JP2014504857A - ロックドヌクレオチドを含むｍｉｃｒｏＲＮＡ阻害剤 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は、ｍｉＲ−２０８ａ、ｍｉＲ−２０８ｂ、および／またはｍｉＲ−４９９を含むｍｉＲ−２０８ファミリーのｍｉＲＮＡの発現（たとえば存在量）を阻害可能な化学修飾オリゴヌクレオチドを提供する。
【解決手段】本発明は、いくつかの実施形態において、ｍｉＲ−２０８ａ、ｍｉＲ−２０８ｂ、およびｍｉＲ−４９９のそれぞれの発現または存在量を特異的に阻害可能なオリゴヌクレオチドを提供する。本発明は、本オリゴヌクレオチドを含む医薬組成物、およびｍｉＲ−２０８ファミリーのｍｉＲＮＡに関連するまたはそれが関与する病状または障害、たとえば、心臓血管病状を有する患者を治療する方法をさらに提供する。種々の実施形態において、本オリゴヌクレオチドは、効力、送達効率、標的特異性、毒性、および／または安定性の１つ以上の利点を提供する。
【選択図】なし

Description

関連発明の相互参照
本出願は、２０１０年１２月１５日に出願された米国仮出願第６１／４２３，４５６号および２０１１年６月９日に出願された米国仮出願第６１／４９５，２２４号（それぞれその全体を参照により本明細書に援用する）の優先権および利益を主張する。

発明の分野
本発明は、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲ）阻害剤の化学モチーフ、特に、患者に投与したときに効力（potency）、送達効率、標的特異性、安定性、および／または毒性における利点を有する化学修飾されたｍｉＲＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。

背景
ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲ）は、心臓機能の制御および維持を含む多くの生物学的プロセスに関与している（Eva Van Rooij and Eric Olson, MicroRNAs: Powerful new regulators of heart disease and proactive therapeutic targets, J. Clin. Invest. 117(9):2369-2376 (2007)、Chien KR, Molecular Medicine: MicroRNAs and the tell-tale heart. Nature 447, 389-390 (2007)を参照）。したがって、ｍｉＲは、約１８〜約２５ヌクレオチドの長さの小さな、タンパク質をコードしない（non-protein coding）ＲＮＡであり、配列が完全に相補的である場合には分解を促進することにより、または配列がミスマッチを含む場合には翻訳を阻害することにより、標的ｍＲＮＡのリプレッサーとして働く。その機序は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）中への成熟ｍｉＲＮＡ鎖の導入（incorporation）を含み、ここで、塩基対の相補性によって標的ＲＮＡと会合する。

ｍｉＲＮＡ機能は、アンチセンスポリヌクレオチドまたはｍｉＲＮＡ機能を模倣するポリヌクレオチド（「ｍｉＲＮＡミメティック（mimetic）」）によって治療的に標的とされ得る。しかしながら、オリゴヌクレオチド系作用剤によるｍｉＲＮＡの治療的標的化は、ＲＮＡ結合親和性および特異性、細胞内取込みの効率、ならびにヌクレアーゼ耐性を含むいくつかの難題を呈する。たとえば、ポリヌクレオチドを無傷の細胞に導入したとき、ヌクレアーゼによる攻撃および分解を受けて、活性が失われる。その分解を２’置換等によって回避しようとしてポリヌクレオチド類似体が調製されているが（B. Sproat et al., Nucleic Acids Research 17 (1989), 3373-3386）、この修飾は、意図する生物学的作用に関するポリヌクレオチドの効力に影響を与えることが多い。そのような効力低下は、いずれの場合も、修飾ポリヌクレオチドが標的ＲＮＡと安定な二本鎖を形成できないことおよび／または細胞機構との相互作用が失われることに起因し得る。他の修飾は、ＲＮＡ結合親和性を向上させる可能性を有するロックド核酸の使用を含む。Veedu RN and Wengel J, Locked nucleic acid as a novel class of therapeutic agent. RNA Biology 6:3, 321-323 (2009)。

ｍｉＲＮＡ阻害剤のオリゴヌクレオチドの化学様式（chemistry patterns）または化学モチーフは、阻害剤の送達、安定性、効力、特異性、および／または毒性プロフィールを改善する可能性を有しており、そうしたことが、治療場面においてｍｉＲＮＡ機能を効果的に標的とするのに必要とされている

発明の概要
本発明は、ｍｉＲ−２０８ａ、ｍｉＲ−２０８ｂ、および／またはｍｉＲ−４９９を含むｍｉＲ−２０８ファミリーのｍｉＲＮＡの発現（たとえば存在量）を阻害可能な化学修飾オリゴヌクレオチドを提供する。本発明は、本オリゴヌクレオチドを含む医薬組成物、およびｍｉＲ−２０８ファミリーのｍｉＲＮＡに関連するまたはそれが関与する病状または障害を有する患者を治療する方法をさらに提供する。そのような病状は、種々の心臓血管病状を含む。種々の実施形態において、本オリゴヌクレオチドは、効力、送達効率、標的特異性、毒性、および／または安定性の１つ以上の利点を提供する。

一態様において、本発明は、ｍｉＲ−２０８ファミリーのｍｉＲＮＡの発現または存在量を低減可能な化学修飾オリゴヌクレオチドを提供する。本オリゴヌクレオチドの活性または効力は、in vitroおよび／またはin vivoで決定してもよい。たとえば、本オリゴヌクレオチドは、有意に約５０ｎＭ以下、または他の実施形態において、４０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、もしくは１０ｎＭ以下の濃度で、ｍｉＲ−２０８ファミリーのｍｉＲＮＡの活性（デュアル（dual）ルシフェラーゼアッセイにおいて決定される）を阻害することができる（たとえば、約５０％阻害）。代わりに、またはさらに、本オリゴヌクレオチドの活性は、本明細書に記載されるように、好適なマウスモデルもしくはラットモデルまたは非ヒト霊長動物モデルで決定することができ、ｍｉＲ−２０８ファミリーのｍｉＲＮＡの阻害（たとえば、少なくとも５０％）は、５０ｍｇ／ｋｇ以下、たとえば、２５ｍｇ／ｋｇ以下、１０ｍｇ／ｋｇ以下、または５ｍｇ／ｋｇ以下の用量で観測される。これらの実施形態において、本オリゴヌクレオチドは、皮下または静脈内に投与することができ（本明細書に記載のとおり）、水性調製物（たとえば、生理食塩水）中に製剤化することができる。

本オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列は、ヒトｍｉＲ−２０８ａまたはｍｉＲ−２０８ｂ（あるいはｐｒｅ−またはｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）のヌクレオチド配列に実質的に相補的であり、ロックド（locked）ヌクレオチドと非ロックド（non-locked）ヌクレオチドとの混合物を含む。たとえば、本オリゴヌクレオチドは、少なくとも３、少なくとも５、または少なくとも７つのロックドヌクレオチドと、少なくとも１つの非ロックドヌクレオチドとを含んでいてもよい。一般的には、本オリゴヌクレオチドの長さならびにロックドヌクレオチドの数および位置は、本明細書に記載されるように、本オリゴヌクレオチドが、in vitroルシフェラーゼアッセイにおいて、約５０ｎＭ以下のオリゴヌクレオチド濃度で、または、好適なラットモデルもしくはマウスモデルまたは非ヒト霊長動物モデルにおいて５０ｍｇ／ｋｇ以下の用量で、ｍｉＲ−２０８ａ、ｍｉＲ−２０８ｂ、および／またはｍｉＲ−４９９の活性を低減するようなものである。代表的な実施形態において、ロックドヌクレオチドは、２’−４’メチレン架橋を有する。

