CN107496932A - Xten缀合组合物和制造其的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及延伸重组多肽(XTEN)组合物、包含XTEN和连接到适用于与药理活性的有效负载缀合的交联剂的XTEN的缀合组合物、制造高度纯化的XTEN的方法、制造XTEN‑接头和XTEN‑有效负载缀合物的方法，以及使用XTEN‑交联剂和XTEN‑有效负载组合物的方法。

Description

XTEN缀合组合物和制造其的方法
本申请是2013年02月27日提交的发明名称为“XTEN缀合组 合物和制造其的方法”的第201380020791.8号(国际申请号 PCT/US2013/028116)中国专利申请的分案申请。
相关申请的交叉引用
本申请要求2012年2月27日提交的美国临时申请序号61/634,312、2012 年6月18日提交的美国临时申请序号61/690,187和2012年10月4日提交的 美国临时申请序号61/709,942的优先权益，这些申请以引用的方式并入本文 中。
发明背景
延长治疗剂(不管是治疗性蛋白质、肽还是小分子)的半衰期常常需要对治 疗剂本身进行专门的配制或修饰。常规的修饰方法，如聚乙二醇化、向治疗 剂中添加抗体片段或白蛋白分子，具有许多明显的缺点。虽然这些经修饰的 形式可以大规模地制备，但这些常规方法一般受到高的商品成本、复杂的制 造工艺和最终产物的低纯度所困扰。时常难以(如果不是不可能的话)纯化到目 标实体的同质性。对于聚乙二醇化来说尤其如此，聚乙二醇化的反应本身无 法精确地受控制以产生带有相同数目或质量的聚乙二醇的经聚乙二醇化的试 剂的同质群体。此外，这些经聚乙二醇化的试剂的代谢物可以具有严重的副 作用。举例来说，已经观测到经聚乙二醇化的蛋白质在动物模型中引起肾小 管空泡形成(Bendele,A.,Seely,J.,Richey,C.,Sennello,G.和Shopp,G.Sho rt communication:renal tubular vacuolation in animals treated with polyethy lene-glycol-conjugated proteins.Toxicol.Sci.1998.42,152-157)。肾清除的经 聚乙二醇化的蛋白质或其代谢物可以在肾中积聚，导致PEG水合物的形成， PEG水合物干扰正常的肾小球滤过。另外，动物和人类可以经过诱导来制造 针对PEG的抗体(Sroda,K.等人Repeatedinjections of PEG-PE liposomes g enerate anti-PEGantibodies.Cell.Mol.Biol.Lett.2005.10,37-47)。
因此，对适用于在合理的成本下生产具有延长的半衰期特性的治疗剂的 高纯度形式的替代性组合物和方法仍有相当大的需要。
发明概要
本发明解决了这一需要并且提供了相关优势。本文所公开的组合物和方 法不仅适用作治疗剂，而且特别适用作候选治疗剂的临床前和临床开发的研 究工具。在一些方面，本发明一部分是通过产生延伸重组多肽(XTEN)试剂来 解决这一需要，这些试剂可以使用一个或几个简单的步骤纯化到同质，和/或 可以使用多种多样的缀合方法与具有反应基团的有效负载肽、蛋白质和小分 子进行化学缀合。XTEN试剂的使用产生XTEN连接的试剂的高产率产物， 其与未经缀合的产物相比在一个或多个方面是优良的，包括高同质性、高溶解度、长稳定性和提高的终末半衰期。
本发明一部分是关于新颖组合物，其包含基本上同质的延伸重组多肽 (XTEN)，这些XTEN适用作连接到一个或多个有效负载药理活性剂或生物活 性剂的缀合伴侣，从而得到XTEN-有效负载组合物。在一个方面，本发明提 供了经过工程改造以直接或经由交联剂共价连接到一个或多个有效负载的 XTEN，从而得到XTEN-有效负载组合物，这种组合物包含一种、两种、三 种或更多种类型的有效负载的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8 个、9个或10个或更多个分子。本发明的一个目的在于提供这些经工程改造 的XTEN多肽，用来与所关注的有效负载剂形成缀合物，作为具有增强的医 药学特性(包括增强的药物动力学特性)的组合物。本发明提供了在长度和序列 上基本上同质的XTEN，其适用于制备包含连接到一个或多个有效负载的 XTEN的缀合物，以使所得XTEN-有效负载缀合物具有高纯度。高纯度的这 些缀合物适用于制备用于患有医学病状的受试者的医药组合物，对此，一个 或多个有效负载具有预防、治疗或改善这种病状的效用。
在第一个方面，本发明提供了基本上同质的XTEN多肽组合物，其适用 作缀合伴侣以形成XTEN-交联剂中间物和XTEN-有效负载组合物。在一些实 施方案中，本发明提供了多肽的基本上同质的群体，其包含延伸重组多肽 (XTEN)，并且其中所述群体中至少90％、91％、92％、93％、94％或95％的 个别多肽分子具有相同的序列长度。在前述的一个实施方案中，XTEN的特 征在于：总XTEN氨基酸残基是至少36个至约3000个氨基酸残基；甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)残基的总和 占XTEN的总氨基酸残基的约90％以上；XTEN序列是基本上非重复的，以 使得(i)XTEN序列不含有相同的三个连续氨基酸，除非这些氨基酸是丝氨酸， (ii)至少约80％、或约90％、或约95％的XTEN序列由非重叠的序列基序组成， 这些序列基序中的每一者包含约9个至约14个氨基酸残基，其中任何两个相 连氨基酸残基在这些序列基序中的每一者中不会出现两次以上；或(iii)XTEN 序列具有小于10的子序列计分；如通过GOR算法所测定，XTEN序列具有 大于90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或大于99％的 无规卷曲形成率；如通过Chou-Fasman算法所测定，XTEN序列具有小于2％、 或3％、或4％、或5％的α螺旋；XTEN序列具有小于2％、或3％、或4％、 或5％的β折叠；并且当通过TEPITOPE算法进行分析时，XTEN序列缺乏预 测的T细胞表位，其中对于XTEN序列内的表位的TEPITOPE算法预测是基 于-8、或-9、或-10的计分。在前述的另一个实施方案中，XTEN包含与选自 由表2、表3、表4和表22-25中所阐述的序列组成的组的序列具有至少约90％、 或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、 或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％、或100％的 序列同一性的序列。
在其它实施方案中，基本上同质的XTEN多肽组合物包含一个或多个亲 和标签。在一个实施方案中，本发明提供了基本上同质的XTEN多肽组合物， 其包含第一亲和标签，其中这个第一亲和标签对选自由疏水相互作用色谱(HI C)底物、阳离子交换底物、阴离子交换底物、固定化金属离子亲和色谱(IMA C)底物和固定化抗体底物组成的组的色谱底物具有结合亲和力。在前述的一 个实施方案中，第一亲和标签与选自由表7中所阐述的序列组成的组的序列 具有至少约90％、91％、92％、93％、94％或至少约95％的序列同一性。在前述XTEN和亲和标签的另一个实施方案中，组合物进一步包含一个或多个辅 助序列。在一个实施方案中，辅助序列包含与选自由表10中所阐述的序列组 成的组的序列具有至少约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约9 3％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少 约98％、或至少约99％、或100％的序列同一性的序列。在另一个实施方案 中，辅助序列选自由以下组成的组：KNPEQAEEQX1EET，其中X1独立地 是S或R；ANPEQAEEQX1EET，其中X1独立地是S或R；KNPEQAEEQA EEQX1EET，其中X1独立地是S或R；KX2X3EQAEEQAEEQX1EET，其中 X1独立地是S或R，X2独立地是K或N，并且X3独立地是K、N、T、Q、 H、P、E、D、A、R或S；KX2(X3)10QX1EET，其中X1独立地是S或R， X2独立地是K或N，并且X3独立地是K、N、T、Q、H、P、E、D、A、R 或S；KX2(X3)7AEEQX1EET，其中X1独立地是S或R，X2独立地是K或 N，并且X3独立地是K、N、T、Q、H、P、E、D、A、R或S；KX2X3EQ E(X3)3AEEQREET，其中X2独立地是K或N，并且X3独立地是K、N、T、 Q、H、P、E、D、A、R或S；KX2X3EQE(X3)3AEE(X3)5，其中X2独立地 是K或N，并且X3独立地是K、N、T、Q、H、P、E、D、A、R或S；KK QEQEKEQAEEQ(X4X5)2REET，其中X4独立地是A或S，并且X5独立地 是K、Q或E；KKQEQEKEQAEEQ(X4X5)4REET，其中X4独立地是A或S， 并且X5独立地是K、Q或E；KKQEQEKEQAEEQ(Z)4REET，其中Z是任何 天然存在的L-氨基酸；KX2(X3)n，其中n是10到40的整数，并且X2独立 地是K或N，并且X3独立地是K、N、T、Q、H、P、E、D、A、R或S；(X 3)n，其中n是10到50的整数，并且X3独立地是K、N、T、Q、H、P、E、 D、A、R或S；KX2QEQEKEQAEEQ(X4X5)nX1EET，其中n是0或1到10 的整数，并且X1独立地是S或R，X2独立地是K或N，X4独立地是A或 S，并且X5独立地是K、Q或E；KX2(X3)n(X4X5)mX1EET，其中n是5到2 0的整数，m是0或1到10的整数，X1独立地是S或R，X2独立地是K或 N，X3独立地是K、N、T、Q、H、P、E、D、A、R或S，X4独立地是A 或S，并且X5独立地是K、Q或E；以及KX2(X3)n(Z)mX1EET，其中n是5 到20的整数，m是0或1到10的整数，X1独立地是S或R，X2独立地是 K或N，X3独立地是K、N、T、Q、H、P、E、D、A、R或S，并且Z是任 何天然存在的L-氨基酸，以及当最佳比对时与前述序列显示至少80％、90％、 95％、98％或99％的序列同一性的任何序列同源物。
在前述基本上同质的XTEN、亲和标签和辅助序列组合物的其它实施方 案中，组合物进一步包含第一裂解序列。必要时，裂解序列选自由表8和表 9中所阐述的序列组成的组。在前述的一个实施方案中，组合物具有式I的构 型：
(HS)-(AT1)-(CS1)-(XTEN) I
其中HS是辅助序列；AT1是第一亲和标签；CS1是第一裂解序列；并 且XTEN是延伸重组多肽。在前述组合物的另一个实施方案中，组合物进一 步包含第二裂解序列。必要时，第一裂解序列和第二裂解序列能够用相同的 蛋白酶裂解，并且其中组合物具有式II的构型：
(HS)-(CS1)-(XTEN)-(CS2)-(AT1) II
其中HS是辅助序列；AT1是第一亲和标签；CS1是第一裂解序列；CS2 是第二裂解序列；并且XTEN是延伸重组多肽。在前述组合物的另一个实施 方案中，第一亲和标签包含序列RPRPRPRPRPRPR、HHHHHH，或本领域中 已知或本文所公开的任何亲和标签。
在基本上同质的XTEN组合物的其它实施方案中，组合物包含第一亲和 标签和第二亲和标签、第一裂解序列和第二裂解序列，以及辅助序列，其中 第二亲和标签不同于第一亲和标签并且对与第一亲和标签的色谱底物不同的 色谱底物具有结合亲和力，其中这个色谱底物选自由HIC底物、阳离子交换 底物、阴离子交换底物、IMAC底物和固定化抗体底物组成的组，并且其中 第一裂解序列和第二裂解序列能够用相同的蛋白酶裂解，并且其中第二亲和 标签与选自由表7中所阐述的序列组成的组的序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％或至少约95％的序列同一性。在前述组合物的一个实施方案 中，组合物具有式III的构型：
(HS)-(AT1)-(CS1)-(XTEN)-(CS2)-(AT2) III
其中HS是辅助序列；AT1是第一亲和标签；CS1是第一裂解序列；CS2 是第二裂解序列；XTEN是延伸重组多肽；并且AT2是第二亲和标签。在前 述组合物的另一个实施方案中，第一亲和标签包含序列RPRPRPRPRPRPR并 且第二亲和标签包含序列HHHHHH。在前述组合物的另一个实施方案中，第 一亲和标签包含序列HHHHHH并且第二亲和标签包含序列RPRPRPRPRPRP R。在前述组合物的另一个实施方案中，第一亲和标签包含序列RPRPRPRPRPRPRPRPRPRPRPR并且第二亲和标签包含序列HHHHHHHH。
在另一个方面，本发明提供了包含多肽的基本上同质的群体的组合物， 其是通过一种工艺获得。在一些实施方案中，组合物是通过包括以下的工艺 来获得：在一定条件下于发酵反应物中培养包含编码多肽的载体的宿主细胞， 这些条件通过宿主细胞的粗表达产物有效地表达多肽，其中经编码的多肽包 含XTEN、第一裂解序列和第一亲和标签；在一定条件下使粗表达产物的多 肽吸附到第一色谱底物上，这些条件有效地将第一亲和标签捕获到第一色谱 底物上；洗脱多肽；以及回收多肽。在一些实施方案中，所得群体的至少90％、 91％、92％、93％、94％或95％的多肽具有相同的序列长度。在前述组合物的 一个实施方案中，第一色谱底物选自由HIC底物、阳离子交换底物、阴离子 交换底物和IMAC底物组成的组。在前述组合物的另一个实施方案中，亲和 标签选自由表7的亲和标签组成的组。在前述组合物的另一个实施方案中， 第一色谱底物是阳离子交换底物并且第一亲和标签包含序列RPRPRPRPRPR PR。在前述组合物的另一个实施方案中，第一色谱底物是IMAC底物并且第 一亲和标签包含序列HHHHHHHH。在前述组合物的一个实施方案中，编码 载体编码本文所描述的XTEN实施方案中的任一者，其包含至少亲和标签、 至少第一裂解序列、辅助序列和任选的第二裂解序列。在前述组合物的另一 个实施方案中，载体进一步编码第二裂解序列和第二亲和标签，其中第一裂 解序列和第二裂解序列能够用相同的蛋白酶裂解，并且其中第二亲和标签相 较第一亲和标签对第二、不同的色谱底物具有结合亲和力，并且其中组合物 是通过进一步包括以下的工艺来获得：在一定条件下使多肽吸附到第二色谱 底物上，这些条件有效地将第二亲和标签捕获到第二色谱底物上；洗脱多肽； 以及回收多肽，其中这个群体的至少90％、91％、92％、93％、94％或95％的 多肽具有相同的序列长度。在前述的一个实施方案中，第一色谱底物不同于 第二色谱底物，并且第一色谱底物和第二色谱底物中的每一者独立地选自由 HIC底物、阳离子交换底物、阴离子交换底物和IMAC底物组成的组。在前 述组合物的另一个实施方案中，第一色谱底物是阳离子交换底物并且第一亲和标签包含序列RPRPRPRPRPRPR或RPRPRPRPRPRPRPRPRPRPRPR，并 且第二色谱底物是IMAC底物并且第一亲和标签包含序列HHHHHHHH或H HHHHHHH。在前述组合物的另一个实施方案中，第一色谱底物是IMAC底 物并且第一亲和标签包含序列HHHHHHHH或HHHHHHHH，并且第二色谱 底物是阳离子交换底物并且第一亲和标签包含序列RPRPRPRPRPRPR或RPRPRPRPRPRPRPRPRPRPRPR。在另一个实施方案中，包含第一亲和标签或 第一亲和标签和第二亲和标签的前述组合物是通过以下来进一步加工：在有 效地使裂解序列裂解的条件下用蛋白酶处理组合物，由此从亲和标签中释放 XTEN；在有效地捕获XTEN而不是亲和标签或蛋白酶的条件下使XTEN吸 附到色谱底物上；洗脱XTEN；以及回收XTEN。所得组合物中至少90％、9 1％、92％、93％、94％或95％的个别XTEN分子具有相同的序列长度。在前 述组合物的一个实施方案中，裂解序列能够用选自由表9的蛋白酶组成的组 的蛋白酶裂解。在前述组合物的另一个实施方案中，裂解序列能够用胰蛋白 酶裂解并且蛋白酶是胰蛋白酶。在前述组合物的另一个实施方案中，色谱底 物是阴离子交换底物。阴离子交换底物可以选自由macrocap Q、capto Q、s uperQ-650M和poros D组成的组的底物。或者，包含一个亲和标签或两个亲 和标签的前述组合物是通过以下来进一步加工：在有效地使裂解序列裂解的 条件下处理组合物，由此从一个或两个亲和标签中释放XTEN；在有效地捕 获蛋白酶和亲和标签而不是XTEN的条件下使蛋白酶吸附到色谱底物上；以 及从洗脱物中回收XTEN。在一些实施方案中，所得洗脱物的至少90％、91％、 92％、93％、94％或95％的个别XTEN分子具有相同的序列长度。在前述组 合物的一个实施方案中，裂解序列能够用选自由表9的蛋白酶组成的组的蛋 白酶裂解。在前述组合物的另一个实施方案中，裂解序列能够用胰蛋白酶裂解并且所利用的蛋白酶是胰蛋白酶。色谱底物可以选自阳离子交换底物、HI C底物或IMAC底物中的一者或多者。
在另一个方面，本发明一部分是关于多肽组合物，其可以被裂解成同等 长度和序列的XTEN区段。在一个实施方案中，本发明提供了一种包含XTEN 序列的组合物，其中XTEN序列进一步包含一个或多个能够用胰蛋白酶裂解 的裂解序列，并且其中在有效地使所有裂解序列裂解的条件下用胰蛋白酶处 理得到XTEN片段的制剂，其中每个XTEN片段与这个制剂中所有其它的片 段具有至少约99％的序列同一性。在组合物的一个实施方案中，裂解序列与 序列SASRSA或SASKSA具有至少86％的序列同一性或与序列SASRSA或 SASKSA相同。在组合物的另一个实施方案中，裂解序列包含序列RX或KX， 其中X是除了脯氨酸以外的任何L-氨基酸。在前述组合物的一个实施方案中， XTEN组合物与选自表6中所阐述的序列的组的序列具有至少约90％、91％、 92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。
在另一个方面，本发明一部分是关于产生基本上同等长度和序列的 XTEN片段的方法。在一个实施方案中，本发明提供了一种产生XTEN的基 本上同质的群体的方法，这种方法包括在有效地使所有裂解序列裂解的条件 下用胰蛋白酶处理包含选自表6中所阐述的序列的组的序列的多肽的群体， 从而得到基本上同质的XTEN群体，其中XTEN片段的至少90％、91％、92％、 93％、94％或95％的个别分子具有相同的序列长度。在前述方法的一个实施 方案中，这种方法进一步包括在有效地捕获XTEN片段而不是蛋白酶的条件 下使XTEN片段吸附到色谱底物上；洗脱XTEN片段；以及回收XTEN片段， 其中这个群体的至少90％、91％、92％、93％、94％或95％的个别分子具有相 同的序列长度。在前述方法的一个实施方案中，色谱底物是阴离子交换底物。 底物可以选自由macrocap Q、capto Q、superQ-650M和poros D组成的组。 在前述方法的另一个实施方案中，XTEN与选自表6中所阐述的序列的组的 序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或 99％的序列同一性。在前述方法的另一个实施方案中，所得XTEN片段与选 自表2或3中所阐述的序列的组的序列具有至少约90％、91％、92％、93％、 94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在另一个实施方案中， 本发明提供了XTEN组合物，其是通过前述方法的实施方案的工艺来制造。
在另一个方面，本发明一部分是关于以高表达产率从宿主细胞中产生 XTEN的方法。在一些实施方案中，本发明提供了一种方法，其包括在一定 条件下于发酵反应物中培养包含编码包含XTEN和辅助序列的多肽的载体的 宿主细胞，这些条件有效地以大于约2克/升(g/L)、或约3g/L、或约4g/L、 或约5g/L、或约6g/L、或约7g/L的所述多肽的浓度表达多肽作为粗表达产 物的组分。在前述方法的一个实施方案中，当发酵反应物在600nm的波长下 达到至少100、或至少130、或至少150的光密度时，实现前述表达产率。在 另一个实施方案中，本发明提供了一种方法，其包括在一定条件下于发酵反 应物中培养包含编码包含XTEN和辅助序列的多肽的载体的宿主细胞，这些 条件有效地以大于约10毫克/克宿主细胞干重(mg/g)、或至少约15mg/g、或 至少约20mg/g、或至少约25mg/g、或至少约30mg/g、或至少约40mg/g、 或至少约50mg/g的所述多肽的浓度表达多肽作为粗表达产物的组分。在前述方法的一个实施方案中，当发酵反应物在600nm的波长下达到至少100、 或至少130、或至少150的光密度时，实现前述高产率表达。在另一个实施 方案中，本发明提供了一种方法，其包括在一定条件下于发酵反应物中培养 包含编码包含XTEN和辅助序列的多肽的载体的宿主细胞，这些条件有效地 以大于约10毫克/克宿主细胞干重(mg/g)、或至少约250微摩尔/升、或约300 微摩尔/升、或约350微摩尔/升、或约400微摩尔/升、或约450微摩尔/升、或约500微摩尔/升的所述多肽的浓度表达多肽作为粗表达产物的组分。在前 述方法的一个实施方案中，当发酵反应物在600nm的波长下达到至少100、 或至少130、或至少150的光密度时，实现前述表达产率。在前述方法的一 个实施方案中，经表达的多肽的辅助序列是在这个多肽的N端，其中这个辅 助序列与选自由表10中所阐述的序列组成的组的序列具有至少约90％、91％、 92％、93％、94％或95％的序列同一性或与选自由表10中所阐述的序列组成 的组的序列相同。在前述方法的另一个实施方案中，表达载体进一步编码第 一亲和标签和介于这个亲和标签与XTEN之间的裂解序列，并且这种方法进 一步包括回收宿主细胞的发酵反应混合物的粗表达产物；在一定条件下使粗 表达产物的多肽吸附到第一色谱底物上，这些条件有效地将多肽的第一亲和 标签捕获到这个色谱底物上，其中第一色谱底物选自由HIC底物、阳离子交 换底物、阴离子交换底物和IMAC底物组成的组；洗脱并回收多肽，其中至 少90％、91％、92％、93％、94％或95％的多肽具有相同的序列长度。在前述 方法的另一个实施方案中，表达载体进一步编码第一亲和标签和不同于第一 标签的第二亲和标签以及介于每个亲和标签与XTEN之间的裂解序列，并且 这种方法进一步包括回收宿主细胞的发酵反应混合物的粗表达产物；在一定 条件下使多肽吸附到第一色谱底物上，这些条件有效地将多肽的第一亲和标 签捕获到这个色谱底物上，其中第一色谱底物选自由HIC底物、阳离子交换 底物、阴离子交换底物和IMAC底物组成的组；洗脱多肽；在一定条件下使 多肽吸附到第二色谱底物上，这些条件有效地将多肽的第二亲和标签捕获到 这个色谱底物上，其中第二色谱底物选自由HIC底物、阳离子交换底物、阴 离子交换底物和IMAC底物组成的组；洗脱多肽；以及回收多肽，其中至少 90％、91％、92％、93％、94％或95％的多肽具有相同的序列长度。在前述方 法的一个实施方案中，这些方法进一步包括在有效地使裂解序列裂解的条件 下用蛋白酶处理多肽，由此从多肽中释放XTEN；在有效地捕获XTEN的条 件下使XTEN吸附到阴离子色谱底物上；洗脱XTEN；以及回收XTEN，其 中至少90％、或至少91％、或至少92％、或至少93％、或至少94％、或至少 95％的个别XTEN分子具有相同的序列长度。在前述方法中，阴离子交换底 物可以选自由macrocap Q、capto Q、superQ-650M和poros D组成的组。在 前述方法的一个实施方案中，裂解序列能够用胰蛋白酶裂解并且蛋白酶是胰 蛋白酶。在前述方法的另一个实施方案中，这种方法进一步包括在有效地使 裂解序列裂解的条件下用蛋白酶处理多肽，由此从多肽中释放XTEN；在有 效地捕获蛋白酶和亲和标签而不是XTEN的条件下使蛋白酶吸附到色谱底物 上；以及回收洗脱物中的XTEN，其中至少90％、91％、92％、93％、94％或 95％的XTEN具有相同的序列长度。在前述方法的一个实施方案中，裂解序 列能够用胰蛋白酶裂解并且所利用的蛋白酶是胰蛋白酶。在用以捕获蛋白酶 和亲和标签的前述方法中，色谱底物可以选自HIC底物、阳离子交换底物和 IMAC底物中的一者或多者。
在另一个方面，本发明一部分是关于一种固体支撑物，其包含固定在上 面的基本上相同的XTEN多肽分子的群体。在一个实施方案中，本发明提供 了一种固体支撑物，其包含固定在上面的基本上相同的多肽分子的群体，其 中固体支撑物包含色谱底物、各自包含XTEN、第一亲和标签和第二亲和标 签的经固定的多肽，其中第一亲和标签是通过在XTEN的N端的裂解序列连 接到XTEN并且第二亲和标签是通过在C端的裂解序列连接到XTEN，并且其中第二亲和标签不同于第一亲和标签，其中色谱底物能够结合到所述第一 亲和标签或所述第二亲和标签而不同时结合两者，并且其中至少90％、91％、 92％、93％、94％或95％的经固定的多肽分子具有相同的序列长度。在一个实 施方案中，XTEN包含与选自由表2、表3、表4和表22-25中所阐述的序列 组成的组的序列具有至少约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约 93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％、或100％的序列同一性的序列，第一亲和标签和 第二亲和标签各自独立地与选自由表7中所阐述的序列组成的组的序列具有 至少约90％、91％、92％、93％、94％或至少约95％的序列同一性，并且裂解 序列选自由表8和表9中所阐述的序列组成的组。在前述的一个实施方案中， 裂解序列与序列SASRSA或SASKSA具有至少约86％的序列同一性或与序列 SASRSA或SASKSA相同。在前述的一个实施方案中，裂解序列包含序列RX或KX，其中X是除了脯氨酸以外的任何L-氨基酸。在前述的一个实施 方案中，固体支撑物选自由HIC色谱树脂、阳离子交换色谱树脂、阴离子交 换色谱树脂和IMAC色谱树脂组成的组。在前述的一个实施方案中，第一亲 和标签包含序列RPRPRPRPRPRPR或RPRPRPRPRPRPRPRPRPRPRPR并且 第二亲和标签包含序列HHHHHH或HHHHHHHH。在前述的另一个实施方 案中，第一亲和标签包含序列HHHHHH或HHHHHHHH并且第二亲和标签 包含序列RPRPRPRPRPRPR或RPRPRPRPRPRPRPRPRPRPRPR。
在另一个方面，本发明一部分是关于缀合到交联剂的XTEN的组合物。 在一些实施方案中，本发明提供了本文所描述的XTEN中的任一者的组合物， XTEN共价连接到至少第一交联剂的一个或多个分子，其中这个交联剂选自 由表13中所阐述的交联剂、表15中所阐述的炔烃反应物和表15中所阐述的 叠氮化物反应物组成的组。在缀合组合物的一个实施方案中，第一交联剂在 选自由以下组成的组的位置处缀合到至少第一XTEN：XTEN的N端氨基酸 残基的α-氨基；XTEN的每个赖氨酸残基的ε-氨基；以及XTEN的每个半胱 氨酸残基的硫醇基。必要时，在这个实施方案中的XTEN与选自表2和表3 中所阐述的序列的组的序列具有至少约90％、或至少约91％、或至少约92％、 或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、 或至少约98％、或至少约99％、或100％的序列同一性。在缀合组合物的另 一个实施方案中，XTEN选自由以下组成的组：AE144、AE288、AE432、AE576、AE864、Seg 174、Seg 175、Seg 176、Seg 177、Seg 186、Seg 187、Seg 188、 Seg 189、Seg190、Seg 191、Seg 192、Seg 193、Seg 194、Seg 195、Seg 196、 Seg 197、Seg 198和Seg199，并且交联剂缀合到XTEN的N端氨基酸的α- 氨基。在缀合组合物的另一个实施方案中，XTEN选自由以下组成的组：表3 中所阐述的Seg 174、Seg 175、Seg 176、Seg 177、Seg 186、Seg 187、Seg 188、 Seg 189、Seg 190、Seg 191、Seg 192、Seg 193、Seg 194、Seg 195、Seg196、 Seg 197、Seg 198和Seg 199，并且交联剂缀合到XTEN的每个半胱氨酸残基 的硫醇基。在缀合组合物的另一个实施方案中，第一交联剂选自由以下组成 的组：N-马来酰亚胺、碘乙酰基、吡啶基二硫化物和乙烯基砜、3-炔丙氧基 丙酸、(氧乙基)n-乙炔(其中n是1-10)、二苯甲基环辛炔(DBCO)、环辛炔(COT)、 3-叠氮-丙酸、6-叠氮-己酸和(氧乙基)n-叠氮化物(其中n是1-10)。在这一段的 前述实施方案中，缀合物具有式IV的构型：
其中就各次出现独立而言：CL1是交联剂；x是1至约100、或1至约50、 或1至约40、或1至约20、或1至约10、或1至约5的整数，或是9，或是 3，或是2，或是1。必要时，在这个实施方案中的XTEN包含与选自表2和 3中所阐述的序列的组的序列具有至少约80％、或至少约90％、或至少约91％、 或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、 或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％、或具有100％的序列同一性 的序列。在式IV的缀合物的一个实施方案中，CL1是选自表13的交联剂。 在XTEN-交联剂缀合组合物的其它实施方案中，组合物进一步包含缀合到每 个第一交联剂的第一有效负载的单原子残基，其中这个残基选自由碳、氮、 氧和硫组成的组。在前述的一个实施方案中，单原子残基的第一有效负载可 以选自由表11、12、18和21中所阐述的有效负载组成的组。在XTEN-交联 剂缀合组合物的其它实施方案中，组合物进一步包含缀合到每个第一交联剂的选自由表11和12中所阐述的有效负载组成的组的有效负载。
在XTEN-交联剂缀合组合物的其它实施方案中，本发明提供了本文所描 述的实施方案的XTEN的组合物，XTEN共价连接到第一交联剂的一个或多 个分子和第二交联剂的一个或多个分子，其中第一交联剂缀合到XTEN的每 个半胱氨酸残基的硫醇基或缀合到XTEN的每个赖氨酸残基的ε-氨基；并且 第二交联剂缀合到XTEN的N端氨基酸的α-氨基，其中每个交联剂独立地选 自由表13中所阐述的交联剂、表15的炔烃反应物和表15的叠氮化物反应物 组成的组。在前述实施方案中，组合物具有式V的构型：
其中就各次出现独立而言；CL1是缀合到XTEN的半胱氨酸残基的第一 交联剂；CL2是在N端缀合到XTEN的第二交联剂；x是1至约10的整数； y是整数1，其限制条件为x+y≥2；并且XTEN是包含x个半胱氨酸残基 数的经半胱氨酸工程改造的XTEN或包含x个赖氨酸残基数的经赖氨酸工程 改造的XTEN。在XTEN-交联剂缀合组合物的另外的实施方案中，组合物进 一步包含缀合到第一交联剂中的每一者的第一有效负载的单原子残基，其中 这个残基选自由碳、氮、氧和硫组成的组，以及缀合到第二交联剂中的每一 者的第二有效负载的单原子残基，其中这个残基选自由碳、氮、氧和硫组成 的组。在前述的一个实施方案中，单原子残基的第一有效负载可以选自由表 11、12、18和21中所阐述的有效负载组成的组，并且单原子残基的第二有效 负载可以独立地选自由表11、12、18和21中所阐述的有效负载组成的组。 在XTEN-交联剂-有效负载残基组合物的一些实施方案中，组合物具有式VI 的构型：
其中就各次出现独立而言：PR1是有效负载的单原子残基，其中这个残基 选自由碳、氮、氧和硫组成的组；CL1是交联剂；x是1至约100、或1至约 50、或1至约40、或1至约20、或1至约10、或1至约5的整数，或是3， 或是2，或是1。必要时，在这个实施方案中的XTEN包含与选自表2和3 中所阐述的序列的组的序列具有至少约80％、或至少约90％、或至少约91％、 或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、 或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％、或具有100％的序列同一性 的序列。在式VI的缀合物的一个实施方案中，有效负载的单原子残基是来自 选自由表11、12、18、19和21中所阐述的有效负载组成的组的有效负载。 在式VI的缀合物的一个实施方案中，CL1是选自表13的交联剂。在式VI的 缀合物的一个实施方案中，每个交联剂连接到XTEN的半胱氨酸的硫。在式 VI的缀合物的另一个实施方案中，每个交联剂连接到XTEN的赖氨酸的ε- 氨基。在式VI的缀合物的另一个实施方案中，x是1并且交联剂连接到XTEN 的N端氨基。在式VI的缀合物的另一个实施方案中，CL1是选自表15的第 一和第二点击化学反应物的反应产物。在另一个实施方案中，本发明提供了 式VI的缀合物的制剂，其中缀合物的制剂的至少约80％、或至少约90％、 或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％ 的XTEN分子具有相同的序列长度。在XTEN-交联剂缀合组合物的其它实施 方案中，组合物进一步包含缀合到第一交联剂中的每一者的第一有效负载， 其中这个有效负载选自由表11、12、18和21中所阐述的有效负载组成的组， 以及缀合到第二交联剂的不同于第一有效负载的第二有效负载，其中第二有 效负载选自由表11、12、18和21中所阐述的有效负载组成的组。在XTEN- 交联剂-有效负载缀合组合物的一个实施方案中，组合物包含缀合到第一交联 剂中的每一者的第一有效负载，其中这个有效负载选自由表21的药物部分组 成的组，以及缀合到第二交联剂的不同于第一有效负载的第二有效负载，其 中第二有效负载选自由表21的靶向部分组成的组。在具有第一有效负载和第 二有效负载的XTEN-交联剂-有效负载缀合组合物的一个实施方案中，单一的 第二有效负载是通过炔烃反应物与叠氮化物反应物的反应而缀合的第二交联 剂连接到XTEN的N端，这些反应物选自由表15的反应物组成的组。在 XTEN-交联剂-有效负载组合物的一些实施方案中，组合物具有式VII的构型：
其中就各次出现独立而言：P1选自由表11、12、18、19和21中所阐述 的有效负载组成的组的有效负载；CL1是交联剂；x是1至约100、或1至约 50、或1至约40、或1至约20、或1至约10、或1至约5的整数，或是9， 或是3，或是2，或是1；并且XTEN是与选自表2和3中所阐述的序列的组 的序列具有至少约80％、或至少约90％、或至少约91％、或至少约92％、或 至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、 或至少约98％、或至少约99％、或具有100％的序列同一性的序列。在式VII 的缀合物的一个实施方案中，CL1是选自表13的交联剂。在式VII的缀合物 的一个实施方案中，每个交联剂连接到XTEN的半胱氨酸的硫。在式VII的 缀合物的另一个实施方案中，每个交联剂连接到XTEN的赖氨酸的ε-氨基。 在式VII的缀合物的另一个实施方案中，x是1并且交联剂连接到XTEN的N 端氨基。在一个实施方案中，式VII的缀合物选自由表21中所阐述的缀合物 组成的组。在式VII的缀合物的另一个实施方案中，CL1是选自表15的第一 和第二点击化学反应物的反应产物。本领域的技术人员应了解，包含使用指 定组分缀合到XTEN-交联剂的有效负载的前述实施方案的组合物代表反应物 的反应产物并且因此不同于反应物的精确组成。在另一个实施方案中，本发 明提供了式VII的缀合物的制剂，其中缀合物的制剂的至少约80％、或至少 约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或 至少约95％的XTEN分子具有相同的序列长度。
在另一个方面，本发明一部分是关于彼此缀合的第一XTEN和第二XTEN 的组合物。在一些实施方案中，缀合组合物包含第一XTEN和第二XTEN， 其中这些XTEN是相同的或是不同的，并且各自独立地与选自表3中所阐述 的序列的组的序列具有至少约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少 约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或 至少约98％、或至少约99％、或100％的序列同一性，并且其中第一XTEN 和第二XTEN是使用炔烃反应物与叠氮化物反应物的反应而形成的交联剂通 过第一XTEN和第二XTEN的N端彼此缀合，这些反应物选自由表15的反 应物组成的组，从而得到二聚XTEN缀合物。在二聚XTEN组合物的一个实 施方案中，第一XTEN中的每一者的至少90％、91％、92％、93％、94％或 95％的个别分子具有相同的序列长度，并且第二XTEN中的每一者的至少90％、91％、92％、93％、94％或95％的个别分子具有相同的序列长度。在二 聚XTEN缀合物的一个实施方案中，第一XTEN与选自由表3中所阐述的Seg 174、Seg 175、Seg 176、Seg177、Seg 186、Seg 187、Seg 188、Seg 189、Seg 190、Seg 191、Seg 192、Seg 193、Seg 194、Seg 195、Seg 196、Seg 197、Seg 198和Seg 199组成的序列的组的序列具有至少约90％、或至少约91％、或至 少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％、或100％的序列同一性，并 且第二XTEN与选自由表3中所阐述的Seg 174、Seg 175、Seg 176、Seg 177、 Seg 186、Seg 187、Seg 188、Seg189、Seg 190、Seg 191、Seg 192、Seg 193、 Seg 194、Seg 195、Seg 196、Seg 197、Seg 198和Seg 199组成的序列的组的 不同序列具有至少约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、 或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％、或100％的序列同一性。在二聚XTEN缀合物的另一个实施 方案中，第一XTEN和第二XTEN是相同的，并且各自与选自表3中所阐述 的序列的组的序列具有至少约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少 约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或 至少约98％、或至少约99％、或100％的序列同一性。在二聚XTEN缀合物 的另一个实施方案中，第一XTEN和第二XTEN是相同的，并且各自与选自 由表3中所阐述的Seg 174、Seg 175、Seg 176、Seg 177、Seg 186、Seg 187、 Seg 188、Seg 189、Seg 190、Seg 191、Seg 192、Seg 193、Seg 194、Seg 195、 Seg 196、Seg 197、Seg 198和Seg 199组成的序列的组的序列具有至少约90％、 或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、 或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％、或100％的 序列同一性。在二聚XTEN缀合物的另一个实施方案中，第一XTEN和第二 XTEN各自包含一个或多个半胱氨酸残基，并且进一步包含缀合到第一XTEN 的每个半胱氨酸残基的第一交联剂和缀合到第二XTEN的每个半胱氨酸残基 的第二交联剂，其中第一交联剂和第二交联剂独立地选自由表13中所阐述的 交联剂组成的组。在二聚XTEN缀合物的另一个实施方案中，第一XTEN和 第二XTEN各自包含一个或多个赖氨酸残基，并且进一步包含缀合到缀合物 的第一XTEN和第二XTEN的每个赖氨酸残基的交联剂，其中这个交联剂选 自由表13中所阐述的交联剂组成的组。在缀合到交联剂的二聚XTEN的另一 个实施方案中，缀合物进一步包含缀合到第一XTEN的每个交联剂的第一有 效负载的单原子残基，其中这个残基选自由碳、氮、氧和硫组成的组，并且 进一步包含缀合到第二XTEN的每个交联剂的第二有效负载的单原子残基， 其中这个残基选自由碳、氮、氧和硫组成的组。在前述实施方案中，单原子 残基的第一有效负载可以选自由表11、12、18和21中所阐述的有效负载组 成的组，并且单原子残基的第二有效负载是不同于第一有效负载的有效负载 并且可以选自由表11、12、18和21中所阐述的有效负载组成的组。在二聚 XTEN-交联剂-有效负载残基组合物的一些实施方案中，组合物具有式X的构 型：
其中就各次出现独立而言：PR1是第一有效负载的单原子残基，其中这个 残基选自由碳、氮、氧和硫组成的组；PR2是第二有效负载的单原子残基，其 中这个残基选自由碳、氮、氧和硫组成的组；CL1是交联剂；x是1至约100、 或1至约50、或1至约40、或1至约20、或1至约10、或1至约5的整数， 或是9，或是3，或是2，或是1；CL2是不同于CL1的交联剂；y是1至约100、或1至约50、或1至约40、或1至约20、或1至约10、或1至约5的 整数，或是9，或是3，或是2，或是1，其限制条件为x+y≥2；2xCL二者 择一地是二价交联剂或选自表15的第一和第二点击化学反应物的反应产物； XTEN1是与选自表2和3中所阐述的序列的组的序列具有至少80％、或至少 约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或 至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％、 或具有100％的序列同一性的多肽；并且XTEN2是与选自表2和3中所阐述 的序列的组的序列具有至少80％、或至少约90％、或至少约91％、或至少约 92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至 少约97％、或至少约98％、或至少约99％、或具有100％的序列同一性的多 肽。在式X的缀合物的一个实施方案中，CL1和CL2各自选自表13中所阐述 的交联剂的组。在式X的缀合物的另一个实施方案中，x是1并且CL1连接 到XTEN的N端氨基。在式X的缀合物的另一个实施方案中，CL1是选自表 15的第一和第二点击化学反应物的反应产物。在式X的缀合物的另一个实施 方案中，C2是选自表15的第一叠氮化物与第二炔烃点击化学反应物的反应产 物。在式X的缀合物的另一个实施方案中，每个CL1连接到XTEN1的半胱氨 酸的硫，并且每个CL2连接到XTEN2的半胱氨酸的硫。在式X的缀合物的另 一个实施方案中，每个CL1连接到XTEN1的赖氨酸的ε-氨基，并且每个CL2连接到XTEN2的赖氨酸的ε-氨基。在式X的缀合物的另一个实施方案中，每 个CL1连接到XTEN1的半胱氨酸的硫，并且每个CL2连接到XTEN2的赖氨 酸的ε-氨基。在式X的缀合物的另一个实施方案中，XTEN1和XTEN2是相同的。在式X的缀合物的另一个实施方案中，XTEN1和XTEN2是不同的。 在另一个实施方案中，本发明提供了式X的缀合物的制剂，其中缀合物的制 剂的至少约80％、或至少约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约 93％、或至少约94％、或至少约95％的XTEN分子具有相同的序列长度。在 缀合到交联剂的二聚XTEN的另一个实施方案中，组合物进一步包含缀合到 第一XTEN的每个交联剂的第一有效负载，其中第一有效负载选自由表11、 12、18和21中所阐述的有效负载组成的组，并且进一步包含不同于第一有 效负载的第二有效负载，其中第二有效负载缀合到第二XEN的每个交联剂， 其中第二有效负载选自由表11、12、18和21中所阐述的有效负载组成的组。 在缀合到交联剂的二聚XTEN的另一个实施方案中，组合物进一步包含缀合 到第一XTEN的每个交联剂的第一有效负载，其中第一有效负载选自由表18或表21中所阐述的靶向部分组成的组，并且进一步包含不同于第一有效负载 的第二有效负载，其中第二有效负载缀合到第二XTEN的每个交联剂，其中 第二有效负载是选自表18或表21中所阐述的毒素的组。在缀合到交联剂以 及第一有效负载和第二有效负载的二聚XTEN的另一个实施方案中，第一 XTEN是表3中所阐述的Seg 176，并且第二XTEN选自由表3中所阐述的 Seg 176和Seg 177组成的组。在二聚XTEN-交联剂-有效负载组合物的一些 实施方案中，组合物具有式XI的构型：
其中就各次出现独立而言：P1是选自表11、12、18、19和21中所阐述 的有效负载的组的第一有效负载；P2是选自表11、12、18、19和21中所阐 述的有效负载的组并且不同于P1的第二有效负载；CL1是交联剂；x是1至 约100、或1至约50、或1至约40、或1至约20、或1至约10、或1至约5 的整数，或是9，或是3，或是2，或是1；CL2是不同于CL1的交联剂；y是 1至约100、或1至约50、或1至约40、或1至约20、或1至约10、或1至 约5的整数，或是9，或是3，或是2，或是1，其限制条件为x+y≥2；2xCL 二者择一地是二价交联剂或选自表15的第一和第二点击化学反应物的反应 产物；XTEN1是与选自表2和3中所阐述的序列的组的序列具有至少80％、 或至少约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、 或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％、 或具有100％的序列同一性的第一基本上同质的XTEN；并且XTEN2是与选 自表2和3中所阐述的序列的组的序列具有至少80％、或至少约90％、或至 少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、 或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％、或具有100％ 的序列同一性的第一基本上同质的XTEN。在式XI的缀合物的一个实施方案 中，CL1和CL2各自选自表13中所阐述的交联剂的组。在式XI的缀合物的 另一个实施方案中，x是1并且CL1连接到XTEN的N端氨基。在式XI的缀 合物的另一个实施方案中，CL1是选自表15的第一和第二点击化学反应物的 反应产物。在式XI的缀合物的另一个实施方案中，C2是选自表15的第一和 第二点击化学反应物的反应产物。在式XI的缀合物的另一个实施方案中，每个CL1连接到XTEN1的半胱氨酸的硫，并且每个CL2连接到XTEN2的半胱 氨酸的硫。在式XI的缀合物的另一个实施方案中，每个CL1连接到XTEN1的赖氨酸的ε-氨基，并且每个CL2连接到XTEN2的赖氨酸的ε-氨基。在式 XI的缀合物的另一个实施方案中，每个CL1连接到XTEN1的半胱氨酸的硫， 并且每个CL2连接到XTEN2的赖氨酸的ε-氨基。在式XI的缀合物的另一个 实施方案中，XTEN1和XTEN2是相同的。在式XI的缀合物的另一个实施方 案中，XTEN1和XTEN2是不同的。在一个实施方案中，式XI的缀合物选自 由表21中所阐述的缀合物组成的组。在另一个实施方案中，本发明提供了式 XI的缀合物的制剂，其中缀合物的制剂的至少约80％、或至少约90％、或至 少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％的 相应的XTEN1和XTEN2分子具有相同的序列长度。
在另一个方面，本发明一部分是关于彼此缀合的第一XTEN和第二XTEN 和第三XTEN的组合物，从而得到三聚缀合组合物。在一些实施方案中，缀 合组合物包含第一XTEN和第二XTEN和第三XTEN，其中这些XTEN可以 是相同的或可以是不同的，并且其中第一XTEN和第二XTEN和第三XTEN 是使用选自由表13或表14中所阐述的三价交联剂组成的组的三价交联剂通 过N端彼此缀合。在三聚缀合物的一个实施方案中，第一XTEN和第二XTEN 和第三XTEN是相同的或是不同的，并且各自与选自表2或表3中所阐述的 序列的组的序列具有至少约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约 93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至 少约98％、或至少约99％、或100％的序列同一性。在三聚缀合物的另一个 实施方案中，第一XTEN和第二XTEN和第三XTEN是相同的或是不同的， 并且第一XTEN中的每一者的至少90％、91％、92％、93％、94％或95％的个 别分子具有相同的序列长度，并且第二XTEN中的每一者的至少90％、91％、 92％、93％、94％或95％的个别分子具有相同的序列长度，并且第三XTEN 中的每一者的至少90％、91％、92％、93％、94％或95％的个别分子具有相同 的序列长度。在三聚缀合物的另一个实施方案中，三价交联剂选自由三(2-马 来酰亚胺基乙基)胺(TMEA)和胺反应性氨基三乙酸三(琥珀酰亚胺酯)(TSAT)组成的组。在三聚缀合物的另一个实施方案中，第一XTEN和第二XTEN和 第三XTEN是相同的，并且各自与选自由表3中所阐述的Seg 174、Seg 175、 Seg 176、Seg 177、Seg 186、Seg187、Seg 188、Seg 189、Seg 190、Seg 191、 Seg 192、Seg 193、Seg 194、Seg 195、Seg 196、Seg 197、Seg 198和Seg 199 组成的组的序列具有至少约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约 93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％、或100％的序列同一性。在三聚缀合物的另一个 实施方案中，第一XTEN和第二XTEN和第三XTEN是相同的，并且各自与 选自由表3中所阐述的Seg 174、Seg175、Seg 176、Seg 177、Seg 186、Seg 187、 Seg 188、Seg 189、Seg 190、Seg 191、Seg 192、Seg 193、Seg 194、Seg 195、 Seg 196、Seg 197、Seg 198和Seg 199组成的组的序列具有至少约90％、或 至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％、或100％的 序列同一性，并且第三XTEN不同于第一XTEN和第二XTEN并且与选自由 表3中所阐述的Seg 174、Seg 175、Seg176、Seg 177、Seg 186、Seg 187、 Seg 188、Seg 189、Seg 190、Seg 191、Seg 192、Seg 193、Seg 194、Seg 195、 Seg 196、Seg 197、Seg 198和Seg 199组成的组的序列具有至少约90％、或 至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、 或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％、或100％的 序列同一性。在三聚缀合物的另一个实施方案中，每个XTEN包含至少第一 半胱氨酸残基，并且缀合物进一步包含缀合到第一XTEN的每个半胱氨酸残 基第一交联剂、缀合到第二XTEN的每个半胱氨酸残基的第二交联剂和缀合 到第三XTEN的每个半胱氨酸残基的第三交联剂，其中交联剂选自由表13 中所阐述的交联剂组成的组。在三聚缀合物的一些实施方案中，组合物具有 式XII的构型：
其中就各次出现独立而言；3xCL是三价交联剂；CL1是缀合到XTEN1的第一交联剂；CL2是缀合到XTEN2的第二交联剂；CL3是缀合到XTEN3的第三交联剂；x是1至约10的整数；y是1至约10的整数；z是1至约10 的整数，其限制条件为x+y+z≥3；XTEN1是第一XTEN；XTEN2是第二 XTEN；并且XTEN3是第三XTEN。在三聚缀合物的另一个实施方案中，缀 合物进一步包含缀合到第一XTEN的每个第一交联剂的第一有效负载的单原 子残基，其中这个残基选自由碳、氮、氧和硫组成的组；缀合到第二XTEN 的每个第二交联剂的第二有效负载的单原子残基，其中这个残基选自由碳、 氮、氧和硫组成的组；以及缀合到第三XTEN的每个第三交联剂的第三有效 负载的单原子残基，其中这个残基选自由碳、氮、氧和硫组成的组。在三聚 缀合组合物的另一个实施方案中，组合物进一步包含缀合到第一XTEN的每 个第一交联剂的第一有效负载，这个第一有效负载选自由表11、12、18和21 中所阐述的有效负载组成的组；缀合到第二XTEN的每个第二交联剂的第二 有效负载，这个第二有效负载选自由表11、12、18和21中所阐述的有效负 载组成的组，其中这个有效负载与第一有效负载是相同的或是不同的；以及 缀合到第三XTEN的每个第三交联剂的第三有效负载，这个第三有效负载选自由表11、12、18和21中所阐述的有效负载组成的组，其中这个有效负载 与第一有效负载或第二有效负载是相同的或是不同的。在三聚XTEN-有效负 载缀合组合物的一个实施方案中，第一有效负载是对标靶具有特异性结合亲 和力的靶向部分，其中这个靶向部分选自由表17-19和21中所阐述的靶向部 分组成的组，并且第二有效负载和第三有效负载是药物，其可以是相同的或 可以是不同的，并且其中这个药物选自由表11、表18和表21中所阐述的药 物组成的组。在三聚XTEN-有效负载缀合组合物的一个实施方案中，其中第 一有效负载是对标靶具有特异性结合亲和力的靶向部分并且第二有效负载和 第三有效负载是药物，这个靶向部分选自由LHRH和叶酸盐组成的组，并且 这个药物选自由以下组成的组：阿霉素(doxorubicin)、太平洋紫杉醇 (paclitaxel)、奥利司他汀(auristatin)、单甲基奥利司他汀E(MMAE)、单甲基 奥利司他汀F、美登素(maytansine)、海兔毒素(dolastatin)、卡奇霉素(calicheamicin)、长春花生物碱(vinca alkaloid)、喜树碱(camptothecin)、丝裂霉 素C(mitomycin C)、埃博霉素(epothilone)、hTNF、Il-12、硼替佐米(bortezomib)、 豹蛙酶(ranpirnase)、假单胞菌外毒素(pseudomonas exotoxin)、SN-38和雷查霉 素(rachelmycin)。在三聚XTEN-有效负载缀合组合物的一个实施方案中，其 中第一有效负载是对标靶具有特异性结合亲和力的靶向部分并且第二有效负 载和第三有效负载是药物，这个靶向部分和这个药物部分对应于表21中所阐 述的缀合物1-290中的任一者。在三聚XTEN-有效负载缀合组合物的另一个 实施方案中，其中第一有效负载是对标靶具有特异性结合亲和力的靶向部分 并且第二有效负载和第三有效负载是药物，缀合物具有对应于表21的缀合物 71的XTEN、靶向部分和药物部分。在三聚XTEN-有效负载缀合组合物的另 一个实施方案中，组合物具有式XIII的构型：
其中就各次出现独立而言：3xCL是选自表13和14中所阐述的三价交联 剂的组的三价交联剂；P1缀合到第一XTEN的每个交联剂并且选自由表11、 12、18和21中所阐述的有效负载组成的组，P2是缀合到第二XTEN的每个 交联剂的第二有效负载并且选自由表11、12、18和21中所阐述的有效负载 组成的组，其中这个有效负载与第一有效负载是相同的或是不同的，并且P3是缀合到第三XTEN的每个交联剂的第三有效负载并且选自由表11、12、18和21中所阐述的有效负载组成的组，其中这个有效负载与第一有效负载或第 二有效负载是相同的或是不同的；CL1是第一交联剂；x是1至约100、或1 至约50、或1至约40、或1至约20、或1至约10、或1至约5的整数，或 是9，或是3，或是2，或是1；CL2是第二交联剂；y是1至约100、或1至 约50、或1至约40、或1至约20、或1至约10、或1至约5的整数，或是 9，或是3，或是2，或是1；并且z是1至约100、或1至约50、或1至约 40、或1至约20、或1至约10、或1至约5的整数，或是9，或是3，或是 2，或是1，其限制条件为x+y+z≥3；XTEN1是与选自表2和3中所阐述的序列的组的序列具有至少80％、或至少约90％、或至少约91％、或至少约 92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至 少约97％、或至少约98％、或至少约99％、或具有100％的序列同一性的第 一XTEN；XTEN2是与选自表2和3中所阐述的序列的组的序列具有至少 80％、或至少约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至 少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、 或至少约99％、或具有100％的序列同一性的第二XTEN；并且XTEN3是与 选自表2和3中所阐述的序列的组的序列具有至少80％、或至少约90％、或 至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、 或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％、或具有100％ 的序列同一性的第三XTEN，其中XTEN1、XTEN2和XTEN3是相同的或是不同的XTEN序列。在一些实施方案中，式XIII的缀合物进一步包含第一有效 负载，其中这个有效负载是对标靶具有特异性结合亲和力的靶向部分，其中 这个靶向部分选自由表17-19和21中所阐述的靶向部分组成的组，并且这些 有效负载中至少有一者是药物，其中这个药物选自由表11、表19和表21中 所阐述的药物组成的组。在前述的一个实施方案中，靶向部分是LHRH或叶 酸盐，并且药物是选自阿霉素、太平洋紫杉醇、奥利司他汀、单甲基奥利司他汀E(MMAE)、单甲基奥利司他汀F、美登素、海兔毒素、卡奇霉素、长春 花生物碱、喜树碱、丝裂霉素C、埃博霉素、hTNF、Il-12、硼替佐米、豹蛙 酶、假单胞菌外毒素、SN-38和雷查霉素。在三聚XTEN缀合组合物的另一 个实施方案中，组合物具有式XIV的构型：
其中就各次出现独立而言；3xCL是三价交联剂；CL1是缀合到XTEN1的第一交联剂；CL2是缀合到XTEN2的第二交联剂；x是1至约10的整数； y是1至约10的整数，其限制条件为x+y≥2；XTEN1是第一XTEN；XTEN2是第二XTEN；并且XTEN3是第三XTEN，其中这个XTEN选自由表2中所 阐述的序列组成的组。在式XVI的三聚XTEN缀合组合物的一个实施方案中， 组合物进一步包含缀合到第一XTEN的每个第一交联剂的第一有效负载的单 原子残基，其中这个残基选自由碳、氮、氧和硫组成的组；以及缀合到第二 XTEN的每个第二交联剂的第二有效负载的单原子残基，其中这个残基选自 由碳、氮、氧和硫组成的组。在式XVI的三聚XTEN缀合组合物的另一个实 施方案中，组合物进一步包含缀合到第一XTEN的每个第一交联剂的第一有 效负载，这个第一有效负载选自由表11、12、18和21中所阐述的有效负载 组成的组；以及缀合到第二XTEN的每个第二交联剂的第二有效负载，这个 第二有效负载选自由表11、12、18和21中所阐述的有效负载组成的组，其 中这个有效负载与第一有效负载是相同的或是不同的。在前述的一个实施方 案中，第一有效负载是对标靶具有特异性结合亲和力的靶向部分，其中这个 靶向部分选自由表17-19和21中所阐述的靶向部分组成的组，并且第二有效 负载选自由表6、表18和表21中所阐述的药物组成的组的药物。在前述的 另一个实施方案中，第一有效负载选自由LHRH和叶酸盐组成的组的靶向部 分，并且第二有效负载选自由以下组成的组的药物：阿霉素、太平洋紫杉醇、 奥利司他汀、单甲基奥利司他汀E(MMAE)、单甲基奥利司他汀F、美登素、 海兔毒素、卡奇霉素、长春花生物碱、喜树碱、丝裂霉素C、埃博霉素、hTNF、 Il-12、硼替佐米、豹蛙酶、假单胞菌外毒素、SN-38和雷查霉素。在前述的 一个实施方案中，第一有效负载选自由表11的药物和表12的蛋白质组成的 组的药物，并且第二有效负载不同于第一有效负载并且选自由表11的药物和 表12的蛋白质组成的组。在前述的另一个实施方案中，第一有效负载和第二 有效负载是相同的并且选自由表11的药物和表12的蛋白质组成的组。在三 聚XTEN缀合组合物的另一个实施方案中，组合物具有式XV的构型：
其中就各次出现独立而言；3xCL是连接XTEN1、XTEN2、XTEN3的三 价交联剂；CL1是缀合到XTEN1的第一交联剂；x是1至约10的整数；XTEN1是第一XTEN，其中这个XTEN选自由表3中所阐述的序列组成的组；XTEN2是第二XTEN，其中这个XTEN选自由表2中所阐述的序列组成的组；并且 XTEN3是第三XTEN，其中这个XTEN选自由表2中所阐述的序列组成的组。 在呈式XVII构型的三聚XTEN缀合组合物的一个实施方案中，组合物进一 步包含缀合到第一XTEN的每个第一交联剂的第一有效负载的单原子残基， 其中这个残基选自由碳、氮、氧和硫组成的组。在呈式XVII构型的三聚XTEN 缀合组合物的一个实施方案中，组合物进一步包含缀合到第一XTEN的每个 第一交联剂的第一有效负载，这个第一有效负载选自由表11、12、18和21 中所阐述的有效负载组成的组。
在另一个方面，本发明一部分是关于彼此缀合的第一XTEN、第二XTEN、 第三XTEN和第四XTEN的组合物，从而得到四聚缀合组合物。在一些实施 方案中，缀合组合物包含第一XTEN和第二XTEN和第三XTEN和第四 XTEN，其中XTEN选自由表3中所阐述的序列组成的组，其中这些XTEN 可以是相同的或可以是不同的，并且其中第一XTEN和第二XTEN和第三XTEN和第四XTEN是使用四价交联剂通过N端彼此缀合，其中四价交联剂 是四价马来酰亚胺簇。在四聚缀合物的一个实施方案中，第一XTEN和第二 XTEN和第三XTEN和第四XTEN是相同的或是不同的，并且各自与选自表 2或表3中所阐述的序列的组的序列具有至少约90％、或至少约91％、或至 少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％、或100％的序列同一性。在 四聚缀合物的另一个实施方案中，第一XTEN和第二XTEN和第三XTEN是 相同的或是不同的，并且第一XTEN中的每一者的至少90％、91％、92％、 93％、94％或95％的个别分子具有相同的序列长度，并且第二XTEN中的每 一者的至少90％、91％、92％、93％、94％或95％的个别分子具有相同的序列 长度，并且第三XTEN中的每一者的至少90％、91％、92％、93％、94％或 95％的个别分子具有相同的序列长度，并且第四XTEN中的每一者的至少 90％、91％、92％、93％、94％或95％的个别分子具有相同的序列长度。在四 聚缀合物的另一个实施方案中，第一XTEN、第二XTEN、第三XTEN和第 四XTEN是相同的，并且各自与选自由表3中所阐述的Seg 174、Seg175、 Seg 176、Seg 177、Seg 186、Seg 187、Seg 188、Seg 189、Seg 190、Seg 191、 Seg192、Seg 193、Seg 194、Seg 195、Seg 196、Seg 197、Seg 198和Seg 199 组成的组的序列具有至少约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约 93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至 少约98％、或至少约99％、或100％的序列同一性。在四聚缀合物的另一个 实施方案中，第一XTEN和第二XTEN是相同的，并且各自与选自由表3中 所阐述的Seg 174、Seg 175、Seg 176、Seg 177、Seg 186、Seg 187、Seg 188、 Seg189、Seg 190、Seg 191、Seg 192、Seg 193、Seg 194、Seg 195、Seg 196、 Seg 197、Seg 198和Seg 199组成的组的序列具有至少约90％、或至少约91％、 或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、 或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％、或100％的序列同一性，并 且第三XTEN和第四XTEN是相同的，但不同于第一XTEN和第二XTEN， 并且各自与选自由表3中所阐述的Seg 174、Seg 175、Seg 176、Seg 177、Seg186、Seg 187、Seg 188、Seg 189、Seg 190、Seg 191、Seg 192、Seg 193、Seg 194、Seg 195、Seg 196、Seg 197、Seg 198和Seg 199组成的组的序列具有至 少约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、 或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％、 或100％的序列同一性。在四聚缀合物的另一个实施方案中，每个XTEN包 含至少第一半胱氨酸残基，并且缀合物进一步包含缀合到第一XTEN的每个半胱氨酸残基的第一交联剂、缀合到第二XTEN的每个半胱氨酸残基的第二 交联剂、缀合到第三XTEN的每个半胱氨酸残基的第三交联剂和缀合到第四 XTEN的每个半胱氨酸残基的第四交联剂，其中每个交联剂选自由表13中所 阐述的交联剂组成的组。在四聚缀合组合物的一些实施方案中，组合物具有 式XVI的构型：
其中就各次出现独立而言：4xCL是四价交联剂；CL1是缀合到XTEN1的第一交联剂；CL2是缀合到XTEN2的第二交联剂；CL3是缀合到XTEN3的第三交联剂；CL4是缀合到XTEN4的第四交联剂；v是1至约10的整数； x是1至约10的整数；y是1至约10的整数；z是1至约10的整数，其限制 条件为x+y+z≥4；XTEN1是第一XTEN；XTEN2是第二XTEN；XTEN3是第三XTEN；并且XTEN3是第四XTEN。在四聚缀合组合物的另一个实施 方案中，组合物进一步包含缀合到第一XTEN的每个第一交联剂的第一有效 负载的单原子残基，其中这个残基选自由碳、氮、氧和硫组成的组；缀合到 第二XTEN的每个第二交联剂的第二有效负载的单原子残基，其中这个残基 选自由碳、氮、氧和硫组成的组；缀合到第三XTEN的每个第三交联剂的第 三有效负载的单原子残基，其中这个残基选自由碳、氮、氧和硫组成的组； 以及缀合到第四XTEN的每个第四交联剂的第四有效负载的单原子残基，其 中这个残基选自由碳、氮、氧和硫组成的组。在四聚缀合组合物的另一个实 施方案中，组合物进一步包含缀合到第一XTEN的每个第一交联剂的第一有 效负载，这个第一有效负载选自由表11、12、18和21中所阐述的有效负载 组成的组；缀合到第二XTEN的每个第二交联剂的第二有效负载，这个第二 有效负载选自由表11、12、18和21中所阐述的有效负载组成的组，其中这 个有效负载与第一有效负载是相同的或是不同的；缀合到第三XTEN的每个 第三交联剂的第三有效负载，这个第三有效负载选自由表11、12、18和21 中所阐述的有效负载组成的组，其中这个有效负载与第一有效负载或第二有 效负载是相同的或是不同的；以及缀合到第四XTEN的每个第四交联剂的第 四有效负载，这个第四有效负载选自由表11、12、18和21中所阐述的有效 负载组成的组，其中这个有效负载与第一有效负载或第二有效负载或第三有 效负载是相同的或是不同的。在四聚XTEN-有效负载缀合组合物的一个实施 方案中，第一有效负载是对标靶具有特异性结合亲和力的靶向部分，其中这 个靶向部分选自由表17-19和21中所阐述的靶向部分组成的组，并且第二有 效负载、第三有效负载和第四有效负载中至少有一者是药物，其中这个药物 选自由表11、18和21中所阐述的药物组成的组。在四聚XTEN-有效负载缀 合组合物的一个实施方案中，第一有效负载是靶向部分，其中这个靶向部分 选自由LHRH和叶酸盐组成的组，并且第二有效负载、第三有效负载和第四 有效负载中至少一者选自由以下组成的组的药物：阿霉素、太平洋紫杉醇、 奥利司他汀、美登素、海兔毒素、卡奇霉素、长春花生物碱、喜树碱、丝裂 霉素C、埃博霉素、hTNF、Il-12、硼替佐米、豹蛙酶、假单胞菌外毒素、SN-38 和雷查霉素。在四聚XTEN-有效负载缀合组合物的另一个实施方案中，第一 有效负载是对标靶具有特异性结合亲和力的靶向部分，其中这个靶向部分选 自由表17-19和21中所阐述的靶向部分组成的组，并且第二有效负载、第三 有效负载和第四有效负载中至少有一者是药物，其中这个药物选自由表11、 18和21中所阐述的药物组成的组，并且其中XTEN、靶向部分和药物部分对 应于表21中所阐述的缀合物1-290中的任一者。
在另一个方面，本发明一部分是关于包含以分支方式配置的多聚XTEN 分子的组合物，其中这种组合物的溶液具有降低的粘度。在一个实施方案中， 本发明提供了一种包含溶液的组合物，这种溶液包含具有至少三个以分支方 式(例如，三聚方式)连接在一起的XTEN片段的多聚XTEN，其中这种溶液 的粘度在含有≧100、130或150mg/ml的三聚XTEN制剂的溶液中与含有 ≧100、130或150mg/ml的等摩尔浓度的对应的线性XTEN的溶液相比降低至少5、6、7、8、9或10cP。在另一个实施方案中，本发明提供了一种包含 溶液的组合物，这种溶液包含具有至少四个以分支方式(例如，四聚方式)连接 在一起的XTEN片段的多聚XTEN，其中这种组合物具有小于包含具有相同 数目的氨基酸和相同的摩尔浓度的对应的线性XTEN的溶液的粘度，其中这 种溶液的粘度在含有≧100、130或150mg/ml的三聚XTEN制剂的溶液中与 含有≧100、130或150mg/ml的等摩尔浓度的对应的线性XTEN的溶液相比 降低至少5、6、7、8、9或10cP。在另一个实施方案中，本发明提供了一种 包含溶液的组合物，这种溶液包含具有至少五个以分支方式(例如，五聚方式) 连接在一起的XTEN片段的多聚XTEN，其中这种组合物具有小于包含具有 相同数目的氨基酸和相同的摩尔浓度的对应的线性XTEN的溶液的粘度，其 中这种溶液的粘度在含有≧100、130或150mg/ml的三聚XTEN制剂的溶液中与含有≧100、130或150mg/ml的等摩尔浓度的对应的线性XTEN的溶液 相比降低至少5、6、7、8、9或10cP。在这一段的前述实施方案中，多聚构 型的个别XTEN选自由表2和表3中所阐述的序列组成的组。
在另一个实施方案中，本发明提供了多肽的组合物，这种多肽与选自表 52中所阐述的序列的组的序列具有至少约90％、或至少约91％、或至少约 92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至 少约97％、或至少约98％、或至少约99％、或100％的序列同一性。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种医药组合物，其包含本文所描 述的XTEN-有效负载缀合物的实施方案中的任一者的缀合物和医药学上可接 受的载剂。在一个实施方案中，前述医药组合物具有治疗选自表16中所阐述 的病状的组的病状的效用。在另一个实施方案中，前述医药组合物具有用于 治疗受试者的医药方案的效用，这种方案包含医药组合物。在另一个实施方 案中，前述医药方案进一步包括确定在受试者中实现有益作用所需的医药组 合物的量的步骤，这个受试者患有选自表16中所阐述的病状的组的病状。在 另一个实施方案中，用于治疗受试者的前述医药方案包括以有效量将医药组 合物以两个或更多个连续剂量施用给受试者，其中投药使得至少一个、两个 或三个与病状相关的参数与未经治疗的受试者相比改进至少10％、或20％、 或30％、或40％、或50％、或60％、或70％、或80％、或90％以上。
在另一个实施方案中，本发明提供了本文所描述的XTEN-有效负载缀合 物的实施方案中的任一者的缀合物，其是用于制备用以治疗选自表16中所阐 述的病状的组的病状的药剂。
在一些实施方案中，本发明提供了选择连接到XTEN的有效负载的组合 作为治疗剂的方法，这种方法包括提供包含多个XTEN序列的XTEN的文库， 其中所述XTEN序列中的每一者缀合到至少第一有效负载和不同于第一有效 负载的至少第二有效负载；如果XTEN序列与(1)缀合到单独的第一有效负载 的XTEN序列；以及(2)缀合到单独的第二有效负载的XTEN序列相比展现改 进的体外或体内参数，那么从所述文库中选择这个XTEN序列作为治疗剂。 在这种方法的一个实施方案中，第一有效负载和第二有效负载在治疗上有效 改善常见疾病(例如，第一有效负载和第二有效负载都靶向的疾病)。在这种方 法的一个实施方案中，第一药物和第二药物在治疗上有效治疗常见疾病的不 同症状。在这种方法的一个实施方案中，常见疾病是选自癌症、癌症支持性 护理、心血管疾病、中枢神经系统疾病、内分泌疾病、胃肠疾病、泌尿生殖 器疾病、血液疾病、HIV感染、激素疾病、炎症、自体免疫疾病、传染病、 代谢疾病、肌肉骨胳疾病、肾脏科病症、眼科疾病、疼痛和呼吸疾病。在这 种方法的一个实施方案中，第一有效负载和第二有效负载经由共同的生物路 径介导其治疗作用。在这种方法的一个实施方案中，第一有效负载和第二有 效负载选自由表11、表18和表21中所阐述的药物组成的组的不同药物。在 这种方法的一个实施方案中，第一有效负载和第二有效负载选自由表12、表 18和表21中所阐述的蛋白质组成的组的不同生物活性蛋白质。在这种方法 的一个实施方案中，第一有效负载选自由表11、表18和表21中所阐述的药 物组成的组的药物，并且第二有效负载选自由表12、表18和表21中所阐述 的蛋白质组成的组的生物活性蛋白质。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种经分离的多肽，其包含延伸重 组多肽，这种延伸重组多肽经由具有选自SASRSA或SASXSA(其中X是R 或K)的序列的蛋白水解裂解位点连接到亲和纯化标签。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种经分离的多肽，其包含有包含 XTEN的多肽，XTEN在其N端经由具有选自SASRSA或SASXSA(其中X 是R或K)的序列的蛋白水解裂解位点连接到第一亲和纯化标签，并且在其C 端经由具有选自SASRSA或SASXSA(其中X是R或K)的序列的蛋白水解裂 解位点连接到第二亲和纯化标签。
在另一个方面，本发明涉及一种用XTEN-有效负载缀合组合物治疗受试 者的病状的方法。在一个实施方案中，本发明提供了一种治疗受试者的病状 的方法，其包括将有效量的本文所描述的XTEN-有效负载的实施方案中的任 一者的缀合物施用给有需要的受试者。在另一个实施方案中，本发明提供了 一种治疗受试者的病状的方法，其包括将有效量的由表21中所阐述的缀合物 组成的组的缀合物施用给有需要的受试者。在这一段的前述实施方案中，有 待治疗的病状包括(但不限于)表13中所阐述的病状。在另一个实施方案中， 本发明提供了一种医药组合物，其包含本文所描述的XTEN-有效负载缀合物 的实施方案中的任一者和医药学上可接受的载剂，这种医药组合物是用于治 疗方案中，这种方案包括施用两个或更多个连续剂量的医药组合物。
在一个实施方案中，本发明提供了本文所描述的XTEN-有效负载的实施 方案中的任一者的缀合物的用途，其是用于制备用以治疗选自表16中所阐述 的病状的组的病状的药剂。在另一个实施方案中，本发明提供了一种医药组 合物，其是用于治疗选自表16中所阐述的病状的组的病状，这种医药组合物 包含有效量的本文所描述的XTEN-有效负载的实施方案中的任一者的缀合 物。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种组合物，其具有图117中所阐 述的结构。
特别预期，缀合物的实施方案可以展现本文所公开的特性的一个或多个 组合或任何组合。另外，本文所公开的XTEN组合物中的任一者可以被用于 本文所公开的方法中的任一者中。
援引并入
本说明书中所提及的所有公布、专利和专利申请都以引用的方式并入本 文中，其引用的程度如同每个个别的公布、专利或专利申请特定地并且个别 地指示以引用的方式并入一样。
附图简述
本发明的特征和优点可以参考以下阐述说明性的实施方案的详细描述和 随附图式来进一步阐明。
图1示出了适合于与有效负载缀合的XTEN的示意图。图1A示出了未 经修饰的XTEN。图1B示出了具有含硫醇侧链的内部半胱氨酸的经半胱氨酸 工程改造的XTEN；下面是具有反应性的N端氨基的XTEN；下面是具有含 硫醇反应基团的N端半胱氨酸的XTEN。图1C示出了具有多个内部半胱氨 酸的经半胱氨酸工程改造的XTEN。图1D示出了具有含硫醇侧链的内部半胱 氨酸和反应性的N端氨基的经半胱氨酸工程改造的XTEN的两种变型，并且 在底部示出了具有内部半胱氨酸和内部赖氨酸的经半胱氨酸工程改造和经赖 氨酸工程改造的XTEN。
图2示出了利用NHS酯和其水溶性类似物(磺基-NHS酯)与伯氨基反应 来得到稳定的酰胺XTEN-有效负载产物的缀合反应。
图3示出了利用硫醇基和N-马来酰亚胺的缀合反应。当反应混合物的pH 介于pH6.5与7.5之间时马来酰亚胺基特定地与巯基反应，形成不可逆的稳 定的硫醚键。
图4示出了利用卤乙酰基的缀合反应。最常用的卤乙酰基试剂含有在生 理pH下与巯基反应的碘乙酰基。碘乙酰基与巯基的反应通过用硫醇对碘进 行亲核取代而进行，在XTEN-有效负载中产生稳定的硫醚键。
图5示出了利用吡啶基二硫化物的缀合反应。吡啶基二硫化物在宽的pH 范围(最佳pH是4-5)上与巯基反应，形成将XTEN连接到有效负载的二硫键。
图6示出了利用零长度交联剂的缀合反应，其中这些交联剂被用来直接 将一个分子(如有效负载)的羧基官能团缀合到另一个分子(如XTEN)的伯胺。
图7示出了多官能(或多价)的XTEN前体的不同构型，包括树枝状聚合 物。三官能接头的非限制性实例是“Y形”巯基反应性TMEA(三(2-马来酰亚胺 基乙基)胺)和胺反应性TSAT(氨基三乙酸三(琥珀酰亚胺酯))。反应性部分的 任何组合可以使用线性(形成“梳状”构型)或分支(形成“树枝状聚合物”构型)的 支架聚合物来设计，用于多价展示。
图8示出了利用炔烃与叠氮化物的休斯根1,3-偶极环加成(Huisgen 1,3-dipolar cycloaddition)来形成1,4-二取代-1,2,3-三唑的缀合反应，如所示。
图9示出了使用基于硫-烯(thio-ene)的点击化学的缀合反应，其可以通过 称为硫醇-烯反应的自由基反应或称为硫醇迈克尔加成(thiol Michael addition) 的阴离子反应而进行。
图10示出了利用基于酰肼与醛之间的反应的点击化学的缀合反应，从而 在XTEN-有效负载中形成所说明的腙键。
图11示出了C端酰基叠氮化物与伯氨基之间的反应，从而形成酰胺键。
图12示出了利用天然化学接合(Native Chemical Ligation；NCL)的缀合反 应，其涉及C端硫酯作为亲电试剂和N端半胱氨酸作为亲核试剂。这个反应 的结果是在XTEN-有效负载组合物的接合位点处的天然酰胺键。
图13示出了利用表达蛋白质接合(expressed protein ligation；EPL)方法的 缀合反应。EPL方法是基于蛋白质剪接，在这个过程中蛋白质经历分子内重 排，从而挤出内部序列(内含肽)并连接旁侧序列(外显肽)。在这种方法中，当 前体蛋白的内含肽部分的第一半胱氨酸残基的侧链亲核攻击上游紧邻的残基 (即，例如XTEN的最末残基)的肽键时融合蛋白质经历N-S转变以形成线性 硫酯中间物，接下来进行重排以在XTEN-交联剂与有效负载之间形成酰胺键。
图14示出了利用无痕施陶丁格接合(traceless Staudinger ligation)，如天 然化学接合(NCL)的缀合反应，从而在接合位点处形成天然酰胺键。
图15示出了利用酶促接合的缀合反应。转谷氨酰胺酶是催化有效负载肽 或蛋白质的谷氨酰胺的γ-甲酰胺基与经赖氨酸工程改造的XTEN中的赖氨酸 的ε-氨基(或N端氨基)之间的异肽键形成的酶，由此在XTEN与有效负载之 间形成分子间或分子内交联。
图16示出了酶促形成的XTEN-有效负载组合物，其利用来自金黄色葡 萄球菌(Staphylococcus aureus)的分选酶A转肽酶来催化蛋白质1的苏氨酸与 甘氨酸残基之间的短的5-氨基酸识别序列LPXTG裂解，随后将酰基片段转 移到蛋白质1的N端寡聚甘氨酸亲核试剂。通过使蛋白质2官能化以含有寡 聚甘氨酸，两种蛋白质的酶促缀合以位点特异性方式实现，从而得到所需的 XTEN-有效负载组合物。
图17示出了各种XTEN-交联剂前体区段，其被用作反应物来连接到有 效负载或连接到其它的XTEN反应物。图17A想要示出，1B代表在右边的 前体的剩余反应基团。图17B示出了具有缀合到XTEN的多个(左边)或单一 (右边)有效负载A分子的类似反应前体。
图18示出了具有交联剂的两个反应基团或所并入的氨基酸的反应基团 的XTEN-交联剂前体区段的示范性的排列，其被用作反应物来连接到有效负 载或连接到其它的XTEN反应物。1B和2B代表反应基团，这些反应基团将 在其它图中与同样编号的反应基团反应；1与1反应并且2与2反应，等等。
图19想要示出对于图式中的其它地方所说明的构型的各种反应物和命 名的实例。图19A示出了反应性的XTEN区段前体的各种形式，其各自在N 端具有不同的反应基团。图19B示出了具有2个、3个或4个反应基团的各 种交联剂。在第一种情况下，二价交联剂是异官能接头，其与两种不同类型 的反应基团(用“2”和“1”表示)反应。在三价和四价交联剂的情况下，各者只与 一种类型的反应基团(用“1”表示)反应。图19C说明了两个XTEN区段前体的 反应产物的命名。在上部的型式中，1A与1B反应形成在N端连接的二聚 XTEN，其中交联剂的残基用1AR-1BR指示，而下部的型式也是在N端连接 的二聚XTEN，其中交联剂的残基用2AR-2BR指示。
图20说明了各种XTEN前体区段的形成。图20A示出了制造XTEN多 肽的步骤，接下来N端与具有2B-1A反应基团的交联剂反应，其中1A与N 端的1B(例如，α氨基酸)反应形成具有反应基团2B的XTEN前体2。图20B 示出了顺序添加两个具有2A反应基团的交联剂到XTEN的2B反应基团中， 从而得到XTEN前体4，XTEN前体4然后与交联剂在N端于交联剂的反应 基团1B与1A之间反应，从而得到具有反应基团4B和3B的XTEN前体5。 在这种情况下，XTEN前体5然后可以充当具有两个不同的有效负载或XTEN 的反应物。
图21说明了多聚缀合物的实例。图21A说明了具有缀合的有效负载A 的XTEN的三个分子怎样可以缀合到三聚交联剂，从而得到具有三个A有效 负载的三聚XTEN-有效负载缀合物。图21B说明了具有A有效负载的多肽的 三个分子怎样可以缀合到三聚交联剂，从而得到具有三个具有A有效负载的 多肽的三聚XTEN-有效负载缀合物。
图22说明了可以来源于具有单一的半胱氨酸的XTEN前体的多价XTEN 缀合物的实例。XTEN前体中的氨基充当反应基团2B并且硫醇基充当反应基 团1B。XTEN前体可以使用可以与基团1B反应的交联剂进行交联。交联剂 的化合价控制所得中间物的化合价。这种交联的中间物可以与带有反应基团 2A的有效负载反应，这个反应基团2A可以与氨基反应形成缀合键2A-BR。 图22A是具有单一的硫醇基的XTEN前体。图22B是二价缀合物。图22C 是三聚缀合物。图22D是四聚缀合物。
图23说明了可以来源于具有单一的半胱氨酸的XTEN前体的多价XTEN 缀合物的实例。XTEN前体中的氨基充当反应基团1B并且硫醇基充当反应基 团2B。XTEN前体可以使用可以与基团1B反应的交联剂进行交联。交联剂 的化合价控制所得中间物的化合价。这种交联的中间物可以与带有反应基团 2A的有效负载反应，这个反应基团2A可以与硫醇基反应形成缀合键2A-BR。 图23A说明了接近于XTEN的C端定位的硫醇基。因此，有效负载定位在最终三聚缀合物的远端。图23B说明了硫醇基接近于XTEN的N端定位。因此， 有效负载定位在最终缀合物的近端，从而增加XTEN对有效负载的屏蔽。
图24说明了形成“梳状”构型的一个实例。图24A是包含接头的反应基团 1A的XTEN-有效负载前体。有效负载可以重组融合到XTEN或其可以缀合。 图24B说明了具有梳状交联剂的XTEN前体。这可以是带有多个反应基团B 的XTEN。图24C示出了呈“梳状”构型的最终产物，其具有五个有效负载A。 化合价受梳状前体中反应基团的数目所控制。
图25说明了具有两个有效负载的双特异性缀合物的各种构型。图25A 说明了具有两个有效负载中的每一者的一个分子的构型，而图25B说明了具 有一个或两个有效负载的多个拷贝的各种构型。
图26说明了具有高化合价的缀合物的各种实例。有效负载的缀合位点可 以分组(图26A)或散布(图26B)。
图27说明了从带有氨基和硫醇基两者的XTEN前体制备双特异性缀合 物，其中可以使用许多化学并且有效负载添加的次序可以变化。可以产生接 头-缀合物作为前体。图27A示出了附接有两个不同的有效负载的单一的 XTEN前体的形成。图27B示出了从两个XTEN前体分子开始的区段法。这 种方法允许使用相同类型的接头化学将两个有效负载缀合到XTEN。在这种 情况下，这个图示出了硫醇作为有效负载所缀合的基团，然后每个区段的N 端经交联剂修饰以能够进行头对头的区段缀合，从而得到最终产物二聚、双 特异性缀合物。
图28示出了组合抗体、XTEN和有效负载的多价缀合物的实例。这些构 建体可以具有不同的化合价并且提供了以下许多益处：XTEN可以具有可裂 解接头，XTEN可以为组合物提供可溶性，并且其可以允许调整每个IgG的 载药量，并且XTEN可以与药物预先缀合以简化制造。图28A说明了两个在 铰链区中的Cys残基处缀合到IgG的XTEN。图28B说明了四个使用铰链区 中的Cys缀合到IgG的XTEN。图28C说明了在铰链外缀合的XTEN。这可 以通过插入Cys以控制缀合位点或通过随机缀合到Lys侧链来完成。
图29示出了构建组合抗体、XTEN和有效负载的缀合物的实例。抗体可 以具有一个或多个反应基团1B。XTEN可以缀合到一个或多个有效负载A。 另外，XTEN可以带有反应基团1A，这个反应基团1A可以优先与抗体上的 反应基团1B反应。抗体中反应基团1B的定位控制缀合到抗体的XTEN的数 目和定位，从而得到最终产物。
图30示出了包含靶向部分、XTEN和有效负载的缀合物的实例。靶向部 分可以是肽、类肽或受体配体。图30A示出了1x(1x3)缀合物。图30B示出 了1x2(1x3)缀合物。图30C示出了3x1(1x3)缀合物。
图31示出了包含多个不同的靶向部分、XTEN和有效负载的缀合物的实 例。靶向部分可以是肽、类肽、受体配体。
图32示出了包含靶向部分、XTEN和多个不同的有效负载的缀合物的实 例。
图33示出了组合的XTEN缀合物的实例。有效负载A、B、C和D带有 反应基团2A，这个反应基团2A与XTEN前体上的反应基团2B反应。在下 一个步骤中，有效负载E和F带有反应基团1A，这个反应基团1A与XTEN 上的反应基团1B反应，从而得到双特异性缀合物的不同排列的文库。在这种 情况下，反应基团1B和2B分别是硫醇基和氨基。
图34示出了形成组合的XTEN缀合物文库的一个实例。有效负载A、B、 C缀合到带有反应基团1A的XTEN，从而得到一组XTEN前体区段。有效 负载E、F和G缀合到带有反应基团1B的XTEN，从而得到第二组XTEN前 体区段。对这些区段进行组合缀合，然后从反应物中纯化。这能够形成组合 产物，可以对这些组合产物立即进行体外和体内测试。在这种情况下，反应 基团1A和1B是具有或不具有双特异性交联剂的XTEN的α-氨基。在一个实 例中，1A是叠氮化物并且1B是炔烃，或反之亦然，而有效负载是经由XTEN 中的硫醇基附接到XTEN。
图35示出了形成组合的XTEN缀合物文库的一个实例，这个文库优化了 两个有效负载之间的比率。每个文库成员带有不同比率的有效负载A和有效 负载E。
图36示出了形成组合的XTEN缀合物文库的一个实例，这个文库建立了 靶向部分与有效负载的组合。靶向部分1、2和3缀合到带有反应基团1A的 XTEN。有效负载E、F和G缀合到带有反应基团1B的XTEN。对这些区段 进行组合缀合，从而能够形成组合产物，其中每个文库成员包含靶向部分和 有效负载。带有有效负载的缀合基团的所有XTEN区段都可以被纯化成组合 产物，可以对这些组合产物立即进行体外和体内测试。
图37示出了包含对靶细胞(如肿瘤细胞)的表面发挥选择性作用的靶向部 分和有效负载的XTEN缀合物的一个实例。二聚XTEN缀合物的特定设计包 含LHRH和阿霉素。这种缀合物结合到在许多癌细胞上过度表达的LHRH受 体。受体结合引起内化，接下来是蛋白水解分解和阿霉素的细胞内释放，阿 霉素对细胞有毒。
图38是XTEN的组装、产生和评估中的代表性步骤的示意性流程图。
