ES2870991T3 - Proteínas inmunomoduladoras con afinidades ajustables - Google Patents

Abstract

Una proteína inmunomoduladora, que comprende al menos un dominio de la superfamilia de inmunoglobulinas (IgSF) CD80 con afinidad modificada que comprende una o más sustituciones de aminoácidos en un dominio de IgSF CD80 de tipo salvaje, en donde el al menos un dominio de de IgSF CD80 con afinidad modificada tiene una unión aumentada al menos a dos compañeros de unión afines en comparación con el dominio de IgSF CD80 de tipo salvaje, en donde el dominio de IgSF CD80 con afinidad modificada se une específicamente de manera no competitiva a los al menos dos compañeros de unión afines y los al menos dos compañeros de unión afines son CD28 y PD-L1 , y en donde el dominio de IgSF CD80 con afinidad modificada comprende al menos un 85 % de identidad de secuencia con un dominio de IgSF CD80 de tipo salvaje o un fragmento de unión específico del mismo contenido en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1.

Description

DESCRIPCIÓN

Proteínas inmunomoduladoras con afinidades ajustables

Campo

La presente invención se refiere a proteínas terapéuticas para modular la respuesta inmune en el tratamiento del cáncer y las enfermedades inmunológicas.

Antecedentes

La modulación de la respuesta inmune mediante la intervención en los procesos que ocurren en la sinapsis inmunológica (SI) formada por y entre células presentadoras de antígeno (APC) o células diana y linfocitos tiene un interés médico cada vez mayor. Actualmente, los productos biológicos utilizados para potenciar o suprimir la respuesta inmune se han limitado generalmente a inmunoglobulinas (p. ej., mAb anti-PD-1) o receptores solubles (p. ej., Fc-CTLA4). Los receptores solubles adolecen de una serie de deficiencias. Si bien son útiles para antagonizar las interacciones entre proteínas, los receptores solubles a menudo carecen de la capacidad de agonizar tales interacciones. Los anticuerpos han demostrado ser menos limitados a este respecto y se conocen en la técnica ejemplos de anticuerpos tanto agonistas como antagonistas. Sin embargo, tanto los receptores solubles como los anticuerpos carecen de atributos importantes que son críticos para funcionar en la SI. Desde el punto de vista del mecanismo, las proteínas de la superficie celular en la SI pueden implicar la interacción coordinada y, a menudo, simultánea de múltiples dianas proteicas con una sola proteína a la que se unen. Las interacciones S i ocurren en estrecha asociación con la unión de dos células, y una sola proteína en esta estructura puede interaccionar tanto con una proteína en la misma célula (cis) como con una proteína en la célula asociada (trans), probablemente al mismo tiempo. Por tanto, existe la necesidad de moléculas mejoradas para la modulación de las respuestas inmunes. Se proporcionan realizaciones que satisfacen tales necesidades.

Resumen

En la presente memoria se proporcionan proteínas inmunomoduladoras que exhiben afinidades de unión alteradas con parejas de unión que son ligandos proteicos inmunes implicados en las respuestas inmunológicas, como se define en las reivindicaciones adjuntas. En algunas realizaciones, las proteínas inmunomoduladoras proporcionadas pueden modular, tal como potenciar o amortiguar, la actividad del ligando proteico inmune, modulando así las respuestas inmunológicas. En algunas realizaciones, también se proporcionan proteínas inmunomoduladoras para su uso en métodos para modular respuestas inmunes poniendo en contacto células que expresan uno o más de los ligandos proteicos inmunes con la proteína inmunomoduladora proporcionada, por ejemplo, en el tratamiento inmunoterapéutico de enfermedades o afecciones que se pueden tratar modulando la respuesta inmune.

Según la invención reivindicada, en la presente memoria se proporciona una proteína inmunomoduladora, que comprende al menos un dominio no de inmunoglobulina de la superfamilia de las inmunoglobulinas (IgSF) modificado por afinidad que comprende una o más sustituciones de aminoácidos en un dominio IgSF de tipo salvaje, en donde: al menos un dominio de IgSF con afinidad modificada tiene una unión aumentada a al menos dos compañeros de unión afines en comparación con el dominio de IgSF de tipo salvaje; y el al menos un dominio de IgSF con afinidad modificada se une específicamente de forma no competitiva a los al menos dos compañeros de unión afines. En algunas realizaciones, los al menos dos compañeros de unión afines son especies moleculares de la superficie celular expresadas en la superficie de una célula de mamífero. En algunas realizaciones, las especies moleculares de la superficie celular se expresan en configuración cis o configuración trans. En algunas realizaciones, la célula de mamífero es una de las dos células de mamífero que forman una sinapsis inmunológica (SI) y cada una de las especies moleculares de la superficie celular se expresa en al menos una de las dos células de mamífero que forman la SI. En algunas realizaciones, al menos una de las células de mamífero es un linfocito. En algunas realizaciones, el linfocito es una célula NK o una célula T. En algunas realizaciones, la unión del dominio de IgSF con afinidad modificada modula la actividad inmunológica del linfocito.

En algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora es capaz de dar lugar a una actividad inmunológica incrementada en comparación con la proteína de tipo salvaje que comprende el dominio de IgSF de tipo salvaje. En algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora es capaz de dar lugar a una actividad inmunológica disminuida en comparación con la proteína de tipo salvaje que comprende el dominio de IgSF de tipo salvaje. En algunas realizaciones, al menos una de las células de mamífero es una célula tumoral. En algunas realizaciones, las células de mamífero son células humanas. En algunas realizaciones, el dominio de IgSF con afinidad modificada es capaz de unirse específicamente a las dos células de mamífero que forman la SI.

Según la invención reivindicada y según una cualquiera de las proteínas inmunomoduladoras descritas anteriormente, el dominio de IgSF de tipo salvaje es de un miembro de la familia de IgSF de una familia seleccionada de la familia de proteínas reguladoras de señales (SIRP), familia semejantes al receptor de activación expresado en células mieloides (TREML), familia de moléculas de adhesión celular relacionadas con antígenos carcinoembrionarios (CEACAM), familia de lectinas similares a Ig de unión a ácido siálico (SIGLEC), familia de butirofilinas, familia B7, familia CD28, familia que contiene dominios de conjunto V y de inmunoglobulina (VSIG), familia de dominios de conjunto V transmembrana (VSTM), familia de complejos mayores de histocompatibilidad (MHC), familia de moléculas de activación linfocítica de señalización (SLAM), receptor semejante a inmunoglobulina leucocitaria (LIR), familia de nectina (Nec), familia semejante a nectina (NECL), familia relacionada con el receptor de poliovirus (PVR), familia de receptores desencadenantes de citotoxicidad natural (NCR), familia de inmunoglobulina y mucina de células T (TIM) 0 familia de receptores semejantes a inmunoglobulina de células asesinas (KIR). Según la invención reivindicada, el dominio de IgSF de tipo salvaje es de un miembro de IgSF seleccionado de CD80. En algunas realizaciones, el dominio de IgSF de tipo salvaje es un miembro de IgSF humano.

En algunas realizaciones según una cualquiera de las proteínas inmunomoduladoras descritas anteriormente, el dominio de IgSF de tipo salvaje es un dominio IgV, un dominio IgC1, un dominio IgC2 o un fragmento de unión específico del mismo. En algunas realizaciones, el dominio de IgSF con afinidad modificada es un dominio IgV con afinidad modificada, un dominio IgC1 con afinidad modificada o un dominio IgC2 con afinidad modificada o es un fragmento de unión específico del mismo que comprende una o más sustituciones de aminoácidos.

En algunas realizaciones según una cualquiera de las proteínas inmunomoduladoras descritas anteriormente, la proteína inmunomoduladora comprende al menos dos dominios de IgSF no de inmunoglobulina con afinidad modificada. En algunas realizaciones, cada uno de los dominios de IgSF no de inmunoglobulina con afinidad modificada se une a un compañero de unión afín diferente, en donde los dos dominios de IgSF con afinidad modificada se unen específicamente de forma no competitiva a los al menos dos compañeros de unión afines diferentes. En algunas realizaciones, los al menos dos dominios no de inmunoglobulina de IgSF con afinidad modificada comprenden cada uno una o más sustituciones de aminoácidos diferentes en el mismo dominio de IgSF de tipo salvaje. En algunas realizaciones, los al menos dos dominios de IgSF no de inmunoglobulina con afinidad modificada comprenden cada uno una o más sustituciones de aminoácidos en diferentes dominios de IgSF de tipo salvaje. En algunas realizaciones, los diferentes dominios de IgSF de tipo salvaje son de diferentes miembros de la familia de IgSF.

En algunas realizaciones según una cualquiera de las proteínas inmunomoduladoras descritas anteriormente, la proteína inmunomoduladora comprende sólo un dominio de IgSF no de inmunoglobulina con afinidad modificada.

Según la invención reivindicada y según una cualquiera de las proteínas inmunomoduladoras descritas anteriormente, la IgSF modificada por afinidad comprende al menos un 85 % de identidad de secuencia con un dominio de IgSF de tipo salvaje o un fragmento de unión específico del mismo contenido en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora comprende además una segunda IgSF modificada por afinidad, en donde el segundo dominio de IgSF con afinidad modificada comprende al menos un 85 % de identidad de secuencia con un dominio de IgSF de tipo salvaje o un fragmento de unión específico del mismo contenido en la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las SEQ ID NO: 1-27.

Según la invención reivindicada y según una cualquiera de las proteínas inmunomoduladoras descritas anteriormente, el dominio de IgSF de tipo salvaje es un miembro de la familia B7. Según la invención reivindicada, el dominio de IgSF de tipo salvaje es un dominio de CD80.

Según la invención reivindicada y según una cualquiera de las proteínas inmunomoduladoras descritas anteriormente, en la presente memoria se proporciona una proteína inmunomoduladora, que comprende al menos un dominio de la superfamilia de inmunoglobulinas (IgSF) CD80 con afinidad modificada que comprende una o más sustituciones de aminoácidos en un dominio de IgSF de CD80 de tipo salvaje, en donde el al menos un dominio de IgSF de CD80 con afinidad modificada tiene una unión aumentada a al menos dos compañeros de unión afines en comparación con el dominio de IgSF de CD80 de tipo salvaje.

Según la invención reivindicada y según una cualquiera de las proteínas inmunomoduladoras descritas anteriormente, los compañeros de unión afines son CD28 y PD-L1. En algunas realizaciones, el dominio de IgSF de tipo salvaje es un dominio IgV y/o el dominio de CD80 con afinidad modificada es un dominio IgV con afinidad modificada. Según la invención reivindicada, el dominio con afinidad modificada comprende al menos un 85 % de identidad de secuencia con un dominio de CD80 de tipo salvaje o un fragmento de unión específico del mismo contenido en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1.

En algunas realizaciones según una cualquiera de las proteínas inmunomoduladoras descritas anteriormente, el al menos un dominio de IgSF con afinidad modificada comprende al menos 1 y no más de veinte sustituciones de aminoácidos en el dominio de IgSF de tipo salvaje. En algunas realizaciones, el al menos un dominio de IgSF con afinidad modificada comprende al menos 1 y no más de diez sustituciones de aminoácidos en el dominio de IgSF de tipo salvaje. En algunas realizaciones, el al menos un dominio de IgSF con afinidad modificada comprende al menos 1 y no más de cinco sustituciones de aminoácidos en el dominio de IgSF de tipo salvaje.

En algunas realizaciones según una cualquiera de las proteínas inmunomoduladoras descritas anteriormente, el dominio de IgSF con afinidad modificada tiene al menos un 120 % de la afinidad de unión como su dominio IgSF de tipo salvaje a cada uno de los al menos dos compañeros de unión afines.

En algunas realizaciones según una cualquiera de las proteínas inmunomoduladoras descritas anteriormente, la proteína inmunomoduladora comprende además un dominio de IgSF no con afinidad modificada.

En algunas realizaciones según una cualquiera de las proteínas inmunomoduladoras descritas anteriormente, la proteína inmunomoduladora es soluble. En algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora carece de un dominio transmembrana o un dominio citoplásmico. En algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora comprende solo el dominio extracelular (ECD) o un fragmento de unión específico del mismo que comprende el dominio de IgSF con afinidad modificada.

En algunas realizaciones según una cualquiera de las proteínas inmunomoduladoras descritas anteriormente, la proteína inmunomoduladora está glicosilada o pegilada.

En algunas realizaciones según una cualquiera de las proteínas inmunomoduladoras descritas anteriormente, la proteína inmunomoduladora está unida a un dominio de multimerización. En algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora está unida a un dominio Fc o una variante del mismo con función efectora reducida. En algunas realizaciones, el dominio Fc es un dominio de IgG1, un dominio de IgG2 o es una variante del mismo con función efectora reducida. En algunas realizaciones, el dominio Fc es de mamífero, opcionalmente humano; o el dominio Fc variante comprende una o más modificaciones de aminoácidos en comparación con un dominio Fc no modificado que es de mamífero, opcionalmente humano. En algunas realizaciones, el dominio Fc o variante del mismo comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 226 o SEQ ID NO: 227 o una secuencia de aminoácidos que exhibe al menos un 85 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 226 o SEQ ID NO: 227.

En algunas realizaciones según una cualquiera de las proteínas inmunomoduladoras descritas anteriormente, la proteína inmunomoduladora está unida indirectamente a través de un enlazador.

En algunas realizaciones según una cualquiera de las proteínas inmunomoduladoras descritas anteriormente, la proteína inmunomoduladora es un dímero.

En algunas realizaciones según una cualquiera de las proteínas inmunomoduladoras descritas anteriormente, la proteína inmunomoduladora está unida a una membrana liposomal.

En la presente memoria también se describen proteínas inmunomoduladoras que comprenden al menos dos dominios de la superfamilia de inmunoglobulinas (IgSF) que no son inmunoglobulina, en donde: al menos uno es un dominio de IgSF con afinidad modificada y los al menos dos dominios de IgSF que no son de inmunoglobulina se unen cada uno independientemente a al menos un compañero de unión diferente. En algunas realizaciones, los al menos dos dominios de IgSF que no son de inmunoglobulina se unen de forma no competitiva a los diferentes compañeros de unión. En algunas realizaciones, el dominio de IgSF con afinidad modificada contiene una sustitución de aminoácido más en un primer dominio de IgSF de tipo salvaje o no modificado. En algunas realizaciones, el otro dominio de IgSF es un dominio de IgSF de tipo salvaje o no modificado. En algunas realizaciones, el otro dominio de IgSF es también un dominio de IgSF con afinidad modificada.

En algunas realizaciones según una cualquiera de las proteínas inmunomoduladoras anteriores, la proteína inmunomoduladora contiene al menos dos dominios de IgSF que no son de inmunoglobulina con afinidad modificada (un primer dominio de IgSF con afinidad modificada y un segundo dominio de IgSF con afinidad modificada) en los que el primer dominio de IgSF no modificado que no es de inmunoglobulina comprende una o más sustituciones de aminoácidos en un primer dominio de IgSF de tipo salvaje y el segundo dominio de IgSF no modificado que no es de inmunoglobulina comprende una o más sustituciones de aminoácidos en un segundo dominio de IgSF de tipo salvaje, y en el que el primer y el segundo dominio de IgSF no modificado que no es de inmunoglobulina se une cada uno específicamente a al menos un compañero de unión afín diferente. En algunas realizaciones, los al menos dos dominios de IgSF que no son de inmunoglobulina se unen de forma no competitiva a los diferentes compañeros de unión. En algunas realizaciones, el primer y segundo dominio de IgSF modificado que no es de inmunoglobulina se modifica por afinidad para exhibir una unión alterada a su compañero de unión afín. Por tanto, en algunas realizaciones, el primer y segundo dominios de IgSF modificados que no son de inmunoglobulina son dominios de IgSF con afinidad modificada. En algunas realizaciones, el primer dominio de IgSF no modificado que no es de inmunoglobulina exhibe una unión alterada a al menos uno de sus compañeros de unión afines en comparación con el primer dominio de IgSF de tipo salvaje; y el segundo dominio de IgSF modificado que no es de inmunoglobulina exhibe una unión alterada a al menos uno de sus compañeros de unión afines en comparación con el segundo dominio de IgSF de tipo salvaje. En algunas realizaciones, la unión alterada aumenta o disminuye independientemente.

En algunas realizaciones, los diferentes compañeros de unión afines son especies moleculares de la superficie celular expresadas en la superficie de una célula de mamífero. En algunas realizaciones, las diferentes especies moleculares de la superficie celular se expresan en configuración cis o configuración trans. En algunas realizaciones, la célula de mamífero es una de las dos células de mamífero que forman una sinapsis inmunológica (IS) y las diferentes especies moleculares de la superficie celular se expresan en al menos una de las dos células de mamífero que forman la IS. En algunas realizaciones, al menos una de las células de mamífero es un linfocito. En algunas realizaciones, el linfocito es una célula NK o una célula T. En algunas realizaciones, la unión de la proteína inmunomoduladora a la célula modula la actividad inmunológica del linfocito. En algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora es capaz de dar lugar a una actividad inmunológica incrementada en comparación con la proteína de tipo salvaje que comprende el dominio de IgSF de tipo salvaje. En algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora es capaz de dar lugar a una actividad inmunológica disminuida en comparación con la proteína de tipo salvaje que comprende el dominio de IgSF de tipo salvaje. En algunas realizaciones, al menos una de las células de mamífero es una célula tumoral. En algunas realizaciones, las células de mamífero son células humanas. En algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora es capaz de unirse específicamente a las dos células de mamífero que forman la IS.

En algunas realizaciones según una cualquiera de las proteínas inmunomoduladoras descritas anteriormente, el primer y segundo dominios de IgSF modificados comprenden cada uno una o más sustituciones de aminoácidos en diferentes dominios de IgSF de tipo salvaje. En algunas realizaciones, los diferentes dominios de IgSF de tipo salvaje son de diferentes miembros de la familia de IgSF. En la presente memoria también se describen proteínas inmunomoduladoras en las que el primer y segundo dominios de IgSF modificados son combinaciones que no son de tipo salvaje. En algunas realizaciones, el primer dominio de IgSF de tipo salvaje y el segundo dominio de IgSF de tipo salvaje, cada uno individualmente, es de un miembro de la familia de IgSF de una familia seleccionada de la familia de proteínas reguladoras de señales (SIRP), familia semejante al receptor de activación expresado en células mieloides (TREML), familia de moléculas de adhesión celular relacionadas con antígenos carcinoembrionarios (CEACAM), familia de lectinas similares a Ig de unión a ácido siálico (SIGLEC), familia de butirofilinas, familia B7, familia CD28, familia que contiene dominios de conjunto V y de inmunoglobulina (VSIG), familia de dominios de conjunto V transmembrana (VSTM), familia de complejos mayores de histocompatibilidad (MHC), familia de moléculas de activación linfocítica de señalización (SLAM), receptor semejante a inmunoglobulina leucocitaria (LIR), familia de nectina (Nec), familia semejante a nectina (NECL), familia relacionada con el receptor de poliovirus (PVR), familia de receptores desencadenantes de citotoxicidad natural (NCR), familia de inmunoglobulina y mucina de células T (TIM) o familia de receptores semejantes a inmunoglobulina de células asesinas (KIR). En algunas realizaciones, el primer dominio de IgSF de tipo salvaje y el segundo dominio de IgSF de tipo salvaje, cada uno individualmente, es de un miembro de IgSF seleccionado de CD80, CD86, PD-L1, PD-L2, Ligando ICOS, B7-H3, B7-H4, CD28, CTLA4, PD-1, ICOS, BTLA, CD4, CD8-alfa, CD8-beta, LAG3, TIM-3, CEACAM1, TIGIT, PVR, PVRL2, CD226, CD2, CD160, CD200, CD200R o Nkp30.

En algunas realizaciones según una cualquiera de las proteínas inmunomoduladoras descritas anteriormente, el primer dominio de IgSF modificado y el segundo dominio de IgSF modificado, cada uno individualmente, comprende al menos un 85 % de identidad de secuencia con un dominio de IgSF de tipo salvaje o un fragmento de unión específico del mismo contenido en la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las SEQ ID NO: 1 -27.

En algunas realizaciones según una cualquiera de las proteínas inmunomoduladoras descritas anteriormente, el primer y segundo dominio de IgSF de tipo salvaje, cada uno individualmente, es un miembro de la familia B7. En algunas realizaciones, el primer y segundo dominio de IgSF de tipo salvaje, cada uno individualmente, es de CD80, CD86 o ICOSLG. En algunas realizaciones, el primer o segundo dominio de IgSF de tipo salvaje es de un miembro de la familia B7 y el otro del primer o segundo dominio de IgSF de tipo salvaje es de otra familia de IgSF.

En la presente memoria también se describen proteínas inmunomoduladoras según una cualquiera de las proteínas inmunomoduladoras descritas anteriormente, en donde el primer y segundo dominio de IgSF de tipo salvaje es de ICOSLG y NKp30.

En algunas realizaciones según una cualquiera de las proteínas inmunomoduladoras descritas anteriormente, el primer y segundo dominio de IgSF de tipo salvaje es de CD80 y NKp30.

En algunas realizaciones según una cualquiera de las proteínas inmunomoduladoras descritas anteriormente, el primer y segundo dominio de IgSF de tipo salvaje, cada uno individualmente, es un miembro de IgSF humana.

En algunas realizaciones según una cualquiera de las proteínas inmunomoduladoras descritas anteriormente, el primer y segundo dominio de IgSF de tipo salvaje, cada uno individualmente, es un dominio IgV y un dominio IgC1, un dominio IgC2 o una unión específica del mismo. En algunas realizaciones, el primer dominio modificado que no es inmunoglobulina y el segundo dominio modificado que no es inmunoglobulina, cada uno individualmente, es un dominio IgV modificado, un dominio IgC1 modificado o un dominio IgC2 modificado o es un fragmento de unión específico del mismo que comprende una o más sustituciones de aminoácidos. En algunas realizaciones, al menos uno del primer dominio modificado que no es inmunoglobulina o el segundo dominio modificado que no es inmunoglobulina es un dominio IgV modificado. En algunas realizaciones, el primer dominio de IgSF modificado que no es de inmunoglobulina y el segundo dominio de IgSF modificado que no es de inmunoglobulina, cada uno individualmente, comprende 1 y no más de veinte sustituciones de aminoácidos. En algunas realizaciones, el primer dominio de IgSF modificado que no es de inmunoglobulina y el segundo dominio de IgSF modificado que no es de inmunoglobulina, cada uno individualmente, comprende 1 y no más de diez sustituciones de aminoácidos. En algunas realizaciones, el primer dominio de IgSF modificado que no es de inmunoglobulina y el segundo dominio de IgSF modificado que no es de inmunoglobulina, cada uno individualmente, comprende 1 y no más de cinco sustituciones de aminoácidos.

En algunas realizaciones según una cualquiera de las proteínas inmunomoduladoras descritas anteriormente, al menos uno del primer o segundo dominio de IgSF modificado que no es de inmunoglobulina tiene entre un 10 % y un 90 % de la afinidad de unión del dominio de IgSF de tipo salvaje para al menos uno de sus compañeros de unión afines. En algunas realizaciones, al menos uno del primer o segundo dominio de IgSF modificado que no es de inmunoglobulina tiene al menos un 120 % de la afinidad de unión del dominio de IgSF de tipo salvaje para al menos uno de sus compañeros de unión afines.

En algunas realizaciones según una cualquiera de las proteínas inmunomoduladoras descritas anteriormente, el primer y segundo dominio de IgSF modificado que no es de inmunoglobulina, cada uno individualmente, tiene al menos un 120 % de la afinidad de unión del dominio de IgSF de tipo salvaje para al menos uno de sus compañeros de unión afines.

En algunas realizaciones según una cualquiera de las proteínas inmunomoduladoras descritas anteriormente, la proteína inmunomoduladora es soluble.

En algunas realizaciones según una cualquiera de las proteínas inmunomoduladoras descritas anteriormente, la proteína inmunomoduladora está glicosilada o pegilada.

En algunas realizaciones según una cualquiera de las proteínas inmunomoduladoras descritas anteriormente, la proteína inmunomoduladora está unida a un dominio de multimerización. En algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora está unida a un dominio Fc o una variante del mismo con función efectora reducida. En algunas realizaciones, el dominio Fc es un dominio de IgG1, un dominio de IgG2 o es una variante del mismo con función efectora reducida. En algunas realizaciones, el dominio Fc es de mamífero, opcionalmente humano; o el dominio Fc variante comprende una o más modificaciones de aminoácidos en comparación con un dominio Fc no modificado que es de mamífero, opcionalmente humano. En algunas realizaciones, el dominio Fc o variante del mismo comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 226 o SEQ ID NO: 227 o una secuencia de aminoácidos que exhibe al menos un 85 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 226 o SEQ ID NO: 227.

En algunas realizaciones según una cualquiera de las proteínas inmunomoduladoras descritas anteriormente, el polipéptido CD80 variante se une indirectamente a través de un enlazador.

En algunas realizaciones según una cualquiera de las proteínas inmunomoduladoras descritas anteriormente, la proteína inmunomoduladora es un dímero.

En algunas realizaciones según una cualquiera de las proteínas inmunomoduladoras descritas anteriormente, la proteína inmunomoduladora comprende además uno o más dominios adicionales de IgSF que no son inmunoglobulina que son iguales o diferentes del primer o segundo dominio de IgSF no modificado que no es inmunoglobulina. En algunas realizaciones, el uno o más dominios adicionales de IgSF que no son inmunoglobulina es un dominio de IgSF con afinidad modificada.

En algunas realizaciones según una cualquiera de las proteínas inmunomoduladoras descritas anteriormente, la proteína inmunomoduladora está unida a una membrana liposomal.

En algunas realizaciones, en la presente memoria se proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido inmunomodulador según una cualquiera de las realizaciones descritas anteriormente. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico es un ácido nucleico sintético. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico es ADNc.

En algunas realizaciones, en la presente memoria se proporciona un vector, que comprende la molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las realizaciones descritas anteriormente. En algunas realizaciones, el vector es un vector de expresión.

En algunas realizaciones, en la presente memoria se proporciona una célula, que comprende el vector según una cualquiera de las realizaciones descritas anteriormente. En algunas realizaciones, la célula es una célula eucariota o una célula procariota.

En algunas realizaciones, en la presente memoria se proporciona un método para producir una proteína inmunomoduladora, que comprende introducir la molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las realizaciones descritas anteriormente o el vector según una cualquiera de las realizaciones descritas anteriormente en una célula huésped en condiciones para expresar la proteína en la célula. En algunas realizaciones, el método comprende además aislar o purificar la proteína inmunomoduladora de la célula.

En algunas realizaciones, en la presente memoria se proporciona una composición farmacéutica que comprende la proteína inmunomoduladora según una cualquiera de las realizaciones descritas anteriormente. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica es estéril.

En la presente memoria también se describe un artículo de fabricación que comprende la composición farmacéutica según una cualquiera de las realizaciones descritas anteriormente en un vial. En algunas realizaciones, el vial está sellado.

En la presente memoria también se describe un kit que comprende la composición farmacéutica según una cualquiera de las realizaciones descritas anteriormente e instrucciones para su uso.

En la presente memoria también se describe un kit que comprende el artículo de fabricación según una cualquiera de las realizaciones descritas anteriormente, e instrucciones para su uso.

En algunas realizaciones, en la presente memoria se proporciona una composición farmacéutica según una cualquiera de las realizaciones descritas anteriormente para su uso en un método para modular una respuesta inmune en un sujeto. En algunas realizaciones, el método comprende administrar a un sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína inmunomoduladora según una cualquiera de las realizaciones descritas anteriormente. En algunas realizaciones, la modulación de la respuesta inmune trata una enfermedad o afección en el sujeto. En algunas realizaciones, se incrementa la respuesta inmune. En algunas realizaciones, la enfermedad o afección es un tumor o cáncer. En algunas realizaciones, la enfermedad o afección se selecciona de melanoma, cáncer de pulmón, cáncer de vejiga o una malignidad hematológica. En algunas realizaciones, se reduce la respuesta inmune. En algunas realizaciones, la enfermedad o afección es una enfermedad o afección inflamatoria. En algunas realizaciones, la enfermedad o afección se selecciona de enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, esclerosis múltiple, asma, artritis reumatoide o psoriasis.

En la presente memoria también se describe un método para identificar una proteína inmunomoduladora modificada por afinidad, que comprende: a) poner en contacto una proteína modificada que comprende al menos un dominio de la superfamilia de inmunoglobulinas (IgSF) que no es de inmunoglobulina modificado o un fragmento de unión específico del mismo con al menos dos compañeros de unión afines en condiciones capaces de lograr la unión de la proteína con los al menos dos compañeros de unión afines, en donde el al menos un dominio de IgSF modificado comprende una o más sustituciones de aminoácidos en un dominio de IgSF de tipo salvaje; b) identificar una proteína modificada que comprende el dominio de IgSF modificado que tiene una unión aumentada a al menos uno de los dos compañeros de unión afines en comparación con una proteína que comprende el dominio de IgSF de tipo salvaje; y c) seleccionar una proteína modificada que comprende el dominio de IgSF modificado que se une de forma no competitiva a los al menos dos compañeros de unión afines, identificando así la proteína inmunomoduladora modificada por afinidad. La etapa b) puede comprender identificar una proteína modificada que comprende un dominio de IgSF modificado que tiene una unión aumentada a cada uno de los al menos dos compañeros de unión afines en comparación con una proteína que comprende el dominio de tipo salvaje. Antes de la etapa a), se pueden introducir una o más sustituciones de aminoácidos en el dominio de IgSF de tipo salvaje, generando así una proteína modificada que comprende el dominio de IgSF modificado. La proteína modificada puede comprender al menos dos dominios de IgSF modificados o fragmentos de unión específicos de los mismos, en donde el primer dominio de IgSF comprende una o más sustituciones de aminoácidos en un primer dominio de IgSF de tipo salvaje y el segundo dominio de IgSF con afinidad modificada que no es inmunoglobulina comprende una o más sustituciones de aminoácidos en un segundo dominio de IgSF de tipo salvaje. El primer y segundo dominio de IgSF con afinidad modificada que no es inmunoglobulina pueden unirse cada uno específicamente a al menos un compañero de unión afín diferente.

En algunas realizaciones, también se proporcionan proteínas inmunomoduladoras de la invención que comprenden al menos un dominio de la superfamilia de inmunoglobulinas (IgSF) con afinidad modificada que no es inmunoglobulina. Según la invención reivindicada, el dominio de IgSF con afinidad modificada se une específicamente de manera no competitiva a al menos dos especies moleculares de la superficie celular. En algunas realizaciones, cada una de las especies moleculares se expresa en al menos una de las dos células de mamífero que forman una sinapsis inmunológica (IS). En algunas realizaciones, las especies moleculares están en configuración cis o configuración trans. En algunas realizaciones, una de las células de mamífero es un linfocito y la unión del dominio de IgSF con afinidad modificada modula la actividad inmunológica del linfocito. En algunas realizaciones, el dominio de IgSF con afinidad modificada se une específicamente a las dos células de mamífero que forman la IS.

En algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora de la invención comprende al menos dos dominios de IgSF con afinidad modificada que no son inmunoglobulina y la proteína inmunomoduladora se une específicamente a las dos células de mamífero que forman la IS. En algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora comprende al menos dos dominios de IgSF con afinidad modificada, en donde los dominios de IgSF con afinidad modificada no son la misma especie de dominio de IgSF.

En algunas realizaciones, una de las dos células de mamífero es una célula tumoral. En algunas realizaciones, el linfocito es una célula NK o una célula T. En algunas realizaciones, las células de mamífero son células de ratón, rata, mono cynomolgus o humanas.

En algunas realizaciones, las especies moleculares de la superficie celular IgSF son miembros de IgSF humana.

En algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora comprende un miembro de IgSF de mamífero con afinidad modificada. En algunas realizaciones, el dominio de IgSF con afinidad modificada es un dominio IgV, IgC1 o IgC2 con afinidad modificada. En algunas realizaciones, el dominio de IgSF con afinidad modificada difiere en al menos una y no más de diez sustituciones de aminoácidos de su dominio de IgSF de tipo salvaje. En algunas realizaciones, el dominio de IgSF con afinidad modificada difiere en al menos una y no más de cinco sustituciones de aminoácidos de su dominio de IgSF de tipo salvaje.

Según la invención reivindicada, el miembro de IgSF humano con afinidad modificada es CD80. En algunas realizaciones, el dominio de IgSF con afinidad modificada comprende al menos un dominio de CD80 humano con afinidad modificada. En algunas realizaciones, el dominio de IgSF con afinidad modificada es un dominio de IgSF CD80 humano.

En algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEQ ID NO: 1-27, o un fragmento de la misma. En algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEQ ID NO: 1-27 o un fragmento de la misma. En algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEQ ID NO: 1-27, o un fragmento de la misma. En algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora tiene al menos un 99 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEQ ID NO: 1-27, o un fragmento de la misma. En algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora que tiene al menos un 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEQ ID NO: 1-27 o un fragmento de la misma comprende además una segunda proteína inmunomoduladora, en donde la segunda proteína inmunomoduladora tiene al menos un 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEQ ID NO: 1-27 o un fragmento de la misma.

En algunas realizaciones, se potencia la actividad inmunológica. En otras, se suprime.

En algunas realizaciones, el dominio de IgSF con afinidad modificada tiene entre un 10 % y un 90 % de la afinidad de unión del dominio de IgSF de tipo salvaje para al menos una de las dos especies moleculares de la superficie celular. En algunas realizaciones, el dominio de IgSF con afinidad modificada se une específicamente de forma no competitiva a exactamente un miembro de IgSF. En algunas realizaciones, el dominio de IgSF con afinidad modificada tiene al menos un 120 % de la afinidad de unión como su dominio de IgSF de tipo salvaje para al menos una de las dos especies moleculares de la superficie celular.

En algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora está unida covalentemente, directa o indirectamente, a un fragmento de anticuerpo cristalizable (Fc). En algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora está glicosilada o pegilada. En algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora es soluble. En algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora está embebida en una membrana liposomal. En algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora se dimeriza mediante enlaces disulfuro intermoleculares.

En algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora está en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En otro aspecto, en la presente memoria se proporcionan proteínas inmunomoduladoras de la invención que comprenden al menos dos dominios de la superfamilia de las inmunoglobulinas (IgSF) modificados por afinidad que no son inmunoglobulinas. Cada uno de los dominios de IgSF con afinidad modificada se une específicamente a su propia especie molecular de la superficie celular. Cada una de las especies moleculares se expresa en al menos una de las dos células de mamífero que forman una sinapsis inmunológica (IS) y una de las células de mamífero es un linfocito. Las especies moleculares están, en algunas realizaciones, en configuración cis o configuración trans. La unión del dominio de IgSF con afinidad modificada modula la actividad inmunológica del linfocito. En algunas realizaciones, al menos uno de los dominios de IgSF con afinidad modificada se une de forma competitiva. En algunas realizaciones, los dominios de IgSF con afinidad modificada no son la misma especie de dominio de IgSF. En algunas realizaciones, los dominios de IgSF con afinidad modificada son combinaciones de tipo no salvaje. En algunas realizaciones, las especies moleculares de la superficie celular son miembros de IgSF humano. Según la invención reivindicada, los al menos dos dominios de IgSF con afinidad modificada son de al menos uno de: CD80, CD86, CD274, PDCD1LG2, ICOSLG, CD276, VTCN1, CD28, CTLA4, PDCD1, ICOS, BTLA, CD4, CD8A, CD8B, LAG3, HAVCR2, CEACAM1, TIGIT, PVR, PVRL2, CD226, CD2, CD160, CD200, NKp30 o CD200R1.

En algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora de la invención comprende al menos dos miembros de IgSF de mamífero con afinidad modificada. En algunas realizaciones, los miembros de IgSF de mamífero son miembros de IgSF humano. En algunas realizaciones, los miembros de IgSF de mamífero son al menos dos de: CD80, CD86, CD274, PDCD1LG2, ICOSLG, CD276, VTCN1, CD28, CTLA4, PDCD1, ICOS, BTLA, CD4, CD8A, CD8B, LAG3, HAVCR2, CEACAM1, TIGIT, PVR, PVRL2, CD226, CD2, CD160, CD200, NKp30 o CD200R1. En algunas realizaciones, se potencia la actividad inmunológica. En algunas realizaciones, se suprime la actividad inmunológica. En algunas realizaciones, una de las dos células de mamífero es una célula tumoral. En algunas realizaciones, el linfocito es una célula NK o una célula T. En algunas realizaciones, las células de mamífero son células de ratón, rata, mono cynomolgus o humanas. En algunas realizaciones, al menos uno de los dos dominios de IgSF con afinidad modificada tiene entre un 10 % y un 90 % de la afinidad de unión del dominio de IgSF de tipo salvaje para al menos una de las especies moleculares de la superficie celular. En algunas realizaciones, al menos uno de los dos dominios de IgSF con afinidad modificada se une específicamente a exactamente una especie molecular de la superficie celular. En algunas realizaciones, al menos uno de los dos dominios de IgSF con afinidad modificada tiene al menos un 120 % de la afinidad de unión como su dominio de IgSF de tipo salvaje para al menos una de las dos especies moleculares de la superficie celular. En algunas realizaciones, los dominios de IgSF con afinidad modificada son al menos uno de un dominio IgV, IgC1 o IgC2. En algunas realizaciones, cada uno de los al menos dos dominios de IgSF con afinidad modificada difiere en al menos una y no más de diez sustituciones de aminoácidos de su dominio de IgSF de tipo salvaje. En algunas realizaciones, cada uno de los al menos dos dominios de IgSF con afinidad modificada difiere en al menos una y no más de cinco sustituciones de aminoácidos de su dominio de IgSF de tipo salvaje. En algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora está unida covalentemente, directa o indirectamente, a un fragmento de anticuerpo cristalizable (Fc). En algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora está en un vehículo farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora está glicosilada o pegilada. En algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora es soluble. En algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora está embebida en una membrana liposomal. En algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora se dimeriza mediante enlaces disulfuro intermoleculares.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un ácido nucleico recombinante que codifica cualquiera de las proteínas inmunomoduladoras resumidas anteriormente.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un vector de expresión recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica cualquiera de las proteínas inmunomoduladoras resumidas anteriormente.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a una célula huésped recombinante que comprende un vector de expresión como se resume anteriormente.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para preparar cualquiera de las proteínas inmunomoduladoras resumidas anteriormente. El método comprende cultivar la célula huésped recombinante en condiciones en las que se expresa la proteína inmunomoduladora, expresar la proteína inmunomoduladora codificada por el vector de expresión recombinante en la misma y purificar la proteína inmunomoduladora recombinante expresada por la misma.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende cualquiera de las proteínas inmunomoduladoras resumidas anteriormente para su uso en un método de tratamiento de un paciente mamífero que necesita una respuesta inmunológica aumentada o suprimida mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína inmunomoduladora de cualquiera de las realizaciones descritas anteriormente. En algunas realizaciones, la respuesta inmunológica aumentada trata el melanoma, el cáncer de pulmón, el cáncer de vejiga o una malignidad hematológica en el paciente. En algunas realizaciones, la respuesta inmunológica suprimida trata la enfermedad de Crohn, la colitis ulcerosa, la esclerosis múltiple, el asma, la artritis reumatoide o la psoriasis en el paciente.

Breve descripción de los dibujos

La FIG. 1A representa los resultados de un ensayo de unión de competición para la unión de la proteína de fusión CD28 Fc recombinante biotinilada (rCD28.Fc) a la molécula de fusión variante de ECD de CD80 A91G-Fc inmovilizada en presencia de PD-L1 -his humana recombinante no marcada, CTLA-4-his humana o proteína de fusión PD-L2-Fc humana.

La FIG. 1B representa los resultados de un ensayo de unión de competición para la unión de la proteína monomérica PD-L1 -his humana recombinante biotinilada a la molécula de fusión variante de ECD de CD80 A91G-Fc inmovilizada en presencia de rCD28.Fc humana recombinante no marcado, CTLA-4.Fc humana o PD-L2.Fc humana.

Si una definición mostrada en la presente memoria es contraria a o de otra forma inconsistente con una definición mostrada en las patentes, solicitudes, solicitudes publicadas y otras publicaciones, prevalecerá la definición mostrada en la presente memoria.

Descripción detallada

En la presente memoria se proporcionan proteínas inmunomoduladoras solubles como se definen en las reivindicaciones adjuntas que son capaces de unirse a uno o más ligandos proteicos, y generalmente a dos o más ligandos proteicos, para modular, p. ej., inducir, potenciar o suprimir respuestas inmunológicas. Según la invención reivindicada, los ligandos proteicos son proteínas de la superficie celular expresadas por las células inmunes que se unen con uno o más de otros receptores inmunes, p. ej., en linfocitos, para inducir señales inhibidoras o activadoras. Por ejemplo, la interacción de ciertos receptores en los linfocitos con sus ligandos de la superficie celular afines para formar una sinapsis inmunológica (IS) entre las células presentadoras de antígenos (APC) o las células diana y los linfocitos puede proporcionar señales coestimuladoras o inhibidoras que pueden regular el sistema inmune. En algunos aspectos, las proteínas inmunomoduladoras proporcionadas en la presente memoria pueden alterar la interacción de los ligandos proteicos de la superficie celular con sus receptores para modular de este modo la actividad de las células inmunes, tales como las células T.

En algunas realizaciones, en condiciones fisiológicas normales, la respuesta inmune mediada por células T se inicia mediante el reconocimiento de antígenos por el receptor de células T (TCR) y está regulada por un equilibrio de señales coestimuladoras e inhibidoras (es decir, proteínas de puntos de control inmunitarios). El sistema inmune se basa en puntos de control inmunológicos para prevenir la autoinmunidad (es decir, la auto-tolerancia) y para proteger a los tejidos de un daño excesivo durante una respuesta inmune, por ejemplo, durante un ataque contra una infección patógena. En algunos casos, sin embargo, estas proteínas inmunomoduladoras pueden desregularse en enfermedades y afecciones, incluyendo los tumores, como un mecanismo para evadir el sistema inmune.

Por tanto, en algunos aspectos, la inmunoterapia que altera la actividad de las células inmunes, tal como la actividad de las células T, puede tratar determinadas enfermedades y afecciones en las que la respuesta inmune está desregulada. Los enfoques terapéuticos que buscan modular las interacciones en la IS se beneficiarían de la capacidad de unir múltiples dianas de la IS simultáneamente y de una manera que sea sensible a la secuencia temporal y la orientación espacial. Los enfoques terapéuticos actuales no alcanzan este objetivo. En cambio, los receptores solubles y los anticuerpos no se unen típicamente a más de una proteína diana a la vez. Esto puede deberse a la ausencia de más de una especie diana. Además, los ligandos y receptores de tipo salvaje poseen afinidades bajas por los compañeros de unión afines, lo que excluye su uso como agentes terapéuticos solubles.

Sin embargo, de manera menos trivial, los receptores solubles y los anticuerpos generalmente se unen de manera competitiva (p. ej., a no más de una especie diana a la vez) y, por lo tanto, carecen de la capacidad de unirse simultáneamente a múltiples dianas. Y, aunque los anticuerpos biespecíficos, así como las modalidades que comprenden regiones duales de unión a antígeno, pueden unirse a más de una molécula diana simultáneamente, la configuración tridimensional típica de estas modalidades a menudo les impide intervenir en procesos clave que ocurren en la IS de una manera consistente con sus requisitos temporales y espaciales.

Lo que se necesita es una clase completamente nueva de moléculas terapéuticas que tengan la especificidad y afinidad de los anticuerpos o receptores solubles, pero, además, mantengan las restricciones de tamaño, volumen y orientación espacial requeridas en la IS y posean una mayor afinidad hacia los respectivos compañeros de unión afines. Además, dichos agentes terapéuticos tendrían la capacidad de unirse a sus dianas tanto de forma no competitiva como competitiva. Por tanto, una molécula con estas propiedades tendría una función novedosa en la capacidad de integrarse en complejos de múltiples proteínas en la IS y generar la configuración de unión y la actividad biológica resultante deseadas.

Con este fin, los regímenes terapéuticos de inmuno-oncología emergentes deben romper de forma segura la tolerancia de las células T inducida por los tumores. Los inmunoterapéuticos de última generación bloquean PD-1 o CTLA4, moléculas inhibidoras centrales de la familia B7/CD28 que se sabe que limitan la función efectora de las células T. Si bien los anticuerpos antagonistas contra dichas dianas únicas funcionan para disrumpir los complejos de señalización del punto de control de la sinapsis inmune, no logran activar simultáneamente las células T. Por el contrario, los enfoques de anticuerpos biespecíficos activan las células T, pero no logran bloquear simultáneamente los ligandos inhibidores que regulan la señal inducida.

Para abordar estas deficiencias, se proporcionan moléculas terapéuticas según las reivindicaciones que, en algunas realizaciones, estimularán la señalización de activación de las células T y bloquearán simultáneamente la regulación inhibidora. Según la invención reivindicada, las proteínas inmunomoduladoras proporcionadas se refieren a componentes de la superfamilia de inmunoglobulinas (IgSF) de la sinapsis inmune que se sabe que tienen un papel doble tanto en la activación de las células T como en el bloqueo de ligandos inhibidores. En aspectos particulares, las proteínas inmunomoduladoras proporcionadas proporcionan una plataforma de inmunoterapia usando ligandos inmunes nativos con afinidad modificada para generar productos biológicos de inmunoterapia que se unen con afinidades ajustables a uno o más de sus receptores inmunes afines en el tratamiento de una variedad de indicaciones oncológicas e inmunológicas. En algunos aspectos, los agentes terapéuticos basados en IgSF preparados por ingeniería a partir de ligandos del sistema inmune, tales como los ligandos del sistema inmune humano, tienen más probabilidades de retener su capacidad para ensamblarse normalmente en vías clave de la sinapsis inmune y mantener interacciones y funciones reguladoras normales de una manera que no pueden lograr los anticuerpos o los reactivos biespecíficos de última generación. Esto se debe al tamaño relativamente grande de los anticuerpos, así como al hecho de que no son componentes naturales de la sinapsis inmune. Estas características únicas de los ligandos del sistema inmune humano prometen proporcionar un nuevo nivel de eficacia y seguridad inmunoterapéuticas.

Los encabezamientos de las secciones usados en la presente memoria son solo para fines organizativos y no deben interpretarse como limitantes del contenido descrito.

I. Definiciones

A menos que se defina de otro modo, todos los términos de la técnica, notaciones y otros términos o terminología técnicos y científicos usados en la presente memoria pretenden tener el mismo significado que el comúnmente entendido por un experto en la técnica a la que pertenece el contenido reivindicado. En algunos casos, los términos con significados comúnmente entendidos se definen en la presente memoria para mayor claridad y/o para una fácil referencia, y no debe interpretarse necesariamente que la inclusión de tales definiciones en la presente memoria represente una diferencia sustancial con respecto a lo que se entiende generalmente en la técnica.

Los términos utilizados a lo largo de esta memoria descriptiva se definen como sigue, a menos que se limiten de otra manera en casos específicos. Tal y como se usa en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el" incluyen referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. A menos que se defina de otro modo, todos los términos, acrónimos y abreviaturas técnicos y científicos utilizados en la presente memoria tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por un experto en la técnica a la que pertenece la invención. A menos que se indique lo contrario, las abreviaturas y los símbolos de los nombres químicos y bioquímicos son según la nomenclatura IUPAC-IUB. A menos que se indique lo contrario, todos los rangos numéricos incluyen los valores que definen el rango, así como todos los valores enteros intermedios.

El término "con afinidad modificada", tal y como se usa en el contexto de un dominio de la superfamilia de inmunoglobulinas, significa un dominio de la superfamilia de inmunoglobulinas (IgSF) de mamíferos que tiene una secuencia de aminoácidos alterada (en relación con el dominio de IgSF de control de tipo salvaje) de modo que tiene una afinidad o avidez de unión aumentada o disminuida para al menos uno de sus compañeros de unión afines en comparación con el dominio de control de IgSF de tipo salvaje (es decir, sin afinidad modificada). En algunas realizaciones, el dominio de IgSF puede contener 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o más diferencias de aminoácidos, tales como sustituciones de aminoácidos, en un dominio de IgSF de tipo salvaje o no modificado. Un dominio de IgSF que tiene una secuencia de aminoácidos alterada (en relación con el dominio de IgSF de tipo salvaje) que no tiene una afinidad o avidez de unión aumentada o disminuida para al menos uno de sus compañeros de unión afines en comparación con el dominio de control de IgSF de tipo salvaje es un dominio de IgSF con afinidad no modificada. Se puede determinar un aumento o disminución de la afinidad o avidez de unión usando ensayos de unión bien conocidos, tales como la citometría de flujo. Larsen et al., American Journal of Transplantation, Vol 5: 443-453 (2005). Véase, también, Linsley et al., Immunity, 1: 7930801 (1994). Un aumento en la afinidad o avidez de unión de una proteína para su o sus compañeros de unión afines tiene un valor al menos un 10 % mayor que el del control del dominio de IgSF de tipo salvaje y, en algunas realizaciones, al menos un 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 100 %, 200 %, 300 %, 500 %, 1.000 %, 5.000 % o 10.000 % mayor que el del valor de control de dominio de IgSF de tipo salvaje. Una disminución en la afinidad o avidez de unión de una proteína para al menos uno de sus compañeros de unión afines tiene un valor no superior al 90 % del control, pero no inferior al 10 % del valor de control del dominio de IgSF de tipo salvaje, y en algunas realizaciones no superior al 80 %, 70 % 60 %, 50 %, 40 %, 30 % o 20 %, pero no inferior al 10 % del valor de control del dominio de IgSF de tipo salvaje. Una proteína con afinidad modificada se altera en la secuencia de aminoácidos primaria mediante sustitución, adición o deleción de residuos de aminoácidos. El término "dominio de IgSF con afinidad modificada" no debe interpretarse como que impone ninguna condición para ninguna composición o método de partida particular mediante el cual se creó el dominio de IgSF con afinidad modificada. Por tanto, los dominios de IgSF con afinidad modificada de la presente invención no se limitan a dominios de IgSF de tipo salvaje que luego se transforman en un dominio de IgSF con afinidad modificada mediante cualquier proceso particular de modificación de la afinidad. Un polipéptido de dominio de IgSF con afinidad modificada puede, por ejemplo, generarse a partir de la información de secuencia del dominio de IgSF de mamífero de tipo salvaje, luego modelarse in silico para unirse a su compañero de unión afín, y finalmente sintetizarse recombinantemente o químicamente para producir la composición de dominio de IgSF con afinidad modificada de interés. En solo un ejemplo alternativo, se puede crear un dominio de IgSF con afinidad modificada mediante mutagénesis dirigida a sitio de un dominio de IgSF de tipo salvaje. Por tanto, el dominio de IgSF con afinidad modificada denota un producto y no necesariamente un producto producido por ningún proceso dado. Puede emplearse una variedad de técnicas que incluyen métodos recombinantes, síntesis química o combinaciones de los mismos.

Los términos "afinidad de unión" y "avidez de unión" tal y como se usan en la presente memoria significan la afinidad de unión específica y la avidez de unión específica, respectivamente, de una proteína por su compañero de unión afín en condiciones de unión específicas. En cinética bioquímica, la avidez se refiere a la fuerza acumulada de múltiples afinidades de interacciones de unión no covalentes individuales, tales como entre un dominio de IgSF y su compañero de unión afín. Como tal, la avidez es distinta de la afinidad, que describe la fuerza de una única interacción. Los métodos para determinar la afinidad o avidez de unión se conocen en la técnica. Véase, por ejemplo, Larsen et al., American Journal of Transplantation, Vol 5: 443-453 (2005).

El término "semivida biológica" se refiere a la cantidad de tiempo que tarda una sustancia, tal como un polipéptido inmunomodulador de la presente invención, en perder la mitad de su actividad o concentración farmacológica o fisiológica. La semivida biológica puede verse afectada por la eliminación, excreción, degradación (p. ej., enzimática) de la sustancia o la absorción y concentración en ciertos órganos o tejidos del cuerpo. En algunas realizaciones, la semivida biológica se puede evaluar determinando el tiempo que tarda la concentración de la sustancia en el plasma sanguíneo en alcanzar la mitad de su nivel de estado estacionario ("semivida en plasma"). Los conjugados que se pueden usar para derivatizar y aumentar la semivida biológica de los polipéptidos de la invención son conocidos en la técnica e incluyen, pero no están limitados a, polietilenglicol (PEG), hidroxietil almidón (HES), XTEN (péptidos recombinantes extendidos; véase, WO2013130683), albúmina de suero humano (HSA), albúmina de suero bovino (BSA), lípidos (acilación) y poli-Pro-Ala-Ser (PAS), ácido poliglutámico (glutamilación).

El término "compañero de unión afín", en referencia a una proteína, tal como un dominio de IgSF o un dominio de IgSF con afinidad modificada, se refiere a al menos una molécula (típicamente una proteína de mamífero nativa) a la que la proteína de referencia se une específicamente en condiciones de unión específicas. Una especie de ligando reconocida y que se une específicamente a su receptor afín en condiciones de unión específicas es un ejemplo de un compañero de unión afín de ese receptor. Un "compañero de unión de la superficie celular afín" es un compañero de unión afín expresado en la superficie de una célula de mamífero. En la presente invención, una "especie molecular de la superficie celular" es un compañero de unión afín de la sinapsis inmunológica (IS), expresada en y por células, tales como células de mamífero, que forman la sinapsis inmunológica.

El término "unión competitiva", tal y como se usa en la presente memoria, significa que una proteína es capaz de unirse específicamente a al menos dos compañeros de unión afines, pero que la unión específica de un compañero de unión afín inhibe, tal como previene o impide, la unión simultánea del segundo compañero de unión afín. Por tanto, en algunos casos, no es posible que una proteína se una a los dos compañeros de unión afines al mismo tiempo. Generalmente, los ligantes competitivos contienen el mismo sitio de unión o superpuesto para una unión específica, pero esto no es un requisito. En algunas realizaciones, la unión competitiva provoca una inhibición mensurable (parcial o completa) de la unión específica de una proteína a uno de sus compañeros de unión afines debido a la unión específica de un segundo compañero de unión afín. Se conocen diversos métodos para cuantificar la unión competitiva, tales como los ensayos ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas).

El término "sustitución conservativa de aminoácidos", tal y como se usa en la presente memoria, significa una sustitución de aminoácidos en la que un residuo de aminoácido está sustituido por otro residuo de aminoácido que tiene un grupo R de cadena lateral con propiedades químicas similares (p. ej., carga o hidrofobicidad). Los ejemplos de grupos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con propiedades químicas similares incluyen 1) cadenas laterales alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; 2) cadenas laterales con hidroxilo alifáticas: serina y treonina; 3) cadenas laterales que contienen amida: asparagina y glutamina; 4) cadenas laterales aromáticas: fenilalanina, tirosina y triptófano; 5) cadenas laterales básicas: lisina, arginina e histidina; 6) cadenas laterales ácidas: ácido aspártico y ácido glutámico; y 7) cadenas laterales que contienen azufre: cisteína y metionina. Los grupos de sustitución de aminoácidos conservativas son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alaninavalina, glutamato-aspartato y asparagina-glutamina.

El término "correspondiente a" con referencia a las posiciones de una proteína, tales como la recitación de que las posiciones de nucleótidos o aminoácidos "corresponden a" posiciones de nucleótidos o aminoácidos en una secuencia descrita, tal como se establece en el listado de secuencias, se refiere a posiciones de nucleótidos o aminoácidos identificadas tras el alineamiento con la secuencia descrita basándose en el alineamiento de la secuencia estructural o usando un algoritmo de alineamiento estándar, tal como el algoritmo GAP. Al alinear las secuencias, un experto en la técnica puede identificar los residuos correspondientes, por ejemplo, utilizando residuos de aminoácidos conservados e idénticos como guías.

El término "citoquina" incluye, p. ej., pero no está limitado a, interleucinas, interferones (IFN), quimioquinas, factores de crecimiento hematopoyético, factores de necrosis tumoral (TNF) y factores de crecimiento transformantes. En general, se trata de proteínas de pequeño peso molecular que regulan la maduración, activación, proliferación y diferenciación de las células del sistema inmune.

Los términos "disminuir" o "atenuar" "o suprimir" tal y como se usan en la presente memoria significan disminuir en una cantidad estadísticamente significativa. Una disminución puede ser al menos del 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 100 %.

Los términos "derivados" o "derivatizado" se refieren a la modificación de una proteína inmunomoduladora uniéndola covalentemente, directa o indirectamente, para alterar características tales como semivida, biodisponibilidad, inmunogenicidad, solubilidad, toxicidad, potencia o eficacia mientras se retiene o potencia su beneficio terapéutico. Los derivados se pueden preparar mediante glicosilación, pegilación, lipidación o fusión con Fc.

Tal y como se usa en la presente memoria, dominio (típicamente una secuencia de tres o más, generalmente 5 o 7 o más aminoácidos, tal como 10 a 200 residuos de aminoácidos) se refiere a una porción de una molécula, tal como una proteína o un ácido nucleico codificante, que es estructural y/o funcionalmente diferente de otras porciones de la molécula y es identificable. Por ejemplo, los dominios incluyen aquellas porciones de una cadena polipeptídica que pueden formar una estructura plegada independientemente dentro de una proteína formada por uno o más restos estructurales y/o que se reconoce en virtud de una actividad funcional, tal como la actividad de unión. Una proteína puede tener uno, o más de uno, dominios distintos. Por ejemplo, un dominio puede identificarse, definirse o distinguirse por homología de la secuencia o estructura primaria con miembros de la familia relacionados, tal como homología con restos. En otro ejemplo, un dominio se puede distinguir por su función, tal como la capacidad de interaccionar con una biomolécula, tal como un compañero de unión afín. Un dominio puede exhibir independientemente una función o actividad biológica de manera que el dominio independientemente o fusionado a otra molécula pueda realizar una actividad, tal como, por ejemplo, la unión. Un dominio puede ser una secuencia lineal de aminoácidos o una secuencia no lineal de aminoácidos. Muchos polipéptidos contienen una pluralidad de dominios. Dichos dominios son conocidos y pueden ser identificados por los expertos en la técnica. Para ejemplificación en la presente memoria, se proporcionan definiciones, pero se entiende que está bien dentro de la experiencia en la técnica reconocer dominios particulares por su nombre. Si es necesario, se puede emplear el software adecuado para identificar los dominios. Se entiende que la referencia a aminoácidos, incluyendo una secuencia específica mostrada como SEQ ID NO utilizada para describir la organización del dominio de un dominio de IgSF, tiene fines ilustrativos y no pretende limitar el alcance de las realizaciones proporcionadas. Se entiende que los polipéptidos y la descripción de los dominios de los mismos se derivan teóricamente basándose en análisis de homología y alineamientos con moléculas similares. Por lo tanto, el locus exacto puede variar y no es necesariamente el mismo para cada proteína. Por tanto, el dominio de IgSF específico, tal como el dominio IgV específico o el dominio IgC, puede tener una longitud más larga o corta de varios aminoácidos (uno, dos, tres o cuatro).

El término "ectodominio", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a la región de una proteína de membrana, tal como una proteína transmembrana, que se encuentra fuera de la membrana vesicular. Los ectodominios a menudo comprenden dominios de unión que se unen específicamente a ligandos o receptores de la superficie celular. El ectodominio de una proteína transmembrana celular se denomina alternativamente dominio extracelular.

Los términos "cantidad eficaz" o "cantidad terapéuticamente eficaz" se refieren a una cantidad y/o concentración de una composición terapéutica de la invención, que cuando se administra ex vivo (por contacto con una célula de un paciente) o in vivo (por administración en un paciente) ya sea sola (es decir, como monoterapia) o en combinación con agentes terapéuticos adicionales, produce una inhibición estadísticamente significativa de la progresión de la enfermedad tal como, por ejemplo, mejorando o eliminando los síntomas y/o la causa de la enfermedad. Una cantidad eficaz para tratar una enfermedad o trastorno del sistema inmune puede ser una cantidad que mitiga, disminuye o alivia al menos un síntoma o respuesta biológica o efecto asociado con la enfermedad o trastorno, previene la progresión de la enfermedad o trastorno, o mejora el funcionamiento físico del paciente. En algunas realizaciones, el paciente es un paciente humano.

Los términos "potenciado" o "aumentado", tal y como se usan en la presente memoria en el contexto de aumentar la actividad inmunológica de un linfocito de mamífero, significan aumentar la producción de interferón gamma (IFN-gamma), tal como en una cantidad estadísticamente significativa. En algunas realizaciones, la actividad inmunológica se puede evaluar en un ensayo de reacción de linfocitos mixtos (MLR). Los métodos para realizar ensayos de MLR se conocen en la técnica. Wang et al., Cancer Immunol Res. 2014 sep: 2(9): 846-56. En algunas realizaciones, una potenciación puede ser un aumento de al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 75 %, 100 %, 200 %, 300 %, 400 % o 500 % mayor que un valor de control cero.

El término "célula huésped" se refiere a una célula que puede usarse para expresar una proteína codificada por un vector de expresión recombinante. Una célula huésped puede ser un procariota, por ejemplo, E. coli, o puede ser un eucariota, por ejemplo, un eucariota unicelular (p. ej., una levadura u otro hongo), una célula vegetal (p. ej., una célula de la planta del tabaco o tomate), una célula animal (p. ej., una célula humana, una célula de mono, una célula de hámster, una célula de rata, una célula de ratón o una célula de insecto) o un hibridoma. Los ejemplos de células huésped incluyen células de ovario de hámster chino (CHO) o sus derivados tales como Veggie CHO y líneas celulares relacionadas que crecen en medio sin suero o la cepa de CHO DX-B11, que es deficiente en DHFR.

El término "sinapsis inmunológica" o "sinapsis inmune", tal y como se usa en la presente memoria, significa la interfaz entre una célula de mamífero que expresa MHC I (complejo mayor de histocompatibilidad) o MHC II, tal como una célula presentadora de antígeno o una célula tumoral, y un linfocito de mamífero, tal como una célula T efectora o una célula asesina natural (NK).

El término "inmunoglobulina" (abreviado "Ig"), tal y como se usa en la presente memoria, es sinónimo del término "anticuerpo" (abreviado "Ab") y se refiere a una proteína de inmunoglobulina de mamífero que incluye cualquiera de las cinco clases humanas: IgA (que incluye las subclases IgA1 y IgA2), IgD, IgE, IgG (que incluye las subclases IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4) e IgM. El término también incluye inmunoglobulinas que no tienen la longitud completa, ya sean total o parcialmente sintéticas (p. ej., recombinante o síntesis química) o producidas naturalmente, tal como fragmento de unión a antígeno (Fab), fragmento variable (Fv) que contiene V^h y V^l, el fragmento variable monocatenario (scFv) que contiene V^h y V^l unidos entre sí en una cadena, así como otros fragmentos de la región V del anticuerpo, tales como fragmentos de polipéptido Fab', F(ab)2, F(ab')2, diacuerpo dsFv, Fc y Fd. Los anticuerpos biespecíficos, homobiespecíficos y heterobiespecíficos, se incluyen dentro del significado del término.

Una región o dominio Fc (fragmento cristalizable) de una molécula de inmunoglobulina (también denominado polipéptido Fc) corresponde en gran medida a la región constante de la cadena pesada de inmunoglobulina y es responsable de varias funciones, incluyendo las funciones efectoras del anticuerpo. Una fusión de Fc de inmunoglobulina ("fusión Fc") es una molécula que comprende uno o más polipéptidos (o una o más moléculas pequeñas) unidos operativamente a una región Fc de una inmunoglobulina. Una fusión Fc puede comprender, por ejemplo, la región Fc de un anticuerpo (que facilita la farmacocinética) y el dominio de IgSF de un dominio de superfamilia de inmunoglobulina de tipo salvaje o con afinidad modificada ("IgSF"), u otra proteína o fragmento de la misma. En algunas realizaciones, el Fc facilita además las funciones efectoras. En algunas realizaciones, el Fc es un Fc variante que presenta una actividad reducida (p. ej., reducida en más del 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o más) para facilitar una función efectora. El dominio de IgSF media el reconocimiento del compañero de unión afín (comparable a la de la región variable del anticuerpo de un anticuerpo para un antígeno). Una región Fc de inmunoglobulina puede unirse directa o indirectamente a uno o más polipéptidos o moléculas pequeñas (compañeros de fusión). Se conocen varios enlazadores en la técnica y se pueden usar para enlazar un Fc a un compañero de fusión para generar una fusión Fc. Una proteína de fusión Fc de la invención comprende típicamente una región Fc de inmunoglobulina unida covalentemente, directa o indirectamente, a al menos un dominio de IgSF con afinidad modificada. Las fusiones Fc de especies idénticas se pueden dimerizar para formar homodímeros de fusión Fc, o usando especies no idénticas para formar heterodímeros de fusión Fc.

El término "superfamilia de inmunoglobulinas" o "IgSF", tal y como se usa en la presente memoria, significa el grupo de proteínas solubles y de la superficie celular que están involucradas en los procesos de reconocimiento, unión o adhesión de las células. Las moléculas se clasifican como miembros de esta superfamilia basándose en características estructurales compartidas con inmunoglobulinas (es decir, anticuerpos); todos poseen un dominio conocido como dominio o pliegue de inmunoglobulina. Los miembros de la IgSF incluyen receptores de antígenos de la superficie celular, correceptores y moléculas coestimuladoras del sistema inmune, moléculas implicadas en la presentación de antígenos a linfocitos, moléculas de adhesión celular, ciertos receptores de citoquinas y proteínas musculares intracelulares. Por lo general, se asocian con funciones en el sistema inmune. Las proteínas en la sinapsis inmunológica son a menudo miembros de la IgSF. La IgSF también se puede clasificar en "subfamilias" según las propiedades compartidas, tal como la función. Dichas subfamilias consisten típicamente en 4 a 30 miembros de IgSF.

Los términos "dominio de IgSF" o "dominio de inmunoglobulina" o "dominio de Ig", tal y como se usan en la presente memoria, se refieren a un dominio estructural de proteínas IgSF. Los dominios de Ig reciben el nombre de las moléculas de inmunoglobulina. Contienen aproximadamente 70-110 aminoácidos y se clasifican según su tamaño y función. Los dominios de Ig poseen un pliegue de Ig característico, que tiene una estructura tipo sándwich formada por dos láminas de hebras beta antiparalelas. Las interacciones entre los aminoácidos hidrófobos en el lado interno del sándwich y los enlaces disulfuro altamente conservados formados entre los residuos de cisteína en las cadenas B y F, estabilizan el pliegue de Ig. Un extremo del dominio de Ig tiene una sección denominada región determinante de la complementariedad que es importante para la especificidad de los anticuerpos por sus ligandos. Los dominios similares a Ig se pueden clasificar (en clases) como: IgV, IgC1, IgC2 o Ig I. La mayoría de los dominios de Ig son variables (IgV) o constantes (IgC). Los dominios de IgV con 9 cadenas beta son generalmente más largos que los dominios de IgC con 7 cadenas beta. Los dominios de Ig de algunos miembros de la IgSF se parecen a los dominios de IgV en la secuencia de aminoácidos, pero son similares en tamaño a los dominios de IgC. Estos se denominan dominios de IgC2, mientras que los dominios de IgC estándar se denominan dominios de IgC1. Las cadenas del receptor de células T (TCR) contienen dos dominios de Ig en la porción extracelular; un dominio IgV en el extremo N y un dominio IgC1 adyacente a la membrana celular.

El término "especie de IgSF", tal y como se usa en la presente memoria, significa un conjunto de proteínas miembro de IgSF con una secuencia de aminoácidos primaria idéntica o sustancialmente idéntica. Cada miembro de la superfamilia de inmunoglobulinas (IgSF) de mamíferos define una identidad única de todas las especies de IgSF que pertenecen a ese miembro de IgSF. Por tanto, cada miembro de la familia de IgSF es único respecto a otros miembros de la familia de IgSF y, en consecuencia, cada especie de un miembro de la familia de IgSF particular es única respecto a las especies de otro miembro de la familia de IgSF. No obstante, pueden producirse variaciones entre moléculas que son de la misma especie de IgSF debido a diferencias en la modificación postraduccional tales como glicosilación, fosforilación, ubiquitinación, nitrosilación, metilación, acetilación y lipidación. Además, las diferencias menores de secuencia dentro de una única especie de IgSF debido a polimorfismos génicos constituyen otra forma de variación dentro de una única especie de IgSF al igual que las formas truncadas de tipo salvaje de especies de IgSF debido, por ejemplo, a la escisión proteolítica. Una "especie de IgSF de la superficie celular" es una especie de IgSF expresada en la superficie de una célula, generalmente una célula de mamífero.

El término "actividad inmunológica", tal y como se usa en la presente memoria en el contexto de linfocitos de mamíferos, significa su expresión de citoquinas, tales como quimioquinas o interleuquinas. Los ensayos para determinar el aumento o la supresión de la actividad inmunológica incluyen ensayos MLR para interferón-gamma (Wang et al., Cancer Immunol Res. 2014 sep: 2(9): 846-56), ensayo de estimulación de células T por SEB (enterotoxina estafilocócica B) (Wang et al., Cancer Immunol Res. 2014 sep: 2(9): 846-56) y ensayos de estimulación de células T anti-CD3 (Li y Kurlander, J Transl Med. 2010: 8: 104). La inducción de una respuesta inmune da como resultado un aumento de la actividad inmunológica en relación con los linfocitos quiescentes. Una proteína inmunomoduladora o un dominio de IgSF con afinidad modificada de la invención puede, en algunas realizaciones, aumentar o, en realizaciones alternativas, disminuir la expresión de IFN-gamma (interferón-gamma) en un ensayo de células T primarias en relación con un miembro de IgSF de tipo salvaje o control de dominio de IgSF. Los expertos reconocerán que el formato del ensayo de células T primarias usado para determinar un aumento en la expresión de IFN-gamma diferirá del empleado para ensayar una disminución en la expresión de IFN-gamma. En el ensayo de la capacidad de una proteína inmunomoduladora o dominio de IgSF con afinidad modificada de la invención para disminuir la expresión de IFN-gamma en un ensayo de células T primarias, se puede usar un ensayo de reacción de linfocitos mixtos (MLR) como se describe en el Ejemplo 6. Convenientemente, se puede emplear una forma soluble de un dominio de IgSF con afinidad modificada de la invención para determinar su capacidad para antagonizar y, por lo tanto, disminuir la expresión de IFN-gamma en un MLR como se describe igualmente en el Ejemplo 6. Alternativamente, en el ensayo de la capacidad de una proteína inmunomoduladora o dominio de IgSF con afinidad modificada de la invención para aumentar la expresión de IFN-gamma en un ensayo de células T primarias, se puede usar un ensayo de coinmovilización. En un ensayo de coinmovilización, una señal del receptor de células T, proporcionada en algunas realizaciones por un anticuerpo anti-CD3, se usa junto con un dominio de IgSF con afinidad modificada coinmovilizado para determinar la capacidad de aumentar la expresión de IFN-gamma en relación con un control de dominio de IgSF de tipo salvaje.

Una "proteína inmunomoduladora" es una proteína que modula la actividad inmunológica. Por "modulación" o "que modula" una respuesta inmune se entiende que la actividad inmunológica se potencia o se suprime. Una proteína inmunomoduladora puede ser una única cadena polipeptídica o un multímero (dímeros o multímeros de orden superior) de al menos dos cadenas polipeptídicas unidas covalentemente entre sí mediante, por ejemplo, enlaces disulfuro intercadena. Por tanto, las proteínas monoméricas, diméricas y multiméricas de orden superior están dentro del alcance del término definido. Las proteínas multiméricas pueden ser homomultiméricas (de cadenas polipeptídicas idénticas) o heteromultiméricas (de cadenas polipeptídicas diferentes).

El término "aumento", tal y como se usa en la presente memoria, significa aumentar en una cantidad estadísticamente significativa. Un aumento puede ser al menos del 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 75 %, 100 % o mayor que un valor de control distinto de cero.

El término "linfocito", tal y como se usa en la presente memoria, significa cualquiera de los tres subtipos de glóbulos blancos en el sistema inmune de un mamífero. Incluyen células asesinas naturales (células NK) (que funcionan en la inmunidad innata citotóxica mediada por células), células T (para la inmunidad adaptativa citotóxica mediada por células) y células B (para la inmunidad adaptativa humoral dirigida por anticuerpos). Las células T incluyen: células T auxiliares, células T citotóxicas, células T asesinas naturales, células T de memoria, células T reguladoras o células T gamma delta. Las células linfoides innatas (ILC) también se incluyen dentro de la definición de linfocito.

Los términos "mamífero", "sujeto" o "paciente" incluyen específicamente una referencia a al menos uno de: ser humano, chimpancé, mono rhesus, mono cynomolgus, perro, gato, ratón o rata.