本オリゴヌクレオチドは、全長または短縮（truncated）されたｍｉＲ−２０８ａ、ｍｉＲ−２０８ｂ、またはｍｉＲ−４９９アンチセンス配列を含んでもよく、これらから本質的になってもよく、またはこれらからなってもよい。これらの実施形態において、本オリゴヌクレオチドは、約６〜２２ヌクレオチド長であり、または約１０〜１８ヌクレオチド長であり、または約１１〜約１６ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、本オリゴヌクレオチドは、約１４、１５、１６、または１７ヌクレオチド長である。本オリゴヌクレオチドは、５’−ＴＧＣＴＣＧＴＣＴＴＡ−３’（配列番号１）のヌクレオチド配列を含んでいてもよく、または５’−ＴＧＴＴＣＧＴＣＴＴＡ−３’（配列番号２）のヌクレオチド配列を含んでいてもよい。特定の実施形態において、本オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド配列５’−ＣＴＴＴＴＴＧＣＴＣＧＴＣＴＴＡ−３’（配列番号３）または５’−ＣＣＴＴＴＴＧＴＴＣＧＴＣＴＴＡ−３’（配列番号４）を含む、これらから本質的になる、またはこれらからなる。

本オリゴヌクレオチドは、少なくとも約３、少なくとも約５、もしくは少なくとも約７つのロックドヌクレオチド、または少なくとも９つのロックドヌクレオチドを含んでいてもよいが、種々の実施形態において、完全にはロックドヌクレオチドで構成されない。一般的には、ロックドヌクレオチドの数および位置は、本オリゴヌクレオチドが、ｍｉＲ−２０８ａ、ｍｉＲ−２０８ｂ、および／またはｍｉＲ−４９９の活性を高い効力で低減または阻害するようなものである。特定の実施形態において、本オリゴヌクレオチドは、４超、３超、または２超の隣接する非ロックドヌクレオチドを有する一続きのヌクレオチドを含んでいない。代表的な実施形態において、本オリゴヌクレオチドは、正確に９つのロックドヌクレオチドおよび７つの非ロックドヌクレオチドを有する。たとえば、ロックドヌクレオチドの様式は、少なくとも位置１、６、１０、１３、および１５がロックドヌクレオチドであるようなものであってもよい。特定の実施形態において、少なくとも位置１、５、１０、および１６は、ロックドヌクレオチドである。特定の実施形態において、位置１、５、６、８、１０、１１、１３、１５、および１６は、ロックドヌクレオチドであり、残りの位置は、非ロックドヌクレオチドである。他の実施形態において、位置１、３、４、５、６、８、１０、１３、１５、および１６は、ロックドヌクレオチドであり、残りの位置は、非ロックドヌクレオチドである。さらに他の実施形態様において、位置１、４、５、７、９、１０、１２、１４、および１６は、ロックドヌクレオチドであり、残りの位置は、非ロックドヌクレオチドである。ロックドヌクレオチドのこれらの様式は、特定の実施形態において、本明細書に記載の配列番号３もしくは配列番号４またはそれらの変異体のヌクレオチド配列を用いて、利用してもよい。阻害剤が配列番号３または配列番号４のヌクレオチド配列からなるまたはこれらから本質的になる場合、本オリゴヌクレオチドは、すべてロックドヌクレオチドを含んでいてもよい。

非ロックドヌクレオチドでは、ヌクレオチドは、２’ヒドロキシルに対して２’修飾を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、２’修飾は、Ｏ−アルキル（置換されていてもよい）、ハロ、およびデオキシ（Ｈ）から独立して選択してもよい。

本オリゴヌクレオチドはまた、１つまたは複数のホスホロチオエートリンケージを含んでいてもよい。たとえば、本オリゴヌクレオチドは、完全にホスホロチオエートリンケージ（fully phosphorothioate-linked）であってもよく、または約半分もしくは３／４がホスホロチオエート（phosphorotioate）リンケージを含んでいてもよい。

例示的なオリゴヌクレオチド阻害剤を表１に示す。

他の態様において、本発明は、細胞内送達のための種々の高分子集合体、ミセル、またはリポソーム組成物中へのオリゴヌクレオチドの導入を含んでいてもよい、本発明のオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物および製剤を提供する。特定の実施形態において、本オリゴヌクレオチドは、従来の静脈内、皮下、または筋内投与のために製剤化される。そのような製剤は、従来の水性製剤、たとえば、生理食塩水中の製剤であってもよい。特定の実施形態において、本組成物は、皮内、皮下、筋内、腹腔内、もしくは静脈内注入、または標的組織（たとえば心臓組織）中への直接注入に好適であり、あるいはそのために製剤化される。

さらに他の態様において、本発明は、たとえば、哺乳動物患者の病状の進行を治療、寛解、または予防するために、in vitroまたはex vivoのいずれかで哺乳動物細胞にオリゴヌクレオチドおよび医薬組成物を送達する方法を提供する。本方法は、本オリゴヌクレオチドまたはそれを含む組成物を哺乳動物患者または標的細胞集団に投与することを含んでいてもよい。患者は、ｍｉＲ−２０８ファミリー発現に関連する、それにより介される、またはそれから生じる症状を有していてもよい。そのような病状は、たとえば、心臓肥大、心筋梗塞、心不全（たとえば鬱血性心不全）、血管傷害、再狭窄症、または病的心臓線維症（pathologic cardiac fibrosis）を含む。したがって、本発明は、そのような病状を治療するための、およびそのような治療のための医薬を調製するための、本発明の修飾オリゴヌクレオチドおよび組成物の使用を提供する。

