙ ｓｏｒｔａｓｅ．（２００８）Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ ９
５，８０２−８０７）。ソルターゼ媒介性トランスペプチド化に適合する求核剤は、遊離
アミノ末端を持つ、長く伸びたグリシン残基の単一構造要件を有する。良好なトランスペ
プチド化は、１〜５個のグリシンをどこかに含有する求核剤を用いて達成することができ
るが、好適な実施形態において、最大反応率は、２個または３個のグリシンが存在すると
きに得られる。
タンパク質−タンパク質共役に関して、共役化学の様々な実施形態が記載されたが、本
発明を実施する際に、ＸＴＥＮ−ペイロード共役体のペイロード部分は、標的小分子薬中
に存在する、アミン、スルフヒドリル、カルボキシル等の官能基に適用可能な共役方法に
おいて、小分子薬であり得ることが特に意図される。当業者であれば、官能性が、通常、
アミノ、スルフヒドリル、およびカルボキシル基に限定されるタンパク質およびペプチド
と比較して、さらにより広範な化学技法を適用できることを理解するであろう。薬物ペイ
ロードは、官能基を通じてＸＴＥＮに共役され得、第１級アミノ基、アミノキシ、ヒドラ
ジド、ヒドロキシル、チオール、チオール酸塩、コハク酸塩（ＳＵＣ）、スクシンイミジ
ルコハク酸塩（ＳＳ）、スクシンイミジルプロピオン酸塩（ＳＰＡ）、スクシンイミジル
ブタン酸塩（ＳＢＡ）、スクシンイミジルカルボキシメチル酸塩（ＳＣＭ）、ベンゾトリ
アゾール炭酸塩（ＢＴＣ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、ｐ−ニトロフェ
ニル炭酸塩（ＮＰＣ）が挙げられるが、これらに限定されない。薬物分子ペイロードの他
の適した反応性官能基としては、アセタール、アルデヒド（例えば、アセトアルデヒド、
プロピオンアルデヒド、およびブチルアルデヒド）、アルデヒド水和物、アルケニル、ア
クリル酸塩、メタクリル酸塩、アクリルアミド、活性スルホン、酸ハロゲン化物、イソシ
アン酸塩、イソチオシアン酸塩、マレイミド、ビニルスルホン、ジチオピリジン、ビニル
ピリジン、ヨードアセトアミド、エポキシド、グリオキサル、ジオン、メシル酸塩、トシ
ル酸塩、およびトレシル酸塩が挙げられる。
別の実施形態において、薬物ペイロードは、１つ以上の環原子がヘテロ原子、例えば、
窒素、酸素、リン、または硫黄原子である複素環式環系を使用して、ＸＴＥＮ−架橋剤共
役体に共役され得る。複素環基は、少なくとも１個〜２０個もの炭素原子、ならびにＮ、
Ｏ、Ｐ、およびＳから選択される１〜３個のヘテロ原子を含む。この実施形態において、
複素環は、３〜７個の環員（２〜６個の炭素原子、ならびにＮ、Ｏ、Ｐ、およびＳから選
択される１〜３個のヘテロ原子）を有する単環、または７〜１０個の環員（４〜９個の炭
素原子、ならびにＮ、Ｏ、Ｐ、およびＳから選択される１〜３個のヘテロ原子）を有する
二環、例えば、ビシクロ［４，５］、［５，５］、［５，６］、または［６，６］系であ
り得る。複素環は、Ｐａｑｕｅｔｔｅ，Ｌｅｏ Ａ．″Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｍ
ｏｄｅｒｎ Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ″，Ｗ．Ａ．Ｂｅｎｊａｍ
ｉｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９６８）、″Ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｈｅｔ
ｅｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，Ａ ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ Ｍｏｎｏｇｒａｐ
ｈｓ″（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９５０から現在）
、特に第１３、１４、１６、１９、および２８巻に記載されている。共役に適した薬物中
に見出され得る複素環の非限定例としては、ピリジル、ジヒドロピリジル、テトラヒドロ
ピリジル（ピペリジル）、チアゾリル、テトラヒドロチオフェニル、酸化硫黄テトラヒド
ロチオフェニル、ピリミジニル、フラニル、チエニル、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾ
リル、テトラゾリル、ベンゾフラニル、チアナフタレニル、インドリル、インドレニル、
キノリニル、イソキノリニル、ベンズイミダゾリル、ピペリジニル、４−ピペリドニル、
ピロリジニル、２−ピロリドニル、ピロリニル、テトラヒドロフラニル、ビス−テトラヒ
ドロフラニル、テトラヒドロピラニル、ビス−テトラヒドロピラニル、テトラヒドロキノ
リニル、テトラヒドロイソキノリニル、デカヒドロキノリニル、オクタヒドロキノリニル
、アゾシニルトリアジニル、６Ｈ−１，２，５−チアジアジニル、２Ｈ，６Ｈ−１，５，
２−ジチアジニル、チエニル、チアントレニル、ピラニル、イソベンゾフラニル、クロメ
ニル、キサンテニル、フェノキサチニル、２Ｈ−ピロリル、イソチアゾリル、イソキサゾ
リル、ピラジニル、ピリダジニル、インドリジニル、イソインドリル、３Ｈ−インドリル
、１Ｈ−インダゾリル、プリニル、４Ｈ−キノリジニル、フタラジニル、ナフチリジニル
、キノキサリニル、キナゾリニル、シンノリニル、プテリジニル、４Ａｈ−カルバゾリル
、カルバゾリル、β−カルボリニル、フェナントリジニル、アクリジニル、ピリミジニル
、フェナントロリニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フラザニル、フェノキサジニ
ル、イソクロマニル、クロマニル、イミダゾリジニル、イミダゾリニル、ピラゾリジニル
、ピラゾリニル、ピペラジニル、インドリニル、イソインドリニル、キヌクリジニル、モ
ルホリニル、オキサゾリジニル、ベンゾトリアゾリル、ベンズイソキサゾリル、オキシン
ドリル、ベンゾキサゾリニル、およびイサチノイルが挙げられる。
ペイロードとして薬物を持つＸＴＥＮ−ペイロード共役体のいくつかの実施形態におい
て、薬物分子は、薬物およびＸＴＥＮに結合するための２つの反応部位を有する架橋剤に
より、リジンまたはシステイン操作されたＸＴＥＮ（例えば、表３の配列）に付着される
。好適な架橋剤群は、循環中の加水分解に対し比較的安定であり、共役体から切断される
ときに非毒性であるものである。さらに、架橋剤の使用は、薬物とＸＴＥＮとの間にさら
に優れた柔軟性を持つ共役体の可能性を提供するか、またはＸＴＥＮが、ファルマコフォ
アとその結合部位との間の結合を干渉しないように、薬物とＸＴＥＮとの間に十分な空間
を提供する。一実施形態において、架橋剤は、ＸＴＥＮ上に存在する求核基に対し反応性
である求電子基を有する反応部位を有する。好適な求核剤としては、チオール、チオール
酸塩、および第１級アミンが挙げられる。リジンまたはシステイン操作されたＸＴＥＮの
求核基のヘテロ原子は、架橋剤上の求電子基に対して反応性であり、架橋剤単位への共有
結合を形成し、ＸＴＥＮ−架橋剤共役体を形成する。架橋剤に有用な求電子基としては、
限定されないが、マレイミドおよびハロアセトアミド基が挙げられ、 ＸＴＥＮへの付着
に便利な部位を提供する。別の実施形態において、架橋剤は、共役が、ＸＴＥＮ−架橋剤
とペイロード薬物との間に発生し、ＸＴＥＮ−薬物共役体をもたらすことができるように
、薬物上に存在する求電子基に対して反応性である求核基を有する反応部位を有する。薬
物上の有用な求電子基としては、ヒドロキシル、チオール、アルデヒド、アルケン、アル
カン、アジド、およびケトンカルボニル基が挙げられるが、これらに限定されない。架橋
剤の求核基のヘテロ原子は、薬物上の求電子基と反応し、共有結合を形成することができ
る。架橋剤上の有用な求核基としては、ヒドラジド、オキシム、アミノ、ヒドラジン、チ
オセミカルバゾン、カルボン酸ヒドラジン、およびアリールヒドラジドが挙げられるが、
これらに限定されない。薬物上の求電子基は、架橋剤への付着に便利な部位を提供する。
特定の実施形態において、対象のリジン操作されたＸＴＥＮのリジンεアミノ基への薬
物の共役は、反応性薬物−Ｎ−ヒドロキシルスクシンイミド反応物、または薬物−スクシ
ンイミジルプロピオン酸塩、薬物−スクシンイミジルブタン酸塩、または他の薬物−スク
シンイミド共役体等のエステルを利用する。代替として、対象のリジン操作されたＸＴＥ
Ｎのリジン残基を使用し、２−イミノチオランとの反応を通じて遊離スルフヒドリル基を
導入してもよい。代替として、対象のリジン操作されたＸＴＥＮの標的基質リジンは、活
性薬剤との共役に使用可能な遊離ヒドラジドまたはアルデヒド基を有するヘテロ二官能性
試薬に結合されてもよい。反応性エステルは、生理的ｐＨで共役することができるが、反
応性の低い誘導体は、典型的に、より高いｐＨ値を必要とする。不安定なタンパク質ペイ
ロードが使用されている場合は、低温が用いられてもよい。低温条件下で、より長い反応
時間が共役反応に使用され得る。
別の特定の実施形態において、本発明は、対象のリジン操作されたＸＴＥＮのリジン残
基とのアミノ基共役を持つＸＴＥＮ−ペイロード共役体を提供し、共役は、Ｎ末端アミノ
酸のα−アミノ基のｐＫａ値（約７．６〜８．０）とリジンのε−アミノ基のｐＫａ（約
１０）との間の差によって促進される。末端アミノ基の共役は、多くの場合、アミンに対
してより選択的であり、したがって、例えば、ヒスチジンのイミダゾール基と反応する可
能性が低い、反応性薬物−アルデヒド（例えば、薬物−プロピオンアルデヒドまたは薬物
−ブチルアルデヒド）を用いる。さらに、アミノ残基は、コハク酸もしくは他のカルボン
酸無水物、またはＮ，Ｎ’−ジスクシンイミジル炭酸塩（ＤＳＣ）、Ｎ，Ｎ’−カルボニ
ルジイミダゾール（ＣＤＩ）、またはｐ−ニトロフェニルクロロギ酸塩と反応し、それぞ
れ活性化されたスクシンイミジル炭酸塩、イミダゾールカルバミン酸塩、またはｐ−ニト
ロフェニル炭酸塩を生じる。これらの薬剤との誘導体化は、リジニル残基の電荷を逆にす
る効果を有する。対象のＸＴＥＮの末端アミノ基への薬物−アルデヒドの共役は、典型的
に、適切な緩衝液中で起こり、リジン残基のε−アミノ基とタンパク質のＮ末端残基のα
−アミノ基のとの間のｐＫａ差を利用することを可能にする。この実施形態の方法におい
て、連結のための反応は、約ｐＨ７〜最大約８の範囲のｐＨを使用する。リジンεアミノ
基の共役に有用な方法は、米国特許第４，９０４，５８４号および米国特許第６，０４８
，７２０号に記載されている。
当業者であれば、ＸＴＥＮ−ペイロード共役体の創製に使用される活性化方法および／
または共役化学は、ＸＴＥＮポリペプチドの反応基ならびに薬物部分の官能基（例えば、
アミノ、ヒドロキシル、カルボキシル、アルデヒド、スルフヒドリル、アルケン、アルカ
ン、アジド等である）、薬物架橋剤反応物の官能基、またはＸＴＥＮ−架橋剤反応物の官
能基に依存することに気付くであろう。薬物共役は、操作されたＸＴＥＮポリペプチド上
の全ての使用可能な付着基、例えば、組み込まれたシステイン残基またはリジン残基上の
特定の操作された付着基への共役に向けられ得る。共役が適切な反応部位に配向されるよ
うに反応物を制御するために、本発明は、共役反応中の保護基の使用を企図する。「保護
基」は、ある反応条件下で、分子中の特定の化学反応性官能基の反応を回避またはブロッ
クする部分である。保護基は、保護される化学反応基の種類、ならびに用いられる反応条
件、ならびに分子中の追加の反応基の存在に応じて異なる。保護され得る官能基の非限定
例としては、カルボン酸基、ヒドロキシル基、アミノ基、チオール基、およびカルボニル
基が挙げられる。カルボン酸およびヒドロキシルの代表的な保護基としては、エステル（
例えば、ｐ−メトキシベンジルエステル）、アミド、およびヒドラジド；アミノ基の場合
は、カルバミン酸塩（例えば、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）およびアミド；ヒドロキ
シル基の場合は、エーテルおよびエステル；チオール基の場合は、チオエーテルおよびチ
オエステル；カルボニル基の場合は、アセタールおよびケタール等が挙げられる。そのよ
うな保護基は、当業者には周知であり、例えば、Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｇ．Ｍ
．Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈ
ｅｓｉｓ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｗｉｌｅｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９
９、およびそこに引用されている参照文献に記載されている。共役は、１ステップ、また
は段階的方法で（例えば、第ＷＯ９９／５５３７７号に記載される）、例えば、反応中間
体架橋剤の付加を通じて、本明細書に開示される架橋剤、または薬物分子上の反応性官能
基に結合されるポリペプチドのシステインまたはリジン残基への共役に有用であることが
知られている架橋剤を使用して達成され得る。
本発明のいくつかの実施形態において、架橋剤をシステイン操作されたＸＴＥＮに共役
するための方法は、ＸＴＥＮが、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）等の還元剤で前処理され
、任意のシステインジスルフィド残基を還元して、高度に求核性のシステインチオール基
（−ＣＨ２ＳＨ）を形成することを提供し得る。還元剤は、脱塩等の任意の従来方法によ
って後次に除去される。したがって、還元されたＸＴＥＮは、例えば、Ｋｌｕｓｓｍａｎ
ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １５（４
），７６５−７７３の共役方法に従い、求電子性官能基（例えば、マレイミドまたはα−
ハロカルボニル）を持つ薬物−リンカー化合物または架橋剤試薬と反応する。システイン
残基への架橋剤または薬物の共役は、典型的に、ｐＨ６〜９の適切な緩衝液中、４℃〜２
５℃の範囲の温度で最長約１６時間起こる。代替として、システイン残基は誘導体化され
得る。適切な誘導体化剤および方法は、当該技術分野において周知である。例えば、シス
テイニル残基は、最も一般的に、ヨード酢酸またはヨードアセトアミド等のα−ハロ酢酸
塩（および対応するアミン）と反応し、カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル
誘導体を生じる。システイニル残基も、ブロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−
（４−イミドゾイル）プロピオン酸、クロロアセチルリン酸塩、Ｎ−アルキルマレイミド
、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロ
ロメルクリ安息香酸塩、２−クロロメルクリ−４−ニトロフェノール、またはクロロ−７
−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールとの反応によって誘導体化される。
場合によっては、共役は、使用可能なＸＴＥＮ付着基のうちの可能な限り多くを、薬物
または薬物−リンカー分子と反応させることを目的とする条件下で行われる。これは、ポ
リペプチドに関する薬物の適切なモル過剰により達成される。活性化薬物または薬物−リ
ンカー分子：ポリペプチドの典型的なモル比は、最大約１０００：１、例えば、最大約２
００：１、または最大約１００：１である。しかしながら、場合によって、この比率は、
いくらか低い場合がある（例えば、最大約５０：１、１０：１、または５：１）。等モル
比も使用され得る。
実施形態において、開示のＸＴＥＮ−ペイロード共役体は、ＸＴＥＮに結合されていな
い対応するペイロードと比較して、薬理活性の少なくとも一部分を保持する。一実施形態
において、ＸＴＥＮ−ペイロードは、ＸＴＥＮに結合されていないペイロードの薬理活性
の少なくとも約１％、または少なくとも約５％、または少なくとも約１０％、または少な
くとも約２０％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％、または少なく
とも約５０％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくと
も約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％を保持する。
一実施形態において、ＸＴＥＮ−ペイロード共役体は、ジスルフィド結合還元、ｐＨ依
存性放出を含むリンカーの非特異的または酵素的加水分解によって、または表９のプロテ
アーゼを含む外因性もしくは内因性プロテアーゼによって、体内でペイロードを放出する
ように設計することができる。巨大分子は、受容体媒介性エンドサイトーシス、吸着性エ
ンドサイトーシス、または液相エンドサイトーシスのいずれかを通じて細胞により吸収さ
れ得る（Ｊａｉｎ Ｒ．Ｋ．Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ａｃｒｏ
ｓｓ ｔｕｍｏｒ ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ．（１９８７）Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔ
ａｓｉｓ Ｒｅｖ．６（４），５５９−５９３；Ｊａｉｎ Ｒ．Ｋ．Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ
ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，ｐａｒｔｉｃｌｅｓ，ａｎｄ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｓｏｌ
ｉｄ ｔｕｍｏｒｓ．（１９９９）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１，２４１
−２６３；Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ Ｓ．，Ｇｈｏｓｈ Ｒ．Ｎ．，Ｍａｘｆｉｅｌｄ Ｆ．
Ｒ．Ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ．（１９９７）Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．７７（３），７５
９−８０３）。ＸＴＥＮ−ペイロードの細胞取り込み時に、ペイロードは、エンドソーム
中の低いｐＨ値（ｐＨ５．０〜６．５）およびリソソーム（ｐＨ４．５〜５．０）、なら
びにリソソーム酵素（例えば、エステラーゼおよびプロテアーゼ）によって放出され得る
。酸感受性架橋剤の例は、チオール担持担体に結合され得る６−マレイミドドカプロイル
ヒドラゾンである。ヒドラゾンリンカーは、５未満のｐＨ値で急速に切断され、共役体の
内在化に続いて、酸性ｐＨのエンドソームおよびリソソーム中のペイロードの放出を可能
にする（Ｔｒａｉｌ Ｐ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｌｉｎｋｅｒ ｖａｒ
ｉａｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ，ｐｏｔｅｎｃｙ，ａｎｄ ｅｆｆｉ
ｃａｃｙ ｏｆ ｃａｒｃｉｎｏｍａ−ｒｅａｃｔｉｖｅ ＢＲ６４−ｄｏｘｏｒｕｂｉ
ｃｉｎ ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７
（１），１００−１０５；Ｋｒａｔｚ Ｆ． ｅｔ ａｌ． Ａｃｕｔｅ ａｎｄ ｒｅ
ｐｅａｔ−ｄｏｓｅ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ（６−ｍａｌｅ
ｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌ）ｈｙｄｒａｚｏｎｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ ｏｆ ｄｏｘ
ｏｒｕｂｉｃｉｎ（ＤＯＸＯ−ＥＭＣＨ），ａｎ ａｌｂｕｍｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐ
ｒｏｄｒｕｇ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ａｇｅｎｔ ｄｏｘｏｒｕｂｉｃ
ｉｎ．（２００７）Ｈｕｍ．Ｅｘｐ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．２６（１），１９−３５）。臨床
的に承認されたｍＡｂ−薬物共役体、ゲムツズマブオゾガマイシン（Ｍｙｌｏｔａｒｇ（
商標））は、細胞毒性抗生物質剤カリケアマイシンに化学的に結合されたＣＤ３３に対す
るヒト化ｍＡｂ Ｐ６７．６を含有する薬物−抗体共役体である。抗体と薬物との間のリ
ンカーは、２つの不安定な結合（ヒドラゾンおよび立体障害のジスルフィド）を組み込む
。酸感受性ヒドラゾン結合は、実際の切断部位であることが示された（Ｊａｒａｃｚ Ｓ
．，Ｃｈｅｎ Ｊ．，Ｋｕｚｎｅｔｓｏｖａ Ｌ．Ｖ．，Ｏｊｉｍａ Ｉ．Ｒｅｃｅｎｔ
ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｔｕｍｏｒ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ
ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．（２００５）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１３
（１７），５０４３−５０５４）。
ペイロードがジスルフィド結合によって結合されるそれらのＸＴＥＮ−ペイロード共役
体の場合、ペイロードは、不安定なリンカー内のジスルフィド結合の還元によってＸＴＥ
Ｎから放出され得る。例えば、ｈｕＮ９０１−ＤＭ１は、小細胞肺癌の処置のためにＩｍ
ｍｕｎｏＧｅｎ，Ｉｎｃ．によって開発された腫瘍活性化免疫療法プロドラッグである。
プロドラッグは、微小管阻害剤メイタンシノイドＤＭ１で共役されたヒト化抗ＣＤ５６
ｍＡｂ（ｈｕＮ９０１）からなる。ＤＭ１の３．５〜３．９分子の平均は、障害されたジ
スルフィド結合を介して各抗体に結合される。ジスルフィド結合は、血液中で安定してい
るが、ｈｕＭ９０１によって標的細胞に侵入するときに急速に切断され、したがって活性
ＤＭ１を放出する（Ｓｍｉｔｈ Ｓ．Ｖ．Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ
：ｈｕＮ９０１−ＤＭ１，ＩｍｍｕｎｏＧｅｎ．（２００５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏ
ｌ．Ｔｈｅｒ．７（４），３９４−４０１）。ＤＭ１は、抗前立腺特異的膜抗原ｍＡｂで
あるＭｉｌｌｅｎｎｉｕｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ＭＬＮ−５９１にも連結
された。ＤＭ１は、内在化時の細胞内薬物放出を可能にするのと同時に、血清安定性を提
供する障害されたジスルフィド結合を介して抗体に結合される（Ｈｅｎｒｙ Ｍ．Ｄ．ｅ
ｔ ａｌ．Ａ ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｎｔｉｇｅ
ｎ−ｔａｒｇｅｔｅｄ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ
ａｐｅｕｔｉｃ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔ
ｍｅｎｔ ｏｆ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ．（２００４）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ
．６４（２１），７９９５−８００１）。
担体ＸＴＥＮからのペイロードの放出は、短い切断可能なペプチドを、ペイロードとＸ
ＴＥＮとの間のリンカーとして使用する組成物を創製することによって達成することがで
きる。臨床的に評価された共役体の例は、ドキソルビシン−ＨＰＭＡ（Ｎ−（２−ヒドロ
キシプロピル）メタクリルアミド）共役体であり、ドキソルビシンが、そのアミノ糖を通
じて、カテプシンＢ等のリソソームプロテアーゼにより切断されるテトラペプチドスペー
サーＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙを介して、ＨＰＭＡコポリマーに結合される（Ｖａｓｅｙ
Ｐ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｐｈａｓｅ Ｉ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏ
ｋｉｎｅｔｉｃ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ＰＫ１［Ｎ−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ）
ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ］：ｆｉ
ｒｓｔ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ａ ｎｅｗ ｃｌａｓｓ ｏｆ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐ
ｅｕｔｉｃ ａｇｅｎｔｓ−ｄｒｕｇ−ｐｏｌｙｍｅｒ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．（１９
９９）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５（１），８３−９４）。開発の臨床段階に到
達したペプチドリンカーとの担体−薬物共役体の他の例は、巨大分子白金錯体である。２
つのＨＰＭＡ系薬物候補は、ＨＰＭＡコポリマー骨格からなり、複雑なアミノマロン酸白
金錯体は、カテプシンＢ切断可能なペプチドスペーサーＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙまたは
トリペプチドスペーサーＧｌｙＧｌｙＧｌｙを通じて結合された（Ｒａｄｅｍａｋｅｒ−
Ｌａｋｈａｉ Ｊ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．Ａ Ｐｈａｓｅ Ｉ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏ
ｌｏｇｉｃａｌ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｅ ｐｌａｔｉｎｕｍ ｐｏｌｙｍｅｒ ＡＰ
５２８０ ｇｉｖｅｎ ａｓ ａｎ ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｉｎｆｕｓｉｏｎ ｏｎ
ｃｅ ｅｖｅｒｙ ３ ｗｅｅｋｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｓｏｌｉｄ
ｔｕｍｏｒｓ．（２００４）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１０（１０），３３８６
−３３９５；Ｓｏｏｄ Ｐ． ｅｔ ａｌ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｃｈａｒａｃ
ｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＡＰ５３４６，ａ ｎｏｖｅｌ ｐｏｌｙｍｅｒ−ｌｉｎ
ｋｅｄ ｄｉａｍｉｎｏｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ ｐｌａｔｉｎｕｍ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ
ａｐｅｕｔｉｃ ａｇｅｎｔ．（２００６） Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１
７（５），１２７０−１２７９）。
高度に選択的な方法は、前立腺組織および前立腺癌においてほぼ優先的に発現される、
前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）プロテアーゼを介して前立腺癌を標的とするように開発され
た。パクリタキセルの新規のアルブミン結合プロドラッグ、ＥＭＣ−ＡｒｇＳｅｒＳｅｒ
ＴｙｒＴｙｒＳｅｒＬｅｕ−ＰＡＢＣ−パクリタキセル（ＥＭＣ：ε−マレイミドカプロ
イル、ＰＡＢＣ：ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル）が合成された。このプロドラッ
グは、水溶性であり、内因性および外因性アルブミンに結合された。このプロドラッグの
アルブミン結合形態は、パクリタキセル−ジペプチドＳｅｒ−Ｌｅｕ−ＰＡＢＣ−パクリ
タキセルを放出するＰＳＡによって切断された。ＰＡＢＣ自己排除リンカーの組込みに起
因して、このジペプチドは、急速に分解され、パクリタキセルを最終切断産物として遊離
させた（Ｅｌｓａｄｅｋ Ｂ． ｅｔ ａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｎｏ
ｖｅｌ ｐｒｏｄｒｕｇ ｏｆ ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ ｔｈａｔ ｉｓ ｃｌｅａｖｅ
ｄ ｂｙ ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ：ａｎ ｉｎ ｖｉｔ
ｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｓｔｕｄｙ．（２０１０）Ｅｕ
ｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ４６（１８），３４３４−３４４４）。
自壊性スペーサーは、プロドラッグ送達系におけるそれらの有用性に起因して、多くの
関心を集めている。いくつかの報告は、単一切断事象によって開始される、ドミノ様鎖フ
ラグメント化を通じて、それらの単位の全てを放出することができる、線状自己排除系ま
たはデンドリマー構造について説明している（Ｈａｂａ Ｋ． ｅｔ ａｌ．Ｓｉｎｇｌ
ｅ−ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ ｔｒｉｍｅｒｉｃ ｐｒｏｄｒｕｇｓ．（２００５）Ａｎｇｅ
ｗ．Ｃｈｅｍ．，Ｉｎｔ．Ｅｄ．４４，７１６−７２０；Ｓｈａｂａｔ Ｄ．Ｓｅｌｆ−
ｉｍｍｏｌａｔｉｖｅ ｄｅｎｄｒｉｍｅｒｓ ａｓ ｎｏｖｅｌ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉ
ｖｅｒｙ ｐｌａｔｆｏｒｍｓ．（２００６）Ｊ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．，Ｐａｒｔ Ａ
：Ｐｏｌｙｍ．Ｃｈｅｍ．４４，１５６９−１５７８．Ｗａｒｎｅｃｋｅ Ａ．，Ｋｒａ
ｔｚ Ｆ．２，４−Ｂｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｎｉｌｉｎｅ ａｓ ａ
ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｂｌｏｃｋ ｆｏｒ ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ ｗｉｔｈ ｓｅｌｆ−ｅ
ｌｉｍｉｎａｔｉｎｇ ａｎｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒｅｌｅａｓｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉ
ｅｓ．（２００８）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．７３，１５４６−１５５２；Ｓａｇｉ Ａ．
ｅｔ ａｌ．Ｓｅｌｆ−ｉｍｍｏｌａｔｉｖｅ ｐｏｌｙｍｅｒｓ．（２００８）Ｊ．Ａ
ｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３０，５４３４−５４３５）。一研究において、抗癌剤カンプ
トテシンの４つの分子、およびＰＥＧ５０００の２つの分子を持つ自壊性樹状プロドラッ
グが設計され、合成された。プロドラッグは、生理学的条件下で、ペニシリン−Ｇ−アミ
ダーゼによって効果的に活性化され、遊離カンプトテシンは、反応媒体に放出され、細胞
成長阻害を引き起こした（Ｇｏｐｉｎ Ａ．ｅｔ ａｌ． Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｃｔ
ｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｃｏｎｄ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｐ
ｒｏｄｒｕｇｓ：ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｌｆ−ｉｍｍｏｌａｔｉｖｅ ｄ
ｅｎｄｒｉｍｅｒｓ ｗｉｔｈ ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）ｖｉａ
ｃｌｉｃｋ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．（２００６）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．
１７，１４３２−１４４０）。腫瘍細胞中に過剰発現されるプロテアーゼにより切断され
、特定の酵素基質の組込みは、高度に効率的な癌細胞特異的樹状プロドラッグ活性化系を
生成することができる。プロテアーゼにより切断可能なスペーサー配列の非限定例は、表
９に列挙される。
いくつかの実施形態において、本発明は、二量体、三量体、四量体、およびより高次の
共有体を含む、ＸＴＥＮ−ペイロード構成を提供し、ペイロードは、本明細書において上
述される不安定なリンカーを使用してＸＴＥＮに付着される。前述の一実施形態において
、組成物は、標的細胞上のリガンドまたは受容体に組成物を送達するための標的化成分を
さらに含む。別の実施形態において、本発明は、１つ、２つ、３つ、または４つのＸＴＥ
Ｎ−ペイロード組成物が、抗体または抗体フラグメントへの不安定なリンカーと共役され
、限定されないが、腫瘍および他の癌の様々な処置等の臨床適応の標的療法において使用
するための可溶性組成物を提供する、共役体を提供し、抗体は、標的化成分を提供し、次
いで、標的細胞内で内在化されるときに、不安定なリンカーは、ＸＴＥＮ−ペイロードが
組成物から解離するのを許し、意図される活性（例えば、腫瘍細胞中の細胞毒性）を生じ
させる。したがって、本発明の組成物は、免疫共役体の一種である。
非構造化特徴、および均一な組成物、およびＸＴＥＮの電荷は、共役反応に続いて、Ｘ
ＴＥＮ−ペイロード共役体の精製のために利用されることができる特性をもたらす。特に
、有用性は、イオン交換によるＸＴＥＮ共役体の捕捉であり、これは未反応のペイロード
およびペイロード誘導体の除去を可能にする。特に、有用性は、疎水性相互作用クロマト
グラフィー（ＨＩＣ）による共役体の捕捉である。それらの親水性性質に起因して、ほと
んどのＸＴＥＮポリペプチドは、ＨＩＣ樹脂への低い結合を示し、これはペイロードとカ
ラム材料との間の疎水性相互作用に起因して、ＸＴＥＮ−ペイロード共役体の捕捉、およ
び共役プロセス中のペイロードへの共役に失敗した非共役ＸＴＥＮからのそれらの分離を
促進する。高純度のＸＴＥＮおよびＸＴＥＮ−ペイロード共役体は、ほとんどの化学ポリ
マーまたは天然ポリマー、特にペグ化ペイロードと比較して、著しい利点を提供する。ほ
とんどの化学ポリマーおよび天然ポリマーは、ランダムまたは半ランダム重合により産生
され、多くの相同体の生成をもたらす。そのようなポリマーは、産物中の標的実体の分画
を増加させるための様々な方法によって分画され得る。しかしながら、富化後であっても
、天然ポリマーおよびそれらのペイロード共役体のほとんどの調製物は、１０％未満の標
的実体を含有する。Ｇ−ＣＳＦを持つＰＥＧ共役体の例は、［Ｂａｇａｌ，Ｄ．，ｅｔ
ａｌ．（２００８）Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ，８０：２４０８−１８］に記載されている。こ
の刊行物は、治療使用に承認されるＰＥＧ共役体も、標的実体の少なくとも１０％の濃度
で発生する１００個超の相同体を含有することを示す。
ＰＥＧ等のランダムポリマーの複雑性は、共役および精製中の監視および品質制御にと
って重大な障害である。対照的に、本明細書に記載される方法によって精製されたＸＴＥ
Ｎは、高レベルの純度および均一性を有する。さらに、本明細書に記載されるように創製
された共役体は、日常的に、意図される標的の約８０％、９０％、９１％、９２％、９３
％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％超を意図される構成で含有
し、質量分析およびクロマトグラムの解釈を容易にする。

２． 単量体ＸＴＥＮ−架橋剤、およびＸＴＥＮ−ペイロード構成
別の態様において、本発明は、ＸＴＥＮ−架橋剤共役体、および単一ＸＴＥＮを持つＸ
ＴＥＮ−ペイロード共役体を提供し、共役体は異なる構成で設計される。そのような共役
体の例示的な構成は以下の通りである。
一実施形態において、本発明は、式ＩＶ：
の構成を有する共役体を提供し、式中、独立して、各発生時に、ＣＬ１は、架橋剤であり
、ｘは、１〜約１００、または１〜約５０、または１〜約４０、または１〜約２０、また
は１〜約１０、または１〜約５の整数であるか、または９であるか、または３であるか、
または２であるか、または１であり、ＸＴＥＮは、表２および３に記載される配列の群か
ら選択される配列に対して少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少な
くとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なく
とも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくと
も約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％、または１００％の
配列同一性を有する配列である。式ＩＶの共役体の一実施形態において、ＣＬ１は、表１
３から選択される架橋剤である。式ＩＶの共役体の別の実施形態において、ｘは、前述の
範囲を有し、表１３の架橋剤は、ＸＴＥＮの各システイン硫黄に結合される。式ＩＶの共
役体の別の実施形態において、ｘは、前述の範囲を有し、架橋剤は、ＸＴＥＮの各リジン
εアミノ基に結合される。式ＶＩの共役体の別の実施形態において、ｘは１であり、表１
３の架橋剤は、ＸＴＥＮのＮ末端アミノ基に結合される。特定の成分を使用してＸＴＥＮ
に共役された架橋剤を含む前述の実施形態の組成物が、個別の反応物の反応産物を表し、
したがって反応物の精密な組成物とは異なることは、当業者によって理解されるであろう
。別の実施形態において、本発明は、式ＩＶの共役体の調製物を提供し、この共役体の調
製物のＸＴＥＮ分子の少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくと
も約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも
約９４％、または少なくとも約９５％は、同一配列長を有する。
別の実施形態において、本発明は、式Ｖ：
の構成を有する共役体を提供し、式中、独立して、各発生に対し、ＣＬ１は、架橋剤であ
り、ｘは、１〜約１００、または１〜約５０、または１〜約４０、または１〜約２０、ま
たは１〜約１０、または１〜約５の整数であるか、または９であるか、または３であるか
、または２であるか、または１であり、ＣＬ２は、ＣＬ１とは異なる架橋剤であり、ｙは
、１〜約１００、または１〜約５０、または１〜約４０、または１〜約２０、または１〜
約１０、または１〜約５の整数であるか、または９であるか、または３であるか、または
２であるか、または１であるが、但し、ｘ＋ｙ＞２を条件とし、ＸＴＥＮは、表２および
３に記載される配列の群から選択される配列に対して少なくとも約８０％、または少なく
とも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくと
も約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも
約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約
９９％、または１００％の配列同一性を有する配列である。式Ｖの共役体の一実施形態に
おいて、ＣＬ１およびＣＬ２は、それぞれ、表１３に記載される架橋剤の群から選択され
る。式Ｖの共役体の一実施形態において、ｘは、前述の範囲を有し、各ＣＬ１は、ＸＴＥ
Ｎの各リジンのεアミノ基に結合され、ｙは、前述の範囲を有し、各ＣＬ２は、ＸＴＥＮ
の各システインの硫黄基に結合される。式Ｖの共役体の別の実施形態において、ｘは１で
あり、ＣＬ１は、ＸＴＥＮのＮ末端アミノ基に結合され、各ＣＬ２は、ＸＴＥＮのシステ
イン硫黄基に結合される。特定の成分を使用してＸＴＥＮに共役された架橋剤を含む前述
の実施形態の組成物が、反応物の反応産物を表し、したがって反応物の精密な組成物とは
異なることは、当業者によって理解されるであろう。別の実施形態において、本発明は、
式Ｖの共役体の調製物を提供し、この共役体の調製物のＸＴＥＮ分子の少なくとも約８０
％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％
、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％は
、同一配列長を有する。
別の態様において、本発明は、定義された構成を有するＸＴＥＮ−ペイロード共役体を
提供する。本発明は、ペイロードの反応性分子が、化学反応によって接合され得る、本明
細書に記載の反応性ＸＴＥＮ−架橋剤共役パートナー組成物を利用する。
一実施形態において、本発明は、式ＶＩ：
の構成を有する共役体を提供し、式中、独立して、各発生時に、ＰＲ１は、ペイロードの
単一原子残基であり、残基は、炭素、窒素、酸素、および硫黄からなる群から選択され、
ＣＬ１は、架橋剤であり、ｘは、１〜約１００、または１〜約５０、または１〜約４０、
または１〜約２０、または１〜約１０、または１〜約５の整数であるか、または３である
か、または２であるか、または１であり、ＸＴＥＮは、表２および３に記載される配列の
群から選択される配列に対して少なくとも８０％、または少なくとも約９０％、または少
なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少な
くとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なく
とも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％、または１００％
の配列同一性を有する配列である。式ＶＩの共役体の一実施形態において、ペイロードの
単一原子残基は、表１１、１２、１８、１９、および２１に記載されるペイロードからな
る群から選択されたペイロードに由来する。式ＶＩの共役体の一実施形態において、ＣＬ
１は、表１３から選択される架橋剤である。式ＶＩの共役体の一実施形態において、 各
架橋剤は、ＸＴＥＮのシステイン硫黄に結合される。式ＶＩの共役体の別の実施形態にお
いて、各架橋剤は、ＸＴＥＮのリジンεアミノ基に結合される。式ＶＩの共役体の別の実
施形態において、ｘは１であり、架橋剤は、ＸＴＥＮのＮ末端アミノ基に結合される。式
ＶＩの共役体の別の実施形態において、ＣＬ１は、表１５から選択される第１および第２
のクリック化学反応物の反応産物である。別の実施形態において、本発明は、式ＶＩの共
役体の調製物を提供し、この共役体の調製物のＸＴＥＮ分子の少なくとも約８０％、また
は少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または
少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％は、同一配
列長を有する。
別の実施形態において、本発明は、式ＶＩＩ：
の構成を有する共役体を提供し、式中、独立して、各発生に対し、Ｐ１は、表１１、１２
、１８、１９、および２１に記載されるペイロードからなる群から選択されるペイロード
であり、ＣＬ１は、架橋剤であり、ｘは、１〜約１００、または１〜約５０、または１〜
約４０、または１〜約２０、または１〜約１０、または１〜約５の整数であるか、または
９であるか、または３であるか、または２であるか、または１であり、ＸＴＥＮは、表２
および３に記載される配列の群から選択される配列に対して少なくとも約８０％、または
少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少
なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少な
くとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なく
とも約９９％、または１００％の配列同一性を有する配列である。式ＶＩＩの共役体の一
実施形態において、ＣＬは１、表１３から選択される架橋剤である。式ＶＩＩの共役体の
一実施形態において、各架橋剤は、ＸＴＥＮのシステイン硫黄に結合される。式ＶＩＩの
共役体の別の実施形態において、各架橋剤は、ＸＴＥＮのリジンεアミノ基に結合される
。式ＶＩＩの共役体の別の実施形態において、ｘは１であり、架橋剤は、ＸＴＥＮのＮ末
端アミノ基に結合される。一実施形態において、式ＶＩＩの共役体は、表２１に記載され
る共役体からなる群から選択される。式ＶＩＩの共役体の別の実施形態において、ＣＬ１
は、表１５から選択される第１および第２のクリック化学反応物の反応産物である。特定
の成分を使用してＸＴＥＮ−架橋剤に共役されたペイロードを含む前述の実施形態の組成
物が、反応物の反応産物を表し、したがって反応物の精密な組成物とは異なることは、当
業者によって理解されるであろう。別の実施形態において、本発明は、式ＶＩＩの共役体
の調製物を提供し、この共役体の調製物のＸＴＥＮ分子の少なくとも約８０％、または少
なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少な
くとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％は、同一配列長
を有する。
別の実施形態において、本発明は、式ＶＩＩＩ：
の構成を有する共役体を提供し、式中、独立して、各発生時に、ＰＲ１は、ペイロードの
単一原子残基であり、この残基は、炭素、窒素、酸素、および硫黄からなる群から選択さ
れ、ＰＲ２は、ペイロードの単一原子残基であり、この残基は、炭素、窒素、酸素、およ
び硫黄からなる群から選択され、ＣＬ１は、架橋剤であり、ｘは、１〜約１００、または
１〜約５０、または１〜約４０、または１〜約２０、または１〜約１０、または１〜約５
の整数であるか、または９であるか、または３であるか、または２であるか、または１で
あり、ＣＬ２は、ＣＬ１とは異なる架橋剤であり、ｙは、１〜約１００、または１〜約５
０、または１〜約４０、または１〜約２０、または１〜約１０、または１〜約５の整数で
あるか、または９であるか、または３であるか、または２であるか、または１であるが、
但し、ｘ＋ｙ＞２を条件とし、ＸＴＥＮは、は、表２および３に記載される配列の群から
選択される配列に対して少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なく
とも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくと
も約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも
約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％、または１００％の配
列同一性を有する配列である。式ＶＩＩＩの共役体の一実施形態において、ペイロードの
単一原子残基は、表１１、１２、１８、１９、および２１に記載されるペイロードからな
る群から選択されたペイロードに由来する。式ＶＩＩＩの共役体の一実施形態において、
ＣＬ１およびＣＬ２は、それぞれ、表１３に記載される架橋剤の群から選択される。式Ｖ
ＩＩＩの共役体の一実施形態において、各ＣＬ１は、ＸＴＥＮのリジンεアミノ基に結合
され、各ＣＬ２は、ＸＴＥＮのシステイン硫黄に結合される。式ＶＩＩＩの共役体の別の
実施形態において、ｘは１であり、ＣＬ１は、ＸＴＥＮのＮ末端アミノ基に結合され、Ｃ
Ｌ２は、ＸＴＥＮのシステイン硫黄またはリジンεアミノ基のいずれかに結合される。式
ＶＩＩＩの共役体の別の実施形態において、ＣＬ１は、表１５から選択される第１および
第２のクリック化学反応物の反応産物である。式ＶＩＩＩの共役体の別の実施形態におい
て、Ｃ２は、表１５から選択される第１および第２のクリック化学反応物の反応産物であ
る。別の実施形態において、本発明は、式ＶＩＩＩの共役体の調製物を提供し、この共役
体の調製物のＸＴＥＮ分子の少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少
なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少な
くとも約９４％、または少なくとも約９５％は、同一配列長を有する。
別の実施形態において、本発明は、式ＩＸ：
の構成を有する共役体を提供し、式中、独立して、各発生時に、Ｐ１は、表１１、１２、
１８、１９、および２１に記載されるペイロードからなる群から選択されるペイロードで
あり、Ｐ２は、表１１、１２、１８、１９、および２１に記載されるペイロードからなる
群から選択され、Ｐ１とは異なるペイロードであり、ＣＬ１は、架橋剤であり、ｘは、１
〜約１００、または１〜約５０、または１〜約４０、または１〜約２０、または１〜約１
０、または１〜約５の整数であるか、または９であるか、または３であるか、または２で
あるか、または１であり、ＣＬ２は、ＣＬ１とは異なる架橋剤であり、ｙは、１〜約１０
０、または１〜約５０、または１〜約４０、または１〜約２０、または１〜約１０、また
は１〜約５の整数であるか、または９であるか、または３であるか、または２であるか、
または１であるが、但し、ｘ＋ｙ＞２を条件とし、ＸＴＥＮは、表２および３に記載され
る配列の群から選択される配列に対して少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％
、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、
または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、ま
たは少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％、また
は１００％の配列同一性を有する配列である。式ＩＸの共役体の一実施形態において、ペ
イロードの単一原子残基は、表１１、１２、１８、１９、および２１に記載されるペイロ
ードからなる群から選択されたペイロードに由来する。式ＩＸの共役体の一実施形態にお
いて、ＣＬ１およびＣＬ２は、それぞれ、表１３に記載される架橋剤の群から選択される
。式ＩＸの共役体の一実施形態において、各ＣＬ１は、ＸＴＥＮのリジンεアミノ基に結
合され、各ＣＬ２は、ＸＴＥＮのシステイン硫黄に結合される。式ＩＸの共役体の別の実
施形態において、ｘは１であり、ＣＬ１は、ＸＴＥＮのＮ末端アミノ基に結合され、ＣＬ
２は、ＸＴＥＮのシステイン硫黄またはリジンεアミノ基のいずれかに結合される。式Ｉ
Ｘの共役体の別の実施形態において、ＣＬ１は、表１５から選択される第１および第２の
クリック化学反応物の反応産物である。式ＩＸの共役体の別の実施形態において、Ｃ２は
、表１５から選択される第１および第２のクリック化学反応物の反応産物である。一実施
形態において、式ＩＸの共役体は、表２１に記載される共役体からなる群から選択される
。別の実施形態において、本発明は、式ＩＸの共役体の調製物を提供し、この共役体の調
製物のＸＴＥＮ分子の少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくと
も約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも
約９４％、または少なくとも約９５％は、同一配列長を有する。
３． 二量体、三量体、四量体、および多量体構成のＸＴＥＮ−架橋剤およびＸＴＥＮ−
ペイロード共役体
一態様において、本発明は、異なる数のＸＴＥＮまたはＸＴＥＮ−ペイロード共役パー
トナーが、数値的に定義された構成（例えば、二量体、三量体、四量体、または多量体）
で、リンカーにより接合される共役体を提供する。本明細書において使用される場合、「
前駆体」は、共役反応において反応物として使用され、中間体または最終組成物をもたら
す成分を含むことが意図され、任意の長さのＸＴＥＮセグメント（表２および３のＸＴＥ
Ｎ、または上記の様々な式で表されるＸＴＥＮを含む）、ＸＴＥＮ−架橋剤、ＸＴＥＮ−
ペイロード−架橋剤セグメント、反応基を持つペイロード、リンカー、および本明細書に
記載される他のそのような成分が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、本発明は、２つのＸＴＥＮまたはＸＴＥＮ−ペイロード
前駆体セグメントが、二価架橋剤によって結合され、例えば、図１９Ｃおよび図２７Ｂに
示される、二価構成をもたらす共役体を提供する。二価ＸＴＥＮ−ペイロード共役体の一
実施形態において、各ＸＴＥＮ−ペイロードは、生物学的に活性なペプチドまたはポリペ
プチドを含む単量体融合タンパク質であり得、各融合タンパク質前駆体セグメントは、Ｎ
末端のα−アミノ基によって二価リンカーに結合され、二価共役体をもたらす。二価ＸＴ
ＥＮ−ペイロード共役体の別の実施形態において、各ＸＴＥＮ−ペイロード前駆体セグメ
ントは、生物学的に活性なペプチドまたはポリペプチドを含む単量体融合タンパク質であ
り、各融合タンパク質は、Ｃ末端の二価リンカーに結合され、二価共役体をもたらす。二
価ＸＴＥＮ−ペイロード共役体の別の実施形態において、各ＸＴＥＮは、ＸＴＥＮに共役
された１つ以上のペイロード（ペプチド、ポリペプチド、または薬物であり得る）を含み
、各ＸＴＥＮ前駆体は、Ｎ末端の二価リンカーによって１つ以上の第２の異なるペイロー
ド分子を含む他のＸＴＥＮ前駆体に結合され、二価共役体をもたらす。二価ＸＴＥＮ−ペ
イロード共役体の別の実施形態において、各ＸＴＥＮは、ＸＴＥＮに共役された１つ以上
のペイロード（ペプチド、ポリペプチド、または薬物であり得る）を含み、各ＸＴＥＮ前
駆体は、Ｃ末端のカルボキシル基または修飾基によって１つ以上の第２の異なる二価リン
カーによるペイロード分子を含む他のＸＴＥＮ前駆体に結合され（限定されないが、Ｃ末
端におけるシステインの挿入によって修飾されたＸＴＥＮが挙げられる）、二価共役体を
もたらす。このパラグラフの前述の実施形態において、本開示に照らして当業者によって
理解されるように、結合される前駆体を創製するための異なる手法があり、例えば、リン
カーを第１の前駆体ＸＴＥＮ−ペイロードに共役し、次いで、第２の反応を生じさせて第
２のＸＴＥＮ−ペイロード前駆体の末端の反応基にその前駆体を接合させることである。
代替として、ＸＴＥＮ末端の一方または双方は、次いで、クリック化学によって、または
本明細書に記載されるか、もしくは例示される他の方法によって接合され得る前駆体とし
て修飾されることができ、ＸＴＥＮの交差点を架橋するための残留原子をほとんど残さな
いか、または全く残さない。別の実施形態において、２つのＸＴＥＮ−ペイロード前駆体
配列は、前駆体ＸＴＥＮ−ペイロード反応物の末端、またはその付近に導入されたシステ
インまたはチオール基を使用するジスルフィド架橋によって結合され、二価ＸＴＥＮ−ペ
イロード共役体をもたらす。そのような二価共役体の例示的な構成は以下の通りである。
一実施形態において、本発明は、式Ｘ：
の構成を有する共役体を提供し、式中、独立して、各発生に対し、ＰＲ１は、第１のペイ
ロードの単一原子残基であり、この残基は、炭素、窒素、酸素、および硫黄からなる群か
ら選択され、ＰＲ２は、第２のペイロードの単一原子残基であり、この残基は、炭素、窒
素、酸素、および硫黄からなる群から選択され、ＣＬ１は、架橋剤であり、ｘは、１〜約
１００、または１〜約５０、または１〜約４０、または１〜約２０、または１〜約１０、
または１〜約５の整数であるか、または９であるか、または３であるか、または２である
か、または１であり、ＣＬ２は、ＣＬ１とは異なる架橋剤であり、ｙは、１〜約１００、
または１〜約５０、または１〜約４０、または１〜約２０、または１〜約１０、または１
〜約５の整数であるか、または９であるか、または３であるか、または２であるか、また
は１であるが、但し、ｘ＋ｙ＞２を条件とし、２ｘＣＬは、代替として、二価架橋剤また
は表１５から選択される第１および第２のクリック化学反応物の反応産物であり、ＸＴＥ
Ｎ１は、表２および３に記載される配列の群から選択される配列に対して少なくとも８０
％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％
、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、
または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、ま
たは少なくとも約９９％、または１００％の配列同一性を有するポリペプチドであり、Ｘ
ＴＥＮ２は、表２および３に記載される配列の群から選択される配列に対して少なくとも
８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９
２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５
％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％
、または少なくとも約９９％、または１００％の配列同一性を有するポリペプチドである
。式Ｘの共役体の一実施形態において、ＣＬ１およびＣＬ２は、それぞれ、表１３に記載
される架橋剤の群から選択される。式Ｘの共役体の別の実施形態において、ｘは１であり
、ＣＬ１は、ＸＴＥＮのＮ末端アミノ基に結合される。式Ｘの共役体の別の実施形態にお
いて、ＣＬ１は、表１５から選択される第１および第２のクリック化学反応物の反応産物
である。式Ｘの共役体の別の実施形態において、Ｃ２は、表１５から選択される第１およ
び第２のクリック化学反応物の反応産物である。式Ｘの共役体の別の実施形態において、
各ＣＬ１は、ＸＴＥＮ１のシステイン硫黄に結合され、各ＣＬ２は、ＸＴＥＮ２のシステ
イン硫黄に結合される。式Ｘの共役体の別の実施形態において、 各ＣＬ１は、ＸＴＥＮ
１のリジンεアミノ基に結合され、各ＣＬ２は、ＸＴＥＮ２のリジンεアミノ基に結合さ
れる。式Ｘの共役体の別の実施形態において、各ＣＬ１は、ＸＴＥＮ１のシステイン硫黄
に結合され、各ＣＬ２は、ＸＴＥＮ２のリジンεアミノ基に結合される。式Ｘの共役体の
別の実施形態において、ＸＴＥＮ１およびＸＴＥＮ２は、同一である。式Ｘの共役体の別
の実施形態において、ＸＴＥＮ１およびＸＴＥＮ２は、異なる。別の実施形態において、
本発明は、式Ｘの共役体の調製物を提供し、この共役体の調製物のＸＴＥＮ分子の少なく
とも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくと
も約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも
約９５％は、同一配列長を有する。
別の実施形態において、本発明は、式ＸＩ：
の構成を有する共役体を提供し、式中、独立して、各発生に対し、Ｐ１は、表１１、１２
、１８、１９、および２１に記載されるペイロードの群から選択される第１のペイロード
であり、Ｐ２は、表１１、１２、１８、１９、および２１に記載されるペイロードの群か
ら選択され、Ｐ１とは異なる第１のペイロードであり、ＣＬ１は、架橋剤であり、ｘは、
１〜約１００、または１〜約５０、または１〜約４０、または１〜約２０、または１〜約
１０、または１〜約５の整数であるか、または９であるか、または３であるか、または２
であるか、または１であり、ＣＬ２は、ＣＬ１とは異なる架橋剤であり、ｙは、１〜約１
００、または１〜約５０、または１〜約４０、または１〜約２０、または１〜約１０、ま
たは１〜約５の整数であるか、または９であるか、または３であるか、または２であるか
、または１であるが、但し、ｘ＋ｙ＞２を条件とし、２ｘＣＬは、代替として、二価架橋
剤、または表１５から選択される第１および第２のクリック化学反応物の反応産物であり
、ＸＴＥＮ１は、表２および３に記載される配列の群から選択される配列に対して少なく
とも８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも
約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約
９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９
８％、または少なくとも約９９％、または１００％の配列同一性を有する第１の実質的に
均質なＸＴＥＮであり、ＸＴＥＮ２は、表２および３に記載される配列の群から選択され
る配列に対して少なくとも８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１
％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％
、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、
または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％、または１００％の配列同一性を
有する第１の実質的に均質なＸＴＥＮである。式ＸＩの共役体の一実施形態において、Ｃ
Ｌ１およびＣＬ２は、それぞれ、表１３に記載される架橋剤の群から選択される。式ＸＩ
の共役体の別の実施形態において、ｘは１であり、ＣＬ１は、ＸＴＥＮのＮ末端アミノ基
に結合される。式ＸＩの共役体の別の実施形態において、ＣＬ１は、表１５から選択され
る第１および第２のクリック化学反応物の反応産物である。式ＸＩの共役体の別の実施形
態において、Ｃ２は、表１５から選択される第１および第２のクリック化学反応物の反応
産物である。式ＸＩの共役体の別の実施形態において、各ＣＬ１は、ＸＴＥＮ１のシステ
イン硫黄に結合され、各ＣＬ２は、ＸＴＥＮ２のシステイン硫黄に結合される。式ＸＩの
共役体の別の実施形態において、各ＣＬ１は、ＸＴＥＮ１のリジンεアミノ基に結合され
、各ＣＬ２は、ＸＴＥＮ２のリジンεアミノ基に結合される。式ＸＩの共役体の別の実施
形態において、各ＣＬ１は、ＸＴＥＮ１のシステイン硫黄に結合され、各ＣＬ２は、ＸＴ
ＥＮ２のリジンεアミノ基に結合される。式ＸＩの共役体の別の実施形態において、ＸＴ
ＥＮ１およびＸＴＥＮ２は、同一である。式ＸＩの共役体の別の実施形態において、ＸＴ
ＥＮ１およびＸＴＥＮ２は、異なる。一実施形態において、式ＸＩの共役体は、表２１に
記載される共役体からなる群から選択される。別の実施形態において、本発明は、式ＸＩ
の共役体の調製物を提供し、この共役体の調製物のそれぞれＸＴＥＮ１およびＸＴＥＮ２
分子の少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、ま
たは少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、また
は少なくとも約９５％は、同一配列長を有する。
他の実施形態において、本発明は、例えば、図２１〜２３に示される、三量体構成を持
つＸＴＥＮ−リンカーおよびＸＴＥＮ−リンカーペイロード共役体を提供する。
本発明は、３つのＸＴＥＮ架橋剤共役体が三価リンカーにより結合され、三量体ＸＴＥ
Ｎ−架橋剤構成をもたらす、三量体共役体を提供する。一実施形態において、本発明は、
式ＸＩＩ：
の構成を有する三量体ＸＴＥＮ−架橋剤を提供し、式中、独立して、各発生時に、３ｘＣ
Ｌは、三価架橋剤であり、ＣＬ１は、ＸＴＥＮ１に共役された第１の架橋剤であり、ＣＬ
２は、ＸＴＥＮ２に共役された第２の架橋剤であり、ＣＬ３は、ＸＴＥＮ３に共役された
第３の架橋剤であり、ｘは、１〜約１０の整数であり、ｙは、１〜約１０の整数であり、
ｚは、１〜約１０の整数であるが、但し、ｘ＋ｙ＋ｚ＞３を条件とし、ＸＴＥＮ１は、表
２および３に記載される配列の群から選択される配列に対して少なくとも８０％、または
少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少
なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少な
くとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なく
とも約９９％、または１００％の配列同一性を有する第１のＸＴＥＮであり、ＸＴＥＮ２
は、表２および３に記載される配列の群から選択される配列に対して少なくとも８０％、
または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、ま
たは少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、また
は少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または
少なくとも約９９％、または１００％の配列同一性を有する第２のＸＴＥＮであり、ＸＴ
ＥＮ３は、表２および３に記載される配列の群から選択される配列に対して少なくとも８
０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２
％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％
、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、
または少なくとも約９９％、または１００％の配列同一性を有する第３のＸＴＥＮであり
、ＸＴＥＮ１、ＸＴＥＮ２、およびＸＴＥＮ３は、同じか、または異なるＸＴＥＮ配列で
ある。式ＸＩＩの共役体の一実施形態において、ＣＬ１、ＣＬ２、およびＣＬ３は、それ
ぞれ表１３に記載される架橋剤からなる群から選択され、同じであるか、または異なる。
一実施形態において、式ＸＩＩの共役体は、第１の実質的に均質なＸＴＥＮの各架橋剤に
共役された第１のペイロードの単一原子残基であって、炭素、窒素、酸素、および硫黄か
らなる群から選択される残基と、第２の実質的に均質なＸＴＥＮの各架橋剤に共役された
第２のペイロードの単一原子残基であって、炭素、窒素、酸素、および硫黄からなる群か
ら選択される残基と、第３の実質的に均質なＸＴＥＮの各架橋剤に共役された第３のペイ
ロードの単一原子残基であって、炭素、窒素、酸素、および硫黄からなる群から選択され
る残基と、をさらに含む。
別の実施形態において、本発明は、３つのＸＴＥＮ−ペイロード前駆体が、三価リンカ
ーによって結合され、例えば、図２１および９７〜１０６に示される、三量体ＸＴＥＮ−
ペイロード構成をもたらす三量体共役体を提供する。一実施形態において、本発明は、式
ＸＩＩＩ：
の構成を有する三量体ＸＴＥＮ−架橋剤を提供し、式中、独立して、各発生に対し、３ｘ
ＣＬは、表１３および１４に記載される三価架橋剤の群から選択される三価架橋剤であり
、Ｐ１は、第１のＸＴＥＮの各架橋剤に共役され、表１１、１２、１８、および２１に記
載されるペイロードからなる群から選択され、Ｐ２は、第２のＸＴＥＮの各架橋剤に共役
された第２のペイロードであり、表１１、１２、１８、および２１に記載されるペイロー
ドからなる群から選択され、このペイロードは、第１のペイロードと同じであるか、また
は異なり、Ｐ３は、第３のＸＴＥＮの各架橋剤に共役された第３のペイロードであり、表
１１、１２、１８、および２１に記載されるペイロードからなる群から選択され、このペ
イロードは、第１または第２のペイロードと同じであるか、または異なり、ＣＬ１は、第
１の架橋剤であり、ｘは、１〜約１００、または１〜約５０、または１〜約４０、または
１〜約２０、または１〜約１０、または１〜約５の整数であるか、または９であるか、ま
たは３であるか、または２であるか、または１であり、ＣＬ２は、第２の架橋剤であり、
ｙは、１〜約１００、または１〜約５０、または１〜約４０、または１〜約２０、または
１〜約１０、または１〜約５の整数であるか、または９であるか、または３であるか、ま
たは２であるか、または１であり、ｚは、１〜約１００、または１〜約５０、または１〜
約４０、または１〜約２０、または１〜約１０、または１〜約５の整数であるか、または
９であるか、または３であるか、または２であるか、または１であるが、但し、ｘ＋ｙ＋
ｚ＞３を条件とし、ＸＴＥＮ１は、表２および３に記載される配列の群から選択される配
列に対して少なくとも８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、
または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、ま
たは少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、また
は少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％、または１００％の配列同一性を有す
る第１のＸＴＥＮであり、 ＸＴＥＮ２は、表２および３に記載される配列の群から選択
される配列に対して少なくとも８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約
９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９
４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７
％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％、または１００％の配列同一
性を有する第２のＸＴＥＮであり、ＸＴＥＮ３は、表２および３に記載される配列の群か
ら選択される配列に対して少なくとも８０％、または少なくとも約９０％、または少なく
とも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくと
も約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも
約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％、または１００％の配
列同一性を有する第３のＸＴＥＮであり、ＸＴＥＮ１、ＸＴＥＮ２、およびＸＴＥＮ３は
、同じであるか、または異なるＸＴＥＮ配列である。いくつかの実施形態において、式Ｘ
ＩＩＩの共役体は、第１のペイロードをさらに含み、このペイロードは、標的に対する特
異的結合親和性を持つ標的化部分であり、この標的化部分は、表１７〜１９および２１に
記載される標的化部分からなる群から選択され、これらのペイロードの少なくとも他の１
つは、表１１、表１９、および表２１に記載される薬物からなる群から選択される薬物で
ある。前述の一実施形態において、標的化部分は、ＬＨＲＨまたは葉酸であり、薬物は、
ドキソルビシン、パクリタキセル、オーリスタチン、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭ
ＡＥ）、モノメチルオーリスタチンＦ、メイタンシン、ドラスタチン、カリケアミシン、
ビンカアルカロイド、カンプトテシン、ミトマイシンＣ、エポチロン、ｈＴＮＦ、Ｉ１−
１２、ボルテゾミブ、ランピルナーゼ、スードモナス外毒素、ＳＮ−３８、およびラケル
マイシンからなる群から選択される。
三量体ＸＴＥＮ共役組成物の別の実施形態において、組成物は、式ＸＩＶ：
の構成を有し、式中、独立して、各発生に対し、３ｘＣＬは、三価架橋剤であり、ＣＬ１
は、ＸＴＥＮ１に共役された第１の架橋剤であり、ＣＬ２は、ＸＴＥＮ２に共役された第
２の架橋剤であり、ｘは、１〜約１０の整数であり、ｙは、１〜約１０の整数であるが、
但し、ｘ＋ｙ＞２を条件とし、ＸＴＥＮ１は、第１のＸＴＥＮであり、ＸＴＥＮ２は、第
２のＸＴＥＮであり、ＸＴＥＮ３は、第３のＸＴＥＮであり、ＸＴＥＮは、表２に記載さ
れる配列からなる群から選択される。式ＸＩＶの三量体ＸＴＥＮ共役組成物の一実施形態
において、組成物は、第１のＸＴＥＮの各第１の架橋剤に共役された第１のペイロードの
単一原子残基であって、炭素、窒素、酸素、および硫黄からなる群から選択される残基と
、第２のＸＴＥＮの各第２の架橋剤に共役された第２のペイロードの単一原子残基であっ
て、炭素、窒素、酸素、および硫黄からなる群から選択される残基と、をさらに含む。式
ＸＩＶの三量体ＸＴＥＮ共役組成物の別の実施形態において、組成物は、表６、７、１８
、および２１に記載されるペイロードからなる群から選択される第１のＸＴＥＮの各第１
の架橋剤に共役された第１のペイロードと、表６、７、１８、および２１に記載されるペ
イロードからなる群から選択される第２のＸＴＥＮの各第２の架橋剤に共役された第２の
ペイロードと、をさらに含み、このペイロードは、第１のペイロードと同じであるか、ま
たは異なる。前述の一実施形態において、第１のペイロードは、標的に対する特異的結合
親和性を持つ標的化部分であり、この標的化部分は、表１７〜１９および２１に記載され
る標的化部分からなる群から選択され、第２のペイロードは、表６、表１８、および表２
１に記載される薬物からなる群から選択される薬物である。前述の別の実施形態において
、第１のペイロードは、ＬＨＲＨおよび葉酸塩からなる群から選択される標的化部分であ
り、第２のペイロードは、ドキソルビシン、パクリタキセル、オーリスタチン、モノメチ
ルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルオーリスタチンＦ、メイタンシン、ドラス
タチン、カリケアミシン、ビンカアルカロイド、カンプトテシン、ミトマイシンＣ、エポ
チロン、ｈＴＮＦ、Ｉ１−１２、ボルテゾミブ、ランピルナーゼ、スードモナス外毒素、
ＳＮ−３８、およびラケルマイシンからなる群から選択される薬物である。前述の一実施
形態において、第１のペイロードは、表１１の薬物および表１２のタンパク質からなる群
から選択され、第２のペイロードが、第１のペイロードとは異なり、表１１の薬物および
表１２のタンパク質からなる群から選択される。前述の別の実施形態において、第１のペ
イロードおよび第２のペイロードは、同一であり、表１１の薬物および表１２のタンパク
質からなる群から選択される。三量体ＸＴＥＮ共役組成物の別の実施形態において、組成
物は、式ＸＶ：
の構成を有し、式中、独立して、各発生に対し、３ｘＣＬは、三価架橋剤であり、ＣＬ１
は、ＸＴＥＮ１に共役された第１の架橋剤であり、ｘは、１〜約１０の整数であり、ＸＴ
ＥＮ１は、第１のＸＴＥＮであり、このＸＴＥＮは、表３に記載される配列からなる群か
ら選択され、ＸＴＥＮ２は、第２のＸＴＥＮであり、このＸＴＥＮは、表２に記載される
配列からなる群から選択され、ＸＴＥＮ３は、第３のＸＴＥＮであり、このＸＴＥＮは、
表２に記載される配列からなる群から選択される。式ＸＶとして構成された三量体ＸＴＥ
Ｎ共役組成物の一実施形態において、組成物は、第１のＸＴＥＮの各第１の架橋剤に共役
された第１のペイロードの単一原子残基をさらに含み、この残基は、炭素、窒素、酸素、
および硫黄からなる群から選択される。式ＸＶとして構成された三量体ＸＴＥＮ共役組成
物の一実施形態において、組成物は、表６、７、１８、および２１に記載されるペイロー
ドからなる群から選択される第１のＸＴＥＮの各第１の架橋剤に共役された第１のペイロ
ードをさらに含む。
三量体ＸＴＥＮ−ペイロード共役体の別の実施形態において、各ＸＴＥＮ−ペイロード
は、生物学的に活性なペプチドまたはポリペプチドを含む単量体融合タンパク質であり得
、この融合タンパク質は、ＸＴＥＮのアミノ基またはチオール基において三価リンカーに
結合される。三量体ＸＴＥＮ−ペイロード共役体の別の実施形態において、各ＸＴＥＮ−
ペイロードは、ＸＴＥＮに結合されたペイロードの共役体であり得、ＸＴＥＮに結合され
、順にＸＴＥＮのＮ末端において三価リンカーに結合される、生物学的に活性なペプチド
もしくはポリペプチド、または薬理学的に活性な小分子もしくは毒素であり得る。このパ
ラグラフにおいて上記に記載される前述のＸＴＥＮ−リンカー−ペイロードの実施形態に
おいて、３つのペイロードは同一であり得るか、または異なり得る。三量体ＸＴＥＮ−ペ
イロード共役体の一実施形態において、共役体は、少なくとも１つの生物学的に活性なタ
ンパク質と、異なるＸＴＥＮに結合され、順に、ＸＴＥＮのＮ末端において三価リンカー
に結合される、少なくとも１つの薬物とを含む。前述の構成の特定の実施形態において、
少なくとも１つの生物学的に活性なタンパク質は、標的化部分であり、少なくとも１つの
薬物は、ドキソルビシン、パクリタキセル、オーリスタチン、モノメチルオーリスタチン
Ｅ、モノメチルオーリスタチンＦ、メイタンシン、ドラスタチン、カリケアミシン、ビン
カアルカロイド、カンプトテシン、ミトマイシンＣ、エポチロン、ｈＴＮＦ、Ｉ１−１２
、ボルテゾミブ、ランピルナーゼ、スードモナス外毒素、ＳＮ−３８、およびラケルマイ
シンが挙げられるが、これらに限定されない毒素である。ＸＴＥＮ中のチオールまたはε
アミノ基の位置に応じて、ペイロードが、架橋されたＸＴＥＮの内部に存在するか（図２
３Ｂに示される）、またはその末端に存在するか（図２３Ａに示される）を制御すること
ができる。前述の実施形態において、例示的な非限定標的化部分としては、ＬＨＲＨ、葉
酸塩、オクトレオチド、パシレオチド、ボンベシン、モノクローナル抗体、ｓｃＦＶ、セ
ントリイン、ならびに表１７の抗体フラグメント、足場、および模倣体が挙げられる。そ
のような三量体共役体の例示的な構成は以下の通りである。
本発明は、三量体構成を持つＸＴＥＮ−リンカーおよびＸＴＥＮ−リンカーペイロード
共役体をさらに提供する。一実施形態において、本発明は、４つのＸＴＥＮ配列が、四価
リンカーによって結合され、例えば、図２２Ｄに示される、四量体ＸＴＥＮ−架橋剤構成
をもたらす共役体を提供する。四量体リンカーの非限定例としては、例えば、米国特許第
７，５２４，８２１号に記載される四価−チオール、四価−Ｎ−マレイミドリンカー、ま
たは４つの反応基を持つ抗体もしくは抗体フラグメントが挙げられる。
本発明は、４つのＸＴＥＮ架橋剤配列が四価リンカーにより結合され、四価ＸＴＥＮ−
架橋剤構成をもたらす共役体を提供する。一実施形態において、本発明は、式ＸＶＩ：
の構成を有する四量体ＸＴＥＮ−架橋剤を提供し、式中、独立して、各発生時に、４ｘＣ
Ｌは、四価架橋剤であり、ＣＬ１は、ＸＴＥＮ１に共役された第１の架橋剤であり、ＣＬ
２は、ＸＴＥＮ２に共役された第２の架橋剤であり、ＣＬ３は、ＸＴＥＮ３に共役された
第３の架橋剤であり、ＣＬ４は、ＸＴＥＮ４に共役された第４の架橋剤であり、ｖは、１
〜約１０の整数であり、ｘは、１〜約１０の整数であり、ｙは、１〜約１０の整数であり
、ｚは、１〜約１０の整数であるが、但し、ｘ＋ｙ＋ｚ＞４を条件とし、ＸＴＥＮ１は、
表２および３に記載される配列の群から選択される配列に対して少なくとも８０％、また
は少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または
少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少
なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少な
くとも約９９％、または１００％の配列同一性を有する第１のＸＴＥＮであり、ＸＴＥＮ
２は、表２および３に記載される配列の群から選択される配列に対して少なくとも８０％
、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、
または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、ま
たは少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、また
は少なくとも約９９％、または１００％の配列同一性を有する第２のＸＴＥＮであり、
ＸＴＥＮ３は、表２および３に記載される配列の群から選択される配列に対して少なくと
も８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約
９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９
５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８
％、または少なくとも約９９％、または１００％の配列同一性を有する第３のＸＴＥＮで
あり、ＸＴＥＮ１、ＸＴＥＮ２、およびＸＴＥＮ３は、同じであるか、または異なるＸＴ
ＥＮ配列であり、ＸＴＥＮ４は、表２および３に記載される配列の群から選択される配列
に対して少なくとも８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、ま
たは少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、また
は少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または
少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％、または１００％の配列同一性を有する
第４のＸＴＥＮであり、ＸＴＥＮ１、ＸＴＥＮ２、ＸＴＥＮ３、およびＸＴＥＮ４は、同
じであるか、または異なるＸＴＥＮ配列である。
本発明は、４つのＸＴＥＮ−ペイロード前駆体配列が、四価リンカーによって結合され
、例えば、図２２Ｃおよび１０５に示される、四量体ＸＴＥＮ−ペイロード構成をもたら
す共役体を提供する。一実施形態において、本発明は、式ＸＶＩＩ：
の構成を有する四量体ＸＴＥＮ−ペイロードを提供し、式中、独立して、各発生時に、４
ｘＣＬは、四価架橋剤であり、Ｐ１は、第１のＸＴＥＮの各架橋剤に共役され、表１１、
１２、１８、および２１に記載されるペイロードからなる群から選択され、Ｐ２は、第２
のＸＴＥＮの各架橋剤に共役された第２のペイロードであり、表１１、１２、１８、およ
び２１に記載されるペイロードからなる群から選択され、このペイロードは、第１のペイ
ロードと同じであるか、または異なり、Ｐ３は、第３のＸＴＥＮの各架橋剤に共役された
第３のペイロードであり、表１１、１２、１８、および２１に記載されるペイロードから
なる群から選択され、このペイロードは、第１または第２のペイロードと同じであるか、
または異なり、Ｐ４は、第４のＸＴＥＮの各架橋剤に共役された第４のペイロードであり
、表１１、１２、１８、および２１に記載されるペイロードからなる群から選択され、こ
のペイロードは、第１、第２、または第３のペイロードと同じであるか、または異なり、
ＣＬ１は、ＸＴＥＮ１に共役された第１の架橋剤であり、ＣＬ２は、ＸＴＥＮ２に共役さ
れた第２の架橋剤であり、ＣＬ３は、ＸＴＥＮ３に共役された第３の架橋剤であり、ＣＬ
４は、ＸＴＥＮ４に共役された第４の架橋剤であり、ｖは、１〜約１０の整数であり、ｘ
は、１〜約１０の整数であり、ｙは、１〜約１０の整数であり、ｚは、１〜約１０の整数
であるが、但し、ｘ＋ｙ＋ｚ＞４を条件とし、ＸＴＥＮ１は、表２および３に記載される
配列の群から選択される配列に対して少なくとも８０％、または少なくとも約９０％、ま
たは少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、また
は少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または
少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％、または１
００％の配列同一性を有する第１のＸＴＥＮであり、ＸＴＥＮ２は、表２および３に記載
される配列の群から選択される配列に対して少なくとも８０％、または少なくとも約９０
％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％
、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、
または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％、ま
たは１００％の配列同一性を有する第２のＸＴＥＮであり、ＸＴＥＮ３は、表２および３
に記載される配列の群から選択される配列に対して少なくとも８０％、または少なくとも
約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約
９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９
６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９
％、または１００％の配列同一性を有する第３のＸＴＥＮであり、ＸＴＥＮ１、ＸＴＥＮ
２、およびＸＴＥＮ３は、同じであるか、または異なるＸＴＥＮ配列であり、ＸＴＥＮ４
は、表２および３に記載される配列の群から選択される配列に対して少なくとも８０％、
または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、ま
たは少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、また
は少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または
少なくとも約９９％、または１００％の配列同一性を有する第４のＸＴＥＮであり、ＸＴ
ＥＮ１、ＸＴＥＮ２、ＸＴＥＮ３、およびＸＴＥＮ４は、同じであるか、または異なるＸ
ＴＥＮ配列である。
四価ＸＴＥＮ−ペイロード共役体の別の実施形態において、各ＸＴＥＮ−ペイロードは
、生物学的に活性なペプチドまたはポリペプチドを含む単量体融合タンパク質であり得、
この融合タンパク質は、ＸＴＥＮのアミノ基またはチオール基において四価リンカーに結
合される。四価ＸＴＥＮ−ペイロード共役体の別の実施形態において、各ＸＴＥＮ−ペイ
ロードは、ペイロードの共役体であり得、ＸＴＥＮに結合され、順にＸＴＥＮのＮ末端に
よって四価リンカーに結合される、生物学的に活性なペプチドもしくはポリペプチド、ま
たは薬理学的に活性な小分子もしくは毒素であり得る。このパラグラフにおいて上記に記
載される前述のＸＴＥＮ−リンカー−ペイロードの実施形態において、４つのペイロード
は同一であり得るか、または異なり得る。前述の構成の特定の実施形態において、少なく
とも１つの生物学的に活性なタンパク質は、標的化部分であり、少なくとも１つの薬物は
、ドキソルビシン、パクリタキセル、オーリスタチン、メイタンシン、ドラスタチン、カ
リケアミシン、ビンカアルカロイド、カンプトテシン、ミトマイシンＣ、エポチロン、ｈ
ＴＮＦ、Ｉ１−１２、ボルテゾミブ、ランピルナーゼ、スードモナス外毒素、ＳＮ−３８
、およびラケルマイシンが挙げられるが、これらに限定されない毒素である。ＸＴＥＮ中
のチオールまたはεアミノ基の位置に応じて、ペイロードが、架橋されたＸＴＥＮの内部
に存在するか、またはその末端に存在するかを制御することができる。
４． ４つ以上のＸＴＥＮ−ペイロードを持つ多価構成
表３のＸＴＥＮを使用するとき、組成物は、システインまたはリジン操作された骨格に
結合され、「くし形」多価構成をもたらすか、または図７に示されるように、複数の分岐
前駆体を結合して「デンドリマー」構成を製造する、４つ以上のＸＴＥＮ−ペイロード分
子を含有することが企図される。一実施形態において、多価構成共役体は、システインま
たはリジン操作されたＸＴＥＮを、システインまたはリジン操作されたＸＴＥＮとの反応
（図２４に例示される）に適切なリンカーを含むＸＴＥＮ−ペイロードと反応させること
によって創製され、最終産物をもたらす。別の実施形態において、多価構成共役体は、シ
ステインまたはリジン操作されたＸＴＥＮを、システインまたはリジン操作されたＸＴＥ
Ｎに結合されたリンカーとの反応に適切な第１級もしくはεアミノ基またはシステインを
含むＸＴＥＮ−ペイロードを持つリンカーと反応させることによって創製され、最終産物
をもたらす。これらの実施形態において、最終産物の原子価は、反応性アミノ酸またはリ
ンカーにかかわらず、ＸＴＥＮに組み込まれた反応基の数によって制御される。さらに、
最終産物は、そのリガンドとの相互作用を改善するＸＴＥＮ末端の近く、または分岐点の
近くのいずれかにペイロードを配置して、ペイロードを遮断し、リガンドとの相互作用の
程度を低減するように設計できることが企図される。
５． 単量体ＸＴＥＮ骨格上の二重特異性ペイロード構成
別の態様において、本発明は、図２７Ａに示されるように、単一のシステインおよびリ
ジン操作されたＸＴＥＮ骨格に結合され、二価共役体をもたらす、２つの異なるペイロー
ド分子を含有する共役体を提供する。一実施形態において、二価構成共役体は、表３に具
体的に提供されるもの等の操作されたＸＴＥＮを、システイン操作されたＸＴＥＮとの反
応に適切なリンカーを含む第１のＸＴＥＮ−ペイロードと反応させることに続いて、リジ
ン操作されたＸＴＥＮとの反応に適切なリンカーを含む第２のＸＴＥＮ−ペイロードとの
第２の反応によって創製され、最終産物をもたらす。ペイロードの数および位置は、決定
的な反応性チオールまたはアミノ基の配置とともに、操作されたＸＴＥＮの設計により制
御される。一実施形態において、二価共役体は、第１のペイロードの単一分子と、リンカ
ーによってシステイン−リジン操作されたＸＴＥＮに結合された第２のペイロードの単一
分子と、を含む。別の実施形態において、二価共役体は、第１のペイロードの１個、また
は２個、または３個、または４個、または５個の分子と、リンカーによってシステイン−
リジン操作されたＸＴＥＮに結合された第２のペイロードの単一分子と、を含む。別の実
施形態において、二価共役体は、第１のペイロードの１個、または２個、または３個、ま
たは４個、または５個の分子と、リンカーによってシステイン−リジン操作されたＸＴＥ
Ｎに結合された第２のペイロードの１個、または２個、または３個、または４個、または
５個の分子と、を含む。
別の実施形態において、二価構成共役体は、表３もの等のシステインおよびリジン操作
されたＸＴＥＮを、システイン操作されたＸＴＥＮとの反応に適切な第１のリンカーと反
応させることに続いて、リジン操作されたＸＴＥＮとの反応に適切なリンカーとの第２の
反応によって、次いで第１のペイロードを有するＸＴＥＮ−架橋剤骨格を、第１のリンカ
ーと反応することができるチオール反応基と反応させることに続いて、第２の架橋剤と反
応することができるアミノ基との第２のペイロードの反応によって創製され、最終産物を
もたらす。
６． スペーサーおよび遊離基を持つＸＴＥＮ−架橋剤およびＸＴＥＮ−ペイロード共役
体
別の態様において、本発明は、組成物の官能性または特性を組み込むか、もしくは強化
するように、または組成物の組立てもしくは製造の補助として設計される、ＸＴＥＮに組
み込まれるか、またはそれに隣接した１つ以上のスペーサーとともに構成されたＸＴＥＮ
−架橋剤およびＸＴＥＮ−ペイロード共役体を提供する。そのような特性としては、限定
されないが、ペイロードの放出を許す、タンパク質分解的に切断されることができる配列
、または不安定な官能基の包含が挙げられるか、またはスペーサーをＸＴＥＮ配列とペイ
ロード成分との間に導入し、ペイロード成分が、その標的リガンドと適切に相互作用し得
るように、立体障害を減少させることができる。
一実施形態において、１つ以上のスペーサーは、対象の共役体のリンカーに組み込まれ
る。スペーサーおよび望ましいスペーサーを特定する方法については、例えば、Ｇｅｏｒ
ｇｅ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １５：８７
１−８７９を参照されたい（参照により本明細書に具体的に組み込まれる）。一実施形態
において、スペーサーは、１〜５０アミノ酸残基の長さ、または約１〜２５残基、または
約１〜１０残基の長さである１つ以上のペプチド配列を含む。スペーサー配列は、切断部
位を除いて、２０個の天然Ｌアミノ酸のうちのいずれかを含むことができ、好ましくは、
残基の大半が立体的に障害されていない親水性アミノ酸であるというＸＴＥＮ様特性を有
する。このスペーサーは、ポリグリシンもしくはポリアラニンであり得るか、または主に
グリシン、セリン、およびアラニン残基の組合せの混合物である。一実施形態において、
スペーサー配列は、表１５からの配列である。別の実施形態において、スペーサー配列は
、ＧＰＥＧＰＳである。
さらに、スペーサー配列は、Ｔ細胞エピトープの導入を回避するように設計され、これ
は、スペーサーにおいて利用される疎水性アミノ酸を回避するか、またはその数を限定す
ることによって部分的に達成されることができ、エピトープの決定は、上記および実施例
に記載される。
一実施形態において、スペーサーは、共役体からのペイロードの放出を許す放出基を含
む。別の実施形態において、架橋剤は、共役体からのペイロードの放出を許す放出基を含
む。放出基は、そのような放出可能な付着を提供する任意の不安定な基であり得る。一実
施形態において、放出基は、化学的に切断可能な結合または不安定な化学結合である。そ
のような結合は、典型的に、当業者に周知の方法によって、例えば、酸、塩基、酸化、還
元、移動、または排除によって切断されてよい。特定の実施形態において、化学的に切断
可能な結合は、修飾塩基、修飾糖、ジスルフィド結合、架橋剤またはスペーサーに組み込
まれた化学的に切断可能な基を含む。これらの結合のいくつかの例は、ＰＣＴ第ＷＯ９６
／３７６３０号および米国特許第７，１３２，５１９号に記載されている（参照により本
明細書に組み込まれる）。本発明に包含される放出基は、酵素によって切断可能な基また
は結合も含む。酵素的に切断可能な放出基は、ホスホジエステルまたはアミド結合、なら
びに制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含む。一実施形態において、本発明は、１つ以上
のペイロードを含む組成物を提供し、バリン−シトルリンの切断可能なリンカーは、ペイ
ロードとＸＴＥＮとの間にあり、組成物が細胞内、例えば、腫瘍細胞内に内在化されると
きに、カテプシンによる切断を許す。別の実施形態において、放出基は、ヌクレアーゼに
よって切断可能である。これらのヌクレアーゼは、典型的に、エキソヌクレアーゼまたは
制限エンドヌクレアーゼであってよい。典型的なエキソヌクレアーゼとしては、二本鎖お
よび一本鎖ポリ核酸双方に特異的なエキソヌクレアーゼが挙げられる。さらに、ある実施
形態によって包含される制限エンドヌクレアーゼとしては、ＩＩＳ型およびＩＩ型制限エ
ンドヌクレアーゼが挙げられる。他の実施形態において、放出基は、プロテアーゼによっ
て切断可能な配列であってもよく、この配列は、表９に記載される配列から選択される。
本発明の組成物に含めるのに適した配列に作用する典型的なプロテアーゼとしては、表９
のプロテイナーゼを含む、エンドプロテイナーゼが挙げられる。
７． ＸＴＥＮ−ペイロード構成のライブラリー
別の態様において、本発明は、ＸＴＥＮ−ペイロード前駆体のライブラリー、そのライ
ブラリーを作製する方法、および図３４〜３５に示されるように、ペイロードの最適な組
合せならびに最適な比率を達成するために、ライブラリー前駆体を組合せ手法で合わせる
方法を提供する。一実施形態において、本発明は、ＸＴＥＮ−ペイロード前駆体のライブ
ラリーを創製するように、本明細書に記載されるものを含む、所与のペイロードの１個、
または２個、または３個、または４個、または５個、または６個、または７個、または８
個、または９個、または１０個、あるいはそれ以上の分子にそれぞれ結合された個別のＸ
ＴＥＮライブラリーを提供する。この方法において、結合される一連のＸＴＥＮ−ペイロ
ード前駆体は、リンカーにさらに共役され、次いで、共役を生じさせる条件下でリンカー
と反応することができる他のＸＴＥＮ−ペイロード前駆体と後次に混合および反応し、Ｘ
ＴＥＮに結合されたペイロードの様々な順列および比率のライブラリーをもたらす。次い
で、そのようなライブラリーは、最適な応答を提供する組成物を決定するために、所与の
臨床適応（例えば、癌、代謝性障害、糖尿病）におけるパラメータを評価するために適し
たインビトロまたはインビボアッセイにおいてスクリーニングされる。例示的な一実施形
態において、ペイロード前駆体の１つのカテゴリーは、表２０の腫瘍関連抗原に対し結合
親和性を持つ、ペプチド（例えば、表１７の標的化部分）等の様々な標的分子を含み、前
駆体の第２のカテゴリーは、細胞毒性薬または表９から選択される薬物等の１つ以上の薬
物である。結合される前駆体の各カテゴリーは、リンカーにさらに共役され、図３６に示
されるように、共役を生じさせる条件下でリンカーと反応することができる他のＸＴＥＮ
−ペイロード前駆体と後次に混合および反応し、互いに異なる比率の様々な標的化部分お
よび薬物順列のライブラリーをもたらす。ＸＴＥＮ−ペイロード共役体は、１つのペイロ
ード：別のペイロードの固定比を許すように設計され、例えば、２つの異なるペイロード
の場合、１：１、または１：１．５、または１：２、または１：３、または２：３、また
は１：４、または１：５、または１：９である。同様の比率範囲は、３つ、４つ、５つ、
またはそれ以上のペイロードを含むライブラリー共役体に適用される。
他の実施形態において、ライブラリーは、共通の疾患の処置において有益な効果を有す
ることが知られている３つ以上のペイロードを使用して構築される。一実施形態において
、ライブラリーは、ＸＴＥＮに結合されたペイロードを含み、各ペイロードは、共通の疾
患を改善するために生物学的に有効な薬物である。別の実施形態において、ライブラリー
は、ＸＴＥＮに結合されたペイロードを含み、各薬物または生物製剤は、共通の疾患の異
なる症状を処置するために有効である。別の実施形態において、ライブラリーは、ＸＴＥ
Ｎに結合されたペイロードを含み，各薬物または生物製剤は、共通の生物学的経路を介し
てそれらの治療効果を媒介する。ライブラリーの前述の実施形態において、共通の疾患は
、癌、癌の支持療法、心血管、中枢神経系、内分泌疾患、消化管、血液学的、ＨＩＶ感染
、ホルモン系、炎症、自己免疫疾患、感染症、代謝疾患、筋骨格系疾患、腎臓学的障害、
