JP2020505326A - Tead相互作用を妨害するためのペプチド組成物およびその使用方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、その開示全体が本明細書に援用される、2017年1月18日に出願された米国仮特許出願第62/447,864号明細書および2017年5月24日に出願された米国仮特許出願第62/510,719号明細書の利益を主張する。
本出願は、その内容全体が参照により援用される、ASCII形式で電子的に提出された配列表を含む。2018年1月17日に作成された前記ASCIIコピーは、44189−718_601_SL.txtと命名され、サイズが177,067バイトである。
本明細書で言及される全ての刊行物、特許および特許出願は、個々の刊行物、特許または特許出願があたかも具体的かつ個別に参照により援用されているかのように参照により本明細書に援用される。
本明細書で開示されているのは、TEADに結合できるか、またはYAP−TEAD相互作用、他のタンパク質とのTEAD相互作用、YAPおよびTEADの相同体、誘導体もしくは変異型間の相互作用を妨害できる、表1に列挙されるものなどのペプチド配列である。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるペプチドは、がん性細胞もしくは腫瘍細胞、肝細胞、膵臓細胞、結腸細胞、卵巣細胞、乳房細胞および/もしくは肺細胞またはそれらの任意の組み合わせなどの標的細胞に浸透または侵入し得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるようなTEAD結合ペプチドは、ジスルフィドまたはCysを含有しない。他の実施形態では、TEAD結合ペプチドは、1つまたは複数のCysまたは1つまたは複数のジスルフィド結合を含む。いくつかの実施形態では、TEAD結合ペプチドは、ノットペプチドまたはノッチンペプチドから誘導される。いくつかの実施形態では、このようなノットペプチドは、TEADと結合し得、それによってYAP−TEAD相互作用などのTEAD相互作用を妨げる。いくつかの実施形態では、TEAD結合相互作用を妨害するペプチドは、安定性、タンパク質分解耐性、還元条件耐性および/または血液脳関門通過能力など、いくつかのノッチンペプチドの1つまたは複数の特性を含む。
配列同一性百分率または相同性は、従来法によって判定される。例えば、Altschul et al.,Bull.Math.Bio.48:603(1986)およびHenikoff and Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915(1992)を参照されたい。簡潔に述べると、ギャップオープニングペナルティ10、ギャップ伸長ペナルティ1およびHenikoff and Henikoff(同上)の「BLOSUM62」重み行列を用いて、2つのアミノ酸配列が整列され、アライメントスコアが最適化される。次に、配列同一性または相同性は、([完全一致の総数]/[より長い配列長+2つの配列を整列させるためにより長い配列に導入されたギャップ数])(100)として計算される。
ペプチドは、様々な方法の1つまたは複数で化学的に修飾され得る。いくつかの実施形態では、ペプチドが変異して、機能が付加されるか、機能が欠失されるか、または生体内挙動が変更され得る。例えば、本開示のペプチドは、TEADのプロテアソーム分解をもたらすであろう分子で化学的に修飾され得る(例えば、ユビキチンリガーゼ係合コンジュゲートもしくは融合物またはセレブロン結合分子)。ジスルフィド結合間の1つまたは複数のループを修飾または置換して、他のペプチドからの活性成分を含め得る(Moore and Cochran,Methods in Enzymology,503,p.223−251,2012に記載されるように)。アミノ酸は、半減期を増加させ、生体内結合挙動を修飾、もしくは付加、もしくは欠失させ、新たな標的機能を追加し、表面電荷および疎水性を変更し、またはコンジュゲーション部位を可能にするなどのためにも変異され得る。N−メチル化は、本開示のペプチドにおいて生じ得るメチル化の一例である。いくつかの実施形態では、ペプチドは、遊離アミン上のメチル化によって修飾される。例えば、完全メチル化は、ホルムアルデヒドおよびシアノ水素化ホウ素ナトリウムによる還元的メチル化の使用を通じて達成され得る。
いくつかの実施形態では、本開示のペプチド自体を使用してTEADへのYAPの結合が阻害され得る。他の実施形態では、本開示のペプチドを使用して他の活性薬剤を送達することもできる。本開示に従ったペプチドは、腫瘍およびがんの治療で使用するための薬剤にコンジュゲート、連結または融合され得る。例えば、特定の実施形態では、本明細書に記載のペプチドは、追加の機能的能力を提供する活性薬剤などの別の分子に融合される。活性薬剤の配列とペプチドの配列とを含有するベクターの発現を通じて、ペプチドが活性薬剤と融合され得る。様々な実施形態において、ペプチドの配列および活性薬剤の配列は、同一のオープンリーディングフレーム(ORF)から発現され得る。様々な実施形態において、ペプチドの配列および活性薬剤の配列は、連続配列を含み得る。ペプチドおよび活性薬剤は、融合ペプチドにおいて、それらの機能的能力が別々に発現された場合と比較して同様の機能的能力をそれぞれ維持し得る。特定の実施形態では、活性剤の例は、他のペプチドを含み得る。
ペプチドは、イメージング、研究、治療学、セラノスティクス、医薬品、化学療法、キレート療法、標的化薬物送達および放射線療法に使用される薬剤にコンジュゲート、連結または融合され得る。いくつかの実施形態では、ペプチドは、例えば、フルオロフォア、近赤外線色素、造影剤、ナノ粒子、金属含有ナノ粒子、金属キレート、X線造影剤、PET薬剤、金属、放射性同位体、色素、放射性核種キレート剤またはイメージングで使用され得る別の適切な材料などの検出可能薬剤にコンジュゲート、連結または融合される。いくつかの実施形態では、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10個の検出可能薬剤がペプチドに連結され得る。放射性同位体の非限定的例としては、α放射体、β放射体、陽電子放射体およびγ放射体が挙げられる。いくつかの実施形態では、金属または放射性同位体は、アクチニウム、アメリシウム、ビスマス、カドミウム、セシウム、コバルト、ユウロピウム、ガドリニウム、イリジウム、鉛、ルテチウム、マンガン、パラジウム、ポロニウム、ラジウム、ルテニウム、サマリウム、ストロンチウム、テクネチウム、タリウムおよびイットリウムからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、金属は、アクチニウム、ビスマス、鉛、ラジウム、ストロンチウム、サマリウムまたはイットリウムである。いくつかの実施形態では、放射性同位体は、アクチニウム−225または鉛−212である。いくつかの実施形態において、近赤外線色素は、生物学的組織および体液によって容易に消光されない。いくつかの実施形態では、フルオロフォアは、650nm〜4000nmの波長の電磁放射を発する蛍光剤であり、このような放射は、薬剤を検出するために使用されている。本開示のコンジュゲート分子として使用され得る蛍光色素の非限定的例としては、DyLight−680、DyLight−750、VivoTag−750、DyLight−800、IRDye−800、VivoTag−680、Cy5.5またはインドシアニングリーン(ICG)が挙げられる。いくつかの実施形態では、近赤外線色素は、多くの場合、シアニン色素(例えば、Cy7、Cy5.5およびCy5)を含む。本開示のコンジュゲート分子として使用される蛍光色素の追加的な非限定的例としては、アクラジンオレンジまたはイエロー、Alexa Fluor(例えば、Alexa Fluor790、750、700、680、660および647)およびそのあらゆる誘導体、7−アクチノマイシンD、8−アニリノナフタレン−1−スルホン酸、ATTO色素およびそのあらゆる誘導体、オーラミン−ローダミン染色およびそのあらゆる誘導体、ベンゾアントルホン、ビマン、9−10−ビス(フェニルエチニル)アントラセン、5,12−ビス(フェニルエチニル)ナタタセン、ビスベンズイミド、ブレインボウ、カルセイン、カルボジフルオレセインおよびそのあらゆる誘導体、1−クロロ−9,10−ビス(フェニルエチニル)アントラセンおよびそのあらゆる誘導体、DAPI、DiOC6、DyLight Fluorsおよびそのあらゆる誘導体、エピコッコノン、臭化エチジウム、FlAsH−EDT2、Fluo色素およびそのあらゆる誘導体、FluoProbeおよびそのあらゆる誘導体、フルオレセインおよびそのあらゆる誘導体、Furaおよびそのあらゆる誘導体、GelGreenおよびそのあらゆる誘導体、GelRedおよびそのあらゆる誘導体、蛍光タンパク質およびそのあらゆる誘導体、例えばmCherryなどのmイソ型タンパク質およびそのあらゆる誘導体、ヘタメチン色素およびそのあらゆる誘導体、ヘスキスト染色、イミノクマリン、インディアンイエロー、indo−1およびそのあらゆる誘導体、ラウルダン、ルシファーイエローおよびそのあらゆる誘導体、ルシフェリンおよびそのあらゆる誘導体、ルシフェラーゼおよびそのあらゆる誘導体、メルコシアニンおよびそのあらゆる誘導体、ナイル色素およびそのあらゆる誘導体、ペリレン、フロキシン、フィコ色素およびそのあらゆる誘導体、ヨウ化プロピウム、ピラニン、ローダミンおよびそのあらゆる誘導体、リボグリーン、RoGFP、ルブレン、スチルベンおよびそのあらゆる誘導体、スルホローダミンおよびそのあらゆる誘導体、SYBRおよびそのあらゆる誘導体、synapto−pHluorin、テトラフェニルブタジエン、テトラナトリウムトリス、テキサスレッド、チタンイエロー、TSQ、ウンベリフェロン、ビオラントロン、黄色蛍光タンパク質およびYOYO−1が挙げられる。他の適切な蛍光色素としては、フルオレセインおよびフルオレセイン色素(例えば、フルオレセインイソチオシアニンまたはFITC、ナフトフルオレセイン、4’、5’−ジクロロ−2’,7’−ジメトキシフルオレセイン、6−カルボキシフルオレセインまたはFAMなど)、カルボシアニン、メロシアニン、スチリル色素、オキソノール色素、フィコエリトリン、エリスロシン、エオシン、ローダミン色素(例えば、カルボキシテトラメチル−ローダミンまたはTAMRA、カルボキシローダミン6G、カルボキシ−X−ローダミン(ROX)、リサミンローダミンB、ローダミン6G、ローダミングリーン、ローダミンレッド、テトラメチルローダミン(TMR)など)、クマリンおよびクマリン色素(例えば、メトキシクマリン、ジアルキルアミノクマリン、ヒドロキシクマリン、アミノメチルクマリン(AMCA)など)、オレゴングリーン色素(例えば、オレゴングリーン488、オレゴングリーン500、オレゴングリーン514、など)、テキサスレッド、テキサスレッド−X、スペクトラムレッド、スペクトラムグリーン、シアニン色素(例えば、CY−3、Cy−5、CY−3.5、CY−5.5など)、ALEXA FLUOR色素(例えば、ALEXA FLUOR 350、ALEXA FLUOR 488、ALEXA FLUOR 532、ALEXA FLUOR 546、ALEXA FLUOR 568、ALEXA FLUOR 594、ALEXA FLUOR 633、ALEXA FLUOR 660、ALEXA FLUOR 680など)、BODIPY色素(例えば、BODIPY FL、BODIPY R6G、BODIPY TMR、BODIPY TR、BODIPY 530/550、BODIPY 558/568、BODIPY 564/570、BODIPY 576/589、BODIPY 581/591、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665など)、IRDyes(例えば、IRD40、IRD 700、IRD 800など)などが挙げられるが、これに限定されるものではない。追加的な適切な検出可能薬剤は、PCT/米国特許出願公開第14/56177号明細書に記載されている。放射性同位体の非限定的例としては、α放射体、β放射体、陽電子放射体およびγ放射体が挙げられる。いくつかの実施形態では、金属または放射性同位体は、アクチニウム、アメリシウム、ビスマス、カドミウム、セシウム、コバルト、ユウロピウム、ガドリニウム、イリジウム、鉛、ルテチウム、マンガン、パラジウム、ポロニウム、ラジウム、ルテニウム、サマリウム、ストロンチウム、テクネチウム、タリウムおよびイットリウムからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、金属は、アクチニウム、ビスマス、鉛、ラジウム、ストロンチウム、サマリウムまたはイットリウムである。いくつかの実施形態では、放射性同位体は、アクチニウム−225または鉛−212である。