本発明の他の態様および実施形態は、以下の本発明の詳細な説明から明らかになるであろう。

デュアルルシフェラーゼアッセイを用いてin vitroで阻害剤活性を定量化するためのｐｓｉＣＨＥＣＫ^ＴＭ−２構築物（Promega）。 ｍｉＲ−２０８ａに対してデュアルルシフェラーゼアッセイにより測定されたｍｉＲ−２０８阻害剤の有効性。図２は、ＬＮＡを追加する効果を示す。１０６７３は、１６ヌクレオチドのうち９つのＬＮＡを有し（９／１６）、１０６７４は、１１／１６を有し、１０６７７は、１３／１６を有し、１０１０１および１０５９１は、９／１６を有する。「２０８単独」とは、ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子の３’側にクローニングされたｍｉＲ−２０８ａ認識部位を有するルシフェラーゼ構築物単独を意味する。「２０８＋ミミック」は、ｍｉｒ−２０８ａの共トランスフェクションを含む。 ｍｉＲ−２０８ａに対するデュアルルシフェラーゼアッセイにより測定されたｍｉＲ−２０８阻害剤の有効性。Ｍ−１０５９１は、非標的化コントロールである。 ｍｉＲ−２０８ｂに対してデュアルルシフェラーゼアッセイにより測定されたｍｉＲ−２０８阻害剤の有効性。 ｍｉＲ−４９９に対してデュアルルシフェラーゼアッセイにより測定されたｍｉＲ−２０８阻害剤の有効性。 正常マウスにおけるｍｉＲＮＡ阻害剤設計物のin vivo投与後の心臓でのｍｉＲ−２０８ａおよびｍｉＲ−２０８ｂの発現レベル。左の棒は、ｍｉＲ−２０８ａ発現レベルであり、右の棒は、ｍｉＲ−２０８ｂ発現レベルである。 ２週間ごとに２５ｍｇ／ｋｇのｍｉＲＮＡ阻害剤設計物をin vivoで皮下投与した後のダール食塩感受性ラットの生存率。 図７と同様に阻害剤設計物が投与されたダール食塩感受性ラットの体重変化パーセント。 上位１０位以内のｍｉＲ−２０８阻害剤設計物中のロックド核酸の配置（配列番号９４〜９９）を示すチャート。 正常マウスにおけるｍｉＲ−２０８ａ阻害剤設計物のin vivo投与後のリアルタイムＰＣＲにより決定された心臓でのｍｉＲ−２０８ａ存在量。 正常マウスにおけるｍｉＲ−２０８ａ阻害剤設計物のin vivo投与後のリアルタイムＰＣＲにより決定された心臓でのｍｉＲ−２０８ｂ存在量。 ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａ（Ｍ−１０１０１）の全身送達は、心臓でｍｉＲ−２０８の有効かつ持続的なサイレンシングを誘導する。図１２は、漸増用量のａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａの静脈内（ｉ．ｖ．）送達１週間後のネズミ心臓のリアルタイムＰＣＲ分析を示し、ｍｉＲ−２０８ａレベルの用量依存性低減を実証する。各用量に対してｎ＝４。 示された時点で採取された心臓組織のリアルタイムＰＣＲ分析。図１３は、２５ｍｇ／ｋｇのａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａ（Ｍ−１０１０１）のｉ．ｖ．、腹腔内（ｉ．ｐ）、または皮下（ｓ．ｃ．）送達が、ｍｉＲ−２０８ａの強力なサイレンシングを誘導することを示す。各群に対してｎ＝４。 ｍｉＲ−２０８ａサイレンシングは、ｍｉＲ−４９９およびＭｙｈ７を低減する。図１４Ａは、ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａ（Ｍ−１０１０１）が、注入６週間後までｍｉＲ−２０８ａの心臓中レベルを強力に低減し、それにより、ｍｉＲ−４９９の時間応答性低減をもたらすことを実証するリアルタイムＰＣＲ分析を示す。ｍｉＲ−２０８ａおよび−４９９の両方に対するａｎｔｉｍｉＲの投与は、ｍｉＲ−２０８ａおよびｍｉＲ−４９９の両方の心臓中レベルの即時低減を誘導する。図１４Ｂは、ｍｉＲ−２０８ａ阻害４週間後にＭｙｈ７が低減され、一方、２週間後にｍｉＲ−２０８ａおよびｍｉＲ−４９９の阻害がＭｙｈ７を低減することを示す（リアルタイムＰＣＲにより）。図１４Ｃは、ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａまたはａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａ／−４９９治療後の示された時点での低減されたＭｙｈ７発現を示すＭｙｈ７に対するウェスタンブロット分析である。Ｇａｐｄｈは、ローディングコントロールとして機能する。図１４ＡおよびＢに対して、エラーバーはＳＥＭを示す。各時点および各用量に対してｎ＝４。 組織中分布解析から、注入６週間後まで、血漿、心臓、肝臓、または腎臓で、有意量のａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａ（Ｍ−１０１０１）を検出可能であることが示される。エラーバーはＳＥＭを示す。各時点および各用量に対してｎ＝４。 ｍｉＲ−２０８ａの治療的サイレンシングは、心不全に有益である。図１６Ａは、ダール高血圧ラットモデルにおけるカプラン・マイヤー生存曲線を示しており、ＨＳ／生理食塩水群およびＨＳ／コントロール群の両方でＨＳ食に応答して生存率の顕著な低減を示すが、これはａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａ（Ｍ−１０１０１）治療に応答して有意に改善される。図１６Ｂは、体重解析を示しており、８％ＨＳ食のダール高血圧ラットが、ＬＳ食の動物と比較して低減された体重増加を呈するが、ＨＳ／ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａ治療ラットが、体重増加の有意により良好な維持を示すことを示唆する。（ａ）および（ｂ）では、ＬＳ／生理食塩水に対してｎ＝６、ＨＳ／生理食塩水およびＨＳ／コントロールに対してｎ＝１５、およびＨＳ／ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａに対してｎ＝１４。グラフ上の「ｎ」は、摂食後８週目で生き残っている全生存動物数を表す。 ４％ＨＳ食のダールラットの体重解析であり（図１７Ａ）、ＬＳ食コントロールと比較して体重増加が有意に低減するが、２週間ごとの５および２５ｍｇ／ｋｇ注入の両方が、普通食の動物に匹敵する体重増加を維持するのに十分であることを示す。エラーバーは、ＳＥＭ、^＊ｐ＜０．０５対ＨＳ生理食塩水、^＃ｐ＜０．０５対ＬＳ生理食塩水を示す。図１７Ｂは、心エコー測定を示しており、４％ＨＳ食に応答するＩＶＲＴの増加およびＭＶ Ｅ／Ａの低減が、摂食開始８週間後、ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａ治療に応答して有意に改善されることを示唆する。ＩＶＲＴは、等容弛綬時間であり、ＭＶ Ｅ／Ａは、僧帽弁早期対能動期充満速度比（mitral valve early to active filling velocity ratio）である。すべての群に対してｎ＝１０。 Ｈ＆Ｅおよびピクロシリウスレッドで染色された左室組織切片の代表的な画像は、８週間の４％ＨＳ食に応答して心筋細胞肥大の増加および血管周囲線維症を示すが、両方のパラメーターが、ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａ（Ｍ−１０１０１）治療に応答して低減される（図１８Ａ）。図１８Ｂは、ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａの存在下で有意により少ない肥大および繊維症を示す組織学的定量化の棒グラフ図である。エラーバーは、ＳＥＭ、^＊ｐ＜０．０５対ＨＳ生理食塩水、^＃ｐ＜０．０５対ＬＳ生理食塩水を示す。 ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａ（Ｍ−１０１０１）治療は、ダール食塩感受性ラットにおいてｍｉＲ−４９９およびＭｙｈ７を低減する。分析はすべて、４％ＨＳ食開始８週間後およびａｎｔｉｍｉＲ治療開始７週間後に行った。（ａ）および（ｃ）のすべての群に対してｎ＝１０。図１９Ａは、左室（ＬＶ）および右室（ＲＶ）の両方でｍｉＲ−２０８ａの用量依存性低減を示すリアルタイムＰＣＲ分析を示しており、これは、ｍｉＲ−４９９の用量依存性低減に対応する。ｍｉＲ−２０８ｂは、ＨＳ食に応答して増大されるが、ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａは、この応答を有意に減弱させる。コントロール化学物質（Ｃ．エレガンス（C. elegans）ｍｉＲに対するもの）の投与は、ｍｉＲ−２０８ａ、ｍｉＲ−４９９、またはｍｉＲ−２０８ｂのいずれの発現にも影響を及ぼさない。エラーバーは、ＳＥＭ、^＊ｐ＜０．０５対ＨＳ生理食塩水、^＃ｐ＜０．０５対ＬＳ生理食塩水を示す。図１９Ｂは、ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａ治療に応答するｍｉＲ−４９９およびｍｉＲ−２０８ｂの制御をノーザンブロット分析により確認できることを示す。Ｕ６は、ローディングコントロールとして機能する。 ＨＳ食はＭｙｈ６を低減するがＭｙｈ７を増大させることを示すリアルタイムＰＣＲ分析（図２０Ａ）。ＡｎｉｔｍｉＲ−２０８ａ（Ｍ−１０１０１）治療は、用量依存的にＭｙｈ６発現を増大させるが、Ｍｙｈ７ｂ発現を低減する。Ｍｙｈ７のＨＳ食起因性増加は、ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａにより用量依存的に低減される。エラーバーは、ＳＥＭ、^＊ｐ＜０．０５対ＨＳ生理食塩水、^＃ｐ＜０．０５対ＬＳ生理食塩水を示す。図２０Ｂは、心室組織のＭｙｈ７のウェスタンブロット分析によりａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａ治療に応答して用量依存性低減が確認されることを示す。Ｇａｐｄｈは、ローディングコントロールとして使用される。 血漿中のｍｉＲ−４９９は、ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａの有効性のバイオマーカーの役割を果たす。図２１は、血漿サンプルのリアルタイムＰＣＲ分析を示しており、ＨＳ食に応答してｍｉＲ−４９９が増加するが、４％ＨＳ食開始８週間後およびａｎｔｉｍｉＲ治療開始７週間後、ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａが血漿中のｍｉＲ−４９９の検出を有意に低減することを示唆する。さらなるｍｉＲＮＡ解析は、そのほかに、ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａに応答して血漿中の検出可能なｍｉＲ−４２３−５ｐの低減を示す。 アフリカミドリザル（約３ｋｇ）における組織中および血漿中の分布。Ａｎｔｉｍｉｒ１０１０１（ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａ）および１０７０７（ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ｂ）を伏在静脈により２５ｍｇ／ｋｇの用量で３回投与し、薬剤の血漿クリアランスを調べた（右のパネル）。組織を４週間後に採取し、阻害剤をアッセイした（暗色バー、Ｍ−１０１０１、および明色バー、Ｍ−１０７０７）。 アフリカミドリザルにおける特異的ｍｉＲＮＡ標的阻害。左のパネルは、左室でのｍｉＲ−２０８ａ発現の変化を示す（左から右へ：未治療、Ｍ−１０１０１、Ｍ−１０７０７、Ｍ−１０５９１）。右のパネルは、左室でのｍｉＲ−２０８ｂの変化を示す（左から右へ：未治療、Ｍ−１０１０１、Ｍ−１０７０７、Ｍ−１０５９１）。示されるように、Ｍ−１０１０１とＭ−１０７０７との差はわずか２ヌクレオチドにすぎないが、ａｎｔｉｍｉＲは、それらの標的ｍｉＲ（それぞれｍｉＲ−２０８ａおよびｍｉＲ−２０８ｂ）に特異的である。 治療後のｍｉｒ−４９９のレベル。レベルは、左室（ＬＶ）、右室（ＲＶ）、および中隔に対して示されている。棒は、左から右へ、未治療、Ｍ−１０１０１、Ｍ−１０７０７、およびＭ−１０５９１である。 異なる化学様式を有するａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａ化合物は、２５ｍｇ／ｋｇでラットに皮下投与したとき、左室でｍｉＲ−２０８ａノックダウンを示す。化合物は、異なるレベルの標的脱抑制を示す。 図２５と同様のａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａ化合物を用いた標的脱抑制。 図２５と同様のａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａ化合物を用いた標的脱抑制。 図２５と同様のａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａ化合物を用いた標的脱抑制。 Ａｎｔｉｍｉｒ−２０８ａ治療は、無ストレス齧歯動物（ＳＤラット）において血漿中ｍｉＲ−１９ｂレベルを増大させる。 食塩感受性ラットを用いた試験は、標的脱抑制度がストレス度に依存することを示す。Ｄｙｎｌｔ１は、６％食塩ストレスでよりロバストな脱抑制を示す。 食塩感受性ラットモデルにおける異なるストレス度（４％および６％食塩食）での標的脱抑制度（Ｖｃｐｉｐ１）。 食塩感受性ラットモデルにおける異なるストレス度（４％および６％食塩食）での標的脱抑制度（Ｔｍｂｉｍ６）。 心臓の異なる領域でのｍｉＲ阻害度であり、より多くのストレスを受けた領域がより大きい影響を示すことを示す。 ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａ治療を受けた心臓の異なる領域でのミオシン発現度であり、より多くのストレスを受けた領域がより大きい影響を示すことを示す。 ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａ治療を受けた心臓の異なる領域での特定の心臓ストレスマーカーの発現度。 ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａ治療を受けた心臓の異なる領域での標的発現度であり、より多くのストレスを受けた領域がより大きい影響を示すことを示す。 ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａ治療を受けた心臓の異なる領域での標的発現度であり、より多くのストレスを受けた領域がより大きい影響を示すことを示す。 ａｔｉｍｉＲ−２０８ａ治療を受けた心臓の異なる領域でのＤｙｎｌｔ１脱抑制度であり、より多くのストレスを受けた領域がより大きい影響を示すことを示す。 ａｔｉｍｉＲ−２０８ａ治療を受けた心臓の異なる領域での標的脱抑制度であり、より多くのストレスを受けた領域がより大きい影響を示すことを示す。

