MX2011008190A

MX2011008190A - Direccionamiento dual de mir-208 y mir-499 en el tratamiento de trastornos cardiacos.

Info

Publication number: MX2011008190A
Application number: MX2011008190A
Authority: MX
Inventors: Eric Olson; Eva Van Rooij
Original assignee: Univ Texas
Priority date: 2009-02-04
Filing date: 2010-02-04
Publication date: 2011-10-06
Also published as: NZ594365A; AU2010210605B2; WO2010091204A1; RU2515926C2; EP2393945A1; CN102356162A; BRPI1008517A2; UA105029C2; KR20110128838A; US20140179764A1; JP5943608B2; EP2393945A4; RU2011136640A; US20120035243A1; JP2012516856A; US8629119B2; AU2010210605A1; CA2751489A1

Abstract

La presente invención provee un método para tratar o prevenir trastornos cardíacos en un sujeto que lo necesita al inhibir la expresión o función tanto de miR-499 como de miR-208 en las células del corazón del sujeto. En particular, se revelan protocolos específicos para administrar inhibidores de los dos miARNs que alcanzan supresión a largo plazo eficiente. Asimismo, la invención provee un método para tratar o prevenir trastornos musculoesqueléticos en un sujeto que lo necesita al incrementar la expresión o actividad tanto de miR-208 como de miR-499 en las células del músculo esquelético del sujeto.

Description

DIRECCIONAMIENTO DUAL DE MIR-208 Y MIR-499 EN EL TRATAMIENTO DE TRASTORNOS CARDÍACOS REFERENCIA CRUZADA CON SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud de patente provisional estadounidense No. 61/149.915, presentada el 4 de febrero de 2009, que se incorpora en la presente por referencia en su totalidad.

DECLARACIÓN DE AUSPICIO GUBERNAMENTAL Esta invención se realizó con auspicio del gobierno bajo el número de concesión HL53351-06 otorgado por el Instituto Nacional de Salud. El gobierno tiene ciertos derechos sobre la invención.

DESCRIPCIÓN DEL ARCHIVO DE TEXTO PRESENTADO POR VÍA ELECTRÓNICA Los contenidos del archivo de texto presentado por vía electrónica junto con la presente se incorporan en la misma por referencia en su totalidad: una copia de formato legible por computadora del listado de secuencias (nombre del archivo: MIRG_013_01WO_SeqList_ST25.txt, creado el 1 de febrero de 2010; tamaño de archivo: 5 kilobytes) .

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere al tratamiento de trastornos cardíacos y musculoesqueléticos mediante la administración de agentes que modulan la actividad o expresión de los microARNs (miARNs) . En particular, la invención provee un método para tratar o prevenir trastornos cardíacos al inhibir la expresión o actividad tanto de miR-208a/miR-208b como de miR-499 en las células del corazón de un sujeto, con inclusión de humanos. Asimismo, la invención provee un método para tratar o prevenir trastornos musculoesqueléticos al incrementar la expresión o actividad tanto de miR-208b como de miR-499 en las células del músculo esquelético de un sujeto.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La enfermedad cardíaca y sus manifestaciones -con inclusión de enfermedad de las arterias coronarias, infarto del miocardio, insuficiencia cardíaca congestiva e hipertrofia cardíaca- claramente presentan un riesgo de salud significativo en los Estados Unidos hoy en día. El costo implicado en el diagnóstico, tratamiento y seguimiento de los pacientes que padecen estas enfermedades abarca miles de millones de dólares. Dos manifestaciones particularmente severas de enfermedades cardíaca son el infarto del miocardio y la hipertrofia cardíaca.

El infarto del miocardio -comúnmente conocido como "ataque cardíaco"- es causado por una falta repetida y sostenida de flujo sanguíneo al tejido del corazón, que por lo general es el resultado de un estrechamiento o una oclusión de una arteria coronaria. Sin el suministro sanguíneo adecuado, el tejido se torna isquémico, lo que provoca la muerte de los cardiomiocitos (por ej . células del músculo cardíaco) y las estructuras vasculares. El tejido necrótico resultante de la muerte de los cardiomiocitos por lo general es reemplazado por tejido cicatricial, que no es contráctil, no logra contribuir con la función cardíaca, y con frecuencia juega un papel perjudicial en la función cardíaca al expandirse durante la contracción cardíaca, o al incrementar el tamaño y radio efectivo del ventrículo; por ejemplo, al tornarse hipertrófico.

La hipertrofia cardíaca es una respuesta adaptadora del corazón a casi todas las formas de enfermedad cardíaca, incluso las que se originan por hipertensión, carga mecánica, infarto del miocardio, arritmias cardíacas, trastornos endocrinos y mutaciones genéticas en los genes de proteínas contráctiles cardíacas. Si bien la respuesta hipertrófica es al principio un mecanismo compensatorio que aumenta el gasto cardíaco, la hipertrofia sostenida puede provocar cardiomiopatía dilatada (DCM, del inglés Dilated Cardio yopathy) , insuficiencia cardíaca y muerte súbita. En los Estados Unidos, aproximadamente medio millón de individuos son diagnosticados con insuficiencia cardíaca cada año, con una tasa de mortalidad que alcanza el 50%.

Numerosas vías de señalización -en especial, aquellas que implican señalización de calcio aberrante- dirigen el remodelado patológico y la hipertrofia cardíaca (Heineke & olkentin, 2006) . El crecimiento hipertrófico en respuesta al estrés implica diferentes vías de señalización y patrones de expresión génica que la hipertrofia fisiológica, que ocurre en respuesta al ejercicio. La hipertrofia miocárdica mediada por estrés es un fenómeno complejo asociado con numerosas consecuencias adversas con distintas características moleculares e histológicas que causan la fibrosis, dilatación y descompensación del corazón, lo que -a través de la degeneración y muerte de los cardiomiocitos- con frecuencia desencadena en insuficiencia cardíaca. Por esta razón, ha habido un intenso interés por descifrar los mecanismos moleculares subyacentes y descubrir nuevos blancos terapéuticos para suprimir el crecimiento cardíaco adverso y la consecuente insuficiencia cardíaca. Entender estos mecanismos es esencial para el diseño de nuevas terapias para tratar hipertrofia cardíaca e insuficiencia cardíaca.

Recientemente, se ha involucrado a los microARNs en numerosos procesos biológicos, que incluyen la regulación del ritmo del desarrollo, la apoptosis, el metabolismo de las grasas y la diferenciación de las células hematopoyéticas , entre otros. Los microARNs (miARNs) son ARNs pequeños, no codificadores de proteínas, de aproximadamente 18 a aproximadamente 25 nucleótidos de longitud, que derivan de genes de miARN individuales, de intrones de genes codificadores de proteínas, o de transcriptos poli-cistrónicos que con frecuencia codifican miARNs múltiples, estrechamente relacionados. Véase la revisión hecha por Carrington y colaboradores. (Science, Vol. 301 (5631) : 336-338 , 2003) . Los miARNs actúan como represores de los ARNms blanco al promover su degradación, cuando sus secuencias son perfectamente complementarias, o al inhibir la traducción, cuando sus secuencias contienen discordancias .

Los miARNs son transcriptos por ARN polimerasa II (pol II) o ARN polimerasa III (pol III; véase Qi y colaboradores. (2006) Cellular & Molecular Im unology, Vol. 3:411-419) y se originan a partir de transcriptos iniciales, denominados "transcriptos de miARNs primarios (pri -miARNs) " , que por lo general tienen varios miles de bases de longitud. Los pri-miARNs son procesados en el núcleo por la ribonucleasa (RNasa) Drosha en precursores en forma de horquilla de aproximadamente 70 a aproximadamente 100 nucleótidos (pre-miARNs) . Después del transporte al citoplasma, el pre-miARN en forma de horquilla es adicionalmente procesado por Dicer para producir un miARN bicatenario. La hebra de miARN maduro se incorpora luego en el complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC, del inglés RNA- Induced Silencing Complex) , donde se asocia con sus ARNms blanco mediante complementariedad de pares de base. En los casos relativamente raros en los cuales una base de miARN concuerda perfectamente con un ARNm blanco, ésta promueve la degradación del ARNm. Con mayor frecuencia, los miARNs forman heterodúplex imperfectos con ARNms blanco, lo que afecta la estabilidad del ARNm o bien inhibe la traducción del ARNm.

Recientemente, los inventores informaron sobre un microARN cardíaco-específico, el miR-208a, que es codificado por un intrón del gen de la cadena pesada de a-miosina (MHC, del inglés a-Myosin Heavy Chain) , y es necesario para la regulación ascendente de la expresión de la ß-MHC en respuesta al estrés cardíaco y para la represión de los genes del músculo esquelético rápido en el corazón (van Rooij y colaboradores., (2007) Science, Vol . 316: 575-579) . La presente invención se explaya sobre la base de este descubrimiento y provee un enfoque terapéutico novedoso al tratamiento de trastornos cardíacos y musculoesqueléticos .

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de que la regulación descendente sistemática tanto de miR-208a como de miR-499 en las células del corazón produce un efecto sinérgico sobre el desarrollo de la hipertrofia cardíaca, la contractilidad reforzada y el remodelado cardíaco patológico en respuesta al estrés. Los inventores han encontrado, en forma sorprendente, que el período de tiempo para regular la expresión de los genes relacionados con el estrés, tales como ß- HC, se reduce drásticamente al regular en forma descendente tanto miR-208a como miR-499 mediante administración simultánea o secuencial de inhibidores de miR-208a y miR-499. Dicho direccionamiento dual {dual targeting) produce efectos inmediatos sobre la expresión de los genes relacionados con el estrés en comparación con el retraso de varios meses que se necesita para observar efectos similares con la regulación descendente de miR-208a en forma individual. Por consiguiente, la presente invención provee un enfoque terapéutico novedoso para el tratamiento de hipertrofia cardíaca patológica, insuficiencia cardíaca e infarto del miocardio en un sujeto que lo necesita, con inclusión de un humano.

En una forma de realización, el método comprende administrar un inhibidor de miR-208a o miR-208b y un inhibidor de miR-499 a un sujeto, en donde la expresión o actividad de miR-208a o miR-208b y miR-499 es reducida en las células del corazón del sujeto después de la administración. En algunas formas de realización, la expresión o actividad de miR-208a o miR-208b y miR-499 se reduce a más del 60% en las células del corazón del sujeto después de la administración de los inhibidores. Los inhibidores de miR-208 y miR-499 incluyen antagomires o oligonucleótidos antisentido. En una forma de realización, los inhibidores de miARN son codificados en un vector de expresión.

En otra forma de realización, la respuesta al estrés cardíaco es reducida en el sujeto después de la administración de un inhibidor de miR-208a o miR-208b y un inhibidor de miR-499. La respuesta al estrés cardíaco incluye hipertrofia de cardiomiocitos , fibrosis del corazón, expresión reducida de a-MHC y/o expresión incrementada de ß-MHC en las células del corazón de dicho sujeto. En ciertas formas de realización, la reducción de la respuesta al estrés cardíaco ocurre menos de dos meses después de la administración de los inhibidores de miR-208a/miR-208b y miR-499. En una forma de realización preferente, la reducción de la respuesta al estrés cardíaco ocurre menos de una semana después de la administración de los inhibidores .

En algunas formas de realización, el inhibidor de miR-208a/miR-208b y el inhibidor de miR-499 se administran en forma secuencial. La administración de los dos inhibidores se puede separar por un intervalo que puede estar en el orden de minutos a semanas. En una forma de realización, el inhibidor de miR-2C8a/miR-208b y el inhibidor de miR-499 se administran al menos con 24 horas de diferencia. En otra forma de realización, el inhibidor de miR-208a/miR-208b y el inhibidor de miR-499 son co-administrados . Los dos inhibidores se pueden administrar, cada uno, a una dosis de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 200 mg/kg.

La presente invención también provee un método para tratar o prevenir un trastorno musculoesquelético en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar un antagonista de miR-208 y un antagonista de miR-499 al sujeto, en donde la expresión o actividad de miR-208 y miR-499 es incrementada en las células del músculo esquelético del sujeto después de la administración. En una forma de realización, el método comprende administrar un antagonista de miR-208b y un antagonista de miR-499 al sujeto. Los antagonistas de miARN pueden ser polinucleótidos que codifican secuencias maduras de miR-208a, miR-208b o miR-499. En algunas formas de realización, dichos polinucleótidos están ligados en forma operativa a una secuencia promotora y son provistos a las células del sujeto en un vector de expresión.

Los antagonistas de miARN pueden ser co-administrados o administrados en forma secuencial, separados por un intervalo de tiempo particular. En algunas formas de realización, la expresión de uno o más genes del músculo esquelético rápido en las células del músculo esquelético de un sujeto es reducida después de la administración de los antagonistas de miR-499 y de miR-208a o miR-208b al sujeto. Uno o más genes del músculo esquelético rápido pueden incluir troponina 12, troponina T3 , cadena liviana de la miosina del músculo esquelético rápido y actina alfa del músculo esquelético rápido .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Figura 1. Los animales con gen MiR-208 inactivado (knockout) exhiben menor hipertrofia cardíaca y fibrosis en respuesta a bandeo de aorta torácica. A. Esquema que ilustra el procedimiento de bandeo de aorta torácica (TAB, del inglés Thoracic Aortic Banding) (a la izquierda) . Secciones histológicas de los corazones de los ratones silvestres y de miR-208 -/- para tinción tricrómica de Masson después del procedimiento TAB o procedimiento simulado (a la derecha) . La ausencia de miR-208 disminuye la hipertrofia y la fibrosis observadas en los ratones silvestres sometidos a TAB durante 21 días. B. Niveles relativos de expresión para la cadena pesada de beta-miosina (ß-MHC), factor natriurético atrial (ANF, del inglés Atrial Natriuretic Factor) , y péptido natriurético cerebral (BNP, del inglés Brain Natriuretic Peptide) en los corazones de los animales silvestres y con miR-208 -/- después de un procedimiento simulado o TAB. C.