本開示に従ったペプチドは、リンカーを介してまたはリンカーの非存在下で直接、小分子、第2のペプチド、タンパク質、抗体、抗体断片、アプタマー、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、フルオロフォア、放射性同位体、放射性核種キレート剤、ポリマー、生体高分子、脂肪酸、アシル付加物、化学リンカーもしくは糖または本明細書に記載の他の活性薬剤もしくは検出可能薬剤などの別の部分(例えば、活性薬剤または検出可能薬剤)に付着され得る。リンカーの非存在下では、例えば、活性薬剤または検出可能薬剤は、ペプチドのN末端またはC末端にコンジュゲート、連結または融合されて、活性薬剤または検出可能薬剤融合ペプチドが生成し得る。他の実施形態では、還元的アルキル化によるペプチド融合を通して連結が生成され得る。いくつかの実施形態では、細胞、エンドソームまたは核への侵入時、切断または分解され得るリンカーなどの切断可能リンカーがペプチドの生体内送達に使用される。いくつかの実施形態では、ペプチドの生体内送達は、細胞の浸透または細胞核への局在化に干渉しない小型リンカーを必要とする。リンカーを用いて、本明細書に記載のペプチドを、標的化、細胞傷害性、治療的、ホーミング、画像化または診断的機能などの別個の機能を有する別の部分または分子に共有結合的に付着させることもできる。
本開示のペプチドは、細胞内、細胞質ゾル内、細胞核内またはエンドソーム内のpHまたは還元環境などの様々な生物学的または生理学的条件において安定であり得る。例えば、配列番号1〜配列番号84のいずれのペプチドも還元剤、プロテアーゼ、酸化条件または酸性条件に対して耐性を示し得る。
ペプチドの製造および精製。いくつかの実施形態では、コンピュータによる設計から生成されたペプチドライブラリーからの配列は、発現ベクターまたは固相もしくは液相ペプチド合成法を用いて合成され得る。例えば、TEAD結合ペプチドまたはペプチドおよびシデロカリン−YAPは、Bandaranayake et al.,2011に従って、分泌された可溶性タンパク質産生/発現ベクターにクローニングされ、精製され得る。精製法としては、親和性精製カラム、イオン交換(カチオンおよび/またはアニオンカラム)、逆相、疎水性相互作用およびサイズ交換カラムが挙げられるが、これに限定されるものではない。SDS−PAGEと、それに続くクマシー染色および逆相HPLCを用いて、精製タンパク質のサンプルが分析され得る。タンパク質濃度は、UVスペクトル吸収および/またはアミノ酸分析によって評価された。
様々な発現ベクター/宿主系が、本明細書に記載のペプチドの組換え発現に利用され得る。このようなシステムの非限定的例としては、本明細書に記載のペプチドまたはペプチド融合タンパク質/キメラタンパク質をコードする核酸配列を含有する、組換えバクテリオファージDNAまたはプラスミドDNAまたはコスミドDNA発現ベクターで形質転換された細菌などの微生物、前述の核酸配列を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母、前述の核酸配列を含有する組換えウイルス発現ベクター(例えば、バキュロウイルス)で感染された昆虫細胞系、組換えウイルス発現ベクター(例えば、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)、タバコモザイクウイルス(TMV))で感染されるか、または前述の核酸配列を含有する組換えプラスミド(例えば、Tiプラスミド)発現ベクターで形質転換された植物細胞系または二重微小染色体において安定して増幅される(例えば、CHO/dhfr、CHO/グルタミンシンセターゼ)か、または不安定に増幅される(例えば、マウス型細胞株)かのいずれかである、遺伝子操作されて前述の核酸配列の複数コピーを含有する細胞株を含む、組換えウイルス発現ベクター(例えば、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、レンチウイルス)で感染された動物細胞系が挙げられる。ペプチドのジスルフィド結合の形成および折り畳みは、発現中もしくは発現後またはその両方で起こり得る。
本開示の医薬組成物は、本明細書に記載されるような任意のペプチドと、担体、安定剤、希釈剤、分散剤、懸濁剤、増粘剤、抗酸化剤、溶解剤、緩衝液、オスモライト、塩類、界面活性剤、アミノ酸、封入剤、増量剤、抗凍結剤および/または賦形剤などの他の化学成分との組み合わせであり得る。医薬組成物は、本明細書に記載のペプチドの生物への投与を容易にする。場合により、医薬組成物は、ペプチドの半減期を延長し、かつ/またはペプチドが標的細胞に浸透することを促進する因子を含む。
いくつかの実施形態では、方法は、本明細書に記載の有効量のペプチドを、それを必要とする対象に投与するステップを含む。
一態様では、本明細書に記載のペプチドは、キットとして提供され得る。別の実施形態では、本明細書に記載のペプチドコンジュゲートは、キットとして提供され得る。別の実施形態では、キットは、本明細書に記載のペプチドをコードするアミノ酸、ベクター、宿主生物および取扱説明書を含む。いくつかの実施形態では、キットは、ペプチドの使用または投与に関する書面による指示を含む。
ペプチドの製造
この実施例は、本明細書に記載のペプチドの製造を記載する。タンパク質由来のペプチドは、公表された方法論を用いて哺乳類細胞培養において生成した。(A.D.Bandaranayke,C.Correnti,B.Y.Ryu,M.Brault,R.K.Strong,D.Rawlings.2011.Daedalus:a robust,turnkey platform for rapid production of decigram quantities of active recombinant proteins in human cell lines using novel lentiviral vectors.Nucleic Acids Research.(39)21,e143)。
哺乳類発現系を用いたペプチド発現
この実施例は、哺乳類発現系を用いたペプチドの発現を記載する。ペプチドは、Bandaranayake et al.,Nucleic Acids Res.2011 Nov;39(21):e143に記載される方法に従って発現させた。ペプチドを、タバコエッチウイルスプロテアーゼを使用してシデロカリンから切断し、1×DPBS中で4カラム容量にわたって定組成溶離を使用して、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)カラム上でFPLCにより精製した。次に、ペプチドを4℃で保存した。
TEADの製造および検証
この実施例は、TEAD結合ペプチドの製造を記載する。設計されたライブラリーからTEADバインダーを同定するために、可溶性TEAD(194〜411)を2つのC末端タグ:6×His(配列番号284)およびAviTagを用いて作製した。His−Avi−TEADの安定性およびYAP結合能を確認するために、YAP(50−171)を可溶性シデロカリン融合物として作製した。図1は、製造されたビオチン化TEADおよびシデロカリン融合YAPの検証および機能解析を示す。図1Aは、シデロカリン−YAPの存在を示唆する付近の55kDaのバンドを有するSDS−PAGEを示す。図1Bは、シデロカリン融合YAPがSPRチップ上に固定化されたビオチン化TEADに570nMの解離定数(KD)で結合することを示す表面プラズモン共鳴(SPR)データを示す。図1Cは、表面係留YAP(50−171)を発現するHEK−293細胞が、ビオチン化TEADに結合したストレプトアビジンにコンジュゲートされたAlexaフルオロフォア(AF)−647(AF657−ストレプトアビジン)によって染色されることを示す。ヒトトランスフェリン受容体に対する特異的リガンドであるマチュポウイルス(MACV)糖タンパク質を発現する細胞は、AF−647によって染色されず、これは、TEADがMACVに結合しないことを示唆する。
TEAD結合ペプチドの哺乳類表面提示
この実施例は、本開示のTEAD結合ペプチドの哺乳類表面提示を記載する。TEADバインダーのスクリーニングは、哺乳類細胞の提示候補ペプチドへの形質移入または形質導入と、それに続くAlexaフルオロフォア647(AF647)にコンジュゲートしたビオチン化TEADでのスクリーニングによって実施した。哺乳類細胞は、ジスルフィド架橋タンパク質の折り畳みにおける改善された忠実度を有し、それらを本開示のペプチドの提示に適した細胞型にする。図2は、表面提示GFP FasL(SDGF)ベクターがペプチド発現および別の部分へのノッチンペプチド結合の評価のための効果的な哺乳類提示ベクターであることを示す。図2Aは、SDGFベクターの概略図を示す。細胞質ゾルのN末端GFPは、ヒトFasLの膜貫通ドメインを介して細胞外ドメインに接続する。ウシロドプシンC9タグが続き、C末端ノッチンから短いリンカーで分離されている(エラフィンが代表例としてここに示されるが、任意のペプチドも使用され得る)。特異的結合パートナー(エラフィンに対するエラスターゼが代表例としてここに示されているが、任意のペプチドまたはペプチドのライブラリーも使用され得る)は、ノッチンに結合し、結合パートナーが蛍光でタグ付けされている場合、その蛍光を細胞に付与する。図2Bは、SDGF−エラフィンを発現するHEK−293懸濁細胞がAF647コンジュゲートエラスターゼによって染色されることを示すフローサイトメトリーヒストグラムを示す。SDGF−YAP(50〜171)またはSDGF−MACV糖タンパク質のいずれかを発現する細胞による陰性対照実験は、AF647エラスターゼによって染色されない。
TEAD結合ペプチドのスクリーニング
この実施例は、実施例4の哺乳類表面提示システムを用いたTEAD結合ペプチドのスクリーニングを記載する。潜在的なTEAD結合ペプチドをSDGFにクローニングし、200nMのTEAD−ストレプトアビジンを用いて有効なバインダーをスクリーニングした。図3は、TEAD結合ペプチドについて設計されたライブラリーをスクリーニングすることを示す。図3Aは、SDGFペプチドライブラリーのスクリーニング工程の概略図を示す。図3Bは、x軸にペプチドコンストラクト発現(GFP)の蛍光を示し、y軸にTEAD(AF647)を示すフローサイトメトリープロットを示す。二重陽性細胞(右上の四分円)は、TEADに結合したペプチド発現細胞を示す。HEK−293細胞をSDGF TEADバインダーライブラリーで形質導入し、200nMのAF547−ストレプトアビジン−TEADで染色した。フローサイトメトリープロットは、未分類の細胞、1、2または3回のスクリーニング後に分類された細胞を示す。
細胞表面提示TEAD結合ペプチドおよび可溶性TEAD結合ペプチドの結合
この実施例は、TEADと、本開示のペプチドと、本開示のペプチド変異型との結合を記載する。YAPが結合するのと同じ一部位(部位2)でTEADに結合するように配列番号1および配列番号2のペプチドを設計した。配列番号1および配列番号2の両方のペプチドは、YAPらせん2にも存在するLX1X2LF(配列番217)モチーフを含み、式中、X1およびX2は、任意のアミノ酸であり得る。図4は、配列番号1および配列番号2のペプチドならびにYAPと界面を接するモデル化TEADおよび配列番号1変異型および配列番号2変異型へのTEADの結合を示す。図4Aは、YAPならびに配列番号1および配列番号2のペプチドが同一部位(部位2)でTEADに結合すると予測されることを示す。YAP−TEAD構造(タンパク質データバンク(PDB)ID:3KYS)は、構造バイオインフォマティクス研究共同体(RCSB)からのものである。RCSB 3KYSからのTEAD構造に結合した配列番号1および配列番号2をモデル化した。図4Bは、配列番号2のSDGF−L23A変異型(配列番号2の23位のリジンからアラニンへの変異型)で形質移入されたHEK−293懸濁細胞に対するTEAD結合と対比した、SDGFー配列番号2で形質移入されたHEK−293懸濁細胞に対するTEAD結合を示すフローサイトメトリープロットを示す。アラニンに変異した場合、YAPのL65残基と類似した配列番号2のL23位は、TEADへの結合の喪失をもたらした。図4Cは、配列番号2のSDGF−L26A変異型(配列番号2の26位のリジンからアラニンへの変異型)で形質移入されたHEK−293懸濁細胞に対するTEAD結合と対比した、SDGF−配列番号2で形質移入されたHEK−293懸濁細胞に対するTEAD結合を示すフローサイトメトリープロットを示す。アラニンに変異した場合、YAPのL68残基と類似した配列番号2のL26位は、TEADへの結合の喪失をもたらした。図4Dは、配列番号2のSDGF−L27A変異型(配列番号2の27位のフェニルアラニンからアラニンへの変異型)で形質移入されたHEK−293懸濁細胞に対するTEAD結合と対比した、SDGF−配列番号2で形質移入されたHEK−293懸濁細胞に対するTEAD結合を示すフローサイトメトリープロットを示す。アラニンに変異した場合、YAPのF69残基と類似した配列番号2のF27位は、TEADへの結合の喪失をもたらした。図4Eは、配列番号2のSDGF−6xCS変異型(6個全てのシステインがセリンに変異している配列番号2の変異型)で形質移入されたHEK−293懸濁細胞に対するTEAD結合と対比した、SDGF−配列番号2で形質移入されたHEK−293懸濁細胞に対するTEAD結合を示すフローサイトメトリープロットを示す。