图39是编码融合蛋白质的XTEN多核苷酸构建体的组装中的代表性步骤 的示意性流程图。个别的寡核苷酸501粘接到序列基序502，如12氨基酸基 序(“12聚体”)中，这个基序接合到来自文库的额外的序列基序以形成涵盖所 需长度的XTEN 504的汇集物，也接合到较小浓度的含寡核苷酸的BbsI和 KpnI限制位点503。对接合产物的所得汇集物进行凝胶纯化，并且切割具有 所需长度的XTEN的色带，从而得到具有终止序列的经分离的XTEN基因505。将XTEN基因克隆到填充载体中。在这种情况下，载体编码任选的CBD 序列506和GFP基因508。然后，用BbsI/HindIII进行消化以去除507和508 并且放置终止密码子。然后，将所得产物克隆到经BsaI/HindIII消化的载体中， 从而得到编码XTEN的基因500。
图40是编码XTEN的基因的组装、其表达、与有效负载缀合和作为 XTEN-有效负载回收以及其作为候选产物评估中的代表性步骤的示意性流程 图。
图41示出了具有经过优化以供使用图42中所说明的方法纯化的N端或 C端标签或N端和C端序列的一般性XTEN。
图42示出了用于纯化XTEN的一般性流程，在这个说明性的实施方案中 使用两个标签，其中两步纯化法用来捕获第一个标签，然后第二个标签可以 被用来从发酵中去除截短的XTEN，从而得到高度纯化的目标XTEN实体。
图43示出了如实施例10中所描述在来自药瓶培养物的大肠杆菌BL21 DE3 rne-131和大肠杆菌BL21 DE3细胞中表达的CBD-TEV位点 -XTEN_AE864和CBD-TEV位点-XTEN_AE864-GFP构建体的SDS-PAGE凝 胶。具有MW标志物和来自构建体的经表达的蛋白质的凝胶泳道样品是：1) MW标志物；2-5)来自在大肠杆菌BL21 DE3中表达CBD-TEV位点 -XTEN_AE864-GFP融合蛋白质的4个独立的瓶的溶解产物；6-9)来自在大肠 杆菌BL21 DE3 rne-131中表达CBD-TEV位点-XTEN_AE864-GFP融合蛋白 质的4个独立的瓶的溶解产物；10-13)来自在大肠杆菌BL21 DE3中表达 CBD-TEV位点-XTEN_AE864融合蛋白质的4个独立的瓶的溶解产物；14-17) 来自在大肠杆菌BL21 DE3 rne-131中表达CBD-TEV位点-XTEN_AE864融合 蛋白质的4个独立的瓶的溶解产物。全长蛋白质斑点出现在有轮廓线的框内。 较低分子量的色带是宿主细胞蛋白质。
图44示出了如实施例10中所描述在来自摇瓶培养物的大肠杆菌BL21 DE3 rne-131和大肠杆菌BL21 DE3细胞中表达的CBD-TEV位点 -XTEN_AE864-GFP的相对GFP荧光。
图45示出了如实施例17中所描述在大肠杆菌发酵中表达的CBD-R-C-X TEN_AE864-RH8(EC682)和CBD-R-XTEN_AE864-RH8(EC683)构建体的S DS-PAGE凝胶。具有MW标志物和来自构建体的经表达的蛋白质的凝胶泳道 样品是：1)MW标志物；在接种后的以下时间点的经大肠杆菌发酵#EC682 澄清的可溶性溶解产物：2)16小时、3)24小时、4)40小时、5)45小时； 在接种后的以下时间点的经大肠杆菌发酵#EC683澄清的可溶性溶解产物：6) 16小时、7)24小时、8)40小时、9)45小时；经纯化的CBD-R-XTEN_A E864-RH8参考标准：10)1微克、11)2微克和12)4微克。对于经大肠杆菌 发酵澄清的可溶性溶解产物来说，每个泳道代表3微升的发酵槽培养物。全 长蛋白质斑点出现在有轮廓线的框内。较低分子量的色带是宿主细胞蛋白质。
图46示出了如实施例18中所描述，Toyopearl Phenyl 650 M疏水相互作 用色谱的迹线输出。
图47示出了如图中所指示并且如实施例18中所描述，Toyopearl Phenyl 650 M疏水相互作用色谱部分的非还原性4-12％Bis-Tris SDS-PAGE分析。每 个泳道的材料是：泳道1：标志物；泳道2：加载物7.5μl；泳道3：流通液1； 泳道4：流通液2；泳道5：洗脱部分E1；泳道6：洗脱部分E2；泳道7：洗 脱部分E3；泳道8：洗脱部分E4；泳道9：洗脱部分E5；泳道10：洗脱部 分E6；泳道11：洗脱部分E7；泳道12：洗脱部分E8。
图48示出了如实施例18中所描述的Toyopearl IMAC色谱流通液、洗涤 液(图48A)和洗脱部分(图48B)(非还原性)的非还原性4-12％Bis-Tris SDS-PAGE分析。
图49示出了实施例18中所描述的经胰蛋白酶消化的IMAC汇集物的非 还原性SDS-PAGE分析。
图50示出了实施例18中所描述的MacroCap Q色谱的洗脱型态。
图51示出了如实施例18中所描述，MacroCap Q洗脱部分的4-12％Bi s-Tris SDS-PAGE分析。图51A，流通液，考马斯染色(Coomassie staining)。 图51B，洗脱部分，考马斯染色。图51C，洗脱部分，银染色。
图52示出了如实施例18中所描述，来自MacroCap Q洗脱部分的C18 RP-HPLC分析的迹线。
图53示出了如实施例18中所描述，来自MacroCap Q洗脱汇集物的C18 RP-HPLC的迹线。
图54示出了如实施例19中所描述，Toyopearl Phenyl 650 M疏水相互作 用色谱部分的非还原性SDS-PAGE分析。
图55示出了如实施例19中所描述，Toyopearl IMAC色谱部分的非还原 性SDS-PAGE分析。
图56示出了如实施例19中所描述，MacroCap Q洗脱部分的非还原性 4-12％Bis-Tris SDS-PAGE/银染色分析。
图57示出了如实施例19中所描述，来自MacroCap Q洗脱部分的C18 RP-HPLC分析的迹线。
图58示出了实施例19中所描述的来自MacroCap Q洗脱汇集物的C18 RP-HPLC分析的迹线。
图59示出了如实施例20中所描述，在大肠杆菌中表达之后具有实验标 签的XTEN构建体的SDS-PAGE分析。将可溶性溶解产物加载于4-12％ Bis-Tris聚丙烯酰胺凝胶上，每个泳道加载的量相当于36μl的细胞培养悬浮 液。使用标准方法用考马斯蓝染色将凝胶染色。
图60示出了如实施例20中所描述，在大肠杆菌中表达的RP11-XTEN- His8构建体的SDS-PAGE分析。将经过热处理的可溶性溶解产物加载于4-1 2％Bis-Tris聚丙烯酰胺凝胶上，其量分别相当于1或2μl的细胞培养悬浮液。 用考马斯蓝染色将凝胶染色。凝胶展示了基本上所有经表达的RP11-XTEN- His8蛋白质都在成团的部分中发现。
图61示出了实施例21中所描述的RP11-XTEN-His8多肽的MacroCap S P纯化的SDS-PAGE分析。通过4-12％SDS-PAGE对部分进行分析，接下来 进行考马斯染色。
图62示出了实施例21中所描述的RP11-XTEN-His8多肽的IMAC纯化 的SDS-PAGE分析。通过4-12％SDS-PAGE对部分进行分析，接下来进行考 马斯染色。
图63示出了通过实施例21中所描述的两个色谱步骤(SP+IMAC)纯化的 RP11-XTEN-His8蛋白质的胰蛋白酶消化的SDS-PAGE分析。通过4-12％ SDS-PAGE对制剂进行分析，接下来进行考马斯染色(图63A)和银染色(图 63B)。
图64示出了如实施例23中所描述的DBCO-Mal与3x硫醇-XTEN的缀 合反应的分析的结果。图64A示出了反应混合物的C18 RP-HPLC分析。将 20μg蛋白质样品加载于Phenomenex Jupiter C18 5uM 300A 4.6mm×1 50mm柱上。以含乙腈的0.1％三氟乙酸的5-50％梯度来洗脱蛋白质。图64 B示出了DBCO-XTEN反应产物的HIC纯化。图64C示出了经HIC纯化的D BCO-XTEN反应产物的C18 RP-HPLC分析。
图65示出了如实施例24中所描述，加双标签的前体XTEN的胰蛋白酶 裂解的结果。图65A示出了每个泳道加载2μg的蛋白质样品的4-12％Bis-Tris SDS-PAGE分析。用Invitrogen SimplyBlue SafeStain将凝胶染色。图65B示 出了每个泳道加载0.5μg的蛋白质样品的4-12％Bis-Tris SDS-PAGE分析。用 Pierce银染色试剂盒将凝胶染色。
图66示出了如实施例24中所描述，经胰蛋白酶消化的加双标签的前体 的MacroCap Q纯化的SDS-PAGE分析的结果。图66A示出了每个泳道加载 3μg的蛋白质样品的4-12％Bis-Tris SDS-PAGE分析。用Invitrogen SimplyBlue SafeStain将凝胶染色。图66B示出了每个泳道加载0.5μg的蛋白质样品的 4-12％Bis-Tris SDS-PAGE分析。用Pierce银染色试剂盒将凝胶染色。图66C 示出了每个泳道加载0.5μg的蛋白质样品的4-12％Bis-Tris SDS-PAGE分析。 用Pierce银染色试剂盒将凝胶染色。
图67示出了残余胰蛋白酶活性的C18 RP-HPLC测试的结果。图67A是 呈完整形式的合成[G2]GLP2肽的分析的迹线输出。图67B是经牛胰蛋白酶消 化的合成[G2]GLP2肽的分析的迹线输出。图67C是如实施例24中所描述， 外加有[G2]GLP2并且在37℃下孵育过夜的XTEN_AE869_Am1,C2的分析的 迹线输出。
图68示出了如实施例26中所描述，从GLP2-Cys肽和1x氨基-XTEN制 备GLP2-XTEN缀合物。将20μg蛋白质样品加载于Phenomenex Jupiter C18 5 uM 300A 4.6mm×150mm柱上。以含乙腈的0.1％三氟乙酸的5-50％梯度来 洗脱蛋白质，并且通过在214nm下的吸光度来检测(左图A-C)。使用NanoSep 3K Omega离心装置(Pall Corp.)使100μg蛋白质样品脱盐。将于50％乙腈、 0.5％甲酸中的蛋白质溶液以10ul/分钟的流速注入到高分辨率质谱仪中。在 800-1600amu的范围内撷取ESI-MS光谱，并且使用Bayesian蛋白质重构软 件重构成零电荷光谱(右图A-C)。图68A：初始的1x氨基-XTEN蛋白质。图 68B：1x氨基-XTEN与磺基-SMCC交联剂之间反应的产物。图68C：在 GLP2-Cys与N-Mal-XTEN之间反应之后经纯化的GLP2-XTEN缀合物。
图69示出了如实施例27中所描述，从GLP2-Mal肽和1x硫醇-XTEN制 备GLP2-XTEN缀合物。将20μg蛋白质样品加载于Phenomenex Jupiter C18 5 uM 300A 4.6mm×150mm柱上。以含乙腈的0.1％三氟乙酸的5-50％梯度来 洗脱蛋白质，并且通过在214nm下的吸光度来检测(左图A、B)。使用NanoSep 3K Omega离心装置(Pall Corp.)使100μg蛋白质样品脱盐。将于50％乙腈、 0.5％甲酸中的蛋白质溶液以10ul/分钟的流速注入到高分辨率质谱仪中。在 800-1600amu的范围内撷取ESI-MS光谱，并且使用Bayesian蛋白质重构软 件重构成零电荷光谱(右图A、B)。图69A：初始的1x硫醇-XTEN蛋白质。图69B：GLP2-Mal与1x硫醇-XTEN之间反应的产物。
图70示出了如实施例27中所描述，使用制备型C4 RP-HPLC纯化 GLP2-XTEN的结果。图70A示出了制备型RP-HPLC的色谱型态。收集56-62 分钟的部分，并且在真空下蒸发。图70B示出了通过C18 RP-HPLC对经纯化 的GLP2-XTEN进行的分析。
图71示出了如实施例28中所描述，DBCO-Mal与1x硫醇-XTEN缀合 的结果。图71A示出了反应混合物的C18 RP-HPLC分析。将20μg蛋白质样 品加载于Phenomenex Jupiter C185uM 300A 4.6mm×150mm柱上。以含乙 腈的0.1％三氟乙酸的5-50％梯度来洗脱蛋白质。图71B示出了DBCO-XTEN 的HIC纯化。图71C示出了经HIC纯化的DBCO-XTEN的C18 RP-HPLC分析。
图72示出了如实施例31中所描述，与经交联的FITC缀合的XTEN的 分析试验的结果。图72A示出了通过UV灯箱成像的凝胶中的共迁移来显示 含FITC的缀合物质的大的表观MW，这也通过在SEC柱中OD214(蛋白质 信号)和OD495(FITC信号)下的SEC来检测，从而指示具有最小的游离染料 污染的XTEN的成功标记。在MW标准之后的通过泳道的材料(从左到右)是： 经标记的FITC-CL-CBD-XTEN；经标记的FITC-CL-XTEN；经纯化的FITC- CL-XTEN；经纯化的FITC-CL-XTEN；以及经纯化的FITC-CL-XTEN。通过 UV灯箱使凝胶成像来显示含FITC的物质的FITC表观MW。图72B示出了 经FITC缀合的XTEN的SEC分析的结果，从而显示在OD214和OD495下 检测的材料的输出的重叠，以及表观大分子量。
图73示出了如实施例32中所描述，交联到XTEN的GFP的缀合物和游 离GFP的峰值洗脱部分的SEC分析的结果。通过在SEC柱中OD214蛋白质 信号和OD395GFP信号的共迁移来确认交联。
图74示出了如实施例33中所描述，在食蟹猴中测试的GFP-X-XTEN和 FITC-X-XTEN的药物动力学试验的结果。
图75示出了如实施例33中所描述，皮下或静脉内施用单次剂量的连接 到不同长度的非结构化多肽的GFP的不同组合物之后食蟹猴中的药物动力学 型态(血浆浓度)。组合物是GFP-L288、GFP-L576、GFP-XTEN_AF576、 GFP-Y576和XTEN_AD836-GFP。在注射后的多个时间分析血液样品，并且 通过ELISA使用用于捕获的针对GFP的多克隆抗体和用于检测的相同多克隆 抗体的生物素化制剂来测量血浆中GFP的浓度。结果是以血浆浓度对比给药后的时间(h)来呈现，并且特别显示具有最长序列长度的XTEN的组合物 XTEN_AD836-GFP的半衰期的显著增加。具有最短序列长度的构建体 GFP-L288具有最短半衰期。
图76示出了来自融合到GFP的N端的XTEN_AE864的融合蛋白质的稳 定性研究的样品的SDS-PAGE凝胶。如实施例55中所描述，在37℃下于食 蟹猴血浆和大鼠肾溶解产物中孵育GFP-XTEN至多7天。另外，还评定了施 用给食蟹猴的GFP-XTEN。第0天、第1天和第7天取出样品，并且通过SDS PAGE进行分析，接下来使用西方分析进行检测并用针对GFP的抗体进行检 测。
图77示出了如实施例56所描述的来进行，Ex4-XTEN_AE864的近UV 圆二色光谱。
图78示出了如实施例58中所描述，针对已知分子量的蛋白质标准测量 的胰高血糖素-XTEN构建体样品的尺寸排阻色谱分析的结果，其中图形以吸 光度对比保留体积来输出。胰高血糖素-XTEN构建体是1)胰高血糖素-Y288； 2)胰高血糖素Y-144；3)胰高血糖素-Y72；以及4)胰高血糖素-Y36。结果指示
图79是算法SegScore(实施例59)的逻辑流程图的示意图。在这个图中， 应用以下图例：i、j-在贯穿整个序列的控制回路中所用的计算符；HitCount -这个变量是记录子序列多少次遭遇方块中的相同子序列的计算符；SubSeqX -这个变量保存了正在检查冗余的子序列；SubSeqY-这个变量保存了检查 SubSeqX所针对的子序列；BlockLen-这个变量保存了用户决定的方块长度； SegLen-这个变量保存了区段的长度。对程序进行硬编码以产生长度是3、4、 5、6、7、8、9和10的子序列的计分；Block-这个变量保存了长度BlockLen 的字符串。这个字符串由来自输入XTEN序列的字母组成并且由i计算符的 位置决定；SubSeqList-这是保存了所有产生的子序列计分的列表。
图80描绘了将算法SegScore应用到11个氨基酸的假定XTEN以确定重 复性。由N个氨基酸组成的XTEN序列被分成长度S(在这种情况下S＝3) 的N-S+1个子序列。进行所有子序列的成对比较，并且计算相同子序列的平 均数目，从而在这种情况下得到1.89的子序列计分。
图81提供了如实施例12中所描述，用来测量RP11克隆体pSD0107到 pSD0118的荧光信号的试验的结果。包括一个阳性对照(pLCW970)和两个阴 性对照(pBr322和pLCW970+10mM磷酸盐)。每个构建体使用来自2-3个摇 瓶的样品来测量GFP表达水平。
图82示出了文库LCW1157-1159的筛选结果。图82A-C提供了如实施例 12中所描述，LCW1157-1159的荧光直方图，从而显示针对每个荧光信号区 鉴别的集落的数目。在图中标出阴性对照(黑色箭头)和阳性对照pSD0116(白 色箭头)的平均荧光读数。图82D-F提供了所选克隆体的原始测试与再测试中 的荧光读数之间的相关性。
图83示出了如实施例12中所描述，在未还原的条件下最高的8个表达 构建体产物和对照的SDS-PAGE分析的结果。所需的全长蛋白质终产物 RP11-XTEN-GFP用箭头指示，并且较高色带是蛋白质的二聚体。泳道：1-8： 最高的8个表达构建体(表达水平从高到低，基于再测试的荧光读数)，1. LCW1159.004，2.LCW1159.006，3.LCW1158.004，4.LCW1157.040，5. LCW1158.003，6.LCW1157.039，7.LCW1157.025，8.LCW1157.038；C1-C3： 对照：C1.pSD0114，C2.pSD0116，C3.pCW1146(阴性对照)。
图84示出了如实施例12中所描述，在非还原性条件下最高的4个表达 构建体产物的MacroCap SP捕获效率的SDS-PAGE评估。泳道1-4： LCW1159.004的加载物、流通液、洗涤液和洗脱液。2.泳道5-8：LCW1159.006 的加载物、流通液、洗涤液和洗脱液。泳道9-12：LCW1158.004的加载物、 流通液、洗涤液和洗脱液。13-16：LCW1157.040的加载物、流通液、洗涤液 和洗脱液。泳道17-20 1-4：阴性对照的加载物、流通液、洗涤液和洗脱液。 未标记的泳道是分子量标准。
图85示出了如实施例12中所描述，在再测试中比较最高的4个表达产 物和对照的荧光信号的文库LCW1163筛选结果的总结。每个样品具有4次重 复，用图中的4个个别的点表示。
图86示出了如实施例12中所描述，文库LCW1160筛选结果的总结。 LCW1157-1159的荧光直方图，显示针对每个荧光信号区鉴别的集落的数目； 在图中标出阴性对照(黑色箭头)、pSD0116(白色箭头)和LCW1159.004(来自 筛选LCW1157-1159的高表达候选物，灰色箭头)的平均荧光读数。
图87示出了如实施例14中所描述的MacroCap Q部分的4-12％ SDS-PAGE/银染色分析。图87A：批次2，泳道1：分子量标准；泳道2-5： 分别是MacroCap Q流通部分1-4；泳道6-16：分别是MacroCap Q洗脱部分 1-11。图87B：批次1，泳道1：分子量标准；泳道2-6：分别是MacroCap Q 流通部分1-5；泳道7-16：分别是MacroCap Q洗脱部分1-10。
图88示出了如实施例34中所描述，在制备1xDBCO,3xLHRH-XTEN期 间中间物和最终产物的分析的结果。
图89示出了如实施例35中所描述，通过C18-RP-HPLC和质谱法分析的 来自制备缀合物到1x叠氮化物,3xMMAE-XTEN的反应混合物的分析的结 果。图89A是初始的1x氨基,3x硫醇-XTEN反应物的分析。图89B是用MMAE- 马来酰亚胺进行蛋白质修饰的分析，从而显示质量增加对应于用MMAE-Mal 进行三个半胱氨酸的修饰。图89C示出了用叠氮化物-PEG4-NHS酯进行蛋白 质修饰的分析，其中质量增加对应于叠氮化物-PEG4部分的单一添加。
图90示出了如实施例36中所描述，在3xLHRH,3xMMAE-XTEN的缀合 物中的反应产物的分析。图90A：点击缀合物的SDS-PAGE分析。将每个泳 道0.5μg的蛋白质加载于12％Bis-Tris NuPAGE微型凝胶(Life Technologies) 上。用Pierce银染色试剂盒(ThermoScientific，目录号24612)将凝胶染色。泳 道1，1x叠氮化物,3xMMAE-XTEN；泳道2，1xDBCO,3xLHRH-XTEN；泳 道3，点击化学反应的产物。缀合产物的色带用箭头指示。图90B：点击缀合反应物和产物的C4 RP-HPLC分析-(1)1xDBCO,3xLHRH-XTEN；(2)1x叠 氮化物,3xMMAE-XTEN；(3)点击化学反应的产物。
图91示出了如实施例37中所描述，在制备1xLHRH,3xMMAE-XTEN的 缀合物期间的反应的流程图。图91A：初始的1x氨基,3x硫醇-XTEN；图91 B：用2,2'-二吡啶基二硫化物进行蛋白质修饰；图91C：用DBCO-磺基-NHS 进行蛋白质修饰；图91D：用TCEP对半胱氨酸进行脱保护；图91E：用M MAE-Mal进行三个半胱氨酸的修饰；图91F：LHRH-叠氮化物与N端DBCO缀合。
图92示出了如实施例41中所描述，在制备1xMal,3xPTX-XTEN反应物 的缀合物期间的反应的流程图。图92A：初始的1x氨基,3x硫醇-XTEN；图 92B：用PTX-Mal进行蛋白质修饰；图92C：用磺基-SMCC进行蛋白质修饰。
图93示出了如实施例42中所描述，来自制备碘乙酰基-XTEN的反应混 合物的分析的结果。图93A：在与10x过量的SIA一起孵育之前和之后通过 C18-RP-HPLC分析的1x氨基-XTEN。图93B：经SIA修饰的1x氨基-XTEN 的ESI-MS分析。图93C：通过C18 RP-HPLC分析的样品-下部型态-HC KFWW肽。中间型态-IA-XTEN。上部型态-IA-XTEN与5x过量的HCK FWW肽的反应。
图94示出了如实施例14中所描述，筛选文库LCW1171、1172、1203 和1204的结果。图94A-D：LCW1171、1172、1203、1204的荧光直方图， 从而显示针对每个荧光信号区鉴别的集落的数目；在图94A和B中标出当筛 选LCW1171-1172时阴性对照(黑色箭头)和pSD0116(白色箭头)的平均荧光读 数；在图94C和D中标出当筛选LCW1203-1204时阴性对照(黑色箭头)、 pSD0116(白色箭头)和CBD对照(灰色箭头)的平均荧光读数。
图95示出了如实施例12中所描述，筛选文库LCW1208-1210的结果。 图95A-C：LCW1208-1210的荧光直方图，显示针对每个荧光信号区鉴别的 集落的数目；在图中标出阴性对照(黑色箭头)和CBD对照(灰色箭头)的平均 荧光读数。
图96说明了从含有相同长度和序列的XTEN的三个重复拷贝的前体产生 XTEN区段。在图96A中，XTEN前体包含由相同的蛋白酶裂解位点侧接的 XTEN的三个相同拷贝。在图96B中，XTEN前体进一步包含N端和C端亲 和纯化标签以有助于全长前体分子的纯化。在纯化前体之后，用作用于所有 并入的裂解序列的蛋白酶使前体裂解以从XTEN中释放标签，接下来进行纯 化以分离XTEN的个别单元，从而有助于从长链前体分子以高产率产生具有 短长度和中间长度的XTEN。
图97说明了三聚、分支XTEN-有效负载缀合物的不同实施方案，其中 所示出的所有缀合物都可以从相同的XTEN分子经由缀合到其N端氨基和官 能团来制备，这个官能团如半胱氨酸的硫醇，其接近于C端定位。图97A和 B说明了具有单一的有效负载分子的缀合物，其中图97A使用所有XTEN都 紧密缀合到有效负载的4臂交联剂，从而显著屏蔽有效负载与其它分子的相 互作用。图97B说明了如下构型：其中有效负载缀合到在这个构型的远端分支的单一的XTEN臂，从而与图97A的构型相比减少了有效负载屏蔽。图97C 说明了具有两个有效负载的缀合物，这可以使亲合力增加或效力增加。图97D 和E说明了具有三个相同的有效负载以进一步增加效力和/或亲合力的构型。 图97F说明了具有一个有效负载A和有效负载B的两个相同拷贝以供高亲合 力结合或相互作用的构型。图97G说明了具有3个不同的有效负载的构型， 这能够将三种不同的功能纳入到单一的XTEN缀合物中。
图98说明了在分支XTEN与单一的有效负载分子之间合成缀合物的流 程。最初，通过与碘乙酰胺反应来阻断XTEN中的硫醇基(或者，可以使用缺 乏硫醇基的XTEN来开始合成)。接下来，将DBCO基团添加到XTEN的α- 氨基中，然后与四官能交联剂反应，这种四官能交联剂包含一个碘乙酰基和 三个叠氮基。接下来，所得XTEN与带有游离硫醇基的有效负载反应，从而 得到最终XTEN-有效负载缀合物。
图99说明了在分支XTEN与单一的有效负载分子之间合成缀合物的流 程。通过使XTEN与包含两个叠氮官能团和NHS官能团的三官能接头反应， 接下来经由马来酰亚胺化学将有效负载A添加到硫醇基中来产生中间物(这 两个步骤的次序可以颠倒)。通过使具有半胱氨酸的XTEN与碘乙酰胺反应以 阻断游离硫醇基，接下来经由NHS活化将DBCO添加到α-氨基中来产生第 二个中间物(这两个步骤的次序可以颠倒)。随后，使用点击化学反应来缀合中 间物分子，从而得到最终XTEN-有效负载缀合物。
图100说明了合成具有分支XTEN和两个相同的有效负载分子的缀合物 的流程。通过经由NHS化学将DBCO基团添加到XTEN的α-氨基中来产生 中间物。通过用碘乙酰胺阻断XTEN的游离硫醇基，接下来将三官能交联剂 (用NHS活化的2个N-马来酰亚胺基和羧基)添加到α-氨基中来产生第二个中 间物(这两个步骤的次序可以颠倒)。使两个中间物反应，从而得到分支缀合物， 然后经由点击化学反应添加两个有效负载A分子，从而得到最终产物XTEN- 有效负载缀合物。
图101说明了合成具有分支XTEN和三个相同的有效负载分子的缀合物 的流程。通过经由NHS化学将DBCO基团添加到XTEN的α-氨基中来产生 中间物。通过经由N-马来酰亚胺官能团使有效负载A缀合到XTEN的硫醇基 来产生另一个中间物。经由包含三个叠氮官能团的三官能交联剂将三个分子 连接在一起，从而得到最终XTEN-有效负载缀合物。
图102说明了合成具有分支XTEN和三个相同的有效负载分子的缀合物 的流程。通过经由N-马来酰亚胺化学将DBCO基团添加到XTEN A的硫醇基 中来产生中间物。在下一个步骤中，经由NHS化学使有效负载A缀合到XTEN 中间物的α-氨基。经由包含三个叠氮官能团的三官能交联剂来连接所得 XTEN的三个分子，从而得到最终XTEN-有效负载缀合物。
图103说明了合成每个缀合物具有分支XTEN和两个有效负载A和一个 有效负载B分子的缀合物的流程。通过使用N-马来酰亚胺官能团将有效负载 A添加到XTEN的硫醇基中，接下来将三官能交联剂(用NHS活化的两个叠 氮基和羧基)添加到α-氨基中来产生中间物(这两个步骤的次序可以颠倒)。通 过经由NHS活化将DBCO添加到XTEN的α-氨基中，接下来使用N-马来酰 亚胺基将有效负载B添加到XTEN的游离硫醇基中来产生第二个中间物(这两 个步骤的次序可以颠倒)。使第二个中间物的两个分子与第一个中间物的一个 分子反应，形成最终XTEN-有效负载缀合物。
图104说明了合成具有分支XTEN和三个不同的有效负载的缀合物的流 程。通过使用N-马来酰亚胺官能团将有效负载A添加到XTEN上的硫醇基中， 接下来将三官能交联剂(用NHS活化的一个叠氮基、一个N-马来酰亚胺基和 一个羧基)添加到α-氨基中来产生中间物(这两个步骤的次序可以颠倒)。通过 经由NHS化学将有效负载B添加到XTEN的α-氨基中来产生第二个中间物。 通过经由NHS活化将DBCO添加到XTEN的α-氨基中，接下来使用N-马来 酰亚胺基将有效负载C添加到XTEN的游离硫醇基中来产生第三个中间物(这 两个步骤的次序可以颠倒)。使三个中间物彼此反应，形成最终XTEN-有效负 载缀合物。
图105说明了合成具有二聚或四聚分支XTEN和有效负载A分子的缀合 物的流程。通过使用N-马来酰亚胺官能团将DBCO添加到XTEN的硫醇基 中，接下来使用NHS将有效负载A添加到XTEN的氨基中来产生中间物(这 两个步骤的次序可以颠倒)。随后，通过添加叠氮化物交联剂使中间物进行多 聚。使用二价交联剂得到二聚构型，并且使用四价交联剂得到最终产物的四 聚构型。
图106说明了合成具有分支XTEN和三个不同的有效负载的缀合物的流 程。通过使用N-马来酰亚胺官能团将有效负载A添加到XTEN的硫醇基中， 接下来将三官能交联剂(用NHS活化的一个叠氮基、一个N-马来酰亚胺基和 一个羧基)添加到α-氨基中来产生中间物(这两个步骤的次序可以颠倒)。通过 经由N-马来酰亚胺官能团将有效负载B添加到XTEN的游离硫醇基中来产生 第二个中间物。通过经由NHS活化将DBCO添加到XTEN的α-氨基中，接下来使用N-马来酰亚胺基将有效负载C添加到游离硫醇基中来产生第三个中 间物(这两个步骤的次序可以颠倒)。使三个中间物彼此反应，形成最终XTEN- 有效负载缀合物。
图107示出了如实施例38中所描述，通过C18-RP-HPLC和质谱法分析 的来自制备缀合物到1xDBCO,3xFA(γ)-XTEN的反应混合物的分析的结果。 图107A是初始的1x氨基,3x硫醇-XTEN反应物的分析。图107B是用叶酸盐 -γ-马来酰亚胺进行蛋白质修饰的分析，从而显示质量增加对应于用FA(γ)-Mal 进行三个半胱氨酸的修饰。图107C示出了用DBCO-磺基-NHS酯进行蛋白质 修饰的分析，其中质量增加对应于DBCO部分的单一添加。
图108示出了如实施例39中所描述，点击缀合反应物和产物3xFA(γ),3x MMAE-XTEN的C4 RP-HPLC分析。(1)1xDBCO,3xFA(γ)-XTEN；(2)1x叠 氮化物,3xMMAE-XTEN；(3)点击化学反应的产物。
图109示出了如实施例39中所描述，通过制备型RP-HPLC纯化的最终3xFA(γ),3xMMAE-XTEN产物的分析。图109A示出了尺寸排阻色谱分析(Ph enomenex BioSep-SEC-s4000 600×7.80mm柱，50mM磷酸钠pH 6.5，3 00mM NaCl缓冲液，流速0.5ml/分钟，等度洗脱70分钟)。图109B示出 了RP-HPLC分析(Phenomenex Jupiter C18 5μM150×4.60mm柱， 缓冲液A：含0.1％TFA的H2O，缓冲液B：含0.1％TFA的CAN，流速： 1ml/分钟，梯度：在45分钟内5％到50％B)。图109C示出了ESI-MS分析 (QSTAR-XL，计算MW 85,085.4Da，实验MW 85,091Da)。
图110示出了如实施例62中所描述的来进行，重组GLP2-2G-XTEN(实 心正方形)和缀合物GLP2-2G-XTEN(实心圆)的GPCR Ca2+动员活性的结果。
图111示出了如实施例63中所描述的来进行，在37℃下于多个时间点处 重组GLP2-2G-XTEN(实心正方形)和缀合物GLP2-2G-XTEN(实心三角形) 的体外人类血浆稳定性的结果。
图112示出了如实施例64中所描述的来进行，大鼠中重组GLP2-2G-XT EN(实心正方形)和缀合物GLP2-2G-XTEN(实心三角形)的药物动力学型态 的结果。
图113.图113A示出了三[2-马来酰亚胺基乙基]胺与1x氨基,1x硫醇-XT EN432之间的反应产物的SEC-HPLC分析：图113A-缀合混合物：峰1- 三聚XTEN，峰2-二聚XTEN，峰3-未反应的单体XTEN；图113B- 线性XTEN_1296对照；图113C-线性XTEN_864对照；图113D-线性X TEN_432对照。
图114.图114A示出了如实施例65中所描述，DBCO-磺基-NHS与1x 氨基-XTEN_288缀合的C18 RP-HPLC分析。未反应的XTEN在19分钟时洗 脱。1xDBCO-XTEN_288在27分钟时洗脱。DBCO-磺基-NHS试剂和其水解 产物分别在41.5分钟和38.5分钟时洗脱。图114B示出了叠氮基-PEG4-NHS 酯与三(2-氨乙基)胺缀合的C18 RP-HPLC分析。3x叠氮化物-PEG4-TAEA通 过MALDI-TOF MS和ESI-MS鉴别为具有966Da的MW的产物。
图115示出了如实施例66中所描述，3x叠氮化物-PEG4-TAEA与 1xDBCO-XTEN_288之间的反应产物的SEC-HPLC分析：(迹线A)缀合混合 物：峰1-三聚XTEN，峰2-二聚XTEN，峰3-未反应的单体XTEN，峰 4-低分子量化合物；(迹线B)线性XTEN_864对照；(迹线C)线性XTEN576 对照；(迹线D)线性XTEN_288对照。
图116示出了如实施例69中所描述，展示3xFA(γ),3xMMAE-XTEN对K B细胞的选择性细胞毒性的杀伤试验的结果。示出了以下组的抑制性剂量反 应曲线：游离MMAE(实心圆)；3xMMAE-XTEN(实心的倒三角形)；以及 在存在(实心三角形)和不存在(实心正方形)对KB细胞的叶酸竞争剂的情况下 的3xFA(γ),3xMMAE-XTEN。
图117示出了XTEN-有效负载缀合物3xFA(γ),3xMMAE-XTEN的结构。 图117A示出了通过叠氮化物1-叠氮基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸、N-羟基 琥珀酰亚胺酯与炔烃6-(11,12-二脱氢二苯并[b,f]吖辛因-5(6H)-基)-6-氧代己 酸、N-羟基琥珀酰亚胺(或N-羟基磺基琥珀酰亚胺)酯的反应而连接的两个 XTEN。图117B示出了经叶酸盐-γ-氨戊基-马来酰亚胺修饰的Cys的X残基。 图117C示出了经马来酰亚胺基己酰基-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苯甲氧羰基-单 甲基奥利司他汀E修饰的Cys的Z残基。
发明详述
在描述本发明的实施方案之前，要了解的是，这些实施方案仅仅作为实 例而提供，并且在实施本发明中可以采用本文所描述的本发明的实施方案的 各种替代方案。众多变更、变化和取代现在将在不脱离本发明的情况下被本 领域的技术人员所想到。
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属 领域的一般技术人员通常所理解的含义相同的含义。虽然在本发明的实施或 测试中可以使用类似于或等效于本文所描述的方法和材料，但下文描述了适 合的方法和材料。在相矛盾的情况下，将以专利说明书(包括定义)为准。另外， 材料、方法和实例仅仅是说明性的并且不打算有限制性。众多变更、变化和 取代现在将在不脱离本发明的情况下被本领域的技术人员所想到。
定义
在本申请的上下文中，除非另有规定，否则以下术语具有赋予其的含义：
如贯穿本说明书和权利要求书所使用，术语“一(a/an)”和“所述”以其意味 着“至少一个”、“至少第一”、“一个或多个”或“多个”所提及的组分或步骤的意 义来使用，其中上限在此后特别规定的情形除外。因此，如本文所用的“有效 负载”意味着“至少第一有效负载”，但包括多个有效负载。组合的可操作界限 和参数，如同任何单剂的量一样，将鉴于本公开为本领域的一般技术人员所 知。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，以指代任何长度的氨 基酸的聚合物。聚合物可以是线性或分支的，其可以包含经修饰的氨基酸， 并且其可以间杂有非氨基酸。这些术语还涵盖了已经修饰的氨基酸聚合物， 例如，通过二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作， 如与标记组分缀合。
如本文所用的术语“氨基酸”指的是天然和/或非天然或合成氨基酸，包括 (但不限于)D或L光学异构体，以及氨基酸类似物和拟肽。使用标准单字母 或三字母代码来命名氨基酸。
“药理活性”剂包括需要递送给受试者的任何药物、化合物、物质组合物 或混合物，例如治疗剂、诊断剂或药物递送剂，其提供或期望提供某种药理 作用，通常是有益作用，这种作用可以在体内或体外展示。这些试剂可以包 括肽、蛋白质、碳水化合物、核酸、核苷、寡核苷酸和小分子合成化合物， 或其类似物。
术语“天然L-氨基酸”意味着甘氨酸(G)、脯氨酸(P)、丙氨酸(A)、缬氨酸 (V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)、苯丙氨酸(F)、 酪氨酸(Y)、色氨酸(W)、组氨酸(H)、赖氨酸(K)、精氨酸(R)、谷氨酰胺(Q)、 天冬酰胺(N)、谷氨酸(E)、天冬氨酸(D)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T)的L光学异构 体形式。
如应用于序列并且如本文所用的术语“非天然存在”意味着不具有与哺乳 动物中所发现的野生型或天然存在的序列的对应物，不与这个序列互补，或 不与这个序列具有高度同源性的多肽或多核苷酸序列。举例来说，非天然存 在的多肽或片段与天然序列相比在适当比对时可以共有不大于99％、98％、 95％、90％、80％、70％、60％、50％或甚至更小的氨基酸序列同一性。
术语“亲水”和“疏水”指的是物质与水所具有的亲和力的程度。亲水物质 对水具有强亲和力，从而倾向于溶解于水中、与水混合或被水润湿，而疏水 物质基本上缺乏对水的亲和力，从而倾向于排斥并且不吸收水，并且不倾向 于溶解于水中或与水混合或被水润湿。氨基酸可以基于其疏水性来表征。已 经开发了许多量表。一个实例是由Levitt,M等人,J Mol Biol(1976)104:59开 发的量表，其被列在Hopp,TP等人,Proc Natl Acad Sci U SA(1981)78:3824 中。“亲水氨基酸”的实例是精氨酸、赖氨酸、苏氨酸、丙氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。特别关注的是亲水氨基酸天冬氨酸、谷氨酸和丝氨酸以及甘氨酸。 “疏水氨基酸”的实例是色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、异 亮氨酸和缬氨酸。
“片段”当应用于生物活性蛋白质时，是生物活性蛋白质的截短形式，其 保留了至少一部分治疗和/或生物活性。“变异体”当应用于生物活性蛋白质时， 是与天然的生物活性蛋白质具有序列同源性的蛋白质，其保留了生物活性蛋 白质的至少一部分治疗和/或生物活性。举例来说，变异型蛋白质与参考生物 活性蛋白质相比可以共有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、 97％、98％或99％的氨基酸序列同一性。如本文所用的术语“生物活性蛋白质 变异体”包括有意地，例如通过定点诱变、合成编码基因、插入而修饰，或偶 然地通过突变而修饰并且保留活性的蛋白质。
术语“序列变异体”意味着与其天然或原始序列相比已经通过一个或多个 氨基酸插入、缺失或取代而修饰的多肽。插入可以定位在蛋白质的任一端或 两端，和/或可以位于氨基酸序列的内部区域内。一个非限制性实例是在生物 活性有效负载蛋白质的序列内插入XTEN序列。另一个非限制性实例是用不 同的氨基酸取代XTEN中的氨基酸。在缺失变异体中，去除了如本文所描述 的多肽中的一个或多个氨基酸残基。因此，缺失变异体包括有效负载多肽序 列的所有片段。在取代变异体中，去除了多肽的一个或多个氨基酸残基并且用替代性残基置换。在一个方面，取代在本质上是保守的，并且这种类型的 保守取代在本领域中是众所周知的。
术语“部分”意味着较大组合物的组分或将要并入到较大组合物中的组 分，如连接到较大多肽的药物分子或靶向肽的官能团。
如本文所用的“末端XTEN”指的是当有效负载是肽或多肽时，已经融合 到有效负载的N端或C端或在有效负载的N端或C端的XTEN序列。
术语“XTEN释放位点”指的是XTEN-有效负载中的裂解序列，其可以用 蛋白酶识别并裂解，从而实现XTEN或一部分XTEN从XTEN-有效负载多肽 中释放。如本文所用的“哺乳动物蛋白酶”意味着通常存在于哺乳动物的体液、 细胞或组织中的蛋白酶。XTEN释放位点可以经过工程改造以用各种哺乳动 物蛋白酶(又称为“XTEN释放蛋白酶”)裂解，这些蛋白酶如胰蛋白酶、FXIa、 FXIIa、激肽释放酶、FVIIIa、FVIIIa、FXa、FIIa(凝血酶)、弹性蛋白酶-2、 MMP-12、MMP13、MMP-17、MMP-20，或受试者中所存在的任何蛋白酶。 可以利用能够识别规定裂解位点的其它等效的蛋白酶(内源或外源)。裂解位点 可以针对所利用的蛋白酶进行调整和定制。
术语“在……内”当涉及第一多肽连接到第二多肽时，涵盖将第一多肽或 第二多肽的N端分别连接到第二多肽或第一多肽的C端的连接，以及第一多 肽插入到第二多肽的序列中。举例来说，当XTEN在有效负载多肽“内”连接 时，XTEN可以连接到N端、C端，或可以插入有效负载多肽的任何两个氨 基酸之间。
如应用于本文所提供的XTEN-有效负载组合物的形式的“活性”指的是作 用或效应，包括(但不限于)受体结合、拮抗剂活性、促效剂活性、细胞或生理 反应，或本领域中对于有效负载一般已知的效应(通过体外、离体或体内试验 来测量)，或临床效应。
如本文所用的术语“ELISA”指的是如本文所描述或如本领域中另外所知 的酶联免疫吸附试验。
“宿主细胞”包括个别的细胞或细胞培养物，其可以是或已经是主题载体 (如本文所描述的那些)的接受者。宿主细胞包括单一的宿主细胞的子代。子代 由于天然、偶然或有意突变而可能不一定与原始母细胞完全相同(在形态方面 或在总DNA补体的基因组方面)。宿主细胞包括在体内用本发明的载体转染 的细胞。
“经分离”当用于描述本文所公开的各种多肽时，意味着已经从其天然环 境的组分中鉴别并分离和/或回收的多肽。其天然环境的污染物组分是典型地 会干扰多肽的诊断或治疗用途的材料，并且可以包括酶、激素和其它蛋白质 类或非蛋白质类溶质。如本领域的技术人员显而易见，非天然存在的多核苷 酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段不需要“分离”来将其与其天然存在的 对应物相区分。另外，“经浓度”、“经分离”或“经稀释”的多核苷酸、肽、多肽、 蛋白质、抗体或其片段可与其天然存在的对应物相区分，这是在于每体积的分子的浓度或数目一般大于其天然存在的对应物。一般来说，通过重组手段 制造并且在宿主细胞中表达的多肽被视为“经分离”。
“经分离”的核酸是从至少一个污染物核酸分子中鉴别并分离的核酸分 子，在多肽编码核酸的天然来源中这个核酸分子通常与这至少一个污染物核 酸分子缔合。举例来说，经分离的多肽编码核酸分子不同于其在自然界中所 发现的形式或设置。因此，经分离的多肽编码核酸分子与特异性的多肽编码 核酸分子的区别在于其存在于天然细胞中。然而，经分离的多肽编码核酸分 子包括通常表达多肽的细胞中所含的多肽编码核酸分子，在这些细胞中，举 例来说，核酸分子在不同于天然细胞的染色体或染色体外位置中。
“嵌合”蛋白质含有至少一个融合多肽，这至少一个融合多肽包含在不同 于自然界中所存在的序列中的位置中的至少一个区域。这些区域可能通常存 在于独立的蛋白质中，并且在融合多肽中集合在一起；或其可能通常存在于 相同的蛋白质中，但在融合多肽中以新的排列放置。嵌合蛋白质可以例如通 过化学合成，或通过形成并翻译多核苷酸来形成，在这个多核苷酸中肽区以 所需的关系来编码。
“经融合”和“融合”在本文中可互换使用，并且指的是通过重组手段将两 个或更多个肽或多肽序列连接在一起。
“可操作地连接”意味着连接中的DNA序列是相连的，并且在阅读相中或 在框内。“框内融合”指的是以维持原始ORF的正确阅读框架的方式，连接两 个或更多个开放阅读框架(ORF)以形成连续更长的ORF。举例来说，如果启 动子或增强子影响多肽序列的转录，那么这个启动子或增强子可操作地连接 到多肽的编码序列。因此，所得重组融合蛋白质是含有两个或更多个区段的 单一蛋白质，这两个或更多个区段对应于由原始ORF编码的多肽(这些区段 在自然界中通常不会这样连接)。
“交联”、“缀合”“连接”和“连接到”在本文中可互换使用，并且指的是两个 不同的分子通过化学反应而共价连接。如下文更全面地描述，交联可以在一 个或多个化学反应中发生。
如本文所用的术语“缀合伴侣”指的是在缀合反应中可以连接或被连接的 个别组分。
术语“缀合物”打算指的是由于缀合伴侣一个与另一个共价连接而形成的 异质分子，例如，生物活性有效负载共价连接到XTEN分子或交联剂共价连 接到反应性XTEN。
“交联剂”和“接头”可互换使用，并且在其最宽泛的情形中意味着用于共 价连接两个或更多个实体的化学实体。举例来说，交联剂连接两个、三个、 四个或更多个XTEN，或将有效负载连接到XTEN，这些实体定义于本文中。 交联剂包括(但不限于)小分子零长度、同双官能或异双官能和多官能的交联剂 化合物的反应产物，两个点击化学反应物的反应产物。本领域的技术人员应 了解，交联剂可以指的是在反应物交联之后残留的共价结合的反应产物。交 联剂还可以包含尚未反应，但能够与另一个实体反应的一个或多个反应物。
在多肽的情形中，“线性序列”或“序列”是在氨基端到羧基端的方向上多 肽中的氨基酸的次序，其中在序列中彼此相邻的残基在多肽的一级结构中是 相连的。“部分序列”是已知在一个或两个方向上包含额外的残基的一部分多 肽的线性序列。
“异源”意味着来源于与其所比较的实体的其余部分在基因型方面不同的 实体。举例来说，从其天然编码序列中去除并且操作性地连接到不同于天然 序列的编码序列的富甘氨酸序列是异源富甘氨酸序列。如应用于多核苷酸、 多肽的术语“异源”意味着多核苷酸或多肽来源于与其所比较的实体的其余部 分在基因型方面不同的实体。
术语“多核苷酸”、“核酸”、“核苷酸”和“寡核苷酸”可互换使用。其指的是 任何长度的核苷酸的聚合形式，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。 多核苷酸可以具有任何三维结构，并且可以执行任何已知或未知的功能。以 下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段的编码或非编码区、从连锁 分析定义的基因座、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖 体RNA、核糖酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的经分离DNA、任何序列的经分离RNA、核酸探针和引物。多核苷 酸可以包含经修饰的核苷酸，如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。如果存在的 话，那么可以在聚合物组装之前或之后赋予对核苷酸结构的修饰。核苷酸的 序列可以间杂有非核苷酸组分。在聚合之后可以进一步修饰多核苷酸，例如 通过与标记组分缀合。
术语“多核苷酸的补体”表示与参考序列相比具有互补碱基序列和相反定 向的多核苷酸分子，以使得其可以完全保真地与参考序列杂交。
如应用于多核苷酸的“重组”意味着多核苷酸是可以包括克隆、限制和/或 接合步骤的重组步骤以及使得在宿主细胞中表达重组蛋白质的其它程序的各 种组合的产物。
术语“基因”和“基因片段”在本文中可互换使用。其指的是含有至少一个 开放阅读框架的多核苷酸，这至少一个开放阅读框架能够在转录和翻译之后 编码特定蛋白质。基因或基因片段可以是基因组或cDNA，只要多核苷酸含 有至少一个开放阅读框架即可，这至少一个开放阅读框架可以覆盖整个编码 区或其区段。“融合基因”是由至少两个连接在一起的异源多核苷酸组成的基 因。
“同源性”或“同源”或“序列同一性”指的是两个或更多个多核苷酸序列之 间或两个或更多个多肽序列之间的序列相似性或可互换性。当使用如BestFit 等程序来确定两个不同的氨基酸序列之间的序列同一性、相似性或同源性时， 可以使用默认设置，或可以选择适当的记分矩阵，如blosum45或blosum80， 来优化同一性、相似性或同源性计分。优选地，同源的多核苷酸是在如本文 所定义的严格条件下杂交并且与那些序列相比具有至少70％、优选地至少 80％、更优选地至少90％、更优选地95％、更优选地97％、更优选地98％并 且甚至更优选地99％的序列同一性的多核苷酸。同源的多肽优选地具有至少 70％、优选地至少80％、甚至更优选地至少90％、甚至更优选地至少95-99％ 一致的序列同一性。
如应用于多核酸的“接合”指的是在两个核酸片段或基因之间形成磷酸二 酯键，从而将其连接在一起的过程。为了将DNA片段或基因接合在一起， DNA的末端必须彼此相容。在一些情况下，末端在核酸内切酶消化之后将直 接相容。然而，可能必须要首先将在核酸内切酶消化之后通常产生的交错末 端转变成钝圆末端以使其对于接合来说是相容的。
术语“严格条件”或“严格杂交条件”包括提及如下条件：在这些条件下多 核苷酸将与其靶序列杂交，杂交程度可检测地高于其它序列(例如，高于背景 至少2倍)。一般来说，杂交的严格度部分地是根据进行洗涤步骤的温度和盐 浓度来表示。典型地，严格条件将为如下条件：其中盐浓度在pH 7.0到8.3 下小于约1.5M Na离子，典型地约0.01到1.0MNa离子浓度(或其它盐)，并 且温度对于短多核苷酸(例如，10到50个核苷酸)是至少约30℃并且对于长多 核苷酸(例如，大于50个核苷酸)是至少约60℃—举例来说，“严格条件”可以包括在37℃下于50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中杂交，并且在60℃到 65℃下于0.1×SSC/1％SDS中洗涤三次，每次15分钟。或者，可以使用约65℃、 60℃、55℃或42℃的温度。SSC浓度可以从约0.1×SSC到2×SSC之间变化， 其中SDS是以约0.1％存在。这些洗涤温度典型地经过选择以在规定的离子强 度和pH下比特异性序列的热熔点低约5℃到20℃。Tm是50％的靶序列与完 全匹配的探针杂交的温度(在规定的离子强度和pH下)。用于计算核酸杂交的 Tm和条件的等式是众所周知的，并且可以在Sambrook,J.等人,"MolecularCloning:A Laboratory Manual",第3版,Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001中找到。典型地，使用阻断试剂来阻断非特异性杂交。这些阻断试剂包 括例如约100-200μg/ml的经剪切和变性的鲑鱼精DNA。在特定情况下，例 如对于RNA:DNA杂交，还可以使用有机溶剂，如浓度为约35-50％v/v的甲 酰胺。这些洗涤条件的适用变化将为本领域的一般技术人员显而易见。
如应用于多核苷酸序列的术语“同一性百分比”、“序列同一性百分比”和 “同一性％”指的是使用标准化算法比对的至少两个多核苷酸序列之间残基匹 配的百分比。这种算法可以按标准化和可重现的方式将间隙插入到进行比较 的序列中，以优化两个序列之间的比对，并且因此实现两个序列的更有意义 的比较。同一性百分比可以在整个规定的多核苷酸序列的长度上测量，或可 以在较短长度上测量，例如，在从较大、规定的多核苷酸序列获取的片段的 长度上测量，例如，至少45个、至少60个、至少90个、至少120个、至少 150个、至少210个或至少450个相连残基的片段。这些长度仅仅是示范性 的，并且应了解，本文中、表格、图或序列表中所示的序列所支持的任何片 段长度都可以被用来描述可以测量同一性百分比的长度。序列同一性百分比 是通过在比较窗口上比较两个最佳比对序列，确定匹配位置的数目(在这些匹 配位置处相同的残基在两个多肽序列中出现)，用匹配位置的数目除以比较窗 口中的位置的总数(即，窗口尺寸)，以及用结果乘以100以得到序列同一性百 分比来计算。当要比较不同长度的序列时，最短序列规定了比较窗口的长度。 当计算序列同一性时不考虑保守取代。
关于本文所鉴别的多肽序列的“序列同一性百分比(％)”被定义为在比对 序列并且必要时引入间隙以实现最大序列同一性百分比，并且不将任何保守 取代视为序列同一性的一部分，由此得到最佳比对之后，查询序列中与第二 个参考多肽序列或其一部分的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。用于 确定氨基酸序列同一性百分比的目的的比对可以按本领域的技术范围内的各 种方式来实现，例如，使用公开可用的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、 ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域的技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括在进行比较的序列的全长上实现最佳比对所需的任何 算法。同一性百分比可以在整个规定的多肽序列的长度上测量，或可以在较 短长度上测量，例如，在从较大、规定的多肽序列获取的片段的长度上测量， 例如，至少15个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少 70个或至少150个相连残基的片段。这些长度仅仅是示范性的，并且应了解， 本文中、表格、图或序列表中所示的序列所支持的任何片段长度都可以被用 来描述可以测量同一性百分比的长度。
在多核苷酸序列的情形中所用的“重复性”指的是序列中内部同源性的程 度，例如，给定长度的相同核苷酸序列的频率。重复性可以例如通过分析相 同序列的频率来测量。
“载体”是核酸分子，优选地在适当宿主中自我复制，其将所插入的核酸 分子转移到宿主细胞中和/或宿主细胞之间。这个术语包括主要功能在于将 DNA或RNA插入到细胞中的载体，主要功能在于复制DNA或RNA的复制 载体，以及功能在于转录和/或翻译DNA或RNA的表达载体。还包括了提供 一种以上的上述功能的载体。“表达载体”是当引入到适当宿主细胞中时可以 被转录并翻译到多肽中的多核苷酸。“表达系统”通常意味着包含可以发挥功 能以得到所需的表达产物的表达载体的适合宿主细胞。
如应用于多肽的“抗血清降解性”指的是多肽在血液或其组分中耐受降解 的能力，降解典型地涉及血清或血浆中的蛋白酶。抗血清降解性可以通过典 型地历时一定天数范围(例如，0.25天、0.5天、1天、2天、4天、8天、16 天)，典型地在约37℃下，组合蛋白质与人类(或小鼠、大鼠、猴，视情况而 定)血清或血浆来测量。可以在西方墨点试验中操作这些时间点的样品，并且 用抗体来检测蛋白质。抗体可以连接到蛋白质中的标签。如果蛋白质在西方 墨点上显示单一的色带，其中蛋白质的尺寸与所注入的蛋白质的尺寸相同， 那么就没有发生降解。在这种示范性的方法中，如通过西方墨点法或等效技 术来判定的50％的蛋白质降解的时间点是蛋白质的血清降解半衰期或“血清 半衰期”。
术语“t1/2”、“半衰期”、“终末半衰期”、“消除半衰期”和“循环半衰期”在本 文中可互换使用，并且如本文所用，意味着以ln(2)/Kel计算的终末半衰期。 Kel是通过对数浓度对比时间的曲线的终末线性部分的线性回归来计算的终 末消除速率常数。半衰期典型地指的是沉积在活生物体中的所施用的物质的 一半量通过正常的生物过程代谢或消除所需的时间。
“活性清除”意味着蛋白质以不同于滤过的方式从循环中去除的机制，并 且包括通过细胞、受体、代谢或蛋白质降解而介导的从循环中去除。
“表观分子量因子”和“表观分子量”是相关术语，其指的是特定氨基酸或 多肽序列所展现的表观分子量的增加或减小的量度。表观分子量是使用尺寸 排阻色谱(SEC)或类似方法通过与球状蛋白质标准比较来测定，并且以“表观 kD”单位来测量。表观分子量因子是表观分子量与实际分子量之间的比率；后 者是通过基于氨基酸组成将组合物中每种类型的氨基酸的计算分子量相加或 通过在SDS电泳凝胶中与分子量标准比较进行估算来预测。代表性蛋白质的 表观分子量和表观分子量因子的测定描述于实施例中。
术语“流体动力学半径”或“斯托克斯半径(Stokes radius)”是溶液中分子的 有效半径(Rh，nm)，这是通过假定这个分子是移动通过溶液的物体并且受溶 液的粘度抵抗来测量。在本发明的实施方案中，XTEN多肽的流体动力学半 径测量与更直观的量度“表观分子量因子”相关联。蛋白质的“流体动力学半 径”影响其在水溶液中的扩散速率以及其在大分子凝胶中迁移的能力。蛋白质 的流体动力学半径是由其分子量以及由其结构(包括形状和致密性)来决定。测 定流体动力学半径的方法在本领域中是众所周知的，例如通过使用尺寸排阻 色谱(SEC)，如美国专利号6,406,632和7,294,513中所描述。大多数蛋白质具 有球状结构，其为蛋白质以最小的流体动力学半径可以具有的最致密的三维 结构。一些蛋白质采用随机和开放的、非结构化或‘线性’构象，并且因此与类 似分子量的典型球状蛋白质相比具有大得多的流体动力学半径。
“生理条件”指的是在活宿主中的一组条件以及模拟活受试者的那些条件 的体外条件，包括温度、盐浓度、pH。已经确立了许多用于体外试验中的生 理相关条件。一般来说，生理缓冲液含有生理浓度的盐，并且被调整到约6.5 至约7.8并且优选地约7.0至约7.5的范围内的中性pH。多种生理缓冲液被 列在Sambrook等人(2001)中。生理相关温度在约25℃至约38℃并且优选地 约35℃至约37℃的范围内。
“有效负载的单原子残基”意味着在与主题XTEN或XTEN-接头组合物反 应之后化学连接到XTEN的有效负载的原子；典型地是硫、氧、氮或碳原子。 举例来说，有效负载的原子残基可以是有效负载中的半胱氨酸硫醇反应基团 的硫残基，肽或多肽或小分子有效负载的氨基反应基团的氮分子，肽、蛋白 质或小分子或合成有机药物的反应性羧基或醛基的碳或氧残基。
“反应基团”是可以偶合到第二个反应基团的化学结构。反应基团的实例 是氨基、羧基、巯基、羟基、醛基、叠氮基。一些反应基团可以经过活化以 促进与第二个反应基团直接或经由交联剂缀合。如本文所用的反应基团可以 是XTEN、交联剂、叠氮化物/炔烃点击化学反应物或有效负载的一部分，只 要其具有参与化学反应的能力即可。一旦反应，缀合键即连接有效负载或交 联剂或XTEN反应物的残基。
“控释剂”、“缓释剂”、“积存配制品”和“持续释放剂”可互换使用，以指代 能够相对于在不存在试剂的情况下施用本发明的多肽时的释放持续时间延长 这种多肽的释放持续时间的试剂。本发明的不同实施方案可以具有不同释放 速率，从而产生不同治疗量。
如本文所用的术语“有效负载”指的是当施用给受试者中时具有生物、药 理或治疗活性或有益作用的任何蛋白质、肽序列、小分子、药物或物质组合 物，或这种作用可以在体外展示。有效负载还包括可以用于成像或体内诊断 目的的分子。有效负载的实例包括(但不限于)细胞因子、酶、激素、凝血因子 和生长因子、化学治疗剂、抗病毒化合物、毒素、抗癌药、放射性化合物和 对比剂，以及靶向肽、蛋白质、抗体、抗体片段，或用于结合到受体或配体 的化合物。
术语“抗原”、“靶抗原”和“免疫原”在本文中可互换使用，以指代抗体片段 或基于抗体片段的治疗剂所结合的或具有针对其的特异性的结构或结合决定 子。
如本文所用的术语“拮抗剂”包括部分或完全阻断、抑制或中和本文所公 开的天然多肽的生物活性的任何分子。鉴别多肽的拮抗剂的方法可以包括使 天然多肽与候选拮抗剂分子接触以及测量与天然多肽通常相关的一种或多种 生物活性的可检测变化。在本发明的上下文中，拮抗剂可以包括减小生物活 性蛋白质的作用的蛋白质、核酸、碳水化合物、抗体或任何其它分子。
“合成培养基”指的是包含培养中的细胞存活和/或生长所必需的营养和激 素需求的培养基，这样的话，培养基的组分是已知的。传统上，合成培养基 已经通过添加生长和/或存活所必需的营养因子和生长因子来配制。典型地， 合成培养基提供来自一个或多个下列类别的至少一种组分：a)所有必需氨基 酸，并且通常是二十种氨基酸加上半胱氨酸的基本设置；b)能源，通常呈碳 水化合物的形式，如葡萄糖；c)在低浓度下所需的维生素和/或其它有机化合 物；d)游离脂肪酸；以及e)痕量元素，其中痕量元素被定义为典型地在极低 浓度下、通常在微摩尔范围内所需的无机化合物或天然存在的元素。合成培 养基还可以任选地补充有来自下列类别中的任一者的一种或多种组分：a)一 种或多种促有丝分裂剂；b)盐和缓冲液，例如，钙、镁和磷酸盐；c)核苷和碱 基，例如，腺苷和胸苷、次黄嘌呤；以及d)蛋白质和组织水解物。
术语“促效剂”在最宽泛的意义上使用，并且包括模拟本文所公开的天然 多肽的生物活性的任何分子。适合的促效剂分子具体包括促效剂抗体或抗体 片段，天然多肽、肽、小有机分子的片段或氨基酸序列变异体，等等。鉴别 天然多肽的促效剂的方法可以包括使天然多肽与候选促效剂分子接触以及测 量与天然多肽通常相关的一种或多种生物活性的可检测变化。
“抑制常数”或“Ki”可互换使用，并且意味着酶-抑制剂复合物的离解常数， 或抑制剂对酶的结合亲和力的倒数。
如本文所用的“治疗”或“缓和”或“改善”可互换使用，并且意味着施用药物 或生物剂以实现治疗益处，治愈或减轻现有病状的严重程度，或实现预防益 处，防止或降低病状发作的可能性或病状发生的严重程度。治疗益处意味着 治疗中的潜在病状或一种或多种与潜在病状相关的生理症状的根除或改善， 以使得在受试者中观测到好转，尽管如此，这个受试者可能仍罹患潜在病状。
如本文所用的“治疗作用”或“治疗益处”指的是生理作用，包括(但不限于) 缓解、改善或预防人类或其它动物的疾病，或以其它方式提高人类或动物的 身体或精神健康状况，这是通过施用本发明的多肽来达成，除此之外，本发 明的多肽能够诱导针对生物活性蛋白质所具有的抗原表位的抗体产生。对于 预防益处来说，组合物可以施用给处在显现特定疾病、病状或疾病症状(例如， 经过诊断的A型血友病受试者的出血)的风险下的受试者，或施用给报告疾病 的一种或多种生理症状的受试者，即使可能尚未作出这种疾病的诊断。
如本文所用的术语“治疗有效量”和“治疗有效剂量”指的是单独的或作为 多肽组合物的一部分的药物或生物活性蛋白质的量，这种量当以一次剂量或 重复剂量施用给受试者时能够对疾病病况或病状的任何症状、方面、测量参 数或特征具有任何可检测的有益作用。这种作用不需要绝对是有益的。治疗 有效量的确定充分处于本领域的技术人员的能力范围内，尤其是鉴于本文所 提供的详细公开内容。
如本文所用的术语“治疗有效剂量方案”指的是连续施用多次剂量(即，至 少两次或更多次)的单独的或作为多肽组合物的一部分的生物活性蛋白质的 时程，其中这些剂量以治疗有效量给出以对疾病病况或病状的任何症状、方 面、测量参数或特征产生持续有益作用。
I).一般技术
除非另有指示，否则本发明的实施采用在本领域的技术范围内的免疫学、 生物化学、化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA 的常规技术。参看Sambrook,J.等人,"Molecular Cloning:A Laboratory Manual", 第3版,Cold SpringHarbor Laboratory Press,2001；"Current protocols in molecular biology",F.M.Ausubel等人编,1987；系列丛书"Methods in Enzymology",Academic Press,SanDiego,CA.；"PCR 2:a practical approach", M.J.MacPherson,B.D.Hames和G.R.Taylor编,Oxford University Press,1995； "Antibodies,a laboratory manual"Harlow,E.和Lane,D.编,Cold Spring Harbor Laboratory,1988；"Goodman&Gilman's ThePharmacological Basis of Therapeutics",第11版,McGraw-Hill,2005；以及Freshney,R.I.,"Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique",第4版,John Wiley&Sons, Somerset,NJ,2000，其内容以其全文引用的方式并入本文中。
宿主细胞可以在多种培养基中培养。可商购的培养基，如Ham's F10 (Sigma)、最低必需培养基(MEM,Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和达尔伯克改良 伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)(DMEM,Sigma)适合于培 养真核细胞。另外，动物细胞可以在合成培养基中生长，这种合成培养基缺 乏血清，但补充有特定细胞类型的存活和/或生长所必需的激素、生长因子或 任何其它因子。支持细胞存活的合成培养基维持细胞的活力、形态、代谢能 力并且潜在地维持细胞分化的能力，而促进细胞生长的合成培养基提供了细胞增殖或倍增所必需的所有化学物。在本领域中充分确立了在体外主导哺乳 动物细胞的存活和生长的一般参数。可以在不同细胞培养系统中控制的物理 化学参数是例如pH、pO2、温度和摩尔渗透压浓度。细胞的营养需求通常在 标准培养基配制品中提供，这些配制品经过开发以提供最佳环境。营养素可 以被分成几个类别：氨基酸和其衍生物、碳水化合物、糖、脂肪酸、复合脂 质、核酸衍生物和维生素。除了用于维持细胞代谢的营养素之外，大多数细 胞还需要来自至少一个下列组的一种或多种激素：类固醇、前列腺素、生长 因子、垂体激素和肽激素，以在无血清培养基中增殖(Sato,G.H.等人"Growth of Cells inHormonally Defined Media",Cold Spring Harbor Press,N.Y.,1982)。 除了激素以外，细胞可能需要转运蛋白，如转铁蛋白(血浆铁转运蛋白)、血浆 铜蓝蛋白(铜转运蛋白)和高密度脂蛋白(脂质载体)，以供体外存活和生长。最 佳激素或转运蛋白的设置将针对每种细胞类型而变化。这些激素或转运蛋白 中的大多数已经外源添加，或在罕见的情况下，已经发现不需要特定因子的 突变细胞系。本领域的技术人员将在没有过度实验的情况下了解到维持细胞 培养物所需的其它因子。
用于原核宿主细胞生长的生长培养基包括营养肉汤(液体营养素培养基) 或LB培养基(Luria Bertani)。适合的培养基包括合成培养基和非合成培养基。 一般来说，培养基含有碳源，如细菌生长所需的葡萄糖、水和盐。培养基还 可以包括氨基酸和氮的来源，例如牛肉或酵母提取物(在非合成培养基中)或已 知量的氨基酸(在合成培养基中)。在一些实施方案中，生长培养基是LB肉汤， 例如LB Miller肉汤或LB Lennox肉汤。LB肉汤包含蛋白胨(酪蛋白的酶促消 化产物)、酵母提取物和氯化钠。在一些实施方案中，使用包含抗生素的选择 性培养基。在这种培养基中，只有对抗生素具有抗性的所需细胞才会生长。
II).XTEN蛋白质聚合物和缀合组合物
本发明一部分是关于基本上同质的组合物，其包含延伸重组多肽 (XTEN)。在第一个方面，本发明提供了XTEN组合物，其在长度上是基本上 同质的。这些组合物适用作试剂缀合伴侣以形成XTEN-交联剂中间物和 XTEN-有效负载组合物。另外，本发明的一个目的在于提供形成基本上同质 的XTEN组合物的方法。本发明还提供了以高产率形成这些基本上同质的 XTEN组合物的方法。
在第二个方面，本发明提供了XTEN。举例来说，能够连接到一个或多 个有效负载缀合伴侣，从而得到有效负载-XTEN缀合物的XTEN经过特定工 程改造以并入规定数目的反应性氨基酸用于直接或经由交联剂或叠氮化物/ 炔烃反应物连接到有效负载。本发明还提供了形成这些经工程改造的XTEN 聚合物的方法，这些XTEN聚合物用来与所关注的有效负载剂形成缀合物， 作为具有增强的医药学特性(包括增强的药物动力学和药理学特性)以及降低 的毒性的组合物。
在另一个方面，本发明提供了基本上同质的XTEN聚合物，其包含规定 数目的交联剂或叠氮化物/炔烃反应物作为呈单体和多聚构型的反应物缀合 伴侣，以及制备这些反应物的方法。包含交联剂或叠氮化物/炔烃反应物的 XTEN衍生物被用作有效负载剂的缀合中的反应物，以得到展现所需的物理、 医药学和药理学特性的XTEN-有效负载缀合物。
在另一个方面，本发明提供了XTEN-有效负载的组合物，其中一个或多 个XTEN化学连接到一个或多个有效负载，包括规定数目的呈单体或多聚构 型的不同有效负载的组合，以提供具有增强的医药学、药物动力学和药理学 特性的组合物。连接到这些有效负载的这些组合物当施用给受试者时由于有 效负载的药理作用或生物作用而可以具有预防、治疗或改善疾病或病状的效 用。
1.XTEN：延伸重组多肽
在一个方面，本发明提供了基本上同质的XTEN多肽组合物，其适用作 缀合伴侣以直接或经由交联剂反应物连接到一个或多个有效负载，从而得到 XTEN-有效负载缀合物。
XTEN是具有非天然存在的、基本上非重复的序列的多肽，这些多肽在 生理条件下具有低程度的或没有二级或三级结构。XTEN典型地具有约36个 至约3000个氨基酸，其中大多数或全部是小亲水氨基酸。如本文所用的 “XTEN”特别地排除全抗体或抗体片段(例如，单链抗体和Fc片段)。XTEN多 肽具有作为缀合伴侣的效用，这是在于其起到多种作用，从而当连接到有效 负载时赋予某些理想的特性。所得XTEN-有效负载缀合物与未连接到XTEN的对应的有效负载相比具有增强的特性，例如增强的药物动力学、物理化学、 药理学和医药学特性，从而使其适用于治疗在本领域中已知将使用有效负载 的某些病状。
XTEN的非结构化特征和物理化学特性一部分是由以下产生：总体氨基 酸组成，这种组成不成比例地限于4-6种类型的亲水氨基酸；可量化的非重 复设计中的氨基酸的连接；以及XTEN多肽的长度。在对于XTEN是常见的 但对于天然多肽不常见的一个有利特征中，本文所公开的XTEN的特性并不 依赖于绝对一级氨基酸序列，如表2的示范性序列的多样性所显现，在不同 的长度范围内，这些序列具有类似特性，其中许多在实施例中有记录。因此， XTEN具有比起蛋白质更像非蛋白质类、亲水聚合物的特性。本发明的XTEN 展现以下有利特性中的一者或多者：构象柔性、二级结构的减少或缺乏、高 度水溶性、高度蛋白酶抗性、低免疫原性、与哺乳动物受体的低程度结合、 规定的荷电程度，以及增大的流体动力学(或斯托克斯)半径；类似于某些亲水 聚合物(例如，聚乙二醇)的特性，这些特性使其特别适用作缀合伴侣。
尽管聚合物的长度延长，但主题缀合物的XTEN组分经过设计以在生理 条件下表现得像变性的肽序列。“变性”描述了溶液中肽的状态，其特征为肽 骨架的大的构象自由度。大多数肽和蛋白质在存在高浓度的变性剂下或在高 温下采用变性构象。呈变性构象的肽具有例如特征性圆二色(CD)光谱并且特 征为如通过NMR确定的长程相互作用缺乏。“变性构象”和“非结构化构象” 在本文中同义使用。在一些实施方案中，本发明提供了XTEN序列，其在生 理条件下类似于在很大程度上没有二级结构的变性序列。在其它情况下， XTEN序列在生理条件下基本上没有二级结构。如这个情形中所用的“在很大 程度上没有”意味着如通过本文所描述的手段测量或测定，XTEN序列的少于 50％的XTEN氨基酸残基促成二级结构。如这个情形中所用的“基本上没有” 意味着如通过本文所描述的方法测量或测定，XTEN序列的至少约60％、或 约70％、或约80％、或约90％、或约95％、或约97％、或至少约99％的XTEN 氨基酸残基不促成二级结构。
多种方法和试验在本领域中已知用于测定主题XTEN的物理化学特性。 这些特性包括(但不限于)二级或三级结构、溶解度、蛋白质聚集、稳定性、绝 对和表观分子量、纯度和均匀性、熔融特性、污染和水含量。用以测量这些 特性的方法包括分析离心、EPR、HPLC-离子交换、HPLC-尺寸排阻色谱(SE C)、逆相HPLC、光散射、毛细管电泳、圆二色光谱法、差示扫描量热法、 荧光、HPLC-离子交换、HPLC-尺寸排阻、IR、NMR、拉曼光谱法(Raman spectroscopy)、量折射术和UV/可见光谱法。具体地说，二级结构可以用分光 光度法测量，例如，通过在“远UV”光谱区(190-250nm)中的圆二色光谱法。 二级结构元素，如α螺旋和β折叠，各自产生CD光谱的特征形状和量级， 这些结构元素的缺乏也是如此。如美国专利申请公布号20030228309A1中所 描述，二级结构还可以经由某些计算机程序或算法来预测多肽序列，这些算 法如众所周知的Chou-Fasman算法(Chou,P.Y.等人(1974)Biochemistry,13:222-45)和Garnier-Osguthorpe-Robson算法(“Gor算法”)(Garnier J,Gibrat JF, RobsonB.(1996),GOR method for predicting protein secondary structure from aminoacid sequence.Methods Enzymol 266:540-553)。对于给定的序 列，这些算法可以预测是否存在一些二级结构或根本没有二级结构，这是以 形成例如α螺旋或β折叠的序列的残基的总数和/或百分比，或预测会引起无 规卷曲形成(其缺乏二级结构)的序列的残基的百分比表示。多肽序列可以使用 万维网上的站点，例如，fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_www.cgi？r m＝misc1的Chou-Fasman算法和npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page ＝npsa_gor4.html的Gor算法(两者都在2012年9月5日访问)来分析。额外的 方法在Arnau等人,Prot Expr and Purif(2006)48,1-13中公开。
在一个实施方案中，主题缀合物中所用的XTEN序列具有如通过 Chou-Fasman算法所测定在0％到小于约5％的范围内的α螺旋百分比。在另 一个实施方案中，XTEN序列具有如通过Chou-Fasman算法所测定在0％到小 于约5％的范围内的β折叠百分比。在一个实施方案中，缀合物的XTEN序 列具有如通过Chou-Fasman算法所测定在0％到小于约5％的范围内的α螺旋 百分比以及在0％到小于约5％的范围内的β折叠百分比。在一个实施方案中，缀合物的XTEN序列具有小于约2％的α螺旋百分比和小于约2％的β折叠百 分比。如通过GOR算法所测定，缀合组合物的XTEN序列具有高度无规卷 曲百分比。在一些实施方案中，如通过GOR算法所测定，XTEN序列具有至 少约80％、更优选地至少约90％、更优选地至少约91％、更优选地至少约92％、 更优选地至少约93％、更优选地至少约94％、更优选地至少约95％、更优选 地至少约96％、更优选地至少约97％、更优选地至少约98％并且最优选地至少约99％的无规卷曲。在一个实施方案中，缀合组合物的XTEN序列具有如 通过Chou-Fasman算法所测定在0％到小于约5％的范围内的α螺旋百分比以 及在0％到小于约5％的范围内的β折叠百分比，以及如通过GOR算法所测 定至少约90％的无规卷曲。在另一个实施方案中，所公开的组合物的XTEN 序列具有小于约2％的α螺旋百分比和小于约2％的β折叠百分比，如通过GOR 算法所测定至少约90％的无规卷曲。在另一个实施方案中，如通过圆二色光 谱法所测量，组合物的XTEN序列基本上缺乏二级结构。
将连接到用于形成缀合组合物的有效负载的XTEN的选择准则一般涉及 XTEN的物理化学特性和构象结构的属性，XTEN继而对组合物赋予增强的 医药学、药理学和药物动力学特性。
1.非重复序列
特别预期，主题缀合组合物的实施方案中所包括的主题XTEN序列是基 本上非重复的。一般来说，重复氨基酸序列具有聚集或形成更高级结构的趋 势，如天然的重复序列，例如胶原蛋白和亮氨酸拉链所例示。这些重复氨基 酸还可能趋向于形成接触，从而产生结晶或假结晶结构。相比之下，非重复 序列的低聚集趋势能够设计具有相对低频率的带电氨基酸的长序列XTEN， 如果序列是重复的话，那么长序列XTEN将可能以其它方式聚集。主题XTEN 的非重复性可以通过评定一个或多个下列特征来观测。在一个实施方案中， 基本上非重复的XTEN序列在序列中不具有相同氨基酸类型的三个相连氨基 酸，除非氨基酸是丝氨酸，在这种情况下，不超过三个相连氨基酸是丝氨酸 残基。在另一个实施方案中，如下文更全面地描述，基本上非重复的XTEN 序列，其中80-99％的序列包含9到14个氨基酸残基的基序，其中这些基序 由3种、4种、5种或6种类型的选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏 氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)的氨基酸组成，并且其中在任一个基序中任 何两个相连氨基酸残基的序列在序列基序中不会重复两次以上。
多肽或基因的重复性的程度可以通过计算机程序或算法或通过本领域中 已知的其它手段来测量。根据本发明，将用于计算特定多肽(如XTEN)的重复 性的程度的算法在本文中公开，并且提供了通过算法分析的序列的实例(参看 下文的实施例)。在一个实施方案中，预定长度的多肽的重复性可以根据等式 I所给出的公式来计算(下文中的“子序列计分”)：
其中：m＝(多肽的氨基酸长度)-(子序列的氨基酸长度)+1；并且Counti＝在序列i内每个独特的子序列出现的累计次数
开发了称为“SegScore”的算法以将前述等式应用于量化多肽(如XTEN)的 重复性，从而提供子序列计分，其中预定氨基酸长度“n”的序列是通过测定长 度“s”的独特子序列在设定长度中出现的次数(“计数”)，将其除以在预定长度 的序列内子序列的绝对数目来分析重复性。图79描绘了SegScore算法的逻 辑流程图，而图80描画了对于具有11个氨基酸并且子序列长度是3个氨基 酸残基的假想XTEN怎样得出子序列计分的示意图。举例来说，200个氨基 酸残基的预定多肽长度具有192个重叠的9-氨基酸子序列和198个3聚体子序列，但任何给定多肽的子序列计分将取决于独特子序列的绝对数目以及每 个独特的子序列(意味着不同的氨基酸序列)在预定长度的序列中出现的频繁 程度。
在本发明的上下文中，“子序列计分”意味着每个独特的3聚体框架跨越 累计的XTEN多肽的200个连续氨基酸出现次数的总和除以在200个氨基酸 序列内独特的3聚体子序列的绝对数目。从重复多肽和非重复多肽的200个 连续氨基酸得出的这些子序列计分的实例呈现于实施例45中。在一个实施方 案中，本发明提供了包含一个XTEN的XTEN-有效负载，其中XTEN具有小 于12、更优选地小于10、更优选地小于9、更优选地小于8、更优选地小于 7、更优选地小于6并且最优选地小于5的子序列计分。在另一个实施方案中， 本发明提供了包含XTEN的XTEN-交联剂缀合物，其中XTEN具有小于10、 更优选地小于9、更优选地小于8、更优选地小于7、更优选地小于6并且最 优选地小于5的子序列计分。在另一个实施方案中，本发明提供了包含XTEN 的XTEN-点击化学缀合物，其中XTEN具有小于10、更优选地小于9、更优 选地小于8、更优选地小于7、更优选地小于6并且最优选地小于5的子序列 计分。在又另一个实施方案中，本发明提供了包含至少两个经连接的XTEN 的XTEN缀合组合物，其中每个个别的XTEN具有小于10、或小于9、或小 于8、或小于7、或小于6、或小于5、或更小的子序列计分。在又另一个实 施方案中，本发明提供了包含至少三个经连接的XTEN的XTEN缀合组合物， 其中每个个别的XTEN具有小于10、或小于9、或小于8、或小于7、或小于 6、或小于5、或更小的子序列计分。在本文所描述的XTEN组合物的实施方 案中，具有10或更小(即，9、8、7等等)的子序列计分的XTEN的特征为基 本上非重复的。
在一个方面，本发明的XTEN的非重复特征连同在XTEN中占主导的氨 基酸的特定类型而不是绝对一级序列一起，赋予XTEN和所得XTEN-有效负 载缀合物一种或多种增强的物理化学和生物特性。这些增强的特性包括所得 缀合物与未缀合到XTEN的有效负载或缀合到具有重复序列的蛋白质的有效 负载相比，在宿主细胞中XTEN蛋白质的较高程度的表达、编码XTEN的基 因的较高遗传稳定性、较高程度的可溶性、较小聚集趋势和增强的药物动力 学。这些增强的特性允许较高效率的制造、最终产物的较高均匀性、较低商 品成本，和/或有助于含有极高蛋白质浓度(在一些情况下超过100mg/ml)的包 含XTEN的医药制剂的配制。在一些实施方案中，缀合物的XTEN多肽序列 经过设计以具有低程度的内部重复性，从而当施用给哺乳动物时降低或基本 上消除免疫原性。由主要仅限于三个氨基酸(如甘氨酸、丝氨酸和谷氨酸)的短 的重复基序组成的多肽序列当施用给哺乳动物时可能产生相对高的抗体滴 度，尽管在这些序列中不存在预测的T细胞表位。这可能是由多肽的重复性 质而引起，因为已显示具有重复表位的免疫原，包括蛋白质聚集体、交联免 疫原和重复的碳水化合物，具有高度免疫原性并且可以例如使得B细胞受体 交联，从而引起B细胞活化。(Johansson,J.等人(2007)Vaccine,25:1676-82； Yankai,Z.等人(2006)BiochemBiophys Res Commun,345:1365-71；Hsu,C.T. 等人(2000)Cancer Res,60:3701-5；Bachmann MF等人Eur J Immunol.(1995) 25(12):3445-3451)。
2.示范性的序列基序
本发明涵盖了用作缀合伴侣的XTEN，这些缀合伴侣包含较短序列、或 基序的多个单元，其中这些基序的氨基酸序列是基本上非重复的。如图18-19 中所示，甚至使用“构建基块”法，使用序列基序的文库也可以满足非重复特 性，这些序列基序进行多聚以形成XTEN序列。虽然XTEN序列可以由少至 四种不同类型的序列基序的多个单元组成，但因为基序本身一般由非重复的 氨基酸序列组成，所以总的XTEN序列经过设计而促使序列是基本上非重复 的。
在一个实施方案中，XTEN具有大于约36个至约3000个、或约100个 至约2000个、或约144个至约1000个氨基酸残基的基本上非重复的序列， 其中至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约 97％、或约99％至约100％的XTEN序列由非重叠的序列基序组成，并且其中 每个基序具有约9个到36个氨基酸残基。如本文所用的“非重叠”意味着个别 的基序并不共有氨基酸残基，而是以线性方式融合到其它基序或氨基酸残基。在其它实施方案中，至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约 95％、或至少约97％、或约99％至约100％的XTEN序列由非重叠的序列基 序组成，其中每个基序具有9个到14个氨基酸残基。在还有其它的实施方案 中，至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约 97％、或约99％至约100％的XTEN序列由非重叠的序列基序组成，其中每个 基序具有12个氨基酸残基。在这些实施方案中，优选的是，序列基序基本上 (例如，90％或更多)或排他地由小亲水氨基酸组成，以使得总体序列具有非结 构化的柔性特征。XTEN中所包括的氨基酸的实例是例如精氨酸、赖氨酸、 苏氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸和甘氨 酸。在一个实施方案中，XTEN序列主要具有四种到六种类型的选自甘氨酸 (G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)或脯氨酸(P)的氨基酸， 这些氨基酸排列成基本上非重复的序列，这个序列的长度为约36个至约3000 个、或约100个至约2000个、或约144个至约1000个氨基酸残基。在某个 实施方案中，XTEN序列由4种、5种或6种类型的选自由甘氨酸(G)、丙氨 酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)或脯氨酸(P)组成的组的氨基酸构成。 在一些实施方案中，XTEN具有约36个至约1000个、或约100个至约2000 个、或约400个至约3000个氨基酸残基的序列，其中至少约80％的序列由非 重叠的序列基序组成，其中每个基序具有9个到36个氨基酸残基，并且其中 至少90％、或至少91％、或至少92％、或至少93％、或至少94％、或至少95％、 或至少96％、或至少97％、或100％的每个基序由4种到6种类型的选自甘 氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)的氨基 酸组成，并且其中全长XTEN中任一种氨基酸类型的含量不超过30％。在其 它实施方案中，至少约90％的XTEN序列由非重叠的序列基序组成，其中每 个基序具有9个到36个氨基酸残基，其中这些基序由4种到6种类型的选自 甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)的氨 基酸组成，并且其中全长XTEN中任一种氨基酸类型的含量不超过40％、或 约30％、或25％、或约17％、或约12％、或约8％。在其它实施方案中，至 少约90％的XTEN序列由非重叠的序列基序组成，其中每个基序具有12个 氨基酸残基，这些氨基酸残基由4种到6种类型的选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、 丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)的氨基酸组成，并且其中全长XTEN中任一种氨基酸类型的含量不超过40％、或30％、或约25％、或约17％、 或约12％、或约8％。在另外其它的实施方案中，至少约90％、或约91％、 或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约 98％、或约99％至约100％的XTEN序列由非重叠的序列基序组成，其中每个 基序具有12个由甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E) 和脯氨酸(P)组成的氨基酸残基。
在一些实施方案中，本发明提供了XTEN-有效负载、XTEN-交联剂和 XTEN-点击化学反应物缀合物，其包含一个、或两个、或三个、或四个或更 多个具有约36个至约1000个氨基酸残基或累计约100个至约3000个氨基酸 残基的基本上非重复的XTEN序列，其中至少约80％、或至少约90％、或约 91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、 或约98％、或约99％至约100％的序列由四个或更多个选自表1的氨基酸序 列的非重叠的序列基序的多个单元组成，其中总体序列保持基本上非重复的。 在一些实施方案中，XTEN包含非重叠的序列基序，其中约80％、或至少约 85％、或至少约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、 或约96％、或约97％、或约98％、或约99％、或约100％的序列由选自从表1 中选出的单一基序家族的非重叠序列的多个单元组成，从而得到家族序列。 如应用于基序的家族意味着XTEN具有选自来自表1的单一基序类别的基序；即，AD、AE、AF、AG、AM、AQ、BC或BD。在其它实施方案中，XTEN 包含来自表1的两个或更多个基序家族的基序序列的多个单元，这些基序家 族经过选择以实现所需的物理化学特征，包括下文更全面描述的特性，如净 电荷、亲水性、二级结构缺乏，或基序的氨基酸组成可能赋予的重复性缺乏。 在这一段的上文所描述的实施方案中，并入到XTEN中的基序或基序部分可以使用本文所描述的方法来选择和组装，以获得约36个、约42个、约72个、 约144个、约288个、约576个、约864个、约1000个、约2000个至约3000 个氨基酸残基或任何中间长度的XTEN。适用于并入到主题缀合物中的XTEN 家族序列的非限制性实例呈现于表2中。关于表2所提到的指定序列打算具 有表2中所阐述的那个序列，而一般性地提及例如AE144序列打算涵盖具有 144个氨基酸残基的任何AE序列，例如AE144_1A、AE144_2A等等，或一 般性地提及例如AG144序列打算涵盖具有144个氨基酸残基的任何AG序列， 例如AG144_1、AG144_2、AG144_A、AG144_B、AG144_C等等。
表1：12个氨基酸的XTEN序列基序以及基序家族
基序家族＊ 基序序列
AD GESPGGSSGSES
AD GSEGSSGPGESS
AD GSSESGSSEGGP
AD GSGGEPSESGSS
AE，AM GSPAGSPTSTEE
AE，AM，AQ GSEPATSGSETP
AE，AM，AQ GTSESATPESGP
AE，AM，AQ GTSTEPSEGSAP
AF，AM GSTSESPSGTAP
AF，AM GTSTPESGSASP
AF，AM GTSPSGESSTAP
AF，AM GSTSSTAESPGP
AG，AM GTPGSGTASSSP
AG，AM GSSTPSGATGSP
AG，AM GSSPSASTGTGP
AG，AM GASPGTSSTGSP
AQ GEPAGSPTSTSE
AQ GTGEPSSTPASE
AQ GSGPSTESAPTE
AQ GSETPSGPSETA
AQ GPSETSTSEPGA
AQ GSPSEPTEGTSA
BC GSGASEPTSTEP
BC GSEPATSGTEPS
BC GTSEPSTSEPGA
BC GTSTEPSEPGSA
BD GSTAGSETSTEA
BD GSETATSGSETA
BD GTSESATSESGA
BD GTSTEASEGSAS
*表示个别的基序序列，其当以各种排列一起使用时，得到“家族序列”
表2：XTEN多肽