Análisis Western de niveles de proteínas de a-MHC y ß-MHC en los corazones de animales silvestres y con miR-208 -/-después de un procedimiento simulado o TAB. Se detectó GAPDH como control de carga.

Figura 2. El silenciamiento (knockdown) a largo plazo de miR-208 fenocopia la inhibición de la respuesta al estrés en los animales con miR-208 inactivado. A. Secuencia de un oligonucleótido sintético direccionado a la secuencia madura de miR-208 (SEC ID NO: 16) . La secuencia control discordante contiene cuatro discordancias de bases en comparación con la secuencia anti-miR-208 (SEC ID NO: 17) . B. El análisis de PCR en tiempo real (PCR-TR) muestra el silenciamiento eficiente de miR-208 en los corazones de animales tratados con el oligonucleótido anti-miR-208. C. Niveles relativos de expresión para la cadena pesada de la beta-miosina (ß-MHC) , factor natriurético atrial (ANF) y péptido natriurético cerebral (BNP) en los corazones de animales que recibieron un oligonucleótido anti-miR-208 (anti 208) o un control discordante (mm, del inglés mis atched) después de un procedimiento simulado o bandeo de aorta torácica (TAB) . Si bien los marcadores de estrés ANF y BNP son inducidos en respuesta al TAB, los animales que recibieron anti-miR-208 mostraron inducción reducida de la expresión de ß-MHC.

Figura 3. Myh7b y miR-499 son regulados por miR-208.

Análisis Northern blot que ilustra la expresión de miR-499 en los corazones de los ratones silvestres (+/+) , heterocigotos para miR-208 (+/-) y con miR-208 inactivado (knockout) (-/-) . Existe una correlación directa entre la expresión de miR-208 y miR-499, así como también Myh7b en los ratones silvestres y mutantes. La expresión de GAPDH se midió como control.

Figura 4. Myh7b y miR-499 se expresan en músculo cardíaco y músculo esquelético lento. A. El análisis Northern indica que miR-499 se expresa en el músculo cardíaco y en el músculo esquelético lento (por ej . soleo) . El análisis PCR-TR para Myh7b muestra que miR-499 es co-expresado con su gen huésped. B. El análisis de PCR en tiempo real para miR-499 en el músculo cardíaco y cuatro tipos de músculos esqueléticos (gastrocnemio/plantar (GP) , tibial anterior (TA) , extensor largo de los dedos (EDL, del inglés Extensor Digitorum Longus) y soleo) confirma que miR-499 se expresa predominantemente en el corazón y soleo. Solamente se pueden detectar niveles menores de expresión de miR-499 en TA y EDL. C. La hibridación in situ indica que, durante la embriogénesis , Myh7b se expresa de manera específica en el corazón y somitas .

Figura 5. MiR-499 no afecta la expresión de la miosina. A. El análisis de PCR-TR para Myh7b muestra que la deleción genética de miR-499 no afecta la expresión de su gen huésped, Myh7b. GP-gastrocnemio/plantar ; TA- tibial anterior; EDL-extensor largo de los dedos. La expresión de GAPDH se midió como control. B. El análisis Western blot de los corazones de los animales silvestres (WT, del inglés Wyld-Type) , heterocigotos (+/-), y con miR-499 inactivado (KO, del inglés Knockout) tanto para a- HC como para ß-MHC muestra que la deleción de miR-499 no afecta la expresión del gen a nivel proteico. C. El propiltiouracilo (PTU) , que bloquea la biogénesis de la hormona tiroidea y es un fuerte inductor de ß-MHC, produce una reducción de a-MHC y un incremento de ß-MHC tanto en animales silvestres (WT) como en animales con miR-499 inactivado (KO) .

Figura 6. Regulación de miR-499 mediante silenciamiento in vivo de miR-208. A. Análisis Northern de la expresión de miR-208 y miR-499 tres días después de la inyección en la vena de la cola de la cantidad indicada de oligonucleótido anti-miR-208 o solución salina (Sal) . B. Análisis Northern para expresión de miR-208 y miR-499 en te ido cardíaco de animales inyectados con una dosis única de 80 mg/kg de anti-miR-208, 2 dosis de 80 mg/kg de anti-miR-208 en dos días consecutivos, o un oligonucleótido control discordante (mm) dos meses después del tratamiento. C. Análisis de PCR en tiempo real para la expresión de miR-208, miR-499, miR-208b, a-MHC, yh7b y ß-MHC en tejido cardíaco dos meses después del tratamiento con una dosis única de anti-miR-208 , dos dosis de anti-miR-208 en dos días consecutivos, o dos dosis de oligonucleótido discordante en dos días consecutivos. D. Análisis Western blot de expresión de ß-MHC en tejido cardíaco dos meses después de tratamiento con anti-miR-208 (dosis única de 80 mg/kg o dos dosis consecutivas de 80 mg/kg) o tratamiento con control discordante (mm) .

Figura 7. Direccionamiento dual de miR-208 y miR-499. A. El análisis Northern para miR-208, miR-208b y miR-499 en tejido cardíaco de animales silvestres y animales con miR-499 inactivado muestra una fuerte inducción de miR-208b en respuesta a PTU. MiR-208b es co-expresado con ß-MHC y es indicativo de su expresión. En los animales con miR-499 inactivado, la inducción de miR-208b es comparable con los animales silvestres. No obstante, el silenciamiento de miR-208 en animales con miR-499 inactivado suprime la inducción de la expresión de miR-208b mediante PTU. B. Análisis de PCR en tiempo real para miR-208, OÍ-MHC y ß-MHC en tejido cardíaco de animales silvestres, animales con miR-208 inactivado, animales con miR-499 inactivado y animales con miR-499 inactivado tratados con anti-miR-208 en presencia y ausencia de PTU.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN El músculo cardíaco y el músculo esquelético responden a una variedad de estímulos patofisiológicos -tales como carga de trabajo, señalización de hormona tiroidea y lesión- al modular la expresión de las isoformas de miosina, que regulan la eficiencia de la contracción.

La relación de las isoformas de a-MHC respecto de ß-MHC en el corazón adulto es un determinante principal de la contractilidad cardíaca. ß-MHC, la isoforma principal de miosina en el corazón adulto, despliega actividad de ATPasa relativamente baja, mientras que a-MHC tiene actividad de ATPasa alta. En respuesta a una variedad de estímulos patológicos -tales como infarto del miocardio, hipertensión y otros trastornos- la expresión de ß-MHC se incrementa, mientras que la expresión de a-MHC disminuye, con una reducción consecuente en la actividad de ATPasa miofibrilar y velocidad de acortamiento reducida de miofibras cardíacas, lo que provoca la eventual disfunción contráctil. En forma notoria, los cambios menores en el contenido de a-MHC del corazón pueden tener profunda influencia sobre el funcionamiento cardíaco.

Recientemente, los inventores informaron sobre un miARN cardíaco-específico, el miR-208a, que es codificado por un intrón del gen de la cadena pesada de la a-miosina, y se necesita para la regulación ascendente de la expresión de ß-MHC en respuesta al estrés cardíaco y para la represión de los genes del músculo esquelético rápido en el corazón (ver solicitud en trámite WO 2008/016924, que se incorpora en la presente por referencia en su totalidad) .

Los inventores recientemente han descubierto que el miR-208a también se necesita para la expresión cardíaca de un miARN estrechamente relacionado, el miR-499, que es codificado por un intrón del gen Myh7b (ver solicitud en trámite PCT/US08/71837 , que se incorpora en la presente por referencia en su totalidad) . La expresión de Myh7b y miR-499 en el corazón, así como también en el músculo esquelético lento, es controlada por el factor de transcripción MEF2 , un regulador señal-dependiente de la expresión génica del músculo estriado. La expresión forzada de miR-499 o miR-208 es suficiente para mediar una conversión de miofibra rápida a lenta in vivo. MiR-208 y miR-499 pueden regular negativamente la expresión de Thrapl, un co-regulador del receptor de hormona tiroidea, y miembros de la familia PUR de factores de transcripción, que a su vez regulan negativamente la expresión de ß-MHC en el músculo cardíaco y el músculo esquelético. Sox6 funciona como represor de genes específicos de tipos de fibras lentas. El silenciamiento de la expresión de Sox6 en miotubos silvestres genera un incremento significativo en la expresión de ß-MHC. El análisis del promotor de ß-MHC reveló una secuencia consenso de Sox que sugiere que Sox6 juega un papel fundamental en la diferenciación de los tipos de fibras del músculo esquelético fetal y la regulación de ß-MHC en el corazón. Estos hallazgos develan un mecanismo regulador común en el cual los genes Myh regulan los patrones de expresión génica de los músculos estriados al codificar miARNs reguladores que gobiernan la contractilidad y la capacidad de respuesta a señales (van Rooij y colaboradores. (2009) Developmental Cell, Vol . 17: 662-673) .

La presente invención se basa, en parte, en el hallazgo de que la regulación descendente tanto de miR-208 como de miR-499 en las células del corazón produce un efecto sinérgico al suprimir la respuesta al estrés cardíaco. La inhibición de la expresión de miR-208a en las células del corazón genera una reducción de la expresión inducida por estrés de ß-MHC. No obstante, este efecto no es observado hasta dos meses después de la administración del inhibidor de miR-208. Los inventores han encontrado sorprendentemente que la inhibición tanto de miR-208a como de miR-499 genera la supresión de la expresión inducida por estrés de ß-MHC casi inmediatamente después de la administración, y así se acelera el efecto sobre la respuesta al estrés cardíaco. Por consiguiente, las estrategias para manipular la expresión génica del músculo cardíaco y el músculo esquelético al modular la expresión de miR-208 y miR-499, ya sea en forma simultánea o bien en forma secuencial, para el tratamiento y la prevención de enfermedades cardíacas se describen a la luz de estos hallazgos.

El miR-208a se ubica dentro de un intrón del gen de a- MHC. La ubicación precisa en el intrón depende de la especie particular y el transcripto específico. Por ejemplo, en los humanos, miR-208a es codificado dentro del 28vo intrón del gen de a-MHC, mientras que en los ratones, es codificado dentro del 29no intrón. Las secuencias que codifican pre-miARN para miR-208a para humano, ratón, rata y perro se ilustran a continuación como SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3 y SEC ID NO: 4, respectivamente. La secuencia de miR-208a maduro se provee en SEC ID NO: 5. Al igual que la OÍ-MHC, miR-208a se expresa únicamente en el corazón.

Pre-miR-208a para humano (SEC ID NO: 1) ACGGGCGAGC TTTTGGCCCG GGTTATACCT GATGCTCACG TATAAGACGA GCAAAAAGCT TGTTGGTCAG A Pre-miR-208a para ratón (SEC ID NO: 2) ACGGGTGAGC TTTTGGCCCG GGTTATACCT GACTCTCACG TATAAGACGA GCAAAAAGCT TGTTGGTCAG A Pre-miR-208a para rata (SEC ID NO: 3) ACGGGTGAGC TTTTGGCCCG GGTTATACCT GACTCTCACG TATAAGACGA GCAAAAAGCT TGTTGGTCAG A Pre-miR-208a para perro (SEC ID NO: 4) ACGCATGAGC TTTTGGCTCG GGTTATACCT GATGCTCACG TATAAGACGA GCAAAAAGCT TGTTGGTCAG A miR-208a maduro (SEC ID NO: 5) AUAAGACGAGCAAAAAGCUUGU El análisis de la ubicación genómica del gen de miR-499 mostró que se encontraba dentro del 20mo intrón del gen Myh7b, un homólogo del gen de a-MHC. Las secuencias codificadoras de pre-miARN para miR-499 para ratón, rata, humano, perro, zarigüeya, pollo y X. tropicalis se proveen en SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 7, SEC ID NO : 8, SEC ID NO : 9, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 11 y SEC ID NO: 12, respectivamente. SEC ID NO: 13 es la estructura en tallo-lazo de la secuencia precursora para ratón y SEC ID NO: 14 es la secuencia de miR-499 maduro. El gen Myh7b es conservado en los vertebrados y expresado únicamente en el corazón y músculo esquelético lento (por ej . soleo) .