発明の詳細な説明
本発明は、ｍｉＲ−２０８ａ、ｍｉＲ−２０８ｂ、および／またはｍｉＲ−４９９を含むｍｉＲ−２０８ファミリーのｍｉＲＮＡの発現（たとえば存在量）を阻害可能な化学修飾オリゴヌクレオチドを提供する。本発明は、いくつかの実施形態において、ｍｉＲ−２０８ａ、ｍｉＲ−２０８ｂ、およびｍｉＲ−４９９のそれぞれの発現または存在量を特異的に阻害可能なオリゴヌクレオチドを提供する。本発明は、本オリゴヌクレオチドを含む医薬組成物、およびｍｉＲ−２０８ファミリーのｍｉＲＮＡに関連するまたはそれが関与する病状または障害、たとえば、種々の心臓血管病状を有する患者を治療する方法をさらに提供する。種々の実施形態において、本オリゴヌクレオチドは、効力、送達効率、標的特異性、毒性、および／または安定性の１つ以上の利点を提供する。

化学修飾ｍｉＲ−２０８ａアンチセンスオリゴヌクレオチド
一態様において、本発明は、ｍｉＲ−２０８ファミリーのｍｉＲＮＡの発現または存在量を低減可能なオリゴヌクレオチドを提供する。本オリゴヌクレオチドの活性は、in vitroおよび／またはin vivoで決定することができる。たとえば、ｍｉＲ−２０８ａ、ｍｉＲ−２０８ｂ、またはｍｉＲ−４９９の活性の阻害をin vitroで決定する場合、活性は、本明細書に記載のデュアルルシフェラーゼアッセイを用いて決定することができる。本オリゴヌクレオチドは、約５０ｎＭ以下、または他の実施形態において４０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、もしくは１０ｎＭ以下の濃度で、デュアルルシフェラーゼ活性で決定したとき、そのような活性を有意に阻害する。たとえば、本オリゴヌクレオチドは、デュアルルシフェラーゼアッセイにおいて決定したとき、ｍｉＲ−２０８ａ、ｍｉＲ−２０８ｂ、および／またはｍｉＲ−４９９の活性の阻害に対して、約５０ｎＭ以下、４０ｎＭ以下、３０ｎＭ以下、または２０ｎＭ以下のＩＣ５０を有し得る。

デュアルルシフェラーゼアッセイは、市販品として入手可能な製品ＰｓｉＣＨＥＣＫ^ＴＭ（Promega）により例示されるように、検出可能なタンパク質（たとえば、ウミシイタケルシフェラーゼ）の遺伝子の３’ＵＴＲにｍｉＲ認識部位を配置することを含む。構築物は、阻害活性をシグナル変化により決定できるように、標的ｍｉＲＮＡと共に共発現される。検出可能なタンパク質（たとえば、ホタルルシフェラーゼ）をコードする第２の遺伝子を同一プラスミドに組み込んで、シグナル比をａｎｔｉｍｉＲ活性の指標として決定することができる。

代わりに、またはさらに、本オリゴヌクレオチドの活性は、本明細書に記載されるように、好適なマウスモデルまたはラットモデルで決定することができ、ｍｉＲ−２０８ファミリーのｍｉＲＮＡの阻害（たとえば、少なくとも５０％）は、５０ｍｇ／ｋｇ以下、たとえば、２５ｍｇ／ｋｇ以下、１０ｍｇ／ｋｇ以下、または５ｍｇ／ｋｇ以下のオリゴヌクレオチド用量で観測される。いくつかの実施形態において、本オリゴヌクレオチドの活性は、国際公開第２００８／０１６９２４号（その記載を参照により本明細書に援用する）に記載の動物モデルで決定される。たとえば、本オリゴヌクレオチドは、５０ｍｇ／ｋｇ以下または２５ｍｇ／ｋｇ以下、たとえば、１０ｍｇ／ｋｇ以下または５ｍｇ／ｋｇ以下の用量で、少なくとも５０％の標的ｍｉＲＮＡ阻害または標的脱抑制を呈することができる。そのような実施形態において、本オリゴヌクレオチドは、マウスに静脈内または皮下投与することができ、本オリゴヌクレオチドは、生理食塩水中に製剤化することができる。