在XTEN中少于100％的其氨基酸由4种、5种或6种类型的选自甘氨酸 (G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)的氨基酸组 成，或少于100％的序列由来自表1的序列基序或表2、3和22-25的XTEN 序列组成的一些实施方案中，XTEN的其它氨基酸残基是选自其它14种天然 L-氨基酸中的任一者，但优先选自亲水氨基酸，以使得XTEN序列含有至少 约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少约99％的 亲水氨基酸。不同于甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸 (E)和脯氨酸(P)的个别氨基酸或氨基酸的短序列可以被并入到XTEN中以实 现所需的特性，例如允许通过编码核苷酸并入限制位点，或有助于连接到有 效负载组分，或并入裂解序列。作为下文更全面描述的一个示范性的实施方 案，本发明提供了并入有1个至约20个、或1个至约15个、或1个至约10 个、或1个到5个赖氨酸残基的XTEN，其中如本文所描述，反应性赖氨酸 用于连接到交联剂或有效负载。在下文更全面描述的另一个实施方案中， XTEN并入有1个至约20个、或1个至约15个、或1个至约10个、或1个 至5个半胱氨酸残基，其中如本文所描述，反应性半胱氨酸用于连接到交联 剂或有效负载。在另一个实施方案中，XTEN并入有1个至约20个半胱氨酸 和赖氨酸残基，其中如本文所描述，赖氨酸和半胱氨酸用于连接到不同的交 联剂或有效负载。在另一个实施方案中，XTEN并入有1个、2个、3个、4 个、5个或更多个精氨酸残基，紧随其后没有脯氨酸残基以提供可以用胰蛋 白酶裂解的裂解序列，从而形成XTEN区段，这在下文更全面地描述。不是 甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)的XTEN 氨基酸散布在整个XTEN序列中，定位在序列基序内或序列基序之间，或集 中在XTEN序列的一个或多个短延伸段中，如在N端或C端或接近N端或C 端。由于疏水氨基酸赋予多肽以结构，因此本发明规定，缀合构建体中所利 用的XTEN中的疏水氨基酸的含量将典型地小于5％、或小于2％、或小于1％ 的疏水氨基酸含量。在XTEN的构建中不太偏好的疏水残基包括色氨酸、苯 丙氨酸、酪氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和甲硫氨酸。另外，可以对XTEN 序列进行设计以含有少于5％、或少于4％、或少于3％、或少于2％、或少于1％或没有下列氨基酸：甲硫氨酸(为避免氧化)、天冬酰胺和谷氨酰胺(为避免 脱酰胺)。在其它实施方案中，缀合构建体中所用的XTEN组分中的甲硫氨酸 和色氨酸的氨基酸含量典型地小于5％、或小于2％并且最优选地小于1％。 在其它实施方案中，主题XTEN缀合物的XTEN将具有如下序列：其中少于 10％的氨基酸残基具有正电荷，或少于约7％、或少于约5％、或少于约2％的 氨基酸残基具有正电荷，甲硫氨酸和色氨酸残基的总和将少于2％，并且天冬 酰胺和谷氨酰胺残基的总和将少于总XTEN序列的5％。
3.经半胱氨酸工程改造和经赖氨酸工程改造的XTEN序列
在另一个方面，本发明提供了具有规定数目的所并入的半胱氨酸或赖氨 酸残基的XTEN；分别是“经半胱氨酸工程改造的XTEN”和“经赖氨酸工程改 造的XTEN”。本发明的一个目的在于提供具有规定数目的半胱氨酸和/或赖氨 酸残基以允许半胱氨酸的硫醇基或赖氨酸的ε-氨基与将缀合到XTEN骨架的 有效负载或交联剂上的反应基团之间进行缀合的XTEN。在前述的一个实施 方案中，本发明的XTEN具有约1个至约100个赖氨酸残基、或约1个至约 70个赖氨酸残基、或约1个至约50个赖氨酸残基、或约1个至约30个赖氨 酸残基、或约1个至约20个赖氨酸残基、或约1个至约10个赖氨酸残基、 或约1个至约5个赖氨酸残基、或1个至约3个赖氨酸残基，或者仅具有单 一的赖氨酸残基。在前述的另一个实施方案中，本发明的XTEN具有约1个 至约100个半胱氨酸残基、或约1个至约70个半胱氨酸残基、或约1个至约 50个半胱氨酸残基、或约1个至约30个半胱氨酸残基、或约1个至约20个 半胱氨酸残基、或约1个至约10个半胱氨酸残基、或约1个至约5个半胱氨 酸残基、或1个至约3个半胱氨酸残基，或者仅具有单一的半胱氨酸残基。 在前述的另一个实施方案中，本发明的XTEN具有约1个至约10个赖氨酸残 基和约1个至约10个半胱氨酸残基。使用前述含赖氨酸和/或含半胱氨酸的 XTEN，可以构建包含XTEN、任选的交联剂加上适用于治疗受试者的病状的 有效负载的缀合物，其中连接到XTEN组分的有效负载剂的分子的最大数目 是由并入到XTEN中的具有反应侧基(例如，末端氨基或硫醇)的赖氨酸、半 胱氨酸或其它氨基酸的数目确定。
在一个实施方案中，本发明提供了经半胱氨酸工程改造的XTEN，其中 编码XTEN的一个或多个氨基酸的核苷酸经半胱氨酸氨基酸置换以形成经半 胱氨酸工程改造的XTEN基因。在另一个实施方案中，本发明提供了经半胱 氨酸工程改造的XTEN，其中编码一个或多个半胱氨酸氨基酸的核苷酸被插 入到XTEN编码基因中以形成经半胱氨酸工程改造的XTEN基因。在其它情 况下，包含编码一个或多个半胱氨酸的密码子的编码一个或多个具有约9个 至约14个氨基酸的基序的寡核苷酸与编码XTEN基序或全长XTEN的其它 寡核苷酸框内连接，以形成经半胱氨酸工程改造的XTEN基因。在前述的一 个实施方案中，其中在形成XTEN基因期间一个或多个半胱氨酸被插入到 XTEN序列中，可以使用本文所描述的方法(参看实施例61和图40-41)或通过 标准分子生物学技术将编码半胱氨酸的核苷酸连接到编码XTEN中所用的氨 基酸的密码子以形成在规定位置处具有半胱氨酸的半胱氨酸-XTEN基序，并 且随后将基序组装成编码经半胱氨酸工程改造的全长XTEN的基因。在这些 情况下，其中例如编码单一半胱氨酸的核苷酸被添加到编码选自表1的基序 的DNA中，所得基序将具有13个氨基酸，而并入两个半胱氨酸将得到具有 14个氨基酸的基序，等等。在其它情况下，如本文所描述并且如图7-8中所 说明，可以通过将编码半胱氨酸的核苷酸在规定位置处连接到编码XTEN中 所用的一个或多个氨基酸残基(例如，G、S、T、E、P、A)的核苷酸来重新形成半胱氨酸基序并且具有预先确定的长度和数目的半胱氨酸氨基酸，并且随 后通过与其它XTEN编码基序序列粘接将编码基序组装成编码全长XTEN的 基因。在经赖氨酸工程改造的XTEN用于制造本发明的缀合物的情况下，将 用编码赖氨酸而不是半胱氨酸的密码子进行上文所描述的方法。因此，通过 前述内容，可以形成新的XTEN基序，其可以包含约9-14个氨基酸残基并且 具有一个或多个反应性氨基酸；即，半胱氨酸或赖氨酸。含有单一半胱氨酸 或赖氨酸的适合用于经工程改造的XTEN中的基序的非限制性实例是：
GGSPAGSCTSP
GASASCAPSTG
TAEAAGCGTAEAA
GPEPTCPAPSG
GGSPAGSKTSP
GASASKAPSTG
然而，本发明涵盖了不同长度的基序，如表5和表11的那些基序，以供 并入到XTEN中。
在这些情况下，其中编码具有一个或多个半胱氨酸和/或赖氨酸基序的 XTEN的基因将从现有的XTEN基序或区段构建，这个基因可以通过连接以 下来设计和构建：编码短长度和长长度的XTEN的现有“构建基块”多核苷酸； 例如，AE48、AE144、AE288、AE432、AE576、AE864，AM48，AM875、AE912、 AG864，或编码实施例1-4和表22-25的36聚体的核苷酸，其可以与编码含 半胱氨酸和/或含赖氨酸的基序的核苷酸框内融合；或者，编码半胱氨酸和/ 或编码赖氨酸的核苷酸可以使用例如编码表4和5的岛状物的核苷酸通过 PCR加入到现有的XTEN序列中(如下文和实施例中更全面地描述)，以构建 经工程改造的XTEN，其中反应性半胱氨酸和/或赖氨酸以所需的数量置于序 列中的一个或多个经设计的位置处。这种经工程改造的XTEN的非限制性实 例提供于表3中。因此，在一个实施方案中，本发明提供了XTEN序列，其 当最佳比对时与选自表3的序列或序列片段具有至少约80％的序列同一性、 或至少约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或 约96％、或约97％、或约98％、或约99％的序列同一性，或与这个序列或序 列片段相同。然而，应用经半胱氨酸工程改造或经赖氨酸工程改造的方法形 成包含半胱氨酸或赖氨酸残基的XTEN并不意味着受限于前述实施方案的精 确组成或组成同一性的范围。如本领域的技术人员将了解，XTEN中所并入 的半胱氨酸或赖氨酸残基的精确位置和数目在不脱离所描述的本发明的情况 下可以有变化。
表3：经半胱氨酸工程改造和经赖氨酸工程改造的XTEN
在另一个实施方案中，本发明提供了赖氨酸插入物作为较长序列的一部 分，其被定义为赖氨酸岛状物。赖氨酸岛状物的实例示于表4中。用相似或 相同的序列侧接XTEN中的所有赖氨酸残基的益处在于其使得每个赖氨酸的 化学反应性更加均匀。另一个益处是由于能够进行肽图分析以测量有效负载 连接的程度而产生。实例包括表4的岛状物I_L6、I_L7和I_L8。这些岛状物 包含谷氨酸残基，其有助于使用GluC蛋白酶进行肽图分析。在另一个实施方 案中，本发明提供了半胱氨酸插入物作为较长序列的一部分，其被定义为半胱氨酸岛状物。半胱氨酸岛状物的实例示于表5中。用相似或相同的序列侧 接XTEN中的所有半胱氨酸残基的益处在于其使得每个半胱氨酸的化学反应 性更加均匀。另一个益处是由于能够进行肽图分析以测量有效负载缀合的程 度而产生。实例包括表5的岛状物I_C4、I_C7、I_C8和I_C9。这些岛状物 包含谷氨酸残基，其有助于使用GluC蛋白酶进行肽图分析。如上文和实施例 中所描述，可以通过常规的PCR方法将岛状物插入到编码现有XTEN的构建体中。可以通过常规的PCR方法将编码岛状物的寡核苷酸插入到编码现有 XTEN的构建体中。举例来说，在一个实施方案中，其中现有的全长XTEN 基因要用编码一个或多个反应性半胱氨酸或赖氨酸残基的核苷酸修饰，可以 形成寡核苷酸，这种寡核苷酸编码半胱氨酸或赖氨酸并且与XTEN的一个或 多个短序列展现部分同源性并且可以与XTEN的一个或多个短序列杂交，从 而产生重组事件并且半胱氨酸或赖氨酸密码子取代XTEN基因的现有密码子(关于一般方法的描述，参看例如实施例6和7)。在一个示范性的实施方案中， 重组使得用I_C1岛状物的氨基酸序列GGSPAGSCTSP置换。然而，寡核苷 酸可以经过设计以将半胱氨酸(或赖氨酸)置于基序中的不同位置处或在基序 中包括第二个半胱氨酸(或赖氨酸)。编码半胱氨酸或编码赖氨酸的寡核苷酸可 以经过设计以在沿着已知的XTEN序列的不同点处与给定的序列区段杂交， 从而允许其插入到XTEN编码基因中。因此，本发明预期，多个XTEN基因 构建体可以用在XTEN序列内的不同位置处插入的半胱氨酸或赖氨酸来形 成，这是通过选择XTEN序列内的限制位点并且设计适于给定的位置并编码 半胱氨酸或赖氨酸的寡核苷酸来实现，包括使用在相同的XTEN序列中产生 多个插入的经设计的寡核苷酸。通过考虑到XTEN的已知序列来设计和选择 一个或多个这种寡核苷酸，并且适当使用本发明的方法，可以估计插入到全 长XTEN中的经取代的反应性半胱氨酸或赖氨酸残基的潜在数目，然后通过 对所得XTEN基因进行测序来确认。
表4：赖氨酸岛状物的实例
命名符 氨基酸序列
I_L1 GGSPAGSKPTSP
I_L2 GASASKPAPSTG
I_L3 PKP
I_L4 PPKPP
I_L5 GGKPG
I_L6 EGGKPGES
I_L7 EGGSPAGSKPTSPE
I_L8 EGASASKPAPSTGE
表5：半胱氨酸岛状物的实例
命名符 序列
I_C1 GGSPAGSCTSP
I_C2 GASASCAPSTG
I_C3 GPEPTCPAPSG
I_C4 TAEAAGCGTAEAA
I_C5 GECEP
I_C6 GRPCRP
I_C7 GETSPAGSCTSPTET
I_C8 TESGRPCRPSET
I_C9 GPEPTCPAPSEG
XTEN可以经过设计以包含赖氨酸和半胱氨酸残基两者以供如图1D中 所说明进行缀合。这能够使用定制的缀合方法将两个不同的有效负载缀合到 相同的XTEN聚合物以与附接到半胱氨酸或赖氨酸的官能团或接头反应。这 些混合的有效负载当以单一的组合物施用给受试者时可以具有相加和/或协 同药理效应。或者，混合的有效负载可以是靶向部分和活性有效负载的组合 以将药效团递送到受试者中的所需位置。通过控制赖氨酸和半胱氨酸残基的 数目和位置，可以控制经缀合的有效负载的数目和位置。这能够调整所得XTEN-有效负载缀合物中有效负载的相对效力或选择性。
本发明的设计、选择和制备方法能够形成经工程改造的XTEN，其与亲 电官能团起反应。如图1中示意性地说明，用以制造本文所提供的主题缀合 物的方法能够用在指定位点处以定量方式添加的接头或有效负载分子形成 XTEN-有效负载缀合物、XTEN-交联剂缀合物和XTEN-叠氮化物/炔烃反应物 缀合物。如下文更全面地描述，有效负载、交联剂和叠氮化物/炔烃反应物可 以按位点特异性方式并且有效地连接到XTEN的N端或C端，用硫醇反应性 试剂连接到经半胱氨酸工程改造的XTEN，或用胺反应性试剂连接到本发明 的经赖氨酸工程改造的XTEN，并且连接到XTEN的N端的α-氨基，然后如 图40中示意性地示出，使用例如实施例中更具体描述的非限制性方法来纯化 和表征。
4.序列的长度
在另一个方面，本发明提供了不同长度的XTEN以供并入到组合物中， 其中XTEN序列的长度是基于将在组合物中实现的特性或功能来选择。取决 于所想要的特性或功能，XTEN-有效负载缀合物包含短长度或中间长度的 XTEN或更长的XTEN序列，或可以充当载体的短长度、中间长度或更长的 XTEN的多聚体。虽然不打算有限制性，但XTEN或XTEN片段包括约6个 至约99个氨基酸残基的短区段、约100个至约399个氨基酸残基的中间长度， 以及约400个至约1000个并且至多约3000个氨基酸残基的更长长度。因此， 用作缀合伴侣以供并入到主题缀合物中的XTEN涵盖长度为约6个、或约12 个、或约36个、或约40个、或约48个、或约72个、或约96个、或约144 个、或约288个、或约400个、或约432个、或约500个、或约576个、或 约600个、或约700个、或约800个、或约864个、或约900个、或约1000 个、或约1500个、或约2000个、或约2500个或至多约3000个氨基酸残基 长度的XTEN或XTEN片段。在其它情况下，XTEN序列的长度可以为约6 个至约50个、约50个至约100个、约100个至150个、约150个至250个、 约250个至400个、约400个至约500个、约500个至约900个、约900个 至1500个、约1500个至2000个、或约2000个至约3000个氨基酸残基。并 入到主题XTEN-有效负载缀合物中的XTEN的精确长度在不会对缀合物的生 物活性产生不利影响的情况下可以有变化。在一个实施方案中，一个或多个 XTEN可以选自XTEN家族序列之一；例如，AD、AE、AF、AG、AM、AQ、 BC或BD。在一些实施方案中，用于形成主题缀合物的XTEN包含选自表2、 表3和表22-25中的序列中的任一者的XTEN，其可以直接或经由本文所公 开的交联剂连接到有效负载组分。在其它实施方案中，用于形成主题缀合物 的一个或多个XTEN个别地包含XTEN序列，这个XTEN序列当与相当长度 的序列进行最佳比对时，与选自表2、3、22-25的XTEN或其片段相比具有 至少约80％的序列同一性，或者81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、 88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％ 或100％的序列同一性。在一些实施方案中，主题缀合物包含2个、3个、4 个或更多个XTEN序列，其中XTEN序列中的残基的累计长度大于约100个 至约3000个、或约400个至约2000个、或约800个到1000个氨基酸残基， 并且XTEN在序列或长度上可以是相同的或可以是不同的。当一个以上的 XTEN并入到缀合物中时，如本文所用的累计长度打算涵盖氨基酸残基的总 长度。
如下文更全面地描述，公开了通过选择XTEN的长度来设计XTEN-有效 负载缀合物的方法以及与交联剂反应物或有效负载连接以赋予物理化学特性 (例如，稳定性或溶解度)或当将XTEN-有效负载缀合物施用给受试者时得到 目标半衰期或活性保持的方法。
XTEN被用作组合物中的载体，本发明利用了以下发现：增加非重复的 非结构化多肽的长度增强了XTEN的非结构化性质并且相应地增强了包含 XTEN载体的构建体的物理化学和药物动力学特性。一般来说，并入到缀合 物中的呈单体形式或呈累计长度长于约400个残基的多聚体形式的XTEN与 较短累计长度(例如，短于约280个残基)相比得到较长半衰期。如实施例中更 全面地描述，即使是由重复次序的单一的家族序列基序(例如，表1的四个 AE基序)形成，XTEN的长度的成比例增加与较短的XTEN长度相比得到具 有如通过GOR算法所测定的较高百分比的无规卷曲形成率或如通过 Chou-Fasman算法所测定的较低含量的α螺旋或β折叠的序列。另外，如实 施例中所描述，增加非结构化多肽融合伴侣的长度得到终末半衰期与具有较 短序列长度的非结构化多肽伴侣的多肽相比不成比例地增加的构建体。在 XTEN主要充当载体的一些实施方案中，本发明涵盖了包含两个、三个、四 个或更多个XTEN的XTEN缀合组合物，其中XTEN蛋白质的累计XTEN序 列长度大于约100个、200个、400个、500个、600个、800个、900个、或 1000个至约3000个氨基酸残基，其中构建体当施用给受试者时与未连接到 XTEN并且以相当的剂量施用的有效负载相比展现增强的药物动力学特性。 在前述的一个实施方案中，两个或更多个XTEN序列各自与选自表2、表3 或表22-25中的任一者的序列展现至少约80％、90％、91％、92％、93％、94％、 95％、96％、97％或98％或更高的同一性，并且载体序列的其余部分(如果有 的话)含有至少90％的亲水氨基酸并且小于约2％的总体序列由疏水或芳香族 氨基酸或半胱氨酸组成。下文更全面地描述了XTEN-有效负载缀合物与未连 接到XTEN的有效负载相比增强的药物动力学特性。
5.来自XTEN前体的XTEN区段
在另一个方面，本发明提供了用以从较长的“供体”XTEN序列形成短长 度或中间长度的XTEN的方法，其中较长的供体XTEN序列在N端或C端 被截短，或通过包含裂解序列的XTEN的蛋白水解而形成区段，由此得到短 长度或中间长度的XTEN。在非限制性实例中，864个氨基酸残基的AG864 序列可以被截短以得到具有144个残基的AG144、具有288个残基的AG288、 具有576个残基的AG576，或其它中间长度，而AE864序列可以被截短以得 到多个AE144序列、具有288个或576个残基的AE288序列或AE576序列， 或其它较短长度或中间长度。类似地，可以操作编码较长“供体”序列的DNA 以并入半胱氨酸或赖氨酸残基以打算用于具有短长度或中间长度的XTEN的 缀合物中。特别预期，这种方法可以与本文所描述的XTEN实施方案中的任 一者或与表2、3、21和22中所列的序列中的任一者一起使用以得到所需长 度的XTEN。
在另一个方面，本发明提供了具有以规定间隔并入到序列内部的裂解序 列的XTEN，以使得XTEN可以通过裂解而加工成2个、3个、4个、5个或 6个均匀长度的较短XTEN。如图96A中所说明，单体XTEN被设计成具有 两个内部裂解序列，这些内部裂解序列当在有效引起所有裂解序列都裂解的 条件下用蛋白酶处理时，得到三个均匀长度的XTEN区段。另外，XTEN被 设计成具有一定序列，以使得所得XTEN区段也具有相同的氨基酸序列，将 残余的裂解序列包括在内。在一个实施方案中，本发明提供了具有规定序列 的XTEN，这个序列包含1个、2个、3个、4个或5个在XTEN序列内部并 且沿着桥接相同XTEN区段的XTEN序列以均匀间隔隔开的精氨酸(R)残基， 其中用胰蛋白酶处理使得XTEN裂解成具有相同长度和序列的XTEN区段。 在前述实施方案中，精氨酸残基在邻近的P1'位置处不具有脯氨酸残基。因此， 通过用胰蛋白酶处理前述序列，具有1个内部精氨酸的XTEN将得到2个相 同的XTEN区段，具有2个内部精氨酸的XTEN将得到3个相同的XTEN区 段，等等。在另一个实施方案中，前述实施方案的每个精氨酸经赖氨酸残基 置换。在另一个实施方案中，本发明提供了具有规定序列的XTEN，这个序 列包含1个、2个、3个、4个或5个在XTEN序列内部并且沿着XTEN序列以均匀间隔隔开的裂解序列，其中每个裂解序列是SASRSA，并且其中用胰 蛋白酶处理使得XTEN裂解成具有相同长度和序列的XTEN区段。在另一个 实施方案中，本发明提供了与选自表6中所阐述的序列的组的序列具有至少 约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或 至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％ 的序列同一性的XTEN。在另一个实施方案中，本发明提供了与选自表6中 所阐述的序列的组的序列具有至少约90％、或至少约91％、或至少约92％、 或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、 或至少约98％、或至少约99％的序列同一性的XTEN，其中XTEN进一步包 含第一亲和标签和第二亲和标签，其中每个亲和标签分别在XTEN的N端和 C端通过裂解序列连接到XTEN，其中每个裂解序列能够用胰蛋白酶裂解，并且其中第一亲和标签不同于第二亲和标签并且各自独立地选自由表7中所 阐述的亲和标签组成的组。图96B中说明了前述实施方案，其中用蛋白酶处 理具有两个内部裂解序列以及各自通过裂解序列连接到XTEN的N端和C端 亲和标签的XTEN使得构建体裂解成三个均匀长度的XTEN区段并且释放两 个亲和标签，其所得制剂可以随后被加工成如下文所描述的基本上同质的 XTEN。包含这些均匀裂解序列的XTEN的变化以及这些裂解序列在序列中的分布被本发明所涵盖。
表6：具有内部裂解序列的前体XTEN
6.净电荷
在其它实施方案中，XTEN多肽具有通过并入具有净电荷的氨基酸残基 并且在XTEN序列中含有低百分比的疏水氨基酸或没有疏水氨基酸而赋予的 非结构化特征。总净电荷和净电荷密度是通过改变XTEN序列中带电氨基酸 (正的或负的)的含量来控制，其中净电荷典型地表示为除了被具有相反电荷的 残基抵消的那些残基以外，多肽中促成带电状态的氨基酸的百分比。在一些 实施方案中，缀合物的XTEN的净电荷密度可以高于+0.1或低于-0.1电荷/残 基。本文中的蛋白质或肽的“净电荷密度”意味着净电荷除以蛋白质中氨基酸 的总数。在其它实施方案中，XTEN的净电荷可以为约0％、约1％、约2％、 约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、 约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、或 约20％或更高。基于净电荷，一些XTEN具有1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0或甚至6.5的等电点(pI)。在一个实施方案中，XTEN 将具有介于1.5与4.5之间的等电点并且在生理条件下带有净负电荷。
因为人类或动物中的大多数组织和表面具有净负电荷，所以在一些实施 方案中，XTEN序列经过设计以具有净负电荷，从而使含XTEN的组合物与 各种表面(如血管、健康组织或各种受体)之间的非特异性相互作用减至最小。 不受特定理论束缚，由于XTEN多肽的个别地带有净负电荷的个别氨基酸与 跨越XTEN多肽的序列分布的氨基酸之间的静电排斥，XTEN可以采用开放 构象。在一些实施方案中，XTEN序列被设计成具有至少90％到95％的带电 残基，这些带电残基被其它非带电残基(如丝氨酸、丙氨酸、苏氨酸、脯氨酸 或甘氨酸)隔开，这引起电荷的更均匀分布、更好的表达或纯化行为。XTEN 的延长的序列长度中的净负电荷的这种均匀分布也促成了聚合物的非结构化 构象，继而可以引起流体动力学半径的有效增大。在优选的实施方案中，主 题XTEN的负电荷是通过并入谷氨酸残基来赋予。一般来说，谷氨酸残基跨 越XTEN序列均匀地间隔开。在一些情况下，XTEN对于每20kDa的XTEN 可以含有约10-80个、或约15-60个、或约20-50个谷氨酸残基，这可以得到 具有带电残基的XTEN，这些带电残基将具有非常类似的pKa，从而可以增 加产物的电荷同质性并且使其等电点变尖锐，增强所得XTEN-有效负载的物 理化学特性，并且因此简化纯化程序。举例来说，在需要具有负电荷的XTEN 的情况下，XTEN可以仅选自AE家族序列，这个AE家族序列由于所并入的 谷氨酸而具有约17％的净电荷，或可以包括不同比例的表1的含谷氨酸的基 序以提供所需程度的净电荷。AE XTEN的非限制性实例包括(但不限于)表2 和21的AE36、AE42、AE144、AE288、AE432、AE576、AE624、AE864 和AE912序列或其片段。在一个实施方案中，表2或3的XTEN序列可以经 过修饰以包括额外的谷氨酸残基，从而实现所需的净负电荷。因此，在一个 实施方案中，本发明提供了XTEN，其中XTEN序列含有约1％、2％、4％、8％、10％、15％、17％、20％、25％或甚至约30％的谷氨酸。在一些情况下， XTEN对于每20kDa的XTEN可以含有约10-80个、或约15-60个、或约20-50 个谷氨酸残基，这可以得到具有带电残基的XTEN，这些带电残基将具有非 常类似的pKa，从而可以增加产物的电荷同质性并且使其等电点变尖锐，增 强所得XTEN缀合组合物的物理化学特性，并且因此简化纯化程序。在一个 实施方案中，本发明涵盖了除谷氨酸之外将至多5％的天冬氨酸残基并入到XTEN中以实现净负电荷。
不受特定理论束缚，预期具有较高净负电荷的XTEN-有效负载缀合物的 XTEN与各种带负电表面(如血管、组织或各种受体)具有较小的非特异性相互 作用，这将进一步促成降低的活性清除率。相反地，相信具有低(或没有)净电 荷的XTEN-有效负载缀合物的XTEN将与表面具有较高程度的相互作用，这 可以加强脉管系统或组织中相关缀合物的活性。
在其它实施方案中，在不需要净电荷的情况下，XTEN可以选自例如AG XTEN组分，如表1的AG基序，或表1的没有静电荷的那些AM基序。AG XTEN的非限制性实例包括(但不限于)表2和22的36、42、144、288、576 和864AG家族序列或其片段。在另一个实施方案中，XTEN可以包含不同比 例的AE和AG基序以具有被视为对于给定的用途来说最佳的净电荷或维持给定的物理化学特性。
本发明的缀合物的XTEN一般不具有或具有低含量的带正电氨基酸。在 一些实施方案中，XTEN可以具有少于约10％的具有正电荷的氨基酸残基， 或少于约7％、或少于约5％、或少于约2％、或少于约1％的具有正电荷的氨 基酸残基。然而，本发明涵盖了如下构建体：其中规定数目的具有正电荷的 氨基酸(如赖氨酸)被并入到XTEN中以允许赖氨酸的ε-胺与将缀合到XTEN 骨架的有效负载或交联剂上的反应基团之间进行缀合。在前述的一个实施方 案中，主题缀合物的XTEN具有约1个至约100个赖氨酸残基、或约1个至 约70个赖氨酸残基、或约1个至约50个赖氨酸残基、或约1个至约30个赖 氨酸残基、或约1个至约20个赖氨酸残基、或约1个至约10个赖氨酸残基、 或约1个至约5个赖氨酸残基、或约1个至约3个赖氨酸残基，或者仅具有 单一的赖氨酸残基。使用前述含赖氨酸的XTEN，可以构建包含XTEN、任 选的交联剂加上适用于治疗受试者的病状的有效负载的缀合物，其中连接到XTEN组分的有效负载剂的分子的最大数目是由并入到XTEN中的具有反应 侧基(例如，末端胺)的赖氨酸的数目确定。
7.低免疫原性
在另一个方面，本发明提供了具有低程度的免疫原性或基本上是非免疫 原性的XTEN组合物。若干因素可以促成XTEN的低免疫原性，例如，非重 复序列、非结构化构象、高度可溶性、低程度的或缺乏自聚集、序列内低程 度的或缺乏蛋白水解位点、以及XTEN序列中低程度的或缺乏表位。
构象表位是由蛋白质表面的区域形成，这些区域由蛋白质抗原的多个不 连续的氨基酸序列组成。蛋白质的精确折叠使这些序列变成明确界定的稳定 空间构型，或可以被宿主体液免疫系统识别为“外来”的表位，从而使得产生 针对蛋白质的抗体或活化细胞介导的免疫反应。在后一种情况下，对个体中 的蛋白质的免疫反应深受T细胞表位识别所影响，T细胞表位识别是个体的 HLA-DR异型的肽结合特异性的功能。MHC II类肽复合物被T细胞表面上的 同源T细胞受体啮合，以及某些其它辅受体(如CD4分子)的交叉结合，可以 诱导T细胞内的活化状态。活化使得细胞因子释放，从而进一步活化其它淋 巴细胞(如B细胞)以产生抗体，或活化T杀伤细胞作为完整细胞免疫反应。
肽结合给定的MHC II类分子用于在APC(抗原呈递细胞)的表面上呈递 的能力取决于许多因素；最显著的是其一级序列。在一个实施方案中，较低 程度的免疫原性是通过设计抵抗抗原呈递细胞中的抗原加工的XTEN序列， 和/或选择不会充分结合MHC受体的序列来实现。本发明提供了具有基本上 非重复的XTEN多肽的XTEN-有效负载、XTEN-交联剂和XTEN-点击化学反 应物缀合物，这些XTEN多肽经过设计以减少与MHC II受体结合，以及避免用于T细胞受体或抗体结合的表位形成，从而产生低程度的免疫原性。避 免免疫原性至少一部分可以归因于XTEN序列的构象柔性的结果；即，因氨 基酸残基的选择和次序所致的二级结构的缺乏。举例来说，特别关注的是在 水溶液中或在可以产生构象表位的生理条件下具有适应紧密折叠的构象的低 趋势的序列。使用常规的治疗惯例和给药施用包含XTEN的多肽将一般不会 形成针对XTEN序列的中和抗体，以及降低缀合物中的有效负载的免疫原性。
在一个实施方案中，主题多肽中所用的XTEN序列可以基本上没有被人 类T细胞识别的表位。为了产生较小免疫原性的蛋白质的目的而消除这些表 位在先前已经公开；参看例如WO 98/52976、WO 02/079232和WO 00/331 7，其以引用的方式并入本文中。已经描述了用于人类T细胞表位的试验(Sti ckler,M.等人(2003)J Immunol Methods,281:95-108)。特别关注的是可以 在不产生T细胞表位或非人类序列的情况下进行寡聚的肽序列。这是通过以 下来实现：针对T细胞表位的存在以及针对并非人类的6聚体到15聚体并且 特别是9聚体的出现来测试这些序列的正向重复，然后改变XTEN序列的设 计以消除或破坏表位序列。在一些实施方案中，通过限制经预测结合MHC 受体的XTEN的表位的数目而使XTEN序列基本上是非免疫原性的。随着能 够结合到MHC受体的表位的数目减少，T细胞活化的潜力以及T细胞辅助 功能伴随地降低，B细胞活化或上调减少以及抗体产生减少。如实施例46中所示，低程度的预测的T细胞表位可以通过表位预测算法(如TEPITOPE)来确 定(Sturniolo,T.等人(1999)Nat Biotechnol,17:555-61)。如Sturniolo,T.等 人(1999)Nature Biotechnology 17:555)中所公开，在蛋白质内给定的肽框 架的TEPITOPE计分是那个肽框架与多个最常见的人类MHC等位基因的结 合的Kd(离解常数、亲和力、离解率)的对数。这个计分范围在至少20个对 数上，从约10至约-10(对应于10e10Kd到10e-10Kd的结合约束)，并且可以 通过避免在MHC上进行肽展示期间充当锚定残基(如M、I、L、V、F)的疏 水氨基酸来降低。在一些实施方案中，并入到XTEN-有效负载、XTEN-交联 剂或XTEN-点击化学反应物缀合物中的XTEN组分在约-5、或-6、或-7、或- 8、或-9的TEPITOPE阈值计分下或在-10的TEPITOPE计分下不具有预测的 T细胞表位。如本文所用的“-9”的计分是比-5的计分更严格的TEPITOPE阈 值。
8.增大的流体动力学半径
在另一个方面，适用作融合伴侣的主题XTEN具有高流体动力学半径； 这一特性与没有XTEN的有效负载相比向XTEN-有效负载组合物赋予相应增 加的表观分子量。如实施例26中所详述，XTEN与治疗性蛋白质序列的连接 得到组合物，这类组合物与未连接到XTEN的治疗性蛋白质相比可以具有增 大的流体动力学半径、增加的表观分子量以及增大的表观分子量因子。举例 来说，在需要延长的半衰期的治疗性应用中，其中一个或多个具有高流体动 力学半径的XTEN缀合到有效负载的组合物可以有效地扩大缀合物的流体动 力学半径超过约3-5nm的肾小球孔隙尺寸(对应于约70kDa的表观分子量)(Caliceti.2003.Pharmacokinetic and biodistribution properties of poly(ethylene glycol)-protein conjugates.Adv Drug Deliv Rev 55:1261-1277)，从而使得 循环蛋白质的肾清除率降低并且终末半衰期相应地增加以及其它药物动力学 特性增强。蛋白质的流体动力学半径是由其分子量以及其结构所赋予，其结 构包括形状或致密性。不受特定理论束缚，由于XTEN中所并入的带电残基 的个别电荷之间的静电排斥以及由于缺乏具有二级结构的潜力的序列中的特 定氨基酸所赋予的固有柔性，XTEN可以采用开放构象。XTEN多肽的开放、 延伸和非结构化的构象与具有二级或三级结构的相当序列长度和/或分子量 的多肽(如典型的球状蛋白质)相比具有更大比例的流体动力学半径。测定流体 动力学半径的方法在本领域中是众所周知的，例如通过使用如美国专利号6, 406,632和7,294,513中所描述的尺寸排阻色谱(SEC)。实施例26展示了，XT EN长度的增加使得流体动力学半径、表观分子量和/或表观分子量因子成比 例地增大，并且因此允许定制XTEN-有效负载以达到表观分子量或流体动力 学半径的所需截止值。因此，在某些实施方案中，XTEN-有效负载可以被配 置成具有一种XTEN，以使得所得缀合物可以具有至少约5nm、或至少约8 nm、或至少约10nm、或约12nm、或约15nm、或约20nm、或约30nm 或更大的流体动力学半径。在前述的实施方案中，由XTEN-有效负载缀合物 中的XTEN所赋予的大流体动力学半径可以使得所得缀合物的清除率降低、 终末半衰期增加以及平均停留时间增加。如实施例中所描述，当含XTEN的 组合物的分子量来源于尺寸排阻色谱分析时，由于低程度的二级结构所致的XTEN的开放构象使得其所并入的缀合物的表观分子量增加。在一个实施方 案中，本发明利用了以下发现：如下文更全面地描述，表观分子量的增加可 以通过不仅连接给定长度的单一XTEN，而且以线性方式或以三聚或四聚分 支构型连接2个、3个、4个或更多个成比例缩短的长度的XTEN来实现。在 一些实施方案中，包含有效负载和一个或多个XTEN的XTEN展现至少约4 00kD、或至少约500kD、或至少约700kD、或至少约1000kD、或至少约 1400kD、或至少约1600kD、或至少约1800kD、或至少约2000kD的表 观分子量。因此，XTEN-有效负载缀合物展现比缀合物的实际分子量约高1. 3倍、或约高2倍、或约高3倍、或约高4倍、或约高8倍、或约高10倍、 或约高12倍、或约15倍、或约高20倍的表观分子量。在一个实施方案中， 本文所公开的实施方案中的任一者的经分离的XTEN-有效负载缀合物在生理 条件下展现大于约1.3、或约2、或约3、或约4、或约5、或约6、或约7、 或约8、或约10或大于约15的表观分子量因子。在另一个实施方案中，XT EN-有效负载相对于缀合物的实际分子量在生理条件下具有约3至约20、或 约5至约15、或约8至约12、或约9至约10的表观分子量因子。一般来说， 主题XTEN-有效负载缀合物的增加的表观分子量通过因素的组合增强了组合 物的药物动力学特性，这些因素包括降低的活性清除率、降低的肾清除率以 及减少的通过毛细血管和静脉接合处的损失。
9.组合物和将XTEN纯化成基本上同质的制剂的方法
本发明的一个目的在于提供XTEN的组合物以及制造包含具有高水平的 纯度和长度均匀性的XTEN的制剂和本文所描述的XTEN的组合物的方法。
如同任何球状蛋白质一样，在宿主细胞中正常地表达包含XTEN的重组 XTEN蛋白质或重组融合蛋白质得到不同化合物的混合物，其中一部分是所 需蛋白质长度的截短型式。截短可以是在宿主细胞中早期翻译终止、mRNA 不稳定或蛋白水解的结果。因为球状蛋白质一般有效或完全折叠成其三维结 构，而截短型式不会这样，所以典型的纯化和回收工艺可以成功地分离并去 除截短型式，以使得在球状蛋白质的给定制剂中实现高水平的产物同质性。 然而，如XTEN的蛋白质聚合物的独特之处在于，考虑到其非结构化性质， 一般缺乏三维结构。由于一个或多个上述问题而难以获得全长XTEN的同质 制剂。这是因为不完全或截短的XTEN链在其物理化学特性方面与所需的全 长序列仅仅稍有不同，这使得将足以纯化球状蛋白质的传统工艺不会有效地 从表达产物中去除截短的XTEN来获得全长序列的基本上同质的制剂。虽然 本发明的主题XTEN，包括连接到有效负载的XTEN，可以通过用于蛋白质 的常规手段纯化到中等程度的同质性，这些手段如盐分分离、离子交换色谱、 尺寸排阻色谱、羟磷灰石吸附色谱、疏水相互作用色谱或凝胶电泳，但单独 的这些方法不会得到XTEN在序列长度上是基本上同质的制剂。
本文所提供的主题方法允许经由一个或几个简单的纯化步骤产生XTEN 的基本上同质的制剂。在一个实施方案中，本发明的这些方法中的任一者的 实施可以利用XTEN，这种XTEN经过设计以作为融合蛋白质进一步包含定 位在XTEN的N端和C端的亲和标签，以使得可以对经表达的产物进行纯化 方法来选择性地捕获经表达的全长多肽，由此去除截短的XTEN副产物(参看 图41-42)。可以添加到XTEN的末端的亲和标签的非限制性实例呈现于表7 中。用以实现基本上同质的XTEN的设计、表达方法和纯化方法的非限制性 实例描述于实施例中。
在一些实施方案中，本发明提供了基本上同质的多肽组合物，其具有直 接融合到一个亲和标签(例如(但不限于)表7的标签)的XTEN，这个亲和标签 连接到XTEN的N端或C端。在其它实施方案中，本发明提供了基本上同质 的多肽组合物，其具有融合到一个亲和标签(例如(但不限于)表7的标签)的 XTEN，这个亲和标签通过裂解序列连接到XTEN的N端或C端。在其它实 施方案中，本发明提供了基本上同质的多肽组合物，其具有直接融合到一个 或两个不同的亲和标签(例如(但不限于)表7的标签)的XTEN，这一个或两个 不同的亲和标签连接到XTEN的N端和/或C端，如图41中所示。在其它实 施方案中，本发明提供了基本上同质的组合物，其具有融合到一个或两个裂 解序列(例如(但不限于)表8或表9的裂解序列)的XTEN，这一个或两个裂解 序列继而各自融合到不同的亲和标签(例如(但不限于)表7的标签)，这些亲和 标签连接到XTEN的N端或C端或N端和C端，如图41中所示。在另外其 它的实施方案中，本发明提供了基本上同质的多肽组合物，其具有直接融合 到一个或两个不同的亲和标签(例如(但不限于)表7的标签)的XTEN，这一个 或两个不同的亲和标签连接到XTEN的N端和/或C端，这些多肽组合物进 一步包含融合到蛋白质的N端的辅助序列(例如(但不限于)表12的序列)。如 在本文所描述的蛋白质的情形中所用的“基本上同质”意味着制剂的至少约 85％、或至少约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至 少约94％、或至少约95％、96％、97％、98％、99％或甚至更多的多肽序列具 有相同的序列长度。百分比值是基于通过HPLC分析的制剂的色谱图的面积 百分比或通过SDS-PAGE分析的制剂的扫描的面积百分比，或通过本领域中 已知用于评定蛋白质纯度的其它这类的标准程序。
在一个实施方案中，本发明提供了基本上同质的多肽，其具有式I的构 型：
(HS)-(AT1)-(CS1)-(XTEN) I
其中HS是辅助序列，AT1是第一亲和标签，CS1是第一裂解序列，并 且XTEN是延伸重组多肽。
在另一个实施方案中，本发明提供了基本上同质的多肽，其具有式II的 构型
(HS)-(CS1)-(XTEN)-(CS2)-(AT1) II
其中HS是辅助序列，AT1是第一亲和标签，CS1是第一裂解序列，CS2 是第二裂解序列，并且XTEN是延伸重组多肽。
在另一个实施方案中，其中组合物具有式III的构型：
(HS)-(AT1)-(CS1)-(XTEN)-(CS2)-(AT2) III
其中HS是辅助序列，AT1是第一亲和标签，AT2是第二亲和标签，CS1 是第一裂解序列，CS2是第二裂解序列，并且XTEN是延伸重组多肽。
包含亲和标签的多肽构建体与未连接到亲和标签的XTEN相比具有有利 的特性，在于能够通过使用亲和标签将结合的色谱底物纯化到基本上同质的 长度。在一些实施方案中，用于纯化方法中的色谱底物的类别是选自表7中 所阐述的色谱底物，这些色谱底物被用于纯化连接到表中对应的指定亲和标 签的XTEN。如本领域的技术人员应了解，色谱底物的类别可以包含连接到 不同基质或树脂的不同化学基团；例如，阴离子交换底物包括结合到树脂的 三甲基季铵和二乙氨乙基，阳离子交换底物包括结合到树脂的磺基或磺丙基或羧甲基或磷酸酯基，HIC底物包括结合到树脂的乙基、异丙基、丁基、苯 基或辛基，并且IMAC底物包括结合到树脂的亚氨基二乙酸基和次氮基乙酸 基。列出前述底物用于说明的目的，并且不打算限制可以用于实施本发明的 底物的范围。
在一些实施方案中，本发明提供了从多肽制备的基本上同质的XTEN， 这种多肽包含通过裂解序列(例如(但不限于)表8的裂解序列)融合到第一亲和 标签或第一亲和标签和第二亲和标签的XTEN，这些裂解序列能够用蛋白酶 裂解，其中制剂经蛋白酶处理以使裂解序列裂解以从多肽中释放XTEN，接 下来进行色谱步骤以结合、然后洗脱，然后回收基本上同质的XTEN。在前 述的一个实施方案中，蛋白酶是胰蛋白酶并且裂解序列能够用胰蛋白酶裂解， 其非限制性实例列在表11和15中。在前述的另一个实施方案中，蛋白酶是 TEV并且裂解序列能够用TEV裂解。在前述的另一个实施方案中，经裂解的 XTEN通过结合到MacoCap SP色谱底物而纯化，接下来用例如(但不限于)磷 酸钠/NaCl的盐或缓冲溶液洗脱，从而得到基本上同质的XTEN。如在XTEN 和/或包含XTEN的多肽的情形中所用的“基本上经纯化”的制剂意味着给定制 剂的至少约85％、并且更优选地至少约90％、并且更优选地至少约91％、并 且更优选地至少约92％、并且更优选地至少约93％、并且更优选地至少约94％、并且更优选地至少约95％或更多的个别分子具有相同的序列长度；换 句话说，具有相同数目的氨基酸。可以被用来分析长度的同质性的方法包括 质谱法、尺寸排阻色谱/HPLC或SDS-PAGE继之以银染色；这些方法可以个 别地或共同地使用以量化同质性的程度。用于纯化包含具有针对纯化而优化 的亲和标签序列的XTEN的多肽的一般性流程示于图41-42中。在纯化之后， 标签可以被蛋白水解裂解(图41B)或被保留(图41C)。如图42中所说明，由于 XTEN的独特氨基酸组成，XTEN可以从污染物中纯化。
在一个实施方案中，本发明提供了一种用以产生包含XTEN的多肽的基 本上经纯化的制剂的方法，其包括以下步骤：设计编码XTEN和第一亲和标 签的基因，形成适合于转化包含可操作地连接到控制序列的编码基因的宿主 细胞的表达载体，用表达载体转化宿主细胞，在适合于表达与亲和标签连接 的XTEN的条件下培养宿主细胞，对粗表达产物进行包括亲和纯化步骤的纯 化工艺，在这个步骤中将粗表达产物加载到选择性地结合第一亲和标签的第 一色谱底物上，洗涤色谱底物以洗脱未结合到色谱底物的物质，在适当条件下洗脱被保留的蛋白质，以及回收洗脱物，其中经回收的多肽在长度上是基 本上同质的。在另一个实施方案中，本发明提供了一种用以产生包含XTEN 的多肽的基本上同质的制剂的方法，其包括以下步骤：设计编码包含第一亲 和标签和第二亲和标签的XTEN的基因，形成适合于转化包含可操作地连接 到控制序列的编码基因的宿主细胞的表达载体，用表达载体转化宿主细胞， 在适合于表达多肽的条件下培养宿主细胞，对粗表达产物进行包括亲和纯化 步骤的纯化工艺，在这个步骤中将溶解产物加载到选择性地结合第一亲和标 签的第一色谱底物上，洗涤色谱底物以洗脱未结合到色谱底物的物质，在适 当条件下洗脱被保留的蛋白质，以及回收洗脱物，在有效地将具有第二亲和 标签的多肽捕获到色谱底物上的条件下将经回收的XTEN多肽加载到第二色 谱底物上，洗涤色谱底物以洗脱未结合到色谱底物的物质，在有效地洗脱具 有第二亲和标签的XTEN多肽的条件下洗脱XTEN多肽，回收含有包含具有 第一亲和标签和第二亲和标签的XTEN多肽的多肽的洗脱物，其中经回收的 多肽在长度上是基本上同质的。在又另一个实施方案中，本发明提供了一种 用以产生包含XTEN的多肽的基本上同质的制剂的方法，其包括以下步骤： 设计编码XTEN的基因，这个XTEN包含通过裂解序列连接到经编码的XT EN的N端的第一亲和标签以及通过裂解序列连接到经编码的XTEN的C端 的第二亲和标签，形成适合于转化包含可操作地连接到控制序列的编码基因 的宿主细胞的表达载体，用表达载体转化宿主细胞，在适合于表达多肽的条件下培养宿主细胞，对粗表达产物进行包括亲和纯化步骤的纯化工艺，在这 个步骤中将溶解产物加载到选择性地结合第一亲和标签的第一色谱底物上， 洗涤色谱底物以洗脱未结合到色谱底物的物质，在适当条件下洗脱被保留的 蛋白质，以及回收洗脱物，在有效地将具有第二亲和标签的多肽捕获到色谱 底物上的条件下将经回收的多肽加载到第二色谱底物上，洗涤色谱底物以洗 脱未结合到色谱底物的物质，在有效地洗脱具有第二亲和标签的多肽的条件 下洗脱多肽，然后在有效地从多肽中释放XTEN的条件下用蛋白酶处理经回 收的多肽，以及将物质加载到能够捕获XTEN而不是亲和标签的色谱底物上， 洗涤色谱底物以洗脱未结合到色谱底物的物质，洗脱XTEN，回收含有XTE N多肽的洗脱物，其中经回收的XTEN在长度上是基本上同质的。在这一段 中所描述的前述方法的一个实施方案中，第一亲和标签和第二亲和标签是选 自表7中所阐述的亲和标签的组。在这种方法的一个实施方案中，以融合蛋 白质形式连接到XTEN的第一亲和标签包含序列RPRPRPRPRPRPR并且用于 结合多肽的色谱底物是MacroCap SP。在前述方法的另一个实施方案中，以 融合蛋白质形式连接到XTEN的第一端的第一亲和标签包含序列RPRPRPRP RPRPRPRPRPRPRPR，连接到XTEN的第二端的第二亲和标签包含序列HH HHHHHH，用于结合多肽的第一色谱底物是MacroCapSP，并且用于结合多 肽的第二色谱底物是固定在亲和(IMAC)底物上的金属。在前述方法的另一个 实施方案中，与以融合蛋白质形式融合到XTEN的第一端的裂解序列融合的 第一亲和标签包含序列RPRPRPRPRPRPR或RPRPRPRPRPRPRPRPRPRPRP R，与融合到XTEN的第二端的裂解序列融合的第二亲和标签包含序列HHH HHH或HHHHHHHH，用于结合多肽的第一色谱底物是MacroCap SP，用于 结合多肽的第二色谱底物是固定在亲和(IMAC)底物上的金属，裂解序列包含 精氨酸或赖氨酸(包括(但不限于)表8和9的序列)并且用胰蛋白酶裂解，并且Macrocap Q是用于结合从亲和标签中游离出的XTEN的色谱底物，或在替代 方案中，游离出的XTEN通过以下方式以流通液的形式捕获：使经蛋白酶处 理的制剂通过阳离子交换、HIC和/或IMAC中的一者或多者以捕获裂解产物 和蛋白酶，在流通液中留下XTEN，然后以基本上同质的制剂回收XTEN。
本领域的技术人员应了解，方法步骤的次序和特定条件将视XTEN-亲和 标签多肽的组合物以及起始表达水平和截短的污染物的污染程度而变化。举 例来说，关于某些XTEN组合物，连接到XTEN的单一亲和标签的使用将足 以获得多肽分子在长度上是基本上同质的制剂。在这些情况下，在一个实施 方案中，单一亲和标签是选自表7中所阐述的亲和标签。关于其它XTEN组 合物，第一亲和标签和第二亲和标签的使用将足以获得多肽分子在长度上是 基本上同质的制剂，并且在这些情况下，在一个实施方案中，第一亲和标签 和第二亲和标签是不同的并且各自选自表7中所阐述的亲和标签。本领域的 技术人员应进一步了解，一旦纯化包含裂解序列的多肽，经回收的多肽即可 随后通过蛋白水解来处理以释放一个或两个亲和标签，接下来使经处理的 XTEN通过色谱底物以回收没有连接亲和标签的XTEN。图42中说明了这种 方法的示意图，并且示范性的方法描述于实施例中。许多不同的蛋白酶可以 被用于释放末端纯化标签，这取决于将亲和标签连接到XTEN的序列，包括 (但不限于)选自表9的蛋白酶。在一个实施方案中，蛋白酶选自由胰蛋白酶、 胰凝乳蛋白酶、烟草蚀纹病毒(tobacco etch mosaic virus)蛋白酶(TEV)、FXa 和肠激酶组成的组。在另一个实施方案中，并入到多肽中的裂解序列包含可 以被裂解的精氨酸残基以及通过胰蛋白酶处理而去除的亲和标签，由此释放 XTEN，这个XTEN随后以基本上经纯化的形式通过色谱来回收，例如，通 过使用阴离子交换(包括(但不限于)MacroCap Q)捕获，或以流通液的形式回 收，其中非XTEN裂解产物和蛋白酶通过HIC、阳离子交换或IMAC色谱中 的一者或多者而捕获，在流通液中留下基本上同质的XTEN。
表7：亲和标签和结合亲和标签的色谱底物的类别
表8：胰蛋白酶裂解序列
P4 P3 P2 P1 P1′ P2′
S A S R S A
S A S K S A
G S G R A T
E A A R H H
A P G R H H
G S G R G S
R X*
K X*
*X＝除了脯氨酸以外的任何L-氨基酸
表9：蛋白酶和蛋白酶裂解序列
↓指示裂解位点
*在斜线号之前、中间或之后的多个氨基酸的列表指示在这个位置处可以 取代的替代性氨基酸；“-”指示任何氨基酸都可以取代中间栏中所指示的对应 的氨基酸
**x是除了脯氨酸以外的任何L-氨基酸
在另一个实施方案中，XTEN可以经过设计以使得一个或两个连接到末 端并且用来有助于纯化的亲和标签可以保留为最终产物的一部分，从而消除 了对蛋白酶释放步骤的需要。如果纯化标签经过设计以保留为药物产品的一 部分，那么就选择不会引发明显的免疫反应的标签序列。可以使用计算预测 算法或实验性试验来预测免疫原性。避免T细胞和B细胞表位的序列是优选 的。并入到XTEN序列的末端，有助于捕获并且可以任选地保持与缀合物构 建体相关联的序列的非限制性实例提供于表7中。
10.用于增加XTEN的表达的组合物
在另一个方面，本发明提供了包含编码XTEN的多核酸序列的构建体以 及制造用于主题缀合物中的XTEN的方法，其中将额外的编码多核苷酸辅助 序列添加到编码XTEN的多核苷酸的5'端或添加到编码连接到编码XTEN的 序列的5'端的亲和标签的序列的5'端，以增强并促进XTEN或具有连接到亲 和标签多肽的裂解序列的XTEN在经转化的宿主细胞(如细菌)中的表达。这 些经编码的辅助序列的实例在表10中和实施例中给出。在一个实施方案中， 本发明提供了编码包含辅助序列的多肽的多核苷酸序列构建体，这个辅助序 列与选自表10的序列具有至少约80％、或至少约90％、或至少约95％、或 至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％的序列同一性， 这个辅助序列连接到选自表7中所阐述的序列的组的第一亲和标签的N端， 这个第一亲和标签继而连接到本文所描述的裂解序列或直接连接到XTEN的 N端，这个XTEN与选自表2和3中所阐述的序列的组的序列具有至少约 90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至 少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％的 序列同一性。本发明提供了编码构建体的表达载体，其适用于以高表达水平 产生多肽和XTEN的基本上同质的制剂的方法中。在一些实施方案中，本发 明提供了产生包含XTEN和第一亲和标签和第二亲和标签以及辅助序列的多 肽的基本上同质的群体的方法，这种方法包括在一定条件下于发酵反应物中 培养包含编码包含XTEN和第一亲和标签和第二亲和标签的多肽的载体的宿 主细胞，当发酵反应物在600nm的波长下达到至少130的光密度时，这些条 件有效地表达多肽以使得作为宿主细胞的粗表达产物的组分产生大于约2 g/L、或大于约3g/L、或大于约4g/L、或大于约5g/L、或大于约6g/L、或 大于约7克/升(7g/L)的多肽。在一个实施方案中，这种方法进一步包括以下 步骤：在一定条件下使多肽吸附到第一色谱底物上，这些条件有效地将多肽 的第一亲和标签捕获到这个色谱底物上；洗脱并回收多肽；在一定条件下使 多肽吸附到第二色谱底物上，这些条件有效地将多肽的第二亲和标签捕获到 这个色谱底物上；洗脱多肽；以及回收基本上同质的多肽制剂。在前述方法 的一个实施方案中，载体进一步包含编码在经编码的多肽的N端的辅助序列 的核苷酸，其中辅助序列与表10中所阐述的序列具有至少80％、或至少90％、 或至少95％的序列同一性。在其它实施方案中，本发明提供了产生包含XTEN 和第一亲和标签和第二亲和标签以及辅助序列的多肽的基本上同质的群体的方法，这种方法包括在一定条件下于发酵反应物中培养包含编码包含XTEN 和第一亲和标签和第二亲和标签的多肽的载体的宿主细胞，当发酵反应物在 600nm的波长下达到至少130的光密度时，这些条件有效地以大于约10毫 克/克宿主细胞干重(mg/g)、或至少约250微摩尔/升、或约300微摩尔/升、或 约350微摩尔/升、或约400微摩尔/升、或约450微摩尔/升、或约500微摩 尔/升的所述多肽的浓度表达多肽产物。在前述的一个实施方案中，这种方法 进一步包括以下步骤：在一定条件下使多肽吸附到第一色谱底物上，这些条 件有效地将多肽的第一亲和标签捕获到这个色谱底物上；洗脱并回收多肽； 在一定条件下使多肽吸附到第二色谱底物上，这些条件有效地将多肽的第二 亲和标签捕获到这个色谱底物上；洗脱多肽；以及回收基本上同质的多肽制 剂。在前述方法的一个实施方案中，载体进一步包含编码在经编码的多肽的 N端的辅助序列的核苷酸，其中辅助序列与表10中所阐述的序列具有至少 80％、或至少90％、或至少95％的序列同一性。在其它实施方案中，本发明 提供了产生包含XTEN和第一亲和标签和第二亲和标签以及辅助序列的多肽 的基本上同质的群体的方法，这种方法包括在一定条件下于发酵反应物中培 养包含编码包含XTEN和第一亲和标签和第二亲和标签的多肽的载体的宿主 细胞，当发酵反应物在600nm的波长下达到至少130的光密度时，这些条件 有效地以大于约10毫克/克宿主细胞干重(mg/g)、或至少约15mg/g、或至少 约20mg/g、或至少约25mg/g、或至少约30mg/g、或至少约40mg/g、或至 少约50mg/g的所述多肽的浓度表达多肽产物。在前述的一个实施方案中， 这种方法进一步包括以下步骤：在一定条件下使多肽吸附到第一色谱底物上， 这些条件有效地将多肽的第一亲和标签捕获到这个色谱底物上；洗脱并回收 多肽；在一定条件下使多肽吸附到第二色谱底物上，这些条件有效地将多肽 的第二亲和标签捕获到这个色谱底物上；洗脱多肽；以及回收基本上同质的 多肽制剂。在前述方法的一个实施方案中，载体进一步包含编码在经编码的 多肽的N端的辅助序列的核苷酸，其中辅助序列与表10中所阐述的序列具 有至少80％、或至少90％、或至少95％的序列同一性。在另一个实施方案中， 这一段的前述方法的构建体进一步包含编码在亲和标签与XTEN之间的蛋白 酶裂解序列的核苷酸，并且这种方法提供了，用能够使裂解序列裂解的蛋白 酶(例如(但不限于)胰蛋白酶)处理制剂的经回收的多肽，由此从多肽中释放 XTEN；在有效地捕获XTEN的条件下使XTEN吸附到色谱底物上；然后以 基本上同质的XTEN洗脱并回收XTEN。
表10：有助于蛋白质在细菌中表达、分泌和加工的辅助序列的实例
*在n或m＝0的情况下，邻接的氨基酸是相连的
**指示可以在氨基酸序列条目中的给定位置处利用的氨基酸，其中替代 物用“/”隔开
III).有效负载
本发明一部分是关于连接到一个或多个有效负载分子的XTEN缀合物。 预期，XTEN可以连接到多种多样的有效负载分子，包括生物活性肽、蛋白 质、聚合物、药理活性小分子、多核酸、靶向肽和蛋白质、靶向小分子、抗 体和抗体片段，和成像小分子有效负载，以及这些类型的有效负载的组合， 从而得到具有2种、3种、4种或更多种类型的有效负载的组合物。本发明解 决了增加外源施用给有需要的受试者的治疗性和诊断性有效负载的终末半衰 期，以及可以包括治疗性组分和靶向组分的有效负载的组合的长期需要。
用于连接到本发明的XTEN的药理活性的有效负载剂的功能种类的非限 制性实例可以是以下任一者或多者：安眠药和镇静剂、心力加强剂、安定剂、 呼吸道药物、抗惊厥药、肌肉松弛药、抗帕金森剂(antiparkinson agent)(多巴 胺拮抗剂)、止痛剂、消炎药、抗焦虑药物(抗焦虑剂)、食欲抑制剂、抗偏头 痛剂、肌肉收缩药、抗感染药(抗生素、抗病毒剂、抗真菌剂、疫苗)、抗关节 炎药、抗疟药、止吐药、抗癫痫药、支气管扩张剂、凝血因子、细胞因子、 趋化因子、白介素、生长因子、生长激素、内分泌激素、外分泌激素、胰岛 素、葡萄糖调节肽、抗癌剂、抗血栓形成剂、抗高血压药、心血管药物、抗 心律失常药、抗氧化剂、平喘剂、激素剂(包括避孕药)、拟交感神经药、利尿 剂、脂质调节剂、抗雄激素剂、抗寄生虫药、抗凝血剂、肿瘤药、抗肿瘤药、 降血糖药、营养剂和补充剂、生长补充剂、抗肠炎剂、疫苗、抗体、诊断剂、 对比剂和放射性成像剂。
更具体地说，活性有效负载可以属于许多结构种类之一，包括(但不限于) 小分子药物、生物活性蛋白质(肽、多肽、蛋白质、重组蛋白质、抗体和糖蛋 白)、类固醇、核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸、脂肪、电解质，等等。对于 XTEN-有效负载缀合组合物来说，特别预期，有效负载可以是具有适合的反 应官能团，包括(但不限于)天然氨基、巯基、羧基、醛基、酮基、烯烃基、炔 烃基、叠氮基、醇基、杂环的药理活性剂，或者，经过修饰以含有适合于使 用本文所描述的缀合方法中的任一者偶合到本发明的XTEN、XTEN-交联剂 或XTEN-点击化学反应物的前述反应基团中的至少一者，或以其它方式已知 在本领域中适用于缀合这些反应基团。特定的官能部分和其反应性描述于 Organic Chemistry,第2版Thomas Sorrell,University Science Books,Herndon, VA(2005)中。此外，应了解，含有反应基团或经过修饰以含有反应基团的任 何有效负载还将含有在缀合到XTEN、XTEN-交联剂或XTEN-点击化学反应 物所连接者之后的残基。
适合于共价连接到XTEN聚合物、XTEN-交联剂或XTEN-点击化学反应 物的示范性的有效负载包括具有活性的生物活性蛋白质和药理活性小分子药 物。适用于本发明组合物的示范性的药物可以如官方的美国药典(United States Pharmacopeia)、官方的美国顺势疗法药典(Homeopathic Pharmacopeia of the United States)或官方的国家处方集(National Formulary)中所阐述，在美国食品 和药物管理局(U.S.Food and DrugAdministration；FDA)所保存的医师案头参 考(Physician's Desk Reference；PDR)中和橙皮书(Orange Book)中找到。优选的 药物是具有所需的反应官能团的那些药物或可以容易地进行衍生化以提供用 于缀合的反应官能团的那些药物，并且当缀合到XTEN时将保留未经缀合的 有效负载的至少一部分药理活性。
1.作为有效负载的药物
在一些实施方案中，用于缀合到本文所描述的主题XTEN、XTEN-交联 剂或XTEN-点击化学反应物的药物有效负载是本文所描述的或选自表11的 有效负载的一种或多种药剂，或其医药学上可接受的盐、酸或衍生物或促效 剂。在一个实施方案中，药物经过衍生化以将用于缀合的反应基团引入到本 文所描述的主题XTEN、XTEN-交联剂或XTEN-点击化学反应物中。在另一 个实施方案中，用于缀合的药物经过衍生化以引入可裂解接头，例如(但不限 于)缬氨酸-瓜氨酸-PAB，其中这个接头在施用给受试者之后能够用循环或细 胞内蛋白酶裂解，由此使药物从缀合物中游离出。
表11：用于缀合到XTEN的药物
2.作为有效负载的生物活性蛋白质
在另一个方面，本发明提供了XTEN-有效负载组合物，其中有效负载是 生物活性蛋白质，呈肽或多肽的形式。在XTEN-有效负载缀合物的一些实施 方案中，有效负载是任何药理活性肽或多肽，其可以作为连接到一个或多个 XTEN的融合蛋白质来重组表达。在XTEN-有效负载缀合物的其它实施方案 中，有效负载是任何药理活性肽或多肽，其可以缀合到一个或多个XTEN。 缀合物可以呈如下文所描述的构型。示范性的肽或多肽有效负载意味着涵盖 类似物、促效剂、拮抗剂、抑制剂和异构体。应了解，主题肽和蛋白质涵盖 合成、半合成、重组、天然、糖基化和非糖基化形式，以及其生物活性片段、 序列变异体、物种变异体、同源物和突变，只要所得变异型蛋白质保留母体 或天然蛋白质的一部分活性即可。
生物活性蛋白质序列可以获自公开可用的资料库、专利或参考文献以及 在本领域中众所周知的其它这类的来源。举例来说，序列可以获自通用蛋白 质资源(UniversalProtein Resource；UniProt)/Swiss-Prot、欧洲生物信息研究所 (EuropeanBioinformatics Institute；EBI)、SIB瑞士生物信息研究所(Swiss Institute ofBioinformatics)、蛋白质信息资源(Protein Information Resource； PIR)。化学文摘服务(Chemical Abstracts Services；CAS)登记号(由美国化学学 会(American ChemicalSociety)公布)和/或GenBank入藏号(例如，AAA-AZZ、 HAA-HZZ、JAA-JZZ)、通过国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information；NCBI)网页可得的模型蛋白质标识符(在万维网的 ncbi.nlm.nih.gov上可得)，这些标识符对应于含有所关注的蛋白质或蛋白质的 片段或变异体的氨基酸序列的CAS登记或GenBank资料库中的条目。对于 本文所提供的这些序列标识符来说，与这些CAS和GenBank和GenSeq入藏 号以及所引用的期刊出版物(例如，PubMed ID编号(PMID))中的每一者相关 联的总结页面各自以其全文引用的方式并入，特别是关于其中所描述的氨基 酸序列。
在一个实施方案中，呈重组或缀合物形式的XTEN-有效负载组合物包含 生物活性肽或蛋白质的一个或多个分子，这种肽或蛋白质包括(但不限于)选自 表12中所阐述的有效负载的肽或多肽，或其保留生物活性蛋白质的至少一部 分活性的序列变异体。“序列变异体”意味着生物活性蛋白质当最佳比对时与 已知的肽或多肽(如表12中所列者)展现至少约80％、或90％、或91％、或92％、 或93％、或94％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％的序列同一性。
表12：用于连接到XTEN的生物活性蛋白质
3.作为有效负载的示范性的生物活性蛋白质
特别预期作为主题组合物中的有效负载的蛋白质类化合物是以下肽和蛋 白质：
“C型利尿钠肽”或“CNP”意味着由NPPC基因编码的人类蛋白质(UniProt 编号P23582)，其被裂解成具有序列GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC的22 氨基酸肽C型利尿钠肽(CNP)，以及其具有天然肽的至少一部分生物活性的 物种和合成变异体。CNP是B型利尿钠受体(NPRB)的选择性促效剂并且据报 道是软骨内骨生长的强力刺激剂。CNP结合到其受体，起始细胞内信号并且 最终抑制过度活跃的FGFR3路径。CNP的使用适用于软骨发育不全，骨骼发 育不良或短肢侏儒的一种常见形式，以及由FGFR3突变引起的人类病症，包 括影响骨骼发育的综合症；例如，软骨发育低下[HCH]、ACH、致死性发育 不良[TD]、皮肤(表皮痣、脂溢性角化病、黑棘皮病)，和癌症(多发性骨髓瘤[M M]、前列腺和膀胱癌、精原细胞瘤)(Foldynova-Trantirkova S.Hum Mutat.(2 012)33:29)。CNP-22的半衰期据报道是2.6分钟，被中性肽链内切酶快速代 谢并且被清除受体清除(Prickett T.,2004,ClinicalScience,106:535)，由此限 制其效用。
“促黄体激素释放激素”或“LHRH”意味着由GNRH1基因编码的人类蛋白 质(UniProt编号P01148)，其在视前区下丘脑前部从92氨基酸前激素原被加 工成具有序列pyroGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2的线性十肽 终产物，以及其具有天然肽的至少一部分生物活性的物种和合成变异体。LH RH在垂体/性腺轴的调控中并且因此在繁殖中起关键作用。LHRH通过结合 到垂体促性腺激素细胞上的高亲和力受体并且随后释放FSH和LH来发挥其 作用。LHRH在下丘脑和垂体外部的器官中发现，并且因为高百分比的某些 癌组织具有LHRH结合位点并且因为性类固醇已经牵涉于乳癌和前列腺癌的 发展中，所以使用LHRH促效剂的激素疗法被批准或被考虑用于治疗性类固 醇依赖性病状，如雌激素依赖性乳癌、卵巢癌、子宫内膜癌、膀胱癌和雄激 素依赖性前列腺癌。因为半衰期据报道小于4分钟(Redding TW等人The H alf-life,Metabolism and Excretion ofTritiated Luteinizing Hormone-Releasin g Hormone(LH-RH)Man.J ClinEndocrinol.Metab.(1973)37:626-631)， 所以其作为治疗剂的效用受限制。
“西仑吉肽”意味着具有序列Arg-Gly-Asp-Dphe-NmeVal或化学名称 2-[(2S,5R,8S,11S)-5-苯甲基-11-{3-[(二氨基亚甲基)氨基]丙基}-7-甲基 -3,6,9,12,15-五氧代-8-(丙-2-基)-1,4,7,10,13-五氮杂环十五烷-2-基]乙酸(CAS 编号188968-51-6)的合成环状RGD五肽。西仑吉肽对αv整合素具选择性， αv整合素在血管生成(形成新血管)中很重要。这些配体的结合活化了整合素 以调控肿瘤细胞侵入、迁移、增殖、存活和血管生成。因此，西仑吉肽的使 用正处于通过抑制血管生成治疗成胶质细胞瘤的研究中(Burke P等人Cilengitide targeting of αvβ3 integrin receptor synergizes withradioimmunotherapy to increase efficacy and apoptosis in breast cancerxenografts".Cancer Res(2002)62(15):4263-4272)。因为西仑吉肽具有3-5小时 的短半衰期以及将最大药物浓度限于15mg/mL的不良溶解度(O'Donnell PH. Aphase I study ofcontinuous infusion cilengitide in patients with solid tumors. Invest NewDrugs(2012)30:604)，所以其作为治疗剂的效用受限制。
“生长激素释放激素”或“GHRH”(又称为生长激素释放因子、GRF、GHR F、促生长素释放素(somatoliberin)或生长激泌素(somatocrinin))意味着在下丘 脑的弓状核中产生并且具有序列YADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMSR QQGESNQERGARARL的44氨基酸肽激素，以及其具有天然肽的至少一部 分生物活性的物种和合成变异体，包括生物活性的1-29氨基酸截短肽YADA IFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMSR。GHRH从神经分泌神经末梢释放并且 由下丘脑垂体门脉系统携带到垂体前叶，在这里，其作用于GHRH受体以刺 激脉动式生长激素释放。GHRH类似物替莫瑞林(tesamorelin)是批准用于治疗 处于高效抗逆转录病毒疗法中的HIV患者的脂肪营养不良的药物，并且也被 考虑用于恶病质、生长激素缺乏患者的腹部肥胖、与某些慢性疾病相关的肌 肉萎缩、轻度认知障碍以及生长激素缺乏患者的生长激素替代中。因为半衰 期据报道小于15分钟(Chapman IM.J Endocrinol(1991)128:369-374)，所以 其作为治疗剂的效用受限制。
“肽YY”和“PYY”意味着人类肽YY多肽(UniProt编号P10082)、具有成 熟PYY的至少一部分生物活性的合成型式以及物种和非天然序列变异体。如 本文所用的“PYY”包括人类全长36氨基酸肽PYY1-36的两种主要形式，以及 具有PP折叠结构基序的主要循环形式PYY3-36(“PYY3-36”)。PYY3-36具有 序列IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNLVTRQRY-NH2。PYY在人进食 之后由肠中的特化内分泌细胞(L细胞)产生并且抑制胃运动并增加结肠中的 水和电解质吸收。PYY还可以抑制胰分泌。天然存在的PYY3-36是非选择性 的Y1、Y2和Y5促效剂。本发明的含PPY融合蛋白质可以特别用来治疗糖尿 病用于葡萄糖调控、胰岛素抵抗病症和肥胖。如美国专利号5,604,203、5,57 4,010和7,166,575中所描述，已经制备出PYY类似物。因为半衰期据报道小 于1小时(Addison ML.A role for metalloendopeptidases in thebreakdown o f the gut hormone,PYY 3-36.Endocrinology(2011)152(12):4630-4640)并 且典型地通过鼻内途径每天施用三次，所以其作为治疗剂的效用受限制。
“瘦素”意味着由Ob(Lep)基因编码的天然存在的瘦素(UnitProt编号P4115 9)、具有成熟瘦素的至少一部分生物活性的合成型式以及物种和非天然序列 变异体。瘦素具有序列VPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQ LDLSPGC，并且在残基97与147之间具有二硫桥键。瘦素在调控能量摄入 和能量消耗(包括食欲、代谢和体重)中起关键作用。本发明的含瘦素多肽可以 特别用来治疗糖尿病用于葡萄糖调控、胰岛素抵抗病症、肥胖、先天性/获得 性脂肪营养不良、HAART诱发的脂肪营养不良、下丘脑性闭经。已经克隆了如美国专利号7,112,659中所描述的瘦素，以及美国专利号5,521,283、美国专 利号5,532,336、PCT/US96/22308和PCT/US96/01471中的瘦素类似物和片段。 因为可商购的形式美曲普汀(metreleptin)具有报道为8-30分钟的半衰期(Klein S.等人Adipose tissue leptinproduction and plasma leptin kinetics in huma ns.Diabetes(1996)45:984-987)并且大多数当前瘦素疗法需要每天1次到2 次的给药，所以其作为治疗剂的效用受限制。
“普兰林肽”意味着具有序列KCNTATCATNRLANFLVHSSNNFGPILPPT NVGSNTY-NH2的合成胰淀素模拟物，以及具有普兰林肽或天然胰淀素的至 少一部分生物活性的序列变异体。普兰林肽具有这样的序列：其中来自大鼠 胰淀素序列的氨基酸取代人类胰淀素序列中的氨基酸。胰淀素是由胰脏b细 胞分泌的37aa肽，其以脉动方式与胰岛素共同释放，典型地以100个胰岛素 比1个胰淀素的摩尔比。胰淀素功能在于抑制胃排空、胰高血糖素分泌，促进饱腹感和进餐终止(Kong MF等人Infusion of pramlintide,a human amyli nanalogue,delays gastric emptying in men with IDDM.Diabetologia.(199 7)40:82-88)。普兰林肽被用作T1D和T2D中的胰岛素疗法的佐剂并且显示 出血糖控制的改善和胰岛素需求的减少，而且展示了体重的适度减轻(Neary MT,Batterham RL.Gut hormones:Implications for the treatment of obesity. Pharmacology&Therapeutics(2009)124:44-56)。因为普兰林肽具有报道为 20分钟的半衰期(McQueen,J.Pramlintideacetate.Am.J.Health-System Ph armacy(2005)22:2363-2372)并且需要每天2次到3次的给药，所以其作为治 疗剂的效用受限制。
“催产素”意味着具有序列CYIQNCPLG-NH2并且在残基1与6之间具有 二硫桥键的哺乳动物激素肽(UniProt编号P01178)，以及合成型式，如匹脱新 (pitocin)。催产素主要用作脑中的神经调节物，其具有非常类似于血管加压素 的结构，血管加压素是由人类垂体后叶释放以在一定距离处起作用的唯一已 知的激素。催产素具有由在乳腺和子宫中表达的特异性的高亲和力催产素受 体介导的子宫收缩特性；因此，其在分娩和哺乳中起作用。本发明的含催产 素多肽可以特别用来治疗孤独症、脆性X综合症、慢性每日头痛和男性不育。
“松弛素”意味着作为通过从185氨基酸前体蛋白(UniProt编号P04090)形 成的二硫桥键连接的24和29个氨基酸的两条肽链的异二聚体的蛋白质激素； B链具有序列DSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWS并且A链具有序列 QLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC，其中二硫桥键在B10-A10与B23-A24 之间，并且包括合成和重组型式。松弛素在女性的月经周期和怀孕期间由黄 体产生，并且在男性中由前列腺产生。松弛素编排了对怀孕的许多母性生理反应，用作全身和肾脏血管舒张剂，是心脏保护和抗纤维化剂。松弛素结合 到松弛素受体(GPCR)，增加cAMP并活化PKC、PI3K和内皮素(endothelin) B型受体，从而增加一氧化氮产生，而且活化MAPK，MAPK可以在松弛素 诱导的VEGF表达中起作用。本发明的含松弛素多肽可以特别用来治疗急性 失代偿性心力衰竭(ADHF)。因为松弛素在人类中的报道半衰期小于10分钟(D schietzig T等人Intravenous recombinant human relaxin incompensated hea rt failure:a safety,tolerability,and pharmacodynamic trial.JCard Fail.200 9；15:182-190)，所以未经修饰的蛋白质作为治疗剂的效用受限制。
“申得立肽”和“CD-NP”意味着具有序列GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGCPSLRDPRPNAPSTSA的人类C型利尿钠肽-(32-53)-肽(CNP-22)与东部绿曼 巴蛇(easterngreen mamba；Dendroaspis angusticeps)利尿钠肽-(24-38)-肽，其 中二硫桥键在残基6与22之间。嵌合肽经由受体鸟苷酰环化酶(GC)-A和GC -B的活化具有血管保护和RAAS抑制作用，并且可以加强肾增强和心脏卸载， 同时具有最小的降血压作用。因此，其可以用来治疗心肾疾病，如急性失代 偿性心力衰竭(ADHF)和急性心肌梗塞(AMI)，特别是在“急性后”治疗期期间。
“聚乙二醇肽(peginesatide)”或“赫玛德”是由两个具有序列GlyGlyLeuTyrAlaCysHisMetGlyProIleThr1NalValCysGlnProLeuArgSarLys的合成21氨基酸 肽组成的肽，这两个肽在赖氨酸处与分支聚乙二醇连接。聚乙二醇肽是红细 胞生成素的新颖类似物，其具有红血球生成特性并且被开发用于治疗由于未 进行透析的患者的慢性肾病(CKD)所致的贫血的医学用途。
“胃泌酸调节素”或“OXM”意味着人类胃泌酸调节素、其具有成熟胃泌酸 调节素的至少一部分生物活性的合成型式和序列变异体。胃泌酸调节素是具 有序列HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIA的37氨基 酸肽，在餐后从结肠中的肠道L细胞产生，并且含有胰高血糖素的29氨基酸 序列，接下来是8氨基酸羧基端延伸。胃泌酸调节素是对胰高血糖素受体和 GLP-1R两者的促效剂，其具有可能经由后一种受体介导的厌食作用。已经发 现OXM抑制食欲。本发明的含OXM多肽可以特别用来治疗糖尿病用于葡萄 糖调控、胰岛素抵抗病症、肥胖，并且可以被用作减重治疗。因为已经报道 天然胃泌酸调节素在人类血浆中具有约12分钟的半衰期(使用交叉反应胰高 血糖素试验来测量；SchjoldagerBT.Oxyntomodulin:a potential hormone fr om the distal gut.Pharmacokineticsand effects on gastric acid and insulin secretion in man.Eur J Clin Invest.(1988)18(5):499-503)，所以未经修饰的 蛋白质作为治疗剂的效用受限制。
“POT4”或“APL-1”意味着具有序列H-Ile-[Cys-Val-Val-Gln-Asp-Trp-Gly-H is-His-Arg-Cys]-Thr-NH2的合成环肽。POT4是比坎普他汀(compstatin)更强力 的C3补体抑制剂，这种抑制剂抑制天然C3裂解成其活性片段C3a和C3b， 并且具有8小时的延长的循环体内半衰期。其被考虑用于预防如年龄相关性 黄斑变性(AMD)、阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)、哮喘和COPD等疾病中的 炎症、损伤和血管生成因子(如VEGF)的上调。
“干扰素-λ””、“IFN-λ”、白介素-29”和“IL-29”意味着由IL29基因编码并 且具有序列GPVPTSKPTTTGKGCHIGRFKSLSPQELASFKKARDALEESLKLKNWSCSSPVFPGNWDLRLLQVRERPVALEAELALTLKVLEAAAGPALEDVLDQPLHTLHHILSQLQACIQPQPTAGPRPRGRLHHWLHRLQEAPKKESAGCLEASVTFNLFRLLTRDLKYVADGNLCLRTSTHPEST的人类白介素(UniProt 编号Q8IU54(20-200))、其具有成熟IL-29的至少一部分生物活性的重组和合 成型式以及序列变异体。III型干扰素IL-29不同于I型IFN(IFNAR1/IFNAR 2受体复合物)通过异二聚体受体复合物(IL-10R2和IL-28Rα受体链)传导信 号，并且在抗病毒免疫中起重要作用。值得注意地，IL-29受体在肝细胞(HC V感染的原发位点)上高度表达，但在免疫或骨髓细胞上不会显著表达。经聚 乙二醇化的型式具有50-70小时的估算半衰期。
“干扰素-β”或“IFN-β”意味着由IFNB1基因编码并且具有序列MSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQLQQFQKEDAALTIYEMLQNIFAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKTVLEEKLEKEDFTRGKLMSSLHLKRYYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRVEILRNFYFINRL TGYLRN的人类蛋白质，以及其具有成熟IFN-β的至少一部分生物活性的重 组和合成型式以及序列变异体。IFN-β由包括成纤维细胞和巨噬细胞的多种细 胞类型产生，并且响应病毒感染和其它生物诱导物来介导抗病毒、抗增殖和 免疫调节活性。IFN-β与人类细胞表面上的特异性受体的结合起始细胞内事件 的级联，从而表达众多干扰素诱导的基因产物，如2',5'-寡腺苷酸合成酶、β2 -微球蛋白和新蝶呤(neopterin)。这些基因产物常规上用作临床环境中的生物 标志物。IFN-β用于治疗各种形式的多发性硬化(MS)，包括复发缓解型MS、 继发进展型MS、原发进展型MS、幼年发作型MS，以及暗示着MS的临床 孤立综合症。IFN-β的可商购形式具有4到67小时的报道半衰期并且需要频 繁给药，使得其作为治疗剂的效用受限制。
“C肽”意味着具有序列EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ 的人类胰蛋白，以及其具有天然C肽的至少一部分生物活性的重组和合成型 式以及序列变异体。C肽是胰岛素原的中间区段，其在N端B链与C端A链 之间，并且在形成和分泌成熟胰岛素时且从前胰岛素原裂解出。循环C肽结 合到可能与G蛋白偶合的受体，并且信号活化Ca2+依赖性细胞内信号传导路 径，如MAPK、PLCγ和PKC，从而使得一系列转录因子以及eNOS和Na+ K+ATP酶活性上调。C肽被考虑用于糖尿病并发症和糖尿病性肾病。因为报 道的半衰期为约30分钟(Matthews DR.The half-life of endogenous insulin and C-peptide in manassessed by somatostatin suppression.Clin Endocrinol (Oxf).(1985)23(1):71-79)，所以未经修饰的蛋白质作为治疗剂的效用受限 制。
“饥饿素”意味着具有序列GSSFLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR的人 类激素、其具有天然饥饿素的至少一部分生物活性的截短型式、重组和合成 型式以及序列变异体，包括天然的、经加工的27或28氨基酸序列和同源序 列。饥饿素诱导饱食，或具有成熟饥饿素的至少一部分生物活性的物种和非 天然序列变异体，包括天然的、经加工的27或28氨基酸序列和同源序列。 饥饿素主要由内衬人胃底的P/D1细胞和刺激饥饿的胰脏ε细胞产生，并且被视为与瘦素对应的激素。饥饿素水平在进餐之前上升并且在进餐之后下降， 并且可以使得食物摄入增加并且通过对下丘脑的水平发挥的作用而增加脂肪 量。饥饿素还刺激生长激素的释放。饥饿素在丝氨酸残基处被正辛酸酰化； 这种酰化对于结合到GHS1a受体并且对于饥饿素的促效剂活性和GH释放能 力是必要的。本发明的含饥饿素多肽可以特别用作促效剂；例如，用来选择 性地刺激胃肠动力障碍中GI道的运动性，加速胃排空，或刺激生长激素的释 放。本发明还涵盖了饥饿素的未酰化形式和序列变异体，其用作拮抗剂。具 有序列取代的饥饿素类似物或截短的变异体，例如美国专利号7,385,026中所 描述，可以特别用作XTEN的融合伴侣以用作拮抗剂来改善葡萄糖稳态，治 疗胰岛素抵抗，以及治疗肥胖、癌症恶病质、术后肠梗阻、肠病和肠胃失调。 已经报道了饥饿素的分离和表征(Kojima M等人,Ghrelin is a growth-hormo ne-releasing acylated peptide fromstomach.Nature.1999；402(6762):656-66 0)，并且如美国专利号6,967,237中所描述，已经通过肽合成来制备合成类似 物。因为饥饿素具有10-30分钟的报道终末半衰期(AkamizuT等人Pharmac okinetics,safety,and endocrine and appetite effects of ghrelinadministration in young healthy subjects.Eur J.Endocrinology(2004)150(4):447-455)，所 以未经修饰的蛋白质作为治疗剂的效用受限制，并且在位置3处具有辛基侧 基取代天然辛酰基侧基的天然丝氨酸氨基酸的类似物可以赋予对蛋白酶增加 的抗性。
“卵泡抑素，”又称为“激活素结合蛋白”或“FSH抑制蛋白(FSP)，”意味着在 人类中由FST基因编码的蛋白质。如本文所用的“卵泡抑素”包括其同源物、 物种变异体、序列变异体和片段。人类中的成熟蛋白质形式具有315个氨基 酸，被称作FS-315并且已经被克隆(美国专利号5,041,538和5,182,375)。卵 泡抑素含有两个潜在N-糖基化位点Asn95和Asn259，然而，已经证实，在 这些位点处的突变后继之以测试重组产物抑制FSH分泌和结合激活素的能力 使得每个突变体具有与非突变的重组hFS-315类似的特性，表明卵泡抑素分 子的糖基化在这些功能中没有影响(Inouye,S.等人Site-specific mutagenesis of humanfollistatin.BBRC(1991)179(1):352-358)。猪卵泡抑素在Ueno等 人,PNAS:USA84:8282-8286(1987)中公开，并且牛卵泡抑素在Robertson等 人,Biochem.Biophys.Res.Commun.149:744-749(1987)中公开。因为骨形 态发生蛋白和生长/分化因子(如激活素和肌抑素)具有诱导包括骨、软骨、腱/ 韧带、肌肉、神经和各种器官的各种组织的生长、形成、分化和维护的能力， 所以其被卵泡抑素和卵泡抑素促效剂中和具有治疗价值(美国专利号5,545,61 6、5,041,538和AU9675056)。因为施用给受试者的卵泡抑素从循环中快速消 除，在大鼠中具有稍超过2小时的终末半衰期(Kogure K等人Intravenous a dministration of follistatin:delivery to the liver and effecton liver regenerat ion after partial hepatectomy.Hepatology.(1996)24(2):361-366)，所以未经修 饰的蛋白质作为治疗剂的效用受限制。
“血管活性肠肽”和“VIP”意味着由VIP基因残基编码并且具有序列HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILN-NH2的28氨基酸肽激素(UniProt编号P 01282(125-152))，以及其具有天然VIP的至少一部分生物活性的重组和合成 型式以及序列变异体。VIP肽在许多组织中产生，包括肠、胰脏以及脑中下 丘脑的视交叉上核。VIP刺激心脏的收缩性，引起血管舒张，增加糖原分解， 降低动脉血压，并且放松气管、胃和胆囊的平滑肌。浓度的变化与心肌纤维 化、心力衰竭、心肌病和肺高血压相关联，并且其在呼吸系统中的缺乏被视 为肺病中的致病因素(Said SI,2007,Circulation,115:1260；Said SI,2008, Ann N Y AcadSci,1144:148；Petkov V等人,2003,J Clin Invest,111:133 9)。VIP被考虑用于治疗顽固性高血压、原发性肺动脉高血压(PAH)、哮喘、 COPD、糖尿病、勃起功能障碍和女性性功能障碍。因为其半衰期据报道为约 1分钟(Domschke S等人Vasoactive intestinal peptidein man:pharmacokinet ics,metabolic and circulatory effects.Gut(1978)19:1049-1053)，所以未经修 饰的蛋白质作为治疗剂的效用受限制。
“福泽昂”意味着来源于HIV的gp41(HIV与CD4+T细胞融合中所涉及 的病毒蛋白)并且具有序列YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLW NWF的36氨基酸肽，以及其具有天然gp41的至少一部分结合活性的重组和 合成型式以及序列变异体。福泽昂和其多聚体或与相关肽的缀合物被用于或 被考虑用于治疗HIV感染的抗性形式。因为福泽昂在患者中具有3.8小时的 半衰期，需要频繁的注射投药，所以其效用受限制。
“KAI-4169”意味着正在由KAI Pharma开发用于治疗肾病患者和骨病(C KD-MBD)患者的继发性甲状旁腺机能亢进(SHPT)的人类细胞表面钙敏感受 体(CaSR)的肽促效剂。
“帕瑞肽”意味着用于治疗库欣氏病(Cushing's disease)的具有化学名称N- (2-氨乙基)氨基甲酸[(3S,6S,9S,12R,15S,18S,20R)-9-(4-氨丁基)-3-苯甲基-12-(1 H-吲哚-3-基甲基)-2,5,8,11,14,17-六氧代-15-苯基-6-[(4-苯基甲氧基苯基)甲基] -1,4,7,10,13,16-六氮杂双环[16.3.0]二十一烷-20-基]酯的生长抑素类似物。帕瑞 肽是对生长抑素R亚型R1、2、3和5具有高结合亲和力的多受体生长抑素 类似物，其抑制生长激素、IGF-1和促肾上腺皮质激素分泌。除了治疗库欣氏 病之外，其还被考虑用于肢端肥大症、神经内分泌疾病、肝病、有症状的多 囊性肝病、神经内分泌肿瘤、淋巴管平滑肌瘤病、先天性高胰岛素血症、复 发性或进展性脑膜瘤以及其它内分泌病状。因为可商购的形式具有12到17小时的报道半衰期(Petersenn,S.等人Tolerability and Dose Proportional Pharmacokinetics of Pasireotide Administered as a Single Dose or Two DividedDoses in Healthy Male Volunteers:A Single-Center,Open-Label,Ascending -DoseStudy.Clinical Therapeutics(2012)34:677-688)，所以其效用受限制。