Pre-miR-499 para ratón (SEC ID NO: 6) TCCCTGTGTC TTGGGTGGGC AGCTGTTAAG ACTTGCAGTG ATGTTTAGCT CCTCTGCATG TGAACATCAC AGCAAG Pre-miR-499 para rata (SEC ID NO: 7) TCCCTGTCTT GGGTGGGCAG CTGTTAAGAC TTGCAGTGAT GTTTAGCTCC TCTCCATGTG AACATCACAG CAAG Pre-miR-499 para humano (SEC ID NO : 8) CCCCTGTGCC TTGGGCGGGC GGCTGTTAAG ACTTGCAGTG ATGTTTAACT CCTCTCCACG TGAACATCAC AGCAAG Pre-miR-499 para perro (SEC ID NO: 9) CCCTTGCACC CTGGGCGGGC GGCCGTTAAG ACTTGCAGTG ATGTTTAACT CCTCTCCACG TGAACATCAC AGCAAG Pre-miR-499 para zarigüeya (SEC ID NO: 10) CCCCTGCCTC CCCGGCGGGC AGCTGTTAAG ACTTGCAGTG ATGTTTAATT CTTCTCTATG TGAACATCAC AACAAG Pre-miR-499 para pollo (SEC ID NO: 11) GGAGCGGCAG TTAAGACTTG TAGTGATGTT TAGATAATGT ATTACATGGA CATCACTTTA AG Pre-miR-499 para X. tropicalis (SEC ID NO: 12) GTCTTAGCGA GGCAGTTAAG ACTTGCAGTG ATGTTTAGTT AAAATCTTTT CATGAACATC ACTTTAAG Tallo-lazo de la secuencia de pre-miR-499 para ratón (SEC ID NO: 13) GGGUGGGCAG CUGUUAAGAC UUGCAGUGAU GUUUAGCUCC UCUGCAUGUG AACAUCACAG CAAGUCUGUG CUGCUGCCU MiR-499 maduro (SEC ID NO: 14) UUAAGACUUG CAGUGAUGUU U Los inventores también han descubierto que el genoma contiene una segunda versión de miR208a, que se denomina miR-208b y se ubica dentro del gen ß-MHC en el intrón 31. Al igual que la ß-MHC, el miARN 208b es expresado únicamente en el corazón y músculo esquelético lento (por ej . soleo) . Los genes regulados por miR-208b incluyen, por ejemplo, Sp3 , Miostatina, PURbeta, THRAP1, y genes de proteínas del músculo esquelético rápido. La secuencia de este miAR se superpone en gran medida con miR-208a con una homología del 100% en la "región semilla" (seed región) la región que define blancos de AR m de cierto miARN. Por ende, el miR-208b puede tener profundos efectos sobre la contractilidad del músculo esquelético y músculo cardíaco en los humanos. La secuencia de pre-miR-208b es conservada en varias especies de mamíferos (por ej . humanos, ratones, ratas y perros) . La secuencia de pre-miR-208b así como también la secuencia de miR-208b maduro se ilustran a continuación: Pre-miR-208b (SEC ID NO: 18) TTTCTGATCC GAATATAAGA CGAACAAAAG GTTTGTCTGA GGG MÍR-208b maduro (SEC ID NO: 19) AUAAGACGAA CAAAAGGUUU GU Se entiende que, cuando las secuencias de ARN reveladas en la presente se usan en las formas de realización que requieren desoxirribonucleótidos , un residuo de timidina es sustituido por un residuo de uridina. En forma similar, en las formas de realización que requieren ribonucleótidos , un residuo de uridina es sustituido por un residuo de timidina en las secuencias de ADN divulgadas en la presente.

En una forma de realización, la presente invención provee un método para tratar hipertrofia cardíaca patológica, infarto del miocardio o insuficiencia cardíaca en un sujeto que lo necesita, con inclusión de un humano, mediante direccionamiento ( targeting) de la expresión y/o actividad de cualquiera o de ambos miR-208 (por ej . , miR-208a y/o miR-208b, o en otras palabras, miR208a/miR208b) y de miR-499 en las células del corazón del sujeto. En algunas formas de realización, se administra un inhibidor de miR-208a/miR-208b y un inhibidor de miR-499 al sujeto para reducir la expresión o actividad de miR-208a/miR-208b y miR-499 en las células del corazón del sujeto.

En otra forma de realización, el sujeto que lo necesita puede estar en riesgo de desarrollar hipertrofia cardíaca patológica, insuficiencia cardíaca o infarto del miocardio. Dicho sujeto puede exhibir uno o más factores de riesgo que incluyen, mas no se limitan a: hipertensión no controlada de larga data, enfermedad valvular no corregida, angina crónica, infarto del miocardio reciente, predisposición congénita a enfermedades cardíacas o hipertrofia patológica. El sujeto en riesgo puede recibir un diagnóstico de predisposición genética a hipertrofia cardíaca o puede tener antecedentes familiares de hipertrofia cardíaca.

Preferentemente, la administración tanto de un inhibidor de miR-208a/miR-208b como de un inhibidor de miR-499 al sujeto genera la mejora de uno o más síntomas de hipertrofia cardíaca, insuficiencia cardíaca o infarto del miocardio en el sujeto, o en el retraso de la transición de hipertrofia cardíaca a insuficiencia cardíaca. Dichos uno o más síntomas mejorados pueden ser, por ejemplo: mejoramiento de la capacidad de ej ercitación, incremento del volumen de eyección cardíaca, descenso de presión diastólica final del ventrículo izquierdo, descenso de presión enclavada capilar pulmonar, incremento del gasto cardíaco, incremento del índice cardíaco, descenso de presión arterial pulmonar, reducción de dimensiones diastólicas y sistólicas finales del ventrículo izquierdo, reducción de fibrosis cardíaca, reducción de depósito de colágeno en el músculo cardíaco, disminución de estrés en pared de ventrículo derecho e izquierdo, disminución de tensión de pared, aumento de calidad de vida, y descenso de mortalidad o morbidez relacionadas con la enfermedad .

En una forma de realización de la invención, la respuesta al estrés cardíaco se reduce en el sujeto después de la administración de los inhibidores de miR-208 (por ej . , miR-208a y/o miR-208b) y miR-499. La respuesta al estrés cardíaco incluye, inter alia, hipertrofia de cardiomiocitos , fibrosis del corazón, reducción de la expresión de OÍ-MHC en las células del corazón y/o aumento de la expresión de ß-MHC en las células del corazón. La administración tanto de un inhibidor de miR-208a/miR-208b como de un inhibidor de miR-499 al sujeto genera un efecto más rápido sobre la respuesta al estrés cardíaco en comparación con la administración de cualquier inhibidor en forma individual. Por ejemplo, la reducción de la respuesta al estrés cardíaco ocurre menos de ocho semanas, menos de seis semanas, menos de cuatro semanas, menos de tres semanas, menos de dos semanas, menos de una semana, menos de cinco días, menos de tres días, o menos de un día después de la administración de los inhibidores. En otra forma de realización, la reducción en la respuesta al estrés cardíaco ocurre menos de doce horas después de la administración de los inhibidores.

En algunas formas de realización, los inhibidores de miR-208 (por ej . , miR-208a y/o miR-208b) y miR-499 pueden ser oligonucleótidos antisentido que se direccionan a las secuencias maduras de miR-499 y/o miR-208a o miR-208b. Los oligonucleótidos antisentido pueden ser ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos . Preferentemente, los oligonucleótidos antisentido tienen al menos una modificación química. Por ejemplo, los oligonucleótidos antisentido adecuados pueden estar compuestos por una o más modificaciones de azúcares de nucleósidos bicíclicos o "de conformación restringida" ; por ejemplo, "ácidos nucleicos bloqueados". Los "ácidos nucleicos bloqueados" (LNAs, del inglés Locked Nucleic Acids) son ribonucleótidos modificados que contienen un puente extra entre los carbonos 2' y 4' de la fracción de azúcar ribosa, lo que genera una conformación "bloqueada" que confiere estabilidad térmica a los oligonucleotidos que contienen los LNAs. Los oligonucleotidos antisentido que se direccionan a miR-208a/miR-208b y miR-499 pueden contener combinaciones de LNAs u otros nucleótidos modificados y ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos . En forma alternativa, los oligonucleotidos antisentido pueden comprender ácidos nucleicos peptídicos (PNAs, del inglés Peptide Nucleic Acids) , que contienen una estructura de base peptídica en lugar de un esqueleto azúcar- fosfato . Otras modificaciones químicas que los oligonucleotidos antisentido pueden contener incluyen, mas no se limitan a: modificaciones de azúcares, tales como modificaciones de 2 ' -O-alquilo (por ej . 2'-0-metilo, 2 ' -O-metoxietilo) , 2'-fluoro y 4' tio, y modificaciones de estructuras, tales como uno o más enlaces fósforotioato, morfolino o fosfonocarboxilato (véase, por ejemplo, las patentes estadounidenses Nos. 6.693.187 y 7.067.641, que se incorporan en la presente por referencia en su totalidad). Por ejemplo, los oligonucleotidos antisentido -en particular, aquellos de menores longitudes (por ej . , menos de 15 nucleótidos) - pueden comprender una o más modificaciones que potencian la afinidad, tales como, mas sin limitarse a: LNAs , nucleósidos bicíclicos, fosfonoformatos , 2' 0 alquilo y similares. En algunas formas de realización, los oligonucleótidos antisentido adecuados son "gapmers" de 2 ' -O-metoxietilo que contienen ribonucleótidos con 2'-0-metoxietilo modificado en ambos extremos 5' y 3' con al menos diez desoxirribonucleótidos en el centro. Estos "gapmers" son capaces de desencadenar los mecanismos de degradación dependientes de ribonucleasa H de los blancos de ARN. Otras modificaciones de oligonucleótidos antisentido para reforzar la estabilidad y mejorar la eficacia -tales como los descritos en la patente estadounidense No. 6.838.283, que se incorpora en la presente por referencia en su totalidad- son conocidos en el arte y resultan adecuados para uso en los métodos de la invención. Los oligonucleótidos antisentido preferentes, útiles para inhibir la actividad de miARNs , tienen aproximadamente de 5 a aproximadamente 50 nucleótidos de longitud, de aproximadamente 10 a aproximadamente 30 nucleótidos de longitud, o de aproximadamente 20 a aproximadamente 25 nucleótidos de longitud. En ciertas formas de realización, los oligonucleótidos antisentido que se direccionan a miR-208a/miR-208b y miR-499 tienen de aproximadamente 8 a apro imadamente 18 nucleótidos de longitud, y en otras formas de realización, de aproximadamente 12 a 16 nucleótidos de longitud. En particular, se puede usar cualquiera que tenga 8 unidades mer (8 mers) o más y que sea complementario a miR208a o miR208b; es decir, cualquier secuencia anti-miR que sea complementaria a cualquier secuencia consecutiva en miR208a o miR208b, comenzando desde el extremo 5' de miR hasta el extremo 3' de la secuencia madura. Los oligonucleótidos antisentido pueden comprender, en algunos casos, una secuencia que es al menos parcialmente complementaria a una secuencia madura de miARN, por ej . al menos aproximadamente 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% complementaria a una secuencia madura de miARN. En algunas formas de realización, el oligonucleótido antisentido puede ser sustancialmente complementario a una secuencia madura de miARN, que es al menos aproximadamente 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% complementaria a una secuencia de polinucleótidos blanco. En una forma de realización, el oligonucleótido antisentido comprende una secuencia que es 100% complementaria a una secuencia madura de miARN.

En otras formas de realización, los oligonucleótidos antisentido son antagomires . Los "antagomires" son ribonucleótidos monocatenarios , químicamente modificados, que son al menos parcialmente complementarios a la secuencia de miARN. Los antagomires pueden comprender uno o más nucleótidos modificados, tales como modificaciones de 2'-0-metil-azúcar . En algunas formas de realización, los antagomires comprenden solamente nucleótidos modificados. Los antagomires también pueden comprender uno o más enlaces fósforotioato, lo que genera una estructura de fósforotioato parcial o total. Para facilitar el suministro y la estabilidad in vivo, el antagomir se puede ligar a un esteroide tal como colesterol, un ácido graso, una vitamina, un carbohidrato, un péptido u otro ligando de molécula pequeña en su extremo 3' . Los antagomires adecuados para inhibir miARNs pueden tener de aproximadamente 15 a aproximadamente 50 nucleótidos de longitud, más preferentemente de aproximadamente 18 a aproximadamente 30 nucleótidos de longitud, y con mayor preferencia, de aproximadamente 20 a aproximadamente 25 nucleótidos de longitud. La expresión "parcialmente complementaria" se refiere a una secuencia que es al menos aproximadamente 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% complementaria a una secuencia de polinucleótidos blanco. Los antagomires pueden ser al menos aproximadamente 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% complementarios a la secuencia madura de miARN. En algunas formas de realización, el antagomir puede ser sustancialmente complementario a una secuencia madura de miARN, que es al menos aproximadamente 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% complementaria a un secuencia de polinucleótidos blanco. En otras formas de realización, los antagomires son 100% complementarios a la secuencia madura de miARN.

En algunas formas de realización, los inhibidores de miR-499 y miR-208a/miR-208b son antagomires que comprenden una secuencia que es perfectamente complementaria a la secuencia de miR-499 maduro y miR-208a o miR-208b maduro. En una forma de realización, un inhibidor de miR-499 es un antagomir que tiene una secuencia que es parcial o perfectamente complementaria a 5 ' -UUAAGACUUGCAGUGAUGUUU-3 ' (SEC ID NO: 14 ) . En otra forma de realización, un inhibidor de miR-208a es un antagomir que tiene una secuencia que es parcial o perfectamente complementaria a 5'-AUAAGACGAGCAAAAAGCUUGU- 3 ' (SEC ID NO : 5) . En otra forma de realización, un inhibidor de miR-208a es un antagomir que tiene la secuencia 5 ' -ACAAGCUUUUUGCUCGUCUUAU- 3 ' (SEC ID NO: 15) . En incluso otra forma de realización, un inhibidor de miR-208a es un antagomir que tiene la secuencia de SEC ID NO: 16. En otra forma de realización, un inhibidor de miR-208b es un antagomir que tiene una secuencia que es parcial o perfectamente complementaria a 5 ' -AUAAGACGAACAAAAGGUUUGU -3' (SEC ID NO: 19) .