システインのセリンへの変異は、TEADへの結合の喪失をもたらした。図4Fは、配列番号4のペプチド(配列番号1の25位のグルタミン酸からアラニンへの変異型である配列番号1のSDGF−E25A変異型)で形質移入されたHEK−293懸濁細胞に対するTEAD結合と対比した、SDGF−配列番号1で形質移入されたHEK−293懸濁細胞に対するTEAD結合を示すフローサイトメトリープロットを示す。アラニンに変異した場合、配列番号1のE25位は、TEADへの結合の喪失をもたらした。図4Gは、配列番号6のペプチド(配列番号1の33位のメチオニンからアラニンへの変異型である配列番号1のSDGF−M33A変異型)で形質移入されたHEK−293懸濁細胞に対するTEAD結合と対比した、SDGF−配列番号1で形質移入されたHEK−293懸濁細胞に対するTEAD結合を示すフローサイトメトリープロットを示す。アラニンに変異した場合、配列番号2のM33位は、TEADへの結合の喪失をもたらした。図4Hは、配列番号5のペプチド(配列番号1の37位のロイシンからアラニンへの変異型である配列番号1のSDGF−L37A変異型)で形質移入されたHEK−293懸濁細胞に対するTEAD結合との対比で、SDGF−配列番号1で形質移入されたHEK−293懸濁細胞に対するTEAD結合を示すフローサイトメトリープロットを示す。アラニンに変異した場合、YAPのL68残基と類似した配列番号1のL37位は、TEADへの結合の喪失をもたらした。図4Iは、配列番号7のペプチド(配列番号1の38位のフェニルアラニンからアラニンへの変異型である配列番号1のSDGF−F38A変異型)で形質移入されたHEK−293懸濁細胞に対するTEAD結合と対比した、SDGF−配列番号1で形質移入されたHEK−293懸濁細胞に対するTEAD結合を示すフローサイトメトリープロットを示す。アラニンに変異した場合、YAPのF69残基と類似した配列番号1のF38位は、TEADへの結合の喪失をもたらした。図4Jは、配列番号184のペプチド(6個全てのシステインがセリンに変異している配列番号1の変異型である、配列列番号1のSDGF−6xCS型)で形質移入されたHEK−293懸濁細胞に対するTEAD結合と対比した、SDGF−配列番号1で形質移入されたHEK−293懸濁細胞に対するTEAD結合を示すフローサイトメトリープロットを示す。システインのセリンへの変異は、TEADへの結合の喪失をもたらした。
YAP−TEAD結合のペプチド妨害
この実施例は、本開示のペプチドによるYAP−TEAD結合の妨害を記載する。免疫共沈降により、配列番号1のペプチドをTEADへのYAP結合の妨害について評価した。HEK−293T懸濁細胞の2つの別々の集団にMyc−TEADまたはFLAG−YAPのいずれかを形質移入し、細胞を溶解した。Myc−TEAD溶解物を抗Myc樹脂と共にインキュベートしてTEAD結合樹脂を生成し、引き続いてこれをYAP溶解物および配列番号1または配列番号7のペプチドと共に30分間インキュベートした。ビーズを洗浄し、銀染色またはウエスタンブロットによって分析した。LX1X2LF(配列番号217)配列を含む配列番号1のペプチドは、TEADに結合する能力を実証し、その結果、YAPがTEADに結合しTEAD結合樹脂によって沈降することを妨げた。図6Aは、FLAG−YAPが配列番号1のペプチドの存在下でMyc−TEAD樹脂によって沈降しないが、配列番号7のペプチドの存在下でMyc−TEAD樹脂によって沈降したことを示す銀染色およびウエスタンブロットを示す。図6Bは、Myc−TEAD樹脂へのFLAG−YAP結合の用量依存的阻害を例証する、配列番号1のペプチドの希釈系列を示すウエスタンブロットを示す。図6Cは、図6Bからプロットされた定量化濃度測定データを示す。誤差棒は、1回の実験における1サンプル当たり4レーンのシグナルの定量化からの標準偏差を示す。TEADシグナルに対するYAPシグナル(図示せず)の4つのブロットレーンのそれぞれの比率を取ることにより、FLAG−YAPシグナルをMyc−TEADシグナルに対して正規化した。
ペプチドの部位飽和変異誘発
この実施例は、有益なまたは有害な変異を同定するための本開示のペプチドの部位飽和変異誘発(SSM)を例示する。部位飽和変異誘発を配列番号1のペプチドに対して実施した。保存され置換されていないシステイン残基を除いて、配列番号1の全ての可能な単一アミノ酸置換をクローニングした。配列番号1のペプチドは、34個の非システイン残基を有する(N末端「GS」は数えない)。所与の位置で可能な18個の非システイン置換残基を用いて、SSMライブラリーは、配列番号1の612個の全変異型を含み、ライブラリーは、配列番号1の非変異ペプチドも含む。SSMライブラリーのペプチドを発現する哺乳類細胞のTEAD結合は、実施例4および実施例5に記載されるように、しかし、より高ストリンジェンシーなプロトコルを用いて実施した。より高ストリンジェンシーなプロトコルは、より低濃度のTEAD(20nM)および最初のビオチン化TEAD染色と、それに続くAF647−ストレプトアビジン染色の2つの別々のステップでの染色とを含んだ。4回の選別後、変異型を発現するほぼ全ての細胞集団がTEADへの改善された結合を示した。図7は、TEADに対する結合活性が改善された配列番号1の変異型の部位飽和変異誘発スクリーニングの結果を示す。フローサイトメトリープロットは、x軸上のペプチドコンストラクト発現の蛍光(GFP)およびy軸上のTEAD(AF647)を示す。二重陽性細胞(右上の四分円)は、TEADに結合したペプチド発現細胞を示す。「SSM01」と標識されたパネルは、ペプチド変異型の全ライブラリーで形質導入された細胞を示す。図7Aは、配列番号1のペプチドのみを発現するHEK−293細胞を示すフローサイトメトリープロットを示す。図7Bは、ビオチン化TEADの非存在下でAF647−ストレプトアビジンのみと共にインキュベートされた、配列番号1のペプチドを発現するHEK−293細胞を示すフローサイトメトリープロットを示す。図7Cは、選別前にTEADと共にインキュベートされた、配列番号1の変異型のライブラリー(配列番号1および612変異型の元のペプチドを含有する部位飽和変異誘発「SSM01」ライブラリー)で形質導入されたHEK−293細胞を示すフローサイトメトリープロットを示す。図7Dは、1回の選別後にTEADと共にインキュベートされた、配列番号1の変異型のライブラリー(配列番号1および612の変異型の元のペプチドを含有する部位飽和変異誘発「SSM01」ライブラリー)で形質導入されたHEK−293細胞を示すフローサイトメトリープロットを示す。図7Eは、2回の選別後にTEADと共にインキュベートされた、配列番号1の変異型のライブラリー(配列番号1および612の変異型の元のペプチドを含有する部位飽和変異誘発「SSM01」ライブラリー)で形質導入されたHEK−293細胞を示すフローサイトメトリープロットを示す。図7Fは、2回の選別後、ビオチン化TEADの非存在下でAF647−ストレプトアビジンのみと共にインキュベートされた、配列番号1の変異型のライブラリー(配列番号1および612変異型の元のペプチドを含有する部位飽和変異誘発「SSM01」ライブラリー)で形質導入されたHEK−293細胞を示すフローサイトメトリープロットを示す。結果は、2回の選別後、二重陽性細胞(右上の四分区間)が濃縮されたことを示し、YAP−TEAD結合の阻害の増強を示唆する。図19は、TEADに対する結合活性が改善された配列番号1の変異型の部位飽和変異誘発スクリーニングの結果も示す。フローサイトメトリープロットは、x軸上のペプチドコンストラクト発現の蛍光(GFP)およびy軸上のTEAD(AF647)を示す。二重陽性細胞(右上の四分円)は、TEADに結合したペプチド発現細胞を示す。「SSM」と標識されたパネルは、ペプチド変異型の全ライブラリーで形質導入された細胞を示す。図19Aは、配列番号1のペプチドのみを発現するHEK−293細胞を示すフローサイトメトリープロットを示す。配列番号1の結合は、明らかであるが、20nMのTEAD濃度および2段階染色結合条件下で弱かった。図19Bは、選別前にTEADと共にインキュベートされた、配列番号1の変異型のライブラリー(配列番号1変異型の元のペプチドを含有する部位飽和変異誘発「SSM」ライブラリー)で形質導入されたHEK−293細胞を示すフローサイトメトリープロットを示す。図19Cは、1回の選別後にTEADと共にインキュベートされた、配列番号1の変異型ライブラリーで形質導入されたHEK−293細胞を示すフローサイトメトリープロットを示す。図19Dは、2回の選別後にTEADと共にインキュベートされた、配列番号1の変異型ライブラリーで形質導入されたHEK−293細胞を示すフローサイトメトリープロットを示す。図19Eは、2回の選別後、ビオチン化TEADの非存在下において、AF647−ストレプトアビジンのみと共にインキュベートされた、配列番号1の変異型のライブラリーで形質導入されたHEK−293細胞を示すフローサイトメトリープロットを示す。2回のスクリーニング終了後にTEAD結合ペプチドの分布を評価した。図8は、部位飽和(SSM)変異誘発スクリーニングにおいて生成された配列番号1の変異型の各位置における濃縮スコアおよびペプチドまたは変異型ペプチドとTEADとの間の結合界面の構造モデルを示す。図8Aは、SSMスクリーニングにおいて生成された配列番号1のペプチドの変異型のマトリックスを示す。x軸は、配列番号1のペプチドの配列を示し、y軸は、各位置で試験された各アミノ酸置換を示す(全て非システイン残基)。各単一点変異の濃縮度は、2回の選別後のマトリックス表に示される。濃縮スコア(入力量と対比した、2回の選別後の相対量のlog2変化)をグレースケールでかつ数値として示す。陽性または高い濃縮スコア(より薄い灰色)は、置換に対してより耐性のある残基に対応する。置換に対してより寛容な残基の例としては、配列番号1の15、23および40位に対応する残基が挙げられる。陰性またはより低い濃縮スコア(より濃い灰色)は、結合に重要である残基などの置換に対して耐性がより低い残基に対応する。
SSM生成変異型TEAD結合ペプチドのTEAD結合
この実施例は、実施例8で作製されたSSM生成変異型TEAD結合ペプチドのTEAD結合を記載する。SSMスクリーニングは、多数の有益な変異を生じさせ、その中から、本発明者らは、配列番号1のペプチドに対する、G15Q、Y23I、E25D、G28KおよびP40Wをはじめとする5つの特に有益な変異を選択した。これらの変異を有する配列番号1の変異型を作製し、上述した5つの変異のうちの3つが含まれる全ての組み合わせを含む10の三重変異体、上述した5つの変異のうちの4つが含まれる全ての組み合わせを含む5つの四重変異体および五重変異体を作製した。実施例4および実施例5に記載されるTEAD結合アッセイは、実施例8で使用されたのと同じストリンジェンシーで試験した。ビオチン化TEADとのインキュベーションと、AF647−ストレプトアビジンとのインキュベーションとの間に追加の洗浄ステップが導入されるTEAD結合アッセイについても記載した。追加の洗浄ステップによる結合の変化は、候補ペプチドのTEADへの結合の動態、特にkoff値について本発明者らに情報を与えた。
細胞表面提示YAPと対比したTEADへのペプチドの競合的結合
この実施例は、本開示のペプチドのTEADへの競合的結合または表面提示YAPへのTEAD結合の妨害について記載する。SDGF−YAPを発現するHEK−293懸濁細胞を最初に配列番号1または配列番号9のペプチドのいずれかと共にインキュベートした。次に、細胞培養物を図11に示すように5nMのビオチン化TEADで染色した。
還元条件におけるペプチドの安定性
この実施例は、還元条件下におけるペプチドの安定性を記載する。核内のTEADを標的化するペプチドは、細胞の細胞質ゾル区画内の還元条件に曝露される。したがって、本開示のペプチドが還元条件において安定性を示すことは有利である。本開示のペプチドの安定性を10mM DTTおよび10mM GSH中で試験した。GSHは、細胞内条件におけるペプチド安定性を試験するためのより生理学的に関連のある還元剤である。図12Bに示されるように、細胞の細胞質ゾル区画内の還元性環境をより良く代表する還元剤であるGSH下の還元条件に配列番号1および配列番号9のペプチドを曝露させた場合、いずれのペプチドも、HPLCによって観察されるように非還元ペプチドと比較して有意に移行したピークを示さなかったため、配列番号1および配列番号9は、GSH還元条件に対して耐性であった。図10Bに示されるように、10mM DTTなどのより強い還元条件では、配列番号9のペプチドは、DTT還元に対してある程度耐性であった。DTT還元条件における配列番号9のペプチドのインライン質量分析は、非還元ペプチドの約6Da以内の断片を明らかにし、したがって配列番号9のペプチドがDTTの還元に対してある程度耐性であることを実証した。
プロテアーゼに対するペプチド安定性