“鸢尾素”意味着由FNDC5基因编码并且具有序列DSPSAPVNVTVRHLKANSAVVSWDVLEDEVVIGFAISQQKKDVRMLRFIQEVNTTTRSCALWDLEEDTEYIVHVQAISIQGQSPASEPVLFKTPREAEKMASKNKDEVTMKE的蛋 白质的裂解产物，以及其具有天然鸢尾素的至少一部分生物活性的重组和合 成型式以及序列变异体。鸢尾素介导肌肉训练的有益作用，并且通过经核受 体PPARA的活化上调UCP1表达来诱导白色脂肪组织棕化。已经显示，适度 增加的鸢尾素水平使得能量消耗增加、体重减轻以及饮食诱发的胰岛素抵抗 得到改善(Bostrom P,2012,Nature,481:463)。鸢尾素被考虑用于治疗肥胖、 糖尿病和代谢紊乱。
“TXA127”和“PanCyte”是血管紧缩素类似物(1-7)，其中TXA127具有序 列NRVYIHP并且PanCyte是分别将第4个和第7个残基与dAla和Ala连接 的环状类似物，结果是其对降解更具抗性并且具有更长的半衰期。这些类似 物结合到MAS受体并且刺激骨髓中的早期造血前体细胞，而且具有血管舒 张、抗营养、抗纤维化、尿钠排泄、消炎、抗血栓形成作用。这些化合物被 考虑用于加速在对患有血液学癌症的患者进行干细胞移植之后的血小板恢复，这些血液学癌症如急性骨髓性白血病(AML)、骨髓发育异常综合症(MD S)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性淋巴细胞白 血病(CLL)、霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma；HL)或非霍奇金氏淋巴瘤 (non-Hodgkin's lymphoma；NHL)和多发性骨髓瘤，并且用于治疗肺纤维化、 急性肺损伤、肺动脉高血压以及肾脏和肝脏的纤维化。
“白介素-7”和“IL-7”意味着由IL7基因编码并且具有序列DCDIEGKDGKQYESVLMVSIDQLLDSMKEIGSNCLNNEFNFFKRHICDANKEGMFLFRAARKLRQFLKMNSTGDFDLHLLKVSEGTTILLNCTGQVKGRKPAALGEAQPTKSLEENKSLKEQKKLNDLCFLKRLLQEIKTCWNKILMGTKEH的人类白介 素(UniProt编号P13232(26-177))，以及其具有天然IL-7的至少一部分生物活 性的重组和合成型式以及序列变异体。IL-7 IL-7刺激多能(多潜能)造血干细 胞分化成淋巴祖细胞，包括CD4/CD8 T细胞的扩张。IL-7通过TGF-B拮抗 作用限制了抑制调控性T细胞的产生和T细胞无能，并且支持中心记忆T细 胞的产生。IL-7被考虑用于治疗HIV、肿瘤学、移植、HBV和HCV感染中 的淋巴细胞减少，以及治疗微小残留病或晚期肿瘤，并且可以在免疫疗法的 免疫重建或增强中起作用。因为IL-7在人类中的报道半衰期为约10小时(Spo rtès,C.等人Phase I Study ofRecombinant Human Interleukin-7Administrat ion in Subjects with RefractoryMalignancy.Clin Cancer Res 2010；16:727- 735)，所以其未经修饰的形式的效用受限制。
“成纤维细胞生长因子18”或“FGF-18”意味着由FGF18基因编码并且具 有序列EENVDFRIHVENQTRARDDVSRKQLRLYQLYSRTSGKHIQVLGRRISARGEDGDKYAQLLVETDTFGSQVRIKGKETEFYLCMNRKGKLVGKPDGTSKECVFIEKVLENNYTALMSAKYSGWYVGFTKKGRPRKGPKTRENQQDVHFMKRYPKGQPELQKPFKYTTVTKRSRRIRPTHPA的人类蛋白质(UniProt 编号O76093(28-207))，以及其具有天然FGF-18的至少一部分生物活性的重 组和合成型式以及序列变异体。FGF-18是成纤维细胞生长因子(FGF)家族的 蛋白质成员。FGF家族成员具有广泛的促有丝分裂和细胞存活活性，并且涉 及于多种生物过程中，包括胚胎发育、细胞生长、形态发生、组织修复、肿 瘤生长、和侵入。已经在体外显示，这种蛋白质能够诱导PC12细胞中的神 经突增生。FGF-18刺激软骨细胞和成骨细胞(产生并维护骨骼和软骨的细胞) 的增殖，并且其用途被考虑用于软骨的修复和生成，例如在膝关节中(Ellswor th JL.Fibroblast growthfactor-18 is a trophic factor for mature chondrocyt es and theirprogenitors.Osteoarthritis Cartilage(2002)10:308-320)。
“α-黑素细胞刺激激素”或“α-MSH”是从ACTH(1-13)作为蛋白水解裂解 产物产生并且具有序列N-Ac-SYSMGFRWGLPV的13氨基酸肽，而ACTH (1-13)是前鸦片黑皮质素(proopiomelanocortin；POMC)的裂解产物，以及其具 有天然α-MSH的至少一部分生物活性的合成型式和序列变异体。α-MSH是 黑皮质素受体MC1、MC3、MC4和MC5而不是MC2(其对于ACTH是专有 的)的非选择性促效剂。α-MSH刺激黑素细胞产生和释放具有光保护作用的黑色素；其向大脑传导信号，这对食欲和性唤起有影响。其被考虑用于治疗红 细胞生成性原卟啉症(EPP，对日光不耐)、非节段型白癜风(皮肤色素减退)、 光化性角化病(AK，日光性角化病，皮肤癌的前兆)、多形性日光疹(PLE/PML E)、术后肾损伤、勃起功能障碍和性功能障碍。因为其半衰期是几秒，所以 其未经修饰的形式的效用受限制。
“内皮抑素”意味着来源于XVIII型胶原蛋白(UniProt.编号P39060(1572-1 754))并且具有序列HSHRDFQPVLHLVALNSPLSGGMRGIRGADFQCFQQARAVGLAGTFRAFLSSRLQDLYSIVRRADRAAVPIVNLKDELLFPSWEALFSGSEGPLKPGARIFSFDGKDVLRHPTWPQKSVWHGSDPNGRRLTESYCETWRTEAPSATGQASSLLGGRLLGQSAASCHHAYIVLCIENSFMTASK的天然存 在的20-kDa C端片段，以及其具有天然内皮抑素的至少一部分生物活性的重 组和合成型式以及序列变异体。内皮抑素是血管生成抑制剂，并且可以干扰 如碱性成纤维细胞生长因子(bFGF/FGF-2)和VEGF等生长因子的促血管生成 作用。其被考虑用于某些癌症中。因为其半衰期是13小时(Thomas,JP等人 Phase I Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Study of Recombinant Human Endostatin in Patients With Advanced Solid Tumors.J.Clin.Oncol.(200 3)21:223-231)，所以其未经修饰的形式的效用受限制。
“人体肽”意味着由MT-RNR2基因编码并且具有序列MAPRGFSCLLLLT SEIDLPVKRRA的肽(UniProt编号Q8IVG9(1-24))，以及其具有天然人体肽的 至少一部分生物活性的重组和合成型式以及序列变异体。人体肽在对与阿耳 茨海默氏病(Alzheimer's disease；AD)、AD特异性损害、朊病毒诱发的细胞 凋亡和化学诱发的神经元损伤相关的细胞死亡进行神经保护中起作用(Hashi moto,Y,A rescue factor abolishing neuronal cell death bya wide spectrum offamilial Alzheimer's disease genes and Aβ.PNAS(2001)98:6336-634 1)。最近，发现人体肽帮助改善胰岛素作用并且降低血糖水平(Muzumdar RH,Humanin:A Novel Central Regulator of Peripheral Insulin Action.PLoS O ne(2009)4:e6334)。人体肽被考虑用于治疗阿耳茨海默氏病、糖尿病以及血 管和心血管疾病。
“胰高血糖素”意味着具有序列HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWL MNT的人类胰高血糖素葡萄糖调控肽，以及其具有天然胰高血糖素的至少一 部分生物活性的重组和合成型式以及序列变异体。如本文所用的术语“胰高血 糖素”还包括胰高血糖素的肽模拟物。天然胰高血糖素是由胰脏产生，当血糖 水平开始下降过低时释放，从而使肝脏将所储存的糖原转化成葡萄糖并且将 其释放到血流中。虽然胰高血糖素的作用与胰岛素的作用相反，胰岛素向身 体的细胞传导信号以从血液中吸收葡萄糖，但胰高血糖素也刺激胰岛素的释 放，因此血流中新鲜可用的葡萄糖可以被胰岛素依赖性组织吸收和使用。本 发明的含胰高血糖素多肽可以特别用来增加具有现存的肝糖原储存量的个体 中的血糖水平并且维持糖尿病中的葡萄糖稳态。如美国专利号4,826,763中所 公开，已经克隆了胰高血糖素。
“胰高血糖素样蛋白质-1”或“GLP-1”意味着人类胰高血糖素样肽-1以及 其具有天然GLP-1的至少一部分生物活性的序列变异体。术语“GLP-1”包括 具有序列HDEFERHAEGTFTSDVSSTLEGQAALEFIAWLVKGRG的人类GL P-1(1-37)，GLP-1(7-37)，以及GLP-1(7-36)酰胺。GLP-1刺激胰岛素分泌，但 只是在高血糖症的阶段期间。GLP-1相较于胰岛素的安全性是通过这种特性 以及通过所分泌的胰岛素量与高血糖症的量级成比例的观测结果来增强。GL P-1(7-37)OH的生物半衰期只有3到5分钟(美国专利号5,118,666)。本发明的含GLP-1多肽可以特别用来治疗糖尿病和胰岛素抵抗病症用于葡萄糖调控。 如美国专利号5,118,666中所描述，已经克隆了GLP-1并且制备出衍生物。
“胰高血糖素样蛋白质-2”或“GLP-2”在本文中总的意味着具有序列HADGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD的人类胰高血糖素样肽-2，人类 GLP-2的物种同源物，以及具有成熟GLP-2的至少一部分生物活性的非天然 序列变异体，包括以下变异体：例如(但不限于)在成熟序列的位置2处用甘氨 酸取代丙氨酸，从而得到HGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD (“2G”)的变异体，以及在位置2处用Val、Glu、Lys、Arg、Leu或Ile取代丙 氨酸的变异体。如美国专利或申请号5,789,379、5,834,428、5,990,077、5,99 4,500、6,184,201、7,186,683、7,563,770、20020025933和20030162703中所 描述，已经分离、合成、表征或克隆了GLP-2或序列变异体。
“胰岛素”意味着人类胰岛素或其同源物、物种变异体或序列变异体，包 括(但不限于)由51个氨基酸组成并且具有5808Da的分子量的成熟人类胰岛 素蛋白以及110个氨基酸的胰岛素原前体。前体蛋白被加工成成熟胰岛素， 这种成熟胰岛素具有通过二硫键结合在一起的具有序列GIVEQCCTSICSLY QLENYCN的A链和具有序列FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT 的B链。
“因子XIII A链””、“FXIIIA”或“F13A”意味着具有序列SETSRTAFGGRRAVPPNNSNAAEDDLPTVELQGVVPRGVNLQEFLNVTSVHLFKERWDTNKVDHHTDKYENNKLIVRRGQSFYVQIDFSRPYDPRRDLFRVEYVIGRYPQENKGTYIPVPIVSELQSGKWGAKIVMREDRSVRLSIQSSPKCIVGKFRMYVAVWTPYGVLRTSRNPETDTYILFNPWCEDDAVYLDNEKEREEYVLNDIGVIFYGEVNDIKTRSWSYGQFEDGILDTCLYVMDRAQMDLSGRGNPIKVSRVGSAMVNAKDDEGVLVGSWDNIYAYGVPPSAWTGSVDILLEYRSSENPVRYGQCWVFAGVFNTFLRCLGIPARIVTNYFSAHDNDANLQMDIFLEEDGNVNSKLTKDSVWNYHCWNEAWMTRPDLPVGFGGWQAVDSTPQENSDGMYRCGPASVQAIKHGHVCFQFDAPFVFAEVNSDLIYITAKKDGTHVVENVDATHIGKLIVTKQIGGDGMMDITDTYKFQEGQEEERLALETALMYGAKKPLNTEGVMKSRSNVDMDFEVENAVLGKDFKLSITFRNNSHNRYTITAYLSANITFYTGVPKAEFKKETFDVTLEPLSFKKEAVLIQAGEYMGQLLEQASLHFFVTARINETRDVLAKQKSTVLTIPEIIIKVRGTQVVGSDMTVTVQFTNPLKETLRNVWVHLDGPGVTRPMKKMFREIRPNSTVQWEEVCRPWVSGHRKLIASMSSDS LRHVYGELDVQIQRRPSM的凝固蛋白(UniProt编号P00488(2-732))，以及其 具有天然FXIIIA的至少一部分生物活性的重组和合成型式以及序列变异体。 因子XIII是凝固级联中的最后的酶，并且负责在新形成的血凝块中将纤维蛋 白分子彼此交联。通过在纤维蛋白单体之间形成分子间共价键并且通过交联 α-2抗纤维蛋白溶酶、纤维蛋白原、纤连蛋白、胶原蛋白和其它蛋白质来增强 纤维蛋白凝块的机械强度，保护免受蛋白水解降解，并且为细胞外基质提供 稳定性。血浆FXIII以异四聚体的形式循环，这种异四聚体由非共价连接在 一起并且结合到纤维蛋白原的2个A亚单元和2个B亚单元组成。似乎稳定 A亚单元的结构并且保护A亚单元免受蛋白水解的B亚单元通常以游离的F XIII-B亚单元形式过量存在于血浆中。大多数FXIII缺乏患者在FXIII-A亚单 元中具有突变；已经报道了具有FXIII-B亚单元突变的患者的少数病例(Mikkola,H,1996,Semin Thromb Hemost,22:393；Ichinose A,1996,Semin Thr omb Hemost,22:385)。FXIIIA被用于或被考虑用于治疗血友病和相关凝血 病、先天性FXIII缺乏、以及因慢性肝病所致的获得性FXIII缺乏、发炎性肠 病和术后出血。
“因子X”或“FX”意味着具有序列GRPLHLVLLSASLAGLLLLGESLFIRREQANNILARVTRANSFLEEMKKGHLERECMEETCSYEEAREVFEDSDKTNEFWNKYKDGDQCETSPCQNQGKCKDGLGEYTCTCLEGFEGKNCELFTRKLCSLDNGDCDQFCHEEQNSVVCSCARGYTLADNGKACIPTGPYPCGKQTLERRKRSVAQATSSSGEAPDSITWKPYDAADLDPTENPFDLLDFNQTQPERGDNNLTRIVGGQECKDGECPWQALLINEENEGFCGGTILSEFYILTAAHCLYQAKRFKVRVGDRNTEQEEGGEAVHEVEVVIKHNRFTKETYDFDIAVLRLKTPITFRMNVAPACLPERDWAESTLMTQKTGIVSGFGRTHEKGRQSTRLKMLEVPYVDRNSCKLSSSFIITQNMFCAGYDTKQEDACQGDSGGPHVTRFKDTYFVTGIVSWGEGCARKGKYGIYTKVTAFLKWIDRSMKTRGLPKAKSHAPE VITSSPLK的凝固蛋白(UniProt编号P00742(2-488))，以及其具有天然FX的 至少一部分生物活性的重组和合成型式以及序列变异体。因子X通过因子I X(与其辅因子，因子VIII，以制成被称为内在Xase的复合物)和因子VII与 其辅因子，组织因子(以制成被称为外在Xase的复合物)被活化成因子Xa。因子X是最终共同(或凝血酶)途径的第一个成员。因子X被用于治疗因子X缺 乏、由于显现针对FVIII和FIX替代疗法的抑制性抗体的FVIII和FIX患者 而使用绕道策略的血友病A和B、由于口服抗凝血剂的过度给药或未知原因 的严重出血所致的出血的患者的急诊治疗，以及显现因缺乏维生素K引起的 获得性FX缺乏的患者、淀粉样变性、严重肝病和抗凝血剂(例如华法令(warf arin))的使用。虽然成熟因子X的半衰期是40-45小时，但活化因子X(Fxa)的血浆半衰期<1-2分钟((Bunce MW,2008,Blood,117:290)，使其未经修饰 的形式的效用受限制，被抗凝血酶III和TFP1快速灭活。
4.作为有效负载的核酸
本发明还涵盖了在XTEN缀合物中作为有效负载的核酸的用途。在一个 实施方案中，本发明提供了XTEN-有效负载缀合物，其中有效负载选自由适 体、反义寡核苷酸、核糖酶核酸、RNA干扰核酸和抗原核酸组成的组。用作 治疗剂的这些核酸在本领域中是已知的(Edwin Jarald,Nucleic acid drugs:a novel approach.African Journal ofBiotechnology第3卷(12):662-666,200 4；Joanna B.Opalinska.Nucleic-acidtherapeutics:basic principles and recen t applications.Nature Reviews DrugDiscovery 1:503-514,2002)。
IV).XTEN-交联剂和XTEN-有效负载缀合物以及制造这些缀合物的方 法
本发明一部分是关于如本文所描述，适用作与有效负载缀合的缀合伴侣 的XTEN-交联剂缀合组合物的高度纯化的制剂。本发明还关于使用XTEN- 交联剂缀合伴侣连接到一个或多个XTEN的有效负载的高度纯化的制剂。本 发明涵盖了组合物和制造通过将本文所描述的XTEN中的任一者与有效负载 连接而形成的XTEN-有效负载缀合物的方法，以及反应性组合物和制造通过 将XTEN与交联剂缀合而形成的组合物的方法或本文所描述的其它化学方 法。特别打算，术语“XTEN-有效负载”和“XTEN-交联剂”涵盖在反应物缀合 伴侣缀合之后保留的经连接的反应产物，包括交联剂的反应产物、点击化学 反应物，或本文所描述的其它方法。
在一些实施方案中，用于形成主题缀合物的XTEN包含选自表2、表3 和表22-25中的序列中的任一者的XTEN，其可以直接或经由本文所公开的 交联剂连接到有效负载组分。在其它实施方案中，用于形成主题缀合物的一 个或多个XTEN个别地包含XTEN序列，这个XTEN序列当与相当长度的序 列进行最佳比对时，与选自表2、3和22-25的XTEN或其片段相比具有至少 约80％的序列同一性，或者81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％ 的序列同一性。在一个实施方案中，主题缀合物是多聚的，这是在于其包含 第一XTEN序列和第二XTEN序列，其中XTEN是相同的或是不同的，并且 其中各自个别地包含XTEN序列，这个XTEN序列当与相当长度的序列进行 最佳比对时，与选自表2、3和22-25的XTEN或其片段相比具有至少约80％ 的序列同一性，或者81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、 90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序 列同一性。在另一个实施方案中，主题缀合物是多聚的，这是在于其包含第 一XTEN序列、第二XTEN序列和第三XTEN序列，其中XTEN是相同的或 是不同的，并且其中各自个别地包含XTEN序列，这个XTEN序列当与相当 长度的序列进行最佳比对时，与选自表2、3、22-25的XTEN或其片段相比 具有至少约80％的序列同一性，或者81％、82％、83％、84％、85％、86％、 87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、 99％或100％的序列同一性。在又另一个实施方案中，主题缀合物是多聚的， 这是在于其包含3个、4个、5个、6个或更多个XTEN序列，其中XTEN是 相同的或是不同的，并且其中各自个别地包含XTEN序列，这个XTEN序列 与选自表2、3和22-25的XTEN或其片段相比具有至少约80％的序列同一性， 或者81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、 92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在 多聚缀合物中，XTEN序列中的残基的累计长度大于约200个至约3000个或 约400个至约1000个氨基酸残基，并且XTEN在序列或长度上可以是相同的或可以是不同的。当一个以上的XTEN并入到缀合物中时，如本文所用的累 计长度打算涵盖氨基酸残基的总长度。
在一个方面，本发明提供了共价连接到小分子有效负载药物的XTEN的 组合物，从而得到XTEN-药物缀合物(“XTEN-D”)。在另一个方面，本发明提 供了共价连接到有效负载生物活性蛋白质(其涵盖了肽或多肽)的XTEN的组 合物，从而得到XTEN-肽/多肽缀合物(“XTEN-P”)。在另一个方面，本发明提 供了重组连接到有效负载肽或多肽的一个或多个XTEN的组合物，从而得到 XTEN-肽/多肽重组融合蛋白质(“XTEN-PR”)。在另一个方面，本发明提供了 连接到一个或多个药物和一个或多个蛋白质的有效负载的一个或多个XTEN 的组合物，这些有效负载可以是生物活性的或可以是靶向部分。具体地说， 本发明提供了适用于治疗病状的经分离的XTEN-D、XTEN-P、XTEN-PR和 XTEN-D-P组合物，对此，有效负载药物和/或蛋白质的投药在本领域中已知 适用于治疗、改善或预防受试者的疾病或病状。XTEN-D缀合物一般包含以 下组分中的一者或多者：1)XTEN；2)交联剂；以及3)XTEN直接或通过使 用交联剂(如本文所描述的可商购的交联剂)或通过使用点击化学反应物化学 缀合的有效负载，或在一些情况下，可以通过在不使用如本文所描述的接头 的情况下在XTEN与有效负载中的反应基团之间进行缀合来形成。XTEN-P 一般包含以下组分中的一者或多者：1)XTEN；2)交联剂；以及3)生物活性蛋 白质有效负载，并且一般还借助于交联剂或点击化学反应物通过缀合来形成。 XTEN-PR缀合物一般包含以下组分中的一者或多者：1)一个或多个XTEN； 2)间隔序列以及3)有效负载。XTEN-D-P一般包含以下组分中的一者或多者：1)XTEN；2)任选的接头；3)生物活性蛋白质；以及4)药物，其中有效负载一 般如上文所描述，借助于交联剂或点击化学反应物通过缀合来形成。然而， 在前述类型的组合物的一些情况下，可以在不使用交联剂的情况下形成组合 物，条件是组分以其它方式具化学反应性。
XTEN与有效负载的缀合与未连接到XTEN的有效负载相比向所得组合 物赋予若干优点。如下文更全面地描述，增强的特性的非限制性实例包括总 体溶解度和代谢稳定性增加、在循环中对蛋白水解的敏感性降低、免疫原性 降低、当皮下或肌肉内施用时吸收速率下降、肾清除率降低、与底物的相互 作用增强、毒性降低、有效负载的靶向递送以及药物动力学特性增强。缀合 物与未连接到XTEN的有效负载相比增强的药物动力学特性包括终末半衰期 更长(例如，两倍、三倍、四倍或更多倍)、曲线下面积(AUC)增加(例如，25％、 50％、100％或更多)、分布体积减小、在皮下或肌肉内注射后的吸收减缓(与 必须通过类似途径施用的有效负载的可商购形式相比的优点)以使得Cmax减 小，继而使得有效负载的副作用减少，总的来说，使得施用给受试者的缀合 组合物提供治疗活性的时间段增加。在一些实施方案中，缀合组合物包含允 许活性有效负载的持续释放的裂解序列(下文更全面地描述)，以使得所施用的 XTEN-有效负载当皮下或肌肉内施用时充当积存物。特别预期，XTEN-有效 负载缀合物可以展现本文所公开的改进的特性中的一者或多者或其任何组 合。作为这些增强的特性的结果，XTEN-有效负载缀合物与未连接到XTEN 并且以相当的方式施用的有效负载相比允许更低频率的给药、更加定制的给 药和/或降低的毒性。这些XTEN-有效负载缀合物具有治疗本领域中已知的某 些病状的效用，这些病状有待通过如本文所描述，将有效负载施用给有需要 的受试者来影响、改善或预防。
1.用于缀合的交联剂和叠氮化物/炔烃点击化学反应物
在另一个方面，本发明涉及缀合到交联剂的XTEN，从而得到XTEN-交 联剂缀合物，其可以被用来制备XTEN-有效负载缀合组合物。具体地说，本 文所描述的XTEN-交联剂缀合物伴侣适用于缀合到带有至少一个硫醇、氨基、 羧基、醛或醇或任何其它反应基团的有效负载剂或表面，这些基团如本领域 中已知可用于并且适合于本文所描述的组分之间的反应。
在另一个方面，本发明涉及制造XTEN-交联剂反应物和XTEN-点击化学 叠氮化物/炔烃反应物的方法，从而得到可以被用来制备主题XTEN-有效负载 组合物的缀合物。具体地说，本文所描述的制造XTEN-交联剂和XTEN-叠氮 化物/炔烃反应物的方法是适用的，其中有效负载剂或反应表面带有至少一个 可用于反应的硫醇、氨基、羧基、醛、烯烃、炔烃、杂环、醇或其它反应基 团。
上文已经描述了XTEN的示范性的实施方案，包括基本上同质的XTEN 的制剂。本发明提供了进一步充当有效负载可以缀合的平台的XTEN，以使 得其充当“载体，”从而向组合物赋予某些理想的药物动力学、化学和医药学特 性，尤其下文所描述的特性。在其它实施方案中，本发明提供了编码XTEN 的多核苷酸，其可以连接到编码肽或多肽有效负载的基因，这些有效负载可 以并入到表达载体中并且并入到适合于表达和回收主题XTEN-有效负载重组 融合蛋白质的宿主中。
在一些实施方案中，如上文所描述的XTEN组分经过工程改造以并入可 以与交联剂反应的规定数目的反应性氨基酸残基或可以进一步含有可以用于 缀合到有效负载的反应基团。在一个实施方案中，本发明提供了经半胱氨酸 工程改造的XTEN，其中各自含有反应性硫醇基的半胱氨酸缀合到交联剂， 从而得到XTEN-交联剂缀合物。在另一个实施方案中，本发明提供了经赖氨 酸工程改造的XTEN，其中各自含有带正电的亲水ε-氨基的赖氨酸缀合到交 联剂，从而得到XTEN-交联剂缀合物。在经半胱氨酸工程改造的XTEN的实 施方案中，各自包含约1个至约100个半胱氨酸氨基酸、或1个至约50个半 胱氨酸氨基酸、或1个至约40个半胱氨酸氨基酸、或1个至约20个半胱氨 酸氨基酸、或1个至约10个半胱氨酸氨基酸、或1个至约5个半胱氨酸氨基 酸、或9个半胱氨酸、或3个半胱氨酸、或单一的半胱氨酸氨基酸，其可用 于缀合。在经赖氨酸工程改造的XTEN的实施方案中，各自包含约1个至约 100个赖氨酸氨基酸、或1个至约50个赖氨酸氨基酸、或1个至约40个经 赖氨酸工程改造的氨基酸、或1个至约20个经赖氨酸工程改造的氨基酸、或 1个至约10个经赖氨酸工程改造的氨基酸、或1至约5个经赖氨酸工程改造 的氨基酸、或9个半胱氨酸、或3个半胱氨酸，或单一的赖氨酸，其可用于 缀合。在另一个实施方案中，经工程改造的XTEN包含前述范围或数目的半胱氨酸和赖氨酸残基。
一般来说，XTEN半胱氨酸硫醇基比胺基或羟基对亲电缀合试剂更具反 应性，即，更亲核。另外，半胱氨酸残基一般在给定的蛋白质中以较小数目 发现；因此，不太可能在相同的蛋白质内产生多个缀合。已经通过遗传工程 改造技术将半胱氨酸残基引入到蛋白质中以形成与配体的共价连接或形成新 的分子内二硫键(Better等人(1994)J.Biol.Chem.13:9644-9650；Bernhard 等人(1994)Bioconjugate Chem.5:126-132；Greenwood等人(1994)Therap eutic Immunology 1:247-255；Tu等人(1999)Proc.Natl.Acad.Sci USA 96: 4862-4867；Kanno等人(2000)J.of Biotechnology,76:207-214；Chmura等 人(2001)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 98(15):8480-8484；美国专利号6,248,5 64)。
在一个实施方案中，本发明提供了一种经分离的组合物，其包含缀合到 交联剂的经半胱氨酸工程改造的XTEN，其中交联剂是选自巯基反应性同双 官能或异双官能交联剂。在另一个实施方案中，本发明提供了一种经分离的 组合物，其包含用交联剂缀合的经赖氨酸工程改造的XTEN，其中交联剂是 选自胺反应性同双官能或异双官能交联剂。交联是通过共价键化学连接两个 或更多个分子的过程。就其与蛋白质和其它生物分子一起使用来说，这个过 程也被称为缀合或生物缀合。举例来说，蛋白质可以经过修饰以改变蛋白质 和肽上的N端和C端以及氨基酸侧链来阻断或暴露反应性结合位点、灭活功 能，或改变官能团来形成用于交联的新标靶。
在一个方面，本发明提供了位点特异性缀合到XTEN聚合物的方法，这 是使用化学活性的氨基酸残基或其衍生物(例如，N端α-胺基、赖氨酸的ε- 胺基、半胱氨酸的硫醇基、C端羧基、谷氨酸和天冬氨酸的羧基来实现。适 合于与一级α-氨基和ε-氨基反应的官能团是氯氰尿酸酯、二氯三嗪、三氟乙 基磺酸酯(trezylate)、苯并三唑碳酸酯、碳酸对硝基苯酯、碳酸三氯苯酯、醛、 混合酸酐、羰基咪唑、亚氨酸酯、N-羟基琥珀酰亚胺酯、N-羟基磺基琥珀酰 亚胺酯(Harris,J.M.,Herati,R.S.Polym.Prepr.(Am.Chem.Soc.,Div.Po lym.Chem),32(1),154-155(1991)；Herman,S.等人Macromol.Chem.Phys. 195,203-209(1994)；Roberts,M.J.等人Advanced Drug Delivery Reviews, 54,459-476(2002))。N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS酯和其水溶性类似物磺基- NHS酯)通常用于蛋白质缀合(见图2)。NHS酯在生理pH下通过相对有效的 偶合与伯胺反应后得到稳定的酰胺产物。缀合反应典型地在4℃到室温下于5 0-200mM磷酸盐、碳酸氢盐/碳酸盐、HEPES或硼酸盐缓冲液(pH在7与9 之间)中进行0.5到2小时。NHS酯通常以蛋白质的两倍到50倍摩尔过量来 使用。典型地，试剂的浓度可以在0.1mM到10mM之间变化，而最佳蛋白 质浓度是50-100μM。
在另一种方法中，考虑到XTEN多肽仅具有单一的N端α-氨基，XTEN 可以经过工程改造以含有有意并入的赖氨酸残基的额外ε-氨基；其示范性的 序列提供于表3中。α-氨基和ε-氨基具有不同的pKa值：对于N端氨基酸的 α-氨基为约7.6到8.0，并且对于赖氨酸的ε-氨基为约10到10.5。pKa值的这 种显著差异可以用于氨基的选择性修饰。所有伯胺的去质子化在高于pH 8.0 的pH下发生。在这种环境中，不同胺的亲核特性决定其反应性。当去质子 化时，赖氨酸的更亲核的ε-氨基一般比α-氨基对亲电试剂更具反应性。另一 方面，在较低pH(例如pH 6)下，更酸性的α-氨基一般比ε-氨基的去质子化 程度更高，并且反应性的次序颠倒。举例来说，经FDA批准的药物培非格司 亭(Neulasta；pegfilgranstim)是通过共价连接20kDa的PEG-醛而修饰的粒细 胞集落刺激因子(G-CSF)。对蛋白质的N端氨基酸的特异性修饰是通过利用α -氨基与内部赖氨酸的ε-氨基相比更低的pKa来实现(Molineaux,G.Curr.Ph arm.Des.10,1235-1244(2004)，美国专利5,824,784)。
包含半胱氨酸残基的XTEN多肽可以使用本文所描述的重组方法(参看 例如实施例)或通过本领域中已知的标准方法来进行遗传工程改造。与硫醇基 缀合可以使用高度特异性反应来进行，使得用交联剂连接的单一缀合物种类 形成。适合于与半胱氨酸硫醇基反应的官能团是N-马来酰亚胺、卤乙酰基和 吡啶基二硫化物。当反应混合物的pH在pH 6.5与7.5之间时马来酰亚胺基 特异性地与巯基反应，形成不可逆的稳定硫醚键(见图3)。在中性pH下，马 来酰亚胺与巯基的反应比胺快1,000倍，但当pH升到大于8.5时，反应偏向 于伯胺。马来酰亚胺不与酪氨酸、组氨酸或甲硫氨酸反应。对于反应溶液来 说，硫醇必须从与马来酰亚胺一起使用的反应缓冲液中排除，因为其将竞争 偶合位点。反应中的过量马来酰亚胺可以在反应结束时通过添加游离硫醇来 淬灭，而EDTA可以被包括在偶合缓冲液中以使巯基的氧化减到最少。
在另一个实施方案中，本发明涵盖了卤乙酰基试剂的用途，其适用于交 联XTEN或有效负载的巯基以制备主题缀合物。最常用的卤乙酰基试剂含有 在生理pH下与巯基反应的碘乙酰基。碘乙酰基与巯基的反应通过用硫醇对 碘进行亲核取代来进行，产生稳定的硫醚键(见图4)。在pH 8.3下使用比巯 基数目稍过量的碘乙酰基确保了巯基的选择性。如果使用大量过量的碘乙酰 基，那么碘乙酰基可以与其它氨基酸反应。咪唑可以在pH 6.9-7.0下与碘乙 酰基反应，但孵育必须进行超过一周。组氨酰基侧链和氨基分别在高于pH 5和pH7下以未质子化的形式与碘乙酰基反应。在另一个实施方案中，适用 于巯基的交联剂是吡啶基二硫化物。吡啶基二硫化物在宽pH范围上(最佳p H是4-5)与巯基反应以形成将XTEN连接到有效负载的二硫键(见图5)。作为 二硫化物，使用这些试剂制备的缀合物是可裂解的。在反应期间，二硫化物 交换在分子的-SH基团与2-吡啶基二硫醇基之间发生。结果，释放出吡啶-2- 硫酮。这些试剂可以被用作交联剂并且用来将巯基引入到蛋白质中。二硫化 物交换可以在生理pH下进行，不过反应速率较慢。
包含活性合成肽或多肽的XTEN-有效负载缀合物可以使用化学活性的氨 基酸残基或其衍生物来制备；例如，N端α-氨基、赖氨酸的ε-氨基、半胱氨 酸的硫醇基、C端氨基酸的羧基、天冬氨酸或谷氨酸的羧基。与一级氨基酸 序列无关，每个肽含有N端α-氨基。必要时，N端α-氨基可以在活性肽/多肽 的化学合成后保持被保护/阻断。合成肽/多肽可以含有赖氨酸的额外ε-氨基， 其可以是天然的或经特异性取代以供缀合。如上文所描述的α-氨基和ε-氨基 可以在不同pH下进行选择性修饰。另一种用以选择性地修饰合成肽中的α- 氨基或ε-氨基的方法是用二碳酸二叔丁酯(BOC2)对氨基进行可逆的保护。举 例来说，伐普肽(合成生长抑素类似物)的选择性BOC保护已经通过在pH 6 下(α-基团被保护)或在pH 8.5下(ε-基团被保护)修饰来实现。然后，用PEG- N-羟基琥珀酰亚胺或PEG-醛特异性地修饰剩余的游离氨基。最后，通过酸性 处理来去除BOC保护以得到经单修饰的肽(Morpurgo,M.等人Selective Alk ylation and Acylation of α and ε Amino Groups with PEG in aSomatostat in Analogue:Tailored Chemistry for OptimizedBioconjugates.Bioconjugate Chem.2002.13:1238-1243)。
因为半胱氨酸一般在天然肽和蛋白质序列中相比赖氨酸不太丰富，所以 使用半胱氨酸作为缀合位点降低了在反应中多重缀合到XTEN-交联剂分子的 可能性。其还降低了在缀合后肽/蛋白质失活的坑性。此外，与半胱氨酸位点 的缀合常常可以按明确定义的方式来进行，使得单一种类的XTEN聚合物- 肽或XTEN聚合物-多肽缀合物形成。在一些情况下，半胱氨酸可能不存在于 将要缀合的肽的氨基酸序列中。在这种情况下，可以使用标准方法以重组方 式或合成方式将半胱氨酸残基添加到肽的N端或C端。或者，可以将所选氨基酸化学或遗传修饰成半胱氨酸。举个例子，对半胱氨酸的丝氨酸修饰被认 为是保守突变。另一种用以将硫醇基引入到缺乏半胱氨酸的肽中的方法是使 用硫醇化试剂对赖氨酸ε-氨基进行化学修饰，这些硫醇化试剂如2-亚氨基硫 烷(特劳特氏试剂(Traut'sreagent))、SATA(S-乙酰基硫代乙酸N-琥珀酰亚胺 酯)、SATP(S-乙酰基硫代丙酸N-琥珀酰亚胺酯)、SAT-PEO4-Ac(N-琥珀酰亚 胺基S-乙酰基(硫代四乙二醇))、SPDP(3-(2-吡啶二硫代)丙酸N-琥珀酰亚胺 酯)、LC-SPDP(6-(3'-[2-吡啶二硫代]丙酰胺基)己酸琥珀酰亚胺酯)(下文更全 面地描述)。一旦将独特的硫醇基引入到肽中，其可以用含有反应性巯基的化 合物选择性地修饰，这些化合物如上文所描述的N-马来酰亚胺、卤乙酰基和 吡啶基二硫化物。
XTEN多肽与肽、蛋白质或小分子药物有效负载之间的缀合可以通过多 种连接化学来实现，包括可商购的零长度、同双官能或异双官能和多官能的 交联剂化合物，根据本领域中已知和可用的方法，如例如R.F.Taylor(1991) "Proteinimmobilization.Fundamentals and Applications",Marcel Dekker In c.,N.Y.；G.T.Hermanson等人(1992)"Immobilized Affinity Ligand Techni ques",AcademicPress,San Diego；G.T.Hermanson(2008)"Bioconjugate Techniques",第2版Elsevier,Inc.,S.S.Wong(1991)"Chemistry of Protei n Conjugation and Crosslinking",CRCPress,Boca Raton中所描述的方法。 用于制备本公开的缀合物的适合交联剂可从公司商购，这些公司如Sigma-Al drich、Thermo Fisher Scientific(Pierce Protein ResearchProducts)、Invitroge n、ProteoChem、G-Biosciences。交联剂的优选实施方案包含硫醇反应性官能 团或氨基反应性官能团。示范性的交联剂的列表提供于表13中。
表13：示范性的交联剂
交联剂的非限制性实例是ABH(对叠氮基苯甲酰基酰肼)、AMAS(N-(α- 马来酰亚胺基乙酰氧基)-琥珀酰亚胺酯)、ANB-NOS(N-5-叠氮基-2-硝基苯甲 氧基-琥珀酰亚胺)、APDP(N-(4-[对叠氮基水杨酰胺基]丁基)-3'-(2'-吡啶二硫代) 丙酰胺)、ASBA(4-(对叠氮基水杨酰胺基)-丁胺)、BASED(双(β-[4-叠氮基水 杨酰胺基]乙基)二硫化物)、BMB(1,4-双马来酰亚胺基丁烷)、BMDB(1,4-双 马来酰亚胺基-2,3-二羟基丁烷)、BMH(双马来酰亚胺基己烷)、BMOE(双马 来酰亚胺基乙烷)、BMPH(N-(β-马来酰亚胺基丙酸)酰肼)、BMPS(N-(β-马来酰亚胺基丙氧基)琥珀酰亚胺酯)、BM(PEG)2(1,8-双马来酰亚胺基二乙二醇)、 BM(PEG)3(1,11-双马来酰亚胺基三乙二醇)、BS2G(戊二酸双(磺基琥珀酰亚胺 酯))、BS3(磺基-DSS)(辛二酸双(磺基琥珀酰亚胺酯))、BS[PEG]5(双 (NHS)PEG5)、BS(PEG)9(双(NHS)PEG9)、BSOCOES(双(2-[琥珀酰亚胺氧基 羰氧基]乙基)砜)、C6-SANH(4-肼基烟酸C6-琥珀酰亚胺酯丙酮腙)、C6-SFB (4-甲酰基苯甲酸C6-琥珀酰亚胺酯)、DCC(N,N-二环己基碳化二亚胺)、 DFDNB(1-5-二氟-2,4-二硝基苯)、DMA(己二亚胺酸二甲酯)、DMP(庚二亚 胺酸二甲酯)、DMS(辛二亚胺酸二甲酯)、DPDPB(1,4-二(3'-[2'吡啶二硫代] 丙酰胺基)丁烷)、DSG(戊二酸二琥珀酰亚胺酯)、DSP(二硫代双(丙酸琥珀酰 亚胺酯)、拉蒙特氏试剂)、DSS(辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、DST(酒石酸二琥 珀酰亚胺酯)、DTBP(3,3'-二硫代双丙亚胺酸二甲酯)、DTME(二硫代双马来 酰亚胺基乙烷)、DTSSP(磺基-DSP)(3,3'-二硫代双(丙酸磺基琥珀酰亚胺酯))、EDC(1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐)、EGS(乙二醇琥珀酸双 (琥珀酰亚胺酯))、EMCA(N-ε-马来酰亚胺基己酸)、EMCH(N-(ε-马来酰亚胺 基己酸)酰肼)、EMCS(N-(ε-马来酰亚胺基己酰氧基)琥珀酰亚胺酯)、GMBS (N-(γ-马来酰亚胺基丁酰氧基)琥珀酰亚胺酯)、KMUA(N-κ-马来酰亚胺基十一 烷酸)、KMUH(N-(κ-马来酰亚胺基十一烷酸)酰肼)、LC-SDA(NHS-LC-双吖 丙啶)、LC-SMCC(4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧基-(6-酰胺基己酸)琥 珀酰亚胺酯)、LC-SPDP(6-(3'-[2-吡啶二硫代]丙酰胺基)己酸琥珀酰亚胺酯)、MBS(间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯)、MPBH(4-(4-N-马来 酰亚胺基苯基)-丁酸酰肼)、NHS-ASA(N-羟基琥珀酰亚胺基-4-叠氮基水杨 酸)、PDPH(3-(2-吡啶二硫代)丙酰肼)、PMPI(异氰酸N-(对马来酰亚胺基苯 酯))、SADP((4-叠氮基苯基二硫代)丙酸琥珀酰亚胺酯)、SAED(2-[7-叠氮基-4- 甲基香豆素-3-乙酰胺基]乙基-1,3'-二硫代丙酸琥珀酰亚胺酯)、SAND(2-(间叠 氮基-邻硝基苯甲酰胺基)乙基-1,3'-二硫代丙酸琥珀酰亚胺酯)、SANH(4-肼基 烟酸琥珀酰亚胺酯丙酮腙)、SANPAH(6-(4'-叠氮基-2'-硝基苯氨基)己酸N-琥 珀酰亚胺酯)、SASD(2-(对叠氮基水杨酰胺基)乙基-1,3-二硫代丙酸琥珀酰亚胺酯)、SBAP(3-(溴乙酰胺基)丙酸琥珀酰亚胺酯)、SDA(NHS-双吖丙啶)、 SDAD(NHS-SS-双吖丙啶)、SFAD((全氟叠氮基苯甲酰胺基)乙基-1,3'-二硫代 丙酸琥珀酰亚胺酯)、SFB(4-甲酰基苯甲酸琥珀酰亚胺酯)、SHTH(4-酰肼基 对苯二甲酸琥珀酰亚胺酯)、SIA(碘乙酸N-琥珀酰亚胺酯)、SIAB((4-碘乙酰 基)氨基苯甲酸N-琥珀酰亚胺酯)、SMPB(4-(对马来酰亚胺基苯基)丁酸琥珀酰 亚胺酯)、SMCC(4-(N-马来酰亚胺基-甲基)环己烷-1-甲酸琥珀酰亚胺酯)、 SM[PEG]2(NHS-PEG2-马来酰亚胺)、SM[PEG]4(NHS-PEG4-马来酰亚胺)、 SM(PEG)6(NHS-PEG6-马来酰亚胺)、SM[PEG]8(NHS-PEG8-马来酰亚胺)、 SM[PEG]12(NHS-PEG12-马来酰亚胺)、SM(PEG)24(NHS-PEG24-马来酰亚 胺)、SMPB(4-(对马来酰亚胺基-苯基)丁酸琥珀酰亚胺酯)、SMPH(6-(β-马来 酰亚胺基丙酰胺基)己酸琥珀酰亚胺酯)、SMPT(4-琥珀酰亚胺基氧羰基-甲基 -α-(2-吡啶二硫代)甲苯)、SPB((4-补骨脂素-8-基氧基)丁酸琥珀酰亚胺酯)、 SPDP(3-(2-吡啶二硫代)丙酸N-琥珀酰亚胺酯)、磺基-DST(酒石酸磺基二琥珀 酰亚胺酯)、磺基-EGS(乙二醇琥珀酸双(磺基-琥珀酰亚胺酯))、磺基-EMCS (N-(ε-马来酰亚胺基己酰氧基)磺基琥珀酰亚胺酯)、磺基-GMBS(N-(γ-马来酰 亚胺基丁酰氧基)磺基琥珀酰亚胺酯)、磺基-HSAB(4-叠氮基苯甲酸N-羟基磺 基琥珀酰亚胺酯)、磺基-KMUS(N-(κ-马来酰亚胺基十一烷酰氧基)磺基琥珀酰 亚胺酯)、磺基-LC-SDA(磺基-NHS-LC-双吖丙啶)、磺基-LC-SMPT(6-(α-甲基 -α-[2-吡啶二硫代]-甲苯酰胺基)己酸磺基琥珀酰亚胺酯)、磺基-LC-SPDP (6-(3'-[2-吡啶二硫代]丙酰胺基)己酸磺基琥珀酰亚胺酯)、磺基-MBS(间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯)、磺基-NHS-LC-ASA((4-叠氮基- 水杨酰胺基)己酸磺基琥珀酰亚胺酯)、磺基-SADP((4-叠氮基苯基二硫代)丙酸 磺基琥珀酰亚胺酯)、磺基-SAED(2-[7-叠氮基-4-甲基香豆素-3-乙酰胺基]乙基 -1,3'-二硫代丙酸磺基琥珀酰亚胺酯)、磺基-SAND(2-(间叠氮基-邻硝基苯甲酰 胺基)乙基-1,3'-二硫代丙酸磺基琥珀酰亚胺酯)、磺基-SANPAH(6-(4'-叠氮基 -2'-硝基苯氨基)己酸磺基琥珀酰亚胺酯)、磺基-SASD(2-(对叠氮基水杨酰胺基) 乙基-1,3-二硫代丙酸磺基琥珀酰亚胺酯)、磺基-SDA(磺基-NHS-双吖丙啶)、 磺基-SDAD(磺基-NHS-SS-双吖丙啶)、磺基-SFAD((全氟叠氮基苯甲酰胺基) 乙基-1,3'-二硫代丙酸磺基琥珀酰亚胺酯)、磺基-SIAB((4-碘-乙酰基)氨基苯甲酸磺基琥珀酰亚胺酯)、磺基-SMCC(4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸磺 基琥珀酰亚胺酯)、磺基-SMPB(4-(对马来酰亚胺基苯基)丁酸磺基琥珀酰亚胺 酯)、THPP(β-(三[羟甲基]膦)丙酸(甜菜碱))、TMEA(三(2-马来酰亚胺基乙基) 胺)、TSAT(氨基三乙酸三(琥珀酰亚胺酯))。
在一些实施方案中，使用交联试剂的XTEN-有效负载缀合物引入了非天 然的间隔臂。然而，在优选天然肽键的情况下，本发明提供了可以使用经由 活化羧酸酯基而起作用的零长度交联剂来进行反应。在其实施方案中，为了 实现反应选择性，第一多肽必须仅含有游离的C端羧基，而所有赖氨酸、谷 氨酸和天冬氨酸侧链被保护，并且第二肽/蛋白质N端α-胺必须是唯一可用的 未被保护的氨基(要求任何赖氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺都被保护)。在这些情 况下，使用没有谷氨酸的表2的XTEN AG家族序列作为XTEN-有效负载或XTEN-交联剂中的第一多肽是优选的。因此，在一个实施方案中，本发明提 供了包含AGXTEN序列的XTEN-交联剂和XTEN-有效负载，其中使用零长 度交联剂将组合物缀合到有效负载。用于实施方案中的示范性的零长度交联 剂包括(但不限于)DCC(N,N-二环己基碳化二亚胺)和EDC(1-乙基-3-(3-二甲 氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐)，其中交联剂被用来直接将一个分子(如有效负 载)的羧基官能团缀合到另一个分子(如具有伯胺官能团的有效负载)的伯胺 (见图6)。磺基-NHS(N-羟基磺基琥珀酰亚胺)和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)被 用作缀合的催化剂，从而增加反应效率(Grabarek Z,Gergely J.Zero-length crosslinkingprocedure with the use of active esters.(1990)Anal.Biochem.185(1), 131-135)。EDC与羧酸基反应并且活化羧基以形成活性O-酰基异脲中间物， 使其偶合到反应混合物中的氨基。O-酰基异脲中间物在水溶液中不稳定，使 其在没有使用N-羟基琥珀酰亚胺增加中间物的稳定性的情况下在两步缀合程 序中不太有效。这种中间物与伯胺反应形成醯胺衍生物。对于许多应用来说， 交联反应通常在pH 4.5到5之间进行并且仅需要几分钟。然而，反应产率在 4.5到7.5的pH下是类似的。EDC的水解是偶合期间的竞争反应并且取决于 温度、pH和缓冲液组成。4-吗啉代乙烷磺酸(MES)是有效的碳化二亚胺反应 缓冲液。磷酸盐缓冲液降低了EDC的反应效率，但增加EDC的量可以补偿 效率的降低。Tris、甘氨酸和乙酸盐缓冲液可能不用作缀合缓冲液。
本发明还提供了如下组合物：其中三个XTEN被三价交联剂连接，从而 得到三聚XTEN-交联剂缀合物。三聚交联剂可以通过使用标准缀合技术，用 具有表14中所描述的各种反应侧基的间隔子连接对称的三价核心(如叔胺、 经三取代的甲烷或1,3,5-三取代的苯)或不对称的三价分子(如LysLys二肽或 GluGlu二肽或AspAsp二肽或CysCysCys三肽)来形成。在一个实施方案中， 本发明提供了如下组合物：其中三个XTEN被三价交联剂共价连接，这种交 联剂选自由硫醇反应性三(2-马来酰亚胺基乙基)胺(TMEA)、胺反应性氨基三乙酸三(琥珀酰亚胺酯)(TSAT)和表14中所阐述的交联剂组成的组。
表14：三价交联剂
*三价核心之一+基团1中的任一者+基团2中的任一者+基团3中 的任一者
在其它实施方案中，XTEN和有效负载可以使用一大组交联剂来缀合， 包括由间隔臂(线性或分支的)和两个或更多个反应末端组成的交联剂，这些反 应末端能够附接到蛋白质或其它分子上的特定官能团(例如，伯胺、巯基等)。 线性交联剂可以是同双官能或异双官能的。同双官能交联剂具有两个相同的 反应基团，这些反应基团被用来在一步反应程序中交联蛋白质。胺反应性同 双官能交联剂的非限制性实例是BS2G(戊二酸双(磺基琥珀酰亚胺酯))、BS3 (磺基-DSS)(辛二酸双(磺基琥珀酰亚胺酯))、BS[PEG]5(双(NHS)PEG5)、BS(PEG)9(双(NHS)PEG9)、BSOCOES(双(2-[琥珀酰亚胺氧基羰氧基]乙基) 砜)、DFDNB(1-5-二氟-2,4-二硝基苯)、DMA(己二亚胺酸二甲酯)、DMP(庚 二亚胺酸二甲酯)、DMS(辛二亚胺酸二甲酯)、DSG(戊二酸二琥珀酰亚胺酯)、 DSP(二硫代双(丙酸琥珀酰亚胺酯)(拉蒙特氏试剂)、DSS(辛二酸二琥珀酰亚 胺酯)、DST(酒石酸二琥珀酰亚胺酯)、DTBP(3,3'-二硫代双丙亚胺酸二甲酯)、 DTSSP(磺基-DSP)(3,3'-二硫代双(丙酸磺基琥珀酰亚胺酯))、EGS(乙二醇琥 珀酸双(琥珀酰亚胺酯))、磺基-EGS(乙二醇琥珀酸双(磺基-琥珀酰亚胺酯))。
另外，用于组合物中和形成XTEN-有效负载和/或XTEN-交联剂组合物 的方法中的同双官能交联剂的实例是巯基反应剂，如BMB(1,4-双马来酰亚胺 基丁烷)、BMH(双马来酰亚胺基己烷)、BMDB(1,4-双马来酰亚胺基-2,3-二羟 基丁烷)、BMOE(双马来酰亚胺基乙烷)、BM(PEG)2(1,8-双马来酰亚胺基二 乙二醇)、BM(PEG)3(1,11-双马来酰亚胺基三乙二醇)、DPDPB(1,4-二(3'-[2' 吡啶二硫代]丙酰胺基)丁烷)、DTME(二硫代双马来酰亚胺基乙烷)。
为了形成XTEN-交联剂缀合物用于随后缀合到有效负载，以及形成 XTEN-有效负载缀合物，异双官能交联剂是优选的，这是因为可以控制顺序 反应。由于异双官能交联剂具有两个不同的反应基团，因此其在组合物中的 使用允许顺序的两步缀合。异双官能试剂与使用更不稳定的基团的第一蛋白 质反应。在一个实施方案中，异双官能交联剂与XTEN中的反应基团的缀合 得到XTEN-交联剂缀合物。在完成反应并且去除过量未反应的交联剂之后， 可以将经修饰的蛋白质(如XTEN-交联剂)添加到有效负载中，这个有效负载 与交联剂的第二反应基团相互作用，从而得到XTEN-有效负载缀合物。最常 用的异双官能交联剂一端含有胺反应基团并且另一端含有巯基反应基团。因 此，这些交联剂适合与经半胱氨酸工程改造或经赖氨酸工程改造的XTEN一 起使用，或与XTEN的N端的α-氨基一起使用。异双官能交联剂的非限制性 实例是AMAS(N-(α-马来酰亚胺基乙酰氧基)-琥珀酰亚胺酯)、BMPS(N-(β-马 来酰亚胺基丙氧基)琥珀酰亚胺酯)、EMCS(N-(ε-马来酰亚胺基己酰氧基)琥珀酰亚胺酯)、GMBS(N-(γ-马来酰亚胺基丁酰氧基)琥珀酰亚胺酯)、LC-SMCC (4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧基-(6-酰胺基己酸)琥珀酰亚胺酯)、 LC-SPDP(6-(3'-[2-吡啶二硫代]丙酰胺基)己酸琥珀酰亚胺酯)、MBS(间马来酰 亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯)、SBAP(3-(溴乙酰胺基)丙酸琥珀酰亚 胺酯)、SIA(碘乙酸N-琥珀酰亚胺酯)、SIAB((4-碘乙酰基)氨基苯甲酸N-琥珀 酰亚胺酯)、SMPB(4-(对马来酰亚胺基苯基)丁酸琥珀酰亚胺酯)、SMCC(4-(N- 马来酰亚胺基-甲基)环己烷-1-甲酸琥珀酰亚胺酯)、SM[PEG]2(NHS-PEG2-马 来酰亚胺)、SM[PEG]4(NHS-PEG4-马来酰亚胺)、SM(PEG)6(NHS-PEG6-马来 酰亚胺)、SM[PEG]8(NHS-PEG8-马来酰亚胺)、SM[PEG]12(NHS-PEG12-马来 酰亚胺)、SM(PEG)24(NHS-PEG24-马来酰亚胺)、SMPB(4-(对马来酰亚胺基- 苯基)丁酸琥珀酰亚胺酯)、SMPH(6-(β-马来酰亚胺基丙酰胺基)己酸琥珀酰亚 胺酯)、SMPT(4-琥珀酰亚胺基氧羰基-甲基-α-(2-吡啶二硫代)甲苯)、SPDP (3-(2-吡啶二硫代)丙酸N-琥珀酰亚胺酯)、磺基-EMCS(N-(ε-马来酰亚胺基己 酰氧基)磺基琥珀酰亚胺酯)、磺基-GMBS(N-(γ-马来酰亚胺基丁酰氧基)磺基 琥珀酰亚胺酯)、磺基-KMUS(N-(κ-马来酰亚胺基十一烷酰氧基)磺基琥珀酰亚 胺酯)、磺基-LC-SMPT(6-(α-甲基-α-[2-吡啶二硫代]-甲苯酰胺基)己酸磺基琥 珀酰亚胺酯)、磺基-LC-SPDP(6-(3'-[2-吡啶二硫代]丙酰胺基)己酸磺基琥珀酰 亚胺酯)、磺基-MBS(间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯)、 磺基-SIAB((4-碘-乙酰基)氨基苯甲酸磺基琥珀酰亚胺酯)、磺基-SMCC(4-(N- 马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸磺基琥珀酰亚胺酯)、磺基-SMPB(4-(对马来 酰亚胺基苯基)丁酸磺基琥珀酰亚胺酯)。允许共价缀合含胺分子和含巯基分子 的异双官能交联剂的一个实例是磺基-SMCC(4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷 -1-甲酸磺基磺基琥珀酰亚胺酯)。磺基-SMCC是SMCC的水溶性类似物，其可以在水性缓冲液中制备成至多10mM浓度。这种交联剂的间隔臂中的环己 烷环与不含这个环的类似试剂相比降低了马来酰亚胺基的水解速率。这种特 征使已经用SMCC或磺基-SMCC进行马来酰亚胺活化的XTEN能够冻干并 储存以供稍后缀合到含巯基分子。因此，在一个实施方案中，本发明提供了 一种具有XTEN的XTEN-交联剂，这个XTEN当最佳比对时与选自表3的序 列或序列片段具有至少约80％的序列同一性、或至少约90％、或约91％、或 约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、 或约99％的序列同一性，或与这个序列或序列片段相同，其中XTEN-交联剂 具有连接到XTEN的α-氨基或经赖氨酸工程改造的XTEN的ε-胺的磺基 -SMCC的一个或多个交联剂。在另一个实施方案中，本发明提供了一种具有 XTEN的XTEN-交联剂，这个XTEN当最佳比对时与选自表2的序列或序列 片段具有至少约80％的序列同一性、或至少约90％、或约91％、或约92％、 或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、或约 99％的序列同一性，或与这个序列或序列片段相同，其中XTEN-交联剂具有 连接到XTEN的N端氨基的一个磺基-SMCC。前面所描述的异双官能交联剂 经由单一的胺和单一的半胱氨酸缀合两个分子。开发了一种特殊类型的交联 剂用于位点特异性缀合到蛋白质中的二硫桥键(Balan S.等人Site-specificPEGylation of protein disulfide bonds using a three-carbon bridge.(2007)Bioconjugate Chem.18,61-76；Brocchini S.等人Disulfide bridge based PEGylationof proteins.(2008)Advanced Drug Delivery Reviews 60,3-12)。首 先，将接头合成为胺特异性4-[2,2-双[对甲苯磺酰基)甲基]乙酰基)苯甲酸-NHS 酯。这个分子可以共价连接到XTEN的氨基，得到XTEN-双(砜)。在50mM 磷酸钠缓冲液(pH 7.8)中孵育后一种分子将会消除甲苯亚磺酸以产生 XTEN-α,β-不饱和β'-单砜。所计分子将以位点特异性方式与含二硫桥键的有 效负载蛋白质反应。在第一步中，通过还原使二硫桥键转化成两个硫醇。在 第二步中，XTEN-单砜使两个半胱氨酸双烷基化，从而得到化学稳定的三碳 桥。上述α,β-不饱和β'-单砜可以不仅用来缀合到来源于二硫桥键的两个硫醇 基，而且用来缀合到多聚组氨酸标签(Cong Y.等人Site-specific PEGylation at histidine tags.(2012)Bioconjugate Chem.23,248-263)。
使用XTEN-交联剂组合物与磺基-SMCC缀合在两步过程中进行。在一个 实施方案中，在例如磷酸盐缓冲盐水(PBS＝100mM磷酸钠，150mM氯化钠， pH 7.2)的缀合缓冲液或相当的无胺和无巯基缓冲液(pH 6.5-7.5)中制备含胺蛋 白质。添加EDTA到1-5mM有助于螯合二价金属，由此减少含巯基蛋白质 中的二硫化物形成。含胺蛋白质的浓度决定了将要使用的交联剂的摩尔过量。 一般来说，小于1mg/ml的蛋白质样品利用40-80倍摩尔过量，1-4mg/ml的 蛋白质样品利用20倍摩尔过量，并且5-10mg/ml的蛋白质样品利用5到10 倍摩尔过量的交联剂。将反应混合物(含胺蛋白质和交联剂)在室温下孵育30 分钟或在4℃下孵育2小时，然后使用经缀合缓冲液平衡的脱盐柱去除过量 交联剂。在制备XTEN-交联剂的情况下，组合物将被保持在那个点。在XTEN- 交联剂缀合到有效负载的实施方案中，含巯基有效负载和XTEN-交联剂缀合 物以一定摩尔比混合，这个摩尔比对应于最终缀合物所需的摩尔比(将缀合到 每个XTEN分子的一个或多个氨基的预期交联剂的数目考虑在内)并且与存 在于有效负载上的单一巯基一致。将反应混合物在室温下孵育30分钟或在 4℃下孵育2小时。可以通过SDS-PAGE继之以蛋白质染色，或通过如逆相 HPLC或阳离子/阴离子交换色谱等适当分析型色谱技术来估算缀合效率。
在一个实施方案中，本发明提供了使用多价的交联剂形成的XTEN-交联 剂缀合组合物，从而得到具有2个、3个、4个、5个、6个或更多个XTEN 的组合物。在另一个实施方案中，本发明提供了使用多价的交联剂形成的 XTEN-交联剂-有效负载缀合组合物，从而得到具有连接到1个、2个、3个、 4个、5个、6个或更多个不同有效负载的2个、3个、4个、5个、6个或更多个XTEN的组合物。多价三官能交联剂的非限制性实例是“Y形”巯基反应 性TMEA(三(2-马来酰亚胺基乙基)胺)和胺反应性TSAT(氨基三乙酸三(琥珀 酰亚胺酯)。可以使用线性或分支的支架聚合物来设计反应部分的任何组合， 用于多价组合物。实例示于图7中，其中构建体可以具有同官能或异官能反 应基团的任何组合。特别关注的是图21-23和97-105中示意性示出的三聚构 型，以及图21和105-106中示出的四聚构型。不受特定理论束缚，具有经三官能接头(与有效负载连接，继而经由所并入的赖氨酸或半胱氨酸残基连接到 XTEN)连接的三个XTEN的缀合组合物可以利用与单价XTEN-有效负载组合 物相比成比例缩短的XTEN用于构建体的每个“臂”，其中相同数目的有效负 载连接到每个XTEN所并入的半胱氨酸或赖氨酸或N端氨基残基，并且所得 三聚XTEN-有效负载组合物与具有当量数目的XTEN氨基酸的单体XTEN- 有效负载组合物相比将具有与单体XTEN-有效负载组合物相当的表观分子量 和流体动力学半径，而将具有更低的粘度，从而有助于通过小孔针将组合物 施用给受试者，并且由于位阻减小和组合物的柔性增大而将从有效负载提供 同等或更佳的效力。
在一个实施方案中，本发明提供了一种包含经三价交联剂连接的三个 XTEN的组合物，其中含有组合物的约100mg/ml蛋白质的溶液具有比相等 分子量和浓度的对应的线性XTEN低至少约5cP、或约6cP、或约7cP、或 约8cP、或约9cP、或约10cP的粘度。在另一个实施方案中，本发明提供 了一种包含经四价交联剂连接的四个XTEN组合物，其中含有组合物的约100 mg/ml蛋白质的溶液具有比相等分子量和浓度的对应的线性XTEN低至少约 5cP、或约6cP、或约7cP、或约8cP、或约9cP、或约10cP的粘度。
使用多价交联剂制造这些组合物的方法可以采用如上文所描述的类似反 应条件，而示范性的方法和支持性资料提供于下文的实施例中。另外，多价 交联剂可以容易地通过修饰赖氨酸低聚体来获得。举例来说，肽Lys-Lys在 每个Lys残基处包含三个氨基，一个α-氨基和两个ε-氨基。这些氨基可以通 过使其与具有一个胺反应基团的双官能交联剂反应来转化成许多其它反应基 团。举例来说，Lys-Lys与DBCO-NHS交联剂的反应得到带有三个DBCO基 团的产物。Lys-Lys与NMal-NHS交联剂的反应得到带有三个NMal基团的产 物。以类似方式，可以通过使用更长的赖氨酸肽获得基于Lys-Lys-Lys的四价 交联剂和更高化合价的交联剂。
交联剂可以被归类为“同双官能”或“异双官能”，其中同双官能交联剂具 有两个或更多个相同的反应基团并且用于一步反应程序中以随机连接或聚合 含有相似官能团的分子，并且异双官能交联剂具有不同的反应基团，这些不 同的反应基团允许具有相应的目标官能团的分子的单步缀合或允许使不合需 要的聚合或自缀合减到最少的顺序(两步)缀合。在一个优选的实施方案中，其 中XTEN-交联剂以组合物的形式制备并分离以供后续反应，XTEN-交联剂连 接到异双官能交联剂并且具有至少一个可用于后续反应的反应基团。
在一个实施方案中，本发明提供了利用具有二硫键的可裂解交联剂缀合 的XTEN-交联剂和XTEN-有效负载。典型地，裂解是通过二硫键还原剂(如 β-巯基乙醇、DTT、TCEP)来实现，然而，特别预期，这些组合物将通过用内 源还原剂(如半胱氨酸和谷胱甘肽)调节而以缓释方式可内源裂解。以下是这类 交联剂的非限制性实例：APDP(N-(4-[对叠氮基水杨酰胺基]丁基)-3'-(2'-吡啶 二硫代)丙酰胺)、BASED(双(β-[4-叠氮基水杨酰胺基]乙基)二硫化物)、DPDPB (1,4-二(3'-[2'吡啶二硫代]丙酰胺基)丁烷)、DSP(二硫代双(丙酸琥珀酰亚胺酯)) (拉蒙特氏试剂)、DTBP(3,3'-二硫代双丙亚胺酸二甲酯)、DTME(二硫代双马来酰亚胺基乙烷)、DTSSP(磺基-DSP)(3,3'-二硫代双(丙酸磺基琥珀酰亚胺 酯))、LC-SPDP(6-(3'-[2-吡啶二硫代]丙酰胺基)己酸琥珀酰亚胺酯)、PDPH (3-(2-吡啶二硫代)丙酰肼)、SDAD(NHS-SS-双吖丙啶)、SMPT(4-琥珀酰亚胺 基氧羰基-甲基-α-(2-吡啶二硫代)甲苯)、SPDP(3-(2-吡啶二硫代)丙酸N-琥珀 酰亚胺酯)、磺基-LC-SMPT(6-(α-甲基-α-[2-吡啶二硫代]-甲苯酰胺基)己酸磺 基琥珀酰亚胺酯)、磺基-LC-SPDP(6-(3'-[2-吡啶二硫代]丙酰胺基)己酸磺基琥 珀酰亚胺酯)、磺基-SAED(2-[7-叠氮基-4-甲基香豆素-3-乙酰胺基]乙基-1,3'- 二硫代丙酸磺基琥珀酰亚胺酯)、磺基-SAND(2-(间叠氮基-邻硝基苯甲酰胺基) 乙基-1,3'-二硫代丙酸磺基琥珀酰亚胺酯)、磺基-SDAD(磺基-NHS-SS-双吖丙 啶)、磺基-SFAD((全氟叠氮基苯甲酰胺基)乙基-1,3'-二硫代丙酸磺基琥珀酰亚 胺酯)。在另一个实施方案中，包含BSOCOES(双(2-[琥珀酰亚胺氧基羰氧基] 乙基)砜)的XTEN-有效负载缀合物可以在碱性条件下裂解。在另一个实施方 案中，包含DST(酒石酸二琥珀酰亚胺酯)和BMDB(1,4-双马来酰亚胺基-2,3- 二羟基丁烷)的XTEN-有效负载缀合物可以通过高碘酸盐氧化而裂解。EGS (乙二醇琥珀酸双(琥珀酰亚胺酯))和磺基-EGS(乙二醇琥珀酸双(磺基-琥珀酰 亚胺酯))被羟胺裂解，但将预期被内源裂解以使得活性有效负载将从缀合物中释放。
一般来说，上文所描述的缀合试剂假定，交联剂与以其它方式稳定并且 惰性的基团(如胺、巯基和羧基)反应。在其它实施方案中，本发明提供了基于 用两个官能团对XTEN和有效负载进行独立修饰的不同缀合方法，这两个官 能团对生物聚合物稳定并且无活性，而一般对彼此具高度反应性。已经在点 击化学的概念下将若干正交反应分组，从而提供了XTEN-叠氮化物/炔烃反应 物，其具有良好的稳定特性并且因此特别适合作为用于随后在独立的反应中 与有效负载缀合的试剂(Kolb H.C.,Finn M.G.,Sharpless K.B.Clickchemistry: diverse chemical function from a few good reactions.(2001)Angew.Chem.Int.Ed. Engl.40(11),2004-2021)。一般来说，点击化学用作包涵涉及(1)炔烃-叠氮化物； (2)“烯”-硫醇，以及(3)醛-酰肼的反应的反应概念，并且本发明涵盖全部三种 的用途。一个实例是炔烃与叠氮化物的休斯根1,3-偶极环加成以形成图8中 所示的1,4-二取代-1,2,3-三唑。可以通过对N端α-氨基、赖氨酸的ε-氨基和 半胱氨酸的巯基进行化学修饰来将叠氮化物和炔烃部分引入到肽/蛋白质或 药物有效负载中或引入到XTEN中。表15提供了预期用于制造缀合组合物的 点击化学反应物的非限制性实例，其中预定的缀合物(和XTEN或有效负载) 的一种组分与表格的反应物1反应并且第二种组分(有效负载或XTEN)与表格 的叠氮化物反应物2反应。举例来说，使用胺反应性炔烃以炔烃部分修饰一个分子，这种胺反应性炔烃如3-炔丙氧基丙酸NHS酯、乙炔-PEG4-NHS酯、 二苯甲基环辛炔(DBCO)-NHS酯、DBCO-PEG4-NHS酯、环辛炔 (COT)-PEG2-NHS酯、COT-PEG3-NHS酯、COT-PEG4-NHS酯、COT-PEG2- 五氟苯基(PFP)酯、COT-PEG3-PFP酯、COT-PEG4-PFP酯、BCOT-PEG2-NHS酯、BCOT-PEG3-NHS酯、BCOT-PEG4-NHS酯、BCOT-PEG2-PFP酯、 BCOT-PEG3-PFP酯、BCOT-PEG4-PFP酯。或者，用巯基反应性炔烃来修饰 分子，这种巯基反应性炔烃如乙炔-PEG4-马来酰亚胺、DBCO-马来酰亚胺或 DBCO-PEG4-马来酰亚胺。用叠氮化物-PEG2-NHS酯、叠氮化物-PEG3-NHS 酯、叠氮化物-PEG4-NHS酯、叠氮化物-PEG2-PFP酯、叠氮化物-PEG3-PFP 酯、叠氮化物-PEG4-PFP酯或叠氮化物-PEG4-马来酰亚胺来修饰第二个分子。 叠氮化物和炔烃部分可以互换使用；其对生物分子和水性环境是生物独特的、 稳定的并且惰性的。当混合时，叠氮化物和炔烃反应物形成不可逆的共价键 而没有任何副反应(Moses J.E.和Moorhouse A.D.The growing applications of click chemistry.(2007)Chem.Soc.Rev.36,1249-1262；Breinbauer R.和M. Azide-alkyne coupling:apowerful reaction for bioconjugate chemistry.(2003) ChemBioChem 4(11),1147-1149；Rostovtsev V.V.,Green L.G.,Fokin V.V., Sharpless K.B.A stepwise Huisgencycloaddition process:copper(I)-catalyzed regioselective"ligation"of azidesand terminal alkynes.(2002)Angew Chem Int Ed Engl.41(14),2596-2599)。在一个实施方案中，本发明提供了包含缀合到第 二XTEN的第一XTEN的缀合物，其中第一XTEN连接到来自表15的炔烃 反应物1，第二XTEN连接到来自表15的叠氮化物反应物2，然后，第一XTEN和第二XTEN在有效地使炔烃反应物1与叠氮化物反应物2反应的条件下连 接，从而得到XTEN-XTEN缀合物。在另一个实施方案中，本发明提供了包 含缀合到有效负载的第一XTEN的缀合物，其中XTEN连接到来自表15的 炔烃反应物1，有效负载连接到来自表15的叠氮化物反应物2，然后，XTEN 和有效负载在有效地使炔烃反应物1和叠氮化物反应物2反应的条件下连接， 从而得到XTEN-有效负载缀合物。在另一个实施方案中，本发明提供了包含 缀合到有效负载的第一XTEN的缀合物，其中XTEN连接到来自表15的叠 氮化物反应物2，有效负载连接到来自表15的炔烃反应物1，然后，XTEN 和有效负载在有效地使炔烃反应物1和叠氮化物反应物2反应的条件下连接， 从而得到XTEN-有效负载缀合物。在前述实施方案中，用以实现反应的条件 是本文所描述的那些条件或本领域中已知用于缀合这些反应物的反应条件。 本发明还涵盖了前述缀合物的各种组合；例如，XTEN-XTEN缀合物，其中 XTEN被点击化学反应物连接并且其中一个XTEN进一步包含使用点击化学 缀合到XTEN的有效负载的一个或多个分子；XTEN-XTEN缀合物，其中 XTEN被点击化学反应物连接，其中一个XTEN进一步包含使用点击化学缀 合到XTEN的第一有效负载的一个或多个分子并且第二XTEN进一步包含使 用点击化学缀合到XTEN的第二有效负载的一个或多个分子。这些组合的额 外变化将为本领域的一般技术人员显而易见。
表15：炔烃和叠氮化物点击化学反应物
*可以是NHS酯或磺基-NHS酯
在一些实施方案中，XTEN-XTEN缀合物和XTEN-有效负载缀合物是使 用基于硫-烯的点击化学来缀合，这种点击化学通过称为硫醇-烯反应的自由基 反应或称为硫醇迈克尔加成的阴离子反应来进行(见图9)(Hoyle C.E.和 Bowman C.N.Thiol-ene clickchemistry.(2010)Angew.Chem.Int.第49版, 1540-1573)。特别相信，硫醇迈克尔加成更适于有效负载是蛋白质的XTEN- 有效负载缀合物(Pounder R.J.等人Metal free thiol-maleimide'Click'reaction as a mild functionalisation strategy for degradablepolymers.(2008)Chem Commun(Camb).41,5158-5160)。由于至少一个分子需要含有游离硫醇基，因 此如果有效负载不含半胱氨酸，那么可以利用经半胱氨酸工程改造的XTEN。 或者，可以通过使用硫醇化试剂对XTEN或有效负载肽/蛋白质的N端α-氨 基或赖氨酸ε-氨基进行化学修饰来引入硫醇基，这些硫醇化试剂如2-亚氨基 硫烷(特劳特氏试剂)、SATA(S-乙酰基硫代乙酸N-琥珀酰亚胺酯)、SATP(S- 乙酰基硫代丙酸N-琥珀酰亚胺酯)、SAT-PEO4-Ac(N-琥珀酰亚胺基S-乙酰基 (硫代四乙二醇))、SPDP(3-(2-吡啶二硫代)丙酸N-琥珀酰亚胺酯)、LC-SPDP (6-(3'-[2-吡啶二硫代]丙酰胺基)己酸琥珀酰亚胺酯)。这些方法在本领域中是已 知的(Carlsson J.等人(1978)Biochem.J.173,723-737；Wang D.等人(1997)Bioconjug.Chem.8,878-884；Traut R.R.等人(1973)Biochemistry 12(17), 3266-3273；Duncan,R.J.S.等人(1983)Anal.Biochem.132.68-73；美国专利号 5,708,146)。硫醇迈克尔加成反应的第二种组分需要具有缺电子碳碳双键的试 剂，如在(甲基)丙烯酸酯、马来酰亚胺、α,β-不饱和酮、富马酸酯、丙烯腈、 肉桂酸酯和巴豆酸酯中。N-马来酰亚胺通常用作巯基反应性官能团并且可以 经由使用可商购的异双官能交联剂进行N端α-氨基或Lysε-氨基修饰而引入 到有效负载蛋白质或XTEN分子中，这些交联剂如AMAS(N-(α-马来酰亚胺 基乙酰氧基)-琥珀酰亚胺酯)、BMPS(N-(β-马来酰亚胺基丙氧基)琥珀酰亚胺 酯)和上文所描述的其它交联剂。所得的分别含有游离硫醇和马来酰亚胺部分 的两个分子在温和条件下形成稳定的共价键，从而得到经马来酰亚胺连接的 XTEN-有效负载。
在其它实施方案中，XTEN-XTEN缀合物和XTEN-有效负载缀合物是利 用基于酰肼与醛之间的反应的点击化学来形成，如Ganguly等人所描述并且 如图10中所示的点击化学(Ganguly T.等人The hydrazide/hydrazone click reaction as a biomoleculelabeling strategy for M(CO)3(M＝Re,99mTc) radiopharmaceuticals.(2011)Chem.Commun.47,12846-12848)。举例来说， XTEN可以经过修饰以具有肼或酰肼，其可以与具有醛基的有效负载混合以 得到所需的XTEN-有效负载缀合物。在一个实施方案中，本发明提供了具有 在α-N端氨基或者一个或多个赖氨酸ε-氨基引入的至少一个肼或酰肼的XTEN，这些氨基经过修饰以提供适合作为用于缀合到目标有效负载的试剂的 XTEN，因为其被视为稳定的。由芳香族肼和芳香族醛形成的所得双芳基腙稳 定到92℃和2.0到10.0的宽pH值范围(Solulink,Inc.,Protein-Protein Conjugation Kit,Technical Manual,目录号S-9010-1)。反应中的离去基团是水， 并且不需要还原剂(例如，氰基硼氢化钠)来稳定键。经肼/酰肼或醛部分修饰 的分子在水性环境中具有良好的稳定性并且在没有特殊处理要求下保持活 性。XTEN分子的氨基用NHS酯/酰肼修饰，如SANH(4-肼基烟酸琥珀酰亚 胺酯丙酮腙)、C6-SANH(4-肼基烟酸C6-琥珀酰亚胺酯丙酮腙)、SHTH(4-酰 肼基对苯二甲酸琥珀酰亚胺酯盐酸盐)。在一个典型反应中，在修饰缓冲液(100 mM磷酸盐，150mM NaCl，pH 7.4)中将蛋白质制备成1-5mg/ml溶液，并且 以5到20倍摩尔过量添加修饰剂，并且反应在室温下进行2小时。独立地， 在类似条件下用NHS酯/醛SFB(4-甲酰基苯甲酸琥珀酰亚胺酯)或C6-SFB(4- 甲酰基苯甲酸C6-琥珀酰亚胺酯)来修饰有效负载分子。然后，将经修饰的分 子脱盐到缀合缓冲液(100mM磷酸盐，150mM NaCl，pH 6.0)中。使用1摩 尔当量的限制蛋白质和1.5-2摩尔当量的可以大量使用的蛋白质将所得组合 混合在一起。添加100mM苯胺于100mM磷酸盐、150mM NaCl(pH 6.0)中 的催化剂缓冲液以将苯胺的最终浓度调整到10mM，并且反应在室温下进行 2小时。
在另一个实施方案中，可以通过醛与伯氨基之间的反应，接下来用硼氢 化钠或氰基硼氢化钠还原所形成的希夫碱(Schiff base)来产生XTEN-有效负 载缀合物。作为这种方法中的第一步，使用典型的胺-NHS化学，在如0.1M 磷酸钠、0.15M NaCl(pH 7.2)的无胺偶合缓冲液中，用NHS酯/醛SFB(4-甲 酰基苯甲酸琥珀酰亚胺酯)、C6-SFB(4-甲酰基苯甲酸C6-琥珀酰亚胺酯)或 SFPA(4-甲酰基苯氧基乙酸琥珀酰亚胺酯)修饰XTEN分子，如具有一级α-氨 基的XTEN或具有ε-氨基的含Lys的XTEN。所得经修饰的醛-XTEN可以被 保持在作为XTEN-交联剂组合物的这个点，或可以被用作形成XTEN-有效负 载缀合物的试剂。为了制造XTEN-有效负载，将经修饰的醛-XTEN与具有反 应性氨基的有效负载和温和还原剂(如20-100mM氰基硼氢化钠)混合。将反 应混合物在室温下孵育至多6小时或在4℃下孵育过夜。然后，用50-500mM Tris·HCl(pH 7.4)和20-100mM氰基硼氢化钠阻断未反应的醛基，从而允许分 离经缀合、经纯化的XTEN-有效负载。
在其它实施方案中，本发明提供了包含肽或蛋白质有效负载的XTEN-有 效负载缀合物，其中有效负载是基于有效负载的肽/蛋白质C端酰基叠氮化物 的反应性而经由化学接合来缀合。举个例子，当使用固相肽合成(SPPS)用羟 甲基苯甲酸(HMBA)树脂来产生肽或蛋白质时，最终肽可以用多种亲核试剂从 树脂中裂解以得到具有多样的C端官能团的肽。在一个实施方案中，这种方 法包括肽基/蛋白质树脂的肼解以得到肽或蛋白质酰肼。然后，在稀盐酸中用 亚硝酸钠或亚硝酸叔丁酯对所得酰基酰肼进行亚硝化使得酰基叠氮化物形成。所得羰基叠氮化物(或酰基叠氮化物)是经活化的羧酸酯基(酯)，其可以与 XTEN的伯胺反应形成稳定的酰胺键，从而得到XTEN-有效负载缀合物。在 替代性实施方案中，伯胺可以是XTEN N端的α-胺或XTEN序列中经工程改 造的赖氨酸残基的一个或多个ε-胺。在缀合反应中，叠氮化物功能是离去基 团(示于图11中)。与胺基的缀合反应通过在缺电子羰基处进行亲核试剂攻击 而发生(Meienhofer,J.(1979)The Peptides:Analysis,Synthesis,Biology.第1卷, Academic Press:N.Y.；ten Kortenaar P.B.W.等人Semisynthesis ofhorse heart cytochrome c analogues from two or three fragments.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci. USA 82,8279-8283)。
在另外其它的实施方案中，本发明提供了XTEN-交联剂和XTEN-有效负 载缀合物，其中缀合是通过正交蛋白质接合来进行，其中初始的化学选择性 捕获后继之以分子内酰基重排(如图12中所示)。化学选择性捕获需要置于N 端胺的最近处的亲核试剂或亲电试剂以及也定位在C端羧酸酯的最近处的另 一种相容的亲电试剂或亲核试剂。在这个实施方案中，特别预期，XTEN可 以充当图12中的蛋白质1或蛋白质2。因此，在替代性实施方案中，XTEN 可以与适当试剂反应以在C端产生硫酯或在N端引入半胱氨酸来产生替代性 XTEN-交联剂组合物。在使用前述XTEN-交联剂缀合物制造XTEN-有效负载 中，形成酯或硫酯的亲核试剂和亲电试剂对的化学选择性捕获使得相应的反 应物的N端氨基和C端酯紧密靠近以允许自发分子内酰基转移来形成酰胺 键。大多数正交接合反应不需要保护侧链基团并且在与生物环境相容的温和 条件下发生(Tam J.P.,Xu J.,Eom K.D.Methods and strategiesof peptide ligation.(2001)Biopolymers(Peptide Science)60,194-205)。
在另一个实施方案中，缀合物可以通过被称为天然化学接合(NCL)的反应 法来形成，其涉及C端硫酯作为亲电试剂和N端半胱氨酸作为亲核试剂。这 个反应的结果是在XTEN-有效负载缀合物的接合位点处的天然酰胺键 (Dawson P.E.,Muir T.W.,Clark-Lewis I.,Kent S.B.Synthesis of proteins by native chemical ligation.(1994)Science 266,776-779；Tam J.P.；Lu Y.-A.；Liu C. F.；Shao,J.Peptide synthesisusing unprotected peptides through orthogonal coupling methods.(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,92,12485-12489；Johnson, E.C.B.；Kent,S.B.H.J.Insightsinto the mechanism and catalysis of the native chemical ligation reaction.(2006)J.Am.Chem.Soc.128,6640-6646；Kent S.B. (2009)Total chemical synthesis ofproteins.(2009)Chem.Soc.Rev.38:338-351)。 NCL反应中的C端组分(在图12中以蛋白质2示出)的第一氨基酸是半胱氨酸。 这种蛋白质可以是在第一位置处具有半胱氨酸的XTEN或通过常规的重组蛋 白质生物合成而制备的任何其它蛋白质，包括肽/蛋白质有效负载。通过化学 合成将N端组分(在图13中以有效负载示出)制备成C端硫酯。硫酯合成法的 实例在本领域中是已知并可用的，如例如以下文献中所描述的那些方法：Li X., Kawakami T.,Aimoto S.,Direct preparation of peptide thioesters using an Fmoc solid-phasemethod.(1998)Tetrahedron Lett.,39,8660-8672；Ingenito R.,Bianchi E.,FattoriD.,Pessi A.Solid-phase synthesis of peptide C-terminal thioesters by Fmoc/tBuchemistry.(1999)J.Am.Chem.Soc.,121,11369-11374；Sewing A., Hilvert D.Fmoc-compatible solid-phase peptide synthesis of long C-terminal peptidethioesters.(2001)Angew.Chem.Int.Ed.40,3395-3398；Brask J., Albericio F.,JensenK.J.,Fmoc solid-phase synthesis of peptide thioesters by masking astrithioorthoesters.(2003)Org.Lett.,2003,5,2951-2953；Ollivier N., Behr J.-B.,El-Mahdi O.,Blanpain A.,Melnyk O.Fmoc-solid-phase synthesis of peptidethioesters using an intramolecular N,S-acyl shift.(2005)Org.Lett.,7, 2647-2650。通常，α-烷基硫酯因便于制备和储存是优选的。然而，因为其相 当不起反应，所以通过用硫醇添加剂进行原位硫酯转移来催化接合反应，其 中最常用的硫醇催化剂是2-巯基乙烷磺酸盐(MESNa)或4-巯基苯乙酸 (MPAA)。化学缀合典型地在几小时内并且以高产率完成。虽然全部20种天 然氨基酸都适合作N端组分的最末残基，但对于甘氨酸和组氨酸报道了最高 接合速率，使得XTEN特别适于这个反应，因为表2的示范性的XTEN几乎 全部是甘氨酸N端多肽(Hackeng T.M.等人Protein synthesis by native chemical ligation:expanded scope by using straightforward methodology.(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96,10068-10073)。在这种缀合方法的其它实施方案中，正交接 合反应包括：(1)C端硫代酸与N端BrAla或N端氮丙啶(Tam J.P.；Lu Y.-A.；Liu C.F.；Shao,J.Peptide synthesis using unprotected peptides through orthogonal couplingmethods.(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,92,12485-12489)；(2)C端 硫代酸与N端Cys-过硫酯(Liu,C.F.,Rao,C.,Tam,J.P.(1996)Tetrahedron Lett., 37,933-936)；(3)C端硫酯与N端高半胱氨酸(Tam J.P.,Yu Q.Methionine ligation strategy in the biomimeticsynthesis of parathyroid hormones.(1998) Biopolymers 46(5),319-327)；以及(4)C端硫代酸与N端His(Zhang L.,Tam J.P. (1997)Tetrahedron.Lett.38,3-6)。在这种方法中，通过化学合成制备C端硫酯 限制了NCL反应中N端组分的尺寸。然而，使用表达蛋白质接合(EPL)方法 克服了因需要化学合成而施加的肽α-硫酯的尺寸限制(Muir T.W.；SondhiD.； Cole P.A.Expressed protein ligation:a general method for proteinengineering. (1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95,6705-6710；Muir T.W.Semisynthesisof proteins by expressed protein ligation.(2003)Annu.Rev.Biochem.72,249-289)。EPL方法是基于蛋白质剪接，在这个过程中蛋白质经历分子内重排，从而挤 出内部序列(内含肽)并连接旁侧序列(外显肽)。后一个过程涉及形成酯或硫酯 中间物。在实施本发明中，可商购的大肠杆菌(Escherichia coli)蛋白质表达载 体允许产生所关注的蛋白质，如XTEN，其与内含肽-几丁质结合域(CBD)序 列框内融合表达。在这种方法中，当前体蛋白的内含肽部分的第一半胱氨酸 残基的侧链亲核攻击上游紧邻的残基(即，例如XTEN的最末残基)的肽键时 融合蛋白质经历N-S转变以形成线性硫酯中间物(如图13中所示)。通过将蛋白质与苯硫酚(或其它硫醇催化剂，如MESNa和MPAA)和含半胱氨酸的合成 肽或蛋白质一起孵育来起始化学接合步骤。这使得原位产生例如XTEN蛋白 质的高度反应性的苯基α-硫酯衍生物，其然后与合成肽/蛋白质有效负载快速 接合以得到所需的XTEN-有效负载缀合物。在另一个实施方案中，可以在20 mM Na-HEPES(pH 8.5)、50-1000mM NaCl和1mM EDTA(可选的)中用50 mM 2-巯基乙烷磺酸(MESNa)使XTEN-硫酯中间物裂解，并且可以纯化所得 加MESNa标签的蛋白质并在-80℃下储存于5mM Bis Tris(pH 6.5)、250mM NaCl中直到用作XTEN-交联剂缀合物以作为上述缀合中的N端组分用于 NCL反应。C端组分可以是具有含N端半胱氨酸的天然或合成肽/蛋白质的有 效负载。
在另外其它的实施方案中，本发明提供了XTEN-交联剂和XTEN-有效负 载缀合物，其中XTEN与有效负载之间的缀合是通过无痕施陶丁格接合(如天 然化学接合(NCL))来进行，从而在接合位点处产生天然酰胺键。在这种方法 的一个优点中，在接合的连接点处不需要半胱氨酸(Saxon,E.；Armstrong,C.R.； Bertozzi,C.R.A"traceless"Staudingerligation for the chemoselective synthesis of amide bonds.(2000)Org.Lett.2,21412143；Nilsson,B.L.；Kiessling,L.L.； Raines,R.T.Staudinger ligation:apeptide from a thioester and azide.(2000)Org. Lett.2,1939-1941)。替代地，使用二苯基膦甲硫醇将N端蛋白质1制备成C 端硫酯(见图14)，而将C端蛋白质2制备成N端叠氮化物，这种叠氮化物可 以经由重氮转移反应来产生(Cavender C.J.；Shiner V.J.,Jr.(1972)J.Org.Chem. 22,3567-3569；Lundquist J.T.,IV,Pelletier J.C.Improvedsolid-phase peptide synthesis method utilizing alpha-azide-protected aminoacids.(2001)Org.Lett.3, 781-783)。膦残基与蛋白质2的叠氮化物反应以在消除氮之后形成亚氨基正膦 (施陶丁格反应(Staudinger reaction))。具有高度亲核的氮原子的所得亚氨基正 膦也可以被视为氮叶立德(aza-ylide)。氮叶立德的亲核氮原子然后攻击蛋白质1的羰基，从而使硫酯裂解。特别打算，XTEN或有效负载可以是这个反应中 的蛋白质1或蛋白质2。重排的XTEN-有效负载产物的水解最终产生天然酰 胺并且以氧化膦(V)的形式释放膦组分。双(对二甲基氨乙基苯基)膦基甲硫醇， 二苯基膦甲硫醇的水溶性变体，介导等摩尔浓度的底物在水中快速接合(Tam, A.；Soellner,M.B.；Raines,R.T.Water-solublephosphinothiols for traceless Staudinger ligation and integration withExpressed Protein Ligation.(2007)J.Am. Chem.Soc.,129,1142111-430)。