En algunas formas de realización, los inhibidores de miR-499 y miR-208a o miR-208b son oligonucleótidos 3 O antisentido modificados a nivel químico. En una forma de realización, un inhibidor de miR-499 es un oligonucleótido antisentido modificado a nivel químico que comprende una secuencia sustancialmente complementaria a 5'-UUAAGACUUGCAGUGAUGUUU-3 ' (SEC ID NO: 14) . En otra forma de realización, un inhibidor de miR-208a es un oligonucleótido antisentido modificado a nivel químico que comprende una secuencia sustancialmente complementaria a 5'- AUAAGACGAGCAAAAAGCUUGU-3 ' (SEC ID NO: 5) . En incluso otra forma de realización, un inhibidor de miR-208b es un oligonucleótido antisentido modificado a nivel químico que comprende una secuencia sustancialmente complementaria a 5'-AUAAGACGAACAAAAGGUUUGU -3' (SEC ID NO: 19) . Tal como se utiliza en la presente, la expresión "sustancialmente complementaria" se refiere a una secuencia que es al menos aproximadamente 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% complementaria a una secuencia de polinucleótidos blanco (por ej . una secuencia de miARN maduro o precursor) .

Los oligonucleótidos antisentido pueden comprender una secuencia que es sustancialmente complementaria a una secuencia de miARN precursor (pre-miARN) para miR-499 o miR-208a/miR- 208b . En algunas formas de realización, el oligonucleótido antisentido comprende una secuencia que es sustancialmente complementaria a una secuencia ubicada fuera de la región tallo-lazo de la secuencia de pre-miR-499 o pre-miR-208a/miR-208 . En una forma de realización, un inhibidor de la función de miR-499 es un oligonucleótido antisentido que tiene una secuencia que es sustancialmente complementaria a una secuencia de pre-miR-499 seleccionada entre el grupo conformado por SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 11 y SEC ID NO: 12. En otra forma de realización, un inhibidor de la función de miR-208a es un oligonucleótido antisentido que tiene una secuencia que es sustancialmente complementaria a una secuencia de pre-miR-208a seleccionada entre el grupo conformado por SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO : 3 y SEC ID NO: 4. En incluso otra forma de realización, un inhibidor de la función de miR-208b es un oligonucleótido antisentido que tiene una secuencia que es sustancialmente complementaria a una secuencia de pre-miR-208b de SEC ID NO: 18.

En otra forma de realización de la invención, una única molécula de ácido nucleico se puede usar para inhibir tanto miR-208 como miR-499 en forma simultánea. Por ejemplo, un ácido nucleico único puede contener una secuencia que es al menos parcialmente complementaria a una secuencia madura de miR-208a (por ej . SEC ID NO: 5) y una secuencia que es al menos parcialmente complementaria a una secuencia madura de miR-499 (por e . SEC ID NO: 14) . En otra forma de realización, un único ácido nucleico puede contener una secuencia que es al menos parcialmente complementaria a una secuencia madura de miR-208b (por ej . SEC ID NO: 19) y una secuencia que es al menos parcialmente complementaria a una secuencia madura de miR-499 (por ej . SEC ID NO: 14). En incluso otra forma de realización más, el ácido nucleico único puede contener una secuencia que es al menos parcialmente complementaria a una secuencia madura de pre-miR-208a (por ej . SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3 y SEC ID NO: 4) y una secuencia que es al menos parcialmente complementaria a una secuencia madura de pre-miR-499 (por ej . SEC ID NO: 6, SEC ID NO : 7, SEC ID NO : 8, SEC ID NO : 9, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 11 y SEC ID NO : 12) . En otra forma de realización, la molécula de ácido nucleico única puede contener una secuencia que es al menos parcialmente complementaria a una secuencia de pre-miR-208b (por ej . SEC ID NO: 18) y una secuencia que es al menos parcialmente complementaria a una secuencia de pre-miR-499 (por ej . SEC ID NO: 6, SEC ID NO : 7, SEC ID NO: 8, SEC ID NO : 9, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 11 y SEC ID NO : 12) . La molécula de ácido nucleico única puede comprender, además, uno o más nucleótidos espaciadores entre las secuencias de direccionamiento de miR-208 (por ej . , miR-208a o miR-208b) y miR-499. Por ejemplo, la molécula de ácido nucleico única puede contener de aproximadamente 1 a aproximadamente 200 nucleótidos espaciadores; más preferentemente, de aproximadamente 5 a aproximadamente 100 nucleótidos espaciadores, y con mayor preferencia, de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 nucleótidos espaciadores entre las secuencias de direccionamiento de miR-208a/miR-20Sb y miR-499.

Cualquiera de los inhibidores de miR-208a/miR-208b y miR-499 descritos en la presente puede ser llevado a la célula blanco (por ej . célula del corazón, célula del músculo esquelético) al llevar a la célula un vector de expresión que codifica los inhibidores de miR-208a/miR-208b y miR-499. El inhibidor de miR-208a/miR-208b y el inhibidor de miR-499 pueden ser codificados por el mismo vector de expresión. En forma alternativa, el inhibidor de miR-208 (por e . , miR-208a o miR-208b) y el inhibidor de miR-499 son codificados en vectores de expresión separados. Un "vector" es una composición de materia que puede ser usada para llevar un ácido nucleico de interés al interior de una célula. En el arte se conocen numerosos vectores, que incluyen, mas no se limitan a: polinucleótidos lineales, polinucleótidos asociados con compuestos iónicos o anfifílieos, plásmidos y virus. Por ende, el término "vector" incluye un virus o un plásmido de replicación autónoma. Los ejemplos de vectores virales incluyen, mas no se limitan a: vectores adenovirales , vectores virales adeno-asociados , vectores retrovirales , y similares. Una construcción de expresión puede ser replicada en una célula viva, o puede ser formada de manera sintética. A los efectos de esta solicitud, las frases "construcción de expresión" , "vector de expresión" y "vector" se usan de manera intercambiable para describir la aplicación de la invención en un sentido ilustrativo general, y no están destinadas a limitar la invención.

En una forma de realización, un vector de expresión para expresar un inhibidor e miR-208a/miR-208b y/o miR-499 comprende un promotor ligado en forma operativa a un polinucleótido que codifica un oligonucleótido antisentido, en donde la secuencia del oligonucleótido antisentido expresado es parcial o perfectamente complementaria a una secuencia madura de miR-208 (por ej . , miR-208a o miR-208b) y/o miR-499. La frase "ligado en forma operativa" o "bajo control de transcripción" tal como se usa en la presente significa que el promotor se encuentra en la ubicación y orientación correctas con relación a un polinucleótido para controlar el inicio de la transcripción mediante ARN polimerasa y la expresión del polinucleótido. En otra forma de realización, el vector de expresión puede codificar un único ácido nucleico que se direcciona tanto a miR-208 (por e . , miR-208a o miR-208b) como a miR-499 tal como se describe en la presente, en donde el ácido nucleico único está ligado en forma operativa a un promotor. En otra forma de realización, un único vector de expresión puede codificar un inhibidor de miR-208a/miR-208b y un inhibidor de miR-499, en donde el inhibidor de miR-208a/miR-208b es dirigido por un promotor diferente del inhibidor de miR-499.

Tal como se usa en la presente, un "promotor" se refiere a una secuencia de ADN reconocida por la maquinaria sintética de la célula, o maquinaria sintética introducida, necesaria para iniciar la transcripción específica de un gen. Los promotores adecuados incluyen, mas no se limitan a: AR pol I, pol II, pol III, y promotores virales (por ej . promotor del gen temprano inmediato de citomegalovirus humano (CMV, del inglés Human Cytomegalovirus) , el promotor temprano de SV40, y la repetición terminal larga del virus del sarcoma de Rous) . En una forma de realización, el promotor es un promotor tejido-específico. Son de particular interés los promotores músculo-específicos y, más particularmente, los promotores cardíaco-específicos. Estos incluyen el promotor de la cadena liviana de la miosina 2 (Franz y colaboradores (1994) Cardioscience, Vol. 5(4):235-43; Kelly y colaboradores (1995) J. Cell Biol . , Vol . 129 (2 ) : 383 -396 ) , el promotor de la actina alfa (Moss y colaboradores (1996) Biol. Chem. , Vol. 271 (49) : 31688-31694) , el promotor de la troponina 1 (Bhavsar y colaboradores (1996) Genomics, Vol . 35 (1) : 11-23 ) ; el promotor de intercambio Na+/Ca2+ (Barnes y colaboradores. (1997) J-. Biol. Chem. , Vol. 272 ( 17) : 11510-11517 ) , el promotor de distrofina (Kimura y colaboradores. (1997) Dev. Growth Differ. , Vol. 39 (3) :257-265) , el promotor de integrina alfa 7 (Ziober y Kramer (1996) J. Bio. Chem., Vol. 271 (37) : 22915-22) , el promotor de péptido natriurético cerebral (LaPointe y colaboradores (1996) Hypertension, Vol. 27(3 Pt 2):715-22) y el promotor de proteína de choque térmico pequeña masa molecular/ alfa B-cristalina (Gopal-Srivastava (1995) J. Mol. Cell. Biol., Vol. 15 ( 12 ): 7081-7090 ) , promotor de la cadena pesada de la miosina alfa (Yamauchi-Takihara y colaboradores (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, Vol. 86 ( 10 ): 3504 -3508 ) y el promotor de A F (LaPointe y colaboradores (1988) J. Biol. Chem., Vol. 263 (19) : 075-9078) .

En ciertas formas de realización, el promotor ligado en forma operativa a un polinucleótido que codifica un inhibidor de miR-499 y/o un inhibidor de miR-208a/miR-208b puede ser un promotor inducible. Los promotores inducibles son conocidos en el arte e incluyen, mas no se limitan a: promotor de tetraciclina, promotor de metalotioneina IIA, promotor de choque térmico, elementos de respuesta hormona esteroidea/tiroidea/ácido retinoico, el promotor tardío de adenovirus, el LTR de virus del tumor mamario de ratón inducible. Un vector de expresión puede codificar un único ácido nucleico que se direcciona tanto a miR-208 (por ej . , miR-208a o miR-208b) como a miR-499 tal como se describe en la presente, en donde el ácido nucleico único está ligado en forma operativa a un promotor inducible. En forma alternativa, un único vector de expresión puede codificar un inhibidor de miR-208a/miR-208b y un inhibidor de miR-499 , en donde el inhibidor de miR-208a/miR-208b es dirigido por un primer promotor inducible y el inhibidor de miR-499 es dirigido por un segundo promotor inducible. En otra forma de realización, un primer vector de expresión puede codificar un inhibidor de miR-208a/miR-208b, en donde el inhibidor de miR-208a/miR-208b está ligado en forma operativa a un primer promotor inducible y un segundo vector de expresión puede codificar un inhibidor de miR-499, en donde el inhibidor de miR-499 está ligado en forma operativa a un segundo promotor inducible. También se contemplan otras combinaciones de promotores inducibles y constitutivos para controlar la expresión de los inhibidores de miR-208 (por ej . , miR-208a o miR-208b) y miR-499. Por ejemplo, un inhibidor de miR-208a/miR-208b puede ser expresado a partir de un vector que usa un promotor constitutivo, mientras que un inhibidor de miR-499 puede ser expresado a partir de un vector que usa un promotor inducible.

La presente invención también incluye métodos para barrer o depurar los inhibidores de miR-499 de miR-208a/miR-208b después del tratamiento. El método puede comprender sobreexpresar sitios de unión para los inhibidores de miR-499 y miR-208a/miR-208b en el tejido cardíaco. En otra forma de realización, la presente invención provee un método para barrer o depurar miR-499 y miR-208 (por ej . , miR-208a o miR-208b) después del tratamiento. En una forma de realización, el método comprende sobreexpresar las regiones de sitio de unión para miR-499 y miR-208a/miR-208b en el músculo esquelético usando un promotor específico para músculo esquelético y músculo cardíaco (creatina quinasa muscular (MCK, del inglés Muscle Creatine Kinase) ) . Las regiones de sitio de unión preferentemente contienen una secuencia de la región semilla para miR-499 y miR-208a o miR-208b. La región semilla es la porción 5' de un miARN que abarca las bases 2-8, importante para el reconocimiento del blanco. En algunas formas de realización, el sitio de unión puede contener una secuencia de la 3 ' UTR de uno o más blancos de miR-499 o miR-208, tales como THRAP1 o PURbeta. En otra forma de realización, un inhibidor de miR-499 y miR-208 puede ser administrado después de miR-499 y miR-208 para atenuar o frenar la función del miARN.