これらのまたは他の実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、投与後、安定であり、投与の少なくとも３週間後、少なくとも４週間後、少なくとも５週間後、または少なくとも６週間後、循環血および／または標的器官で検出可能である。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドは、より低頻度の投与、より低い用量、および／または治療効果のより長い持続期間を提供する可能性を有する。

本オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列は、ヒトｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂのヌクレオチド配列に実質的に相補的であり、ロックドヌクレオチドと非ロックドヌクレオチドとの混合物を含む。たとえば、本オリゴヌクレオチドは、少なくとも５または少なくとも７または少なくとも９つのロックドヌクレオチドと、少なくとも１つの非ロックドヌクレオチドとを含んでいてもよい。一般的には、本オリゴヌクレオチドの長さならびにロックドヌクレオチドの数および位置は、それぞれ記載されるように、本オリゴヌクレオチドが、in vitroルシフェラーゼアッセイにおいて、約５０ｎＭ以下のオリゴヌクレオチド濃度で、または、好適なマウスモデルもしくはラットモデルにおいて約５０ｍｇ／ｋｇ以下もしくは約２５ｍｇ／ｋｇ以下の用量で、ｍｉＲ−２０８ａ、ｍｉＲ−２０８ｂ、および／またはｍｉＲ−４９９の活性を低減するようなものである。実質的に相補的なオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ−２０８ａまたはｍｉＲ−２０８ｂの標的配列に対して１〜４つのミスマッチ（たとえば、１または２つのミスマッチ）を有していてもよい。

ｍｉＲ−２０８ａは、その構造およびプロセシング、ならびにそれにより（いくつかある病状の中で特に）心臓肥大、心不全、または心筋梗塞を治療する可能性を含めて、国際公開第２００８／０１６９２４号に記載されており、その全体を参照により本明細書に援用する。本発明による阻害ｍｉＲＮＡの設計に使用可能なヒトｍｉＲ−２０８ａのｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ配列は、以下のとおりである（下線付き配列は成熟型である）。

ｍｉＲ−２０８ｂおよびｍｉＲ−４９９の構造およびプロセシングはまた、国際公開第２００９／０１８４９２号にも記載されており、参照により本明細書に援用する。成熟ｍｉＲ−２０８ｂは、ヌクレオチド配列５’−ＡＵＡＡＧＡＣＧＡＡＣＡＡＡＡＧＧＵＵＵＧＵ−３’（配列番号６）を有し、成熟ｍｉＲ−４９９は、ヌクレオチド配列５’−ＵＵＡＡＧＡＣＵＵＧＣＡＧＵＧＡＵＧＵＵＵ−３’（配列番号７）を有する。これらの配列は、本発明による相補的阻害剤を設計するために使用してもよい。

本オリゴヌクレオチドは、１つまたは複数のロックド核酸（ＬＮＡ）残基または「ロックドヌクレオチド」を含む。ＬＮＡは、たとえば、米国特許第６，２６８，４９０号、米国特許第６，３１６，１９８号、米国特許第６，４０３，５６６号、米国特許第６，７７０，７４８号、米国特許第６，９９８，４８４号、米国特許第６，６７０，４６１号、および米国特許第７，０３４，１３３号に記載されており、そのすべてをその全体を参照により本明細書に援用する。ＬＮＡは、「ロックされた（ｌｏｃｋｅｄ）」コンフォメーションおよび／または二環式構造をもたらすリボース糖部分の２’および４’炭素間の追加の架橋を含む、修飾されたヌクレオチドまたはリボヌクレオチドである。一実施形態において、本オリゴヌクレオチドは、以下の構造Ａにより示される構造を有する１つまたは複数のＬＮＡを含む。代わりに、またはさらに、本オリゴヌクレオチドは、以下の構造Ｂにより示される構造を有する１つまたは複数のＬＮＡを含んでいてもよい。代わりに、またはさらに、本オリゴヌクレオチドは、以下の構造Ｃにより示される構造を有する１つまたは複数のＬＮＡを含む。

本発明のオリゴヌクレオチドに導入できる他の好適なロックドヌクレオチドは、米国特許第６，４０３，５６６号および米国特許第６，８３３，３６１号に記載されるものが含まれ、これらの両方をその全体を参照により本明細書に援用する。

代表的な実施形態において、ロックドヌクレオチドは、たとえば、構造Ａに示されるように、２’−４’メチレン架橋を有する。

本オリゴヌクレオチドは、全長または短縮されたｍｉＲ−２０８ａまたはｍｉＲ−２０８ｂアンチセンス配列を含んでもよく、これらから本質的になってもよく、またはこれらからなってもよい。本明細書で用いられる場合、ｍｉＲＮＡ配列に関して「全長」という用語は、成熟ｍｉＲＮＡアンチセンス対応物の長さを意味する。したがって、本明細書に記載の阻害剤は、短縮されたまたは全長のアンチセンス成熟ｍｉＲＮＡ配列であってもよく、または他のポリヌクレオチド配列と組み合わせてこれらの配列を含んでいてもよい。特定の実施形態において、本明細書に記載の化学修飾モチーフでは、全長アンチセンスｍｉＲＮＡ（成熟）配列が不要になる。これらの実施形態において、本オリゴヌクレオチドは、８〜２０ヌクレオチド長であり、または１０〜１８のヌクレオチド長であり、または１１〜１６ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態の本オリゴヌクレオチドは、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、または約１８ヌクレオチド長である。短縮されたオリゴヌクレオチドは、５’−ＵＡＡＧＡＣＧＡＧＣＡＡＡＡＡＧ−３’（配列番号８）内のｍｉＲ−２０８ａ配列またはＵＡＡＧＡＣＧＡＡＣＡＡＡＡＡＧ−３’（配列番号９）内のｍｉＲ−２０８ｂ配列をアンチセンス阻害による標的とする配列を有していてもよい。

本オリゴヌクレオチドは、一般的には、成熟ｍｉＲ−２０８ａ、成熟ｍｉＲ−２０８ｂ、および／または成熟ｍｉＲ−４９９を標的とするように設計されたヌクレオチド配列を有する。本オリゴヌクレオチドは、これらのもしくは他の実施形態において、または代替的に、ｐｒｅ−またはｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ形を標的としてもよい。特定の実施形態において、本オリゴヌクレオチドは、完全に相補的な（成熟）ｍｉＲ−２０８配列に対して、１〜５つ（たとえば、１、２、３、または４つ）のミスマッチを含む配列を有するように設計してもよい。

特定の実施形態において、本オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ−２０８ａまたはｍｉＲ−２０８ｂのヌクレオチド配列に完全に相補的なヌクレオチド配列を含む。たとえば、本オリゴヌクレオチドは、５’−ＴＧＣＴＣＧＴＣＴＴＡ−３’（配列番号１）のヌクレオチド配列を含んでいてもよく、または５’−ＴＧＴＴＣＧＴＣＴＴＡ−３’（配列番号２）のヌクレオチド配列を含んでいてもよい。特定の実施形態において、本オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド配列５’−ＣＴＴＴＴＴＧＣＴＣＧＴＣＴＴＡ−３’（配列番号３）または’５−ＣＣＴＴＴＴＧＴＴＣＧＴＣＴＴＡ（配列番号４）を含み、これらから本質的になり、またはこれらからなる。これとの関連では、「〜から本質的になる」は、追加のヌクレオチドが、デュアルルシフェラーゼアッセイまたはマウスモデルにおいて標的ｍｉＲＮＡ活性の本オリゴヌクレオチドによる阻害に実質的に影響しない限り（２０％以下のＩＣ５０の増加により定義される）、５’および３’末端の一方または両方にヌクレオチド（たとえば、１または２つ）の任意選択の付加を含む。