在另一个实施方案中，本发明提供了通过酶促接合制备的XTEN-有效负 载缀合物。转谷氨酰胺酶是催化有效负载肽或蛋白质的谷氨酰胺的γ-甲酰胺 基与经赖氨酸工程改造的XTEN中的赖氨酸的ε-氨基之间形成异肽键的酶， 由此在XTEN与有效负载之间形成分子间或分子内交联(见图15)，从而得到 组合物(Lorand L,ConradS.M.Transglutaminases.(1984)Mol.Cell Biochem. 58(1-2),9-35)。已经成功地用于接合的酶的非限制性实例是因子XIIIa (Schense J.C.,Hubbell J.A.Cross-linkingexogenous bifunctional peptides into fibrin gels with factor XIIIa.(1999)Bioconjug.Chem.10(1):75-81)和组织转谷氨 酰胺酶(Collier J.H.,MessersmithP.B.Enzymatic modification of self-assembled peptide structures with tissuetransglutaminase.(2003)Bioconjug.Chem.14(4), 748-755；Davis N.E.,Karfeld-Sulzer L.S.,Ding S.,Barron A.E.Synthesis and characterization of a new classof cationic protein polymers for multivalent display and biomaterialapplications.(2009)Biomacromolecules 10(5),1125-1134)。已知 谷氨酰胺底物序列GQQQL对组织转谷氨酰胺酶具有高度特异性(Hu B.H., Messersmith P.B.Rationaldesign of transglutaminase substrate peptides for rapid enzymatic formationof hydrogels.(2003)J.Am.Chem.Soc.125(47), 14298-14299)。组织转谷氨酰胺酶序列特异性对于酰基接受体(赖氨酸)相比酰 基供体(谷氨酰胺)来说不太严格(Greenberg C.S.,Birckbichler P.J.,Rice R.H. Transglutaminases:multifunctional cross-linkingenzymes that stabilize tissues. (1991)FASEB J.1991,5,3071-3077)。
在酶促形成的XTEN-有效负载组合物的一个替代性实施方案中，来自金 黄色葡萄球菌的分选酶A转肽酶用于催化蛋白质1的苏氨酸与甘氨酸残基之 间的短的5-氨基酸识别序列LPXTG裂解，并且随后将酰基片段转移到蛋白 质1的N端寡聚甘氨酸亲核试剂(见图16)。通过使蛋白质2官能化以含有寡 聚甘氨酸，可能以位点特异性方式酶促缀合两种蛋白质，从而得到所需的X TEN-有效负载组合物。带有分选酶识别位点(LPXTG)的(多)肽可以容易地使 用标准分子生物克隆方案来制成。适宜将谷氨酸引入到识别位点的X位置处， 因为这个残基通常在分选酶A的天然底物中发现(Boekhorst J.,de Been M. W.,KleerebezemM.,Siezen R.J.Genome-wide detection and analysis of c ell wall-bound proteinswith LPxTG-like sorting motifs.(2005)J.Bacteriol. 187,4928-4934)。高水平的酰基转移可以通过将分选酶裂解位点置于底物的 C端(Popp M.W.,Antos J.M.,GrotenbregG.M.,Spooner E.,Ploegh H.L.So rtagging:A versatile method for proteinlabeling.(2007)Nat.Chem.Biol.3 11,707-708)和柔性环中(Popp M.W.,Artavanis-Tsakonas K.,Ploegh H.L.Sub strate filtering by the active-site crossover loopin UCHL3revealed by sorta gging and gain-of-function mutations.(2009)J.Biol.Chem.284(6),3593-36 02)来实现。对于在C端标记的蛋白质来说，重要的是，最小LPETG标签中 的甘氨酸并非置于C端；其必须在具有至少一个其它的C端氨基酸的肽键中。另外，通过将额外的甘氨酸添加到裂解位点的C端以得到LPETGG来实现较 佳的连接(PritzS.,Wolf Y.,Kraetke O.,Klose J.,Bienert M.,Beyermann M.Synthesis ofbiologically active peptide nucleic acid-peptide conjugates b y sortase-mediated ligation.(2007)J.Org.Chem.72,3909-3912；Tanaka T., Yamamoto T.,Tsukiji S.,Nagamune T.Site-specific protein modification o n living cellscatalyzed by sortase.(2008)Chembiochem 95,802-807)。与分 选酶介导的肽基转移相容的亲核试剂具有含游离氨基端的甘氨酸残基的延伸 段的单一结构要求。成功的肽基转移可以使用在任何地方含有一个到五个甘 氨酸的亲核试剂来实现；然而，在一个优选的实施方案中，当存在两个或三 个甘氨酸时获得最大反应速率。
虽然已经在蛋白质-蛋白质缀合方面描述了缀合化学的各种实施方案，但 特别打算，在实施本发明中，XTEN-有效负载缀合物的有效负载部分可以是 在适用于目标小分子药物中所存在的官能团(如胺、巯基、羧基)的那些缀合方 法中的小分子药物。本领域的一般技术人员应了解，与官能团通常限于氨基、 巯基和羧基的蛋白质和肽相比可以应用甚至更广泛的化学技术。药物有效负 载可以通过官能团缀合到XTEN，这些官能团包括(但不限于)伯氨基、氨氧基、 酰肼、羟基、硫醇、硫醇酯、琥珀酸酯(SUC)、琥珀酸琥珀酰亚胺酯(SS)、丙 酸琥珀酰亚胺酯(SPA)、丁酸琥珀酰亚胺酯(SBA)、羧甲基琥珀酰亚胺(SCM)、 苯并三唑碳酸酯(BTC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、碳酸对硝基苯酯(NPC)。 药物分子有效负载的其它适合的反应官能团包括缩醛、醛(例如，乙醛、丙醛 和丁醛)、水合醛、烯基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、活性砜、酰 基卤、异氰酸酯、异硫氰酸酯、马来酰亚胺、乙烯基砜、二硫吡啶、乙烯基 吡啶、碘乙酰胺、环氧化物、乙二醛、二酮、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯和三氟 乙基磺酸酯。
在另一个实施方案中，药物有效负载还可以使用杂环环系统缀合到 XTEN-交联剂缀合物，在这种环系统中一个或多个环原子是杂原子，例如氮、 氧、磷或硫原子。杂环基团包含至少1个到多达20个碳原子和1个到3个选 自N、O、P和S的杂原子。在这个实施方案中，杂环可以是具有3到7个环 成员(2到6个碳原子和1到3个选自N、O、P和S的杂原子)的单环，或具 有7到10个环成员(4到9个碳原子和1到3个选自N、O、P和S的杂原子) 的双环，例如：双环[4,5]、[5,5]、[5,6]或[6,6]系统。杂环描述于Paquette,Leo A."Principles of ModernHeterocyclic Chemistry",W.A.Benjamin,New York, (1968)；"The Chemistry ofHeterocyclic Compounds,A series of Monographs" (John Wiley&Sons,New York,1950至今)，特别是第13卷、第14卷、第16 卷、第19卷和第28卷中。可以见于适合缀合的药物中的杂环的非限制性实 例包括吡啶基、二氢吡啶基、四氢吡啶基(哌啶基)、噻唑基、四氢苯硫基、硫 氧化的四氢苯硫基、嘧啶基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、 四唑基、苯并呋喃基、噻萘基(thianaphthalenyl)、吲哚基、吲哚烯基(indolenyl)、 喹啉基、异喹啉基、苯并咪唑基、哌啶基、4-哌啶酮基、吡咯烷基、2-吡咯烷 酮基、吡咯啉基、四氢呋喃基、双四氢呋喃基、四氢吡喃基、双四氢吡喃基、 四氢喹啉基、四氢异喹啉基、十氢喹啉基、八氢异喹啉基、吖辛因基(azocinyl)、 三嗪基、6H-1,2,5-噻二嗪基、2H,6H-1,5,2-二噻嗪基、噻吩基、噻蒽基、吡喃 基、异苯并呋喃基、色烯基、呫吨基、吩恶噻基、2H-吡咯基、异噻唑基、异恶唑基、吡嗪基、哒嗪基、吲哚嗪基、异吲哚基、3H-吲哚基、1H-吲唑基、 嘌呤基、4H-喹嗪基、酞嗪基、萘啶基、喹喔啉基、喹唑啉基、噌啉基、蝶啶 基、4Ah-咔唑基、咔唑基、β-咔啉基、菲啶基、吖啶基、嘧啶基、菲咯啉基、 吩嗪基、吩噻嗪基、呋呫基、吩恶嗪基、异色满基、色满基、咪唑烷基、咪 唑啉基、吡唑烷基、吡唑啉基、哌嗪基、吲哚啉基、异吲哚啉基、奎宁环基、 吗啉基、恶唑烷基、苯并三唑基、苯并异恶唑基、羟吲哚基、苯并恶唑啉基 和靛红酰基(isatinoyl)。
在具有药物作为有效负载的XTEN-有效负载缀合物的一些实施方案中， 药物分子通过具有用于结合到药物和XTEN的两个反应位点的交联剂附接到 经赖氨酸工程改造或经半胱氨酸工程改造的XTEN(如表3的序列)。优选的 交联剂基团是在循环中对水解相对稳定，是生物可降解的并且当从缀合物中 裂解时无毒的那些基团。另外，交联剂的使用可以提供在药物与XTEN之间 具有甚至更大的柔性的缀合物的潜力，或在药物与XTEN之间提供足够的空 间以使得XTEN不会干扰药效团与其结合位点之间的结合。在一个实施方案 中，交联剂具有反应位点，这个反应位点具有对XTEN上所存在的亲核基团 具反应性的亲电基团。优选的亲核试剂包括硫醇、硫醇酯和伯胺。经赖氨酸 工程改造或经半胱氨酸工程改造的XTEN的亲核基团的杂原子对交联剂上的 亲电基团具反应性，并且与交联剂单元形成共价键，从而得到XTEN-交联剂 缀合物。适用于交联剂的亲电基团包括(但不限于)马来酰亚胺和卤乙酰胺基 团，并且提供了用于附接到XTEN的适宜位点。在另一个实施方案中，交联剂具有反应位点，这个反应位点具有对药物上所存在的亲电基团具反应性的 亲核基团，以使得缀合可以在XTEN-交联剂与有效负载药物之间发生，从而 得到XTEN-药物缀合物。在药物上适用的亲电基团包括(但不限于)羟基、硫 醇、醛、烯烃、烷烃、叠氮化物和酮羰基。交联剂的亲核基团的杂原子可以 与药物上的亲电基团反应并且形成共价键。在交联剂上适用的亲核基团包括 (但不限于)酰肼、肟、氨基、肼、缩氨基硫脲、羧酸肼和芳基酰肼。药物上的亲电基团提供了用于附接到交联剂的适宜位点。
在一个特定实施方案中，药物与经赖氨酸工程改造的主题XTEN的赖氨 酸ε-氨基的缀合利用了反应性药物-N-羟基琥珀酰亚胺反应物，或如药物-丙 酸琥珀酰亚胺酯或药物-丁酸琥珀酰亚胺酯的酯，或其它药物-琥珀酰亚胺缀合 物。或者，经赖氨酸工程改造的主题XTEN的赖氨酸残基可以用于通过与2- 亚氨基硫烷反应而引入游离巯基。或者，经赖氨酸工程改造的主题XTEN的 靶向物质赖氨酸可以连接到具有可用于与活性药剂缀合的游离酰肼或醛基的 异双官能试剂。反应性酯可以在生理pH下缀合，但反应性较低的衍生物典型地需要较高的pH值。如果正在使用不稳定的蛋白质有效负载，那么还可 以采用低温。在低温条件下，较长的反应时间可以用于缀合反应。
在另一个特定实施方案中，本发明提供了与经赖氨酸工程改造的主题 XTEN的赖氨酸残基进行氨基缀合的XTEN-有效负载缀合物，其中通过N端 氨基酸的α-氨基的pKa值(约7.6到8.0)与赖氨酸的ε-氨基的pKa(约10)之间 的差异来促进缀合。末端氨基的缀合常常采用反应性药物-醛(如药物-丙醛或 药物-丁醛)，其对胺更敏感并且因此不太可能与例如组氨酸的咪唑基反应。另 外，氨基残基与琥珀酸酐或其它羧酸酐反应，或与碳酸N,N′-二琥珀酰亚胺酯 (DSC)、N,N′-羰基二咪唑(CDI)或氯甲酸对硝基苯酯反应，分别得到经活化的 碳酸琥珀酰亚胺酯、咪唑氨基甲酸酯或碳酸对硝基苯酯。用这些试剂衍生化 具有逆转赖氨酰基残基的电荷的作用。药物-醛与主题XTEN的末端氨基的缀 合典型地在一定pH下实行的适合缓冲液中进行，这个pH允许利用赖氨酸残 基的ε-氨基与蛋白质的N端残基的α-氨基之间的pKa差异。在这个实施方案 的方法中，偶合反应使用了在约pH 7至约8的范围内的pH。适用于缀合赖 氨酸ε-氨基的方法已经描述于美国专利号4,904,584和美国专利号6,048,720 中。
本领域的一般技术人员应知晓，将要在形成XTEN-有效负载缀合物中使 用的活化方法和/或缀合化学取决于XTEN多肽的反应基团以及药物部分的官 能团(例如，氨基、羟基、羧基、醛、巯基、烯烃、烷烃、叠氮化物等)、药物 -交联剂反应物的官能团或XTEN-交联剂反应物的官能团。药物缀合可以针对 与经工程改造的XTEN多肽上的所有可用的连接基团，例如所并入的半胱氨 酸残基或赖氨酸残基上的特定的经工程改造的连接基团进行缀合。为了控制 反应物以使得缀合针对适当反应位点，本发明涵盖了在缀合反应期间使用保 护基。“保护基”是防止或阻断分子中的特定化学反应官能团在某些反应条件 下反应的部分。保护基将视被保护的化学反应基团的类型以及将要采用的反 应条件，以及分子中额外反应基团的存在而变化。可以被保护的官能团的非 限制性实例包括羧酸基、羟基、氨基、硫醇基和羰基。羧酸和羟基的代表性 保护基包括酯(如对甲氧基苯甲酯)、酰胺和酰肼；对于氨基来说，是氨基甲酸 酯(如叔丁氧羰基)和酰胺；对于羟基来说，是醚和酯；对于硫醇基来说，是硫 醚和硫酯；对于羰基来说，是缩醛和缩酮；等等。这些保护基为本领域的技 术人员所熟知，并且描述于例如T.W.Greene和G.M.Wuts,Protecting Groups in OrganicSynthesis,第三版,Wiley,New York,1999和其中所引用的参考文献 中。缀合可以一步实现或以逐步方式实现(例如，如WO 99/55377中所描述)， 如通过添加反应中间物交联剂，使用本文所公开的交联剂或本领域中已知适 用于缀合到将要与药物分子上的反应官能团连接的多肽的半胱氨酸或赖氨酸 残基的那些交联剂。
在本发明的一些实施方案中，将交联剂缀合到经半胱氨酸工程改造的 XTEN的方法可以提供，用如二硫苏糖醇(DTT)的还原剂预处理XTEN以还原 任何半胱氨酸二硫化物残基，从而形成高度亲核的半胱氨酸硫醇基(-CH2SH)。 随后通过任何常规的方法，例如通过脱盐来去除还原剂。根据例如Klussman 等人(2004)Bioconjugate Chemistry 15(4),765-773的缀合方法，经还原的 XTEN由此与药物-接头化合物或具有亲电官能团(如马来酰亚胺或α-卤羰基) 的交联试剂反应。交联剂或药物与半胱氨酸残基的缀合典型地在从4℃到 25℃之间变化的温度下于pH 6-9的适合缓冲液中进行至多约16小时的时段。 或者，可以对半胱氨酸残基进行衍生化。适合的衍生化剂和方法在本领域中 是众所周知的。举例来说，半胱氨酰基残基最通常与α-卤乙酸酯(和对应的胺)， 例如碘乙酸或碘乙酰胺反应，得到羧甲基或羧酰胺基甲基衍生物。半胱氨酰 基残基还通过与溴三氟丙酮、α-溴-β-(4-咪唑基)丙酸、氯乙酰基磷酸酯、N- 烷基马来酰亚胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物、甲基2-吡啶基二硫化物、对氯 汞苯甲酸酯、2-氯汞基-4-硝基苯酚或氯-7-硝基苯并-2-恶-1,3-二唑反应进行衍 生化。
在一些情况下，缀合是在目的在于使尽可能多的可用的XTEN连接基团 与药物或药物-接头分子反应的条件下进行。这是借助于相对于多肽适当摩尔 过量的药物来实现。经活化的药物或药物-接头分子与多肽的典型摩尔比是至 多约1000-1，例如至多约200-1或至多约100-1。然而，在一些情况下，比率 可能稍低，例如至多约50-1、10-1或5-1。还可以使用等摩尔比。
在这些实施方案中，本公开的XTEN-有效负载缀合物与未连接到XTEN 的对应的有效负载相比保留至少一部分药理活性。在一个实施方案中，XTEN- 有效负载保留未连接到XTEN的有效负载的至少约1％、或至少约5％、或至 少约10％、或至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、 或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％、或至少约95％ 的药理活性。
在一个实施方案中，XTEN-有效负载缀合物可以经过设计以在体内通过 接头的非特异性或酶促水解，包括二硫键还原、pH依赖性释放，或用外源或 内源蛋白酶(包括表9的蛋白酶)来释放有效负载。大分子可以经由受体介导的 内吞、吸附内吞或液相内吞而被细胞吸收(Jain R.K.Transport of molecules across tumor vasculature.(1987)CancerMetastasis Rev.6(4),559-593；Jain R.K.Transport of molecules,particles,andcells in solid tumors.(1999)An n.Rev.Biomed.Eng.1,241-263；Mukherjee S.,GhoshR.N.,Maxfield F.R. Endocytosis.(1997)Physiol.Rev.77(3),759-803)。在细胞吸收XTEN-有效负 载后，有效负载可以由核内体(pH 5.0-6.5)和溶酶体(pH 4.5-5.0)中的低pH值， 以及由溶酶体酶(例如，酯酶和蛋白酶)释放。酸敏性交联剂的实例是可以偶合 到带硫醇载体的6-马来酰亚胺基己酰腙。腙接头在小于5的pH值下快速裂 解，从而允许在缀合物内化之后在酸性pH的核内体和溶酶体中释放有效负 载(Trail P.A.等人Effect oflinker variation on the stability,potency,and eff icacy of carcinoma-reactiveBR64-doxorubicin immunoconjugates.(1997)Ca ncer Res.57(1),100-105；Kratz F.等人Acute and repeat-dose toxicity studi es of the(6-maleimidocaproyl)hydrazonederivative of doxorubicin(DOXO-E MCH),an albumin-binding prodrug of theanticancer agent doxorubicin.(20 07)Hum.Exp.Toxicol.26(1),19-35)。临床上批准的mAb-药物缀合物吉妥珠 单抗奥唑米星(gemtuzumab ozogamicin；MylotargTM)是含有化学连接到细胞毒 性抗生素剂卡奇霉素的针对CD33的人源化mAb P67.6的药物-抗体缀合物。在抗体与药物之间的接头并入有两个不稳定键：腙和位阻二硫化物。已经显 示，酸敏性腙键是实际裂解位点(Jaracz S.,Chen J.,Kuznetsova L.V.,Ojima I.Recent advances intumor-targeting anticancer drug conjugates.(2005)Bio org.Med.Chem.13(17),5043-5054)。
对于有效负载经二硫键连接的那些XTEN-有效负载缀合物来说，有效负 载可以通过还原不稳定接头内的二硫键而从XTEN中释放。举例来说，huN9 01-DM1是由ImmunoGen,Inc.开发的用于治疗小细胞肺癌的肿瘤活化的免疫 治疗性前药。这种前药由与微管抑制剂类美登素DM1缀合的人源化抗CD56 mAb(huN901)组成。平均3.5-3.9个DM1分子经由受阻二硫键结合到每个 抗体。尽管二硫化物连接在血液中是稳定的，但其在进入huM901靶向的细 胞时快速裂解，由此释放活性DM1(Smith S.V.Technology evaluation:huN 901-DM1,ImmunoGen.(2005)Curr.Opin.Mol.Ther.7(4),394-401)。DM1 还偶合到MillenniumPharmaceuticals MLN-591，一种抗前列腺特异性膜抗原 mAb。DM1经由受阻二硫键连接到抗体，这个受阻二硫键提供了血清稳定性， 同时在内化时允许细胞内药物释放(HenryM.D.等人A prostate-specific me mbrane antigen-targeted monoclonal antibody-chemotherapeutic conjugate desi gned for the treatment of prostate cancer.(2004)Cancer Res.64(21),7995- 8001)。
有效负载从载体XTEN中的释放可以通过使用短的可裂解肽作为有效负 载与XTEN之间的接头形成组合物来实现。临床上评定的缀合物的实例是阿 霉素-HPMA(N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺)缀合物，其中阿霉素经其氨基糖通 过四肽间隔子GlyPheLeuGly连接到HPMA共聚物，这个四肽间隔子用溶酶 体蛋白酶，如组织蛋白酶B裂解(Vasey P.A.等人Phase I clinical and pharm acokinetic study of PK1[N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide copolymer dox orubicin]:first member of a new class ofchemotherapeutic agents-drug-poly mer conjugates.(1999)Clin.Cancer Res.5(1),83-94)。达到临床开发阶段的 具有肽接头的载体-药物缀合物的其它实例是大分子铂络合物。两种基于HP MA的药物候选物由络合氨基丙二酸铂络合物经组织蛋白酶B-可裂解肽间隔 子GlyPheLeuGly或三肽间隔子GlyGlyGly结合的HPMA共聚物骨架组成(Ra demaker-Lakhai J.M.等人A Phase I and pharmacological study of the plati num polymerAP5280given as an intravenous infusion once every 3 weeks in patients withsolid tumors.(2004)Clin.Cancer Res.10(10),3386-3395； Sood P.等人Synthesis andcharacterization of AP5346,a novel polymer-link ed diaminocyclohexyl platinumchemotherapeutic agent.(2006)Bioconjugate Chem.17(5),1270-1279)。
开发了高度选择性的方法以经由前列腺特异性抗原(PSA)蛋白酶靶向前 列腺癌，这种蛋白酶几乎排他地在前列腺组织和前列腺癌中表达。合成了太 平洋紫杉醇的新颖的白蛋白结合前药，EMC-ArgSerSerTyrTyrSerLeu-PABC- 太平洋紫杉醇(EMC：ε-马来酰亚胺基己酰基；PABC：对氨基苯甲氧羰基)。 这种前药是水溶性的并且结合到内源和外源白蛋白。前药的白蛋白结合形式 用PSA裂解，从而释放太平洋紫杉醇-二肽Ser-Leu-PABC-太平洋紫杉醇。由 于并入了PABC自消除接头，这种二肽容易被降解以释放太平洋紫杉醇作为最终裂解产物(Elsadek B.等人Development of a novel prodrug of paclitaxel thatis cleaved by prostate-specific antigen:an in vitro and in vivo evaluat ionstudy.(2010)Eur.J.Cancer 46(18),3434-3444)。
自消型间隔子由于其在药物递送系统中的效用而得到了相当大的关注。 若干报道描述了线性自消除系统或树枝状聚合结构，其可以经由以单一裂解 事件起始的类多米诺链片段化来释放其所有单元(Haba K.等人 Single-triggered trimeric prodrugs.(2005)Angew.Chem.,Int.Ed.44,716-720； Shabat D.Self-immolative dendrimers asnovel drug delivery platforms.(2006)J. Polym.Sci.,Part A:Polym.Chem.44,1569-1578；Warnecke A.,Kratz F. 2,4-Bis(hydroxymethyl)aniline as a building blockfor oligomers with self-eliminating and multiple release properties.(2008)J.Org.Chem.73, 1546-1552；Sagi A.等人Self-immolative polymers.(2008)J.Am.Chem.Soc.130, 5434-5435)。在一项研究中，设计并合成了具有抗癌剂喜树碱的四个分子和 PEG5000的两个分子的自消型树枝状前药。这种前药在生理条件下用青霉素 G酰胺酶有效地活化，并且将游离喜树碱释放到反应介质中以使细胞生长受 抑制(Gopin A.等人Enzymatic activation of second-generation dendritic prodrugs:conjugation ofself-immolative dendrimers with poly(ethylene glycol) via click chemistry.(2006)Bioconjugate Chem.17,1432-1440)。并入了用过度表 达于肿瘤细胞中的蛋白酶裂解的特异性酶底物可以产生高效的癌细胞特异性 树枝状前药活化系统。可用蛋白酶裂解的间隔序列的非限制性实例列在表9 中。
在一些实施方案中，本发明提供了XTEN-有效负载构型，包括二聚、三 聚、四聚和更高级的缀合物，其中有效负载是使用如上文所描述的不稳定接 头附接到XTEN。在前述的一个实施方案中，组合物进一步包括靶向组分以 将组合物递送到经靶向的细胞上的配体或受体。在另一个实施方案中，本发 明提供了缀合物，其中一个、两个、三个或四个XTEN-有效负载组合物用不 稳定接头缀合到抗体或抗体片段，从而提供可溶性组合物用于临床适应症的 靶向疗法，例如(但不限于)对肿瘤和其它癌症的各种治疗，其中抗体提供靶向 组分，然后，当在靶细胞内内化时，不稳定接头允许XTEN-有效负载从组合 物脱离并且实现预定的活性(例如，在肿瘤细胞中的细胞毒性)。因此，本发明 组合物是免疫缀合物的一种类型。
XTEN的非结构化特征以及均匀组成和电荷产生了可以在缀合反应之后 用于XTEN-有效负载缀合物的纯化的特性。特定的效用是通过离子交换捕获 XTEN缀合物，其允许去除未反应的有效负载和有效负载衍生物。特定的效 用是通过疏水相互作用色谱(HIC)捕获缀合物。大多数XTEN多肽由于其亲水 性质而显示出与HIC树脂的低结合性，这由于有效负载与柱材料之间的疏水 相互作用而有助于捕获XTEN-有效负载缀合物，并且有助于其与在缀合过程 中未能缀合到有效负载的未经缀合的XTEN分离。XTEN和XTEN-有效负载 缀合物的高纯度与大多数化学或天然聚合物，特别是经聚乙二醇化的有效负 载相比提供了显著的益处。大多数化学和天然聚合物是通过无规或半无规聚 合而产生，这使得产生了许多同系物。这些聚合物可以通过各种方法来分级 以增加产物中目标实体的分数。然而，甚至在富集之后，天然聚合物和其有 效负载缀合物的大多数制剂也含有少于10％的目标实体。具有G-CSF的PEG 缀合物的实例已经描述于[Bagal,D.等人(2008)Anal Chem,80:2408-18]中。 这个出版物显示了，甚至经批准用于治疗用途的PEG缀合物也含有大于100 种同系物，这些同系物与至少10％的目标实体的浓度一起出现。
无规聚合物(如PEG)的复杂性是在缀合和纯化期间监控和质量控制的重 大阻碍。相比之下，通过本文所描述的方法纯化的XTEN具有高水平的纯度 和均匀性。另外，如本文所描述而形成的缀合物常规上含有大于约80％、90％、 91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的预定目标并且呈 预定构型，从而易于解译质谱和色谱图。
2.单体XTEN-交联剂和XTEN-有效负载构型
在另一个方面，本发明提供了具有单一XTEN的XTEN-交联剂缀合物和 XTEN-有效负载缀合物，其中缀合物被设计成不同的构型。这些缀合物的示 范性的构型如下。
在一个实施方案中，本发明提供了一种缀合物，其具有式IV的构型：
其中就各次出现独立而言：CL1是交联剂；x是1至约100、或1至约 50、或1至约40、或1至约20、或1至约10、或1至约5的整数，或是9， 或是3，或是2，或是1；并且XTEN是与选自表2和3中所阐述的序列的组 的序列具有至少约80％、或至少约90％、或至少约91％、或至少约92％、或 至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％、或具有100％的序列同一性的序列。在式IV 的缀合物的一个实施方案中，CL1是选自表13的交联剂。在式IV的缀合物 的另一个实施方案中，x具有前述范围并且表13的交联剂连接到XTEN的每 个半胱氨酸的硫。在式IV的缀合物的另一个实施方案中，x具有前述范围并 且交联剂连接到XTEN的每个赖氨酸的ε-氨基。在式IV的缀合物的另一个 实施方案中，x是1并且表13的交联剂连接到XTEN的N端氨基。本领域的 技术人员应了解，包含使用指定组分缀合到XTEN的交联剂的前述实施方案 的组合物代表个别反应物的反应产物并且因此不同于反应物的精确组成。在 另一个实施方案中，本发明提供了式IV的缀合物的制剂，其中缀合物的制剂 的至少约80％、或至少约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、 或至少约94％、或至少约95％的XTEN分子具有相同的序列长度。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种缀合物，其具有式V的构型：
其中就各次出现独立而言：CL1是交联剂；x是1至约100、或1至约50、 或1至约40、或1至约20、或1至约10、或1至约5的整数，或是9，或是 3，或是2，或是1；CL2是不同于CL1的交联剂；y是1至约100、或1至约 50、或1至约40、或1至约20、或1至约10、或1至约5的整数，或是9， 或是3，或是2，或是1，其限制条件为x+y≥2；并且XTEN是与选自表2 和3中所阐述的序列的组的序列具有至少约80％、或至少约90％、或至少约 91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至 少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％、或具有100％的 序列同一性的序列。在式V的缀合物的一个实施方案中，CL1和CL2各自选 自表13中所阐述的交联剂的组。在式V的缀合物的一个实施方案中，x具有 前述范围并且每个CL1连接到XTEN的每个赖氨酸的ε-氨基，并且y具有前 述范围并且每个CL2连接到XTEN的每个半胱氨酸的硫基。在式V的缀合物 的另一个实施方案中，x是1并且CL1连接到XTEN的N端氨基并且每个CL2连接到XTEN的半胱氨酸的硫基。本领域的技术人员应了解，包含使用指定 组分缀合到XTEN的交联剂的前述实施方案的组合物代表反应物的反应产物并且因此不同于反应物的精确组成。在另一个实施方案中，本发明提供了式 V的缀合物的制剂，其中缀合物的制剂的至少约80％、或至少约90％、或至 少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％的 XTEN分子具有相同的序列长度。
在另一个方面，本发明提供了具有规定构型的XTEN-有效负载缀合物。 本发明利用了有效负载的反应性分子可以通过化学反应而连接的本文所描述 的反应性XTEN-交联剂缀合伴侣组合物。
在一个实施方案中，本发明提供了一种缀合物，其具有式VI的构型：
其中就各次出现独立而言：PR1是有效负载的单原子残基，其中这个残基 选自由碳、氮、氧和硫组成的组；CL1是交联剂；x是1至约100、或1至约 50、或1至约40、或1至约20、或1至约10、或1至约5的整数，或是3， 或是2，或是1；并且XTEN是与选自表2和3中所阐述的序列的组的序列具 有至少约80％、或至少约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、 或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、 或至少约99％、或具有100％的序列同一性的序列。在式VI的缀合物的一个 实施方案中，有效负载的单原子残基是来自选自由表11、12、18、19和21 中所阐述的有效负载组成的组的有效负载。在式VI的缀合物的一个实施方案 中，CL1是选自表13的交联剂。在式VI的缀合物的一个实施方案中，每个 交联剂连接到XTEN的半胱氨酸的硫。在式VI的缀合物的另一个实施方案 中，每个交联剂连接到XTEN的赖氨酸的ε-氨基。在式VI的缀合物的另一 个实施方案中，x是1并且交联剂连接到XTEN的N端氨基。在式VI的缀合 物的另一个实施方案中，CL1是选自表15的第一和第二点击化学反应物的反 应产物。在另一个实施方案中，本发明提供了式VI的缀合物的制剂，其中缀 合物的制剂的至少约80％、或至少约90％、或至少约91％、或至少约92％、 或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％的XTEN分子具有相同的序列 长度。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种缀合物，其具有式VII的构型：
其中就各次出现独立而言：P1选自由表11、12、18、19和21中所阐述 的有效负载组成的组的有效负载；CL1是交联剂；x是1至约100、或1至约 50、或1至约40、或1至约20、或1至约10、或1至约5的整数，或是9， 或是3，或是2，或是1；并且XTEN是与选自表2和3中所阐述的序列的组 的序列具有至少约80％、或至少约90％、或至少约91％、或至少约92％、或 至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、 或至少约98％、或至少约99％、或具有100％的序列同一性的序列。在式VII 的缀合物的一个实施方案中，CL1是选自表13的交联剂。在式VII的缀合物 的一个实施方案中，每个交联剂连接到XTEN的半胱氨酸的硫。在式VII的 缀合物的另一个实施方案中，每个交联剂连接到XTEN的赖氨酸的ε-氨基。 在式VII的缀合物的另一个实施方案中，x是1并且交联剂连接到XTEN的N 端氨基。在一个实施方案中，式VII的缀合物选自由表21中所阐述的缀合物 组成的组。在式VII的缀合物的另一个实施方案中，CL1是选自表15的第一 和第二点击化学反应物的反应产物。本领域的技术人员应了解，包含使用指 定组分缀合到XTEN-交联剂的有效负载的前述实施方案的组合物代表反应物 的反应产物并且因此不同于反应物的精确组成。在另一个实施方案中，本发 明提供了式VII的缀合物的制剂，其中缀合物的制剂的至少约80％、或至少 约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或 至少约95％的XTEN分子具有相同的序列长度。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种缀合物，其具有式VIII的构型：
其中就各次出现独立而言：PR1是有效负载的单原子残基，其中这个残基 选自由碳、氮、氧和硫组成的组；PR2是有效负载的单原子残基，其中这个残 基选自由碳、氮、氧和硫组成的组；CL1是交联剂；x是1至约100、或1至 约50、或1至约40、或1至约20、或1至约10、或1至约5的整数，或是 9，或是3，或是2，或是1；CL2是不同于CL1的交联剂；y是1至约100、 或1至约50、或1至约40、或1至约20、或1至约10、或1至约5的整数， 或是9，或是3，或是2，或是1，其限制条件为x+y≥2；并且XTEN是与 选自表2和3中所阐述的序列的组的序列具有至少约80％、或至少约90％、 或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、 或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％、或具有100％ 的序列同一性的序列。在式VIII的缀合物的一个实施方案中，有效负载的单 原子残基是来自选自由表11、12、18、19和21中所阐述的有效负载组成的 组的有效负载。在式VIII的缀合物的一个实施方案中，CL1和CL2各自选自 表13中所阐述的交联剂的组。在式VIII的缀合物的一个实施方案中，每个 CL1连接到XTEN的赖氨酸的ε-氨基并且每个CL2连接到XTEN的半胱氨酸的硫。在式VIII的缀合物的另一个实施方案中，x是1并且CL1连接到XTEN 的N端氨基并且CL2连接到XTEN的半胱氨酸的硫或赖氨酸的ε-氨基。在式 VIII的缀合物的另一个实施方案中，CL1是选自表15的第一和第二点击化学 反应物的反应产物。在式VIII的缀合物的另一个实施方案中，C2是选自表15 的第一和第二点击化学反应物的反应产物。在另一个实施方案中，本发明提 供了式VIII的缀合物的制剂，其中缀合物的制剂的至少约80％、或至少约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至 少约95％的XTEN分子具有相同的序列长度。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种缀合物，其具有式IX的构型：
其中就各次出现独立而言：P1选自由表11、12、18、19和21中所阐述 的有效负载组成的组的有效负载；P2选自由表11、12、18、19和21中所阐 述的有效负载组成的组并且不同于P1的有效负载；CL1是交联剂；x是1至 约100、或1至约50、或1至约40、或1至约20、或1至约10、或1至约5 的整数，或是9，或是3，或是2，或是1；CL2是不同于CL1的交联剂；y是 1至约100、或1至约50、或1至约40、或1至约20、或1至约10、或1至 约5的整数，或是9，或是3，或是2，或是1，其限制条件为x+y≥2；并 且XTEN是与选自表2和3中所阐述的序列的组的序列具有至少约80％、或 至少约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、 或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％、 或具有100％的序列同一性的序列。在式IX的缀合物的一个实施方案中，有 效负载的单原子残基是来自选自由表11、12、18、19和21中所阐述的有效 负载组成的组的有效负载。在式IX的缀合物的一个实施方案中，CL1和CL2各自选自表13中所阐述的交联剂的组。在式IX的缀合物的一个实施方案中， 每个CL1连接到XTEN的赖氨酸的ε-氨基并且每个CL2连接到XTEN的半胱氨酸的硫。在式IX的缀合物的另一个实施方案中，x是1并且CL1连接到 XTEN的N端氨基并且CL2连接到XTEN的半胱氨酸的硫或赖氨酸的ε-氨基。 在式IX的缀合物的另一个实施方案中，CL1是选自表15的第一和第二点击 化学反应物的反应产物。在式IX的缀合物的另一个实施方案中，C2是选自表 15的第一和第二点击化学反应物的反应产物。在一个实施方案中，式IX的 缀合物选自由表21中所阐述的缀合物组成的组。在另一个实施方案中，本发 明提供了式IX的缀合物的制剂，其中缀合物的制剂的至少约80％、或至少约 90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至 少约95％的XTEN分子具有相同的序列长度。
3.XTEN-交联剂和XTEN-有效负载缀合物的二聚、三聚、四聚和多聚构型
在一个方面，本发明提供了缀合物，其中不同数目的XTEN或XTEN- 有效负载缀合伴侣是用接头以数目规定的构型连接；例如，二聚、三聚、四 聚或多聚。如本文所用的“前体”打算包括在缀合反应中用作反应物以得到中 间物或最终组合物的组分，并且包括(但不限于)任何长度的XTEN区段(包括 表2和3的XTEN或如上文的各个式中所描绘)、XTEN-交联剂、XTEN-有效 负载-交联剂区段、具有反应基团的有效负载、接头，以及本文所描述的其它 这类的组分。
在一些实施方案中，本发明提供了缀合物，其中两个XTEN或XTEN- 有效负载前体区段是用二价交联剂连接，从而得到二价构型，例如图19C和 图27B中所示。在二价XTEN-有效负载缀合物的一个实施方案中，每个XTEN- 有效负载可以是包含生物活性肽或多肽的单体融合蛋白质，其中每个融合蛋 白质前体区段通过N端的α-氨基连接到二价接头，从而得到二价缀合物。在 二价XTEN-有效负载缀合物的另一个实施方案中，每个XTEN-有效负载前体 区段是包含生物活性肽或多肽的单体融合蛋白质，其中每个融合蛋白质在C 端连接到二价接头，从而得到二价缀合物。在二价XTEN-有效负载缀合物的 另一个实施方案中，每个XTEN包含缀合到XTEN的一个或多个有效负载(可 以是肽、多肽或药物)，其中每个XTEN前体在N端用二价接头连接到包含 一个或多个第二、不同有效负载分子的另外的XTEN前体，从而得到二价缀 合物。在二价XTEN-有效负载缀合物的另一个实施方案中，每个XTEN包含 缀合到XTEN的一个或多个有效负载(可以是肽、多肽或药物)，其中每个 XTEN前体在C端通过羧基或经修饰的基团(包括(但不限于)在C端通过插入 半胱氨酸而修饰的XTEN)用二价接头连接到包含一个或多个第二、不同有效 负载分子的另外的XTEN前体，从而得到二价缀合物。在这一段的前述实施 方案中，如本领域的一般技术人员鉴于本公开应了解，存在不同的方法来形 成将要连接的前体，例如将接头缀合到第一前体XTEN-有效负载，然后实现 第二反应以将这个前体连接到第二XTEN-有效负载前体的末端的反应基团。 或者，一个或两个XTEN末端可以被修饰成前体，然后可以通过点击化学或 通过本文所描述或说明的其它方法来连接，留下很少的或没有留下残基原子 来交接XTEN。在另一个实施方案中，两个XTEN-有效负载前体序列是使用 在前体XTEN-有效负载反应物的末端或末端附近引入的半胱氨酸或硫醇基通 过二硫桥键连接，从而得到二价XTEN-有效负载缀合物。这些二价缀合物的 示范性的构型如下。
在一个实施方案中，本发明提供了一种缀合物，其具有式X的构型：
其中就各次出现独立而言：PR1是第一有效负载的单原子残基，其中这个 残基选自由碳、氮、氧和硫组成的组；PR2是第二有效负载的单原子残基，其 中这个残基选自由碳、氮、氧和硫组成的组；CL1是交联剂；x是1至约100、 或1至约50、或1至约40、或1至约20、或1至约10、或1至约5的整数， 或是9，或是3，或是2，或是1；CL2是不同于CL1的交联剂；y是1至约100、或1至约50、或1至约40、或1至约20、或1至约10、或1至约5的 整数，或是9，或是3，或是2，或是1，其限制条件为x+y≥2；2xCL二者 择一地是二价交联剂或选自表15的第一和第二点击化学反应物的反应产物； XTEN1是与选自表2和3中所阐述的序列的组的序列具有至少80％、或至少 约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或 至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％、 或具有100％的序列同一性的多肽；并且XTEN2是与选自表2和3中所阐述 的序列的组的序列具有至少80％、或至少约90％、或至少约91％、或至少约 92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至 少约97％、或至少约98％、或至少约99％、或具有100％的序列同一性的多 肽。在式X的缀合物的一个实施方案中，CL1和CL2各自选自表13中所阐述 的交联剂的组。在式X的缀合物的另一个实施方案中，x是1并且CL1连接 到XTEN的N端氨基。在式X的缀合物的另一个实施方案中，CL1是选自表 15的第一和第二点击化学反应物的反应产物。在式X的缀合物的另一个实施 方案中，C2是选自表15的第一和第二点击化学反应物的反应产物。在式X 的缀合物的另一个实施方案中，每个CL1连接到XTEN1的半胱氨酸的硫并且每个CL2连接到XTEN2的半胱氨酸的硫。在式X的缀合物的另一个实施方案 中，每个CL1连接到XTEN1的赖氨酸的ε-氨基并且每个CL2连接到XTEN2的赖氨酸的ε-氨基。在式X的缀合物的另一个实施方案中，每个CL1连接到 XTEN1的半胱氨酸的硫并且每个CL2连接到XTEN2的赖氨酸的ε-氨基。在式 X的缀合物的另一个实施方案中，XTEN1和XTEN2是相同的。在式X的缀 合物的另一个实施方案中，XTEN1和XTEN2是不同的。在另一个实施方案中， 本发明提供了式X的缀合物的制剂，其中缀合物的制剂的至少约80％、或至 少约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、 或至少约95％的XTEN分子具有相同的序列长度。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种缀合物，其具有式XI的构型：
其中就各次出现独立而言：P1是选自表11、12、18、19和21中所阐述 的有效负载的组的第一有效负载；P2是选自表11、12、18、19和21中所阐 述的有效负载的组并且不同于P1的第二有效负载；CL1是交联剂；x是1至 约100、或1至约50、或1至约40、或1至约20、或1至约10、或1至约5 的整数，或是9，或是3，或是2，或是1；CL2是不同于CL1的交联剂；y是 1至约100、或1至约50、或1至约40、或1至约20、或1至约10、或1至 约5的整数，或是9，或是3，或是2，或是1，其限制条件为x+y≥2；2xCL 二者择一地是二价交联剂或选自表15的第一和第二点击化学反应物的反应 产物；XTEN1是与选自表2和3中所阐述的序列的组的序列具有至少80％、 或至少约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、 或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％、 或具有100％的序列同一性的第一基本上同质的XTEN；并且XTEN2是与选 自表2和3中所阐述的序列的组的序列具有至少80％、或至少约90％、或至 少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、 或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％、或具有100％ 的序列同一性的第一基本上同质的XTEN。在式XI的缀合物的一个实施方案 中，CL1和CL2各自选自表13中所阐述的交联剂的组。在式XI的缀合物的 另一个实施方案中，x是1并且CL1连接到XTEN的N端氨基。在式XI的缀 合物的另一个实施方案中，CL1是选自表15的第一和第二点击化学反应物的 反应产物。在式XI的缀合物的另一个实施方案中，C2是选自表15的第一和 第二点击化学反应物的反应产物。在式XI的缀合物的另一个实施方案中，每个CL1连接到XTEN1的半胱氨酸的硫并且每个CL2连接到XTEN2的半胱氨 酸的硫。在式XI的缀合物的另一个实施方案中，每个CL1连接到XTEN1的 赖氨酸的ε-氨基并且每个CL2连接到XTEN2的赖氨酸的ε-氨基。在式XI的 缀合物的另一个实施方案中，每个CL1连接到XTEN1的半胱氨酸的硫并且每 个CL2连接到XTEN2的赖氨酸的ε-氨基。在式XI的缀合物的另一个实施方案中，XTEN1和XTEN2是相同的。在式XI的缀合物的另一个实施方案中， XTEN1和XTEN2是不同的。在一个实施方案中，式XI的缀合物选自由表21 中所阐述的缀合物组成的组。在另一个实施方案中，本发明提供了式XI的缀 合物的制剂，其中缀合物的制剂的至少约80％、或至少约90％、或至少约91％、 或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％的相应的XTEN1和XTEN2分子具有相同的序列长度。
在其它实施方案中，本发明提供了具有三聚构型的XTEN-接头和XTEN- 接头有效负载缀合物，例如图21-23中所示。
本发明提供了三聚缀合物，其中三个XTEN-交联剂缀合物是用三价接头 连接，从而得到三聚XTEN-交联剂构型。在一个实施方案中，本发明提供了 一种三聚XTEN-交联剂，其具有式XII的构型：
其中就各次出现独立而言：3xCL是三价交联剂，CL1是缀合到XTEN1 的第一交联剂，CL2是缀合到XTEN2的第二交联剂，CL3是缀合到XTEN3 的第三交联剂，x是1至约10的整数，y是1至约10的整数，z是1至约10 的整数，其限制条件为x+y+z>3，XTEN1是与选自表2和3中所阐述的序 列的组的序列具有至少80％、或至少约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、 或至少约98％、或至少约99％、或具有100％的序列同一性的第一XTEN； XTEN2是与选自表2和3中所阐述的序列的组的序列具有至少80％、或至少 约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或 至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％、 或具有100％的序列同一性的第二XTEN；并且XTEN3是与选自表2和3中 所阐述的序列的组的序列具有至少80％、或至少约90％、或至少约91％、或 至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、 或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％、或具有100％的序列同一性 的第三XTEN，其中XTEN1、XTEN2和XTEN3是相同的或是不同的XTEN 序列。在式XII的缀合物的一个实施方案中，CL1、CL2和CL3各自选自由 表13中所阐述的交联剂组成的组，并且是相同的或是不同的。在一个实施方 案中，式XII的缀合物进一步包含缀合到第一基本上同质的XTEN的每个交 联剂的第一有效负载的单原子残基，其中这个残基选自由碳、氮、氧和硫组 成的组；缀合到第二基本上同质的XTEN的每个交联剂的第二有效负载的单 原子残基，其中这个残基选自由碳、氮、氧和硫组成的组；以及缀合到第三 基本上同质的XTEN的每个交联剂的第三有效负载的单原子残基，其中这个 残基选自由碳、氮、氧和硫组成的组。
在另一个实施方案中，本发明提供了三聚缀合物，其中三个XTEN-有效 负载前体是用三价接头连接，从而得到三聚XTEN-有效负载构型，例如图21 和97-106中所示。在一个实施方案中，本发明提供了一种三聚XTEN-交联剂， 其具有式XIII的构型：
其中就各次出现独立而言：3xCL是选自表13和14中所阐述的三价交联 剂的组的三价交联剂；P1缀合到第一XTEN的每个交联剂并且选自由表11、 12、18和21中所阐述的有效负载组成的组，P2是缀合到第二XTEN的每个 交联剂的第二有效负载并且选自由表11、12、18和21中所阐述的有效负载 组成的组，其中这个有效负载与第一有效负载是相同的或是不同的，并且P3是缀合到第三XTEN的每个交联剂的第三有效负载并且选自由表11、12、18和21中所阐述的有效负载组成的组，其中这个有效负载与第一有效负载或第 二有效负载是相同的或是不同的；CL1是第一交联剂；x是1至约100、或1 至约50、或1至约40、或1至约20、或1至约10、或1至约5的整数，或 是9，或是3，或是2，或是1；CL2是第二交联剂；y是1至约100、或1至 约50、或1至约40、或1至约20、或1至约10、或1至约5的整数，或是 9，或是3，或是2，或是1；并且z是1至约100、或1至约50、或1至约 40、或1至约20、或1至约10、或1至约5的整数，或是9，或是3，或是 2，或是1，其限制条件为x+y+z≥3；XTEN1是与选自表2和3中所阐述的序列的组的序列具有至少80％、或至少约90％、或至少约91％、或至少约 92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至 少约97％、或至少约98％、或至少约99％、或具有100％的序列同一性的第 一XTEN；XTEN2是与选自表2和3中所阐述的序列的组的序列具有至少 80％、或至少约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至 少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、 或至少约99％、或具有100％的序列同一性的第二XTEN；并且XTEN3是与 选自表2和3中所阐述的序列的组的序列具有至少80％、或至少约90％、或 至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、 或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％、或具有100％ 的序列同一性的第三XTEN，其中XTEN1、XTEN2和XTEN3是相同的或是不同的XTEN序列。在一些实施方案中，式XIII的缀合物进一步包含第一有效 负载，其中这个有效负载是对标靶具有特异性结合亲和力的靶向部分，其中 这个靶向部分选自由表17-19和21中所阐述的靶向部分组成的组，并且有效 负载中至少有一者是药物，其中这个药物选自由表11、表19和表21中所阐 述的药物组成的组。在前述的一个实施方案中，靶向部分是LHRH或叶酸盐， 并且药物是选自阿霉素、太平洋紫杉醇、奥利司他汀、单甲基奥利司他汀E(MMAE)、单甲基奥利司他汀F、美登素、海兔毒素、卡奇霉素、长春花生物 碱、喜树碱、丝裂霉素C、埃博霉素、hTNF、Il-12、硼替佐米、豹蛙酶、假 单胞菌外毒素、SN-38和雷查霉素。在三聚XTEN缀合组合物的另一个实施 方案中，组合物具有式XIV的构型：
其中就各次出现独立而言；3xCL是三价交联剂；CL1是缀合到XTEN1的第一交联剂；CL2是缀合到XTEN2的第二交联剂；x是1至约10的整数； y是1至约10的整数，其限制条件为x+y≥2；XTEN1是第一XTEN；XTEN2是第二XTEN；并且XTEN3是第三XTEN，其中这个XTEN选自由表2中所 阐述的序列组成的组。在式XIV的三聚XTEN缀合组合物的一个实施方案中， 组合物进一步包含缀合到第一XTEN的每个第一交联剂的第一有效负载的单 原子残基，其中这个残基选自由碳、氮、氧和硫组成的组；以及缀合到第二 XTEN的每个第二交联剂的第二有效负载的单原子残基，其中这个残基选自 由碳、氮、氧和硫组成的组。在式XIV的三聚XTEN缀合组合物的另一个实 施方案中，组合物进一步包含缀合到第一XTEN的每个第一交联剂的第一有 效负载，这个第一有效负载选自由表6、7、18和21中所阐述的有效负载组 成的组；以及缀合到第二XTEN的每个第二交联剂的第二有效负载，这个第 二有效负载选自由表6、7、18和21中所阐述的有效负载组成的组，其中这 个有效负载与第一有效负载是相同的或是不同的。在前述的一个实施方案中， 第一有效负载是对标靶具有特异性结合亲和力的靶向部分，其中这个靶向部 分选自由表17-19和21中所阐述的靶向部分组成的组，并且第二有效负载选 自由表6、表18和表21中所阐述的药物组成的组的药物。在前述的另一个 实施方案中，第一有效负载选自由LHRH和叶酸盐组成的组的靶向部分，并 且第二有效负载是选自由以下组成的组的药物：阿霉素、太平洋紫杉醇、奥 利司他汀、单甲基奥利司他汀E(MMAE)、单甲基奥利司他汀F、美登素、海 兔毒素、卡奇霉素、长春花生物碱、喜树碱、丝裂霉素C、埃博霉素、hTNF、 Il-12、硼替佐米、豹蛙酶、假单胞菌外毒素、SN-38和雷查霉素。在前述的 一个实施方案中，第一有效负载选自由表11的药物和表12的蛋白质组成的 组的药物，并且第二有效负载不同于第一有效负载并且选自由表11的药物和 表12的蛋白质组成的组。在前述的另一个实施方案中，第一有效负载和第二 有效负载是相同的并且选自由表11的药物和表12的蛋白质组成的组。在三 聚XTEN缀合组合物的另一个实施方案中，组合物具有式XV的构型：
其中就各次出现独立而言；3xCL是三价交联剂；CL1是缀合到XTEN1的第一交联剂；x是1至约10的整数；XTEN1是第一XTEN，其中这个XTEN 选自由表3中所阐述的序列组成的组；XTEN2是第二XTEN，其中这个XTEN 选自由表2中所阐述的序列组成的组；并且XTEN3是第三XTEN，其中这个 XTEN选自由表2中所阐述的序列组成的组。在呈式XV构型的三聚XTEN 缀合组合物的一个实施方案中，组合物进一步包含缀合到第一XTEN的每个 第一交联剂的第一有效负载的单原子残基，其中这个残基选自由碳、氮、氧 和硫组成的组。在呈式XV构型的三聚XTEN缀合组合物的一个实施方案中， 组合物进一步包含缀合到第一XTEN的每个第一交联剂的第一有效负载，这 个第一有效负载选自由表6、7、18和21中所阐述的有效负载组成的组。
在三聚XTEN-有效负载缀合物的另一个实施方案中，每个XTEN-有效负 载可以是包含生物活性肽或多肽的单体融合蛋白质，其中这个融合蛋白质在 XTEN的氨基或硫醇基处连接到三价接头。在三聚XTEN-有效负载缀合物的 另一个实施方案中，每个XTEN-有效负载可以是连接到XTEN的有效负载的 缀合物，这个有效负载可以是连接到XTEN的生物活性肽或多肽或药理活性 小分子或毒素，而XTEN在XTEN的N端连接到三价接头。在这一段的上文 所描述的前述XTEN-接头-有效负载的实施方案中，三个有效负载可以是相同 的或可以是不同的。在三聚XTEN-有效负载缀合物的一个实施方案中，缀合 物包含连接到不同XTEN的至少一个生物活性蛋白质和至少一个药物，而 XTEN在XTEN的N端连接到三价接头。在前述构型的一个特定实施方案中， 至少一个生物活性蛋白质是靶向部分，并且至少一个药物是包括(但不限于) 以下的毒素：阿霉素、太平洋紫杉醇、奥利司他汀、单甲基奥利司他汀E、单甲基奥利司他汀F、美登素、海兔毒素、卡奇霉素、长春花生物碱、喜树 碱、丝裂霉素C、埃博霉素、hTNF、Il-12、硼替佐米、豹蛙酶、假单胞菌外 毒素、SN-38和雷查霉素。取决于XTEN中硫醇或ε-氨基的位置，可以控制 有效负载在经交联的XTEN的内部(如图23B中所示)抑或末端(如图23A中所 示)。在前述实施方案中，示范性的非限制性靶向部分包括LHRH、叶酸盐、 奥曲肽、帕瑞肽、蛙皮素(bombesin)、单克隆抗体、scFV、塞曲因(centryin)， 以及表17的抗体片段、支架和模拟物。这些三聚缀合物的示范性的构型如下。
本发明进一步提供了具有四聚构型的XTEN-接头和XTEN-接头有效负 载缀合物。在一个实施方案中，本发明提供了缀合物，其中四个XTEN序列 是用四价接头连接，从而得到四聚XTEN-交联剂构型，例如图22D中所示。 四价接头的非限制性实例包括四价硫醇、如美国专利号7,524,821中所描述的 四价N-马来酰亚胺接头，或具有四个反应基团的抗体或抗体片段。
本发明提供了缀合物，其中四个XTEN-交联剂前体序列是用四价接头连 接，从而得到四价XTEN-交联剂构型。在一个实施方案中，本发明提供了一 种四聚XTEN-交联剂，其具有式XVI的构型：
其中就各次出现独立而言：4xCL是四价交联剂；CL1是缀合到XTEN1的第一交联剂；CL2是缀合到XTEN2的第二交联剂；CL3是缀合到XTEN3的 第三交联剂；CL4是缀合到XTEN4的第四交联剂；v是1至约10的整数；x 是1至约10的整数；y是1至约10的整数；z是1至约10的整数，其限制 条件为x+y+z≥4；XTEN1是与选自表2和3中所阐述的序列的组的序列具 有至少80％、或至少约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、 或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、 或至少约99％、或具有100％的序列同一性的第一XTEN；XTEN2是与选自 表2和3中所阐述的序列的组的序列具有至少80％、或至少约90％、或至少 约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或 至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％、或具有100％ 的序列同一性的第二XTEN；XTEN3是与选自表2和3中所阐述的序列的组 的序列具有至少80％、或至少约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至 少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、 或至少约98％、或至少约99％、或具有100％的序列同一性的第三XTEN，其 中XTEN1、XTEN2和XTEN3是相同的或是不同的XTEN序列；XTEN4是与 选自表2和3中所阐述的序列的组的序列具有至少80％、或至少约90％、或 至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、 或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％、或具有100％ 的序列同一性的第四XTEN，其中XTEN1、XTEN2、XTEN3和XTEN4是相同 的或是不同的XTEN序列。
本发明提供了缀合物，其中四个XTEN-有效负载前体序列是用四价接头 连接，从而得到如图22C和105中所示的四价XTEN-有效负载构型。在一个 实施方案中，本发明提供了一种四聚XTEN-有效负载，其具有式XVII的构 型：
其中就各次出现独立而言：4xCL是四价交联剂；P1缀合到第一XTEN 的每个交联剂并且选自由表11、12、18和21中所阐述的有效负载组成的组， P2是缀合到第二XTEN的每个交联剂的第二有效负载并且选自由表11、12、 18和21中所阐述的有效负载组成的组，其中这个有效负载与第一有效负载 是相同的或是不同的，P3是缀合到第三XTEN的每个交联剂的第三有效负载 并且选自由表11、12、18和21中所阐述的有效负载组成的组，其中这个有效负载与第一有效负载或第二有效负载是相同的或是不同的；P4是缀合到第 四XTEN的每个交联剂的第四有效负载并且选自由表11、12、18和21中所 阐述的有效负载组成的组，其中这个有效负载与第一有效负载、第二有效负 载或第三有效负载是相同的或是不同的；CL1是缀合到XTEN1的第一交联剂； CL2是缀合到XTEN2的第二交联剂；CL3是缀合到XTEN3的第三交联剂；CL4是缀合到XTEN4的第四交联剂；v是1至约10的整数；x是1至约10的整 数；y是1至约10的整数；z是1至约10的整数，其限制条件为x+y+z≥4； XTEN1是与选自表2和3中所阐述的序列的组的序列具有至少80％、或至少 约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或 至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％、 或具有100％的序列同一性的第一XTEN；XTEN2是与选自表2和3中所阐述 的序列的组的序列具有至少80％、或至少约90％、或至少约91％、或至少约 92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至 少约97％、或至少约98％、或至少约99％、或具有100％的序列同一性的第 二XTEN；XTEN3是与选自表2和3中所阐述的序列的组的序列具有至少 80％、或至少约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至 少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、 或至少约99％、或具有100％的序列同一性的第三XTEN，其中XTEN1、XTEN2和XTEN3是相同的或是不同的XTEN序列；XTEN4是与选自表2和3中所阐 述的序列的组的序列具有至少80％、或至少约90％、或至少约91％、或至少 约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或 至少约97％、或至少约98％、或至少约99％、或具有100％的序列同一性的 第四XTEN，其中XTEN1、XTEN2、XTEN3和XTEN4是相同的或是不同的 XTEN序列。
在四价XTEN-有效负载缀合物的另一个实施方案中，每个XTEN-有效负 载可以是包含生物活性肽或多肽的单体融合蛋白质，其中这个融合蛋白质在 XTEN的氨基或硫醇基处连接到四价接头。在四价XTEN-有效负载缀合物的 另一个实施方案中，每个XTEN-有效负载可以是有效负载的缀合物，这个有 效负载可以是连接到XTEN的生物活性肽或多肽或药理活性小分子或毒素， 而XTEN通过XTEN的N端连接到四价接头。在这一段的上文所描述的前述 XTEN-接头-有效负载的实施方案中，四个有效负载可以是相同的或可以是不 同的。在前述构型的一个特定实施方案中，至少一个生物活性蛋白质是靶向 部分，并且至少一个药物是包括(但不限于)以下的毒素：阿霉素、太平洋紫杉 醇、奥利司他汀、美登素、海兔毒素、卡奇霉素、长春花生物碱、喜树碱、 丝裂霉素C、埃博霉素、hTNF、Il-12、硼替佐米、豹蛙酶、假单胞菌外毒素、 SN-38和雷查霉素。取决于XTEN中硫醇或ε-氨基的位置，可以控制有效负 载在经交联的XTEN的内部抑或末端。
4.具有四个或更多个XTEN-有效负载的多价构型
使用表3的XTEN，预期组合物含有连接到经半胱氨酸工程改造或经赖 氨酸工程改造的骨架的四个或更多个XTEN-有效负载分子，从而得到“梳状” 多价构型；或连接多个分支前体以产生如图7中所说明的“树枝状聚合物”构 型。在一个实施方案中，多价构型缀合物是通过使经半胱氨酸工程改造或经 赖氨酸工程改造的XTEN与包含适于与经半胱氨酸工程改造或经赖氨酸工程 改造的XTEN反应的接头的XTEN-有效负载反应来形成(如图24中所说明)， 从而得到最终产物。在另一个实施方案中，多价构型缀合物是通过使具有接 头的经半胱氨酸工程改造或经赖氨酸工程改造的XTEN与包含适于与连接到 经半胱氨酸工程改造或经赖氨酸工程改造的XTEN的接头反应的半胱氨酸或 伯氨基或ε-氨基的XTEN-有效负载反应来形成，从而得到最终产物。在这些 实施方案中，最终产物的化合价是由并入到XTEN中的反应基团(反应性氨基 酸或接头)的数目来控制。另外，预期最终产物可以经过设计以将有效负载定 位于靠近XTEN末端，这改进了与其配体的相互作用，或靠近分支点以屏蔽 有效负载并且降低与配体相互作用的程度。
5.单体XTEN骨架上的双特异性有效负载构型
在另一个方面，本发明提供了缀合物，如图27A中所说明，其含有连接 到单一的经半胱氨酸工程改造和经赖氨酸工程改造的XTEN骨架的两个不同 有效负载分子，从而得到二价缀合物。在一个实施方案中，二价构型缀合物 是通过以下方式形成：使经工程改造的XTEN(如表3中特别提供的那些XTEN) 与包含适于与经半胱氨酸工程改造的XTEN反应的接头的第一XTEN-有效负 载反应，接下来与包含适于与经赖氨酸工程改造的XTEN反应的接头的第二 XTEN-有效负载进行第二反应，从而得到最终产物。有效负载的数目和位置 是由经工程改造的XTEN的设计来控制，其中反应性硫醇或氨基的安置是决 定性的。在一个实施方案中，二价缀合物包含经接头连接到经半胱氨酸-赖氨 酸工程改造的XTEN的第一有效负载的单一分子和第二有效负载的单一分 子。在另一个实施方案中，二价缀合物包含经接头连接到经半胱氨酸-赖氨酸 工程改造的XTEN的第一有效负载的一个、或两个、或三个、或四个、或五 个分子和第二有效负载的单一分子。在另一个实施方案中，二价缀合物包含 经接头连接到经半胱氨酸-赖氨酸工程改造的XTEN的第一有效负载的一个、 或两个、或三个、或四个、或五个分子和第二有效负载的一个、或两个、或 三个、或四个、或五个分子。
在另一个实施方案中，二价构型缀合物是通过以下方式形成：使经半胱 氨酸工程改造和经赖氨酸工程改造的XTEN(如表3的那些XTEN)与适于与经 半胱氨酸工程改造的XTEN反应的第一接头反应，接下来与适于与经赖氨酸 工程改造的XTEN反应的接头进行第二反应，然后使XTEN-交联剂骨架与具 有能够与第一接头反应的硫醇反应基团的第一有效负载反应，接下来使第二 有效负载与能够与第二交联剂反应的氨基反应，从而得到最终产物。
6.具有间隔子和释放基团的XTEN-交联剂和XTEN-有效负载缀合物
在另一个方面，本发明提供了配置有并入到XTEN中或与XTEN相邻的 一个或多个间隔子的XTEN-交联剂和XTEN-有效负载缀合物，这一个或多个 间隔子经过设计以将功能性或特性并入到组合物中或增强组合物的功能性或 特性，或作为组合物的组装或制造的辅助。这些特性包括(但不限于)纳入能够 经蛋白水解裂解的序列或不稳定的官能团以允许释放有效负载，或可以将间 隔子引入到XTEN序列与有效负载组分之间以减小位阻，使得有效负载组分 可以适当地与其靶配体相互作用。
在一个实施方案中，将一个或多个间隔子并入到主题缀合物的接头中。 关于间隔子和鉴别理想的间隔子的方法，参看例如George等人(2003)Protein Engineering 15:871-879，其以引用的方式明确并入本文中。在一个实施方案 中，间隔子包含一个或多个肽序列，其长度介于1到50个氨基酸残基、或约 1到25个残基、或约1到10个残基之间。不包括裂解位点的间隔序列可以 包含20种天然L-氨基酸中的任一者，并且将优选地具有类XTEN特性，这 是在于大多数残基将为空间上不受阻的亲水氨基酸。间隔子可以是多聚甘氨 酸或多聚丙氨酸，或主要是甘氨酸、丝氨酸和丙氨酸残基的组合的混合物。 在一个实施方案中，间隔序列是来自表15的序列。在另一个实施方案中，间 隔序列是GPEGPS。
另外，间隔序列经过设计以避免引入T细胞表位，这可以部分地通过避 免或限制间隔子中所用的疏水氨基酸的数目来实现；表位的确定描述于上文 和实施例中。
在一个实施方案中，间隔子包含允许有效负载从缀合物中释放的释放基 团。在另一个实施方案中，交联剂包含允许有效负载从缀合物中释放的释放 基团。释放基团可以是提供这种可释放的连接的任何不稳定基团。在一个实 施方案中，释放基团是化学可裂解键或不稳定化学键。这些键可以典型地通 过本领域的技术人员熟知的方法来裂解，例如通过酸、碱、氧化、还原、置 换或消除。在一个特定实施方案中，化学可裂解键包含并入到交联剂或间隔 子中的经修饰的碱、经修饰的糖、二硫键、化学可裂解基团。这些键的一些 实例描述于PCT WO 96/37630和美国专利号7,132,519中，其以引用的方式 并入本文中。本发明所涵盖的释放基团还包括可用酶裂解的基团或键。酶可 裂解的释放基团包括磷酸二酯或酰胺键以及限制性核酸内切酶识别位点。在 一个实施方案中，本发明提供了包含一个或多个有效负载的组合物，其中缬 氨酸-瓜氨酸的可裂解接头在有效负载与XTEN之间，从而当组合物在细胞内 (例如，在肿瘤细胞内)内化时允许用组织蛋白酶裂解。在另一个实施方案中， 释放基团可用核酸酶裂解。这些核酸酶可以典型地为核酸外切酶或限制性核 酸内切酶。典型的核酸外切酶包括对双链和单链多核酸都具特异性的核酸外 切酶。另外，某些实施方案所涵盖的限制性核酸内切酶包括IIS型和II型限 制性核酸内切酶。在其它实施方案中，释放基团可以是可用蛋白酶裂解的序 列，其中这个序列是选自表9中所阐述的序列。作用于适合纳入到本发明组 合物中的序列的典型蛋白酶包括蛋白内切酶，包括表9的蛋白酶。
7.XTEN-有效负载构型的文库
在另一个方面，本发明提供了XTEN-有效负载前体的文库，用以制造这 些文库的方法，以及如图34-35中所说明以组合方法组合文库前体来实现有 效负载的最佳组合以及最佳比率的方法。在一个实施方案中，本发明提供了 各自连接到给定的有效负载(包括本文所描述的那些有效负载)的1个、或2 个、或3个、或4个、或5个、或6个、或7个、或8个、或9个、或10个 或更多个分子的个别XTEN的文库，以形成XTEN-有效负载前体的文库。在 这种方法中，一系列将要连接的XTEN-有效负载前体进一步缀合到接头，并 且随后与其它能够与接头在实现缀合的条件下反应的XTEN-有效负载前体混 合并反应，从而得到连接到XTEN的有效负载的各种排列和比率的文库。然 后，在适合于评定给定的临床适应症(例如，癌症、代谢紊乱、糖尿病)中的参 数的体外或体内试验中筛选这种文库，以确定提供最佳反应的那些组合物。 在一个示范性的实施方案中，一种类别的有效负载前体包括各种靶向模块， 例如对表20的肿瘤相关抗原具有结合亲和力的肽(例如，表17的靶向部分)， 并且第二种类别的前体是一种或多种药物，例如细胞毒性药物或选自表9的 药物。每种类别的将要连接的前体进一步缀合到接头，并且如图36中所说明， 随后与其它能够与接头在实现缀合的条件下反应的XTEN-有效负载前体混合 并反应，从而得到彼此成不同比率的各种靶向部分和药物排列的文库。XTEN- 有效负载缀合物经过设计以允许一个有效负载与另一个有效负载成固定比 率；例如，在两个不同有效负载的情况下是1:1、或1:1.5、或1:2、或1:3、 或2:3、或1:4、或1:5或1:9。类似范围的比率将适用于包含3个、4个、5 个或更多个有效负载的文库缀合物。
在其它实施方案中，使用三个或更多个已知在治疗常见疾病中具有有益 作用的有效负载来构建文库。在一个实施方案中，文库包含连接到XTEN的 有效负载，其中每个有效负载是药物或对于改善常见疾病是生物有效的。在 另一个实施方案中，文库包含连接到XTEN的有效负载，其中每个药物或生 物剂有效地治疗常见疾病的不同症状。在另一个实施方案中，文库包含连接 到XTEN的有效负载，其中每个药物或生物剂经由共同的生物路径介导其治 疗作用。在文库的前述实施方案中，常见疾病是选自癌症、癌症支持性护理、 心血管疾病、中枢神经系统疾病、内分泌疾病、胃肠疾病、泌尿生殖器疾病、 血液疾病、HIV感染、激素系统疾病、炎症、自体免疫疾病、传染病、代谢 疾病、肌肉骨胳疾病、肾脏科病症、眼科疾病、疼痛和呼吸疾病。更具体地 说，使用已知具有有益作用的有效负载构建文库所用于的疾病是选自表16。 适合用于治疗或预防这些疾病的有效负载包括本文所描述的那些有效负载 (例如，表11、12、18和21的有效负载)，或可以在通常可用的资料库中找到 或将以其它方式为本领域的一般技术人员所知。
表16：有效负载所适用的疾病
在一个实施方案中，如图37中所说明，双特异性缀合物具有经可裂解或 不稳定接头连接到XTEN的药物模块，其中这个接头可以在施用给受试者后， 包括在靶向模块所靶向的细胞中进行细胞内内化后裂解或脱离。在另一个实 施方案中，药物经不可裂解接头连接到XTEN，但缀合物保持对降解敏感。 在内化后，XTEN用蛋白酶裂解并且连接到这个接头的药物被释放出，从而 产生细胞毒性。
在一个示范性的实施方案中，靶向模块是促黄体激素释放激素(又称为 LHRH、GnRH和促性腺激素释放激素)，药物是阿霉素，其中LHRH与阿霉 素的比率是1:1、或1:1.5、或1:2、或1:3、或1:9、或2:3、或3:1、或3:2、 或2:1、或1.5:1。可以从XTEN前体开始来产生缀合物。一个XTEN前体可 以带有1个、2个或更多个药物分子和反应性交联剂或点击化学反应物或反 应性氨基酸。第二个XEN前体带有1个、2个或更多个用于靶向的LHRH域 和反应性交联剂或点击化学反应物或反应性氨基酸。然后，通过相应的XTEN 的反应基团之间的反应来连接两个前体区段。在一个示范性的实施方案中， 反应基团是经由交联剂缀合到第一XTEN区段的N端的叠氮化物；并且第二 XTEN的反应基团是经由交联剂缀合到第二XTEN区段的N端的炔烃。在 LHRH-XTEN-药物缀合物的另一个实施方案中，药物是美登素。在 LHRH-XTEN-药物缀合物的另一个实施方案中，药物是奥利司他汀。
8.连接到靶向部分的XTEN-有效负载的缀合物
在另一个方面，本发明提供了缀合组合物，其包含连接到靶向部分的一 个或多个XTEN-有效负载组合物。主题靶向组合物应用于治疗多种病状，其 中需要治疗性或毒性有效负载选择性递送到细胞、组织或器官。本发明涵盖 了用于主题组合物中的多种多样的靶向部分，包括抗体、抗体片段和抗体模 拟物，包括(但不限于)表17中所阐述的那些，以及能够结合与疾病或代谢或 生理异常相关的配体或受体的肽和小分子。在一个实施方案中，本发明提供 了一种缀合物，其包含连接到至少一个XTEN的至少一个来自表17、18或 21的靶向部分。在另一个实施方案中，本发明提供了一种缀合物，其包含连 接到至少两个、或三个、或四个XTEN中的每一者的至少一个来自表17、18 或21的靶向部分。在另一个实施方案中，本发明提供了一种缀合物，其包含 连接到至少一个XTEN的至少一个来自表17、18或21的靶向部分以及连接 到至少一个XTEN的至少一个选自由表11、表12、表18或表21中所阐述的 有效负载组成的组的药物或生物有效负载。在一个实施方案中，如图37中所 说明，本发明提供了靶向部分-XTEN-药物缀合组合物，其中组合物选择性地 递送到经靶向的细胞上的配体或受体，然后可以内化到细胞中，从而产生本 领域中关于药物组分已知的药理作用。
如图21-24和28-32中所说明，这些缀合组合物可以具有不同的化合价， 其中一个、两个、三个或四个或更多个XTEN-有效负载分子连接到一个或多 个靶向抗体或靶向部分。在抗体靶向部分的情况下，在一个实施方案中， XTEN-有效负载经交联剂连接到抗体的铰链区中的半胱氨酸。在另一个实施 方案中，XTEN-有效负载经二硫桥键连接到抗体的铰链区中的半胱氨酸。因 此，抗体-XTEN-有效负载缀合物可以包含连接到抗体、抗体片段或模拟物的 1个、2个、3个或4个或更多个XTEN-有效负载区段。在另一个实施方案中， XTEN在铰链区的外部缀合，其包括将半胱氨酸插入到抗体中以控制缀合位 点或通过缀合到现有的赖氨酸侧链。连接XTEN-有效负载以形成抗体缀合物 具有许多益处：a)XTEN有效负载充当可裂解接头，b)其提供可溶性，c)其允 许设定每个IgG的载药量的比率，以及d)其可以与药物预先缀合以简化制造。
表17：靶向部分：抗体片段、支架和模拟物
在一些实施方案中，本发明提供了缀合物，其包含作为一个有效负载的 靶向组分和作为第二有效负载的毒素，其中每种有效负载类型的一个或多个 拷贝连接到组合物的XTEN。在前述的一个变化中，缀合物可以任选地具有 用不稳定或可裂解接头连接到XTEN的毒素，以使得当递送到标靶或在标靶 内内化时毒素被释放出。在前述的另一个变化中，靶向组分是抗体或抗体片 段，其中一个、两个、三个或四个XTEN-有效负载组合物用接头缀合到抗体 (例如，缀合到铰链区中的半胱氨酸，如图28-29中所说明)，从而提供缀合物 用于临床适应症的靶向疗法，例如(但不限于)对肿瘤和其它癌症的各种治疗， 其中抗体提供靶向组分并且XTEN-有效负载实现预定的活性(例如，在肿瘤细 胞中的细胞毒性)。因此，本发明缀合物是免疫缀合物的一种类型。靶向的缀 合物可以被设计成具有靶向组分，这些靶向组分来源于抗体或抗体模拟物， 或是结合与疾病细胞或器官相关的配体的肽或小分子。抗体片段、支架和模 拟物的类别的非限制性实例提供于表17中。特异性的靶向组分、其所针对的 标靶以及可以用作本发明缀合物中的有效负载的毒素的非限制性实例提供于 表18中。特别预期，本公开的靶向的缀合组合物包括任何给定的靶向组分的 组合物，这种靶向组分可以与表18的毒素或表11或表12中所提供的有效负 载中的任何一者或多者组合使用。进一步预期，XTEN-有效负载缀合物可以 包含两个或更多个靶向组分，其可以是相同的或可以是不同的。预期，这些 缀合物可以用于治疗病状，例如(但不限于)表15中所阐述的那些病状。
表18：示范性的靶向部分、毒素有效负载，以及缀合组合物可以针对的标靶
在特定实施方案中，本发明提供了XTEN-有效负载缀合物，其包含一个 或多个选自表19的LHRH靶向组分和一个或多个选自表11的药物组分。在 前述实施方案中，LHRH可以连接到一个XTEN区段，继而连接到一个或多 个与药物组分缀合的XTEN区段。或者，LHRH和药物组分可以缀合到单体 XTEN。此外，药物组分可以任选地使用不稳定或可裂解接头连接到XTEN， 从而允许在施用给受试者之后从缀合物中释放出药物。
表19：示范性的LHRH
组合物
pGlu-HWSYGLRPG-NH2
pGlu-HWSY[D-Lys]LRPG-NH2
pGlu-HWSY[D-Trp]LRPG-NH2
pGlu-HWSY[D-Leu]LRP-NHEt
pGlu-HWSY[D-Ser(tBu)]LRP-NHEt
pGlu-HWSY[D-2-Nal]LRPG-NH2
pGlu-HWSY[D-His(Bzl)]LRP-NHEt
pGlu-HWSY[D-Ser(tBu)]LRP-Azagly-NH2
pGlu-HWSY[D-Trp]LRP-NHEt
pGlu-HWSHDWLPG-NH2
预期XTEN-有效负载缀合物可以针对的额外标靶包括表20中所列的肿 瘤相关抗原。在一个实施方案中，本发明提供了XTEN-有效负载缀合物，其 包含能够结合表20的一个或多个标靶的一个或多个靶向组分。
表20：肿瘤相关抗原标靶
在特定实施方案中，本发明提供了XTEN-有效负载缀合物，其包含缀合 到XTEN的一个、两个或更多个靶向组分和一个、两个或更多个药物组分。 特定缀合组合物的非限制性实施方案提供于表21中，其中第2栏的命名组合 物具有以下指定组分：i)在表格的XTEN栏中指明的表3的XTEN序列；ii) 在表格的靶向部分栏中指定的靶向部分有效负载，其提供组合物的靶向能力 (其中指定了部分的数目；例如，1x或3x)；以及iii)在表格的药物部分栏中指 定的药物药效团(其中有缀合到XTEN的药物分子的数目；例如，3x或9x)。 如本领域的技术人员应了解，本发明涵盖了所公开的组分的其它组合，以及 不同数目或比率的相应的指定组分，以及与有效负载缀合的不同XTEN序列。 举例来说，本发明预期，附接到给定XTEN的药物部分的数目可以是1个、 或2个、或3个、或4个、或5个、或6个、或7个、或8个、或9个、或 10个或更多个，并且XTEN将具有例如对应数目的将与药物部分缀合的半胱 氨酸或赖氨酸残基。此外，本发明预期，附接到缀合物的靶向部分的数目可 以是1个、或2个、或3个或更多个，其将以类似方式连接到具有N端氨基 或对应数目的赖氨酸或半胱氨酸残基的XTEN。
表21：示范性的缀合物
*1x、3x、9x指的是缀合到XTEN的指定部分的数目
**指的是来自表3的XTEN序列；例如，Seg 174
***单甲基奥利司他汀E ****单甲基奥利司他汀F
V).医药组合物
本发明提供了医药组合物，其包含本公开的XTEN-有效负载缀合物。在 一个实施方案中，医药组合物包含选自由表21中所阐述的缀合物组成的组的 缀合物以及至少一种医药学上可接受的载剂。在一个实施方案中，医药组合 物包含一种缀合物，这种缀合物包含与选自表2和表3中所阐述的序列的组 的序列具有至少约80％、或至少约90％、或至少约91％、或至少约92％、或 至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、 或至少约98％、或至少约99％、或具有100％的序列同一性的至少第一XTEN 序列，其中组合物的XTEN序列在长度上是基本上同质的，并且其中XTEN 缀合到选自表11、12、18、19和21中所阐述的有效负载的组的至少第一有 效负载，并且其中组合物进一步包含至少一种医药学上可接受的载剂。在一 个实施方案中，本发明提供了一种医药组合物，其包含本文所描述的实施方 案中的任一者的XTEN-有效负载缀合物以及至少一种医药学上可接受的载 剂。
本发明提供了一种制备医药组合物的方法，其包括将实施方案的主题缀 合组合物与至少一种医药学上可接受的载剂组合成医药学上可接受的配制品 的步骤。本发明的XTEN-有效负载缀合物可以根据已知用以制备医药学上适 用的组合物的方法来配制，藉此将XTEN-有效负载与医药学上可接受的载剂 媒剂混合来加以组合，这种媒剂如水性溶液或缓冲液、医药学上可接受的悬 浮液和乳液。非水性溶剂的实例包括丙基乙二醇、聚乙二醇和植物油。治疗 性配制品是通过将具有所需纯度的活性成分与任选的生理学上可接受的载 剂、赋形剂或稳定剂混合来制备以供储存，如Remington's Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编(1980)中所描述，呈冻干配制品或水溶液的形 式。医药组合物可以通过任何适合的手段或途径来施用，包括皮下施用、用 输液泵皮下施用、肌肉内施用和静脉内施用。应了解，优选的途径将随接受 者的疾病和年龄以及所治疗的病状的严重程度而变化。渗透泵可以用作呈片 剂、丸剂、胶囊或植入式装置的形式的缓释剂。注射泵也可以用作缓释剂。 这些装置描述于美国专利号4,976,696、4,933,185、5,017,378、6,309,370、 6,254,573、4,435,173、4,398,908、6,572,585、5,298,022、5,176,502、5,492,534、 5,318,540和4,988,337中，其内容以引用的方式并入本文中。考虑到本发明 的公开内容和这些其它专利的公开内容，本领域的技术人员可以产生用于本 发明的组合物的长期释放的注射泵。
在另一个实施方案中，本发明提供了本文所描述的实施方案中的任一者 的XTEN-有效负载缀合物，其用来制造适用于治疗包括(但不限于)表16中所 阐述的病状的病状的药剂。
VI).治疗方法
本发明提供了一种治疗受试者的疾病的方法，其包括向受试者施用有效 量的前述实施方案中的任一者的XTEN-有效负载缀合物到有需要的受试者。 在一个实施方案中，XTEN-有效负载包含单一类型的选自表11、12、18、19 和21的有效负载。在另一个实施方案中，XTEN-有效负载包含两种类型的选 自表11、12、18、19和21的有效负载。在另一个实施方案中，XTEN-有效 负载包含两种类型的有效负载，其中一种有效负载是选自表11、12和18，并 且第二有效负载是对表20的标靶具有结合亲和力的靶向部分或是表18、19 或21中的任一者的靶向部分。在另一个实施方案中，XTEN-有效负载包含多 于三种或更多种类型的选自表11、12、18、19和21的有效负载。在这种方 法中，缀合物的有效负载是当施用给患有特定疾病或病状的受试者时在本领 域中已知具有有益作用或对疾病标靶具有亲和力的有效负载。在一个实施方 案中，组合物的有效负载经由共同的生物路径介导其治疗作用。在这一段的 前述实施方案中，这种方法适用于治疗或改善或预防选自以下的疾病：癌症、 癌症支持性护理、心血管疾病、中枢神经系统疾病、内分泌疾病、胃肠疾病、 泌尿生殖器疾病、血液疾病、HIV感染、激素系统疾病、炎症、自体免疫疾 病、传染病、代谢疾病、肌肉骨胳疾病、肾脏科病症、眼科疾病、疼痛和呼 吸疾病。更具体地说，疾病是选自表16。
在治疗方法的一些实施方案中，缀合组合物可以皮下、肌肉内或静脉内 施用。在一个实施方案中，组合物是使用治疗有效量来施用。在一个实施方 案中，施用治疗有效量的两个或更多个连续剂量使得组合物与未连接到 XTEN并且使用相当的剂量施用给受试者的有效负载相比在治疗窗内所耗费 的时间增加。在治疗窗内所耗费的时间增加可以比未经修饰的有效负载长至 少三倍，或者，比未连接到XTEN的有效负载长至少四倍、或五倍、或六倍、 或七倍、或八倍、或九倍、或至少10倍、或至少20倍、或至少约30倍、或 至少约50倍、或至少约100倍。