眼科疾患、疼痛、および呼吸器から選択される。さらなる特殊性に応じて、ライブラリー
が有益な効果を有することが知られているペイロードで構築される疾患は、表１６から選
択される。そのような疾患の処置または予防における使用に適したペイロードは、本明細
書に記載されるものを含むか（例えば、表１１、１２、１８、および２１のペイロード）
、または一般にアクセス可能なデータベースにおいて見出され得るか、そうでなければ当
業者に既知である。
一実施形態において、図３７に示されるように、二重特異性共役体は、切断可能または
不安定なリンカーによってＸＴＥＮに結合された薬物モジュールを有し、このリンカーは
、対象への投与後（標的分子によって標的細胞における細胞内内在化時を含む）に切断さ
れ得るか、または解離し得る。別の実施形態において、薬物は、非切断可能なリンカーに
よってＸＴＥＮに結合されるが、共役体は、依然として分解の影響を受け易い。内在化す
ると、ＸＴＥＮはプロテアーゼによって切断され、そのリンカーに接続された薬物は遊離
され、細胞毒性をもたらす。
例示的な一実施形態において、標的分子は、ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ、ＧｎＲ
Ｈ、およびゴナンドトロピン放出ホルモンとして知られる）を黄体化し、薬物はドキソル
ビシンであり、ＬＨＲＨ：ドキソルビシンの比率は、１：１、または１：１．５、または
１：２、または１：３、または１：９、または２：３、または３：１、または３：２、ま
たは２：１、または１．５：１である。共役体は、ＸＴＥＮ前駆体から開始して生成する
ことができる。１つのＸＴＥＮ前駆体は、１、２、またはそれ以上の薬物分子、および反
応性架橋剤、またはクリック化学反応物、または反応性アミノ酸を担持することができる
。第２のＸＴＥＮ前駆体は、標的するための１、２、またはそれ以上のＬＨＲＨドメイン
、および反応性架橋剤、またはクリック化学反応物、または反応性アミノ酸を担持する。
次いで、前駆体セグメントの双方は、それぞれのＸＴＥＮの反応基間の反応によって接合
される。例示的な一実施形態において、反応基は、架橋剤を介して第１のＸＴＥＮセグメ
ントのＮ末端に共役されるアジドであり、第２のＸＴＥＮの反応基は、架橋剤を介して第
２のＸＴＥＮセグメントのＮ末端に共役されるアルキンである。ＬＨＲＨ−ＸＴＥＮ−薬
物共役体の別の実施形態において、薬物は、メイタンシンである。ＬＨＲＨ−ＸＴＥＮ−
薬物共役体の別の実施形態において、薬物は、オーリスタチンである。
８． 標的化部分に結合されたＸＴＥＮ−ペイロードの共役体
別の態様において、本発明は、標的化部分に結合された１つ以上のＸＴＥＮ−ペイロー
ド組成物を含む、共役組成物を提供する。対象の標的組成物は、細胞、組織、または器官
への治療的または毒性ペイロードの選択的送達が所望される、多様な状態の処置における
使用を見出す。本発明は、抗体、抗体フラグメント、および抗体模倣体を含む（限定され
ないが、表１７に記載されるものを含む）、対象の組成物における使用のための他用な標
的化部分、ならびに疾患または代謝性もしくは生理学的異常と関連付けられたリガンドま
たは受容体を結合することができるペプチドおよび小分子を企図する。一実施形態におい
て、本発明は、少なくとも１つのＸＴＥＮに結合された表１７、１８、または２１からの
少なくとも１つの標的化部分を含む共役体を提供する。別の実施形態において、本発明は
、少なくとも２つ、または３つ、または４つのＸＴＥＮのそれぞれに結合された表１７、
１８、または２１からの少なくとも１つの標的化部分を含む共役体を提供する。別の実施
形態において、本発明は、少なくとも１つのＸＴＥＮに結合された表１７、１８、または
２１からの少なくとも１つの標的化部分と、少なくとも１つのＸＴＥＮに結合された表１
１、表１２、表１８、または表２１に記載されるペイロードからなる群から選択される少
なくとも１つの薬物または生物学的ペイロードと、を含む共役体を提供する。一実施形態
において、本発明は、標的化部分−ＸＴＥＮ−薬物共役組成物を提供し、この組成物は、
標的細胞上のリガンドまたは受容体に選択的に送達され、次いで、図３７に示されるよう
に、細胞の中に内在化されることができ、薬物成分に対し、当該技術分野において既知の
薬理学的効果をもたらす。
図２１〜２４、および２８〜３２に示されるように、そのような共役組成物は、異なる
原子価を有することができ、１つ以上の標的抗体または標的化部分に結合された１、２、
３、または４、あるいはそれ以上のＸＴＥＮ−ペイロード分子を持つ。抗体標的化部分の
場合、一実施形態において、ＸＴＥＮ−ペイロードは、架橋剤によって、抗体のヒンジ領
域内のシステインに結合される。別の実施形態において、ＸＴＥＮ−ペイロードは、ジス
ルフィド架橋によって、抗体のヒンジ領域内のシステインに結合される。したがって、抗
体−ＸＴＥＮ−ペイロード共役体は、抗体、抗体フラグメント、または模倣体に結合され
た１、２、３、または４、あるいはそれ以上のＸＴＥＮ−ペイロードセグメントを含むこ
とができる。別の実施形態において、ＸＴＥＮは、ヒンジ領域の外側で（システインを抗
体に挿入して共役部位を制御することを含む）、または既存のリジン側鎖への共役によっ
て共役される。抗体共役体を創製するためのＸＴＥＮ−ペイロードの結合は、ａ）ＸＴＥ
Ｎペイロードが切断可能なリンカーとして機能する、ｂ）可溶性を提供する、ｃ）ＩｇＧ
当たりの薬物負荷の比率を設定できるようにする、およびｄ）製造を簡素化するためにＸ
ＴＥＮを薬物と事前共役することができるという、多くの利点を有する。
いくつかの実施形態において、本発明は、標的化成分を第１のペイロードとして、毒素
を第２のペイロードとして含む共役体を提供し、各ペイロード型の１つ以上のコピーが組
成物のＸＴＥＮに結合される。前述の変化形において、共役体は、任意に、不安定なリン
カーまたは切断可能なリンカーを用いてＸＴＥＮに結合された毒素を有することができ、
標的に送達されるか、または標的内に内在化されるときに、毒素が遊離されるようにする
。前述の別の変化形において、標的化成分は、リンカーを用いて抗体に共役された（例え
ば、図２８〜２９に示されるヒンジ領域内のシステインに共役された）１、２、３、また
は４つのＸＴＥＮ−ペイロード組成物を持つ、抗体または抗体フラグメントであり、限定
されないが、腫瘍および他の癌の様々な処置等の臨床適応の標的治療における使用のため
の共役体を提供し、抗体は標的化成分を提供し、ＸＴＥＮ−ペイロードは、意図された活
性（例えば、腫瘍細胞中の細胞毒性）を生じさせる。したがって、本発明の共役体は、免
疫共役体の一種である。標的共役体は、抗体、もしくは抗体模倣体に由来する標的化成分
を用いて設計することができるか、または疾患細胞もしくは器官と関連付けられたリガン
ドを結合するペプチドもしくは小分子である。抗体フラグメント、足場、および模倣体の
カテゴリーの非限定例は、表１７に提供される。特定の標的化成分、それらが配向される
標的、および本発明の共役体においてペイロードとして利用され得る毒素の非限定例は、
表１８に提供される。本開示の標的共役組成物は、表１８の毒素のいずれかの１つ以上、
または表１１もしくは表１２に提供されるペイロードと併用され得る、任意の所与の標的
化成分の組成物を含むことが特に企図される。ＸＴＥＮ−ペイロード共役体は、同一であ
り得るか、または異なり得る２つ以上の標的化成分を含むことができることがさらに企図
される。そのような共役体は、限定されないが、表１５に記載されるもの等の状態の処置
において使用できることが企図される。
特定の実施形態において、本発明は、表１９から選択される１つ以上のＬＨＲＨ標的化
成分と、表１１から選択される１つ以上の薬物成分と、を含むＸＴＥＮ−ペイロード共役
体を提供する。前述の実施形態において、ＬＨＲＨは、１つのＸＴＥＮセグメントに結合
され得、順に、薬物成分が共役される１つ以上のＸＴＥＮセグメントに結合される。代替
として、ＬＨＲＨおよび薬物成分は、単量体ＸＴＥＮに共役され得る。さらに、薬物成分
は、任意に、薬物が、対象への投与後に共役体から遊離されるのを許す不安定なリンカー
または切断可能なリンカーを使用して、ＸＴＥＮに結合され得る。
ＸＴＥＮ−ペイロード共役体が配向され得ることが企図される追加の標的としては、表
２０に列挙される腫瘍関連抗原が挙げられる。一実施形態において、本発明は、表２０の
１つ以上の標的を結合することができる１つ以上の標的化成分を含む、ＸＴＥＮ−ペイロ
ード共役体を提供する。
特定の実施形態において、本発明は、１つ、２つ、またはそれ以上の標的化成分、およ
びＸＴＥＮに共役された１つ、２つ、またはそれ以上の薬物成分を含むＸＴＥＮ−ペイロ
ード共役体を提供する。特定の共役組成物の非限定実施形態は、表２１に提供され、カラ
ム２の指定組成物は、ｉ）表のＸＴＥＮカラムにおいて指定される表３のＸＴＥＮ配列、
ｉｉ）組成物の標的化能力を提供する表の標的化部分カラムにおいて特定された標的化部
分ペイロード（特定された部分の数を持つ、例えば、１ｘまたは３ｘ）、およびｉｉｉ）
表の薬物部分カラムにおいて特定される薬物ファーマコフォア（ＸＴＥＮに共役された薬
物分子の数を持つ、例えば、３ｘまたは９ｘ）の特定の成分を有する。当業者によって理
解されるように、本発明は、開示された成分の他の組合せ、ならびにそれぞれの特定成分
の異なる数または比率、ならびにペイロードが共役される異なるＸＴＥＮ配列を企図する
。例えば、本発明は、所与のＸＴＥＮに付着された薬物部分の数が、１、または２、また
は３、または４、または５、または６、または７、または８、または９、または１０、あ
るいはそれ以上であり得ること、およびＸＴＥＮが、例えば、対応する数の、薬物部分が
共役されるシステインまたはリジン残基を有することを企図する。さらに、本発明は、共
役体に付着された標的部分の数が、１、または２、または３、あるいはそれ以上であり得
ることを企図し、Ｎ末端アミノ基、または対応する数のリジンまたはシステイン残基を持
つＸＴＥＮに同様に結合される。
Ｖ）． 薬学的組成物
本発明は、本開示のＸＴＥＮ−ペイロード共役体を含む薬学的組成物を提供する。一実
施形態において、薬学的組成物は、表２１に記載される共役体からなる群から選択される
共役体と、少なくとも１つの薬学的に許容される担体と、を含む。一実施形態において、
薬学的組成物は、表２および３に記載される配列の群から選択される配列に対して少なく
とも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくと
も約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも
約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約
９８％、または少なくとも約９９％、または１００％の配列同一性を有する、少なくとも
第１のＸＴＥＮ配列を含む共役体を含み、この組成物のＸＴＥＮ配列は、実質的に均質な
長さであり、ＸＴＥＮは、表１１、１２、１８、１９、および２１に記載されるペイロー
ドの群から選択される、少なくとも第１のペイロードに共役され、組成物は、少なくとも
１つの薬学的に許容される担体をさらに含む。一実施形態において、本発明は、本明細書
に記載される実施形態のうちのいずれかのＴＥＮ−ペイロード共役体と、少なくとも１つ
の薬学的に許容される担体と、を含む、薬学的組成物を提供する。
本発明は、実施形態の対象の共役組成物を、少なくとも１つの薬学的に許容される担体
と合わせ、薬学的に許容される製剤にするステップを含む、薬学的組成物を調製する方法
を提供する。本発明のＸＴＥＮ−ペイロード共役体は、既知の方法に従い、薬学的に有用
な組成物を調製するように製剤化されることができ、それによりＸＴＥＮ−ペイロードは
、水溶液または緩衝液、薬学的に許容される懸濁液および乳剤等の薬学的に許容される担
体媒体との混合に合わされる。非水性溶媒の例としては、プロピルエチレングリコール、
ポリエチレングリコール、および植物油が挙げられる。治療製剤は、所望の程度の純度を
有する活性成分を、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅ
ｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に記載される
、任意の生理学的に許容される担体、賦形剤、また安定化剤と混合することによって、凍
結乾燥製剤または水溶液の形態で貯蔵用に調製される。薬学的組成物は、皮下的、注入ポ
ンプによって皮下的、筋肉内、および静脈内を含む任意の適切な手段または経路によって
投与することができる。好適な経路は、受容体の疾患および年齢、ならびに処置される状
態の重症度によって異なることが理解されるであろう。浸透圧ポンプは、錠剤、ピル、カ
プセル、または埋め込み型デバイスの形態で徐放剤として使用され得る。シリンジポンプ
が徐放剤として使用されてもよい。そのようなデバイスは、米国特許第４，９７６，６９
６号、第４，９３３，１８５号、第５，０１７，３７８号、第６，３０９，３７０号、第
６，２５４，５７３号、第４，４３５，１７３号、第４，３９８，９０８号、第６，５７
２，５８５号、第５，２９８，０２２号、第５，１７６，５０２号、第５，４９２，５３
４号、第５，３１８，５４０号、および第４，９８８，３３７号に記載され、それらの内
容は、参照により本明細書に組み込まれる。当業者であれば、本発明の開示およびこれら
の他の特許の開示の双方を考慮して、本発明の組成物の持続放出のためのシリンジポンプ
を産生することができる。
別の実施形態において、本発明は、限定されないが、表１６に記載される状態を含む、
状態の処置に有用な医薬品を製造する際に使用するための本明細書に記載される実施形態
のうちのいずれかのＸＴＥＮ−ペイロード共役体を提供する。
ＶＩ）． 処置方法
本発明は、対象における疾患を処置する方法を提供し、有効な量の前述の実施形態のう
ちのいずれかのＸＴＥＮ−ペイロード共役体を、処置を必要とする対象に投与することを
含む。一実施形態において、ＸＴＥＮ−ペイロードは、表１１、１２、１８、１９、およ
び２１から選択される単一種のペイロードを含む。別の実施形態において、ＸＴＥＮ−ペ
イロードは、表１１、１２、１８、１９、および２１から選択される２種のペイロードを
含む。別の実施形態において、ＸＴＥＮ−ペイロードは、１つのペイロードが表１１、１
２、および１８から選択される２種のペイロードを含み、第２のペイロードは、表２０の
標的への結合親和性を持つ標的化部分であるか、または表１８、１９、もしくは２１のう
ちのいずれか１つの標的化部分である。別の実施形態において、ＸＴＥＮ−ペイロードは
、表１１、１２、１８、１９、および２１から選択される３種以上のペイロードを含む。
この方法において、共役体のペイロードは、当該技術分野において有益な効果を有するこ
とが知られているものであるか、または特定の疾患もしくは状態を持つ対象に投与される
ときに、疾患標的に対する親和性を有するものである。一実施形態において、組成物のペ
イロード（複数可）は、共通の生物学的経路を介して、それらの治療効果を媒介する。こ
のパラグラフの前述の実施形態において、この方法は、癌、癌の支持療法、心血管、中枢
神経系、内分泌疾患、消化管、泌尿生殖器、血液学的、ＨＩＶ感染、ホルモン疾患、炎症
、自己免疫疾患、感染症、代謝疾患、筋骨格系疾患、腎臓学的障害、眼科疾患、疼痛、お
よび呼吸器から選択される疾患を処置または改善または予防することにおいて有用である
。さらなる特殊性に応じて、疾患は、表１６から選択される。
処置方法のいくつかの実施形態において、共役組成物は、皮下的、筋肉内、または静脈
内に投与することができる。一実施形態において、組成物は、治療上有効な量を使用して
投与される。一実施形態において、治療上有効な量の２回以上の連続用量の投与は、ＸＴ
ＥＮに結合されず、相当する用量を使用して対象に投与されるペイロードと比較して、組
成物の治療域内で費やす時間の増加をもたらす。治療域内で費やす時間の増加は、非修飾
ペイロードよりも少なくとも３倍長いか、または代替として、ＸＴＥＮに結合されていな
いペイロードよりも少なくとも４倍、または５倍、または６倍、または７倍、または８倍
、または９倍、または少なくとも１０倍、または少なくとも２０倍、または少なくとも約
３０倍、または少なくとも約５０倍、または少なくとも約１００倍長くなり得る。
処置方法の一実施形態において、治療効果を維持するために必要とされる用量計画下で
、ＸＴＥＮに結合されていない対応するペイロード（複数可）と比較して、より小さなモ
ル／ｋｇ量の約２倍少ないか、または約３倍少ないか、または約４倍少ないか、または約
５倍少ないか、または約６倍少ないか、または約８倍少ないか、または約１０倍少ないか
、あるいはそれ以上少ない共役体またはその共役体を含む薬学的組成物は、処置を必要と
する対象に投与され、この共役体は、治療効果を維持するために必要とされるＸＴＥＮに
結合されていない、対応するモル／ｋｇ量のペイロード（複数可）として、相当する曲線
下面積を達成する。別の実施形態において、共役体またはその共役体を含む薬学的組成物
は、対象の日常的処置に対してより頻度の低い投与を必要とし、共役体または薬学的組成
物の用量は、約４日毎、約７日毎、約１０日毎、約１４日毎、約２１日毎、または約月１
回対象に投与され、共役体は、ＸＴＥＮに結合されずに対象に投与された対応するペイロ
ード（複数可）として、相当する曲線下面積を達成する。さらに他の実施形態において、
有効な血液濃度を維持するために必要とされる用量計画下でＸＴＥＮに結合されていない
、対応する量のペイロード（複数可）と比較して、累積的に少ない量の約５％、または約
１０％、または約２０％、または約４０％、または約５０％、または約６０％、または約
７０％、または約８０％、または約９０％少ないモル／ｋｇの共役体は対象に投与される
が、この共役体は、ＸＴＥＮに結合されていない対応するペイロード（複数可）として、
少なくとも相当する曲線下面積を達成する。累積的に少ない量は、少なくとも約１週間、
または約１４日、または約２１日、または約１ヶ月の期間の対策である。この方法のいく
つかの実施形態において、治療効果は、処置または予防される対象の基礎疾患と関連付け
られることが当該技術分野において知られている、測定パラメータ、臨床症状、またはエ
ンドポイントである。
一実施形態において、本発明は、癌細胞をインビトロで処置する方法を提供し、有効な
量のＸＴＥＮ−ペイロード組成物を含む組成物を、癌細胞の培養物に投与することを含み
、第１のペイロードは、標的化部分であり、第２のペイロードは、表２１の毒素である。
別の実施形態において、本発明は、対象における癌を処置する方法を提供し、有効な量の
ＸＴＥＮ−ペイロード組成物を含む薬学的組成物を、対象に投与することを含み、第１の
ペイロードは、標的化部分であり、第２のペイロードは、表２１の毒素である。この方法
の一実施形態において、薬学的組成物は、図１１７に記載される構造を有する組成物を含
む。この方法の別の実施形態において、癌は、非小細胞肺癌または中皮腫、白金耐性卵巣
癌、子宮内膜癌、肺の腺癌、および難治性進行性腫瘍からなる群から選択される。この方
法の別の実施形態において、投与は、未処置の対象と比較して、癌と関連付けられた少な
くとも１つ、２つ、または３つのパラメータの少なくとも１０％、または２０％、または
３０％、または４０％、または５０％、または６０％、または７０％、または８０％、ま
たは９０％超の改善をもたらし、これらのパラメータは、固形癌の治療効果判定のための
ガイドライン（Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｉｎ Ｓ
ｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｒｓ（ＲＥＣＩＳＴ））によって定義される反応速度、癌の無増悪期
間（再発）、局所再発の発見、局所転移の発見、遠隔転移の発見、症状の発症、入院、疼
痛投薬の必要性の増加、救援化学療法の必要性、救援手術の必要性、救援放射線療法の必
要性、治療成功期間、および生存期間の増加からなる群から選択される。
別の態様において、本発明は、疾患を持つ対象を処置するための計画を提供し、当該計
画は、本明細書に記載される実施形態のうちのいずれかの共役体を含む組成物を含む。こ
の計画の一実施形態において、この計画は、患者における治療効果を達成するために必要
とされるＣＦＸＴＥＮを含む薬学的組成物の量を決定するステップをさらに含む。
本発明は、本明細書に記載される実施形態のうちのいずれかの共役体を含む薬学的組成
物を、有効な量の２回以上の連続用量で投与することを含む、罹患した対象のための治療
計画を含む共役体を提供し、この投与は、疾患と関連付けられた少なくとも１つのパラメ
ータの改善をもたらす。
ＶＩＩ）． 共役キット
別の態様において、本発明は、ＸＴＥＮ−架橋剤共役組成物の使用を促進するためのキ
ットを提供する。一実施形態において、このキットは、製剤中のＸＴＥＮ−架橋剤と、容
器と、その容器上またはそれと関連付けられたラベルと、を含む。前述の実施形態におい
て、ＸＴＥＮ−架橋剤は、本明細書に記載される実施形態のうちのいずれか１つであり得
る。容器は、ペイロードに結合するための共役反応における使用に適した緩衝液中、定義
された濃度でＸＴＥＮ−架橋剤を保持する。
ＶＩＩＩ）． 薬学的キット
別の態様において、本発明は、共役組成物の使用を促進するためのキットを提供する。
このキットは、本明細書に提供される薬学的組成物と、容器と、その容器上またはそれと
関連付けられたラベルまたは添付文書と、を含む。適切な容器としては、例えば、ガラス
またはプラスチック等の多様な材料から形成される、例えば、瓶、小瓶、シリンジ等が挙
げられる。容器は、対象を処置するために有効な製剤として薬学的組成物を保持し、無菌
のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は、静脈内の溶液袋、または皮下注射針によ
って貫通可能な留め具を有する小瓶であってもよい）。添付文書は、薬物の承認された適
応、再構成のための指示、および／または承認された適応に使用するための薬物の投与、
適切な投与量および安全情報、ならびに薬物のロットおよび有効期限を特定する情報を列
挙することができる。前述の別の実施形態において、キットは、薬学的組成物に適した希
釈液を担持することができる第２容器を含むことができ、その使用は、対象に送達される
適切な濃度を使用者に提供する。別の実施形態において、キットは、少なくとも第１の容
器中に、第１の容器と、疾患を持つ対象の処置において投与するのに十分な量の共役組成
物薬と、一定量の薬学的に許容される担体、対象に送達される適切な濃度の薬学的組成物
を使用者に提供する、対象の組成物に適した希釈液を担持することができる第２の容器と
を、薬物および保管および取扱い条件を特定するラベル、および／または薬物の承認され
た適応、再構成のための指示、および／または承認された適応の処置に使用するための薬
物の投与、適切な投与量および安全情報、ならびに薬物のロットおよび有効期限を特定す
る情報のシートと一緒に含む。
ＩＸ）． 本発明の核酸配列
本発明は、共役体のポリペプチド成分をコードするポリ核酸分子に相補的な共役体およ
び配列のポリペプチド成分をコードする単離されたポリ核酸を提供する。いくつかの実施
形態において、本発明は、本明細書に記載される共役体実施形態のうちのいずれかのＸＴ
ＥＮをコードするポリ核酸、またはそのポリ核酸の相補体を提供する。一実施形態におい
て、ポリ核酸は、表２および３に記載されるＸＴＥＮからなる群から選択されるＸＴＥＮ
、またはそのポリ核酸の相補体をコードする。
他の実施形態において、本発明は、本明細書に記載される実施形態のうちのいずれかの
切断配列、親和性タグ、およびヘルパー配列タンパク質に結合されたＸＴＥＮをコードす
るポリ核酸、またはそのポリ核酸の相補体を提供する。一実施形態において、ポリ核酸は
、表７、１８、１９、および２１に記載されるタンパク質ペイロードからなる群から選択
されるタンパク質ペイロード、またはそのポリ核酸の相補体をコードする。
一実施形態において、本発明は、ＸＴＥＮをコードするポリ核酸を産生する方法、およ
び切断配列、親和性タグ、およびヘルパー配列タンパク質実施形態、またはポリ核酸（そ
の相同変異体を含む）に対して相補的な配列に結合されたＸＴＥＮを包含する。一般に、
図３８および３９に示されるように、ＸＴＥＮをコードするポリヌクレオチド配列を産生
し、得られた遺伝子産物を発現させる方法は、ＸＴＥＮをコードするヌクレオチドを組み
立てることと、枠内の成分をライゲーションすることと、コード遺伝子を宿主細胞に適切
な発現ベクターに組み込むことと、適切な宿主細胞を発現ベクターで変形させることと、
変型した宿主細胞中にＸＴＥＮを発現させるか、またはそれを許す条件下で宿主細胞を培
養し、それにより、本明細書に記載される方法または当該技術分野において既知の標準タ
ンパク質精製方法によって回収される、ＸＴＥＮポリペプチドを産生することと、を含む
。分子生物学における標準組換え技法を使用して、本発明のポリヌクレオチドおよび発現
ベクターを製造する。
本発明に従い、ＸＴＥＮをコードする核酸配列、または切断配列、親和性タグ、および
ヘルパー配列タンパク質（またはその相補体）に結合されたＸＴＥＮを使用して、適切な
宿主細胞中の発現を配向する組換えＤＮＡ分子を生成する。いくつかのクローニング戦略
は、本発明を実行するために適切であり、これらの多くを使用して、本発明のＸＴＥＮま
たはペイロード組成物をコードする遺伝子、またはその相補体を含む構築体を生成する。
一実施形態において、クローニング戦略を使用して、ＸＴＥＮ組成物の発現のために宿主
細胞を形質転換するように使用されるＸＴＥＮをコードするヌクレオチドを含む、ＸＴＥ
Ｎをコードする遺伝子を創製する。このパラグラフに記載される前述の実施形態において
、遺伝子は、切断配列、親和性タグ、およびヘルパー配列をコードするヌクレオチドをさ
らに含むことができる。別の実施形態において、クローニング戦略を使用して、ペイロー
ド組成物の発現のために宿主細胞を形質転換するように使用されるペイロードをコードす
るヌクレオチドを含む、タンパク質ペイロードをコードする遺伝子を創製する。
所望のＸＴＥＮ配列を設計する際に、本発明の組成物のＸＴＥＮの非反復性質は、ＸＴ
ＥＮをコードする配列の創製における「ビルディングブロック」分子手法の使用にかかわ
らず達成されることが発見された。これは、上記のペプチド配列モチーフをコードするポ
リヌクレオチドのライブラリーの使用によって達成され、次いで、ライゲーションおよび
／または多量体化され、ＸＴＥＮ配列をコードする遺伝子を創製する（図３８および３９
、ならびに実施例参照）。したがって、発現されたポリペプチドのＸＴＥＮ（複数可）は
、わずか４つの異なる配列モチーフの複数単位からなり得るが、これらのモチーフ自体は
、非反復アミノ酸配列からなるため、全体ＸＴＥＮ配列は、非反復性になる。したがって
、一実施形態において、ＸＴＥＮをコードするポリヌクレオチドは、非反復配列またはモ
チーフをコードし、枠内で操作可能に結合される複数のポリヌクレオチドを含み、得られ
た発現ＸＴＥＮアミノ酸配列は、非反復性である。
一手法において、構築体は、最初に、ＸＴＥＮに対応するＤＮＡ配列を含有して調製さ
れる。そのような構築体の調製のための例示的な方法は、実施例に記載される。次いで、
構築体を使用して、ＸＴＥＮの発現および回収のために、原核宿主細胞（例えば、大腸菌
）等の宿主細胞を形質転換するのに適した発現ベクターを創製する。発現ベクターの創製
、宿主細胞の形質転換、およびＸＴＥＮの回収のための例示的な方法は、実施例に記載さ
れる。
ＸＴＥＮをコードする遺伝子は、１つ以上のステップで、完全に合成的に、または制限
酵素媒介性クローニング、ＰＣＲ、および重複伸長等の酵素的プロセスと合わせた合成に
よるかのいずれかで製造することができ、実施例により完全に説明される方法を含む。本
明細書に開示される方法を使用して、例えば、ＸＴＥＮをコードするポリヌクレオチドの
短い配列を、所望の長さおよび配列のより長いＸＴＥＮ遺伝子にライゲーションすること
ができる。一実施形態において、この方法は、約９〜１４個のアミノ酸、または約１２〜
２０個のアミノ酸、または約１８〜３６個のアミノ酸、または約４８〜１４４個のアミノ
酸、または約１４４〜約２８８個以上のＸＴＥＮモチーフまたはセグメント配列をコード
する２つ、３つ、４つ、またはそれ以上のコドン最適化オリゴヌクレオチド、あるいは前
述の範囲のモチーフまたはセグメント長の任意の組合せをライゲーションする。代替とし
て、開示された方法を使用して、ＸＴＥＮをコードする配列を、所望の長さのより長い配
列に多量体化し、例えば、３６個のアミノ酸のＸＴＥＮをコードする遺伝子は、７２個、
次いで１４４個、次いで２８８個等のアミン酸をコードする遺伝子に二量体化され得る。
多量体化を用いる場合でも、ＸＴＥＮをコードする遺伝子が、使用される最短単位のモチ
ーフに対し選択されたコドンの設計を通じて、低い反復性を有するか、または事実上有し
ないように、ＸＴＥＮポリペプチドを構築することができ、形質転換された宿主における
コード遺伝子の組換えを低減し、安定性を増加させる。非反復配列を持つＸＴＥＮをコー
ドする遺伝子は、遺伝子合成の標準技法を使用して、オリゴヌクレオチドから組み立てら
れる。遺伝子設計は、コドン使用およびアミノ酸組成物を最適化するアルゴリズムを使用
して行うことができる。本発明の一方法において、比較的短いＸＴＥＮをコードするポリ
ヌクレオチド構築体のライブラリーは、上記の通り創製され、次いで組み立てられる。次
いで、得られた遺伝子は、本明細書に記載されるように、ペイロードペプチドまたはポリ
ペプチドをコードする遺伝子と組み立てられ、得られた遺伝子を使用して、宿主細胞を形
質転換し、その特定の評価のために、ＸＴＥＮ−ペイロードを産生および回収する。
得られたＸＴＥＮをコードするポリヌクレオチド、およびそれが結合されるペプチド配
列は、次いで、発現ベクターに個別にクローン化することができる。核酸配列は、多様な
手順によってベクターに挿入される。一般に、ＤＮＡは、当該技術分野において既知の技
法を使用して、適切な制限エンドヌクレアーゼ部位（複数可）に挿入される。ベクター成
分としては、一般に、１つ以上のシグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、
エンハンサー要素、プロモーター、および転写終結配列が挙げられるが、これらに限定さ
れない。これらの成分のうちの１つ以上を含有する適切なベクターの構築は、熟練者には
既知の標準ライゲーション技法を用いる。そのような技法は、当該技術分野において周知
であり、科学的文献および特許文献に十分に記載されている。様々なベクターは、公的に
入手可能である。このベクターは、例えば、便宜的に組換えＤＮＡ手順に共され得るプラ
スミド、コスミド、ウイルス粒子、またはファージの形態であってよく、ベクターの選択
は、それが導入される宿主細胞に依存する場合が多い。したがって、ベクターは、自家複
製ベクター、すなわち、染色体外実体として存在し、その複製が染色体複製から独立して
いるベクター、例えば、プラスミドであり得る。代替として、ベクターは、宿主細胞に導
入されるとき、その宿主細胞ゲノムに統合され、それが組み込まれた染色体（複数可）と
一緒に複製されるものであり得る。代表的なプラスミドは、図１７に例示され、描かれる
ＦＶＩＩＩおよびＸＴＥＮ成分の異なる構成のコード領域を持つ。
本発明は、複製を含有するプラスミド発現ベクター、および宿主細胞と適合し、それに
よって認識され、かつポリペプチドの制御された発現のために、ポリペプチドをコードす
る遺伝子に操作可能に結合される制御配列の使用を提供する。ベクターは、通常、複製部
位、ならびに形質転換された細胞中で表現型選択を提供することができるタンパク質をコ
ードする配列を担持する。そのようなベクター配列は、多様な細菌、酵母、およびウイル
スに対し周知である。使用され得る有用な発現ベクターとしては、例えば、染色体、非染
色体、および合成ＤＮＡ配列のセグメントが挙げられる。「発現ベクター」とは、適切な
宿主においてポリペプチドをコードするＤＮＡの発現を生じさせることができる適切な制
御配列に操作可能に結合される、ＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ構築体を指す。ベクターが
、選択した宿主細胞中で複製可能であり、かつ生存可能であることが要件である。必要に
応じて、低または高コピー数のベクターが使用されてもよい。
適切なベクターとしては、ＳＶ４０およびｐｃＤＮＡの誘導体および既知の細菌プラス
ミド（例えば、Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ５７：３１−４０（１９８８）に
記載されるｃｏｌ ＥＩ、ｐＣＲｌ、ｐＢＲ３２２、ｐＭａｌ−Ｃ２、ｐＥＴ、ｐＧＥＸ
）、ｐＭＢ９およびその誘導体、プラスミド（例えば、ＲＰ４）、ファージＤＮＡ（例え
ば、ＮＭ９８ ９等のファージＩの多数の誘導体、ならびに他のファージＤＮＡ（例えば
、Ｍ１３）および糸状一本鎖ファージＤＮＡ；酵母プラスミド（例えば、２ミクロンプラ
スミドまたはその２ｍプラスミドの誘導体）、ならびにセントメトリックおよび統合酵母
シャトルベクター；真核細胞中で有用なベクター（例えば、昆虫または哺乳類細胞中で有
用なベクター）；プラスミドおよびファージＤＮＡの組合せに由来するベクター（例えば
、ファージＤＮＡまたは発現制御配列を用いるように修飾されたプラスミド）等が挙げら
れるが、これらに限定されない。本発明において使用することもできる酵母発現系として
は、非融合ｐＹＥＳ２ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、融合ｐＹＥＳＨｉｓＡ、Ｂ、
Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲＳベクター等が挙げられるが、これらに限定されない
。ベクターの制御配列としては、転写を生じさせるためのプロモーター、そのような転写
を制御するための任意のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコード
する配列、および転写および翻訳の終結を制御する配列が挙げられる。プロモーターは、
選択された宿主細胞中の転写活性を示す任意のＤＮＡ配列であり得、その宿主細胞に対し
て相同性または非相同性のいずれかであるタンパク質をコードする遺伝子に由来し得る。
発現ベクター中で原核宿主とともに使用するのに適したプロモーターとしては、β−ラク
タマーゼおよびラクトースプロモーター系［Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，
２７５：６１５（１９７８）；Ｇｏｅｄｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２８１：
５４４（１９７９）］、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモータ
ーシステム［Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，８：４０５７（
１９８０）；ＥＰ３６，７７６］、およびｔａｃプロモーター等のハイブリッドプロモー
ター［ｄｅＢｏｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，
８０：２１−２５（１９８３）］が挙げられ、全て、ＣＦＸＴＥＮポリペプチドをコード
するＤＮＡに操作可能に結合される。細菌系に使用するためのプロモーターは、ＣＦＸＴ
ＥＮポリペプチドをコードするＤＮＡに操作可能に連結されたＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒ
ｎｏ（Ｓ．Ｄ．）配列を含有することもできる。
実施例１：ＸＴＥＮ＿ＡＤ３６モチーフセグメントの構築
以下の実施例は、３６個のアミノ酸のモチーフ配列をコードするコドン最適化遺伝子の
集合の構築について説明する。最初のステップとして、ｐＥＴベクターに基づいてスタッ
ファーベクターｐＣＷ０３５９が構築され、Ｔ７プロモーターを含む。ｐＣＷ０３５９は
、セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）、およびＴＥＶプロテアーゼ認識部位に続いて、Ｂ
ｓａＩ、ＢｂｓＩ、およびＫｐｎＩ部位に隣接するスタッファー配列をコードする。Ｂｓ
ａＩおよびＢｂｓＩ部位を、それらが消化後に適合する突出を生成するように挿入した。
スタッファー配列の後に、ＧＦＰ遺伝子およびＨｉｓタグの切断異形が続く。スタッファ
ー配列は、終止コドンを含有し、したがってスタッファープラスミドｐＣＷ０３５９を担
持する大腸菌細胞は、非蛍光コロニーを形成する。このスタッファーベクターｐＣＷ０３
５９は、ＢｓａＩおよびＫｐｎＩで消化され、スタッファーセグメントを除去し、得られ
たベクターフラグメントは、アガロースゲル精製によって単離された。配列は、指定され
たＸＴＥＮ＿ＡＤ３６であり、ＡＤファミリーのモチーフを反映する。そのセグメントは
、アミノ酸配列［Ｘ］３を有し、式中、Ｘは、配列：ＧＥＳＰＧＧＳＳＧＳＥＳ、ＧＳＥ
ＧＳＳＧＰＧＥＳＳ、ＧＳＳＥＳＧＳＳＥＧＧＰ、またはＧＳＧＧＥＰＳＥＳＧＳＳを持
つ１２ｍｅｒペプチドである。以下のホスホリル化合成オリゴヌクレオチド対をアニール
することによって挿入を得た。
ＡＤ１ｆｏｒ： ＡＧＧＴＧＡＡＴＣＴＣＣＤＧＧＴＧＧＹＴＣＹＡＧＣＧＧＴＴＣＹＧ
ＡＲＴＣ
ＡＤ１ｒｅｖ： ＡＣＣＴＧＡＹＴＣＲＧＡＡＣＣＧＣＴＲＧＡＲＣＣＡＣＣＨＧＧＡＧ
ＡＴＴＣ
ＡＤ２ｆｏｒ： ＡＧＧＴＡＧＣＧＡＡＧＧＴＴＣＴＴＣＹＧＧＴＣＣＤＧＧＹＧＡＲＴ
ＣＹＴＣ
ＡＤ２ｒｅｖ： ＡＣＣＴＧＡＲＧＡＹＴＣＲＣＣＨＧＧＡＣＣＲＧＡＡＧＡＡＣＣＴＴ
ＣＧＣＴ
ＡＤ３ｆｏｒ： ＡＧＧＴＴＣＹＴＣＹＧＡＡＡＧＣＧＧＴＴＣＴＴＣＹＧＡＲＧＧＹＧ
ＧＴＣＣ
ＡＤ３ｒｅｖ： ＡＣＣＴＧＧＡＣＣＲＣＣＹＴＣＲＧＡＡＧＡＡＣＣＧＣＴＴＴＣＲＧ
ＡＲＧＡ
ＡＤ４ｆｏｒ： ＡＧＧＴＴＣＹＧＧＴＧＧＹＧＡＡＣＣＤＴＣＹＧＡＲＴＣＴＧＧＴＡ
ＧＣＴＣ

ホスホリル化オリゴヌクレオチド３ＫｐｎＩｓｔｏｐｐｅｒＦｏｒ：ＡＧＧＴＴＣＧＴ
ＣＴＴＣＡＣＴＣＧＡＧＧＧＴＡＣ、および非ホスホリル化オリゴヌクレオチドｐｒ＿３
ＫｐｎＩｓｔｏｐｐｅｒＲｅｖ：ＣＣＴＣＧＡＧＴＧＡＡＧＡＣＧＡもアニールした。ア
ニールしたオリゴヌクレオチド対をライゲーションしたところ、可変長を持つ産物の混合
物をもたらし、これは１つのＢｂｓＩ／ＫｐｎＩセグメントにライゲーションされた可変
数の１２ｍｅｒ反復を表す。３６個のアミノ酸長に対応する産物は、調製アガロースゲル
電気泳動によって混合物から単離され、ＢｓａＩ／ＫｐｎＩ消化されたスタッファーベク
ターｐＣＷ０３５９にライゲーションされた。得られたライブラリー（ＬＣＷ０４０１と
指定される）中のクローンの大部分は、誘導後に緑色蛍光を示し、これは、ＸＴＥＮ＿Ａ
Ｄ３６の配列が、枠内でＧＦＰ遺伝子とライゲーションされていたこと、およびＸＴＥＮ
＿ＡＤ３６の大部分の配列が、良好な発現レベルを有したことを示す。
ライブラリーＬＣＷ０４０１からの９６個の単離体を、ＩＰＴＧを含有するアガープレ
ートの上にそれらをスタンプすることによって、高レベルの蛍光についてスクリーニング
した。同じ単離体をＰＣＲによって評価し、３６個のアミノ酸ならびに強力な蛍光を持つ
セグメントを含有する４８個の単離体を特定した。これらの単離体を配列決定し、正しい
ＸＴＥＮ＿ＡＤ３６セグメントを含有する３９個のクローンを特定した。これらのセグメ
ントのヌクレオチドおよびアミノ酸構築体のファイル名は、表２２に列挙される。
実施例２：ＸＴＥＮ＿ＡＥ３６セグメントの構築
３６アミノ酸長のＸＴＥＮ配列をコードするコドンライブラリーを構築した。ＸＴＥＮ
配列は、ＸＴＥＮ＿ＡＥ３６と指定した。そのセグメントは、アミノ酸配列［Ｘ］３を有
し、式中、Ｘは、配列：ＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥ、ＧＳＥＰＡＴＳＧＳＥＴＰ、ＧＴＳ
ＥＳＡＴＰＥＳＧＰ、またはＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰを持つ１２ｍｅｒペプチドである
。以下のホスホリル化合成オリゴヌクレオチド対をアニールすることによって挿入を得た
。
ＡＥ１ｆｏｒ： ＡＧＧＴＡＧＣＣＣＤＧＣＷＧＧＹＴＣＴＣＣＤＡＣＹＴＣＹＡＣＹＧ
ＡＲＧＡ
ＡＥ１ｒｅｖ： ＡＣＣＴＴＣＹＴＣＲＧＴＲＧＡＲＧＴＨＧＧＡＧＡＲＣＣＷＧＣＨＧ
ＧＧＣＴ
ＡＥ２ｆｏｒ： ＡＧＧＴＡＧＣＧＡＡＣＣＫＧＣＷＡＣＹＴＣＹＧＧＹＴＣＴＧＡＲＡ
ＣＹＣＣ
ＡＥ２ｒｅｖ： ＡＣＣＴＧＧＲＧＴＹＴＣＡＧＡＲＣＣＲＧＡＲＧＴＷＧＣＭＧＧＴＴ
ＣＧＣＴ
ＡＥ３ｆｏｒ： ＡＧＧＴＡＣＹＴＣＴＧＡＡＡＧＣＧＣＷＡＣＹＣＣＫＧＡＲＴＣＹＧ
ＧＹＣＣ
ＡＥ３ｒｅｖ： ＡＣＣＴＧＧＲＣＣＲＧＡＹＴＣＭＧＧＲＧＴＷＧＣＧＣＴＴＴＣＡＧ
ＡＲＧＴ
ＡＥ４ｆｏｒ： ＡＧＧＴＡＣＹＴＣＴＡＣＹＧＡＡＣＣＫＴＣＹＧＡＲＧＧＹＡＧＣＧ
ＣＷＣＣ
ＡＥ４ｒｅｖ： ＡＣＣＴＧＧＷＧＣＧＣＴＲＣＣＹＴＣＲＧＡＭＧＧＴＴＣＲＧＴＡＧ
ＡＲＧＴ

ホスホリル化オリゴヌクレオチド３ＫｐｎＩｓｔｏｐｐｅｒＦｏｒ：ＡＧＧＴＴＣＧＴ
ＣＴＴＣＡＣＴＣＧＡＧＧＧＴＡＣ、および非ホスホリル化オリゴヌクレオチドｐｒ＿３
ＫｐｎＩｓｔｏｐｐｅｒＲｅｖ：ＣＣＴＣＧＡＧＴＧＡＡＧＡＣＧＡもアニールした。ア
ニールしたオリゴヌクレオチド対をライゲーションしたところ、可変長を持つ産物の混合
物をもたらし、これは１つのＢｂｓＩ／ＫｐｎＩセグメントにライゲーションされた可変
数の１２ｍｅｒ反復を表す。３６個のアミノ酸長に対応する産物は、調製アガロースゲル
電気泳動によって混合物から単離され、ＢｓａＩ／ＫｐｎＩ消化されたスタッファーベク
ターｐＣＷ０３５９にライゲーションされた。得られたライブラリー（ＬＣＷ０４０２と
指定される）中のクローンの大部分は、誘導後に緑色蛍光を示し、これは、ＸＴＥＮ＿Ａ
Ｅ３６の配列が、枠内でＧＦＰ遺伝子とライゲーションされていたこと、およびＸＴＥＮ
＿ＡＥ３６の大部分の配列が、良好な発現を示すことを示す。
ライブラリーＬＣＷ０４０２からの９６個の単離体を、ＩＰＴＧを含有するアガープレ
ートの上にそれらをスタンプすることによって、高レベルの蛍光についてスクリーニング
した。同じ単離体をＰＣＲによって評価し、３６個のアミノ酸ならびに強力な蛍光を持つ
セグメントを含有する４８個の単離体を特定した。これらの単離体を配列決定し、正しい
ＸＴＥＮ＿ＡＥ３６セグメントを含有する３７個のクローンを特定した。これらのセグメ
ントのヌクレオチドおよびアミノ酸構築体のファイル名は、表２３に列挙される。
実施例３：ＸＴＥＮ＿ＡＦ３６セグメントの構築
３６アミノ酸長の配列をコードするコドンライブラリーを構築した。配列は、ＸＴＥＮ
＿ＡＦ３６と指定した。そのセグメントは、アミノ酸配列［Ｘ］３を有し、式中、Ｘは、
配列：ＧＳＴＳＥＳＰＳＧＴＡＰ、ＧＴＳＴＰＥＳＧＳＡＳＰ、ＧＴＳＰＳＧＥＳＳＴＡ
Ｐ、またはＧＳＴＳＳＴＡＥＳＰＧＰを持つ１２ｍｅｒペプチドである。以下のホスホリ
ル化合成オリゴヌクレオチド対をアニールすることによって挿入を得た。
ＡＦ１ｆｏｒ： ＡＧＧＴＴＣＴＡＣＹＡＧＣＧＡＡＴＣＹＣＣＫＴＣＴＧＧＹＡＣＹＧ
ＣＷＣＣ
ＡＦ１ｒｅｖ： ＡＣＣＴＧＧＷＧＣＲＧＴＲＣＣＡＧＡＭＧＧＲＧＡＴＴＣＧＣＴＲＧ
ＴＡＧＡ
ＡＦ２ｆｏｒ： ＡＧＧＴＡＣＹＴＣＴＡＣＹＣＣＫＧＡＡＡＧＣＧＧＹＴＣＹＧＣＷＴ
ＣＴＣＣ
ＡＦ２ｒｅｖ： ＡＣＣＴＧＧＡＧＡＷＧＣＲＧＡＲＣＣＧＣＴＴＴＣＭＧＧＲＧＴＡＧ
ＡＲＧＴ
ＡＦ３ｆｏｒ： ＡＧＧＴＡＣＹＴＣＹＣＣＫＡＧＣＧＧＹＧＡＡＴＣＴＴＣＴＡＣＹＧ
ＣＷＣＣ
ＡＦ３ｒｅｖ： ＡＣＣＴＧＧＷＧＣＲＧＴＡＧＡＡＧＡＴＴＣＲＣＣＧＣＴＭＧＧＲＧ
ＡＲＧＴ
ＡＦ４ｆｏｒ： ＡＧＧＴＴＣＹＡＣＹＡＧＣＴＣＴＡＣＹＧＣＷＧＡＡＴＣＴＣＣＫＧ
ＧＹＣＣ
ＡＦ４ｒｅｖ： ＡＣＣＴＧＧＲＣＣＭＧＧＡＧＡＴＴＣＷＧＣＲＧＴＡＧＡＧＣＴＲＧ
ＴＲＧＡ

ホスホリル化オリゴヌクレオチド３ＫｐｎＩｓｔｏｐｐｅｒＦｏｒ：ＡＧＧＴＴＣＧＴ
ＣＴＴＣＡＣＴＣＧＡＧＧＧＴＡＣ、および非ホスホリル化オリゴヌクレオチドｐｒ＿３
ＫｐｎＩｓｔｏｐｐｅｒＲｅｖ：ＣＣＴＣＧＡＧＴＧＡＡＧＡＣＧＡもアニールした。ア
ニールしたオリゴヌクレオチド対をライゲーションしたところ、可変長を持つ産物の混合
物をもたらし、これは１つのＢｂｓＩ／ＫｐｎＩセグメントにライゲーションされた可変
数の１２ｍｅｒ反復を表す。３６個のアミノ酸長に対応する産物は、調製アガロースゲル
電気泳動によって混合物から単離され、ＢｓａＩ／ＫｐｎＩ消化されたスタッファーベク
ターｐＣＷ０３５９にライゲーションされた。得られたライブラリー（ＬＣＷ０４０３と
指定される）中のクローンの大部分は、誘導後に緑色蛍光を示し、これは、ＸＴＥＮ＿Ａ
Ｆ３６の配列が、枠内でＧＦＰ遺伝子とライゲーションされていたこと、およびＸＴＥＮ
＿ＡＦ３６の大部分の配列が、良好な発現を示すことを示す。
ライブラリーＬＣＷ０４０３からの９６個の単離体を、ＩＰＴＧを含有するアガープレ
ートの上にそれらをスタンプすることによって、高レベルの蛍光についてスクリーニング
した。同じ単離体をＰＣＲによって評価し、３６個のアミノ酸ならびに強力な蛍光を持つ
セグメントを含有する４８個の単離体を特定した。これらの単離体を配列決定し、正しい
ＸＴＥＮ＿ＡＦ３６セグメントを含有する４４個のクローンを特定した。これらのセグメ
ントのヌクレオチドおよびアミノ酸構築体のファイル名は、表２４に列挙される。
実施例４：ＸＴＥＮ＿ＡＧ３６セグメントの構築
３６アミノ酸長の配列をコードするコドンライブラリーを構築した。配列は、ＸＴＥＮ
＿ＡＧ３６と指定した。そのセグメントは、アミノ酸配列［Ｘ］３を有し、式中、Ｘは、
配列：ＧＴＰＧＳＧＴＡＳＳＳＰ、ＧＳＳＴＰＳＧＡＴＧＳＰ、ＧＳＳＰＳＡＳＴＧＴＧ
Ｐ、またはＧＡＳＰＧＴＳＳＴＧＳＰを持つ１２ｍｅｒペプチドである。以下のホスホリ
ル化合成オリゴヌクレオチド対をアニールすることによって挿入を得た。
ＡＧ１ｆｏｒ： ＡＧＧＴＡＣＹＣＣＫＧＧＹＡＧＣＧＧＴＡＣＹＧＣＷＴＣＴＴＣＹＴ
ＣＴＣＣ
ＡＧ１ｒｅｖ： ＡＣＣＴＧＧＡＧＡＲＧＡＡＧＡＷＧＣＲＧＴＡＣＣＧＣＴＲＣＣＭＧ
ＧＲＧＴ
ＡＧ２ｆｏｒ： ＡＧＧＴＡＧＣＴＣＴＡＣＹＣＣＫＴＣＴＧＧＴＧＣＷＡＣＹＧＧＹＴ
ＣＹＣＣ
ＡＧ２ｒｅｖ： ＡＣＣＴＧＧＲＧＡＲＣＣＲＧＴＷＧＣＡＣＣＡＧＡＭＧＧＲＧＴＡＧ
ＡＧＣＴ
ＡＧ３ｆｏｒ： ＡＧＧＴＴＣＴＡＧＣＣＣＫＴＣＴＧＣＷＴＣＹＡＣＹＧＧＴＡＣＹＧ
ＧＹＣＣ
ＡＧ３ｒｅｖ： ＡＣＣＴＧＧＲＣＣＲＧＴＡＣＣＲＧＴＲＧＡＷＧＣＡＧＡＭＧＧＧＣ
ＴＡＧＡ
ＡＧ４ｆｏｒ： ＡＧＧＴＧＣＷＴＣＹＣＣＫＧＧＹＡＣＹＡＧＣＴＣＴＡＣＹＧＧＴＴ
ＣＴＣＣ
ＡＧ４ｒｅｖ： ＡＣＣＴＧＧＡＧＡＡＣＣＲＧＴＡＧＡＧＣＴＲＧＴＲＣＣＭＧＧＲＧ
ＡＷＧＣ
ホスホリル化オリゴヌクレオチド３ＫｐｎＩｓｔｏｐｐｅｒＦｏｒ：ＡＧＧＴＴＣＧＴ
ＣＴＴＣＡＣＴＣＧＡＧＧＧＴＡＣ、および非ホスホリル化オリゴヌクレオチドｐｒ＿３
ＫｐｎＩｓｔｏｐｐｅｒＲｅｖ：ＣＣＴＣＧＡＧＴＧＡＡＧＡＣＧＡもアニールした。ア
ニールしたオリゴヌクレオチド対をライゲーションしたところ、可変長を持つ産物の混合
物をもたらし、これは１つのＢｂｓＩ／ＫｐｎＩセグメントにライゲーションされた可変
数の１２ｍｅｒ反復を表す。３６個のアミノ酸長に対応する産物は、調製アガロースゲル
電気泳動によって混合物から単離され、ＢｓａＩ／ＫｐｎＩ消化されたスタッファーベク
ターｐＣＷ０３５９にライゲーションされた。得られたライブラリー（ＬＣＷ０４０４と
指定される）中のクローンの大部分は、誘導後に緑色蛍光を示し、これは、ＸＴＥＮ＿Ａ
Ｇ３６の配列が、枠内でＧＦＰ遺伝子とライゲーションされていたこと、およびＸＴＥＮ
＿ＡＧ３６の大部分の配列が、良好な発現を示すことを示す。
ライブラリーＬＣＷ０４０４からの９６個の単離体を、ＩＰＴＧを含有するアガープレ
ートの上にそれらをスタンプすることによって、高レベルの蛍光についてスクリーニング
した。同じ単離体をＰＣＲによって評価し、３６個のアミノ酸ならびに強力な蛍光を持つ
セグメントを含有する４８個の単離体を特定した。これらの単離体を配列決定し、正しい
ＸＴＥＮ＿ＡＧ３６セグメントを含有する４４個のクローンを特定した。これらのセグメ
ントのヌクレオチドおよびアミノ酸構築体のファイル名および配列は、表２５に列挙され
る。
実施例５：ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４の構築
ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４は、ＸＴＥＮ＿ＡＥ３６からＡＥ７２、１４４、２８８、５７６
、および８６４への連続二量体化から構築した。ＸＴＥＮ＿ＡＥ７２セグメントの集合は
、ＸＴＥＮ＿ＡＥ３６の３７個の異なるセグメントから構築した。３７個の異なる３６−
アミノ酸セグメントを全て内包する大腸菌の培養物を混合し、プラスミドを単離した。こ
のプラスミドプールをＢｓａＩ／Ｎｃｏｌで消化し、小さなフラグメントを挿入として生
成した。同じプラスミドプールをＢｂｓＩ／Ｎｃｏｌで消化し、大きなフラグメントをベ
クターとして生成した。これらの挿入およびベクターフラグメントをライゲーションして
長さを２倍にし、ライゲーション混合物をＢＬ２１Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）細胞に形質転換し
てＸＴＥＮ＿ＡＥ７２のコロニーを得た。
ＸＴＥＮ＿ＡＥ７２セグメントのこのライブラリーは、ＬＣＷ０４０６と指定した。Ｌ
ＣＷ０４０６からの全てのクローンを合わせ、上記と同じプロセスを使用して再度二量体
化して、ＸＴＥＮ＿ＡＥ１４４のライブラリーＬＣＷ０４１０を生じた。ＬＣＷ０４１０
からの全てのクローンを合わせ、上記と同じプロセスを使用して再度二量体化して、ＸＴ