Los términos "que modulan" o "modulan", tal y como se usan en la presente memoria en el contexto de una respuesta inmune, tal como una respuesta inmune de mamífero, se refieren a cualquier alteración, tal como un aumento o una disminución, de una respuesta inmune existente o potencial que ocurre como resultado de la administración de una proteína inmunomoduladora de la presente invención. Por tanto, se refiere a una alteración, tal como un aumento o una disminución, de una respuesta inmune en comparación con la respuesta inmune que se produce o está presente en ausencia de la administración de la proteína inmunomoduladora. Dicha modulación incluye cualquier inducción, o alteración en el grado o extensión, o supresión de la actividad inmunológica de una célula inmune. Las células inmunes incluyen células B, células T, células NK (asesinas naturales), células T NK, células presentadoras de antígenos (APC) profesionales y células presentadoras de antígenos no profesionales, y células inflamatorias (neutrófilos, macrófagos, monocitos, eosinófilos, y basófilos). La modulación incluye cualquier cambio impartido en una respuesta inmune existente, una respuesta inmune en desarrollo, una respuesta inmune potencial o la capacidad de inducir, regular, influir o responder a una respuesta inmune. La modulación incluye cualquier alteración en la expresión y/o función de genes, proteínas y/u otras moléculas en las células inmunes como parte de una respuesta inmune. La modulación de una respuesta inmune o la modulación de la actividad inmunológica incluye, por ejemplo, lo siguiente: eliminación, deleción o secuestro de células inmunes; inducción o generación de células inmunes que pueden modular la capacidad funcional de otras células tales como linfocitos autorreactivos, células presentadoras de antígenos o células inflamatorias; inducción de un estado no respondedor en las células inmunes (es decir, anergia); potenciar o suprimir la actividad o función de las células inmunes, incluyendo, pero no limitado a, alterar el patrón de proteínas expresadas por estas células. Los ejemplos incluyen la producción y/o secreción alterada de ciertas clases de moléculas tales como citoquinas, quimioquinas, factores de crecimiento, factores de transcripción, quinasas, moléculas coestimuladoras u otros receptores de la superficie celular o cualquier combinación de estos eventos moduladores. La modulación se puede evaluar, por ejemplo, mediante una alteración en la expresión de IFN-gamma (interferón gamma) en relación con o en comparación con el control de dominio(s) de IgSF de tipo salvaje o no modificado en un ensayo de células T primarias (véase, Zhao y Ji, Exp Cell Res. 2016 ene 1; 340(1) 132-138).

El término "especie molecular", tal y como se usa en la presente memoria, significa un conjunto de proteínas con una secuencia de aminoácidos primaria idéntica o sustancialmente idéntica. Cada miembro de la superfamilia de inmunoglobulinas (IgSF) de mamíferos define una colección de especies moleculares idénticas o sustancialmente idénticas. Así, por ejemplo, la CD80 humana es un miembro de IgSF y cada molécula de CD80 humana es una especie de CD80. La variación entre moléculas que son de la misma especie molecular puede ocurrir debido a diferencias en la modificación postraduccional tal como glicosilación, fosforilación, ubiquitinación, nitrosilación, metilación, acetilación y lipidación. Además, las diferencias de secuencia menores dentro de una única especie molecular debido a polimorfismos génicos constituyen otra forma de variación dentro de una única especie molecular al igual que las formas truncadas de tipo salvaje de una única especie molecular debido, por ejemplo, a la escisión proteolítica. Una "especie molecular de la superficie celular" es una especie molecular expresada en la superficie de una célula de mamífero. Se dice que dos o más especies diferentes de proteína, cada una de las cuales está presente exclusivamente en una o exclusivamente en la otra (pero no en ambas) de las dos células de mamífero que forman la IS, están en "cis" o "configuración cis" entre sí. Se dice que dos especies diferentes de proteína, la primera de las cuales está presente exclusivamente en una de las dos células de mamífero que forman la IS y la segunda de las cuales está presente exclusivamente en la segunda de las dos células de mamífero que forman la IS, están en "trans" o "configuración trans". Dos especies diferentes de proteína, cada una de las cuales está presente en las dos células de mamífero que forman la IS, están en configuraciones cis y trans en estas células.

El término "unión no competitiva", tal y como se usa en la presente memoria, significa la capacidad de una proteína para unirse específicamente de forma simultánea a al menos dos compañeros de unión afines. En algunas realizaciones, la unión se produce en condiciones de unión específicas. Por lo tanto, la proteína puede unirse al menos a dos compañeros de unión afines diferentes al mismo tiempo, aunque la interacción de la unión no necesita tener la misma duración, de modo que, en algunos casos, la proteína se une específicamente a solo uno de los compañeros de unión afines. En algunas realizaciones, la unión simultánea es tal que la unión de un compañero de unión afín no inhibe sustancialmente la unión simultánea a un segundo compañero de unión afín. En algunas realizaciones, unión no competitiva significa que la unión de un segundo compañero de unión afín a su sitio de unión en la proteína no desplaza la unión de un primer compañero de unión afín a su sitio de unión en la proteína. Los métodos para evaluar la unión no competitiva son bien conocidos en la técnica, tales como el método descrito en Perez de La Lastra et al., Immunology, abril de 1999: 96(4): 663-670. En algunos casos, en las interacciones no competitivas, el primer compañero de unión afín se une específicamente a un sitio de interacción que no se superpone con el sitio de interacción del segundo compañero de unión afín, de modo que la unión del segundo compañero de unión afín no interfiere directamente con la unión del primer compañero de unión afín. Por tanto, cualquier efecto sobre la unión del compañero de unión afín por la unión del segundo compañero de unión afín es a través de un mecanismo distinto de la interferencia directa con la unión del primer compañero de unión afín. Por ejemplo, en el contexto de interacciones enzima-sustrato, un inhibidor no competitivo se une a un sitio diferente al sitio activo de la enzima. La unión no competitiva abarca interacciones de unión no competitivas en las que un segundo compañero de unión afín se une específicamente a un sitio de interacción que no se superpone con la unión del primer compañero de unión afín, sino que se une al segundo sitio de interacción solo cuando el primer sitio de interacción está ocupado por el primer compañero de unión afín.

Los términos "ácido nucleico" y "polinucleótido" se usan indistintamente para hacer referencia a un polímero de residuos de ácido nucleico (p. ej., desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos) en forma monocatenaria o bicatenaria. A menos que se limite específicamente, los términos abarcan ácidos nucleicos que contienen análogos conocidos de los nucleótidos naturales y que tienen propiedades de unión similares y se metabolizan de una manera similar a los nucleótidos de origen natural. A menos que se indique lo contrario, una secuencia de ácido nucleico particular también abarca implícitamente variantes modificadas de manera conservativa de la misma (p. ej., sustituciones de codones degenerados) y secuencias de nucleótidos complementarias, así como la secuencia indicada explícitamente. Específicamente, las sustituciones de codones degenerados se pueden lograr generando secuencias en las que la tercera posición de uno o más codones seleccionados (o todos) está sustituida con residuos de base mixta y/o desoxiinosina. El término ácido nucleico o polinucleótido abarca ADNc o ARNm codificado por un gen.

El término "composición farmacéutica" se refiere a una composición adecuada para uso farmacéutico en un sujeto mamífero, a menudo un ser humano. Una composición farmacéutica comprende típicamente una cantidad eficaz de un agente activo (p. ej., una proteína inmunomoduladora de la invención) y un vehículo, excipiente o diluyente. El vehículo, excipiente o diluyente es típicamente un vehículo, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable, respectivamente.

Los términos "polipéptido" y "proteína" se usan indistintamente en la presente memoria y se refieren a una cadena molecular de dos o más aminoácidos unidos mediante enlaces peptídicos. Los términos no se refieren a una longitud específica del producto. Por tanto, "péptidos" y "oligopéptidos" se incluyen dentro de la definición de polipéptido. Los términos incluyen modificaciones postraduccionales del polipéptido, por ejemplo, glicosilaciones, acetilaciones, fosforilaciones y similares. Los términos también incluyen moléculas en las que se incluyen uno o más análogos de aminoácidos o aminoácidos no canónicos o no naturales que pueden sintetizarse o expresarse de forma recombinante usando técnicas de ingeniería de proteínas conocidas. Además, las proteínas pueden derivatizarse como se describe en la presente memoria mediante técnicas de química orgánica bien conocidas.

El término "ensayo de células T primarias", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a un ensayo in vitro para medir la expresión de interferón-gamma ("IFN-gamma"). Se conoce en la técnica una variedad de dichos ensayos de células T primarias tales como el descrito en el Ejemplo 6. En una realización preferida, el ensayo usado es un ensayo de coinmovilización de anti-CD3. En este ensayo, las células T primarias son estimuladas por anti-CD3 inmovilizado con o sin proteínas recombinantes adicionales. Los sobrenadantes del cultivo se recogen en puntos de tiempo, generalmente 24-72 horas. En otra realización, el ensayo utilizado es una reacción de linfocitos mixtos (MLR). En este ensayo, las células T primarias se simulan con APC alogénica. Los sobrenadantes del cultivo se recogen en puntos de tiempo, generalmente 24-72 horas. Los niveles de IFN-gamma humano se miden en sobrenadantes de cultivo mediante técnicas estándar de ELISA. Los proveedores ofrecen kits comerciales y el ensayo se realiza según las recomendaciones del fabricante.

El término "purificado" aplicado a ácidos nucleicos o proteínas inmunomoduladoras de la invención denota generalmente un ácido nucleico o polipéptido que está sustancialmente libre de otros componentes según se determina mediante técnicas analíticas bien conocidas en la técnica (p. ej., un polipéptido o polinucleótido purificado forma una banda discreta en un gel electroforético, eluato cromatográfico y/o un medio sometido a centrifugación en gradiente de densidad). Por ejemplo, un ácido nucleico o polipéptido que da lugar esencialmente a una banda en un gel electroforético está "purificado". Un ácido nucleico o proteína inmunomoduladora de la invención purificado es al menos aproximadamente un 50 % puro, normalmente al menos aproximadamente un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 99 % o más puro (p. ej., porcentaje en peso o sobre una base molar).

El término "recombinante" indica que el material (p. ej., un ácido nucleico o un polipéptido) ha sido alterado artificialmente (es decir, de forma no natural) por la intervención humana. La alteración se puede realizar en el material dentro o fuera de su entorno o estado natural. Por ejemplo, un "ácido nucleico recombinante" es uno que se prepara recombinando ácidos nucleicos, p. ej., durante la clonación, modificación de afinidad, mezcla de ADN u otros procedimientos biológicos moleculares bien conocidos. Una "molécula de ADN recombinante" se compone de segmentos de ADN unidos entre sí mediante dichas técnicas de biología molecular. El término "proteína recombinante" o "polipéptido recombinante", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a una molécula de proteína (p. ej., una proteína inmunomoduladora) que se expresa usando una molécula de ADN recombinante. Una "célula huésped recombinante" es una célula que contiene y/o expresa un ácido nucleico recombinante. Las señales de control de la transcripción en eucariotas comprenden elementos "promotores" y "potenciadores". Los promotores y potenciadores consisten en series cortas de secuencias de ADN que interaccionan específicamente con proteínas celulares involucradas en la transcripción. Se han aislado elementos promotores y potenciadores de una variedad de fuentes eucariotas que incluyen genes en células de levadura, insectos y mamíferos y virus (elementos de control análogos, es decir, promotores, también se encuentran en procariotas). La selección de un promotor y potenciador particular depende del tipo de célula que se utilizará para expresar la proteína de interés. Los términos "en combinación operativa", "en orden operativo" y "unido operativamente", tal y como se usan en la presente memoria, se refieren a la unión de secuencias de ácido nucleico de tal manera u orientación que se produce una molécula de ácido nucleico capaz de dirigir la transcripción de un gen dado y/o la síntesis de una molécula de proteína deseada. El término también se refiere a la unión de secuencias de aminoácidos de tal manera que se produce y/o transporta una proteína funcional.

El término "vector de expresión recombinante", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a una molécula de ADN que contiene una secuencia codificante deseada (p. ej., un ácido nucleico inmunomodulador) y secuencias de ácido nucleico apropiadas necesarias para la expresión de la secuencia codificante unida operativamente en una célula huésped particular. Las secuencias de ácido nucleico necesarias para la expresión en procariotas incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operadora, un sitio de unión al ribosoma y posiblemente otras secuencias. Se sabe que las células eucariotas utilizan promotores, potenciadores y señales de terminación y poliadenilación. Una secuencia de péptido señal secretora también puede estar codificada, opcionalmente, por el vector de expresión recombinante, unida operativamente a la secuencia codificante de la proteína de fusión recombinante de la invención, de modo que la proteína de fusión expresada pueda ser secretada por la célula huésped recombinante, para un aislamiento más fácil de la proteína de fusión de la célula, si se desea.

El término "identidad de secuencia", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a la identidad de secuencia entre genes o proteínas a nivel de nucleótidos o aminoácidos, respectivamente. La "identidad de secuencia" es una medida de la identidad entre proteínas a nivel de aminoácidos y una medida de la identidad entre ácidos nucleicos a nivel de nucleótidos. La identidad de la secuencia de la proteína se puede determinar comparando la secuencia de aminoácidos en una posición dada en cada secuencia cuando las secuencias están alineadas. De manera similar, la identidad de la secuencia de ácido nucleico se puede determinar comparando la secuencia de nucleótidos en una posición dada en cada secuencia cuando las secuencias están alineadas. Los métodos para el alineamiento de secuencias para comparación son bien conocidos en la técnica, dichos métodos incluyen GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA y TFASTA. El algoritmo BLAST calcula el porcentaje de identidad de secuencia y realiza un análisis estadístico de la similitud entre las dos secuencias. El software para realizar el análisis BLAST está disponible públicamente a través del sitio web del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI).

El término "soluble", tal y como se usa en la presente memoria con referencia a proteínas, significa que la proteína no es una proteína de membrana. En general, una proteína soluble contiene solo el dominio extracelular de un receptor miembro de la familia de IgSF, o una porción del mismo que contiene un dominio o dominios de IgSF o fragmentos de unión específicos del mismo.

El término "especie", tal y como se usa en la presente memoria en el contexto de una secuencia de ácido nucleico o una secuencia de polipéptido, se refiere a una colección idéntica de dichas secuencias. Se considera que las secuencias ligeramente truncadas que difieren (o codifican una diferencia) de la especie de longitud completa en el extremo amino o extremo carboxi en no más de 1, 2 o 3 residuos de aminoácidos son de una única especie. Dichas microheterogeneidades son una característica común de las proteínas fabricadas.

El término "se une específicamente", tal y como se usa en la presente memoria, significa la capacidad de una proteína, en condiciones de unión específicas, para unirse a una proteína diana de manera que su afinidad o avidez sea al menos 10 veces mayor, pero opcionalmente 50, 100, 250 o 500 veces mayor, o incluso al menos 1.000 veces mayor, que la afinidad o avidez promedio de la misma proteína por una colección de péptidos o polipéptidos aleatorios de tamaño estadístico suficiente. Una proteína que se une específicamente no necesita unirse exclusivamente a una única molécula diana (p. ej., su compañero de unión afín), sino que puede unirse específicamente a una molécula no diana debido a la similitud en la conformación estructural entre la diana y la no diana (p. ej., parálogos u ortólogos). Los expertos reconocerán que es posible la unión específica a una molécula que tiene la misma función en una especie de animal diferente (es decir, ortólogo) o a una molécula no diana que tiene un epítopo sustancialmente similar al de la molécula diana (p. ej., parálogo) y no resta valor a la especificidad de la unión que se determina en relación con una colección estadísticamente válida de no dianas únicas (p. ej., polipéptidos aleatorios). Por tanto, un polipéptido con afinidad modificada de la invención puede unirse específicamente a más de una especie distinta de molécula diana debido a la reactividad cruzada. Generalmente, dicha unión específica fuera de la diana se mitiga reduciendo la afinidad o la avidez por dianas no deseadas. Pueden usarse inmunoensayos ELISA en fase sólida o mediciones de Biacore para determinar la unión específica entre dos proteínas. Generalmente, las interacciones entre dos proteínas de unión tienen constantes de disociación (Kd) menores de 1x10-5 M, y a menudo tan bajas como 1x10-12 M. En ciertos aspectos de la presente descripción, las interacciones entre dos proteínas de unión tienen constantes de disociación de 1x10- M, 1x10-7 M, 1x10-8 M, 1x10-9 M, 1x10-10 M o 1x10-11 M.

El término "fragmento de unión específico" o "fragmento", tal y como se usa en la presente memoria en referencia a un dominio de IgSF de tipo salvaje maduro (es decir, sin el péptido señal), significa un polipéptido que es más corto que el dominio de IgSF maduro de longitud completa y que se une específicamente in vitro y/o in vivo al compañero de unión afín nativa del dominio de IgSF de tipo salvaje maduro. En algunas realizaciones, el fragmento de unión específico tiene una longitud de secuencia que es al menos el 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de la secuencia de tipo salvaje madura de longitud completa. Se puede alterar la secuencia del fragmento de unión específico para formar un dominio de IgSF con afinidad modificada de la invención. En algunas realizaciones, el fragmento de unión específico modula la actividad inmunológica de un linfocito.

Los términos "suprimido" o "disminuido", tal y como se usan en la presente memoria, significan disminuir en una cantidad estadísticamente significativa. En algunas realizaciones, la supresión puede ser una disminución de al menos un 10 % y hasta un 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 %.

El término "resto de direccionamiento", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a una composición que está unida covalentemente o no covalentemente a, o encapsula físicamente, un polipéptido que comprende un dominio de IgSF de tipo salvaje y/o con afinidad modificada de la presente invención. El resto de direccionamiento tiene una afinidad de unión específica para un compañero de unión afín deseado, tal como un receptor de la superficie celular o un antígeno tumoral, tal como un antígeno tumoral específico (TSA) o un antígeno asociado a tumor (TAA). Típicamente, el compañero de unión afín deseado se localiza en un tejido o tipo celular específico. Los restos de direccionamiento incluyen: anticuerpos, fragmento de unión a antígeno (Fab), fragmento variable (Fv) que contiene V^h y V^l, el fragmento variable monocatenario (scFv) que contiene V^h y V^l unidos entre sí en una cadena, así como otros fragmentos de la región V de anticuerpo, tales como Fab', F(ab)2, F(ab')2, diacuerpo dsFv, nanocuerpos, receptores solubles, ligandos de receptor, ligandos o receptores madurados por afinidad, así como composiciones de moléculas pequeñas (<500 dalton) (p. ej., composiciones de receptores de unión específicos). Los restos de direccionamiento también pueden unirse covalentemente o no covalentemente a la membrana lipídica de los liposomas que encapsulan un polipéptido inmunomodulador de la presente invención.

Los términos "tratar", "tratamiento" o "terapia" de una enfermedad o trastorno, tal y como se usan en la presente memoria, significan ralentizar, detener o revertir la progresión de la enfermedad o los trastornos, como se pone de manifiesto por la disminución, el cese o la eliminación de los síntomas clínicos o de diagnóstico, por la administración de una proteína inmunomoduladora de la presente invención sola o en combinación con otro compuesto como se describe en la presente memoria. "Tratar", "tratamiento" o "terapia" también significa una disminución de la gravedad de los síntomas en una enfermedad o trastorno agudo o crónico o una disminución en la tasa de recidiva tal como, por ejemplo, en el caso de un curso de enfermedad autoinmune recurrente o remitente. o una disminución de la inflamación en el caso de un aspecto inflamatorio de una enfermedad autoinmune. Tal y como se usan en la presente memoria en el contexto del cáncer, los términos "tratamiento" o "inhibir", "que inhibe " o "inhibición" del cáncer se refieren al menos a uno de: una disminución estadísticamente significativa en la tasa de crecimiento tumoral, un cese del crecimiento tumoral, o una reducción en el tamaño, masa, actividad metabólica o volumen del tumor, según se mide por criterios estándar tales como, pero no limitado a, los Criterios de Evaluación de la Respuesta para Tumores Sólidos (RECIST), o un aumento estadísticamente significativo en la supervivencia libre de progresión (PFS) o supervivencia global (OS). "Prevenir", "profilaxis" o "prevención" de una enfermedad o trastorno, tal y como se usa en el contexto de esta invención, se refiere a la administración de una proteína inmunomoduladora de la presente invención, ya sea sola o en combinación con otro compuesto, para prevenir la aparición o inicio de una enfermedad o trastorno o de algunos o todos los síntomas de una enfermedad o trastorno o disminuir la probabilidad del inicio de una enfermedad o trastorno.

El término "antígeno específico de tumor" o "TSA", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a un antígeno que está presente principalmente en células tumorales de un sujeto mamífero, pero que no se encuentra generalmente en células normales del sujeto mamífero. No es necesario que un antígeno específico de tumor sea exclusivo de las células tumorales, pero el porcentaje de células de un mamífero en particular que tiene el antígeno específico de tumor es lo suficientemente alto o los niveles del antígeno específico de tumor en la superficie del tumor son lo suficientemente altos como para que pueda ser diana de terapias antitumorales, tales como polipéptidos inmunomoduladores de la invención, y proporcionar prevención o tratamiento del mamífero de los efectos del tumor. En algunas realizaciones, en una muestra estadística aleatoria de células de un mamífero con un tumor, al menos el 50 % de las células que presentan un TSA son cancerosas. En otras realizaciones, al menos el 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de las células que presentan un TSA son cancerosas.

Tal y como se usa en la presente memoria, "cribado" se refiere a la identificación o selección de una molécula o parte de la misma de una colección o biblioteca de moléculas y/o partes de la misma, basándose en la determinación de la actividad o propiedad de una molécula o parte de la misma. El cribado se puede realizar de una variedad de formas, incluyendo, por ejemplo, mediante ensayos que evalúan la unión directa (p. ej., afinidad de unión) de la molécula a una proteína diana o mediante ensayos funcionales que evalúan la modulación de una actividad de una proteína diana.

El término "de tipo salvaje" o "natural" o "nativo" o "parental", tal y como se usa en la presente memoria, se usa en conexión con materiales biológicos tales como moléculas de ácido nucleico, proteínas, miembros de IgSF, células huésped y similares, se refiere a aquellos que se encuentran en la naturaleza y no están modificados por la intervención humana. Un dominio de IgSF de tipo salvaje es un tipo de dominio de IgSF sin modificación de la afinidad. En algunas realizaciones de proteínas inmunomoduladoras de la invención, una IgSF sin modificación de la afinidad es un dominio de IgSF de tipo salvaje.

II. Proteínas inmunomoduladoras con afinidad modificada

La presente invención proporciona proteínas inmunomoduladoras como se define en las reivindicaciones adjuntas que tienen utilidad terapéutica al modular la actividad inmunológica en un mamífero con una enfermedad o trastorno en el que la modulación de la respuesta del sistema inmune es beneficiosa.

Los miembros de la familia de IgSF incluidos dentro del alcance de las proteínas inmunomoduladoras de la presente invención excluyen los anticuerpos (es decir, inmunoglobulinas) tales como los que son mamíferos o pueden ser de origen mamífero. Por tanto, la presente invención se refiere a dominios de IgSF que no son inmunoglobulinas (es decir, no anticuerpos). Los miembros de la familia de IgSF de mamíferos de tipo salvaje que no son inmunoglobulinas (es decir, anticuerpos) son conocidos en la técnica al igual que sus secuencias nucleicas y de aminoácidos. Todos los miembros de la familia de IgSF de mamíferos que no son inmunoglobulinas están incluidos dentro del alcance de la invención.

En algunas realizaciones, los miembros de la familia de IgSF que no son inmunoglobulinas, y los correspondientes dominios de IgSF presentes en ellos, son de origen de ratón, rata, mono cynomolgus o humano. En algunas realizaciones, los miembros de la familia de IgSF son miembros de al menos o exactamente una, dos, tres, cuatro, cinco o más subfamilias de IgSF tales como: familia de proteínas reguladoras de señales (SIRP), familia semejante al receptor de activación expresado en células mieloides (TREML), familia de moléculas de adhesión celular relacionadas con antígenos carcinoembrionarios (CEACAM), familia de lectinas similares a Ig de unión a ácido siálico (SIGLEC), familia de butirofilinas, familia B7, familia CD28, familia que contiene dominios de conjunto V y de inmunoglobulina (VSIG), familia de dominios de conjunto V transmembrana (VSTM), familia de complejos mayores de histocompatibilidad (MHC), familia de moléculas de activación linfocítica de señalización (SLAM), receptor semejante a inmunoglobulina leucocitaria (LIR), familia de nectina (Nec), familia semejante a nectina (NECL), familia relacionada con el receptor de poliovirus (PVR), familia de receptores desencadenantes de citotoxicidad natural (NCR), o familia de receptores semejantes a inmunoglobulina de células asesinas (KIR).

En algunas realizaciones, los miembros de la familia de IgSF que no son inmunoglobulinas, y los correspondientes dominios de IgSF presentes en ellos, de una proteína inmunomoduladora de la invención, tienen afinidad modificada en comparación con un miembro de IgSF de mamífero. En algunas realizaciones, el miembro de IgSF de mamífero es uno de los miembros de IgSF o comprende un dominio de IgSF de uno de los miembros de IgSF como se indica en la Tabla 1 que incluye cualquier ortólogo de mamífero del mismo. Los ortólogos son genes de diferentes especies que evolucionaron a partir de un gen ancestral común por especiación. Normalmente, los ortólogos retienen la misma función en el curso de la evolución.

La primera columna de la Tabla 1 proporciona el nombre y, opcionalmente, el nombre de algunos sinónimos posibles para ese miembro de IgSF en particular. La segunda columna proporciona el identificador de proteínas de la base de datos UniProtKB, una base de datos disponible públicamente accesible a través de internet en uniprot.org. Universal Protein Resource (UniProt) es un recurso completo para la secuencia de proteínas y los datos de anotación. Las bases de datos de UniProt incluyen la base de conocimientos de UniProt (UniProtKB). UniProt es una colaboración entre el Instituto Europeo de Bioinformática (EMBL-EBI), el Instituto Suizo de Bioinformática SIB y el Recurso de Información de Proteínas (PIR) y está financiada principalmente por una subvención de los Institutos Nacionales de Salud de EE. UU. (NIH). La tercera columna proporciona la región donde se encuentra el dominio de IgSF indicado. La región se especifica como un rango donde el dominio incluye los residuos que definen el rango. La columna 3 también indica la clase de dominio de IgSF para la región de IgSF especificada. La columna 4 proporciona la región donde se encuentran los dominios adicionales indicados (péptido señal, S; dominio extracelular, E; dominio transmembrana, T; dominio citoplásmico, C). La columna 5 indica para algunos de los miembros de IgSF enumerados, algunos de sus compañeros de unión a la superficie celular afines.

Típicamente, el dominio de IgSF con afinidad modificada de las realizaciones proporcionadas es un dominio de IgSF con afinidad modificada humano o murino.

En algunas realizaciones, las proteínas inmunomoduladoras de la presente invención comprenden al menos un dominio de IgSF de mamífero con afinidad modificada. El dominio de IgSF con afinidad modificada puede modificarse en su afinidad para que se una específicamente a múltiples (2, 3, 4 o más) compañeros de unión afines (también denominados "ligando de contraestructura"). Un dominio de IgSF puede modificarse en su afinidad para aumentar o disminuir independientemente la afinidad o avidez de unión específica a cada uno de los múltiples compañeros de unión afines a los que se une. Mediante este mecanismo, la unión específica a cada uno de los múltiples compañeros de unión afines se ajusta independientemente a una afinidad o avidez particular.

En algunas realizaciones, el compañero de unión afín de un dominio de IgSF es al menos dos o tres de los compañeros de unión afines del dominio de IgSF de tipo salvaje, tales como los enumerados en la Tabla 1. La secuencia del dominio de IgSF, tal como un dominio de IgSF de mamífero se modifica en su afinidad alterando su secuencia con al menos una sustitución, y puede alterarse con al menos una adición o deleción. La alteración de la secuencia puede ocurrir en el sitio de unión para el compañero de unión afín o en un sitio alostérico. En algunas realizaciones, un ácido nucleico que codifica un dominio de IgSF, tal como un dominio de IgSF de mamífero, se modifica en su afinidad mediante sustitución, adición, deleción o combinaciones de los mismos, de sitios de nucleótidos específicos y predeterminados para producir un ácido nucleico de la invención. En algunas realizaciones contrastantes, un ácido nucleico que codifica un dominio de IgSF, tal como un dominio de IgSF de mamífero, se modifica en su afinidad mediante sustitución, adición, deleción o combinaciones de los mismos, en sitios aleatorios dentro del ácido nucleico. En algunas realizaciones, se utiliza una combinación de los dos enfoques (predeterminado y aleatorio). En algunas realizaciones, el diseño de los dominios de IgSF con afinidad modificada de la presente invención se realiza in silico.

Según la invención reivindicada, el dominio de IgSF con afinidad modificada contiene una o más sustituciones de aminoácidos (alternativamente, "mutaciones" o "reemplazos") con respecto a un polipéptido de tipo salvaje o no modificado o una porción del mismo que contiene un dominio del a superfamilia de inmunoglobulinas (IgSF), tal como un dominio IgV o un dominio IgC o un fragmento de unión específico del dominio IgV o el dominio IgC. En algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora comprende un dominio de IgSF con afinidad modificada que contiene un dominio IgV o un dominio IgC o fragmentos de unión específicos del mismo en el que al menos una de las sustituciones de aminoácidos está en el dominio IgV o dominio IgC o en un fragmento de unión específico del mismo. En algunas realizaciones, en virtud de la actividad de unión o afinidad alterada, el dominio IgV o el dominio IgC es un dominio de IgSF con afinidad modificada.

En algunas realizaciones, el dominio de IgSF, tal como un dominio de IgSF de mamífero, se modifica en su afinidad en la secuencia con al menos una pero no más de un total de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 sustituciones, adiciones, deleciones de aminoácidos o combinaciones de las mismas. En algunas realizaciones, el dominio de IgSF, tal como un dominio de IgSF de mamífero, se modifica en su afinidad en la secuencia con al menos una pero no más de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 o 2 sustituciones de aminoácidos. En algunas realizaciones, las sustituciones son sustituciones conservativas. En algunas realizaciones, las sustituciones no son conservativas. En algunas realizaciones, las sustituciones son una combinación de sustituciones conservativas y no conservativas. En algunas realizaciones, la modificación en la secuencia se realiza en el sitio de unión del dominio de IgSF para su compañero de unión afín.

En algunas realizaciones, el dominio de IgSF de tipo salvaje o no modificado es un dominio de IgSF de mamífero. En algunas realizaciones, el dominio de IgSF de tipo salvaje o no modificado puede ser un dominio de IgSF que incluye, pero no se limita a, humano, ratón, mono cynomolgus o rata. En algunas realizaciones, el dominio de IgSF de tipo salvaje o no modificado es humano.

En algunas realizaciones, el dominio de IgSF de tipo salvaje o no modificado es un dominio de IgSF o un fragmento de unión específico del mismo contenido en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1 o una forma madura de la misma que carece de la secuencia señal, una secuencia de aminoácidos que exhibe al menos un 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1 o una forma madura de la misma, o es una porción de la misma que contiene un dominio IgV o un dominio IgC o fragmentos de unión específicos del mismo.

En algunas realizaciones, el dominio de IgSF de tipo salvaje o no modificado es o comprende un dominio extracelular de un miembro de la familia de IgSF o una porción del mismo que contiene un dominio de IgSF (p. ej., dominio IgV o dominio IgC). En la presente memoria también se describen dominios de IgSF no modificados o de tipo salvaje que comprenden la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las SEQ ID NO: 28-54, o un ortólogo de la misma. Por ejemplo, los dominios de IgSF no modificados o de tipo salvaje que comprenden (i) la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las SEQ ID NO: 28-54, (ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 28- 54, o (iii) es un fragmento de unión específico de la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las SEQ ID NO: 28-54 o un fragmento de unión específico de una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 28-54 que comprende un dominio IgV o un dominio IgC.

En algunas realizaciones, el dominio extracelular de un dominio de IgSF no modificado o de tipo salvaje puede comprender más de un dominio de IgSF, por ejemplo, un dominio IgV y un dominio IgC. Sin embargo, el dominio de IgSF con afinidad modificada no necesita comprender tanto el dominio IgV como el dominio IgC. En algunas realizaciones, el dominio de IgSF con afinidad modificada comprende o consiste esencialmente en el dominio IgV o un fragmento de unión específico del mismo. En algunas realizaciones, el dominio de IgSF con afinidad modificada comprende o consiste esencialmente en el dominio IgC o un fragmento de unión específico del mismo. En algunas realizaciones, el dominio de IgSF con afinidad modificada comprende el dominio IgV o un fragmento de unión específico del mismo, y el dominio IgC o un fragmento de unión específico del mismo.

En algunas realizaciones, la una o más sustituciones de aminoácidos del dominio de IgSF con afinidad modificada puede estar localizado en uno cualquiera o más de los dominios polipeptídicos de IgSF. Por ejemplo, en algunas realizaciones, una o más sustituciones de aminoácidos están localizadas en el dominio extracelular del polipéptido de IgSF. En algunas realizaciones, una o más sustituciones de aminoácidos están localizadas en el dominio IgV o fragmento de unión específico del dominio IgV. En algunas realizaciones, una o más sustituciones de aminoácidos están localizadas en el dominio IgC o fragmento de unión específico del dominio IgC.

En algunas realizaciones, al menos un dominio de IgSF, tal como un dominio de IgSF de mamífero, de una proteína inmunomoduladora proporcionada en la presente memoria se modifica independientemente en su afinidad en la secuencia para tener al menos un 99 %, 98 %, 97 %, 96 %, 95 %, 94 % , 93 %, 92 %, 91 %, 90 %, 89 %, 88 %, 87 %, 86 % u 85 % de identidad de secuencia con un dominio de IgSF de tipo salvaje o no modificado o fragmento de unión específico del mismo contenido en una proteína de IgSF de tipo salvaje o no modificada, tal como, pero no limitado a, las descritas en la Tabla 1 como SEQ ID NO: 1.

En algunas realizaciones, el dominio de IgSF de una proteína inmunomoduladora proporcionada en la presente memoria es un fragmento de unión específico de un dominio de IgSF de tipo salvaje o no modificado contenido en una proteína de IgSF de tipo salvaje o no modificada, tal como, pero no limitado a, los descritos en la Tabla 1 en la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, el fragmento de unión específico puede tener una longitud de aminoácidos de al menos 50 aminoácidos, tal como al menos 60, 70, 80, 90, 100 o 110 aminoácidos. En algunas realizaciones, el fragmento de unión específico del dominio IgV contiene una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de la longitud del dominio IgV de tipo salvaje o no modificado. En algunas realizaciones, el fragmento de unión específico del dominio IgC comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de la longitud del dominio IgC de tipo salvaje o no modificado. En algunas realizaciones, el fragmento de unión específico modula la actividad inmunológica. En realizaciones más específicas, el fragmento de unión específico de un dominio de IgSF aumenta la actividad inmunológica. En realizaciones alternativas, el fragmento de unión específico disminuye la actividad inmunológica.

Para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de ácido nucleico o de dos aminoácidos, las secuencias se alinean con fines de comparación óptimos (p. ej., se pueden introducir huecos en la secuencia de una primera secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico para un alineamiento óptimo con una segunda secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico). A continuación, se comparan los residuos de aminoácidos o nucleótidos en las posiciones de aminoácidos o posiciones de nucleótidos correspondientes. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo residuo de aminoácido o nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, % de identidad = no. de posiciones idénticas/no. total de posiciones (p. ej., posiciones superpuestas) x 100). En una realización, las dos secuencias tienen la misma longitud. Se pueden alinear manualmente las secuencias y contar el número de ácidos nucleicos o aminoácidos idénticos. Alternativamente, el alineamiento de dos secuencias para la determinación del porcentaje de identidad se puede lograr usando un algoritmo matemático. Dicho algoritmo está incorporado en los programas NBLAST y XBLAST. Las búsquedas de nucleótidos BLAST se pueden realizar con el programa NBLAST, puntuación = 100, longitud de palabra = 12, para obtener secuencias de nucleótidos homólogas a las moléculas de ácido nucleico de la invención. Las búsquedas de proteínas BLAST se pueden realizar con el programa XBLAST, puntuación = 50, longitud de palabra = 3 para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a una molécula de proteína de la invención. Para obtener alineamientos con huecos con fines de comparación, se puede utilizar Gapped BLAST. Alternativamente, se puede usar PSI-Blast para realizar una búsqueda iterada que detecta relaciones distantes entre moléculas. Cuando se utilizan los programas NBLAST, XBLAST y Gapped BLAST, se pueden utilizar los parámetros por defecto de los programas respectivos, tales como los disponibles en el sitio web de NCBI. Alternativamente, la identidad de secuencia se puede calcular después de que las secuencias se hayan alineado, p. ej., por el programa BLAST en la base de datos NCBI. Generalmente, se pueden utilizar para el alineamiento los ajustes por defecto con respecto, p. ej., a, la "matriz de puntuación" y la "penalización por huecos". En el contexto de la presente invención, se pueden emplear los ajustes por defecto de BLASTN y PSI BLAST NCBI.

Según la invención reivindicada, la proteína inmunomoduladora contiene al menos un dominio de IgSF con afinidad modificada. En algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora contiene al menos un dominio con afinidad modificada y además contiene al menos un dominio de IgSF sin afinidad modificada (p. ej., dominio de IgSF no modificado o de tipo salvaje). En algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora contiene al menos dos dominios con afinidad modificada. En algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora puede contener una pluralidad de dominios de IgSF sin afinidad modificada y/o dominios de IgSF con afinidad modificada tal como 1,2, 3, 4, 5 o 6 dominios de IgSF sin afinidad modificada y/o de IgSF con afinidad modificada.