在治疗方法的一个实施方案中，在维持治疗作用所需的给药方案下将与 未连接到XTEN的对应的有效负载相比约少两倍、或约少三倍、或约少四倍、 或约少五倍、或约少六倍、或约少八倍、或约少10倍或更多倍的缀合物或包 含缀合物的医药组合物的较小mol/kg量施用给有需要的受试者，并且缀合物 实现了与维持治疗作用所需的未连接到XTEN的有效负载的对应的mol/kg量 相当的曲线下面积。在另一个实施方案中，缀合物或包含缀合物的医药组合 物需要更低频率的投药用于受试者的常规治疗，其中缀合物或医药组合物的剂量大约每四天、大约每七天、大约每10天、大约每14天、大约每21天、 或大约每个月施用给受试者，并且缀合物实现了与未连接到XTEN并且施用 给受试者的对应的有效负载相当的曲线下面积。在另外其它的实施方案中， 在维持有效血液浓度所需的给药方案下将与未连接到XTEN的有效负载的对 应的量相比少约5％、或约10％、或约20％、或约40％、或约50％、或约60％、 或约70％、或约80％、或约90％mol/kg的缀合物的累计较小量施用给受试者， 而缀合物仍实现了与未连接到XTEN的对应的有效负载至少相当的曲线下面 积。累计较小量是历时至少约一周、或约14天、或约21天、或约一个月的 时段的量度。在这种方法的一些实施方案中，治疗作用是在本领域中已知与 有待治疗或预防的受试者的潜在病状相关的测量参数、临床症状或终点。
在一个实施方案中，本发明提供了一种体外治疗癌细胞的方法，其包括 向癌细胞的培养物施用包含有效量的XTEN-有效负载组合物的组合物，其中 第一有效负载是靶向部分并且第二有效负载是表21的毒素。在另一个实施方 案中，本发明提供了一种治疗受试者的癌症的方法，其包括向受试者施用包 含有效量的XTEN-有效负载组合物的医药组合物，其中第一有效负载是靶向 部分并且第二有效负载是表21的毒素。在这种方法的一个实施方案中，医药 组合物包含具有图117中所阐述的结构的组合物。在这种方法的另一个实施方案中，癌症选自由非小细胞肺癌或间皮瘤、铂类耐药卵巢癌、子宫内膜癌、 肺腺癌和难治性晚期肿瘤组成的组。在这种方法的另一个实施方案中，投药 使得至少一个、两个或三个与癌症相关的参数与未经治疗的受试者相比改进 至少10％、或20％、或30％、或40％、或50％、或60％、或70％、或80％、 或90％以上，其中这些参数选自由以下组成的组：如由实体肿瘤反应评估标 准(Response Evaluation Criteria in Solid Tumors；RECIST)定义的反应率、癌症 进展时间(复发)、发现局部复发、发现区域转移、发现远端转移、症状发作、住院治疗、止痛药需求增大、补救性化学疗法的需求、补救性手术的需求、 补救性放射疗法的需求、治疗失败时间以及增加的存活时间。
在另一个方面，本发明提供了一种治疗患有疾病的受试者的方案，所述 方案包括包含本文所描述的实施方案中的任一者的缀合物的组合物。在这种 方案的一个实施方案中，方案进一步包括确定在患者中实现治疗作用所需的 包含CFXTEN的医药组合物的量的步骤。
本发明提供了包含用于患病受试者的治疗方案的缀合物，这种治疗方案 包括施用包含本文所描述的实施方案中的任一者的缀合物的医药组合物，这 种医药组合物以有效量分两个或更多个连续剂量施用，其中投药使得至少一 个与疾病相关的参数有改进。
VII).缀合试剂盒
在另一个方面，本发明提供了一种用以有助于XTEN-交联剂缀合组合物 的使用的试剂盒。在一个实施方案中，试剂盒包含配制品中的XTEN-交联剂、 容器以及在容器上或与容器相关联的标签。在前述实施方案中，XTEN-交联 剂可以是本文所描述的实施方案中的任一者。容器容纳了在适合用于缀合反 应的缓冲液中的规定浓度的XTEN-交联剂以连接到有效负载。
VIII).医药试剂盒
在另一个方面，本发明提供了一种用以有助于缀合组合物的使用的试剂 盒。试剂盒包含本文所提供的医药组合物、容器以及在容器上或与容器相关 联的标签或包装说明书。适合的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器等，其由 如玻璃或塑料等多种材料形成。容器容纳了有效治疗受试者的呈配制品形式 的医药组合物并且可以具有无菌进入孔(例如，容器可以是静脉内溶液袋或具 有可用皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。包装说明书可以列出药物获批准的适 应症、用于获批准的适应症的药物的复原和/或投药的说明、适当剂量和安全 性信息，以及鉴别药物的批号和有效期的信息。在前述的另一个实施方案中， 试剂盒可以包含第二容器，这个容器可以携带适用于医药组合物的稀释剂， 这种稀释剂的使用将向使用者提供将要递送给受试者的适当浓度。在另一个 实施方案中，试剂盒在至少第一容器中包含：第一容器：足以施用来治疗患 有疾病的受试者的缀合组合物药物的量；一定量的医药学上可接受的载剂； 可以携带适用于主题组合物的稀释剂的第二容器，这种稀释剂将向使用者提 供将要递送给受试者的医药组合物的适当浓度；连同鉴别药物和储存和处理 条件的标签，和/或药物获批准的适应症的表单，以及用于治疗获批准的适应 症的药物的复原和/或投药的说明、适当剂量和安全性信息，以及鉴别药物的 批号和有效期的信息。
IX).本发明的核酸序列
本发明提供了编码缀合物的多肽组分的经分离的多核酸以及与编码缀合 物的多肽组分的多核酸分子互补的序列。在一些实施方案中，本发明提供了 编码本文所描述的缀合物实施方案中的任一者的XTEN的多核酸，或多核酸 的补体。在一个实施方案中，多核酸编码选自由表2和3中所阐述的XTEN 组成的组的XTEN，或多核酸的补体。
在其它实施方案中，本发明提供了编码连接到本文所描述的实施方案中 的任一者的裂解序列、亲和标签和辅助序列蛋白质的XTEN的多核酸，或多 核酸的补体。在一个实施方案中，多核酸编码选自由表7、18、19和21中所 阐述的蛋白质有效负载组成的组的蛋白质有效负载，或多核酸的补体。
在一个实施方案中，本发明涵盖了用以产生编码XTEN和连接到裂解序 列、亲和标签和辅助序列蛋白质实施方案的XTEN的多核酸，或与多核酸互 补的序列(包括其同源变异体)的方法。一般来说，并且如图38和39中所说明， 产生编码XTEN并且表达所得基因产物的多核苷酸序列的方法包括组装编码 XTEN的核苷酸，框内接合组分，将编码基因并入到适于宿主细胞的表达载 体中，用表达载体转化适当宿主细胞，以及在促使或允许XTEN表达于经转 化的宿主细胞中的条件下培养宿主细胞，由此产生XTEN多肽，这种多肽是 通过本文所描述的方法或通过本领域中已知的标准蛋白质纯化方法来回收。 分子生物学中的标准重组技术被用来制造本发明的多核苷酸和表达载体。
根据本发明，编码XTEN或连接到裂解序列、亲和标签和辅助序列蛋白 质(或其补体)的XTEN的核酸序列用于产生重组DNA分子，这些分子引导在 适当宿主细胞中表达。若干克隆策略适用于执行本发明，其中许多用于产生 包含编码本发明的XTEN或有效复合物组合物的基因或其补体的构建体。在 一个实施方案中，克隆策略用于形成编码XTEN的基因，这种基因包含编码 XTEN的核苷酸并且用来转化用于表达XTEN组合物的宿主细胞。在这一段 的上文所描述的前述实施方案中，基因可以进一步包含编码裂解序列、亲和 标签和辅助序列的核苷酸。在另一个实施方案中，克隆策略用于形成编码蛋 白质有效负载的基因，这种基因包含编码有效负载的核苷酸并且用来转化用 于表达有效负载组合物的宿主细胞。
在设计所需的XTEN序列中发现，尽管在形成XTEN编码序列中使用“构 建基块”分子法，但仍实现了本发明组合物的XTEN的非重复性质。这是通过 使用上文所描述的编码肽序列基序的多核苷酸的文库来实现，这些序列基序 然后进化接合和/或多聚以形成编码XTEN序列的基因(见图38和39以及实 施例)。因此，虽然经表达的多肽的XTEN可以由少至四个不同序列基序的多 个单元组成，但因为这些基序本身由非重复的氨基酸序列组成，所以促使总 XTEN序列是非重复的。因此，在一个实施方案中，XTEN编码多核苷酸包 含多个多核苷酸，这些多核苷酸编码框内可操作地连接的非重复序列或基序， 并且其中所得经表达的XTEN氨基酸序列是非重复的。
在一种方法中，首先制备含有对应于XTEN的DNA序列的构建体。用 于制备这些构建体的示范性的方法描述于实施例中。然后，使用构建体来形 成适合于转化宿主细胞，如原核宿主细胞(例如，大肠杆菌)的表达载体，这种 宿主细胞用于表达和回收XTEN。用于形成表达载体、转化宿主细胞以及表 达和回收XTEN的示范性的方法描述于实施例中。
编码XTEN的基因可以分一个或多个步骤，以完全合成方式或通过与酶 促过程组合合成来制造，这些酶促过程如限制酶介导的克隆、PCR和重叠延 伸，包括实施例中更全面描述的方法。本文所公开的方法可以例如用于将编 码XTEN的多核苷酸的短序列接合到所需长度和序列的较长XTEN基因中。 在一个实施方案中，这种方法接合两个、三个、四个或更多个经密码子优化 的寡核苷酸，其编码约9个到14个氨基酸、或约12个到20个氨基酸、或约18个到36个氨基酸、或约48个至约144个氨基酸、或约144个至约288个 或更长的XTEN基序或区段序列，或前述范围的基序或区段长度的任何组合。 或者，所公开的方法用于使XTEN编码序列多聚成所需程度的更长序列；例 如，编码XTEN的36个氨基酸的基因可以二聚成编码72个氨基酸的基因， 然后是144个，然后是288个，等等。即使进行多聚，也可以通过设计经选 择用于所使用的最短单元的基序的密码子来构建XTEN多肽以使得XTEN编 码基因具有很低的或几乎没有重复性，这可以减少经转化的宿主中的编码基 因的重组并增加其稳定性。使用标准基因合成技术从寡核苷酸来组装编码具 有非重复序列的XTEN的基因。可以使用优化密码子使用和氨基酸组成的算 法来进行基因设计。在本发明的一种方法中，如上文所描述，形成相对短的 XTEN编码多核苷酸构建体的文库，然后加以组装。然后，将所得基因与编 码有效负载肽或多肽的基因一起组装，并且使用所得基因来转化宿主细胞并 产生和回收XTEN-有效负载用于如本文所描述评估其特性。
然后，可以将编码XTEN和其所连接的肽序列的所得多核苷酸个别地克 隆到表达载体中。通过多种程序将核酸序列插入到载体中。一般来说，使用 本领域中已知的技术将DNA插入到适当限制性核酸内切酶位点中。载体组分 一般包括(但不限于)信号序列、复制起点、一个或多个标志基因、增强子元件、 启动子和转录终止序列中的一者或多者。含有这些组分中的一者或多者的适 合载体的构建采用熟练的技术人员所知的标准接合技术。这些技术在本领域 中是众所周知的并且充分描述于科学和专利文献中。各种载体是公开可用的。 载体可以是例如呈适宜进行重组DNA程序的质粒、粘粒、病毒粒子或噬菌体 的形式，并且载体的选择将通常取决于其所引入的宿主细胞。因此，载体可 以是自主复制载体，即，以染色体外实体形式存在的载体，其复制与染色体 复制无关，例如质粒。或者，载体可以是当引入到宿主细胞中时整合到宿主 细胞基因组中并且与其所整合的染色体一起复制的载体。代表性质粒在图17 中说明，其中描画了FVIII和XTEN组分的不同构型的编码区。
本发明提供了含有复制和控制序列的质粒表达载体的用途，这些序列与 宿主细胞相容并且由宿主细胞识别，并且可操作地连接到用于多肽的受控表 达的编码多肽的基因。载体通常带有复制位点，以及编码能够在经转化的细 胞中提供表型选择的蛋白质的序列。这些载体序列对于多种细菌、酵母和病 毒是熟知的。可以使用的适用表达载体包括例如染色体、非染色体和合成 DNA序列的区段。“表达载体”指的是含有DNA序列的DNA构建体，这种 DNA序列可操作地连接到能够实现在适合宿主中表达编码多肽的DNA的适 合控制序列。要求载体在所选宿主细胞中是可复制的和有活力的。必要时， 可以使用低拷贝数或高拷贝数的载体。
适合的载体包括(但不限于)SV40和pcDNA的衍生物，以及已知的细菌 质粒，例如col EI、pCRl、pBR322、pMal-C2、pET、pGEX(如Smith等人,Gene 57:31-40(1988)所描述)、pMB9和其衍生物、如RP4的质粒、如噬菌体I的 众多衍生物(如NM98 9)的噬菌体DNA，以及如M13和丝状单链噬菌体DNA 的其它噬菌体DNA；酵母质粒，例如2微米质粒或2m质粒的衍生物，以及 着丝粒和整合酵母穿梭载体；适用于真核细胞中的载体，例如适用于昆虫或 哺乳动物细胞中的载体；来源于质粒与噬菌体DNA的组合的载体，例如，已 经过修饰以采用噬菌体DNA或表达控制序列的质粒；等等。在本发明中也可 以使用的酵母表达系统包括(但不限于)非融合pYES2载体(Invitrogen)、融合 pYESHisA、B、C(Invitrogen)、pRS载体，等等。载体的控制序列包括用以 实现转录的启动子、用以控制这种转录的任选的操纵序列、编码适合的mRNA 核糖体结合位点的序列，以及控制转录和翻译的终止的序列。启动子可以是 任何DNA序列，其可以在所选宿主细胞中显示出转录活性并且可以来源于编 码与宿主细胞同源或异源的蛋白质的基因。适合用于表达载体与原核宿主中 的启动子包括β-内酰胺酶和乳糖启动子系统[Chang等人,Nature,275:615 (1978)；Goeddel等人,Nature,281:544(1979)]、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动 子系统[Goeddel,Nucleic Acids Res.,8:4057(1980)；EP 36,776]，以及杂合启动 子，如tac启动子[deBoer等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80:21-25(1983)]， 所有启动子都可操作地连接到编码CFXTEN多肽的DNA。用于细菌系统中 的启动子还可以含有夏因-达尔加诺(Shine-Dalgarno；S.D.)序列，其可操作地 连接到编码CFXTEN多肽的DNA。
本发明提供了包括但不限于以下实施方式：
1.一种产生包含XTEN序列的基本上同质的群体的组合物的方法，所述 方法包括：
a.提供包含至少一个具有选自表6中所阐述的序列的组的氨基酸序列的 多肽的多肽组合物，其中所述氨基酸序列包含至少一个裂解序列，
b.在有效地使所述裂解序列裂解的条件下用胰蛋白酶处理所述多肽组合 物；并且
其中所得到的XTEN序列的基本上同质的群体中至少95％、96％、97％、 98％或99％的个别序列具有相同的序列长度。
2.如实施方式1所述的方法，其进一步包括：
a.在有效地捕获所述XTEN序列而不是所述蛋白酶的条件下使所述 XTEN序列吸附到色谱底物上；
b.洗脱所述XTEN序列；以及
c.回收所述XTEN序列，其中所述群体的至少90％、91％、92％、93％、 94％、95％、96％、97％、98％或99％的个别分子具有相同的序列长度。
3.如实施方式2所述的方法，其中所述色谱底物是阴离子交换底物。
4.如实施方式3所述的方法，其中所述阴离子交换底物选自由macrocap Q、captoQ、superQ-650M和poros D组成的组。
5.如实施方式1至4中任一项所述的方法，其中所述XTEN序列与选自 表6中所阐述的氨基酸序列的组的序列具有至少约90％、91％、92％、93％、 94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。
6.如实施方式1至5中任一项所述的方法，其中所述XTEN序列与选自 表2或3中所阐述的氨基酸序列的组的序列具有至少约90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。
7.一种组合物，其是通过如实施方式1至6中任一项所述的方法来产生。
8.一种组合物，其包含多肽的基本上同质的群体，所述多肽包含延伸重 组多肽(XTEN)，并且其中所述群体中至少90％、91％、92％、93％、94％或 95％的个别多肽分子具有相同的序列长度。
9.如实施方式8所述的组合物，其中所述XTEN的特征在于：
a.所述XTEN包含约36个至约3000个氨基酸残基；
b.甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P) 残基的总和占所述XTEN的总氨基酸残基的约90％以上；
c.所述XTEN序列是基本上非重复的，以使得(i)所述XTEN序列不含有 相同的三个连续氨基酸，除非所述氨基酸是丝氨酸，(ii)至少约80％的所述 XTEN序列由非重叠的序列基序组成，所述序列基序中的每一者包含约9个 至约14个氨基酸残基，其中任何两个连续氨基酸残基在所述序列基序中的每 一者中不会出现两次以上；或(iii)所述XTEN序列具有小于10的子序列计分；
d.如通过GOR算法所测定，所述XTEN序列具有大于90％的无规卷曲 形成率；
e.如通过Chou-Fasman算法所测定，所述XTEN序列具有小于2％的α 螺旋和2％的β折叠；以及
f.当通过TEPITOPE算法进行分析时，所述XTEN序列缺乏预测的T细 胞表位，其中对于所述XTEN序列内的表位的所述TEPITOPE算法预测是基 于-9的计分。
10.如实施方式8所述的组合物，其中所述XTEN包含与选自由表2、表 3、表4和表22-25中所阐述的序列组成的组的序列具有至少约90％、或至少 约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或 至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％、或100％的序 列同一性的序列。
11.如实施方式8所述的组合物，其进一步包含第一亲和标签。
12.如实施方式11所述的组合物，其中所述第一亲和标签对选自由疏水 相互作用色谱(HIC)底物、阳离子交换底物、阴离子交换底物、固定化金属离 子亲和色谱(IMAC)底物和固定化抗体底物组成的组的色谱底物具有结合亲 和力。
13.如实施方式11所述的组合物，其中所述第一亲和标签选自由表7中 所阐述的序列组成的组。
14.如实施方式11至13中任一项所述的组合物，其进一步包含辅助序列。
15.如实施方式14所述的组合物，其中所述辅助序列包含与选自由表10 中所阐述的序列组成的组的序列具有至少约90％、或至少约91％、或至少约 92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至 少约97％、或至少约98％、或至少约99％、或100％的序列同一性的序列。
16.如实施方式14所述的组合物，其中所述辅助序列选自由以下组成的 组：
a.KNPEQAEEQX1EET，其中X1独立地是S或R；
b.ANPEQAEEQX1EET，其中X1独立地是S或R；
c.KNPEQAEEQAEEQX1EET，其中X1独立地是S或R；
d.KX2X3EQAEEQAEEQX1EET，其中X1独立地是S或R，X2独立地 是K或N，并且X3独立地是K、N、T、Q、H、P、E、D、A、R或S；
e.KX2(X3)10QX1EET，其中X1独立地是S或R，X2独立地是K或N， 并且X3独立地是K、N、T、Q、H、P、E、D、A、R或S；
f.KX2(X3)7AEEQX1EET，其中X1独立地是S或R，X2独立地是K或 N，并且X3独立地是K、N、T、Q、H、P、E、D、A、R或S；
g.KX2X3EQE(X3)3AEEQREET，其中X2独立地是K或N，并且X3独 立地是K、N、T、Q、H、P、E、D、A、R或S；
h.KX2X3EQE(X3)3AEE(X3)5，其中X2独立地是K或N，并且X3独立 地是K、N、T、Q、H、P、E、D、A、R或S；
i.KKQEQEKEQAEEQ(X4X5)2REET，其中X4独立地是A或S，并且 X5独立地是K、Q或E；KKQEQEKEQAEEQ(X4X5)4REET，其中X4独立 地是A或S，并且X5独立地是K、Q或E；
j.KKQEQEKEQAEEQ(Z)4REET，其中Z是任何天然存在的L-氨基酸；
k.KX2(X3)n，其中n是10至40的整数，并且X2独立地是K或N，并 且X3独立地是K、N、T、Q、H、P、E、D、A、R或S；
l.(X3)n，其中n是10至50的整数，并且X3独立地是K、N、T、Q、 H、P、E、D、A、R或S；
m.KX2QEQEKEQAEEQ(X4X5)nX1EET，其中n是0或1至10的整数， 并且X1独立地是S或R，X2独立地是K或N，X4独立地是A或S，并且 X5独立地是K、Q或E；
n.KX2(X3)n(X4X5)mX1EET，其中n是5至20的整数，m是0或1至 10的整数，X1独立地是S或R，X2独立地是K或N，X3独立地是K、N、 T、Q、H、P、E、D、A、R或S，X4独立地是A或S，并且X5独立地是K、 Q或E；以及
o.KX2(X3)n(Z)mX1EET，其中n是5至20的整数，m是0或1至10的 整数，X1独立地是S或R，X2独立地是K或N，X3独立地是K、N、T、Q、 H、P、E、D、A、R或S，并且Z是任何天然存在的L-氨基酸。
17.如实施方式11至16中任一项所述的组合物，其进一步包含第一裂解 序列，其中所述第一裂解序列选自由表8和表9中所阐述的序列组成的组。
18.如实施方式17所述的组合物，其中所述组合物具有式I的构型：
(HS)-(AT1)-(CS1)-(XTEN) I
其中
a.HS是所述辅助序列；
b.AT1是所述第一亲和标签；
c.CS1是所述第一裂解序列；以及
d.XTEN是所述延伸重组多肽。
19.如实施方式17所述的组合物，其进一步包含第二裂解序列，其中所 述第一裂解序列和所述第二裂解序列能够用相同的蛋白酶裂解，并且其中所 述组合物具有式II的构型：
(HS)-(CS1)-(XTEN)-(CS2)-(AT1) II
其中
a.HS是辅助序列；
b.AT1是所述第一亲和标签；
c.CS1是所述第一裂解序列；
d.CS2是所述第二裂解序列；以及
e.XTEN是所述延伸重组多肽。
20.如实施方式18或19所述的组合物，其中所述第一亲和标签包含序 列RPRPRPRPRPRPR或HHHHHH。
21.如实施方式11至17中任一项所述的组合物，其进一步包含第二亲和 标签和第二裂解序列，其中所述第二亲和标签相较所述第一亲和标签对不同 的色谱底物具有结合亲和力，其中所述色谱底物选自由HIC底物、阳离子交 换底物、阴离子交换底物、IMAC底物和固定化抗体底物组成的组，并且其 中所述第一裂解序列和所述第二裂解序列能够用相同的蛋白酶裂解。
22.如实施方式21所述的组合物，其中所述第二亲和标签不同于所述第 一亲和标签，并且所述第二亲和标签选自表7中所阐述的序列的组。
23.如实施方式21或实施方式22所述的组合物，其中所述组合物具有 式III的构型：
(HS)-(AT1)-(CS1)-(XTEN)-(CS2)-(AT2) III
其中
a.HS是所述辅助序列；
b.AT1是所述第一亲和标签；
c.CS1是所述第一裂解序列；
d.CS2是所述第二裂解序列；
e.XTEN是所述延伸重组多肽；以及
f.AT2是所述第二亲和标签。
24.如实施方式23所述的组合物，其中所述第一亲和标签包含序列RPRPRPRPRPRPR，并且所述第二亲和标签包含序列HHHHHH。
25.如实施方式23所述的组合物，其中所述第一亲和标签包含序列 HHHHHH，并且所述第二亲和标签包含序列RPRPRPRPRPRPR。
26.一种包含多肽的基本上同质的群体的组合物，其是通过包括以下的 工艺来获得：
a.在一定条件下于发酵反应物中培养包含编码所述多肽的载体的宿主细 胞，所述条件有效地表达所述多肽作为所述宿主细胞的粗表达产物的组分， 其中所述经编码的多肽包含XTEN、第一裂解序列和第一亲和标签；
b.在一定条件下使所述粗表达产物的所述多肽吸附到第一色谱底物上， 所述条件有效地将所述第一亲和标签捕获到所述第一色谱底物上；
c.洗脱所述多肽；以及
d.回收所述多肽，其中所述群体的至少90％、91％、92％、93％、94％或 95％的所述多肽具有相同的序列长度。
27.如实施方式26所述的组合物，其中所述第一色谱底物选自由HIC底 物、阳离子交换底物、阴离子交换底物和IMAC底物组成的组。
28.如实施方式26所述的组合物，其中所述亲和标签选自由表7的亲和 标签组成的组。
29.如实施方式27所述的组合物，其中所述第一色谱底物是阳离子交换 底物，并且所述第一亲和标签包含序列RPRPRPRPRPRPR。
30.如实施方式27所述的组合物，其中所述第一色谱底物是IMAC底物， 并且所述第一亲和标签包含序列HHHHHHHH。
31.如实施方式26所述的组合物，其中所述载体编码如实施方式11至 19中任一项所述的多肽。
32.如实施方式26至28中任一项所述的组合物，其中所述载体进一步 编码第二裂解序列和第二亲和标签，其中所述第一裂解序列和所述第二裂解 序列能够用相同的蛋白酶裂解，并且其中所述第二亲和标签相较所述第一亲 和标签对第二、不同的色谱底物具有结合亲和力，并且其中所述组合物是通 过进一步包括以下的工艺来获得：
a.在一定条件下使所述多肽吸附到第二色谱底物上，所述条件有效地将 所述第二亲和标签捕获到所述第二色谱底物上；
b.洗脱所述多肽；以及
c.回收所述多肽，其中所述群体的至少90％、91％、92％、93％、94％或 95％的所述多肽具有相同的序列长度。
33.如实施方式32所述的组合物，其中所述载体编码如实施方式23所 述的多肽。
34.如实施方式32所述的组合物，其中第一色谱底物不同于所述第二色 谱底物，并且所述第一色谱底物和所述第二色谱底物中的每一者独立地选自 由HIC底物、阳离子交换底物、阴离子交换底物和IMAC底物组成的组。
35.如实施方式32所述的组合物，其中所述第一色谱底物是阳离子交换 底物并且所述第一亲和标签包含序列RPRPRPRPRPRPR，并且所述第二色谱 底物是IMAC底物并且所述第一亲和标签包含序列HHHHHHHH。
36.如实施方式32所述的组合物，其中所述第一色谱底物是IMAC底物 并且所述第一亲和标签包含序列HHHHHHHH，并且所述第二色谱底物是阳 离子交换底物并且所述第一亲和标签包含序列RPRPRPRPRPRPR。
37.如实施方式23至28或32至34中任一项所述的组合物，所述工艺 进一步包括：
a.在有效地使所述裂解序列裂解的条件下用蛋白酶处理所述组合物，由 此从所述亲和标签中释放所述XTEN；
b.在有效地捕获所述XTEN而不是所述亲和标签或所述蛋白酶的条件下 使所述XTEN吸附到色谱底物上；
c.洗脱所述XTEN；以及
d.回收所述XTEN，其中至少90％、91％、92％、93％、94％或95％的个 别XTEN分子具有相同的序列长度。
38.如实施方式37所述的组合物，其中所述裂解序列能够用选自由表9 的蛋白酶组成的组的蛋白酶裂解。
39.如实施方式38所述的组合物，其中所述裂解序列能够用胰蛋白酶裂 解，其中所述序列选自由表8中所阐述的序列组成的组，并且其中所述蛋白 酶是胰蛋白酶。
40.如实施方式37或38所述的组合物，其中所述色谱底物是阴离子交 换底物。
41.如实施方式40所述的组合物，其中所述阴离子交换色谱底物选自由 macrocapQ、capto Q、superQ-650M和poros D组成的组。
42.如实施方式23至28或32至34中任一项所述的组合物，所述工艺 进一步包括：
a.在有效地使所述裂解序列裂解的条件下用蛋白酶处理所述组合物，由 此从所述亲和标签中释放所述XTEN；
b.在有效地捕获所述蛋白酶而不是所述XTEN的条件下使所述蛋白酶吸 附到色谱底物上；以及
c.从洗脱物中回收所述XTEN，其中至少90％、91％、92％、93％、94％ 或95％的个别XTEN分子具有相同的序列长度。
43.如实施方式42所述的组合物，其中所述裂解序列能够用选自由表9 的蛋白酶组成的组的蛋白酶裂解。
44.如实施方式42或43所述的组合物，其中所述裂解序列能够用胰蛋 白酶裂解，其中所述序列选自由表8中所阐述的序列组成的组，并且其中所 述蛋白酶是胰蛋白酶。
45.如实施方式42至44中任一项所述的组合物，其中所述色谱底物是 阳离子交换底物、HIC底物或IMAC底物中的一者或多者。
46.一种包含XTEN序列的组合物，其中所述XTEN序列进一步包含一 个或多个能够用胰蛋白酶裂解的裂解序列，并且其中在有效地使所有所述裂 解序列裂解的条件下用胰蛋白酶处理得到XTEN片段的制剂，其中每个XTEN 片段与所述制剂中所有其它的片段具有至少约95％、96％、97％、98％或99％ 的序列同一性。
47.如实施方式46所述的组合物，其中所述裂解序列与序列SASRSA或 SASKSA具有至少86％的序列同一性或与序列SASRSA或SASKSA相同。
48.如实施方式46所述的组合物，其中所述裂解序列包含序列RX或KX， 其中X是除了脯氨酸以外的任何L-氨基酸。
49.如实施方式46所述的组合物，其中所述组合物与选自表6中所阐述 的序列的组的序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、 97％、98％、99％或100％的序列同一性。
50.一种在宿主细胞中产生XTEN序列的方法，所述方法包括在一定条 件下于发酵反应物中培养包含编码包含a)所述XTEN序列和b)辅助序列的多 肽的载体的宿主细胞，所述条件有效地以大于约2克/升(g/L)、或约3g/L、 或约4g/L、或约5g/L、或约6g/L、或约7g/L的所述多肽的浓度表达所述 多肽作为粗表达产物的组分。
51.一种在宿主细胞中产生XTEN序列的方法，所述方法包括在一定条 件下于发酵反应物中培养包含编码包含a)所述XTEN序列和b)辅助序列的多 肽的载体的宿主细胞，所述条件有效地以大于约10毫克/克宿主细胞干重 (mg/g)、或至少约15mg/g、或至少约20mg/g、或至少约25mg/g、或至少约 30mg/g、或至少约40mg/g、或至少约50mg/g的所述多肽的浓度表达所述多 肽作为粗表达产物的组分。
52.一种在宿主细胞中产生XTEN序列的方法，所述方法包括在一定条 件下于发酵反应物中培养包含编码包含a)所述XTEN序列和b)辅助序列的多 肽的载体的宿主细胞，所述条件有效地以大于约10毫克/克宿主细胞干重 (mg/g)、或至少约250微摩尔/升、或约300微摩尔/升、或约350微摩尔/升、 或约400微摩尔/升、或约450微摩尔/升、或约500微摩尔/升的所述多肽的 浓度表达所述多肽作为粗表达产物的组分。
53.如实施方式50至52中任一项所述的方法，其中所述浓度是在所述 发酵反应物在600nm的波长下达到至少130的光密度时测量的。
54.如实施方式50至52中任一项所述的方法，其中所述经表达的多肽 的所述辅助序列是在所述多肽的N端，并且其中所述辅助序列与选自由表10 中所阐述的序列组成的组的序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％或 95％的序列同一性或与选自由表10中所阐述的序列组成的组的序列相同。
55.如实施方式54所述的方法，其中所述载体编码如实施方式14至17 中任一项所述的多肽。
56.如实施方式55所述的方法，其进一步包括
a.回收所述宿主细胞发酵反应混合物的所述粗表达产物；
b.在一定条件下使所述粗表达产物的所述多肽吸附到第一色谱底物上， 所述条件有效地将所述多肽的第一亲和标签捕获到所述色谱底物上，其中所 述第一色谱底物选自由HIC底物、阳离子交换底物、阴离子交换底物和IMAC 底物组成的组；
c.洗脱并回收所述XTEN序列，其中至少90％、91％、92％、93％、94％ 或95％的所述多肽具有相同的序列长度。
57.如实施方式50至52中任一项所述的方法，其中所述载体编码如实 施方式21至23中任一项所述的多肽。
58.如实施方式57所述的方法，其进一步包括：
a.回收所述宿主细胞发酵反应混合物的所述粗表达产物；
b.在一定条件下使所述多肽吸附到第一色谱底物上，所述条件有效地将 所述多肽的第一亲和标签捕获到所述色谱底物上，其中所述第一色谱底物选 自由HIC底物、阳离子交换底物、阴离子交换底物和IMAC底物组成的组；
c.洗脱所述多肽；
d.在一定条件下使所述多肽吸附到第二色谱底物上，所述条件有效地将 所述多肽的所述第二亲和标签捕获到所述色谱底物上，其中所述第二色谱底 物选自由HIC底物、阳离子交换底物、阴离子交换底物和IMAC底物组成的 组；
e.洗脱所述多肽；以及
f.回收所述XTEN序列，其中至少90％、91％、92％、93％、94％或95％ 的所述多肽具有相同的序列长度。
59.如实施方式56或58所述的方法，所述方法进一步包括：
a.在有效地使裂解序列裂解的条件下用蛋白酶处理所述多肽，由此从所 述多肽中释放所述XTEN；
b.在有效地捕获所述XTEN的条件下使所述XTEN吸附到阴离子色谱底 物上；
c.洗脱所述XTEN；以及
d.回收所述XTEN，其中至少90％、或至少91％、或至少92％、或至少 93％、或至少94％、或至少95％的个别XTEN分子具有相同的序列长度。
60.如实施方式59所述的方法，其中所述阴离子色谱底物选自由 macrocap Q、capto Q、superQ-650M和poros D组成的组。
61.如实施方式59或60所述的方法，其中所述蛋白酶是胰蛋白酶，并 且其中所述序列选自由表8中所阐述的序列组成的组。
62.如实施方式56或实施方式58所述的方法，所述方法进一步包括：
a.在有效地使裂解序列裂解的条件下用蛋白酶处理所述多肽，由此从所 述多肽中释放所述XTEN；
b.在有效地捕获所述蛋白酶而不是所述XTEN的条件下使所述蛋白酶吸 附到色谱底物上；以及
c.回收洗脱物中的所述XTEN，其中至少90％、91％、92％、93％、94％ 或95％的所述XTEN具有相同的序列长度。
63.如实施方式62所述的方法，其中所述蛋白酶是胰蛋白酶，并且其中 所述序列选自由表8中所阐述的序列组成的组。
64.如实施方式62或实施方式63所述的方法，其中所述色谱底物是HIC 底物、阳离子交换底物和IMAC底物中的一者或多者。
65.一种固体支撑物，其包含固定在上面的基本上相同的多肽的群体， 其中所述固体支撑物包含色谱底物，并且所述经固定的多肽各自包含XTEN、 第一亲和标签和第二亲和标签，其中：
a.所述第一亲和标签是通过在所述XTEN的N端的裂解序列连接到所述 XTEN；
b.所述第二亲和标签是通过在所述XTEN的C端的裂解序列连接到所述 XTEN；
c.所述第二亲和标签不同于所述第一亲和标签；
d.所述色谱底物能够结合到所述第一亲和标签或所述第二亲和标签而不 同时结合两者；以及
e.至少90％、91％、92％、93％、94％或95％的所述经固定的多肽分子具 有相同的序列长度。
66.如实施方式65所述的固体支撑物，其中所述经固定的多肽分子包含 如实施方式21至25中任一项所述的多肽。
67.如实施方式65或实施方式66所述的固体支撑物，其中所述裂解序 列与序列SASRSA或SASKSA具有至少约86％的序列同一性或与序列 SASRSA或SASKSA相同。
68.如实施方式65或实施方式66所述的固体支撑物，其中所述裂解序 列包含序列RX或KX，其中X是除了脯氨酸以外的任何L-氨基酸。
69.如实施方式65至68中任一项所述的固体支撑物，其中所述固体支 撑物选自由HIC色谱树脂、阳离子交换色谱树脂、阴离子交换色谱树脂和 IMAC色谱树脂组成的组。
70.如实施方式69所述的组合物，其中所述第一亲和标签包含序列RPRPRPRPRPRPR，并且所述第二亲和标签包含序列HHHHHH。
71.如实施方式69所述的组合物，其中所述第一亲和标签包含序列 HHHHHH，并且所述第二亲和标签包含序列RPRPRPRPRPRPR。
72.一种缀合组合物，其包含共价连接到至少第一交联剂的一个或多个 分子的XTEN，其中所述交联剂选自由表13中所阐述的交联剂、表15中所 阐述的炔烃反应物和表15中所阐述的叠氮化物反应物组成的组，并且所述 XTEN选自由如实施方式37所述的XTEN、如实施方式42所述的XTEN、 如实施方式7所述的XTEN、表2中所阐述的序列和表3中所阐述的序列组 成的组。
73.如实施方式72所述的缀合组合物，其中所述第一交联剂在选自由以 下组成的组的位置处缀合到至少第一XTEN：
a.所述XTEN的N端氨基酸残基的α-氨基；
b.所述XTEN的每个赖氨酸残基的ε-氨基；以及
c.所述XTEN的每个半胱氨酸残基的硫醇基。
74.如实施方式72或实施方式73所述的缀合组合物，其中所述XTEN 与选自表2和表3中所阐述的序列的组的序列具有至少约90％、或至少约 91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至 少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％、或100％的序列 同一性。
75.如实施方式74所述的缀合组合物，其中所述XTEN选自由以下组成 的组：AE144、AE288、AE432、AE576、AE864、Seg 174、Seg 175、Seg 176、 Seg 177、Seg 186、Seg187、Seg 188、Seg 189、Seg 190、Seg 191、Seg 192、 Seg 193、Seg 194、Seg 195、Seg 196、Seg 197、Seg 198和Seg 199，并且所 述交联剂缀合到所述XTEN的所述N端氨基酸的所述α-氨基。
76.如实施方式74所述的缀合组合物，其中所述XTEN选自由以下组成 的组：表3中所阐述的Seg 174、Seg 175、Seg 176、Seg 177、Seg 186、Seg 187、 Seg 188、Seg 189、Seg190、Seg 191、Seg 192、Seg 193、Seg 194、Seg 195、 Seg 196、Seg 197、Seg 198和Seg199，并且所述交联剂缀合到所述XTEN的 每个半胱氨酸残基的所述硫醇基。
77.如实施方式72至76中任一项所述的缀合物，其中所述第一交联剂 选自由以下组成的组：N-马来酰亚胺、碘乙酰基试剂、吡啶基二硫化物试剂、 乙烯基砜试剂、3-炔丙氧基丙酸、(氧乙基)n-乙炔(其中n是1-10)、二苯甲基 环辛炔(DBCO)、环辛炔(COT)、3-叠氮-丙酸、6-叠氮-己酸和(氧乙基)n-叠氮 化物(其中n是1-10)。
78.如实施方式76所述的缀合组合物，其中所述第一交联剂缀合到所述 XTEN的每个半胱氨酸残基的所述硫醇基，并且所述缀合物进一步包含缀合 到所述XTEN的所述N端氨基酸的所述α-氨基的第二交联剂，其中所述交联 剂选自由表13中所阐述的交联剂、表15的炔烃反应物和表15的叠氮化物反 应物组成的组。
79.如实施方式78所述的缀合组合物，其具有式V的构型：
其中就各次出现独立而言；
a.CL1是缀合到所述XTEN的半胱氨酸残基的所述第一交联剂；
b.CL2是在所述N端缀合到XTEN的所述第二交联剂；
c.x是1至约10的整数；
d.y是整数1，其限制条件为x+y>2；
e.XTEN是包含x个半胱氨酸残基数的经半胱氨酸工程改造的XTEN。
80.如实施方式72至77中任一项所述的缀合组合物，其进一步包含缀 合到每个第一交联剂的第一有效负载的单原子残基，其中所述残基选自由碳、 氮、氧和硫组成的组。
81.如实施方式80所述的缀合组合物，其中所述单原子残基的所述第一 有效负载选自由表6、7、18和21中所阐述的有效负载组成的组。
82.如实施方式72至77中任一项所述的缀合组合物，其进一步包含缀 合到每个第一交联剂的选自由表6、7、18和21中所阐述的有效负载组成的 组的有效负载。
83.如实施方式78或实施方式79所述的缀合组合物，其进一步包含缀 合到所述第一交联剂中的每一者的第一有效负载的单原子残基，其中所述残 基选自由碳、氮、氧和硫组成的组，以及缀合到所述第二交联剂的第二有效 负载的单原子残基，其中所述残基选自由碳、氮、氧和硫组成的组。
84.如实施方式83所述的缀合组合物，其中所述单原子残基的所述第一 有效负载选自由表6、7、18和21中所阐述的有效负载组成的组，并且所述 单原子残基的所述第二有效负载是不同于所述第一有效负载的有效负载并且 选自由表6、7、18和21中所阐述的有效负载组成的组。
85.如实施方式78或79所述的缀合组合物，其进一步包含缀合到所述 第一交联剂中的每一者的第一有效负载，其中所述有效负载选自由表6、7、 18和21中所阐述的有效负载组成的组，以及缀合到所述第二交联剂的不同 于所述第一有效负载的第二有效负载，其中所述第二有效负载选自由表6、7、 18和21中所阐述的有效负载组成的组。
86.如实施方式78或实施方式79所述的缀合组合物，其进一步包含缀 合到所述第一交联剂中的每一者的第一有效负载，其中所述有效负载选自由 表21的药物部分组成的组，以及缀合到所述第二交联剂的不同于所述第一有 效负载的第二有效负载，其中所述第二有效负载选自由表21的靶向部分组成 的组。
87.如实施方式85或实施方式86所述的缀合组合物，其中所述第二有 效负载是由通过炔烃反应物与叠氮化物反应物的反应而缀合的所述第二交联 剂连接到所述XTEN的所述N端，所述反应物选自由表15的反应物组成的 组。
88.一种缀合组合物，其包含至少第一XTEN和第二XTEN，其中所述 XTEN是相同的或是不同的并且各自选自由如实施方式37所述的XTEN、如 实施方式42所述的XTEN、如实施方式7所述的XTEN和表3中所阐述的序 列组成的组，并且其中所述第一XTEN和所述第二XTEN是使用炔烃反应物 与叠氮化物反应物的反应而产生的交联剂通过所述第一XTEN和所述第二 XTEN的N端彼此缀合，所述反应物选自由表15的反应物组成的组。
89.如实施方式88所述的缀合组合物，其中所述第一XTEN和所述第二 XTEN是不同的，并且各自独立地与选自表3中所阐述的序列的组的序列具 有至少约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、 或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％、 或100％的序列同一性。
90.如实施方式89所述的缀合组合物，其中所述第一XTEN与选自由表 3中所阐述的Seg 174、Seg 175、Seg 176、Seg 177、Seg 186、Seg 187、Seg 188、 Seg 189、Seg 190、Seg 191、Seg 192、Seg 193、Seg 194、Seg 195、Seg 196、 Seg 197、Seg 198和Seg 199组成的序列的组的序列具有至少约90％、或至少 约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或 至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％、或100％的序 列同一性，并且所述第二XTEN与选自由表3中所阐述的Seg 174、Seg 175、 Seg176、Seg 177、Seg 186、Seg 187、Seg 188、Seg 189、Seg 190、Seg 191、 Seg 192、Seg 193、Seg 194、Seg 195、Seg 196、Seg 197、Seg 198和Seg 199 组成的序列的组的不同序列具有至少约90％、或至少约91％、或至少约92％、 或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、 或至少约98％、或至少约99％、或100％的序列同一性。
91.如实施方式88所述的缀合组合物，其中所述第一XTEN和所述第二 XTEN是相同的，并且各自与选自表3中所阐述的序列的组的序列具有至少 约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或 至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％、 或100％的序列同一性。
92.如实施方式91所述的缀合组合物，其中所述第一XTEN和所述第二 XTEN各自与选自由表3中所阐述的Seg 174、Seg 175、Seg 176、Seg 177、 Seg 186、Seg 187、Seg 188、Seg 189、Seg 190、Seg 191、Seg 192、Seg 193、 Seg 194、Seg 195、Seg 196、Seg 197、Seg198和Seg 199组成的序列的组的 序列具有至少约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至 少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％、或100％的序列同一性。
93.如实施方式88至92中任一项所述的缀合组合物，其中所述第一 XTEN和所述第二XTEN各自包含一个或多个半胱氨酸残基，并且进一步包 含缀合到所述第一XTEN的每个半胱氨酸残基的第一交联剂和缀合到所述第 二XTEN的每个半胱氨酸残基的第二交联剂，其中所述第一交联剂和所述第 二交联剂独立地选自由表13中所阐述的交联剂组成的组。
94.如实施方式88至92中任一项所述的缀合组合物，其中所述第一 XTEN和所述第二XTEN各自包含一个或多个赖氨酸残基，并且进一步包含 缀合到所述缀合物的所述第一XTEN和/或所述第二XTEN的每个赖氨酸残基 的交联剂，其中所述交联剂选自由表13中所阐述的交联剂组成的组。
95.如实施方式93或实施方式94所述的缀合组合物，其进一步包含缀 合到所述第一XTEN的每个交联剂的第一有效负载的单原子残基，其中所述 残基选自由碳、氮、氧和硫组成的组，并且进一步包含缀合到所述第二XTEN 的每个交联剂的第二有效负载的单原子残基，其中所述残基选自由碳、氮、 氧和硫组成的组。
96.如实施方式95所述的缀合组合物，其中所述单原子残基的所述第一 有效负载选自由表6、7、18和21中所阐述的有效负载组成的组，并且所述 单原子残基的所述第二有效负载是不同于所述第一有效负载的有效负载并且 选自由表6、7、18和21中所阐述的有效负载组成的组。
97.如实施方式93或实施方式94所述的缀合组合物，其进一步包含缀 合到所述第一XTEN的每个交联剂的第一有效负载，其中所述第一有效负载 选自由表6、7、18和21中所阐述的有效负载组成的组，并且进一步包含不 同于所述第一有效负载的第二有效负载，其中所述第二有效负载缀合到所述 第二XEN的每个交联剂，其中所述第二有效负载选自由表6、7、18和21中 所阐述的有效负载组成的组。
98.如实施方式93或实施方式94所述的缀合组合物，其进一步包含缀 合到所述第一XTEN的每个交联剂的第一有效负载，其中所述第一有效负载 选自由表18中所阐述的靶向部分组成的组，并且进一步包含不同于所述第一 有效负载的第二有效负载，其中所述第二有效负载缀合到所述第二XTEN的 每个交联剂，其中所述第二有效负载选自表18中所阐述的毒素的组。
99.如实施方式93或实施方式94所述的缀合组合物，其进一步包含缀 合到所述第一XTEN的每个交联剂的第一有效负载，其中所述第一有效负载 选自由表21中所阐述的靶向部分组成的组，并且进一步包含不同于所述第一 有效负载的第二有效负载，其中所述第二有效负载缀合到所述第二XTEN的 每个交联剂，其中所述第二有效负载选自表21中所阐述的毒素的组。
100.如实施方式99所述的缀合组合物，其中所述第一XTEN是表3的 Seg 176，并且所述第二XTEN选自由表3中所阐述的Seg 176和Seg 177组 成的组。
101.一种缀合组合物，其包含至少第一XTEN、第二XTEN和第三 XTEN，其中所述XTEN各自独立地选自由如实施方式37所述的XTEN、如 实施方式42所述的XTEN、如实施方式7所述的XTEN和表3中所阐述的序 列组成的组，其中所述第一XTEN和所述第二XTEN和所述第三XTEN是使 用选自由表13或表14中所阐述的三价交联剂组成的组的三价交联剂在N端彼此缀合。
102.如实施方式100所述的缀合组合物，其中所述三价交联剂选自由三 (2-马来酰亚胺基乙基)胺(TMEA)和胺反应性氨基三乙酸三(琥珀酰亚胺酯) (TSAT)组成的组。
103.如实施方式100至102中任一项所述的缀合组合物，其中所述第一 XTEN、所述第二XTEN和所述第三XTEN是相同的，并且各自与选自由表 3中所阐述的Seg 174、Seg 175、Seg 176、Seg 177、Seg 186、Seg 187、Seg 188、 Seg 189、Seg 190、Seg 191、Seg 192、Seg193、Seg 194、Seg 195、Seg 196、 Seg 197、Seg 198和Seg 199组成的组的序列具有至少约90％、或至少约91％、 或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、 或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％、或100％的序列同一性。
104.如实施方式100至102中任一项所述的缀合组合物，其中所述第一 XTEN和所述第二XTEN是相同的，并且各自与选自由表3中所阐述的Seg 174、Seg 175、Seg 176、Seg177、Seg 186、Seg 187、Seg 188、Seg 189、Seg 190、Seg 191、Seg 192、Seg 193、Seg 194、Seg 195、Seg 196、Seg 197、Seg 198和Seg 199组成的组的序列具有至少约90％、或至少约91％、或至少约 92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％、或100％的序列同一性，并且所 述第三XTEN不同于所述第一XTEN和所述第二XTEN，并且与选自由表3 中所阐述的Seg 174、Seg 175、Seg176、Seg 177、Seg 186、Seg 187、Seg 188、 Seg 189、Seg 190、Seg 191、Seg 192、Seg 193、Seg 194、Seg 195、Seg 196、 Seg 197、Seg 198和Seg 199组成的组的序列具有至少约90％、或至少约91％、 或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、 或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％、或100％的序列同一性。
105.如实施方式103或实施方式104所述的缀合组合物，其中所述缀合 物进一步包含缀合到所述第一XTEN的每个半胱氨酸残基的第一交联剂、缀 合到所述第二XTEN的每个半胱氨酸残基的第二交联剂和缀合到所述第三 XTEN的每个半胱氨酸残基的第三交联剂，其中所述交联剂选自由表13中所 阐述的交联剂组成的组。
106.如实施方式105所述的缀合组合物，其具有式XII的构型：
其中就各次出现独立而言；
a.3xCL是所述三价交联剂；
b.CL1是缀合到XTEN1的所述第一交联剂；
c.CL2是缀合到XTEN2的所述第二交联剂；
d.CL3是缀合到XTEN3的所述第三交联剂；
e.x是1至约10的整数；
f.y是1至约10的整数；
g.z是1至约10的整数，其限制条件为x+y+z>3；
h.XTEN1是所述第一XTEN；
i.XTEN2是所述第二XTEN；以及
j.XTEN3是所述第三XTEN。
107.如实施方式105或实施方式106所述的缀合组合物，其进一步包含
a.缀合到所述第一XTEN的每个第一交联剂的第一有效负载的单原子残 基，其中所述残基选自由碳、氮、氧和硫组成的组；
b.缀合到所述第二XTEN的每个第二交联剂的第二有效负载的单原子残 基，其中所述残基选自由碳、氮、氧和硫组成的组；以及
c.缀合到所述第三XTEN的每个第三交联剂的第三有效负载的单原子残 基，其中所述残基选自由碳、氮、氧和硫组成的组。
108.如实施方式105或106所述的缀合组合物，其进一步包含
a.缀合到所述第一XTEN的每个第一交联剂的第一有效负载，所述第一 有效负载选自由表6、7、18和21中所阐述的有效负载组成的组；
b.缀合到所述第二XTEN的每个第二交联剂的第二有效负载，所述第二 有效负载选自由表6、7、18和21中所阐述的有效负载组成的组，其中所述 有效负载与所述第一有效负载是相同的或是不同的；以及
c.缀合到所述第三XTEN的每个第三交联剂的第三有效负载，所述第三 有效负载选自由表6、7、18和21中所阐述的有效负载组成的组，其中所述 第三有效负载与所述第一有效负载或所述第二有效负载是相同的或是不同 的。
109.如实施方式108所述的缀合组合物，其中所述第一有效负载是对标 靶具有特异性结合亲和力的靶向部分，其中所述靶向部分选自由表17-19和 21中所阐述的靶向部分组成的组，并且所述第二有效负载和所述第三有效负 载是药物，其可以是相同的或可以是不同的，并且其中所述药物选自由表6、 表18和表21中所阐述的药物组成的组。
110.如实施方式109所述的缀合组合物，其中所述靶向部分选自由 LHRH和叶酸盐组成的组，并且其中所述药物选自由以下组成的组：阿霉素、 太平洋紫杉醇、奥利司他汀、单甲基奥利司他汀E(MMAE)、单甲基奥利司 他汀F、美登素、海兔毒素、卡奇霉素、长春花生物碱、喜树碱、丝裂霉素C、 埃博霉素、hTNF、Il-12、硼替佐米、豹蛙酶、假单胞菌外毒素、SN-38和雷 查霉素。
111.如实施方式108所述的缀合组合物，其中所述靶向部分和所述药物 部分对应于表21中所阐述的缀合物1-290中的任一者。
112.如实施方式111所述的缀合组合物，其中所述缀合物具有对应于表 21的缀合物71的所述XTEN、所述靶向部分和所述药物部分。
113.一种缀合组合物，其包含至少第一XTEN和第二XTEN和第三 XTEN和第四XTEN，其中所述XTEN选自由如实施方式37所述的XTEN、 如实施方式42所述的XTEN、如实施方式7所述的XTEN和表3中所阐述的 序列组成的组，其中所述XTEN可以是相同的或不同的，并且其中所述第一 XTEN和所述第二XTEN和所述第三XTEN和所述第四XTEN是使用四价交 联剂通过N端彼此缀合，其中所述四价交联剂是四价马来酰亚胺簇。
114.如实施方式113所述的缀合组合物，其中所述第一XTEN、所述第 二XTEN、所述第三XTEN和所述第四XTEN是相同的，并且各自与选自由 表3中所阐述的Seg 174、Seg 175、Seg 176、Seg 177、Seg 186、Seg 187、 Seg 188、Seg 189、Seg 190、Seg 191、Seg 192、Seg193、Seg 194、Seg 195、 Seg 196、Seg 197、Seg 198和Seg 199组成的组的序列具有至少约90％、或 至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、 或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％、或100％的 序列同一性。
115.如实施方式113所述的缀合组合物，其中所述第一XTEN和所述第 二XTEN是相同的，并且各自与选自由表3中所阐述的Seg 174、Seg 175、 Seg 176、Seg 177、Seg 186、Seg 187、Seg 188、Seg 189、Seg 190、Seg 191、 Seg 192、Seg 193、Seg 194、Seg 195、Seg196、Seg 197、Seg 198和Seg 199 组成的组的序列具有至少约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约 93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％、或100％的序列同一性，并且所述第三XTEN和 所述第四XTEN是相同的，但不同于所述第一XTEN和所述第二XTEN，并 且各自与选自由表3中所阐述的Seg174、Seg 175、Seg 176、Seg 177、Seg 186、 Seg 187、Seg 188、Seg 189、Seg 190、Seg 191、Seg 192、Seg 193、Seg 194、 Seg 195、Seg 196、Seg 197、Seg 198和Seg 199组成的组的序列具有至少约 90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至 少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％、 或100％的序列同一性。
116.如实施方式114或115所述的缀合组合物，其中所述缀合物进一步 包含缀合到所述第一XTEN的每个半胱氨酸残基的第一交联剂、缀合到所述 第二XTEN的每个半胱氨酸残基的第二交联剂、缀合到所述第三XTEN的每 个半胱氨酸残基的第三交联剂和缀合到所述第四XTEN的每个半胱氨酸残基 的第四交联剂，其中每个交联剂选自由表13中所阐述的交联剂组成的组。
117.如实施方式116任一项所述的缀合组合物，其具有式XIV的构型：
其中就各次出现独立而言：
a.4xCL是所述四价交联剂；
b.CL1是缀合到XTEN1的所述第一交联剂；
c.CL2是缀合到XTEN2的所述第二交联剂；
d.CL3是缀合到XTEN3的所述第三交联剂；
e.CL4是缀合到XTEN4的所述第四交联剂；
f.v是1至约10的整数；
g.x是1至约10的整数；
h.y是1至约10的整数；
i.z是1至约10的整数，其限制条件为x+y+z>4；
j.XTEN1是所述第一XTEN；
k.XTEN2是所述第二XTEN；
l.XTEN3是所述第三XTEN；以及
m.XTEN4是所述第四XTEN。
118.如实施方式116或实施方式117所述的缀合组合物，其进一步包含
a.缀合到所述第一XTEN的每个第一交联剂的第一有效负载的单原子残 基，其中所述残基选自由碳、氮、氧和硫组成的组；
b.缀合到所述第二XTEN的每个第二交联剂的第二有效负载的单原子残 基，其中所述残基选自由碳、氮、氧和硫组成的组；
c.缀合到所述第三XTEN的每个第三交联剂的第三有效负载的单原子残 基，其中所述残基选自由碳、氮、氧和硫组成的组；以及
d.缀合到所述第四XTEN的每个第四交联剂的第四有效负载的单原子残 基，其中所述残基选自由碳、氮、氧和硫组成的组。
119.如实施方式116或实施方式117所述的缀合组合物，其进一步包含
a.缀合到所述第一XTEN的每个第一交联剂的第一有效负载，所述第一 有效负载选自由表6、7、18和21中所阐述的有效负载组成的组；
b.缀合到所述第二XTEN的每个第二交联剂的第二有效负载，所述第二 有效负载选自由表6、7、18和21中所阐述的有效负载组成的组，其中所述 有效负载与所述第一有效负载是相同的或是不同的；
c.缀合到所述第三XTEN的每个第三交联剂的第三有效负载，所述第三 有效负载选自由表6、7、18和21中所阐述的有效负载组成的组，其中所述 有效负载与所述第一有效负载或所述第二有效负载是相同的或是不同的；以 及
d.缀合到所述第四XTEN的每个第四交联剂的第四有效负载，所述第四 有效负载选自由表6、7、18和21中所阐述的有效负载组成的组，其中所述 有效负载与所述第一有效负载或所述第二有效负载或所述第三有效负载是相 同的或是不同的。
120.如实施方式119所述的缀合组合物，其中所述第一有效负载是对标 靶具有特异性结合亲和力的靶向部分，其中所述靶向部分选自由表17-19和 21中所阐述的靶向部分组成的组，并且所述第二有效负载、所述第三有效负 载和所述第四有效负载中至少有一者是药物，其中所述药物选自由表6、18 和21中所阐述的药物组成的组。
121.如实施方式120所述的缀合组合物，其中所述靶向部分选自由 LHRH和叶酸盐组成的组，并且所述药物选自由以下组成的组：阿霉素、太 平洋紫杉醇、奥利司他汀、美登素、海兔毒素、卡奇霉素、长春花生物碱、 喜树碱、丝裂霉素C、埃博霉素、hTNF、Il-12、硼替佐米、豹蛙酶、假单胞 菌外毒素、SN-38和雷查霉素。
122.如实施方式119所述的缀合组合物，其中所述第一有效负载是对标 靶具有特异性结合亲和力的靶向部分，其中所述靶向部分选自由表17-19和 21中所阐述的靶向部分组成的组，并且所述第二有效负载、所述第三有效负 载和所述第四有效负载中至少有一者是药物，其中所述药物选自由表6、18 和21中所阐述的药物组成的组，并且其中所述XTEN、所述靶向部分和所述 药物部分对应于表21中所阐述的缀合物1-290中的任一者。
123.如实施方式101所述的缀合组合物，其具有式XVI的构型：
其中就各次出现独立而言；
a.3xCL是所述三价交联剂；
b.CL1是缀合到XTEN1的所述第一交联剂；
c.CL2是缀合到XTEN2的所述第二交联剂；
d.x是1至约10的整数；
e.y是1至约10的整数，其限制条件为x+y>2；
f.XTEN1是所述第一XTEN；
g.XTEN2是所述第二XTEN；以及
h.XTEN3是所述第三XTEN，其中所述XTEN选自由表2中所阐述的序 列组成的组。
124.如实施方式123所述的缀合组合物，其进一步包含
a.缀合到所述第一XTEN的每个第一交联剂的第一有效负载的单原子残 基，其中所述残基选自由碳、氮、氧和硫组成的组；以及
b.缀合到所述第二XTEN的每个第二交联剂的第二有效负载的单原子残 基，其中所述残基选自由碳、氮、氧和硫组成的组。
125.如实施方式123所述的缀合组合物，其进一步包含：
a.缀合到所述第一XTEN的每个第一交联剂的第一有效负载，所述第一 有效负载选自由表6、7、18和21中所阐述的有效负载组成的组；以及
b.缀合到所述第二XTEN的每个第二交联剂的第二有效负载，所述第二 有效负载选自由表6、7、18和21中所阐述的有效负载组成的组，其中所述 有效负载与所述第一有效负载是相同的或是不同的。
126.如实施方式125所述的缀合组合物，其中所述第一有效负载是对标 靶具有特异性结合亲和力的靶向部分，其中所述靶向部分选自由表17-19和 21中所阐述的靶向部分组成的组，并且所述第二有效负载是药物，其可以是 相同的或可以是不同的，并且其中所述药物选自由表6、表18和表21中所 阐述的药物组成的组。
127.如实施方式126所述的缀合组合物，其中所述靶向部分选自由 LHRH和叶酸盐组成的组，并且其中所述药物选自由以下组成的组：阿霉素、 太平洋紫杉醇、奥利司他汀、单甲基奥利司他汀E(MMAE)、单甲基奥利司 他汀F、美登素、海兔毒素、卡奇霉素、长春花生物碱、喜树碱、丝裂霉素C、 埃博霉素、hTNF、Il-12、硼替佐米、豹蛙酶、假单胞菌外毒素、SN-38和雷 查霉素。
128.如实施方式125所述的缀合组合物，其中所述第一有效负载选自由 表11的药物和表12的蛋白质组成的组，并且所述第二有效负载不同于所述 第一有效负载并且选自由表11的药物和表12的蛋白质组成的组。
129.如实施方式125所述的缀合组合物，其中所述第一有效负载和所述 第二有效负载是相同的并且选自由表11的药物和表12的蛋白质组成的组。
130.如实施方式101所述的缀合组合物，其具有式XVII的构型：
其中就各次出现独立而言；
a.3xCL是所述三价交联剂；
b.CL1是缀合到XTEN1的所述第一交联剂；
c.x是1至约10的整数；
d.XTEN1是所述第一XTEN，其中所述XTEN选自由表3中所阐述的序 列组成的组；
e.XTEN2是所述第二XTEN，其中所述XTEN选自由表2中所阐述的序 列组成的组；以及
f.XTEN3是所述第三XTEN，其中所述XTEN选自由表2中所阐述的序 列组成的组。
131.如实施方式130所述的缀合组合物，其进一步包含缀合到所述第一 XTEN的每个第一交联剂的第一有效负载的单原子残基，其中所述残基选自 由碳、氮、氧和硫组成的组。
132.如实施方式130所述的缀合组合物，其进一步包含缀合到所述第一 XTEN的每个第一交联剂的第一有效负载，所述第一有效负载选自由表6、7、 18和21中所阐述的有效负载组成的组。
133.一种包含多聚分支XTEN分子的组合物，其中所述组合物的溶液具 有小于包含具有相同数目的氨基酸和相同的摩尔浓度的对应的线性XTEN的 溶液的粘度。
134.如实施方式133所述的组合物，其中所述XTEN分子具有三聚、四 聚或五聚构型。
135.如实施方式133所述的组合物，其中所述XTEN分子选自由表2和 表3中所阐述的序列组成的组。
136.如实施方式133至135中任一项所述的组合物，其中所述溶液的所 述粘度在含有≧100mg/ml的所述多聚XTEN的溶液中与含有≧100mg/ml的 等摩尔浓度的所述对应的线性XTEN的溶液相比降低至少5、6、7、8、9或 10cP。
137.一种多肽，其与选自表52中所阐述的序列的组的序列具有至少约 90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至 少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％、 或100％的序列同一性。
138.一种医药组合物，其包含如实施方式85至87、97至99、108至112、 118至122、125至127、129或132中任一项所述的缀合物和医药学上可接受 的载剂。
139.如实施方式138所述的医药组合物，其是用于治疗选自表16中所 阐述的病状的组的病状。
140.如实施方式138所述的医药组合物，其是用于治疗受试者的医药方 案中，所述方案包含所述医药组合物。
141.如实施方式140所述的医药组合物，其中所述医药方案进一步包括 确定在受试者中实现有益作用所需的医药组合物的量的步骤，所述受试者患 有选自表16中所阐述的病状的组的病状。
142.如实施方式141所述的医药组合物，其中治疗所述受试者的所述医 药方案包括以有效量将所述医药组合物以两个或更多个连续剂量施用给所述 受试者，其中所述施用使得至少一个、两个或三个与所述病状相关的参数与 未经治疗的受试者相比改进至少10％、或20％、或30％、或40％、或50％、 或60％、或70％、或80％、或90％以上。
143.如实施方式85至87、97至99、108至112、118至122、125至127、 129或132中任一项所述的缀合物，其是用于制备用以治疗选自表16中所阐 述的病状的组的病状的药剂。
144.一种选择连接到XTEN的有效负载的组合作为治疗剂的方法，所述 方法包括
a.提供包含多个XTEN序列的XTEN的文库，其中所述XTEN序列中的 每一者缀合到至少第一有效负载和不同于所述第一有效负载的至少第二有效 负载；
b.如果XTEN序列与(1)缀合到单独的所述第一有效负载的XTEN序列； 以及(2)缀合到单独的所述第二有效负载的XTEN序列相比展现改进的体外或 体内参数，那么从所述文库中选择所述XTEN序列作为所述治疗剂。
145.如实施方式144所述的方法，其中第一有效负载和第二有效负载在 治疗上有效改善常见疾病。
146.如实施方式144所述的方法，其中所述第一药物和第二药物在治疗 上有效治疗常见疾病的不同症状。
147.如实施方式145或实施方式146所述的方法，其中所述常见疾病是 选自癌症、癌症支持性护理、心血管疾病、中枢神经系统疾病、内分泌疾病、 胃肠疾病、泌尿生殖器疾病、血液疾病、HIV感染、激素疾病、炎症、自体 免疫疾病、传染病、代谢疾病、肌肉骨胳疾病、肾脏科病症、眼科疾病、疼 痛和呼吸疾病。
148.如实施方式144所述的方法，其中所述第一有效负载和所述第二有 效负载经由共同的生物路径介导其治疗作用。
149.如实施方式144所述的方法，其中所述第一有效负载和所述第二有 效负载是选自由表6、表18和表21中所阐述的药物组成的组的不同药物。
150.如实施方式144所述的方法，其中所述第一有效负载和所述第二有 效负载是选自由表7、表18和表21中所阐述的蛋白质组成的组的不同生物 活性蛋白质。
151.如实施方式144所述的方法，其中所述第一有效负载是选自由表6、 表18和表21中所阐述的药物组成的组的药物，并且所述第二有效负载是选 自由表7、表18和表21中所阐述的蛋白质组成的组的生物活性蛋白质。
152.一种经分离的多肽，其包含延伸重组多肽(XTEN)，所述XTEN经 由具有选自SASRSA或SASXSA(其中X是R或K)的序列的蛋白水解裂解位 点连接到亲和纯化标签。
153.一种多肽，其包含延伸重组多肽(XTEN)，所述XTEN在其N端经 由具有选自SASRSA或SASXSA(其中X是R或K)的序列的蛋白水解裂解位 点连接到第一亲和纯化标签，并且在其C端经由具有选自SASRSA或 SASXSA(其中X是R或K)的序列的蛋白水解裂解位点连接到第二亲和纯化 标签。
154.一种组合物，其具有图117中所阐述的结构。
实施例
实施例1：构建XTEN_AD36基序区段
以下实施例描述了一批编码36个氨基酸的基序序列的经密码子优化的 基因的构建。作为第一步，基于pET载体来构建填充载体pCW0359并且其 包括T7启动子。pCW0359编码纤维素结合域(CBD)和TEV蛋白酶识别位点， 接下来是由BsaI、BbsI和KpnI位点侧接的填充序列。插入BsaI和BbsI位点 以使得其在消化后产生相容的突出物(overhang)。填充序列后继之以截短型式 的GFP基因和His标签。填充序列含有终止密码子并且因此带有填充质粒pCW0359的大肠杆菌细胞形成非荧光集落。用BsaI和KpnI消化填充载体 pCW0359以去除填充区段，并且通过琼脂糖凝胶纯化来分离所得载体片段。 将序列指定为XTEN_AD36，其反映基序的AD家族。其区段具有氨基酸序 列[X]3，其中X是具有以下序列的12聚体肽：GESPGGSSGSES、 GSEGSSGPGESS、GSSESGSSEGGP或GSGGEPSESGSS。通过粘接磷酸化 的合成寡核苷酸对的以下对来获得插入物：
AD1for：AGGTGAATCTCCDGGTGGYTCYAGCGGTTCYGARTC
AD1rev：ACCTGAYTCRGAACCGCTRGARCCACCHGGAGATTC
AD2for：AGGTAGCGAAGGTTCTTCYGGTCCDGGYGARTCYTC
AD2rev：ACCTGARGAYTCRCCHGGACCRGAAGAACCTTCGCT
AD3for：AGGTTCYTCYGAAAGCGGTTCTTCYGARGGYGGTCC
AD3rev：ACCTGGACCRCCYTCRGAAGAACCGCTTTCRGARGA
AD4for：AGGTTCYGGTGGYGAACCDTCYGARTCTGGTAGCTC
我们还粘接了磷酸化的寡核苷酸3KpnIstopperFor：AGGTTCGTCTTCAC TCGAGGGTAC和非磷酸化的寡核苷酸pr_3KpnIstopperRev：CCTCGAGTG AAGACGA。接合经粘接的寡核苷酸对，得到具有不同长度的产物的混合物， 其代表接合到一个BbsI/KpnI区段的不同数目的12聚体重复。通过制备型琼 脂糖凝胶电泳从混合物中分离对应于36个氨基酸的长度的产物，并且将其接 合到经BsaI/KpnI消化的填充载体pCW0359中。所得文库中指定为LCW040 1的大多数克隆体在诱导后显示出绿色荧光，这显示了，XTEN_AD36的序列 已经与GFP基因框内接合并且XTEN_AD36的大多数序列具有良好的表达水 平。
我们从文库LCW0401中针对高水平的荧光筛选出96个分离物，这是通 过将其粘贴到含有IPTG的琼脂板上来达成。通过PCR评估上述分离物，并 且鉴别含有具有36个氨基酸以及强荧光的区段的48个分离物。对这些分离 物进行测序，并且鉴别含有正确的XTEN_AD36区段的39个克隆体。这些区 段的核苷酸和氨基酸构建体的文件名列在表22中。
表22：36聚体基序的DNA和氨基酸序列
实施例2：构建XTEN_AE36区段
构建编码36个氨基酸的长度的XTEN序列的密码子文库。将XTEN序 列指定为XTEN_AE36。其区段具有氨基酸序列[X]3，其中X是具有以下序列 的12聚体肽：GSPAGSPTSTEE、GSEPATSGSE TP、GTSESA TPESGP或 GTSTEPSEGSAP。通过粘接磷酸化的合成寡核苷酸对的以下对来获得插入 物：
AE1for：AGGTAGCCCDGCWGGYTCTCCDACYTCYACYGARGA
AE1rev：ACCTTCYTCRGTRGARGTHGGAGARCCWGCHGGGCT
AE2for：AGGTAGCGAACCKGCWACYTCYGGYTCTGARACYCC
AE2rev：ACCTGGRGTYTCAGARCCRGARGTWGCMGGTTCGCT
AE3for：AGGTACYTCTGAAAGCGCWACYCCKGARTCYGGYCC
AE3rev：ACCTGGRCCRGAYTCMGGRGTWGCGCTTTCAGARGT
AE4for：AGGTACYTCTACYGAACCKTCYGARGGYAGCGCWCC
AE4rev：ACCTGGWGCGCTRCCYTCRGAMGGTTCRGTAGARGT
我们还粘接了磷酸化的寡核苷酸3KpnIstopperFor：AGGTTCGTCTTCAC TCGAGGGTAC和非磷酸化的寡核苷酸pr_3KpnIstopperRev：CCTCGAGTG AAGACGA。接合经粘接的寡核苷酸对，得到具有不同长度的产物的混合物， 其代表接合到一个BbsI/KpnI区段的不同数目的12聚体重复。通过制备型琼 脂糖凝胶电泳从混合物中分离对应于36个氨基酸的长度的产物，并且将其接 合到经BsaI/KpnI消化的填充载体pCW0359中。所得文库中指定为LCW040 2的大多数克隆体在诱导后显示出绿色荧光，这显示了，XTEN_AE36的序列 已经与GFP基因框内接合并且XTEN_AE36的大多数序列显示出良好的表 达。
我们从文库LCW0402中针对高水平的荧光筛选出96个分离物，这是通 过将其粘贴到含有IPTG的琼脂板上来达成。通过PCR评估上述分离物，并 且鉴别含有具有36个氨基酸以及强荧光的区段的48个分离物。对这些分离 物进行测序，并且鉴别含有正确的XTEN_AE36区段的37个克隆体。这些区 段的核苷酸和氨基酸构建体的文件名列在表23中。
表23：36聚体基序的DNA和氨基酸序列
实施例3：构建XTEN_AF36区段
构建编码36个氨基酸的长度的序列的密码子文库。将序列指定为 XTEN_AF36。其区段具有氨基酸序列[X]3，其中X是具有以下序列的12聚 体肽：GSTSESPSGTAP、GTSTPESGSASP、GTSPSGESSTAP或 GSTSSTAESPGP。通过粘接磷酸化的合成寡核苷酸对的以下对来获得插入 物：
AF1for：AGGTTCTACYAGCGAATCYCCKTCTGGYACYGCWCC
AF1rev：ACCTGGWGCRGTRCCAGAMGGRGATTCGCTRGTAGA
AF2for：AGGTACYTCTACYCCKGAAAGCGGYTCYGCWTCTCC
AF2rev：ACCTGGAGAWGCRGARCCGCTTTCMGGRGTAGARGT
AF3for：AGGTACYTCYCCKAGCGGYGAATCTTCTACYGCWCC
AF3rev：ACCTGGWGCRGTAGAAGATTCRCCGCTMGGRGARGT
AF4for：AGGTTCYACYAGCTCTACYGCWGAATCTCCKGGYCC
AF4rev：ACCTGGRCCMGGAGATTCWGCRGTAGAGCTRGTRGA
我们还粘接了磷酸化的寡核苷酸3KpnIstopperFor： AGGTTCGTCTTCACTCGAGGGTAC和非磷酸化的寡核苷酸 pr_3KpnIstopperRev：CCTCGAGTGAAGACGA。接合经粘接的寡核苷酸对， 得到具有不同长度的产物的混合物，其代表接合到一个BbsI/KpnI区段的不 同数目的12聚体重复。通过制备型琼脂糖凝胶电泳从混合物中分离对应于 36个氨基酸的长度的产物，并且将其接合到经BsaI/KpnI消化的填充载体 pCW0359中。所得文库中指定为LCW0403的大多数克隆体在诱导后显示出 绿色荧光，这显示了，XTEN_AF36的序列已经与GFP基因框内接合并且 XTEN_AF36的大多数序列显示出良好的表达。
我们从文库LCW0403中针对高水平的荧光筛选出96个分离物，这是通 过将其粘贴到含有IPTG的琼脂板上来达成。通过PCR评估上述分离物，并 且鉴别含有具有36个氨基酸以及强荧光的区段的48个分离物。对这些分离 物进行测序，并且鉴别含有正确的XTEN_AF36区段的44个克隆体。这些区 段的核苷酸和氨基酸构建体的文件名列在表24中。
表24：36聚体基序的DNA和氨基酸序列
实施例4：构建XTEN_AG36区段
构建编码36个氨基酸的长度的序列的密码子文库。将序列指定为XTEN _AG36。其区段具有氨基酸序列[X]3，其中X是具有以下序列的12聚体肽： GTPGSGTASSSP、GSSTPSGATGSP、GSSPSASTGTGP或GASPGTSSTGSP。 通过粘接磷酸化的合成寡核苷酸对的以下对来获得插入物：
AG1for：AGGTACYCCKGGYAGCGGTACYGCWTCTTCYTCTCC
AG1rev：ACCTGGAGARGAAGAWGCRGTACCGCTRCCMGGRGT
AG2for：AGGTAGCTCTACYCCKTCTGGTGCWACYGGYTCYCC
AG2rev：ACCTGGRGARCCRGTWGCACCAGAMGGRGTAGAGCT
AG3for：AGGTTCTAGCCCKTCTGCWTCYACYGGTACYGGYCC
AG3rev：ACCTGGRCCRGTACCRGTRGAWGCAGAMGGGCTAGA
AG4for：AGGTGCWTCYCCKGGYACYAGCTCTACYGGTTCTCC
AG4rev：ACCTGGAGAACCRGTAGAGCTRGTRCCMGGRGAWGC
我们还粘接了磷酸化的寡核苷酸3KpnIstopperFor：AGGTTCGTCTTCAC TCGAGGGTAC和非磷酸化的寡核苷酸pr_3KpnIstopperRev：CCTCGAGTG AAGACGA。接合经粘接的寡核苷酸对，得到具有不同长度的产物的混合物， 其代表接合到一个BbsI/KpnI区段的不同数目的12聚体重复。通过制备型琼 脂糖凝胶电泳从混合物中分离对应于36个氨基酸的长度的产物，并且将其接 合到经BsaI/KpnI消化的填充载体pCW0359中。所得文库中指定为LCW040 4的大多数克隆体在诱导后显示出绿色荧光，这显示了，XTEN_AG36的序列 已经与GFP基因框内接合并且XTEN_AG36的大多数序列显示出良好的表 达。
我们从文库LCW0404中针对高水平的荧光筛选出96个分离物，这是通 过将其粘贴到含有IPTG的琼脂板上来达成。通过PCR评估上述分离物，并 且鉴别含有具有36个氨基酸以及强荧光的区段的48个分离物。对这些分离 物进行测序，并且鉴别含有正确的XTEN_AG36区段的44个克隆体。这些区 段的核苷酸和氨基酸构建体和序列的文件名列在表25中。
表25：36聚体基序的DNA和氨基酸序列
实施例5：构建XTEN_AE864
通过XTEN_AE36连续二聚成AE72、144、288、576和864来构建XT EN_AE864。从XTEN_AE36的37个不同区段来构建一批XTEN_AE72区段。 混合具有全部37个不同的36氨基酸区段的培养物，并且分离质粒。用BsaI/ NcoI消化这个质粒汇集物以产生作为插入物的小片段。用BbsI/NcoI消化上 述质粒汇集物以产生作为载体的大片段。接合插入物和载体片段以使长度加 倍，并且将接合混合物转化到BL21Gold(DE3)细胞中以获得XTEN_AE72的 集落。
将XTEN_AE72区段的这个文库指定为LCW0406。组合来自LCW0406 的所有克隆体，并且使用与上文所描述相同的过程再次二聚，得到XTEN_A E144的文库LCW0410。组合来自LCW0410的所有克隆体，并且使用与上文 所描述相同的过程再次二聚，得到XTEN_AE288的文库LCW0414。从文库 中随机挑选两个分离物LCW0414.001和LCW0414.002，并且对其进行测序以 验证身份。组合来自LCW0414的所有克隆体，并且使用与上文所描述相同 的过程再次二聚，得到XTEN_AE576的文库LCW0418。我们从文库LCW04 18中针对高水平的GFP荧光筛选出96个分离物。对通过PCR和强荧光分析 具有正确尺寸的插入物的8个分离物进行测序，并且基于测序和表达资料来 选择2个分离物(LCW0418.018和LCW0418.052)以供将来使用。
通过使用与上文所描述相同的二聚过程将XTEN_AE576的LCW0418.01 8与XTEN_AE288的LCW0414.002组合来构建XTEN_AE864的特定克隆体 pCW0432。
实施例6：构建XTEN_AG864
使用若干连续轮次的二聚，我们从实施例1中所列的XTEN_AD36的区 段开始来组装一批XTEN_AG864序列。如实施例3中所描述来组装这些序列。 评估来自XTEN_AG864的若干分离物，并且发现其在生理条件下显示出良好 的表达和极佳的溶解度。XTEN_AG864的全长克隆体具有极佳的溶解度并且 在食蟹猴中显示出超过60小时的半衰期。
实施例7：构建CBD-XTEN-Cys，一种经半胱氨酸工程改造的XTEN
将编码含有一个半胱氨酸的氨基酸序列GGSPAGSCTSP的半胱氨酸岛状 物(CysIsland)用经粘接的寡核苷酸引入到CBD-填充物-GFP载体中以获得CB D-CysIsland-GFP，其中CysIsland由限制位点BsaI和BbsI侧接。CBD-填充 物-GFP载体是来自Novagen的pET30衍生物，其中TEV蛋白酶识别位点在 CBD与填充物之间。先前，通过用编码XTEN_AE288和XTEN_AE576的基 因置换CBD-填充物-GFP载体中的填充物来产生构建体。用BsaI/NcoI消化C BD-XTEN_AE288-GFP的质粒以产生作为插入物的小片段。用BbsI/NcoI消 化CBD-CysIsland-GFP的质粒以产生作为载体的大片段。接合插入物和载体 片段，并且将接合混合物电穿孔到BL21-Gold(DE3)细胞中以获得CBD-CysI sland-XTEN_AE288-GFP的转化体。类似地，用BsaI/NcoI消化CBD-CysIsla nd-XTEN_AE288-GFP的质粒以产生作为插入物的小片段。用BbsI/NcoI消化 CBD-XTEN_AE576-GFP的质粒以产生作为载体的大片段。接合插入物和载 体片段，并且将接合混合物电穿孔到BL21-Gold(DE3)细胞中以获得CBD-X TEN_AE576-CysIsland-XTEN_AE288-GFP的转化体。最后，用BbsI/HindIII 消化CBD-XTEN_AE576-CysIsland-XTEN_AE288-GFP的质粒以去除GFP并 且与用于终止密码子的经粘接的寡核苷酸接合，并且将接合混合物电穿孔到 BL21-Gold(DE3)细胞中以获得CBD-XTEN_AE576-CysIsland-XTEN_AE288 的转化体，其具有下表26中的DNA和经编码的氨基酸序列。通过选择适于 给定位置的限制位点，使用在XTEN序列内的不同位置处插入的半胱氨酸来形成额外的构建体，包括多个插入。这种方法还可以被用来通过用编码赖氨 酸的密码子取代编码寡核苷酸中的半胱氨酸的那些密码子来形成经赖氨酸工 程改造的XTEN。
表26：经Cys工程改造的XTEN的DNA和氨基酸序列
实施例8：构建Cys3-XTEN
设计一对引物以将限制位点BamHI和序列GRATAEAAGCGTAEAA的半 胱氨酸岛状物1引入到XTEN_AE432-1的N端，并且将序列TAEAAG的部 分半胱氨酸岛状物2和限制位点BbsI引入到XTEN_AE432-1的C端。设计 第二对引物以将限制位点BsaI和序列GCGTAEAA的部分半胱氨酸岛状物2 引入到XTEN_AE432-2的N端，并且将具有8xHis标签(H8)的序列TAEAAGCGTAEAAR的半胱氨酸岛状物4和限制位点HindIII引入到XTEN_AE432- 2的C端。XTEN_AE432-1含有1-432氨基酸序列，并且XTEN_AE432-2含 有由XTEN_AE864基因编码的433-864氨基酸序列。使用这两对引物来分别 通过聚合酶链反应(PCR)扩增XTEN_AE432-1和XTEN_AE432-2基因。对正 确尺寸的PCR产物进行凝胶纯化，并且分别用限制酶BamHI/BbsI和BsaI/Hi ndIII消化，作为用于接合的插入物。目的载体，一种pET30衍生物(Novagen)， 包括具有侧接限制位点BamHI和HindIII的CBD(纤维素结合域)-填充物。 用限制酶BamHI/HindIII消化目的载体以去除填充物并且制备成载体。将载 体与上述XTEN_AE432-1的经BamHI/BbsI消化的PCR产物和XTEN_AE43 2-2的经BsaI/HindIII消化的PCR接合。将接合混合物转化到大肠杆菌TOP1 0感受态细胞中。通过DNA小量制备(miniprep)来筛选转化体，并且通过DN A测序来确认所需的构建体。因此，最终质粒在T7启动子的控制下得到CB D-半胱氨酸岛状物1-XTEN_AE432-半胱氨酸岛状物2-XTEN_AE432-半胱氨 酸岛状物3-H8基因。DNA序列和蛋白质序列提供于表27中。
表27：Cys3-XTEN DNA和氨基酸序列
实施例9：构建Lys2-XTEN
设计一对引物以将限制位点BamHI和氨基酸序列GRGSP引入到XTEN _AE432-1的N端，并且将氨基酸序列TAEAAG和限制位点BbsI引入到XT EN_AE432-1的C端。设计第二对引物以将限制位点BsaI和并入有赖氨酸的 氨基酸序列GKPGTAEAA引入到XTEN_AE432-2的N端，并且将具有8xHi s标签(H8)的并入有赖氨酸的氨基酸序列GKAT和限制位点HindIII引入到X TEN_AE432-2的C端。XTEN_AE432-1含有1-432氨基酸序列，并且XTEN _AE432-2含有由XTEN_AE864基因编码的433-864氨基酸序列。使用这两 对引物来分别通过聚合酶链反应(PCR)扩增XTEN_AE432-1和XTEN_AE432 -2基因。对正确尺寸的PCR产物进行凝胶纯化，并且分别用限制酶BamHI/ BbsI和BsaI/HindIII消化，作为用于接合的插入物。用限制酶BamHI/HindIII 消化具有侧接限制位点BamHI和HindIII的CBD(纤维素结合域)-填充物的 目的载体，pET30衍生物(Novagen)，以去除填充物并且制备成载体。将载体 与上述XTEN_AE432-1的经BamHI/BbsI消化的PCR产物和XTEN_AE432- 2的经BsaI/HindIII消化的PCR接合。将接合混合物转化到大肠杆菌TOP10 感受态细胞中。通过DNA小量制备来筛选转化体，并且通过DNA测序来确 认所需的构建体。因此，最终质粒在T7启动子的控制下得到CBD-GRGSP-XTEN_AE432-TAEAAGKPGTAEAA-XTEN_AE432-GKAT-H8基因。DNA序 列和蛋白质序列提供于表28中。
表28：Lys2-XTEN DNA和氨基酸序列
实施例10：用于表达供缀合用的XTEN的寄助株和启动子
将在T7/lac启动子的控制下表达CBD-TEV位点-XTEN_AE864的质粒 pCW1054、在T7/lac启动子的控制下表达CBD-TEV位点-XTEN_AE864-GFP 的pLCW0968.003以及在PhoA启动子的控制下表达CBD-TEV位点 -XTEN_AE864-GFP的pLCW0970.030转化到大肠杆菌BL21DE3和大肠杆菌 BL21 DE3 rne-131中(Lopez,P.J.等人(1999)Mol.Microbiol.33,188-199)。 rne-131突变破坏了RNA酶E的3'内切核糖核酸裂解活性(Kido,M.等人 (1996)Journal of Bacteriology,178:3917-3925)。通过挑选单一的集落以接种2 mL含有适当选择性抗生素的LB肉汤培养基来制备全部六个转化体的起子培 养物。使起子培养物生长过夜，并且使用0.5mL以一式四份接种25mL的 2xYT肉汤用于含有pCW1054和pLCW0968.003的细胞，或接种25mL的 PhoA诱导肉汤(Amunix配方136-1)用于含有pLCW0970.030的细胞。在37℃ 下振荡培养物3小时。然后，使所有培养物的温度降到26℃；并且对于含有 pCW1054和pLCW0968.003的细胞，用1.0mM最终浓度的IPTG诱导蛋白 质表达。在磷酸盐从培养基中耗尽后，pLCW070.030中PhoA启动子的诱导 是自诱导的。然后，在26℃下振荡培养物过夜。使每个培养物的样品溶解， 并且根据制造商的说明书，利用考马斯染色，使用来自Invitrogen的NuPAGE 4-12％Bis-Tris凝胶对20μl的每个溶解产物进行非还原性SDS-PAGE。结果 (图43)显示，当CBD-TEV位点-XTEN_AE864-GFP或CBD-TEV位点 -XTEN_AE864在T7/lac启动子的控制下表达时，重组蛋白质的产率在大肠杆 菌BL21 DE3 rne-131中与大肠杆菌BL21DE3细胞相比显著更高。还使用荧 光板读取器来测量细胞的GFP荧光。结果(图44)显示，在PhoA启动子的控 制下CBD-TEV位点-XTEN_AE864-GFP于大肠杆菌BL21DE3细胞中的表达 比在T7/lac启动子的控制下CBD-TEV位点-XTEN_AE864-GFP的表达高近三 倍。在大肠杆菌BL21 DE3 rne-131中，T7/lac和PhoA启动子都得到类似水 平的表达。因此，只有在抑制RNA酶E 3'核糖核酸裂解活性后，T7/lac诱导 才得到与使用PhoA诱导所获得的滴度类似的滴度。很可能，T7RNAP转录 相对于翻译的更快速率(Studier,W.等人(1986)Journalof Molecular Biology 189:113-130)使得mRNA易受内切核酸裂解攻击，而在用天然大肠杆菌RNA 聚合酶II介导转录的PhoA诱导的情况下，转录速率与翻译速率紧密偶合， 从而保护mRNA免受内切核酸裂解攻击。
实施例11：构建1x氨基-XTEN288