ＥＮ＿ＡＥ２８８のライブラリーＬＣＷ０４１４を生じた。２つの単離体ＬＣＷ０４１４
．００１およびＬＣＷ０４１４．００２を、ライブラリーからランダムに選抜し、配列決
定して同一性を検証した。ＬＣＷ０４１４からの全てのクローンを合わせ、上記と同じプ
ロセスを使用して再度二量体化して、ＸＴＥＮ＿ＡＥ５７６のライブラリーＬＣＷ０４１
８を生じた。ライブラリーＬＣＷ０４１８からの９６個の単離体を、高レベルのＧＦＰ蛍
光についてスクリーニングした。ＰＣＲによる適正サイズの挿入および強い蛍光を持つ８
個の単離体を配列決定し、２個の単離体（ＬＣＷ０４１８．０１８およびＬＣＷ０４１８
．０５２）を、配列決定および発現データに基づいて、今後の使用のために選択した。
ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４の特定のクローンｐＣＷ０４３２は、上記と同じ二量体化プロセ
スを使用し、ＸＴＥＮ＿ＡＥ５７６のＬＣＷ０４１８．０１８と、ＸＴＥＮ＿ＡＥ２８８
のＬＣＷ０４１４．００２とを合わせることによって構築した。
実施例６：ＸＴＥＮ＿ＡＧ８６４の構築
数回の連続二量体化を使用して、実施例１に列挙されるＸＴＥＮ＿ＡＤ３６のセグメン
トから始まるＸＴＥＮ＿ＡＧ８６４配列の集合を組み立てた。これらの配列は、実施例３
に記載の通り組み立てた。ＸＴＥＮ＿ＡＧ８６４からのいくつかの単離体を評価したとこ
ろ、生理学的条件下で良好な発現および優れた可溶性を示すことが見出された。ＸＴＥＮ
＿ＡＧ８６４の全長クローンは、優れた可溶性を有し、カニクイザルにおいて６０時間を
超える半減期を示した。
実施例７：ＣＢＤ−ＸＴＥＮ−Ｃｙｓ、システイン操作されたＸＴＥＮの構築
１つのシステインを含有するアミノ酸配列ＧＧＳＰＡＧＳＣＴＳＰをコードするシステ
イン島（ＣｙｓＩｓｌａｎｄ）は、アニールしたオリゴによってＣＢＤ−スタッファー−
ＧＦＰベクターに導入し、ＣＢＤ−ＣｙｓＩｓｌａｎｄ−ＧＦＰを得た（ＣｙｓＩｓｌａ
ｎｄは、制限部位ＢｓａＩおよびＢｂｓＩに隣接する）。ＣＢＤ−スタッファー−ＧＦＰ
ベクターは、ＣＢＤとスタッファーとの間にＴＥＶプロテアーゼ認識部位を持つＮｏｖａ
ｇｅｎに由来するｐＥＴ３０である。構築体は、ＣＢＤ−スタッファー−ＧＦＰベクター
中のスタッファーを、ＸＴＥＮ＿ＡＥ２８８およびＸＴＥＮ＿ＡＥ５７６をコードする遺
伝子と置き換えることによって以前に生成された。ＣＢＤ−ＸＴＥＮ＿ＡＥ２８８−ＧＦ
ＰのプラスミドをＢｓａＩ／Ｎｃｏｌで消化し、小さなフラグメントを挿入として生成し
た。ＣＢＤ−ＣｙｓＩｓｌａｎｄ−ＧＦＰのプラスミドをＢｂｓＩ／Ｎｃｏｌで消化し、
大きなフラグメントをベクターとして生成した。これらの挿入およびベクターフラグメン
トをライゲーションし、ライゲーション混合物をＢＬ２１−Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）細胞に電
気穿孔して、ＣＢＤ−ＣｙｓＩｓｌａｎｄ−ＸＴＥＮ＿ＡＥ２８８−ＧＦＰの形質転換体
を得た。同様に、ＣＢＤ−ＣｙｓＩｓｌａｎｄ−ＸＴＥＮ＿ＡＥ２８８−ＧＦＰのプラス
ミドをＢｓａＩ／Ｎｃｏｌで消化し、小さなフラグメントを挿入として生成した。ＣＢＤ
−ＸＴＥＮ＿ＡＥ５７６−ＧＦＰのプラスミドをＢｂｓＩ／Ｎｃｏｌで消化し、大きなフ
ラグメントをベクターとして生成した。これらの挿入およびベクターフラグメントをライ
ゲーションし、ライゲーション混合物をＢＬ２１−Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）細胞に電気穿孔し
て、ＣＢＤ−ＸＴＥＮ＿ＡＥ５７６−ＣｙｓＩｓｌａｎｄ−ＸＴＥＮ＿ＡＥ２８８−ＧＦ
Ｐの形質転換体を得た。最後に、ＣＢＤ−ＸＴＥＮ＿ＡＥ５７６−ＣｙｓＩｓｌａｎｄ−
ＸＴＥＮ＿ＡＥ２８８−ＧＦＰのプラスミドをＢｂｓＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化してＧＦ
Ｐを除去し、終止コドンに対しアニールしたオリゴとライゲーションし、ライゲーション
混合物をＢＬ２１−Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）細胞に電気穿孔して、表２６に列挙されるＤＮＡ
およびコードされたアミノ酸配列を有するＣＢＤ−ＸＴＥＮ＿ＡＥ５７６−ＣｙｓＩｓｌ
ａｎｄ−ＸＴＥＮ＿ＡＥ２８８の形質転換体を得た。追加の構築体は、複数の挿入を含む
、所与の位置に適切な制限部位の選択によって、ＸＴＥＮ配列内の異なる位置に挿入され
たシステインを用いて創製することができる。この方法を利用して、リジンをコードする
コドンを、オリゴヌクレオチド中のシステインをコードするものと置換することによって
、リジン操作されたＸＴＥＮを創製することもできる。
実施例８：Ｃｙｓ３−ＸＴＥＮの構築
一対のプライマーは、配列ＧＲＡＴＡＥＡＡＧＣＧＴＡＥＡＡの制限部位ＢａｍＨＩお
よびシステイン島１をＸＴＥＮ＿ＡＥ４３２−１のＮ末端に、および配列ＴＡＥＡＡＧの
部分的システイン島２および制限部位ＢｂＳｌをＸＴＥＮ＿ＡＥ４３２−１のＣ末端に導
入するように設計された。第２のプライマー対は、配列ＧＣＧＴＡＥＡＡの制限部位Ｂｓ
ａＩおよび部分的システイン島２をＸＴＥＮ＿ＡＥ４３２−２のＮ末端に、および８ｘＨ
ｉｓタグ（Ｈ８）を持つ配列ＴＡＥＡＡＧＣＧＴＡＥＡＡＲのシステイン島４および制限
部位ＨｉｎｄＩＩＩをＸＴＥＮ＿ＡＥ４３２−２のＣ末端に導入するように設計された。
ＸＴＥＮ＿ＡＥ４３２−１は、１〜４３２アミノ酸配列を含有し、ＸＴＥＮ＿ＡＥ４３２
−２は、ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４遺伝子によってコードされた４３３〜８６４アミノ酸配列
を有する。これらの２つのプライマー対を使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に
よって、それぞれＸＴＥＮ＿ＡＥ４３２−１およびＸＴＥＮ＿ＡＥ４３２−遺伝子を増幅
させた。適正サイズのＰＣＲ産物をゲル精製し、それぞれ制限酵素ＢａｍＨＩ／ＢｂｓＩ
およびＢｓａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩでライゲーションのための挿入として消化した。宛先ベ
クターである、ｐＥＴ３０の誘導体（Ｎｏｖａｇｅｎ）は、隣接する制限部位ＢａｍＨＩ
およびＨｉｎｄＩＩＩを持つＣＢＤ（セルロース結合ドメイン）−スタッファーを含む。
宛先ベクターを制限酵素ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化してスタッファーを除去し、
ベクターとして調製した。このベクターを、上記ＸＴＥＮ＿ＡＥ４３２−１のＢａｍＨＩ
／ＢｂｓＩで消化されたＰＣＲ産物、およびＸＴＥＮ＿ＡＥ４３２−２のＢｓａＩ／Ｈｉ
ｎｄＩＩＩで消化されたＰＣＲとライゲーションした。ライゲーション混合物は、大腸菌
の上位１０個のコンピテント細胞に形質転換した。ＤＮＡミニプレップによって軽質転換
体をスクリーニングし、ＤＮＡ配列決定によって所望の構築体を確認した。したがって、
最終プラスミドは、Ｔ７プロモーターの制御下で、ＣＢＤ−システイン島１−ＸＴＥＮ＿
ＡＥ４３２−システイン島２−ＸＴＥＮ＿ＡＥ４３２−システイン島３−Ｈ８遺伝子を生
じる。ＤＮＡ配列およびタンパク質配列は、表２７に提供される。
実施例９：Ｌｙｓ２−ＸＴＥＮの構築
一対のプライマーは、制限部位ＢａｍＨＩおよびアミノ酸配列ＧＲＧＳＰをＸＴＥＮ＿
ＡＥ４３２−１のＮ末端に、およびアミノ酸配列ＴＡＥＡＡＧおよび制限部位ＢｂｓＩを
ＸＴＥＮ＿ＡＥ４３２−１のＣ末端に導入するように設計された。第２のプライマー対は
、制限部位ＢｓａＩおよびＧＫＰＧＴＡＥＡＡの統合されたリジンを持つアミノ酸配列を
ＸＴＥＮ＿ＡＥ４３２−２のＮ末端に、および８ｘＨｉｓタグ（Ｈ８）を持つＧＫＡＴの
統合されたリジンを持つアミノ酸配列および制限部位ＨｉｎｄＩＩＩをＸＴＥＮ＿ＡＥ４
３２−２のＣ末端に導入するように設計された。ＸＴＥＮ＿ＡＥ４３２−１は、１〜４３
２アミノ酸配列を含有し、ＸＴＥＮ＿ＡＥ４３２−２は、ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４遺伝子に
よってコードされた４３３〜８６４アミノ酸配列を有する。これらの２つのプライマー対
を使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、それぞれＸＴＥＮ＿ＡＥ４３２
−１およびＸＴＥＮ＿ＡＥ４３２−２遺伝子を増幅させた。適正サイズのＰＣＲ産物をゲ
ル精製し、それぞれ制限酵素ＢａｍＨＩ／ＢｂｓＩおよびＢｓａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩでラ
イゲーションのための挿入として消化した。隣接する制限部位ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩ
Ｉを持つＣＢＤ（セルロース結合ドメイン）−スタッファーの宛先ベクターであるｐＥＴ
３０（Ｎｏｖａｇｅｎ）の誘導体を、制限酵素ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化してス
タッファーを除去し、ベクターとして調製した。このベクターを、上記のＸＴＥＮ＿ＡＥ
４３２−１のＢａｍＨＩ／ＢｂｓＩで消化されたＰＣＲ産物、およびＸＴＥＮ＿ＡＥ４３
２−２のＢｓａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化されたＰＣＲとライゲーションする。ライゲー
ション混合物は、大腸菌の上位１０個のコンピテント細胞に形質転換した。ＤＮＡミニプ
レップによって形質転換体をスクリーニングし、ＤＮＡ配列決定によって所望の構築体を
確認した。したがって、最終プラスミドは、Ｔ７プロモーターの制御下で、ＣＢＤ−ＧＲ
ＧＳＰ−ＸＴＥＮ＿ＡＥ４３２−ＴＡＥＡＡＧＫＰＧＴＡＥＡＡ−ＸＴＥＮ＿ＡＥ４３２
−ＧＫＡＴ−Ｈ８遺伝子を生じる。ＤＮＡ配列およびタンパク質配列は、表２８に提供さ
れる。
実施例１０：共役のためのＸＴＥＮの発現の宿主株およびプロモーター
Ｔ７／ｌａｃプロモーターの制御下でＣＢＤ−ＴＥＶ部位−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４を発
現するプラスミドｐＣＷ１０５４、Ｔ７／ｌａｃプロモーターの制御下でＣＢＤ−ＴＥＶ
部位−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４−ＧＦＰを発現するｐＬＣＷ０９６８．００３、およびＰｈ
ｏＡプロモーターの制御下でＣＢＤ−ＴＥＶ部位−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４−ＧＦＰを発現
するｐＬＣＷ０９７０．０３０を、大腸菌ＢＬ２１ ＤＥ３および大腸菌ＢＬ２１ ＤＥ
３ ｒｎｅ−１３１の双方において形質転換した（Ｌｏｐｅｚ，Ｐ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．
（１９９９）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３３，１８８−１９９）。ｒｎｅ−１３１変
異は、ＲＮａｓｅ Ｅの３’エンドリボヌクレアーゼ的活性を妨害する（Ｋｉｄｏ，Ｍ．
，ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１７８
：３９１７−３９２５）。単一コロニーを選抜し、適切な選択的抗生物質を含有する２ｍ
ＬのＬＢブロス培地に播種することによって、６つの形質転換体の全ての種培養物を調製
した。種培養物を終夜成長させ、０．５ｍＬを使用して、ｐＣＷ１０５４およびｐＬＣＷ
０９６８．００３を含有する細胞には２５ｍＬの２ｘＹＴブロス、ｐＬＣＷ０９７０．０
３０を含有する細胞には２５ｍＬのＰｈｏＡ誘導ブロス（Ａｍｕｎｉｘレシピ１３６−１
）を４重複で播種した。培養物を３７℃で３時間振動させた。次いで、全ての培養物に対
して温度を２６℃に低減し、ｐＣＷ１０５４およびｐＬＣＷ０９６８．００３タンパク質
を含有する細胞に対し、１．０ｍＭの最終濃度でＩＰＴＧを用いて発現を誘導した。ｐＬ
ＣＷ０７０．０３０中のＰｈｏＡプロモーターの誘導は、培養培地からのリン酸塩が枯渇
すると自己誘導される。次いで、培養物を２６℃で終夜振動させた。各培養物の試料を溶
解し、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのＮｕＰＡＧＥ ４〜１２％のビス−トリスゲルを使用
し、製造者の仕様に従い、クマシー染色を用いて２０μｌの各溶解物を非還元ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥに共した。結果（図４３）は、ＣＢＤ−ＴＥＶ部位−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４−ＧＦ
ＰまたはＣＢＤ−ＴＥＶ部位−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４のいずれかが、Ｔ７／ｌａｃプロモ
ーターの制御下で発現されるとき、組換えタンパク質の収率は、大腸菌ＢＬ２１ ＤＥ３
細胞と比較して、ＢＬ２１ ＤＥ３ ｒｎｅ−１３１中で著しく高いことを示した。細胞
は、蛍光プレートリーダーを使用し、ＧＦＰ蛍光についても測定した。結果（図４４）は
、ＰｈｏＡプロモーターの制御下でのＣＢＤ−ＴＥＶ部位−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４−ＧＦ
Ｐの大腸菌ＢＬ２１ ＤＥ３細胞における発現は、Ｔ７／ｌａｃプロモーターの制御下で
のＣＢＤ−ＴＥＶ部位−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４−ＧＦＰの発現よりもほぼ３倍多いことを
示した。大腸菌ＢＬ２１ ＤＥ３ ｒｎｅ−１３１において、Ｔ７／ｌａｃおよびＰｈｏ
Ａプロモーターの双方は、同様レベルの発現を生じた。したがって、Ｒｎａｓｅ Ｅ ３
’リボエンドヌクレアーゼ的活性の阻害時にのみ、Ｔ７／ｌａｃ誘導は、ＰｈｏＡ誘導を
使用して得られるものに類似する力価を生じる。同様に、翻訳に対して、より速い速度の
Ｔ７ ＲＮＡＰ転写（Ｓｔｕｄｉｅｒ，Ｗ．，ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １８９：１１３−１３０）は、エンドヌ
クレアーゼ的攻撃の影響を受け易い核酸ｍＲＮＡをもたらすが、転写が天然の大腸菌ＲＮ
ＡポリメラーゼＩＩによって媒介されるＰｈｏＡ誘導の場合、転写速度は、翻訳速度と密
接に結合し、エンドヌクレアーゼ的攻撃からｍＲＮＡを保護する。
実施例１１：１ｘアミノ−ＸＴＥＮ２８８の構築
一対のプライマーＡＥ２７８ＢｓａＩｆｏｒ−ＡＡＣＧおよびＡＥ２７８−ＲＨ８Ｈｉ
ｎｄＩＩＩｒｅｖを使用して、ＰＣＲ産物ＸＴＥＮ＿ＡＥ２７８を得るために、ＸＴＥＮ
＿ＡＥ８６４＿００３を含有するプラスミドをＰＣＲした。適正サイズのバンドのゲル精
製に続いて、ＸＴＥＮ＿ＡＥ２７８−Ｒ−Ｈ８の挿入としてＢｓａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩを
用いて消化を行った。Ｎ末端−ＲＰ１１−Ｒ−ＡＥ４３２＿３Ｃｙｓ−Ｒ−Ｈ８（構築体
ＡＣ７６３）の遺伝子をコードするプラスミドｐＣＷ１１６１の消化をＢｓａＩ／Ｈｉｎ
ｄＩＩＩで行い、ＡＥ４３２＿３Ｃｙｓ−Ｒ−Ｈ８のフラグメントを除去し、大きなフラ
グメントをベクターとしてゲル精製した。ベクターの挿入とのライゲーションを行い、そ
れを使用してＢＬ２１コンピタント細胞を形質転換し、Ｎ末端−ＲＰ１１−Ｒ−ＡＥ２８
８−Ｒ−Ｈ８の構築体を得た。２つのトリプシン消化部位（Ｒ、アルギニン）間のＸＴＥ
Ｎの長さを、ＸＴＥＮ＿ＡＥ２７８にいくつかの隣接するアミノ酸を足すことによって計
算したところ、ちょうど２８８個のアミノ酸に相当した。したがって、構築体は、トリプ
シン消化によるＮ末端−ＲＰ１１タグおよびＣ末端８ｘＨｉｓタグの除去後、前駆体Ｎ末
端−ＲＰ１１−Ｒ−ＡＥ２８８−Ｒ−Ｈ８（以下の表２９の配列）を産生し、１ｘアミノ
−ＸＴＥＮ２８８（表３のセグメント１７８、共役のためのＮ末端アミノ基を持つ）を生
成するように設計する。
実施例１２：ＲＰ１１親和性タグを持つＸＴＥＮ構築体の発現の最適化
１．１．Ｎ末端−ＲＰ１１−ＡＥ８６４−ＧＦＰおよびＭａｌＥｓｓ−ＡＥ４８−ＲＰ
１１−ＡＥ８６４をコードする構築体の設計および構築
Ｉｓｈｉｈａｍａ Ｙ．ｅｔ ａｌ，ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２００８，９：１０
２に記載される高度に発現した天然の大腸菌タンパク質の群を使用し、最初の２０個のＮ
末端アミノ酸（表３０のカラム３）の一覧を生成し、少なくとも１１個のアミノ酸（表３
０のカラム４）を含有するヘルパー配列を創製するための候補を生成するために、疎水性
アミノ酸Ｆ、Ｉ、Ｗ、Ｌ、Ｖ、Ｍ、Ｃをアラニンもしくはセリンに変換するか、または削
除した。比較目的で、Ａｍｕｎｉｘ（ＡＣ６１６）において構築された十分に発現した構
築体からの既知のＣＢＤ配列の最初の２０個のアミノ酸も対照として含まれた。
表３１の１０７Ｎ−Ｆ＆Ｒ〜１１９Ｎ−Ｆ＆Ｒ系およびＲＰ１１Ｆ＆Ｒ配列のＤＮＡオ
リゴヌクレオチドは、Ｅｌｉｍ Ｂｉｏｐｈａｒｍ（Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）において合
成された。各ＤＮＡ対（１０７Ｎ−Ｆと１０７Ｎ−Ｒ、１０８Ｎ−Ｆと１０８Ｎ−Ｒ等）
の溶液を、１：１のモル比で混合し、９５℃で３分間変性させた後、０．１℃／分で２５
℃に冷却して二本鎖ＤＮＡアニーリングを可能にした。塩基ベクターＬＣＷ０９７０．０
３０（ＣＢＤ−ＡＥ８６４−ＧＦＰをコードする）をＮｄｅｌ／ＢｓａＩで消化し、より
大きなフラグメントをベクターとしてゲル精製した。ベクターを、アニールしたオリゴ１
０７−１１８Ｎ−Ｆ＆ＲおよびＰＮＫ処理したアニールしたＲＰ１１Ｆ＆Ｒオリゴとライ
ゲーションし、ライゲーション産物を大腸菌ＢＬ２１コンピタント細胞（Ｎｅｗ Ｅｎｇ
ｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）に形質転換し、ｐＳＤ０１０７〜ｐＳＤ１１８と指定される
コロニーを得た。クローンｐＳＤ０１０７−１０９、ｐＳＤ０１１１−１１２、およびｐ
ＳＤ０１１４−１１８が得られ、ＤＮＡ配列決定によって検証した。クローンｐＳＤ０１
１０．００１は、フレーム−シフトの１つの変異を有し、スタッファーベクターとして使
用した。
プラスミド構築体ｐＣＷ１１１０（ＲＰ１１−ＡＥ８６４をコードする）をＢｓａＩ／
ＮｏｔＩで消化し、ＡＥ８６４をコードするヌクレオチドに対応するより小さなバンドを
挿入としてゲル精製した。ｐＣＷ１１３９（ＭａｌＥｓｓ−ＡＥ４８−ペイロード−ＡＥ
８６４をコードする）をＸｈｏＩ／ＢｓｔＸＩ／ＮｏｔＩによって消化し、より大きなフ
ラグメントをベクターとしてゲル精製した。１１９−ＡＥＮ−Ｆ＆Ｒのオリゴのアニール
産物を挿入およびベクターとライゲーションした後、大腸菌ＢＬ２１に形質転換して、ｐ
ＳＤ０１１９と指定されるプラスミドを持つコロニーを得た。クローンを配列検証した。
２．ｐＳＤ０１１６に基づくＮ末端ヘルパーライブラリーの構築
スタッファー−ＲＰ５ｆｏｒとスタッファー−ＲＰ５ｒｅｖＰ、ＲＰ６−ＳＡＳＲＳＡ
ｆｏｒＰとＲＰ６−ＳＡＳＲＳＡｒｅｖ、Ｌ２ｆｏｒとＬ２ｒｅｖ、Ｌ３ｆｏｒとＬ３ｒ
ｅｖ、Ｌ４ｆｏｒとＬ４ｒｅｖ、Ｌ５ｆｏｒとＬ５ｒｅｖ、Ｌ６ｆｏｒとＬ６ｒｅｖ、Ｌ
７ｆｏｒとＬ７ｒｅｖ、Ｌ８ｆｏｒとＬ８ｒｅｖ、Ｌ９ｆｏｒとＬ９ｒｅｖ、Ｌ１０ｆｏ
ｒとＬ１０ｒｅｖ、Ｌ１１ｆｏｒとＬ１１ｒｅｖ、Ｌ１２ｆｏｒとＬ１２ｒｅｖ、および
Ｌ１３ｆｏｒとＬ１３ｒｅｖのＤＮＡオリゴヌクレオチド対（表３１）は、Ｅｌｉｍ Ｂ
ｉｏｐｈａｒｍ（Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）において合成され、各対を上記の通りアニール
し（セクション１）、二本鎖ＤＮＡを生成した。
プラスミドｐＳＤ０１１０をＮｄｅＩ／ＢｓａＩで消化し、より大きなフラグメントは
、ベクターとしてゲル精製した。ベクターをスタッファー−ＲＰ５ｆｏｒ＆ｒｅｖＰおよ
びＲＰ６−ＳＡＳＲＳＡｆｏｒＰ＆ｒｅｖのアニールしたオリゴとライゲーションした後
、大腸菌ＢＬ２１に形質変換して、スタッファーベクタープラスミドｐＣＷ１１４６を持
つコロニーを得た（Ｓｔｕｆｆｅｒ−ＲＰ１１−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４＿００３−ＧＦＰ
）。クローンを配列検証した。
ＮｄｅＩ／ＢｓａＩ消化されたｐＳＤ０１１０ベクターをＬ５ｆｏｒ＆ｒｅｖアニール
したオリゴとライゲーションし、ＬＣＷ１１６０（Ｌ５）のコロニーを得た。
スタッファーベクターｐＣＷ１１４６をＮｄｅＩ／ＢｓａＩで消化し、より大きなフラ
グメントは、ベクターとしてゲル精製した。ベクターを表３１に示されるようなＬ２−４
、およびＬ６−１３ｆｏｒ＆ｒｅｖのアニールしたオリゴとライゲーションした後、大腸
菌ＢＬ２１に形質転換して、構築体ＬＣＷ１１５７（Ｌ２）、ＬＣＷ１１５８（Ｌ３）、
ＬＣＷ１１５９（Ｌ４）、ＬＣＷ１１６３（Ｌ６）、ＬＣＷ１１７１（Ｌ７）、ＬＣＷ１
１７２（Ｌ８）、ＬＣＷ１２０３（Ｌ９）、ＬＣＷ１２０４（Ｌ１０）、ＬＣＷ１２０８
（Ｌ１１）、ＬＣＷ１２０９（Ｌ１２）、およびＬＣＷ１２１０（Ｌ１３）のコロニーを
得た。
３．Ｎ末端ヘルパーライブラリーＬＣＷ１１５７−１１５９のスクリーニングおよび分
析
プラスミドｐＳＤ０１０７〜ｐＳＤ０１１８で形質転換された大腸菌宿主を振動フラ
スコ中で発現させ、Ｃ末端ＧＦＰ受容体からの蛍光を測定することによって、それぞれの
発現レベルを評価した。つまり、終夜培養物を各構築体に対し、ＳＢ培地（１２．５μｇ
／ｍＬテトラシクリンを含む）中で成長させた後、それを使用して、１２．５μｇ／ｍＬ
テトラシクリンを含むＰｈｏＡリン酸塩枯渇自己誘導培地の２００ｍＬの培養物を播種し
た（各構築体に対し３つの振動フラスコを成長させた）。２６℃で４８時間、２２５ｒｍ
ｐで成長させた後、１００μｌのアリコートを各培養物から採取し、蛍光プレートリーダ
ーを用いて、励起波長３９５ｎｍおよび放出波長５１０ｎｍでＧＦＰ発現レベルを測定し
た。各振動フラスコに対し２つの測定値を取った。試験した構築体の中で、ｐＳＤ０１１
６が最高の蛍光シグナルを有し、ｐＳＤ０１１４が続いたが（図８１）、これら２つの構
築体の発現レベルは、ＬＣＷ０９７０．０３０（ｐＬＣＷ９７０）陽性対照よりも著しく
低かった。
発現をさらに改善するために、３つのライブラリー（ＬＣＷ１１５７、１１５８、およ
び１１５９）をｐＳＤ０１０６に基づいて構築し、高スループット形式でスクリーニング
した。これらのライブラリーから（表３２）多数のコロニーを選抜し、９６深ウェルプレ
ートの５００μｌ ＳＢ培地（１２．５μｇ／ｍＬテトラシクリンを含む）中、３７℃で
終夜、３００ｒｐｍで振動させながら成長させた。２０μｌの飽和培地を使用し、５００
μｌのＰｈｏＡリン酸塩枯渇自己誘導培地（１２．５μｇ／ｍＬテトラシクリンを含む）
を９６深ウェルプレートに播種し、それを２６℃で２２〜２４時間、３００ｒｐｍで振動
させながらインキュベートした。次いで、１００μｌの培養物を９６ウェルプレートに置
き、Ｃ末端ＧＦＰレポーターからの蛍光を測定することによって、発現を決定した。
蛍光シグナルの評価後、６つの最高発現クローンおよび２つの低発現クローンを、試験
した各９６深ウェルプレートから選択し、これらのクローンの発現を再度４重複で試験し
た。３つのライブラリー全てについて、ｐＳＤ０１１６構築体よりも高い発現を有するク
ローンを特定し（図８２Ａ〜Ｃ）、元の試験と再試験との間の相関は良好であった（図８
２Ｄ〜Ｆ）。試験した３つのライブラリーの中で、ライブラリーＬＣＷ１１５９は、一般
ｎより高い発現レベルを示し、このスクリーニングからの最高発現構築体（ＬＣＷ１１５
９．００４）は、このライブラリーから生じた。
これらの３つのライブラリーからの最高発現レベルを持つ８つの構築体、および対照を
、Ｐｏｐ Ｃｕｌｔｕｒｅ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で処理し、熱処理して、得ら
れた溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ／クマシー染色で分析した（図８３）。８つの構築体の発
現レベルは、対照（陰性対照、ＬＳＤ０１１４およびＬＳＤ０１１６）よりも高いことが
確認され、全長タンパク質は、これらの構築体から産生された。４つの上位発現構築体の
溶解物（Ｐｏｐ Ｃｕｌｔｕｒｅおよび熱処理後）および陰性対照（ＡＰ３２、ＲＰ１１
タグのない精製ＸＴＥＮ−ＧＦＰタンパク質）を、ｐＨ８および導電性６．５ｍＳ／ｃｍ
でＭａｃｒｏＣａｐ ＳＰカラムの上にそれぞれ負荷した。カラムを２０ｍＭ リン酸ナ
トリウム、ｐＨ８、１００ｍＭ ＮａＣｌで洗浄し、タンパク質を２０ｍＭ リン酸ナト
リウム、ｐＨ８、５００ｍＭ ＮａＣｌで溶出した。負荷、フロースルー、洗浄、および
溶出の試料は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによって分析した（図８４）。結果は、３つのライ
ブラリー全てから生じた４つの発現タンパク質は、ＭａｃｒｏＣａｐ ＳＰによって捕捉
され得、したがって、陰性対照（ＲＰ１１タグを含有しない）がＭａｃｒｏＣａｐ ＳＰ
カラムに結合しなかったため、結合がタンパク質中のＲＰ１１タグの存在に寄与すること
を実証した。
再試験に選択されたクローンのプラスミドをミニプレップし、Ｎ末端ヘルパーのＤＮＡ
配列を分析した。コドンバイアスをいくつかの位置で観測した（表３３）。例えば、ＬＣ
Ｗ１１５７の第３のアミノ酸であるＮは、ＡＡＣまたはＡＡＴによってコードされる。Ｌ
ＣＷ１１５７中の高発現クローンの大部分（７７％）は、第３のアミノ酸でＡＡＴによっ
てコードされるが、低発現クローンの大部分（８８％）は、ＡＡＣによってコードされ、
高発現のために、この位置にはＡＡＣよりもＡＡＴが好適である。同様に、ＣＣＧは、第
４のアミノ酸において好適であるが、第７のアミノ酸におけるＧＣＧは、低発現クローン
中に蓄積する。これらの傾向は、ライブラリーＬＣＷ１１５８およびＬＣＷ１１５９にお
いても同様に観察された。
４．Ｎ末端ヘルパーライブラリーＬＣＷ１１６３のスクリーニングおよび分析
ライブラリーＬＣＷ１１５９は、一般に、ＬＣＷ１１５７およびＬＣＷ１１５８よりも
高い発現を有したため、次のライブラリー設計は、ＬＣＷ１１５９に基づき、Ｎ末端ヘル
パードメインコード領域内により多くの変異体を導入した。このライブラリーからの合計
６７２個のクローン（理論的多様性５５２９６）をスクリーニングし、ライブラリーＬＣ
Ｗ１１５７〜１１５９と同じ方法で再試験した。ＬＣＷ１１５９．００４よりも高い（前
回のスクリーニングから最高の）発現を持つクローンを観測した（図８５）。最高発現ク
ローンであるＬＣＷ１１６３．０２９は、ＬＣＷ１１５９．００４から４０％の改善を達
成したが、その発現レベルは、ＣＢＤ対照よりも２７％低かった。高発現および低発現ク
ローンの配列を分析し、発現に好適なヌクレオチドを特定してまとめた（表３４参照）。
位置の大部分は、より高い発現のためのコドンＡの選好を示したが、Ｃを選好するものも
ある。
＊ コドンが変化した位置のそれぞれにおけるＡ、Ｇ、Ｃ、またはＴのパーセンテージ
を分析し、特定された好適なヌクレオチドを最下列にまとめた。
５．ＲＰ１１ライブラリーＬＣＷ１１６０のスクリーニングおよび分析
同時に、ライブラリーＬＣＷ１１６０からの１６８個のコロニー（Ｎ末端ヘルパードメ
インの無いＲＰ１１タグのコード領域を変化させるライブラリー（総理論的多様性８．８
Ｘ１０１２））をスクリーニングし、分析した。しかしながら、このライブラリーは、一
般に非常に低い発現レベルを有し（図８６）、高発現を持つ１つの異常値は、プラスミド
ミニプレップおよびＤＮＡ配列決定分析を行った後、切断ＲＰ１１タグをコードすること
が見出された。これらの実験条件下でのライブラリーのスクリーニング結果は、Ｎ末端ヘ
ルパーが、高い発現レベルを達成することが必要であることを強く示唆する。
６．Ｎ末端ヘルパーライブラリーＬＣＷ１１７１、ＬＣＷ１１７２、ＬＣＷ１２０３、
およびＬＣＷ１２０４のスクリーニング
より多くのＮ末端ライブラリー（ＬＣＷ１１７１、ＬＣＷ１１７２、ＬＣＷ１２０３、
およびＬＣＷ１２０４）を、上述されるものと同じ方法でスクリーニングし、分析した。
ＬＣＷ１１７１および１１７２は同様に設計されたが、ＬＣＷ１１７１は、ヘルパー配列
において、ＬＣＷ１１７２よりも多くのアミノ酸変化を許した。スクリーニング結果は、
ＬＣＷ１１７１が、一般に、ＬＣＷ１１７２よりもはるかに低い発現レベルを有したこと
を示した（図９４ＡおよびＢ）。ＬＣＷ１２０３および１２０４は、同様に設計され、Ｌ
ＣＷ１１７１および１１７２と比較して、ヘルパー配列の異なる領域をランダム化するこ
とに重点を置く。ＬＣＷ１２０４は、ＬＣＷ１２０３よりも多くのアミノ酸変更を許し、
一般に、ＬＣＷ１２０３よりも低い発現をもたらした（図９４ＣおよびＤ）。これらの結
果は、発現レベルが、ヘルパードメイン配列中のアミノ酸変化に敏感であることを示唆す
る。
７．Ｎ末端ヘルパーライブラリーＬＣＷ１２０８、ＬＣＷ１２０９、およびＬＣＷ１２
１０のスクリーニング
３つの新たなＮ末端ライブラリー（ＬＣＷ１２０８、ＬＣＷ１２０９、およびＬＣＷ１
２１０）を設計し、Ｎ末端ヘルパー配列のさらなる伸長の効果を調査した（表３５）。Ｌ
ＣＷ１２０８およびＬＣＷ１２１０は、さらに４個の残基をヘルパードメインに導入した
が、ＬＣＷ１２０９は、さらに８個の残基を導入した。スクリーニング結果は、ＬＣＷ１
２０９が最高の発現を有し、ＬＣＷ１２０８、次いでＬＣＷ１２１０が続くという一般的
な傾向を示し（図９５）、ヘルパー配列により多くのアミノ酸を追加する有益な効果を確
認した。
ヘルパー配列中の追加の残基には下線を引いた。
３つの新たなＮ末端ライブラリー（ＬＣＷ１２０８、ＬＣＷ１２０９、およびＬＣＷ１
２１０）を設計し、Ｎ末端ヘルパー配列のさらなる伸長の効果を調査した（表３６）。Ｌ
ＣＷ１２０８およびＬＣＷ１２１０は、さらに４個の残基をヘルパードメインに導入した
が、ＬＣＷ１２０９は、さらに８個の残基を導入した。スクリーニング結果は、ＬＣＷ１
２０９が最高の発現を有し、ＬＣＷ１２０８、および次いでＬＣＷ１２１０が続くという
一般的な傾向を示し（図９５）、発現を改善するために、さらに多くのアミノ酸をヘルパ
ー配列に追加する有益な効果を確認した。
３つのライブラリーから最高発現レベルを持つ４つの上位構築体は、再試験から選択さ
れ、それらのＮ末端ヘルパー配列の配列を分析した（表３６）。現在最高に発現した構築
体（ＬＣＷ１２０９．０２９）は、陰性対照を控除した後の平均蛍光を比較することによ
ってＣＢＤ対照の発現レベルの９０％を達成した。
要約すれば、スクリーニング結果は、これらの実験条件下で、Ｎ末端ヘルパーが、高い
発現レベルを達成することに寄与することを示唆する。
実施例１３：ＰｈｏＡ誘導を使用するＸＴＥＮの発酵−発現収率の評価
ヘルパー＿ＬＣＷ１１５９．００４−ＲＰ１１−ＡＥ２８８−Ｈｉｓ８（ＡＣ７６７）
、ヘルパー＿ＬＣＷ１１７２．０３３−ＲＰ１１−ＡＥ５７６−Ｈｉｓ８（ＡＣ７８０）
、およびヘルパー＿ＬＣＷ１１７２．０３３−ＲＰ１１−ＡＥ８６４−Ｈｉｓ８（ＡＣ７
８６）をコードするプラスミドを担持する大腸菌ＢＬ２１を、大腸菌ＢＬ２１株に形質転
換した。３つの株のそれぞれに対し、３回の１０Ｌ発酵を実行した。グリセロールストッ
クを使用し、１０μｇ／ｍＬのテトラシクリンを含有する１２５ｍＬのＬＢブロス培地を
播種した。次いで、種培養物を３７℃で終夜振動させた。種培養物を使用し、Ｂ．Ｂｒａ
ｕｎ Ｂｉｏｓｔａｔ Ｂコントローラを備える１０Ｌガラス被覆容器中に、２０ｇの硫
酸アンモニウム、１０．４ｇのリン酸カリウム二塩基性無水物、５ｇのクエン酸ナトリウ
ム二水和物、４．６ｇのリン酸ナトリウム一塩基性一水和物、１０６ｇのＮＺ ＢＬ４ダ
イズペプトン（Ｋｅｒｒｙ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＃５Ｘ０００４３）、５４ｇの酵母
抽出物（Ｔｅｋｎｏｖａ ＃Ｙ９０２０）、３．６Ｌの水、０．０５ｍＬのポリプロピレ
ングリコール、５．２ｍＬのトレース要素溶液（Ａｍｕｎｉｘレシピ、１４４−１）、３
５ｍＬの１Ｍ硫酸マグネシウム、および４ｍＬのカナマイシン（５０ｍｇ／ｍＬ）を含有
する４Ｌの発酵バッチ培地を播種した。発酵制御設定は、ｐＨ＝６．９＋／−０．１、ｄ
Ｏ２＝１０％、攪拌棒のみモードで１２５〜１１８０ｒｐｍの範囲の溶解酸素カスケード
、９０％酸素の５リットル／分の気流、初期温度３７℃、塩基制御１３％水酸化アンモニ
ウム、および酸対照無しであった。６時間の培養後、７０％グリセロールフィードは、４
０ｇ／時間の速度で開始した。５０＋／−１０ＯＤのＯＤ６００に到達する培養時に、培
養温度を２６℃に低下させ、５４ｍＬの１Ｍ硫酸マグネシウムを添加し、１０ｇ／Ｌの硫
酸塩アンモニウム、２６ｇ／Ｌのリン酸カリウム二塩基性無水物、２ｇ／Ｌのクエン酸ナ
トリウム二水和物、１３ｇ／Ｌリン酸ナトリウム一塩基性一水和物、１５ｇ／Ｌリン酸カ
リウム一塩基性無水物、０．０８％トレース要素からなる塩フィードを３３ｇ／Ｌの速度
で開始し、６時間継続した。６４〜７０時間の総発酵実行時間後、培養物を遠心分離によ
って採取し、湿潤重量で１．６〜２．３キログラムの細胞ペレットを生じた。ペレットは
、今後の使用まで−８０℃で凍結保存した。力価分析の場合、実行された発酵の終了時に
、０．２ｍＬ容量の全体ブロス試料を凍結し、次いで解凍した後、０．２ｍＬの水を添加
して、宿主タンパク質を溶解および凝集し、試料を８５℃で１５分間、次いで４℃で１５
分間インキュベートした後、２０，０００ｇで１０分間遠心分離した。得られた凝集可溶
性溶解物を、Ｃ１８逆相ＨＰＬＣによってアッセイし、ヘルパー−ＲＰ１１−ＸＴＥＮ−
Ｈｉｓ８を表すピークに対応するＡ２１４吸光領域を、精製された参照基準と比較した。
次に、乾燥細胞重量（ＤＣＷ）を決定するために、細胞のアリコートをペレットで取り、
上澄みを破棄した。細胞ペレットを水で１回洗浄し、次いで８０℃のオーブンで３日間乾
燥させた。細胞ペレットを含有する管を計量し、管の重量を測定重量から差し引き、残り
の重量を各試料の初期容量（０．０００２Ｌ）で割ってＤＣＷを得た。発酵成長、力価分
析、および乾燥細胞重量の結果は、以下の表３７に要約される。９６ウェルプレートスク
リーニングアッセイにおいて、Ｎ末端ヘルパーを持たないＲＰ１１−ＸＴＥＮ−Ｈｉｓ８
構築体のライブラリーである、ＬＣＷ１１６０をスクリーニングしたとき（実施例１２、
図８６）、ＬＣＷ１１６０．００６の発現レベル、最高発現構築体は、ＬＣＷ１１５９．
００４またはＬＣＷ１１７２．０３３の発現のわずか５０％であり、ヘルパー配列を持つ
構築体であった。したがって、Ｎ末端ヘルパー配列を持つＸＴＥＮ構築体は、ヘルパー配
列を有しないＸＴＥＮ構築体と比較して、著しく高い発現力価をもたらすことが予想され
る。
実施例１４：ＲＰ１１およびＨｉｓ８タグを持つＸＴＥＮの精製
１．発現、溶解、および清澄化
実施例１０に記載されるライブラリーメンバーＬＣＷ１１５９．００４からのＮ末端ヘ
ルパー配列を持ち、それぞれＮ末端およびＣ末端でＸＴＥＮに結合された２つの親和性タ
グを持つ、融合タンパク質ＭＫＮＰＥＱＡＥＥＱＡＥＥＱＲＥＥＴ−ＲＰ１１−ＳＡＳＲ
ＳＡ−ＸＴＥＮ＿ＡＥ４３２（Ｃ１２，Ｃ２１７，Ｃ４２２）−ＳＡＳＲＳＡ−Ｈｉｓ（
８）］は、本明細書に記載される条件を使用し、４Ｌ発酵槽を用いて大腸菌中で発現させ
た。成長後、細胞を遠心分離によって採取し、使用するまで−８０℃で冷凍した。細胞ペ
レットを溶解緩衝液（２０ｍＭ リン酸ナトリウム、５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤ
ＴＡ ｐＨ８．０、細胞ペースト１ｇ当たり３ｍＬの緩衝液）中に再懸濁した。ＡＰＶホ
モジナイザーに３回、８３０〜９００バールの圧力で通すことによって細胞を溶解した。
溶解緩衝液（細胞ペースト１グラム当たり１ｍＬの緩衝液）を追跡として使用し、ホモジ
ナイザーから滞留量を回収した。均質化した溶解物を８５℃の水浴中で２０分間インキュ
ベートし、続いて氷水浴中で２０分間急速冷却した。加熱および冷却処理後、溶解物を１
１０００ＲＰＭで９０分間、ＳＯＲＶＡＬＬ遠心分離器内で遠心分離した。遠心分離後、
上澄みを２つのＣＵＮＯ Ｂｉｏ ｃａｐ ２５（ＢＣ００２５Ｌ９０ＳＰ０８Ａ）フィ
ルターに通して濾過した。清澄化した上澄みを４℃で終夜保管した。
２．捕捉ステップ：Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＩＭＡＣクロマトグラフィー
ＩＭＡＣ親和性クロマトグラフィーは、ＸＴＥＮを正常なＣ末端Ｈｉｓタグと結合する
ための捕捉ステップとして使用した。つまり、クロマトグラフィーカラムＢＰＧ１４０／
１２（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に、２０００ｍＬのＴｏｙｏｐｅａｒｌ Ｉ
ＭＡＣ ６５０Ｍ樹脂（ＴＯＳＯＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を充填した。２カラム容
量（ＣＶ）の平衡緩衝液（２０ｍＭ リン酸ナトリウム、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８
．０）でカラムを平衡化した。清澄化した細胞溶解物を、５Ｍ ＮａＣｌストック溶液を
使用して最終ＮａＣｌ濃度５００ｍＭに調整し、次いでＩＭＡＣ樹脂の上に負荷した。２
カラム容量の平衡緩衝液、次いで２カラム容量の２０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ
ＮａＣｌ、５ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０に続いて、２カラム容量の２０ｍＭリン酸
ナトリウム、５ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０でカラムを洗浄し、塩を除去した。２カラ
ム容量の２０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０で溶出を行っ
た。フロースルー、洗浄、および溶出分画を、非還元４〜１２％ビス−トリスＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ／クマシー染色によって分析し、所望の産物を持つ分画をプールした。
３．研摩／捕捉ステップ：ＭａｃｒｏＣａｐ ＳＰクロマトグラフィー
カチオン交換クロマトグラフィーを研摩ステップとして使用し、産物のＮ末端完全性を
保証した。産物に対するその優れた能力および選択性に起因して、いくつかのカチオン交
換培地の中からＭａｃｒｏＣａｐ ＳＰ樹脂（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を選
択した。１０００ｍＬのＭａｃｒｏＣａｐ ＳＰ樹脂をＢＰＧ１００／１３（ＧＥ Ｌｉ
ｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）クロマトグラフィーカラムに充填し、２０ｍＭリン酸ナトリウ
ム、ｐＨ８．０、２０ｍＭ ＮａＣｌで平衡化した。ＩＭＡＣプールをカラムの上に負荷
し、樹脂を２カラム容量の２０ｍＭリン酸ナトリウム、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０
、および２カラム容量の２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ
で洗浄した。タンパク質を、２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）中、５カラム容量
の直線勾配１５０〜５００ｍＭ ＮａＣｌで溶出した。分画を回収し、４〜１２％ビス−
トリスＳＤＳ／ＰＡＧＥによって分析した。次のステップのために、所望の産物を持つ分
画を合わせた。
４．Ｍａｃｒｏｃａｐ ＳＰ溶出プールのトリプシン消化
ＳＰ溶出プールのトリプシン（Ｓｉｇｍａ、ウシ膵臓からのトリプシン）消化は、１：
２００ｍ／ｍの酵素／タンパク質比で、３７℃で終夜行った。
５．研摩ステップ：Ｍａｃｒｏｃａｐ Ｑクロマトグラフィー
トリプシン消化後、Ｍａｃｒｏｃａｐ Ｑクロマトグラフィーを使用し、切断されたタ
グを最終産物から分離した。ＢＰＧ１００／１９カラム（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃ
ｅｓ）に、１５００ｍＬカラム容量のＭａｃｒｏｃａｐ Ｑ樹脂（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃ
ｉｅｎｃｅｓ）を充填した。トリプシン消化したＭａｃｒｏｃａｐ ＳＰ溶出プールを８
０℃で１５分間、２０ｍＭ ＤＴＴおよび２ｍＭ ＥＤＴＡでインキュベートし、ジスル
フィド結合を低減し、トリプシンを不活性化した。冷却したタンパク質溶液を、Ｍｉｌｌ
ｉ−Ｑ水で５ｍＳ／ｃｍ以下の導電性に希釈し、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ、ｐＨ７．０で平衡化されたＭａｃｒｏｃａｐ Ｑカラムの上に負荷した。２カラム
容量の２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０、次いで２カラム容量の
２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ ＴＣＥＰ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０でカラム
を洗浄した。タンパク質は、２０カラム容量の２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０中、線
形勾配１５０ｍＭ ＮａＣｌ〜５００ｍＭ ＮａＣｌで溶出した。分画は、ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ／銀染色によって分析した。
６．濃縮および透析濾過（最終製剤化）
選択したＭａｃｒｏＣａｐ Ｑ分画を合わせ、１０ＫＤ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ ｍｉｎｉ
（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用し、２０ｐｓｉ未満のフィード圧、８ｐｓｉ未満の残余分
で濃縮し、続いて２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０を用いた１０
Ｘ透析濾過によって５ｍｇ／ｍＬ超の最終タンパク質濃度を達成した。
９．異なる方法で精製されたタンパク質の純度分析
１つのバッチ（バッチ１）は、上記のような３つの精製ステップを通じて精製された。
別のバッチ（バッチ２）は、同じ発酵材料から精製されたが、ＭａｃｒｏＣａｐ ＳＰ研
摩ステップは省略された。ＸＴＥＮの切断種は、バッチ１のＭａｃｒｏＣａｐ Ｑ溶出分
画中のＳＤＳ−ＰＡＧＥ／銀染色によって検出されたが（図８７Ａ）、バッチ１のＭａｃ
ｒｏＣａｐ Ｑ溶出分画は、本質的に切断を含まなかった（図８７Ｂ）。これらの結果は
、用いられた条件下で、ＲＰ１１タグに基づくＭａｃｒｏＣａｐ ＳＰステップが、Ｎ末
端完全性および全体的な産物品質を保証するために必須であることを支持する。
実施例１５：１ｘアミノ，９ｘチオール−ＸＴＥＮ４３２の構築
以下のプライマー５Ａｆｏｒ＆ＣＩ１ＢｂｓＩｒｅｖ−ＴＧＧＣ、ＣＩ１ＢｓａＩｆｏ
ｒ−ＴＧＧＣ＆ＣＩ２−ＡＥ３８ＢｂｓＩｒｅｖ、およびＣＩ２−ＡＥ３８ＢｓａＩｆｏ
ｒ＆ＡａｔＩＩＣＩ３−２Ｐのセットを使用し、それぞれＡＥ−ＣＩ１、ＣＩ１−２、お
よびＣＩ２−３のＰＣＲ産物を得るために、ＸＴＥＮ＿ＡＥ４３２（Ｃ４２２）を含有す
るプラスミドｐＣＷ１１６４をＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）させた。ＣＩ１、２、お
よび３は、同じアミノ酸配列ＴＡＥＡＡＧＣＧＴＡＥＡＡを有するが、異なるコドン使用
頻度を持つシステイン島１、２、および３として指定された。ＰＣＲ産物のゲル精製を行
い、適正サイズのバンドを得て、これらを、挿入としてそれぞれ制限酵素ＳｂｆＩ／Ｂｂ
ｓＩ、ＢｓａＩ／ＢｂｓＩ、およびＢｓａＩ／ＡａｔＩＩで消化した。Ｎ末端−ＲＰ１１
−Ｒ−ＸＴＥＮ＿ＡＥ４３２（Ｃ４２２）−Ｒ−Ｈ８の遺伝子をコードするプラスミドｐ
ＣＷ１１６４の消化をＳｂｆＩ／ＡａｔＩＩで行い、ＸＴＥＮ＿ＡＥ４３２内の約２９０
個のアミノ酸のフラグメントを除去し、ベクターとしての残りの大きなフラグメント上で
ゲル精製を行った。上記のＰＣＲ産物の３つの挿入とのベクターのライゲーションを行い
、それを使用してＢＬ２１コンピタント細胞を形質転換し、Ｎ末端−ＲＰ１１−Ｒ−ＸＴ
ＥＮ＿ＡＥ４３２（Ｃ３１９，Ｃ３７０，Ｃ４２２）−Ｒ−Ｈ８構築体を得た。プライマ
ーＣＩ１ＢｓａＩｆｏｒ−ＴＧＧＣ＆ＡａｔＩＩＣＩ３−２Ｐを用いてＰＣＲをこの構築
体上で行い、長さ約３６０ｂｐのＰＣＲ産物を得た。適正サイズのバンドのゲル精製を行
い、続いて３つのシステイン島を含有する挿入ＸＴＥＮ＿ＡＥ１２０−３Ｃｙｓとして、
ＢｓａＩ／ＡａｔＩＩで消化した。
同時に、６つのシステイン島を含有するＸＴＥＮ＿ＡＥ３１３−６Ｃｙｓのコドン最適
化ＤＮＡフラグメントを設計し、合成した（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）。隣接する制限酵素Ｂ
ｓａＩ／ＢｂｓＩによってフラグメントを消化し、ＸＴＥＮ＿ＡＥ４３２の最初の６つの
システイン島を含有する挿入としてゲル精製した。ＢｓａＩ／ＡａｔＩＩを用いたＮ末端
−ＲＰ１１−Ｒ−ＸＴＥＮ＿ＡＥ４３２＿３Ｃｙｓ−Ｒ−Ｈ８の遺伝子をコードするプラ
スミドｐＣＷ１１６１の消化を行い、ＸＴＥＮ＿ＡＥ４３２＿３Ｃｙｓのフラグメントを
除去し、ゲル精製を行い、ベクターとして大きなフラグメントを得た。上記ＸＴＥＮ＿Ａ
Ｅ３１３−６ＣｙｓのＢｓａＩ／ＢｂｓＩ消化された挿入、およびＸＴＥＮ＿ＡＥ１２０
−３ＣｙｓのＢｓａＩ／ＡａｔＩＩ消化された挿入とのベクターのライゲーションを行っ
た。ライゲーションした産物を使用し、構築体Ｎ末端−ＲＰ１１−Ｒ−ＸＴＥＮ＿ＡＥ４
３２（Ｃ１２，Ｃ６３，Ｃ１１４，Ｃ１６５，Ｃ２１７，Ｃ２６８，Ｃ３１９，Ｃ３７０
，Ｃ４２２）−Ｒ−Ｈ８を得るために、ＢＬ２１コンピタント細胞を形質転換した。構築
体は、前駆体Ｎ末端−ＲＰ１１−Ｒ−ＡＥ４３２＿９Ｃｙｓ−Ｒ−Ｈ８を産生するように
設計され（以下、表３８の配列）、この産物を使用し、トリプシン消化によるＮ末端−Ｒ
Ｐ１１タグおよびＣ末端８ｘＨｉｓタグの除去後に、１ｘアミノ，９−チオ−ＸＴＥＮ４
３２を生成した。最終産物は、ＸＴＥＮ４３２配列中に９個のシステインを含有する（セ
グメント１７７）。
実施例１６：１ｘアミノ，９ｘチオール−ＸＴＥＮ８６４の構築
プライマーＰｈｏＡｆｏｒ＆ＲＰ１１−ＳＡＳＲＳＡＢｓａＩｒｅｖＡＧＧＴを使用し
、Ｎ末端−ＲＰ１１タグを含有するプラスミドをＰＣＲして、Ｎ末端−ＲＰ１１−ＲのＰ
ＣＲ産物を得た。適正サイズのバンドのゲル精製を行い、第１の挿入としてＮｄｅＩ／Ｂ
ｓａＩを用いて消化した。別のＰＣＲは、プライマーＡＥ４３２ＢｓａＩｆｏｒＡＧＧＴ
＆ＡＥ４３２＿００１ＢｂｓＩｒｅｖ−ＡＡＣＧを用いて、ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４＿００
３を含有するプラスミド上で行い、ＸＴＥＮ＿ＡＥ４３２のＰＣＲ産物を得た。適正サイ
ズのバンド上でゲル精製を行い、第２の挿入としてＢｓａＩ／ＢｂｓＩを用いて消化した
。実施例１０からの構築体Ｎ末端−ＲＰ１１−Ｒ−ＡＥ４３２＿９Ｃｙｓ−Ｒ−Ｈ８の消
化をＮｄｅＩ／ＢｓａＩで行って、Ｎ末端−ＲＰ１１−Ｒフラグメントを除去し、ゲル精
製を行って、大きなフラグメントをベクターとして得た。上記の第１および第２の挿入と
のベクターのライゲーションを行い、その産物を使用して、ＢＬ２１コンピタント細胞を
形質転換し、構築体Ｎ末端−ＲＰ１１−Ｒ−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４（Ｃ４４４，Ｃ４９５
，Ｃ５４６，Ｃ５９７，Ｃ６４９，Ｃ７００，Ｃ７５１，Ｃ８０２，Ｃ８５４）−Ｒ−Ｈ
８を得た。得られた構築体は、前駆体Ｎ末端−ＲＰ１１−Ｒ−ＡＥ８６４＿９Ｃｙｓ−Ｒ
−Ｈ８を産生するように設計され（以下、表３９の配列）、この産物は、トリプシン消化
によるＮ末端−ＲＰ１１タグおよびＣ末端８ｘＨｉｓタグの除去後に、１ｘアミノ，９−
チオ−ＸＴＥＮ８６４を生成した。得られた産物は、共役のためのＸＴＥＮ８６４配列中
にＮ末端アミノ基および９個のシステインを含有する（セグメント１７５）。
実施例１７：共役のためのＸＴＥＮの発酵
種培養物は、共役タンパク質配列に適切なＸＴＥＮを含有するプラスミドを担持する大
腸菌のグリセロールストックを５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含有する１２５ｍＬのＬＢ
ブロス培地に播種することによって調製した。次いで、培養物を３７℃で終夜振動させた
。種培養物を使用し、Ｂ．Ｂｒａｕｎ Ｂｉｏｓｔａｔ Ｂコントローラを備える５Ｌガ
ラス被覆容器中に、１２．５ｇの硫酸アンモニウム、１５ｇのリン酸カリウム二塩基性無
水物、２．５ｇのクエン酸ナトリウム二水和物、８．５ｇのリン酸ナトリウム一塩基性一
水和物、５０ｇのＮＺ ＢＬ４ダイズペプトン（Ｋｅｒｒｙ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＃