En algunas realizaciones, al menos un dominio de IgSF sin afinidad modificada y/o un dominio de IgSF con afinidad modificada presente en una proteína inmunomoduladora proporcionada en la presente memoria se une específicamente al menos a una especie molecular de la superficie celular expresada en células de mamífero que forman la sinapsis inmunológica (IS). Por supuesto, en algunas realizaciones, una proteína inmunomoduladora proporcionada en la presente memoria comprende una pluralidad de dominios de IgSF sin afinidad modificada y dominios de IgSF con afinidad modificada tal como 1,2, 3, 4, 5 o 6 dominios de IgSF sin afinidad modificada y dominios de IgSF con afinidad modificada. Uno o más de estos dominios de IgSF sin afinidad modificada y/o dominios de IgSF con afinidad modificada pueden unirse específicamente independientemente a una o ambas de las células de mamífero que forman la IS.

Según la invención reivindicada, la especie molecular de la superficie celular a la que se une específicamente el dominio de IgSF con afinidad modificada es el compañero de unión afín del miembro de la familia de IgSF de tipo salvaje o del dominio de IgSF de tipo salvaje que ha sido modificado en su afinidad. En algunas realizaciones, la especie molecular de la superficie celular es un miembro de IgSF de mamífero. En algunas realizaciones, la especie molecular de la superficie celular es un miembro de IgSF humano. Según la invención reivindicada, las especies moleculares de la superficie celular serán los compañeros de unión afines de la superficie celular como se indica en la Tabla 1. En la presente memoria también se describe una especie molecular de la superficie celular que es una proteína viral, tal como una proteína de poliovirus, en superficie celular de una célula de mamífero tal como una célula humana.

En algunas realizaciones, al menos un dominio de IgSF sin afinidad modificada y/o con afinidad modificada de una proteína inmunomoduladora proporcionada en la presente memoria se une al menos a dos o tres especies moleculares de la superficie celular presentes en células de mamífero que forman la IS. Las especies moleculares de la superficie celular a las que se unen específicamente los dominios de IgSF sin afinidad modificada y/o los dominios de IgSF con afinidad modificada de la invención pueden estar exclusivamente en una u otra de las dos células de mamífero (es decir, en configuración cis) que forman la IS o, alternativamente, la especie molecular de la superficie celular puede estar presente en ambas.

En algunas realizaciones, el dominio de IgSF con afinidad modificada se une específicamente al menos a dos especies moleculares de la superficie celular en donde una de las especies moleculares está presente en una de las dos células de mamífero que forman la IS y la otra especie molecular está presente en la segunda de las dos células de mamíferos que forman la IS. En dichas realizaciones, la especie molecular de la superficie celular no está necesariamente presente únicamente en una u otra de las dos células de mamífero que forman la IS (es decir, en una configuración trans) aunque en algunas realizaciones sí lo está. Por lo tanto, las realizaciones proporcionadas en la presente memoria incluyen aquellas en las que cada especie molecular de la superficie celular está exclusivamente en una u otra de las células de mamífero que forman la IS (configuración cis), así como aquellas en las que la especie molecular de la superficie celular a la que se une cada IgSF con afinidad modificada está presente en ambas células de mamífero que forman la IS (es decir, configuración cis y trans).

Los expertos reconocerán que las células presentadoras de antígenos (APC) y las células tumorales forman una sinapsis inmunológica con los linfocitos. Por tanto, en algunas realizaciones, al menos un dominio de IgSF sin afinidad modificada y/o al menos un dominio de IgSF con afinidad modificada de la proteína inmunomoduladora se une específicamente solo a especies moleculares de la superficie celular presentes en una célula cancerosa, en donde la célula cancerosa junto con linfocito forma la IS. En otras realizaciones, al menos un dominio de IgSF sin afinidad modificada y/o al menos un dominio de IgSF con afinidad modificada de la proteína inmunomoduladora se une específicamente solo a especies moleculares de la superficie celular presentes en un linfocito, en donde el linfocito junto con una APC o célula tumoral forma la IS. En algunas realizaciones, el dominio de IgSF sin afinidad modificada y/o el dominio de IgSF con afinidad modificada se une a especies moleculares de la superficie celular presentes tanto en la célula diana (o APC) como en el linfocito que forman la IS.

Las proteínas inmunomoduladoras de la invención reivindicada comprenden al menos un dominio de IgSF con afinidad modificada con una secuencia de aminoácidos que difiere de un dominio de IgSF de tipo salvaje o no modificado (p. ej., un dominio de IgSF de mamífero) de manera que su afinidad de unión (o avidez si es multimérico u otra estructura relevante), en condiciones de unión específicas, para al menos dos de sus compañeros de unión afines se incrementa en relación con el control de dominio de IgSF de tipo salvaje inalterado o no modificado. En algunas realizaciones, un dominio de IgSF con afinidad modificada tiene una afinidad de unión para un compañero de unión afín que difiere de la de una secuencia de control de IgSF de tipo salvaje o no modificado según se determina, por ejemplo, mediante inmunoensayos ELISA en fase sólida, citometría de flujo o ensayos Biacore. El dominio de IgSF de la invención reivindicada tiene una mayor afinidad de unión para dos o más compañeros de unión afines. En algunas realizaciones, el dominio de IgSF con afinidad modificada tiene una afinidad de unión disminuida para uno o más compañeros de unión afines, en relación con un dominio de IgSF de tipo salvaje o no modificado. En algunas realizaciones, el compañero de unión afín puede ser una proteína de mamífero, tal como una proteína humana o una proteína murina.

Las afinidades de unión para cada uno de los compañeros de unión afines son independientes; es decir, en algunas realizaciones, un dominio de IgSF con afinidad modificada tiene una afinidad de unión aumentada para dos o tres compañeros de unión afines diferentes, y una afinidad de unión disminuida por uno, dos o tres de los compañeros de unión afines diferentes, en relación con un polipéptido ICOSL de tipo salvaje o no modificado.

En algunas realizaciones de una proteína inmunomoduladora proporcionada en la presente memoria, la afinidad o avidez de unión del dominio de IgSF con afinidad modificada aumenta al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 100 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 %, 1.000 %, 5.000 % o 10.000 % con respecto al dominio de IgSF de control de tipo salvaje o no modificado. En algunas realizaciones, el aumento en la afinidad de unión en relación con el dominio de IgSF de tipo salvaje o no modificado es más de 1,2 veces, 1,5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces 40 veces o 50 veces.

En algunas realizaciones, la afinidad o avidez de unión disminuye al menos un 10 % y hasta un 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o hasta un 90 % en relación con el dominio de IgSF de control de tipo salvaje o no modificado. En algunas realizaciones, la disminución de la afinidad de unión en relación con el dominio de IgSF de tipo salvaje o no modificado es más de 1,2 veces, 1,5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces 40 veces o 50 veces.

En algunas realizaciones, la afinidad de unión específica de un dominio de IgSF con afinidad modificada a un compañero de unión afín puede ser de al menos 1x10-5 M, 1x10-6 M, 1x10-7 M, 1x10-8 M, 1x10-9 M, 1x10-10 M o 1x10-11 M, o 1x10-12 M.

En algunas realizaciones, una proteína inmunomoduladora proporcionada comprende al menos dos dominios de IgSF en los que al menos uno de los dominios de IgSF tiene la afinidad modificada mientras que en algunas realizaciones ambos están tienen la afinidad modificada, y en los que al menos uno de los dominios de IgSF con afinidad modificada tiene una afinidad (o avidez) aumentada para su compañero de unión afín y al menos un dominio de IgSF con afinidad modificada tiene una afinidad (o avidez) disminuida para su compañero de unión afín.

En algunas realizaciones, un dominio de IgSF que de otro modo se une a múltiples especies moleculares de la superficie celular se modifica en su afinidad de manera que sustancialmente ya no se une específicamente a una de sus especies moleculares afines de la superficie celular. Por tanto, en estas realizaciones, la unión específica a una de sus especies moleculares afines de la superficie celular se reduce a una unión específica de no más del 10 % del nivel de tipo salvaje y, a menudo, no más del 7 %, 5 %, 3 %, 1 %, o ninguna unión específica detectable o estadísticamente significativa.

En estas realizaciones, un sitio de unión específico en un dominio de IgSF de mamífero se inactiva o se inactiva sustancialmente con respecto al menos a una de las especies moleculares de la superficie celular. En la presente memoria también se describe, si un dominio de IgSF de tipo salvaje se une específicamente a exactamente dos especies moleculares de la superficie celular, entonces puede modificarse su afinidad para que se una específicamente a exactamente una especie molecular de la superficie celular (por lo que la determinación del número de dominios de IgSF con afinidad modificada ignora cualquier secuencia fraccionaria sustancialmente inmunológica inactiva del mismo). Y, si un dominio de IgSF de tipo salvaje se une específicamente a exactamente tres especies moleculares de la superficie celular, entonces, en algunas realizaciones, se modifica su afinidad para que se una específicamente a exactamente dos especies moleculares de la superficie celular. El dominio de IgSF con afinidad modificada para que ya no se una sustancialmente específicamente a una de sus especies moleculares afines de la superficie celular puede ser un dominio de IgSF que, de otro modo, se une específicamente de forma competitiva o no competitiva a sus especies moleculares de la superficie celular. Los expertos apreciarán que un dominio de IgSF de tipo salvaje que se une competitivamente a dos compañeros de unión afines puede, no obstante, inactivarse con respecto a exactamente uno de ellos si, por ejemplo, sus sitios de unión no son precisamente coextensivos, sino que simplemente se superponen de manera que la unión específica de uno inhibe la unión del otro compañero de unión afín y, sin embargo, ambos sitios de unión competitivos son distintos.

Los dominios de IgSF sin afinidad modificada y/o los dominios de IgSF con afinidad modificada de las proteínas inmunomoduladoras proporcionadas pueden en algunas realizaciones unirse específicamente de forma competitiva a sus especies moleculares afines de la superficie celular. En otras realizaciones, los dominios de IgSF sin afinidad modificada y/o los dominios de IgSF con afinidad modificada de una proteína inmunomoduladora proporcionada en la presente memoria se unen específicamente de forma no competitiva a sus especies moleculares afines de la superficie celular. Cualquier número de dominios de IgSF sin afinidad modificada y/o dominios de IgSF con afinidad modificada presentes en una proteína inmunomoduladora proporcionada en la presente memoria puede unirse específicamente de forma competitiva o no competitiva, siempre que al menos un dominio de la superfamilia de inmunoglobulinas (IgSF) CD80 con afinidad modificada se una específicamente de forma no competitiva a los al menos dos compañeros de unión afines.

En algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora proporcionada en la presente memoria comprende al menos dos dominios de IgSF sin afinidad modificada, o al menos un dominio de IgSF sin afinidad modificada y al menos un dominio de IgSF con afinidad modificada, o al menos dos dominios de IgSF con afinidad modificada en donde un dominio de IgSF se une específicamente de manera competitiva y un segundo dominio de IgSF se une de manera no competitiva a sus especies moleculares afines de la superficie celular. Más generalmente, una proteína inmunomoduladora proporcionada en la presente memoria puede comprender 1, 2, 3, 4, 5 o 6 dominios de IgSF sin afinidad modificada y/o dominios de IgSF con afinidad modificada con unión competitiva o 1, 2, 3, 4, 5 o 6 con unión no competitiva o cualquier combinación de los mismos. Por lo tanto, una proteína inmunomoduladora proporcionada en la presente memoria puede tener el número de dominios de IgSF de unión competitiva y no competitiva, respectivamente, de: 1 y 0, 1 y 1, 1 y 2, 1 y 3, 2 y 0, 2 y 1,2 y 2, 2 y 3, 3 y 0, 3 y 1,3 y 2, 3 y 3, 4 y 0, 4 y 1, y 4 y 2.

No es necesario que una pluralidad de proteínas inmunomoduladoras de dominios de IgSF sin afinidad modificada y con afinidad modificada proporcionadas en la presente memoria estén unidas covalentemente directamente entre sí. En algunas realizaciones, un tramo intermedio de uno o más residuos de aminoácidos enlaza indirectamente covalentemente los dominios de IgSF sin afinidad modificada y/o con afinidad modificada entre sí. El enlace puede ser a través de los residuos N-terminal a C-terminal.

En algunas realizaciones, el enlace se puede realizar a través de las cadenas laterales de residuos de aminoácidos que no están localizados en el extremo N-terminal o C-terminal del dominio de IgSF sin afinidad modificada o con afinidad modificada. Por tanto, los enlaces se pueden realizar mediante residuos de aminoácidos internos o terminales o combinaciones de los mismos.

Los "enlazadores peptídicos" que unen los dominios de IgSF sin afinidad modificada y/o con afinidad modificada pueden tener una longitud de un solo residuo de aminoácido o mayor. En algunas realizaciones, el enlazador peptídico tiene una longitud de al menos un residuo de aminoácido, pero no más de 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 residuos de aminoácidos. En algunas realizaciones, el enlazador es (en código de aminoácidos de una letra): GGGGS ("4GS") o multímeros del enlazador 4GS, tales como repeticiones de 2, 3, 4 o 5 enlazadores 4GS. En otras realizaciones opcionales, se interponen una serie de residuos de alanina entre los enlazadores 4GS y una Fc a la que se une covalentemente la proteína inmunomoduladora. En algunas realizaciones, el número de residuos de alanina en cada serie es: 2, 3, 4, 5 o 6 alaninas.

A. Dominios de IgSF con afinidad modificada ejemplares

Según la invención reivindicada, el dominio de IgSF con afinidad modificada tiene una o más sustituciones de aminoácidos en un dominio de IgSF de una proteína de IgSF de tipo salvaje o no modificada, tal como se muestra en la Tabla 1 anterior. La una o más sustituciones de aminoácidos pueden estar en el ectodominio del dominio de IgSF de tipo salvaje o no modificado, tal como el dominio extracelular. En algunas realizaciones, la una o más sustituciones de aminoácidos están en el dominio IgV o en un fragmento de unión específico del mismo. En algunas realizaciones, la una o más sustituciones de aminoácidos están en el dominio IgC o en un fragmento de unión específico del mismo. En algunas realizaciones del dominio de IgSF con afinidad modificada, algunas de la una o más sustituciones de aminoácidos están en el dominio IgV o en un fragmento de unión específico del mismo, y algunas de la una o más sustituciones de aminoácidos están en el dominio IgC o en un fragmento de unión específico del mismo.

En algunas realizaciones, el dominio de IgSF con afinidad modificada tiene hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 sustituciones de aminoácidos. Las sustituciones pueden estar en el dominio IgV o en el dominio IgC. En algunas realizaciones, el dominio de IgSF con afinidad modificada tiene hasta 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 sustituciones de aminoácidos en el dominio IgV o fragmento de unión específico del mismo. En algunas realizaciones, el dominio de IgSF con afinidad modificada tiene hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 sustituciones de aminoácidos en el dominio IgC o fragmento de unión específico del mismo. En algunas realizaciones, el dominio de IgSF con afinidad modificada tiene al menos aproximadamente un 85 %, 86 %, 86 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con el dominio de IgSF de tipo salvaje o no modificado o fragmento de unión específico del mismo, tal como el dominio de IgSF contenido en la proteína de IgSF mostrada en la SEQ ID NO: 1.

Según la invención reivindicada, el dominio de IgSF con afinidad modificada contiene una o más sustituciones de aminoácidos en un dominio de IgSF de tipo salvaje o no modificado de un miembro de la familia B7 de IgSF. Según la invención reivindicada, el miembro de la familia B7 de IgSF es CD80. En algunas realizaciones, el dominio de IgSF con afinidad modificada tiene al menos aproximadamente un 85 %, 86 %, 86 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con el dominio de IgSF de tipo salvaje o no modificado o fragmento de unión específico del mismo, tal como el dominio de IgSF contenido en la proteína de IgSF mostrada en la SEQ ID NO: 1. Los dominios de IgSF con afinidad modificada ejemplares de CD80 se muestran en la Tabla 2. Los dominios de IgSF con afinidad modificada ejemplares de ICOSL se muestran en la Tabla 3. Los dominios de IgSF con afinidad modificada ejemplares de CD86 se muestran en la Tabla 4.

En la presente memoria también se describen dominios de IgSF con afinidad modificada que contienen una o más sustituciones de aminoácidos en un dominio de IgSF de tipo salvaje o no modificado de un miembro de la familia NkP30. El dominio de IgSF con afinidad modificada puede tener al menos aproximadamente un 85 %, 86 %, 86 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % de identidad de secuencia con el dominio de IgSF de tipo salvaje o no modificado o fragmento de unión específico del mismo, tal como el dominio de IgSF contenido en la proteína de IgSF mostrada en la SEQ ID NO: 27. La Tabla 5 proporciona dominios de IgSF de NkP30 con afinidad modificada ejemplares .

B. Tipos de proteína inmunomoduladora con afinidad modificada

1. Dominio con afinidad modificada de unión dual

En algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora proporcionada en la presente memoria puede comprender la secuencia de al menos un dominio de IgSF de un miembro de la familia de IgSF que no es una inmunoglobulina (es decir, no es un anticuerpo) de mamífero de tipo salvaje, en donde al menos un dominio de IgSF en la misma tiene la afinidad modificada (Proteínas inmunomoduladoras de "Tipo I"). Según la invención, el al menos un dominio de IgSF modificado se une específicamente de forma no competitiva a los al menos dos compañeros de unión afines.

En algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora comprende al menos un dominio de la superfamilia de inmunoglobulinas (IgSF) con afinidad modificada que no es una inmunoglobulina que se une específicamente de forma no competitiva al menos a dos compañeros de unión afines. En la presente memoria también se describen dominios con afinidad modificada que exhiben una unión aumentada al menos a uno de los compañeros de unión afines en comparación con el dominio de IgSF de tipo salvaje o no modificado. Según la invención reivindicada, el dominio con afinidad modificada exhibe una unión aumentada al menos a dos compañeros de unión afines diferentes.

Según la invención reivindicada, el miembro de IgSF no modificado o de tipo salvaje, tal como el miembro de IgSF de mamífero, es uno de los miembros de IgSF o comprende un dominio de IgSF de uno de los miembros de IgSF como se indica en la Tabla 1, incluyendo cualquier ortólogo de mamífero del mismo.

En algunas realizaciones, los dominios de IgSF adicionales presentes en la proteína inmunomoduladora de Tipo I pueden no tener la afinidad modificada y/o tener la afinidad modificada, tales como al menos dos, tres, cuatro o cinco dominios de IgSF y, en algunas realizaciones, exactamente dos, tres, cuatro o cinco dominios de IgSF.

En algunas realizaciones, una proteína inmunomoduladora de Tipo I de la presente memoria que comprende al menos un dominio de la superfamilia de inmunoglobulinas (IgSF) con afinidad modificada que no es una inmunoglobulina que comprende una o más sustituciones de aminoácidos en un dominio de IgSF de tipo salvaje o no modificado, en el que el dominio de IgSF con afinidad modificada tiene 1) unión aumentada al menos a dos compañeros de unión afines en comparación con el dominio de IgSF de tipo salvaje o no modificado; y 2) el al menos un dominio de IgSF con afinidad modificada se une específicamente de forma no competitiva a los al menos dos compañeros de unión afines. Según la invención reivindicada, el dominio de IgSF con afinidad modificada de la proteína inmunomoduladora de Tipo I tiene una unión aumentada al menos a dos compañeros de unión afines. En la presente memoria también se describen dominios de IgSF con afinidad modificada de proteínas inmunomoduladoras de Tipo I con unión disminuida al menos a dos compañeros de unión afines. El dominio de IgSF con afinidad modificada de la proteína inmunomoduladora de Tipo I puede tener una unión aumentada al menos a un compañero de unión afín y una unión disminuida al menos a otro compañero de unión afín diferente.

En algunas realizaciones, los dos compañeros de unión afines se expresan en la superficie de al menos dos células diferentes, tales como dos células de mamífero diferentes. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un compañero de unión afín se expresa en un linfocito y otro compañero de unión afín se expresa en células presentadoras de antígeno. En algunas realizaciones, los dos compañeros de unión afines se expresan en el mismo tipo de célula, tal como la misma célula inmune. En alguna realización, la proteína inmunomoduladora de Tipo I es capaz de modular la actividad inmunológica de una o más de las células inmunes, tal como la actividad inmunológica de un linfocito, por ejemplo, una célula T. En algunas realizaciones, se incrementa la actividad inmunológica. En algunas realizaciones, se disminuye la actividad inmunológica.

En algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora comprende o consiste esencialmente en solo un dominio de IgSF con afinidad modificada, que se une de manera no competitiva a los al menos dos compañeros de unión afines. En algunas realizaciones, el dominio con afinidad modificada es un dominio IgV con afinidad modificada. En algunas realizaciones, el dominio con afinidad modificada es un dominio IgC con afinidad modificada.

Según la invención reivindicada, una proteína inmunomoduladora de Tipo I proporcionada en la presente memoria comprende un dominio de IgSF de CD80 con afinidad modificada que se une específicamente de forma no competitiva a CD28 y PDL1. En algunas realizaciones, el dominio de IgSF de CD80 con afinidad modificada es un dominio IgV. En algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora comprende además un dominio de IgSF adicional sin afinidad modificada.

2. Proteínas inmunomoduladoras apiladas o multidominio

En algunas realizaciones de la presente invención, una proteína inmunomoduladora comprende una combinación (una "combinación de tipo no salvaje") y/o disposición (una "disposición de tipo no salvaje" o "permutación de tipo no salvaje") de secuencias de dominio de IgSF con afinidad modificada y/o sin afinidad modificada que no se encuentran en miembros de la familia de IgSF de tipo salvaje (proteínas inmunomoduladoras de "Tipo II"). Las secuencias de los dominios de IgSF que no tienen la afinidad modificada (por ejemplo, de tipo salvaje) o que tienen la afinidad modificada pueden ser de mamífero, tal como de ratón, rata, mono cynomolgus o de origen humano, o combinaciones de los mismos. El número de dichos dominios de IgSF sin afinidad modificada o con afinidad modificada presentes en estas realizaciones de una proteína inmunomoduladora de Tipo II (ya sean combinaciones de tipo no salvaje o disposiciones de tipo no salvaje) es al menos 2, 3, 4 o 5 y en algunas realizaciones exactamente 2, 3, 4 o 5 dominios de IgSF (por lo que la determinación del número de dominios de IgSF con afinidad modificada ignora cualquier secuencia fraccionaria de unión no específica de las mismas y/o secuencias fraccionarias sustancialmente inmunológicamente inactivas de las mismas).

Según la invención reivindicada, las proteínas inmunomoduladoras de Tipo II de la invención comprenden una combinación de dominios de IgSF de tipo no salvaje en donde los dominios de IgSF comprenden un dominio de IgSF de un miembro de la familia de IgSF de los enumerados en la Tabla 1. Por lo tanto, en algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora puede contener un primer y segundo dominio de IgSF que puede ser cada uno un dominio de IgSF con afinidad modificada que contiene una o más sustituciones de aminoácidos en comparación con un dominio de IgSF contenido en un miembro de la familia de IgSF mostrado en la Tabla 1.

En algunas realizaciones, los dominios de IgSF son cada uno independientemente un dominio de IgSF con afinidad modificada o sin afinidad modificada contenido en un miembro de la familia de IgSF de una familia seleccionada de la familia de proteínas reguladoras de señales (SIRP), familia semejantes al receptor de activación expresado en células mieloides (TREML), familia de moléculas de adhesión celular relacionadas con antígenos carcinoembrionarios (CEACAM), familia de lectinas similares a Ig de unión a ácido siálico (SIGLEC), familia de butirofilinas, familia B7, familia CD28, familia que contiene dominios de conjunto V y de inmunoglobulina (VSIG), familia de dominios de conjunto V transmembrana (VSTM), familia de complejos mayores de histocompatibilidad (MHC), familia de moléculas de activación linfocítica de señalización (SLAM), receptor semejante a inmunoglobulina leucocitaria (LIR), familia de nectina (Nec), familia semejante a nectina (NECL), familia relacionada con el receptor de poliovirus (PVR), familia de receptores desencadenantes de citotoxicidad natural (NCR), familia de inmunoglobulina y mucina de células T (TIM) o familia de receptores semejantes a inmunoglobulina de células asesinas (KIR). En algunas realizaciones, cada uno de los dominios de IgSF se deriva independientemente de una proteína de IgSF seleccionada del grupo que consiste en CD80 (B7-1), CD86 (B7-2), CD274 (PD-L1, B7-H1), PDCD1 LG2 (PD-L2, CD273), ICOSLG (B7RP1, CD275, ICOSL, B7-H2), CD276 (B7-H3), VTCN1 (B7-H4), CD28, CTLA4, PDCD1 (PD-1), ICOS, BTLA (CD272), CD4, CD8A (CD8-alfa), CD8B (CD8-beta), LAG3, HAVCR2 (TIM-3), CEACAM1, TIGIT, PVR (CD155), PVRL2 (CD112), CD226, CD2, CD160, CD200, CD200R1 (CD200R ) y NC R3 (NKp30).

En algunas realizaciones, los dominios de IgSF contienen independientemente una o más sustituciones de aminoácidos en comparación con un dominio de IgSF en un dominio de IgSF de tipo salvaje o no modificado, tal como un dominio de IgSF en un miembro de la familia de IgSF mostrado en la Tabla 1. Según la invención reivindicada, el dominio de IgSF con afinidad modificada comprende al menos un 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % , 98 %, 99 % o más de identidad de secuencia con un dominio de IgSF de tipo salvaje o no modificado o un fragmento de unión específico del mismo contenido en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, el dominio de IgSF de tipo salvaje o no modificado es un dominio IgV o un dominio IgC, tal como un dominio IgC1 o IgC2. En algunas realizaciones, el dominio de IgSF con afinidad modificada es un dominio IgV o un dominio IgC con afinidad modificada.

En la presente memoria también se describe la proteína inmunomoduladora de Tipo II de la invención, en la que el número de dominios de IgSF es al menos 2 en donde el número de dominios de IgSF con afinidad modificada y el número de dominios de IgSF sin afinidad modificada es cada uno independientemente al menos: 0, 1, 2, 3, 4, 5 o 6. Por lo tanto, el número de dominios de IgSF con afinidad modificada y el número de dominios de IgSF sin afinidad modificada, respectivamente, (dominio de IgSF con afinidad modificada: dominio de IgSF sin afinidad modificada), puede ser exactamente o al menos: 2:0 (afinidad modificada: tipo salvaje), 0:2, 2:1, 1: 2, 2:2, 2:3, 3:2, 2:4, 4:2, 1:1 , 1:3, 3:1, 1:4, 4:1, 1:5 o 5:1.

En algunas realizaciones de una proteína inmunomoduladora de Tipo II, al menos dos de los dominios de IgSF con afinidad modificada y/o sin afinidad modificada son dominios de IgSF idénticos.

En algunas realizaciones, una proteína inmunomoduladora de Tipo II de la presente invención comprende al menos dos dominios de IgSF con afinidad modificada y/o sin afinidad modificada de un solo miembro de IgSF, pero en una disposición de tipo no salvaje (alternativamente, "permutación"). Un ejemplo ilustrativo de una disposición o permutación de tipo no salvaje es una proteína inmunomoduladora de la presente invención que comprende un orden de tipo no salvaje de secuencias de dominio de IgSF con afinidad modificada y/o sin afinidad modificada en relación con las que se encuentran en el miembro de la familia de IgSF de mamífero de tipo salvaje cuyas secuencias de dominio de IgSF sirvieron como fuente de los dominios de IgSF sin afinidad modificada y/o con afinidad modificada. Los miembros de IgSF de tipo salvaje de mamífero en la realización anterior incluyen específicamente los enumerados en la Tabla 1. Por tanto, en un ejemplo, si el miembro de la familia de tipo salvaje comprende un dominio IgC1 próximo al dominio transmembrana de una proteína de la superficie celular y un dominio IgV distal al dominio transmembrana, entonces una proteína inmunomoduladora de la presente invención puede comprender un IgV próximo y un IgC1 distal al dominio transmembrana, aunque en una forma sin afinidad modificada y/o con afinidad modificada. La presencia, en una proteína inmunomoduladora de la presente invención, tanto de combinaciones de tipo no salvaje como de disposiciones de tipo no salvaje de dominios de IgSF sin afinidad modificada y/o con afinidad modificada también está dentro del alcance de la presente invención.

En algunas realizaciones de una proteína inmunomoduladora de Tipo II, los dominios de IgSF sin afinidad modificada y/o con afinidad modificada son dominios de IgSF no idénticos (es decir, diferentes). Los dominios de IgSF con afinidad modificada no idénticos se unen específicamente, en condiciones de unión específicas, a diferentes compañeros de unión afines y son "no idénticos" independientemente de si los dominios de IgSF de tipo salvaje a partir de los cuales se prepararon por ingeniería eran o no los mismos. Así, por ejemplo, una combinación de tipo no salvaje de al menos dos dominios de IgSF no idénticos en una proteína inmunomoduladora de la presente invención puede comprender al menos una secuencia de dominio de IgSF cuyo origen es de y único de un miembro de la familia de IgSF, y al menos una de una segunda secuencia de dominio de IgSF cuyo origen es de y único de otro miembro de la familia de IgSF, en donde los dominios de IgSF de la proteína inmunomoduladora están en forma sin afinidad modificada y/o con afinidad modificada. Sin embargo, en realizaciones alternativas, los dos dominios de IgSF no idénticos se originan a partir de la misma secuencia del dominio de IgSF, pero al menos uno tiene la afinidad modificada de modo que se unen específicamente a diferentes compañeros de unión afines.

En algunas realizaciones, el número de dominios de IgSF sin afinidad modificada y/o con afinidad modificada no idénticos presentes en una proteína inmunomoduladora de la invención es al menos 2, 3, 4 o 5 y en algunas realizaciones exactamente 2, 3, 4, o 5 dominios de IgSF sin afinidad modificada y/o con afinidad modificada no idénticos. En algunas realizaciones, los dominios de IgSF no idénticos son combinaciones de al menos dos miembros de IgSF indicados en la Tabla 1, y en algunas realizaciones al menos 3 o 4 miembros de IgSF de la Tabla 1.

En la presente memoria también se describe una proteína inmunomoduladora de Tipo II de la invención que comprende un dominio de IgSF NKp30 con afinidad modificada y un dominio de IgSF ICOSLG con afinidad modificada, un dominio de IgSF CD80 con afinidad modificada o un dominio de IgSF CD86 con afinidad modificada. En algunas realizaciones, una proteína inmunomoduladora de Tipo II comprende un dominio de IgSF con afinidad modificada de al menos dos miembros de la familia B7. En algunas realizaciones, las proteínas inmunomoduladoras comprenden al menos dos dominios con afinidad modificada de un dominio de IgSF CD80 con afinidad modificada, un dominio de IgSF ICOSL con afinidad modificada o un dominio de IgSF CD86 con afinidad modificada o fragmentos de unión específicos del mismo. En algunas realizaciones, los dominios con afinidad modificada se unen mediante al menos o exactamente 1, 2, 3, 4 dominios G4S.

No es necesario que una pluralidad de dominios de IgSF sin afinidad modificada y/o con afinidad modificada en una cadena polipeptídica de proteína inmunomoduladora apilada estén unidos covalentemente directamente entre sí. En algunas realizaciones, un tramo intermedio de uno o más residuos de aminoácidos une indirectamente covalentemente los dominios de IgSF sin afinidad modificada y/o con afinidad modificada entre sí. La unión puede ser a través de los residuos N-terminal a C-terminal.

En algunas realizaciones, la unión se puede realizar a través de las cadenas laterales de los residuos de aminoácidos que no están localizados en el extremo N-terminal o C-terminal del dominio de IgSF sin afinidad modificada y/o con afinidad modificada. Por tanto, las uniones se pueden realizar mediante residuos de aminoácidos internos o terminales o combinaciones de los mismos.

En algunas realizaciones, los "enlazadores peptídicos'' que enlazan los dominios de IgSF sin afinidad modificada y/o con afinidad modificada pueden tener una longitud de un residuo de aminoácido único o mayor. En algunas realizaciones, el enlazador peptídico tiene una longitud de al menos un residuo de aminoácido, pero no más de 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 residuos de aminoácidos. En algunas realizaciones, el enlazador es (en código de aminoácidos de una letra): GGGGS ("4GS") o multímeros del enlazador 4GS, tales como repeticiones de 2, 3, 4 o 5 enlazadores 4GS. En realizaciones opcionales adicionales, se interpone una serie de residuos de alanina entre un enlazador peptídico (tal como un enlazador 4GS o un multímero del mismo) y un Fc al que se une covalentemente la proteína inmunomoduladora. En algunas realizaciones, el número de residuos de alanina en cada serie es: 2, 3, 4, 5 o 6 alaninas.

En algunas realizaciones, los dominios de IgSF sin afinidad modificada y/o con afinidad modificada se unen mediante "enlazadores de péptidos de tipo salvaje" insertados en el extremo N-terminal y/o C-terminal del primer y/o segundo dominio de IgSF sin afinidad modificada y/o con afinidad modificada. En algunas realizaciones, está presente un enlazador peptídico líder insertado en el extremo N-terminal del primer dominio de IgSF y/o una primera secuencia final insertada en el extremo C-terminal del primer dominio de IgSF sin afinidad modificada y/o con afinidad modificada. En algunas realizaciones, está presente un segundo enlazador peptídico líder insertado en el extremo N del segundo dominio de IgSF y/o una segunda secuencia final insertada en el extremo C del segundo dominio de IgSF sin afinidad modificada y/o con afinidad modificada. Cuando el primer y segundo dominios de IgSF sin afinidad modificada y/o con afinidad modificada se derivan de la misma proteína parental y están conectados en la misma orientación, los enlazadores peptídicos de tipo salvaje entre el primer y segundo dominios de IgSF sin afinidad modificada y/o con afinidad modificada no están duplicados. Por ejemplo, cuando el primer enlazador peptídico de tipo salvaje final y el segundo enlazador peptídico de tipo salvaje líder son los mismos, la proteína inmunomoduladora de Tipo II no comprende ni el primer enlazador peptídico de tipo salvaje final ni el segundo enlazador peptídico de tipo salvaje líder.

En algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora de Tipo II comprende un primer enlazador peptídico de tipo salvaje líder insertado en el extremo N-terminal del primer dominio de IgSF sin afinidad modificada y/o con afinidad modificada, en donde el primer enlazador peptídico de tipo salvaje líder comprende en al menos 5 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o más) aminoácidos consecutivos de la secuencia intermedia en la proteína de tipo salvaje de la que se deriva el primer dominio de IgSF sin afinidad modificada y/o con afinidad modificada entre el dominio de IgSF parental y el dominio inmediatamente anterior (tal como un péptido señal o un dominio de IgSF). En algunas realizaciones, el primer enlazador peptídico de tipo salvaje líder comprende la secuencia intermedia completa en la proteína de tipo salvaje a partir de la cual se deriva el primer dominio de IgSF sin afinidad modificada y/o con afinidad modificada entre el dominio de IgSF parental y el dominio inmediatamente anterior (tal como un péptido señal o un dominio de IgSF).

En algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora de Tipo II comprende además un primer enlazador peptídico de tipo salvaje final insertado en el extremo C-terminal del primer dominio de IgSF sin afinidad modificada y/o con afinidad modificada, en donde el primer enlazador peptídico de tipo salvaje final comprende al menos 5 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o más) aminoácidos consecutivos de la secuencia intermedia en la proteína de tipo salvaje de la que se deriva el primer dominio de IgSF sin afinidad modificada y/o con afinidad modificada entre el dominio de IgSF parental y el dominio inmediatamente siguiente (tal como un dominio de IgSF o un dominio transmembrana). En algunas realizaciones, el primer enlazador peptídico de tipo salvaje final comprende la secuencia intermedia completa en la proteína de tipo salvaje de la que se deriva el primer dominio de IgSF sin afinidad modificada y/o con afinidad modificada entre el dominio de IgSF parental y el dominio inmediatamente siguiente (tal como un dominio de IgSF o un dominio transmembrana).

En algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora de Tipo II comprende además un segundo enlazador peptídico de tipo salvaje líder insertado en el extremo N-terminal del segundo dominio de IgSF sin afinidad modificada y/o con afinidad modificada, en donde el segundo enlazador peptídico de tipo salvaje líder comprende al menos 5 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o más) aminoácidos consecutivos de la secuencia intermedia en la proteína de tipo salvaje de la que se deriva el segundo dominio de IgSF sin afinidad modificada y/o con afinidad modificada entre el dominio de IgSF parental y el dominio inmediatamente anterior (tal como un péptido señal o un dominio de IgSF). En algunas realizaciones, el segundo enlazador peptídico de tipo salvaje líder comprende la secuencia intermedia completa en la proteína de tipo salvaje de la que se deriva el segundo dominio de IgSF sin afinidad modificada y/o con afinidad modificada entre el dominio de IgSF parental y el dominio inmediatamente anterior (tal como un péptido señal o un dominio de IgSF).

En algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora de Tipo II comprende además un segundo enlazador peptídico de tipo salvaje final insertado en el extremo C-terminal del segundo dominio de IgSF sin afinidad modificada y/o con afinidad modificada, en donde el segundo enlazador peptídico de tipo salvaje final comprende al menos 5 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o más) aminoácidos consecutivos de la secuencia intermedia en la proteína de tipo salvaje de la que se deriva el segundo dominio de IgSF sin afinidad modificada y/o con afinidad modificada entre el dominio de IgSF parental y el dominio inmediatamente siguiente (tal como un dominio de IgSF o un dominio transmembrana). En algunas realizaciones, el segundo enlazador peptídico de tipo salvaje final comprende la secuencia intermedia completa en la proteína de tipo salvaje de la que se deriva el segundo dominio de IgSF sin afinidad modificada y/o con afinidad modificada entre el dominio de IgSF parental y el dominio inmediatamente siguiente (tal como un dominio de IgSF o un dominio transmembrana).

En la SEQ ID NO: 231 y SEQ ID NO: 232 se muestra un ejemplo de una secuencia líder y una secuencia final para una proteína de Tipo II que contiene un dominio de IgSF de CD80. Un ejemplo de una secuencia líder y una secuencia final para una proteína de Tipo II que contiene un dominio de IgSF de ICOSL se muestra en la SEQ ID NO: 233 y 234. Un ejemplo de una secuencia líder y una secuencia final para una proteína de Tipo II que contiene un dominio de IgSF de CD86 se muestra en cualquiera de las SEQ ID NO: 236-238. Un ejemplo de una secuencia enlazadora de tipo salvaje para una proteína de Tipo II que contiene un dominio de IgSF de NKp30 se muestra en la SEQ ID NO: 235.

C. Formato de la proteína inmunomoduladora con afinidad modificada

En algunas realizaciones, una proteína inmunomoduladora proporcionada en la presente memoria está en forma soluble. Los expertos apreciarán que las proteínas de la superficie celular tienen típicamente un dominio intracelular, transmembrana y extracelular (ECD) y que se puede preparar una forma soluble de dichas proteínas usando el dominio extracelular o una subsecuencia inmunológicamente activa del mismo. Por tanto, en algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora que contiene un dominio de IgSF con afinidad modificada carece de un dominio transmembrana o de una parte del dominio transmembrana. En algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora que contiene un dominio de IgSF con afinidad modificada carece del dominio intracelular (citoplásmico) o de una porción del dominio intracelular. En algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora contiene un dominio de IgSF con afinidad modificada que solo contiene el dominio ECD o una porción del mismo que contiene un dominio IgV y/o dominio IgC o fragmentos de unión específicos del mismo.

En algunas realizaciones, la forma soluble de una proteína inmunomoduladora de la presente invención está unida covalentemente, directa o indirectamente, a un Fc de inmunoglobulina. Generalmente, el Fc está unido covalentemente al extremo amino de la proteína inmunomoduladora. El Fc de inmunoglobulina es en algunas realizaciones de una inmunoglobulina de clase IgG de mamífero, tal como IgG1 o IgG2. En realizaciones particulares, el Fc será Fc de IgG1 o IgG2 humana. Los expertos en la técnica apreciarán que se pueden realizar pequeños cambios, tales como 1,2, 3 o 4, sustituciones, deleciones, adiciones de aminoácidos o combinaciones de las mismas en un Fc sin cambiar sustancialmente sus propiedades farmacocinéticas. Dichos cambios pueden realizarse, por ejemplo, para ayudar en la capacidad de fabricación o para aumentar, suprimir o eliminar la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos. El término "Fc", tal y como se usa en la presente memoria, pretende abarcar dichas moléculas.

En algunas realizaciones, el Fc es Fc murino o humano. En algunas realizaciones, el Fc se deriva de IgG1, tal como IgG1 humana. En algunas realizaciones, el Fc comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 226 o una secuencia de aminoácidos que exhibe al menos un 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 226. En algunas realizaciones, el Fc se deriva de IgG2, tal como IgG2 humana. En algunas realizaciones, el Fc comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 227 o una secuencia de aminoácidos que exhibe al menos un 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 227.

En algunas realizaciones, pueden introducirse una o más modificaciones de aminoácidos en la región Fc de una fusión IgSF-variante de Fc proporcionada en la presente memoria, generando así una variante de la región Fc. En algunas realizaciones, la variante de la región Fc tiene una función efectora disminuida. Hay muchos ejemplos de cambios o mutaciones en las secuencias de Fc que pueden alterar la función efectora. Por ejemplo, WO 00/42072, WO2006019447 y Shields et al. J Biol. Chem. 9 (2 ): 6591-6604 (2001) describen variantes de Fc ejemplares con unión mejorada o disminuida a los FcR.

En algunas realizaciones, la región Fc que posee algunas, pero no todas las funciones efectoras, lo que la convierte en un candidato deseable para aplicaciones en las que es importante la semivida de la fusión Fc in v ivo , sin embargo, ciertas funciones efectoras (tales como CDC y ADCC) son innecesarias o perjudiciales. Se pueden realizar ensayos de citotoxicidad in v itro y/o in v ivo para confirmar la reducción/depleción de las actividades CDC y/o ADCC. Por ejemplo, se pueden realizar ensayos de unión al receptor de Fc (FcR) para asegurar que la fusión de la variante Fc-ICOSL carece de unión a FcyR (por lo tanto, probablemente carece de actividad ADCC), pero conserva la capacidad de unión a FcRn. Las células primarias para mediar ADCC, las células NK, solo expresan FcyRIII, mientras que los monocitos expresan FcyRI, FcyRII y FcyRIII. La expresión de FcR en células hematopoyéticas se resume en la Tabla 3 en la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991). Los ejemplos no limitantes de ensayos in v itro para evaluar la actividad ADCC de una molécula de interés se describen en la Pat. de EE. UU. No. 5.500.362 (véase, p. ej., Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'l Acad Sci. USA 83:7059-7063 (1986)) y Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA Unidos 82:1499-1502 (1985); Pat. de EE. UU. No. 5.821.337 (véase, Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med.

166:1351-1361 (1987)). Alternativamente, se pueden emplear métodos de ensayo no radiactivos (véase, por ejemplo, ensayo de citotoxicidad no radiactivo ACTI™ para citometría de flujo (CellTechnology, Inc. Mountain View, Calif.; y ensayo de citotoxicidad no radiactivo CytoTox 96™ (Promega, Madison, Wis.). Las células efectoras útiles para dichos ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y células asesinas naturales (NK). Alternativamente, o adicionalmente, se puede evaluar la actividad ADCC de la molécula de interés in vivo, p. ej., en un modelo animal tal como el descrito en Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998). También se pueden llevar a cabo ensayos de unión de C1q para confirmar que la fusión de la variante Fc-ICOSL es incapaz de unirse a C1q y, por tanto, carece de actividad c Dc . Véase, p. ej., ELISA de unión a C1q y C3c en WO 2006/029879 y WO 2005/100402. Para evaluar la activación del complemento, se puede realizar un ensayo de CDC (véase, por ejemplo, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M. S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003); y Cragg, M. S. y M. J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)). Las determinaciones de la unión a FcRn y del aclaramiento/semivida in v ivo también se pueden realizar usando métodos conocidos en la técnica (véase, p. ej., Petkova, S. B. et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)).

Las fusiones de Fc con función efectora reducida incluyen aquellas con sustitución de uno o más de los residuos de la región Fc 238, 265, 269, 270, 297, 327 y 329 por la numeración EU (Pat. de EE. UU. No. 6.737.056). Dichos mutantes de Fc incluyen mutantes de Fc con sustituciones en dos o más de las posiciones de aminoácidos 265, 269, 270, 297 y 327 por numeración EU, incluyendo el mutante de Fc llamado "DANA" con sustitución de los residuos 265 y 297 por alanina (Pat. de EE. UU. No. 7.332.581).

Se describen ciertas variantes de Fc con unión mejorada o disminuida a FcR. (Véase, p. ej., la Pat. de EE. UU. No.

6.737.056; WO 2004/056312, WO2006019447 y Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2):6591-6604 (2001).)

En algunas realizaciones, se realizan alteraciones en la región Fc que dan como resultado una unión de C1q y/o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) disminuida, p. ej., como se describe en la Pat. de EE. UU. No.

6.194.551, WO 99/51642, e Idusogie et al., J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).

En la presente memoria se describe una fusión ICOSL-variante de Fc que comprende una región Fc variante que comprende una o más sustituciones de aminoácidos que aumentan la semivida y/o mejoran la unión al receptor de Fc neonatal (FcRn). Los anticuerpos con semividas aumentadas y unión mejorada a FcRn se describen en US2005/0014934A1 (Hinton et al.). Esos anticuerpos comprenden una región Fc con una o más sustituciones en la misma que mejoran la unión de la región Fc a FcRn. Dichas variantes de Fc incluyen aquellas con sustituciones en uno o más de los residuos de la región Fc: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311,312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 o 434 por numeración EU, p. ej., sustitución del residuo de la región Fc 434 (Pat. de EE. UU. No.7.371.826).

Véase también Duncan y Winter, Nature 322: 738-40 (1988).); Pat. de EE. UU. No. 5,648.260; Pat. de EE. UU. No.

5.624.821; y WO 94/29351 con respecto a otros ejemplos de variantes de la región Fc.

En algunas realizaciones, el Fc es una variante de IgG1 que contiene al menos una sustitución de aminoácido que es N82G por la numeración de la SEQ ID NO: 226 (correspondiente a N297G por la numeración de EU). En algunas realizaciones, la región Fc variante comprende además una modificación de aminoácido C5S. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la región Fc variante comprende las siguientes modificaciones de aminoácidos: C5S y N82G.

En algunas realizaciones, el enlace covalente indirecto de un Fc a una proteína inmunomoduladora de la presente invención puede realizarse mediante, por ejemplo, un único aminoácido o mediante un enlazador peptídico (con una longitud de dos o más residuos de aminoácidos). Además, las cadenas polipeptídicas simples de dichas moléculas de fusión Fc pueden dimerizarse a través de una variedad de medios que incluyen a través de enlaces disulfuro entre cadenas polipeptídicas. Las formas dimerizadas de las proteínas inmunomoduladoras de la invención pueden comprender dos especies idénticas o sustancialmente idénticas de polipéptidos de la invención (homodímeros), o especies separadas de cadenas polipeptídicas de la invención (heterodímeros). Se apreciará que pueden existir microheterogeneidades incluso entre la misma especie de cadena polipeptídica debido a diferencias menores en los residuos amino-terminales y carboxi-terminales por diferencias menores en la expresión o proteólisis, o por diferencias resultantes de la modificación postraduccional. No obstante, se considera que dichas cadenas sustancialmente idénticas son homodiméricas. Las proteínas inmunomoduladoras derivatizadas están dentro del alcance de la presente invención y a menudo se preparan para, por ejemplo, proporcionar propiedades físico-químicas o farmacocinéticas alteradas.

En realizaciones incluso más específicas, las realizaciones específicas precedentes están unidas covalentemente a un Fc, tal como un dominio de IgG1 o IgG2 humana. En una realización específica adicional, el Fc se une a una proteína inmunomoduladora a través de uno o más dominios G4S, a menudo con al menos o exactamente uno, dos, tres, cuatro o cinco residuos de alanina sucesivos unidos directamente al Fc y a la proteína inmunomoduladora.

En otras realizaciones, una proteína inmunomoduladora proporcionada en la presente memoria se une a una membrana liposomal. Se conocen en la técnica una variedad de métodos para unir proteínas de forma covalente o no covalente a la superficie de un liposoma, tales como conjugación de amida o conjugación de disulfuro/tioéter.

D. Actividad funcional de las proteínas inmunomoduladoras

En algunas realizaciones, las proteínas inmunomoduladoras que contienen un dominio de IgSF con afinidad modificada proporcionadas en la presente memoria (fragmentos de unión de longitud completa y/o específicos o construcciones apiladas o de fusión de los mismos) exhiben actividad inmunomoduladora para modular la activación de las células T. Funcionalmente, e independientemente de si la unión específica a su compañero de unión afín está aumentada o disminuida, las proteínas inmunomoduladoras proporcionadas en la presente memoria actúan para potenciar o suprimir la actividad inmunológica de los linfocitos en relación con los linfocitos bajo los controles de ensayo apropiados, tal como en un ensayo MLR. En algunas realizaciones, una proteína inmunomoduladora proporcionada en la presente memoria comprende al menos dos dominios de IgSF con afinidad modificada en donde al menos uno de los dominios de IgSF con afinidad modificada actúa para potenciar la actividad inmunológica y al menos un dominio de IgSF con afinidad modificada actúa para suprimir la actividad inmunológica.

En algunas realizaciones, las proteínas inmunomoduladoras proporcionadas modulan la expresión de IFN-gamma en un ensayo de células T primarias en relación con un control de dominio de IgSF de tipo salvaje o no modificado. En algunos casos, la modulación de la expresión de IFN-gamma puede aumentar o disminuir la expresión de IFN-gamma en relación con el control. Los ensayos para determinar la unión específica y la expresión de IFN-gamma son bien conocidos en la técnica e incluyen los ensayos de MLR (reacción de linfocitos mixtos) que miden los niveles de citoquinas de interferón gamma en sobrenadantes de cultivo (Wang et al., Cancer Immunol Res. 2014 sep: 2(9): 846-56), ensayo de estimulación de células T por SEB (enterotoxina estafilocócica B) (Wang et al., Cancer Immunol Res.2014 sep: 2(9): 846-56) y ensayos de estimulación de células T con anti-CD3 (Li y Kurlander, J Transl Med. 2010: 8: 104).

En algunas realizaciones, una proteína inmunomoduladora que contiene un dominio con afinidad modificada puede en algunas realizaciones aumentar o, en realizaciones alternativas, disminuir la expresión de IFN-gamma (interferóngamma) en un ensayo de células T primarias en relación con un control de dominio de IgSF de tipo salvaje. En algunas realizaciones de los polipéptidos proporcionados que contienen un dominio de IgSF con afinidad modificada, el polipéptido puede aumentar la expresión de IFN-gamma y, en realizaciones alternativas, disminuir la expresión de IFN-gamma en un ensayo de células T primarias en relación con un control de ICOSL de tipo salvaje. En algunas realizaciones de los polipéptidos proporcionados que contienen múltiples dominios de IgSF con afinidad modificada, el polipéptido puede aumentar la expresión de IFN-gamma y, en realizaciones alternativas, disminuir la expresión de IFN-gamma en un ensayo de células T primarias en relación con un control de dominio de IgSF de tipo salvaje.

Los expertos reconocerán que el formato del ensayo de células T primarias usado para determinar un aumento en la expresión de IFN-gamma puede diferir del empleado para ensayar una disminución en la expresión de IFN-gamma. Al analizar la capacidad de una proteína inmunomoduladora para disminuir la expresión de IFN-gamma en un ensayo de células T primarias, se puede usar un ensayo de reacción de linfocitos mixtos (MLR) como se describe en el Ejemplo 6. En algunos casos, puede emplearse una forma soluble de la proteína inmunomoduladora para determinar la capacidad del dominio de IgSF con afinidad modificada para antagonizar y de ese modo disminuir la expresión de IFN-gamma en un MLR como se describe igualmente en el Ejemplo 6.

Alternativamente, al analizar la capacidad de una proteína inmunomoduladora para aumentar la expresión de IFN-gamma en un ensayo de células T primarias, se puede usar un ensayo de coinmovilización como se describe en el Ejemplo 6. En un ensayo de coinmovilización, una señal de TCR, proporcionada en algunas realizaciones por el anticuerpo anti-CD3, se usa junto con una proteína inmunomoduladora coinmovilizada que contiene un dominio de IgSF con afinidad modificada para determinar la capacidad de aumentar la expresión de IFN-gamma en relación con un control de dominio de IgSF. En algunos casos, se puede emplear una forma soluble de una proteína inmunomoduladora que está multimerizada hasta el grado de proporcionar unión multivalente para determinar la capacidad de la proteína inmunomoduladora para agonizar y, por lo tanto, aumentar la expresión de IFN-gamma en un MLR como se describe igualmente en el Ejemplo. 6.

El uso de controles apropiados es conocido por los expertos en la técnica, sin embargo, en las realizaciones mencionadas anteriormente, el control típicamente implica el uso del dominio de IgSF no modificado, tal como un tipo salvaje de isoforma de IgSF nativa de la misma especie de mamífero de la que se derivó o desarrolló el dominio de IgSF. Independientemente de si la afinidad de unión a uno o ambos compañeros de unión afines aumenta o disminuye, una proteína inmunomoduladora particular en algunas realizaciones aumentará la expresión de IFN-gamma y, en realizaciones alternativas, disminuirá la expresión de IFN-gamma en un ensayo de células T primarias en relación con un control de dominio de IgSF de tipo salvaje.

En algunas realizaciones, una proteína inmunomoduladora que contiene un dominio de IgSF con afinidad modificada aumenta la expresión de IFN-gamma (es decir, la expresión de proteína) en relación con un control de dominio de IgSF de tipo salvaje o no modificado en al menos un: 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o más. En otras realizaciones, una proteína inmunomoduladora que contiene un dominio de IgSF con afinidad modificada, disminuye la expresión de IFN-gamma (es decir, la expresión de proteína) en relación con un control de dominio de IgSF de tipo salvaje o no modificado en al menos un: 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o más. En algunas realizaciones, una potenciación de la actividad inmunológica puede ser un aumento de al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 75 %, 100 %, 200 %, 300 %, 400 % o 500 % mayor que un valor de control distinto de cero, tal como en un ensayo MLR. Wang et al., Cancer Immunol Res. 2014 sep: 2(9): 846-56. En algunas realizaciones, la supresión de la actividad inmunológica puede ser una disminución de al menos un 10 % y hasta un 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 %.

III. Ácidos nucleicos y métodos para preparar proteínas

La presente invención proporciona ácidos nucleicos aislados o recombinantes denominados colectivamente "ácidos nucleicos de la invención" que codifican cualquiera de las diversas realizaciones de las proteínas inmunomoduladoras (Tipo I y Tipo II) de la invención. Los ácidos nucleicos de la invención, incluyendo todos los descritos a continuación, son útiles en la producción recombinante (p. ej., expresión) de polipéptidos de la invención. Los ácidos nucleicos de la invención pueden estar en forma de ARN o en forma de ADN, e incluyen ARNm, ARNc, ARN y ADN recombinantes o sintéticos y ADNc. Los ácidos nucleicos de la invención son típicamente moléculas de ADN y normalmente moléculas de ADN bicatenarias. Sin embargo, también se proporcionan ADN monocatenario, a Rn monocatenario, ARN bicatenario y ácidos nucleicos híbridos ADN/ARN o combinaciones de los mismos que comprenden cualquiera de las secuencias de nucleótidos de la invención.

La presente invención también se refiere a vectores de expresión y células huésped útiles para producir las proteínas inmunomoduladoras de la presente invención. Las proteínas inmunomoduladoras de la invención se pueden preparar en células huésped transformadas usando técnicas de ADN recombinante. Para ello, se prepara una molécula de ADN recombinante que codifica una proteína inmunomoduladora. Los métodos para preparar dichas moléculas de ADN son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, las secuencias que codifican los péptidos podrían escindirse del ADN usando enzimas de restricción adecuadas. Alternativamente, la molécula de ADN podría sintetizarse usando técnicas de síntesis química, tales como el método de la fosforamidita. Además, podría usarse una combinación de estas técnicas. En algunos casos, se puede generar un ácido nucleico recombinante o sintético mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

La invención también incluye vectores de expresión capaces de expresar las proteínas inmunomoduladoras en una célula huésped apropiada en condiciones adecuadas para la expresión de la proteína inmunomoduladora. Un vector de expresión recombinante comprende la molécula de ADN que codifica la proteína inmunomoduladora unida operativamente a secuencias de control de la expresión apropiadas. Los métodos para efectuar esta unión operativa, ya sea antes o después de que la molécula de ADN se inserte en el vector, son bien conocidos. Las secuencias de control de la expresión incluyen promotores, activadores, potenciadores, operadores, sitios de unión ribosómica, señales de inicio, señales de parada, señales de caperuza, señales de poliadenilación y otras señales implicadas en el control de la transcripción o traducción. El vector de expresión recombinante resultante que tiene la molécula de ADN en el mismo se usa para transformar un huésped apropiado. Esta transformación se puede realizar usando métodos bien conocidos en la técnica. En algunas realizaciones, un ácido nucleico de la invención comprende además una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido secretor o señal unido operativamente al ácido nucleico que codifica una proteína inmunomoduladora de la invención, de modo que la proteína inmunomoduladora se recupera del medio de cultivo, célula huésped o periplasma de la célula huésped.

En la práctica de esta invención se puede utilizar cualquiera de un gran número de células huésped disponibles y bien conocidas. La selección de un huésped adecuado depende de varios factores reconocidos por la técnica. Estos incluyen, por ejemplo, la compatibilidad con el vector de expresión elegido, toxicidad de los péptidos codificados por la molécula de ADN, velocidad de transformación, facilidad de recuperación de los péptidos, características de expresión, bioseguridad y costes. Debe lograrse un equilibrio de estos factores entendiendo que no todos los huéspedes pueden ser igualmente efectivos para la expresión de una secuencia de ADN en particular. Las células huésped pueden ser una variedad de células eucariotas, tales como en las células de levadura, o con células de mamíferos, tales como las células de ovario de hámster chino (CHO) o HEK293. Las células huésped también pueden ser células procariotas, tales como con E. co H. El huésped transformado se cultiva en condiciones de expresión de proteínas inmunomoduladoras y luego se purifica. Las células huésped recombinantes se pueden cultivar en condiciones de fermentación convencionales de modo que se expresen las proteínas inmunomoduladoras deseadas. Dichas condiciones de fermentación son bien conocidas en la técnica. Finalmente, las proteínas inmunomoduladoras se recuperan y purifican a partir de cultivos de células recombinantes mediante cualquiera de varios métodos bien conocidos en la técnica, que incluyen precipitación con sulfato de amonio o etanol, extracción con ácido, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba y cromatografía de afinidad. Las etapas de replegamiento de las proteínas pueden usarse, según se desee, para completar la configuración de la proteína madura. Finalmente, se puede emplear cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) en las etapas finales de purificación. Las proteínas inmunomoduladoras de la presente invención también se pueden preparar mediante métodos sintéticos. La síntesis en fase sólida es la técnica preferida para preparar péptidos individuales, ya que es el método más rentable para preparar péptidos pequeños. Por ejemplo, las técnicas de síntesis en fase sólida bien conocidas incluyen el uso de grupos protectores, enlazadores y soportes de fase sólida, así como condiciones de reacción de protección y desprotección específicas, condiciones de escisión del enlazador, uso de secuestradores y otros aspectos de la síntesis de péptidos en fase sólida. A continuación, los péptidos pueden ensamblarse en las proteínas inmunomoduladoras de la presente invención.

Los medios por los que se diseñan o crean los dominios de IgSF con afinidad modificada de la invención inmunomoduladora no se limitan a ningún método en particular. En algunas realizaciones, sin embargo, los dominios de IgSF de tipo salvaje se mutagenizan (específico de sitio, aleatorio o combinaciones de los mismos) a partir de material genético de IgSF de tipo salvaje y se criban para determinar la unión alterada según los métodos descritos en los Ejemplos. Los expertos en la técnica conocen métodos de mutagenización de ácidos nucleicos. En algunas realizaciones, los dominios de IgSF con afinidad modificada se sintetizan de novo utilizando secuencias de proteínas o ácidos nucleicos disponibles en varias bases de datos disponibles públicamente y luego se criban posteriormente. El Centro Nacional de Información Biotecnológica proporciona dicha información y su sitio web es de acceso público a través de Internet, al igual que la base de datos UniProtKB, como se discutió anteriormente.

IV. Métodos de cribado o identificación de dominios de IgSF con afinidad modificada

En la presente memoria también se describe un método para identificar una proteína inmunomoduladora con afinidad modificada que es capaz de unirse a dos o más compañeros de unión afines al mismo tiempo o de una manera no competitiva. El método puede comprender: a) poner en contacto una proteína modificada que comprende al menos un dominio de la superfamilia de inmunoglobulinas (IgSF) modificado que no es inmunoglobulina o un fragmento de unión específico del mismo con al menos dos compañeros de unión afines en condiciones capaces de efectuar la unión de la proteína con al menos dos compañeros de unión afines, en donde el al menos un dominio de IgSF modificado comprende una o más sustituciones de aminoácidos en un dominio de IgSF de tipo salvaje; b) identificar una proteína modificada que comprende el dominio de IgSF modificado que tiene una unión aumentada al menos a uno de los dos compañeros de unión afines en comparación con una proteína que comprende el dominio de IgSF de tipo salvaje; y c) seleccionar una proteína modificada que comprende el dominio de IgSF modificado que se une de forma no competitiva a los al menos dos compañeros de unión afines, identificando así la proteína inmunomoduladora con afinidad modificada. La proteína con afinidad modificada que se selecciona puede ser capaz de unirse a los dos compañeros de unión afines simultáneamente al mismo tiempo. Está dentro del nivel de un experto en la técnica evaluar o determinar la presencia de interacciones de unión no competitivas de una proteína para dos ligandos diferentes más. En el Ejemplo 7 se describen ejemplos de dichos métodos.

El dominio de IgSF puede ser un dominio de IgSF que no es una inmunoglobulina. La proteína modificada o variante puede ser una en la que se hayan realizado una o más sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos en el dominio de IgSF de cualquier miembro de la familia de IgSF que no es una inmunoglobulina, tal como cualquiera que se muestra en la Tabla 1. El dominio de IgSF modificado o variante o la proteína modificada que contiene el dominio de IgSF modificado o variante puede contener al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 cambios de aminoácidos, tales como sustituciones de aminoácidos.

Pueden generarse bibliotecas de proteínas modificadas o variantes mediante la mutación de uno cualquiera o más residuos de aminoácidos de una proteína que se sabe que contiene un dominio de IgSF que no es de inmunoglobulina usando cualquier método comúnmente conocido en la técnica. Cualquiera de los métodos empleados en la técnica para generar, preparar por ingeniería o diversificar una molécula de unión puede usarse para generar un dominio de IgSF modificado en la presente memoria. Los ejemplos de dichos métodos para generar, preparar por ingeniería o diversificar una molécula de unión incluyen, pero no se limitan a, los métodos descritos en las Patentes de EE. UU. No. 5.223.409; 5.571.698, 5.750.373, 5.821.047; 5.837.500; 5.733.743; 5.871.907; 5.969.108; 6.040.136; 6.172.197; 6.291.159; 6.955.877; 6.979.538; 6.831.161; 7.063.943; 7.118.879; 7.208.293; 7.332.571; 7.385.028; 7.696.312; 7.638.299; 7.888.533; 7.642.044; Solicitud de Patente de EE. UU. No. US20080300163; US20090208454; US20090155843; US20080113412; US20100035812; US20100093608; US20110015345; Por ejemplo, se puede usar una que contiene IgSF en métodos en lugar de otras moléculas de unión en métodos de diversificación o ingeniería de biomoléculas.

Los métodos para generar bibliotecas de moléculas de unión y para crear diversidad en la biblioteca son bien conocidos en la técnica y pueden emplearse para generar bibliotecas de variantes de proteínas. Los enfoques para generar diversidad incluyen enfoques dirigidos y no dirigidos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, los enfoques conocidos para generar bibliotecas de ácidos nucleicos y polipéptidos diversas incluyen, pero no se limitan a, PCR propensa a errores, mutagénesis en casete; extensión mutua del cebador; ligadura y extensión asistida por molde; mutagénesis de casete de codones; mutagénesis dirigida por oligonucleótidos; amplificación usando cebadores de oligonucleótidos degenerados, incluyendo la PCR de solapamiento y de dos etapas; y enfoques combinados, tales como mutagénesis combinatoria de casetes múltiples (CMCM) y técnicas relacionadas. Un artesano experto está familiarizado con estas técnicas.

Los ejemplos de métodos para mutar una proteína para generar bibliotecas de moléculas de proteína modificadas candidatas incluyen métodos que dan como resultado mutagénesis aleatoria en toda la secuencia de la proteína o métodos que dan como resultado mutagénesis de una región o dominio seleccionado de la proteína. Las mutaciones se pueden introducir aleatoriamente, usando métodos que dan como resultado mutagénesis aleatoria de la proteína, o más sistemáticamente, usando métodos que crean específicamente un cambio de aminoácidos único o múltiple en una posición diana. Se pueden usar tanto la mutagénesis aleatoria como la mutagénesis sistemática dirigida a sitio para introducir una o más mutaciones en la proteína. La proteína variante puede albergar una o más sustituciones, inserciones o deleciones de aminoácidos en comparación con la proteína de tipo salvaje o no modificada utilizada como armazón para generar la biblioteca. Las sustituciones o inserciones pueden ser con cualquier aminoácido de origen natural o aminoácido de origen no natural.

En los métodos para identificar o generar una proteína variante o modificada que contiene un dominio de IgSF que no es de inmunoglobulina según los métodos proporcionados, una o más regiones de la proteína, tal como un dominio de IgSF o dominios de la proteína, se pueden modificar usando mutagénesis aleatoria de una región para generar una o una pluralidad de moléculas de proteína modificadas. Por ejemplo, se puede generar una biblioteca de variantes que contenga una pluralidad de moléculas modificadas que difieren cada una por al menos una deleción o inserción de reemplazo de aminoácidos (es decir, sustitución) en un dominio de IgSF en comparación con una proteína de tipo salvaje o no modificada correspondiente que contiene el dominio de IgSF. La sustitución o sustituciones de aminoácidos pueden ser sustituciones de aminoácidos de origen natural o aminoácidos de origen no natural en comparación con la proteína no modificada o de tipo salvaje. Generalmente, las bibliotecas proporcionadas en la presente memoria incluyen bibliotecas que contienen al menos 2 , 3, 4, 5 , 6 , 7 , 8, 9, 10 , 20 , 30, 40, 50, 102, 103, 104, 2 x 104, 3 x 104, 4 x 104, 5 x 104, 6 x 104, 7 x 104, 8 x 104, 9 x 104, 105, 106, 107, 108, 109 o más miembros diferentes. La biblioteca generada que contiene una pluralidad de proteínas modificadas se puede generar como una biblioteca de presentación, incluyendo una biblioteca combinatoria en la que la presentación de la variante se realiza mediante, por ejemplo, presentación en fagos, presentación en superficie celular, presentación en perlas, presentación en ribosomas u otros. Las bibliotecas se pueden usar para cribar proteínas modificadas o variantes que contienen dominios de IgSF que no son de inmunoglobulina que se unen específicamente de forma no competitiva a los al menos dos compañeros de unión afines.

Antes de seleccionar una proteína modificada que comprende el dominio de IgSF modificado que se une de forma no competitiva a los al menos dos compañeros de unión afines, el método puede incluir combinar dos o más dominios de IgSF modificados o fragmentos de unión específicos de los mismos identificados en la etapa (b) para generar una construcción de moléculas apiladas que contiene una pluralidad de diferentes dominios de IgSF modificados.

Por lo tanto, en la presente memoria también se describe un método para identificar una proteína inmunomoduladora con afinidad modificada, que comprende: a) poner en contacto una proteína modificada que comprende al menos un dominio de la superfamilia de inmunoglobulinas (IgSF) modificado que no es de inmunoglobulina o un fragmento de unión específico del mismo con al menos dos compañeros de unión afines en condiciones capaces de efectuar la unión de la proteína con los al menos dos compañeros de unión afines, en donde el al menos un dominio de IgSF modificado comprende una o más sustituciones de aminoácidos en un dominio de IgSF de tipo salvaje; b) identificar una proteína modificada que comprende el dominio de IgSF modificado que tiene una unión aumentada al menos a uno de los dos compañeros de unión afines en comparación con una proteína que comprende el dominio de IgSF de tipo salvaje; c) combinar dos o más dominios de IgSF modificados presentes en dos o más proteínas identificadas para generar una proteína de fusión (apilada) que comprende un primer dominio de IgSF modificado unido a un segundo dominio de IgSF; y d) seleccionar una proteína modificada que comprende los dominios de IgSF modificados que se une de manera no competitiva a los al menos dos compañeros de unión afines, identificando así la proteína inmunomoduladora con afinidad modificada.

Los al menos dos compañeros de unión afines pueden ser especies moleculares de la superficie celular expresadas en la superficie de una célula de mamífero. Las especies moleculares de la superficie celular pueden expresarse en configuración cis o configuración trans. La célula de mamífero puede ser una de dos células de mamífero que forman una sinapsis inmunológica (IS) y cada una de las especies moleculares de la superficie celular puede expresarse en al menos una de las dos células de mamífero que forman la IS. Al menos una de las células de mamífero puede ser un linfocito, que puede ser una célula NK o una célula T. Al menos una de las células de mamífero puede ser una célula tumoral. Al menos una de las células de mamífero puede ser una célula presentadora de antígeno.

Los dos o más compañeros de unión afines pueden ser independientemente un ligando de un miembro de IgSF seleccionado de CD80, CD86, PD-L1, PD-L2, ligando ICOS, B7-H3, B7-H4, CD28, CTLA4, PD-1, ICOS , BTLA, CD4, CD8-alfa, CD8-beta, LAG3, TIM-3, CEACAM1, TIGIT, PVR, PVRL2, CD226, CD2, CD160, CD200, CD200R o Nkp30. Los dos o más compañeros de unión afines pueden ser independientemente un ligando de un miembro de la familia B7. Los dos o más compañeros de unión afines pueden seleccionarse de dos o más de CD28, CTLA-4, ICOS o PD-L1.

V. Composiciones y formulaciones farmacéuticas

Una composición farmacéutica que comprende una composición terapéutica de la invención puede contener materiales de formulación para modificar, mantener o conservar, por ejemplo, el pH, osmolaridad, viscosidad, claridad, color, isotonicidad, olor, esterilidad, estabilidad, velocidad de disolución o liberación, adsorción, o penetración de la composición. El vehículo o portador principal en una composición farmacéutica puede ser de naturaleza acuosa o no acuosa. Por ejemplo, un vehículo o portador adecuado puede ser agua para inyección o disolución salina fisiológica, posiblemente complementada con otros materiales comunes en las composiciones para administración parenteral. La disolución salina tamponada neutra o la disolución salina mezclada con albúmina de suero son vehículos ejemplares adicionales. Otras composiciones farmacéuticas ejemplares comprenden tampón T ris con un pH de aproximadamente 7,0-8,5, o tampón acetato con un pH de aproximadamente 4,0-5,5, que puede incluir además sorbitol o un sustituto adecuado del mismo. En una realización de la presente invención, las composiciones de agentes de unión se pueden preparar para almacenamiento mezclando la composición seleccionada que tiene el grado de pureza deseado con agentes de formulación opcionales en forma de una torta liofilizada o una disolución acuosa. Además, el producto del agente de unión se puede formular como un liofilizado usando excipientes apropiados tales como sacarosa.

Los componentes de la formulación están presentes en concentraciones que son aceptables para el sitio de la administración. Por ejemplo, se utilizan tampones para mantener la composición a un pH fisiológico o un pH ligeramente más bajo, típicamente dentro de un rango de pH de aproximadamente 5 a aproximadamente 8. Un vehículo particularmente adecuado para la administración parenteral es agua destilada estéril en la que se formula un agente de unión, tal como disolución isotónica estéril, debidamente conservada. Otra preparación más puede implicar la formulación de la molécula deseada con un agente, tal como microesferas inyectables, partículas bio-erosionables, compuestos poliméricos (ácido poliláctico, ácido poliglicólico), perlas o liposomas, que proporcionan la liberación controlada o sostenida del producto que puede administrarse entonces mediante una inyección de depósito.

En otro aspecto, las formulaciones farmacéuticas adecuadas para la administración parenteral pueden formularse en disoluciones acuosas, preferiblemente en tampones fisiológicamente compatibles tales como disolución de Hanks, disolución de Ringer o disolución salina tamponada fisiológicamente. Las suspensiones inyectables acuosas pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, tales como carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol o dextrano. Las composiciones farmacéuticas adicionales serán evidentes para los expertos en la técnica, incluyendo las formulaciones que implican moléculas del agente de unión en formulaciones de liberación sostenida o controlada. Los expertos en la técnica también conocen técnicas para formular una variedad de otros medios de administración sostenida o controlada, tales como vehículos liposomales, micropartículas bio-erosionables o perlas porosas e inyecciones de depósito. La composición farmacéutica que se utilizará para la administración in vivo normalmente debe ser estéril. Esto se puede lograr mediante filtración a través de membranas de filtración estériles. Cuando la composición se liofiliza, la esterilización usando este método puede realizarse antes o después de la liofilización y reconstitución. La composición para la administración parenteral puede almacenarse en forma liofilizada o en disolución. Además, las composiciones parenterales generalmente se ponen en un contenedor que tiene un puerto de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa de disolución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica.