この実施例は、プロテアーゼに対する本開示のペプチドの安定性を例示する。腫瘍環境は、一般に大量のプロテアーゼを含有する。さらに、タンパク質分解(プロテアーゼによる分解または切断)に対する耐性は、ペプチドが分解され、次にMHCによって免疫系に提示される可能性を減少させる。さらに、タンパク質分解に対する耐性は、腫瘍への輸送に先立つ投与後における血清中のペプチド半減期を増加させ得る。したがって、本開示のペプチドがプロテアーゼによる分解に対して耐性であることは有利である。
ペプチド放射性標識
この実施例は、ペプチドの放射性標識を記載する。いくつかのペプチドを標準技術(Jentoft et al.J Biol Chem.254(11):4359−65.1979に記載のものなど)により、14Cホルムアルデヒドおよびシアノ水素化ホウ素ナトリウムを用いた還元的メチル化によって放射性標識した。配列は、N末端にアミノ酸「G」および「S」を有するように操作した。Methods in Enzymology V91:1983p.570およびJBC 254(11):1979 p.4359を参照されたい。過剰なホルムアルデヒドを使用して、完全なメチル化(全ての遊離アミンのジメチル化)を駆動した。標識されたペプチドは、Strata−Xカラム(Phenomenex 8B−S100−AAK)上での固相抽出によって単離し、5%メタノール添加水で洗浄して、2%ギ酸添加メタノール中に回収した。溶媒は、引き続いて穏やかな加熱および窒素ガス流を用いてブローダウン蒸発器内で除去した。
ペプチド検出可能薬剤コンジュゲート
この実施例は、ペプチドの色素標識を記載する。本開示のペプチドを組換え的に発現させるかまたは化学的に合成し、次にDCCまたはEDCを用いて、ペプチドのN末端を、NHSエステルを介して検出可能薬剤にコンジュゲート、連結または融合させ、ペプチド検出可能薬剤コンジュゲートを作製する。検出可能薬剤は、Cy5.5などのシアニン色素などのフルオロフォア色素またはAlexa647などのAlexaフルオロフォアである。
がんの治療
この実施例は、本開示のペプチドを使用したがんの治療を例示する。本開示のペプチドを組換え的に発現させるかまたは化学的に合成し、直接使用する。ペプチドを、それを必要とする対象にがんの治療薬として医薬組成物中で投与する。ペプチドを配列番号1〜配列番号84のペプチドのいずれか1つから選択する。ペプチドは、配列番号9であり得る。1つまたは複数のペプチドを対象に投与する。対象は、ヒトまたは動物であり得る。医薬組成物を、静脈内、皮下、筋肉内、経口的に投与するか、または腫瘍微小環境内に直接注射する。ペプチドは、TEADに結合し、引き続くYAPまたはTAZによる結合を排除することにより、YAP−TEAD相互作用およびTAZ−TEAD相互作用を妨害する。ペプチドは、結合YAPまたはTAZと競合することにより、YAP−TEADおよびTAZ−TEAD相互作用を妨害し、TEADからのYAPまたはTAZの解離およびTEADへのペプチド結合をもたらす。YAP−TEADおよびTAZ−TEAD相互作用を妨害する投与されたペプチドは、対象のがんの病状を治療する。がんの病状は、乳がん、肝臓がん、結腸がんまたは脳がんであり得る。
遺伝子治療修飾細胞によるペプチド送達
この実施例は、遺伝子治療修飾細胞によるペプチド送達を例示する。本開示のペプチドは、遺伝子治療修飾細胞によって媒介される送達により、腫瘍微小環境(例えば、免疫浸潤物またはがん性細胞)に向けられ得る。がん細胞に選択的に感染または標的化するウイルスベクターを含み、本開示のペプチドをコードする遺伝子を保有する遺伝子治療組成物を対象に投与して、がん細胞または腫瘍においてペプチドを選択的に発現させ得る。代わりに、本開示のペプチドを発現する細胞を、遺伝子治療を用いて生体外で修飾し、修飾細胞の対象への移植がそれに続く。対象は、ヒトまたは動物である。移植後、修飾細胞は、腫瘍微小環境またはがん細胞に移動して生体内でTEAD結合を妨害する。医薬組成物は、静脈内、皮下または経口投与される。
ペプチド結合相互作用の表面プラズモン共鳴(SPR)分析
この実施例は、ペプチド結合相互作用の表面プラズモン共鳴(SPR)分析を例示する。本開示の様々なペプチドをTEADへの結合親和性について分析した。簡潔に述べると、シリーズSSAチップを有するBiacore T100装置(GE Healthcare)上において、25℃で実施されたSPR実験によって結合親和性を分析した。0.1mg/mLのウシ血清アルブミン(BSA)を使用した実験における泳動用緩衝液としてHBS−EP+(10mMのHEPES、pH7.4、150mMのNaCl、3mMのEDTA、0.05%界面活性剤P2O)を使用した。ビオチン化TEADを2μg/mLの濃度および10μL/分の速度でフローセル上に注入し、SPRチップ上の約300共鳴単位(RU)に対応するTEADを捕捉した。参照表面は、モル当量のビオチン化ヒトトランスフェリン受容体外部ドメインを捕捉することによって作製した。定常状態に到達できたペプチドについては、ペプチドの連続2倍希釈物を、各ペプチドのKDを広くカバーする濃度範囲において上述の泳動用緩衝液中で調製した。複数の緩衝液空試験がその中に散在する二連のサンプルを2〜5分間の結合および2〜5分間の解離で50μL/分でランダムに注入した。SPRチップ上に緩衝液のみを流すことによって再生を達成した。二重参照データは、BIAevaluation 2.0.4ソフトウェア(GE Healthcare)を使用して、1:1の親和性または動態結合モデルのいずれかに適合させた。2つのペプチドサンプル(配列番号9および配列番号10)を、T100 Control2.0.4ソフトウェアの単一サイクル動態プロトコルを用いて泳動した。配列番号9および配列番号10のペプチドの連続3倍希釈液(3.6nM〜0.044nM)を泳動用緩衝液中で調製し、7分間の注射時間および15分間の解離時間を伴って濃度順に50μL/分の速度で注射した。参照のための2回の緩衝液のみの空試験サイクルをペプチド注射に先立って実施し、1回の緩衝液のみの空試験サイクルがそれに続いて、これは、次のペプチドの注射に先立って完全なペプチド解離のための時間を与えた。二重参照データは、BIAevaluation 2.0.4ソフトウェア(GE Healthcare)を使用して、単一サイクル動態についての1:1結合モデルに適合させた。表6は、捕捉されたビオチン化TEADへのペプチドの結合を評価するためのSPR法の条件を例示する。
細胞浸透性ペプチド融合物
この実施例は、細胞浸透性ペプチド融合物を記載する。本開示のTEAD結合ペプチドを細胞浸透性ペプチド部分への融合物として組換え的に発現させる。TEAD結合ペプチドを配列番号1〜配列番号84のペプチドのいずれか1つから選択する。細胞浸透性ペプチド部分は、N末端にコンジュゲート、連結または融合されたRRRRRRRR(配列番号146)配列などの1つまたは複数のArg残基であり、または本開示の任意のTEAD結合ペプチドのN末端にコンジュゲート、連結または融合された配列YGRKKRRQRRR(配列番号195)を有するTatペプチドである。代わりに、細胞浸透性ペプチド部分は、本開示の任意のTEAD結合ペプチドのN末端に融合しているマウロカリン、インペラトキシン、ハドルカルシン、ヘミカルシン、オプリカリン−1、オピカルシン−2、ミッドカイン(62−104)、MCoTI−IIまたはクロロトキシンから選択される。代わりに、細胞浸透性ペプチド部分は、本開示の任意のTEAD結合ペプチドのN末端に融合しているTAT(配列番号143)、CysTAT(配列番号144)、S19−TAT(配列番号145)、R8(配列番号146)、pAntp(配列番号147)、Pas−TAT(配列番号148)、Pas−R8(配列番号149)、Pas−FHV(配列番号150)、Pas−pAntP(配列番号151)、F2R4(配列番号152)、B55(配列番号153)、アズリン(配列番号154)、IMT−P8(配列番号155)、BR2(配列番号156)、OMOTAG1(配列番号157)、OMOTAG2(配列番号158)、pVEC(配列番号159)、SynB3(配列番号160)、DPV1047(配列番号161)、C105Y(配列番号162)、トランスポータン(配列番号163)、MTS(配列番号164)、hLF(配列番号165)、PFVYLI(配列番号166)またはyBBR(配列番号167)から選択される。代わりに、細胞浸透性ペプチド部分は、リンカーによって本開示の任意のTEAD結合ペプチドのN末端に融合している。リンカーは、GGGSGGGSGGGS(配列番号210)、KKYKPYVPVTTN(配列番号211)(DkTx由来のリンカー)もしくはEPKSSDKTHT(配列番号212)(ヒトIgG3由来のリンカー)または配列番号203〜配列番号212の任意のリンカーあるいは任意の他のリンカーから選択される。代わりに、TEAD結合ペプチド、細胞浸透性ペプチド部分および任意選択的にリンカーは、別の手段によって結合される。例えば、他の手段としては、任意の位置における化学的コンジュゲーション、細胞浸透性ペプチド部分および/またはリンカーのTEAD結合ペプチドC末端への融合、リポソームとの共製剤化または他の方法が挙げられるが、これに限定されるものではない。
核局在化を促進するためのペプチド融合物
この実施例は、核局在化を促進するペプチド融合物を記載する。本開示のTEAD−結合ペプチドを組換え的に発現させるかまたは化学的に合成する。ペプチドを配列番号1〜配列番号84のペプチドのいずれか1つから選択する。TEAD結合ペプチドは、四残基配列K−K/R−X−K/R(配列番号202)などの核局在化シグナルにコンジュゲート、連結、融合される(式中、Xは、任意のアミノ酸またはその変異型であり得る)(Lange et al,J Biol Chem.2007 Feb 23;282(8):5101−5)。ペプチド融合物を、それを必要とする対象に投与する。対象は、ヒトまたは動物であり、がんまたは糖尿病(I型またはII型)などの疾患を有する。投与に際して、ペプチド融合物は、核に移動し、そこで、それらは、YAPとTEADとの結合を効率的に妨げる。
ペプチドの細胞質ゾル送達の促進
この実施例は、ペプチドの細胞質ゾル送達または細胞浸透の促進を記載する。本開示のTEAD−結合ペプチドを組換え的に発現させるかまたは化学的に合成する。ペプチドを配列番号1〜配列番号84のペプチドのいずれか1つから選択する。TEAD結合ペプチドは、dfTATにコンジュゲート、連結または融合され、かつ/またはdfTATと同時送達される。四残基配列K−K/R−X−K/R(配列番号202)などの核局在化シグナル(式中、Xは、任意のアミノ酸またはその変異型であり得る)(Lange et al,J Biol Chem.2007 Feb 23;282(8):5101−5)は、TEAD結合ペプチドにさらにコンジュゲート、結合または融合され得る。ペプチド融合物を、それを必要とする対象に投与する。対象は、ヒトまたは動物であり、がんまたは糖尿病(I型またはII型)などの疾患を有する。投与に際して、ペプチド融合物は、細胞質ゾル中で発現され、細胞質ゾルおよび核内のTEADと相互作用して、YAPまたはTAZなどの転写活性化補助因子へのTEAD結合を妨害する。
がんの併用治療
この実施例は、本開示のペプチドを使用したがんの併用療法を例示する。本開示のペプチドを組換え的に発現させるかまたは化学的に合成し、直接使用する。ペプチドを、それを必要とする対象にがんの治療薬として医薬組成物中で投与する。ペプチドを配列番号1〜配列番号84のペプチドのいずれか1つから選択する。特に、シスプラチン、メトトレキサート、ドセタキセルおよびエトポシドなどの標準的な小分子または化学療法の治療レジメンと共に1つまたは複数のペプチドを対象に投与する。対象は、ヒトまたは動物である。医薬組成物を静脈内、皮下、筋肉内、経口的に投与し、または腫瘍微小環境内に直接注射する。ペプチドは、TEADに結合し、引き続くYAPによる結合を排除することによってYAP−TEAD相互作用を妨害する。標準的な小分子療法によって投与されたペプチドは、対象のがんの病状を治療する。がんの病状は、乳がん、肝臓がん、結腸がんまたは脳がんであり得る。
患者のがんの分析およびペプチドによる治療
この実施例は、患者のがんの分析およびペプチドによる治療を例示する。それを必要とする対象から生検を採取し、YAP過剰発現をもたらす変異などのYAP/TAZ−TEAD経路における変異について分析する。本開示のペプチドを組換え的に発現させるかまたは化学的に合成し、直接使用する。ペプチドを、それを必要とする対象にがんの治療薬として医薬組成物中で投与する。ペプチドを配列番号1〜配列番号84のペプチドのいずれか1つから選択する。1つまたは複数のペプチドを対象に投与する。対象は、ヒトである。医薬組成物を静脈内、皮下、筋肉内、経口的に投与し、または腫瘍微小環境内に直接注射する。ペプチドは、TEADに結合し、引き続くYAPまたはTAZによる結合を排除することによってYAP/TAZ−TEAD相互作用を妨害する。がんの病状は、乳がん、肝臓がん、結腸がんまたは脳がんであり得る。
結合親和性を改善させるペプチドの変異