５Ｘ０００４３）、２５ｇの酵母抽出物（Ｔｅｋｎｏｖａ ＃Ｙ９０２０）、１．８Ｌ水
、０．５ｍＬのポリプロピレングリコール、２．５ｍＬのトレース要素溶液（Ａｍｕｎｉ
ｘレシピ１４４−１）、１７．５ｍＬの１Ｍ硫酸マグネシウム、および２ｍＬカナマイシ
ン（５０ｍｇ／ｍＬ）の２Ｌの発酵バッチ培地を播種した。発酵制御設定は、ｐＨ＝６．
９＋／−０．１、ｄＯ２＝１０％、攪拌棒のみモードで１２５〜１１８０ｒｐｍの範囲の
溶解酸素カスケード、９０％酸素の５リットル／分の気流、初期温度３７℃、塩基制御１
３％水酸化アンモニウム、および酸対照無しであった。６時間の培養後、５０％グルコー
スフィードは、３０ｇ／時間の速度で開始した。２０時間の培養後、２５ｍＬの１Ｍ硫酸
マグネシウム、および３ｍＬの１Ｍ ＩＰＴＧを添加した。４５時間の総発酵実行時間後
、培養物を遠心分離によって採取し、全ての構築体に対し、湿潤重量で０．４５〜１．１
キログラムの細胞ペレットを生じた。ペレットは、今後の使用まで−８０℃で凍結保存し
た。発酵の複数の時点で培養試料を取り、細胞を溶解させた後、細胞残屑を加熱および急
速冷却で凝結させ、清澄化した可溶性溶解物を遠心分離によって調製し、Ｉｎｖｉｔｒｏ
ｇｅｎからのＮｕＰＡＧＥ ４〜１２％ビス−トリスゲルを使用し、製造者の仕様に従い
、クマシー染色を用いて、通常の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。発酵実行時
間の関数としてのＸＴＥＮ融合タンパク質の蓄積の例は、図４５に示される。結果は、Ｘ
ＴＥＮ融合タンパク質構築体が、１ｇ／Ｌ超の力価を持つ発酵スケールで発現し、約１６
０ｋＤａの見掛け分子量を持つことを示した（注記：実際の分子量は１００ｋＤａである
）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて観察された移動は、他のＸＴＥＮ含有融合タンパク質に対
して観察されたものに相当した。
実施例１８：ＣＢＤおよびＨｉｓ８タグを持つ１ｘチオール−ＸＴＥＮ（システイン操
作されたＸＴＥＮ）試薬の精製
この実施例は、単一システイン残基を含むシステイン操作されたＸＴＥＮの精製につい
て説明する。
材料および方法：
１．清澄化
発酵からの２０ｇｍの細胞ペーストを、１００ｍＬの２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ
８．０（溶解緩衝液）中に再懸濁した。細胞溶解物は、ホモジナイザーにおいて３回、８
００〜９００バールで均質化した。５０ｍＬの溶解緩衝液を追跡として使用し、ホモジナ
イザーから滞留量を回収した。均質化した溶解物を８５℃の水浴中で２０分間インキュベ
ートし、続いて氷水浴中で２０分間急速冷却した。加熱および冷却処理後、溶解物を１１
０００ＲＰＭで９０分間、ＳＯＲＶＡＬＬ遠心分離器内で遠心分離した。遠心分離後、上
澄みを２つのＣＵＮＯ Ｂｉｏ ｃａｐ ２５（ＢＣ００２５Ｌ９０ＳＰ０８Ａ）フィル
ターに通して濾過した。フィルターを４０ｍＬの溶解緩衝液で追跡した。清澄化した材料
の最終容量は２３０ｍＬであった。清澄化した上澄みを４℃で終夜保管した。
２．捕捉ステップ：疎水性相互作用クロマトグラフィー
疎水性相互作用クロマトグラフィーを第１のステップとして使用し、ＸＴＥＮの疎水性
ＣＢＤタグを用いて、Ｎ末端無傷タンパク質の捕捉を保証した。Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ Ｐ
ｈｅｎｙｌ ６５０Ｍ（Ｐａｒｔ＃００１４７８３，ＴＯＳＯＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ
）を使用して、ＸＫ１６を１５ｃｍ床高（３０ｍＬカラム容量）まで充填した。このクロ
マトグラフィーは、ＡＫＴＡ ＦＰＬＣ（ＧＥ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して行
った。Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ Ｐｈｅｎｙｌ樹脂は、負荷する前に、２カラム容量の２０ｍ
Ｍリン酸ナトリウム、１Ｍ硫酸ナトリウム、ｐＨ８．０で平衡化した。ＨＩＣ負荷は、上
記清澄化した溶解物に対し１Ｍ濃度まで硫酸ナトリウムを添加することによって調製した
（最終容量約２５０ｍＬ）。試料は、ＨＩＣ樹脂の上に（約４ｍｇ／ｍＬ樹脂負荷）２ｍ
Ｌ／分で負荷した。負荷は、ＵＶ２１５が安定するまで約９カラム容量の平衡緩衝液（２
０ｍＭリン酸ナトリウム、１Ｍ硫酸ナトリウム、ｐＨ８．０）で追跡することによって完
了させた。タンパク質は、１００％ Ｂ（２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０）でス
テップ溶出した。合計７カラム容量の溶出緩衝液を適用し、完全な溶出を確認する（図４
６）。
試料を４〜１２％ビス−トリスＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元）によって分析し、溶出プー
ルを決定した（図４７）。以下のゲル溶出に基づいて、分画Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、およびＥ
４をさらなる処理のためにプールした。総タンパク質は、ＨＩＣ溶出プール中８５ｍｇで
あることが推定され、６５％のステップ収率は、別の定量化ゲルを流すことによって決定
された。
３．研摩／捕捉ステップ：Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＩＭＡＣクロマトグラフィー
ＩＭＡＣ親和性クロマトグラフィーは、ＸＴＥＮの無傷Ｃ末端Ｈｉｓタグに結合するた
めの捕捉ステップとして使用した。クロマトグラフィーカラムＸＫ２６を、Ｔｏｙｏｐｅ
ａｒｌ ＩＭＡＣ ６５０Ｍ（Ｐａｒｔ＃００１４９０７，ＴＯＳＯＨ Ｂｉｏｓｃｉｅ
ｎｃｅｓ）で、１５ｃｍ床高（８５ｍＬカラム容量）まで充填した。２カラム容量の２０
ｍＭリン酸ナトリウム、１０ｍＭイミダゾール、０．２５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０（平
衡緩衝液）でカラムを平衡化した。５Ｍ ＮａＣｌをＨＩＣ溶出プールに添加することに
よってＩＭＡＣ負荷を調製し、最終容量０．２５ＭのＮａＣｌを製造した。試料は、ＩＭ
ＡＣ樹脂の上に流量４ｍＬ／分で負荷した。負荷は、２カラム容量の平衡緩衝液によって
完了させた。樹脂を２カラム容量の２０ｍＭリン酸ナトリウム、１０ｍＭイミダゾール、
ｐＨ８．０で洗浄し、塩を除去した。緩衝液Ａ（２０ｍＭリン酸ナトリウム、１０ｍＭイ
ミダゾール、ｐＨ８．０）、および緩衝液Ｂ（２０ｍＭリン酸ナトリウム、２００ｍＭイ
ミダゾール、ｐＨ８．０）を用いて、７カラム容量の０〜１００％Ｂ、続いて２ＣＶの１
００％Ｂの線形溶出を行った。イミダゾールの存在は、ＡＫＴＡ ＦＰＬＣを用いてＵＶ
２１５吸光度を３５００ｍＡｕ以上に維持したため、溶出ピークは観察されなかった。フ
ロースルー、洗浄、および溶出分画は、４〜１２％ビス−トリス非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ゲルによって分析した（図４８）。ゲルは、宿主細胞タンパク質および切断されたＸＴＥ
Ｎ種の良好な除去を示す（図４８Ａ）。第２のゲルに基づいて（図４８Ｂ）、分画Ｃ５、
Ｃ６、およびＣ７をプールした。ＩＭＡＣ溶出プール中に合計７０ｍｇのタンパク質が推
定された。
４．ＩＭＡＣ溶出プールのトリプシン消化
ＩＭＡＣ溶出プールのトリプシン消化は、１：２００ｍ／ｍの比で行った。０．３５ｍ
ｇのウシ膵臓トリプシン（Ｓｉｇｍａ、カタログ＃Ｔ１４２６）を、７０ｍｇのタンパク
質（ＩＭＡＣ溶出プール）で終夜、３７℃でインキュベートした。非還元４〜１２％ビス
−トリスＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行い、ＣＢＤタグの切断が、図４９に示されるように完
了したことを確認した。
５．研摩ステップ：ＭａｃｒｏＣａｐ Ｑクロマトグラフィー
トリプシン消化後、ＭａｃｒｏＣａｐ Ｑクロマトグラフィーを使用し、切断されたタ
グを分離した。ＸＫ １６カラムを、ＭａｃｒｏＣａｐ Ｑ（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅ
ｎｃｅｓ、カタログ＃１７−５４６９−０２）で１８ｃｍ床高まで充填した。トリプシン
消化したＩＭＡＣ溶出プールを３７℃で１時間、２ｍＭ ＴＣＥＰでインキュベートし、
ＭａｃｒｏＣａｐ Ｑカラム上に負荷する前に、ＸＴＥＮの二量体を還元した。カラムは
、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０で平衡化した。試料は、４ｍＬ／分で負荷した（約
２ｍｇ／ｍＬ樹脂負荷）。カラム負荷は、追加の２カラム容量の２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、
２ｍＭ ＴＣＥＰ、ｐＨ７．０で完了した。カラムを、２カラム容量の２０ｍＭ ＨＥＰ
ＥＳ、２ｍＭ ＴＣＥＰ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０で洗浄した。２０ｍＭ Ｈ
ＥＰＥＳ、２ｍＭ ＴＣＥＰ、ｐＨ７．０緩衝液中１５０ｍＭ ＮａＣｌ〜５００ｍＭ
ＮａＣｌの線形勾配溶出を、２０カラム容量以上行った。ＴＣＥＰの存在に起因して、全
体クロマトグラフィー中に高レベルのＵＶ２１５が観察されたが（図５０）、２２〜３０
ｍＳ／ｃｍの溶出ピークが観察された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、銀染色、およびＣ１８ ＲＰ
−ＨＰＬＣによって、全ての試料を分析した。フロースルーにおいて、切断されたＣＢＤ
の除去が観察され（図５１Ａ）、一方、溶出分画Ｅ１１、Ｅ１２、Ｆ１２、Ｆ１１、Ｆ１
０・・・Ｆ６の中の溶出分画において、ＸＴＥＮのごくわずかなバンドが観察された（図
５１Ｂ）。ＸＴＥＮの切断種の分離は、早期溶出分画Ｅ１１、Ｅ１２、Ｆ１２、およびＦ
１１において、銀染色によって、主なＸＴＥＮポリペプチドよりも速く移動する種として
観察された（図５１Ｃ）。上記の結果に基づき、溶出分画をＣ１８ ＲＰ−ＨＰＬＣによ
ってさらに分析した。図５２は、ＲＰ−ＨＰＬＣ分析のスタック化クロマトグラフィープ
ロファイルを示す。早期溶出分画は、切断された種の著しい存在を示す、広い先導肩部を
有した。またこれらの早期分画（Ｅ１２、Ｆ１２、およびＦ１１）は、タンパク質分解タ
グで富化された。上記分析に基づき、溶出分画Ｆ１０、Ｆ９、Ｆ８、Ｆ７、およびＦ６を
プールした。Ｃ１８ ＲＰ−ＨＰＬＣによって、溶出プールを再度分析した（図５３）。
精製されたタンパク質は、９７．５％の純度であることが見出された。
６．濃縮および透析濾過（最終製剤化）
Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａｃｅｌ−１５（ＭＷＣＯ １０ｋ）遠心分離デバイスを使用
して、上記ＭａｃｒｏＣａｐ Ｑプールを５ｍＬに濃縮し、続いて２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ
ｐＨ７．０を用いた７Ｘ透析濾過によって、８．１３ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度
に濃縮した。２０ｇｍの細胞ペレットから合計４３ｍｇのタンパク質が精製された。３ス
テップクロマトグラフィーの全体回収は、約３３％と推定された。
実施例１９：ＣＢＤおよびＨｉｓ８タグを持つ１ｘアミノ−ＸＴＥＮ試薬の精製
アミノ−ＸＴＥＮの精製は、本質的に、１つのシステインを含有する１ｘチオール−Ｘ
ＴＥＮの精製について記載される通り行った（詳細は実施例１５参照）。発酵からの２０
ｇｍの細胞ペーストを、１００ｍＬの２０ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ８．０（溶解緩
衝液）中で均質化し、熱処理して、遠心分離および濾過によって清澄化した。疎水性相互
作用クロマトグラフィーを第１のステップとして使用し、Ｎ末端無傷タンパク質を捕捉し
た（図５４）。分画Ｅ２、Ｅ３、およびＥ４をさらなる処理のためにプールした。ＩＭＡ
Ｃ親和性クロマトグラフィーは、ＸＴＥＮの無傷Ｃ末端Ｈｉｓタグに結合するための捕捉
ステップとして使用した（図５５）。分画Ｅ２およびＥ３をプールした。ＩＭＡＣ溶出プ
ールのトリプシン消化は、１：２００ｍ／ｍの比で終夜、３７℃で行った。トリプシン消
化後、ＭａｃｒｏＣａｐ Ｑクロマトグラフィーを使用し、切断されたタグを分離した。
分画は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに続いて、銀染色（図５６）およびＣ１８ ＲＰ−ＨＰＬＣ（
図５７）によって分析した。上記分析に基づき、溶出分画Ｃ１０、Ｃ１１、およびＣ１２
をプールした。Ｃ１８ ＲＰ−ＨＰＬＣによって、溶出プールを再度分析した（図５８）
。タンパク質は、９８％超の純度であることが見出された。Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａｃ
ｅｌ−１５（ＭＷＣＯ １０ｋ）遠心分離デバイスを使用して、ＭａｃｒｏＣａｐ Ｑプ
ールを３０００ＲＰＭで５ｍＬに濃縮し、続いて２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．０を用
いた７Ｘ透析濾過によって、５．３５ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度に濃縮した。
実施例２０：ＲＰ１１／Ｈｉｓ８−ＸＴＥＮ２タグ系の精製および評価
上記の発現ベクターを使用して、２タグ付きＸＴＥＮタンパク質を構築し、融合タンパ
ク質を以下のアミノ酸配列または成分：ＭＫＩＫＴＧＡＲＩＬＡＬＳＡＬＴＴＭＭＦＳＡ
ＳＡＬＡＡＰＴＴＡＧＡＧ−Ｔａｇ−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６９（Ａｍ１）−ＲＨＨＨＨＨＨ
ＨＨでコードし、式中、ＭＫＩＫＴＧＡＲＩＬＡＬＳＡＬＴＴＭＭＦＳＡＳＡＬＡは、宿
主細胞周辺質に発現および輸送されたポリペプチドから切断されるＭａｌＥ認識配列であ
り、ＡＰＴＴＡＧＡＧはスペーサーであり、Ｔａｇは、以下に由来する（括弧内の配列が
続くタグ名）：ＲＰ５（ＲＰＲＰＲＰＲＰＲＰＧＲ）；ＲＰ７（ＲＰＲＰＲＰＲＰＲＰＲ
ＰＲＰＧＲ）；ＫＰ５（ＫＰＫＰＫＰＫＰＫＰＧＲ）；ＲＰ９（ＲＰＲＰＲＰＲＰＲＰＲ
ＰＲＰＲＰＲＰＧＲ）；ＲＰ１１（ＲＰＲＰＲＰＲＰＲＰＲＰＲＰＲＰＲＰＲＰＲＰＧＲ
）；Ｐ５Ｋ４Ｐ９（ＲＰＲＰＫＰＲＰＫＰＲＰＫＰＲＰＫＰＧＲ）；およびＲ６Ｋ５Ｐ１
１（ＲＰＲＰＫＰＲＰＫＰＲＰＫＰＲＰＫＰＲＰＫＰＧＲ）。タグを持つ構築体の全ての
変化形を製造し、実施例１５に記載される方法を使用して、タンパク質を大腸菌中で発現
させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／クマシー染色分析のために、可溶性抽出物を宿主細胞から調
製した。分析によって、Ｎ末端タグ長およびアミノ酸組成物は、ＲＰ７、ＲＰ９、ＲＰ１
１、およびＲ６Ｋ５Ｐ１１タグを持つ構築体の発現について、タンパク質発現に顕著に影
響しなかった（図５９参照）。ＲＰ５、ＲＰ７、ＲＰ９、およびＲＰ１１タグを持つ発現
タンパク質を、ＭａｃｒｏＣａｐ ＳＰ樹脂への結合についてさらに試験した。より長い
タグを持つタンパク質は、カチオン交換樹脂により効率的に結合し、よりストリンジェン
トな洗浄条件下で結合されたままであった。したがって、ＲＰ１１タグは、カチオン交換
クロマトグラフィーを使用し、ＸＴＥＮの精製のためのＮ末端タグとして選択された。追
加の実験は、ＲＰ１１−ＸＴＥＮ−Ｈｉｓ８ポリペプチドが、発酵槽中で効率的に発現し
たことを示し、発現したタンパク質の大部分は、細胞ペレット分画中に見出された（図６
０）。
実施例２１：ＲＰ１１／Ｈ８ ２タグ系を持つ１ｘアミノ−ＸＴＥＮ試薬の精製
１．発現
１ｘアミノ−ＸＴＥＮのＲＰ１１−ＸＴＥＮ−Ｈｉｓ８前駆体は、記載される４Ｌ発酵
反応を使用し、形質転換された大腸菌中の発現によって産生された。細胞を遠心分離によ
って採取し、使用するまで−８０℃で冷凍した。
２．溶解および清澄化
２５ｇｍの細胞ペーストを、７５ｍＬの２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０、５０
ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ中に再懸濁した。再懸濁されたペーストを、８００〜
９００バールで３回ホモジナイザーに通すことによって、溶解を行った。ホモジネートを
８５℃の水浴中で１５分間保持した後、氷／水浴を使用し、温度が１０℃以下に低下する
まで急速に冷却した。次いで、処理されたホモジネートを、１０，０００ｒｐｍでＳＬＡ
−３０００ローターにおいて６０分間遠心分離した。上澄みを回収し、０．２２μｍボト
ルトップフィルターを使用して濾過した。
３．カチオン交換捕捉ステップ
カチオン交換クロマトグラフィーを捕捉ステップとして使用し、産物のＮ末端完全性を
保証した。産物に対するその優れた能力および選択性に起因して、いくつかのカチオン交
換培地の中からＭａｃｒｏＣａｐ ＳＰ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を選択した
。２０ｍＬのＭａｃｒｏＣａｐ ＳＰカラムをＲｅｄｉ−Ｓｅｐハウジングに充填し、２
０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）、２０ｍＭ ＮａＣｌ緩衝液で平衡化した。溶解
物を重力によってカラムの上に負荷した。３カラム容量（ＣＶ）の２０ｍＭリン酸ナトリ
ウム、ｐＨ８．０、１００ｍＭ ＮａＣｌを洗浄ステップとして適用した後、タンパク質
を３ＣＶの２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０、５００ｍＭ ＮａＣｌでステップ溶
出した。溶出のために半ＣＶ分画（１０ｍＬ）を回収し、４〜１２％ビス−トリスＳＤＳ
／ＰＡＧＥによって分析した（図６１）。後次のクロマトグラフィーステップのために、
溶出分画２〜４を合わせた。
４．ＩＭＡＣ研摩ステップ
２０ｍＬのＴｏｙｏＰｅａｒｌ ＡＦ−キレートカラムを、Ｒｅｄｉ−Ｓｅｐカラムハ
ウジングに充填し、１００ｍＭ硫酸ニッケルを装入した。カラムを２０ｍＭリン酸ナトリ
ウム、ｐＨ８．０、５００ｍＭ ＮａＣｌで平衡化した後、ＭａｃｒｏＣａｐ ＳＰプー
ルを重力によってカラムの上に負荷した。２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）、５
００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭイミダゾール緩衝液に続いて、２０ｍＭリン酸ナトリウム（
ｐＨ８．０）、５ｍＭイミダゾールを使用し、２つの洗浄ステップを適用した。次いで、
２０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭイミダゾールを使用して、産物をカラムから溶出
し、４ＣＶの溶出に対して半ＣＶ（１０ｍＬ）分画を回収した。各ステップからの試料を
、４〜１２％ビス−トリスＳＤＳ／ＰＡＧＥによって審査した（図６２）。ゲルに基づい
て、溶出２および３をさらなる処理のためにプールした。全体収率は３０％であった。
５．ＩＭＡＣ溶出プールのトリプシン消化
ＩＭＡＣプールのトリプシン消化は、１：２００および１：５００ｍ／ｍの比で、１ｍ
ｇ／ｍＬのウシトリプシン（Ｓｉｇｍａ、カタログ＃Ｔ１４２６、ウシ膵臓からのトリプ
シン）をＩＭＡＣプールに添加することによって行った。反応混合物を３７℃で終夜保持
し、消化の完了は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって確認した。消化前および消化後
試料を、４〜１２％ビス−トリスＳＤＳ／ＰＡＧＥによって分析し、クマシー染色および
銀染色の双方によって染色した（図６３）。クマシー染色されたゲル上の、よりかすかな
染色、ならびに消化後試料の分子量の移行は、消化前試料と比較したとき、ＮおよびＣ末
端タグの双方の良好な除去を示す。銀染色されたゲルは、消化後に均質なバンドを示し、
試料中の切断種の不在を示唆し、ＲＰ１１／Ｈ８ ２タグ系および精製方法が、均質な最
終ＸＴＥＮ産物を提供するという結論を支持する。
実施例２２：ＲＰ１１およびＨｉｓ８親和性タグを持つＸＴＥＮの精製
１．発現
それぞれＮおよびＣ末端でＸＴＥＮに結合された２つの親和性タグを持つ融合タンパク
質ＲＰ１１−ＸＴＥＮ−Ｈｉｓ８は、記載される条件を使用し、４Ｌ発酵反応を使用して
大腸菌中で発現させた。
２．溶解および清澄化
成長後、細胞を遠心分離によって採取し、使用するまで−８０℃で冷凍した。細胞ペレ
ットを溶解緩衝液（２０ｍＭ リン酸ナトリウム、５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴ
Ａ ｐＨ８．０、細胞ペースト１ｇ当たり３ｍＬの緩衝液）中に再懸濁した。ＡＰＶホモ
ジナイザーに３回、８３０〜９００バールの圧力で通すことによって細胞を溶解した。溶
解緩衝液（細胞ペースト１グラム当たり１ｍＬの緩衝液）を追跡として使用し、ホモジナ
イザーから滞留量を回収した。均質化した溶解物を８５℃の水浴中で２０分間インキュベ
ートし、続いて氷水浴中で２０分間急速冷却した。加熱および冷却処理後、溶解物を１１
０００ＲＰＭで９０分間、ＳＯＲＶＡＬＬ遠心分離器内で遠心分離した。遠心分離後、上
澄みを２つのＣＵＮＯ Ｂｉｏ ｃａｐ ２５（ＢＣ００２５Ｌ９０ＳＰ０８Ａ）フィル
ターに通して濾過した。清澄化した上澄みを４℃で終夜保管した。
３．捕捉ステップ：Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＩＭＡＣクロマトグラフィー
ＩＭＡＣ親和性クロマトグラフィーは、ＸＴＥＮを正常なＣ末端Ｈｉｓタグと結合する
ための捕捉ステップとして使用した。つまり、クロマトグラフィーカラムＢＰＧ１４０／
１２（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に、２０００ｍＬのＴｏｙｏｐｅａｒｌ Ｉ
ＭＡＣ ６５０Ｍ樹脂（ＴＯＳＯＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を充填した。２カラム容
量（ＣＶ）の平衡緩衝液（２０ｍＭ リン酸ナトリウム、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８
．０）でカラムを平衡化した。澄化した細胞溶解物を、５Ｍ ＮａＣｌストック溶液を使
用して最終ＮａＣｌ濃度５００ｍＭに調整し、次いでＩＭＡＣ樹脂の上に負荷した。２カ
ラム容量の平衡緩衝液、次いで２カラム容量の２０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ
ＮａＣｌ、５ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０に続いて、２カラム容量の２０ｍＭリン酸ナ
トリウム、５ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０でカラムを洗浄し、塩を除去した。２カラム
容量の２０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０で溶出を行った
。フロースルー、洗浄、および溶出分画は、非還元４〜１２％ビス−トリスＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ／クマシー染色によって分析し、所望の産物を持つ分画をプールした。
４．研摩／捕捉ステップ：ＭａｃｒｏＣａｐ ＳＰクロマトグラフィー
カチオン交換クロマトグラフィーを研摩ステップとして使用し、産物のＮ末端完全性を
保証した。産物に対するその優れた能力および選択性に起因して、いくつかのカチオン交
換培地の中からＭａｃｒｏＣａｐ ＳＰ樹脂（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を選
択した。１０００ｍＬのＭａｃｒｏＣａｐ ＳＰ樹脂をＢＰＧ１００／１３（ＧＥ Ｌｉ
ｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）クロマトグラフィーカラムに充填し、２０ｍＭリン酸ナトリウ
ム、ｐＨ８．０、２０ｍＭ ＮａＣｌで平衡化した。ＩＭＡＣプールをカラムの上に負荷
し、樹脂を２カラム容量の２０ｍＭリン酸ナトリウム、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０
、および２カラム容量の２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ
で洗浄した。タンパク質を、２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）中、５カラム容量
の直線勾配１５０〜５００ｍＭ ＮａＣｌで溶出した。分画を回収し、４〜１２％ビス−
トリスＳＤＳ／ＰＡＧＥによって分析した。次のステップのために、所望の産物を持つ分
画を合わせた。
５．ＭａｃｒｏＣａｐ ＳＰ溶出プールのトリプシン消化
ＳＰ溶出プールのトリプシン（Ｓｉｇｍａ，ウシ膵臓からのトリプシン）消化は、１：
２００ｍ／ｍの酵素／タンパク質比で終夜、３７℃で行った。
６．研摩ステップ：Ｍａｃｒｏｃａｐ Ｑクロマトグラフィー
トリプシン消化後、Ｍａｃｒｏｃａｐ Ｑクロマトグラフィーを使用し、切断されたタ
グを最終産物から分離した。ＢＰＧ１００／１９カラム（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃ
ｅｓ）に、１５００ｍＬカラム容量のＭａｃｒｏｃａｐ Ｑ樹脂（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃ
ｉｅｎｃｅｓ）を充填した。トリプシン消化したＭａｃｒｏｃａｐ ＳＰ溶出プールを８
０℃で１５分間、２０ｍＭ ＤＴＴおよび２ｍＭ ＥＤＴＡでインキュベートし、ジスル
フィド結合を低減し、トリプシンを不活性化した。冷却したタンパク質溶液を、Ｍｉｌｌ
ｉ−Ｑ水で５ｍＳ／ｃｍ以下の導電性に希釈し、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ、ｐＨ７．０で平衡化されたＭａｃｒｏｃａｐ Ｑカラムの上に負荷した。２カラム
容量の２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０、次いで２カラム容量の
２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ ＴＣＥＰ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０でカラム
を洗浄した。タンパク質は、２０カラム容量の２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０中、線
形勾配１５０ｍＭ ＮａＣｌ〜５００ｍＭ ＮａＣｌで溶出した。分画を、ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ／銀染色によって分析した。
７．濃縮および透析濾過（最終製剤化）
選択したＭａｃｒｏＣａｐ Ｑ分画を合わせ、１０ＫＤ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ ｍｉｎｉ
（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を２０ｐｓｉ未満のフィード圧、８ｐｓｉ未満の残余分で濃縮し
、続いて２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０を用いた１０Ｘ透析濾
過によって５ｍｇ／ｍＬ超の最終タンパク質濃度を達成した。
８．異なる方法で精製されたタンパク質の純度分析
１つのバッチ（バッチ１）は、上記のような３つの精製ステップを通じて精製された。
別のバッチ（バッチ２）は、同じ発酵材料から精製されたが、ＭａｃｒｏＣａｐ ＳＰ研
摩ステップは省略された。ＸＴＥＮの切断種は、バッチ２のＭａｃｒｏＣａｐ Ｑ溶出分
画中のＳＤＳ−ＰＡＧＥ／銀染色（図８７Ａ）によって検出され、バッチ１のＭａｃｒｏ
Ｃａｐ Ｑ溶出分画は、本質的に切断を含まなかった（図８７Ｂ）。これらの結果は、用
いられた条件下で、ＲＰ１１タグに基づくＭａｃｒｏＣａｐ ＳＰステップが、Ｎ末端完
全性および全体的な産物品質を保証するために必須であること、ならびにＲＰ１１／Ｈ８
２タグ系および精製方法が、均質な最終ＸＴＥＮ産物を提供することを支持する。
実施例２３：ＸＴＥＮ前駆体を製造するためのＤＢＣＯ−Ｍａｌリンカーの３ｘチオー
ル−ＸＴＥＮとの共役
３ｘ−チオール−ＸＴＥＮ（ＸＴＥＮ＿ＡＥ９０５（Ａｍ１，Ｃ８，Ｃ４５３，Ｃ８９
８，セグメント１７４））システイン操作されたＸＴＥＮセグメントは、２０ｍＭ ＨＥ
ＰＥＳ、ｐＨ７．０、５０ｍＭ ＮａＣｌ中の１９３μＭ（１６ｍｇ／ｍＬ）溶液として
反応のために調製した。ＤＢＣＯ−マレイミド（Ｃｌｉｃｋ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｔｏ
ｏｌｓ，Ｉｎｃ．、カタログ＃Ａ１０８）を、ＤＭＦ中に溶解し、最終濃度５０ｍＭにし
た。３ｘチオール−ＸＴＥＮ（５．１ｍｇ、３２０μｌ）のアリコートを、１０ｍＭの新
鮮な再構築ＤＴＴを用いて、７０℃で２０分間還元した。タンパク質試料を、水で６００
μｌの総容量に希釈した。１２００μｌの１００％アセトニトリルを添加し、混合液を１
３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上澄みを除去し、１０００μｌの８０％アセト
ニトリルを添加し、混合液を１３，０００で１分間遠心分離した。洗浄ステップを再度繰
り返した。ペレットを、３００μｌの１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０中に溶解した
。ＤＭＦ中７．７μｌの５０ｍＭ ＤＢＣＯ−Ｍａｌ溶液を添加し（１：６モル比の３ｘ
チオール−ＸＴＥＮ：ＤＢＣＯ−マレイミド）、２５℃で２時間インキュベートした。Ｃ
１８ ＲＰ−ＨＰＬＣ分析によって、修飾の完了を監視した（図６４Ａ）。タンパク質混
合液を、１．６ｍＬ Ｔｏｙｏｐｅａｒｌブチルカラムを使用し、疎水性相互作用クロマ
トグラフィー（ＨＩＣ）によって精製した。溶出は、２０ｍＭリン酸塩（ｐＨ７．０）緩
衝液中３０カラム容量の下降勾配（１．０５Ｍ〜０．３Ｍ）硫酸アンモニウムを用いて０
．５ｍＬ／分の流量で行った（図６４Ｂ）。Ｃ１８ ＲＰ−ＨＰＬＣによって、クロマト
グラフィー分画を分析した（図６４Ｃ）。
実施例２４：トリプシン切断および二重タグ付加前駆体の精製
トリプシン消化
ＸＴＥＮ＿ＡＥ８７０＿Ａｍ１，Ｃ１の二重タグ付加（ＣＢＤ／Ｈｉｓ８）前駆体は、
ＣＢＤ配列の存在に起因して、クマシーで十分に染色する一方、ＸＴＥＮ＿ＡＥ８７０＿
Ａｍ１，Ｃ１の非タグ付加異形は、クマシーで十分に染色しないが、銀染色によって検出
することができる。したがって、トリプシン消化の完全性は、クマシー染色（図６５Ａ）
および銀染色（図６５Ｂ）技法双方を使用して監視した。ＸＴＥＮ＿ＡＥ８７０＿Ａｍ１
，Ｃ１の二重タグ付加前駆体は、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８）中、異なる比率のウシ
トリプシンおよびプロテオミクス等級のブタトリプシン（陽性対照）で消化した。３７℃
で終夜のインキュベーションは、残留するクマシー染色された１６０ｋＤａバンドの二重
タグ付加前駆体の検出に基づいて、２５℃で終夜のインキュベーションよりもさらに完全
な消化を許した（図６５Ａ：全ての比率は、トリプシン：基質の質量／質量比を指す）。
図６５Ｂは、１：１００、１：２００、および１：５００の比率が、ウシトリプシンで消
化し、１：１００がブタトリプシンで消化して、ＸＴＥＮ前駆体の効率的な消化をもたら
すことを示す。
トリプシン消化された二重タグ付加前駆体のＭａｃｒｏＣａｐ Ｑ精製
１：２００比率のウシトリプシン：二重タグ付加前駆体（質量／質量）を、３７℃で終
夜の消化に使用した。図６６Ａは、二重タグ付加前駆体の消化産物への９０％超の変換を
示す。これは、消化後の約１６０ｋＤａにおけるクマシー染色されたバンドの消失、およ
び２０ｋＤａ ＣＢＤフラグメントの出現によって実証された。
トリプシン消化された材料は、ＭａｃｒｏＣａｐ Ｑアニオン交換樹脂に続いて、緩衝
液Ａ：２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５およびＢ：２０ｍＭ Ｈ
ＥＰＥＳ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５を使用する精製ステップに供された。消化
された材料を重力によって付加し、０％、２０％、４０％、６０％、８０％、および１０
０％緩衝液Ｂの連続する３カラム容量のウォッシュを使用し、段階的に溶出した。ＸＴＥ
Ｎ＿ＡＥ８７０は、６０％Ｂ中に溶出した。図６６Ｂは、切断されたＣＢＤフラグメント
が、使用される条件下でＭａｃｒｏＣａｐ Ｑに結合せず、ＸＴＥＮから完全に分離され
たことを示す。ＭａｃｒｏＣａｐ ＱからのＸＴＥＮの段階的溶出は、切断ポリペプチド
を部分的に分離しただけであった。良好な分離は、ＸＴＥＮの勾配溶出によって達成され
た（図６６Ｃ）。
残留トリプシン活性の試験
最終製剤化ＸＴＥＮ調製物中の残留トリプシン活性の存在を試験するために、タンパク
質試料を１０：１質量／質量比で合成［Ｇ２］ＧＬＰ２ペプチドと混合した。消化の陽性
対照は、［Ｇ２］ＧＬＰ２ペプチドおよびウシトリプシンを含有し、陰性対照は、［Ｇ２
］ＧＬＰ２ペプチドのみを含有した。全ての試料を３７℃で終夜インキュベートした。イ
ンキュベーション後、試料を１％ ＴＦＡで急冷し、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｊｕｐｉｔ
ｅｒ Ｃ１８ ５μｍ ３００Ａ分析カラムを使用し、Ｃ１８ ＲＰ−ＨＰＬＣ分析に供
した。緩衝液Ａは、０．１％ ＴＦＡ、９９．９％ ＨＰＬＣ等級Ｈ２Ｏを含有し、緩衝
液Ｂは、０．１％ ＴＦＡ、９９．９％ ＨＰＬＣ等級アセトニトリルを含有した。５％
Ｂ〜５０％Ｂの勾配を使用し、４５分の溶出時間にわたって分析を行った。図６７は、Ｘ
ＴＥＮ＿ＡＥ８６９（Ａｍ１，Ｃ２）最終調整物中の残留トリプシン活性のＲＰ−ＨＰＬ
Ｃ分析の結果を示す。図６７Ａは、無傷ＧＬＰ２ペプチドを示す（保持時間４１分）。図
６７Ｂは、２つの特徴的なトリプシンフラグメントを持つＧＬＰ２ペプチドのトリプシン
消化を示す（保持時間３３．５分および３４分）。図６７Ｃは、ＧＬＰ２ペプチドが、Ｘ
ＴＥＮを用いた終夜のインキュベーション後に無傷のままであり、トリプシンフラグメン
トが観察されなかったことを示す。この結果は、最終ＭａｃｒｏＣａｐ Ｑ精製調製物が
、残留トリプシン活性を含有しないことを示す。
実施例２５：共役のためのシステイン操作されたＸＴＥＮの発酵および精製
プラスミド上にＡＣ２９２を含有する大腸菌を、２ｘＹＴ中で終夜、飽和まで成長させ
、次いで、２００ｍＬのこの培養物を使用して、ウェーブバッグ中２５Ｌ培養物の２ｘＹ
Ｔ培地に播種した。双方の培養物は、５０μｇ／ｍＬカナマイシンの存在下で存在した。
第２の培養物を約１．０のＯＤ６００まで３７℃で成長させ、２６℃に冷却して、１２ｍ
Ｌの１Ｍ ＩＰＴＧで終夜誘導した。細胞ペレットを、４０００ｒｐｍで２０分間のＳＬ
Ａ−３０００ローター回転で採取した。細胞ペレット（１８４ｇ）を、７３６ｍＬの２０
ｍＭトリス（ｐＨ６．８）、５０ｍＭ ＮａＣｌ中に再懸濁した。再懸濁した細胞を、２
０，０００ｐｓｉでマイクロフルイダイザーを用いて溶解し、次いで７５℃に１５分間加
熱した後、氷上で３０分間急速冷却した。次いで、溶解物を遠心分離によって清澄化した
。次いで、清澄化した溶解物をＤＥ５２カラムの上に負荷し、予めＮａＯＨで衛生化し、
２０ｍＭトリス（ｐＨ６．８）、５０ｍＭ ＮａＣｌで平衡化した。５カラム容量の２０
ｍＭトリス（ｐＨ６．８）、５０ｍＭ ＮａＣｌ、５カラム容量の２０ｍＭトリス（ｐＨ
６．８）、１５０ｍＭ ＮａＣｌでカラムを洗浄し、５カラム容量の２０ｍＭトリス（ｐ
Ｈ６．８）、２５０ｍＭ ＮａＣｌで溶出した。次いで、プールした溶出分画をｍａｃｒ
ｏｃａｐＱカラムの上に負荷し、予めＮａＯＨで衛生化し、２０ｍＭトリス（ｐＨ６．８
）、５０ｍＭ ＮａＣｌで平衡化した。９カラム容量の２０ｍＭトリス（ｐＨ６．８）、
５０ｍＭ ＮａＣｌ、９カラム容量の２０ｍＭトリス（ｐＨ６．８）、１００ｍＭ Ｎａ
Ｃｌでカラムを洗浄し、９カラム容量の２０ｍＭトリス（ｐＨ６．８）、２５０ｍＭ Ｎ
ａＣｌで溶出した。プールした溶出分画を１５％ｗ／ｖ硫酸ナトリウムに調整した後、オ
クチルセファロースＦＦカラムの上に負荷し、予めＮａＯＨで衛生化して、トリスｐＨ７
．５で平衡化した。４カラム容量の２０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、１５％ｗ／ｖ硫酸ナ
トリウムでカラムを洗浄し、４カラム容量の２０ｍＭトリス（ｐＨ６．８）、４カラム容
量の２０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、５％ｗ／ｖ硫酸ナトリウムで溶出した。試料を４℃
で貯蔵し、ロット＃ＡＰ１９７を得た。次いで、精製したシステイン操作されたＸＴＥＮ
は、表１１の薬物等のペイロードとの共役に適した反応物として機能し、ＸＴＥＮ−薬物
共役体をもたらすことができる。
実施例２６：ＧＬＰ２−ＸＴＥＮのＸＴＥＮ−ペイロードをもたらすための１ｘアミノ
−ＸＴＥＮへのＧＬＰ２−Ｃｙｓの共役
１ｘアミノ−ＸＴＥＮ（ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６９（Ａｍ１））を、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ
、ｐＨ７．０、５０ｍＭ ＮａＣｌ中の６７μＭ（５．３５ｍｇ／ｍＬ）として調製した
。Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ＃２２３２２
）を、ＤＭＳＯ中の１０ｍＭ溶液として新たに調製した。１０ｍｇのアミノ−ＸＴＥＮ（
１．８７ｍＬ）を１５モル過剰のスルホ−ＳＭＣＣ（１８．７μｌ）と混合し、２５℃で
１時間インキュベートした。Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５，ＭＷＣＯ ５ｋ遠心分離
装置を使用し、遠心分離濾過によって過剰な架橋剤を除去した。１．８ｍＬ容量の反応混
合物を、８ｍＬの２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．０、５０ｍＭ ＮａＣｌと混合し、Ｓ
ｏｒｖａｌｌ ＲＴ６０００遠心分離機中で３０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離し
た。この手順を２回以上繰り返した。回収された残余分の最終容量は１．８ｍＬであった
。ＧＬＰ２−Ｃｙｓペプチド（ＣＳＢｉｏ，カスタム合成）を２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐ
Ｈ７．０、５０ｍＭ ＮａＣｌ中に溶解し、最終濃度３ｍｇ／ｍＬにした。Ｎ−マレイミ
ド−ＸＴＥＮを、２．３倍モル過剰のＧＬＰ２−Ｃｙｓペプチドと混合し、２５℃で１時
間インキュベートした。Ｃ１８ ＲＰ−ＨＰＬＣによって、修飾の完了を監視した。２０
μｇのタンパク質試料は、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｃ１８ ５μＭ ３
００Ａ ４．６ｍｍｘ１５０ｍｍカラム上に負荷した。タンパク質は、０．１％トリフル
オロ酢酸中の５〜５０％勾配のアセトニトリルで溶出され、２１４ｎｍでの吸光度によっ
て検出された。本質的に、全てのＮ−マレイミド−ＸＴＥＮは、ＨＰＬＣおよびエレクト
ロスプレー質量分析によって実証されるように、ＧＬＰ２−Ｃｙｓ−ＸＴＥＮ共役体に変
換された（ＮａｎｏＳｅｐ ３Ｋ Ｏｍｅｇａ遠心分離装置（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐ．）を
使用して脱塩された１００μｇタンパク質試料上で行われた試料のＥＳＩ−ＭＳ分析）。
５０％アセトニトリル、０．５％ギ酸中のタンパク質溶液は、流量１０μｌ／分で高分解
能質量分析計に注入した。スペクトルは、８００〜１６００ａｍｕ範囲内で得られ、Ｂａ
ｙｅｓｉａｎタンパク質再構築ソフトウェアを使用して、ゼロ電荷スペクトルに再構築さ
れた（図６８）。未反応のＸＴＥＮおよびＧＬＰ２ペプチドを、連続アニオン交換（Ｍａ
ｃｒｏＣａｐ Ｑ）および疎水性相互作用（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ Ｐｈｅｎｙｌ）クロマ
トグラフィーによって共役体から分離した。ＲＰ−ＨＰＬＣおよびＭＳ分析の結果は、反
応物および最終産物の高い収率および純度を実証した（図６８）。
実施例２７：１ｘチオール−ＸＴＥＮ（システイン操作されたＸＴＥＮ）へのＧＬＰ２
−Ｎ−Ｍａｌの共役
１ｘチオール−ＸＴＥＮ（ＸＴＥＮ＿ＡＥ８８０（Ａｍ１，Ｃ８）（セグメント１８１
）は、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、５０ｍＭ ＮａＣｌ中の１２２μＭ（９．８
４ｍｇ／ｍＬ）溶液として調製した。ＧＬＰ２−Ｎ−マレイミドペプチド（ＣＳＢｉｏ，
カスタム合成）をＤＭＳＯ中に溶解し、最終濃度３ｍｇ／ｍＬにした。１ｘチオール−Ｘ
ＴＥＮ（９００μｌ中８．８ｍｇ）を、３倍モル過剰のＧＬＰ２−Ｎ−Ｍａｌペプチドと
混合し、２５℃で１時間インキュベートした。修飾の完了および得られた共役を、Ｃ１８
ＲＰ−ＨＰＬＣ（２０μｇのタンパク質試料を、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｊｕｐｉｔｅ
ｒ Ｃ１８ ５μＭ ３００Ａ ４．６ｍｍｘ１５０ｍｍカラム上に負荷した。タンパク
質は、０．１％トリフルオロ酢酸中の５〜５０％勾配のアセトニトリルで溶出され、２１
４ｎｍでの吸光度によって検出された）およびエレクトロスプレーイオン化質量分析（試
料のＥＳＩ−ＭＳ分析は、ＮａｎｏＳｅｐ ３Ｋ Ｏｍｅｇａ遠心分離装置（Ｐａｌｌ
Ｃｏｒｐ．）を使用して脱塩された１００μｇタンパク質試料上で行われた）によって監
視した。５０％アセトニトリル、０．５％ギ酸中のタンパク質溶液は、流量１０μｌ／分
で高分解能質量分析計に注入した。スペクトルは、８００〜１６００ａｍｕ範囲内で得ら
れ、Ｂａｙｅｓｉａｎタンパク質再構築ソフトウェアを使用して、ゼロ電荷スペクトルに
再構築された。分析の結果は、図６９に示される。 ＧＬＰ２−ＸＴＥＮ共役体は、移動
相として０．１％ ＴＦＡ中５〜５０％勾配のアセトニトリルを使用し、分取Ｃ４ ＲＰ
−ＨＰＬＣ（Ｖｙｄａｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ４ ５μ ３００Ａ １０ｍｍｘ２５０ｍ
ｍカラム）によって精製された（図７０Ａ参照）。最終ＨＰＬＣ精製されたＧＬＰ２−Ｘ
ＴＥＮ共役体は、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｃ１８ ５μＭ ３００Ａ
４．６ｍｍ ｘ １５０ｍｍカラムを使用して分析した（図７０Ｂ参照）。精製されたＧ
ＬＰ２−ＸＴＥＮ共役体の収量は６．２ｍｇ（７０％）であった。
実施例２８：１ｘチオール−ＸＴＥＮへのＤＢＣＯ−Ｍａｌの共役
１ｘチオール−ＸＴＥＮ（ＸＴＥＮ＿ＡＥ８８０（Ａｍ１，Ｃ８）（セグメント１８１
）を、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、５０ｍＭ ＮａＣｌ中の１５０μＭ（１２ｍ
ｇ／ｍＬ）溶液として調製した。ＤＢＣＯ−マレイミド（Ｃｌｉｃｋ Ｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ Ｔｏｏｌｓ，Ｉｎｃ．、カタログ＃Ａ１０８）をＤＭＦに溶解し、最終濃度５０ｍＭ
にした。容量２００μｌ（２．４ｍｇ）の１ｘチオール−ＸＴＥＮを、１Ｍストック溶液
を使用し、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０に調整した。ＤＭＦ中１．２μｌ容量の
５０ｍＭ ＤＢＣＯ−Ｍａｌをタンパク質溶液に添加し（１：２モル比の１ｘチオール−
ＸＴＥＮ：ＤＢＣＯ−マレイミド試薬）、２５℃で１時間インキュベートした。Ｃ１８
ＲＰ−ＨＰＬＣによって、修飾の完了を監視した（図７１Ａ）。タンパク質混合液は、１
．６ｍＬ Ｔｏｙｏｐｅａｒｌブチルカラムを使用し、疎水性相互作用クロマトグラフィ
ー（ＨＩＣ）によって精製した。溶出は、２０ｍＭリン酸塩（ｐＨ７．０）緩衝液中３０
カラム容量の下降勾配（１．０５Ｍ〜０．３Ｍ）硫酸アンモニウムを用いて０．５ｍＬ／
分の流量で行った（図７１Ｂ）。Ｃ１８ ＲＰ−ＨＰＬＣによって、クロマトグラフィー
分画を分析した（図７１Ｃ）。
実施例２９：Ｎ末端によって結合された一特異性ＸＴＥＮ前駆体からの二重特異性共役
体の調製
この実施例は、１つはペイロードＡを持ち、１つはペイロードＢを持つ、２つの異なる
ＸＴＥＭ−ペイロード前駆体をＮ〜Ｎ末端構成で結合し、二重特異性共役体をもたらすこ
とによるＸＴＥＮ−ペイロード組成物の創製について説明する。
第１のステップとして、複数のシステインを含有するＸＴＥＮ分子（システイン操作さ
れたＸＴＥＮ）を、上記のＲＰ１１−Ｈｉｓ８ ２タグ精製系を使用して調製し、２０ｍ
Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、５０ｍＭ ＮａＣｌ中で製剤化する。ペイロードＡ−マレ
イミドを、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、ＤＭＦ、またはＤＭＣＯ水溶液、または
試薬可溶性に依存する任意の他の適切な溶媒中に溶解する。ペイロードＡ−マレイミドを
、２〜６モル過剰のＸＴＥＮでシステイン操作されたＸＴＥＮに添加し、２５℃で１時間
インキュベートする。Ｃ１８ ＲＰ−ＨＰＬＣによって、修飾の完了を監視する。得られ
たペイロードＡ−ＸＴＥＮ共役体を、分取Ｃ４−Ｃ１８ ＲＰ−ＨＰＬＣを使用して汚染
物質および未反応の化合物から精製する。ペイロードＡ−ＸＴＥＮ共役体を、２０ｍＭ
ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、５０ｍＭ ＮａＣｌ中で製剤化する。次に、ペイロードＡ−Ｘ
ＴＥＮ共役体を、ジベンジルシクロオクチン（ＤＢＣＯ）−ＮＨＳエステルまたはＤＢＣ
Ｏ−スルホ−ＮＨＳエステルを１０〜５０モル過剰でＸＴＥＮに添加し、２５℃で１〜２
時間インキュベートすることによってさらに修飾する。分析的Ｃ１８ ＲＰ−ＨＰＬＣに
よって、修飾の完了を監視する。共役効率が低いか（例えば、９０％未満）、または複数
の非特異的産物が形成される場合、ＤＢＣＯ−ペイロードＡ−ＸＴＥＮ共役体は、分取Ｃ
４−Ｃ１８ ＲＰ−ＨＰＬＣを使用して精製される。ＤＢＣＯ−ＮＨＳエステル共役の効
率が高く（９０％超）、著しい副産物が無い場合、ＤＢＣＯ−ペイロードＡ−ＸＴＥＮ共
役体は、１０〜３０ｋＤａ ＭＷＣＯ遠心分離装置、アセトニトリル沈殿、またはアニオ
ン交換クロマトグラフィーを使用し、緩衝液交換によって過剰な試薬から精製される。
第２のＸＴＥＮ−ペイロード前駆体を創製するために、ペイロードＢ−マレイミドを、
２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、ＤＭＦ、またはＤＭＣＯ水溶液、または試薬可溶性
に依存する任意の他の適切な溶媒中に溶解する。ペイロードＢ−マレイミドを、２〜６モ
ル過剰のＸＴＥＮで第２のシステイン含有ＸＴＥＮに添加し、２５℃で１時間インキュベ
ートする。分析的Ｃ１８ ＲＰ−ＨＰＬＣによって、修飾の完了を監視する。得られたペ
イロードＢ−ＸＴＥＮ共役体を、分取Ｃ４−Ｃ１８ ＲＰ−ＨＰＬＣを使用して汚染物質
および反応物から精製する。ペイロードＢ−ＸＴＥＮ共役体を、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、
ｐＨ７．０、５０ｍＭ ＮａＣｌ中で製剤化する。アジド−ＰＥＧ４−ＮＨＳエステルを
、１０〜５０モル過剰でペイロードＢ−ＸＴＥＮに添加し、２５℃で１〜２時間インキュ
ベートする。Ｃ１８ ＲＰ−ＨＰＬＣによって、修飾の完了を監視する。共役効率が低い
か（例えば、９０％未満）、または複数の非特異的産物が形成される場合、アジド−ペイ
ロードＢ−ＸＴＥＮ共役体は、分取Ｃ４−Ｃ１８ ＲＰ−ＨＰＬＣを使用して精製される
。ＤＢＣＯ−ＮＨＳエステル共役の効率が高く（９０％超）、著しい副産物が無い場合、
アジド−ペイロードＢ−ＸＴＥＮ共役体は、１０〜３０ｋＤａ ＭＷＣＯ遠心分離装置、
アセトニトリル沈殿、またはアニオン交換クロマトグラフィーを使用し、緩衝液交換によ
って過剰な試薬から精製される。最終産物は、精製および濃縮されたＤＢＣＯ−ペイロー
ドＡ−ＸＴＥＮおよびアジド−ペイロードＢ−ＸＴＥＮタンパク質を、２０ｍＭ ＨＥＰ
ＥＳ ｐＨ７．０緩衝液、５０ｍＭ ＮａＣｌ中、等モル比で混合することによって創製
され、反応が完了するまで、２５℃で１時間以上インキュベートされる。Ｃ４またはＣ１
８ ＲＰ−ＨＰＬＣによって、修飾の完了を監視する。必要に応じて、二重特異性共役体
ペイロードＡ−ＸＴＥＮ−ペイロードＢは、分取ＲＰ−ＨＰＬＣ、疎水性相互作用クロマ