En algunas realizaciones, la composición farmacéutica es estéril. La esterilización se puede lograr mediante filtración a través de membranas de filtración estériles o radiación. Cuando la composición se liofiliza, la esterilización usando este método puede realizarse antes o después de la liofilización y reconstitución. La composición para la administración parenteral puede almacenarse en forma liofilizada o en disolución. Además, las composiciones parenterales generalmente se ponen en un contenedor que tiene un puerto de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa de disolución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica.

Una vez formulada la composición farmacéutica, puede almacenarse en viales estériles como una disolución, suspensión, gel, emulsión, sólido o polvo deshidratado o liofilizado. Dichas formulaciones pueden almacenarse en una forma lista para usar o en una forma (p. ej., liofilizada) que requiera la reconstitución antes de la administración. Una cantidad eficaz de una composición farmacéutica que se va a emplear terapéuticamente dependerá, por ejemplo, del contexto y los objetivos terapéuticos. Un experto en la técnica apreciará que los niveles de dosificación apropiados para el tratamiento variarán, por lo tanto, dependiendo, en parte, de la molécula administrada, la indicación para la cual se está usando la molécula del agente de unión, la vía de administración y el tamaño (peso corporal, superficie corporal o tamaño de los órganos) y el estado (la edad y la salud general) del paciente. Por consiguiente, el médico puede titular la dosificación y modificar la vía de administración para obtener el efecto terapéutico óptimo. La composición terapéutica de la invención se puede administrar por vía parenteral, subcutánea o intravenosa, o como se describe en otra parte de la presente memoria. La composición terapéutica de la invención puede administrarse en una cantidad terapéuticamente eficaz una, dos, tres o cuatro veces al mes, dos veces a la semana, quincenalmente (cada dos semanas) o cada dos meses (cada dos meses). La administración puede durar un período de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 meses o más (p. ej., uno, dos, tres, cuatro o más años, incluso durante toda la vida del sujeto).

Generalmente, las dosificaciones y vías de administración de la composición farmacéutica se determinan según el tamaño y la condición del sujeto, según la práctica farmacéutica estándar. Por ejemplo, la dosis terapéuticamente eficaz se puede estimar inicialmente en ensayos de cultivo celular o en modelos animales tales como ratones, ratas, conejos, perros, cerdos o monos. También se puede utilizar un modelo animal para determinar el rango de concentración y la vía de administración apropiados. Dicha información puede usarse entonces para determinar dosis y vías útiles para la administración en seres humanos. La dosificación exacta se determinará a la luz de factores relacionados con el sujeto que requiere tratamiento. La dosificación y la administración se ajustan para proporcionar niveles suficientes del compuesto activo o para mantener el efecto deseado. Los factores que se pueden tener en cuenta incluyen la gravedad del estado de la enfermedad, la salud general del sujeto, la edad, el peso y el sexo del sujeto, el tiempo y la frecuencia de la administración, la o las combinaciones de fármacos, las sensibilidades de reacción y la respuesta a la terapia.

En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra a un sujeto a través de cualquier vía, incluyendo por vía oral, transdérmica, por inhalación, por vía intravenosa, intraarterial, intramuscular, aplicación directa a un sitio de herida, aplicación a un sitio quirúrgico, por vía intraperitoneal, por supositorio, por vía subcutánea, intradérmica, transcutánea, por nebulización, por vía intrapleural, intraventricular, intraarticular, intraocular o intraespinal.

En algunas realizaciones, la dosificación de la composición farmacéutica es una dosis única o una dosis repetida. En algunas realizaciones, las dosis se proporcionan a un sujeto una vez al día, dos veces al día, tres veces al día o cuatro o más veces al día. En algunas realizaciones, se proporcionan aproximadamente 1 o más (tal como aproximadamente 2 o más, aproximadamente 3 o más, aproximadamente 4 o más, aproximadamente 5 o más, aproximadamente 6 o más, o aproximadamente 7 o más) dosis en una semana. En algunas realizaciones, se proporcionan múltiples dosis en el transcurso de días, semanas, meses o años. En algunas realizaciones, un curso de tratamiento es aproximadamente 1 o más dosis (tal como aproximadamente 2 o más dosis, aproximadamente 3 o más dosis, aproximadamente 4 o más dosis, aproximadamente 5 o más dosis, aproximadamente 7 o más dosis, aproximadamente 10 o más dosis, aproximadamente 15 o más dosis, aproximadamente 25 o más dosis, aproximadamente 40 o más dosis, aproximadamente 50 o más dosis, o aproximadamente 100 o más dosis).

En algunas realizaciones, una dosis administrada de la composición farmacéutica es aproximadamente 1 pg de proteína por kg de masa corporal del sujeto o más (tal como aproximadamente 2 pg de proteína por kg de masa corporal del sujeto o más, aproximadamente 5 pg de proteína por kg de masa corporal del sujeto o más, aproximadamente 10 pg de proteína por kg de masa corporal del sujeto o más, aproximadamente 25 pg de proteína por kg de masa corporal del sujeto o más, aproximadamente 50 pg de proteína por kg de masa corporal del sujeto o más, aproximadamente 100 pg de proteína por kg de masa corporal del sujeto o más, aproximadamente 250 pg de proteína por kg de masa corporal del sujeto o más, aproximadamente 500 pg de proteína por kg de masa corporal del sujeto o más, aproximadamente 1 mg de proteína por kg de masa corporal del sujeto o más, aproximadamente 2 mg de proteína por kg de masa corporal del sujeto o más, o aproximadamente 5 mg de proteína por kg de masa corporal del sujeto o más).

Para cualquier compuesto, la dosis terapéuticamente eficaz puede estimarse inicialmente en ensayos de cultivo celular o en modelos animales tales como ratones, ratas, conejos, perros, cerdos o monos. También se puede utilizar un modelo animal para determinar el rango de concentración y la vía de administración apropiados. Dicha información puede usarse entonces para determinar dosis y vías útiles para la administración en seres humanos. La dosificación exacta se determinará a la luz de factores relacionados con el sujeto que requiere tratamiento. La dosificación y la administración se ajustan para proporcionar niveles suficientes del compuesto activo o para mantener el efecto deseado. Los factores que pueden tenerse en cuenta incluyen la gravedad del estado de la enfermedad, la salud general del sujeto, la edad, el peso y el sexo del sujeto, el tiempo y la frecuencia de la administración, la o las combinaciones de fármacos, las sensibilidades de reacción y la respuesta. a la terapia. Las composiciones farmacéuticas de acción prolongada se pueden administrar cada 3 a 4 días, cada semana o cada dos semanas, dependiendo de la semivida y la tasa de aclaramiento de la formulación particular. La frecuencia de la dosificación dependerá de los parámetros farmacocinéticos de la molécula en la formulación usada. Normalmente, una composición se administra hasta que se alcanza una dosificación que logra el efecto deseado. Por tanto, la composición puede administrarse como una dosis única, o como dosis múltiples (a la misma o diferentes concentraciones/dosificaciones) a lo largo del tiempo, o como una infusión continua. De forma rutinaria se realiza un mayor refinamiento de la dosificación apropiada. Las dosificaciones apropiadas pueden determinarse mediante el uso de datos de respuesta a la dosis apropiados.

En algunas realizaciones, se pueden monitorizar uno o más biomarcadores o marcadores fisiológicos para el efecto terapéutico, incluyendo la activación o proliferación de las células T, la síntesis o producción de citoquinas (p. ej., producción de TNF-a, IFN-y, IL-2), inducción de diversos marcadores de activación (p. ej., CD25, receptor de IL-2), inflamación, hinchazón o sensibilidad articular, nivel sérico de proteína C reactiva, producción de anticuerpos anti­ colágeno y/o respuesta(s) de anticuerpos dependientes de células T.

Una composición farmacéutica inyectable que comprende un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable adecuado (p. ej., PBS) y una cantidad eficaz de una composición terapéutica de la invención puede administrarse por vía parenteral, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subdérmica, transdérmica, subcutánea o intradérmica a un paciente mamífero. La administración puede facilitarse mediante liposomas. Generalmente, la piel y el músculo son dianas preferidas para la administración de la composición terapéutica de la invención, mediante cualquier técnica adecuada. Por tanto, la administración de la composición terapéutica de la invención en o a través de la piel de un sujeto mamífero (p. ej., un ser humano), es una característica de la invención. Dichas moléculas de la invención se pueden administrar en una disolución inyectable farmacéuticamente aceptable en o a través de la piel, p. ej., por vía intramuscular o intraperitoneal. La administración también puede realizarse mediante dispositivos transdérmicos o, más típicamente, administración biolística de la composición terapéutica de la invención en, o a través de la piel del sujeto o en el músculo expuesto del sujeto mamífero.

Se conocen diversos medios para determinar si la administración de una composición terapéutica de la invención modula suficientemente la actividad inmunológica eliminando, secuestrando o inactivando las células inmunes que median o son capaces de mediar una respuesta inmune no deseada; inducir, generar o ajustar activar células inmunes que median o son capaces de mediar una respuesta inmune protectora; cambiar las propiedades físicas o funcionales de las células inmunes; o una combinación de estos efectos. Los ejemplos de mediciones de la modulación de la actividad inmunológica incluyen, pero no se limitan a, examen de la presencia o ausencia de poblaciones de células inmunes (usando citometría de flujo, inmunohistoquímica, histología, microscopía electrónica, reacción en cadena de la polimerasa (PCR)); medición de la capacidad funcional de las células inmunes, incluyendo la capacidad o resistencia para proliferar o dividirse en respuesta a una señal (tal como el uso de ensayos de proliferación de células T y análisis de pepscan basado en la incorporación de 3H-timidina después de la estimulación con anticuerpo anti-CD3, anticuerpo anti-receptor de células T, anticuerpo anti-CD28, ionóforos de calcio, PMA, células presentadoras de antígeno cargadas con un antígeno peptídico o proteico; ensayos de proliferación de células B); medición de la capacidad para matar o lisar otras células (tal como ensayos de células T citotóxicas); mediciones de las citoquinas, quimioquinas, moléculas de la superficie celular, anticuerpos y otros productos de las células (p. ej., mediante citometría de flujo, ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas, análisis de transferencia Western, análisis de micromatrices de proteínas, análisis de inmunoprecipitación); medición de marcadores bioquímicos de activación de células inmunes o vías de señalización dentro de las células inmunes (p. ej., análisis de inmunoprecipitación y transferencia Western de fosforilación de tirosina, serina o treonina, escisión de polipéptidos y formación o disociación de complejos de proteínas; análisis de matrices de proteínas; transcripción de ADN, perfil utilizando matrices de ADN o hibridación sustractiva); mediciones de muerte celular por apoptosis, necrosis u otros mecanismos (p. ej., tinción de anexina V, ensayos TUNEL, electroforesis en gel para medir la formación de escaleras de ADN, histología; ensayos de caspasa fluorogénicos, análisis de transferencia Western de sustratos de caspasa); medición de los genes, proteínas y otras moléculas producidas por las células inmunes (p. ej., análisis de transferencia Northern, reacción en cadena de la polimerasa, micromatrices de ADN, micromatrices de proteínas, electroforesis en gel bidimensional, análisis de transferencia Western, ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas, citometría de flujo); y medición de síntomas o resultados clínicos tales como la mejora de enfermedades autoinmunes, neurodegenerativas y otras que implican proteínas o polipéptidos propios (puntuaciones clínicas, requisitos para el uso de terapias adicionales, estado funcional, estudios de imágenes) por ejemplo, midiendo la tasa de recidiva o gravedad de la enfermedad (utilizando puntuaciones clínicas conocidas por el experto en la técnica) en el caso de esclerosis múltiple, medición de glucosa en sangre en el caso de diabetes de tipo I o inflamación articular en el caso de artritis reumatoide.

En la presente memoria también se describen artículos de fabricación que comprenden las composiciones farmacéuticas descritas en la presente memoria en envases adecuados. Los envases adecuados para las composiciones (tales como las composiciones oftálmicas) descritas en la presente memoria son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, viales (tales como viales sellados), recipientes, ampollas, botellas, frascos, envases flexibles (p. ej., bolsas Mylar selladas o de plástico), y similares. Estos artículos de fabricación se pueden esterilizar y/o sellar adicionalmente.

Se describen además kits que comprenden las composiciones farmacéuticas (o artículos de fabricación) descritas en la presente memoria, que pueden comprender además instrucciones sobre los métodos de uso de la composición, tales como los usos descritos en la presente memoria. Los kits descritos en la presente memoria también pueden incluir otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y de usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringas y prospectos con instrucciones para llevar a cabo cualquier método descrito en la presente memoria.

VI. Aplicaciones terapéuticas

Se cree que las proteínas inmunomoduladoras de la invención tienen utilidad en una variedad de aplicaciones, que incluyen, pero no están limitadas a, métodos profilácticos o terapéuticos (colectivamente, una "composición terapéutica de la invención") para tratar una variedad de enfermedades del sistema inmune o afecciones en un mamífero en las que la modulación o regulación del sistema inmune y las respuestas del sistema inmune es beneficiosa. Por ejemplo, la supresión de una respuesta inmune puede ser beneficiosa en métodos profilácticos y/o terapéuticos para inhibir el rechazo de un trasplante de tejido, célula u órgano de un donante por parte de un receptor. En un contexto terapéutico, el sujeto mamífero es típicamente uno con una enfermedad o afección del sistema inmune, y la administración se realiza para prevenir la progresión adicional de la enfermedad o afección. Por ejemplo, la administración de una composición terapéutica de la invención a un sujeto que padece una enfermedad del sistema inmune (p. ej., una enfermedad autoinmune) puede dar lugar a la supresión o inhibición de dicho ataque del sistema inmune o respuestas biológicas asociadas con el mismo. Al suprimir este ataque del sistema inmune a los tejidos sanos del cuerpo, los síntomas físicos resultantes (p. ej., dolor, inflamación de las articulaciones, hinchazón o sensibilidad de las articulaciones) resultantes o asociados con dicho ataque a los tejidos sanos pueden disminuirse o aliviarse y el daño biológico y físico que se produce por o está asociado con el ataque del sistema inmune puede disminuirse, retrasarse o detenerse. En un contexto profiláctico, el sujeto puede tener, ser susceptible o creer que presenta una enfermedad, trastorno o afección del sistema inmune, y la administración se realiza típicamente para prevenir la progresión de la enfermedad, trastorno o afección, inhibir o aliviar los síntomas, signos, o las respuestas biológicas asociadas con los mismos, prevenir el daño corporal que pueda producirse por ellos y/o mantener o mejorar el funcionamiento físico del sujeto.

La enfermedad o trastorno del sistema inmune del paciente puede ser o implicar, p. ej., pero no se limita a, enfermedad de Addison, alergia, alopecia areata, de Alzheimer, vasculitis asociada a anticuerpos anticitoplasma de neutrófilos (ANCA), espondilitis anquilosante, síndrome antifosfolípido (síndrome de Hughes), artritis, asma, aterosclerosis, placa aterosclerótica, enfermedad autoinmune (p. ej., lupus, AR, EM, enfermedad de Graves, etc.), anemia hemolítica autoinmune, hepatitis autoinmune, enfermedad del oído interno autoinmune, síndrome linfoproliferativo autoinmune, miocarditis autoinmune, ooforitis autoinmune, orquitis autoinmune, azoospermia, enfermedad de Behcet, enfermedad de Berger, penfigoide ampolloso, miocardiopatía, enfermedad cardiovascular, celiaquía/enfermedad celíaca, síndrome de disfunción inmune por fatiga crónica (CFIDS), polineuritis idiopática crónica, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, polineuropatía recidivante crónica (síndrome de Guillain-Barré), síndrome de Churg-Strauss (CSS), penfigoide cicatricial, enfermedad de las aglutininas frías (CAD), EPOC, síndrome de CREST, enfermedad de Crohn, dermatitis, herpetiformus, dermatomiositis, diabetes, lupus discoide, eccema, epidermólisis ampollosa adquirida, crioglobulinemia esencial mixta, síndrome de Evan, exoftalmos, fibromialgia, síndrome de Goodpasture, enfermedad o trastorno relacionado con injerto, enfermedad de Graves, EICH, tiroiditis de Hashimoto, fibrosis pulmonar idiopática, púrpura trombocitopénica idiopática (PTI), nefropatía por IgA, enfermedad o trastorno inmunoproliferativo (p. ej., psoriasis), enfermedad inflamatoria intestinal (EII), diabetes mellitus dependiente de insulina (IDDM), enfermedad pulmonar intersticial, diabetes juvenil, artritis juvenil, artritis idiopática juvenil (AIJ), enfermedad de Kawasaki, síndrome miasténico de Lambert-Eaton, liquen plano, lupus, nefritis lúpica, linfofisitis linfocítica, enfermedad de Méniere, síndrome de Miller Fish/encefalomielorradiculopatía diseminada aguda, enfermedad mixta del tejido conectivo, esclerosis múltiple (EM), reumatismo muscular, encefalomielitis miálgica (ME), miastenia grave, inflamación ocular, pénfigo foliáceo, pénfigo vulgar, anemia perniciosa, poliarteritis nudosa, policondritis, síndromes poliglandulares (síndrome de Whitaker), polimialgia reumática, polimiositis, agammaglobulinemia primaria, cirrosis biliar primaria/colangiopatía autoinmune, psoriasis, artritis psoriásica, fenómeno de Raynaud, síndrome de Reiter/artritis reactiva, restenosis, fiebre reumática, enfermedad reumática, artritis reumatoide, sarcoidosis, síndrome de Schmidt, esclerodermia, síndrome de Sjorgen, rechazo de trasplante de órganos sólidos (riñón, corazón, hígado, pulmón, etc.), síndrome del hombre rígido, lupus eritematoso sistémico (LES), escleroderma sistémico, arteritis de Takayasu, arteritis temporal/arteritis de células gigantes, tiroiditis, diabetes tipo 1, diabetes tipo 2, colitis ulcerosa, uveítis, vasculitis, vitíligo, granulomatosis de Wegener y prevenir o suprimir una respuesta inmune asociada con el rechazo de un tejido, célula, injerto u órgano de un donante por un sujeto receptor. Las enfermedades o trastornos relacionados con injertos incluyen la enfermedad de injerto contra huésped (GVDH), tal como la asociada con el trasplante de médula ósea, y los trastornos inmunes que se producen por o están asociados con el rechazo del trasplante de injerto de órganos, tejidos o células (p. ej., aloinjertos o xenoinjertos de tejidos o células ), incluyendo, p. ej., injertos de piel, músculo, neuronas, islotes, órganos, células parenquimatosas del hígado, etc. Con respecto a un trasplante de tejido, célula, injerto u órgano sólido de un donante en un sujeto receptor, se cree que una composición terapéutica de la invención descrita en la presente memoria puede ser eficaz para prevenir el rechazo agudo de dicho trasplante en el receptor y/o para la terapia de mantenimiento a largo plazo para prevenir el rechazo de dicho trasplante en el receptor (p. ej., inhibiendo el rechazo del trasplante de células de los islotes productores de insulina de un donante en el sujeto receptor que padece diabetes).

Una composición terapéutica de la invención también se puede usar para inhibir el crecimiento de células cancerosas de mamíferos, particularmente humanas, como monoterapia (es decir, como un solo agente), en combinación con al menos un agente quimioterapéutico (es decir, una terapia de combinación), en combinación con una vacuna contra el cáncer, en combinación con un inhibidor de puntos de control inmunes y/o en combinación con radioterapia. En algunos aspectos de la presente descripción, el inhibidor de puntos de control inmunes es nivolumab, tremelimumab, pembrolizumab, ipilimumab o similares. Se administra una cantidad eficaz de una composición terapéutica para inhibir, detener o revertir la progresión de cánceres que son sensibles a la modulación de la actividad inmunológica por las proteínas inmunomoduladoras de la presente invención. Las células cancerosas humanas pueden tratarse in vivo o ex vivo. En el tratamiento ex vivo de un paciente humano, el tejido o los fluidos que contienen células cancerosas se tratan fuera del cuerpo y luego el tejido o los fluidos se reintroducen de nuevo en el paciente. En algunas realizaciones, el cáncer se trata en un paciente humano in vivo mediante la administración de la composición terapéutica al paciente. Por tanto, la presente invención proporciona métodos ex vivo e in vivo para inhibir, detener o revertir la progresión del tumor, o producir de otra manera un aumento estadísticamente significativo de la supervivencia libre de progresión (es decir, el período de tiempo durante y después del tratamiento en el que un paciente vive con un cáncer que no empeora), o supervivencia global (también llamada "tasa de supervivencia"; es decir, el porcentaje de personas en un grupo de estudio o tratamiento que están vivas durante un cierto período de tiempo después de que se les diagnosticó con o se les trató para el cáncer) en relación con el tratamiento con un control. Los cánceres que pueden tratarse mediante los métodos de la invención incluyen, pero no se limitan a, melanoma, cáncer de vejiga, malignidades hematológicas (leucemia, linfoma, mieloma), cáncer de hígado, cáncer de cerebro, cáncer renal, cáncer de mama, cáncer de páncreas ( adenocarcinoma), cáncer colorrectal, cáncer de pulmón (cáncer de pulmón de células pequeñas y cáncer de pulmón de células no pequeñas), cáncer de bazo, cáncer de timo o células sanguíneas (es decir, leucemia), cáncer de próstata, cáncer testicular, cáncer de ovario, cáncer de uterino, carcinoma gástrico o sarcoma de Ewing.

VII. Realizaciones ejemplares

Entre las enseñanzas de la presente memoria se proporcionan realizaciones, que incluyen realizaciones con fines de antecedentes:

Realización 1. Según la invención reivindicada, se proporciona una proteína inmunomoduladora, que comprende al menos un dominio de la superfamilia de inmunoglobulinas (IgSF) con afinidad modificada que no es de una inmunoglobulina que comprende una o más sustituciones de aminoácidos en un dominio de IgSF de tipo salvaje, en donde: el al menos un dominio de IgSF con afinidad modificada tiene una unión aumentada al menos a dos compañeros de unión afines en comparación con el dominio de IgSF de tipo salvaje; y el al menos un dominio de IgSF con afinidad modificada se une específicamente de forma no competitiva a los al menos dos compañeros de unión afines.

Realización 2. En algunas realizaciones adicionales de la realización 1, los al menos dos compañeros de unión afines son especies moleculares de la superficie celular expresadas en la superficie de una célula de mamífero.

Realización 3. En algunas realizaciones adicionales de la realización 2, las especies moleculares de la superficie celular se expresan en configuración cis o configuración trans.

Realización 4. En algunas realizaciones adicionales de la realización 2 o la realización 3, la célula de mamífero es una de las dos células de mamífero que forman una sinapsis inmunológica (IS) y cada una de las especies moleculares de la superficie celular se expresa en al menos una de las dos células de mamífero que forman la IS.

Realización 5. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 2-4, al menos una de las células de mamífero es un linfocito.

Realización 6. En algunas realizaciones adicionales de la realización 5, el linfocito es una célula NK o una célula T.

Realización 7. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 5-6, la unión del dominio de IgSF con afinidad modificada modula la actividad inmunológica del linfocito.

Realización 8. En algunas realizaciones adicionales de la realización 7, la proteína inmunomoduladora es capaz de efectuar una actividad inmunológica incrementada en comparación con la proteína de tipo salvaje que comprende el dominio de IgSF de tipo salvaje.

Realización 9. En algunas realizaciones adicionales de la realización 7, la proteína inmunomoduladora es capaz de efectuar una actividad inmunológica disminuida en comparación con la proteína de tipo salvaje que comprende el dominio de IgSF de tipo salvaje.

Realización 10. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 2-9, al menos una de las células de mamífero es una célula tumoral.

Realización 11. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 2-10, las células de mamífero son células humanas.

Realización 12. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 4-11, el dominio de IgSF con afinidad modificada es capaz de unirse específicamente a las dos células de mamífero que forman la IS.

Realización 13. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 1-12, el dominio de IgSF de tipo salvaje es de un miembro de la familia de IgSF de una familia seleccionada de la familia de proteínas reguladoras de señales (SIRP), familia semejantes al receptor de activación expresado en células mieloides (TREML), familia de moléculas de adhesión celular relacionadas con antígenos carcinoembrionarios (CEACAM), familia de lectinas similares a Ig de unión a ácido siálico (SIGLEC), familia de butirofilinas, familia B7, familia CD28, familia que contiene dominios de conjunto V y de inmunoglobulina (VSIG), familia de dominios de conjunto V transmembrana (VSTM), familia de complejos mayores de histocompatibilidad (MHC), familia de moléculas de activación linfocítica de señalización (SLAM), receptor semejante a inmunoglobulina leucocitaria (LIR), familia de nectina (Nec), familia semejante a nectina (NECL), familia relacionada con el receptor de poliovirus (PVR), familia de receptores desencadenantes de citotoxicidad natural (NCR), familia de inmunoglobulina y mucina de células T (TIM) o familia de receptores semejantes a inmunoglobulina de células asesinas (KIR).

Realización 14. Según la invención reivindicada, el dominio de IgSF de tipo salvaje de una cualquiera de las realizaciones 1-13 es de un miembro de IgSF seleccionado de CD80.

Realización 15. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 1-14, el dominio de IgSF de tipo salvaje es un miembro de IgSF humano.

Realización 16. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 1-15, el dominio de IgSF de tipo salvaje es un dominio IgV, un dominio IgC1, un dominio IgC2 o un fragmento de unión específico del mismo.

Realización 17. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 1-16, el dominio de IgSF con afinidad modificada es un dominio IgV con afinidad modificada, un dominio IgC1 con afinidad modificada o un dominio IgC2 con afinidad modificada o es un fragmento de unión específico del mismo que comprende una o más sustituciones de aminoácidos.

Realización 18. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 1-17, la proteína inmunomoduladora comprende al menos dos dominios de IgSF con afinidad modificada que no son de inmunoglobulina.

Realización 19. En algunas realizaciones adicionales de la realización 18, los al menos dos dominios de IgSF con afinidad modificada que no son de inmunoglobulina comprenden cada uno una o más sustituciones de aminoácidos diferentes en el mismo dominio de IgSF de tipo salvaje.

Realización 20. En algunas realizaciones adicionales de la realización 19, los al menos dos dominios de IgSF con afinidad modificada que no son de inmunoglobulina comprenden cada uno una o más sustituciones de aminoácidos en diferentes dominios de IgSF de tipo salvaje.

Realización 21. En algunas realizaciones adicionales de la realización 20, los diferentes dominios de IgSF de tipo salvaje son de diferentes miembros de la familia de IgSF.

Realización 22. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 1-17, la proteína inmunomoduladora comprende solo un dominio de IgSF con afinidad modificada que no es de inmunoglobulina. Realización 23. Según la invención reivindicada, la IgSF con afinidad modificada de una cualquiera de las realizaciones 1-22 comprende al menos un 85 % de identidad de secuencia con un dominio de IgSF de tipo salvaje o un fragmento de unión específico del mismo contenido en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1.

Realización 24. En algunas realizaciones adicionales de la realización 23, la proteína inmunomoduladora comprende además una segunda IgSF con afinidad modificada, en donde el segundo dominio de IgSF con afinidad modificada comprende al menos un 85 % de identidad de secuencia con un dominio de IgSF de tipo salvaje o un fragmento de unión específico del mismo contenido en la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las SEQ ID NO: 1-27. Realización 25. Según la invención reivindicada, el dominio de IgSF de tipo salvaje de una cualquiera de las realizaciones 1 -24 es un miembro de la familia B7.

Realización 26. Según la invención reivindicada, el dominio de IgSF de tipo salvaje de una cualquiera de las realizaciones 1-25 es un dominio de CD80.

Realización 27. Según la invención reivindicada, el dominio de IgSF de tipo salvaje de una cualquiera de las realizaciones 1-26 es un dominio de CD80.

Realización 28. Según la invención reivindicada, se proporciona una proteína inmunomoduladora, que comprende al menos un dominio de la superfamilia de inmunoglobulinas (IgSF) CD80 con afinidad modificada que comprende una o más sustituciones de aminoácidos en un dominio de IgSF CD80 de tipo salvaje, en donde el al menos un dominio de IgSF de CD80 con afinidad modificada tiene una unión aumentada al menos a dos compañeros de unión afines en comparación con el dominio de IgSF de CD80 de tipo salvaje.

Realización 29. Según la invención reivindicada, los compañeros de unión afines de la realización 27 o la realización 28 son CD28.

Realización 30. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 27-29, el dominio de IgSF de tipo salvaje es un dominio IgV y/o el dominio de CD80 con afinidad modificada es un dominio IgV con afinidad modificada.

Realización 31. Según la invención reivindicada, el dominio con afinidad modificada de una cualquiera de las realizaciones 27-30 comprende al menos un 85 % de identidad de secuencia con un dominio de CD80 de tipo salvaje o un fragmento de unión específico del mismo contenido en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1.

Realización 32. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 1-31, el al menos un dominio de IgSF con afinidad modificada comprende al menos 1 y no más de veinte sustituciones de aminoácidos en el dominio de IgSF de tipo salvaje.

Realización 33. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 1-32, el al menos un dominio de IgSF con afinidad modificada comprende al menos 1 y no más de diez sustituciones de aminoácidos en el dominio de IgSF de tipo salvaje.

Realización 34. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 1-33, el al menos un dominio de IgSF con afinidad modificada comprende al menos 1 y no más de cinco sustituciones de aminoácidos en el dominio de IgSF de tipo salvaje.

Realización 35. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 1 -34, el dominio de IgSF con afinidad modificada tiene al menos un 120 % de la afinidad de unión como su dominio de IgSF de tipo salvaje para cada uno de los al menos dos compañeros de unión afines.

Realización 36. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 1-35, la proteína inmunomoduladora comprende además un dominio de IgSF sin afinidad modificada.

Realización 37. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 1-36, la proteína inmunomoduladora es soluble.

Realización 38. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 1-37, la proteína inmunomoduladora carece de un dominio transmembrana o un dominio citoplásmico.

Realización 39. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 1-38, la proteína inmunomoduladora comprende solo el dominio extracelular (ECD) o un fragmento de unión específico del mismo que comprende el dominio de IgSF con afinidad modificada.

Realización 40. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 1-39, la proteína inmunomoduladora está glicosilada o pegilada.

Realización 41. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 1-40, la proteína inmunomoduladora está unida a un dominio de multimerización.

Realización 42. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 1-41 la proteína inmunomoduladora está unida a un dominio Fc o una variante del mismo con función efectora reducida.

Realización 43. En algunas realizaciones adicionales de la realización 42, el dominio Fc es un dominio de IgG1, un dominio de IgG2 o es una variante del mismo con función efectora reducida.

Realización 44. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 39-41, el dominio Fc es de mamífero, opcionalmente humano; o el dominio Fc variante comprende una o más modificaciones de aminoácidos en comparación con un dominio Fc no modificado que es de mamífero, opcionalmente humano.

Realización 45. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 42-44, el dominio Fc o variante del mismo comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 226 o SEQ ID NO: 227 o una secuencia de aminoácidos que exhibe al menos un 85 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 226 o SEQ ID NO: 227.

Realización 46. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 38-41, la proteína inmunomoduladora está unida indirectamente mediante un enlazador.

Realización 47. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 41-46, la proteína inmunomoduladora es un dímero.

Realización 48. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 1-47, la proteína inmunomoduladora está unida a una membrana liposomal.

Realización 49. En la presente memoria también se describe una proteína inmunomoduladora, que comprende al menos dos dominios de la superfamilia de inmunoglobulinas (IgSF) que no son de inmunoglobulina, en donde: al menos uno de los dominios de IgSF modificados que no son de inmunoglobulina tiene una afinidad modificada para exhibir una unión alterada a su compañero de unión afín; y cada uno de los al menos dos dominios de IgSF modificados que no son de inmunoglobulina se une específicamente de forma independiente al menos a un compañero de unión afín diferente.

Realización 50. En algunas realizaciones adicionales de la realización 49, cada uno de los al menos dos dominios de IgSF que no son de inmunoglobulina son dominios de IgSF con afinidad modificada, en donde el primer dominio de IgSF modificado que no es de inmunoglobulina comprende una o más sustituciones de aminoácidos en un primer dominio de IgSF de tipo salvaje y el segundo dominio de IgSF modificado que no es de inmunoglobulina comprende una o más sustituciones de aminoácidos en un segundo dominio de IgSF de tipo salvaje.

Realización 51. En algunas realizaciones adicionales de la realización 50, el primer dominio de IgSF modificado que no es de inmunoglobulina exhibe unión alterada al menos a uno de sus compañeros de unión afines en comparación con el primer dominio de IgSF de tipo salvaje; y el segundo dominio de IgSF modificado que no es de inmunoglobulina exhibe unión alterada al menos a uno de sus compañeros de unión afines en comparación con el segundo dominio de IgSF de tipo salvaje.

Realización 52. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 49-51, los diferentes compañeros de unión afines son especies moleculares de la superficie celular expresadas en la superficie de una célula de mamífero.

Realización 53. En algunas realizaciones adicionales de la realización 52, las diferentes especies moleculares de la superficie celular se expresan en configuración cis o configuración trans.

Realización 54. En algunas realizaciones adicionales de la realización 52 o la realización 53, la célula de mamífero es una de las dos células de mamífero que forman una sinapsis inmunológica (IS) y las diferentes especies moleculares de la superficie celular se expresan en al menos una de las dos células de mamífero que forman la IS.

Realización 55. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 52-54, al menos una de las células de mamífero es un linfocito.

Realización 56. En algunas realizaciones adicionales de la realización 55, el linfocito es una célula NK o una célula T.

Realización 57. En algunas realizaciones adicionales de la realización 55 o realización 56, la unión de la proteína inmunomoduladora a la célula modula la actividad inmunológica del linfocito.

Realización 58. En algunas realizaciones adicionales de la realización 57, la proteína inmunomoduladora es capaz de efectuar una actividad inmunológica incrementada en comparación con la proteína de tipo salvaje que comprende el dominio de IgSF de tipo salvaje.

Realización 59. En algunas realizaciones adicionales de la realización 57, la proteína inmunomoduladora es capaz de efectuar una actividad inmunológica disminuida en comparación con la proteína de tipo salvaje que comprende el dominio de IgSF de tipo salvaje.

Realización 60. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 52-59, al menos una de las células de mamífero es una célula tumoral.

Realización 61. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 52-60, las células de mamífero son células humanas.

Realización 62. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 54-61, la proteína inmunomoduladora es capaz de unirse específicamente a las dos células de mamífero que forman la IS.

Realización 63. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 49-62, el primer y segundo dominios de IgSF modificados comprenden cada uno una o más sustituciones de aminoácidos en diferentes dominios de IgSF de tipo salvaje.

Realización 64. En algunas realizaciones adicionales de la realización 63, los diferentes dominios de IgSF de tipo salvaje son de diferentes miembros de la familia de IgSF.

Realización 65. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 49-64, el primer y segundo dominios de IgSF modificados son combinaciones de tipo no salvaje.

Realización 66. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 49-65, el primer dominio de IgSF de tipo salvaje y el segundo dominio de IgSF de tipo salvaje son cada uno individualmente de un miembro de la familia de IgSF de una familia seleccionada de la familia de proteínas reguladoras de señales (SIRP), familia semejantes al receptor de activación expresado en células mieloides (TREML), familia de moléculas de adhesión celular relacionadas con antígenos carcinoembrionarios (CEACAM), familia de lectinas similares a Ig de unión a ácido siálico (SIGLEC), familia de butirofilinas, familia B7, familia CD28, familia que contiene dominios de conjunto V y de inmunoglobulina (VSIG), familia de dominios de conjunto V transmembrana (VSTM), familia de complejos mayores de histocompatibilidad (MHC), familia de moléculas de activación linfocítica de señalización (SLAM), receptor semejante a inmunoglobulina leucocitaria (LIR), familia de nectina (Nec), familia semejante a nectina (NECL), familia relacionada con el receptor de poliovirus (PVR), familia de receptores desencadenantes de citotoxicidad natural (NCR), familia de inmunoglobulina y mucina de células T (TIM) o familia de receptores semejantes a inmunoglobulina de células asesinas (KIR).

Realización 67. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 49-66, el primer dominio de IgSF de tipo salvaje y el segundo dominio de IgSF de tipo salvaje son cada uno individualmente de un miembro de IgSF seleccionado de CD80, CD86, PD-L1, PD-L2 , Ligando ICOS, B7-H3, B7-H4, CD28, CTLA4, PD-1, ICOS, BTLA, CD4, CD8-alfa, CD8-beta, LAG3, TIM-3, CEACAM1, TIGIT, PVR, PVRL2, CD226, CD2, CD160, CD200, CD200R o Nkp30.

Realización 68. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 49-67, el primer dominio de IgSF modificado y el segundo dominio de IgSF modificado comprenden, cada uno individualmente, al menos un 85 % de identidad de secuencia con un dominio de IgSF de tipo salvaje o un fragmento de unión específico del mismo contenido en la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las SEQ ID NO: 1 -27.