本オリゴヌクレオチドは、一般的には、少なくとも３、少なくとも５、少なくとも７、または少なくとも９つのロックドヌクレオチドを含むが、種々の実施形態において、完全にはロックドヌクレオチドで構成されない。一般的には、ロックドヌクレオチドの数および位置は、本オリゴヌクレオチドが、記載のとおりin vitroまたはin vivoで決定したとき、ｍｉＲ−２０８ａ、ｍｉＲ−２０８ｂ、および／またはｍｉＲ−４９９の活性を低減するようなものである。特定の実施形態において、本オリゴヌクレオチドは、４超または３超の隣接する非ロックドヌクレオチドを有する一続きのヌクレオチドを含んでいない。特定の実施形態において、本オリゴヌクレオチドは、２超の隣接する非ロックドヌクレオチドを有する一続きのヌクレオチドを含んでいない。たとえば、本オリゴヌクレオチドは、隣接する非ロックドヌクレオチドの丁度１つの出現を有していてもよい。これらのまたは他の実施形態において、ｍｉＲ−２０８ａ、ｍｉＲ−２０８ｂ、および／またはｍｉＲ−４９９のシード領域に相補的な領域は、少なくとも３または少なくとも４つのロックドヌクレオチドを含む。これらの実施形態は、たとえば、配列番号３または配列番号４のヌクレオチド配列を利用してもよい。

したがって、種々の実施形態において、本オリゴヌクレオチドは、少なくとも９つのロックドヌクレオチドまたは少なくとも１１のロックドヌクレオチドを含む。本オリゴヌクレオチドは、少なくとも３または少なくとも５つの非ロックドヌクレオチドを含んでいてもよい。たとえば、本オリゴヌクレオチドは、９つのロックドヌクレオチドおよび７つの非ロックドヌクレオチドを含んでいてもよく、または１１のロックドヌクレオチドおよび５つの非ロックドヌクレオチドを含んでいてもよい。

ロックドヌクレオチドの様式は、少なくとも位置１、６、１０、１３、および１５がロックドヌクレオチドであるようなものであってもよい。特定の実施形態において、位置１、５、６、８、１０、１１、１３、１５、および１６は、ロックドヌクレオチドであり、残りの位置は、非ロックドヌクレオチドである。他の実施形態において、位置１、３、４、５、６、８、１０、１３、１５、および１６は、ロックドヌクレオチドであり、残りの位置は、非ロックドヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、位置１、４、５、７、９、１０、１２、１４、および１６は、ロックドヌクレオチドであり、残りの位置は、非ロックドヌクレオチドである。代表的な実施形態において、そのような様式は、配列番号３または配列番号４の配列を有するオリゴヌクレオチドと併用される。

非ロックドヌクレオチドでは、ヌクレオチドは、２’ヒドロキシルに対して２’修飾を含んでいてもよい。たとえば、２’修飾は２’デオキシであってもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチド中への２’修飾ヌクレオチドの導入は、ヌクレアーゼに対する本オリゴヌクレオチドの耐性およびそれが相補的ＲＮＡを伴うときの熱安定性の両方を増大させることができる。２’位の種々の修飾は、ＲＮＡ標的との分子相互作用または細胞機構を損なうことなく、増大されたヌクレアーゼ感受性を提供するものから独立して選択することができる。そのような修飾は、in vitroまたはin vivoでの増加した効力に基づいて選択することができる。ｍｉＲＮＡ阻害に関する増大された効力（たとえば、ＩＣ５０）を決定する例示的な方法は、デュアルルシフェラーゼアッセイおよびin vivo ｍｉＲＮＡ発現または標的脱抑制を含めて、本明細書に記載されている。

いくつかの実施形態において、２’修飾は、Ｏ−アルキル（置換されていてもよい）、ハロ、デオキシ（Ｈ）から独立して選択されてもよい。非ロックドヌクレオチドの実質的にすべてのまたはすべてのヌクレオチド２’位は、特定の実施形態において、たとえば、Ｏ−アルキル（たとえばＯ−メチル）、ハロ（たとえばフルオロ）、デオキシ（Ｈ）、およびアミノから独立して選択されるように、修飾してもよい。たとえば、２’修飾は、それぞれ、Ｏ−メチルおよびフルオロから独立して選択してもよい。代表的な実施形態において、プリンヌクレオチドは、それぞれ、２’ＯＭｅを有し、ピリミジンヌクレオチドは、それぞれ、２’−Ｆを有する。特定の実施形態において、１〜約５つの２’位または約１〜約３つの２’位は、非修飾のまま残存する（たとえば、２’−ヒドロキシとして）。

本発明による２’修飾はまた、小さい炭化水素置換基も含む。炭化水素置換基は、アルキル、アルケニル、アルキニル、およびアルコキシアルキルを含み、アルキル（アルコキシのアルキル部分を含む）、アルケニル、およびアルキニルは、置換であっても非置換であってもよい。アルキル、アルケニル、およびアルキニルは、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、アルケニル、またはアルキニル、たとえば、Ｃ１、Ｃ２、またはＣ３であってもよい。炭化水素置換基は、Ｎ、Ｏ、および／またはＳから独立して選択され得る１または２または３つの非炭素原子を含んでいてもよい。２’修飾は、Ｏ−アルキル、Ｏ−アルケニル、およびＯ−アルキニルとして、アルキル、アルケニル、およびアルキニルをさらに含んでいてもよい。

本発明による例示的な２’修飾には、２’−Ｏ−アルキル（Ｃ１〜３アルキル、たとえば、２’ＯＭｅもしくは２’ＯＥｔ）、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、または２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）が含まれる。

特定の実施形態において、本オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの２’ハロ修飾（たとえば、２’ヒドロキシルの代わりに）、たとえば、２’−フルオロ、２’−クロロ、２’−ブロモ、および２’−ヨードを含む。いくつかの実施形態において、２’ハロ修飾はフルオロである。本オリゴヌクレオチドは、１〜約５つの２’ハロ修飾（たとえばフルオロ）、または１〜約３つの２’ハロ修飾（たとえばフルオロ）を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、本オリゴヌクレオチドは、非ロックド位にすべて２’−フルオロヌクレオチドを含み、またはすべての非ロックドピリミジンヌクレオチド上に２’−フルオロを含む。特定の実施形態において、２’−フルオロ基は、独立して、ジ−、トリ−、または非メチル型である。

本オリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の２’−デオキシ修飾（たとえば、２’ヒドロキシルに対してＨ）を有していてもよく、いくつかの実施形態において、非ロックド位に２〜約１０の２’−デオキシ修飾を含んでいてもよく、またはすべての非ロックド位に２’デオキシを含んでいてもよい。

代表的な実施形態において、本オリゴヌクレオチドは、非ロックド位に２’ＯＭｅとして修飾２’位を含む。あるいは、非ロックドプリンヌクレオチドは、２’ＯＭｅとして２’位で修飾され、非ロックドピリミジンヌクレオチドは、２’−フルオロとして２’位で修飾される。