使用一对引物AE278BsaIfor-AACG和AE278-RH8HindIIIrev来对含有 XTEN_AE864_003的质粒进行PCR以获得PCR产物XTEN_AE278。对正确 尺寸的色带进行凝胶纯化，接下来用BsaI/HindIII消化作为 XTEN_AE278-R-H8的插入物。用BsaI/HindIII消化编码N端 -RP11-R-AE432_3Cys-R-H8的基因(构建体AC763)的质粒pCW1161以去除 AE432_3Cys-R-H8的片段，并且对作为载体的大片段进行凝胶纯化。将载体 与插入物接合，并且用于转化BL21感受态细胞以获得N端 -RP11-R-AE288-R-H8的构建体。在两个胰蛋白酶消化位点(R、精氨酸)之间 的XTEN长度是用XTEN_AE278加上一些侧接氨基酸来计算并且精确等于288个氨基酸。因此，设计构建体以产生前体N端-RP11-R-AE288-R-H8(下 表29中的序列)并且在通过胰蛋白酶消化去除N端-RP11标签和C端8xHis 标签之后产生1x氨基-XTEN288(表3的Seg 178，其中N端氨基用于缀合)。
表29：1x氨基-XTEN288的DNA和氨基酸序列
实施例12：优化具有RP11亲和标签的XTEN构建体的表达
1.1.设计和构建编码N端-RP11-AE864-GFP和MalEss-AE48-RP11-AE86 4的构建体
将Ishihama Y.等人,BMC Genomics 2008,9:102所描述的一组高度表达的 天然大肠杆菌蛋白质用于产生一列的前20个N端氨基酸(表30的第3栏)， 自此，疏水氨基酸F、I、W、L、V、M、C转化成丙氨酸或丝氨酸，或已缺 失以产生用以形成含有至少11个氨基酸的辅助序列(表30的第4栏)的候选 物。出于比较的目的，还包括了来自在Amunix(AC616)构建的充分表达的构 建体的已知CBD序列的前20个氨基酸作为对照。
表30：在研究中设计的N端辅助子的列表
在Elim Biopharm(Hayward,CA)合成表31的107N-F&R到119N-F&R 系列和RP11F&R序列的DNA寡核苷酸。将每个DNA对(107N-F和107N-R、 108N-F和108N-R，等等)的溶液以1:1的摩尔比混合，在95℃下变性3分钟， 接下来以0.1℃/分钟冷却到25℃以允许双链DNA粘接。用NdeI/BsaI消化基 本载体LCW0970.030(编码CBD-AE864-GFP)，并且对作为载体的较大片段 进行凝胶纯化。将载体与经粘接的寡核苷酸107-118N-F&R和经PNK处理的 经粘接的RP11F&R寡核苷酸接合，并且将接合产物转化到大肠杆菌BL21感 受态细胞(New EnglandBiolabs)中以获得指定为pSD0107到pSD118的集落。 获得克隆体pSD0107-109、pSD0111-112和pSD0114-118并且通过DNA测序 来验证；克隆体pSD0110.001具有一个移码突变并且被用作填充载体。
用BsaI/NotI消化质粒构建体pCW1110(编码RP11-AE864)，并且对作为 插入物的对应于编码AE864的核苷酸的较小色带进行凝胶纯化。用XhoI/Bst XI/NotI消化pCW1139(编码MalEss-AE48-有效负载-AE864)，并且对作为载 体的较大片段进行凝胶纯化。将119-AEN-F&R的寡核苷酸的经粘接的产物与 插入物和载体接合，然后转化到大肠杆菌BL21中以获得具有质粒的集落， 指定为pSD0119。对克隆体进行序列验证。
2.基于pSD0116构建N端辅助子文库
在Elim Biopharm(Hayward,CA)合成填充物-RP5for和填充物-RP5rev P、RP6-SASRSAforP和RP6-SASRSArev、L2for和L2rev、L3for和L3rev、L 4for和L4rev、L5for和L5rev、L6for和L6rev、L7for和L7rev、L8for和L8r ev、L9for和L9rev、L10for和L10rev、L11for和L11rev、L12for和L12rev 以及L13for和L13rev(表31)的DNA寡核苷酸对，并且如上文(第1节)所描 述粘接每一对以产生双链DNA。
用NdeI/BsaI消化质粒pSD0110，并且对作为载体的较大片段进行凝胶纯 化。将载体与填充物-RP5for&revP和RP6-SASRSAforP&rev的经粘接的寡核 苷酸接合，然后转化到大肠杆菌BL21中以获得具有填充载体质粒pCW1146 (填充物-RP11-XTEN_AE864_003-GFP)的集落。对克隆体进行序列验证。
将经NdeI/BsaI消化的pSD0110载体与经L5for&rev粘接的寡核苷酸接合 以获得LCW1160(L5)的集落。
用NdeI/BsaI消化填充载体pCW1146，并且对作为载体的较大片段进行 凝胶纯化。将载体与表31中的L2-4和L6-13for&rev的经粘接的寡核苷酸接 合，然后转化到大肠杆菌BL21中以获得构建体LCW1157(L2)、LCW1158 (L3)、LCW1159(L4)、LCW1163(L6)、LCW1171(L7)、LCW1172(L8)、L CW1203(L9)、LCW1204(L10)、LCW1208(L11)、LCW1209(L12)和LCW1210(L13)的集落。
表31：DNA寡核苷酸的列表
3.筛选和分析N端辅助子文库LCW1157-1159
在摇瓶中表达经质粒pSD0107到pSD0118转化的大肠杆菌宿主，并且通 过测量来自C端GFP报道子的荧光来评估每一者中的表达水平。简单地说， 使每个构建体的过夜培养物在SB培养基(具有12.5μg/ml四环素(tetracycline)) 中生长，然后将其用于接种具有12.5μg/ml四环素的PhoA磷酸盐耗尽自诱导 培养基的200ml培养物(使每个构建体的3个摇瓶生长)。在26℃下以225rpm 生长48小时后，从每个培养物中获取100μl等分试样，并且用激发波长是 395nm并且发射波长是510nm的荧光板读取器测量GFP表达水平。对于每 个摇瓶获取两个读数。在所测试的构建体当中，pSD0116具有最高荧光信号， 接下来是pSD0114(图81)，但这两个构建体的表达水平显著低于 LCW0970.030(pLCW970)阳性对照。
为了进一步改进表达，基于pSD0106构建三个文库(LCW1157、1158和 1159)，并且以高通量格局进行筛选。从这些文库(表32)中挑选大量集落以个 别地在37℃下以300rpm振荡下在96深孔板中于500μl SB培养基(具有12.5 μg/ml四环素)中生长过夜。使用20μl饱和培养物在96深孔板中接种500μl 的PhoA磷酸盐耗尽自诱导培养基(具有12.5μg/ml四环素)，将其在26℃下以 300rpm振荡下孵育22-24小时。然后，通过将100μl培养物放到96孔板中， 测量来自C端GFP报道子的荧光来测定表达。
表32：文库LCW1157-1159
在评估荧光信号之后，从所测试的每个96深孔板中选择六个最高表达克 隆体和两个低表达克隆体，并且以4次重复再次测试这些克隆体的表达。多 于全部三个文库来说，鉴别相比pSD0116构建体具有更高表达的克隆体(图 82A-C)，并且原始测试与再测试之间的关联性是良好的(图82D-F)。在所测试 的3个文库当中，文库LCW1159一般得到较高的表达水平，并且来自这一轮 筛选的最高表达构建体(LCW1159.004)是来自这个文库。
用Pop Culture(EMD Millipore)处理来自这三个文库的具有最高表达水平 的8个构建体和对照，进行热处理，并且用SDS-PAGE/考马斯染色(图83)分 析所得溶解产物。确认8个构建体的表达水平高于对照(阴性对照，LSD0114 和LSD0116)，并且从这些构建体产生全长蛋白质。将4个最高表达构建体(在 Pop Culture和热处理之后)和阴性对照(AP32，没有RP11标签的经纯化的 XTEN-GFP蛋白质)的溶解产物各自加载到pH是8并且传导率是6.5mS/cm 的MacroCap SP柱上。用20mM磷酸钠(pH 8)、100mM NaCl洗涤这个柱， 并且用20mM磷酸钠(pH 8)、500mM NaCl洗脱蛋白质。通过SDS-PAGE凝 胶分析加载物、流通液、洗涤液和洗脱液的样品(图84)。结果展示，来自全 部三个文库的四者的表达蛋白质可以用MacroCap SP捕获；因此，结合应归 于蛋白质中RP11标签的存在，这是因为阴性对照(不含RP11标签)不会结合 到MacroCap SP柱。
小量制备选择用于再测试的克隆体的质粒，并且分析N端辅助子的DNA 序列。在若干个位置处观测密码子偏倚(表33)。举例来说，LCW1157的第3 个氨基酸N由AAC或AAT编码。LCW1157中的大多数高表达克隆体(77％) 在第3个氨基酸处由AAT编码，而大多数低表达克隆体(88％)由AAC编码， 指示AAT在这个位置对于高表达来说优于AAC。类似地，CCG在第4个氨 基酸处是优选的，而在第7个氨基酸处的GCG在低表达克隆体中积聚。同样， 这些趋势也在文库LCW1158和LCW1159中观测到。
表33：文库LCW1157-1159中的高表达和低表达克隆体的序列结果分析*
*对于每个文库指定所分析的高表达和低表达克隆体的总数，并且分析密 码子有变化的位置中的每一者中A、G、C或T的百分比。
4.筛选和分析N端辅助子文库LCW1163
因为文库LCW1159具有一般比LCW1157和LCW1158更高的表达，所 以下一个文库设计是基于LCW1159，其中将更多变异体引入到N端辅助域编 码区中。从这个文库(理论多样性是55296)中筛选出总共672个克隆体，并且 以与文库LCW1157-1159相同的方式进行再测试。观测到相比LCW1159.004 (来自前一轮筛选的最高表达)具有更高表达的克隆体(图85)。最高表达克隆体 LCW1163.029实现了比LCW1159.004改进40％，而其表达水平比CBD对照 低27％。分析高表达和低表达克隆体的序列，并且鉴别和总结用于表达的优 选核苷酸(见表34)。大多数位置已经显示出对于高表达的密码子A的偏好， 而其它位置具有对C的偏好。
表34：文库LCW1163中的高表达和低表达克隆体的序列结果分析*
*分析密码子有变化的位置中的每一者中A、G、C或T的百分比，并且 在底端行中总结所鉴别的优选核苷酸
5.筛选和分析RP11文库LCW1160
同时，筛选和分析来自文库LCW1160(没有任何N端辅助域的RP11标 签的编码区不同的文库(总理论多样性是8.8×1012))的168个集落。然而，这个 文库一般具有很低的表达水平(图86)，并且在进行质粒小量制备和DNA测序 分析之后发现一个具有高表达的离群物(outlier)编码截短的RP11标签。在这 些实验条件下文库的筛选结果强有力地表明，需要N端辅助子来实现高表达 水平。
6.筛选N端辅助子文库LCW1171、LCW1172、LCW1203和LCW1204。
以与上文所描述的那些相同的方式来筛选和分析更多N端文库 (LCW1171、LCW1172、LCW1203和LCW1204)。类似地设计LCW1171和 1172，而LCW1171相比LCW1172允许在辅助序列中有更多氨基酸变化。筛 选结果显示，LCW1171一般具有比LCW1172低得多的表达水平(图94A和 B)。类似地设计LCW1203和1204，与LCW1171和1172相比集中于随机化 辅助序列的不同区。LCW1204相比LCW1203允许更多的氨基酸变化，这使 得表达一般低于LCW1203(图94C和D)。这些结果表明，表达水平对辅助域 序列中的氨基酸变化敏感。
7.筛选N端辅助子文库LCW1208、LCW1209和LCW1210。
设计三个新的N端文库(LCW1208、LCW1209和LCW1210)以研究进一 步延长N端辅助序列的作用(表35)。LCW1208和LCW1210将4个以上的残 基引入到辅助域中，而LCW1209引入了8个以上的残基。筛选结果显示以 下一般趋势：LCW1209具有最高表达，接着是LCW1208，然后是LCW1210 (图95)，这确认了在辅助序列中添加更多氨基酸的有益作用。
表35：文库LCW1208-1210
辅助序列中的额外残基加下划线。
设计三个新的N端文库(LCW1208、LCW1209和LCW1210)以研究进一 步延长N端辅助序列的作用(表36)。LCW1208和LCW1210将4个以上的残 基引入到辅助域中，而LCW1209引入了8个以上的残基。筛选结果显示以 下一般趋势：LCW1209具有最高表达，接着是LCW1208，然后是LCW1210 (图95)，这确认了在辅助序列中添加更多氨基酸对于改进表达的有益作用。
从再测试中选出来自三个文库的具有最高表达水平的4个顶级构建体， 并且分析其N端辅助序列的序列(表36)。通过比较扣除阴性对照后的平均荧 光，当前最高表达的构建体(LCW 1209.029)实现了CBD对照的表达水平的 90％。
表36：来自文库LCW1208-1210的具有最高表达水平的构建体和对照。
样品名称 平均荧光 辅助序列＊
LCW1208.009 9070 MKKQEQEKEQAEEQAESEREET
LCW 1208.007 8870 MKKQEQEKEQAEEQAESEREET
LCW 1208.008 8800 MKKQEQEKEQAEEQSQSQREET
LCW 1208.010 8740 MKKQEQEKEQAEEQSESEREET
LCW 1209.029 10010 MKKQEQEKEQAEEQAKAESEAEREET
LCW 1209.015 9440 MKKQEQEKEQAEEQSKSQAEAEREET
LCW 1209.023 8980 MKKQEQEKEQAEEQAQAQAEDEREET
LCW 1209.010 8580 MKKQEQEKEQAEEQSKSKAEDEREET
LCW 1210.030 8650 MKKQEQEKEQAEEQPEVQREET
LCW 1210.032 8310 MKKQEQEKEQAEEQVENPREET
LCW 1210.025 8100 MKKQEQEKEQAEEQELCEREET
LCW 1210.009 8030 MKKQEQEKEQAEEQGIDTREET
CBD对照 10940 n/a
阴性对照 1630 n/a
*辅助序列中的额外残基加下划线。
总的来说，在这些实验条件下的筛选结果强有力地表明，N端辅助子有 助于实现高表达水平。
实施例13：使用PhoA诱导使XTEN发酵-评估表达产率
将带有编码辅助子_LCW1159.004-RP11-AE288-His8(AC767)、辅助子_LCW1172.033-RP11-AE576-His8(AC780)和辅助子_LCW1172.033-RP11-AE8 64-His8(AC786)的质粒的大肠杆菌BL21转化到大肠杆菌BL21菌株中。对3 个菌株中的每一者进行三个10L发酵。使用甘油储备液来接种125mL含有 10μg/mL四环素的LB肉汤培养基。然后，在37℃下振荡起子培养物过夜。 在具有B.Braun Biostat B控制器的10L玻璃夹套容器中，使用起子培养物 来接种4L含有以下的发酵分批培养基：20g硫酸铵、10.4g无水磷酸氢二 钾、5g二水合柠檬酸钠；4.6g单水合磷酸二氢钠；106g NZ BL4大豆蛋 白胨(Kerry Bioscience#5X00043)；54g酵母提取物(Teknova #Y9020)；3.6 L水；0.05mL聚丙二醇；5.2mL痕量元素溶液(Amunix配方144-1)；35m L 1M硫酸镁；以及4mL卡那霉素(50mg/mL)。发酵控制设置为：pH＝ 6.9+/-0.1；dO2＝10％；仅搅拌器模式中的溶解氧级联在125到1180rpm的 范围内；空气流量每分钟5升90％氧气；初始温度37℃；碱控制13％氢氧化 铵；并且没有酸控制。在培养6小时后，以40g/h的速率起始70％甘油进料。 在培养物达到50+/-10OD的OD600后，使培养温度降到26℃，添加54mL 1M硫酸镁，并且由以下组成的盐进料：10g/l硫酸铵、26g/l无水磷酸氢 二钾、2g/l二水合柠檬酸钠；13g/l单水合磷酸二氢钠；15g/l无水磷酸二 氢钾；0.08％痕量元素溶液，以33g/L的速率开始并且持续6小时。在64-7 0小时的总发酵运作时间之后，通过离心收集培养物，得到湿重介于1.6到2. 3千克之间的细胞团块。将团块在-80℃下冷冻储存直到进一步使用。对于滴 度分析来说，在发酵运作结束时，将整个肉汤样品以0.2mL体积冷冻，稍后 解冻，然后添加0.2mL水，然后，为了使宿主蛋白质溶解和絮凝，在85℃ 下孵育样品15分钟，然后转到4℃下15分钟，接下来以20,000g离心10分 钟。通过C18逆相HPLC来分析所得絮凝的可溶性溶解产物，并且将对应于 代表辅助子-RP11-XTEN-His8的峰的A214吸光度面积与经纯化的参考标准 的吸光度面积相比较。接下来，为了测定细胞干重(DCW)，使细胞的等分试 样成团并且弃去上清液。用水洗涤细胞团块一次，然后在烘箱中于80℃下干 燥3天。称重含有细胞团块的管，从所测量的重量中扣除管重量，并且用剩余体积除以每个样品的初始体积(0.0002L)以获得DCW。下表37中总结了发 酵生长、滴度分析和细胞干重的结果。在96孔板筛选试验中，当筛选没有N 端辅助子的RP11-XTEN-His8构建体的文库LCW1160时(实施例12，图86)， 最高表达构建体LCW1160.006的表达水平仅仅是具有辅助序列的构建体LC W1159.004或LCW1172.033的表达的50％。因此，预期具有N端辅助序列的 XTEN构建体与没有辅助序列的XTEN构建体相比将产生显著更高的表达滴 度。
表37：所测量的表达参数
实施例14：纯化具有RP11和His8标签的XTEN
1.表达、溶解和澄清
使用4L发酵槽，利用本文所描述的条件，在大肠杆菌中表达融合蛋白 质MKNPEQAEEQAEEQREET-RP11-SASRSA-XTEN_AE432(C12,C217,C422) -SASRSA-His(8)]，其中N端辅助序列来自实施例10中所描述的文库成员L CW1159.004，并且两个亲和标签分别在N端和C端连接到XTEN。在生长之 后，通过离心收集细胞并且在-80℃下冷冻直到使用。使细胞团块再悬浮于溶 解缓冲液(20mM磷酸钠、50mM NaCl、2mM EDTA pH 8.0，每克细胞浆 3ml缓冲液)中。使细胞在830-900巴的压力下通过APV均化器三次来使细 胞溶解。使用溶解缓冲液(每克细胞浆1ml缓冲液)作为追踪物(chase)从均化 器中恢复滞留体积。在85℃下于水浴中孵育均化的溶解产物20分钟，接下 来在冰水浴中快速冷却20分钟。在加热和冷却处理之后，使溶解产物在SO RVALL离心机中以11000RPM离心90分钟。离心后，经两个CUNO Bioc ap 25(BC0025L90SP08A)过滤器过滤上清液。将澄清的上清液在4℃下储存 过夜。
2.捕获步骤：Toyopearl IMAC色谱
使用IMAC亲和色谱作为捕获步骤用于使XTEN与完整的C端His标签 结合。简单地说，用2000ml Toyopearl IMAC 650 M树脂(TOSOH Biosciences) 装填色谱柱BPG140/12(GE Life Sciences)。用2个柱体积(CV)的平衡缓冲液 (20mM磷酸钠，500mM NaCl，pH 8.0)平衡这个柱。使用5M NaCl储备溶 液将澄清的细胞溶解产物调整到500mM的最终NaCl浓度，然后加载到 IMAC树脂上。用2个柱体积的平衡缓冲液，然后用2个柱体积的20mM磷 酸钠、500mM NaCl、5mM咪唑(pH 8.0)，接下来用2个柱体积的20mM磷 酸钠、5mM咪唑(pH 8.0)来洗涤这个柱，以去除盐。用2个柱体积的20mM 磷酸钠、100mM咪唑(pH 8.0)进行洗脱。通过非还原性4-12％Bis-Tris SDS-PAGE/考马斯染色来分析流通液、洗涤液和洗脱部分，并且汇集具有所 需产物的部分。
3.精纯/捕获步骤：MacroCap SP色谱
使用阳离子交换色谱作为精纯步骤以确保产物的N端完整性。在若干阳 离子交换介质当中选择MacroCap SP树脂(GE Life Sciences)，这是由于其优 良的容量和对产物的选择性。将1000ml的MacroCap SP树脂装填在 BPG100/13(GE Life Sciences)色谱柱中，并且用20mM磷酸钠(pH 8.0)、20mM NaCl平衡。将IMAC汇集物加载到这个柱上，并且用2个柱体积的20mM 磷酸钠、50mM NaCl(pH 8.0)和2个柱体积的20mM磷酸钠(pH 8.0)、150mM NaCl洗涤树脂。用5个柱体积的在20mM磷酸钠(pH 8.0)中从150到500mM NaCl的线性梯度洗脱蛋白质。收集部分并且通过4-12％Bis-Tris SDS/PAGE 分析。将具有所需产物的部分组合用于下一个步骤。
4.Macrocap SP洗脱汇集物的胰蛋白酶消化
在37℃下，以1:200m/m酶/蛋白质比进行SP洗脱汇集物的胰蛋白酶 (Sigma，来自牛胰脏的胰蛋白酶)消化过夜。
5.精纯步骤：Macrocap Q色谱
在胰蛋白酶消化之后，使用Macrocap Q色谱将经裂解的标签与最终产物 分离。用1500ml柱体积的Macrocap Q树脂(GE Life Sciences)装填BPG100/19 柱(GE LifeSciences)。在80℃下将经胰蛋白酶消化的Macrocap SP洗脱汇集 物与20mM DTT和2mMEDTA一起孵育15分钟以还原二硫键并且使胰蛋 白酶失活。将经冷却的蛋白质溶液用Milli-Q水稀释到传导率低于5mS/cm， 并且加载到用20mM HEPES、50mM NaCl(pH 7.0)平衡的Macrocap Q柱上。 用2个柱体积的20mM HEPES、50mM NaCl(pH 7.0)，然后用2个柱体积的20mM HEPES、2mM TCEP、150mM NaCl(pH 7.0)洗涤这个柱。使用在20 mM HEPES(pH 7.0)中从150mM NaCl到500mM NaCl的线性梯度以20个柱 体积洗脱蛋白质。通过SDS-PAGE/银染色来分析部分。
6.浓缩和透滤(最终配制品)
将所选MacroCap Q部分组合，并且在小于20psi的进料压力和小于8psi 的渗余物压力下使用10KD Pellicon mini(Millipore)浓缩，接下来用20mM HEPES、50mM NaCl(pH7.0)进行10X透滤以实现大于5mg/ml的最终蛋白 质浓度。
9.用不同方法纯化的蛋白质的纯度分析
经由如上文所描述的三个纯化步骤来纯化一个批次(第1批)。从相同的经 发酵的物质中纯化另一个批次(第2批)，但省略了MacroCap SP精纯步骤。 在第2批的MacroCap Q洗脱部分中通过SDS-PAGE/银染色检测到XTEN的 截短物质(图87A)，而第1批的MacroCap Q洗脱部分基本上没有截短(图87B)。 这些结果支持，在所采用的条件下，基于RP11标签的MacroCap SP步骤对 于确保N端完整性和整体产物质量是必要的。
实施例15：构建1x氨基,9x硫醇-XTEN432
使用以下引物组5Afor&CI1BbsIrev-TGGC、CI1BsaIfor-TGGC&CI2-AE3 8BbsIrev和CI2-AE38BsaIfor&AatIICI3-2P对含有XTEN_AE432(C422)的质 粒pCW1164进行PCR以分别获得AE-CI1、CI1-2和CI2-3的PCR产物。将 CI1、2和3指定为半胱氨酸岛状物1、2和3，其具有相同的氨基酸序列TA EAAGCGTAEAA，但具有不同的密码子使用。对PCR产物进行凝胶纯化以 获得正确尺寸的色带，将其分别用限制酶SbfI/BbsI、BsaI/BbsI和BsaI/AatII 消化，作为插入物。用SbfI/AatII消化编码N端-RP11-R-XTEN_AE432(C42 2)-R-H8的基因的质粒pCW1164以去除XTEN_AE432内约290个氨基酸的片 段，并且对作为载体的剩余大片段进行凝胶纯化。进行载体与上述PCR产物 的三个插入物的接合并且用于转化BL21感受态细胞以获得构建体N端-RP1 1-R-XTEN_AE432(C319、C370、C422)-R-H8。使用引物CI1BsaIfor-TGGC&AatIICI3-2P对这个构建体进行PCR以获得长度为约360bp的PCR产物。 对正确尺寸的色带进行凝胶纯化，接下来用BsaI/AatII消化作为插入物XTE N_AE120-3Cys，其含有三个半胱氨酸岛状物。
同时，设计和合成(Genscript)含有六个半胱氨酸岛状物的XTEN_AE313- 6Cys的经密码子优化的DNA片段。用侧接限制酶BsaI/BbsI消化这个片段， 并且作为含有XTEN_AE432的前六个半胱氨酸岛状物的插入物进行凝胶纯 化。用BsaI/AatII消化编码N端-RP11-R-XTEN_AE432_3Cys-R-H8的基因的 质粒pCW1161以去除XTEN_AE432_3Cys的片段，并且进行凝胶纯化以获得 作为载体的大片段。进行载体与上述XTEN_AE313-6Cys的经BsaI/BbsI消化 的插入物和XTEN_AE120-3Cys的经BsaI/AatII消化的插入物的接合。使用接 合产物来转化BL21感受态细胞以获得构建体N端-RP11-R-XTEN_AE432(C 12、C63、C114、C165、C217、C268、C319、C370、C422)-R-H8。设计构建 体以产生前体N端-RP11-R-AE432_9Cys-R-H8(下表38中的序列)，使用其产 物以在通过胰蛋白酶消化去除N端-RP11标签和C端8xHis标签之后产生1x 氨基,9-硫-XTEN432。最终产物在XTEN432序列(Seg 177)中含有九个半胱氨酸。
表38：1x氨基,9-硫-XTEN432的DNA和氨基酸序列
实施例16：构建1x氨基,9x硫醇-XTEN864
使用引物PhoAfor&RP11-SASRSABsaIrevAGGT对含有N端-RP11标签 的质粒进行PCR以获得N端-RP11-R的PCR产物。对正确尺寸的色带进行 凝胶纯化，并且用NdeI/BsaI消化作为第一插入物。使用引物AE432BsaIfor AGGT&AE432_001BbsIrev-AACG对含有XTEN_AE864_003的质粒进行另一 个PCR以获得XTEN_AE432的PCR产物。对正确尺寸的色带进行凝胶纯化， 将其用BsaI/BbsI消化作为第二插入物。用NdeI/BsaI消化来自实施例10的构 建体N端-RP11-R-AE432_9Cys-R-H8以去除N端-RP11-R片段，并且进行凝 胶纯化以获得作为载体的大片段。进行载体与上述第一插入物和第二插入物 的接合，并且使用产物来转化BL21感受态细胞以获得构建体N端-RP11-R- XTEN_AE864(C444、C495、C546、C597、C649、C700、C751、C802、C8 54)-R-H8。设计所得构建体以产生前体N端-RP11-R-AE864_9Cys-R-H8(下 表39中的序列)，其产物在通过胰蛋白酶消化去除N端-RP11标签和C端8x His标签之后将产生1x氨基,9-硫-XTEN864。所得产物在用于缀合的XTEN 864序列(Seg 175)中含有N端氨基和九个半胱氨酸。
表39：1x氨基，9-硫-XTEN864的DNA和氨基酸序列
实施例17：用于缀合的XTEN的发酵
通过将带有含有用于缀合蛋白质序列的适当XTEN的质粒的大肠杆菌的 甘油储备液接种到125mL含有50μg/mL卡那霉素的LB肉汤培养基中来制 备起子培养物。然后，在37℃下振荡培养物过夜。在具有B.Braun Biostat B 控制器的5L玻璃夹套容器中，使用起子培养物来接种2L含有以下的发酵 分批培养基：12.5g硫酸铵、15g无水磷酸氢二钾、2.5g二水合柠檬酸钠； 8.5g单水合磷酸二氢钠；50g NZ BL4大豆蛋白胨(Kerry Bioscience #5X00043)；25g酵母提取物(Teknova#Y9020)；1.8L水；0.5mL聚丙二醇； 2.5mL痕量元素溶液(Amunix配方144-1)；17.5mL 1M硫酸镁；以及2mL 卡那霉素(50mg/mL)。发酵控制设置为：pH＝6.9+/-0.1；dO2＝10％；仅搅拌 器模式中的溶解氧级联在125到1180rpm的范围内；空气流量每分钟5升90％ 氧气；初始温度37℃；碱控制13％氢氧化铵；并且没有酸控制。培养6小时 后，以30g/h的速率起始50％葡萄糖进料。培养20小时后，添加25mL 1M 硫酸镁和3mL 1MIPTG。在45小时的总发酵运作时间之后，通过离心收集 培养物，得到对于所有构建体来说湿重介于0.45到1.1千克之间的细胞团块。 将团块在-80℃下冷冻储存直到进一步使用。在发酵中的多个时间点获取培养 物样品，使细胞溶解，然后通过加热和快速冷却使细胞碎片絮凝，通过离心 制备澄清的可溶性溶解产物，并且根据制造商的说明书，利用考马斯染色，使用来自Invitrogen的NuPAGE 4-12％Bis-Tris凝胶，通过常规的非还原性 SDS-PAGE来分析。XTEN融合蛋白质的积聚随发酵运作时间而变的一个实 例示于图45中。结果显示，XTEN融合蛋白质构建体在滴度>1g/L的发酵规 模下表达，其中表观MW为约160kDa(注意：试剂分子量是100kDa。在 SDS-PAGE中观测到的迁移与其它含XTEN融合蛋白质观测到的迁移相当)。
实施例18：纯化具有CBD和His8标签的1x硫醇-XTEN(经半胱氨酸工 程改造的XTEN)试剂
这个实施例描述了包含单一半胱氨酸残基的经半胱氨酸工程改造的 XTEN的纯化。
材料和方法：
1.澄清
使20gm来自发酵的细胞浆再悬浮于100ml 20mM磷酸钠(pH 8.0)(溶解 缓冲液)中。在800到900巴之间于均化器中均化细胞溶解产物三次。使用50 ml溶解缓冲液作为追踪物从均化器中恢复滞留体积。在85℃下于水浴中孵育 均化的溶解产物20分钟，接下来在冰水浴中快速冷却20分钟。在加热和冷 却处理之后，使溶解产物在SORVALL离心机中以11000RPM离心90分钟。 离心后，经两个CUNO Bio cap 25(BC0025L90SP08A)过滤器过滤上清液。用 40ml溶解缓冲液追踪过滤器。澄清的物质的最终体积是230ml。将澄清的上 清液在4℃下储存过夜。
2.捕获步骤：疏水相互作用色谱
疏水相互作用色谱用作使用XTEN的疏水CBD标签的第一步以确保捕 获N端完整蛋白质。使用Toyopearl Phenyl 650M(件#0014783，TOSOH Bioscience)装填XK16到15cm床高(30ml柱体积)。使用AKTA FPLC(GE Biosciences)进行色谱。在加载之前，用2个柱体积的20mM磷酸钠、1M硫 酸钠(pH 8.0)平衡Toyopearl Phenyl树脂。通过添加达1M浓度的硫酸钠到上 述澄清的溶解产物中(最终体积约250ml)来制备HIC加载物。将样品以2ml/ 分钟加载于HIC树脂(约4mg/ml树脂加载量)上。通过用约9个柱体积的平 衡缓冲液(20mM磷酸钠，1M硫酸钠，pH 8.0)追踪直到UV215稳定来完成 加载。用100％B(20mM磷酸钠，pH 8.0)逐步洗脱蛋白质。施加总共7个柱 体积的洗脱缓冲液以确认完全洗脱(图46)。
通过4-12％Bis-Tris SDS-PAGE(非还原性)分析样品以测定洗脱汇集物 (图47)。基于以下凝胶洗脱，汇集部分E1、E2、E3和E4用于进一步加工。 HIC洗脱汇集物中的总蛋白质据估计是85mg，其中通过运作另一个定量凝 胶测得65％的步骤产率。
3.精纯/捕获步骤：Toyopearl IMAC色谱
使用IMAC亲和色谱作为捕获步骤用于结合到XTEN的完整C端His标 签。用Toyopearl IMAC 650 M(件号0014907，TOSOH Biosciences)以15cm 床高(85ml柱体积)装填色谱柱XK26。用2个柱体积的20mM磷酸钠、10mM 咪唑、0.25M NaCl(pH 8.0)(平衡缓冲液)平衡这个柱。通过添加5M NaCl到 HIC洗脱汇集物中以在最终体积中制成0.25M NaCl来制备IMAC加载物。 将样品以4ml/分钟的流速加载于IMAC树脂上。用2个柱体积的平衡缓冲液来完成加载。用2个柱体积的20mM磷酸钠、10mM咪唑(pH 8.0)洗涤树脂 以去除盐。用7个柱体积的0到100％B与缓冲液A(20mM磷酸钠，10mM 咪唑，pH 8.0)和缓冲液B(20mM磷酸钠，200mM咪唑，pH 8.0)，接下来用 2CV的100％B进行线性洗脱。咪唑的存在维持了使用AKTAFPLC的UV 215 吸光度高于3500mAu，因此没有观测到洗脱峰。通过4-12％Bis-Tris非还原性SDS-PAGE凝胶来分析流通液、洗涤液和洗脱部分(图48)。凝胶显示成功 地去除宿主细胞蛋白质和截短的XTEN物质(图48A)。基于第二个凝胶(图 48B)，汇集部分C5、C6和C7。估计在IMAC洗脱汇集物中总共有70mg蛋 白质。
4.IMAC洗脱汇集物的胰蛋白酶消化
以1:200m/m的比率进行IMAC洗脱汇集物的胰蛋白酶消化。在37℃下， 将0.35mg来自胰脏的牛胰蛋白酶(Sigma，目录号T1426)与70mg蛋白质 (IMAC洗脱汇集物)一起孵育过夜。进行非还原性4-12％Bis-Tris SDS-PAGE 分析以确认如图49中所示完成CBD标签的裂解。
5.精纯步骤：MacroCap Q色谱
在胰蛋白酶消化之后，使用MacroCap Q色谱来分离经裂解的标签。用 MacroCap Q(GE Life Sciences，目录号17-5469-02)以18cm床高装填XK 16 柱。在加载于MacroCap Q柱上之前，在37℃下将经胰蛋白酶消化的IMAC 洗脱汇集物与2mM TCEP一起孵育1小时以还原XTEN的二聚体。用20mM HEPES(pH 7.0)平衡柱。以4ml/分钟(约2mg/ml树脂加载量)加载样品。用 额外2个柱体积的20mM HEPES、2mM TCEP(pH 7.0)完成柱加载。用2个 柱体积(20mM HEPES、2mM TCEP、150mM NaCl pH 7.0)洗涤这个柱。经 20个柱体积进行在20mMHEPES、2mM TCEP(pH 7.0)缓冲液中从150mM NaCl到500mM NaCl的线性梯度洗脱。在完整色谱(图50)期间由于TCEP的 存在而在高水平上观测UV 215，但在22到30mS/cm之间观测到洗脱峰。通 过SDS-PAGE、银染色和C18 RP-HPLC分析所有样品。在流通液中观测到经 裂解的CBD的去除(图51A)，而在洗脱部分中(图51B，在洗脱部分E11、E12、 F12、F11、F10…F6中)观测到XTEN的非常淡的色带。通过银染色在较早的 洗脱部分E11、E12、F12和F11中观测到XTEN的截短物质的分离，因为物 质比主要的XTEN多肽迁移更快(图51C)。基于上述结果，通过C18 RP-HPLC 进一步分析洗脱部分。图52示出了RP-HPLC分析的堆叠色谱型态。较早的洗脱部分具有宽的主肩，指示截短物质的明显存在。而且，这些较早的部分 (E12、F12和F11)富集有蛋白水解标签。基于上述分析，汇集洗脱部分F10、 F9、F8、F7和F6。通过C18 RP-HPLC再次分析洗脱汇集物(图53)。发现经 纯化的蛋白质是97.5％纯的。
6.浓缩和透滤(最终配制品)
使用Amicon Ultracel-15(MWCO 10k)离心装置将上述MacroCap Q汇集 物浓缩到5ml，接下来用20mM HEPES(pH 7.0)进行7X透滤到8.13mg/ml 的最终蛋白质浓度。从20g细胞团块中纯化总共43mg的蛋白质。三步色谱 的总回收率据估计为约33％。
实施例19：纯化具有CBD和His8标签的1x氨基-XTEN试剂
氨基-XTEN的纯化基本上如针对含有一个半胱氨酸的1x硫醇-XTEN的 纯化所描述来进行(关于细节，参见实施例15)。在100ml 20mM磷酸钠(pH 8.0) (溶解缓冲液)中均化来自发酵的20g细胞浆，进行热处理，并且通过离心和 过滤使其澄清。使用疏水相互作用色谱作为第一步以捕获N端完整蛋白质(图 54)。汇集部分E2、E3和E4用于进一步加工。使用IMAC亲和色谱作为捕 获步骤以结合XTEN的完整C端His标签(图55)。汇集部分E2和E3。在37℃下，以1:200m/m的比率进行IMAC洗脱汇集物的胰蛋白酶消化过夜。在胰 蛋白酶消化之后，使用MacroCap Q色谱来分离经裂解的标签。通过 SDS-PAGE，接下来通过银染色(图56)和C18 RP-HPLC(图57)来分析部分。 基于上述分析，汇集洗脱部分C10、C11和C12。通过C18RP-HPLC再次分 析洗脱汇集物(图58)。发现蛋白质是>98％纯的。使用Amicon Ultracel-15(MWCO 10k)离心装置以3000RPM将MacroCap Q汇集物浓缩到5ml，接下 来用20mM HEPES(pH7.0)进行7X透滤到5.35mg/ml的最终蛋白质浓度。
实施例20：纯化和评定RP11/His8-XTEN双标签系统
使用如上文所描述的表达载体，构建加双标签的XTEN蛋白质以编码具 有以下氨基酸序列或组分的融合蛋白质：MKIKTGARILALSALTTMMFSAS ALAAPTTAGAG-标签-XTEN_AE869(Am1)-RHHHHHHHH，其中：MKIKTG ARILALSALTTMMFSASALA是从表达并转运到宿主细胞周质的多肽中裂解 的MalE识别序列，APTTAGAG是间隔子，并且标签是来自以下(标签名称后 的括号中是序列)：RP5(RPRPRPRPRPGR)；RP7(RPRPRPRPRPRPRPGR)； KP5(KPKPKPKPKPGR)；RP9(RPRPRPRPRPRPRPRPRPGR)；RP11(RPRP RPRPRPRPRPRPRPRPRPGR)；P5K4P9(RPRPKPRPKPRPKPRPKPGR)；以 及R6K5P11(RPRPKPRPKPRPKPRPKPRPKPGR)。制造具有标签的构建体的 所有变化，并且使用如实施例15中所描述的方法在大肠杆菌中表达蛋白质。 从宿主细胞中制备可溶性提取物用于SDS-PAGE/考马斯染色分析。通过分析， 对于具有RP7、RP9、RP11和R6K5P11标签的构建体的表达来说，N端标签 长度和氨基酸组成并不显著影响蛋白质表达(见图59)。针对与MacroCap SP 树脂的结合来进一步测试具有RP5、RP7、RP9和RP11标签蛋白质的经表达 的蛋白质。具有更长标签的蛋白质更高效地结合到阳离子交换树脂，并且在 更严格的洗涤条件下仍保持结合。因此，选择RP11标签作为N端标签用于使用阳离子交换色谱纯化XTEN。额外的实验显示，RP11-XTEN-His8多肽在 发酵槽中有效地表达并且在细胞团块部分中发现大部分经表达的蛋白质(图6 0)。
实施例21：纯化具有RP11/H8双标签系统的1x氨基-XTEN试剂
1.表达
通过使用如所描述的4L发酵反应在经转化的大肠杆菌中表达来产生1x 氨基-XTEN的RP11-XTEN-His8前体。通过离心收集细胞并且在-80℃冷冻直 到使用。
2.溶解和澄清
使25g细胞浆再悬浮于75mL的20mM磷酸钠(pH 8.0)、50mM NaCl、 2mM EDTA中。使再悬浮浆在800-900巴下通过均化器三次来进行溶解。使 匀浆在85℃下于水浴中保持15分钟，随后使用冰/水浴快速冷却降温直到温 度降到低于10℃。然后，使经处理的匀浆在SLA-3000转筒中以10,000rpm 离心60分钟。收集上清液并且使用0.22μm瓶顶过滤器过滤。
3.阳离子交换捕获步骤
使用阳离子交换色谱作为捕获步骤以确保产物的N端完整性。在若干阳 离子交换介质当中选择MacroCap SP树脂(GE Healthcare)，这是由于其优良的 容量和对产物的选择性。将20mLMacroCap SP柱装在Redi-Sep外壳中并且 用20mM磷酸钠(pH 8.0)、20mM NaCl缓冲液平衡。将溶解产物在重力作用 下加载到柱上。施加三个柱体积(CV)的20mM磷酸钠(pH 8.0)、100mM NaCl 作为洗涤步骤，随后用3CV的20mM磷酸钠(pH 8.0)、500mM NaCl逐步洗 脱蛋白质。收集一半CV部分(10mL)用于洗脱并且通过4-12％Bis-Tris SDS/PAGE分析(图61)。将洗脱部分2-4组合用于后续色谱步骤。
4.IMAC精纯步骤
将20mLToyoPearl AF-Chelate柱装在Redi-Sep柱外壳中，并且馈入100 mM硫酸镍。用20mM磷酸钠(pH 8.0)、500mM NaCl平衡这个柱，随后将 MacroCap SP汇集物在重力作用下加载到柱上。使用20mM磷酸钠(pH 8.0)、 500mM NaCl、5mM咪唑缓冲液，接下来使用20mM磷酸钠(pH 8.0)、5mM 咪唑施加两个洗涤步骤。然后，使用20mM磷酸钠、100mM咪唑从柱上洗 脱产物，并且收集一半CV(10mL)部分用于4CV的洗脱。通过4-12％Bis-Tris SDS/PAGE检查来自每个步骤的样品(图62)。基于凝胶，汇集洗脱液2和3 用于进一步加工。总产率是30％。
5.IMAC洗脱汇集物的胰蛋白酶消化
通过将1mg/mL牛胰蛋白酶(Sigma，目录号T1426，来自牛胰脏的胰蛋 白酶)添加到IMAC汇集物中，以1:200和1:500m/m的比率进行IMAC汇集 物的胰蛋白酶消化。使反应混合物在37℃下保持过夜，并且通过MALDI-TOF 质谱法来确认消化完全。通过经考马斯和银染色而染色的4-12％Bis-Tris SDS/PAGE来分析消化前和消化后的样品(图63)。消化后的样品与消化前的 样品相比在经考马斯染色的凝胶上的较淡染色以及分子量的偏移指示，成功 地去除N端和C端标签。经银染色的凝胶显示出在消化之后的均匀色带，表 明样品中不存在截短物质，从而支持了RP11/H8双标签系统和纯化方法提供 同质的最终XTEN产物的结论。
实施例22：纯化具有RP11和His8亲和标签的XTEN
1.表达
使用4L发酵反应，利用所描述的条件，在大肠杆菌中表达融合蛋白质 RP11-XTEN-His8，其中两个亲和标签分别在N端和C端连接到XTEN。
2.溶解和澄清
在生长之后，通过离心收集细胞并且在-80℃下冷冻直到使用。使细胞团 块再悬浮于溶解缓冲液(20mM磷酸钠、50mM NaCl、2mM EDTA(pH 8.0)， 每克细胞浆3ml缓冲液)中。使细胞在830-900巴的压力下通过APV均化器 三次来使细胞溶解。使用溶解缓冲液(每克细胞浆1ml缓冲液)作为追踪物从 均化器中恢复滞留体积。在85℃下于水浴中孵育均化的溶解产物20分钟， 接下来在冰水浴中快速冷却20分钟。在加热和冷却处理之后，使溶解产物在 SORVALL离心机中以11000RPM离心90分钟。离心后，经两个CUNO Bio cap 25(BC0025L90SP08A)过滤器过滤上清液。将澄清的上清液在4℃下储存 过夜。
3.捕获步骤：Toyopearl IMAC色谱
使用IMAC亲和色谱作为捕获步骤用于使XTEN与完整的C端His标签 结合。简单地说，用2000ml Toyopearl IMAC 650 M树脂(TOSOH Biosciences) 装填色谱柱BPG140/12(GE Life Sciences)。用2个柱体积(CV)的平衡缓冲液 (20mM磷酸钠，500mM NaCl，pH 8.0)平衡这个柱。使用5M NaCl储备溶 液将澄清的细胞溶解产物调整到500mM的最终NaCl浓度，然后加载到 IMAC树脂上。用2个柱体积的平衡缓冲液，然后用2个柱体积的20mM磷 酸钠、500mM NaCl、5mM咪唑(pH 8.0)，接下来用2个柱体积的20mM磷 酸钠、5mM咪唑(pH 8.0)来洗涤这个柱，以去除盐。用2个柱体积的20mM 磷酸钠、100mM咪唑(pH 8.0)进行洗脱。通过非还原性4-12％Bis-Tris SDS-PAGE/考马斯染色来分析流通液、洗涤液和洗脱部分，并且汇集具有所 需产物的部分。
4.精纯/捕获步骤：MacroCap SP色谱
使用阳离子交换色谱作为精纯步骤以确保产物的N端完整性。在若干阳 离子交换介质当中选择MacroCap SP树脂(GE Life Sciences)，这是由于其优 良的容量和对产物的选择性。将1000ml的MacroCap SP树脂装填在 BPG100/13(GE Life Sciences)色谱柱中，并且用20mM磷酸钠(pH 8.0)、20mM NaCl平衡。将IMAC汇集物加载到这个柱上，并且用2个柱体积的20mM 磷酸钠、50mM NaCl(pH 8.0)和2个柱体积的20mM磷酸钠(pH 8.0)、150mM NaCl洗涤树脂。用5个柱体积的在20mM磷酸钠(pH 8.0)中从150到500mM NaCl的线性梯度洗脱蛋白质。收集部分并且通过4-12％Bis-Tris SDS/PAGE 分析。将具有所需产物的部分组合用于下一个步骤。
5.Macrocap SP洗脱汇集物的胰蛋白酶消化
在37℃下，以1:200m/m酶/蛋白质比进行SP洗脱汇集物的胰蛋白酶 (Sigma，来自牛胰脏的胰蛋白酶)消化过夜。
6.精纯步骤：Macrocap Q色谱
在胰蛋白酶消化之后，使用Macrocap Q色谱将经裂解的标签与最终产物 分离。用1500ml柱体积的Macrocap Q树脂(GE Life Sciences)装填BPG100/19 柱(GE LifeSciences)。在80oC下将经胰蛋白酶消化的Macrocap SP洗脱汇集 物与20mM DTT和2mMEDTA一起孵育15分钟以还原二硫键并且使胰蛋 白酶失活。将经冷却的蛋白质溶液用Milli-Q水稀释到传导率低于5mS/cm， 并且加载到用20mM HEPES、50mM NaCl(pH 7.0)平衡的Macrocap Q柱上。 用2个柱体积的20mM HEPES、50mM NaCl(pH 7.0)，然后用2个柱体积的20mM HEPES、2mM TCEP、150mM NaCl(pH 7.0)洗涤这个柱。使用在20 mM HEPES(pH 7.0)中从150mM NaCl到500mM NaCl的线性梯度以20个柱 体积洗脱蛋白质。通过SDS-PAGE/银染色来分析部分。
7.浓缩和透滤(最终配制品)
将所选MacroCap Q部分组合，并且在小于20psi的进料压力和小于8psi 的渗余物压力下使用10KD Pellicon mini(Millipore)浓缩，接下来用20mM HEPES、50mM NaCl(pH7.0)进行10X透滤以实现大于5mg/ml的最终蛋白 质浓度。
8.用不同方法纯化的蛋白质的纯度分析
经由如上文所描述的三个纯化步骤来纯化一个批次(第1批)。从相同的经 发酵的物质中纯化另一个批次(第2批)，但省略了MacroCap SP精纯步骤。 在第2批的MacroCap Q洗脱部分中通过SDS-PAGE/银染色检测到XTEN的 截短物质(图87A)，而第1批的MacroCap Q洗脱部分基本上没有截短(图87B)。 这些结果支持，在所采用的条件下，基于RP11标签的MacroCap SP步骤对 于确保N端完整性和整体产物质量是必要的，并且RP11/H8双标签系统和纯 化方法提供了同质的最终XTEN产物。
实施例23：DBCO-Mal接头缀合到3x硫醇-XTEN以制成XTEN前体
制备3x-硫醇-XTEN(XTEN_AE905(Am1,C8,C453,C898，Seg 174))的经半 胱氨酸工程改造的XTEN区段于20mM HEPES(pH 7.0)、50mM NaCl中的 193uM(16mg/ml)溶液用于反应。将DBCO-马来酰亚胺(Click Chemistry Tools, Inc.，目录号A108)溶解于DMF中达50mM的最终浓度。在70℃下用10mM 新鲜复原的DTT还原3x硫醇-XTEN的等分试样(5.1mg，320μl)20分钟。 用水将蛋白质样品稀释到600μl总体积。添加1200μl的100％乙腈，并且使 混合物以13,000rpm离心5分钟。去除上清液，添加1000μl的80％乙腈， 并且使混合物以13,000rpm离心1分钟。将洗涤步骤再重复一次。将团块溶 解于300μl 100mM HEPES(pH 7.0)中。添加DBCO-Mal于DMF中的7.7μl 50 mM溶液(3x硫醇-XTEN与DBCO-马来酰亚胺的摩尔比是1:6)，并且在25℃ 下孵育2小时。通过C18 RP-HPLC分析来监控修饰的完成(图64A)。通过疏 水相互作用色谱(HIC)，使用1.6ml Toyopearl butyl柱来纯化蛋白质混合物。 用30个柱体积的在20mM磷酸盐(pH 7.0)缓冲液中从1.05M到0.3M硫酸铵 的递减梯度以0.5ml/分钟的流速进行洗脱(图64B)。通过C18 RP-HPLC分析 色谱部分(图64C)。
实施例24：加双标签的前体的胰蛋白酶裂解和纯化。
胰蛋白酶消化
XTEN_AE870_Am1,C1的加双标签的(CBD/His8)前体由于CBD序列的 存在而被考马斯良好地染色，而XTEN_AE870_Am1,C1的未加标签型式被考 马斯不良地染色，但可以通过银染色来检测。因此，使用考马斯染色(图65A) 和银染色(图65B)技术来监控胰蛋白酶消化完全性。在20mM磷酸盐缓冲液 (pH 8：)中，用不同比率的牛胰蛋白酶和蛋白质组学级猪胰蛋白酶(阳性对照) 消化XTEN_AE870_Am1,C1的加双标签的前体。基于检测加双标签的前体的 剩余经考马斯染色的160kDa色带，在37℃下孵育过夜相比在25℃下孵育过 夜允许更完全的消化(图65A：所有比率指的是胰蛋白酶与底物的质量/质量 比)。图65B显示，用牛胰蛋白酶以1:100、1:200和1:500的比率消化以及用 猪胰蛋白酶以1:100消化使得有效地消化XTEN前体。
经胰蛋白酶消化的加双标签的前体的MacroCapQ纯化
使用牛胰蛋白酶与加双标签的前体的1:200的比率(质量/质量)用于在 37℃下消化过夜。图66A显示大于90％的加双标签的前体转化成经消化的产 物。这是通过在消化后约160kDa的经考马斯染色的色带消失以及20kDa CBD片段的出现来证实。
对经胰蛋白酶消化的物质进行步骤纯化，其使用MacroCap Q阴离子交换 树脂和以下缓冲液A：20mM HEPES，50mM NaCl，pH 7.5，以及B：20mM HEPES，500mM NaCl，pH 7.5。在重力作用下加载经消化的物质，并且以逐 步方式使用0％、20％、40％、60％、80％和100％缓冲液B的3个柱体积洗涤 液连续地洗脱。XTEN_AE870在60％B中洗脱。图66B显示，经裂解的CBD 片段在所用条件下不会结合到MacroCap Q并且与XTEN完全分离。XTEN 从MacroCapQ中逐步洗脱仅仅部分地分离截短的多肽。通过XTEN的梯度 洗脱来实现更好的分离(图66C)。
残余胰蛋白酶活性的测试
为了测试最终配制的XTEN制剂中残余胰蛋白酶活性的存在，将蛋白质 样品与合成[G2]GLP2肽以10:1的质量/质量比混合。用于消化的阳性对照含 有[G2]GLP2肽和牛胰蛋白酶；阴性对照仅含有[G2]GLP2肽。在37℃下孵育 所有样品过夜。在孵育之后，将样品用1％TFA淬灭，并且使用Phenomenex Jupiter C18 5um 300A分析柱进行C18 RP-HPLC分析。缓冲液A含有0.1％ TFA、99.9％HPLC级H2O；缓冲液B含有0.1％TFA、99.9％HPLC级乙腈。 经45分钟的洗脱时间使用5％B到50％B的梯度进行分析。图67示出了 XTEN_AE869(Am1,C2)最终制剂中残余胰蛋白酶活性的RP-HPLC分析的结 果。图67A示出了完整的GLP2肽(41分钟保留时间)。图67B示出了使用两 个特征性胰蛋白酶片段对GLP2肽进行的胰蛋白酶消化(33.5分钟和34分钟 保留时间)。图67C显示，GLP2肽在与XTEN一起孵育过夜后保持完整并且 没有观测到胰蛋白酶片段。这个结果指示，最终经MacroCap Q纯化的制剂不 含有任何残余胰蛋白酶活性。
实施例25：用于缀合的经半胱氨酸工程改造的XTEN的发酵和纯化
使质粒上含有AC292的大肠杆菌在2xYT中生长到饱和过夜，然后使用 200ml的这种培养物在波浪袋(wavebag)中接种2xYT培养基的25L培养物。 两种培养物都存在50μg/ml卡那霉素。使第二培养物在37℃下生长到约1.0 的OD600，冷却到26℃，并且用12ml 1MIPTG诱导过夜。在旋转20分钟 的SLA-3000转筒中以4000rpm收集细胞团块。使细胞团块(184g)再悬浮于 736ml的20mM Tris(pH 6.8)、50mM NaCl中。在20,000psi下使用微流化器使再悬浮的细胞溶解，然后加热到75℃维持15分钟，接下来在冰上快速 冷却30分钟。然后，通过离心使溶解产物澄清。然后，将澄清的溶解产物加 载到DE52柱上，这个柱先前经NaOH消毒并且用20mM Tris(pH 6.8)、50mM NaCl平衡。用5个柱体积的20mM Tris(pH 6.8)、50mM NaCl，5个柱体积 的20mM Tris(pH 6.8)、150mM NaCl洗涤这个柱，并且用5个柱体积的20mM Tris(pH 6.8)、250mM NaCl洗脱。然后，将经汇集的洗脱部分加载到 macrocapQ柱上，这个柱先前经NaOH消毒并且用20mM Tris(pH 6.8)、50mM NaCl平衡。用9个柱体积的20mM Tris(pH 6.8)、50mM NaCl，9个柱体积 的20mM Tris(pH 6.8)、100mM NaCl洗涤这个柱，并且用9个柱体积的20mM Tris(pH 6.8)、250mM NaCl洗脱。将经汇集的洗脱部分调整到15％w/v硫酸 钠，然后加载到辛基琼脂糖FF柱上，这个柱先前经NaOH消毒并且用Tris(pH7.5)平衡。用4个柱体积的20mM Tris(pH 7.5)、15％w/v硫酸钠洗涤这个柱， 并且用4个柱体积的20mM Tris(pH 7.5)、5％w/v硫酸钠洗脱。将样品储存 在4℃下并且给予批号AP197。经纯化的经半胱氨酸工程改造的XTEN然后 可以充当适合的反应物用于与有效负载(如来自表11的药物)缀合，从而得到 XTEN-药物缀合物。
实施例26：GLP2-Cys缀合到1x氨基-XTEN以得到GLP2-XTEN的 XTEN-有效负载
制备1x氨基-XTEN(XTEN_AE869(Am1))于20mM HEPES(pH 7.0)、50 mM NaCl中的67uM(5.35mg/ml)溶液。新鲜制备磺基-SMCC(Thermo Scientific，目录号22322)于DMSO中的100mM溶液。将10mg氨基-XTEN (1.87ml)与15倍摩尔过量的磺基-SMCC(18.7ul)混合，并且在25℃下孵育1 小时。通过使用Amicon Ultra-15,MWCO 5k离心装置离心过滤来去除过量的 交联剂。将1.8ml体积的反应混合物与8ml的20mM HEPES(pH 7.0)、50mM NaCl混合，并且在4℃下于Sorvall RT6000离心机中以3000rpm离心20分 钟。将这个程序再重复两次。经回收的渗余物的最终体积是1.8ml。将 GLP2-Cys肽(CSBio，定制合成)溶解于20mM HEPES(pH 7.0)、50mM NaCl 中，达到3mg/ml的最终浓度。将N-马来酰亚胺-XTEN与2.3倍摩尔过量的 GLP2-Cys肽混合，并且在25℃下孵育1小时。通过C18 RP-HPLC来监控修 饰的完成。将20μg蛋白质样品加载于Phenomenex Jupiter C18 5uM 300A 4.6 mm×150mm柱上。使用在0.1％三氟乙酸中5-50％的乙腈梯度来洗脱蛋白质， 并且通过在214nm下的吸光度来检测。如通过HPLC和电喷雾质谱法所展示， 基本上所有的N-马来酰亚胺-XTEN都转化成GLP2-Cys-XTEN缀合物(对使用 NanoSep 3K Omega离心装置(Pall Corp.)脱盐的100μg蛋白质样品进行样品的 ESI-MS分析。将50％乙腈、0.5％甲酸中的蛋白质溶液以10ul/分钟的流速注入到高分辨率质谱仪中。撷取800-1600amu范围内的光谱并且使用Bayesian 蛋白质重构软件重构成零电荷光谱)(图68)。通过连续阴离子交换(MacroCap Q)和疏水相互作用(Toyopearl Phenyl)色谱从缀合物中分离未反应的XTEN和 GLP2肽。RP-HPLC和MS分析的结果展示了反应物和最终产物的高产率和 纯度(图68)。
实施例27：GLP2-N-Mal缀合到1x硫醇-XTEN(经半胱氨酸工程改造的 XTEN)
制备1x硫醇-XTEN(XTEN_AE880(Am1,C8)(Seg 181)于20mM HEPES (pH 7.0)、50mMNaCl中的122uM(9.84mg/ml)溶液。将GLP2-N-马来酰亚 胺肽(CSBio，定制合成)溶解于DMSO中，达到3mg/ml的最终浓度。将1x 硫醇-XTEN(8.8mg，于900μl中)与3倍摩尔过量的GLP2-N-Mal肽混合，并 且在25℃下孵育1小时。修饰的完成和所得缀合物是通过C18 RP-HPLC(将20μg蛋白质样品加载于Phenomenex Jupiter C18 5uM 300A 4.6mm×150mm 柱上。使用在0.1％三氟乙酸中5-50％的乙腈梯度来洗脱蛋白质，并且通过在 214nm下的吸光度检测)以及电喷雾电离质谱法(对使用NanoSep 3K Omega 离心装置(Pall Corp.)脱盐的100μg蛋白质样品进行样品的ESI-MS分析。将 50％乙腈、0.5％甲酸中的蛋白质溶液以10μl/分钟的流速注入到高分辨率质谱 仪中。撷取800-1600amu范围内的光谱并且使用Bayesian蛋白质重构软件重 构成零电荷光谱)来监控。分析的结果示于图69中。通过制备型C4 RP-HPLC(Vydac Protein C4 5μ300A 10mm×250mm柱)，使用在0.1％TFA中5-50％ 的乙腈梯度作为流动相来纯化GLP2-XTEN缀合物(见图70A)。使用 Phenomenex Jupiter C18 5uM 300A4.6mm×150mm柱来分析最终经HPLC 纯化的GLP2-XTEN缀合物(见图70B)。经纯化的GLP2-XTEN缀合物的产率 是6.2mg(70％)。
实施例28：DBCO-Mal缀合到1x硫醇-XTEN
制备1x硫醇-XTEN(XTEN_AE880(Am1,C8)(Seg 181)于20mM HEPES (pH 7.0)、50mMNaCl中的150uM(12mg/ml)溶液。将DBCO-马来酰亚胺 (Click Chemistry Tools,Inc.，目录号A108)溶解于DMF中，达到50mM的最 终浓度。使用1M储备溶液将200ul体积的(2.4mg)1x硫醇-XTEN调整到100 mM HEPES(pH 7.0)。将1.2μl体积的在DMF中的50mM DBCO-Mal添加到蛋白质溶液(1x硫醇-XTEN与DBCO-马来酰亚胺试剂的摩尔比是1:2)中，并 且在25℃下孵育1小时。通过C18 RP-HPLC来监控修饰反应的完成(图71A)。 通过疏水相互作用色谱(HIC)，使用1.6ml Toyopearl Butyl柱来纯化蛋白质混 合物。用30个柱体积的在20mM磷酸盐(pH7.0)缓冲液中从1.05M到0.3M 硫酸铵的递减梯度以0.5ml/分钟的流速进行洗脱(图71B)。通过C18 RP-HPLC 分析色谱部分(图71C)。
实施例29：从经N端连接的单特异性XTEN前体制备双特异性缀合物
这个实施例描述了通过以N端到N端构型连接两个不同的XTEN-有效负 载前体来形成XTEN-有效负载组合物；一者具有有效负载A并且一者具有有 效负载B，从而得到双特异性缀合物。
作为第一步，使用上文所描述的RP11-His8双标签纯化系统来制备含有 多个半胱氨酸的XTEN分子(经半胱氨酸工程改造的XTEN)，并且在20mM HEPES(pH 7.0)、50mM NaCl中配制。将有效负载A-马来酰亚胺溶解于水溶 液20mM HEPES(pH 7.0)、DMF或DMCO或者任何其它适当溶剂中，这取 决于试剂的溶解度。将有效负载A-马来酰亚胺以XTEN的2-6倍摩尔过量添 加到经半胱氨酸工程改造的XTEN中，并且在25℃下孵育1小时。通过C18 RP-HPLC来监控修饰的完成。使用制备型C4-C18 RP-HPLC从污染物和未反 应的组分中纯化所得有效负载A-XTEN缀合物。在20mM HEPES(pH 7.0)、 50mM NaCl中配制有效负载A-XTEN缀合物。接下来，通过将二苯甲基环 辛炔(DBCO)-NHS酯或DBCO-磺基-NHS酯以10-50倍摩尔过量添加到XTEN 中并且在25℃下孵育1-2小时来进一步修饰有效负载A-XTEN缀合物。通过 分析型C18 RP-HPLC来监控修饰的完成。如果缀合效率低(例如，<90％)或形 成多个非特异性产物，那么使用制备型C4-C18 RP-HPLC纯化DBCO-有效负 载A-XTEN缀合物。如果DBCO-NHS酯缀合的效率高(>90％)并且没有明显 的副产物，那么使用10-30kDa MWCO离心装置、乙腈沉淀或阴离子交换色 谱，通过缓冲液交换从过量试剂中纯化DBCO-有效负载A-XTEN缀合物。
为了形成第二XTEN-有效负载前体，将有效负载B-马来酰亚胺溶解于水 溶液20mMHEPES(pH 7.0)、DMF或DMCO或者任何其它适当溶剂中，这 取决于试剂的溶解度。将有效负载B-马来酰亚胺以XTEN的2-6倍摩尔过量 添加到第二含半胱氨酸XTEN中，并且在25℃下孵育1小时。通过分析型 C18 RP-HPLC来监控修饰的完成。使用制备型C4-C18 RP-HPLC从污染物和 反应物中纯化所得有效负载B-XTEN缀合物。在20mM HEPES(pH 7.0)、50 mM NaCl中配制有效负载B-XTEN缀合物。将叠氮化物-PEG4-NHS酯以10-50 倍摩尔过量添加到有效负载B-XTEN中，并且在25℃下孵育1-2小时。通过 C18 RP-HPLC来监控修饰的完成。如果缀合效率低(例如，<90％)或形成多个 非特异性产物，那么使用制备型C4-C18 RP-HPLC纯化叠氮化物-有效负载 B-XTEN缀合物。如果DBCO-NHS酯缀合的效率高(>90％)并且没有明显的副产物，那么使用10-30kDa MWCO离心装置、乙腈沉淀或阴离子交换色谱， 通过缓冲液交换从过量试剂中纯化叠氮化物-有效负载B-XTEN缀合物。通过 在20mM HEPES(pH 7.0)缓冲液、50mM NaCl中以等摩尔比混合经纯化和浓 缩的DBCO-有效负载A-XTEN与叠氮化物-有效负载B-XTEN蛋白质来形成 最终产物，并且在25℃下孵育1小时或更长时间直到反应完全。通过C4或 C18 RP-HPLC来监控修饰的完成。必要时，通过制备型RP-HPLC、疏水相互 作用色谱或阴离子交换色谱来纯化双特异性缀合物有效负载A-XTEN-有效负 载B。
实施例30：从经N端连接的单特异性XTEN前体制备三聚缀合物
将单特异性XTEN-有效负载前体制备成有效负载A连接到XTEN分子的 N端融合体；例如，长度在AE144到AE890的范围内，在C端含有单一半 胱氨酸(如实施例25中所描述来制备和纯化)。在20mM HEPES(pH 7.0)、50 mM NaCl中配制经纯化的前体。将三(2-马来酰亚胺基乙基)胺(TMEA，Thermo Scientific，目录号33043)溶解于DMSO或DMF中。混合前体(交联剂的4-6 倍摩尔过量)与TMEA试剂，并且在25℃下孵育1小时。通过C4或C18 RP-HPLC或尺寸排阻色谱来监控修饰的完成。通过疏水相互作用色谱(HIC)、 阴离子交换色谱或制备型C4-C18 RP-HPLC从蛋白质反应物或部分产物混合 物中纯化所得三价有效负载A-XTEN缀合物。
实施例31：缀合和纯化FITC-X-XTEN
用FITC马来酰亚胺标记来源于AC272(批号AP197)的经纯化的蛋白质。 通过在室温下与5mM TCEP一起孵育1小时来还原样品。然后，使用DG-10 柱将样品脱盐到PBS中。通过添加25倍摩尔过量的于DMSO中的FITC-马 来酰亚胺并且在室温下孵育2小时来标记样品。注意，对体积作调整以使得 DMSO浓度小于总溶剂的5％。通过添加2mM DTT淬灭反应，然后用TEV 蛋白酶消化样品过夜。将样品用20mM Tris(pH 7.5)稀释两倍，并且加载到macrocapQ柱上，这个柱先前经NaOH消毒并且用20mM Tris(pH 7.5)平衡。 用5个柱体积的20mM Tris(pH 7.5)、135mM NaCl，5个柱体积的20mM Tris (pH 7.5)、175mM NaCl洗涤这个柱，并且用5个柱体积的20mM Tris(pH 7.5)、 250mM NaCl洗脱。然后，在4C下经60小时用TEV消化经汇集的洗脱部分 以完成消化。然后，使经消化的样品通过1ml小珠纤维(perloza)柱两次，这 个柱先前经NaOH消毒并且用20mM Tris(pH 7.5)、135mM NaCl平衡。为 了去除任何游离的FITC，然后使用10,000MWCO膜针对20mM Tris(pH 7.5)、135mM NaCl来透析样品。在SEC柱中OD214蛋白质信号和OD495 FITC信号的共迁移指示XTEN与标签成功缀合，伴有最小的游离染料污染(图 72B)。使用SDS PAGE中的FITC荧光，蛋白质的表观大MW也指示成功缀 合(图72A)。
实施例32：纯化GFP-X-XTEN
GFP(AC219)经双官能交联剂化学交联到XTEN，这个交联剂具有胺反应 基团以偶合到GFP赖氨酸并且具有半胱氨酸反应基团以偶合到经过工程改造 进入AC292中的XTEN中的游离半胱氨酸。通过在室温下孵育2小时，用双 官能交联剂磺基-SMCC标记GFP。使用DG-10柱将蛋白质脱盐到PBS中以 去除游离磺基-SMCC。还原来源于AC272(批号AP197)的经纯化的蛋白质并 脱盐到DG-10柱上的PBS中，并且与经标记的GFP混合以允许交联。用2mM DTT淬灭交联反应，并且添加TEV以在4℃下孵育过夜来去除CBD域。第 二天，再添加TEV以在4℃下再孵育60小时来完成消化。在TEV消化之后， 将样品于20mM Tris(pH 7.5)中稀释到100ml，并且加载到macrocapQ柱上， 这个柱先前经NaOH消毒并且用20mM Tris(pH 7.5)平衡。用5个柱体积的 20mM Tris(pH 7.5)，5个柱体积的20mM Tris(pH 7.5)、50mM NaCl，5个柱体积的20mM Tris(pH 7.5)、100mM NaCl，5个柱体积的20mM Tris(pH 7.5)、150mM NaCl，5个柱体积的20mM Tris(pH 7.5)、200mM NaCl，5个 柱体积的20mM Tris(pH 7.5)、250mMNaCl，5个柱体积的20mM Tris(pH 7.5)、300mM NaCl，以及5个柱体积的20mM Tris(pH7.5)、500mM NaCl 洗涤这个柱。汇集峰值洗脱部分并且储存在4℃下。用SEC柱中OD214蛋白质信号与OD395GFP信号的共迁移来确认交联，其中SEC输出以叠加图的 形式示于图73中。
实施例33：GFP-XTEN和FITC-XTEN缀合物的药物动力学
在食蟹猴中测试如上述实施例中所描述的GFP-XTEN和FITC-XTEN交 联的缀合物的药物动力学。将GFP-XTEN和FITC-XTEN以2mg/kg并且分 别以0.77和0.68mL的剂量体积静脉内(IV)施用给雄性食蟹猴。在给药前、2、 4、8、24、48、72、96、120、168、216、264、336、388、432、504小时的 时间点将血液样品(1.0mL)收集到预冷却的肝素化管中，并且加工成血浆。通 过ELISA试验，使用抗XTEN抗体进行定量，这种抗体在GFP-XTEN的情 况下用于捕获和检测并且在FITC-XTEN的情况下用于抗XTEN捕获和抗 FITC检测。在WinNonLin中进行非室体分析，其中所有时间点包括在拟合中 以测定PK参数。表40和图74中总结了药物动力学结果。资料显示，XTEN 可以延长其化学缀合的分子的半衰期，这种缀合方式与类似尺寸的有效负载 的基因融合的方式相当。
表40：经缀合的XTEN-有效负载组合物的PK参数
构建体 Cmax(ng/mL) AUC(h＊ng/mL) T1/2(h)
GFP-X-XTEN(AP197d） 52800 8220000 107
FITC-X-XTEN AP197e 18900 3930000 84.2
在食蟹猴中测试GFP-L288、GFP-L576、GFP-XTEN_AF576、GFP-XTE N_Y576和XTEN_AD836-GFP的药物动力学以确定非结构化多肽的组成和长 度对PK参数的影响。在注射后的多个时间分析血液样品，并且通过ELISA， 使用用于捕获的针对GFP的多克隆抗体和用于检测的相同多克隆抗体的生物 素化制剂来测量血浆中GFP的浓度。图75中总结了结果。结果显示，半衰 期随着XTEN序列的长度增加而惊人地增加。举例来说，测得GFP-XTEN_L 288(具有XTEN中的288氨基酸残基)的半衰期为10小时。非结构化多肽融 合伴侣的长度加倍到576个氨基酸使得多个融合蛋白质构建体的半衰期增加 到20-22小时；即，GFP-XTEN_L576、GFP-XTEN_AF576、GFP-XTEN_Y57 6。非结构化多肽融合伴侣的长度进一步增加到836个残基使得XTEN_AD83 6-GFP的半衰期为72-75小时。因此，聚合物长度从288个到576个残基增 加了288个残基使得体内半衰期增加约10小时。然而，多肽长度从576个残 基到836个残基增加了260个残基使得半衰期增加超过50小时。这些结果显 示，非结构化多肽长度存在一个令人惊讶的阈值使得体内半衰期大于成比例 的增加。因此，预期包含延伸的非结构化多肽的融合蛋白质与较短长度的多 肽相比具有增强的药物动力学特性。
实施例34：通过缀合制备1xDBCO,3xLHRH-XTEN
制备1x氨基,3x硫醇-XTEN432(XTEN_AE432(Am1,C12,C217,C422))的 等分试样于20mM HEPES(pH 7.0)、50mM NaCl中的196μM(7.7mg/ ml)溶液。图88A示出了蛋白质的C18RP-HPLC和ESI-MS分析。将2,2'-二 吡啶基二硫化物(DPD，Sigma，目录号D5767)溶解于二甲基甲酰胺(DMF)中， 达到100mM的最终浓度。将4ml 1x氨基,3x硫醇-XTEN432溶液与0.2m l1M HEPES(pH 8.0)混合以将pH调整到约7.5，并且与78μl DPD溶液(蛋 白质的10倍摩尔过量)混合。在25℃下孵育反应混合物2小时，并且通过C1 8 RP-HPLC分析反应产物(图88B)。将DBCO-磺基-NHS(Click Chemistry T ools,Inc.，目录号A124)溶解于无水DMF中，达到10mM的最终浓度。将 0.865ml DBCO-磺基-NHS溶液添加到蛋白质溶液中(蛋白质的11倍摩尔过 量)。在25℃下孵育反应混合物2小时，并且通过C18 RP-HPLC分析反应产 物(图88C)。添加1M乙醇胺溶液(pH 8.0)达到50mM的最终浓度以淬灭未 反应的DBCO-磺基-NHS。在25℃下孵育反应混合物2小时，然后在4℃下孵 育过夜。添加500mM Bond-BreakerTMTCEP溶液(Thermo Scientific，目录 号77720)，达到20mM的最终浓度。在25℃下孵育反应混合物1小时，并 且通过C18 RP-HPLC分析反应产物(图88D)。将反应混合物用0.01％TFA 稀释到15mL，并且使用10％TFA溶液将pH调整到约3。将蛋白质溶液加 载于制备型C4 RP-HPLC柱Vydac C4 250×22mm(Grace Davison Disco very Sciences，目录号214TP1022)上。使用1200ml在0.01％TFA中5-50％ 乙腈的线性梯度以15ml/分钟的流速来洗脱蛋白质。将含有1xDBCO,3x硫醇 -XTEN432的部分用1M HEPES(pH 8)调整到pH约为7，并且通过真空蒸 发而浓缩。在D-Lys的ε-氨基处经3-马来酰亚胺基丙酸修饰的Glp-His-Trp-S er-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2肽(LHRH-Mal)由CSBio Co.(Menlo Park, CA)合成。将这个肽溶解于无水DMF中，达到25mg/ml的最终浓度，并且 以蛋白质的5倍摩尔过量添加到1xDBCO,3x硫醇-XTEN432溶液中。在25℃ 下孵育反应混合物1小时，并且通过C18 RP-HPLC分析反应产物(图88E)。 将反应混合物用0.01％TFA稀释到15mL，并且使用10％TFA溶液将pH 调整到约3。将蛋白质溶液加载于制备型C4 RP-HPLC柱Vydac C4 250× 22mm上。使用1200ml在0.01％TFA中5-50％乙腈的线性梯度以15ml/ 分钟的流速来洗脱蛋白质。将含有1xDBCO,3xLHRH-XTEN432的部分用1 M HEPES(pH 8)调整到约pH 7，并且通过真空蒸发浓缩到2ml以得到最终产物。
实施例35：通过缀合制备1x叠氮化物,3xMMAE-XTEN
制备融合蛋白质1x氨基,3x硫醇-XTEN432(XTEN_AE432(Am1,C12,C2 17,C422))的等分试样于20mM HEPES(pH 7.0)、50mM NaCl中的196μ M(7.7mg/ml)溶液。图89A示出了蛋白质的C18 RP-HPLC和ESI-MS分析。 将MA6-Val-Cit-PAB-MMAE(MMAE-Mal，由ConcortisBiosystems,Inc.定制 合成)溶解于二甲亚砜(DMSO)中，达到1mg/ml的最终浓度。将2.2ml体积 的1x氨基,3x硫醇-XTEN432溶液与2.5ml MMAE-Mal(蛋白质的3.5倍摩 尔过量)混合。在25℃下孵育反应混合物1小时，并且通过C18 RP-HPLC分 析反应产物(图89B)。将叠氮化物-PEG4-NHS酯(Click Chemistry Tools,Inc.， 目录号A103)溶解于无水DMF中，达到500mM的最终浓度。将反应混合物 (4.7ml)与0.235ml 1M HEPES(pH 8.0)并且与9.75ul500mM叠氮化物 -PEG4-NHS(蛋白质的10倍摩尔过量)混合。在25℃下孵育反应混合物2小时，并且通过C18 RP-HPLC分析反应产物(图89C)。将缀合混合物用0.01％ TFA稀释到15ml，并且使用10％TFA将pH调整到约3。将蛋白质溶液加 载到制备型C4 RP-HPLC柱Vydac C4250×22mm(Grace Davison Disco very Sciences，目录号214TP1022)上。使用1200ml在0.01％TFA中5-50％ 乙腈的线性梯度以15ml/分钟的流速来洗脱蛋白质。将含有1x叠氮化物,3x MMAE-XTEN432的部分用1M HEPES(pH 8)调整到约pH 7，并且通过真 空蒸发浓缩以得到最终产物。
实施例36：通过缀合制备3xLHRH,3xMMAE-XTEN
制备融合蛋白质1xDBCO,3xLHRH-XTEN432的等分试样于20mM HEPES(pH 7.0)中的143μM(6.26mg/ml)溶液。制备1x叠氮化 物,3xMMAE-XTEN432于20mM HEPES(pH 7.0)中的135μM(5.90mg/ml)溶 液。将两种蛋白质反应物于溶液中混合以得到1.1倍摩尔过量的1xDBCO,3xLHRH-XTEN432。在25℃下孵育反应混合物过夜。通过SDS-PAGE (图90A)和RP-HPLC(图90B)分析点击化学反应的完成。将缀合混合物用 0.01％TFA稀释到15ml，并且使用10％TFA将pH调整到约3。将蛋白质溶 液加载到制备型C4 RP-HPLC柱Vydac C4 250×10mm(Grace Davison Discovery Sciences，目录号214TP510)上。使用180ml在0.01％TFA中5-50％ 乙腈的线性梯度以2ml/分钟的流速来洗脱蛋白质。将含有 3xLHRH,3xMMAE-XTEN的部分用1M HEPES(pH 8)调整到约pH 7，并且通 过真空蒸发浓缩以得到最终产物。
实施例37：通过缀合制备1xLHRH,3xMMAE-XTEN
制备融合蛋白质1x氨基,3x硫醇-XTEN905(XTEN_AE905(Am1,C8,C45 3,C898；Seg174))的等分试样于20mM HEPES(pH 7.0)、50mM NaCl中 的131μM(10.9mg/ml)溶液。图91A示出了蛋白质的C18 RP-HPLC和ES I-MS分析。将2,2'-二吡啶基二硫化物(DPD，Sigma，目录号D5767)溶解于二 甲基甲酰胺(DMF)中，达到100mM的最终浓度。使用1M HEPES(pH 8) 将1x氨基,3x硫醇-XTEN905溶液的pH调整到约7.5，并且与DPD溶液(蛋 白质的10倍摩尔过量)混合。在25℃下孵育反应混合物2小时，并且通过C1 8 RP-HPLC分析反应产物(图91B)。将DBCO-磺基-NHS(Click Chemistry T ools,Inc.，目录号A124)溶解于无水DMF中，达到10mM的最终浓度。将 DBCO-磺基-NHS溶液添加到蛋白质溶液中(蛋白质的10倍摩尔过量)。在25℃ 下孵育反应混合物2小时，并且通过C18 RP-HPLC分析反应产物(图91C)。 添加1M乙醇胺(pH 8.0)达到50mM的最终浓度以淬灭未反应的DBCO-磺 基-NHS。在25℃下孵育反应混合物2小时，然后在4℃下孵育过夜。添加5 00mM Bond-BreakerTMTCEP溶液(Thermo Scientific，目录号77720)，达到 20mM的最终浓度。在25℃下孵育反应混合物1小时，并且通过C18 RP-HPLC分析反应产物(图91D)。将反应混合物用0.01％TFA稀释到15mL，并 且使用10％TFA溶液将pH调整到约3。将蛋白质溶液加载到制备型C4 RP -HPLC柱Vydac C4 250×22mm(GraceDavison Discovery Sciences，目 录号214TP1022)上。使用1200ml在0.01％TFA中5-50％乙腈的线性梯度以 15ml/分钟的流速来洗脱蛋白质。将含有1xDBCO,3x硫醇-XTEN905的部分 用1M HEPES(pH 8)调整到约pH 7，并且通过真空蒸发而浓缩。将MA6- Val-Cit-PAB-MMAE(MMAE-Mal，由Concortis Biosystems,Inc.定制合成)溶 解于二甲亚砜(DMSO)中，达到1mg/ml的最终浓度。将1xDBCO,3x硫醇-X TEN905溶液与3.5倍摩尔过量的MMAE-Mal混合。在25℃下孵育反应混合 物1小时，并且通过C18 RP-HPLC分析反应产物。Glp-His-Trp-Ser-Tyr-D-L ys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2肽在D-Lys的ε-氨基处经叠氮基-己酸修饰(LHRH-M al，由CS Bio Co.,Menlo Park,CA定制合成)。将这个肽溶解于无水DMF 中，达到25mg/ml的最终浓度，并且以蛋白质的1.5-5倍摩尔过量添加到1x DBCO,3xMMAE-XTEN905溶液中。在25℃下孵育反应混合物，并且通过C 18RP-HPLC分析反应产物。将最终反应混合物用0.01％TFA稀释到15mL， 并且使用10％TFA溶液将pH调整到约3。将蛋白质溶液加载于制备型C4 RP-HPLC柱Vydac C4 250×22mm上。使用1200ml在0.01％TFA中5- 50％乙腈的线性梯度以15ml/分钟的流速来洗脱蛋白质。将含有1xDBCO,3x LHRH-XTEN432的部分用1M HEPES(pH8)调整到约pH 7，并且通过真 空蒸发浓缩以得到最终产物。
实施例38：通过缀合制备1xDBCO,3x叶酸盐(γ)-XTEN
制备融合蛋白质1x氨基,3x硫醇-XTEN432(XTEN_AE432(Am1,C12,C2 17,C422))的等分试样于20mM HEPES(pH 7.0)、50mM NaCl中的203μ M(8.0mg/ml)溶液。图107A示出了蛋白质的C18 RP-HPLC和ESI-MS分析。 将叶酸盐-γ-氨戊基-马来酰亚胺(FA(γ)-Mal，由CPCScientific定制合成)溶解 于二甲基甲酰胺(DMF)中，达到21mg/ml(9.8mM)的最终浓度。将1.1ml 体积的1x氨基,3x硫醇-XTEN432溶液与0.08ml FA(γ)-Mal(蛋白质的3.5 倍摩尔过量)混合。在25℃下孵育反应混合物2小时，并且通过C18RP-HPL C分析反应产物(图107B)。用0.06ml 1M HEPES(pH 8.0)缓冲液调整反应 混合物的pH。将DBCO-磺基-NHS(ClickChemistry Tools,Inc.，目录号A1 24)溶解于无水DMF中，达到50mM的最终浓度。将0.53mlDBCO-磺基- NHS溶液添加到蛋白质溶液中(蛋白质的11倍摩尔过量)。在25℃下孵育反应混合物2小时，并且通过C18 RP-HPLC分析反应产物(图107C)。添加1M 乙醇胺溶液(pH 8.0)达到50mM的最终浓度以淬灭未反应的DBCO-磺基-NH S。在25℃下孵育反应混合物2小时，然后在4℃下孵育过夜。将反应混合物 用0.01％TFA稀释到15mL，并且使用10％TFA溶液将pH调整到约3。将 蛋白质溶液加载于制备型C4 RP-HPLC柱Vydac C4 250×10mm(GraceDavison Discovery Sciences，目录号214TP510)上。使用180ml在0.01％T FA中5-50％乙腈的线性梯度以2ml/分钟的流速来洗脱蛋白质。将含有1xD BCO,3xFA(γ)-XTEN432的部分用1M HEPES(pH 8)调整到pH约为7，并 且通过真空蒸发浓缩以得到最终产物。
基本上如上文所描述，使用叶酸盐-α-马来酰亚胺(FA(α)-Mal，由CPC Scientific定制合成)来制备1xDBCO,3x叶酸盐(α)-XTEN缀合物。
实施例39：通过缀合制备3xFA(γ),3xMMAE-XTEN
制备融合蛋白质1xDBCO,3xFA(γ)-XTEN432的等分试样于20mM HEPES(pH 7.0)中的191μM(8.8mg/ml)溶液。制备1x叠氮化 物,3xMMAE-XTEN432(如实施例32中所描述来制备)于20mM HEPES(pH 7.0)中的242μM(11.1mg/ml)溶液。将两种蛋白质反应物于溶液中混合以得到 1.1倍摩尔过量的1xDBCO,3xFA(γ)-XTEN432。在25℃下孵育反应混合物过 夜。通过RP-HPLC分析点击化学反应的完成(图108)。将缀合混合物用0.01％ TFA稀释到15ml，并且使用10％TFA将pH调整到约3。将蛋白质溶液加载 到制备型C4 RP-HPLC柱Vydac C4250×10mm(Grace Davison Discovery Sciences，目录号214TP510)上。使用180ml在0.01％TFA中5-50％乙腈的线 性梯度以2ml/分钟的流速来洗脱蛋白质。将含有3xFA(γ),3xMMAE-XTEN的 部分用1M HEPES(pH 8)调整到约pH 7，并且通过真空蒸发浓缩以得到最终产物。通过尺寸排阻色谱(SEC-HPLC)(图109A)、RP-HPLC(图109B)和 ESI-MS(图109C)分析最终产物。
基本上如上文所描述，使用1xDBCO,3xFA(α)-XTEN432与1x叠氮化物, 3xMMAE-XTEN432之间的点击反应来制备3xFA(α),3xMMAE-XTEN缀合 物。
实施例40：比较溶液中分支XTEN对比线性XTEN的粘度
可以使用多种类型的粘度计和流变仪来测量线性XTEN和分支XTEN (后者呈三聚或四聚构型)的粘度。举例来说，如Miller,M.A.等人(2010) Langmuir,26:1067所描述，可以测量经30G针吸取1mL液体到注射器中所 需的时间。为了针对粘度比较XTEN的单体线性构型对比三聚或四聚构型， 制备具有XTEN氨基酸组分的当量分子量的构建体，然后以各自20、50、100 mg/ml的蛋白质的固定、当量浓度来制成溶液。然后，使用米勒(Miller)方法 评估溶液。使用这种方法，用已知标准来获得资料以制定标准曲线，然后测 量XTEN溶液。预期，结果将显示，具有类似分子量的XTEN的等摩尔溶液 的粘度将随着分支增加而显著降低；XTEN288的3个臂的缀合物与等浓度的 线性XTEN864相比将具有显著更低的粘度，即使其具有当量数目的氨基酸。 类似地，预期，具有XTEN216的4个臂的构型与具有XTEN288的3个臂的 缀合物相比将具有甚至更低的粘度。
实施例41：通过缀合制备Her2-XTEN-PTX
制备融合蛋白质1x氨基,3x硫醇-XTEN432(XTEN_AE432(Am1,C12,C2 17,C422))的等分试样于20mM HEPES(pH 7.0)、50mM NaCl中的196μ M(7.7mg/ml)溶液。通过用琥珀酸酐修饰太平洋紫杉醇，接下来缀合到氨乙 基马来酰亚胺来定制合成太平洋紫杉醇-Mal(PTX-Mal)。将PTX-Mal溶解于 二甲基甲酰胺(DMF)中，并且以3.5-5倍摩尔过量添加到蛋白质中。在25℃下 孵育反应混合物1-2小时，并且通过C18 RP-HPLC分析反应产物。将磺基- SMCC(Thermo Scientific，目录号22122)溶解于无水DMF中，达到50mM 的最终浓度，并且以蛋白质的10倍摩尔过量添加到蛋白质溶液中。在25℃ 下孵育反应混合物2小时，并且通过C18RP-HPLC分析反应产物(见图92)。 将反应混合物用0.01％TFA稀释到15mL，并且使用10％TFA溶液将pH 调整到约3。将蛋白质溶液加载于制备型C4 RP-HPLC柱Vydac C4 250× 22mm(Grace Davison Discovery Sciences，目录号214TP1022)上。使用12 00ml在0.01％TFA中5-50％乙腈的线性梯度以15ml/分钟的流速来洗脱蛋 白质。将含有1xMal,3xPTX-XTEN432的部分用1M HEPES(pH 8)调整到 约pH 7，并且通过真空蒸发而浓缩。根据说明书在水中使赫赛汀(曲妥珠单 抗，Roche)抗体复原，并且经缓冲液交换到含有5mM EDTA的PBS(pH 7.2)中。将DTT添加到蛋白质溶液中，达到1-10mM的最终浓度，并且在37℃ 下孵育5-30分钟。通过凝胶过滤或截止膜过滤来去除过量DTT。将1xMal,3 xPTX-XTEN432以3-4倍摩尔过量添加到部分还原的抗体中。在25℃下孵育 反应混合物1小时，并且在非还原性和还原性条件下通过SDS-PAGE和尺寸 排阻色谱来分析反应的最终产物。
实施例42：通过缀合制备碘乙酰基-XTEN
制备融合蛋白质1x氨基-XTEN869(XTEN_AE869(Am1))的等分试样于 20mM HEPES(pH 7.0)、50mM NaCl中的164μM(13.1mg/ml)溶液。将1/20 体积的1M HEPES(pH 8)添加到蛋白质溶液中以将蛋白质溶液的pH调整到 约7.5。将碘乙酸N-琥珀酰亚胺酯(SIA，ThermoScientific，目录号22349)溶 解于无水二甲基甲酰胺(DMF)中，达到100mM的最终浓度，并且以蛋白质 的10倍摩尔过量来添加。在25℃下孵育反应混合物1小时，并且通过C18 RP-HPLC分析反应产物(图93A)。通过使用Vivaspin 500超离心装置(5,000 MWCO，VivaScience，目录号VS0112)进行缓冲液交换来去除过量的SIA。 用碘乙酰基修饰N端氨基并不改变经修饰的XTEN的保留时间(图93A)，因 此通过ESI-MS来确认共价修饰(图93B)。而且，IA-XTEN缀合物有效地与含 半胱氨酸肽HCKFWW(Bachem，目录号H-3524)反应(图93C)。
实施例43：针对活性和特异性对LHRH-XTEN-药物缀合物进行基于体 外细胞的筛选
针对体外活性和选择性来评定LHRH-XTEN-药物缀合物。在CellTiter-Glo 抗增殖试验中针对表41中所列的一组LHRH受体阳性和阴性细胞系来测试 每个LHRH-XTEN-药物缀合物、其对应的非靶向XTEN-药物分子以及其相应 的游离药物对照。使用相应的游离药物作为对照来确定适当的试验条件，包 括最佳细胞密度和孵育时间。如下测试LHRH-XTEN-药物缀合物：收集对数 期的细胞，进行计数，并且以预定的细胞密度涂于96孔微量滴定分析板中。 通过在37℃下于5％CO2的气氛中孵育过夜使粘附细胞附着到板上。使用适 当剂量范围的稀释一式两份引入LHRH-XTEN-药物缀合物和对应的对照，并 且将板再孵育2-5天。在适当孵育时段之后，将CellTiter-Glo试剂添加到每 个孔中，在定轨振荡器上混合2分钟。然后，使板以90×g离心，并且在室 温下再孵育10分钟以稳定发光信号。然后，在光度计上读取发光信号，并且 用GraphPad Prism或等效软件计算IC50(半数最大抑制浓度)值。IC50值的定量 比较将能够针对构建体抑制细胞生长的活性和对LHRH受体阳性对比阴性细胞系的选择性进行分级。预期，结果将支持以下发现：LHRH-XTEN-药物缀 合物将对LHRH受体阳性细胞而不会对LHRH受体阴性细胞显示高度选择性 的有效杀伤。这将与游离药物部分成对比，在游离药物部分中预期细胞毒性 在LHRH受体阳性和阴性细胞系之间没有区别。预期XTEN-药物对照产生较 差的细胞毒性活性。将通过在试验中添加游离竞争性LHRH肽针对LHRH受 体缔合来进一步验证相对于对照具有有利的活性和细胞系选择性的 LHRH-XTEN-药物缀合物，这使得LHRH-XTEN-药物的细胞毒性受损，从而 进一步验证构建体的选择性活性。