Realización 69. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 49-68, el primer y segundo dominio de IgSF de tipo salvaje, cada uno individualmente, es un miembro de la familia B7.

Realización 70. En algunas realizaciones adicionales de la realización 69, el primer y segundo dominio de IgSF de tipo salvaje, cada uno individualmente, es de CD80, CD86 o ICOSLG.

R e a liz a c ió n 71. En a lg u n a s re a liz a c io n e s a d ic io n a le s d e u n a c u a lq u ie ra d e la s re a liz a c io n e s 49 -68 , e l p r im e r o s e g u n d o dominio de IgSF de tipo salvaje es de un miembro de la familia B7 y el otro del primer o segundo dominio de IgSF de tipo salvaje es de otra familia de IgSF.

Realización 72. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 49-68 y 71, el primer y segundo dominio de IgSF de tipo salvaje es de ICOSLG y NKp30.

Realización 73. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 49-68 y 71, el primer y segundo dominio de IgSF de tipo salvaje es de CD80 y NKp30.

Realización 74. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 49-73, el primer y segundo dominio de IgSF de tipo salvaje, cada uno individualmente, es un miembro de IgSF humano.

Realización 75. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 49-74, el primer y segundo dominio de IgSF de tipo salvaje, cada uno individualmente, es un dominio IgV y un dominio IgC1, un dominio IgC2 o una unión específica del mismo.

Realización 76. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 49-75, el primer dominio no modificado que no es de inmunoglobulina y el segundo dominio modificado que no es de inmunoglobulina, cada uno individualmente, es un dominio IgV modificado, un dominio IgC1 modificado o un dominio IgC2 modificado o es un fragmento de unión específico del mismo que comprende la una o más sustituciones de aminoácidos.

Realización 77. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 49-76, al menos uno del primer dominio modificado que no es de inmunoglobulina o el segundo dominio modificado que no es de inmunoglobulina es un dominio IgV modificado.

Realización 78. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 49-77, el primer dominio de IgSF modificado que no es de inmunoglobulina y el segundo dominio de IgSF modificado que no es de inmunoglobulina, cada uno individualmente, comprende 1 y no más de veinte sustituciones de aminoácidos.

Realización 79. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 49-78, el primer dominio de IgSF modificado que no es de inmunoglobulina y el segundo dominio de IgSF modificado que no es de inmunoglobulina, cada uno individualmente, comprende 1 y no más de diez sustituciones de aminoácidos.

Realización 80. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 49-79, el primer dominio de IgSF modificado que no es de inmunoglobulina y el segundo dominio de IgSF modificado que no es de inmunoglobulina, cada uno individualmente, comprende 1 y no más de cinco sustituciones de aminoácidos.

Realización 81. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 49-80, al menos uno del primer o segundo dominio de IgSF modificado que no es de inmunoglobulina tiene entre un 10 % y 90 % de la afinidad de unión del dominio de IgSF de tipo salvaje para al menos uno de sus compañeros de unión afines.

Realización 82. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 49-81, al menos uno del primer o segundo dominio de IgSF modificado que no es de inmunoglobulina tiene al menos un 120 % de la afinidad de unión del dominio de IgSF de tipo salvaje para al menos uno de sus compañeros de unión afines.

Realización 83. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 49-80 y 82, el primer y segundo dominio de IgSF modificado que no es de inmunoglobulina tiene, cada uno individualmente, al menos un 120 % de la afinidad de unión del dominio de IgSF de tipo salvaje para al menos uno de sus compañeros de unión afines. Realización 84. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 49-83, la proteína inmunomoduladora es soluble.

Realización 85. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 49-84, la proteína inmunomoduladora está glicosilada o pegilada.

Realización 86. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 49-85, la proteína inmunomoduladora está unida a un dominio de multimerización.

Realización 87. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 49-86, la proteína inmunomoduladora está unida a un dominio Fc o una variante del mismo con función efectora reducida.

Realización 88. En algunas realizaciones adicionales de la realización 87, el dominio Fc es un dominio de IgG1, un dominio de IgG2 o es una variante del mismo con función efectora reducida.

Realización 89. En algunas realizaciones adicionales de la realización 87 o la realización 88, el dominio Fc es de mamífero, opcionalmente humano; o el dominio Fc variante comprende una o más modificaciones de aminoácidos en comparación con un dominio Fc no modificado que es de mamífero, opcionalmente humano.

R e a liz a c ió n 90. En a lg u n a s re a liz a c io n e s a d ic io n a le s d e u n a c u a lq u ie ra d e la s re a liz a c io n e s 87 -89 , e l d o m in io F c o variante del mismo comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 226 o SEQ ID NO: 227 o una secuencia de aminoácidos que exhibe al menos un 85 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 226 o SEQ ID NO: 227.

Realización 91. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 86-90, el polipéptido CD80 variante está unido indirectamente mediante un enlazador.

Realización 92. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 86-91, la proteína inmunomoduladora es un dímero.

Realización 93. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 49-92, la proteína inmunomoduladora comprende además uno o más dominios de IgSF que no son de inmunoglobulina adicionales que son iguales o diferentes del primer o segundo dominio de IgSF que no es de inmunoglobulina.

Realización 94. En algunas realizaciones adicionales de la realización 93, el uno o más dominios de IgSF que no son de inmunoglobulina adicionales es un dominio de IgSF con afinidad modificada.

Realización 95. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 49-94, la proteína inmunomoduladora está unida a una membrana liposomal.

Realización 96. En algunas realizaciones, se proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido inmunomodulador de una cualquiera de las realizaciones 1 -95.

Realización 97. En algunas realizaciones adicionales de la realización 96, el ácido nucleico es un ácido nucleico sintético. Realización 98. En algunas realizaciones adicionales de la realización 96 o la realización 97, el ácido nucleico es ADNc. Realización 99. En algunas realizaciones, se proporciona un vector, que comprende la molécula de ácido nucleico de cualquiera de las realizaciones 96-98.

Realización 100. En algunas realizaciones adicionales de la realización 99, el vector es un vector de expresión. Realización 101. En algunas realizaciones, se proporciona una célula, que comprende el vector de la realización 99 o la realización 100.

Realización 102. En algunas realizaciones adicionales de la realización 101, la célula es una célula eucariota o una célula procariota.

Realización 103. En algunas realizaciones, se proporciona un método para producir una proteína inmunomoduladora, que comprende introducir la molécula de ácido nucleico de cualquiera de las realizaciones 96-98 o el vector de la realización 99 o la realización 100 en una célula huésped en condiciones para expresar la proteína en la célula. Realización 104. En algunas realizaciones adicionales de la realización 103, el método comprende además aislar o purificar la proteína inmunomoduladora de la célula.

Realización 105. En algunas realizaciones, se proporciona una composición farmacéutica que comprende la proteína inmunomoduladora de cualquiera de las realizaciones 1 -95.

Realización 106. En algunas realizaciones adicionales de la realización 105, la composición farmacéutica comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable.

Realización 107. En algunas realizaciones adicionales de la realización 105 o la realización 106, la composición farmacéutica es estéril.

Realización 108. En la presente memoria también se describe un artículo de fabricación que comprende la composición farmacéutica de cualquiera de las realizaciones 105-107 en un vial.

Realización 109. En algunas realizaciones adicionales de la realización 108, el vial está sellado.

Realización 110. En la presente memoria también se describe un kit que comprende la composición farmacéutica de cualquiera de las realizaciones 105-107 e instrucciones para su uso.

Realización 111. En la presente memoria también se describe un kit que comprende el artículo de fabricación según la realización 108 o la realización 109, e instrucciones para su uso.

Realización 112. En algunas realizaciones, se proporciona una composición farmacéutica que comprende la proteína inmunomoduladora de cualquiera de las realizaciones 1-95 para su uso en un método para modular una respuesta inmune en un sujeto, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína inmunomoduladora de cualquiera de realizaciones 1 -95 al sujeto.

Realización 113. En algunas realizaciones adicionales de la realización 112, la modulación de la respuesta inmune trata una enfermedad o afección en el sujeto.

Realización 114. En algunas realizaciones adicionales de la realización 112 o la realización 113, la respuesta inmune se incrementa.

Realización 115. En algunas realizaciones adicionales de la realización 114, la enfermedad o afección es un tumor o cáncer.

Realización 116. En algunas realizaciones adicionales de la realización 114 o la realización 115, la enfermedad o afección se selecciona de melanoma, cáncer de pulmón, cáncer de vejiga o una malignidad hematológica.

Realización 117. En algunas realizaciones adicionales de la realización 112 o la realización 113, la respuesta inmune se disminuye.

Realización 118. En algunas realizaciones adicionales de la realización 117, la enfermedad o afección es una enfermedad o afección inflamatoria.

Realización 119. En algunas realizaciones adicionales de la realización 117 o la realización 118, la enfermedad o afección se selecciona de la enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, esclerosis múltiple, asma, artritis reumatoide o psoriasis.

Realización 120. En la presente memoria también se describe un método para identificar una proteína inmunomoduladora con afinidad modificada, que comprende: a) poner en contacto una proteína modificada que comprende al menos un dominio de la superfamilia de inmunoglobulinas (IgSF) modificado que no es de inmunoglobulina o un fragmento de unión específico del mismo con al menos dos compañeros de unión afines en condiciones capaces de efectuar la unión de la proteína con los al menos dos compañeros de unión afines, en donde el al menos un dominio de IgSF modificado comprende una o más sustituciones de aminoácidos en un dominio de IgSF de tipo salvaje; b) identificar una proteína modificada que comprende el dominio de IgSF modificado que tiene una unión aumentada al menos a uno de los dos compañeros de unión afines en comparación con una proteína que comprende el dominio de IgSF de tipo salvaje; y c) seleccionar una proteína modificada que comprende el dominio de IgSF modificado que se une de forma no competitiva a los al menos dos compañeros de unión afines, identificando así la proteína inmunomoduladora con afinidad modificada.

Realización 121. En algunas realizaciones adicionales de la realización 120, la etapa b) comprende identificar una proteína modificada que comprende un dominio de IgSF modificado que tiene una unión aumentada a cada uno de los al menos dos compañeros de unión afines en comparación con una proteína que comprende el dominio de tipo salvaje.

Realización 122. En algunas realizaciones adicionales de la realización 120 o la realización 121, antes de la etapa a), introducir una o más sustituciones de aminoácidos en el dominio de IgSF de tipo salvaje, generando así una proteína modificada que comprende el dominio de IgSF modificado.

Realización 123. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 120-122, la proteína modificada comprende al menos dos dominios de IgSF modificados o fragmentos de unión específicos de los mismos, en donde el primer dominio de IgSF comprende una o más sustituciones de aminoácidos en un primer dominio de IgSF de tipo salvaje y el segundo dominio de IgSF con afinidad modificada que no es de inmunoglobulina comprende una o más sustituciones de aminoácidos en un segundo dominio de IgSF de tipo salvaje.

Realización 124. En algunas realizaciones adicionales de la realización 123, el primer y segundo dominio de IgSF con afinidad modificada que no es de inmunoglobulina se unen cada uno específicamente al menos a un compañero de unión afín diferente.

Realización 125. En algunas realizaciones, se proporciona una proteína inmunomoduladora de la invención reivindicada que comprende al menos un dominio de la superfamilia de inmunoglobulinas (IgSF) con afinidad modificada que no es de inmunoglobulina, en donde el dominio de IgSF con afinidad modificada se une específicamente de forma no competitiva al menos a dos especies moleculares de la superficie celular, en donde cada una de las especies moleculares se expresa en al menos una de las dos células de mamífero que forman una sinapsis inmunológica (IS), en donde una de las células de mamífero es un linfocito y en donde la unión del dominio de IgSF con afinidad modificada modula la actividad inmunológica del linfocito.

Realización 126. En algunas realizaciones adicionales de la realización 125, el dominio de IgSF con afinidad modificada se une específicamente a las dos células de mamífero que forman la IS.

Realización 127. En algunas realizaciones adicionales de la realización 125 o la realización 126, la proteína inmunomoduladora comprende al menos dos dominios de IgSF con afinidad modificada que no son de inmunoglobulina y la proteína inmunomoduladora se une específicamente a las dos células de mamífero que forman la IS.

Realización 128. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 125-127, las especies moleculares de la superficie celular de IgSF son miembros de IgSF humanos.

Realización 129. Según la invención, el dominio de IgSF con afinidad modificada de una cualquiera de las realizaciones 125-128 comprende al menos un dominio de CD80 humano con afinidad modificada.

Realización 130. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 125-129, la proteína inmunomoduladora comprende un miembro de IgSF de mamífero con afinidad modificada.

Realización 131. Según la invención, el miembro de IgSF de mamífero con afinidad modificada de una cualquiera de las realizaciones 125-130 es CD80.

Realización 132. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 125-131, la actividad inmunológica se potencia.

Realización 133. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 125-132, la actividad inmunológica se suprime.

Realización 134. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 125-133, una de las dos células de mamífero es una célula tumoral.

Realización 135. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 125-134, el linfocito es una célula NK o una célula T.

Realización 136. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 125-135, las células de mamífero son células de ratón, rata, mono cynomologus o humanas.

Realización 137. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 125-136, el dominio de IgSF con afinidad modificada tiene entre un 10 % y un 90 % de la afinidad de unión del dominio de IgSF de tipo salvaje para al menos una de las dos especies moleculares de la superficie celular.

Realización 138. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 125-137, el dominio de IgSF con afinidad modificada se une específicamente de forma no competitiva a exactamente un miembro de IgSF. Realización 139. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 125-138, el dominio de IgSF con afinidad modificada tiene al menos un 120 % de la afinidad de unión que su dominio de IgSF de tipo salvaje para al menos una de las dos especies moleculares de la superficie celular.

Realización 140. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 125-139, el dominio de IgSF con afinidad modificada es un dominio IgV, IgC1 o IgC2 con afinidad modificada.

Realización 141. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 125-140, el dominio de IgSF con afinidad modificada difiere en al menos una y no más de diez sustituciones de aminoácidos de su dominio de IgSF de tipo salvaje.

Realización 142. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 125-141, el dominio de IgSF con afinidad modificada difiere en al menos una y no más de cinco sustituciones de aminoácidos de su dominio de IgSF de tipo salvaje.

Realización 143. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 125-142, el dominio de IgSF con afinidad modificada es un dominio de IgSF CD80 humano.

Realización 144. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 125-143, la proteína inmunomoduladora comprende al menos dos dominios de IgSF con afinidad modificada, en donde los dominios de IgSF con afinidad modificada no son la misma especie de dominio de IgSF.

Realización 145. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 125-144, la proteína inmunomoduladora está unida covalentemente, directa o indirectamente, a un fragmento de anticuerpo cristalizable (Fc). Realización 146. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 125-145, la proteína inmunomoduladora está en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Realización 147. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 125-146, la proteína inmunomoduladora está glicosilada o pegilada.

Realización 148. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 125-147, la proteína inmunomoduladora es soluble.

Realización 149. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 125-148, la proteína inmunomoduladora está unida a una membrana liposomal.

Realización 150. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 125-149, la proteína inmunomoduladora se dimeriza mediante enlaces disulfuro intermoleculares.

Realización 151. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 125-150, las especies moleculares de la superficie celular se expresan en configuración cis o configuración trans.

Realización 152. En la presente memoria también se describe una proteína inmunomoduladora que comprende al menos dos dominios de la superfamilia de inmunoglobulinas (IgSF) con afinidad modificada que no son de inmunoglobulina, en donde los dominios de IgSF con afinidad modificada se unen cada uno específicamente a una especie molecular de la superficie celular diferente, en donde cada una de las especies moleculares se expresa en al menos una de las dos células de mamífero que forman una sinapsis inmunológica (IS), en donde una de las células de mamífero es un linfocito y en donde la unión del dominio de IgSF con afinidad modificada modula la actividad inmunológica del linfocito.

Realización 153. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 125-152, al menos uno de los dominios de IgSF con afinidad modificada se une competitivamente.

Realización 154. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 125-153, los dominios de IgSF con afinidad modificada no son la misma especie de dominio de IgSF.

Realización 155. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 125-154, los dominios de IgSF con afinidad modificada son combinaciones de tipo no salvaje.

Realización 156. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 125-155, las especies moleculares de la superficie celular son miembros de IgSF humano.

Realización 157. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 125-156, los al menos dos dominios de IgSF con afinidad modificada son de al menos uno de: CD80, CD86, CD274, PDCD1 Lg 2, ICOSLG, CD276, VTCN1, CD28, CTLA4, PDCD1, ICOS, BTLA, CD4, CD8A, CD8B, LAG3, HAVCR2, CEACAM1, TIGIT, PVR, PVRL2, CD226, CD2, CD160, CD200 o CD200R1.

Realización 158. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 125-157, la proteína inmunomoduladora comprende al menos dos miembros de IgSF de mamífero con afinidad modificada.

Realización 159. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 125-158, los miembros de IgSF de mamífero son miembros de IgSF humano.

Realización 160. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 125-159, los miembros de IgSF de mamífero son al menos dos de: CD80, CD86, CD274, PDCD1LG2, ICOSLG, CD276, VTCN1, CD28, CTLA4, PDCD1, ICOS, BTLA, CD4, CD8A, CD8B, LAG3, HAVCR2, CEACAM1, TIGIT, PVR, PVRL2, CD226, CD2, CD160, CD200 o CD200R1.

Realización 161. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 125-160, la actividad inmunológica se potencia.

Realización 38. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 125-1, la actividad inmunológica se suprime.

Realización 162. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 125-161, una de las dos células de mamífero es una célula tumoral.

Realización 163. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 125-162, el linfocito es una célula NK o una célula T.

Realización 164. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 125-163, las células de mamífero son células de ratón, rata, mono cynomologus o humanas.

Realización 165. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 125-164, al menos uno de los dos dominios de IgSF con afinidad modificada tiene entre un 10 % y un 90 % de la afinidad de unión del dominio de IgSF de tipo salvaje para al menos una de las especies moleculares de la superficie celular.

Realización 166. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 125-165, al menos uno de los dos dominios de IgSF con afinidad modificada se une específicamente a exactamente una especie molecular de la superficie celular.

Realización 167. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 125-166, al menos uno de los dos dominios de IgSF con afinidad modificada tiene al menos un 120 % de la afinidad de unión como su dominio de IgSF de tipo salvaje para al menos una de las dos especies moleculares de la superficie celular.

Realización 168. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 125-167, los dominios de IgSF con afinidad modificada son al menos uno de un dominio IgV, IgC1 o IgC2.

Realización 169. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 125-168, cada uno de los al menos dos dominios de IgSF con afinidad modificada difiere en al menos una y no más de diez sustituciones de aminoácidos de su dominio de IgSF de tipo salvaje.

Realización 170. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 125-169, cada uno de los al menos dos dominios de IgSF con afinidad modificada difiere en al menos una y no más de cinco sustituciones de aminoácidos de su dominio de IgSF de tipo salvaje.

Realización 171. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 125-170, la proteína inmunomoduladora está unida covalentemente, directa o indirectamente, a un fragmento de anticuerpo cristalizable (Fc). Realización 172. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 125-171, la proteína inmunomoduladora está en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Realización 173. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 125-172, la proteína está glicosilada o pegilada.

Realización 174. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 125-173, la proteína es soluble.

Realización 175. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 125-174, la proteína está unida a una membrana liposomal.

Realización 176. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 125-175, la proteína se dimeriza mediante enlaces disulfuro intermoleculares.

Realización 177. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 125-176, las especies moleculares de la superficie celular se expresan en configuración cis o configuración trans.

Realización 178. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 125-177, la proteína inmunomoduladora tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEQ ID NO: 1-26, una combinación o un fragmento de la misma.

Realización 179. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 125-178, la proteína inmunomoduladora tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEQ ID NO: 1-26, una combinación o un fragmento de la misma.

Realización 180. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 125-179, la proteína inmunomoduladora tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEQ ID NO: 1-26, una combinación o un fragmento de la misma.

Realización 181. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 125-180, la proteína inmunomoduladora tiene al menos un 99 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEQ ID NO: 1-26, una combinación o un fragmento de la misma.

Realización 182. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 125-181, la proteína inmunomoduladora comprende además una segunda proteína inmunomoduladora, en donde la segunda proteína inmunomoduladora tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEQ ID NO: 1 -26 o un fragmento de la misma.

Realización 183. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 125-182, la proteína inmunomoduladora comprende además una segunda proteína inmunomoduladora, en donde la segunda proteína inmunomoduladora tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEQ ID NO: 1 -26 o un fragmento de la misma.

Realización 184. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 125-183, la proteína inmunomoduladora comprende además una segunda proteína inmunomoduladora, en donde la segunda proteína inmunomoduladora tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEQ ID NO: 1 -26 o un fragmento de la misma.

Realización 185. En algunas realizaciones adicionales de una cualquiera de las realizaciones 125-184, la proteína inmunomoduladora comprende además una segunda proteína inmunomoduladora, en donde la segunda proteína inmunomoduladora tiene al menos un 99 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEQ ID NO: 1 -26 o un fragmento de la misma.

Realización 186. En algunas realizaciones, se proporciona un ácido nucleico recombinante que codifica una cualquiera de las proteínas inmunomoduladoras de las realizaciones 125-185.

R e a liz a c ió n 187. En a lg u n a s re a liz a c io n e s , s e p ro p o rc io n a u n v e c to r d e e x p re s ió n re c o m b in a n te q u e c o m p re n d e un ácido nucleico de la realización 186.

Realización 188. En algunas realizaciones, se proporciona una célula huésped recombinante que comprende el vector de expresión de la realización 187.

Realización 189. En algunas realizaciones, se proporciona un método para preparar una proteína inmunomoduladora de una cualquiera de las realizaciones 125-185, que comprende cultivar la célula huésped recombinante en condiciones que expresan la proteína inmunomoduladora, expresar la proteína inmunomoduladora codificada por el vector de expresión recombinante en la misma, y purificar la proteína inmunomoduladora recombinante expresada por la misma.

Realización 190. En algunas realizaciones, se proporciona un método para tratar a un paciente mamífero que necesita una respuesta inmunológica potenciada o suprimida mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de proteína inmunomoduladora de una cualquiera de las realizaciones 125-185.

Realización 191. En algunas realizaciones adicionales de la realización 190, la respuesta inmunológica potenciada trata el melanoma, cáncer de pulmón, cáncer de vejiga o una malignidad hematológica en el paciente.

Realización 192. En algunas realizaciones adicionales de la realización 190, la respuesta inmunológica suprimida trata la enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, esclerosis múltiple, asma, artritis reumatoide o psoriasis en el paciente.

VIII. Ejemplos

Los siguientes ejemplos se incluyen solo para fines ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de la invención.

Los Ejemplos 1-8 describen el diseño, la creación y el cribado de proteínas inmunomoduladoras con CD80 (B7-1), CD86 (B7-2), ICOSL y NKp30 con afinidad modificada, que son componentes de la sinapsis inmune (IS) que han demostrado un papel dual tanto en la activación como en la inhibición inmunes. Estos ejemplos demuestran que la afinidad modificada de los dominios de IgSF produce proteínas que pueden actuar tanto para aumentar como para disminuir la actividad inmunológica. Este trabajo también describe las diversas combinaciones de esos dominios fusionados en pares (es decir, apilados) para formar una proteína inmunomoduladora de Tipo II para lograr la actividad inmunomoduladora.

Ejemplo 1

Generación de construcciones de ADN mutante de dominios de IgSF

El Ejemplo 1 describe la generación de construcciones de ADN mutante de dominios de IgSF CD80, CD86, ICOSL y NKp30 humanos para la traducción y expresión en la superficie de levadura como bibliotecas de presentación en levadura.

A. Bibliotecas degeneradas

Para las bibliotecas que se dirigen a residuos específicos de la proteína diana para la aleatorización completa o parcial con codones degenerados, los ADN codificantes de los dominios extracelulares (ECD) de CD80 humano (SEQ ID NO: 28), ICOSL (SEQ ID NO: 32) y NKp30 (SEQ ID NO: 54) se pidieron a Integrated DNA Technologies (Coralville, IA) como un conjunto de oligonucleótidos superpuestos de hasta 80 pares de bases (pb) de longitud. Para generar una biblioteca de diversas variantes de cada ECD, los oligonucleótidos contenían codones degenerados deseados en las posiciones de aminoácidos deseadas. Se generaron codones degenerados usando un algoritmo en la URL rosettadesign.med.unc.edu/SwiftLib/.

En general, las posiciones para mutar y degenerar codones se eligieron de la siguiente manera: se usaron estructuras cristalinas (CD80, NKp30) o modelos de homología (ICOSL) de los pares diana-ligando de interés para identificar los residuos de contacto del ligando, así como los residuos que están en la interfaz de la interacción de las proteínas. Este análisis se realizó utilizando un visor de estructuras disponible en la URL: spdbv.vital-it.ch). Por ejemplo, una estructura cristalina para CD80 unida a CTLA4 está disponible públicamente en la URL: www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=1 I8L) y se diseñó una biblioteca dirigida basada en la interfaz CD80: CTLA4 para la selección de ligantes mejorados para CTLA4. Sin embargo, no hay estructuras de CD80 disponibles con los ligandos CD28 y PDL1, por lo que también se utilizó la misma biblioteca para seleccionar los ligantes de CD28 (se une a la misma región en CD80 que CTLA4) y PDL1 (no se sabe si PDL1 se une al mismo sitio que CTLA4 ).

La siguiente etapa en el diseño de la biblioteca fue el alineamiento de secuencias de CD80, ICOSL o NKp30 humanas, de ratones, ratas y monos para identificar los residuos conservados. En base a este análisis, los residuos diana conservados se mutaron con codones degenerados que solo especificaban cambios conservativos de aminoácidos más el residuo de tipo salvaje. Los residuos que no estaban conservados se mutaron de manera más agresiva, pero también se incluyó el residuo de tipo salvaje. Se utilizaron codones degenerados que también codificaban el residuo de tipo salvaje para evitar la mutagénesis excesiva de la proteína diana. Por la misma razón, solo se seleccionaron hasta 20 posiciones para mutagénesis a la vez. Estos residuos eran una combinación de residuos de contacto y residuos de interfaz sin contacto.

Los oligonucleótidos se disolvieron en agua estéril, se mezclaron en proporciones equimolares, se calentaron hasta 95 °C durante cinco minutos y se enfriaron lentamente hasta temperatura ambiente para la hibridación. A continuación, se utilizaron cebadores de oligonucleótidos específicos de ECD que se hibridan al inicio y al final de los ECD, respectivamente, para generar el producto de PCR. Se usaron entonces oligonucleótidos específicos de ECD que se superponen en 40-50 pb con una versión modificada del vector de clonación pBYDS03 (Life Technologies USA), más allá e incluyendo los sitios de clonación BamH1 y Kpn1, para amplificar 100 ng de producto de PCR de la etapa anterior para generar un total de 5 pg de ADN. Ambas PCR se realizaron mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando la mezcla maestra de PCR OneTaq 2x (New England Biolabs, EE. UU.). Los segundos productos de PCR se purificaron usando un kit de purificación de PCR (Qiagen, Alemania) y se resuspendieron en agua desionizada estéril.

Para preparar la inserción de la biblioteca, se digirió una versión de presentación de levadura modificada del vector pBYDS03 con las enzimas de restricción BamH1 y Kpn1 (New England Biolabs, EE. UU.) y el fragmento de vector grande se purificó en gel y se disolvió en agua desionizada estéril. Se generó ADN listo para la electroporación para la siguiente etapa mezclando 12 pg de ADN de biblioteca con 4 pg de vector linealizado en un volumen total de 50 pl de agua desionizada y estéril. Una forma alternativa de generar bibliotecas dirigidas fue llevar a cabo mutagénesis dirigida a sitio (kit Multisite, Agilent, EE. UU.) de los ECD diana con oligonucleótidos que contenían codones degenerados. Este enfoque se utilizó para generar sub-bibliotecas que solo se dirigen a tramos específicos de proteína diana para mutagénesis. En estos casos, las sub-bibliotecas se mezclaron antes de continuar con las etapas de selección. En general, los tamaños de las bibliotecas estaban en el rango de 10E7 a 10E8 clones, excepto que las sub-bibliotecas estaban solo en el rango de 10E4 a 10E5. Se generaron bibliotecas grandes para CD80, ICOSL, CD86 y NKp30. Se generaron sub-bibliotecas para CD80, ICOSL y NKp30.

B. Bibliotecas aleatorias

También se construyeron bibliotecas aleatorias para identificar variantes del ECD de CD80 (SEQ ID NO: 28), CD86 (SEQ ID NO: 29), ICOSL (SEQ ID NO: 32) y NKp30 (SEQ ID NO: 54). El ADN que codifica los ECD de tipo salvaje se clonó entre los sitios BamH1 y Kpn1 del vector de presentación en levadura pBYDS03 modificado y luego se liberaron usando las mismas enzimas de restricción. El ADN liberado se mutagenizó entonces con el kit Genemorph II (Agilent, EE. UU.) para generar un promedio de tres a cinco cambios de aminoácidos por variante de biblioteca. El ADN mutagenizado se amplificó entonces mediante PCR de dos etapas y se procesó adicionalmente como se ha descrito anteriormente para las bibliotecas dirigidas.

Ejemplo 2

Introducción de bibliotecas de ADN en levadura

El Ejemplo 2 describe la introducción de bibliotecas de ADN de CD80, CD86, ICOSL y NKp30 en levadura.

Para introducir ADN de biblioteca aleatoria y degenerada en levadura, se prepararon células competentes para electroporación de la cepa de levadura BJ5464 (ATCC.org; ATCC número 208288) y se sometieron a electroporación en un Gene Pulser II (Biorad, EE. UU.) con el ADN listo para electroporación de la etapa anterior esencialmente como se describe (Colby, D.W. et al. 2004 Methods Enzymology 388, 348-358). La única excepción es que las células transformadas se crecieron en medio SCD-Leu selectivo mínimo no inductor para acomodar el marcador selectivo LEU2 portado por el plásmido pBYDS03 modificado.

El tamaño de la biblioteca se determinó sembrando en placas diluciones de células recién recuperadas en placas de agar SCD-Leu y extrapolando entonces el tamaño de la biblioteca a partir del número de colonias individuales de la siembra en placas que generó al menos 50 colonias por placa. El resto del cultivo electroporado se creció hasta la saturación y las células de este cultivo se subcultivaron en el mismo medio una vez más para minimizar la fracción de células sin transformar. Para mantener la diversidad de la biblioteca, esta etapa de subcultivo se llevó a cabo utilizando un inóculo que contenía al menos 10x veces más células que el tamaño de la biblioteca calculado. Las células del segundo cultivo saturado se resuspendieron en medio fresco que contenía glicerol estéril al 25 % (peso/volumen) hasta una densidad de 10E10/ml y se congelaron y almacenaron a -80 °C (preparación madre de biblioteca congelada).

Un litro de medio SCD-Leu consiste en 14,7 gramos de citrato de sodio, 4,29 gramos de monohidrato de ácido cítrico, 20 gramos de dextrosa, 6,7 gramos de base nitrogenada de levadura de la marca Difco y 1,6 gramos de suplemento de medio selectivo sintético de levadura sin leucina. El medio se esterilizó por filtración antes de su uso usando un dispositivo de filtro de vacío de 0,2 pM.

El tamaño de la biblioteca se determinó sembrando en placas diluciones de células recién recuperadas en placas de agar SCD-Leu y extrapolando entonces el tamaño de la biblioteca a partir del número de colonias individuales de una siembra en placa que genera al menos 50 colonias por placa.

Para segregar el plásmido de las células que contienen dos o más clones de bibliotecas diferentes, se tomaron varias células correspondientes a 10 veces el tamaño de la biblioteca del cultivo SCD-Leu de toda la noche y se subcultivaron 1/100 en medio SCD-Leu reciente y se crecieron toda la noche. Las células de este cultivo de toda la noche se resuspendieron en glicerol estéril al 25 % (peso/volumen) hasta una densidad de 10E10/ml y se congelaron y almacenaron a -80 °C (preparación madre de biblioteca congelada).

Ejemplo 3

Selección de levaduras

El Ejemplo 3 describe la selección de levaduras que expresan variantes con afinidad modificada de CD80, CD86, ICOSL y NKp30.

Se descongeló un número de células igual al menos a 10 veces el tamaño de la biblioteca a partir de preparaciones madre de biblioteca individuales, se suspendieron hasta 0,1 x 10E6 células/ml en medio SCD-Leu no inductor y se crecieron toda la noche. Al día siguiente, se centrifugó un número de células igual a 10 veces el tamaño de la biblioteca a 2.000 RPM durante dos minutos y se resuspendieron hasta 0,5 x 10E6 células/ml en medio SCDG-Leu inductor. Un litro del medio de inducción SCDG-Leu consiste en 5,4 gramos de Na2HPO4, 8.56 gramos de NaH2PO4*H2O, 20 gramos de galactosa, 2,0 gramos de dextrosa, 6,7 gramos de base nitrogenada de levadura Difco y 1,6 gramos de suplemento de medio selectivo sintético de levadura sin leucina disuelto en agua y esterilizado a través de un dispositivo de filtro de membrana de 0,22 pm. El cultivo se creció durante dos días a 20 °C para inducir la expresión de las proteínas de la biblioteca en la superficie de las células de levaduras.

Las células se procesaron con perlas magnéticas para reducir los no ligantes y enriquecer todas las variantes de CD80, CD86, ICOSL o NKp30 con la capacidad de unirse a sus proteínas de contraestructura recombinantes exógenas. Por ejemplo, se seleccionaron bibliotecas de CD80 dirigidas o aleatorias de levadura frente a cada uno de CD28, CTL-4, PD-L1, ICOS y B7-H6 por separado. Esto fue seguido entonces por dos o tres rondas de clasificación por citometría de flujo usando tinción de proteína de contraestructura exógena para enriquecer la fracción de células de levadura que muestra ligantes mejorados. El enriquecimiento con perlas magnéticas y las selecciones por citometría de flujo son esencialmente como se describe en Keith D. Miller, 1 Noah B. Pefaur, 2 y Cheryl L. Baird1 Current Protocols in Cytometry 4.7.1-4.7.30, julio de 2008.

Con las bibliotecas de CD80, CD86, ICOSL y NKp30, las proteínas del ligando diana se obtuvieron de R&D Systems (EE. UU.) como sigue: rCD28.Fc humano (es decir, proteína de fusión CD28-Fc recombinante), rPDL1.Fc, rCTLA4.Fc, rICOS.Fc y rB7H6.Fc. Las perlas magnéticas de estreptavidina se obtuvieron de New England Biolabs, EE. UU. Para la biotinilación de la proteína de contraestructura, se utilizó el kit de biotinilación no. de catálogo 21955, Life Technologies, EE. UU. Para la clasificación por citometría de flujo de dos colores, se utilizó un clasificador Becton Dickinson FACS Aria II. Los niveles de presentación de CD80, CD86, ICOSL o NKp30 se monitorizaron con un anticuerpo anti-hemaglutinina marcado con Alexafluor 488 (Life Technologies, EE. UU.). Las proteínas de fusión de Fc de unión a ligando rCD28.Fc, rCTLA4.Fc, rPDL1.Fc, rICOS.Fc o rB7-H6.Fc se detectaron con Fab de cabra específico de Ig humana conjugado con PE (Jackson ImmunoResearch, EE. UU.). Los dobletes de levaduras se eliminaron usando parámetros de dispersión directa (FSC)/dispersión lateral (SSC), y las puertas de clasificación se basaron en una mayor unión de ligando detectada en FL4 que poseía una unión de expresión de etiqueta más limitada en FL1.

Los resultados de levadura de las clasificaciones de la citometría de flujo se ensayaron para determinar una mayor afinidad de unión específica. La levadura de salida de clasificación se expandió y se volvió a inducir para expresar las variantes de dominio de IgSF con afinidad modificada particulares que codifican. A continuación, esta población se puede comparar con la cepa de levadura de tipo salvaje parental, o con cualquier otro resultado seleccionado, tal como la población de levadura de salida de perlas, mediante citometría de flujo.

Para ICOSL, los resultados de la segunda clasificación (F2) se compararon con la levadura ICOSL parental para la unión de cada uno de rICOS.Fc, rCD28.Fc y rCTLA4.Fc mediante la tinción doble de cada población con la expresión de la etiqueta anti-HA (hemaglutinina) y el secundario anti-Fc humano secundaria para detectar la unión del ligando.

En el caso de las variantes de levadura ICOSL seleccionadas para la unión a ICOS, los resultados de la clasificación F2 proporcionaron valores de intensidad de fluorescencia media (MFI) de 997, cuando se tiñeron con rICOS.Fc 5,6 nM, mientras que la MFI de la cepa ICOSL parental se midió en 397 cuando se tiñó con la misma concentración de rICOS.Fc. Esto representa una mejora de aproximadamente tres veces de la unión promedio en este grupo de clones seleccionado de F2, y se predice que los clones individuales de ese grupo tendrán una MFI/afinidad mucho más mejorada cuando se ensayen individualmente.