この実施例は、オフ速度を減少させかつ/またはオン速度を増加させるペプチドの変異を例示する。本開示のペプチドは、部位飽和変異誘発(SSM)または任意のランダム変異誘発方法を用いて、オフ速度を減少させかつ/またはオン速度を増加させ、それによって結合親和性を増加または改善させる。ペプチドを配列番号1〜配列番号84のペプチドのいずれか1つから選択する。代わりに、配列番号1〜配列番号84の任意の1つのペプチドを変異させるかまたはグラフトし、LX1X2LF(配列番号217)配列またはモチーフを含むようにしてTEADに対する結合/拮抗活性を改善する。LX1X2LF(配列番号217)は、TEADに対する結合/拮抗活性を改善できるようにする配列に沿った任意の位置においてペプチド上で変異させるかまたはそれにグラフトする。
ペプチドライブラリーのコンピュータによる設計
この実施例は、TEADに結合する3つのジスルフィド架橋を有するスキャフォールドペプチドのペプチドライブラリーのコンピュータによる設計のための方法を例示する。最初の候補は、特定のペプチド特性を検索することによるかまたはペプチド設計を通じてのいずれかで同定した。Rosettaソフトウェアパッケージをペプチド設計に使用して、新生スキャフォールド構造を同定し、3つのジスルフィド架橋を有する候補スキャフォールドペプチドは、結合機能性を考慮せずに折り畳みおよび安定性についてのみ最適化し、新規の折り畳み設計によって構築した。スキャフォールド構築に使用された入力トポロジーパラメータは以下の通りであった:最小および最大配列長:それぞれ30および41残基;二次構造型:らせん、らせん、らせん;二次構造の長さ範囲:6〜18残基;ターン長:2〜4残基;ジスルフィドの数:3;ジスルフィドトポロジー:H1−H2、H1−H3およびH2−H3。数十万の独立した設計シミュレーションを実施して、候補スキャフォールドの大規模なライブラリーを構築し、次にそれを配列−構造適合性、充填、極性基の満足度およびジスルフィドスコアによってフィルタリングした。各設計シミュレーションの開始時、対応する長さの範囲から、らせんおよびターン長さをランダムにサンプリングして設計の二次構造を固定し、次にそれを使用して、低解像度断片アセンブリーシミュレーションの主鎖断片を選択した。低解像度シミュレーションの終了時、タンパク質のジスルフィド結合に由来するN−Cα−C主鎖変換のライブラリーを使用して、ジスルフィド結合によって連結され得る残基ペアについてタンパク質主鎖をスキャンした。ジスルフィドトポロジー制約を満たす、一致残基対を有する主鎖を使用して、2サイクルの交互固定主鎖配列設計および固定配列構造緩和からなる全原子配列設計シミュレーションを開始した。最終設計は、充填(sasapackスコア<0.5)、埋没極性基の満足度(1.0Aのプローブ半径を使用)についてフィルタリングし、1残基当たりのエネルギーによって分類した。フィルタリングされた設計の上位10%を、コンピュータを用いた再折り畳み検定によって配列−構造適合性について評価し、設計配列を使用して3000の独立した構造予測シミュレーションを開始した。成功は、設計モデルの2ÅCα−RMSD内で低エネルギー構造予測モデルの割合を評価することによって評価した。次に、新規スキャフォールド構造によって同定される有望なペプチドならびに長さ30〜50残基のタンパク質データバンク(PDB)からの75の天然ノッチン構造を、TEAD上のYAPフットプリントを標的化する界面設計のためのスキャフォールドとして使用した。第2段階におけるスキャフォールド配列の再設計は、コアアミノ酸およびジスルフィド形成残基を保存する一方、界面側鎖を標的化した。さらにYAP−TEAD複合体(PDB ID 3KYS)の結晶構造を調べ、TEAD上の結合パッチを同定した。TEADへの結合を保持するために、YAP上の対応する主鎖要素を観察して選択し、各有望なペプチドの界面設計のための鋳型としての役割を果たすようにした。より具体的には、以下の主鎖残基セグメントを、設計スキャフォールドを方向付けるための重ね合わせ標的として選択した:3KYS/B/53−55、3KYS/B/55−57、3KYS/B/64−68、3KYS/B/64−69、3KYS/B/86−89、3KYS/B/94−96(PDB ID/鎖/残基番号として与えられる)。各ペプチドスキャフォールドについて、重ね合わせのために選択された各YAP主鎖セグメントを標的化し、150の設計シミュレーションを実施した。各設計シミュレーションは、以下のステップで構成された:(1)適合する二次構造を有するスキャフォールド主鎖要素を使用して、スキャフォールド主鎖をYAP主鎖セグメントに重ね合わせるステップ、(2)多様性をもたらし、主鎖の衝突を軽減するためのランダムな小さい撹乱ステップ、および(3)固定主鎖配列選択と固定配列構造緩和との間で交互する全原子配列設計ステップ。最終界面設計は、極性基の満足度(1.0Aのプローブ半径を使用)、界面の表面相補性(scスコア>0.5)および界面の品質(100Åの1つの埋没SASA当たりの予測結合エネルギー<−1.1)を満たすようにフィルタリングされ、結合エネルギーの予測値で選別された。トップスコアのデザインは、コンピュータによる再ドッキング試験によって評価され、再設計されたスキャフォールドペプチドがTEADから除去され、ランダムに向きを変えてTEADタンパク質構造上に再ドックされた。成功は、設計された界面コンフォメーションに近い最終状態に達した低エネルギー再ドッキングシミュレーションの割合として測定した。このプロセスは、TEADに結合する3つのジスルフィド架橋を有する潜在的な可溶性ペプチドとして配列番号1および配列番号2の両方を同定したが、配列番号1のみが単分散であり、安定していることが見いだされた。
ペプチドの細胞浸透度を改善する方法
この実施例は、ペプチドの細胞浸透度を改善する方法を例示する。その結合パートナーが細胞内に位置するペプチドは、その活性を発揮するために細胞に侵入/浸透する必要がある。
細胞浸透性ペプチドライブラリーのコンピュータによる設計
この実施例は、スキャフォールド細胞浸透性ペプチドのペプチドライブラリーのコンピュータによる設計方法を例示する。最初の候補は、特定のペプチド特性(細胞浸透性など)について検索することによるかまたはペプチド設計を通じてのいずれかで同定した。Rosettaソフトウェアパッケージをペプチド設計に使用して、新生スキャフォールド構造を同定し、候補細胞浸透性スキャフォールドペプチドは、結合機能性を考慮せずに折り畳みおよび安定性についてのみ最適化して、新規の折り畳み設計によって構築される。次に、新規のスキャフォールド構築によって同定された有望なペプチドならびに長さ30〜50残基の既知の細胞浸透性ペプチドを、TEAD上の配列番号9のフットプリントを標的化する界面設計のためのスキャフォールドとして使用する。スキャフォールドペプチド再設計配列の界面側鎖を第2段階において標的化し、コアアミノ酸およびジスルフィド形成残基を保存する。さらに、配列番号9−TEAD複合体の結晶構造を調べ、TEAD上の結合パッチを同定する。配列番号9上の対応する主鎖要素を観察して選択し、TEADへの結合を保持するためにペプチドの界面設計のための鋳型としての役割を果たすようにした。これから、特定の主鎖残基セグメントを、設計スキャフォールドを方向付けるための重ね合わせ標的として選択した。各ペプチドスキャフォールドについて、重ね合わせのために選択された各配列番号9の主鎖セグメントを標的化して複数の設計シミュレーションを実施する。各設計シミュレーションでは、以下のステップに従う:(1)一致する二次構造を有する主鎖要素を使用して、スキャフォールド主鎖を配列番号9の主鎖セグメントに重ね合わせるステップ、(2)多様性をもたらし、主鎖の衝突を軽減するためのランダムな小さい撹乱ステップ、および(3)固定主鎖配列選択と固定配列構造緩和との間で交互する全原子配列設計ステップ。最終界面設計を、極性基の満足度(1.0Aのプローブ半径を使用)、界面の表面相補性(scスコア>0.5)および界面の品質(100Åの1つの埋没SASA当たりの予測結合エネルギー<−1.1)を満たすようにフィルタリングして、結合エネルギーの予測値で選別する。トップスコアのデザインをコンピュータによる再ドッキング試験によって評価し、再設計されたスキャフォールドペプチドをTEADから除去し、ランダムに向きを変えてTEADタンパク質構造上に再ドックした。成功は、設計された界面コンフォメーションに近い最終状態に達した低エネルギー再ドッキングシミュレーションの割合として測定する。TEADに結合する細胞浸透性ペプチドが同定されている。
高温におけるペプチド安定性
この実施例は、本開示のペプチドが極度の熱において安定していることを示す。タンパク質二次構造を、円二色性(CD)を用いて評価した。CDスペクトルを、1.0mmの光路長セルを使用してJasco J−720W分光偏光計で測定した。10mMリン酸緩衝液(pH=7.4)中のタンパク質サンプルは、25〜30μMのタンパク質濃度であった。サンプルを260〜190nMの波長範囲で分析した。データは、相対楕円率[θ];(mdeg)で表した。タンパク質の熱安定性を判定するために、タンパク質は、2℃/分の勾配で20℃から95℃に温度を徐々に上昇させた。安定性およびタンパク質アンフォールディングは、αらせんおよびβシート二次構造についてそれぞれ220および215でモニターした。データをmdegで報告される相対楕円率[θ]で表す。配列番号9およびその点変異体変異型について、95℃に至るまで加熱してもαらせん優勢構造の変化は観察されなかった。図20Aは、配列番号9のCDスペクトルが、構造がαヘリックス要素によって占められていることを実証したこと、ならびにこの二次構造シグネチャが95℃でのインキュベーション前(Pre)および後(Post)に同一であることを示す。挿入図は、20℃から95℃への加熱間における220nmでの相対楕円率を示す。図20Bは、配列番号10の円二色性スペクトルが、構造がαヘリックス要素によって占められていることを実証したこと、ならびにこの二次構造シグネチャが95℃でのインキュベーション前(Pre)および後(Post)で同一であったことを示す。挿入図は、20℃から95℃への加熱間における220nmでの相対楕円率を示す。図20Cは、配列番号11の円二色性スペクトルが、構造がαヘリックス要素によって占められていることを実証したこと、ならびにこの二次構造シグネチャが95℃でのインキュベーション前(Pre)および後(Post)で同一であったことを示す。この場合にも、挿入図は、20℃から95℃への加熱間における220nmでの相対楕円率を示す。さらに、SYPRO Orange色素(Molecular Probes)を使用して、タンパク質のアンフォールディングをモニターすることにより、タンパク質融解温度(Tm)の判定を実施した。手短に述べると、全容積20μLのPBS緩衝液中の0.1mg/mLタンパク質サンプルを2μLの10×SYPRO Orange色素と混合した。タンパク質アンフォールディングに続く疎水性タンパク質コアへの色素のインターカレーションを、CFX96深型ウェルリアルタイムシステム(BioRad)を備えたC1000 Touchサーマルサイクラーを用いてアッセイした。サンプルを毎分0.5℃ずつ段階的に増加させながら20℃から95℃に加熱し、各点で5秒間保持して、蛍光読み取りがそれに続いた。Tmは、相対発光単位(RFU)の導関数を分析することによって計算した。図20Dは、ペプチドのこのSYPRO Orange融解アッセイを示す。ヒトシデロカリン(HuScn)は、そのRFUのピーク対温度勾配によって解釈されるように、79℃の予想融解温度を実証した。逆に、試験された3つのペプチド(配列番号9、配列番号10および配列番号11)では、融解温度が判定され得なかった。このようにして、SYPRO Orange熱移動アッセイは、タンパク質アンフォールディングの証拠を示さず、したがって、配列番号9およびその点変異型は、高温で安定であることが示された。
細胞浸透性を促進するペプチドコンジュゲート
この実施例は、ペプチドの細胞浸透性を促進するペプチドコンジュゲートを記載する。本開示のTEAD−結合ペプチドを組換え的に発現させるかまたは化学的に合成する。ペプチドを配列番号1〜配列番号84のペプチドのいずれか1つから選択する。TEAD結合ペプチドは、マウロカリン(配列番号168)、インペラトキシン(配列番号169)、ハドルカルシン(配列番号170)、ヘミカルシン(配列番号171)、オピリカリン−1(配列番号172)、オピカルシン−2(配列番号173)、ミッドカイン(62−104)(配列番号174)、MCoTI−II(配列番号175)、クロロトキシン(配列番号176)、DRI−TAT31(rrrqrrkkrgy;式中、小文字表記は、D−アミノ酸を示す;配列番号280)、環状ヘプタペプチドシクロ(cFΦR4)(FΦRRRRQ;式中、Φは、1−2−ナフチルアラニンであり、部分全体が環化され、Glnは、コンジュゲーションハンドルの役割を果たし、Lys(アミンカップリング用)またはCys(スルフヒドリルカップリング用)などの他の官能基で置換され得る;配列番号281)またはミリステートにコンジュゲートされる。場合により、ペプチドは、リンカーによって細胞浸透性部分に連結され、アミンカップリングが使用されて、リンカー/官能基を本開示のTEAD結合ペプチド上のアミンに結合させる。本開示のTEAD結合ペプチドのいずれかまたは全てのLys残基は、化学的コンジュゲーションを均質化し、かつ/または細胞浸透性を増強するためにArgに変異され得る。