En otra forma de realización de la invención, el inhibidor de miR-208 (por ej . , miR-208a o miR-208b) y el inhibidor de miR-499 son co-administrados . El inhibidor de miR-208 y miR-208 se pueden administrar en una única formulación. Por ejemplo, una composición farmacéutica que comprende un inhibidor de miR-208 y un inhibidor de miR-499 se puede usar para co-administrar los dos inhibidores. En forma alternativa, los inhibidores de miR-208 y miR-499 pueden ser codificados por un único ácido nucleico, tal como un vector de expresión como se describe en la presente. Se pueden brindar múltiples co-administraciones de los dos inhibidores en un período prolongado de tiempo, por ejemplo, una semana, dos semanas, tres semanas, un mes, dos meses, tres meses, cuatro meses, cinco meses, seis meses, nueve meses, un año, dos años, tres años, cuatro años o cinco años.

En algunas formas de realización, el inhibidor de miR-208 (por ej . , miR-208a o miR-208b) y el inhibidor de miR-499 se administran en forma secuencial. En una forma de realización, el inhibidor de miR-208 se administra antes del inhibidor de miR-499. En otra forma de realización, el inhibidor de miR-499 se administra antes del inhibidor de miR-208. El intervalo que separa la administración de los inhibidores de miR-208 y miR-499 puede abarcar desde varios minutos hasta varios días. Por ejemplo, el intervalo puede ser de aproximadamente una hora a aproximadamente 72 horas, de seis horas a aproximadamente 48 horas, o de aproximadamente 12 horas a aproximadamente 24 horas. En una forma de realización preferente, el intervalo entre la administración del inhibidor de miR-208 y el inhibidor de miR-499 es de al menos 24 horas. Los inventores han observado que la administración de un inhibidor de miR-499 al menos aproximadamente 24 horas antes de un inhibidor de miR-208 genera al menos aproximadamente una reducción del 50% en la expresión de ß-MHC inducida por estrés a aproximadamente tres días después de la administración del inhibidor de miR-208. En ausencia de un inhibidor de miR-499, no se observa un efecto comparable sobre la expresión de ß-MHC inducida por estrés hasta al menos aproximadamente dos meses después de la administración del inhibidor de miR-208.

En otras formas de realización de la invención, se puede emplear más de una administración secuencial de los inhibidores de miR-208 y miR-499 para producir un efecto prolongado. Al respecto, se pueden usar varias combinaciones. A modo de ilustración, donde el inhibidor de miR-499 es "A" y el inhibidor de miR-208 (por ej . , miR-208a o miR-208b) es "B", las siguientes permutaciones basadas en 3 y 4 administraciones en total sirven de ejemplo: A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B B/A/A A/B/B B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A B/A/B/A B/A/A/B B/B/B/A A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A A/B/B/B B/A/B/B B/B/A/B También se contemplan otras combinaciones.

Preferentemente, la expresión o actividad de miR-208 (por ej . , miR-208a o miR-208b) y miR-499 se reduce en las células del corazón de un sujeto después de la administración del inhibidor de miR-208 y del inhibidor de miR-499 al sujeto. En ciertas formas de realización, la expresión o actividad de miR-208a/miR-208b y/o miR-499 se reduce a más del 50%, más del 60%, más del 70%, más del 75%, más del 80%, más del 85%, más del 90%, o más del 95% después de la administración de un inhibidor miR-208 y miR-499. En una forma de realización, la expresión o actividad de miR-208a/miR-208b y miR-499 se reduce a más del 60% en las células del corazón del sujeto después de la administración de los inhibidores. En otra forma de realización, la expresión o actividad de miR-208a/miR-208b y miR-499 se reduce a más del 80% en las células del corazón del sujeto después de la administración de los inhibidores. En incluso otra forma de realización, la expresión o actividad de miR-208a/miR-208b y miR-499 se reduce a más del 90% en las células del corazón del sujeto después de la administración de los inhibidores .

La presente invención también incluye un método para regular la contractilidad del músculo cardíaco y/o músculo esquelético. Las fibras del músculo esquelético adultas se pueden categorizar en los subtipos de fibras de contracción rápida y lenta, sobre la base de las propiedades metabólicas y contráctiles especializadas. Esas propiedades reflejan la expresión de conjuntos específicos de isoformas de proteínas contráctiles rápidas y lentas de las cadenas livianas y pesadas de la miosina, tropomiosin , y troponinas, así como también mioglobina (Naya y colaboradores. (2000) J Biol Chem, Vol . 275(7) : 4545-4548) . Los músculos de contracción lenta se usan principalmente en las actividades crónicas, tales como mantenimiento de la postura y actividad locomotora sostenida. Las fibras de contracción rápida se usan principalmente para las actividades de impulso de alto esfuerzo. El fenotipo de músculo esquelético adulto no es estático sino que, en realidad, retiene la habilidad de ajustarse a variaciones en el peso de la carga y los patrones de uso contráctiles, lo que genera adaptaciones en la morfología, el fenotipo y las propiedades contráctiles.

Se observó regulación ascendente de varios genes de proteínas contráctiles del músculo esquelético rápido en los corazones de ratones que carecen de ambos alelos del miR-208a. Esta regulación ascendente de los genes de proteínas contráctiles del músculo esquelético rápido en los corazones de ratones con miR-208a inactivado indica que el miR-208 normalmente funciona para reprimir el programa genético del músculo esquelético rápido. Se observó una reducción concomitante de la expresión de miR-499 en los ratones mutantes de miR-208a (ver el Ejemplo 3), lo que sugiere que miR-499 también puede regular en forma negativa la expresión de los genes de proteínas contráctiles del músculo esquelético rápido. Tal como se analizó con anterioridad, miR-208b también se expresa predominantemente en el músculo esquelético lento (por ej . , soleo). Por ende, miR-208b puede tener profundos efectos sobre la contractilidad del músculo cardíaco y el músculo esquelético en los humanos, y también puede regular el programa genético del músculo esquelético rápido y determinar la identidad de la fibra. Los inventores han mostrado recientemente que miR-208b y miR-499 juegan un papel importante en la especificación de la identidad de la fibra muscular al activar programas genéticos de miofibras lentas y reprimir los programas genéticos de miofibras rápidas. Las acciones de estos miARNs están mediadas, en parte, por una colección de represores de transcripción de genes de miofibras lentas, como Sox6 , ???,ß, Sp3 y ???ß. Al usar el promotor MCK específico de músculo esquelético, los animales transgénicos para miR-499 también revelaron conversión a un tipo de miofibra más lenta. Incluso en forma más notoria, cuando los ratones se sometieron a un régimen de corrida forzada en rueda de andar, los animales transgénicos para miR-499 corrieron en un porcentaje superior al 50% más que la carnada de ratones silvestres, lo que indica un incremento de la resistencia generado a partir de la reprogramación de las miofibras rápidas a un tipo de fibra más lenta. Véase van Rooij y colaboradores (2009) Developmental Cell, Vol . 17:662-673).

En una forma de realización, el método para regular la contractilidad del músculo cardíaco y/o esquelético comprende administrar un modulador de la expresión o actividad de miR-499 y miR-208 (por ej . , miR-208a o miR-208b) en las células del músculo cardíaco y/o esquelético. En otra forma de realización, el método comprende administrar un modulador de miR-499 y miR-208b. En otra forma de realización, se provee un método para regular la expresión génica de las proteínas contráctiles cardíacas que comprende administrar un modulador de la expresión o actividad de miR-499 y miR-208 (por ej . , miR-208a o miR-208b) en las células del corazón. En otra forma de realización, se provee un método para regular la expresión génica de las proteínas contráctiles del músculo esquelético, que comprende administrar en las células del músculo esquelético un modulador de la expresión o actividad de miR-499 y miR-208 (por ej . , miR-208a o miR-208b) . En otra forma de realización, se provee un método para regular la expresión génica de las proteínas contráctiles del músculo esquelético, que comprende administrar en las células del músculo esquelético un modulador de la expresión o actividad de miR-499 y miR-208b. En incluso otra forma de realización, la presente invención provee un método para inducir una contracción de tipo fibrosa de una célula del músculo esquelético, que comprende administrar a las células del músculo esquelético un modulador de la expresión o actividad de miR-499 y miR-208 en la célula del músculo esquelético. En otra forma de realización, el método para inducir una contracción de tipo fibrosa de una célula del músculo esquelético comprende administrar a las células del músculo esquelético un modulador de la expresión o actividad de miR-499 y miR-208b. El modulador puede ser un antagonista o un inhibidor de la expresión o actividad de miR-499, miR-208 y/o miR-208b. En algunas formas de realización, la expresión de THRAP1, PURbeta, miostatina, Sp3 , HFip y Sox 6 se incrementa en una célula al poner en contacto la célula con un inhibidor de miR-499 y miR-208a (o miR-208b) . En otras formas de realización, la expresión de THRAP1, PURbeta, miostatina, Sp3 , ???ß y Sox 6 se reduce en una célula al poner en contacto la célula con un antagonista de miR-499 y miR-208a (o miR-208b) .

En ciertas formas de realización de la invención, se provee un método para reducir la expresión de ß-MHC en las células del corazón, que comprende administrar un inhibidor de la expresión o actividad de miR-499 y miR-208 (por ej . , miR-208a o miR-208b) a las células del corazón. En una forma de realización, se provee un método para reducir la expresión de ß-MHC en las células del músculo esquelético, que comprende administrar un inhibidor de la expresión o actividad de miR-499 y miR-208b a las células del músculo esquelético. En otras formas de realización de la invención, se provee un método para elevar la expresión de ß-MHC en células del corazón y/o células del músculo esquelético que comprende incrementar la expresión o actividad de miR-499 y miR-208a (o miR-208b) endógenos o administrar miR-499 y miR-208a (o miR-208b) exógenos a las células del corazón y/o células del músculo esquelético.

En una forma de realización de la invención, se provee un método para incrementar la expresión de un gen de proteína contráctil del músculo esquelético rápido en las células del corazón, que comprende administrar a las células del corazón un inhibidor de la expresión o actividad de miR-499 y miR-208 (por ej . , miR-208a o miR-208b) . En otra forma de realización, se provee un método para incrementar la expresión de un gen de proteína contráctil del músculo esquelético rápido en las células del músculo esquelético, que comprende administrar a las células del músculo esquelético un inhibidor de la expresión o actividad de miR-499 y miR-208b. En otra forma de realización de la invención, se provee un método para reducir la expresión de un gen de proteína contráctil del músculo esquelético rápido en las células del corazón y/o células del músculo esquelético, que comprende incrementar la expresión o actividad de miR-499 y miR-208a (o miR-208b) endógenos o administrar miR-499 y miR-208a (o miR-208b) exógenos a las células del corazón y/o células del músculo esquelético. Los ejemplos de genes de proteínas contráctiles del músculo esquelético rápido que se pueden incrementar o reducir de acuerdo con los métodos de la presente invención incluyen, mas no se limitan a: troponina 12; troponina T3 , cadena liviana de la miosina esquelética rápida, o actina alfa del músculo esquelético.

En el músculo esquelético, la represión de los genes de fibras lentas y la activación de los genes de fibras rápidas están asociadas con numerosos trastornos musculoesqueléticos que incluyen, mas no se limitan a: atrofia por desuso, desgaste muscular en respuesta a anti -gravedad, y denervación. Por ende, la expresión de miR-499 en combinación con miR-208a o miR-208b en las células del músculo esquelético puede ser útil para reprimir los genes de fibras rápidas, lo que de esta manera activa la expresión recíproca de los genes de fibras lentas. Por consiguiente, la presente invención también comprende un método para tratar o prevenir un trastorno musculoesquelético en un sujeto que lo necesita. En una forma de realización, el método comprende administrar un antagonista de miR-208 (por ej . , miR-208a o miR-208b) y un antagonista de miR-499 al sujeto, en donde la expresión o actividad de miR-208a/miR-208b y miR-499 es incrementada en las células del músculo esquelético del sujeto después de la administración. En otra forma de realización, el método comprende administrar un antagonista de miR-208b y un antagonista de miR-499 al sujeto, en donde la expresión o actividad de miR-208b y miR-499 es incrementada en las células del músculo esquelético del sujeto después de la administración. Preferentemente, la expresión de uno o más genes del músculo esquelético rápido en las células del músculo esquelético del sujeto se reduce después de la administración de los antagonistas de miR-499 y miR-208a (o miR-208b) . Dichos uno o más genes del músculo esquelético rápido pueden incluir, mas no se limitan a: troponina 12, troponina T3 , cadena liviana de la miosina esquelética rápida, y actina alfa del músculo esquelético.

En otra forma de realización, la presente invención provee un método para tratar o prevenir el desgaste muscular en respuesta a un ambiente de gravedad reducido al administrar un antagonista de miR-499 y miR-208 (por ej . , miR-208a o miR-208b) al músculo esquelético. En otra forma de realización, el método para tratar o prevenir el desgaste muscular en respuesta a un ambiente de gravedad reducido comprende administrar un antagonista de miR-499 y miR-208b al músculo esquelético. En incluso otra forma de realización, la presente invención provee un método para tratar o prevenir atrofia muscular al administrar un antagonista de miR-499 y un antagonista de miR-208 (por ej . , miR-208a y/o miR-208b) al músculo esquelético. En otra forma de realización, el método para tratar o prevenir atrofia muscular comprende administrar un antagonista de miR-499 y un antagonista de miR-208b al músculo esquelético.