特定の実施形態において、本オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの末端修飾または「キャップ」をさらに含む。キャップは、５’および／または３’キャップ構造であってもよい。「キャップ」または「末端キャップ」という用語は、オリゴヌクレオチドのいずれかの末端における化学修飾（末端リボヌクレオチドに関して）が含まれ、５’末端の最後の２つのヌクレオチドおよび３’末端の最後の２つのヌクレオチドの間の結合における修飾が含まれる。本明細書に記載のキャップ構造は、ＲＮＡ標的または細胞機構との分子相互作用を弱めることなく、エキソヌクレアーゼに対するオリゴヌクレオチドの抵抗性を増加することができる。そのような修飾は、in vitroまたはin vivoでの増加した効力に基づいて選択することができる。キャップは、５’末端（５’キャップ）または３’末端（３’キャップ）に存在してもよいし、あるいは両端に存在してもよい。特定の実施形態において、５’および／または３’キャップは、ホスホロチオエートモノホスフェート、脱塩基（ａｂａｓｉｃ）残基（部分）、ホスホロチオエートリンケージ、４’−チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド、ホスホロジチオエートリンケージ、逆方向（ｉｎｖｅｒｔｅｄ）ヌクレオチドまたは逆方向脱塩基部分（２’−３’または３’−３’）、ホスホロジチオエートモノホスフェート、およびメチルホスホネート部分から独立して選択される。ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエートリンケージは、キャップ構造の一部である場合、５’末端の２つの末端ヌクレオチドおよび３’末端の２つの末端ヌクレオチドの間に通常位置する。

特定の実施形態において、本オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの末端ホスホロチオエートモノホスフェートを有する。ホスホロチオエートモノホスフェートは、エキソヌクレアーゼの作用を阻害することにより、より高い効力を支援することができる。ホスホロチオエートモノホスフェートは、オリゴヌクレオチドの５’および／または３’末端にあってもよい。ホスホロチオエートモノホスフェートは、以下の構造によって定義され、ここで、Ｂは塩基であり、Ｒは上記の２’修飾である。

キャップ構造がロックドヌクレオチドの化学物質を支援できる場合、キャップ構造は、本明細書に記載のロックドヌクレオチドに導入してもよい。

ホスホロチオエートリンケージは、いくつかの実施形態において、たとえば（キャップ構造の一部などとして）５’および３’末端の最後の２つのヌクレオチド間に存在してもよいし、あるいはホスホジエステルリンケージで代替されてもよい。これらの実施形態または他の実施形態において、本ポリヌクレオチドは、５’および３’末端のいずれかまたは両端で少なくとも１つの末端脱塩基残基を含むことができる。脱塩基部分は、アデノシン、グアニン、シトシン、ウラシル、またはチミンなどの一般的に認知されるプリンまたはピリミジンヌクレオチド塩基を含まない。したがって、そのような脱塩基部分は、ヌクレオチド塩基を欠くか、または他の非ヌクレオチド塩基化学基を１’位に有する。たとえば、脱塩基ヌクレオチドは、逆脱塩基ヌクレオチドであってもよく、たとえば逆脱塩基ホスホロアミダイトが（３’アミダイトの代わりに）５’アミダイトを介して結合し、５’−５’リン酸結合となる。ポリヌクレオチドの５’および３’末端の逆脱塩基ヌクレオシドの構造を以下に示す。

本オリゴヌクレオチドは、１つまたは複数のホスホロチオエートリンケージを含んでいてもよい。ホスホロチオエートリンケージは、ヌクレアーゼ切断に対するポリヌクレオチドの耐性をより高めるために使用されている。たとえば、本ポリヌクレオチドは、部分的にホスホロチオエートリンケージしてもよく、たとえば、ホスホロチオエートリンケージは、ホスホジエステル（phophodiester）リンケージで代替されてもよい。しかしながら、特定の実施形態において、本ポリヌクレオチドは、完全にホスホロチオエートリンケージされる。他の実施形態において、本オリゴヌクレオチドは、１〜５つまたは１〜３つのホスフェートリンケージを有する。

いくつかの実施形態において、本ヌクレオチドは、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１１／５９５８８号（ヘテロ環式置換基を有するそこに開示されたすべての例示的なピリミジンカルボキサミド修飾に関するものを含めて、参照により本明細書に援用する）に記載されるように１つまたは複数のカルボキサミド修飾塩基を有する。

代表的な実施形態において、本オリゴヌクレオチドは、以下の表１に列記された化合物構造を有する。

特定の実施形態において、本オリゴヌクレオチドは、１０１０１、１０６７３、１０６７４、１０６７７、１０６７９、１０６８３、１０７０７、もしくは１０６８０、または表１に記載の他のオリゴヌクレオチドである。

固相合成によるオリゴヌクレオチドの合成は、修飾ポリヌクレオチドを含めて、周知であり、New Chemical Methods for Synthesizing Polynucleotides. Caruthers MH, Beaucage SL, Efcavitch JW, Fisher EF, Matteucci MD, Stabinsky Y. Nucleic Acids Symp. Ser. 1980;(7):215-23に概説されている。

組成物、製剤、および送達
本オリゴヌクレオチドは、種々の高分子集合体または組成物内に導入してもよい。そのような送達のための複合体には、患者への送達のために製剤化される種々のリポソーム、ナノ粒子、およびミセルが含まれてもよい。複合体は、細胞膜浸透を開始するために１つまたは複数の融合性または親油性分子を含んでいてもよい。そのような分子は、たとえば、米国特許第７，４０４，９６９号および米国特許第７，２０２，２２７号に記載され、これらはその全体を参照により本明細書に援用する。あるいは、本オリゴヌクレオチド（oligonucelotide）は、国際公開第２０１０／１２９６７２号（参照により本明細書に援用する）に記載されるように、細胞内送達を支援するためにペンダント親油性基をさらに含んでいてもよい。

本組成物または製剤では、本明細書に記載の少なくとも１つを含む複数の治療用オリゴヌクレオチドを利用してもよい。たとえば、本組成物または製剤では、本明細書に記載の少なくとも２、３、４、または５つのｍｉＲＮＡ阻害剤を利用してもよい。

本発明のオリゴヌクレオチドは、種々の医薬組成物として製剤化することができる。医薬組成物は、意図する用途に適切な形態で調製されるであろう。一般に、これは、発熱原およびヒトまたは動物に有害となり得る他の不純物を本質的に含まない組成物を調製することを包含する。例示的な送達／製剤系は、コロイド分散系、高分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、脂質ベース系、たとえば、水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを含む。本発明に係る核酸を心筋組織および骨格筋組織に送達するのに好適な市販の脂肪エマルジョンとしては、Intralipid（登録商標）、Liposyn（登録商標）、Liposyn（登録商標）II、Liposyn（登録商標）III、Nutrilipid、および他の類似の脂質エマルジョンが含まれる。in vivoの送達媒体として使用するのに好ましいコロイド系は、リポソーム（すなわち人工膜小胞）である。そのような系の調製および使用は、当業界で周知である。例示的な製剤もまた、米国特許第５，９８１，５０５号、米国特許第６，２１７，９００号、米国特許第６，３８３，５１２号、米国特許第５，７８３，５６５号、米国特許第７，２０２，２２７号、米国特許第６，３７９，９６５号、米国特許第６，１２７，１７０号、米国特許第５，８３７，５３３号、米国特許第６，７４７，０１４号、および国際公開第０３／０９３４４９号に開示されており、これらはその全体を参照により本明細書に援用する。

いくつかの実施形態において、本オリゴヌクレオチドは、従来の皮下または静脈内投与のために、たとえば、無菌水および正常生理食塩水を含む適切な水性希釈剤を用いて製剤化することにより、製剤化される。

本医薬組成物および製剤では、送達運搬体を安定にし、標的細胞による取込みを可能とするための適切な塩および緩衝剤を利用してもよい。本発明の水性組成物は、薬学的に許容可能な担体または水性媒体に溶解または分散された、阻害剤オリゴヌクレオチド（たとえばリポソームまたは他の複合体）を含む送達運搬体を有効量含む。「薬学的に許容可能な」または「薬理学的に許容可能な」という表現は、動物またはヒトに投与したときに、有害反応、アレルギー性反応、または他の不利な反応を引き起こさない分子体および組成物を意味する。本明細書で用いられる場合、「製薬上許容される担体」には、医薬、たとえばヒトへの投与に好適な医薬の製剤化での使用が許容される１つまたは複数の溶媒、緩衝剤、溶液剤、分散媒、コーティング剤、抗細菌剤および抗菌類剤、等張化剤および吸収遅延剤などが含まれる。医薬活性物質用のそのような媒体および作用剤の使用は、当業界で周知である。補充活性成分もまた、組成物に導入することができる。