ペプチド血清半減期の延長
この実施例は、本明細書で開示されるようなペプチドの血清半減期を延長する方法を示す。その血清半減期を増加させるために、配列番号1〜配列番号142および配列番号222〜配列番号279のいずれか1つのペプチドを修飾する。Cy5.5などの近赤外色素へのペプチドのコンジュゲーションを使用して、ペプチドコンジュゲートの血清半減期を延長する。代わりに、Albuタグなどのアルブミンバインダーへのペプチドのコンジュゲーションを使用して、血清半減期を延長する。任意選択的に、最小の非ヒトタンパク質配列を使用することによって免疫原性が低下した結果として、血清半減期が延長される。
CPP融合物およびタンデムCDPの小規模および大規模生産
この実施例は、TEAD結合細胞浸透性ペプチド融合物(CPP融合物)およびタンデムシステイン高密度ペプチド(タンデムCDP)の小規模および大規模生産を記載する。CPP融合物およびタンデムCDPを、シデロカリンタグ付きタンパク質の分泌を駆動するレンチウイルスベクターであるDaedalusベクターにクローニングした。このベクターによって産生されるシデロカリンは、6×Hisタグ付き(配列番号284)であり、TEV切断部位を有するリンカーを含み、切断後にペプチドのN末端に「GS」のみを残す。クローニングされたベクター配列を、サンガー配列決定法(Genewiz)を用いて検証し、検証されたベクターを小規模で(96ウェル深型ウェルブロック内の1mL)または大規模で(400mL)で精製した。次に、VSV−G偽型レンチウイルスを標準的な方法で作製した。懸濁293F細胞をVSV−G偽型レンチウイルスで形質導入し、FreeStyle(ThermoFisher)発現培地中で培養した。小規模生産では、次に、1×106個の細胞を、100μLのウイルス上清を含む1mL中に形質導入し、収集まで(約7日間)1,000rpmで振盪した。5日後に3mMのバルプロ酸を添加した。大規模生産では、1mLのウイルス上清を含む10mLのVSV−G偽型レンチウイルスで1x107個の細胞を形質導入し(標的感染多重度は約10であった)、その後、培養物(125rpmで振盪された)を8〜10日間かけて400mLの最終容積に拡大した。細胞をペレット化し、残骸を0.22μmで濾過した後、CPP融合物およびタンデムCDPを培地から収集し、ニッケル樹脂精製およびTEVプロテアーゼ切断がそれに続いた。大規模生産では、追加的なSEC精製を実施し、205、214および280nmの波長でモニターした。小規模生産と大規模生産との両方で品質管理をSDS−PAGEによって実施し、クマシー染色がそれに続いた。タンパク質濃度は、214または280nmでのUVスペクトル吸収によって判定した。
クロロアルカン浸透アッセイ(CAPA)を用いた細胞浸透ペプチドの判定
この実施例は、配列番号124のタンデムCDPの細胞浸透性および細胞質ゾルアクセスを判定するためのクロロアルカン浸透アッセイ(CAPA)の使用を示す。
Claims (151)
- TEADに結合できる天然に存在しない、合成のもしくは操作されたペプチドまたはその変異型、相同体もしくは類似体を含む組成物。
- 前記ペプチドは、TEADに結合し、かつTEAD相互作用を妨害する、請求項1に記載の組成物。
- 前記TEAD相互作用は、TAZ、YAPまたはそれらの任意の組み合わせとのTEAD相互作用を含む、請求項1または2に記載の組成物。
- 前記ペプチドは、HIPPOシグナル伝達経路の1つまたは複数の構成要素を妨害または阻害する、請求項1〜3のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ペプチドは、HIPPOシグナル伝達経路の1つまたは複数の構成要素を調節する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ペプチドは、HIPPOシグナル伝達経路において発がん遺伝子を抑制する、請求項1〜5のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ペプチドは、YAPペプチド由来の1〜10個の連続したアミノ酸を含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記1〜10個の連続したアミノ酸は、PDB 3KYSのB鎖のアミノ酸残基:53〜55、55〜57、64〜68、64〜69、86〜89または94〜96の1つまたは複数から選択される、請求項1〜7のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記1〜10個の連続したアミノ酸は、3つのジスルフィド架橋剤を含むペプチド上にグラフトされる、請求項7に記載の組成物。
- 3つのジスルフィド架橋剤を含む前記ペプチドは、ノッチンである、請求項9に記載の組成物。
- 前記1〜10個の連続したアミノ酸は、細胞浸透性ペプチド上にグラフトされる、請求項7〜10のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記細胞浸透性ペプチドは、マウロカルシン、インペラトキシン、ハドルカルシン、ヘミカルシン、オピカルシン−1、オピカルシン−2、ミッドカイン(62−104)、MCoTI−IIまたはクロロトキシンである、請求項10または11に記載の組成物。
- 前記細胞浸透性ペプチドは、配列番号168〜配列番号176のいずれか1つと少なくとも60%、70%、80%、90%、95%または100%の配列同一性を含む、請求項10〜12のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ペプチドは、配列番号1〜配列番号42のいずれか1つの配列またはその変異型もしくは断片を含む、請求項1〜13のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ペプチドは、配列番号1〜配列番号42のいずれか1つと少なくとも80%の配列同一性を有する配列またはその変異型もしくは断片を含む、請求項1〜14のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ペプチドは、配列番号1〜配列番号42のいずれか1つと少なくとも85%、少なくとも90%もしくは少なくとも95%の配列同一性を有する配列またはその変異型もしくは断片を含む、請求項1〜15のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ペプチドは、配列番号43〜配列番号84のいずれか1つの配列またはその変異型もしくは断片を含む、請求項1〜13のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ペプチドは、配列番号43〜配列番号84のいずれか1つと少なくとも80%の配列同一性を有する配列またはその変異型もしくは断片を含む、請求項1〜13または17のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ペプチドは、配列番号43〜84のいずれか1つと少なくとも85%、少なくとも90%もしくは少なくとも95%の配列同一性を有する配列またはその変異型もしくは断片を含む、請求項1〜13または17もしくは18のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ペプチドは、ノットペプチドであるか、またはノットペプチドに由来する、請求項1〜19のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ペプチドは、TEADへの結合についてYAPまたはTAZと競合する、請求項1〜20のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ペプチドは、TEADを隔離するか、または別のタンパク質がTEADに結合することを妨げる、請求項1〜21のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ペプチドは、YAPまたはTAZのものと比較して等しいかまたはより大きいTEADに対する親和性または特異性を有する、請求項1〜22のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ペプチドは、YAPまたはTAZのものと比較して等しいかまたはより低いTEADに対する解離定数を有する、請求項1〜23のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ペプチドは、40nM未満、30nM未満、20nM未満、10nM未満、1nM未満または0.1nM未満のKDを有する、請求項1〜24のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ペプチドは、標的細胞に浸透または局在化する、請求項1〜25のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ペプチドは、細胞浸透性部分との配合、それへの融合またはそれへのコンジュゲーションによって標的細胞に浸透または局在化する、請求項1〜26のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記細胞浸透性部分は、ポリカチオン、ポリ有機酸、エンドソーム放出ポリマー、ポリ(2−プロピルアクリル酸)、ポリ(2−エチルアクリル酸)、Tatペプチド、Argパッチ、ノットペプチド、CysTAT、S19−TAT、R8(配列番号146)、pAntp、Pas−TAT、Pas−R8(配列番号149)、Pas−FHV、Pas−pAntP、F2R4(配列番号152)、B55、オーリン、IMT−P8、BR2、OMOTAG1、OMOTAG2、pVEC、SynB3、DPV1047、C105Y、トランスポータン、MTS、hLF、PFVYLI(配列番号166)、マウロカルシン、インペラトキシン、ハドルカリン、ヘミカルシン、オピカルシン−1、オピカルシン−2、ミッドキン(62−104)、MCoTI−II、クロロトキシン、DRI−TAT、cFΦR4(配列番号281)、ミリステート、yBBRまたはその断片もしくは変異型あるいはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項27に記載の組成物。
- 前記細胞浸透性部分は、配列番号143〜配列番号176のいずれかの配列と少なくとも80%、90%、95%、98%または100%の配列同一性を含む、請求項27または28に記載の組成物。
- 前記細胞浸透性部分へのペプチド融合物は、配列番号85〜配列番号142または配列番号222〜配列番号279と少なくとも80%、90%、95%、98%または100%の配列同一性を含む、請求項27〜29のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ペプチドは、標的細胞の核内に局在化し得る、請求項1〜30のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ペプチドは、核局在化シグナルペプチドまたは部分との配合、それへの融合またはそれへのコンジュゲーションによって前記標的細胞の核内に局在化する、請求項31に記載の組成物。
- 前記ペプチドは、がん細胞を標的化するか、それにホーミングするか、またはそれに選択的に浸透する部分または第2のペプチドにさらにコンジュゲート、連結または融合される、請求項1〜32のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記部分または第2のペプチドは、ノットペプチドまたはその変異型もしくは断片である、請求項1〜33のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ノットペプチドは、血液脳関門を越えて前記ペプチドを標的化するかまたはそれにホーミングする、請求項34に記載の組成物。
- 前記ペプチドは、TEAD不活性化または分解を標的化する部分にコンジュゲート、連結または融合される、請求項1〜35のいずれか一項に記載の組成物。
- TEADの不活性化または分解を標的化する前記部分は、TEADの翻訳後修飾をもたらす、請求項36に記載の組成物。
- TEADの前記翻訳後修飾は、ユビキチン化を含む、請求項37に記載の組成物。