En algunas formas de realización, el antagonista de miR-208 (miR208a o miR-208b) y el antagonista de miR-499 son polinucleótidos que codifican una secuencia madura de miR-208 (miR208a o miR-208b) y/o miR-499. En una forma de realización, el polinucleótido comprende una secuencia madura de miR-208a (SEC ID NO : 5) y una secuencia madura de miR-499 (SEC ID NO: 14 ) . En otra forma de realización, el polinucleótido comprende una secuencia madura de miR-208b (SEC ID NO: 19) y una secuencia madura de miR-499 (SEC ID NO: 14) . En otra forma de realización, el antagonista de miR-499 y el antagonista de miR-208 (miR208a o miR-208b) puede ser un polinucleótido que comprende una secuencia de pri-miARN o pre-miARN para miR-499 y miR-208 (miR208a o miR-208b) . En forma alternativa, el antagonista de miR-208 (miR208a o miR-208b) y el antagonista de miR-499 pueden ser polinucleótidos separados, cada uno de los cuales comprende una secuencia madura o secuencia de pre-miARN del miARN. El polinucleótido que comprende la secuencia madura de miR-499 y/o miR-208 (miR208a o miR-208b) puede ser monocatenario o bicatenario. Los polinucleótidos pueden contener una o más modificaciones químicas, tales como ácidos nucleicos bloqueados, ácidos nucleicos peptídicos, modificaciones de azúcares, tales como modificaciones de 2'-0-alquilo (por ej . 2'-0-metilo, 2'-0-metoxietilo) , 2'-fluoro, y 4' tio, y modificaciones de la estructura, tales como uno o más enlaces fósforotioato , morfolino o fosfonocarboxilato . En una forma de realización, el polinucleótido que comprende una secuencia de miR-499, miR-208 y/o miR-208b está conjugado a colesterol.

En otra forma de realización, el antagonista de miR-499 y miR-208 (miR208a o miR-208b) puede estar codificado en un vector de expresión. Un vector de expresión para expresar miR-499 y miR-208 (miR208a o miR-208b) comprende al menos un promotor ligado en forma operativa a un polinucleótido que codifica miR-499 y/o miR-208 (miR208a o miR-208b) . El polinucleótido que codifica miR-499 puede codificar la secuencia de miARN-499 primario (pri-miR-499) , la secuencia de miARN-499 precursor (pre-miR-499 ) o la secuencia de miR-499 maduro. El polinucleótido que codifica miR-208a/miR-208b puede codificar la secuencia de miARN-208a/208b primario (pri-miR-208/pri-miR-208b) , la secuencia de miARN-208/208b precursor (pre-miR-208a/pre-miR-208b) o la secuencia de miR-208a/208b maduro. En algunas formas de realización, el vector de expresión comprende un polinucleótido ligado en forma operativa a un promotor, en donde dicho polinucleótido comprende la secuencia de SEC ID NO: 5 y SEC ID NO: 14. En otras formas de realización, el vector de expresión comprende un polinucleótido ligado en forma operativa a un promotor, en donde dicho polinucleótido comprende la secuencia de SEC ID NO: 19 y SEC ID NO: 14. Dichos polinucleótidos pueden tener de aproximadamente 18 a aproximadamente 2000 nucleótidos de longitud, de aproximadamente 70 a aproximadamente 200 nucleótidos de longitud, de aproximadamente 20 a aproximadamente 50 nucleótidos de longitud, o de aproximadamente 18 a aproximadamente 25 nucleótidos de longitud. En otra forma de realización, el vector de expresión puede expresar un antagonista de miR-499 (por ej . polinucleotido que comprende una secuencia de miR-499) y un antagonista de miR-208 (por ej . polinucleotido que comprende una secuencia de miR-208a o miR-208b) de diferentes promotores. Los polinucleótidos que codifican miR-499, miR-208a y/o miR-208b pueden estar ubicados en un ácido nucleico que codifica un intrón o en un ácido nucleico que codifica una región no traducida de un ARNm o en un ARN no codificador. En una forma de realización, el vector de expresión puede contener secuencias del 20mo intrón del gen yh7b o secuencias del 31er intrón del gen Myh7 (ß-MHC) .

El antagonista de miR-208a o miR-208b se puede coadministrar con el antagonista de miR-499 a un sujeto. Los dos antagonistas se pueden administrar en una única formulación, por ej . una composición farmacéutica que comprende un antagonista de miR-208a o miR-208b y un antagonista de miR-499. En forma alternativa, los dos antagonistas (por ej . miR-208a y miR-499 o miR-208b y miR-499) pueden ser un único polinucleotido que codifica la secuencia madura de miARN o la secuencia de pre-miARN de los dos miARNs . Se pueden brindar múltiples co-administraciones de los dos antagonistas durante un período prolongado de tiempo; por ejemplo, una semana, dos semanas, tres semanas, un mes, dos meses, tres meses, cuatro meses, cinco meses, seis meses, nueve meses, un año, dos años, tres años, cuatro años o cinco años.

En ciertas formas de realización, el antagonista de miR-208a o miR-208b y el antagonista de miR-499 se administran en forma secuencial. En una forma de realización, el antagonista de miR-208a o miR-208b se administra antes del antagonista de miR-499. En otra forma de realización, el antagonista de miR-499 se administra antes del antagonista de miR-208a o miR-208b. El intervalo que separa la administración de los antagonistas puede abarcar desde varios minutos hasta semanas, por ej . de aproximadamente una hora a aproximadamente 72 horas, de seis horas a aproximadamente 48 horas, o de aproximadamente 12 horas a aproximadamente 24 horas. En una forma de realización preferente, el intervalo entre la administración del antagonista de miR-208a o miR-208b y el antagonista de miR-499 es de al menos 24 horas.

La presente invención también incluye composiciones farmacéuticas que comprenden un inhibidor o antagonista de miR-499, miR-208a, y/o miR-208b. Cuando se contemplan aplicaciones clínicas, las composiciones farmacéuticas se prepararán en la forma apropiada para la aplicación destinada. Por lo general, esto implicará preparar composiciones que son esencialmente libres de pirógenos, así como también otras impurezas que podrían ser perjudiciales para humanos o animales .

En una forma de realización, la composición farmacéutica comprende una dosis efectiva de un miR-499" inhibidor y/o una dosis efectiva de un inhibidor de miR-208a o miR-208b. En otra forma de realización, la composición farmacéutica comprende una dosis efectiva de un antagonista de miR-499 y/o una dosis efectiva de un antagonista de miR-208a o miR-208b. Una "dosis efectiva" es una cantidad suficiente para efectuar un resultado clínico beneficioso o deseado. Una dosis efectiva de un inhibidor de miARN o antagonista de miAR de la invención puede comprender de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 200 mg/kg, de aproximadamente 20 mg/kg a aproximadamente 160 mg/kg, o de aproximadamente 40 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg. En una forma de realización, el inhibidor de miR-208 o miR-208b y el inhibidor de miR-499 se administran, cada uno, a una dosis de aproximadamente 20 mg/kg a aproximadamente 200 mg/kg. En otra forma de realización, el inhibidor de miR-208 o miR-208b y el inhibidor de miR-499 se administran, cada uno, a una dosis de aproximadamente 80 mg/kg. En otra forma de realización, el antagonista de miR-208 o miR-208b y el antagonista de miR-499 se administran, cada uno, a una dosis de aproximadamente 20 mg/kg a aproximadamente 200 mg/kg. En incluso otra forma de realización, el antagonista de miR-208 o miR-208b y el antagonista de miR-499 se administran, cada uno, a una dosis de aproximadamente 80 mg/kg. La determinación precisa de lo que sería considerado una dosis efectiva se puede basar en los factores individuales para cada paciente, con inclusión de su contextura, peso, tipo de trastorno (por ej . infarto del miocardio, insuficiencia cardíaca, hipertrofia cardíaca o trastorno musculoesquelético) , y la naturaleza del inhibidor o antagonista (por ej . antagomir, construcción de expresión, oligonucleótido antisentido, etc.) . Por ende, las dosis pueden ser determinadas con facilidad por parte de las personas versadas en el arte sobre la base de esta descripción y del conocimiento en el arte.

Los sistemas de dispersión coloidales, tales como complejos de macromoléculas , nanocápsulas , microesferas , perlas y sistemas a base de lípidos que incluyen emulsiones aceite en agua, micelas, micelas mixtas, y liposomas, se pueden usar como vehículos de suministro para los inhibidores oligonucleotídicos de la función de miARN, polinucleótidos que codifican antagonistas de miARN, o construcciones que expresan inhibidores o antagonistas de miARN particulares. Las emulsiones grasas comercialmente disponibles que son adecuadas para suministrar los ácidos nucleicos de la invención a los tejidos del músculo esquelético y cardíaco incluyen Intralipid®, Liposyn®, Liposyn® II, Liposyn® III, Nutrilipid, y otras emulsiones lipídicas similares. Un sistema coloidal preferente para uso como vehículo de suministro in vivo es un liposoma (es decir, una vesícula de membrana artificial) . La preparación y el uso de dichos sistemas es ampliamente conocido en ¦ el arte. Las formulaciones de ejemplo también se revelan en los documentos de patentes US 5.981.505, US 6.217.900, US 6.383.512, US 5.783.565, US 7.202.227, US 6.379.965, US 6.127.170, US 5.837.533, US 6.747.014 y WO03/093449, que se incorporan en la presente por referencia en su totalidad.

Por lo general, existe el deseo de emplear sales y tampones (buffers) apropiados para tornar estables los vehículos de suministro y permitir la captación por parte de las células blanco. Las composiciones acuosas de la presente invención comprenden una cantidad efectiva del vehículo de suministro que comprende los polinucleótidos inhibidores o secuencias polinucleotídicas de miARN (por ej . liposomas u otros complejos o vectores de expresión) disueltos o dispersos en un medio acuoso o portador farmacéuticamente aceptable. Las frases "farmacéuticamente aceptable" o "farmacológicamente aceptable" se refieren a entidades moleculares y composiciones que no producen reacciones adversas, alérgicas u otras reacciones opuestas, cuando se administran a un animal o a un humano. Tal como se utiliza en la presente, la expresión "portador farmacéuticamente aceptable" incluye solventes, tampones, soluciones, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos , agentes de retardo de absorción e isotónicos, y similares, aceptables para uso en los productos farmacéuticos de formulación, tales como productos farmacéuticos adecuados para administración a humanos. El uso de dichos medios y agentes para las sustancias farmacéuticamente activas es ampliamente conocido en el arte. Salvo en el caso de que algún medio o agente convencional sea incompatible con los ingredientes activos de la presente invención, su uso en las composiciones terapéuticas está contemplado. Los ingredientes activos suplementarios también se pueden incorporar en las composiciones, siempre que no inactiven los vectores o polinucleótidos de las composiciones.

Las composiciones activas de la presente invención pueden incluir preparaciones farmacéuticas clásicas. La administración de estas composiciones de acuerdo con la presente invención se puede realizar mediante cualquier vía común siempre que el tejido blanco esté disponible mediante esa vía. Esto incluye vía oral, nasal o bucal. En forma alternativa, la administración se puede realizar mediante inyección intradérmica, subcutánea, intramuscular, intraperitoneal o intravenosa, o mediante inyección directa en el tejido cardíaco. Las composiciones farmacéuticas que comprenden inhibidores de miARN, los polinucleótidos que codifican secuencias de miARN o las construcciones de expresión que comprenden secuencias de miARN también se pueden administrar por medio de sistemas de catéter o sistemas que aislan la circulación coronaria para suministrar agentes terapéuticos al corazón. Varios sistemas de catéter para suministrar agentes terapéuticos al corazón y la vasculatura coronaria son conocidos en el arte. Algunos ejemplos no limitativos de métodos de suministro basados en catéter o métodos de aislamiento coronario adecuados para uso en la presente invención se revelan en la patente estadounidense No. 6.416.510; la patente estadounidense No. 6.716.196; la patente estadounidense No. 6.953.466; el documento O 2005/082440; el documento WO 2006/089340; la publicación de patente estadounidense No. 2007/0203445, la publicación de patente estadounidense No. 2006/0148742, y la publicación de patente estadounidense No. 2007/0060907, cada uno de las cuales se incorpora en la presente por referencia en su totalidad. Dichas composiciones normalmente serían administradas como composiciones farmacéuticamente aceptables, tal como se describieron en la presente.

Los compuestos activos también se pueden administrar por vía parenteral o intraperitoneal . A modo de ilustración, las soluciones de los compuestos activos como base libre o sales farmacológicamente aceptables se pueden preparar en agua mezclada de manera adecuada con un agente tensioactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. Las dispersiones también se pueden preparar en glicerol, polietilenglicoles líquidos, y mezclas de los mismos, y en aceites. Bajo las condiciones comunes de almacenamiento y uso, estas preparaciones por lo general contienen un conservante para evitar el desarrollo de microorganismos .