En el caso de las variantes de levadura ICOSL seleccionadas para la unión a CD28, los resultados de la clasificación F2 proporcionaron valores de MFI de 640 cuando se tiñeron con rCD28.Fc 100 nM, mientras que la MFI de la cepa ICOSL parental se midió a 29 cuando se tiñeron con la misma concentración de rCD28.Fc (mejora de 22 veces). En el caso de las variantes de levadura ICOSL seleccionadas para la unión a CTLA4, los resultados de la clasificación F2 proporcionaron valores de MFI de 949 cuando se tiñeron con rCTLA4.Fc 100 nM, mientras que la MFI de la cepa ICOSL parental se midió a 29 cuando se tiñó con la misma concentración de rCTLA4.Fc (mejora 32 veces).

En el caso de las variantes de levadura NKp30 seleccionadas para la unión a B7-H6, los resultados de la clasificación F2 proporcionaron valores de MFI de 533 cuando se tiñeron con rB7H6.Fc 16,6 nM, mientras que la MFI de la cepa parental NKp30 se midió a 90 cuando se tiñó con la misma concentración de rB7H6.Fc (mejora de 6 veces).

Es importante destacar que las MFI de todas los resultados de F2 descritas anteriormente cuando se midieron con el anticuerpo anti-etiqueta HA en FL1 no aumentaron y, a veces, disminuyeron en comparación con las cepas de tipo salvaje, lo que indica que el aumento de la unión no fue una función del aumento de la expresión de las variantes seleccionadas. en la superficie de la levadura, y validaron las estrategias de activación de seleccionar únicamente expresores medios a bajos con alta unión a ligando.

Ejemplo 4

Reformateo de los resultados de selección como fusiones de Fc y en diversos tipos de proteínas inmunomoduladoras

El Ejemplo 4 describe el reformateo de los resultados de selección como proteínas inmunomoduladoras que contienen un dominio extracelular (ECD) con afinidad modificada (variante) de CD80 o ICOSL, fusionado a una molécula de Fc (moléculas de fusión ECD-Fc variantes).

Las células de salida de las clasificaciones finales de citometría de flujo CD80 e ICOSL se crecieron hasta la densidad terminal en medio SCD-Leu. Los ADN plasmídicos de cada salida se aislaron usando un kit de aislamiento de ADN plasmídico de levadura (Zymoresearch, EE. UU.). Para las fusiones de Fc, se utilizaron cebadores de PCR con sitios de restricción añadidos adecuados para la clonación en el vector de fusión Fc de elección para amplificar por lotes, a partir de las preparaciones de ADN plasmídico, los ADN codificantes de los ECD diana mutantes. Después de la digestión por restricción, los productos de PCR se ligaron en un vector de fusión de Fc apropiado seguido de la transformación química en la cepa XL1 Blue de E. Coli (Agilent, EE.UU.) o NEB5alpha (New England Biolabs) según las instrucciones del proveedor. Un ejemplo de un vector de fusión de Fc es pFUSE-hIgG1-Fc2 (Invivogen, EE.UU.).

Las diluciones de las reacciones de transformación se sembraron en placas de agar LB que contenían 100 pg/ml de carbenicilina (Teknova, EE. UU.) para generar colonias individuales. A continuación, se crecieron hasta 96 colonias de cada transformación en placas de 96 pocillos hasta la saturación toda la noche a 37 °C en caldo LB (Teknova no. de catálogo L8112) y se envió una pequeña parte alícuota de cada pocillo para la secuenciación del ADN del inserto de ECD con el fin de identificar la o las mutaciones en todos los clones. La preparación de la muestra para la secuenciación del ADN se llevó a cabo utilizando protocolos proporcionados por el proveedor del servicio (Genewiz; South Plainfield, NJ). Después de la extracción de la muestra para la secuenciación del ADN, se añadió glicerol a los cultivos restantes para obtener un contenido final de glicerol del 25 % y las placas se almacenaron a -20 °C para su uso futuro como placas maestras (véase más abajo). Alternativamente, las muestras para la secuenciación de ADN se generaron mediante réplica de placas de cultivos líquidos crecidos en placas de agar sólido utilizando un replicador de 96 pocillos desechable (VWR, EE. UU.). Estas placas se incubaron toda la noche para generar parches de crecimiento y las placas se enviaron a Genewiz según lo especificado por Genewiz.

Después de identificar los clones de interés a partir del análisis de los datos de secuenciación de ADN generados por Genewiz, los clones de interés se recuperaron de las placas maestras y se crecieron individualmente hasta su densidad en 5 ml de caldo LB líquido que contenía 100 pg/ml de carbenicilina (Teknova, EE. UU.) y se usaron entonces 2 ml de cada cultivo para la preparación de aproximadamente 10 pg de ADN plasmídico miniprep de cada clon usando un kit estándar tal como el kit Pureyield (Promega). La identificación de los clones de interés implicó generalmente las siguientes etapas. Primero, los archivos de datos de secuencias de ADN se descargaron del sitio web de Genewiz. Todas las secuencias se curaron entonces manualmente para que comiencen al inicio de la región codificante de ECD. Las secuencias curadas se tradujeron por lotes utilizando un programa adecuado disponible en la URL: www.ebi.ac.uk/Tools/st/emboss_transeq/. Las secuencias traducidas se alinearon entonces usando un programa adecuado disponible en la URL: multalin.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html.

Los clones de interés se identificaron entonces usando los siguientes criterios: 1.) un clon idéntico aparece al menos dos veces en el alineamiento y 2.) una mutación aparece al menos dos veces en el alineamiento y preferiblemente en clones distintos. Los clones que cumplen con al menos uno de estos criterios fueron clones que se habían enriquecido con nuestro proceso de clasificación debido a una unión mejorada.

Para generar proteínas inmunomoduladoras que contienen un ECD de CD80 o ICOSL con al menos un dominio con afinidad modificada, se generó la molécula de ácido nucleico codificante para codificar una proteína diseñada de la siguiente manera: péptido señal seguido de ECD variante (mutante) seguido de un enlazador de tres alaninas (AAA) seguido de un Fc de IgG 1 humana que contiene la mutación N82G con referencia al Fc de IgG1 humana de tipo salvaje mostrado en la SEQ ID NO: 226. Dado que la construcción no incluye ninguna cadena ligera de anticuerpo que pueda formar un enlace covalente con una cisteína, el Fc de IgG 1 humana también contiene el reemplazo de los residuos de cisteína a un residuo de serina en la posición 5 (C5S) en comparación con el Fc de tipo salvaje o no modificado mostrado en la SEQ ID NO: 226.

Además, el Ejemplo 8 a continuación describe proteínas inmunomoduladoras adicionales que se generaron como construcciones apiladas que contienen al menos dos dominios con afinidad modificada diferentes de moléculas de CD80, CD86, ICOSL y NKp30 variantes identificadas unidas entre sí y fusionadas a un Fc.

Ejemplo 5

Expresión y purificación de fusiones de Fc

El Ejemplo 5 describe la expresión y purificación de alto rendimiento de proteínas de fusión de Fc que contienen ECD variante de CD80, CD86, ICOSL y Nkp30.

Se produjeron proteínas de fusión de Fc variantes recombinantes con el sistema de expresión Expi293 (Invitrogen, EE. UU.). Se añadieron 4 gg de cada ADN plasmídico de la etapa anterior a 200 gl de Opti-MEM (Invitrogen, EE. UU.) al mismo tiempo que se añadieron por separado 10,8 gl de ExpiFectamina a otros 200 gl de Opti-MEM. Después de 5 minutos, los 200 gl de ADN plasmídico se mezclaron con los 200 gl de ExpiFectamina y se incubaron adicionalmente durante 20 minutos más antes de añadir esta mezcla a las células. Se dispensaron diez millones de células Expi293 en pocillos separados de una placa de crecimiento de 24 pocillos profundos, de fondo cónico y estéril de 10 ml (Thomson Instrument Company, EE. UU.) en un volumen de 3,4 ml de medio Expi293 (Invitrogen, e E. UU.). Las placas se agitaron durante 5 días a 120 RPM en una incubadora de cultivo de células de mamíferos ajustada al 95 % de humedad y al 8 % de CO2. Después de una incubación de 5 días, las células se sedimentaron y se retiraron los sobrenadantes del cultivo.

La proteína se purificó de los sobrenadantes usando un kit de purificación de proteína A de 96 pocillos de alto rendimiento usando el protocolo del fabricante (número de catálogo 45202, Life Technologies, EE. UU.). Se cambió el tampón de las fracciones de elución resultantes a PBS utilizando una placa de desalación por rotación Zeba de 96 pocillos (número de catálogo 89807, Life Technologies, EE. UU.) usando el protocolo del fabricante. La proteína purificada se cuantificó utilizando la absorbancia de 280 nm medida con un instrumento Nanodrop (Thermo Fisher Scientific, EE. UU.), y la pureza de la proteína se evaluó cargando 5 gg de proteína en geles de poliacrilamida prefabricados NUPAGE (Life Technologies, EE. UU.) en condiciones desnaturalizantes y reductoras y subsiguiente electroforesis en gel. Las proteínas se visualizaron en el gel usando tinción de Coomassie estándar.

Ejemplo 6

Evaluación de la unión y actividad de moléculas que contienen dominios de IgSF maduradas por afinidad

A. Unión a contraestructuras expresadas en células

Este Ejemplo describe estudios de unión de las fusiones de Fc para mostrar la especificidad y afinidad de las proteínas inmunomoduladoras variantes del dominio CD80 e ICOSL para compañeros de unión afines.

Para producir células que expresan compañeros de unión afines, se diseñaron construcciones de expresión de superficie de mamíferos de longitud completa para cada uno de CD28, CTLA4, PD-L1, ICOS y B7-H6 humanos en el vector de expresión pcDNA3.1 (Life Technologies) y se obtuvieron de Genscript, EE. UU. Los estudios de unión se llevaron a cabo utilizando el sistema de transfección transitoria Expi293F (Life Technologies, EE. UU.) descrito anteriormente. Se determinó el número de células necesario para el experimento y se realizó la escala apropiada de transfección de 30 ml utilizando el protocolo sugerido por el fabricante. Para cada transfección de CD28, CTLA-4, PD-L1, ICOS, B7-H6 o simulacro de 30 ml, se incubaron 75 millones de células Expi293F con 30 gg de ADN de la construcción de expresión y 1,5 ml de reactivo ExpiFectamina 293 diluido durante 48 horas, momento en el que las células se recogieron para la tinción.

Para la tinción mediante citometría de flujo, se sembraron en placas 200.000 células de la transfección transitoria apropiada o control negativo en placas de fondo redondo de 96 pocillos. Las células se sedimentaron y se resuspendieron en tampón de tinción (PBS (disolución salina tamponada con fosfato), BSA al 1 % (albúmina de suero bovino) y azida sódica al 0,1 %) durante 20 minutos para bloquear la unión no específica. Posteriormente, las células se centrifugaron de nuevo y se resuspendieron en tampón de tinción que contenía proteína inmunomoduladora variante de 100 nM a 1 nM, dependiendo del experimento de cada proteína de fusión Fc variante CD80 candidata, Fc variante ICOSL o Fc variante IgSF apilada en 50 gl. La tinción primaria se realizó en hielo durante 45 minutos, antes de lavar las células en tampón de tinción dos veces. Se diluyó Fc antihumano conjugado con PE (Jackson ImmunoResearch, EE. UU.) 1: 150 en 50 gl de tampón de tinción y se añadió a las células y se incubó otros 30 minutos en hielo. El anticuerpo secundario se eliminó por lavado dos veces, las células se fijaron en formaldehído al 4 %/PBS y las muestras se analizaron en un citómetro de flujo FACScan (Becton Dickinson, EE. UU.).

Se calculó la intensidad de fluorescencia media (MFI) para cada transfectante y línea parental negativa con el software Cell Quest Pro (Becton Dickinson, EE. UU.).

B. Caracterización de la bioactividad

Este Ejemplo describe adicionalmente la caracterización de la bioactividad de la proteína variante de fusión de Fc en ensayos in vitro de células T primarias humanas.

1. Reacción de linfocitos mixtos (MLR)

Se ensayó la bioactividad de rICOSL.Fc o rCD80.Fc soluble en una reacción de linfocitos mixtos (MLR) humanos. Se generaron células dendríticas (DC) primarias humanas cultivando monocitos aislados de PBMC (BenTech Bio, EE. UU.) in vitro durante 7 días con 500U/ml de rIL-4 (R&D Systems, EE. UU.) y 250U/ml de rGM-CSF (R&D Systems, EE. UU.) em medio Ex-Vivo 15 (Lonza, Suiza). Se cocultivaron 10.000 DC maduradas y 100.000 células T CD4+ alogénicas purificadas (BenTech Bio, EE. UU.) con proteínas de fusión ICOSL o CD80 Fc variante y controles en placas de fondo redondo de 96 pocilios en un volumen final de 200 pl de medio Ex-Vivo 15. El día 5, se analizó la secreción de IFN-gamma en los sobrenadantes de los cultivos utilizando el kit de ELISA de IFN-gamma humano Duoset (R&D Systems, EE. UU.). La densidad óptica se midió con el lector de microplacas de ELISA VMax (Molecular Devices, EE. UU.) y se cuantificó frente al estándar rIFN-gamma titulado incluido en el kit IFN-gamma Duo-set (R&D Systems, EE. UU.).

2. Ensayo de coinmovilización con anti-CD3

La bioactividad coestimuladora de las variantes de fusión ICOSL y CD80 Fc se determinó en ensayos de coinmovilización anti-CD3. Se diluyó anti-CD3 humano de ratón 1 nM o 4 nM (OKT3, Biolegends, EE. UU.) en PBS con proteínas variantes de rICOSL.Fc o rCD80.Fc de 1 nM a 80 nM. Esta mezcla se añadió a placas de cultivo tisular de 96 pocillos de fondo plano tratadas (Corning, EE. UU.) toda la noche para facilitar la adherencia de las proteínas estimulantes a los pocillos de la placa. Al día siguiente, la proteína no unida se eliminó por lavado de las placas y se añadieron 100.000 células T humanas generales purificadas (BenTech Bio, EE. UU.) o el clon BC3 de células T humanas (Astarte Biologics, EE. UU.) a cada pocillo en un volumen final de 200 pl de medio Ex-Vivo 15 (Lonza, Suiza). Las células se cultivaron 3 días antes de recoger los sobrenadantes de los cultivos y medir los niveles de IFN-gamma humano con el kit de ELISA Duoset (R&D Systems, EE. UU.) como se ha mencionado anteriormente.

C. Resultados

Los resultados de los estudios de unión y actividad para las variantes ensayadas ejemplares se muestran en las Tablas 6-8. En particular, la Tabla 6 indica sustituciones de aminoácidos en el dominio de IgSF ejemplares (reemplazos) en el ECD de CD80 seleccionado en el cribado para la maduración por afinidad contra la estructura afín respectiva CD28. La Tabla 7 indica sustituciones de aminoácidos en el dominio de IgSF ejemplares (reemplazos) en el ECD de CD80 seleccionado en el cribado para la maduración por afinidad contra la estructura afín respectiva PD-L1. La Tabla 8 indica sustituciones de aminoácidos en el dominio de IgSF ejemplares (reemplazos) en el ECD de ICOSL seleccionado en el cribado para la maduración por afinidad contra las estructuras afines respectivas ICOS y CD28. Para cada tabla, las sustituciones de aminoácidos ejemplares se designan por el número de la posición del aminoácido correspondiente a la secuencia de ECD no modificada de referencia respectiva como sigue. Por ejemplo, la secuencia de ECD no modificada de referencia en las Tablas 6 y 7 es la secuencia de ECD de CD80 no modificada mostrada en la SEQ ID NO: 28 y la secuencia de ECD no modificada de referencia en la Tabla 8 es la secuencia de ECD de ICOSL no modificada (SEQ ID NO: 32). La posición del aminoácido se indica en el medio, con el aminoácido no modificado correspondiente (p. ej., de tipo salvaje) enumerado antes del número y la sustitución de aminoácido variante identificada enumerada después del número. La columna 2 muestra el identificador de SEQ ID NO para la variante de ECD para cada variante de molécula de fusión de ECD-Fc.

También se muestra la actividad de unión medida por el valor de intensidad de fluorescencia media (MFI) para la unión de cada molécula de fusión de variante de Fc a células preparadas por ingeniería para expresar el ligando de contraestructura afín y la relación de la MFI en comparación con la unión de la correspondiente molécula de fusión ECD-Fc no modificada que no contiene la o las sustituciones de aminoácidos al mismo ligando de contraestructura expresado en las células. También se muestra la actividad funcional de las moléculas de fusión de Fc variante para modular la actividad de las células T en base a los niveles calculados de IFN-gamma en los sobrenadantes de los cultivos (pg/ml) generados ya sea i) con la molécula de fusión variante ECD-Fc indicada coinmovilizada con anti-CD3 o ii) con la molécula de fusión variante ECD-Fc indicada en un ensayo MLR. Las Tablas también representan la relación de IFN-gamma producido por cada variante de ECD-Fc en comparación con el correspondiente ECD-Fc sin modificar en ambos ensayos funcionales.

Como se muestra, las selecciones dieron como resultado la identificación de varias variantes de dominio de IgSF de CD80 o ICOSL que tenían la afinidad modificada para exhibir una unión aumentada para al menos uno, y en algunos casos más de uno, ligando de contraestructura afín. Además, los resultados mostraron que la modificación de la afinidad de las moléculas variantes también exhibió actividades mejoradas tanto para aumentar como para disminuir la actividad inmunológica dependiendo del formato de la molécula. Por ejemplo, la coinmovilización del ligando proporciona probablemente una interacción multivalente con la célula para agrupar o aumentar la avidez para favorecer la actividad agonista y aumentar la activación de las células T en comparación con la molécula de ECD-Fc no modificada (p. ej., de tipo salvaje) que no contiene el o los reemplazos de aminoácidos. Sin embargo, cuando la molécula se proporciona como una molécula de Fc bivalente en disolución, las mismas variantes del dominio de IgSF exhibieron una actividad antagonista para disminuir la activación de las células T en comparación con la molécula ECD-Fv no modificada (p. ej., de tipo salvaje) que no contiene el o los reemplazos de aminoácidos.

*: Relación parental calculada usando 346 pg/ml de IFN-gamma para ICOSL WT

Ejemplo 7

Ensayo de competición de unión de ligandos

Como se muestra en el Ejemplo 6 , varias moléculas variantes de CD80 exhibieron una unión mejorada a uno o ambos de CD28 y PD-L1. Para evaluar adicionalmente la actividad de unión de CD80 a los ligandos CD28 y PD-L1, este Ejemplo describe un ensayo de competición de ligandos que evalúa la naturaleza no competitiva de variantes de CD80 ejemplares para unirse tanto a CD28 como a PD-L1.

Se estableció un ensayo de unión basado en ELISA incorporando la variante de ECD de CD80 A91 G-Fc unida a placa para evaluar la capacidad de CD80 para unirse simultáneamente a CD28 y PD-L1. Se recubrieron placas de ELISA Maxisorp de 96 pocillos (Nunc, EE. UU.) toda la noche con una concentración 100 nM de proteína de fusión variante de ECD de CD80 A91G-Fc recombinante humana en PBS. Al día siguiente, la proteína no unida se retiró por lavado y la placa se bloqueó con albúmina de suero bovino al 1 % (Millipore, EE. UU.)/PBS durante 1 hora a temperatura ambiente. Este reactivo de bloqueo se retiró lavando tres veces con PBS/Tween al 0,05 %, que incluyó una incubación de dos minutos en un agitador de plataforma para cada lavado.

En un brazo del ensayo de competición, se incubó CD80 con CD28, y luego se evaluó la unión competitiva de CD80 unido a CD28 en presencia de las otras contraestructuras de ligando de CD80 conocidas PD-L1 o CTLA-4 o ligando de control negativo PD-L2. Específicamente, la proteína de fusión de CD28 Fc humana recombinante biotinilada (rCD28.Fc; R&D Systems) se tituló en los pocillos comenzando a 10 nM, diluyendo para ocho puntos con diluciones 1:2 en un volumen de 25 pl. Inmediatamente después de añadir la rCD28.Fc biotinilada, se añadieron a los pocillos los ligantes competitivos no marcados, proteína recombinante humana PD-L1 monomérica etiquetada con his, proteína recombinante humana CTLA-4 monomérica etiquetada con his, o una proteína de fusión PD-L2 Fc recombinante humana de control negativo (R&D Systems ) a 2.000/1.000/500 nM respectivamente en un volumen de 25 pl para un volumen final de 50 pl. Estas proteínas se incubaron juntas durante una hora antes de repetir las tres etapas de lavado como se ha descrito anteriormente.

Después del lavado, se diluyeron 2,5 ng por pocilio de estreptavidina conjugada con HRP (Jackson Immunoresearch, EE. UU.) en BSA al 1 %/PBS y se añadieron a los pocillos para detectar rCD28.Fc biotinilada unida. Después de una hora de incubación, los pocillos se lavaron de nuevo tres veces como se ha descrito anteriormente. Para detectar la señal, se añadieron 50 pl de sustrato TMB (Pierce, EE. UU.) a los pocillos tras el lavado y se incubó durante 7 minutos, antes de añadir 50 pl de disolución de parada de ácido sulfúrico 2M. La densidad óptica se determinó en un lector de microplacas Emax Plus (Molecular Devices, EE. UU.). Los valores de densidad óptica se representaron gráficamente en Prism (Graphpad, EE. UU.).

Los resultados se muestran en la FIG. 1A. Los resultados mostraron una unión disminuida de rCD28.Fc biotinilada a la proteína de fusión variante de ECD de CD80 A91 G-Fc con titulación de la rCD28.Fc. Cuando se realizó la unión de rCD28.Fc en presencia de la proteína de control no competitiva, rPDL2, no hubo disminución en la unión de CD28 para CD80 (triángulo sólido). Por el contrario, una proteína de control competitiva, rCTLA-4, cuando se incubó con CD28.Fc, dio como resultado una disminución de la unión de CD28 para CD80 como se esperaba (línea x). Cuando se incubó PD-L1 recombinante con CD28.Fc, no se observó disminución en la unión de CD28 a CD80, lo que demostró que los epítopos de CD28 y PD-L1 para CD80 no son competitivos. La unión de la proteína PD-L1 recombinante usada en el ensayo de competición de CD28 a CD80 se confirmó incubando la PD-L1 biotinilada en presencia de rCD28.Fc no biotinilada (cuadrado).

También se estableció la competencia inversa en la que se incubó CD80 con PD-L1, y se evaluó entonces la unión competitiva de CD80 unido a PD-L1 en presencia de las otras contraestructuras de ligando de CD80 conocidas CD28 o CTLA-4 o el ligando de control negativo PD-L2. Específicamente, el ensayo se realizó titulando la proteína monomérica PD-L1 -his humana recombinante biotinilada en pocillos que contenían la variante de CD80 recombinante. Debido a que la unión es más débil con este ligando, las titulaciones comenzaron a 5.000 nM con diluciones similares 1:2 en ocho puntos en 25 pL. Cuando se utilizó rPD-L1 -his para detectar la unión, se añadieron los ligandos competitivos rCD28.Fc humana, rCTLA-4.Fc humana o el rPD-L2.Fc humano a una concentración final de 2,5 nM en 25 pl para un volumen total de 50 pl. Los lavados, la detección y las mediciones de DO posteriores fueron los mismos que los descritos anteriormente.

Los resultados se muestran en la FIG. 1B. La unión de PD-L1 -his titulada sola confirmó que PD-L1 se unía a la molécula de fusión variante de ECD de CD80 A91 G-Fc inmovilizada en la placa (cuadrado). Cuando se realizó la unión de PD-L1 -his en presencia de la proteína de control no competitiva, rPDL2, no hubo disminución en la unión de PD-L1 para CD80 (triángulo). La proteína de control competitiva de CD28, rCTLA-4, cuando se incubó con PD-L1 -his, no dio como resultado una disminución de la unión de PD-L1 para CD80 (línea x), aunque CTLA-4 es competitiva para CD28. Este resultado demostró además la falta de competencia entre CD28 y PD-L1 por la unión a CD80. Finalmente, cuando se incubó PD-L1 -his con CD28.Fc, no se observó disminución en la unión de PD-L1 a CD80, lo que demostró que los epítopos de CD28 y PD-L1 para CD80 no son competitivos.

Por lo tanto, los resultados mostraron que CTLA-4, pero no PD-L1 o el control negativo PD-L2, competían por la unión de CD28 a CD80 (FIG. 1A) y que CD28 , CTLA-4 y PD-L2 no competían para la unión de PD-L1 a CD80 (FIG. 1B). Por tanto, estos resultados demostraron que CD28 y PD-L1 son ligantes no competitivos de CD80, y que esta unión no competitiva puede demostrarse independientemente de qué ligando se esté detectando en el ELISA.

Ejemplo 8

Generación y evaluación de moléculas apiladas que contienen diferentes dominios con afinidad modificada

Se usaron moléculas variantes seleccionadas descritas anteriormente a las que se modificó la afinidad para uno o más ligandos de contraestructura para generar una molécula "apilada" (es decir, proteína inmunomoduladora de Tipo II) que contenía dos o más dominios de IgSF con afinidad modificada. Las construcciones apiladas se obtuvieron como bloques de genes (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA) que codifican el apilamiento en un formato que permite su fusión a Fc mediante ensamblaje estándar de Gibson utilizando un kit de ensamblaje Gibson (New England Biolabs).

La molécula de ácido nucleico codificante de todos los apilamientos se generó para codificar una proteína diseñada de la siguiente manera: péptido señal, seguido de la primera IgV variante de interés, seguido de un enlazador de 15 aminoácidos que se compone de tres restos GGGGS (G4S) (SEQ ID NO: 228), seguido del segundo IgV de interés, seguido de dos enlazadores GGGGS (SEQ ID NO: 229) seguido de tres alaninas (AAA), seguido de un Fc de IgG1 humana como se ha descrito anteriormente. Para maximizar la posibilidad de un plegamiento correcto de los dominios de IgV en cada apilamiento, el primer IgV estaba precedido de todos los residuos que normalmente se encuentran en la proteína de tipo salvaje entre este IgV y el péptido señal (secuencia principal). De manera similar, el primer IgV estaba seguido de todos los residuos que normalmente lo conectan en la proteína de tipo salvaje al siguiente dominio de Ig (típicamente un dominio IgC) o si dicho segundo dominio IgV está ausente, los residuos que lo conectan al dominio transmembrana (secuencia final). Se aplicó el mismo principio de diseño al segundo dominio IgV excepto que cuando ambos dominios IgV se derivaron de la misma proteína parental (p. ej., un IgV de CD80 apilado con otro IgV de CD80), el enlazador entre ambos no se duplicó.

La Tabla 9 muestra el diseño de construcciones apiladas ejemplares. Las moléculas apiladas ejemplares mostradas en la Tabla 9 contienen los dominios IgV como se indica y adicionalmente secuencias líder o finales como se ha descrito anteriormente. En la tabla, los siguientes componentes están presentes en orden: péptido señal (SP; SEQ ID NO: 225), dominio 1 de IgV (IgV1), secuencia final 1 (TS1), enlazador 1 (LR1; SEQ ID NO: 228), dominio 2 de IgV (IgV2), secuencia final 2 (Ts 2), enlazador 2 (LR2; SeQ ID NO: 230) y dominio Fc (SEQ ID NO: 226 que contiene la sustitución de aminoácidos C5S/N82G). En algunos casos, está presente una secuencia líder 1 (LS1) entre el péptido señal e IgV1 y, en algunos casos, está presente una secuencia líder 2 (LS2) entre el enlazador e IgV2.

Se generó la expresión y purificación de alto rendimiento de las moléculas de fusión Fc apiladas con IgV variantes que contienen diversas combinaciones de dominios IgV variantes de CD80, CD86 , ICOSL o Nkp30 que contienen al menos un dominio IgV con afinidad modificada como se describe en el Ejemplo 5. También se evaluaron moléculas de fusión variantes de IgV-Fc apiladas a las respectivas contraestructuras y la actividad funcional mediante un ensayo de coinmovilización anti-CD3 como se describe en el Ejemplo 6. Por ejemplo, se determinó la bioactividad coestimuladora de las proteínas de fusión IgSF Fc apiladas en un ensayo similar con anti-CD3 inmovilizado como anteriormente. En este caso, se coinmovilizó 4 nM de anti-CD3 (OKT3, Biolegend, EE. UU.) con 4 nM a 120 nM de rB7-H6.Fc humano (R&D Systems, EE. UU.) o rPD-L1.Fc humano (R&D Systems, EE. UU.) toda la noche en placas de 96 pocillos de cultivo tisular tratadas (Corning, EE. UU.). Al día siguiente, la proteína no unida se retiró por lavado con PBS y se añadieron 100.000 células T generales purificadas a cada pocillo en 100 pl de medio Ex-Vivo 15 (Lonza, Suiza). Los dominios de IgSF apilados se añadieron posteriormente a concentraciones que oscilaban entre 8 nM y 40 nM en un volumen de 100 ul para un volumen total de 200 ul. Las células se cultivaron 3 días antes de recoger los sobrenadantes de los cultivos y medir los niveles de IFN-gamma humano con el kit de ELISA Duoset (R&D Systems, EE. UU.) como se ha mencionado anteriormente.

Los resultados se muestran en las Tablas 10-14. Específicamente, la Tabla 10 muestra los resultados de unión y de actividad funcional para las moléculas de fusión Fc apiladas con IgV variantes que contienen un dominio IgV de NKp30 y un dominio IgV de ICOSL. La Tabla 11 muestra los resultados de unión y de actividad funcional para las moléculas de fusión Fv apiladas con IgV variantes que contienen un dominio IgV de Nkp30 y un dominio IgV de CD80 o CD86. La Tabla 12 muestra los resultados de unión y de actividad funcional para las moléculas de fusión Fc apiladas de IgV variantes que contienen un dominio IgV de CD80 variante y un dominio IgV de CD80, CD86 o ICOSL. La Tabla 13 muestra los resultados de unión y de actividad funcional para las moléculas de fusión Fc apiladas con IgV variantes que contienen dos dominios IgV de CD80 variantes. La Tabla 14 muestra los resultados para las moléculas de fusión Fc apiladas con IgV variantes que contienen un dominio IgV de CD80 o CD86 variante y un dominio IgV de ICOSL variante.

Para cada una de las Tablas 10-14, la columna 1 indica la organización estructural y la orientación de los dominios apilados, con afinidad modificada o de tipo salvaje (WT) que comienzan con el dominio amino terminal (N terminal), seguido por el dominio medio WT o con afinidad modificada localizado antes de los dominios Fc de IgG1 humana C terminales. La columna 2 muestra el identificador de SEQ ID NO para la secuencia de cada dominio IgV contenido en una molécula "apilada" respectiva. La columna 3 muestra los compañeros de unión contra los que se seleccionaron los dominios apilados con afinidad modificada indicados de la columna 1.

También se muestra la actividad de unión medida por el valor de intensidad de fluorescencia media (MFI) para la unión de cada molécula de apilada a células preparadas por ingeniería para expresar varios ligandos de contraestructura y la relación de la MFI en comparación con la unión de la molécula apilada correspondiente que contiene dominios IgV no modificados que no contienen la o las sustituciones de aminoácidos al mismo ligando de contraestructura expresado en las células. También se muestra la actividad funcional de las moléculas apiladas variantes para modular la actividad de las células T en base a los niveles calculados de IFN-gamma en los sobrenadantes de los cultivos (pg/ml) generados con la molécula apilada variante indicada en disolución y el ligando apropiado coinmovilizado con anti-CD3 como se describe en el Ejemplo 6. Las Tablas también representan la relación de IFN-gamma producido por cada molécula apilada variante en comparación con la molécula apilada no modificada correspondiente en el ensayo de coinmovilización.

Como se muestra, los resultados mostraron que era posible generar moléculas apiladas que contienen al menos un dominio de IgSF variante que exhibe actividad con afinidad modificada de unión aumentada para al menos un ligando de contraestructura afín en comparación con una molécula apilada correspondiente que contiene el dominio IgV respectivo no modificado (p. ej., de tipo salvaje). En algunos casos, la molécula apilada, ya sea de uno o una combinación de ambos dominios de IgSF variantes en la molécula, exhibió un aumento de unión para más de un ligando de contraestructura afín. Los resultados también mostraron que el orden de los dominios IgV en las moléculas apiladas podría, en algunos casos, alterar el grado de actividad de unión mejorada. En algunos casos, la actividad funcional de las células T también se alteró cuando se evaluó en el ensayo de coinmovilización dirigida.

Claims (19)

REIVINDICACIONES

1. Una proteína inmunomoduladora, que comprende al menos un dominio de la superfamilia de inmunoglobulinas (IgSF) CD80 con afinidad modificada que comprende una o más sustituciones de aminoácidos en un dominio de IgSF CD80 de tipo salvaje, en donde el al menos un dominio de de IgSF CD80 con afinidad modificada tiene una unión aumentada al menos a dos compañeros de unión afines en comparación con el dominio de IgSF CD80 de tipo salvaje, en donde el dominio de IgSF CD80 con afinidad modificada se une específicamente de manera no competitiva a los al menos dos compañeros de unión afines y los al menos dos compañeros de unión afines son CD28 y PD-L1 , y en donde el dominio de IgSF CD80 con afinidad modificada comprende al menos un 85 % de identidad de secuencia con un dominio de IgSF CD80 de tipo salvaje o un fragmento de unión específico del mismo contenido en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1.

2. La proteína inmunomoduladora de la reivindicación 1, en donde el dominio de IgSF CD80 de tipo salvaje es un dominio IgV de tipo salvaje y/o el dominio de IgSF CD80 con afinidad modificada es un dominio IgV con afinidad modificada.

3. La proteína inmunomoduladora de cualquiera de las reivindicaciones 1 -2, en donde el al menos un dominio de IgSF CD80 con afinidad modificada comprende al menos una y no más de veinte sustituciones de aminoácidos en el dominio de IgSF CD80 de tipo salvaje.

4. La proteína inmunomoduladora de cualquiera de las reivindicaciones 1 -3, en donde el al menos un dominio de IgSF CD80 con afinidad modificada comprende al menos una y no más de diez sustituciones de aminoácidos en el dominio de IgSF CD80 de tipo salvaje.

5. La proteína inmunomoduladora de cualquiera de las reivindicaciones 1 -4, en donde el al menos un dominio de IgSF CD80 con afinidad modificada comprende al menos una y no más de cinco sustituciones de aminoácidos en el dominio de IgSF CD80 de tipo salvaje.

6. La proteína inmunomoduladora de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el dominio de IgSF CD80 con afinidad modificada tiene al menos un 120 % de la afinidad de unión como el dominio de IgSF CD80 de tipo salvaje a cada uno de los al menos dos compañeros de unión afines.

7. La proteína inmunomoduladora de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, que comprende además un dominio de IgSF sin afinidad modificada.

8. La proteína inmunomoduladora de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde la proteína inmunomoduladora es soluble, opcionalmente en donde la proteína inmunomoduladora está unida a un dominio de multimerización.

9. La proteína inmunomoduladora de cualquiera de las reivindicaciones 1-8 que está unida a un dominio Fc o una variante del mismo con función efectora reducida.

10. La proteína inmunomoduladora de la reivindicación 9, en donde el dominio Fc es un dominio de IgG1, un dominio de IgG2 o es una variante del mismo con función efectora reducida.

11. La proteína inmunomoduladora de la reivindicación 9 o la reivindicación 10, en donde el dominio Fc o variante del mismo comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 226 o SEQ ID NO: 227 o una secuencia de aminoácidos que exhibe al menos un 85 %, al menos un 90 %, o al menos un 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 226 o SEQ ID NO: 227.

12. La proteína inmunomoduladora de cualquiera de las reivindicaciones 8-11, en donde la proteína inmunomoduladora es un dímero.

13. Una molécula de ácido nucleico, que codifica la proteína inmunomoduladora de cualquiera de las reivindicaciones 1-11.

14. Un vector, que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 13.

15. Una célula, que comprende el vector de la reivindicación 14.

16. Un método para producir una proteína inmunomoduladora, que comprende introducir la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 13 o el vector de la reivindicación 14 en una célula huésped en condiciones para expresar la proteína inmunomoduladora en la célula huésped.

17. Una composición farmacéutica, que comprende la proteína inmunomoduladora de cualquiera de las reivindicaciones 1-12, que comprende opcionalmente un excipiente farmacéuticamente aceptable.

18. Una composición farmacéutica que comprende la proteína inmunomoduladora de cualquiera de las reivindicaciones 1-12 para su uso en un método de modular una respuesta inmune en un sujeto, opcionalmente en donde se aumenta la respuesta inmune.

19. La composición farmacéutica para su uso de la reivindicación 18, en donde la modulación de la respuesta inmune trata una enfermedad o afección en el sujeto, opcionalmente en donde la enfermedad o afección es un tumor o cáncer.