- 前記標的細胞は、調節不全のHIPPO経路を有する細胞である、請求項26〜38のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記標的細胞は、無制御なまたは調節不全の細胞成長を有する細胞である、請求項26〜39のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記標的細胞は、がん性細胞または腫瘍細胞である、請求項26〜40のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記標的細胞は、膵臓細胞、肝細胞、結腸細胞、卵巣細胞、乳房細胞、肺細胞、脳細胞またはそれらの任意の組み合わせである、請求項26〜41のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ペプチドは、ジスルフィドノットを介してジスルフィドを含む、請求項1〜42のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ペプチドは、システイン残基間に形成された複数のジスルフィド架橋を含む、請求項1〜43のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ペプチドは、システイン残基間に形成された3つ以上のジスルフィド架橋を含み、前記ジスルフィド架橋の1つは、他の2つのジスルフィド架橋によって形成されたループを通過する、請求項1〜44のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ペプチドは、ジスルフィド結合またはジスルフィドノットを含まない、請求項1〜42のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ペプチドの少なくとも1つのアミノ酸残基は、L立体配置にあるか、または少なくとも1つのアミノ酸残基は、D立体配置にある、請求項1〜46のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ペプチドは、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19または少なくとも20個の正荷電残基を含む、請求項1〜47のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ペプチドは、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9または少なくとも10個の連続した正荷電残基を含む、請求項1〜48のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記正荷電残基は、Arg、Lysまたはそれらの任意の組み合わせである、請求項1〜49のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ペプチドは、Argパッチを含む、請求項1〜50のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ペプチドは、N末端に2つ以上の連続したArg残基を含む、請求項1〜51のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ペプチドは、Tatペプチドまたはその断片を含む、請求項1〜52のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記Tatペプチドは、YGRKKRRQRRR(配列番号195)、GRKKRRQRRR(配列番号143)の配列またはその断片もしくは変異型を含む、請求項53に記載の組成物。
- 前記Tatペプチドは、(GS)x(配列番号282)またはGxSy(配列番号283)(式中、xおよびyは、独立して、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10である)の配列を有するリンカーを使用して、前記ペプチドのN末端またはC末端に付加される、請求項53または54に記載の組成物。
- 前記Tatペプチドは、前記ペプチドの任意の残基に付加される、請求項53または54に記載の組成物。
- 前記Tatペプチドは、TEAD結合活性に干渉することなく前記ペプチドの任意の残基に付加される、請求項53または54に記載の組成物。
- 前記ペプチドは、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15または少なくとも16個のシステイン残基を含む、請求項1〜57のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ペプチドは、1、2、3、4、5または6つのCys残基を含む、請求項1〜58のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ペプチドは、LX1X2LF(配列番号217)(式中、X1およびX2は、任意のアミノ酸である)を含むか、またはそれを含むように変異されるか、またはそれを含むようにグラフトされる、請求項1〜59のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記LX1X2LF(配列番号217)配列中のX1およびX2は、EA、IC、EC、MC、VCまたはFCを含む、請求項60に記載の組成物。
- 前記ペプチドは、LX1X2LF(配列番号217)モチーフ(式中、X1およびX2は、任意のアミノ酸である)を含むか、またはそれを含むように変異されるか、またはそれを含むようにグラフトされる、請求項1〜61のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記LX1X2LF(配列番号217)モチーフ中のX1およびX2は、EA、IC、EC、MC、VCまたはFCを含む、請求項62に記載の組成物。
- 前記ペプチドは、L23、L26およびF27位に変異を含む、請求項1〜63のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ペプチドは、G15、Y23、E25、G28およびP40位に変異を含む、請求項1〜64のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ペプチドは、G15、Y23およびP40位に変異を含む、請求項1〜65のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ペプチドは、P40位に変異を含む、請求項1〜66のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ペプチドは、G15Q、Y23I、E25D、G28KおよびP40Wからなる群から選択される1つまたは複数の変異を含む、請求項1〜67のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ペプチドは、E25D、G28KおよびP40Wを含む、請求項1〜68のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ペプチドは、負荷電残基の1つまたは複数の領域を含む、請求項1〜69のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ペプチドは、正荷電残基の1つまたは複数の領域を含む、請求項1〜70のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ペプチド配列は、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、少なくとも25、少なくとも26、少なくとも27、少なくとも28、少なくとも29、少なくとも30、少なくとも31、少なくとも32、少なくとも33、少なくとも34、少なくとも35、少なくとも36、少なくとも37、少なくとも38、少なくとも39、少なくとも40、少なくとも41、少なくとも42、少なくとも43、少なくとも44、少なくとも45、少なくとも46、少なくとも47、少なくとも48、少なくとも49、少なくとも50、少なくとも51、少なくとも52、少なくとも53、少なくとも54、少なくとも55、少なくとも56、少なくとも57、少なくとも58個の残基、少なくとも59、少なくとも60、少なくとも61、少なくとも62、少なくとも63、少なくとも64、少なくとも65、少なくとも66、少なくとも67、少なくとも68、少なくとも69、少なくとも70、少なくとも71、少なくとも72、少なくとも73、少なくとも74、少なくとも75、少なくとも76、少なくとも77、少なくとも78、少なくとも79、少なくとも80または少なくとも81個の残基を含む、請求項1〜71のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ペプチドは、クロロトキシン、ブラゼイン、サーキュリン、ステクリスプ、ハナトキシン、ミッドカイン、ヘフトキシン、ジャガイモカルボキシペプチダーゼ阻害剤、気泡タンパク質、アトラクチン、α−GI、α−GID、μ−pIIIA、ω−MVIIA、ω−CVID、χ−MrIA、ρ−TIA、コナントキンG、コンツラキンG、GsMTx4、マルガトキシン、shK、毒素K、キモトリプシン阻害因子(CTI)、EGFエピレギュリンコア、ハイナントキシン、セラホトキシン、ヘキサトキシン、オピカルシン、インペラトキシン、デフェンシンおよびインセクトトキシンからなる群を含むかまたはそれに由来する、請求項1〜72のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ペプチドは、ヒトタンパク質またはペプチドを含むかまたはそれに由来する、請求項1〜73のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ペプチドは、少なくとも1つの他のペプチドを有する多量体構造に配置される、請求項1〜74のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記多量体構造は、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体または七量体を含む、請求項75に記載の組成物。
- 前記ペプチドは、約3.0〜約10.0の範囲内の等電点を含む、請求項1〜76のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ペプチドは、約4.5〜約8.9の範囲内の等電点を含む、請求項1〜77のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ペプチドは、不均一な電荷分布を含む、請求項1〜78のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ペプチドは、生理学的または細胞内pH価で安定している、請求項1〜79のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ペプチドは、約7または7.5のpHで安定している、請求項1〜79のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ペプチドは、約6.5〜7.5のpHで安定している、請求項1〜79のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ペプチドは、約5.0以下、約3.0以下または約3.0〜約5.0の範囲内のpH価で安定している、請求項1〜79のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ペプチドは、約5.0〜約7.0の範囲内のpH価で安定している、請求項1〜79のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ペプチドは、疎水性コアを含む、請求項1〜84のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ペプチドは、プロテアーゼ分解に対して耐性である、請求項1〜85のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記プロテアーゼは、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、血清プロテアーゼ、細胞内プロテアーゼまたはそれらの任意の組み合わせのいずれか1つである、請求項86に記載の組成物。
- 前記ペプチドは、還元に対して耐性であるか、または還元性環境において安定している、請求項1〜87のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記還元または還元性環境は、DTTまたはGSHを含む、請求項88に記載の組成物。
- 前記ペプチドは、高温で安定している、請求項1〜89のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ペプチドは、細胞膜に浸透できる、請求項1〜90のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ペプチドは、抗がん効果を示す、請求項1〜91のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ペプチドは、1つまたは複数の化学修飾を含む、請求項1〜92のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記化学修飾は、前記ペプチドの半減期を延長するかまたはその薬物動態を修飾する、請求項93に記載の組成物。