Las formas farmacéuticas adecuadas para el uso inyectable o suministro de catéter incluyen, por ejemplo, soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. Por lo general, estas preparaciones son estériles y fluidas al punto que posibilitan la fácil inyección. Las preparaciones deberían ser estables bajo las condiciones de elaboración y almacenamiento, y deberían preservarse de la acción contaminante de los microorganismos, tales como hongos y bacterias. Los solventes o medios de dispersión apropiados pueden contener, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol , y polietilenglicol líquido, y similares), mezclas adecuadas de los mismos, y aceites vegetales. La fluidez apropiada se puede mantener - por ejemplo, a través del uso de un revestimiento, tal como lecitina- mediante el mantenimiento del tamaño de partícula necesario en el caso de la dispersión y mediante el uso de agentes tensioactivos . La prevención de la acción de los microorganismos se puede alcanzar mediante varios agentes antibacterianos y antifúngicos ; por ejemplo, parabenos, clorobutanol , fenol, ácido sórbico, timerosal, y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos; por ejemplo, azúcares o cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se logra mediante el uso en las composiciones de agentes que retardan la absorción; por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Las soluciones inyectables estériles se pueden preparar al incorporar los compuestos activos en la cantidad apropiada en un solvente junto con cualesquiera otros ingredientes (por ejemplo, tal como se enumeraron con anterioridad) según se desee, seguido de esterilización por filtración. Por lo general, las dispersiones se preparan al incorporar los varios ingredientes activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y los otros ingredientes deseados, por ejemplo, tal como se enumeraron con anterioridad. En el caso de los polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferentes de preparación incluyen técnicas de secado al vacío y secado por congelamiento que brindan un polvo del ingrediente activo (o los ingredientes activos) más cualquier ingrediente deseado adicional de una solución previamente esterilizada por filtración del mismo.

Las composiciones de la presente invención se pueden formular, por lo general, en una forma neutra o forma de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen, por ejemplo, sales de adición de ácidos (formadas con los grupos amino libres de la proteína) derivadas de ácidos inorgánicos (por ej . , ácidos clorhídrico o fosfórico) o de ácidos orgánicos (por ej . , ácidos acético, oxálico, tartárico, mandélico, y similares) . Las sales formadas con los grupos carboxilo libres de la proteína también pueden derivar de bases inorgánicas (por ej . , hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o férricos) o de bases orgánicas (por ej . , isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína, y similares) .

Ante la formulación, las soluciones se administran preferentemente de manera compatible con la formulación de administración y en una cantidad tal que sea terapéuticamente efectiva. Las formulaciones pueden ser administradas fácilmente en una variedad de formas de dosis, tales como soluciones inyectables, cápsulas de liberación de fármacos, y similares. Para la administración parenteral en una solución acuosa, por ejemplo, la solución por lo general es tamponada en forma adecuada y el diluyente líquido primero se torna isotónico, por ejemplo, con suficiente solución salina o glucosa. Dichas soluciones acuosas se pueden usar, por ejemplo, para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal . Preferentemente, los medios acuosos estériles se emplean tal como es conocido para la persona versada en el arte, particularmente a la luz de la presente descripción. A modo de ilustración, se puede disolver una única dosis en 1 mi de solución de NaCl isotónica y agregarse ya sea a 1000 mi de fluido de hipodermoclisis o bien inyectarse en el sitio propuesto de infusión, (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences 15ta Edición, páginas 1035 a 1038, y 1570 a 1580). Necesariamente ocurrirá cierta variación en la dosis según la condición del sujeto bajo tratamiento. La persona responsable de la administración, en todo caso, determinará la dosis apropiada para el sujeto individual. Asimismo, para administración humana, las preparaciones deberían cumplir con las normas de esterilidad, pirogenicidad, seguridad y pureza generales de acuerdo con las reglamentaciones de la División de Biología de la FDA.

Cualesquiera de las composiciones descritas en la presente pueden estar contenidas en un kit . En una forma de realización, el kit contiene una primera composición farmacéutica que comprende un inhibidor de miR-208a o miR-208b y una segunda composición farmacéutica que comprende un inhibidor de miR-499. En otra forma de realización, el kit contiene una única composición farmacéutica que comprende un inhibidor de miR-208a o miR-208b y un inhibidor de miR-499. En otra forma de realización, el kit contiene una primera composición farmacéutica que comprende un antagonista de miR-208a o miR-208b y una segunda composición farmacéutica que comprende un antagonista de miR-499. En incluso otra forma de realización, el kit contiene una única composición farmacéutica que comprende un antagonista de miR-208a o miR-208b y un antagonista de miR-499. En algunas formas de realización, el kit también puede incluir uno o más reactivos de transfección para facilitar el suministro de los antagonistas o inhibidores de miARN a las células.

Los componentes de los kits se pueden envasar ya sea en medio acuoso o bien en forma liofilizada. El medio contenedor de los kits por lo general incluirá al menos un frasco, tubo de ensayo, matraz, botella, jeringa y otro medio contenedor, en el cual se puede colocar un componente y, preferentemente, dividir en alícuotas de manera adecuadas . Cuando hay más de un componente en el kit, el kit por lo general contendrá un segundo, tercero u otro recipiente adicional en el cual los componentes adicionales se puedan colocar por separado (por ej . tampón farmacéuticamente aceptable estéril y/o otros diluyentes) . No obstante, varias combinaciones de componentes pueden estar comprendidas en un frasco. Los kits de la presente invención incluyen típicamente un medio para contener los ácidos nucleicos, y cualesquiera otros recipientes para reactivos en estrecha contención para la venta comercial . Dichos recipientes pueden incluir recipientes plásticos moldeados por insuflación de aire comprimido o inyección en los cuales están retenidos los frascos deseados.

Cuando los componentes del kit están provistos en una y/o más soluciones líquidas, la solución líquida es una solución acuosa. En particular, se prefiere una solución acuosa estéril.

No obstante, los componentes del kit pueden ser provistos como polvo (s) seco(s) . Cuando los reactivos y/o componentes son provistos como polvo seco, el polvo puede ser reconstituido mediante la adición de un solvente adecuado. Se contempla que el solvente también pueda estar provisto en otro medio contenedor.

Dichos kits también pueden incluir componentes que conservan o mantienen el antagonista de miARN o inhibidor de miARN o los protegen de la degradación. Dichos componentes pueden ser libres de ADNsa, libres de ARNsa o protegidos contra nucleasas (por ej . ARNsas y ADNsas) . Dichos kits por lo general comprenderán, en los medios adecuados, distintos recipientes para cada reactivo o solución individuales.

Un kit también incluirá instrucciones para emplear los componentes del kit así como también el uso de cualquier otro reactivo no incluido en el kit. Las instrucciones pueden incluir variaciones que se pueden implementar. Un kit también puede incluir utensilios o dispositivos para administrar el antagonista o inhibidor de miARN mediante varias vías de administración, tales como administración parenteral o por catéter .

Se contempla que dichos reactivos son formas de realización de kits de la invención. Dichos kits, no obstante, no se limitan a los artículos particulares identificados con anterioridad, y pueden incluir cualquier reactivo usado para la manipulación o caracterización de miARN.

Los siguientes ejemplos se incluyen solamente para ilustrar los varios aspectos de la invención. La referencia a miR208 en los Ejemplos y Figuras se refiere a miR208a en ratones. No obstante, las personas versadas en el arte -a la luz de la presente descripción- deberían comprender que la invención se aplica en igual medida a cualquier humano u otro animal, y comprende modular ya sea miR208a y/o miR208b.

EJEMPLOS Ejemplo 1. Los ratones con miR-208 inactivado (knockout) exhiben reducción de hipertrofia cardíaca y fibrosis en respuesta a sobrecarga de presión Dentro de un intrón del gen de -MHC se encuentra codificado el miR-208. Al igual que -MHC, miR-208 se expresa específicamente en el corazón con rastro de expresión en el pulmón. MiR-208 se procesa fuera del pre-ARNm de a-MHC en vez de ser transcripto como un transcripto separado. De manera intrigante, no obstante, miR-208 despliega una vida media notoriamente larga de al menos 14 días y, por ende, puede ejercer funciones incluso cuando la expresión del ARNm de a-MHC ha sido regulada en forma descendente.

Los ratones con miR-208 inactivado ( knockout) fueron creados al generar un vector de direccionamiento de miR-208 al digerir ??· fragmento de 0,4 kb (brazo 5') que se extiende corriente arriba de la región codificadora de miR-208 con SacII y Notl y liga el fragmento en el plásmido de direccionamiento de pGKneoF2L2dta de los sitios loxP y el cásete de neomicina Frt- flanqueado . Un fragmento de 3,3 kb (brazo 3') se digirió con Salí y HindIII y se ligó en el vector entre los casetes de resistencia a neomicina y selección negativa de Dta. Las células ES direccionadas que portaban el alelo interrumpido se identificaron mediante análisis Southern blot con sondas 5' y 3'. Tres clones ES direccionados de miR-208 fueron iden ificados y usados para inyección de blastocitos. Los ratones quiméricos resultantes se desarrollaron en C57BL/6 para obtener la transmisión de la línea germinal del alelo mutante.

Si bien la deleción genética de miR-208 en ratones no logró inducir un fenotipo aparente, el análisis de microarreglos en los corazones de animales silvestres y animales con miR-208 -/- a los 2 meses de vida reveló que la extracción de miR-208 generó una expresión pronunciada en numerosos genes de proteínas contráctiles del músculo esquelético rápido, que normalmente no se expresan en el corazón. Por ende, estos resultados sugieren que, bajo condiciones normales, el miR-208 es co-expresado con el único gen de MHC cardíaco-específico para mantener la identidad del cardiomiocito al reprimir la expresión de los genes del músculo esquelético en el corazón.

La función más notoria del miR-208 fue revelada por la respuesta aberrante de los ratones con miR-208 nulo al estrés cardíaco (van Rooij y colaboradores., (2007) Science, Vol . 316: 575-579) . En respuesta a la sobrecarga de presión mediante bandeo de aorta torácica (TAB) que dirige el remodelado patológico del corazón, las secciones histológicas de los corazones de los ratones con miR-208 inactivado mostraron hipertrofia de cardiomiocitos o fibrosis casi nulas en comparación con las secciones de los ratones silvestres (Figura 1A) . Asimismo, los animales con miR-208 inactivado no pudieron regular en forma ascendente la expresión de ß-MHC en respuesta a la sobrecarga de presión (Figura IB y C) . Por el contrario, otros genes de respuesta al estrés -tales como los que codifican A F y BNP- fueron fuertemente inducidos en los animales mutantes para miR-208 (Figura IB) , lo que demuestra que el miR-208 se dedica específicamente al control de la expresión de ß-MHC, desligándose de otras facetas de la respuesta al estrés cardíaco.

Ejemplo 2. El silenciamiento de miR-208 fenocopia los animales con miR-208 inactivado en respuesta al estrés Para examinar la especificidad del efecto de la ausencia de miR-208 sobre la respuesta al estrés cardíaco, los animales fueron inyectados por vía intravenosa diariamente con un antagomir que tiene una secuencia complementaria a la secuencia madura de miR-208 (anti 208; SEC ID NO: 16) o bien una secuencia discordante (mm; SEC ID NO: 17) . Todos los nucleósidos fueron modificados en cuanto a 2'-OMe, y las dos bases 5' terminales y las cuatro bases 3' terminales contenían un fósforotioato internucleósido . Se unió colesterol al extremo 3' de la hebra pasajera a través de un ligador de hidroxiprolinol (Figura 2A) . El análisis de PCR en tiempo real de los corazones de los animales inyectados con el antagomir para miR-208 dos meses después del tratamiento mostró un silenciamiento eficiente de miR-208 (Figura 2B) .

Para evaluar el efecto de la regulación descendente de miR-208 in vivo sobre la respuesta al estrés cardíaco, los animales que recibieron el antagomir anti-miR-208 o bien el control discordante se sometieron a un procedimiento simulado o a un procedimiento de bandeo de aorta torácica para inducir sobrecarga de presión. Los animales que fueron tratados con el control discordante exhibieron una típica respuesta al estrés con la regulación ascendente de ß- HC así como también otros genes relacionados con el estrés (ANF y BNP) . Por el contrario, los animales que fueron tratados con el antagomir anti-miR-208 no lograron mostrar una regulación ascendente de ß-MHC en respuesta a los estímulos de estrés. No obstante, se observó un incremento en la expresión de los otros genes relacionados con el estrés (ANF y BNP) (Figura 2C) . La respuesta al estrés de los animales tratados con el antagomir anti-miR-208 fue notoriamente similar a la de los animales con miR-208 inactivado, lo que sugiere que el miR-208 juega un papel fundamental en la regulación de la expresión de ß- HC en respuesta al estrés.

Ejemplo 3. Se requiere miR-208 para la expresión de miR- 499 Para explorar en forma adicional el mecanismo de acción del miR-208 en el corazón, los inventores definieron los patrones de expresión de miARN en los corazones de ratones silvestres y ratones con miR-208 inactivado mediante análisis de microarreglos . Entre los varios miARNs que fueron regulados en forma ascendente y descendente en los corazones de los ratones con miR-208 inactivado, los inventores descubrieron que el miR-499 fue altamente abundante en los corazones normales, pero que no se expresó por sobre los niveles de referencia en los animales con miR-208 inactivado. Estos hallazgos fueron confirmados mediante análisis Northern blot (Figura 3) . El análisis de la ubicación genómica del gen de miR-499 mostró que el mismo estaba contenido dentro del 20mo intrón del gen Myh7b, un homólogo del gen de a-MHC. El miR-208 parece regular Myh7b y, por ende, la expresión de miR-499 al nivel de transcripción, ya que el análisis de PCR-TR para Myh7b indica que el ARNm del gen huésped es anulado en una forma dependiente de la dosis en ausencia de miR-208 (Figura 3 ) .