トグラフィー、またはアニオン交換クロマトグラフィーによって精製される。
実施例３０：Ｎ末端によって結合された一特異性ＸＴＥＮ前駆体からの三量体共役体の
調製
一特異性ＸＴＥＮ−ペイロード前駆体は、Ｃ末端に単一システインを含有する、例えば
、ＡＥ１４４〜ＡＥ８９０の範囲の長さのＸＴＥＮ分子に結合されたペイロードＡのＮ末
端融合として調製される（実施例２５に記載される通り調製および精製される）。精製さ
れた前駆体を、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、５０ｍＭ ＮａＣｌ中で製剤化する
。トリス−（２−マレイミドエチル）アミン（ＴＭＥＡ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉ
ｆｉｃ、カタログ＃３３０４３）を、ＤＭＳＯまたはＤＭＦ中に溶解する。前駆体（４〜
６モル過剰の架橋剤）およびＴＭＥＡ試薬を混合し、２５℃で１時間インキュベートする
。Ｃ４もしくはＣ１８ ＲＰ−ＨＰＬＣ、またはサイズ排除クロマトグラフィーによって
、修飾の完了を監視する。得られた三価ペイロードＡ−ＸＴＥＮ共役体を、疎水性相互作
用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、アニオン交換クロマトグラフィー、または分取Ｃ４−
Ｃ１８ ＲＰ−ＨＰＬＣによって、タンパク質反応物または部分的産物混合物から精製す
る。
実施例３１：ＦＩＴＣ−Ｘ−ＸＴＥＮの共役および精製
ＡＣ２７２、ロット＃ＡＰ１９７に由来する精製タンパク質は、ＦＩＴＣマレイミドで
標識された。５ｍＭ ＴＣＥＰを用いて室温で１時間インキュベートすることによって、
試料を還元した。次いで、ＤＧ−１０カラムを使用して、試料をＰＢＳ中に脱塩した。２
５倍モル過剰のＤＭＳＯ中ＦＩＴＣ−マレイミドを添加し、室温で２時間インキュベート
することによって、試料を標識した。ＤＭＳＯ濃度が総溶媒の５％未満であるように、容
積を調整することに留意されたい。２ｍＭ ＤＴＴを添加することによって反応を急冷し
、次いで、試料をＴＥＶプロテアーゼで終夜消化した。試料を２０ｍＭトリス（ｐＨ７．
５）で２倍に希釈し、ｍａｃｒｏｃａｐＱカラムの上に負荷し、ＮａＯＨで予め衛生化し
て、２０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）で平衡化した。５カラム容量の２０ｍＭトリス（ｐＨ
７．５）、１３５ｍＭ ＮａＣｌ、５カラム容量の２０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、１７
５ｍＭ ＮａＣｌでカラムを洗浄し、５カラム容量の２０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、２
５０ｍＭ ＮａＣｌで溶出した。次いで、プールした溶出分画をＴＥＶを用いて６０時間
、４℃で消化し、消化を完了させた。次いで、消化した試料を、予めＮａＯＨで衛生化し
、２０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、１３５ｍＭ ＮａＣｌで平衡化した１ｍＬのペルロザ
カラムの上に２回通過させた。任意の遊離ＦＩＴＣを除去するために、次いで、１０，０
００ＭＷＣＯ膜を使用し、２０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、１３５ｍＭ ＮａＣｌに対し
て試料を透析した。ＳＥＣカラム中のＯＤ２１４タンパク質シグナルおよびＯＤ４９５Ｆ
ＩＴＣシグナルの共移動は、ＸＴＥＮの標識との良好な共役を示し、最小の遊離色素汚染
を伴う（図７２Ｂ）。良好な共役は、ＳＤＳ ＰＡＧＥ中のＦＩＴＣ蛍光を持つ、明らか
に大きなＭＷのタンパク質によっても示される（図７２Ａ）。
実施例３２：ＧＦＰ−Ｘ−ＸＴＥＮの精製
ＧＦＰ（ＡＣ２１９）は、ＧＦＰリジンに連結するためのアミン反応基と、ＡＣ２９２
中のＸＴＥＮに操作された遊離システインに連結するためのシステイン反応基を有する二
官能性架橋剤によって、ＸＴＥＮに化学的に架橋された。ＧＦＰは、室温で２時間インキ
ュベートすることによって、二官能性架橋剤スルホ−ＳＭＣＣで標識された。タンパク質
を、ＤＧ−１０カラムを使用し、遊離スルホ−ＳＭＣＣを除去することによって、ＰＢＳ
中に脱塩した。ＡＣ２７２、ロット＃ＡＰ１９７に由来する精製タンパク質を還元し、Ｄ
Ｇ−１０カラム上のＰＢＳ中に脱塩し、標識化ＧＦＰと混合して架橋を可能にした。架橋
反応を、添加された２ｍＭ ＤＴＴで急冷し、ＴＥＶを添加して、４℃で終夜のインキュ
ベーションにおいてＣＢＤドメインを除去した。翌日、追加のＴＥＶを添加し、４℃でさ
らに６０時間のインキュベーションによって消化を完了させた。ＴＥＶ消化に続いて、試
料を２０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）中１００ｍＬに希釈し、ｍａｃｒｏｃａｐＱカラムの
上に負荷し、ＮａＯＨで予め衛生化して、２０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）で平衡化した。
５カラム容量の２０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、５カラム容量の２０ｍＭトリス（ｐＨ７
．５）、５０ｍＭ ＮａＣｌ、５カラム容量の２０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、１００ｍ
Ｍ ＮａＣｌ、５カラム容量の２０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、
５カラム容量の２０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、２００ｍＭ ＮａＣｌ、５カラム容量の
２０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、５カラム容量の２０ｍＭトリス
（ｐＨ７．５）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、および５カラム容量の２０ｍＭトリス（７．５
）、５００ｍＭ ＮＣｌでカラムを洗浄した。ピーク溶出分画をプールし、４℃で貯蔵し
た。架橋は、ＳＥＣカラム中のＯＤ２１４タンパク質シグナルおよびＯＤ３９５ ＧＦＰ
シグナルの共遊走によって確認され、ＳＥＣ出力は、図７３にオーバーレイとして示され
る。
実施例３３：ＧＦＰ−ＸＴＥＮおよびＦＩＴＣ−ＸＴＥＮ共役体の薬物動態
上記実施例に記載されるように調製されたＧＦＰ−ＸＴＥＮおよびＦＩＴＣ−ＸＴＥＮ
架橋された共役体の薬物動態を、カニクイザルにおいて試験した。ＧＦＰ−ＸＴＥＮおよ
びＦＩＴＣ−ＸＴＥＮを、２ｍｇ／ｋｇ、およびそれぞれ０．７７および０．６８ｍＬの
投与量で雄のカニクイザルＩＶに投与した。血液試料（１．０ｍＬ）を事前冷却したヘパ
リン化管に、投与前、２時間、４時間、８時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時
間、１２０時間、１６８時間、２１６時間、２６４時間、３３６時間、３８８時間、４３
２時間、５０４時間の時点で採取し、血漿中に処理した。ＧＦＰ−ＸＴＥＮの場合は、捕
捉および検出の双方のために、ＦＩＴＣ−ＸＴＥＮの場合は、抗ＸＴＥＮ捕捉および抗Ｆ
ＩＴＣ検出のために、抗ＸＴＥＮ抗体を使用して、ＥＬＩＳＡアッセイによって定量化を
行った。フィットに含まれる全ての時点で、ＷｉｎＮｏｎＬｉｎにおいて、非コンパート
メント解析を行い、ＰＫパラメータを決定した。薬物動態結果は、表４０および図７４に
要約される。データは、ＸＴＥＮが、類似するサイズのペイロードへの遺伝的融合に相当
する方法で化学的に共役される分子の半減期を延長し得ることを示す。
カニクイザルにおけるＧＦＰ−Ｌ２８８、ＧＦＰ−Ｌ５７６、ＧＦＰ−ＸＴＥＮ＿ＡＦ
５７６、ＧＦＰ−ＸＴＥＮ＿Ｙ５７６、およびＸＴＥＮ＿ＡＤ８３６−ＧＦＰの薬物動態
を試験し、ＰＫパラメータに対する非構造化ポリペプチドの組成物および長さの影響を決
定した。注入後の様々な時点で血液試料を分析し、捕捉にはＧＦＰに対するポリクローナ
ル抗体を使用し、検出には同じポリクローナル抗体のビオチニル化調製物を使用し、ＥＬ
ＩＳＡによって血漿中のＧＦＰの濃度を測定した。結果は、図７５に要約される。それら
は、ＸＴＥＮ配列の長さの増加とともに、半減期の驚くべき増加を示す。例えば、ＧＦＰ
−ＸＴＥＮ＿Ｌ２８８（ＸＴＥＮ中に２８８個のアミノ酸残基を持つ）に対して１０時間
の半減期が決定された。５７６個のアミノ酸に対する非構造化ポリペプチド融合パートナ
ーの長さを２倍にすることは、複数の融合タンパク質構築体、すなわち、ＧＦＰ−ＸＴＥ
Ｎ＿Ｌ５７６、ＧＦＰ−ＸＴＥＮ＿ＡＦ５７６、ＧＦＰ−ＸＴＥＮ＿Ｙ５７６に対して２
０〜２２時間の半減期を増加させた。８３６個の残基に対する非構造化ポリペプチド融合
パートナーの長さのさらなる増加は、ＸＴＥＮ＿ＡＤ８３６−ＧＦＰに対して７２〜７５
時間の半減期をもたらした。したがって、２８８個から５７６個に残基２８８個分だけポ
リマー長を増加させることは、インビボで半減期を約１０時間増加させた。しかしながら
、５７６個から８３６個に残基２６０個分だけポリペプチド長を増加させることは、半減
期を５０時間以上増加させた。これらの結果は、インビボ半減期のより大きい比例ゲイン
をもたらす、非構造化ポリペプチド長さの驚くべき閾値があることを示す。したがって、
伸長された非構造化ポリペプチドを含む融合タンパク質は、より短い長さのポリペプチド
と比較して、強化された薬物動態の特性を有することが予想される。
実施例３４：共役による１ｘＤＢＣＯ，３ｘＬＨＲＨ−ＸＴＥＮの調製
１ｘアミノ，３ｘチオール−ＸＴＥＮ４３２（ＸＴＥＮ＿ＡＥ４３２（Ａｍ１，Ｃ１２
，Ｃ２１７，Ｃ４２２））のアリコートを、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、５０ｍ
Ｍ ＮａＣｌ中の１９６μＭ（７．７ｍｇ／ｍＬ）溶液として調製した。図８８Ａは、タ
ンパク質のＣ１８ ＲＰ−ＨＰＬＣおよびＥＳＩ−ＭＳ分析を示す。２，２’−ジピリジ
ルジスルフィド（ＤＰＤ，Ｓｉｇｍａ、カタログ＃Ｄ５７６７）を、ジメチルホルムアミ
ド（ＤＭＦ）中に溶解し、最終濃度１００ｍＭにした。４ｍＬの１ｘアミノ，３ｘチオー
ル−ＸＴＥＮ４３２溶液を、０．２ｍＬの１Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０と混合してｐＨ
を約７．５に調整し、７８μｌのＤＰＤ溶液と混合した（１０ｘモル過剰タンパク質）。
反応混合液を２５℃で２時間インキュベートし、反応の産物をＣ１８ ＲＰ−ＨＰＬＣに
よって分析した（図８８Ｂ）。ＤＢＣＯ−スルホ−ＮＨＳ（Ｃｌｉｃｋ Ｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ Ｔｏｏｌｓ，Ｉｎｃ．、カタログ＃Ａ１２４）を、無水ＤＭＦ中に溶解し、最終濃
度１０ｍＭにした。０．８６５ｍＬのＤＢＣＯ−スルホ−ＮＨＳ溶液をタンパク質溶液に
添加した（１１ｘモル過剰タンパク質）。反応混合液を２５℃で２時間インキュベートし
、反応の産物をＣ１８ ＲＰ−ＨＰＬＣによって分析した（図８８Ｃ）。１Ｍエタノール
アミン溶液（ｐＨ８．０）を添加して最終濃度５０ｍＭにし、未反応のＤＢＣＯ−スルホ
−ＮＨＳを急冷した。反応混合液を２５℃で２時間、次いで４℃で終夜インキュベートし
た。５００ｍＭ Ｂｏｎｄ−Ｂｒｅａｋｅｒ（商標）ＴＣＥＰ溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃ
ｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ＃７７７２０）を添加し、最終濃度２０ｍＭにした。反応混
合液を２５℃で１時間インキュベートし、反応の産物をＣ１８ ＲＰ−ＨＰＬＣによって
分析した（図８８Ｄ）。０．０１％ ＴＦＡを用いて反応混合液を１５ｍＬに希釈し、１
０％ ＴＦＡ溶液を使用してｐＨを約３に調整した。タンパク質溶液を、分取Ｃ４ ＲＰ
−ＨＰＬＣカラムＶｙｄａｃ Ｃ４ ２５０ｘ２２ｍｍ（Ｇｒａｃｅ Ｄａｖｉｓｏｎ
Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ＃２１４ＴＰ１０２２）上に負荷した
。タンパク質は、０．０１％ ＴＦＡ中の１２００ｍＬ線形５〜５０％勾配のアセトニト
リルを用いて、１５ｍＬ／分の流量で溶出した。１ｘＤＢＣＯ，３ｘチオール−ＸＴＥＮ
４３２を含有する分画を、１Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８で約ｐＨ７に調整し、真空蒸発によ
って濃縮した。Ｄ−Ｌｙｓ（ＬＨＲＨ−Ｍａｌ）のε−アミノ基において３−マレイミド
プロピオン酸で修飾されたＧｌｐ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｌｅ
ｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＮＨ２ペプチドは、ＣＳＢｉｏ Ｃｏ．（Ｍｅｎｌｏ Ｐ
ａｒｋ，ＣＡ）によって合成された。ペプチドを、無水ＤＭＦ中の最終濃度２５ｍｇ／ｍ
Ｌに溶解し、５ｘモル過剰タンパク質で１ｘＤＢＣＯ，３ｘチオール−ＸＴＥＮ４３２溶
液に添加した。反応混合液を２５℃で１時間インキュベートし、反応の産物をＣ１８ Ｒ
Ｐ−ＨＰＬＣによって分析した（図８８Ｅ）。０．０１％ ＴＦＡを用いて反応混合液を
１５ｍＬに希釈し、１０％ ＴＦＡ溶液を使用してｐＨを約３に調整した。タンパク質溶
液を、分取Ｃ４ ＲＰ−ＨＰＬＣカラムＶｙｄａｃ Ｃ４ ２５０ｘ２２ｍｍ上に負荷し
た。タンパク質は、０．０１％ ＴＦＡ中の１２００ｍＬ線形５〜５０％勾配のアセトニ
トリルを用いて、１５ｍＬ／分の流量で溶出した。１ｘＤＢＣＯ，３ｘＬＨＲＨ−ＸＴＥ
Ｎ４３２を含有する分画を、１Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８で約ｐＨ７に調整し、真空蒸発に
よって２ｍＬに濃縮して、最終産物を得た。
実施例３５：共役による１ｘアジド，３ｘＭＭＡＥ−ＸＴＥＮの調製
融合タンパク質１ｘアミノ，３ｘチオール−ＸＴＥＮ４３２（ＸＴＥＮ＿ＡＥ４３２（
Ａｍ１，Ｃ１２，Ｃ２１７，Ｃ４２２））のアリコートを、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ
７．０、５０ｍＭ ＮａＣｌ中の１９６μＭ（７．７ｍｇ／ｍＬ）溶液として調製した。
図８９Ａは、タンパク質のＣ１８ ＲＰ−ＨＰＬＣおよびＥＳＩ−ＭＳ分析を示す。ＭＡ
６−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ（ＭＭＡＥ−Ｍａｌ、Ｃｏｎｃｏｒｔｉｓ Ｂｉ
ｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．によるカスタム合成）を、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ
）中に溶解し、最終濃度１ｍｇ／ｍＬにした。２．２ｍＬ容量の１ｘアミノ，３ｘチオー
ル−ＸＴＥＮ４３２溶液を、２．５ｍＬのＭＭＡＥ−Ｍａｌと混合した（３．５ｘモル過
剰タンパク質）。反応混合液を２５℃で１時間インキュベートし、反応の産物をＣ１８
ＲＰ−ＨＰＬＣによって分析した（図８９Ｂ）。アジド−ＰＥＧ４−ＮＨＳエステル（Ｃ
ｌｉｃｋ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｔｏｏｌｓ，Ｉｎｃ．、カタログ＃Ａ１０３）を、無水
ＤＭＦ中に溶解し、最終濃度５００ｍＭにした。反応混合液（４．７ｍＬ）を、０．２３
５ｍＬの１Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０、および９．７５μｌの５００ｍＭアジド−ＰＥ
Ｇ４−ＮＨＳと混合した（１０ｘモル過剰タンパク質）。反応混合液を２５℃で２時間イ
ンキュベートし、反応の産物をＣ１８ ＲＰ−ＨＰＬＣによって分析した（図８９Ｃ）。
０．０１％ ＴＦＡを用いて共役混合液を１５ｍＬに希釈し、１０％ ＴＦＡ溶液を使用
してｐＨを約３に調整した。タンパク質溶液を、分取Ｃ４ ＲＰ−ＨＰＬＣカラムＶｙｄ
ａｃ Ｃ４ ２５０ｘ２２ｍｍ（Ｇｒａｃｅ Ｄａｖｉｓｏｎ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓ
ｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ＃２１４ＴＰ１０２２）の上に負荷した。タンパク質は、０．
０１％ ＴＦＡ中の１２００ｍＬ線形５〜５０％勾配のアセトニトリルを用いて、１５ｍ
Ｌ／分の流量で溶出した。１ｘアジド，３ｘＭＭＡＥ−ＸＴＥＮ４３２を含有する分画を
、１Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８で約ｐＨ７に調整し、真空蒸発によって濃縮して、最終産物
を得た。
実施例３６：共役による３ｘＬＨＲＨ，３ｘＭＭＡＥ−ＸＴＥＮの調製
融合タンパク質１ｘＤＢＣＯ，３ｘＬＨＲＨ−ＸＴＥＮ４３２のアリコートを、２０ｍ
Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０中の１４３μＭ（６．２６ｍｇ／ｍＬ）溶液として調製した
。１ｘアジド，３ｘＭＭＡＥ−ＸＴＥＮ４３２を、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０中
の１３５μＭ（５．９０ｍｇ／ｍＬ）溶液として調製した。２つのタンパク質反応物を溶
液中で混合し、１．１モル過剰の１ｘＤＢＣＯ，３ｘＬＨＲＨ−ＸＴＥＮ４３２を得た。
反応混合液を２５℃で終夜インキュベートした。クリック化学反応の完了は、ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ（図９０Ａ）およびＲＰ−ＨＰＬＣ（図９０Ｂ）によって分析した。０．０１％
ＴＦＡを用いて共役混合液を１５ｍＬに希釈し、１０％ ＴＦＡ溶液を使用してｐＨを約
３に調整した。タンパク質溶液を、分取Ｃ４ ＲＰ−ＨＰＬＣカラムＶｙｄａｃ Ｃ４
２５０ｘ１０ｍｍ（Ｇｒａｃｅ Ｄａｖｉｓｏｎ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ
ｓ、カタログ＃２１４ＴＰ５１０）の上に負荷した。タンパク質は、０．０１％ ＴＦＡ
中の１８０ｍＬ線形５〜５０％勾配のアセトニトリルを用いて、２ｍＬ／分の流量で溶出
した。３ｘＬＨＲＨ，３ｘＭＭＡＥ−ＸＴＥＮ４３２を含有する分画を、１Ｍ ＨＥＰＥ
Ｓ、ｐＨ８で約ｐＨ７に調整し、真空蒸発によって濃縮して、最終産物を得た。
実施例３７：共役による１ｘＬＨＲＨ，３ｘＭＭＡＥ−ＸＴＥＮの調製
融合タンパク質１ｘアミノ，３ｘチオール−ＸＴＥＮ９０５（ＸＴＥＮ＿ＡＥ９０５（
Ａｍ１，Ｃ８，Ｃ４５３，Ｃ８９８，セグメント１７４））のアリコートを、２０ｍＭ
ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、５０ｍＭ ＮａＣｌ中の１３１μＭ（１０．９ｍｇ／ｍＬ）溶
液として調製した。図９１Ａは、タンパク質のＣ１８ ＲＰ−ＨＰＬＣおよびＥＳＩ−Ｍ
Ｓ分析を示す。２，２’−ジピリジルジスルフィド（ＤＰＤ，Ｓｉｇｍａ、カタログ＃Ｄ
５７６７）を、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に溶解し、最終濃度１００ｍＭにした
。１ｘアミノ，３ｘチオール−ＸＴＥＮ９０５溶液を、１Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０と
混合してｐＨを約７．５に調整し、ＤＰＤ溶液と混合した（１０ｘモル過剰タンパク質）
。反応混合液を２５℃で２時間インキュベートし、反応の産物をＣ１８ ＲＰ−ＨＰＬＣ
によって分析した（図９１Ｂ）。ＤＢＣＯ−スルホ−ＮＨＳ（Ｃｌｉｃｋ Ｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ Ｔｏｏｌｓ，Ｉｎｃ．、カタログ＃Ａ１２４）を、無水ＤＭＦ中に溶解し、最終
濃度１０ｍＭにした。ＤＢＣＯ−スルホ−ＮＨＳ溶液をタンパク質溶液に添加した（１０
ｘモル過剰タンパク質）。反応混合液を２５℃で２時間インキュベートし、反応の産物を
Ｃ１８ ＲＰ−ＨＰＬＣによって分析した（図９１Ｃ）。１Ｍエタノールアミン（ｐＨ８
．０）を添加して最終濃度５０ｍＭにし、未反応のＤＢＣＯ−スルホ−ＮＨＳを急冷した
。反応混合液を２５℃で２時間、次いで４℃で終夜インキュベートした。５００ｍＭ Ｂ
ｏｎｄ−Ｂｒｅａｋｅｒ（商標）ＴＣＥＰ溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、
カタログ＃７７７２０）を添加し、最終濃度２０ｍＭにした。反応混合液を２５℃で１時
間インキュベートし、反応の産物をＣ１８ ＲＰ−ＨＰＬＣによって分析した（図９１Ｄ
）。０．０１％ ＴＦＡを用いて反応混合液を１５ｍＬに希釈し、１０％ ＴＦＡ溶液を
使用してｐＨを約３に調整した。タンパク質溶液を、分取Ｃ４ ＲＰ−ＨＰＬＣカラムＶ
ｙｄａｃ Ｃ４ ２５０ｘ２２ｍｍ（Ｇｒａｃｅ Ｄａｖｉｓｏｎ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ＃２１４ＴＰ１０２２）の上に負荷した。タンパク質は、
０．０１％ ＴＦＡ中の１２００ｍＬ線形５〜５０％勾配のアセトニトリルを用いて、１
５ｍＬ／分の流量で溶出した。１ｘＤＢＣＯ，３ｘチオール−ＸＴＥＮ９０５を含有する
分画を、１Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８で約ｐＨ７に調整し、真空蒸発によって濃縮した。Ｍ
Ａ６−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ（ＭＭＡＥ−Ｍａｌ，Ｃｏｎｃｏｒｔｉｓ Ｂ
ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．によるカスタム合成）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ
）中に溶解し、最終濃度１ｍｇ／ｍＬにした。１ｘＤＢＣＯ，３ｘチオール−ＸＴＥＮ９
０５溶液を、３．５ｘモル過剰のＭＭＡＥ−Ｍａｌと混合した。反応混合液を２５℃で１
時間インキュベートし、反応の産物をＣ１８ ＲＰ−ＨＰＬＣによって分析した。Ｇｌｐ
−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｎ
Ｈ２ペプチドを、Ｄ−Ｌｙｓ（ＬＨＲＨ−Ｍａｌ）のε−アミノ基においてアジド−ヘキ
サン酸で修飾した（ＬＨＲＨ−Ｍａｌ，ＣＳ Ｂｉｏ Ｃｏ．，Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，
ＣＡによるカスタム合成）ペプチドを、無水ＤＭＦ中の最終濃度２５ｍｇ／ｍＬに溶解し
、１．５〜５ｘモル過剰タンパク質で１ｘＤＢＣＯ，３ｘＭＭＡＥ−ＸＴＥＮ９０５溶液
に添加した。反応混合液を２５℃でインキュベートし、反応の産物をＣ１８ ＲＰ−ＨＰ
ＬＣによって分析した。０．０１％ ＴＦＡを用いて反応混合液を１５ｍＬに希釈し、１
０％ ＴＦＡ溶液を使用してｐＨを約３に調整した。タンパク質溶液を、分取Ｃ４ ＲＰ
−ＨＰＬＣカラムＶｙｄａｃ Ｃ４ ２５０ｘ２２ｍｍ上に負荷した。タンパク質は、０
．０１％ ＴＦＡ中の１２００ｍＬ線形５〜５０％勾配のアセトニトリルを用いて、１５
ｍＬ／分の流量で溶出した。１ｘＤＢＣＯ，３ｘＬＨＲＨ−ＸＴＥＮ４３２を含有する分
画を、１Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８で約ｐＨ７に調整し、真空蒸発によって濃縮して、最終
産物を得た。
実施例３８：共役による１ｘＤＢＣＯ，３ｘ葉酸塩（γ）−ＸＴＥＮの調製
融合タンパク質１ｘアミノ，３ｘチオール−ＸＴＥＮ４３２（ＸＴＥＮ＿ＡＥ４３２（
Ａｍ１，Ｃ１２，Ｃ２１７，Ｃ４２２））のアリコートを、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ
７．０、５０ｍＭ ＮａＣｌ中の２０３μＭ（８．０ｍｇ／ｍＬ）溶液として調製した。
図１０７Ａは、タンパク質のＣ１８ ＲＰ−ＨＰＬＣおよびＥＳＩ−ＭＳ分析を示す。葉
酸塩−γ−アミノペンチル−マレイミド（ＦＡ（γ）−Ｍａｌ，ＣＰＣ Ｓｃｉｅｎｔｉ
ｆｉｃによるカスタム合成）を、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に溶解し、最終濃
度２１ｍｇ／ｍＬ（９．８ｍＭ）にした。１．１ｍＬ容量の１ｘアミノ，３ｘチオール−
ＸＴＥＮ４３２溶液を、０．０８ｍＬのＦＡ（γ）−Ｍａｌと混合した（３．５ｘモル過
剰タンパク質）。反応混合液を２５℃で２時間インキュベートし、反応の産物をＣ１８
ＲＰ−ＨＰＬＣによって分析した（図１０７Ｂ）。反応混合液のｐＨは、０．０６ｍＬの
１Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０緩衝液で調製した。ＤＢＣＯ−スルホ−ＮＨＳ（Ｃｌｉｃ
ｋ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｔｏｏｌｓ，Ｉｎｃ．、カタログ＃Ａ１２４）を、無水ＤＭＦ
中に溶解し、最終濃度５０ｍＭにした。０．５３ｍＬのＤＢＣＯ−スルホ−ＮＨＳ溶液を
タンパク質溶液に添加した（１１ｘモル過剰タンパク質）。反応混合液を２５℃で２時間
インキュベートし、反応の産物をＣ１８ ＲＰ−ＨＰＬＣによって分析した（図１０７Ｃ
）。１Ｍエタノールアミン（ｐＨ８．０）の溶液を添加して最終濃度５０ｍＭにし、未反
応のＤＢＣＯ−スルホ−ＮＨＳを急冷した。反応混合液を２５℃で２時間、次いで４℃で
終夜インキュベートした。０．０１％ ＴＦＡを用いて反応混合液を１５ｍＬに希釈し、
１０％ ＴＦＡ溶液を使用してｐＨを約３に調整した。タンパク質溶液を、分取Ｃ４ Ｒ
Ｐ−ＨＰＬＣカラムＶｙｄａｃ Ｃ４ ２５０ｘ１０ｍｍ（Ｇｒａｃｅ Ｄａｖｉｓｏｎ
Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ＃２１４ＴＰ５１０）上に負荷した
。タンパク質は、０．０１％ ＴＦＡ中の１８０ｍＬ線形５〜５０％勾配のアセトニトリ
ルを用いて、２ｍＬ／分の流量で溶出した。１ｘＤＢＣＯ，３ｘＦＡ（γ）−ＸＴＥＮ４
３２を含有する分画を、１Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８で約ｐＨ７に調整し、真空蒸発によっ
て濃縮して、最終産物を得た。
１ｘＤＢＣＯ，３ｘ葉酸塩（α）−ＸＴＥＮ共役体は、本質的に、葉酸塩−α−マレイ
ミド（ＦＡ（α）−Ｍａｌ，ＣＰＣ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃによるカスタム合成）を使用
し、上記の通り調製した。
実施例３９：共役による３ｘＦＡ（γ），３ｘＭＭＡＥ−ＸＴＥＮの調製
融合タンパク質１ｘＤＢＣＯ，３ｘＦＡ（γ）−ＸＴＥＮ４３２のアリコートを、２０
ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０中の１９１μＭ（８．８ｍｇ／ｍＬ）溶液として調製した
。１ｘアジド，３ｘＭＭＡＥ−ＸＴＥＮ４３２を、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０中
の２４２μＭ（１１．１ｍｇ／ｍＬ）溶液として調製した。２つのタンパク質反応物を溶
液中で混合し、１．１モル過剰の１ｘＤＢＣＯ，３ｘＦＡ（γ）−ＸＴＥＮ４３２を得た
。反応混合液を２５℃で終夜インキュベートした。クリック化学反応の完了は、ＲＰ−Ｈ
ＰＬＣ（図１０８）によって分析した。０．０１％ ＴＦＡを用いて共役混合液を１５ｍ
Ｌに希釈し、１０％ ＴＦＡ溶液を使用してｐＨを約３に調整した。タンパク質溶液を、
分取Ｃ４ ＲＰ−ＨＰＬＣカラムＶｙｄａｃ Ｃ４ ２５０ｘ１０ｍｍ（Ｇｒａｃｅ Ｄ
ａｖｉｓｏｎ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ＃２１４ＴＰ５１０）
の上に負荷した。タンパク質は、０．０１％ ＴＦＡ中の１８０ｍＬ線形５〜５０％勾配
のアセトニトリルを用いて、２ｍＬ／分の流量で溶出した。３ｘＦＡ（γ），３ｘＭＭＡ
Ｅ−ＸＴＥＮを含有する分画を、１Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８で約ｐＨ７に調整し、真空蒸
発によって濃縮して、最終産物を得た。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬ
Ｃ）（図１０９Ａ）、ＲＰ−ＨＰＬＣ（図１０９Ｂ）、およびＥＳＩ−ＭＳ（図１０９Ｃ
）によって、最終産物を分析した。
３ｘＦＡ（α），３ｘＭＭＡＥ−ＸＴＥＮ共役体は、本質的に、１ｘＤＢＣＯ，３ｘＦ
Ａ（α）−ＸＴＥＮ４３２と１ｘアジド，３ｘＭＭＡＥ−ＸＴＥＮ４３２との間のクリッ
ク反応を使用し、上記の通り調製した。
実施例４０：分岐対線状ＸＴＥＮの溶液中の粘度の比較
線状および分岐ＸＴＥＮ（後者は三量体または四量体構成として）の粘度は、様々な種
類の粘度計および血流計を使用して測定することができる。例えば、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｍ．
Ａ．，ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｌａｎｇｍｕｉｒ，２６：１０６７に記載されるように
、３０Ｇ針を通じてシリンジの中に１ｍＬの液体を引き込むために必要な時間を測定する
ことができる。ＸＴＥＮの単量体線状構成と、三量体または四量体構成とを粘土について
比較するために、等モル量のＸＴＥＮアミノ酸成分を有する構築体を調製し、次いで、溶
液をそれぞれ２０、５０、１００ｍｇ／ｍＬで固定された等しいタンパク質濃度で製造す
る。次いで、Ｍｉｌｌｅｒの方法を使用し、これらの溶液を評価する。この方法を使用し
て、既知の基準でデータを取得し、標準曲線を調整した後、ＸＴＥＮ溶液を測定する。結
果は、同様のモル量を持つＸＴＥＮの等モル溶液の粘度は、分岐の増加に伴って著しく減
少し、３アームのＸＴＥＮ２８８の共役体は、それらが等数のアミノ酸を有するとしても
、等濃度の線状ＸＴＥＮ８６４と比較して、著しく低い粘度を有することを示すことが予
想される。同様に、４アームのＸＴＥＮ２１６を持つ構成は、３アームのＸＴＥＮ２８８
との共役体よりもさらに低い粘度を有することが予想される。
実施例４１：共役によるＨｅｒ２−ＸＴＥＮ−ＰＴＸの調製
融合タンパク質１ｘアミノ，３ｘチオール−ＸＴＥＮ４３２（ＸＴＥＮ＿ＡＥ４３２（
Ａｍ１，Ｃ１２，Ｃ２１７，Ｃ４２２））のアリコートを、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ
７．０、５０ｍＭ ＮａＣｌ中の１９６μＭ（７．７ｍｇ／ｍＬ）溶液として調製する。
パクリタキセル−Ｍａｌ（ＰＴＸ−Ｍａｌ）は、無水コハク酸を持つパクリタキセルの修
飾に続いて、アミノエチルマレイミドとの共役によってカスタム合成される。ＰＴＸ−Ｍ
ａｌを、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に溶解し、３．５〜５ｘモル過剰でタンパク
質に添加する。反応混合液を２５℃で１〜２時間インキュベートし、反応の産物をＣ１８
ＲＰ−ＨＰＬＣによって分析した。スルホ−ＳＭＣＣ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉ
ｆｉｃ、カタログ＃２２１２２）を、無水ＤＭＦ中に溶解して、最終濃度５０ｍＭにし、
１０ｘモル過剰タンパク質でタンパク質溶液に添加する。反応混合液を２５℃で２時間イ
ンキュベートし、反応の産物をＣ１８ ＲＰ−ＨＰＬＣによって分析する（図９２参照）
。０．０１％ ＴＦＡを用いて反応混合液を１５ｍＬに希釈し、１０％ ＴＦＡ溶液を使
用してｐＨを約３に調整する。タンパク質溶液を、分取Ｃ４ ＲＰ−ＨＰＬＣカラムＶｙ
ｄａｃ Ｃ４ ２５０ｘ２２ｍｍ（Ｇｒａｃｅ Ｄａｖｉｓｏｎ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ＃２１４ＴＰ１０２２）上に負荷する。タンパク質は、０．
０１％ ＴＦＡ中の１２００ｍＬ線形５〜５０％勾配のアセトニトリルを用いて、１５ｍ
Ｌ／分の流量で溶出する。１ｘＭａｌ，３ｘＰＴＸ−ＸＴＥＮ４３２を含有する分画を、
１Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８で約ｐＨ７に調整し、真空蒸発によって濃縮した。ハーセプチ
ン（トラスツズマブ，Ｒｏｃｈｅ）抗体を、指示に従い、水中で再構築し、５ｍＭ ＥＤ
ＴＡを含有するＰＢＳ（ｐＨ７．２）に緩衝液を交換する。ＤＴＴを、タンパク質溶液に
添加して最終濃度１〜１０ｍＭにし、３７℃で５〜３０分間インキュベートする。ゲル濾
過またはカットオフ膜濾過によって、過剰なＤＴＴを除去する。１ｘＭａｌ，３ｘＰＴＸ
−ＸＴＥＮ４３２を添加し、３〜４ｘモル過剰の抗体を部分的に還元する。反応混合液を
２５℃で１時間インキュベートし、反応の最終産物をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびサイズ排除
クロマトグラフィーによって、非還元および還元条件下で分析した。
実施例４２：共役によるヨードアセチル−ＸＴＥＮの調製
融合タンパク質１ｘアミノ−ＸＴＥＮ８６９（ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６９（Ａｍ１））のア
リコートを、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、５０ｍＭ ＮａＣｌ中の１６４μＭ（
１３．１ｍｇ／ｍＬ）溶液として調製した。１／２０容量の１Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８を
タンパク質溶液に添加し、タンパク質溶液のｐＨを約７．５に調整した。Ｎ−スクシンイ
ミジルヨード酢酸塩（ＳＩＡ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ＃２２３
４９）を、無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に溶解して、最終濃度１００ｍＭにし
、１０ｘモル過剰タンパク質で添加した。反応混合液を２５℃で１時間インキュベートし
、反応の産物をＣ１８ ＲＰ−ＨＰＬＣによって分析する（図９３Ａ）。Ｖｉｖａｓｐｉ
ｎ ５００超遠心分離装置（５，０００ ＭＷＣＯ，ＶｉｖａＳｃｉｅｎｃｅ、カタログ
＃ＶＳ０１１２）を使用し、緩衝液交換によって、過剰なＳＩＡを除去した。ヨードアセ
チル基によるＮ末端アミノ基の修飾は、修飾されたＸＴＥＮの保持時間を変えなかったた
め（図９３Ａ）、共有結合的修飾は、ＥＳＩ−ＭＳによって確認された（図９３Ｂ）。ま
た、ＩＡ−ＸＴＥＮ共役体は、システイン含有ペプチドＨＣＫＦＷＷ（Ｂａｃｈｅｍ、カ
タログ＃Ｈ−３５２４）と効率的に反応した（図９３Ｃ）。
実施例４３：ＬＨＲＨ−ＸＴＥＮ−薬物共役体の活性および特異性についてのインビト
ロ細胞ベースのスクリーニング
ＬＨＲＨ−ＸＴＥＮ−薬物共役体を、インビトロ活性および選択性について評価する。
各ＬＨＲＨ−ＸＴＥＮ−薬物共役体、その対応する非標的化ＸＴＥＮ−薬物分子、および
そのそれぞれの遊離薬物対照を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ抗増殖アッセイにおいて、
表４１に列挙されるＬＨＲＨ受容体陽性および陰性細胞系の一団に対して試験する。最適
な細胞密度およびインキュベーション時間を含む適切なアッセイ条件は、それぞれの遊離
薬物を対照として使用して決定する。ＬＨＲＨ−ＸＴＥＮ−薬物共役体は、以下のように
試験する。ログ相中の細胞を収集し、計数して、９６ウェルマイクロタイターアッセイプ
レートに既定の細胞密度でプレートに置く。粘着性の細胞は、５％ ＣＯ２の雰囲気下、
３７℃で終夜のインキュベーションによって、プレートに付着することが許される。ＬＨ
ＲＨ−ＸＴＥＮ−薬物共役体および対応する対照は、適切な用量範囲希釈を使用して重複
で導入し、プレートをさらに２〜５日間インキュベートする。適切なインキュベーション
期間後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ試薬を各ウェルに添加し、軌道攪拌器上で２分間混
合する。次いで、プレートを９０ｘｇで遠心分離し、室温でさらに１０分間インキュベー
トして、蛍光シグナルを安定化する。次いで、蛍光シグナルを照度計上で読み取り、ＩＣ
５０（半最大阻害性濃度）の値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍまたは相当するソフト
ウェアで計算する。ＩＣ５０値の定量的比較は、ＬＨＲＨ受容体陽性細胞系対陰性細胞系
に対する細胞成長阻害および選択性の構築体活性のランク付けを可能にする。 これらの
結果は、ＬＨＲＨ−ＸＴＥＮ−薬物共役体が、ＬＨＲＨ受容体陰性細胞上ではなく、ＬＨ
ＲＨ受容体陽性細胞上で高度に選択的な強力な殺傷を示すという所見を支持することが予
想される。これは、遊離薬物部分とは異なり、それによってＬＨＲＨ受容体陽性細胞系と
陰性細胞系との間に細胞毒性の差は予想されない。ＸＴＥＮ−薬物対照は、不良な細胞毒
性活性を生じることが予想される。 対照に対して好ましい活性および細胞系選択性を持
つＬＨＲＨ−ＸＴＥＮ−薬物共役体は、アッセイにおいて遊離競合ＬＨＲＨペプチドの付
加によってＬＨＲＨ受容体の関連についてさらに検証され、障害されたＬＨＲＨ−ＸＴＥ
Ｎ−薬物細胞毒性をもたらし、構築体の選択的活性についてさらに検証する。
実施例４４：葉酸塩−ＸＴＥＮ−薬物共役体の活性および特異性についてのインビトロ
細胞ベースのスクリーニング
葉酸塩−ＸＴＥＮ−薬物共役体は、最初に、インビトロ活性および選択性スクリーニン
グに供される。各葉酸塩−ＸＴＥＮ−薬物共役体、その対応する非標的化ＸＴＥＮ−薬物
分子、およびそれぞれの遊離薬物対照を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ抗増殖アッセイに
おいて、表４２に列挙される葉酸塩受容体陽性および陰性細胞系の一団に対して試験する
。培養培地は、高い葉酸含有量を含むため、細胞は成長し、アッセイは、５〜１０％熱不
活性化ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含有する無葉酸培地中、３７℃、５％ ＣＯ２雰囲気下
で行った（熱不活性化ＦＣＳは、葉酸塩受容体を発現する細胞が生存および増殖するのに
十分な内因性レベルの葉酸を含有する）。最適な細胞密度およびインキュベーション時間
を含む適切なアッセイ条件は、５〜１０％ ＦＣＳを含有する無葉酸培地を使用し、それ
ぞれの遊離薬物を対照として使用して決定する。葉酸塩−ＸＴＥＮ−薬物共役体は、以下
のように試験する。ログ相中の細胞を収集し、計数して、９６ウェルマイクロタイターア
ッセイプレートに既定の細胞密度でプレートに置く。粘着性の細胞は、３７℃、５％ Ｃ
Ｏ２で終夜のインキュベーションによって、プレートに付着することが許される。葉酸塩
−ＸＴＥＮ−薬物共役体および対応する対照は、適切な用量範囲希釈を使用して重複で導
入し、プレートをさらに２〜５日間インキュベートする。適切なインキュベーション期間
後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ試薬を各ウェルに添加し、軌道攪拌器上で２分間混合す
る。次いで、プレートを９０ｘｇで遠心分離し、室温でさらに１０分間インキュベートし
て、蛍光シグナルを安定化する。次いで、蛍光シグナルを照度計上で読み取り、ＩＣ５０
（半最大阻害性濃度）の値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍまたは相当するソフトウェ
アで計算する。ＩＣ５０値の定量的比較は、葉酸塩受容体陽性細胞系対陰性細胞系に対す
る細胞成長
阻害および選択性の構築体活性のランク付けを可能にする。 これらの結果は、葉酸塩−
ＸＴＥＮ−薬物共役体が、葉酸塩受容体陰性細胞上ではなく、葉酸塩受容体陽性細胞上で
高度に選択的な強力な殺傷を示すという所見を支持することが予想される。これは、遊離
薬物部分とは異なり、それによって葉酸塩受容体陽性細胞系と陰性細胞系との間に細胞毒
性の差は予想されない。ＸＴＥＮ−薬物対照は、不良な細胞毒性活性を生じることが予想
される。 対照に対して好ましい活性および細胞系選択性を持つ葉酸塩−ＸＴＥＮ−薬物
共役体は、アッセイにおいて遊離競合葉酸の付加によって葉酸塩受容体の関連についてさ
らに検証され、障害された葉酸塩−ＸＴＥＮ−薬物細胞毒性を実証し、構築体の選択的活
性についてさらに検証する。
実施例４５：ＬＨＲＨ−ＸＴＥＮ−薬物共役体のインビトロ血清安定性
安定性の測定として、ＬＨＲＨ−ＸＴＥＮ−薬物共役体を、独立して、健常なヒト、カ
ニクイザル、およびマウス血漿中、３７℃で最大２週間インキュベートし、一定間隔でア
リコートを除去し、分析まで−８０℃で貯蔵する。ＬＨＲＨ−ＸＴＥＮ−薬物共役体の安
定性は、放出された遊離薬物の量、またはＬＨＲＨ−ＸＴＥＮ−薬物共役体の経時的な完
全性のいずれかによって評価することができる。遊離薬物は、ＲＰ−ＨＰＬＣおよび／ま
たはＬＣ−ＭＳ／ＭＳで定量化されるが、無傷ＬＨＲＨ−ＸＴＥＮ−薬物共役体の量は、
ＸＴＥＮ／薬物および／またはＬＨＲＨ／薬物ＥＬＩＳＡを使用して決定される。
ＲＰ−ＨＰＬＣ分析の場合、血漿試料を、アセトニトリルまたはアセトン等の有機溶媒
で処理し、タンパク質を沈殿させる。可溶性分画を真空下で蒸発させ、負荷溶液中に再溶
解し、ＲＰ−ＨＰＬＣによって分析する。検体は、既知の薬物標準と比較し、特定の薬物
に特異的な波長での紫外線吸収によって検出される。例えば、ドキソルビシンは、４８０
ｎｍで検出される。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析の場合、血漿試料を、アセトニトリルまたはア
セトン等の有機溶媒で処理し、タンパク質を沈殿させる。可溶性分画を真空下で蒸発させ
、負荷溶液中に再溶解し、ＲＰ−ＨＰＬＣによって分析する。検体は、既知の薬物標準と
比較し、三連四重極型質量分析計によって検出および定量化される。親イオン−娘イオン
対は、各薬物に対して実験的に決定される。 定量化ＥＬＩＳＡの場合、ＥＬＩＳＡ中の
ＬＨＲＨ−ＸＴＥＮ−薬物共役体の抗体の最適濃度は、十字交差連続希釈分析を使用して
決定される。共役体の１つの成分を認識する適切な捕捉抗体は、４℃で終夜のインキュベ
ーションによって、９６ウェルマイクロタイタープレートの上にコーティングされる。ウ
ェルをブロックして洗浄し、血清安定性試料を、それぞれ異なる希釈でウェルに添加し、
コーティングされた抗体によるＬＨＲＨ−ＸＴＥＮ−薬物共役体の最適な捕捉を可能にす
る。洗浄後、共役体の別の成分を認識する検出抗体を添加し、プレート上に捕捉された共
役体への結合を可能にする。次いで、ウェルを再度洗浄した後、ストレプトアビジン−ホ
ースラディッシュペルオキシダーゼ（検出抗体のビオチニル化異形に相補的）または適切
な二次抗体−ホースラディッシュペルオキシダーゼ（検出抗体の非ビオチニル化異形に相
補的）のいずれかを添加する。適切なインキュベーションおよび最終洗浄ステップ後、テ
トラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質を添加し、プレートを４５０ｎＭで読み取る。次い
で、無傷共役体の濃度を、各時点に対し、測色反応を関連血漿型のＬＨＲＨ−ＸＴＥＮ−
薬物で調製された較正曲線と比較することによって計算する。次いで、ヒト、カニクイザ
ル、およびマウス血清中の共役体の減衰のｔ１／２を、ログ濃度対時間の線形回帰分析を
使用して定義する。
実施例４６：葉酸塩−ＸＴＥＮ−薬物共役体のインビトロ血清安定性
安定性の測定として、葉酸塩−ＸＴＥＮ−薬物共役体を、独立して、健常なヒト、カニ
クイザル、およびマウス血漿中、３７℃で最大２週間インキュベートし、一定間隔でアリ
コートを除去し、分析まで−８０℃で貯蔵する。葉酸塩−ＸＴＥＮ−薬物共役体の安定性
を、遊離薬物の量、または葉酸塩−ＸＴＥＮ−薬物共役体の経時的な完全性のいずれかに
よって評価する。遊離薬物は、ＨＰＬＣおよび／またはＬＣ−ＭＳ／ＭＳで定量化される
が、無傷の葉酸塩−ＸＴＥＮ−薬物共役体の量は、ＸＴＥＮ／薬物および／または葉酸塩
／薬物ＥＬＩＳＡを使用して決定される。
ＲＰ−ＨＰＬＣ分析の場合、血漿試料を、アセトニトリルまたはアセトン等の有機溶媒
で処理し、タンパク質を沈殿させる。可溶性分画を真空下で蒸発させ、負荷溶液中に再溶
解し、ＲＰ−ＨＰＬＣによって分析する。検体は、既知の薬物標準と比較し、特定の薬物
に特異的な波長での紫外線吸収によって検出される。例えば、ドキソルビシンは、４８０
ｎｍで検出される。 ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析の場合、血漿試料を、アセトニトリルまたは
アセトン等の有機溶媒で処理し、タンパク質を沈殿させる。可溶性分画を真空下で蒸発さ
せ、負荷溶液中に再溶解し、ＲＰ−ＨＰＬＣによって分析する。検体は、三連四重極型質
量分析計によってインライン検出され、定量化される。親イオン−娘イオン対は、各薬物
に対して実験的に決定される。較正標準は、既知の量の遊離薬物を対応する血漿型に添加
することによって調製され、実験試料と並行して処理される。 定量的ＥＬＩＳＡの場合
、ＥＬＩＳＡ中の葉酸塩−ＸＴＥＮ−薬物共役体に最適な濃度の抗体は、十字交差連続希
釈分析を使用して決定される。共役体の１つの成分を認識する適切な捕捉抗体は、４℃で
終夜のインキュベーションによって、９６ウェルマイクロタイタープレートの上にコーテ
ィングされる。ウェルをブロックして洗浄し、血清安定性試料を、それぞれ異なる希釈で
ウェルに添加し、コーティングされた抗体による葉酸塩−ＸＴＥＮ−薬物共役体の最適な
捕捉を可能にする。洗浄後、共役体の別の成分を認識する検出抗体を添加し、プレート上
に捕捉された共役体への結合を可能にする。次いで、ウェルを再度洗浄した後、ストレプ
トアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ（検出抗体のビオチニル化異形に相補
的）または適切な二次抗体−ホースラディッシュペルオキシダーゼ（検出抗体の非ビオチ
ニル化異形に相補的）のいずれかを添加する。適切なインキュベーションおよび最終洗浄
ステップ後、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質を添加し、プレートを４５０ｎＭで
読み取る。次いで、無傷共役体の濃度を、各時点に対し、測色反応を関連血漿型の葉酸塩
−ＸＴＥＮ−薬物で調製された較正曲線と比較することによって計算する。次いで、ヒト
、カニクイザル、およびマウス血清中の共役体の減衰のｔ１／２を、ログ濃度対時間の線
形回帰分析を使用して定義する。
実施例４７：ＬＨＲＨ−ＸＴＥＮ−Ｃｙ５．５共役体のインビボおよびエクスビボ撮像
Ｃｙ５．５蛍光タグ付加ＬＨＲＨ−ＸＴＥＮ分子を代理として使用し、ＬＨＲＨ−ＸＴ
ＥＮ−薬物共役体の標的化および生体内分布効率を調査する。インビボに続いてエクスビ
ボで、ＩＶＩＳ ５０光学撮像システム（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
，Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，ＭＡ）を用いる蛍光撮像を使用し、ＬＨＲＨ受容体陽性腫瘍細胞
の皮下成長異種移植片を担持するヌードマウスにおいて実験を行う。つまり、ＬＨＲＨ受
容体陽性腫瘍細胞を担持する雌ｎｕ／ｎｕマウスに、高用量または低用量のＬＨＲＨ−Ｘ
ＴＥＮ−Ｃｙ５．５、および対応する用量の非標的化Ｃｙ５．５タグ付加ＸＴＥＮ対照の
単一静脈注射を付与する。注射前、次いで注射後約８、２４、４８、および７２時間に、
生きた麻酔下動物上で、ＩＶＩＳ ５０光学撮像システムを使用して全身走査を得る。７
２時間の最後の時点で動物全体の蛍光の分布を測定した後、腫瘍、ならびに肝臓、肺、心
臓、脾臓、および腎臓を含む健常な器官を切除し、それらの蛍光を撮像システムによって
登録および処理する。蛍光剤の波長を一致させるように、Ｃｙ５．５励起（６１５〜６６
５ｎｍ）および放出（６９５〜７７０ｎｍ）フィルターを選択する。ＣＣＤチップの小／
中ビニングを使用し、画像において各マウスの観察可能なシグナルから少なくとも数千カ
ウントを得るように、およびＣＣＤチップの飽和を避けるように、露出時間を最適化する
。定量化のための画像を正規化するために、Ｃｙ５．５スペクトル領域に対して背景励起
および放出フィルターを使用し、背景蛍光画像を得る。蛍光の強度は、異なる色として表
され（青色は最低強度を反映し、赤色は最高強度を示す）、得られた画像を使用し、共役
体および対照の取り込みを評価する。
実施例４８：葉酸塩−ＸＴＥＮ−Ｃｙ５．５共役体のインビボおよびエクスビボ撮像
Ｃｙ５．５蛍光タグ付加葉酸塩−ＸＴＥＮ分子を代理として使用し、葉酸塩−ＸＴＥＮ
−薬物共役体の標的化および生体内分布効率を調査する。インビボに続いてエクスビボで
、ＩＶＩＳ ５０光学撮像システム（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈ
ｏｐｋｉｎｔｏｎ，ＭＡ）を用いる蛍光撮像を使用し、葉酸塩受容体陽性腫瘍細胞の皮下
成長異種移植片を担持するヌードマウスにおいて実験を行う。培養培地は、高い葉酸塩含
有量を含むため、これらのマウスに移植される葉酸塩受容体陽性腫瘍細胞は、抗生物質を
持たない５〜１０％熱不活性化ＦＣＳを含有する無葉酸塩細胞培養培地中で成長される。