- 前記化学修飾は、前記ペプチドのN末端をブロックしている、請求項93〜95のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記化学修飾は、メチル化、アセチル化またはアシル化である、請求項93〜96のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記化学修飾は、
1つもしくは複数のリジン残基またはその類似体のメチル化、
N末端のメチル化、または
1つもしくは複数のリジン残基またはその類似体のメチル化およびN末端のメチル化
である、請求項93〜97のいずれか一項に記載の組成物。 - 前記ペプチドは、アシル付加物に連結される、請求項1〜97のいずれかー項に記載の組成物。
- 前記ペプチドは、活性薬剤にコンジュゲート、連結または融合される、請求項1〜98のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記活性薬剤は、前記ペプチドのN末端またはC末端で前記ペプチドにコンジュゲート、連結または融合される、請求項99に記載の組成物。
- 前記活性薬剤は、抗体、抗体断片、Fcまたは一本鎖Fvである、請求項99または100に記載の組成物。
- 前記ペプチドは、Fcドメインにコンジュゲートされるか、連結されるか、融合されるか、または埋め込まれる、請求項101に記載の組成物。
- 1、2、3、4、5、6、7、8、9または10個の活性薬剤は、前記ペプチドに連結される、請求項99〜102のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ペプチドは、切断可能リンカーまたはpH感受性リンカーを介して前記活性薬剤に連結される、請求項99〜103のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ペプチドは、リンカーにより、前記ペプチドのN末端、内部リジン残基のεアミン、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸残基のカルボン酸またはC末端で前記活性薬剤に連結される、請求項99〜104のいずれか一項に記載の組成物。
- 非天然アミノ酸をさらに含み、前記非天然アミノ酸は、挿入、付加または別のアミノ酸への置換である、請求項99〜105のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ペプチドは、リンカーにより、前記非天然アミノ酸で前記活性薬剤に連結される、請求項106に記載の組成物。
- 前記リンカーは、アミド結合、エステル結合、カルバメート結合、炭酸結合、ヒドラゾン結合、オキシム結合、ジスルフィド結合、チオエステル結合、チオエーテル結合または炭素−窒素結合を含む、請求項105〜107のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記切断可能リンカーは、マトリックスメタロプロテイナーゼ、トロンビン、カテプシンまたはβ−グルクロニダーゼのための切断部位を含む、請求項105〜108のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記リンカーは、加水分解的に不安定なリンカーである、請求項105〜109のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ペプチドは、切断不能リンカーを介して前記活性薬剤に連結される、請求項107〜110のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記活性薬剤は、抗がん剤である、請求項97〜111のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記活性薬剤は、オーリスタチン、MMAE、メイタンシノイド、DM1、DM4、ドキソルビシン、カリケアマイシン、白金化合物、シスプラチン、タキサン、パクリタキセル、SN−38、BACE阻害剤、Bcl−xL阻害剤、WEHI−539、ベネトクラクス、ABT−199、ナビトクラクス、AT−101、オバトクラクス、ピロロベンゾジアゼピンもしくはピロロベンゾジアゼピン二量体またはドラスタチンである、請求項97〜112のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ペプチドに結合される半減期修飾剤をさらに含む、請求項1〜113のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記半減期修飾剤は、ポリマー、ポリエチレングリコール(PEG)、ヒドロキシエチルデンプン、ポリビニルアルコール、水溶性ポリマー、両性イオン性水溶性ポリマー、水溶性ポリ(アミノ酸)、プロリン、アラニンおよびセリンの水溶性ポリマー、グリシン、グルタミン酸およびセリンを含有する水溶性ポリマー、Fc領域、脂肪酸、パルミチン酸またはアルブミンに結合する分子を含む、請求項114に記載の組成物。
- 前記ペプチドに結合される検出可能薬剤をさらに含む、請求項1〜115のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記検出可能薬剤は、前記ペプチドのN末端またはC末端で前記ペプチドにコンジュゲート、連結または融合される、請求項116に記載の組成物。
- 1、2、3、4、5、6、7、8、9または10個の検出可能薬剤は、前記ペプチドに連結される、請求項116または117に記載の組成物。
- 前記ペプチドは、切断可能リンカーを介して前記検出可能薬剤に連結される、請求項116〜118のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ペプチドは、リンカーにより、前記ペプチドのN末端、内部リジン残基のεアミンまたはC末端で前記検出可能薬剤に連結される、請求項116〜119のいずれか一項に記載の組成物。
- 非天然アミノ酸をさらに含み、前記非天然アミノ酸は、挿入、付加または別のアミノ酸への置換である、請求項116〜120のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ペプチドは、リンカーにより、前記非天然アミノ酸で前記検出可能薬剤に連結される、請求項121に記載の組成物。
- 前記リンカーは、アミド結合、エステル結合、カルバメート結合、ヒドラゾン結合、オキシム結合または炭素−窒素結合を含む、請求項119〜122のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記切断可能リンカーは、マトリックスメタロプロテイナーゼ、トロンビン、カテプシンまたはβ−グルクロニダーゼのための切断部位を含む、請求項119〜123のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ペプチドは、切断不能リンカーを介して前記検出可能薬剤に連結される、請求項116〜118のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記検出可能薬剤は、フルオロフォア、近赤外線色素、造影剤、ナノ粒子、金属含有ナノ粒子、金属キレート、X線造影剤、PET薬剤、放射性同位体または放射性核種キレート剤である、請求項116〜125のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記検出可能薬剤は、蛍光色素である、請求項116〜126のいずれか一項に記載の組成物。
- 請求項1〜125のいずれか一項に記載の組成物またはその塩と、薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物。
- 対象への投与のために製剤化される、請求項128に記載の医薬組成物。
- 経口投与、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与またはそれらの組み合わせのために製剤化される、請求項128または129に記載の医薬組成物。
- 病状の治療を、それを必要とする対象において行う方法であって、
請求項1〜127のいずれか一項に記載の組成物または請求項128〜130のいずれか一項に記載の医薬組成物を前記対象に投与するステップ
を含む方法。 - 前記組成物は、吸入、鼻腔内、経口、局所、静脈内、皮下、筋肉内投与、腹腔内、腫瘍内またはそれらの組み合わせによって投与される、請求項131に記載の方法。
- 前記組成物は、ボーラス、注入または持続注入として静脈内投与される、請求項131または132に記載の方法。
- 前記組成物または医薬組成物は、TEADとのYAPの相互作用を妨害する、請求項131〜133のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組成物または医薬組成物は、YAPがTEADに結合することを妨げる、請求項131〜134のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組成物または医薬組成物は、TEADへの結合についてYAPと競合する、請求項131〜135のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組成物または医薬組成物は、TEADに結合する、請求項131〜136のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組成物または医薬組成物は、HIPPOシグナル伝達経路において発がん遺伝子を阻害する、請求項131〜137のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組成物または医薬組成物は、細胞によって内在化される、請求項131〜138のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組成物または医薬組成物は、標的細胞の細胞膜に浸透する、請求項131〜139のいずれか一項に記載の方法。
- 前記病状は、糖尿病である、請求項131〜140のいずれか一項に記載の方法。
- 前記病状は、がんまたは腫瘍である、請求項131〜141のいずれか一項に記載の方法。
- 前記がんは、膵臓がん、肝臓がん、結腸がん、卵巣がん、脳がんまたは肺がんである、請求項142に記載の方法。
- 前記がんは、前記HIPPO経路における変異に関連する、請求項142または143に記載の方法。
- 前記病状は、無制御な細胞成長または調節不全のHIPPO経路を含む、請求項142〜144のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組成物または前記医薬組成物は、1日に複数回、1日に2回、1日に1回、1週間に2回、1週間に3回、1週間に1回、2週間に1回または1ヶ月に1回もしくは3ヶ月に1回投与される、請求項131〜145のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組成物は、1日に1回、1週間に1回または1ヶ月に1回皮下投与される、請求項141〜146のいずれか一項に記載の方法。
- TEADに結合できるペプチドを設計する方法であって、
a)コンピュータプログラムを使用して、最適化された安定性および折り畳みを有するペプチドをペプチドのライブラリーから同定するステップであって、前記ペプチドのライブラリーの各ペプチドは、少なくとも3つのジスルフィド架橋剤を含む、ステップと、
b)コンピュータプログラムを使用してペプチド:TEAD複合体からの結合パッチのアミノ酸残基を重ね合わせて、前記結合パッチを前記ペプチド上にグラフトした後にTEADに結合する安定なペプチドを判定するステップと、
c)前記結合パッチを前記ペプチド上にグラフトして、前記安定なペプチドを製造するステップと
を含む方法。 - 部位飽和変異誘発を実施して、前記安定なペプチドよりも高いTEADに対する結合親和性を有する変異ペプチドを得るステップをさらに含む、請求項148に記載の方法。
- ペプチドのライブラリーからの前記ペプチドは、20〜55アミノ酸残基長である、請求項148または149に記載の方法。
- d)コンピュータプログラムを使用して、最適化された安定性および折り畳みを有するペプチドをペプチドのライブラリーから同定するステップであって、前記ペプチドのライブラリーの各ペプチドは、細胞浸透が可能である、ステップと、
e)コンピュータプログラムを使用して変異ペプチド:TEAD複合体からの結合パッチのアミノ酸残基を重ね合わせて、前記結合パッチを前記ペプチド上にグラフトした後にTEADに結合する新しいペプチドを判定するステップと、
f)前記結合パッチを前記変異ペプチド上にグラフトして、前記新しいペプチドを製造するステップと
を含む、細胞浸透が可能であるペプチドを設計するステップをさらに含む、請求項148〜150のいずれか一項に記載の方法。
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