El gen Myh7b es conservado en las vértebras y expresado únicamente en el corazón y en el músculo esquelético lento (por ej . soleo) (Figura 4A) . En forma similar, miR-499 tiene los mismos patrones de expresión que su gen huésped, según lo confirmado por el análisis de PCR en tiempo real (PCR-TR) (Figura 4A & B) . La hibridación in si tu mediante el uso de una sonda dirigida contra el extremo 3' del gen Myh7b indicó que esta miosina (y miR-499) se expresó en el corazón tan pronto como E10.5 (Figura 4C) . Con posterioridad, durante la embriogénesis, Myh7b/miR-499 también se expresa en somitas. Estos datos indican que se necesita miR-208 para dirigir una miosina adicional, Myh7b, que da origen al miR-499 relacionado. Asimismo, el miR-499 es regulado en forma descendente durante la hipertrofia cardiaca.

Para explorar en forma adicional el rol del miR-499 en la hipertrofia cardiaca patológica y la regulación de la contractilidad del músculo, se generaron animales con miR-499 inactivado. La deleción genética de miR-499 no tuvo efecto sobre la expresión de su gen huésped, Myh7b (Figura 5A) . El análisis Western blot de los corazones de los animales mutantes para miR-499 y los animales silvestres tanto para a-MHC como para ß- HC mostró que la deleción de miR-499 no afecta la expresión de ningún gen a nivel proteico (Figura 5B) . Para examinar si miR-499 tenía efecto sobre la regulación de ß-MHC, los animales silvestres y los animales con miR-499 inactivado recibieron propiltiouracilo (PTU) , que induce hipotiroidismo y regula en forma ascendente ß-MHC.

Tanto los animales silvestres como los animales con miR-499 inactivado exhibieron una disminución en a-MHC y un incremento en ß-MHC en respuesta a PTU (Figura 5C) . De manera sorprendente, a diferencia de miR-208, no se necesita miR-499 para la regulación de la expresión de a-MHC ni de ß-MHC.

Ejemplo 4. Direccionamiento dual de miR-208 y miR-499 El miR-208 regula la expresión de miR-499, tal como lo demuestra la reducción dependiente de la dosis en la expresión de miR-499 en los animales heterocigotos para miR-208 y los animales con miR-208 inactivado (Figura 3 y Ejemplo 3) . Para elucidar de manera adicional la interacción entre miR-208 y miR-499, los animales silvestres fueron inyectados por vía intravenosa con solución salina o una entre cuatro dosis (20 mg/kg, 40 mg/kg, 80 mg/kg, y 160 mg/kg) de un oligonucleótido sintético (por ej . un antagomir) que tenía una secuencia complementaria a la secuencia madura de miR-208 (anti-miR-208 ; SEC ID NO: 16) . El análisis Northern del tejido del corazón tres días después de la inyección en la vena de la cola reveló una reducción dependiente de la dosis en la expresión de miR-208 maduro, al tiempo que la expresión del pre-miR-208 quedó intacta (Figura 6A) . No obstante, a diferencia del modelo de deleción genética, la expresión de miR-499 permaneció inalterada. Asimismo, los niveles de expresión de ß-MHC tampoco resultaron afectados tres días después de la inyección de un antagomir anti-miR-208 (datos no ilustrados) .

En una segunda serie de experimentos, los animales silvestres fueron inyectados por vía intravenosa con una dosis única de anti-miR-208 (80 mg/kg) , o con dos dosis secuenciales (80 mg/kg) de anti-miR-208 en dos días consecutivos, o con dos dosis secuenciales (80 mg/kg) de un oligonucleótido de control discordante (SEC ID NO: 17) en dos días consecutivos. El análisis Northern del tejido cardíaco dos meses después del tratamiento mostró que la expresión tanto de miR-208 como de miR-499 se redujo en los animales tratados con anti-miR-208 (Figura 6B) . El análisis de PCR en tiempo real confirmó estos resultados (Figura 6C) . Asimismo, también se observó una reducción en la expresión de miR-208b, que se codifica dentro de un intrón de ß-MHC y se co-expresa con ß-MHC. El análisis de PCR en tiempo real para los correspondientes genes de miosina huésped reveló que el silenciamiento de miR-208 no afecta la expresión de OÍ-MHC, pero induce una reducción en la expresión de ß-MHC y Myh7b (Figura 6C) . Una reducción en la proteína ß-MHC también se observó dos meses después del tratamiento con anti-miR-208 (Figura 6D) . Estos resultados indican que la regulación de miR-208 y miR-499 de la expresión de ß-MHC ocurre después de un retardo, lo que sugiere que miR-208 está corriente arriba de miR-499, que a su vez está corriente arriba de ß-MHC. Por ende, tanto miR-208 como miR-499 necesitan regularse en forma descendente para obtener una reducción expeditiva de la expresión de ß-MHC. La regulación de miR-208 en forma individual genera una eventual reducción en la expresión de miR-499, que a su vez induce una reducción en la expresión de ß-MHC. Para obtener un efecto más inmediato sobre la expresión de ß-MHC, se pueden direccionar tanto miR-499 como miR-208 para la regulación descendente.

Para examinar el efecto combinado de la regulación descendente tanto de miR-208 como de miR-499, los animales con miR-499 inactivado recibieron oligonucleótidos anti-miR-208 antes de recibir propiltiouracilo (PTU) , un inductor de la expresión de ß-MHC. En forma similar a los resultados anteriores, el PTU indujo una reducción en la expresión de a-MHC y un incremento en la expresión de p-MHC/miR-208b (miR-208b se co-expresa con ß-MHC) tanto en los animales silvestres como en los animales con miR-499 inactivado en ausencia de tratamiento con oligonucleótidos anti-miR-208 (Figura 7A, B) . Dichos efectos son característicos de la respuesta al estrés cardíaco. Por el contrario, el análisis Northern y el análisis de PCR en tiempo real del tejido cardíaco de los animales con miR-499 inactivado tratados con oligonucleótidos anti-miR-208 dos semanas después del tratamiento mostraron que no se observó un incremento en la expresión de P-MHC/miR-208b en respuesta a PTU (Figura 7A, B) . La respuesta de los animales con miR-499 inactivado tratados con anti-miR-208 se asemejó a la respuesta de los animales con miR-208 inactivado (Figura 7B) . Estos resultados sugieren que la regulación descendente rápida y eficiente de ß-MHC se puede alcanzar mediante direccionamiento tanto de miR-208 como de miR-499. La dosis de oligonucleótidos anti-miR-208 que se administraron a los animales produjo una reducción del 60% en la expresión de miR-208. Este porcentaje de reducción fue suficiente para suprimir la inducción de ß-MHC mediante PTU en ausencia de miR-499 (Figura 7B) . Estos hallazgos indican que la reducción tanto de miR-499 como de miR-208 puede ser una estrategia terapéutica eficiente para el tratamiento de trastornos cardíacos, tales como hipertrofia cardíaca patológica e insuficiencia cardíaca.

Ejemplo 5. El silenciamiento de miR-208 y miR-499 inhibe la respuesta al estrés cardíaco Para evaluar en forma adicional el valor terapéutico del direccionamiento de miR-208 y miR-499 para tratar trastornos cardíacos, los ratones fueron inyectados por vía intravenosa con un oligonucleótido antisentido que tenía una secuencia complementaria a la secuencia madura de miR-208a (anti-208), un oligonucleótido antisentido que tenía una secuencia complementaria a la secuencia madura de miR-499 (anti-499) , o ambas secuencias de oligonucleótidos anti-208 y anti-499. Ambos anti-208 y anti-499 contienen una combinación de ácidos nucleicos bloqueados (LNA) y ácidos desoxirribonucleicos (ADN) ligados mediante enlaces internucleósidos fósforotioato . El análisis de PCR en tiempo real de los corazones de los animales inyectados con los oligonucleótidos antisentido desde tres semanas hasta dos meses después del tratamiento se usa para evaluar el silenciamiento de miR-208 y miR-499.

Para evaluar el efecto de la regulación descendente de miR-208 y miR-499 in vivo sobre la respuesta al estrés cardíaco, los animales que recibieron oligonucleótidos anti-208, anti-499, o ambos, se someten a un procedimiento simulado o a un procedimiento de bandeo de aorta torácica para inducir sobrecarga de presión. Se espera que los animales que no recibieron tratamiento exhiban una respuesta al estrés típica con la regulación ascendente de ß-MHC así como también otros genes relacionados con el estrés (A F y BNP) . Por el contrario, se espera que los animales que son tratados tanto con anti-208 como con anti-499 exhiban una regulación ascendente reducida de ß-MHC en respuesta al estímulo de estrés que es más pronunciada que los animales que recibieron cualquier oligonucleótido antisentido en forma individual .

Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patentes analizadas y citadas en la presente se incorporan en la presente por referencia en su totalidad. Se entiende que la invención revelada no se limita a la metodología, los protocolos y los materiales particulares descritos, ya que pueden variar. También se entiende que la terminología usada en la presente es a los efectos de describir formas de realización particulares solamente, y no está destinada a limitar el alcance de la presente invención que solamente será limitado por las reivindicaciones adjuntas.

Las personas versadas en el arte reconocerán -o serán capaces de determinar usando no más que la experimentación de rutina- muchos equivalentes a las formas de realización específicas de la invención descritas en la presente. Dichos equivalentes están destinados a ser abarcados por las reivindicaciones que siguen.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la presente invención como antecede, se considera como una novedad y, por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES :

1. Un método para tratar hipertrofia cardiaca patológica, infarto del miocardio o insuficiencia cardiaca en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar un inhibidor de miR-208a o miR-208b y un inhibidor de miR-499 al sujeto, en donde la expresión o actividad de miR-208a o miR-208b y miR-499 es reducida en las células del corazón del sujeto después de la administración.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el inhibidor de miR-208a o miR-208b y el inhibidor de miR-499 son oligonucleótidos antisentido.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el inhibidor de miR-208a o miR-208b y el inhibidor de miR-499 son co-administrados .

4. El método de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el inhibidor de miR-208a o miR-208b y el inhibidor de miR-499 son codificados por un vector de expresión.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el inhibidor de miR-208a o miR-208b y el inhibidor de miR-499 son codificados por el mismo vector de expresión.

6. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el inhibidor de miR-208a o miR-208b y el inhibidor de miR-499 son administrados en forma secuencial.

7. El método de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el inhibidor de miR-208a o miR-208b es administrado antes que el inhibidor de miR-499.

8. El método de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el inhibidor de miR-499 es administrado antes que el inhibidor de miR-208a o miR-208b.

9. El método de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el inhibidor de miR-208a o miR-208b y el inhibidor de miR-499 son administrados con al menos 24 horas de diferencia .

10. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el inhibidor de miR-208a o miR-208b y el inhibidor de miR-499 son administrados a una dosis de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 200 mg/kg.

11. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la expresión o actividad de miR-208a o miR-208b y miR-499 se reduce a más del 60% en las células del corazón del sujeto, después de la administración de los inhibidores.

12. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la respuesta al estrés cardíaco se reduce en el sujeto después de la administración de los inhibidores. 8 O

13. El método de acuerdo con la reivindicación 12, en donde la respuesta al estrés cardíaco incluye una reducción de la expresión de OÍ-MHC y/o un incremento de la expresión de ß-MHC en las células del corazón de dicho sujeto.

14. El método de acuerdo con la reivindicación 12, en donde la reducción de la respuesta al estrés cardíaco ocurre menos de ocho semanas después de la administración de los inhibidores .

15. El método de acuerdo con la reivindicación 12, en donde la reducción de la respuesta al estrés cardíaco ocurre menos de cuatro semanas después de la administración de los inhibidores .

16. El método de acuerdo con la reivindicación 12, en donde la reducción de la respuesta al estrés cardíaco ocurre menos de una semana después de la administración de los inhibidores .

17. Un método para tratar o prevenir un trastorno musculoesquelético en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar un antagonista de miR-208a o miR-208b y un antagonista de miR-499 al sujeto, en donde la expresión o actividad de miR-208a o miR-208b y miR-499 es incrementada en las células del músculo esquelético del sujeto después de la administración.

18. El método de acuerdo con la reivindicación 17, en donde el antagonista de miR-208a o miR-208b y el antagonista de miR-499 son polinucleótidos que codifican una secuencia madura de miR-208a o miR-208b y/o miR-499.

19. El método de acuerdo con la reivindicación 18, en donde el antagonista de miR-208a o miR-208b y el antagonista de miR-499 son codificados en un vector de expresión.

20. El método de acuerdo con la reivindicación 17, en donde el antagonista de miR-208a o miR-208b y el antagonista de miR-499 son co-administrados .

21. El método de acuerdo con la reivindicación 17, en donde el antagonista de miR-208a o miR-208b y el antagonista de miR-499 son administrados en forma secuencial.

22. El método de acuerdo con la reivindicación 21, en donde el antagonista de miR-208a o miR-208b es administrado antes que el antagonista de miR-499.

23. El método de acuerdo con la reivindicación 21, en donde el antagonista de miR-499 es administrado antes que el antagonista de miR-208a o miR-208b.

24. El método de acuerdo con la reivindicación 17, en donde la expresión de uno o más genes del músculo esquelético rápido en dichas células del músculo esquelético es reducida después de la administración de los antagonistas de miR-499 y miR-208.

25. El método de acuerdo con la reivindicación 24, en donde uno o más genes del músculo esquelético rápido se seleccionan entre el grupo conformado por troponina 12, troponina T3, cadena liviana de la miosina esquelética rápida, y actina alfa del músculo esquelético.