同様に、通常の齧歯類食餌は、高濃度の葉酸を含有するため、この研究に使用されるヌー
ドマウスは、血清葉酸塩濃度を低減するように、腫瘍移植前の２週間、および撮像分析期
間の間、葉酸塩を含まない食餌で維持される。
つまり、葉酸塩受容体陽性腫瘍細胞を担持する雌ｎｕ／ｎｕマウスに、高用量または低
用量の葉酸塩−ＸＴＥＮ−Ｃｙ５．５、および対応する用量の非標的化Ｃｙ５．５タグ付
加ＸＴＥＮ対照の単一静脈注射を付与する。注射前、次いで注射後約８、２４、４８、お
よび７２時間に、生きた麻酔下動物上で、ＩＶＩＳ ５０光学撮像システムを使用して全
身走査を得る。７２時間の最後の時点で動物全体の蛍光の分布を測定した後、腫瘍、なら
びに肝臓、肺、心臓、脾臓、および腎臓を含む健常な器官を切除し、それらの蛍光を撮像
システムによって登録および処理する。蛍光剤の波長を一致させるように、Ｃｙ５．５励
起（６１５〜６６５ｎｍ）および放出（６９５〜７７０ｎｍ）フィルターを選択する。Ｃ
ＣＤチップの小／中ビニングを使用し、画像において各マウスの観察可能なシグナルから
少なくとも数千カウントを得るように、およびＣＣＤチップの飽和を避けるように、露出
時間を最適化する。定量化のための画像を正規化するために、Ｃｙ５．５スペクトル領域
に対して背景励起および放出フィルターを使用し、背景蛍光画像を得る。蛍光の強度は、
異なる色として表され（青色は最低強度を反映し、赤色は最高強度を示す）、得られた画
像を使用し、共役体および対照の取り込みを評価する。
実施例４９：ＬＨＲＨ−ＸＴＥＮ−薬物共役体の薬物動態分析
ＬＨＲＨ−ＸＴＥＮ−薬物構築体のインビボ薬物動態を、マウス、ラット、カニクイザ
ル、およびイヌを使用し、タンパク質組成物の標準方法を使用して評価する。ＬＨＲＨ−
ＸＴＥＮ−薬物構築体の組成物は、インビボ投与に適合する水性緩衝液（例えば、リン酸
塩緩衝生理食塩水、トリス緩衝生理食塩水、またはＨｅｐｅｓ緩衝生理食塩水）中に提供
される。組成物を適切な用量で、複数の経路を介して、最も好ましくは静脈内または皮下
経路を介して投与する。血液試料を、０．０８〜５０４時間の範囲の適切な時点で採取し
、血漿中に処理する。血漿試料を、ＥＬＩＳＡ、ＨＰＬＣ、および／またはＬＣ−ＭＳ／
ＭＳを含む多様な方法のうちの１つによって、ＬＨＲＨ−ＸＴＥＮ−薬物共役体の濃度に
ついて分析する。ＥＬＩＳＡ分析は、ＬＨＲＨ−ＸＴＥＮ−薬物共役体の２つの成分、例
えば、ＸＴＥＮ／ＬＨＲＨ、ＸＴＥＮ／薬物部分、ＬＨＲＨ／薬物部分、および／または
ＸＴＥＮ／ＸＴＥＮの組合せを認識することができるサンドウィッチＥＬＩＳＡ形式を使
用して行う。典型的に、ＬＨＲＨ−ＸＴＥＮ−薬物共役体の１つの成分を認識する抗体は
、９６ウェルマイクロタイタープレートのウェル上にコーティングされる。ウェルをブロ
ックして洗浄し、次いで、血清安定性試料を異なる希釈でウェルに添加し、コーティング
された抗体による共役体の捕捉を可能にする。次いで、ウェルを広く洗浄し、結合された
タンパク質を、第２のＬＨＲＨ−ＸＴＥＮ−薬物共役成分に対するビオチニル化抗体また
は適切な二次抗体のいずれかを使用して検出する。次いで、ウェルを再度洗浄した後、ス
トレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ビオチニル化検出抗体に相補
的）または二次抗体−ホースラディッシュペルオキシダーゼ（非ビオチニル化検出抗体に
相補的）を添加する。適切なインキュベーションおよび最終洗浄ステップ後、テトラメチ
ルベンジジン（ＴＭＢ）基質を添加し、プレートを４５０ｎＭで読み取る。次いで、共役
体の濃度を、各時点に対し、測色反応をＬＨＲＨ−ＸＴＥＮ−薬物較正曲線と比較するこ
とによって計算する。薬物動態パラメータを、ＷｉｎＮｏｎＬｉｎソフトウェアパッケー
ジを使用して計算する。
ＲＰ−ＨＰＬＣ分析の場合、血漿試料を、アセトニトリルまたはアセトン等の有機溶媒
で処理し、タンパク質を沈殿させる。可溶性分画を真空下で蒸発させ、負荷溶液中に再溶
解し、ＲＰ−ＨＰＬＣによって分析する。検体は、特定の薬物に特異的な波長での紫外線
吸収によって検出される。例えば、ドキソルビシンは、４８０ｎｍで検出される。較正標
準は、既知の量の遊離薬物を対応する血漿型に添加することによって調製され、実験試料
と並行してアッセイされる。
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析の場合、血漿試料を、アセトニトリルまたはアセトン等の有機溶
媒で処理し、タンパク質を沈殿させる。可溶性分画を真空下で蒸発させ、負荷溶液中に再
溶解し、ＲＰ−ＨＰＬＣによって分析する。検体は、三連四重極型質量分析計によってイ
ンライン検出され、定量化される。親イオン−娘イオン対は、各薬物に対して実験的に決
定される。較正標準は、既知の量の遊離薬物を対応する血漿型に添加することによって調
製され、実験試料と並行してアッセイされる。
これらの結果は、ＬＨＲＨおよび薬物部分へのＸＴＥＮの添加が、終末相半減期を著し
く増加させ、ＸＴＥＮに結合されていない薬物部分を標的化する薬物動態特性を強化する
という所見を支持することが予想される。
実施例５０：葉酸塩−ＸＴＥＮ−薬物共役体の薬物動態分析
葉酸塩−ＸＴＥＮ−薬物構築体のインビボ薬物動態を、マウス、ラット、カニクイザル
、およびイヌを使用し、タンパク質組成物の標準方法を使用して評価する。通常の餌は、
高濃度の葉酸を含有するため（約６ｍｇ／ｋｇマウス食餌）、葉酸塩共役体の薬物動態研
究に使用される動物は、研究開始前の２週間、および研究期間の間、葉酸塩を含まない食
餌で維持される。組成物を適切な用量で、複数の経路を介して、最も好ましくは静脈内ま
たは皮下経路を介して投与する。血液試料を、０．０８〜５０４時間の範囲の適切な時点
で採取し、血漿中に処理する。血漿試料を、ＥＬＩＳＡ、ＨＰＬＣ、および／またはＬＣ
−ＭＳ／ＭＳを含む多様な方法のうちの１つによって、ＬＨＲＨ−ＸＴＥＮ−薬物共役体
の濃度について分析する。
ＥＬＩＳＡ分析は、葉酸塩−ＸＴＥＮ−薬物共役体の２つの成分、例えば、ＸＴＥＮ／
葉酸塩、ＸＴＥＮ／薬物部分、葉酸塩／薬物部分、および／またはＸＴＥＮ／ＸＴＥＮの
組合せを認識することができるサンドウィッチＥＬＩＳＡ形式を使用して行う。典型的に
、葉酸塩−ＸＴＥＮ−薬物共役体の１つの成分を認識する抗体は、９６ウェルマイクロタ
イタープレートのウェル上にコーティングされる。ウェルをブロックして洗浄し、次いで
、血漿試料を異なる希釈でウェルに添加し、コーティングされた抗体による共役体の捕捉
を可能にする。次いで、ウェルを広く洗浄し、結合されたタンパク質を、第２の葉酸塩−
ＸＴＥＮ−薬物共役成分に対するビオチニル化抗体または適切な二次抗体のいずれかを使
用して検出する。次いで、ウェルを再度洗浄した後、ストレプトアビジン−ホースラディ
ッシュペルオキシダーゼ（ビオチニル化検出抗体に相補的）または二次抗体−ホースラデ
ィッシュペルオキシダーゼ（非ビオチニル化検出抗体に相補的）を添加する。適切なイン
キュベーションおよび最終洗浄ステップ後、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質を添
加し、プレートを４５０ｎＭで読み取る。次いで、共役体の濃度を、各時点に対し、測色
反応を葉酸塩−ＸＴＥＮ−薬物較正曲線と比較することによって計算する。物動態パラメ
ータを、ＷｉｎＮｏｎＬｉｎソフトウェアパッケージを使用して計算する。
ＲＰ−ＨＰＬＣ分析の場合、血漿試料を、アセトニトリルまたはアセトン等の有機溶媒
で処理し、タンパク質を沈殿させる。可溶性分画を真空下で蒸発させ、負荷溶液中に再溶
解し、ＲＰ−ＨＰＬＣによって分析する。検体は、特定の薬物に特異的な波長での紫外線
吸収によって検出される。例えば、ドキソルビシンは、４８０ｎｍで検出される。較正標
準は、既知の量の遊離薬物を対応する血漿型に添加することによって調製され、実験試料
と並行してアッセイされる。
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析の場合、血漿試料を、アセトニトリルまたはアセトン等の有機溶
媒で処理し、タンパク質を沈殿させる。可溶性分画を真空下で蒸発させ、負荷溶液中に再
溶解し、ＲＰ−ＨＰＬＣによって分析する。検体は、三連四重極型質量分析計によってイ
ンライン検出され、定量化される。親イオン−娘イオン対は、各薬物に対して実験的に決
定される。較正標準は、既知の量の遊離薬物を対応する血漿型に添加することによって調
製され、実験試料と並行してアッセイされる。
これらの結果は、葉酸塩および薬物部分へのＸＴＥＮの添加が、終末相半減期を著しく
増加させ、ＸＴＥＮに結合されていない薬物部分を標的化する薬物動態特性を強化すると
いう所見を支持することが予想される。
実施例５１：ＬＨＲＨ−ＸＴＥＮ−薬物共役体のインビボ有効性および毒性分析
ＬＨＲＨ−ＸＴＥＮ−薬物共役体は、ＬＨＲＨ受容体陽性腫瘍細胞に対する非常に強力
な毒素の標的送達のために意図される。そのようにして、ＬＨＲＨ−ＸＴＥＮ−薬物構築
体のインビボ薬物動態活性を、ヌードマウスに移植されたヒト腫瘍細胞発現ＬＨＲＨ受容
体を使用して評価することができる。
有効性研究を開始する前に、ヌードマウスにおける初期評価を実行し、ＬＨＲＨ−ＸＴ
ＥＮ−薬物候補の最大耐用量（ＭＴＤ）を確立する。次いで、研究期間の間に動物によっ
て耐容される最高用量であるＭＴＤを使用して、標準異種移植モデルにおける有効性およ
び毒性研究の用量範囲を計算する。つまり、ＭＴＤ実験を１群当たり５匹のマウスを用い
て実行し、様々な用量レベル、間隔、および期間でＬＨＲＨ−ＸＴＥＮ−薬物共役体の静
脈内投与を評価する。必要とされる開始ＭＴＤ用量および用量群の数は、科学的文献、標
的化ＬＨＲＨ部分に関する知識、共役される薬物部分の性質、密接に関連する化合物の毒
素学的特性、および初期薬物動態研究からのデータに基づく（上記参照）。体重の低減、
食餌および水の消費、ならびに立毛、円背、行動パターン、呼吸パターン、振戦、けいれ
ん、衰弱、および自傷の兆候等の標準ＭＴＤパラメータを、毎日監視する。許容されない
毒性を引き起こさないＬＨＲＨ−ＸＴＥＮ−薬物の最高用量は、ＭＴＤとして指定される
。腫瘍異種移植研究は、３〜４投与レベルのＬＨＲＨ−ＸＴＥＮ−薬物共役体を含み、Ｍ
ＴＤ研究の結果に依存し、他のパラメータは、選択された腫瘍細胞系に依存する。表４２
は、異種移植研究において使用することができる腫瘍系の例を提供する。したがって、関
連ヒト腫瘍系からの適切な数のＬＨＲＨ受容体陽性細胞を皮下注射し、腫瘍を形成させて
、そのサイズをキャリパーで測定し、容量を０．５ｘＬｘＷ２として計算し、式中、Ｌは
、最長軸の測定値（ミリメートル）であり、ＷはＬに垂直な軸の測定値（ミリメートル）
である。所望のサイズ範囲の腫瘍体積を含むマウスを８〜１０匹の動物群にランダム化す
ることに続いて、媒体対照、遊離薬物対照、およびＬＨＲＨ−ＸＴＥＮ−薬物共役体を、
選択された用量および間隔で静脈内投与する。腫瘍成長の停止または後退は、腫瘍サイズ
および体積を、選択された時点でキャリパーを用いて測定することによって決定される。
体重および食物消費を１〜２日毎に測定し、全体的な毒性を評価する。動物の生存を毎日
監視する。研究の終了時に、全ての動物を犠牲死させ、主要臓器に関して臨床病理および
組織病理を行う。
これらの結果は、ＬＨＲＨ−ＸＴＥＮ−薬物共役体が、強力な有効性および低い全身毒
性によって提示されるように、陽性治療指数を生じるという所見を支持することが予想さ
れる。対照的に、等モル用量で投与された非ＬＨＲＨ標的遊離薬物は、あまり強力ではな
いが、さらに高度に毒性であることが予想される。媒体対照は、未制御の腫瘍成長および
深刻な毒性を示すことが予想される。
実施例５２：葉酸塩−ＸＴＥＮ−薬物共役体のインビボ有効性および毒性分析
葉酸塩−ＸＴＥＮ−薬物共役体は、葉酸塩受容体陽性腫瘍細胞に対する毒素成分の標的
送達のために意図される。葉酸塩−ＸＴＥＮ−薬物構築体のインビボ薬物動態活性を、ヌ
ードマウス上のヒト腫瘍細胞発現葉酸塩受容体異種移植片を使用して評価する。有効性研
究を開始する前に、ヌードマウスにおける初期評価を実行し、葉酸塩−ＸＴＥＮ−薬物候
補の最大耐用量（ＭＴＤ）を確立する。次いで、研究期間の間に動物によって耐容される
最高用量であるＭＴＤを使用して、標準異種移植モデルにおける有効性および毒性研究の
用量範囲を計算する。通常の齧歯類食餌は、高濃度の葉酸を含有するため（６ｍｇ／ｋｇ
食餌）、これらの研究に使用されるマウスは、研究開始前の２週間、および研究期間の間
、葉酸塩を含まない食餌で維持される。ＭＴＤ実験を１群当たり５匹のマウスを用いて実
行し、様々な用量レベル、間隔、および期間で葉酸塩−ＸＴＥＮ−薬物共役体の静脈内投
与を評価する。必要とされる開始ＭＴＤ用量および用量群の数は、科学的文献、標的化葉
酸塩部分に関する知識、共役される薬物部分の性質、密接に関連する化合物の毒素学的特
性、および初期薬物動態研究からのデータに基づく（上記ＰＫ実施例参照）。体重の低減
、食餌および水の消費、ならびに立毛、円背、行動パターン、呼吸パターン、振戦、けい
れん、衰弱、および自傷の兆候等の標準ＭＴＤパラメータを、注意深く、毎日監視する。
許容されない毒性を引き起こさない葉酸塩−ＸＴＥＮ−薬物の最高用量は、ＭＴＤとして
指定される。
腫瘍異種移植研究は、３〜４投与レベルの葉酸塩−ＸＴＥＮ−薬物を含み、ＭＴＤ研究
の結果に依存し、他のパラメータは、選択された腫瘍細胞系に依存する。表４２は、異種
移植研究において使用することができる腫瘍系の例を記載する。葉酸塩含有量を低減する
ために、ヌードマウス上に移植される葉酸塩受容体陽性腫瘍細胞は、抗生物質を持たない
５〜１０％熱不活性化ウシ胎仔血清を含有する無葉酸塩細胞培養培地中で成長される。同
様に、血清葉酸塩濃度を低減するために、異種移植研究に使用されるマウスは、腫瘍移植
前の２週間、および研究期間の間、葉酸塩を含まない食餌で維持される。関連系からの適
切な数の葉酸塩受容体陽性細胞を皮下注射し、腫瘍を形成させて、そのサイズをキャリパ
ーで測定し、容量を０．５ｘＬｘＷ２として計算し、式中、Ｌは、最長軸の測定値（ミリ
メートル）であり、ＷはＬに垂直な軸の測定値（ミリメートル）である。所望のサイズ範
囲の腫瘍体積を含むマウスを８〜１０匹の動物群にランダム化することに続いて、媒体対
照、遊離薬物対照、および葉酸塩−ＸＴＥＮ−薬物を、選択された用量および間隔で静脈
内投与する。腫瘍成長の停止または後退は、腫瘍サイズおよび体積を、選択された時点で
キャリパーを用いて測定することによって決定される。体重および食物消費を１〜２日毎
に測定し、全体的な毒性を評価する。動物の生存を毎日監視する。研究の終了時に、全て
の動物を犠牲死させ、臨床病理および組織病理審査のために主要臓器を除去する。
標的化学療法葉酸塩−ＸＴＥＮ−薬物共役体は、マウスモデルにおける葉酸塩受容体陽
性腫瘍上の遊離細胞毒性薬物単独よりも有効であり、毒性が低いことが予想される。
実施例５３：ＬＨＲＨ−ＸＴＥＮ−薬物共役体を評価するためのヒト臨床試験設計
標的化学療法は、全身化学療法の有効性を高め、副作用を低減することを目的とする近
代的手法である。ＬＨＲＨは、生殖器官において機能するペプチドである。その受容体は
、特に、ある腫瘍上に集中するが、ほとんどの正常組織中では発現しないため、ＬＨＲＨ
受容体は、悪性腫瘍の選択的崩壊のための理想的な標的である。実際に、乳癌の約５２％
、卵巣癌および子宮内膜癌の約８０％、および前立腺癌の約８５％の検体は、ＬＨＲＨ受
容体を介して標的可能である。注目すべきは、ＬＨＲＨ依存性治療は、三重陰性乳房腫瘍
に対して特に有用であり、エストロゲンもしくはプロゲステロン受容体またはＨＥＲ２を
過剰発現しないため、多くの使用可能な標的薬物での処置に適していない。進行した子宮
内膜癌、卵巣癌、または前立腺癌の患者は、これらの悪性腫瘍が、再発しやすい、および
／または現行の処置に対して耐性であり得るため、特に不良な転帰を有することが多い。
ＬＨＲＨの１つ以上のコピーを担持するＸＴＥＮを３つ以上の薬物分子を担持するＸＴＥ
Ｎに融合し、標的ペプチド−薬物共役体を創製することは、治療指数および半減期を大幅
に改善することが予想され、これがＭＴＤをはるかに下回るレベルでの投薬を可能にし、
投与頻度および費用を低減する（用量当たりに必要な薬物を低減する）。
ＬＨＲＨ−ＸＴＥＮ−薬物組成物の臨床評価を、進行した乳癌、子宮内膜癌、卵巣癌、
および前立腺または膀胱癌に苦しむ患者において行い、治験は、ヒトにおけるＬＨＲＨ−
ＸＴＥＮ−薬物共役体の有効性および安全性を確認するように設計される。患者における
そのような研究は、３つの相を含む。最初に、第Ｉ相の安全性および薬物動態研究を行い
、最大耐用量（ＭＴＤ）を決定し、ヒトにおける用量限定毒性、薬物動態、および予備薬
力学を特徴付ける。これらの初期研究は、標準の治癒的または緩和的手段を使用すること
ができないか、またはそれらがもはや有効でない、もしくは耐容されない、転移性または
切除不可能な癌のある患者において行うことができ、患者におけるＬＨＲＨ受容体陽性状
態が登録条件である。第Ｉ相研究のスキームは、単一上昇用量のＬＨＲＨ−ＸＴＥＮ−薬
物共役体を使用すること、および生化学、ＰＫ、および臨床パラメータを測定することで
あり、後次の第ＩＩ相および第ＩＩＩ相治験において使用される治療ウィンドウを構築す
る、投与量および循環薬物のＭＴＤならびに閾値および最大濃度の決定を可能にすると同
時に、今後の研究において追跡される潜在的毒性および有害事象を定義する。
ヒト患者の第ＩＩ相臨床研究は、独立して、ＬＨＲＨ受容体陽性の進行（ステージ３も
しくは４）または再発した乳癌、子宮内膜癌、卵巣癌、および前立腺癌または膀胱癌患者
において行われる。この治験は、ＬＨＲＨ−ＸＴＥＮ−薬物共役体単独、および特定の適
応において用いられる現在の化学療法との組合せでの有効性および安全性を評価する。患
者は、静脈内投与されたＬＨＲＨ−ＸＴＥＮ−薬物臨床候補を、第Ｉ相において事前に決
定された用量レベルおよび計画で、標準化学療法薬の有無にかかわらず受容する。化学療
法薬およびプラシーボからなる対照アームが含まれる。一次エンドポイントは、固形癌の
治療効果判定のためのガイドライン（ＲＥＣＩＳＴ）によって定義される反応速度である
。二次エンドポイントとしては、安全性および耐用性、無増悪期間、および全生存が挙げ
られる。
第ＩＩＩ相の有効性および安全性研究は、ＬＨＲＨ受容体陽性の進行した（耐性、再発
）乳癌、子宮内膜癌、卵巣癌、および前立腺または膀胱癌患者において行い、ＲＥＣＩＳ
Ｔによって測定される無増悪生存等の統計的に有意な臨床エンドポイントに到達する能力
を試験する。この治験も、二次エンドポイントとしての全生存について統計的に検出力が
あり、４００人超の患者における登録が予想される。有効性の結果は、標準統計方法を使
用して決定する。この研究において、毒性および有害事象マーカーについても追跡し、記
載される方法において使用されるときに、化合物が安全であることを検証する。
実施例５４：葉酸塩−ＸＴＥＮ−薬物共役体を評価するためのヒト臨床試験設計
標的化学療法は、全身化学療法の有効性を高め、副作用を低減することを目的とする近
代的手法である。葉酸としても知られる葉酸塩、ビタミンＢ９は、ある生物学的経路にお
ける共因子として、ヌクレオチド生合成および機能のために全ての生細胞が必要とする重
要な栄養素である。葉酸塩受容体は、急速に分裂する悪性腫瘍、特に卵巣癌および非小細
胞肺癌を処置するための治療開発の焦点である。葉酸塩受容体の発現は、正常な卵巣にお
いてごくわずかであるが、上皮卵巣癌の約９０％は、多くの肺腺癌と同様に、葉酸塩受容
体を過剰発現し、それによって、行われる治療の可能性を開く。葉酸塩の１つ以上のコピ
ーを担持するＸＴＥＮを３つ以上の薬物分子を担持するＸＴＥＮに融合し、標的ペプチド
−薬物共役体を創製することは、治療指数を改善することが予想され、延長された半減期
は、 最大耐用量（ＭＴＤ）をはるかに下回るレベルでの投薬を可能にし、投与頻度およ
び費用を低減する（用量当たりに必要な薬物を低減する）。
葉酸塩−ＸＴＥＮ−薬物組成物の臨床評価は、再発または難治性進行腫瘍を持つ患者、
または他の化学療法を使用することに失敗した白金耐性卵巣癌および非小細胞肺癌に苦し
む患者において行う。臨床試験は、ヒトにおいて標準治療を超える、葉酸塩−ＸＴＥＮ−
薬物共役体の有効性および利点を決定するように設計される。患者におけるそのような研
究は、３つの相を含む。最初に、第Ｉ相の安全性および薬物動態研究を行い、ＭＴＤを決
定し、ヒトにおける用量限定毒性、薬物動態、および予備薬力学を特徴付ける。これらの
初期研究は、再発したか、または難治性の進行腫瘍を有し、標準の治癒的または緩和的手
段を使用することができないか、またはそれらがもはや有効でない、もしくは耐容されな
い葉酸塩受容体陽性状態を持つ患者において行うことができる。第Ｉ相研究は、単一上昇
用量の葉酸塩−ＸＴＥＮ−薬物共役体を使用すること、および生化学、ＰＫ、および臨床
パラメータを測定することであり、ＭＴＤの決定を可能にし、後次の第ＩＩ相および第Ｉ
ＩＩ相治験において使用される治療ウィンドウを構築する、投与量および循環薬物の閾値
および最大濃度を確立すると同時に、今後の研究において追跡される潜在的毒性および有
害事象を定義する。
ヒト患者の第ＩＩ相臨床研究は、独立して、葉酸塩受容体陽性の白金耐性卵巣癌患者集
団、多数の化学療法に失敗した非小細胞肺癌患者、および再発または難治性の進行腫瘍に
苦しむ患者において行われる。この治験は、葉酸塩−ＸＴＥＮ−薬物共役体単独、および
特定の適応において用いられる現在の化学療法との組合せでの有効性および安全性を評価
する。患者は、静脈内投与された葉酸塩−ＸＴＥＮ−薬物臨床候補を、第Ｉ相研究におい
て決定された用量レベルおよび計画で、標準化学療法薬の有無にかかわらず受容する。化
学療法薬およびプラシーボからなる対照アームが含まれる。一次エンドポイントは、固形
癌の治療効果判定のためのガイドライン（ＲＥＣＩＳＴ）によって定義される反応速度で
ある。二次エンドポイントとしては、安全性および耐用性、無増悪期間、および全生存が
挙げられる。
第ＩＩＩ相の有効性および安全性研究は、葉酸塩受容体陽性の白金耐性卵巣癌患者、非
小細胞肺癌患者、または進行腫瘍再発または難治性癌患者において行い、ＲＥＣＩＳＴに
よって測定される無増悪生存等の統計的に有意な臨床エンドポイントに到達する能力を試
験する。この治験も、二次エンドポイントとしての全生存について統計的に検出力があり
、４００人超の患者における登録が予想される。有効性の結果は、標準統計方法を使用し
て決定する。この研究において、毒性および有害事象マーカーについても追跡し、記載さ
れる方法において使用されるときに、化合物が安全であることを検証する。
実施例５５：ＸＴＥＮの血清安定性
ＧＦＰのＮ末端に融合されたＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４を含有する融合タンパク質を、３７
℃で最長７日間、サル血漿およびラット腎臓溶解物中でインキュベートした。図７６に示
されるように、０時点、１日目、および７日目に試料を抽出し、ＳＤＳ ＰＡＧＥに続い
て、ウェスタン分析を使用する検出、およびＧＦＰに対する抗体を用いた検出によって分
析した。ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４の配列は、血漿中７日間にわたってごくわずかな分解の兆
候を示した。しかしながら、ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４は、３日間にわたってラット腎臓溶解
物中で急速に分解された。融合タンパク質のインビボ安定性を、血漿試料中で試験し、Ｇ
ＦＰ＿ＡＥ８６４を、免疫沈降させ、ＳＤＳ ＰＡＧＥによって上記のように分析した。
注入後７日間までに採取された試料は、分解の兆候をほとんど示さなかった。これらの結
果は、血清プロテアーゼに起因する分解に対するａａＴ−ＸＴＥＮの耐性を実証し、これ
はａａＴ−ＸＴＥＮ融合タンパク質の薬物動態特性の強化の要因である。
実施例５６：エキセンジン−４に結合されたＸＴＥＮの二次構造の特性化
ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４−Ｅｘ４は、円偏光二色性分光によって二次構造の程度を評価し
た。ＣＤ分光は、Ｊａｓｃｏ Ｐｅｌｔｉｅｒ温度コントローラ（ＴＰＣ−３４８ＷＩ）
を備えたＪａｓｃｏ Ｊ−７１５（Ｊａｓｃｏ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｔｏｋｙｏ，
Ｊａｐａｎ）分光偏光計上で行った。タンパク質の濃度は、２０ｍＭリン酸ナトリウム（
ｐＨ７．０）、５０ｍＭ ＮａＣｌ中で０．２ｍｇ／ｍＬに調整した。光学経路長０．１
ｃｍのＨＥＬＬＭＡ石英セルを使用して実験を行った。５℃、２５℃、４５℃、および６
５℃でＣＤスペクトルを取得し、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）用Ｊ−７００異形１．０８
．０１（Ｂｕｉｌｄ １）Ｊａｓｃｏソフトウェアを使用して処理した。ＣＤ測定を行う
前に５分間、各温度で試料を平衡化した。１ｎｍの帯域幅および２秒の時間定数を使用し
、１００ｎｍ／分の走査速度で３００ｎｍ〜１８５ｎｍの全てのスペクトルを重複して記
録した。図７７に示されるＣＤスペクトルは、安定した二次構造の証拠を示さず、非構造
化ポリペプチドと一致する。
実施例５７：ＸＴＥＮに結合することによるペプチドペイロードの可溶性および安定性
の増加
ＸＴＥＮが可溶性および安定性という物理化学的特性を強化する能力を評価するために
、グルカゴン＋短長ＸＴＥＮの融合タンパク質を調製し、評価した。被験物質は、中性ｐ
Ｈのトリス緩衝生理食塩水中で調製し、Ｇｃｇ−ＸＴＥＮ溶液の特性化を、逆相ＨＰＬＣ
およびサイズ排除クロマトグラフィーによって行い、タンパク質が溶液中で均質および非
凝集であることを確認した。データは、表４３に提示される。比較目的で、同じ緩衝液中
の非修飾グルカゴンの可溶性限界を、６０μＭ（０．２ｍｇ／ｍＬ）で測定し、結果は、
負荷されたＸＴＥＮの全長に対して実質的な可溶性の増加が得られたことを実証する。重
要なことに、ほとんどの場合において、グルカゴン−ＸＴＥＮ融合タンパク質は、標的濃
度を達成するように調製され、所与の構築体の最大可溶性限界を決定するように評価され
なかった。しかしながら、ＡＦ−１４４ＸＴＥＮに結合されたグルカゴンの場合、可溶性
の限界は決定され、ＸＴＥＮに結合されていないグルカゴンと比較して、６０倍の可溶性
の増加が達成されたという結果を伴う。さらに、グルカゴン−ＡＦ１４４を安定性につい
て評価したところ、冷蔵条件下で少なくとも６ヶ月間、および３７℃で約１ヶ月間、液体
製剤中で安定することが見出された（データ図示せず）。
このデータは、グルカゴン等の生物学的に活性なタンパク質への短長ＸＴＥＮポリペプ
チドの結合が、得られる融合タンパク質によってタンパク質の可溶特性を顕著に強化する
と同時に、より高いタンパク質濃度での安定性を付与することができるという結論を支持
する。
実施例５８：多様なペイロードと結合したＸＴＥＮの分析的サイズ排除クロマトグラフ
ィー
サイズ排除クロマトグラフィー分析は、様々な治療タンパク質、および漸増する長さの
非構造化組換えタンパク質を含有する融合タンパク質上で行った。例示的なアッセイは、
ＴＳＫＧｅｌ−Ｇ４０００ ＳＷＸＬ（７．８ｍｍ ｘ ３０ｃｍ）カラムを使用し、１
ｍｇ／ｍＬ濃度の４０μｇの精製グルカゴン融合タンパク質を、２０ｍＭリン酸塩（ｐＨ
６．８）、１１４ｍＭ ＮａＣｌ中０．６ｍＬ／分の流量で分離した。クロマトグラムプ
ロファイルは、ＯＤ２１４ｎｍおよびＯＤ２８０ｎｍを使用して監視した。全てのアッセ
イのカラム較正は、ＢｉｏＲａｄからのサイズ排除較正標準を使用して行い、マーカーは
、サイログロブリン（６７０ ｋＤａ）ウシγ−グロブリン（１５８ ｋＤａ）、トリオ
ボアルブミン（４４ ｋＤａ）、ブタミオグロブリン（１７ ｋＤａ）、およびビタミン
Ｂ１２（１．３５ ｋＤａ）を含む。グルカゴン−Ｙ２８８、グルカゴン−Ｙ１４４、グ
ルカゴン−Ｙ７２、グルカゴン−Ｙ３６の代表的なクロマトグラフプロファイルは、図７
８にオーバーレイとして示される。データは、各化合物の分子量が、付着したＸＴＥＮ配
列の長さに比例することを示す。しかしながら、データは、各構築体の見掛けの分子量が
、球状タンパク質に対して予想されるよりも著しく大きいことも示す（同じアッセイにお
いて実行された標準タンパク質との比較で示される）。評価された全ての構築体のＳＥＣ
分析に基づいて、見掛けの分子量、見掛けの分子量因子（計算された分子量に対する見掛
けの分子量の比として表される）、および流体力学半径（ＲＨ（ｎｍ））が表４４に示さ
れる。結果は、５７６個以上のアミノ酸の異なるＸＴＥＮの組込みが、約３３９〜７６０
ｋＤａの融合タンパク質に対して見掛けの分子量を付与すること、および８６４個以上の
アミノ酸のＸＴＥＮが、約８００ｋＤＡを超える見掛けの分子量を付与することを示す。
実際の分子量に対する見掛けの分子量の比例増加の結果は、いくつかの異なるモチーフフ
ァミリー、すなわち、ＡＤ、ＡＥ、ＡＦ、ＡＧ、およびＡＭからのＸＴＥＮで創製された
融合タンパク質の場合と一致し、少なくとも４倍の増加、および約１７倍も高い比率を伴
う。さらに、様々なペイロード（およびＹ２８８に融合されたグルカゴンの場合は２８８
個の残基）を持つ融合タンパク質への５７６個以上のアミノ酸を持つＸＴＥＮ融合パート
ナーの組込みは、７ｎｍ以上の流体力学半径をもたらし、約３〜５ｎｍの糸球体孔サイズ
をはるかに超える。したがって、成長およびＸＴＥＮを含む融合タンパク質は、低減した
腎クリアランスを有し、終末相半減期の増加に寄与し、対応する非融合生物学的ペイロー
ドタンパク質に対して治療効果または生物学的効果を改善することが予想される。
実施例５９：予測アルゴリズムによる二次構造の配列の分析
アミノ酸配列は、周知のＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズム（Ｃｈｏｕ，Ｐ．Ｙ．，
ｅｔ ａｌ．（１９７４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１３：２２２−４５）およびＧａ
ｒｎｉｅｒ−Ｏｓｇｕｔｈｏｒｐｅ−Ｒｏｂｓｏｎ、または「Ｇｏｒ」方法（Ｇａｒｎｉ
ｅｒ Ｊ，Ｇｉｂｒａｔ ＪＦ，Ｒｏｂｓｏｎ Ｂ．（１９９６）．ＧＯＲ ｍｅｔｈｏ
ｄ ｆｏｒ ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃ
ｔｕｒｅ ｆｒｏｍ ａｍｉｎｏ ａｓｈｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅ
ｎｚｙｍｏｌ ２６６：５４０−５５３）等の、あるコンピュータプログラムまたはアル
ゴリズムを介して、二次構造について評価することができる。所与の配列について、これ
らのアルゴリズムは、いくつかの二次構造が存在するか、または全く存在しないかを予測
することができ、例えば、αらせんまたはβシートを形成する配列の残基の総数および／
またはパーセンテージ、またはランダムコイル形成をもたらすことが予測される配列の残
基のパーセンテージとして表される。
ＸＴＥＮ「ファミリー」からのいくつかの代表的な配列は、これらの配列における二次
構造の程度を評価するように、Ｃｈｏｕ−ＦａｓｍａｎおよびＧＯＲ方法のための２つの
アルゴリズムツールを使用して評価された。Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎツールは、Ｗｉｌｌ
ｉａｍ Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｖｉｒｇ
ｉｎｉａによって、２００９年６月１９日に存在したワールドワイドウェブ上に位置する
ＵＲＬ（．ｆａｓｔａ．ｂｉｏｃｈ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ２
／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ．ｃｇｉ？ｒｍ＝ｍｉｓｃ１）のインターネットサイト「Ｂｉｏｓ
ｕｐｐｏｒｔ」において提供された。ＧＯＲツールは、Ｐｏｌｅ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｑ
ｕｅ Ｌｙｏｎｎａｉｓによって、２００８年６月１９日に存在したワールドワイドウェ
ブ上に位置するＵＲＬ（．ｎｐｓａ−ｐｂｉｌ．ｉｂｃｐ．ｆｒ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｓｅ
ｃｐｒｅｄ＿ｇｏｒ４．ｐｌ）のインターネットサイト「Ｎｅｔｗｏｒｋ Ｐｒｏｔｅｉ
ｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ」において提供された。
分析の第１ステップとして、単一ＸＴＥＮ配列を、２つのアルゴリズムによって分析し
た。ＡＥ８６４組成物は、アミノ酸Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｅ、Ｐ、およびＡからなる４つの１２ア
ミノ酸配列モチーフの複数コピーから創製された８６４個のアミノ酸残基を持つＸＴＥＮ
である。配列モチーフは、モチーフ内および全体配列内に制限された反復性があり、任意
の２つの連続アミノ酸の配列は、いずれか１つの１２アミノ酸モチーフにおいて２回を超
えて反復しないこと、および全長ＸＴＥＮの３つの連続アミノ酸は同一でないという事実
によって特徴付けられる。Ｎ末端からのＡＦ８６４配列の連続して長い部分は、Ｃｈｏｕ
−ＦａｓｍａｎおよびＧＯＲアルゴリズムによって分析した（後者は、最小１７個のアミ
ノ酸長を必要とする）。これらの配列は、ＦＡＳＴＡ形式配列を予測ツールに入力し、分
析を実行することによって分析した。これらの分析結果は、表４５に提示される。
これらの結果は、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ計算によって、ＡＥおよびＡＧファミリーの
短いＸＴＥＮ、少なくとも２８８個までのアミノ酸残基は、αらせんまたはβシートを有
しないが、ＧＯＲアルゴリズムによって予測されるランダムコイルのパーセンテージは、
７８〜９９％まで異なる。５０４個の残基のＸＴＥＮ長さを１３００超に増加させた場合
、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズムによって分析されたＸＴＥＮは、０〜２％の予測
されたαらせんまたはβシートのパーセンテージを有したが、計算されたランダムコイル
のパーセンテージは、９４〜９９％に増加した。αらせんまたはβシートを持つＸＴＥＮ
は、３つの連続セリン残基の１つ以上の例を持つ配列であり、予測されたβシート形成を
もたらした。しかしながら、これらの配列でさえも依然として、約９９％のランダムコイ
ル形成を有していた。
この分析は、１）連続アミノ酸に対して制限された反復性を有するＧ、Ｓ、Ｔ、Ｅ、Ｐ
、およびＡの複数配列モチーフから創製されたＸＴＥＮは、非常に低量のαらせんおよび
βシートを有することが予測されること、２）ＸＴＥＮの長さを増加させることが、αら
せんまたはβシート形成の可能性を顕著に増加しないこと、および３）アミノ酸Ｇ、Ｓ、
Ｔ、Ｅ、Ｐ、およびＡからなる非反復１２−ｍｅｒの付加によってＸＴＥＮ配列の長さを
段階的に増加させることが、ランダムコイル形成のパーセンテージの増加をもたらすとい
う結論を支持する。これらの方法によって評価された多数の配列に基づいて、制限された
反復性を有する（いずれか１つのモチーフに２つ以上の同一連続アミノ酸がないと定義さ
れる）配列モチーフＧ、Ｓ、Ｔ、Ｅ、Ｐ、およびＡから創製されたＸＴＥＮは、極めて制
限された二次構造を有することが予想されると結論される。３つの連続セリンを含有する
モチーフを例外として、表１からの一般に任意の順序または組合せの配列モチーフを使用
して、二次構造を実質的に欠くＸＴＥＮ配列をもたらし、３つの連続セリンの効果が、Ｘ
ＴＥＮの長さを増加させることによって軽減される、ＸＴＥＮポリペプチドを創製するこ
とができる。そのような配列は、本明細書に開示される発明のＸＴＥＮ含有組成物実施形
態に記載される特徴を有することが予想される。
実施例６０：ポリペプチド配列の反復性の分析
ポリペプチドアミノ酸配列は、より短い部分列が全体ポリペプチド内で出現する回数を
定量化することによって、反復性について評価することができる。例えば、２００アミノ
酸残基のポリペプチドは、１９２個の重複する９アミノ酸部分列（または９−ｍｅｒ「枠
」）を有するが、固有の９−ｍｅｒ部分列の数は、その配列内の反復性の量に依存する。
本分析において、異なる配列を、ポリマー部分の最初の２００アミノ酸全体の各３アミノ
酸枠に対する全ての固有３−ｍｅｒ部分列発生を合計し、２００アミノ酸配列内の固有の
３−ｍｅｒ部分列の絶対数で割ることによって、反復性について評価した。得られた部分
列スコアは、ポリペプチド内の反復性の程度の反映である。
表４６に示される結果は、２または３つのアミノ酸種からなる非構造化ポリペプチドが
、高い部分列スコアを有する一方で、低程度の内部反復性を持つ６つのアミノ酸Ｇ、Ｓ、
Ｔ、Ｅ、Ｐ、およびＡの１２アミノ酸モチーフからなる非構造化ポリペプチドが、１０未
満、場合によっては５未満の部分列スコアを有することを示す。例えば、Ｌ２８８配列は
、２つのアミノ酸種を有し、短い高度に反復性の配列を有し、５０．０の部分列スコアを
もたらす。ポリペプチドＪ２８８配列は、３つのアミノ酸種を有するが、短い反復性配列
も有し、３３．３の部分列スコアをもたらす。Ｙ５７６も３つのアミノ酸種を有するが、
内部反復を形成せず、最初の２００アミノ酸にわたる１５．７の部分列スコアに反映され
る。Ｗ５７６は、４つのアミノ酸種からなるが、より高程度の内部反復性、例えば、「Ｇ
ＧＳＧ」を有し、２３．４の部分列スコアをもたらす。ＡＤ５７６は、４種の１２アミノ
酸モチーフからなり、それぞれは４種のアミノ酸からなる。個別のモチーフの低程度の内
部反復性に起因して、最初の２００アミノ酸にわたる全体部分列スコアは、１３．６であ
る。対照的に、４つのモチーフからなるＸＴＥＮは、６種のアミノ酸を含有し、低程度の
内部反復性を持つそれぞれは、より低い部分列スコアを有する（すなわち、ＡＥ８６４（
６．１）、ＡＦ８６４（７．５）、およびＡＭ８７５（４．５））。
結論：これらの結果は、それぞれが本質的に非反復性である４〜６のアミノ酸種からな
る１２個のアミノ酸部分列モチーフを、より長いＸＴＥＮポリペプチドに合わせることが
、非反復性である全体配列をもたらすことを示す。これは、各部分列モチーフが、配列全
体で複数可使用され得るという事実にかかわらない。対照的に、より少数のアミノ酸種か
ら創製されたポリマーは、より高い部分列スコアをもたらしたが、実際の配列は、反復性
の程度を低減し、より低い部分列スコアをもたらすように調整することができる。
実施例６１：ＴＥＰＩＴＯＰＥスコアの計算
９ｍｅｒペプチド配列のＴＥＰＩＴＯＰＥスコアは、Ｓｔｕｒｎｉｏｌｏ［Ｓｔｕｒｎ
ｉｏｌｏ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１７：５５
５］によって記載されるポケット電位を付加することによって計算することができる。本
実施例において、別個のテピトープスコアを、個別のＨＬＡ対立遺伝子に対して計算した
。表４７は、一例として、白人集団において高頻度で発生する、ＨＬＡ＊０１０１Ｂのポ
ケット電位を示す。配列Ｐ１−Ｐ２−Ｐ３−Ｐ４−Ｐ５−Ｐ６−Ｐ７−Ｐ８−Ｐ９を持つ
ペプチドのＴＥＰＩＴＯＰＥスコアを計算するために、表４７の対応する個別のポケット
電位を付加した。配列ＦＤＫＬＰＲＴＳＧを持つ９ｍｅｒペプチドのＨＬＡ＊０１０１Ｂ
スコアは、０、−１．３、０、０．９、０、−１．８、０．０９、０、０の合計である。
長いペプチドのＴＥＰＩＴＯＰＥスコアを評価するために、配列の全ての９ｍｅｒ部分
列に対してこのプロセスを繰り返すことができる。このプロセスは、他のＨＬＡ対立遺伝
子によってコードされるタンパク質に対して繰り返すことができる。表４８〜５１は、白
人集団において高頻度で発生するＨＬＡ対立遺伝子のタンパク質産物に対するポケット電
位を示す。
この方法によって計算されたＴＥＰＩＴＯＰＥスコアは、約−１０〜＋１０の範囲であ
る。しかしながら、Ｐ１位において疎水性アミノ酸（ＦＫＬＭＶＷＹ）を欠く９ｍｅｒペ
プチドは、−１００９〜−９８９の範囲の計算されたＴＥＰＩＴＯＰＥスコアを有する。
この値は、生物学的に無意味であり、疎水性アミノ酸が、ＨＬＡ結合のアンカー残基とし
て機能し、Ｐ１において疎水性残基を欠くペプチドは、ＨＬＡに対する非結合体であると
見なされるという事実を反映する。ほとんどのＸＴＥＮ配列は、疎水性残基を欠くため、
９ｍｅｒ部分列の全ての組合せは、−１００９〜−９８の範囲のＴＥＰＩＴＯＰＥを有す
る。この方法は、ＸＴＥＮポリペプチドが、予測されたＴ細胞エピトープをほとんど、ま
たは全く有しないことがある。
実施例６２：ＧＰＣＲ Ｃａ２＋動員活性アッセイ
組換えＧＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮは、Ａｌｔｅｒｓ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｇ
ＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮ：ａ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔ
ｈ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｓｅｒｕｍ ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ ａｎｄ ｅｆｆｉｃａｃｙ
ｉｎ ａ ｒａｔ Ｃｒｏｈｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｍｏｄｅｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ；
７（１１）：ｅ５０６３０に記載の通り調製した。共役体ＧＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮは、
実施例２６に記載の通り調製し（図６８）、分取ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した（図７
０）。ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＣｈｅｍｉＳＣＲＥＥＮヒト組換えＧＬＰ−２グル
カゴンファミリー受容体カルシウム最適化された安定した細胞系を使用し、製造者の指示
に従ってＧＰＣＲ Ｃａ２＋フラックス動員活性アッセイを行った結果を図１１０に提示
する。組換えおよび共役ＧＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮの双方を、８点３倍連続希釈用量反応
曲線として描いた。それぞれのＹ軸ＲＦＵを持つ４ＰＬ回帰プロットを使用して、用量反
応曲線を適合し、データを、Ｘ軸上の濃度に対する絶対最大ＲＦＵのパーセンテージとし
て表した。組換えＧＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮおよび共役ＧＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮの双方
は、それぞれ４２３ｎＭおよび５２９ｎＭの予測されたＥＣ５０電位値を持つ、用量依存
性アゴニスト活性を呈した。
実施例６３：共役ＧＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮのインビトロ血漿安定性アッセイ
等濃度の組換えＧＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮおよび共役ＧＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮを、独
立して、それぞれラット、カニクイザル、およびヒト血漿中にスパイクさせた。試料を、
３７℃で最長１０日間インキュベートし、アリコートを適切な時間間隔で除去して、分析
まで−８０℃で貯蔵した。様々な種の共役されたＧＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮの血漿安定性
を、それぞれの血漿マトリックスにおいて行われた抗ＸＴＥＮ／ＧＬＰ２ ＥＬＩＳＡ上
の組換えＧＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮの血漿安定性と比較した。抗ＸＴＥＮ／ＧＬＰ２ Ｅ
ＬＩＳＡは、捕捉抗体としての抗ＸＴＥＮマウス抗体、検出抗体としてのビオチニル化抗
ヒトＧＬＰ２抗体からなる。図１１１に示されるように、共役ＧＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮ
のヒト血漿におけるインビトロ安定性は、２４０時間を超える計算された安定性半減期を
有する組換えＧＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮのそれに相当する。同様のインビトロ安定性は、
ラットおよびカニクイザル血漿における２つのＧＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮタンパク質を用
いても観察された（データ図示せず）。
実施例６４：ラットにおける共役ＧＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮの薬物動態
雌ＳＤ株ラット（２００〜２２０ｇ）を、それぞれ３匹の動物群にランダムに割り当て
た。組換えＧＬＰ−２Ｇ−ＸＴＥＮおよび共役ＧＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮは、２ｍｇ／ｋ
ｇの皮下注射により各動物に投与された。血液試料（０．２ｍＬ）を事前冷却したヘパリ
ン化マイクロタイター管に、投与前、試験化合物投与後０．０８時間、４時間、８時間、
２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１２０時間、および１６８時間に採取した。
次いで、血液を血漿に処理し、分析まで−８０℃で即時に貯蔵した。捕捉抗体として抗Ｘ
ＴＥＮマウス抗体を使用し、検出抗体としてビオチニル化抗ヒトＧＬＰ２抗体を使用する
抗ＸＴＥＮ／ＧＬＰ２ ＥＬＩＳＡを使用して、血漿試料を分析した。関連組換えＧＬＰ
２−２Ｇ−ＸＴＥＮまたは共役ＧＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮを、それぞれＥＬＩＳＡ較正標
準として使用し、ＥＬＩＳＡを行った（図１１２）。組換えＧＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮ（
３６（±７）時間）および共役ＧＬＰ２−２Ｇ−ＸＴＥＮ（３７（±７）時間）の計算さ
れた半減期は、同様であることが見出された。
実施例６５：Ｃ末端システインを介して結合された三量体ＸＴＥＮ共役体
三量体ＸＴＥＮ共役体は、以下の手順によって調製した。１つの内部システイン残基を
持つＸＴＥＮタンパク質１ｘアミノ，１ｘチオール−ＸＴＥＮ４３２（ＸＴＥＮ＿ＡＥ４
３２（Ａｍ１，Ｃ４２２））のアリコートを、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、５０
ｍＭ ＮａＣｌ中の５８７μＭ（２３．２３ｍｇ／ｍＬ）溶液として調製した。トリス−
［２−マレイミドエチル］アミン（ＴＭＥＡ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カ
タログ＃３３０４３）を、無水ＤＭＦ中に溶解し、最終濃度１０ｍＭにした。ＴＭＥＡを
タンパク質溶液に添加し、ＸＴＥＮのチオール基に結合した（リンカー上の５ｘモル過剰
のタンパク質）。反応混合液を２５℃で２時間インキュベートし、反応の産物をＳＥＣ−
ＨＰＬＣによって分析した（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ ＢｉｏＳｅｐ−ＳＥＣ−ｓ４０００
６００ ｘ ７．８０ｍｍ、緩衝液：５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）、３０
０ｍＭ ＮａＣｌ、流量０．５ｍＬ／分、７０分間の定組成溶出）。線状ＸＴＥＮ＿４３
２、ＸＴＥＮ＿８６４、およびＸＴＥＮ＿１２９６（それぞれ４３２個、８６４個、およ
び１２９６個のアミノ酸を有する）を同条件下で分析し、反応産物を特定した（図１１３
）。ピーク１は、２８分でＸＴＥＮ＿１２９６と同時に溶出し、ＸＴＥＮ＿４３２の三量
体として特定された。ピーク２は、３０．５分でＸＴＥＮ＿８６４と同時に溶出し、ＸＴ
ＥＮ＿４３２の二量体として特定された。ピーク３は、３５分でＸＴＥＮ＿４３２と同時
に溶出し、ＸＴＥＮ＿４３２前駆体として特定された。三量体ＸＴＥＮ共役体、および二
量体ＸＴＥＮ共役体の収率は、それぞれ１９％および３６％であった。三量体共役体３ｘ
ＸＴＥＮ＿４３２および線状分子ＸＴＥＮ＿１２９６に対する本質的に同一の保持時間は
、ＸＴＥＮタンパク質の見掛けの分子量および流体力学半径は、その幾何学構成に依存し
ないことを示唆する。
実施例６６：Ｎ末端αアミノ基を介して結合された三量体ＸＴＥＮ共役体
三量体ＸＴＥＮ共役体は、以下の手順によって調製した。
１．１ｘＤＢＣＯ−ＸＴＥＮ２８８の合成
タンパク質１ｘアミノ−ＸＴＥＮ２８８（ＸＴＥＮ＿ＡＥ２８８（Ａｍ１））のアリコ
ートを、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、５０ｍＭ ＮａＣｌ中の７５８μＭ（２０