表41：LHRH受体阳性和阴性细胞系
ER：雌激素受体；PR：孕酮受体
实施例44：针对活性和特异性对叶酸盐-XTEN-药物缀合物进行基于体 外细胞的筛选
首先对叶酸盐-XTEN-药物缀合物进行体外活性和选择性筛选。在 CellTiter-Glo抗增殖试验中针对表42中所列的一组叶酸盐受体阳性和阴性细 胞系来测试每个叶酸盐-XTEN-药物缀合物、其对应的非靶向XTEN-药物分子 以及相应的游离药物对照。因为培养基含有高叶酸含量，所以细胞将在37℃ 下，于5％CO2的气氛中，在含有5-10％热灭活胎牛血清(FCS)的无叶酸培养 基中生长并进行试验(热灭活FCS含有足以使叶酸盐受体表达细胞存活和增 殖的内源水平的叶酸)。使用含有5-10％FCS的无叶酸盐培养基，使用相应的 游离药物作为对照来确立适当的试验条件，包括最佳细胞密度和孵育时间。 然后，如下测试叶酸盐-XTEN-药物缀合物：收集对数期的细胞，进行计数， 并且以预定的细胞密度涂于96孔微量滴定分析板中。通过在37℃、5％CO2下孵育过夜使粘附细胞附着到板上。使用适当剂量范围的稀释一式两份引入 叶酸盐-XTEN-药物缀合物和对应的对照，并且将板再孵育2-5天。在适当孵 育时段之后，将CellTiter-Glo试剂添加到每个孔中，并且在定轨振荡器上混合2分钟。然后，使板以90×g离心，并且在室温下再孵育10分钟以稳定发 光信号。然后，在光度计上读取发光信号，并且用GraphPad Prism或等效软 件计算IC50(半数最大抑制浓度)值。IC50值的定量比较将能够针对构建体抑制 细胞生长的活性和对叶酸盐受体阳性对比阴性细胞系的选择性进行分级。预 期，结果将支持以下发现：叶酸盐-XTEN-药物缀合物将对叶酸盐受体阳性细 胞而不会对叶酸盐受体阴性细胞显示高度选择性的有效杀伤。这将与游离药 物部分成对比，在游离药物部分中预期细胞毒性在叶酸盐受体阳性和阴性细 胞系之间没有区别。预期XTEN-药物对照产生较差的细胞毒性活性。将通过 在试验中添加游离竞争性叶酸针对叶酸盐受体缔合来进一步验证相对于对照 具有有利的活性和细胞系选择性的叶酸盐-XTEN-药物缀合物，这展示出叶酸 盐-XTEN-药物的细胞毒性受损，从而进一步验证构建体的选择性活性。
表42：叶酸盐受体阳性和阴性细胞系
细胞系 组织 叶酸盐受体状态
KB 鼻咽 阳性
IGROV 卵巢 阳性
SK-OV-3 卵巢 阳性
HeLa 子宫颈 阳性
LoVo 结肠直肠 阳性
SW620 结肠直肠 阳性
A549 肺 阴性
A375 多发性黑素瘤 阴性
LS-174T 结肠直肠 阴性
SK-BR-3 乳房 阴性
实施例45：LHRH-XTEN-药物缀合物的体外血清稳定性
作为稳定性的量度，在37℃下于正常人类、食蟹猴和小鼠血浆中独立地 孵育LHRH-XTEN-药物缀合物至多2周，其中等分试样以周期性的时间间隔 移出并且在-80℃下储存直到分析。可以用所释放的游离药物的量或 LHRH-XTEN-药物缀合物随时间的完整性来评定LHRH-XTEN-药物缀合物 的稳定性。用RP-HPLC和/或LC-MS/MS来量化游离药物，而使用XTEN/ 药物和/或LHRH/药物ELISA来测定完整LHRH-XTEN-药物缀合物的量。
对于RP-HPLC分析来说，用如乙腈或丙酮等有机溶剂处理血浆样品以使 蛋白质沉淀。在真空下蒸发可溶性部分，再溶解于加载溶液中，并且通过 RP-HPLC分析。通过在特定地针对特定药物的波长下的UV吸收来检测分析 物，与已知的药物标准相比较。举例来说，在480nm下检测阿霉素。对于 LC-MS/MS分析来说，用如乙腈或丙酮等有机溶剂处理血浆样品以使蛋白质 沉淀。在真空下蒸发可溶性部分，再溶解于加载溶液中，并且通过RP-HPLC分析。通过三极串联四极质谱法来检测和量化分析物，与已知的药物标准相 比较。将以实验方式测定每个药物的母离子-子离子对。对于定量ELISA来说， 使用十字交叉连续稀释分析来测定ELISA中LHRH-XTEN-药物缀合物的抗 体的最佳浓度。通过在4℃下孵育过夜将识别缀合物的一种组分的适当捕获 抗体涂布到96孔微量滴定板上。将孔阻断，洗涤，并且将血清稳定性样品添 加到孔中(各自处于不同的稀释度)，以允许用经涂布的抗体最佳捕获LHRH-XTEN-药物缀合物。在洗涤之后，添加识别缀合物的另一种组分的检 测抗体，并且使其结合到板上所捕获的缀合物。然后再次洗涤孔，然后添加 抗生蛋白链菌素-辣根过氧化酶(与检测抗体的生物素化型式互补)或适当的二 级抗体-辣根过氧化酶(与检测抗体的非生物素化型式互补)。在适当孵育和最 终洗涤步骤之后，添加四甲基联苯胺(TMB)底物，并且在450nM下读取板。 然后，通过将比色反应与使用相关血浆类型中的LHRH-XTEN-药物制定的校 准曲线相比较来计算每个时间点的完整缀合物的浓度。然后，使用对数浓度 对比时间的线性回归分析来定义人类、食蟹猴和小鼠血清中缀合物衰减的 t1/2。
实施例46：叶酸盐-XTEN-药物缀合物的体外血清稳定性
作为稳定性的量度，在37℃下于正常人类、食蟹猴和小鼠血浆中独立地 孵育叶酸盐-XTEN-药物缀合物至多2周，其中等分试样以周期性的时间间隔 移出并且在-80℃下储存直到分析。用游离药物的量或叶酸盐-XTEN-药物缀合 物随时间的完整性来评定叶酸盐-XTEN-药物缀合物的稳定性。用HPLC和/ 或LC-MS/MS来量化游离药物，而使用XTEN/药物和/或叶酸盐/药物ELISA 来测定完整叶酸盐-XTEN-药物缀合物的量。
对于RP-HPLC分析来说，用如乙腈或丙酮等有机溶剂处理血浆样品以使 蛋白质沉淀。在真空下蒸发可溶性部分，再溶解于加载溶液中，并且通过 RP-HPLC分析。通过在特定地针对特定药物的波长下的UV吸收来检测分析 物，与已知的药物标准相比较。举例来说，在480nm下检测阿霉素。对于 LC-MS/MS分析来说，将用如乙腈或丙酮等有机溶剂处理血浆样品以使蛋白 质沉淀。将在真空中蒸发可溶性部分，再溶解于加载溶液中，并且通过 RP-HPLC分析。将通过三极串联四极质谱法在线检测和量化分析物。将以实 验方式测定每个药物的母离子-子离子对。将通过添加已知量的游离药物到对 应的血浆类型中来制备校准标准，并且将与实验样品平行地处理。对于定量 ELISA来说，使用十字交叉连续稀释分析来测定ELISA中叶酸盐-XTEN-药 物缀合物的抗体的最佳浓度。通过在4℃下孵育过夜将识别缀合物的一种组 分的适当捕获抗体涂布到96孔微量滴定板上。将孔阻断，洗涤，并且将血清稳定性样品添加到孔中(各自处于不同的稀释度)，以允许用经涂布的抗体最佳 捕获叶酸盐-XTEN-药物缀合物。在洗涤之后，添加识别缀合物的另一种组分 的检测抗体，并且使其结合到板上所捕获的缀合物。然后再次洗涤孔，然后 添加抗生蛋白链菌素-辣根过氧化酶(与检测抗体的生物素化型式互补)或适当 的二级抗体-辣根过氧化酶(与检测抗体的非生物素化型式互补)。在适当孵育 和最终洗涤步骤之后，添加四甲基联苯胺(TMB)底物，并且在450nM下读取 板。然后，通过将比色反应与使用相关血浆类型中的叶酸盐-XTEN-药物制定 的校准曲线相比较来计算每个时间点的完整缀合物的浓度。然后，使用对数 浓度对比时间的线性回归分析来定义人类、食蟹猴和小鼠血清中缀合物衰减 的t1/2。
实施例47：LHRH-XTEN-Cy5.5缀合物的体内和离体成像
加Cy5.5荧光标签的LHRH-XTEN分子被用作替代物以研究LHRH-XTE N-药物缀合物的靶向和生物分布效率。将在带有皮下生长的LHRH受体阳性 肿瘤细胞的异种移植物的裸小鼠中，利用IVIS 50光学成像系统(Caliper Lif e Sciences,Hopkinton,MA)，使用体内、继之以离体荧光成像来进行实验。 简单地说，向带有LHRH受体阳性肿瘤细胞的雌性nu/nu小鼠给予单次静脉 内注射高或低剂量的LHRH-XTEN-Cy5.5和对应剂量的非靶向的加Cy5.5标 签的XTEN对照。在注射前、然后在注射后约8、24、48和72小时，使用I VIS 50光学成像系统在活的麻醉动物上撷取全身扫描。在72小时的最后时 间点测量荧光在整个动物中的分布之后，切除肿瘤以及包括肝、肺、心、脾 和肾的健康器官，并且用成像系统记录和处理其荧光。选择Cy5.5激发(615- 665nm)和发射(695-770nm)滤光片来匹配荧光剂的波长。使用CCD芯片的 小集成(binning)和中间集成，并且优化暴露时间以从每只小鼠中的图像中可观测到的信号获得至少几千个计数并且避免CCD芯片饱和。为了使图像正规 化用于定量，使用背景激发和发射滤光片针对Cy5.5光谱区撷取背景荧光图 像。荧光的强度用不同颜色表示，其中蓝色反映最低强度并且红色指示最高 强度，并且使用所得图像来评定缀合物和对照的吸收。
实施例48：叶酸盐-XTEN-Cy5.5缀合物的体内和离体成像
加Cy5.5荧光标签的叶酸盐-XTEN分子被用作替代物以研究叶酸盐 -XTEN-药物缀合物的靶向和生物分布效率。将在带有皮下生长的叶酸盐受体 阳性肿瘤细胞的异种移植物的裸小鼠中，利用IVIS 50光学成像系统(Caliper Life Sciences,Hopkinton,MA)，使用体内、继之以离体荧光成像来进行实验。 因为培养基含有高叶酸盐含量，所以将被移植到这些小鼠上的叶酸盐受体阳 性肿瘤细胞将在含有5-10％热灭活FCS并且没有抗生素的无叶酸盐细胞培养 基中生长。类似地，正常啮齿动物食物含有高浓度的叶酸；用于这个研究中 的裸小鼠在肿瘤植入之前将用无叶酸盐膳食维持2周并且持续成像分析的整 段时间以降低血清叶酸盐浓度。
简单地说，向带有叶酸盐受体阳性肿瘤细胞的雌性nu/nu小鼠给予单次 静脉内注射高或低剂量的叶酸盐-XTEN-Cy5.5和对应剂量的非靶向的加 Cy5.5标签的XTEN对照。在注射前、然后在注射后约8、24、48和72小时， 使用IVIS 50光学成像系统在活的麻醉动物上撷取全身扫描。在72小时的最 后时间点测量荧光在整个动物中的分布之后，切除肿瘤以及包括肝、肺、心、 脾和肾的健康器官，并且用成像系统记录和处理其荧光。选择Cy5.5激发(615-665nm)和发射(695-770nm)滤光片来匹配荧光剂的波长。使用CCD芯片 的小集成和中间集成，并且优化暴露时间以从每只小鼠中的图像中可观测到 的信号获得至少几千个计数并且避免CCD芯片饱和。为了使图像正规化用于 定量，使用背景激发和发射滤光片针对Cy5.5光谱区撷取背景荧光图像。荧 光的强度用不同颜色表示，其中蓝色反映最低强度并且红色指示最高强度， 并且使用所得图像来评定缀合物和对照的吸收。
实施例49：LHRH-XTEN-药物缀合物的药物动力学分析
使用小鼠、大鼠、食蟹猴和犬，利用用于蛋白质组合物的标准方法，评 定LHRH-XTEN-药物构建体的体内药物动力学。在与体内投药相容的水性缓 冲液(例如：磷酸盐缓冲盐水、Tris缓冲盐水或Hepes缓冲盐水)中提供 LHRH-XTEN-药物构建体的组合物。这些组合物以适当剂量并且经由多个途 径来施用：最优选地经由静脉内或皮下途径。在0.08到504小时的范围内的 适当时间点收集血液样品，并且加工成血浆。通过多种方法之一来分析血浆 样品的LHRH-XTEN-药物缀合物的浓度，这些方法包括ELISA、HPLC和/ 或LC-MS/MS。使用夹心ELISA格局进行ELISA分析，这种格局可以识别 LHRH-XTEN-药物缀合物的2种组分，例如XTEN/LHRH、XTEN/药物部分、 LHRH/药物部分和/或XTEN/XTEN组合。典型地，将识别LHRH-XTEN-药物 缀合物的一种组分的抗体涂布到96孔微量滴定板的孔上。将孔阻断，洗涤， 然后将血浆样品以不同的稀释度添加到孔中，以允许用经涂布的抗体捕获缀 合物。然后充分地洗涤孔，并且使用针对第二LHRH-XTEN-药物缀合物组分 的生物素化抗体或适当二级抗体来检测经结合的蛋白质。然后再次洗涤孔， 然后添加抗生蛋白链菌素-辣根过氧化酶(与生物素化检测抗体互补)或二级抗 体-辣根过氧化酶(与非生物素化检测抗体互补)。在适当孵育和最终洗涤步骤 之后，添加四甲基联苯胺(TMB)底物，并且在450nM下读取板。然后，通过 将比色反应与LHRH-XTEN-药物校准曲线相比较来计算每个时间点的缀合物 的浓度。使用WinNonLin软件包计算药物动力学参数。
对于RP-HPLC分析来说，用如乙腈或丙酮等有机溶剂处理血浆样品以使 蛋白质沉淀。在真空中蒸发可溶性部分，再溶解于加载溶液中，并且通过 RP-HPLC分析。通过在特定地针对特定药物的波长下的UV吸收来检测分析 物。举例来说，在480nm下检测阿霉素。通过添加已知量的游离药物到对应 的血浆类型中来制备校准标准，并且与实验样品平行地分析。
对于LC-MS/MS分析来说，用如乙腈或丙酮等有机溶剂处理血浆样品以 使蛋白质沉淀。在真空下蒸发可溶性部分，再溶解于加载溶液中，并且通过 RP-HPLC分析。通过三极串联四极质谱法在线检测和量化分析物。以实验方 式测定每个药物的母离子-子离子对。通过添加已知量的游离药物到对应的血 浆类型中来制备校准标准，并且与实验样品平行地分析。
预期，结果将支持以下发现：添加XTEN到LHRH和药物部分中将大大 增加未连接到XTEN的靶向和药物部分的终末半衰期并且增强其药物动力学 特性。
实施例50：叶酸盐-XTEN-药物缀合物的药物动力学分析
使用小鼠、大鼠、食蟹猴和犬，利用用于蛋白质组合物的标准方法，评 定叶酸盐-XTEN-药物构建体的体内药物动力学。因为正常饲料含有高浓度的 叶酸(约6mg/kg小鼠食物)，所以将要在叶酸盐缀合物的药物动力学研究中使 用的动物在研究起始之前将用无叶酸盐膳食维持2周并且持续研究的整段时 间。这些组合物以适当剂量并且经由多个途径来施用：最优选地经由静脉内 或皮下途径。在0.08到504小时的范围内的适当时间点收集血液样品，并且 加工成血浆。通过多种方法来分析血浆样品的叶酸盐-XTEN-药物缀合物的浓度，这些方法包括ELISA、HPLC和/或LC-MS/MS。
使用夹心ELISA格局进行ELISA分析，这种格局可以识别叶酸盐-XTEN- 药物缀合物的2种组分，例如XTEN/叶酸盐、XTEN/药物部分、叶酸盐/药物 部分和/或XTEN/XTEN组合。典型地，将识别叶酸盐-XTEN-药物缀合物的 一种组分的抗体涂布到96孔微量滴定板的孔上。将孔阻断，洗涤，然后将血 浆样品以不同的稀释度添加到孔中，以允许用经涂布的抗体捕获缀合物。然 后充分地洗涤孔，并且使用针对第二叶酸盐-XTEN-药物缀合物组分的生物素 化抗体或适当二级抗体来检测经结合的蛋白质。然后再次洗涤孔，然后添加 抗生蛋白链菌素-辣根过氧化酶(与生物素化检测抗体互补)或二级抗体-辣根 过氧化酶(与非生物素化检测抗体互补)。在适当孵育和最终洗涤步骤之后，添 加四甲基联苯胺(TMB)底物，并且在450nM下读取板。然后，通过将比色反 应与叶酸盐-XTEN-药物校准曲线相比较来计算每个时间点的缀合物的浓度。 使用WinNonLin软件包计算药物动力学参数。
对于RP-HPLC分析来说，用如乙腈或丙酮等有机溶剂处理血浆样品以使 蛋白质沉淀。在真空中蒸发可溶性部分，再溶解于加载溶液中，并且通过 RP-HPLC分析。通过在特定地针对特定药物的波长下的UV吸收来检测分析 物。举例来说，在480nm下检测阿霉素。通过添加已知量的游离药物到对应 的血浆类型中来制备校准标准，并且与实验样品平行地分析。
对于LC-MS/MS分析来说，用如乙腈或丙酮等有机溶剂处理血浆样品以 使蛋白质沉淀。在真空下蒸发可溶性部分，再溶解于加载溶液中，并且通过 RP-HPLC分析。通过三极串联四极质谱法在线检测和量化分析物。以实验方 式测定每个药物的母离子-子离子对。通过添加已知量的游离药物到对应的血 浆类型中来制备校准标准，并且与实验样品平行地分析。
预期，结果将支持以下发现：添加XTEN到叶酸盐和药物部分中将大大 增加未连接到XTEN的靶向和药物部分的终末半衰期并且增强其药物动力学 特性。
实施例51：LHRH-XTEN-药物缀合物的体内功效和毒性分析
LHRH-XTEN-药物缀合物打算用于靶向递送强效毒素到LHRH受体阳性 肿瘤细胞。这样的话，可以使用移植到裸小鼠中的表达LHRH受体的人类肿 瘤细胞来评定LHRH-XTEN-药物构建体的体内药理活性。
在开始功效研究之前，在裸小鼠中进行初始评定以确立LHRH-XTEN-药 物候选物的最大耐受剂量(MTD)。MTD，持续研究的整段时间被动物所耐受 的最高剂量，然后将用于计算在标准异种移植模型中功效和毒性研究的剂量 范围。简单地说，使用每组5只小鼠进行MTD实验，来评估在多个剂量水 平、时间间隔和持续时间下LHRH-XTEN-药物缀合物的静脉内投药。所需的 剂量组的初始MTD剂量和数目是基于科学文献、靶向LHRH部分的知识、经缀合的药物部分的性质、密切相关的化合物的毒物学特性以及来自初始药 物动力学研究的资料(见上文)。每天监控标准MTD参数，例如体重的减轻、 食物和水的消耗，以及立毛、弓背、行为模式、呼吸模式、颤动、痉挛、俯 卧和自残的迹象。不会引起不可接受的毒性的LHRH-XTEN-药物的最高剂量 将被指定为MTD。肿瘤异种移植研究将包括3到4个剂量水平的LHRH-XTEN-药物缀合物并且将取决于来自MTD研究的结果；而其它参数 取决于所选的肿瘤细胞系。表42提供了可以用于异种移植研究中的肿瘤系的 实例。因此，皮下注射适当数目的来自相关人类肿瘤系的LHRH受体阳性细 胞并且使其形成肿瘤，肿瘤的尺寸将用测径规测量并且体积以0.5×L×W2计算，其中L＝最长轴的测量值(毫米)并且W＝垂直于L的轴的测量值(毫 米)。将含有在所需尺寸范围内的肿瘤体积的小鼠随机分成8-10只动物的组之后，以所选的剂量和时间间隔静脉内施用媒剂对照、游离药物对照和 LHRH-XTEN-药物缀合物。通过在所选的时间点用测径规测量肿瘤尺寸和体 积来确定肿瘤生长的停止或衰退。每隔1到2天测量体重和食物消耗以评定 总体毒性。每天监控动物的存活。在研究结束时，将所有动物处死，并且对 主要器官进行临床病理学和组织病理学分析。
预计，结果将支持以下发现：LHRH-XTEN-药物缀合物将产生如强力功 效和低全身毒性所展现的正治疗指数。相比之下，预期以等摩尔剂量给药的 非LHRH靶向的游离药物效力更低，但毒性更高。预期媒剂对照将展示不受 控的肿瘤生长和严重的毒性。
实施例52：叶酸盐-XTEN-药物缀合物的体内功效和毒性分析
叶酸盐-XTEN-药物缀合物打算用于靶向递送毒素组分到叶酸盐受体阳 性肿瘤细胞。使用异种移植到裸小鼠上的表达叶酸盐受体的人类肿瘤细胞来 评定叶酸盐-XTEN-药物构建体的体内药理活性。在开始功效研究之前，在裸 小鼠中进行初始评定以确立叶酸盐-XTEN-药物候选物的最大耐受剂量 (MTD)。MTD，持续研究的整段时间被动物所耐受的最高剂量，然后被用于 计算在标准异种移植模型中功效和毒性研究的剂量范围。因为正常啮齿动物 食物含有高浓度的叶酸(6mg/kg食物)，所以将要用于这些研究中的小鼠在研 究起始之前用无叶酸盐膳食维持2周并且持续研究的整段时间。使用每组5 只小鼠进行MTD实验，来评估在多个剂量水平、时间间隔和持续时间下叶 酸盐-XTEN-药物缀合物的静脉内投药。所需的剂量组的初始MTD剂量和数 目是基于科学文献、靶向叶酸盐部分的知识、经缀合的药物部分的性质、密 切相关的化合物的毒物学特性以及来自初始药物动力学研究的资料(参见上 述PK实施例)。每天小心地监控标准MTD参数，例如体重的减轻、食物和 水的消耗，以及立毛、弓背、行为模式、呼吸模式、颤动、痉挛、俯卧和自 残的迹象。不会引起不可接受的毒性的叶酸盐-XTEN-药物的最高剂量被指定 为MTD。
肿瘤异种移植研究包括3到4个剂量水平的叶酸盐-XTEN-药物，这取决 于来自MTD研究的结果，而其它参数取决于所选的肿瘤细胞系。表42描述 了可以用于异种移植研究中的肿瘤系的实例。为了降低叶酸盐含量，将被移 植到裸小鼠上的叶酸盐受体阳性肿瘤细胞在含有5-10％热灭活胎牛血清并且 没有抗生素的无叶酸盐细胞培养基中生长。类似地，为了降低血清叶酸盐浓 度，用于异种移植研究中的小鼠在肿瘤植入之前用无叶酸盐膳食维持2周并 且持续研究的整段时间。皮下注射适当数目的来自相关系的叶酸盐受体阳性 细胞并且使其形成肿瘤，肿瘤的尺寸用测径规测量并且体积以0.5×L×W2计算，其中L＝最长轴的测量值(毫米)并且W＝垂直于L的轴的测量值(毫 米)。将含有在所需尺寸范围内的肿瘤体积的小鼠随机分成8-10只动物的组之 后，以所选的剂量和时间间隔静脉内施用媒剂对照、游离药物对照和叶酸盐 -XTEN-药物。通过在所选的时间点用测径规测量肿瘤尺寸和体积来确定肿瘤 生长的停止或衰退。每隔1到2天测量体重和食物消耗以评定总体毒性。每天监控动物的存活。在研究结束时，将所有动物处死，并且将移出主要器官 用于临床病理学和组织病理学检查。
预计，靶向的化学治疗性叶酸盐-XTEN-药物缀合物将比单独的游离细胞 毒性药物对小鼠模型中的叶酸盐受体阳性肿瘤更有效并且毒性更低。
实施例53：用于评估LHRH-XTEN-药物缀合物的人类临床试验设计
靶向化学疗法是旨在增加全身化学疗法的功效并且降低副作用的现代方 法。LHRH是在生殖器官中发挥功能的肽。因为其受体特别集中在某些肿瘤 上，但在大多数正常组织中不会表达，所以LHRH受体是用于选择性破坏恶 性肿瘤的理想标靶。确实，约52％的乳癌、约80％的卵巢癌和子宫内膜癌以 及约85％的前列腺癌样本可经由LHRH受体靶向。值得注意地，LHRH依赖 性疗法将尤其适用于三阴性乳房肿瘤，其不会过度表达雌激素或孕酮受体或 HER2并且因此不适合用许多可用的靶向药物治疗。患有晚期子宫内膜癌、 卵巢癌或前列腺癌的患者常常具有特别差的结果，因为这些恶性病可能易复 发和/或对当前治疗具抗性。预期用以形成靶向肽-药物缀合物的带有≥1个 LHRH拷贝的XTEN与带有≥3个药物分子的XTEN的融合具有极大改进的 治疗指数和半衰期，这将使得能够以远低于MTD的水平给药，降低给药频 率和成本(每次给药所需的药物减少)。
在罹患晚期乳癌、子宫内膜癌、卵巢癌和前列腺癌或膀胱癌的患者中进 行LHRH-XTEN-药物组合物的临床评估，其中设计试验以确认LHRH-XTEN- 药物缀合物在人类中的功效和安全性。在患者中的这些研究将包括三期。首 先，将进行第I期安全性和药物动力学研究以确定最大耐受剂量(MTD)并且 在人类中表征剂量限制性毒性、药物动力学和初步药效学。这些初始研究可 以在患有转移性或不可切除的癌症以及标准治愈或缓和措施无法使用或不再 有效或可耐受的患者中进行，并且患者中的LHRH受体阳性状态将为入选标 准。第I期研究的流程将为使用单升级剂量的LHRH-XTEN-药物缀合物并且 测量生物化学、PK和临床参数，从而允许确定MTD以及剂量中和循环药物 中构成将要在后续第II期和第III期试验中使用的治疗窗的阈值和最大浓度， 以及定义将要在进一步研究中追踪的潜在毒性和不良事件。
人类患者的第II期临床研究将在LHRH受体阳性晚期(3期或4期)或复 发性乳癌、子宫内膜癌、卵巢癌和前列腺癌或膀胱癌患者中独立地进行。这 个试验将评估单独的以及与特定适应症中所采用的当前化学疗法组合的 LHRH-XTEN-药物缀合物的功效和安全性。患者将接受以第I期中预定的剂 量水平和方案静脉内施用的LHRH-XTEN-药物临床候选物，伴有或没有标准 化学治疗剂。将包括包含化学治疗剂加上安慰剂的对照臂。主要终点将为如 由实体肿瘤反应评估标准(RECIST)定义的反应率。次要终点将包括安全性和 耐受性、进展时间以及总存活期。
第III期功效和安全性研究在LHRH受体阳性晚期(耐药、复发性)乳癌、 子宫内膜癌、卵巢癌和前列腺癌或膀胱癌患者中进行以测试达到统计上显著 的临床终点，如由RECIST测量的无进展存活期的能力。这个试验还将在统 计上支持总存活期作为次要终点，其中计划入选超过400名患者。使用标准 统计方法来测定功效结果。在这个研究中还追踪毒性和不良事件标志物以验 证化合物当以所描述的方式使用时是安全的。
实施例54：用于评估叶酸盐-XTEN-药物缀合物的人类临床试验设计
靶向化学疗法是旨在增加全身化学疗法的功效并且降低其副作用的现代 方法。叶酸盐，又称为叶酸、维生素B9，是所有活细胞进行核苷酸生物合成 所需的以及在某些生物路径中充当辅因子的至关重要的营养素。叶酸盐受体 是开发用以治疗快速分裂的恶性病，特别是卵巢癌和非小细胞肺癌的疗法的 焦点。虽然叶酸盐受体的表达在正常卵巢中可以忽略，但约90％的上皮卵巢 癌过度表达叶酸盐受体，许多肺腺癌也是这样，由此打开了导向疗法的可能 性。预期用以形成靶向肽-药物缀合物的带有≥1个叶酸盐拷贝的XTEN与带 有≥3个药物分子的XTEN的融合改进了治疗指数，并且延长的半衰期将使 得能够以远低于最大耐受剂量(MTD)的水平给药，降低给药频率和成本(每次 给药所需的药物减少)。
在患有复发性或难治性晚期肿瘤的患者中或在罹患铂类耐药卵巢癌和非 小细胞肺癌并且使用其它化学疗法已经失败的患者中进行叶酸盐-XTEN-药 物组合物的临床评估。设计临床试验以确定叶酸盐-XTEN-药物缀合物在人类 中优于标准疗法的功效和优势。在患者中的这些研究将包括三期。首先，进 行第I期安全性和药物动力学研究以确定MTD并且在人类中表征剂量限制性 毒性、药物动力学和初步药效学。这些初始研究可以在患有复发性或患有难 治性晚期肿瘤以及标准治愈或缓和措施无法使用或不再有效或可耐受的具有 叶酸盐受体阳性状态的患者中进行。第I期研究将使用单升级剂量的叶酸盐 -XTEN-药物缀合物并且将测量生物化学、PK和临床参数以允许确定MTD并 且确立剂量中和循环药物中构成将要在后续第II期和第III期试验中使用的治 疗窗的阈值和最大浓度，以及定义将要在进一步研究中追踪的潜在毒性和不 良事件。
人类患者的第II期临床研究将在叶酸盐受体阳性铂类耐药卵巢癌患者群 体、众多化学疗法已经失败的非小细胞肺癌患者以及罹患复发性或难治性晚 期肿瘤的患者中独立地进行。这些试验将评估单独的以及与特定适应症中所 采用的当前化学疗法组合的叶酸盐-XTEN-药物缀合物的功效和安全性。患者 将接受以第I期研究中确定的剂量水平和方案静脉内施用的叶酸盐-XTEN-药 物缀合物，伴有或没有标准化学治疗剂。将包括包含化学治疗剂加上安慰剂 的对照臂。主要终点将为如由实体肿瘤反应评估标准(RECIST)定义的反应率。 次要终点将包括安全性和耐受性、进展时间以及总存活期。
第III期功效和安全性研究在叶酸盐受体阳性铂类耐药卵巢癌患者、非小 细胞肺癌患者或复发性或难治性晚期肿瘤患者癌症患者中进行以测试达到统 计上显著的临床终点，如由RECIST测量的无进展存活期的能力。这个试验 还将在统计上支持总存活期作为次要终点，其中计划入选超过400名患者。 使用标准统计方法来测定功效结果。在这个研究中还追踪毒性和不良事件标 志物以验证化合物当以所描述的方式使用时是安全的。
实施例55：XTEN的血清稳定性
在37℃下，将含有融合到GFP的N端的XTEN_AE864的融合蛋白质在 猴血浆和大鼠肾溶解产物中孵育至多7天。如图76中所示，在时间0点、第 1天和第7天取出样品，并且通过SDS PAGE分析，接下来使用西方分析来 检测并且用针对GFP的抗体检测。XTEN_AE864的序列显示在血浆中超过7 天的降解迹象可以忽略。然而，XTEN_AE864在大鼠肾溶解产物中超过3天 快速降解。在血浆样品中测试融合蛋白质的体内稳定性，其中如上文所描述 使GFP_AE864免疫沉淀并且通过SDS PAGE分析。在注射后至多7天取出 的样品显示极少的降解迹象。结果展示，aaT-XTEN对血清蛋白酶引起的降解 具抗性；这是增强aaT-XTEN融合蛋白质的药物动力学特性的一个因素。
实施例56：表征连接到艾塞那肽-4的XTEN的二级结构
通过圆二色光谱法来评估XTEN_AE864-Ex4的二级结构程度。在配备有 JascoPeltier温度控制器(TPC-348WI)的Jasco J-715(Jasco Corporation,Tokyo, Japan)分光偏振计上进行CD光谱法。在20mM磷酸钠(pH 7.0)、50mM NaCl 中将蛋白质的浓度调整到0.2mg/mL。使用具有0.1cm的光程长度的 HELLMA石英槽进行实验。在5°、25°、45°和65℃下撷取CD光谱，并且使 用Windows的J-700版本1.08.01(Build 1)Jasco软件处理。在进行CD测量之 前，在每个温度下使样品平衡5分钟。使用1nm的带宽和2秒的时间常数， 以100nm/分钟的扫描速度，从300nm到185nm一式两份记录所有光谱。图 77中所示的CD光谱显示没有稳定的二级结构的证据，并且与非结构化多肽 一致。
实施例57：通过连接到XTEN增加肽有效负载的溶解度和稳定性
为了评估XTEN增强溶解度和稳定性的物理化学特性的能力，制备和评 估胰高血糖素加上较短长度的XTEN的融合蛋白质。在Tris缓冲盐水中于中 性pH下制备测试物品，并且通过逆相HPLC和尺寸排阻色谱来表征 Gcg-XTEN溶液以确认蛋白质是同质的并且在溶液中不聚集。资料呈现于表 43中。出于比较的目的，以60μM(0.2mg/mL)测量未经修饰的胰高血糖素在 相同缓冲液中的溶解限度，并且结果展示，对于所添加的所有长度的XTEN 来说，获得溶解度的大幅度增加。重要的是，在大多数情况下，制备胰高血 糖素-XTEN融合蛋白质以达到目标浓度，并且未作评估来确定给定的构建体 的最大溶解限度。然而，在连接到AF-144 XTEN的胰高血糖素的情况下，确 定溶解限度，结果是与未连接到XTEN的胰高血糖素相比，实现了溶解度增 加60倍。另外，评估胰高血糖素-AF144的稳定性，并且发现其在液体配制 品中在冷藏条件下稳定至少6个月并且在37℃下稳定约一个月(资料未示出)。
资料支持了以下结论：短长度的XTEN多肽与生物活性蛋白质(如胰高血 糖素)的连接可以由所得融合蛋白质显著增强蛋白质的溶解度特性，以及赋予 在较高蛋白质浓度下的稳定性。
表43：胰高血糖素-XTEN构建体的溶解度
实施例58：与不同的有效负载连接的XTEN的分析型尺寸排阻色谱
对含有渐增长度的各种治疗性蛋白质和非结构化重组蛋白质的融合蛋白 质进行尺寸排阻色谱分析。示范性的试验使用TSKGel-G4000SWXL(7.8m m×30cm)柱，其中在20mM磷酸盐(pH 6.8)、114mM NaCl中以0.6ml /分钟的流速分离40μg浓度为1mg/ml的经纯化的胰高血糖素融合蛋白质。 使用OD214nm和OD280nm监控色谱图型态。使用来自BioRad的尺寸排 阻校准标准进行所有试验的柱校准；标志物包括甲状腺球蛋白(670kDa)、牛 γ-球蛋白(158kDa)、鸡卵白蛋白(44kDa)、马肌肉球蛋白(17kDa)和维生素B 12(1.35kDa)。胰高血糖素-Y288、胰高血糖素-Y144、胰高血糖素-Y72、胰 高血糖素-Y36的代表性色谱型态以叠加图的形式示于图78中。资料显示， 每种化合物的分子量与附接的XTEN序列的长度成比例。然而，资料还显示， 每个构建体的表观分子量显著大于球状蛋白质所预期的表观分子量(如通过 与在相同试验中运作的标准蛋白质相比较所示)。基于所评估的所有构建体的SEC分析，表观分子量、表观分子量因子(用表观分子量与计算分子量的比率 表示)和流体动力学半径(RH，nm)示于表44中。结果指示，并入576个氨基 酸或更多氨基酸的不同XTEN向融合蛋白质赋予约339kDa到760的表观分 子量，并且864个氨基酸或更多氨基酸的XTEN赋予大于约800kDA的表观 分子量。表观分子量与实际分子量成比例增加的结果对于使用来自若干不同 基序家族的XTEN形成的融合蛋白质是一致的；即，AD、AE、AF、AG和 AM，其中增加至少四倍并且比率高达约17倍。另外，将具有576个氨基酸 或更多氨基酸的XTEN融合伴侣并入到具有各种有效负载(以及288个残基， 在融合到Y288的胰高血糖素的情况下)的融合蛋白质中使得流体动力学半径 为7nm或更大；远超出约3-5nm的肾小球孔隙尺寸。因此，预期包含生长 和XTEN的融合蛋白质具有降低的肾清除率，这有助于增加终末半衰期并且相对于未融合的生物有效负载蛋白质改进治疗或生物作用。
表44：各种多肽的SEC分析
*不包括糖基化
实施例59：通过预测算法分析序列的二级结构
可以经由某些计算机程序或算法，例如熟知的Chou-Fasman算法(Chou, P.Y.等人(1974)Biochemistry,13:222-45)和Garnier-Osguthorpe-Robson或 “GOR”方法(GarnierJ,Gibrat JF,Robson B.(1996).GOR method for predi cting protein secondarystructure from amino acid sequence.Methods Enzy mol 266:540-553)来评定氨基酸序列的二级结构。对于给定的序列来说，这些 算法可以预测是否存在某种二级结构或根本不存在二级结构，这是用形成例 如α螺旋或β折叠的序列残基的总数和/或百分比或者经预测引起无规卷曲形 成的序列残基的百分比表示。
已经使用Chou-Fasman和GOR方法的两个算法工具来评定来自XTEN “家族”的若干代表性序列以评定这些序列中二级结构的程度。Chou-Fasman 工具是由WilliamR.Pearson和University of Virginia在“Biosupport”互联网 网站提供，URL位于万维网上的.fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_ww w.cgi？rm＝misc1，其在2009年6月19日存在。GOR工具是由Pole Informati que Lyonnais在Network Protein SequenceAnalysis互联网网站提供，URL 位于万维网上的.npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_gor4.pl，其在2008年6月19 日存在。
作为分析中的第一步，通过两种算法来分析单一XTEN序列。AE864组 合物是具有864氨基酸残基的XTEN，这个XTEN从四个由氨基酸G、S、T、 E、P和A组成的12氨基酸序列基序的多个拷贝形成。这些序列基序的特征 为：在基序内和总体序列内存在有限的重复性，这是在于任何两个连续氨基 酸的序列在任一个12氨基酸基序中不会重复两次以上，并且全长XTEN中没 有三个相连氨基酸是相同的。通过Chou-Fasman和GOR算法(后者需要17个 氨基酸的最小长度)分析来自N端的AF 864序列的连续更长部分。通过将 FASTA格式序列加入到预测工具中并且进行分析来分析序列。来自分析的结 果呈现于表45中。
结果指示，通过Chou-Fasman计算，AE和AG家族的达到至少288个氨 基酸残基的短XTEN不具有α螺旋或β折叠，但通过GOR算法分析的无规 卷曲的预测百分比的量在78％到99％之间变化。随着XTEN长度从504个残 基增加到大于1300个，通过Chou-Fasman算法分析的XTEN具有0到约2％ 的α螺旋或β折叠的预测百分比，而无规卷曲的计算百分比增加到94-99％。 那些具有α螺旋或β折叠的XTEN是那些具有三个相连丝氨酸残基的一个或 多个实例的序列，这使得预测的β折叠形成。然而，甚至这些序列仍具有约 99％的无规卷曲形成率。
分析支持了以下结论：1)预测从关于相连氨基酸具有有限重复性的G、S、 T、E、P和A的多个序列基序形成的XTEN具有极低量的α螺旋和β折叠； 2)增加XTEN的长度不会明显增加α螺旋或β折叠形成的可能性；以及3)通 过添加由氨基酸G、S、T、E、P和A组成的非重复12聚体来逐渐增加XTEN 序列的长度使得无规卷曲形成的百分比增加。基于通过这些方法评估的众多 序列得出结论，预期从具有有限重复性(定义为任一个基序中不超过两个相同的相连氨基酸)的G、S、T、E、P和A的序列基序形成的XTEN具有非常有 限的二级结构。除了含有三个相连丝氨酸的基序以外，一般来说，来自表1 的序列基序的任何次序或组合可以用于形成XTEN多肽，这将使得XTEN序 列基本上没有二级结构，并且通过增加XTEN的长度来改善三个相连丝氨酸 的效应。预期这些序列具有本文所公开的本发明的含XTEN组合物的实施方 案中所描述的特征。
表45：多肽序列的CHOU-FASMAN和GOR预测计算
*H：α螺旋E：β折叠
实施例60：分析多肽序列的重复性
可以通过定量较短子序列在整个多肽内出现的次数来评定多肽氨基酸序 列的重复性。举例来说，200个氨基酸残基的多肽具有192个重叠的9氨基 酸子序列(或9聚体“框架”)，但独特的9聚体子序列的数目将取决于序列内重 复性的量。在本分析中，通过将每个3氨基酸框架的所有独特3聚体子序列 跨越聚合物部分的前200个氨基酸的出现次数的总和除以200个氨基酸序列 内的独特3聚体子序列的绝对数目来评定不同序列的重复性。所得子序列计 分反映了多肽内重复性的程度。
表46中所示的结果指示，由2种或3种氨基酸类型组成的非结构化多肽 具有高子序列计分，而由具有低程度的内部重复性的六个氨基酸G、S、T、 E、P和A的12氨基酸基序组成的那些多肽具有小于10并且在一些情况下小 于5的子序列计分。举例来说，L288序列具有两种氨基酸类型并且具有短的、 高度重复的序列，从而得到50.0的子序列计分。多肽J288具有三种氨基酸类 型，而且具有短的重复序列，从而得到33.3的子序列计分。Y576也具有三 种氨基酸类型，但不是由内部重复所组成，这在前200个氨基酸上15.7的子 序列计分反映出。W576由四种类型的氨基酸组成，但具有较高程度的内部重 复性，例如“GGSG”，从而得到23.4的子序列计分。AD576由四种类型的12 氨基酸基序组成，每个基序由四种类型的氨基酸组成。由于个别基序的低程 度的内部重复性，在前200个氨基酸上的总体子序列计分是13.6。相比之下， 由四个基序组成的XTEN含有六种类型的氨基酸，具有低程度的内部重复性 的每个基序具有较低子序列计分；即，AE864(6.1)、AF864(7.5)和AM875 (4.5)。
结论：结果指示，12氨基酸子序列基序(每个基序由四到六种基本上非重 复的氨基酸类型组成)组合成较长的XTEN多肽使得总体序列是非重复的。尽 管如此，每个子序列基序可以在整个序列上多次使用。相比之下，从较少数 目的氨基酸类型形成的聚合物得到较高的子序列计分，不过可以定制实际序 列以降低重复性的程度，从而得到较低的子序列计分。
表46：多肽序列的子序列计分计算
实施例61：计算TEPITOPE计分
如Sturniolo[Sturniolo,T.等人(1999)Nat Biotechnol,17:555]所描述，可 以通过添加口袋型位能(pocket potential)来计算9聚体肽序列的TEPITOPE计 分。在本实施例中，对个别的HLA等位基因计算单独的Tepitope计分。表 47作为实例示出了在高加索人群(Caucasian population)中以高频率出现的 HLA*0101B的口袋型位能。为了计算具有序列P1-P2-P3-P4-P5-P6-P7-P8-P9 的肽的TEPITOPE计分，添加表47中的对应的个别口袋型位能。具有序列 FDKLPRTSG的9聚体肽的HLA*0101B计分是0、-1.3、0、0.9、0、-1.8、 0.09、0、0的总和。
为了评估长肽的TEPITOPE计分，对于序列的所有9聚体子序列可以重 复这个过程。对于由其它HLA等位基因编码的蛋白质可以重复这个过程。表 48-51给出了在高加索人群中以高频率出现的HLA等位基因的蛋白质产物的 口袋型位能。
通过这种方法计算的TEPITOPE计分在约-10到+10的范围内。然而，在 P1位置中缺乏疏水氨基酸(FKLMVWY)的9聚体肽具有在-1009到-989的范 围内的计算TEPITOPE计分。这个值在生物学上无意义，并且反映了疏水氨 基酸充当HLA结合的锚定残基，并且在P1中缺乏疏水残基的肽不被视为 HLA的结合子。因为大多数XTEN序列缺乏疏水残基，所以9聚体子序列的 所有组合将具有在-1009到-989的范围内的TEPITOPE。这种方法确认了 XTEN多肽可以具有极少的或没有预测的T细胞表位。
表47：HLA*0101B等位基因的口袋型位能。
表48：HLA*0301B等位基因的口袋型位能。
氨基酸 P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9
A -999 0 0 0 - 0 0 - 0
C -999 0 0 0 - 0 0 - 0
D -999 -1.3 -1.3 2.3 - -2.4 -0.6 - -0.6
E -999 0.1 -1.2 -1 - -1.4 -0.2 - -0.3
F -1 0.8 0.8 -1 - -1.4 0.5 - 0.9
G -999 0.5 0.2 0.5 - -0.7 0.1 - 0.4
H -999 0.8 0.2 0 - -0.1 -0.8 - -0.5
I 0 1.1 1.5 0.5 - 0.7 0.4 - 0.6
K -999 1.1 0 -1 - 1.3 -0.9 - -0.2
L 0 1 1 0 - 0.2 0.2 - -0
M 0 1.1 1.4 0 - -0.9 1.1 - 1.1
N -999 0.8 0.5 0.2 - -0.6 -0.1 - -0.6
P -999 -0.5 0.3 -1 - 0.5 0.7 - -0.3
Q -999 1.2 0 0 - -0.3 -0.1 - -0.2
R -999 2.2 0.7 -1 - 1 -0.9 - 0.5
S -999 -0.3 0.2 0.7 - -0.1 0.07 - 1.1
T -999 0 0 -1 - 0.8 -0.1 - -0.5
V 0 2.1 0.5 0 - 1.2 0.2 - 0.3
W -1 -0.1 0 -1 - -1.4 -0.6 - -1
Y -1 0.9 0.8 -1 - -1.4 -0.1 - 0.3
表49：HLA*0401B等位基因的口袋型位能。
表50：HLA*0701B等位基因的口袋型位能。
氨基酸 P1 P2 P3 P4 P5 P6P7 P8 P9
A -999 0 0 0 - 00 - 0
C -999 0 0 0 - 00 - 0
D -999 -1.3 -1.3 -1.6 - -2.5-1.3 - -1.2
E -999 0.1 -1.2 -1.4 - -2.50.9 - -0.3
F 0 0.8 0.8 0.2 - -0.82.1 - 2.1
G -999 0.5 0.2 -1.1 - -0.60 - -0.6
H -999 0.8 0.2 0.1 - -0.80.9 - -0.2
I -1 1.1 1.5 1.1 - -0.52.4 - 3.4
K -999 1.1 0 -1.3 - -1.10.5 - -1.1
L -1 1 1 -0.8 - -0.92.2 - 3.4
M -1 1.1 1.4 -0.4 - -0.81.8 - 2
N -999 0.8 0.5 -1.1 - -0.61.4 - -0.5
P -999 -0.5 0.3 -1.2 - -0.5-0.2 - -0.6
Q -999 1.2 0 -1.5 - -1.11.1 - -0.9
R -999 2.2 0.7 -1.1 - -1.10.7 - -0.8
S -999 -0.3 0.2 1.5 - 0.60.4 - -0.3
T -999 0 0 1.4 - -0.10.9 - 0.4
V -1 2.1 0.5 0.9 - 0.11.6 - 2
W 0 -0.1 0 -1.1 - -0.91.4 - 0.8
Y 0 0.9 0.8 -0.9 - -11.7 - 1.1
表51：HLA*1501B等位基因的口袋型位能。
氨基酸 P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9
A -999 0 0 0 - 0 0 - 0
C -999 0 0 0 - 0 0 - 0
D -999 -1.3 -1.3 -0.4 - -0.4 -0.7 - -1.9
E -999 0.1 -1.2 -0.6 - -1 -0.7 - -1.9
F -1 0.8 0.8 2.4 - -0.3 1.4 - -0.4
G -999 0.5 0.2 0 - 0.5 0 - -0.8
H -999 0.8 0.2 1.1 - -0.5 0.6 - -1.1
I 0 1.1 1.5 0.6 - 0.05 1.5 - 0.7
K -999 1.1 0 -0.7 - -0.3 -0.3 - -1.7
L 0 1 1 0.5 - 0.2 1.9 - 0.5
M 0 1.1 1.4 1 - 0.1 1.7 - 0.08
N -999 0.8 0.5 -0.2 - 0.7 0.7 - -1.2
P -999 -0.5 0.3 -0.3 - -0.2 0.3 - -1.1
Q -999 1.2 0 -0.8 - -0.8 -0.3 - -1.6
R -999 2.2 0.7 0.2 - 1 -0.5 - -1
S -999 -0.3 0.2 -0.3 - 0.6 0.3 - -0.3
T -999 0 0 -0.3 - -0 0.2 - -0.2
V 0 2.1 0.5 0.2 - -0.3 0.3 - 0.3
W -1 -0.1 0 0.4 - -0.4 0.6 - -1.4
Y -1 0.9 0.8 2.5 - 0.4 0.7 - -0.9
实施例62：GPCR Ca2+动员活性试验
如Alters，S.等人(2012)GLP2-2G-XTEN：a pharmaceutical protein withimproved serum half-life and efficacy in a rat Crohn′s disease model.PLoSOne； 7(11)：e50630中所描述来制备重组GLP2-2G-XTEN。如实施例26(图68)中所 描述来制备缀合物GLP2-2G-XTEN，并且通过制备型RP-HPLC(图70)来纯 化。使用根据制造商的说明书所用的EMD Millipore ChemiSCREEN人类重组 GLP-2胰高血糖素家族受体钙优化稳定细胞系进行GPCR Ca2+通量动员活性 试验，其结果呈现于图110中。重组和经缀合的GLP2-2G-XTEN用八点、三 倍连续稀释剂量反应曲线来描绘型态。使用具有相应的Y轴RFU的4PL回 归曲线来拟合剂量反应曲线，其中资料用绝对最大RFU的百分比对X轴上的 浓度来表示。重组GLP2-2G-XTEN和缀合物GLP2-2G-XTEN都展现出剂量 依赖性促效剂活性，其中预测的EC50效力值分别为423nM和529nM。
实施例63：缀合物GLP2-2G-XTEN的体外血浆稳定性试验
将等浓度的重组GLP2-2G-XTEN和缀合物GLP2-2G-XTEN独立地外加 到相应的大鼠、食蟹猴和人类血浆中。在37℃下孵育样品至多10天，其中 等分试样以适当的时间间隔移出并且在-80℃下储存直到分析。在相应的血浆 基质中进行的抗XTEN/GLP2 ELISA中，将多种物种中的经缀合的 GLP2-2G-XTEN的血浆稳定性与重组GLP2-2G-XTEN的血浆稳定性相比较。 抗XTEN/GLP2 ELISA包含抗XTEN小鼠抗体作为捕获抗体和生物素化抗人 GLP2抗体作为检测抗体。如图111中所示，缀合物GLP2-2G-XTEN在人类 血浆中的体外稳定性与具有大于240小时的计算稳定性半衰期的重组 GLP2-2G-XTEN的体外稳定性相当。在大鼠和食蟹猴血浆中使用两种 GLP2-2G-XTEN蛋白质也观测到类似的体外稳定性(资料未示出)。
实施例64：大鼠中缀合物GLP2-2G-XTEN的药物动力学
将雌性SD品系大鼠(200-220g)随机分配到组中，每组3只动物。通过以 2mg/kg皮下注射到每只动物中来施用重组GLP-2G-XTEN和缀合物 GLP2-2G-XTEN。在给药前、在施用测试化合物之后0.08、4、8、24、48、 72、96、120和168小时，在预冷却的肝素化微量采血管(heparinized microtainer tube)中收集血液样品(0.2ml)。然后将血液加工成血浆，并且立即在-80℃下储 存直到分析。使用抗XTEN/GLP2 ELISA分析血浆样品，其中使用小鼠抗XTEN抗体作为捕获抗体和生物素化抗人GLP2抗体作为检测抗体。使用相 关的重组GLP2-2G-XTEN或缀合物GLP2-2G-XTEN作为相应的ELISA校准 标准(图112)来进行ELISA。发现重组GLP2-2G-XTEN的计算半衰期(36(±7) 小时)和缀合物GLP2-2G-XTEN的计算半衰期(37(±7)小时)是类似的。
实施例65：经由C端半胱氨酸连接的三聚XTEN缀合物
通过以下程序来制备三聚XTEN缀合物。制备具有一个内部半胱氨酸残 基的XTEN蛋白质1x氨基,1x硫醇-XTEN432(XTEN_AE432(Am1,C422))的等 分试样于20mM HEPES(pH7.0)、50mM NaCl中的587μM(23.23mg/ml)溶 液。将三[2-马来酰亚胺基乙基]胺(TMEA，Thermo Scientific，目录号33043) 溶解于无水DMF中，达到10mM的最终浓度。将TMEA添加到蛋白质溶液 中以连接到XTEN的硫醇基(蛋白质是接头的5倍摩尔过量)。在25℃下孵育反应混合物2小时，并且通过SEC-HPLC(Phenomenex BioSep-SEC-s4000 600 ×7.80mm，缓冲液：50mM磷酸钠(pH 6.5)、300mM NaCl，流速0.5ml/分 钟，等度洗脱70分钟)分析反应产物。在相同的条件下分析线性XTEN_432、 XTEN_864和XTEN_1296(分别具有432个、864个和1296个氨基酸)以鉴别 反应产物(图113)。峰1在28分钟时洗脱，与XTEN_1296的时间相同，并且 被鉴别为XTEN_432的三聚体。峰2在30.5分钟时洗脱，与XTEN_864的时 间相同，并且被鉴别为XTEN_432的二聚体。峰3在35分钟时洗脱，与 XTEN_432的时间相同，并且被鉴别为XTEN_432前体。三聚XTEN缀合物 和二聚XTEN缀合物的产率分别是19％和36％。三聚缀合物3xXTEN_432和 线性分子XTEN_1296的基本上相同的保留时间表明，XTEN蛋白质的表观分子量和流体动力学半径不取决于其几何构型。
实施例66：经由N端α-氨基连接的三聚XTEN缀合物
通过以下程序来制备三聚XTEN缀合物。
1.合成1xDBCO-XTEN288
制备蛋白质1x氨基-XTEN288(XTEN_AE288(Am1))的等分试样于20 mM HEPES(pH7.0)、50mM NaCl中的758μM(20mg/ml)溶液。将2ml蛋白 质与0.1ml 1M HEPES(pH 8.0)和0.152ml 50mM DBCO-磺基-NHS(Click Chemistry Tools，目录号A124)混合，溶解于无水DMF中以将DBCO基团连 接到XTEN的N端氨基。在25℃下孵育反应混合物2小时，并且通过分析型 RP-HPLC来分析(图114A)。将反应混合物用0.01％TFA稀释到15mL，并且 使用10％TFA溶液将pH调整到约3。将蛋白质溶液分成两等分，并且将每 个部分加载于制备型C4 RP-HPLC柱Vydac C4 250×10mm(Grace Davison Discovery Sciences，目录号214TP510)上。使用180ml在0.01％TFA中5-50％ 乙腈的线性梯度以2ml/分钟的流速来洗脱蛋白质。将含有1xDBCO-XTEN288 的部分用1M HEPES(pH 8)调整到pH约为7，并且通过真空蒸发而浓缩。
2.合成3x叠氮化物-PEG4-TAEA
将三(2-氨乙基)胺(TAEA，Sigma Aldrich，目录号225630)于无水DMF中 稀释到200mM的最终浓度。将叠氮基-PEG4-NHS酯(Click Chemistry Tools， 目录号AZ103)溶解于无水DMF中，达到1M的最终浓度。将叠氮基 -PEG4-NHS以5倍摩尔过量与三(2-氨乙基)胺混合，并且在25℃下孵育1小 时。使用C18 RP-HPLC纯化3x叠氮化物-PEG4-TAEA，其使用Phenomenex Jupiter C18 5u150×4.60mm柱，缓冲液A：含0.1％TFA的水，缓冲液 B：含0.1％TFA的乙腈，流速：1ml/分钟，梯度：在45分钟内5％到50％B。 收集色谱峰并且通过MALDI-TOF MS和ESI-MS分析以检测具有966Da的 MW的产物。将3x叠氮化物-PEG4-TAEA鉴别为具有33分钟的保留时间的 峰(图114B)。使用1M HEPES(pH 8.0)中和这个部分，并且通过真空蒸发而 浓缩。
3.合成三聚XTEN缀合物
制备1xDBCO-XTEN288于20mM HEPES(pH 7.0)、50mM NaCl中的 7.85mg/ml(293uM)溶液。对3x叠氮化物-PEG4-TAEA进行RP-HPLC纯化， 并且在相同的缓冲液中配制。未测定经合成的接头的浓度，并且将 1xDBCO-XTEN288与3x叠氮化物-PEG4-TAEA通过经验以各种比率混合并 在25℃下孵育4小时。使用SEC-HPLC(Phenomenex BioSep-SEC-s4000 600×7.80mm，缓冲液：50mM磷酸钠(pH 6.5)、300mM NaCl，流速：0.5ml/分 钟，等度洗脱70分钟)分析缀合产物。在相同的条件下分析线性XTEN_288、 XTEN_576和XTEN_864以鉴别反应产物(图115)。峰1在30.5分钟时洗脱， 与XTEN_864的时间相同，并且被鉴别为XTEN288的三聚体。峰2在34分 钟时洗脱，与XTEN_576的时间相同，并且被鉴别为XTEN_288的二聚体。 峰3在39分钟时洗脱，与XTEN_288的时间相同，并且被鉴别为XTEN_288 前体。峰4对应于低分子量化合物并且不被包括在XTEN物质的定量中。在 优化的蛋白质/接头比率下三聚XTEN缀合物的产率是57％。三聚缀合物 3xXTEN_288和线性分子XTEN_864的基本上相同的保留时间确认了较早的 观测结果：XTEN蛋白质的表观分子量和流体动力学半径不取决于其几何构型。
实施例67：3xFA(γ),3xMMAE-XTEN对KB细胞的选择性细胞毒性
评估选择性地靶向和杀伤带有叶酸盐受体的细胞的能力。在CellTiter-Glo 抗增殖试验中使用叶酸盐受体阳性KB细胞系来评估游离MMAE、非靶向 3xMMAE-XTEN缀合物(连接到毒素的XTEN)和叶酸盐受体靶向的 3xFA(γ),3xMMAE-XTEN缀合物的测试物品。因为培养基含有高叶酸含量， 所以在开始细胞活力实验之前使KB细胞在37℃、5％CO2下于含有10％热 灭活胎牛血清的无叶酸培养基中生长至少7天。还利用这种培养基来完成实 验。简单地说，将KB细胞以10,000个细胞/孔涂于96孔微量滴定分析板上。 通过在37℃、5％CO2下孵育过夜使KB细胞粘附到板上。然后去除已消耗 的培养基，并且指定为含有叶酸竞争剂的孔接收含有叶酸的分析培养基，而 未指定为具有叶酸竞争剂的孔仅接收分析培养基。将板在37℃、5％CO2下 孵育30分钟，随后抽吸分析培养基并且用分析培养基洗涤板。然后，以适当 范围的剂量添加在存在或不存在叶酸竞争剂的情况下的游离MMAE、 3xMMAE-XTEN和3xFA(γ),3xMMAE-XTEN。然后，将板在37℃、5％CO2 下再孵育2-4小时。然后去除培养基，洗涤板，并且引入新鲜培养基并将板 再孵育48-72小时。在适当孵育时段之后，添加CellTiter-Glo试剂，并且在 光度计上读取板。使用4参数逻辑曲线拟合，利用GraphPadPrism来确定每 个测试物品的IC50。
结果：如图116中所示，游离MMAE药物部分显示出KB细胞的强效杀 伤，其中IC50为0.8nM，而缀合到非靶向XTEN的MMAE的3个拷贝使得 细胞杀伤至少降低3个对数(IC50>1,000nM)。显著地，将叶酸盐靶向域的3 个拷贝添加到3xMMAE-XTEN缀合物中恢复了细胞杀伤，其中IC50为4.2 nM；这个活性水平接近于游离MMAE所观测到的水平。同样重要的是，引入叶酸作为靶向缀合物的竞争剂损害了3xFA(γ),3xMMAE-XTEN对KB细胞 系所观测到的细胞杀伤活性。从叶酸盐-XTEN药物缀合物的有效细胞杀伤的 这种降低(从4.2nM到>1,000nM)支持了以下结论：所检测的细胞毒性在实 验条件下是通过使用叶酸盐作为药物缀合物针对KB细胞系的靶向机制来促 进。
实施例68：针对活性和特异性对叶酸盐-XTEN-药物缀合物进行基于体 外细胞的筛选
使用基于体外的筛选和选择性试验来评估使用靶向的叶酸盐-XTEN-药 物缀合物选择性地靶向和杀伤带有叶酸盐受体的细胞的能力。
将在CellTiter-Glo抗增殖试验中针对一组叶酸盐受体阳性和阴性细胞系 来测试每个叶酸盐-XTEN-药物缀合物、其对应的非靶向XTEN-药物分子以及 相应的游离药物对照。细胞系的选择是基于与所提议的临床应用的相关性， 并且包括KB、IGROV、SK-OV-3、HeLa、LoVo、SW620、Madison 109、A549、 A375、LS-174T、HT-29、4T1、SK-BR-3。因为培养基含有高叶酸含量，所 以细胞将在37℃、5％CO2下于含有5-10％热灭活胎牛血清(FCS)的无叶酸培 养基中生长并进行试验。热灭活FCS含有足以使叶酸盐受体表达细胞存活和 增殖的内源水平的叶酸。在含有5-10％FCS的无叶酸盐培养基中使用相应的 游离药物作为对照来预定适当的试验条件，包括最佳细胞密度和孵育时间。 然后，如下测试叶酸盐-XTEN-药物缀合物：收集对数期的细胞，进行计数， 并且以预定的细胞密度涂于96孔微量滴定分析板的每个孔上。通过在37℃、 5％CO2下孵育过夜使粘附细胞附着到板上。以一定剂量范围一式两份引入叶 酸盐-XTEN-药物缀合物和对应的对照，并且将板再孵育2到5天。或者，也 可以向细胞脉冲输送叶酸盐-XTEN-药物缀合物和对应的对照2-6小时，洗涤， 引入新鲜培养基，并且再孵育48-72小时。在适当孵育时段之后，将 CellTiter-Glo试剂添加到每个孔中，在定轨振荡器上混合2分钟。然后，使板 以90g离心，并且在室温下再孵育10分钟以稳定发光信号。然后，在光度计 上读取发光信号，并且用GraphPad Prism或等效软件计算IC50(半数最大抑制 浓度)。IC50的定量比较将能够针对化合物抑制细胞生长的活性和对叶酸盐受体阳性对比阴性细胞系的选择性进行分级。
预期，结果将支持以下发现：叶酸盐-XTEN-药物缀合物将对叶酸盐受体 阳性细胞而不会对叶酸盐受体阴性细胞显示高度选择性的有效杀伤。这将与 游离药物部分成对比，在游离药物部分中预期强细胞毒性在叶酸盐受体阳性 和阴性细胞系之间没有区别。预期XTEN-药物对照产生较差的细胞毒性活性。 将通过在试验中添加游离竞争性叶酸针对叶酸盐受体缔合来进一步验证相对 于对照具有最有利的活性和细胞系选择性的叶酸盐-XTEN-药物缀合物，并且 展示出叶酸盐-XTEN-药物的细胞毒性受损。
实施例69：针对活性和特异性对LHRH-XTEN-药物缀合物进行基于体 外细胞的筛选
使用基于体外的筛选和选择性试验来评估使用靶向的LHRH-XTEN-药物 缀合物选择性地靶向和杀伤带有LHRH受体的细胞的能力。在CellTiter-Glo 抗增殖试验中针对一组LHRH受体阳性和阴性细胞系来测试每个 LHRH-XTEN-药物缀合物、其对应的非靶向XTEN-药物分子以及相应的游离 药物对照。细胞系的选择是基于与所提议的临床应用的相关性，并且包括 MCF-7、MDA-MB-231、HCC1806、HCC1937、OV-1063、EFO-21、EFO-27、 NIH:OVCAR-3、BG-1、HEC-1A、HEC-1B、Ishikawa、KLE、AN-3-CA、MiaPaCa、 Panc-1、大鼠Dunning R-3327-H、PC-82、MDA-PCa-2b、C4-2(LNCaP的衍 生物)、A549、A2780、UCI-107、SK-OV-3、SW 626、MFE-296。使用相应 的游离药物作为对照来预定适当的试验条件，包括最佳细胞密度和孵育时间。 如下测试LHRH-XTEN-药物缀合物：收集对数期的细胞，进行计数，并且以 预定的细胞密度涂于96孔微量滴定分析板的每个孔上。通过在37℃、5％CO2 下孵育过夜使粘附细胞附着到板上。以一定剂量范围一式两份引入 LHRH-XTEN-药物缀合物和对应的对照，并且取决于所使用的细胞系，将板 再孵育2到5天。在适当孵育时段之后，将CellTiter-Glo试剂添加到每个孔 中，在定轨振荡器上混合2分钟。然后，使板以90×g离心，并且在室温下 再孵育10分钟以稳定发光信号。然后，在光度计上读取发光信号，并且用 GraphPad Prism或等效软件计算IC50(半数最大抑制浓度)。IC50的定量比较 将能够针对化合物抑制细胞生长的活性和对LHRH受体阳性对比阴性细胞系 的选择性进行分级。
预期，结果将支持以下发现：LHRH-XTEN-药物缀合物将对LHRH受体 阳性细胞而不会对LHRH受体阴性细胞显示高度选择性的和有效的杀伤。这 将与游离药物部分成对比，在游离药物部分中预期强细胞毒性在LHRH受体 阳性和阴性细胞系之间没有区别。预期没有LHRH靶向部分的XTEN-药物对 照产生较差的细胞毒性活性。通过在试验中添加游离竞争性LHRH肽针对 LHRH受体缔合来进一步验证相对于对照具有最有利的活性和细胞系选择性的LHRH-XTEN-药物缀合物，并且展示出LHRH-XTEN-药物的细胞毒性受 损。
实施例69：LHRH-XTEN-药物缀合物的体外血清稳定性
作为药物连接稳定性的量度，在37℃下于正常人类、食蟹猴和啮齿动物 血浆中独立地孵育LHRH-XTEN-药物缀合物至多2周，其中等分试样以周期 性的时间间隔移出并且在-80℃下储存直到分析。可以用所释放的游离药物的 量或LHRH-XTEN-药物缀合物随时间的完整性来评定LHRH-XTEN-药物缀 合物的稳定性。用RP-HPLC和/或LC-MS/MS来量化游离药物，而通过XTEN/ 药物和/或LHRH/药物ELISA来测定完整LHRH-XTEN-药物缀合物的量。对于RP-HPLC分析来说，用如乙腈或丙酮等有机溶剂处理血浆样品以使蛋白质 沉淀。在真空中蒸发可溶性部分，再溶解于加载溶液中，并且通过RP-HPLC 分析。通过在特定地针对特定药物的波长下的UV吸收来检测分析物。举例 来说，在480nm下检测阿霉素。通过添加已知量的游离药物到对应的血浆类 型中来制备校准标准，并且与实验样品平行地处理。对于LC-MS/MS分析来 说，用如乙腈或丙酮等有机溶剂处理血浆样品以使蛋白质沉淀。在真空中蒸发可溶性部分，再溶解于加载溶液中，并且通过RP-HPLC分析。通过三极串 联四极质谱法在线检测和量化分析物。以实验方式测定每个药物的母离子-子 离子对。通过添加已知量的游离药物到对应的血浆类型中来制备校准标准， 并且与实验样品平行地处理。对于定量ELISA来说，使用十字交叉连续稀释 分析来测定ELISA中LHRH-XTEN-药物缀合物的抗体的最佳浓度。通过在 4℃下孵育过夜将识别缀合物的一种组分的适当捕获抗体涂布到96孔微量滴 定板上。将孔阻断，洗涤，并且将血清稳定性样品添加到孔中(各自处于不同 的稀释度)，以允许用经涂布的抗体最佳捕获LHRH-XTEN-药物缀合物。在洗 涤之后，添加识别缀合物的另一种组分的检测抗体，并且使其结合到板上所 捕获的缀合物。然后再次洗涤孔，然后添加抗生蛋白链菌素-辣根过氧化酶(与 检测抗体的生物素化型式互补)或适当的二级抗体-辣根过氧化酶(与检测抗体 的非生物素化型式互补)。在适当孵育和最终洗涤步骤之后，添加四甲基联苯 胺(TMB)底物，并且在450nM下读取板。然后，通过将比色反应与使用相关 血浆类型中的LHRH-XTEN-药物制定的校准曲线相比较来计算每个时间点的 完整缀合物的浓度。然后，使用对数浓度对比时间的线性回归分析来定义人 类、食蟹猴和小鼠血清中缀合物的t1/2。
实施例70：叶酸盐-XTEN-药物缀合物的体外血清稳定性
作为药物连接稳定性的量度，在37℃下于正常人类、食蟹猴和啮齿动物 血浆中独立地孵育叶酸盐-XTEN-药物缀合物至多2周，其中等分试样以周期 性的时间间隔移出并且在-80℃下储存直到分析。可以用游离药物的量或叶酸 盐-XTEN-药物缀合物随时间的完整性来评定叶酸盐-XTEN-药物缀合物的稳 定性。如上文相关章节中所描述，用HPLC、LC-MS/MS和/或用抗增殖试验 来量化游离药物的存在。通过XTEN/药物和/或叶酸盐/药物ELISA来测定完 整叶酸盐-XTEN-药物缀合物的量。对于RP-HPLC分析来说，用如乙腈或丙 酮等有机溶剂处理血浆样品以使蛋白质沉淀。在真空中蒸发可溶性部分，再 溶解于加载溶液中，并且通过RP-HPLC分析。通过在特定地针对特定药物的 波长下的UV吸收来检测分析物。举例来说，在480nm下检测阿霉素。通过 添加已知量的游离药物到对应的血浆类型中来制备校准标准，并且与实验样 品平行地处理。对于LC-MS/MS分析来说，用如乙腈或丙酮等有机溶剂处理 血浆样品以使蛋白质沉淀。在真空中蒸发可溶性部分，再溶解于加载溶液中， 并且通过RP-HPLC分析。通过三极串联四极质谱法在线检测和量化分析物。 以实验方式测定每个药物的母离子-子离子对。通过添加已知量的游离药物到 对应的血浆类型中来制备校准标准，并且与实验样品平行地处理。当使用抗 增殖试验作为解缀合的游离药物的存在的检测方法时，可以采用叶酸盐受体 阳性或阴性细胞系。当在受体阳性细胞系中进行评定时添加叶酸抑制剂，并 且当在受体阴性细胞系中进行时不需要叶酸抑制剂。在任一种受体细胞类型 中，渐增浓度的解缀合的游离药物有助于细胞毒性的增加。对于定量ELISA 来说，使用十字交叉连续稀释分析来测定ELISA中叶酸盐-XTEN-药物缀合物 的抗体的最佳浓度。通过在4℃下孵育过夜将识别缀合物的一种组分的适当 捕获抗体涂布到96孔微量滴定板上。将孔阻断，洗涤，并且将血清稳定性样 品添加到孔中(各自处于不同的稀释度)，以允许用经涂布的抗体最佳捕获叶酸 盐-XTEN-药物缀合物。在洗涤之后，添加识别缀合物的另一种组分的检测抗 体，并且使其结合到板上所捕获的缀合物。然后再次洗涤孔，然后添加抗生蛋白链菌素-辣根过氧化酶(与检测抗体的生物素化型式互补)或适当的二级抗 体-辣根过氧化酶(与检测抗体的非生物素化型式互补)。在适当孵育和最终洗 涤步骤之后，添加四甲基联苯胺(TMB)底物，并且在450nM下读取板。然后， 通过将比色反应与使用相关血浆类型中的叶酸盐-XTEN-药物制定的校准曲 线相比较来计算每个时间点的完整缀合物的浓度。然后，使用对数浓度对比 时间的线性回归分析来定义人类、食蟹猴和小鼠血清中缀合物的t1/2。
实施例71：LHRH-XTEN-Cy5.5缀合物的体内和离体成像
加Cy5.5荧光标签的LHRH-XTEN缀合物分子被用作替代物以研究 LHRH-XTEN-药物缀合物的靶向和生物分布效率。在带有皮下生长的LHRH 受体阳性肿瘤细胞的异种移植物的裸小鼠中，利用IVIS 50光学成像系统 (Caliper Life Sciences,Hopkinton,MA)，使用体内、继之以离体荧光成像来进 行实验。简单地说，向带有LHRH受体阳性肿瘤细胞的雌性nu/nu小鼠给予 单次静脉内注射高或低剂量的LHRH-XTEN-Cy5.5和对应剂量的非靶向的加Cy5.5标签的XTEN对照。在注射前、然后在注射后约8、24、48和72小时， 使用IVIS 50光学成像系统在活的麻醉动物上撷取全身扫描。在72小时的最 后时间点测量荧光在整个动物中的分布之后，切除肿瘤以及包括肝、肺、心、 脾和肾的健康器官，并且用成像系统记录和处理其荧光。选择Cy5.5激发 (615-665nm)和发射(695-770nm)滤光片来匹配荧光剂的波长。使用CCD芯片 的小集成和中间集成，并且优化暴露时间以从每只小鼠中的图像中可观测到的信号获得至少几千个计数并且避免CCD芯片饱和。为了使图像正规化用于 定量，使用背景激发和发射滤光片针对Cy5.5光谱区撷取背景荧光图像。荧 光的强度用不同颜色表示，其中蓝色反映最低强度并且红色指示最高强度。
实施例72：叶酸盐-XTEN-Cy5.5缀合物的体内和离体成像
加Cy5.5荧光标签的叶酸盐-XTEN分子被用作替代物以研究叶酸盐 -XTEN-药物缀合物的靶向和生物分布效率。在带有皮下生长的叶酸盐受体阳 性肿瘤细胞的异种移植物的裸小鼠中，利用IVIS 50光学成像系统(Caliper Life Sciences,Hopkinton,MA)，使用体内、继之以离体荧光成像来进行实验。因 为培养基含有高叶酸盐含量，所以将被移植到这些小鼠上的叶酸盐受体阳性 肿瘤细胞在含有5-10％热灭活FCS并且没有抗生素的无叶酸盐细胞培养基中 生长。类似地，正常啮齿动物食物含有高浓度的叶酸；用于这个研究中的裸 小鼠在肿瘤植入之前用无叶酸盐膳食维持2周并且持续成像分析的整段时间 以降低血清叶酸盐浓度。向带有叶酸盐受体阳性肿瘤细胞的雌性nu/nu小鼠 给予单次静脉内注射高或低剂量的叶酸盐-XTEN-Cy5.5和对应剂量的非靶向 的加Cy5.5标签的XTEN对照。在注射前、然后在注射后约8、24、48和72 小时，使用IVIS 50光学成像系统在活的麻醉动物上撷取全身扫描。在72小 时的最后时间点测量荧光在整个动物中的分布之后，切除肿瘤以及包括肝、 肺、心、脾和肾的健康器官，并且用成像系统记录和处理其荧光。选择Cy5.5 激发(615-665nm)和发射(695-770nm)滤光片来匹配荧光剂的波长。使用CCD 芯片的小集成和中间集成，并且优化暴露时间以从每只小鼠中的图像中可观 测到的信号获得至少几千个计数并且避免CCD芯片饱和。为了使图像正规化 用于定量，使用背景激发和发射滤光片针对Cy5.5光谱区撷取背景荧光图像。 荧光的强度用不同颜色表示，其中蓝色反映最低强度并且红色指示最高强度。
实施例73：LHRH-XTEN-药物缀合物的药物动力学分析
使用用于蛋白质组合物的标准方法来评定LHRH-XTEN-药物构建体的体 内药物动力学。在多个物种中评定药物动力学，然而，小鼠、大鼠、食蟹猴 和犬由于其通常用于预测人类药物动力学而为优选的。在与体内投药相容的 水性缓冲液(例如：磷酸盐缓冲盐水、Tris缓冲盐水或Hepes缓冲盐水)中提供 LHRH-XTEN-药物构建体的组合物。这些组合物以适当剂量并且经由多个途 径来施用：最优选地经由静脉内或皮下途径。在0.08到504小时的范围内的 适当时间点收集血液样品，并且加工成血浆。然后，将通过多种方法之一来 分析血浆样品的LHRH-XTEN-药物缀合物的浓度，这些方法包括ELISA、 HPLC和/或LC-MS/MS。将使用夹心ELISA格局进行ELISA分析，这种格 局可以识别LHRH-XTEN-药物缀合物的2种组分，例如XTEN/LHRH、XTEN/ 药物部分、LHRH/药物部分和/或XTEN/XTEN组合。典型地，将识别LHRH-XTEN-药物缀合物的一种组分的抗体涂布到96孔微量滴定板的孔上。 将孔阻断，洗涤，然后将已经在不同时间点收集的血浆样品添加到孔中(各自 处于不同的稀释度)，以允许用经涂布的抗体捕获缀合物。然后充分地洗涤孔， 并且使用针对第二LHRH-XTEN-药物缀合物组分的生物素化抗体或适当二级 抗体来检测经结合的蛋白质。然后再次洗涤孔，然后添加抗生蛋白链菌素-辣 根过氧化酶(与生物素化检测抗体互补)或二级抗体-辣根过氧化酶(与非生物 素化检测抗体互补)。在适当孵育和最终洗涤步骤之后，添加四甲基联苯胺(TMB)底物，并且在450nM下读取板。然后，通过将比色反应与LHRH-XTEN- 药物校准曲线相比较来计算每个时间点的缀合物的浓度。使用WinNonLin软 件包计算药物动力学参数。对于RP-HPLC分析来说，用如乙腈或丙酮等有机 溶剂处理血浆样品以使蛋白质沉淀。在真空中蒸发可溶性部分，再溶解于加 载溶液中，并且通过RP-HPLC分析。通过在特定地针对特定药物的波长下的 UV吸收来检测分析物。举例来说，在480nm下检测阿霉素。通过添加已知量的游离药物到对应的血浆类型中来制备校准标准，并且与实验样品平行地 处理。对于LC-MS/MS分析来说，用如乙腈或丙酮等有机溶剂处理血浆样品 以使蛋白质沉淀。在真空中蒸发可溶性部分，再溶解于加载溶液中，并且通 过RP-HPLC分析。通过三极串联四极质谱法在线检测和量化分析物。以实验 方式测定每个药物的母离子-子离子对。通过添加已知量的游离药物到对应的 血浆类型中来制备校准标准，并且与实验样品平行地处理。预期，结果将支 持以下发现：添加XTEN到LHRH和药物部分中作为缀合物制剂与未连接到 XTEN的靶向肽和药物部分相比将大大增加终末半衰期并且增强药物动力学 特性。这继而将转化为用于这些缀合物的更低频率的、更加便利的给药方案。
实施例74：叶酸盐-XTEN-药物缀合物的药物动力学分析
使用用于蛋白质组合物的标准方法来评定叶酸盐-XTEN-药物构建体的 体内药物动力学。在多个物种中评定药物动力学，然而，小鼠、大鼠、食蟹 猴和犬由于其通常用于预测人类药物动力学而为优选的。因为正常饲料含有 高浓度的叶酸(例如6mg/kg小鼠食物)，所以将要在叶酸盐缀合物的药物动力 学研究中使用的动物在研究起始之前用无叶酸盐膳食维持2周并且持续研究 的整段时间。典型地，在与体内投药相容的水性缓冲液(例如：磷酸盐缓冲盐 水、Tris缓冲盐水或Hepes缓冲盐水)中提供叶酸盐-XTEN-药物构建体的组合物。这些组合物将以适当剂量并且经由多个途径来施用：最优选地经由静脉 内或皮下途径。将在0.08到504小时的范围内的适当时间点收集血液样品， 并且加工成血浆。然后，将通过多种方法来分析血浆样品的叶酸盐-XTEN-药 物缀合物的浓度，这些方法包括ELISA、HPLC和/或LC-MS/MS。使用夹心 ELISA格局进行ELISA分析，这种格局可以识别叶酸盐-XTEN-药物缀合物 的2种组分，例如XTEN/叶酸盐、XTEN/药物部分、叶酸盐/药物部分和/或XTEN/XTEN组合。典型地，将识别叶酸盐-XTEN-药物缀合物的一种组分的 抗体涂布到96孔微量滴定板的孔上。将孔阻断，洗涤，然后将已经在不同时 间点收集的血浆样品添加到孔中(各自处于不同的稀释度)，以允许用经涂布的 抗体捕获缀合物。然后充分地洗涤孔，并且使用针对第二LHRH-XTEN-药物 缀合物组分的生物素化抗体或适当二级抗体来检测经结合的蛋白质。然后再 次洗涤孔，然后添加抗生蛋白链菌素-辣根过氧化酶(与生物素化检测抗体互补) 或二级抗体-辣根过氧化酶(与非生物素化检测抗体互补)。在适当孵育和最终洗涤步骤之后，添加四甲基联苯胺(TMB)底物，并且在450nM下读取板。然 后，通过将比色反应与叶酸盐-XTEN-药物校准曲线相比较来计算每个时间点 的缀合物的浓度。使用WinNonLin软件包计算药物动力学参数。对于 RP-HPLC分析来说，用如乙腈或丙酮等有机溶剂处理血浆样品以使蛋白质沉 淀。在真空中蒸发可溶性部分，再溶解于加载溶液中，并且通过RP-HPLC分 析。通过在特定地针对特定药物的波长下的UV吸收来检测分析物。举例来说，在480nm下检测阿霉素。通过添加已知量的游离药物到对应的血浆类型 中来制备校准标准，并且与实验样品平行地处理。对于LC-MS/MS分析来说， 用如乙腈或丙酮等有机溶剂处理血浆样品以使蛋白质沉淀。在真空中蒸发可 溶性部分，再溶解于加载溶液中，并且通过RP-HPLC分析。通过三极串联四 极质谱法在线检测和量化分析物。以实验方式测定每个药物的母离子-子离子 对。通过添加已知量的游离药物到对应的血浆类型中来制备校准标准，并且 与实验样品平行地处理。预期，结果将支持以下发现：添加XTEN到叶酸盐 和药物部分中作为缀合物制剂与未连接到XTEN的靶向肽和药物部分相比将 大大增加终末半衰期并且增强药物动力学特性。这继而将转化为用于这些缀 合物的更低频率的、更加便利的给药方案。
实施例75：LHRH-XTEN-药物缀合物的体内功效和毒性分析
LHRH-XTEN-药物缀合物打算用于靶向递送强效毒素到LHRH受体阳性 肿瘤细胞。这样的话，可以使用移植到裸小鼠上的表达LHRH受体的人类肿 瘤细胞来评定LHRH-XTEN-药物构建体的体内药理活性。在开始功效研究之 前，在裸小鼠中进行初始评定以确立LHRH-XTEN-药物候选物的最大耐受剂 量(MTD)。MTD，持续研究的整段时间被动物所耐受的最高剂量，然后将用 于计算在标准异种移植模型中功效和毒性研究的剂量范围。简单地说，使用 每组5只小鼠进行MTD实验，来评估在多个剂量水平、时间间隔和持续时 间下LHRH-XTEN-药物缀合物的静脉内投药。所需的剂量组的初始MTD剂 量和数目是基于科学文献、靶向LHRH部分的知识、经缀合的药物部分的性 质、密切相关的化合物的毒物学特性以及来自初始药物动力学研究的资料(参 见上文的章节)。每天小心地监控标准MTD参数，例如体重的减轻、食物和 水的消耗，以及立毛、弓背、行为模式、呼吸模式、颤动、痉挛、俯卧和自 残的迹象。不会引起不可接受的毒性的LHRH-XTEN-药物的最高剂量被指定 为MTD。肿瘤异种移植研究将包括3到4个剂量水平的LHRH-XTEN-药物 缀合物并且将取决于来自MTD研究的结果；而其它参数取决于所选的肿瘤 细胞系。实施例69描述了可以用于异种移植研究中的肿瘤系的实例。因此， 皮下注射适当数目的来自相关人类肿瘤系的LHRH受体阳性细胞并且使其形 成肿瘤，肿瘤的尺寸用测径规测量并且体积以0.5×L×W2计算，其中L＝最 长轴的测量值(毫米)并且W＝垂直于L的轴的测量值(毫米)。将含有在所需 尺寸范围内的肿瘤体积的小鼠随机分成8-10只动物的组之后，以所选的剂量 和时间间隔静脉内施用媒剂对照、游离药物对照和LHRH-XTEN-药物缀合物。 通过在所选的时间点用测径规测量肿瘤尺寸并且因此得出体积来确定肿瘤生 长的停止或衰退。每隔1到2天测量体重和食物消耗以评定总体毒性。每天 监控动物的存活。在研究结束时，将所有动物处死，并且对主要器官进行临 床病理学和组织病理学分析。靶向的细胞毒素是用于选择性地消除恶性细胞 的最有前景的策略之一。预计，结果将支持以下发现：LHRH-XTEN-药物缀 合物将产生如强力功效和低全身毒性所展现的极佳治疗指数。相比之下，以 等摩尔剂量给药的非LHRH靶向的游离药物不仅将效力更低，而且毒性更高。 预期媒剂对照展示不受控的肿瘤生长和严重的毒性。
实施例76：叶酸盐-XTEN-药物缀合物的体内功效和毒性分析
叶酸盐-XTEN-药物缀合物打算用于靶向递送强效毒素到叶酸盐受体阳 性肿瘤细胞。这样的话，可以使用异种移植到裸小鼠上的表达叶酸盐受体的 人类肿瘤细胞来评定叶酸盐-XTEN-药物构建体的体内药理活性。在开始功效 研究之前，在裸小鼠中进行初始评定以确立叶酸盐-XTEN-药物候选物的最大 耐受剂量(MTD)。MTD，持续研究的整段时间被动物所耐受的最高剂量，然 后将用于计算在标准异种移植模型中功效和毒性研究的剂量范围。因为正常 啮齿动物食物含有高浓度的叶酸(6mg/kg食物)，所以将要用于这些研究中的 小鼠在研究起始之前用无叶酸盐膳食维持2周并且持续研究的整段时间。使 用每组5只小鼠进行MTD实验，来评估在多个剂量水平、时间间隔和持续 时间下叶酸盐-XTEN-药物缀合物的静脉内投药。所需的剂量组的初始MTD 剂量和数目是基于科学文献、靶向叶酸盐部分的知识、经缀合的药物部分的 性质、密切相关的化合物的毒物学特性以及来自初始药物动力学研究的资料 (参见上文的章节)。每天小心地监控标准MTD参数，例如体重的减轻、食物和水的消耗，以及立毛、弓背、行为模式、呼吸模式、颤动、痉挛、俯卧和 自残的迹象。不会引起不可接受的毒性的叶酸盐-XTEN-药物的最高剂量被指 定为MTD。肿瘤异种移植研究将包括3到4个剂量水平的叶酸盐-XTEN-药 物并且将取决于来自MTD的结果；而其它参数取决于所选的肿瘤细胞系。 实施例69描述了可以用于异种移植研究中的肿瘤系的实例。为了降低叶酸盐 含量，将被移植到裸小鼠上的叶酸盐受体阳性肿瘤细胞在含有5-10％热灭活 胎牛血清并且没有抗生素的无叶酸盐细胞培养基中生长。类似地，为了降低 血清叶酸盐浓度，用于异种移植研究中的小鼠在肿瘤植入之前用无叶酸盐膳 食维持2周并且持续研究的整段时间。因此，皮下注射适当数目的来自相关 系的叶酸盐受体阳性细胞并且使其形成肿瘤，肿瘤的尺寸用测径规测量并且 体积以0.5×L×W2计算，其中L＝最长轴的测量值(毫米)并且W＝垂直于L 的轴的测量值(毫米)。将含有在所需尺寸范围内的肿瘤体积的小鼠随机分成 8-10只动物的组之后，以所选的剂量和时间间隔静脉内施用媒剂对照、游离 药物对照和叶酸盐-XTEN-药物。通过在所选的时间点用测径规测量肿瘤尺寸 并且因此得出体积来确定肿瘤生长的停止或衰退。每隔1到2天测量体重和 食物消耗以评定总体毒性。每天监控动物的存活。在研究结束时，将所有动 物处死，并且对主要器官进行临床病理学和组织病理学分析。靶向的细胞毒 素是用于选择性地消除恶性细胞的最有前景的策略之一。预计，靶向的化学 治疗性叶酸盐-XTEN-药物缀合物将比单独的游离细胞毒性药物对叶酸盐受 体阳性肿瘤更有效并且毒性更低。
实施例76：LHRH-XTEN-药物缀合物的临床应用
靶向化学疗法是旨在增加全身化学疗法的功效并且降低其副作用的现代 方法。经批准用于霍奇金淋巴瘤和全身间变性大细胞淋巴瘤的维布昔单抗 (brentuximabvedotin；Adcentris)是有效的毒素靶向疗法的一个主要实例。 LHRH是在生殖器官中发挥功能的肽。因为其受体特别集中在某些肿瘤上， 但在大多数正常组织中不会表达，所以LHRH受体是用于选择性破坏恶性肿 瘤的理想标靶。确实，约52％的乳癌、约80％的卵巢癌和子宫内膜癌以及约 85％的前列腺癌样本可经由LHRH受体靶向。值得注意地，LHRH依赖性疗 法将尤其适用于三阴性乳房肿瘤，其不会过度表达雌激素或孕酮受体或HER2 并且因此不适合用许多可用的靶向药物治疗。患有晚期子宫内膜癌、卵巢癌 或前列腺癌的患者常常具有特别差的结果，因为这些恶性病可能易复发和/或 对当前治疗具抗性。为了支持这一点，使用LHRH的靶向阿霉素类似物 AEZS-108的临床研究指示，这些癌症类型中的每一者易接受基于LHRH的 疗法。预期用以形成靶向肽-药物缀合物的带有≥1个LHRH拷贝的XTEN与带有≥3个药物分子的XTEN的融合具有极大改进的治疗指数和半衰期，这 将使得能够以远低于MTD的水平给药，降低给药频率和成本(每次给药所需 的药物减少)。
在罹患晚期乳癌、子宫内膜癌、卵巢癌和前列腺癌或膀胱癌的患者中进 行LHRH-XTEN-药物组合物的临床评估。设计临床试验以便可以验证 LHRH-XTEN-药物缀合物在人类中的功效和优势。在患者中的这些研究将包 括三期。首先，进行第I期安全性和药物动力学研究以确定最大耐受剂量(MTD) 并且在人类中表征剂量限制性毒性、药物动力学和初步药效学。这些初始研 究是在患有转移性或不可切除的癌症以及标准治愈或缓和措施无法使用或不 再有效或可耐受的患者中进行。为了增强治疗功效，LHRH受体阳性状态将 为入选标准；这是通过原发性肿瘤或转移性样本的免疫组织化学和/或通过 LHRH靶向的分子成像剂来确定。第I期研究的流程是使用单升级剂量的 LHRH-XTEN-药物缀合物并且测量生物化学、PK和临床参数。这将允许确定 MTD并且确立剂量中和循环药物中构成将要在后续第II期和第III期试验中 使用的治疗窗的阈值和最大浓度。这还定义了将要在进一步研究中追踪的潜 在毒性和不良事件。
人类患者的第II期临床研究是在LHRH受体阳性晚期(3期或4期)或复 发性乳癌、子宫内膜癌、卵巢癌和前列腺癌或膀胱癌患者中独立地进行。这 个试验评估了单独的以及与特定适应症中所采用的当前化学疗法组合的 LHRH-XTEN-药物缀合物的功效和安全性。患者接受以第I期中预定的剂量 水平和方案静脉内施用的LHRH-XTEN-药物临床候选物，伴有或没有标准化 学治疗剂。包括了包含化学治疗剂加上安慰剂的对照臂。主要终点是如由实 体肿瘤反应评估标准(RECIST)定义的反应率。次要终点包括安全性和耐受性、 进展时间以及总存活期。
组织了第III期功效和安全性研究以在LHRH受体阳性晚期(耐药、复发 性)乳癌、子宫内膜癌、卵巢癌和前列腺癌或膀胱癌患者中重复或修改第II期 试验设计，这取决于第II期临床观测结果。可以进一步调整患者入选标准的 细化、进一步的患者分层(例如LHRH受体表达水平)、剂量、方案、标准化 学治疗剂的状态，等等。主要终点是如由RECIST所测量，在定义为LHRH 受体阳性的患者中的无进展存活期。这个试验在统计上支持总存活期作为次 要终点，其中计划入选超过400名患者。评定了不良事件、严重不良事件和 死亡的发生率。
预计，LHRH-XTEN-药物候选物甚至在这些高度预处理的患者群体中仍 将展示出抗癌活性而没有心脏毒性。
实施例76：叶酸盐-XTEN-药物缀合物的临床应用
靶向化学疗法是旨在增加全身化学疗法的功效并且降低其副作用的现代 方法。经批准用于霍奇金淋巴瘤和全身间变性大细胞淋巴瘤的维布昔单抗 (Adcentris)是有效的毒素靶向疗法的一个主要实例。叶酸盐，又称为叶酸、维 生素B9，是所有活细胞进行核苷酸生物合成所需的以及在某些生物路径中充 当辅因子的至关重要的营养素。其在帮助快速细胞分裂和生长中尤其重要。 这样的话，叶酸盐受体是开发用以治疗快速分裂的恶性病，特别是卵巢癌和 非小细胞肺癌的疗法的焦点。某种卵巢肿瘤类型有可能在用手术或基于铂的 化学疗法取得初始成功之后复发，对此，再生长可能对可用的疗法变得有抗 性。虽然叶酸盐受体的表达在正常卵巢中可以忽略，但约90％的上皮卵巢癌 过度表达叶酸盐受体，许多肺腺癌也是这样，由此打开了导向疗法的可能性。 为了支持这一点，使用叶酸盐的靶向长春花生物碱类似物EC-145的临床研究 指示，铂类耐药卵巢癌和非小细胞肺癌易接受基于叶酸盐的疗法。预期用以 形成靶向肽-药物缀合物的带有≥1个叶酸盐拷贝的XTEN与带有≥3个药物分 子的XTEN的融合具有极大改进的治疗指数和半衰期，这将使得能够以远低 于最大耐受剂量(MTD)的水平给药，降低给药频率和成本(每次给药所需的药 物减少)。
在患有复发性或难治性晚期肿瘤的患者中或特别是在罹患铂类耐药卵巢 癌和非小细胞肺癌并且众多化学疗法已经失败的患者中进行叶酸盐-XTEN- 药物组合物的临床评估。设计临床试验以便可以验证叶酸盐-XTEN-药物缀合 物在人类中的功效和优势。在患者中的这些研究将包括三期。首先，进行第 I期安全性和药物动力学研究以确定MTD并且在人类中表征剂量限制性毒 性、药物动力学和初步药效学。这些初始研究是在患有复发性或难治性晚期 肿瘤以及标准治愈或缓和措施无法使用或不再有效或可耐受的患者中进行。 为了增强治疗功效，叶酸盐受体阳性状态是入选标准，这是通过原发性肿瘤 或转移性样本的免疫组织化学和/或通过叶酸盐靶向的分子成像剂来确定。第 I期研究的流程是使用单升级剂量的叶酸盐-XTEN-药物缀合物并且测量生物 化学、PK和临床参数。这将允许确定MTD并且确立剂量中和循环药物中构 成将要在后续第II期和第III期试验中使用的治疗窗的阈值和最大浓度。这还 定义了将要在进一步研究中追踪的潜在毒性和不良事件。
人类患者的第II期临床研究是在叶酸盐受体阳性铂类耐药卵巢癌患者群 体、众多化学疗法已经失败的非小细胞肺癌患者以及罹患复发性或难治性晚 期肿瘤的患者中独立地进行。这个试验评估了单独的以及与特定适应症中所 采用的当前化学疗法组合的叶酸盐-XTEN-药物缀合物的功效和安全性。患者 接受以第I期中预定的剂量水平和方案静脉内施用的叶酸盐-XTEN-药物缀合 物，伴有或没有标准化学治疗剂。包括了包含化学治疗剂加上安慰剂的对照 臂。主要终点是如由实体肿瘤反应评估标准(RECIST)定义的反应率。次要终 点将包括安全性和耐受性、进展时间以及总存活期。
组织了第III期功效和安全性研究以在叶酸盐受体阳性铂类耐药卵巢癌 患者、非小细胞肺癌患者以及复发性或难治性晚期肿瘤患者中重复或修改第 II期试验设计，这取决于第II期临床观测结果。进一步调整患者入选标准的 细化、进一步的患者分层(例如叶酸盐受体表达水平)、剂量、方案、标准化学 治疗剂的状态，等等。主要终点是如由RECIST所测量，在定义为叶酸盐受 体阳性的患者中的无进展存活期。这个试验还将在统计上支持总存活期作为 次要终点，其中计划入选超过400名患者。还评定了不良事件、严重不良事 件和死亡的发生率。
预计，叶酸盐-XTEN-药物候选物甚至在这些高度预处理的患者群体中仍 将展示出抗癌活性而没有严重的毒性。
表52：XTEN-裂解序列-亲和标签多肽序列

Claims (9)

1.一种组合物，其包含如表2中所示的延伸重组多肽(XTEN)，其中所述XTEN包含序列GSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAP。
2.如权利要求1所述的组合物，其进一步包含一个或多个分子的至少第一交联剂，其中所述第一交联剂选自由表13中的交联剂、表15中的炔烃反应物和表15中的叠氮化物反应物组成的组。
3.如权利要求2所述的组合物，其中所述至少第一交联剂在选自由以下组成的组的位置处缀合到所述XTEN：
a.所述XTEN的N端氨基酸残基的α-氨基；和
b.所述XTEN的每个半胱氨酸残基的硫醇基。
4.如权利要求3所述的组合物，其中所述第一交联剂选自由以下组成的组：N-马来酰亚胺、碘乙酰基试剂、吡啶基二硫化物试剂、乙烯基砜试剂、3-炔丙氧基丙酸、其中n是1-10的(氧乙基)n-乙炔、二苯甲基环辛炔(DBCO)、环辛炔(COT)、3-叠氮-丙酸、6-叠氮-己酸和其中n是1-10的(氧乙基)n-叠氮化物。
5.如权利要求4所述的组合物，其中所述第一交联剂缀合到XTEN的每个半胱氨酸残基的硫醇基，并且所述缀合物还包括缀合到XTEN的N端氨基酸的α-氨基的第二交联剂，其中所述第二交联剂选自由表13的交联剂、表15的炔烃反应物和表15的叠氮化物反应物组成的组。
6.如权利要求4所述的组合物，其进一步包含缀合到每个第一交联剂的第一有效负载的单原子残基，其中所述残基选自由碳、氮、氧和硫组成的组。
7.如权利要求6所述的组合物，其中所述第一有效负载选自由表6、7、18和21中所阐述的有效负载组成的组。
8.如权利要求7所述的组合物，其包含第二有效负载，所述第二有效负载通过选自表15中的反应物的炔烃反应物与叠氮化物反应物的反应而连接到XTEN的N端。
9.如权利要求8所述的组合物，其中所述第二有效负载选自由表21的靶向部分组成的组。
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