ｍｇ／ｍＬ）溶液として調製した。２ｍＬのタンパク質を、無水ＤＭＦ中に溶解された０
．１ｍＬの１Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０および０．１５２ｍＬの５０ｍＭ ＤＢＣＯ−
スルホ−ＮＨＳ（Ｃｌｉｃｋ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｔｏｏｌｓ、カタログ＃Ａ１２４）
と混合し、ＤＢＣＯ基をＸＴＥＮのＮ末端アミノ基に結合した。反応混合液を２５℃で２
時間インキュベートし、分析的ＲＰ−ＨＰＬＣによって分析した（図１１４Ａ）。０．０
１％ ＴＦＡを用いて反応混合液を１５ｍＬに希釈し、１０％ ＴＦＡ溶液を使用してｐ
Ｈを約３に調整した。タンパク質溶液を、２つの等分量に分割し、各分画を分取Ｃ４ Ｒ
Ｐ−ＨＰＬＣカラムＶｙｄａｃ Ｃ４ ２５０ｘ１０ｍｍ（Ｇｒａｃｅ Ｄａｖｉｓｏｎ
Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ＃２１４ＴＰ５１０）上に負荷した
。タンパク質は、０．０１％ ＴＦＡ中の１８０ｍＬ線形５〜５０％勾配のアセトニトリ
ルを用いて、２ｍＬ／分の流量で溶出した。１ｘＤＢＣＯ−ＸＴＥＮ２８８を含有する分
画を、１Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８で約ｐＨ７に調整し、真空蒸発によって濃縮した。
２．３ｘアジド−ＰＥＧ４−ＴＡＥＡの合成
トリス（２−アミノエチル）アミン（ＴＡＥＡ，Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、カタロ
グ＃２２５６３０）を、無水ＤＭＦ中に溶解し、最終濃度２００ｍＭにした。アジド−Ｐ
ＥＧ４−ＮＨＳエステル（Ｃｌｉｃｋ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｔｏｏｌｓ、カタログ＃Ａ
Ｚ１０３）を、無水ＤＭＦ中に溶解し、最終濃度１Ｍにした。アジド−ＰＥＧ４−ＮＨＳ
を、５倍モル過剰でトリス（２−アミノエチル）アミンと混合し、２５℃で１時間インキ
ュベートした。３ｘアジド−ＰＥＧ４−ＴＡＥＡを、Ｃ１８ ＲＰ−ＨＰＬＣを使用し、
Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｃ１８ ５ｕ ３００Ａ １５０ｘ４．６０ｍ
ｍカラム、緩衝液Ａ水中の０．１％ ＴＦＡ、緩衝液Ｂアセトニトリル中の０．１％ Ｔ
ＦＡ、流量１ｍＬ／分、勾配５〜５０％Ｂで４５分以内に精製した。クロマトグラフィー
のピークを回収し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳおよびＥＳＩ−ＭＳによって分析して、９
６６Ｄａの分子量を持つ産物を検出した。３ｘアジド−ＰＥＧ４−ＴＡＥＡを、３３分の
保持時間を持つピークとして特定した（図１１４Ｂ）。１Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０を
使用して分画を中和し、真空蒸発によって濃縮した。
３．三量体ＸＴＥＮ共役体の合成
１ｘＤＢＣＯ−ＸＴＥＮ２８８を、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、５０ｍＭ Ｎ
ａＣｌ中の７．８５ｍｇ／ｍＬ（２９３μＭ）溶液として調製した。３ｘアジド−ＰＥＧ
４−ＴＡＥＡを、ＲＰ−ＨＰＬＣ精製し、同じ緩衝液中で製剤化した。合成されたリンカ
ーの濃度は決定されず、１ｘＤＢＣＯ−ＸＴＥＮ２８８および３ｘアジド−ＰＥＧ４−Ｔ
ＡＥＡを、様々な比率で経験的に混合し、２５℃で４時間インキュベートした。ＳＥＣ−
ＨＰＬＣ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ ＢｉｏＳｅｐ−ＳＥＣ−ｓ４０００ ６００ｘ７．８
０ｍｍ、緩衝液：５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、流
量０．５ｍＬ／分、７０分間の定組成溶出）を使用し、共役産物を分析した。線状ＸＴＥ
Ｎ＿２８８、ＸＴＥＮ＿５７６、およびＸＴＥＮ＿８６４を同条件下で分析し、反応産物
を特定した（図１１５）。ピーク１は、３０．５分でＸＴＥＮ＿８６４と同時に溶出し、
ＸＴＥＮ＿２８８の三量体として特定された。ピーク２は、３４分でＸＴＥＮ＿５７６と
同時に溶出し、ＸＴＥＮ＿２８８の二量体として特定された。ピーク３は、３９分でＸＴ
ＥＮ＿２８８と同時に溶出し、ＸＴＥＮ＿２８８前駆体として特定された。ピーク４は、
低分子量化合物に対応し、ＸＴＥＮ種の定量化に含まれなかった。最適化タンパク質／リ
ンカー比での三量体ＸＴＥＮ共役体の収率は、５７％であった。三量体共役体３ｘＸＴＥ
Ｎ＿２８８および線状分子ＸＴＥＮ＿８６４に対する本質的に同一の保持時間は、ＸＴＥ
Ｎタンパク質の見掛けの分子量および流体力学半径は、その幾何学構成に依存しないこと
を示唆する。
実施例６７：ＫＢ細胞上の３ｘＦＡ（γ），３ｘＭＭＡＥ−ＸＴＥＮの選択的細胞毒性
葉酸塩受容体を担持する細胞を選択的に標的および殺傷する能力を評価した。被験物質
の遊離ＭＭＡＥ、非標的化３ｘＭＭＡＥ−ＸＴＥＮ共役体（毒素に結合されたＸＴＥＮ）
、および葉酸塩受容体標的３ｘＦＡ（γ）、３ｘＭＭＡＥ−ＸＴＥＮ共役体を、葉酸塩受
容体陽性ＫＢ細胞系を使用し、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ抗増殖アッセイにおいて評価
した。培養培地は、高い葉酸含有量を含むため、ＫＢ細胞を、１０％熱不活性化ウシ胎仔
血清を含む無葉酸培地中、３７℃、５％ ＣＯ２下で細胞生存性実験の開始前に少なくと
も７日間成長させた。この培地は、実験の実行にも利用した。つまり、１ウェル当たり１
０，０００個のＫＢ細胞を、９６ウェルマイクロタイターアッセイプレートの上に置いた
。ＫＢ細胞は、３７℃、５％ ＣＯ２で終夜のインキュベーションによって、プレートに
付着することが許された。次いで、消費された培地を除去し、葉酸競合体を含有するよう
に指定されたウェルは、葉酸を含有するアッセイ培地を受容したが、葉酸競合体を有する
ように指定されないウェルは、アッセイ培地のみを受容した。プレートを３０分間、３７
℃、５％ ＣＯ２でインキュベートした後、アッセイ培地を吸引し、プレートをアッセイ
培地で洗浄した。次いで、遊離ＭＭＡＥ、３ｘＭＭＡＥ−ＸＴＥＮ、および３ｘＦＡ（γ
），３ｘＭＭＡＥ−ＸＴＥＮを、葉酸競合体の存在または不在下で、適切な用量範囲で添
加した。次いで、プレートを２〜４時間、３７℃、５％ ＣＯ２でインキュベートした。
次いで、培地を除去し、プレートを洗浄して、新鮮な培地を導入し、プレートをさらに４
８〜７２時間インキュベートのを許した。適切なインキュベーション期間後、ＣｅｌｌＴ
ｉｔｅｒ−Ｇｌｏ試薬を添加し、プレートを照度計上で読み取った。４パラメータ論理曲
線適合を使用し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して、各被験物質のＩＣ５０を決
定した。
結果：図１１６に示されるように、遊離ＭＭＡＥ薬物部分は、ＫＢ細胞の非常に強力な
殺傷を示し、ＩＣ５０は０．８ｎＭであったが、非標的化ＸＴＥＮに共役されたＭＭＡＥ
の３つのコピーは、細胞殺傷において少なくとも３つのログ低減をもたらした（ＩＣ５０
＞１，０００ｎＭ）。重要なことに、葉酸塩標的化ドメインの３つのコピーを、３ｘＭＭ
ＡＥ−ＸＴＥＮ共役体に付加することは、細胞殺傷を回復し、ＩＣ５０は４．２ｎＭであ
り、活性レベルは、遊離ＭＭＡＥに対して観察されたものに近い。等しく重要なことに、
葉酸を競合体として標的化共役体に導入することは、ＫＢ細胞系上の３ｘＦＡ（γ）、３
ｘＭＭＡＥ−ＸＴＥＮの観察された細胞殺傷を傷害した。葉酸塩−ＸＴＥＮ薬物共役体の
強力な細胞殺傷からのこの低減（４．２ｎＭ〜１，０００ｎＭ超）は、検出された細胞毒
性が、実験条件下で、ＫＢ細胞系に対する薬物共役体の標的化機構として、葉酸塩の使用
によって促進されたという結論を支持する。
実施例６８：葉酸塩−ＸＴＥＮ−薬物共役体の活性および特異性についてのインビトロ
細胞ベースのスクリーニング
標的葉酸塩−ＸＴＥＮ−薬物共役体を使用して、葉酸塩受容体を担持する細胞を選択的
に標的および殺傷する能力は、インビトロベースのスクリーニングおよび選択性アッセイ
を使用して評価される。
各葉酸塩−ＸＴＥＮ−薬物共役体、その対応する非標的化ＸＴＥＮ−薬物分子、および
それぞれの遊離薬物対照を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ抗増殖アッセイにおいて、葉酸
塩受容体陽性および陰性細胞系の一団に対して試験する。細胞系の選択は、提案された臨
床適用との関連性に基づき、ＫＢ、ＩＧＲＯＶ、ＳＫ−ＯＶ−３、ＨｅＬａ、ＬｏＶｏ、
ＳＷ６２０、Ｍａｄｉｓｏｎ １０９、Ａ５４９、Ａ３７５、ＬＳ−１７４Ｔ、ＨＴ−２
９、４Ｔ１、ＳＫ−ＢＲ−３を含む。培養培地は、高い葉酸含有量を含むため、細胞は成
長し、アッセイは、５〜１０％熱不活性化ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含有する無葉酸培地
中、３７℃、５％ ＣＯ２で行った。熱不活性化ＦＣＳは、葉酸塩受容体を発現する細胞
が生存および増殖するのに十分な内因性レベルの葉酸を含有する。最適な細胞密度および
インキュベーション時間を含む適切なアッセイ条件は、５〜１０％ ＦＣＳを含有する無
葉酸培地中、それぞれの遊離薬物を対照として使用して事前決定する。葉酸塩−ＸＴＥＮ
−薬物共役体は、以下のように試験する。ログ相中の細胞を収集し、計数して、９６ウェ
ルマイクロタイターアッセイプレートのそれぞれに既定の細胞密度でプレートに置く。粘
着性の細胞は、３７℃、５％ ＣＯ２で終夜のインキュベーションによって、プレートに
付着することが許される。葉酸塩−ＸＴＥＮ−薬物共役体および対応する対照は、用量範
囲内で重複で導入し、プレートをさらに２〜５日間インキュベートする。代替として、葉
酸塩−ＸＴＥＮ−薬物共役体および対応する対照で２〜６時間、細胞をパルスし、洗浄し
、新鮮な培地を導入し、さらに４８〜７２時間インキュベートするのを許すことができる
。適切なインキュベーション期間後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ試薬を各ウェルに添加
し、軌道攪拌器上で２分間混合する。次いで、プレートを９０ｇで遠心分離し、室温でさ
らに１０分間インキュベートして、蛍光シグナルを安定化する。次いで、蛍光シグナルを
照度計上で読み取り、ＩＣ５０（半最大阻害性濃度）を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ
または相当するソフトウェアで計算する。ＩＣ５０の定量的比較は、葉酸塩受容体陽性細
胞系対陰性細胞系に対する細胞成長阻害および選択性の化合物活性のランク付けを可能に
する。
これらの結果は、葉酸塩−ＸＴＥＮ−薬物共役体が、葉酸塩受容体陰性細胞上ではなく
、葉酸塩受容体陽性細胞上で高度に選択的な強力な殺傷を示すという所見を支持すること
が予想される。これは、遊離薬物部分とは異なり、それによって葉酸塩受容体陽性細胞系
と陰性細胞系との間に細胞毒性の差は予想されない。ＸＴＥＮ−薬物対照は、不良な細胞
毒性活性を生じることが予想される。 対照に対して好ましい活性および細胞系選択性
を持つ葉酸塩−ＸＴＥＮ−薬物共役体は、アッセイにおいて遊離競合葉酸の付加によって
葉酸塩受容体の関連についてさらに検証され、障害された葉酸塩−ＸＴＥＮ−薬物細胞毒
性を実証する。
実施例６９：ＬＨＲＨ−ＸＴＥＮ−薬物共役体の活性および特異性についてのインビト
ロ細胞ベースのスクリーニング
標的ＬＨＲＨ−ＸＴＥＮ−薬物共役体を使用して、ＬＨＲＨ受容体を担持する細胞を選
択的に標的および殺傷する能力は、インビトロベースのスクリーニングおよび選択性アッ
セイを使用して評価される。各ＬＨＲＨ−ＸＴＥＮ−薬物共役体、その対応する非標的化
ＸＴＥＮ−薬物分子、およびそれぞれの遊離薬物対照を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ抗
増殖アッセイにおいて、ＬＨＲＨ受容体陽性および陰性細胞系の一団に対して試験する。
細胞系の選択は、提案された臨床適用との関連性に基づき、ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−
２３１、ＨＣＣ１８０６、ＨＣＣ１９３７、ＯＶ−１０６３、ＥＦＯ−２１、ＥＦＯ−２
７、ＮＩＨ：ＯＶＣＡＲ−３、ＢＧ−１、ＨＥＣ−１Ａ、ＨＥＣ−１Ｂ、Ｉｓｈｉｋａｗ
ａ、ＫＬＥ、ＡＮ−３−ＣＡ、ＭｉａＰａＣａ、Ｐａｎｃ−１、ラットＤｕｎｎｉｎｇ
Ｒ−３３２７−Ｈ、ＰＣ−８２、ＭＤＡ−ＰＣａ−２ｂ、Ｃ４−２（ＬＮＣａＰの誘導体
）、Ａ５４９、Ａ２７８０、ＵＣＩ−１０７、ＳＫ−ＯＶ−３、ＳＷ ６２６、ＭＦＥ−
２９６を含む。最適な細胞密度およびインキュベーション時間を含む適切なアッセイ条件
は、それぞれの遊離薬物を対照として使用して事前決定する。ＬＨＲＨ−ＸＴＥＮ−薬物
共役体は、以下のように試験する。ログ相中の細胞を収集し、計数して、９６ウェルマイ
クロタイターアッセイプレートに既定の細胞密度でプレートに置く。粘着性の細胞は、３
７℃、５％ ＣＯ２で終夜のインキュベーションによって、プレートに付着することが許
される。ＬＨＲＨ−ＸＴＥＮ−薬物共役体および対応する対照は、用量範囲内で重複で導
入し、プレートをさらに２〜５日間インキュベートする。適切なインキュベーション期間
後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ試薬を各ウェルに添加し、軌道攪拌器上で２分間混合す
る。次いで、プレートを９０ｘｇで遠心分離し、室温でさらに１０分間インキュベートし
て、蛍光シグナルを安定化する。次いで、蛍光シグナルを照度計上で読み取り、ＩＣ５０
（半最大阻害性濃度）を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍまたは相当するソフトウェアで
計算する。ＩＣ５０の定量的比較は、ＬＨＲＨ受容体陽性細胞系対陰性細胞系に対する細
胞成長阻害および選択性の化合物活性のランク付けを可能にする。
これらの結果は、ＬＨＲＨ−ＸＴＥＮ−薬物共役体が、ＬＨＲＨ受容体陰性細胞上では
なく、ＬＨＲＨ受容体陽性細胞上で高度に選択的な強力な殺傷を示すという所見を支持す
ることが予想される。これは、遊離薬物部分とは異なり、それによってＬＨＲＨ受容体陽
性細胞系と陰性細胞系との間に細胞毒性の差は予想されない。ＸＴＥＮ−薬物対照は、不
良な細胞毒性活性を生じることが予想される。対照に対して好ましい活性および細胞系選
択性を持つＬＨＲＨ−ＸＴＥＮ−薬物共役体は、アッセイにおいて遊離競合葉酸の付加に
よってＬＨＲＨ受容体の関連についてさらに検証され、障害されたＬＨＲＨ−ＸＴＥＮ−
薬物細胞毒性を実証する。
実施例６９：ＬＨＲＨ−ＸＴＥＮ−薬物共役体のインビトロ血清安定性
安定性の測定として、ＬＨＲＨ−ＸＴＥＮ−薬物共役体を、独立して、健常なヒト、カ
ニクイザル、および齧歯類血漿中、３７℃で最大２週間インキュベートし、一定間隔でア
リコートを除去し、分析まで−８０℃で貯蔵する。ＬＨＲＨ−ＸＴＥＮ−薬物共役体の安
定性を、遊離薬物の量、またはＬＨＲＨ−ＸＴＥＮ−薬物共役体の経時的な完全性のいず
れかによって評価することができる。遊離薬物は、ＲＰ−ＨＰＬＣおよび／またはＬＣ−
ＭＳ／ＭＳで定量化されるが、無傷のＬＨＲＨ−ＸＴＥＮ−薬物共役体の量は、ＸＴＥＮ
／薬物および／またはＬＨＲＨ／薬物ＥＬＩＳＡによって決定される。ＲＰ−ＨＰＬＣ分
析の場合、血漿試料を、アセトニトリルまたはアセトン等の有機溶媒で処理し、タンパク
質を沈殿させる。可溶性分画を真空下で蒸発させ、負荷溶液中に再溶解し、ＲＰ−ＨＰＬ
Ｃによって分析する。検体は、特定の薬物に特異的な波長での紫外線吸収によって検出さ
れる。例えば、ドキソルビシンは、４８０ｎｍで検出される。較正標準は、既知の量の遊
離薬物を対応する血漿型に添加することによって調製され、実験試料と並行して処理され
る。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析の場合、血漿試料を、アセトニトリルまたはアセトン等の有機
溶媒で処理し、タンパク質を沈殿させる。可溶性分画を真空下で蒸発させ、負荷溶液中に
再溶解し、ＲＰ−ＨＰＬＣによって分析する。検体は、三連四重極型質量分析計によって
インライン検出され、定量化される。親イオン−娘イオン対は、各薬物に対して実験的に
決定される。較正標準は、既知の量の遊離薬物を対応する血漿型に添加することによって
調製され、実験試料と並行して処理される。定量的ＥＬＩＳＡの場合、ＥＬＩＳＡ中のＬ
ＨＲＨ−ＸＴＥＮ−薬物共役体に最適な濃度の抗体は、十字交差連続希釈分析を使用して
決定される。共役体の１つの成分を認識する適切な捕捉抗体は、４℃で終夜のインキュベ
ーションによって、９６ウェルマイクロタイタープレートの上にコーティングされる。ウ
ェルをブロックして洗浄し、血清安定性試料を、それぞれ異なる希釈でウェルに添加し、
コーティングされた抗体によるＬＨＲＨ−ＸＴＥＮ−薬物共役体の最適な捕捉を可能にす
る。洗浄後、共役体の別の成分を認識する検出抗体を添加し、プレート上に捕捉された共
役体への結合を可能にする。次いで、ウェルを再度洗浄した後、ストレプトアビジン−ホ
ースラディッシュペルオキシダーゼ（検出抗体のビオチニル化異形に相補的）または二次
抗体−ホースラディッシュペルオキシダーゼ（検出抗体の非ビオチニル化異形に相補的）
を添加する。適切なインキュベーションおよび最終洗浄ステップ後、テトラメチルベンジ
ジン（ＴＭＢ）基質を添加し、プレートを４５０ｎＭで読み取る。次いで、無傷共役体の
濃度を、各時点に対し、測色反応を関連血漿型のＬＨＲＨ−ＸＴＥＮ−薬物で調製された
較正曲線と比較することによって計算する。次いで、ヒト、カニクイザル、およびマウス
血清中の共役体のｔ１／２を、ログ濃度対時間の線形回帰分析を使用して定義する。
実施例７０：葉酸塩−ＸＴＥＮ−薬物共役体のインビトロ血清安定性
安定性の測定として、葉酸塩−ＸＴＥＮ−薬物共役体を、独立して、健常なヒト、カニ
クイザル、および齧歯類血漿中、３７℃で最大２週間インキュベートし、一定間隔でアリ
コートを除去し、分析まで−８０℃で貯蔵する。葉酸塩−ＸＴＥＮ−薬物共役体の安定性
を、遊離薬物の量、または葉酸塩−ＸＴＥＮ−薬物共役体の経時的な完全性のいずれかに
よって評価することができる。遊離薬物の存在は、上記の関連セクションに記載される、
ＨＰＬＣ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳおよび／または抗増殖アッセイで定量化される。無傷の葉酸
塩−ＸＴＥＮ−薬物共役体の量は、ＸＴＥＮ／薬物および／または葉酸塩／薬物ＥＬＩＳ
Ａによって決定される。ＲＰ−ＨＰＬＣ分析の場合、血漿試料を、アセトニトリルまたは
アセトン等の有機溶媒で処理し、タンパク質を沈殿させる。可溶性分画を真空下で蒸発さ
せ、負荷溶液中に再溶解し、ＲＰ−ＨＰＬＣによって分析する。検体は、特定の薬物に特
異的な波長での紫外線吸収によって検出される。例えば、ドキソルビシンは、４８０ｎｍ
で検出される。較正標準は、既知の量の遊離薬物を対応する血漿型に添加することによっ
て調製され、実験試料と並行して処理される。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析の場合、血漿試料を
、アセトニトリルまたはアセトン等の有機溶媒で処理し、タンパク質を沈殿させる。可溶
性分画を真空下で蒸発させ、負荷溶液中に再溶解し、ＲＰ−ＨＰＬＣによって分析する。
検体は、三連四重極型質量分析計によってインライン検出され、定量化される。親イオン
−娘イオン対は、各薬物に対して実験的に決定される。較正標準は、既知の量の遊離薬物
を対応する血漿型に添加することによって調製され、実験試料と並行して処理される。脱
共役遊離薬物の存在の検出方法として抗増殖アッセイを使用するとき、葉酸塩受容体陽性
または陰性細胞系を用いることができる。受容体陽性細胞系において評価を行うときは、
葉酸阻害剤を添加し、受容体陰性細胞系において行うときは不要である。いずれかの受容
体細胞型において、脱共役遊離薬物の濃度を増加させることは、細胞毒性の増加に寄与す
る。定量的ＥＬＩＳＡの場合、ＥＬＩＳＡ中の葉酸塩−ＸＴＥＮ−薬物共役体に最適な濃
度の抗体は、十字交差連続希釈分析を使用して決定される。共役体の一成分を認識する適
切な捕捉抗体を、４℃で終夜のインキュベーションによって、９６ウェルマイクロタイタ
ープレートの上にコーティングする。ウェルをブロックして洗浄し、血清安定性試料を、
それぞれ異なる希釈でウェルに添加し、コーティングされた抗体による葉酸塩−ＸＴＥＮ
−薬物共役体の最適な捕捉を可能にする。洗浄後、共役体の別の成分を認識する検出抗体
を添加し、プレート上に捕捉された共役体への結合を可能にする。次いで、ウェルを再度
洗浄した後、ストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ（検出抗体のビ
オチニル化異形に相補的）または二次抗体−ホースラディッシュペルオキシダーゼ（検出
抗体の非ビオチニル化異形に相補的）を添加する。適切なインキュベーションおよび最終
洗浄ステップ後、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質を添加し、プレートを４５０ｎ
Ｍで読み取る。次いで、無傷共役体の濃度を、各時点に対し、測色反応を関連血漿型の葉
酸塩−ＸＴＥＮ−薬物で調製された較正曲線と比較することによって計算する。次いで、
ヒト、カニクイザル、およびマウス血清中の共役体のｔ１／２を、ログ濃度対時間の線形
回帰分析を使用して定義する。
実施例７１：ＬＨＲＨ−ＸＴＥＮ−Ｃｙ５．５共役体のインビボおよびエクスビボ撮像
Ｃｙ５．５蛍光タグ付加ＬＨＲＨ−ＸＴＥＮ分子を代理として使用し、ＬＨＲＨ−ＸＴ
ＥＮ−薬物共役体の標的化および生体内分布効率を調査する。インビボに続いてエクスビ
ボで、ＩＶＩＳ ５０光学撮像システム（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
，Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，ＭＡ）を用いる蛍光撮像を使用し、ＬＨＲＨ受容体陽性腫瘍細胞
の皮下成長異種移植片を担持するヌードマウスにおいて実験を行う。つまり、ＬＨＲＨ受
容体陽性腫瘍細胞を担持する雌ｎｕ／ｎｕマウスに、高用量または低用量のＬＨＲＨ−Ｘ
ＴＥＮ−Ｃｙ５．５、および対応する用量の非標的化Ｃｙ５．５タグ付加ＸＴＥＮ対照の
単一静脈注射を付与する。注射前、次いで注射後約８、２４、４８、および７２時間に、
生きた麻酔下動物上で、ＩＶＩＳ ５０光学撮像システムを使用して全身走査を得る。７
２時間の最後の時点で動物全体の蛍光の分布を測定した後、腫瘍、ならびに肝臓、肺、心
臓、脾臓、および腎臓を含む健常な器官を切除し、それらの蛍光を撮像システムによって
登録および処理する。蛍光剤の波長を一致させるように、Ｃｙ５．５励起（６１５〜６６
５ｎｍ）および放出（６９５〜７７０ｎｍ）フィルターを選択する。ＣＣＤチップの小／
中ビニングを使用し、画像において各マウスの観察可能なシグナルから少なくとも数千カ
ウントを得るように、およびＣＣＤチップの飽和を避けるように、露出時間を最適化する
。定量化のための画像を正規化するために、Ｃｙ５．５スペクトル領域に対して背景励起
および放出フィルターを使用し、背景蛍光画像を得る。蛍光の強度は、異なる色によって
表され、青色は最低強度を反映し、赤色は最高強度を示す。
実施例７２：葉酸塩−ＸＴＥＮ−Ｃｙ５．５共役体のインビボおよびエクスビボ撮像
Ｃｙ５．５蛍光タグ付加葉酸塩−ＸＴＥＮ分子を代理として使用し、葉酸塩−ＸＴＥＮ
−薬物共役体の標的化および生体内分布効率を調査する。インビボに続いてエクスビボで
、ＩＶＩＳ ５０光学撮像システム（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈ
ｏｐｋｉｎｔｏｎ，ＭＡ）を用いる蛍光撮像を使用し、葉酸塩受容体陽性腫瘍細胞の皮下
成長異種移植片を担持するヌードマウスにおいて実験を行う。培養培地は、高い葉酸塩含
有量を含むため、これらのマウスに移植される葉酸塩受容体陽性腫瘍細胞は、抗生物質を
持たない５〜１０％熱不活性化ＦＣＳを含有する無葉酸塩細胞培養培地中で成長される。
同様に、通常の齧歯類食餌は、高濃度の葉酸を含有するため、この研究に使用されるヌー
ドマウスは、血清葉酸塩濃度を低減するように、腫瘍移植前の２週間、および撮像分析期
間の間、葉酸塩を含まない食餌で維持される。葉酸塩受容体陽性腫瘍細胞を担持する雌ｎ
ｕ／ｎｕマウスに、高用量または低用量の葉酸塩−ＸＴＥＮ−Ｃｙ５．５、および対応す
る用量の非標的化Ｃｙ５．５タグ付加ＸＴＥＮ対照の単一静脈注射を付与する。注射前、
次いで注射後約８、２４、４８、および７２時間に、生きた麻酔下動物上で、ＩＶＩＳ
５０光学撮像システムを使用して全身走査を得る。７２時間の最後の時点で動物全体の蛍
光の分布を測定した後、腫瘍、ならびに肝臓、肺、心臓、脾臓、および腎臓を含む健常な
器官を切除し、それらの蛍光を撮像システムによって登録および処理する。蛍光剤の波長
を一致させるように、Ｃｙ５．５励起（６１５〜６６５ｎｍ）および放出（６９５〜７７
０ｎｍ）フィルターを選択する。ＣＣＤチップの小／中ビニングを使用し、画像において
各マウスの観察可能なシグナルから少なくとも数千カウントを得るように、およびＣＣＤ
チップの飽和を避けるように、露出時間を最適化する。定量化のための画像を正規化する
ために、Ｃｙ５．５スペクトル領域に対して背景励起および放出フィルターを使用し、背
景蛍光画像を得る。蛍光の強度は、異なる色によって表され、青色は最低強度を反映し、
赤色は最高強度を示す。
実施例７３：ＬＨＲＨ−ＸＴＥＮ−薬物共役体の薬物動態分析
ＬＨＲＨ−ＸＴＥＮ−薬物構築体のインビボ薬物動態を、タンパク質組成物の標準方法
を使用して評価する。薬物動態は、複数の種において評価されるが、マウス、ラット、カ
ニクイザル、およびイヌは、ヒト薬物動態を予測することにおける共通使用に起因して好
適である。ＬＨＲＨ−ＸＴＥＮ−薬物構築体の組成物は、インビボ投与に相当する水性緩
衝液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水、トリス緩衝生理食塩水、またはＨｅｐｅｓ緩衝生
理食塩水）中に提供される。組成物を適切な用量で、複数の経路を介して、最も好ましく
は静脈内または皮下経路を介して投与する。血液試料を、０．０８〜５０４時間の範囲の
適切な時点で採取し、血漿中に処理する。次いで、血漿試料を、ＥＬＩＳＡ、ＨＰＬＣ、
および／またはＬＣ−ＭＳ／ＭＳを含む多様な方法のうちの１つによって、ＬＨＲＨ−Ｘ
ＴＥＮ−薬物共役体の濃度について分析する。ＥＬＩＳＡ分析は、ＬＨＲＨ−ＸＴＥＮ−
薬物共役体の２つの成分、例えば、ＸＴＥＮ／ＬＨＲＨ、ＸＴＥＮ／薬物部分、ＬＨＲＨ
／薬物部分、および／またはＸＴＥＮ／ＸＴＥＮの組合せを認識することができるサンド
ウィッチＥＬＩＳＡ形式を使用して行う。典型的に、ＬＨＲＨ−ＸＴＥＮ−薬物共役体の
１つの成分を認識する抗体は、９６ウェルマイクロタイタープレートのウェル上にコーテ
ィングされる。ウェルをブロックして洗浄し、次いで、血清安定性試料を、それぞれ異な
る希釈でウェルに添加し、コーティングされた抗体による共役体の捕捉を可能にする。次
いで、ウェルを広く洗浄し、結合されたタンパク質を、第２のＬＨＲＨ−ＸＴＥＮ−薬物
共役成分に対するビオチニル化抗体または適切な二次抗体のいずれかを使用して検出する
。次いで、ウェルを再度洗浄した後、ストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキ
シダーゼ（ビオチニル化検出抗体に相補的）または二次抗体−ホースラディッシュペルオ
キシダーゼ（非ビオチニル化検出抗体に相補的）を添加する。適切なインキュベーション
および最終洗浄ステップ後、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質を添加し、プレート
を４５０ｎＭで読み取る。次いで、共役体の濃度を、各時点に対し、測色反応をＬＨＲＨ
−ＸＴＥＮ−薬物較正曲線と比較することによって計算する。薬物動態パラメータを、Ｗ
ｉｎＮｏｎＬｉｎソフトウェアパッケージを使用して計算する。ＲＰ−ＨＰＬＣ分析の場
合、血漿試料を、アセトニトリルまたはアセトン等の有機溶媒で処理し、タンパク質を沈
殿させる。可溶性分画を真空下で蒸発させ、負荷溶液中に再溶解し、ＲＰ−ＨＰＬＣによ
って分析する。検体は、特定の薬物に特異的な波長での紫外線吸収によって検出される。
例えば、ドキソルビシンは、４８０ｎｍで検出される。較正標準は、既知の量の遊離薬物
を対応する血漿型に添加することによって調製され、実験試料と並行して処理される。Ｌ
Ｃ−ＭＳ／ＭＳ分析の場合、血漿試料を、アセトニトリルまたはアセトン等の有機溶媒で
処理し、タンパク質を沈殿させる。可溶性分画を真空下で蒸発させ、負荷溶液中に再溶解
し、ＲＰ−ＨＰＬＣによって分析する。検体は、三連四重極型質量分析計によってインラ
イン検出され、定量化される。親イオン−娘イオン対は、各薬物に対して実験的に決定さ
れる。較正標準は、既知の量の遊離薬物を対応する血漿型に添加することによって調製さ
れ、実験試料と並行して処理される。これらの結果は、ＬＨＲＨおよび薬物部分へのＸＴ
ＥＮの添加が、終末相半減期を著しく増加させ、ＸＴＥＮに結合されていない薬物部分を
標的化する薬物動態特性を強化するという所見を支持することが予想される。これは、順
に、そのような共役体の、より頻繁でない、より便利な投与計画になる。
実施例７４：葉酸塩−ＸＴＥＮ−薬物共役体の薬物動態分析
葉酸塩−ＸＴＥＮ−薬物構築体のインビボ薬物動態を、タンパク質組成物の標準方法を
使用して評価する。薬物動態は、複数の種において評価されるが、マウス、ラット、カニ
クイザル、およびイヌは、ヒト薬物動態を予測することにおける共通使用に起因して好適
である。通常の餌は、高濃度の葉酸を含有するため（例えば、６ｍｇ／ｋｇマウス食餌）
、葉酸塩共役体の薬物動態研究に使用される動物は、研究開始前の２週間、および研究期
間の間、葉酸塩を含まない食餌で維持される。葉酸塩−ＸＴＥＮ−薬物構築体の組成物は
、インビボ投与に適合する水性緩衝液（例えば、リン酸塩緩衝生理食塩水、トリス緩衝生
理食塩水、またはＨｅｐｅｓ緩衝生理食塩水）中に提供される。組成物を適切な用量で、
複数の経路を介して、最も好ましくは静脈内または皮下経路を介して投与する。血液試料
を、０．０８〜５０４時間の範囲の適切な時点で採取し、血漿中に処理する。次いで、血
漿試料を、ＥＬＩＳＡ、ＨＰＬＣ、および／またはＬＣ−ＭＳ／ＭＳを含む多様な方法の
うちの１つによって、葉酸塩−ＸＴＥＮ−薬物共役体の濃度について分析する。ＥＬＩＳ
Ａ分析は、葉酸塩−ＸＴＥＮ−薬物共役体の２つの成分、例えば、ＸＴＥＮ／葉酸塩、Ｘ
ＴＥＮ／薬物部分、葉酸塩／薬物部分、および／またはＸＴＥＮ／ＸＴＥＮの組合せを認
識することができるサンドウィッチＥＬＩＳＡ形式を使用して行う。典型的に、葉酸塩−
ＸＴＥＮ−薬物共役体の１つの成分を認識する抗体は、９６ウェルマイクロタイタープレ
ートのウェル上にコーティングされる。ウェルをブロックして洗浄し、次いで、血清安定
性試料を異なる希釈でウェルに添加し、コーティングされた抗体による共役体の捕捉を可
能にする。次いで、ウェルを広く洗浄し、結合されたタンパク質を、第２のＬＨＲＨ−Ｘ
ＴＥＮ−薬物共役成分に対するビオチニル化抗体または適切な二次抗体のいずれかを使用
して検出する。次いで、ウェルを再度洗浄した後、ストレプトアビジン−ホースラディッ
シュペルオキシダーゼ（ビオチニル化検出抗体に相補的）または二次抗体−ホースラディ
ッシュペルオキシダーゼ（非ビオチニル化検出抗体に相補的）を添加する。適切なインキ
ュベーションおよび最終洗浄ステップ後、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質を添加
し、プレートを４５０ｎＭで読み取る。次いで、共役体の濃度を、各時点に対し、測色反
応を葉酸塩−ＸＴＥＮ−薬物較正曲線と比較することによって計算する。薬物動態パラメ
ータを、ＷｉｎＮｏｎＬｉｎソフトウェアパッケージを使用して計算する。ＲＰ−ＨＰＬ
Ｃ分析の場合、血漿試料を、アセトニトリルまたはアセトン等の有機溶媒で処理し、タン
パク質を沈殿させる。可溶性分画を真空下で蒸発させ、負荷溶液中に再溶解し、ＲＰ−Ｈ
ＰＬＣによって分析する。検体は、特定の薬物に特異的な波長での紫外線吸収によって検
出される。例えば、ドキソルビシンは、４８０ｎｍで検出される。較正標準は、既知の量
の遊離薬物を対応する血漿型に添加することによって調製され、実験試料と並行して処理
される。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析の場合、血漿試料を、アセトニトリルまたはアセトン等の
有機溶媒で処理し、タンパク質を沈殿させる。可溶性分画を真空下で蒸発させ、負荷溶液
中に再溶解し、ＲＰ−ＨＰＬＣによって分析する。検体は、三連四重極型質量分析計によ
ってインライン検出され、定量化される。親イオン−娘イオン対は、各薬物に対して実験
的に決定される。較正標準は、既知の量の遊離薬物を対応する血漿型に添加することによ
って調製され、実験試料と並行して処理される。これらの結果は、葉酸塩および薬物部分
へのＸＴＥＮの添加が、終末相半減期を著しく増加させ、ＸＴＥＮに結合されていない薬
物部分を標的化する薬物動態特性を強化するという所見を支持することが予想される。こ
れは、順に、そのような共役体の、より頻繁でない、より便利な投与計画になる。
実施例７５：ＬＨＲＨ−ＸＴＥＮ−薬物共役体のインビボ有効性および毒性分析
ＬＨＲＨ−ＸＴＥＮ−薬物共役体は、ＬＨＲＨ受容体陽性腫瘍細胞に対する非常に強力
な毒素の標的送達のために意図される。そのようにして、ＬＨＲＨ−ＸＴＥＮ−薬物構築
体のインビボ薬物動態活性を、ヌードマウスに移植されたヒト腫瘍細胞発現ＬＨＲＨ受容
体を使用して評価することができる。有効性研究を開始する前に、ヌードマウスにおける
初期評価を実行し、ＬＨＲＨ−ＸＴＥＮ−薬物候補の最大耐用量（ＭＴＤ）を確立する。
次いで、研究期間の間に動物によって耐容される最高用量であるＭＴＤを使用して、標準
異種移植モデルにおける有効性および毒性研究の用量範囲を計算する。つまり、ＭＴＤ実
験を１群当たり５匹のマウスを用いて実行し、様々な用量レベル、間隔、および期間でＬ
ＨＲＨ−ＸＴＥＮ−薬物共役体の静脈内投与を評価する。必要とされる開始ＭＴＤ用量お
よび用量群の数は、科学的文献、標的化ＬＨＲＨ部分に関する知識、共役される薬物部分
の性質、密接に関連する化合物の毒素学的特性、および初期薬物動態研究からのデータに
基づく（上記参照）。体重の低減、食餌および水の消費、ならびに立毛、円背、行動パタ
ーン、呼吸パターン、振戦、けいれん、衰弱、および自傷の兆候等の標準ＭＴＤパラメー
タを、毎日監視する。許容されない毒性を引き起こさないＬＨＲＨ−ＸＴＥＮ−薬物の最
高用量は、ＭＴＤとして指定される。 腫瘍異種移植研究は、３〜４投与レベルのＬＨＲ
Ｈ−ＸＴＥＮ−薬物共役体を含み、ＭＴＤ研究の結果に依存し、他のパラメータは、選択
された腫瘍細胞系に依存する。実施例６９は、異種移植研究において使用することができ
る腫瘍系の例を記載する。したがって、関連ヒト腫瘍系からの適切な数のＬＨＲＨ受容体
陽性細胞を皮下注射し、腫瘍を形成させて、そのサイズをキャリパーで測定し、容量を０
．５ｘＬｘＷ２として計算し、式中、Ｌは、最長軸の測定値（ミリメートル）であり、Ｗ
はＬに垂直な軸の測定値（ミリメートル）である。所望のサイズ範囲の腫瘍体積を含むマ
ウスを８〜１０匹の動物群にランダム化することに続いて、媒体対照、遊離薬物対照、お
よびＬＨＲＨ−ＸＴＥＮ−薬物共役体を、選択された用量および間隔で静脈内投与する。
腫瘍成長の停止または後退は、腫瘍サイズおよび体積を、選択された時点でキャリパーを
用いて測定することによって決定される。体重および食物消費を１〜２日毎に測定し、全
体的な毒性を評価する。動物の生存を毎日監視する。研究の終了時に、全ての動物を犠牲
死させ、主要臓器に関して臨床病理および組織病理を行う。標的細胞毒素は、悪性細胞の
選択的排除に対して最も有望な戦略の一つである。これらの結果は、ＬＨＲＨ−ＸＴＥＮ
−薬物共役体が、強力な有効性および低い全身毒性によって提示されるように、優れた治
療指数を生じるという所見を支持することが予想される。対照的に、等モル用量で投与さ
れた非ＬＨＲＨ標的遊離薬物は、あまり強力ではないばかりか、さらに高度に毒性である
。媒体対照は、未制御の腫瘍成長および深刻な毒性を示すことが予想される。
実施例７６： 葉酸塩−ＸＴＥＮ−薬物共役体のインビボ有効性および毒性分析
葉酸塩−ＸＴＥＮ−薬物共役体は、葉酸塩受容体陽性腫瘍細胞に対する非常に強力な毒
素の標的送達のために意図される。そのように、葉酸塩−ＸＴＥＮ−薬物構築体のインビ
ボ薬物動態活性を、ヌードマウス上のヒト腫瘍細胞発現葉酸塩受容体異種移植片を使用し
て評価する。有効性研究を開始する前に、ヌードマウスにおける初期評価を実行し、葉酸
塩−ＸＴＥＮ−薬物候補の最大耐用量（ＭＴＤ）を確立する。次いで、研究期間の間に動
物によって耐容される最高用量であるＭＴＤを使用して、標準異種移植モデルにおける有
効性および毒性研究の用量範囲を計算する。通常の齧歯類食餌は、高濃度の葉酸を含有す
るため（６ｍｇ／ｋｇ食餌）、これらの研究に使用されるマウスは、研究開始前の２週間
、および研究期間の間、葉酸塩を含まない食餌で維持される。ＭＴＤ実験を１群当たり５
匹のマウスを用いて実行し、様々な用量レベル、間隔、および期間で葉酸塩−ＸＴＥＮ−
薬物共役体の静脈内投与を評価する。必要とされる開始ＭＴＤ用量および用量群の数は、
科学的文献、標的化葉酸塩部分に関する知識、共役される薬物部分の性質、密接に関連す
る化合物の毒素学的特性、および初期薬物動態研究からのデータに基づく（上記参照）。
体重の低減、食餌および水の消費、ならびに立毛、円背、行動パターン、呼吸パターン、
振戦、けいれん、衰弱、および自傷の兆候等の標準ＭＴＤパラメータを、毎日監視する。
許容されない毒性を引き起こさない葉酸塩−ＸＴＥＮ−薬物の最高用量は、ＭＴＤとして
指定される。腫瘍異種移植研究は、３〜４投与レベルの葉酸塩−ＸＴＥＮ−薬物共役体を
含み、ＭＴＤの結果に依存し、他のパラメータは、選択された腫瘍細胞系に依存する。実
施例６９は、異種移植研究において使用することができる腫瘍系の例を記載する。葉酸塩
含有量を低減するために、ヌードマウス上に移植される葉酸塩受容体陽性腫瘍細胞は、抗
生物質を持たない５〜１０％熱不活性化ウシ胎仔血清を含有する無葉酸塩細胞培養培地中
で成長される。同様に、血清葉酸濃度を低減するために、異種移植研究に使用されるマウ
スは、研究開始前の２週間、および研究期間の間、葉酸塩を含まない食餌で維持される。
関連系からの適切な数の葉酸塩受容体陽性細胞を皮下注射し、腫瘍を形成させて、そのサ
イズをキャリパーで測定し、容量を０．５ｘＬｘＷ２として計算し、式中、Ｌは、最長軸
の測定値（ミリメートル）であり、ＷはＬに垂直な軸の測定値（ミリメートル）である。
所望のサイズ範囲の腫瘍体積を含むマウスを８〜１０匹の動物群にランダム化することに
続いて、媒体対照、遊離薬物対照、および葉酸塩−ＸＴＥＮ−薬物を、選択された用量お
よび間隔で静脈内投与する。腫瘍成長の停止または後退は、腫瘍サイズおよび体積を、選
択された時点でキャリパーを用いて測定することによって決定される。体重および食物消
費を１〜２日毎に測定し、全体的な毒性を評価する。動物の生存を毎日監視する。研究の
終了時に、全ての動物を犠牲死させ、主要臓器に関して臨床病理および組織病理を行う。
標的細胞毒素は、悪性細胞の選択的排除に対して最も有望な戦略の一つである。標的化学
療法葉酸塩−ＸＴＥＮ−薬物共役体は、葉酸塩受容体陽性腫瘍上の遊離細胞毒性薬物単独
よりも有効であり、毒性が低いことが予想される。
実施例７６： ＬＨＲＨ−ＸＴＥＮ−薬物共役体の臨床適用
標的化学療法は、全身化学療法の有効性を高め、副作用を低減することを目的とする近
代的手法である。ホジキンリンパ腫および全身性未分化大細胞リンパ腫に対して認可され
たブレンツキシマブ ベドチン（Ｂｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ（Ａｄｃｅｎ
ｔｒｉｓ））は、有効な毒素標的療法の主な例である。ＬＨＲＨは、生殖器官において機
能するペプチドである。その受容体は、特に、ある腫瘍上に集中するが、ほとんどの正常
組織中では発現しないため、ＬＨＲＨ受容体は、悪性腫瘍の選択的崩壊のための理想的な
標的である。実際に、乳癌の約５２％、卵巣癌および子宮内膜癌の約８０％、および前立
腺癌の約８５％は、ＬＨＲＨ受容体を介して標的可能である。注目すべきは、ＬＨＲＨ依
存性治療は、三重陰性乳房腫瘍に対して特に有用であり、エストロゲンもしくはプロゲス
テロン受容体またはＨＥＲ２を過剰発現しないため、多くの使用可能な標的薬物での処置
に適していない。進行した子宮内膜癌、卵巣癌、または前立腺癌の患者は、これらの悪性
腫瘍が、再発しやすい、および／または現行の処置に対して耐性であり得るため、特に不
良な転帰を有することが多い。これを支持して、ＡＥＺＳ−１０８、ＬＨＲＨの標的ドキ
ソルビシン類似体を用いた臨床研究は、これらの癌種のそれぞれが、ＬＨＲＨを用いた治
療の影響を受け易いことを示す。葉酸塩の１つ以上のコピーを担持するＸＴＥＮを３つ以
上の薬物分子を担持するＸＴＥＮに融合し、標的ペプチド−薬物共役体を創製することは
、治療指数および半減期を大幅に改善することが予想され、これがＭＴＤをはるかに下回
るレベルでの投薬を可能にし、投与頻度および費用を低減する（用量当たりに必要な薬物
を低減する）。
ＬＨＲＨ−ＸＴＥＮ−薬物組成物の臨床評価を、進行した乳癌、子宮内膜癌、卵巣癌、
および前立腺または膀胱癌に苦しむ患者において行う。臨床試験は、ＬＨＲＨ−ＸＴＥＮ
−薬物共役体がヒトにおいて検証され得るように設計される。患者におけるそのような研
究は、３つの相を含む。最初に、第Ｉ相の安全性および薬物動態研究を行い、最大耐用量
（ＭＴＤ）を決定し、ヒトにおける用量限定毒性、薬物動態、および予備薬力学を特徴付
ける。これらの初期研究は、転移性または切除不可能な癌を持ち、標準の治癒的または緩
和的手段を使用することができないか、またはそれらがもはや有効でない、もしくは耐容
されない患者において行う。治療の有効性を強化するために、ＬＨＲＨ受容体陽性状態を
登録条件とし、原発腫瘍または転移性標本の免疫組織化学、および／またはＬＨＲＨ標的
分子造影剤によって決定される。第Ｉ相研究のスキームは、単一上昇用量のＬＨＲＨ−Ｘ
ＴＥＮ−薬物共役体を使用すること、および生化学、ＰＫ、および臨床パラメータを測定
することである。これは、ＭＴＤの決定を可能にし、後次の第ＩＩ相および第ＩＩＩ相治
験において使用される治療ウィンドウを構築する、投与量および循環薬物の閾値および最
大濃度を確立する。今後の研究において追跡される潜在的な毒性および有害事象も定義す
る。
ヒト患者の第ＩＩ相臨床研究は、独立して、ＬＨＲＨ受容体陽性の進行（ステージ３も
しくは４）または再発した乳癌、子宮内膜癌、卵巣癌、および前立腺癌または膀胱癌患者
において行われる。この治験は、ＬＨＲＨ−ＸＴＥＮ−薬物共役体単独、および特定の適
応において用いられる現在の化学療法との組合せでの有効性および安全性を評価する。患
者は、静脈内投与されたＬＨＲＨ−ＸＴＥＮ−薬物臨床候補を、第Ｉ相において事前に決
定された用量レベルおよび計画で、標準化学療法薬の有無にかかわらず受容する。化学療
法薬およびプラシーボからなる対照アームが含まれる。一次エンドポイントは、固形癌の
治療効果判定のためのガイドライン（ＲＥＣＩＳＴ）によって定義される反応速度である
。二次エンドポイントとしては、安全性および耐用性、無増悪期間、および全生存が挙げ
られる。
第ＩＩＩ相の有効性および安全性研究は、第ＩＩ相臨床観察に応じて、ＬＨＲＨ受容体
陽性の進行した（耐性、再発）乳癌、子宮内膜癌、卵巣癌、および前立腺または膀胱癌患
者における第ＩＩ相治験設計を複製または修飾するように構成される。患者登録条件の洗
練、さらなる患者の層別化（例えば、ＬＨＲＨ受容体発現レベル）、投与量、計画、標準
化学療法薬の状態等をさらに調整することができる。一次エンドポイントは、ＬＨＲＨ受
容体陽性として定義された患者において、ＲＥＣＩＳＴによって測定される無増悪生存で
ある。この治験は、二次エンドポイントとしての全生存について統計的に検出力があり、
４００人超の患者における登録が予想される。有害事象、重篤な有害事象、および死亡の
発生率を評価する。
ＬＨＲＨ−ＸＴＥＮ−薬物候補は、これらの高度に前処理された患者集団においても心
毒性なしに抗癌活性を実証することが予想される。
実施例７６： 葉酸塩−ＸＴＥＮ−薬物共役体の臨床適用
標的化学療法は、全身化学療法の有効性を高め、副作用を低減することを目的とする近
代的手法である。ホジキンリンパ腫および全身性未分化大細胞リンパ腫に対して認可され
たブレンツキシマブ ベドチン（Ｂｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ（Ａｄｃｅｎ
ｔｒｉｓ））は、有効な毒素標的療法の主な例である。葉酸としても知られる葉酸塩、ビ
タミンＢ９は、ある生物学的経路における共因子として、ヌクレオチド生合成および機能
のために全ての生細胞が必要とする重要な栄養素である。急速な細胞分裂および成長を補
助することにおいて特に重要である。そのように、葉酸塩受容体は、急速に分裂する悪性
腫瘍、特に卵巣癌および非小細胞肺癌を処置するための治療開発の焦点である。いくつか
の卵巣腫瘍型は、手術および白金を用いた化学療法の初期成功後に発生する可能性があり
、その再生は、使用可能な治療に耐性となり得る。葉酸塩受容体の発現は、正常な卵巣に
おいてごくわずかであるが、上皮卵巣癌の約９０％は、多くの肺腺癌と同様に、葉酸塩受
容体を過剰発現し、それによって、行われる治療の可能性を開く。これを支持して、ＥＣ
−１４５、葉酸塩の標的ビンカアルカロイド類似体を用いた臨床研究は、白金耐性卵巣癌
および非小細胞肺癌が、葉酸塩を用いた治療の影響を受け易いことを示す。葉酸塩の１つ
以上のコピーを担持するＸＴＥＮを３つ以上の薬物分子を担持するＸＴＥＮに融合し、標
的ペプチド−薬物共役体を創製することは、治療指数および半減期を大幅に改善すること
が予想され、これが最大耐用量（ＭＴＤ）をはるかに下回るレベルでの投薬を可能にし、
投与頻度および費用を低減する（用量当たりに必要な薬物を低減する）。
葉酸塩−ＸＴＥＮ−薬物組成物の臨床評価は、再発または難治性進行腫瘍を持つ患者、
または他の化学療法に失敗した白金耐性卵巣癌および非小細胞肺癌に苦しむ患者において
行う。臨床試験は、葉酸塩−ＸＴＥＮ−薬物共役体がヒトにおいて検証され得るように設
計される。患者におけるそのような研究は、３つの相を含む。最初に、第Ｉ相の安全性お
よび薬物動態研究を行い、ＭＴＤを決定し、ヒトにおける用量限定毒性、薬物動態、およ
び予備薬力学を特徴付ける。これらの初期研究は、再発または難治性の進行腫瘍を有し、
標準の治癒的または緩和的手段を使用することができないか、またはそれらがもはや有効
でない、もしくは耐容されない葉酸塩受容体陽性状態を持つ患者において行う。治療の有
効性を強化するために、葉酸塩受容体陽性状態を登録条件とし、原発腫瘍または転移性標
本の免疫組織化学、および／または葉酸塩標的分子造影剤によって決定される。第Ｉ相研
究のスキームは、単一上昇用量の葉酸塩−ＸＴＥＮ−薬物共役体を使用すること、および
生化学、ＰＫ、および臨床パラメータを測定することである。これは、ＭＴＤの決定を可
能にし、後次の第ＩＩ相および第ＩＩＩ相治験において使用される治療ウィンドウを構築
する、投与量および循環薬物の閾値および最大濃度を確立する。今後の研究において追跡
される潜在的毒性および有害事象も定義する。
ヒト患者の第ＩＩ相臨床研究は、独立して、葉酸塩受容体陽性の白金耐性卵巣癌患者集
団、多数の化学療法に失敗した非小細胞肺癌患者、および再発または難治性の進行腫瘍に
苦しむ患者において行われる。この治験は、葉酸塩−ＸＴＥＮ−薬物共役体単独、および
特定の適応において用いられる現在の化学療法との組合せでの有効性および安全性を評価
する。患者は、静脈内投与された葉酸塩−ＸＴＥＮ−薬物共役体を、第Ｉ相において事前
に決定された用量レベルおよび計画で、標準化学療法薬の有無にかかわらず受容する。化
学療法薬およびプラシーボからなる対照アームが含まれる。一次エンドポイントは、固形
癌の治療効果判定のためのガイドライン（ＲＥＣＩＳＴ）によって定義される反応速度で
ある。二次エンドポイントとしては、安全性および耐用性、無増悪期間、および全生存が
挙げられる。
第ＩＩＩ相の有効性および安全性研究は、第ＩＩ相臨床観察に応じて、葉酸塩受容体陽
性の白金耐性卵巣癌患者、非小細胞肺癌患者、および進行した腫瘍再発または難治性患者
＜／ｃ０＞における第ＩＩ相治験設計を複製または修飾するように構成される。患者登録
条件の洗練、さらなる患者の層別化（例えば、葉酸塩受容体発現レベル）、投与量、計画
、標準化学療法薬の状態等をさらに調整する。一次エンドポイントは、葉酸塩受容体陽性
として定義された患者において、ＲＥＣＩＳＴによって測定される無増悪生存である。こ
の治験は、二次エンドポイントとしての全生存について統計的に検出力があり、４００人
超の患者における登録が予想される。有害事象、重篤な有害事象、および死亡の発生率も
評価する。
葉酸塩−ＸＴＥＮ−薬物候補は、これらの高度に前処理された患者集団においても深刻
な毒性なしに抗癌活性を実証することが予想される。

Claims (1)

  1. 図面に記載の発明。
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