本発明の医薬組成物の投与または送達は、その経路によって標的組織が利用可能である限り、任意の経路とすることができる。たとえば、投与は、皮内、皮下、筋内、腹腔内、もしくは静脈内注入であってもよいし、または標的組織（たとえば心臓組織）への直接注入によるものであってもよい。本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドの安定性および／または効力は、皮下、皮内、および筋内を含めて、便利な投与経路を可能にする。ｍｉＲＮＡ阻害剤を含む医薬組成物はまた、カテーテルシステムまたは心臓に治療剤を送達するために冠循環を分離するシステムにより投与することもできる。心臓および冠血管系に治療剤を送達するための種々のカテーテルシステムは、当業界で公知である。本発明で使用するのに好適なカテーテルに基づく送達法または冠脈分離法のいくつかの例（これらに限定されるものではない）は、米国特許第６，４１６，５１０号、米国特許第６，７１６，１９６号、米国特許第６，９５３，４６６号、国際公開第２００５／０８２４４０号、国際公開第２００６／０８９３４０号、米国特許出願公開第２００７／０２０３４４５号、米国特許出願公開第２００６／０１４８７４２号および米国特許出願公開第２００７／００６０９０７号に開示されており、これらはすべてその全体を参照によりに本明細書に援用する。

本組成物または製剤はまた、非経口投与してもよいし、または腹腔内投与してもよい。例示のため、遊離塩基または薬理学的に許容可能な塩としてのコンジュゲートの溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と好適に混合される水中で調製することができる。グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物、ならびに油に導入して、ディスパージョン剤を調製することもできる。通常の貯蔵条件下および使用条件下では、こうした調製物は、微生物の増殖を防止するために一般的には保存剤を含有する。

注入またはカテーテル送達に使用するのに好適な医薬製剤としては、たとえば、無菌の注入用の溶液または分散液を即時調製するための無菌の水性の溶液剤またはディスパージョン剤および無菌の粉末剤が含まれる。一般的には、これらの製剤は、無菌であり、容易な注入が行える程度に流動性である。製剤は、製造条件下および貯蔵条件下で安定でなければならず、かつ細菌や菌類などの微生物の汚染作用を受けないように貯蔵されなければならない。適切な溶媒または分散媒体は、たとえば、水、エタノール、ポリオール（たとえば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それらの好適な混合物、ならびに植物油を含有することができる。適正な流動性は、たとえば、レシチンなどのようなコーティング剤を用いることにより、ディスパージョン剤の場合には所要の粒子サイズを維持することにより、および界面活性剤を用いることにより、維持することができる。微生物の活動の防止は、種々の抗細菌剤および抗菌類剤、たとえば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどにより行うことが可能である。多くの場合、等張化剤、たとえば、糖または塩化ナトリウムを組み込むことが好ましいであろう。吸収を遅らせる作用剤、たとえば、アルミニウムモノステアレートおよびゼラチンを組成物で使用することにより、注入用組成物を長期間にわたり吸収させるようにすることが可能である。

滅菌注射用溶液剤は、適切な量のコンジュゲートを、必要に応じて任意の他の成分（たとえば、以上に列記したもの）と共に、溶媒中に導入することにより、調製することができる。一般的には、ディスパージョン剤は、基剤としての分散媒と所望の他の成分（たとえば、以上に列挙したもの）とを含有する滅菌媒体中に種々の無菌の活性成分を導入することにより調製される。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌粉末剤の場合、好ましい調製方法は、活性成分と任意の追加の所望の成分とよりなる粉末を事前に滅菌濾過されたその溶液から生成する真空乾燥技術および凍結乾燥技術を含む。

製剤化後、溶液剤は、好ましくは、投与処方に適合し得る形でかつ治療上有効な量で投与される。製剤は、注入用溶液剤、薬剤放出カプセル剤などのようなさまざまな剤形で容易に投与することができる。たとえば水溶液の状態で非経口投与に供する場合、一般的には、溶液を適切に緩衝化し、かつたとえば十分な生理食塩水またはグルコースを用いて最初に液体希釈液を等張化する。そのような水性溶液は、たとえば、静脈内、筋肉内、皮下、および腹腔内への投与に使用することができる。好ましくは、当業者に公知のように、特に本開示に照らして、無菌の水性媒体が利用される。例として、１回の投与量を１ｍｌの等張ＮａＣｌ溶液中に溶解させて、１０００ｍｌの皮下注入液に添加するかまたは提案された注入部位に注入することが可能である（たとえば、”Remington’s Pharmaceutical Sciences” 15th Edition, pages 1035-1038 and 1570-1580を参照されたい）。治療される対象の病状に依存して投与量のいくらかの変更を生じることは避けられないであろう。いずれにせよ、投与の責任者が個々の対象に対して適切な用量を決定するであろう。さらに、ヒトに投与する場合、調製物は、食品医薬品局（ＦＤＡ）生物製剤部（Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）基準に規定された、無菌性、発熱原性、ならびに一般的安全性および純度の基準を満たさなければならない。

治療方法
本発明は、オリゴヌクレオチドを哺乳動物細胞に送達する方法（たとえば、本明細書に記載の組成物または製剤の一部として）、および哺乳動物患者の病状の進行を治療、寛解、または予防する方法を提供する。本オリゴヌクレオチドまたは医薬組成物はin vitroまたはin vivoで標的細胞（たとえば、哺乳動物細胞）に接触させることができる。細胞は、心臓細胞であり得る。

本方法は、一般的には、本オリゴヌクレオチドまたはそれを含む組成物を哺乳動物患者または標的細胞集団に投与することを含む。本オリゴヌクレオチドは、すでに記載したように、ｍｉＲＮＡ阻害剤である（たとえば、ｍｉＲ−２０８ファミリーのｍｉＲＮＡの発現または活性を阻害するように設計されたヌクレオチド配列を有する）。したがって、患者は、ｍｉＲ−２０８ファミリー発現に関連する、それにより介される、またはそれから生じる症状を有していてもよい。そのような病状は、たとえば、心臓肥大、心筋梗塞、心不全（たとえば鬱血性心不全）、血管傷害、再狭窄症、または病的心臓線維症を含む。したがって、本発明は、そのような病状を治療するための、およびそのような治療のための医薬を調製するための、本発明の修飾オリゴヌクレオチドおよび組成物の使用を提供する。

特定の実施形態において、患者（たとえば、ヒト患者）は、たとえば、長期持続性コントロール不良高血圧、非根治弁膜疾患、慢性アンギナ、亜急性心筋梗塞、鬱血性心不全、心疾患先天的素因、および病的肥大を含む１つまたは複数のリスク因子を有する。代わりに、またはさらに、患者は、たとえば心臓肥大の遺伝的素因を有すると診断されていてもよいし、またはたとえば心臓肥大の家族歴を有していてもよい。

この態様において、本発明は、心不全または心臓肥大の患者における、運動耐容能の向上、入院期間の短縮、生活の質の向上、罹患率の低減、および／または死亡率の低減を提供し得る。

特定の実施形態において、ｍｉＲ−２０８ａ、ｍｉＲ−２０８ｂ、および／またはｍｉＲ−４９９の活性は、心臓組織でまたは患者血清で決定したとき、低減または阻害される。

種々の実施形態において、本医薬組成物は、心臓組織中への非経口投与によりまたは直接注入により、投与される。非経口投与は、静脈内、皮下、または筋内であり得る。いくつかの実施形態において、本組成物は、経口投与、経皮投与、持続放出投与、制御放出投与、遅延放出投与、坐剤投与、カテーテル投与、または舌下投与により投与される。特定の実施形態において、本オリゴヌクレオチドは、２５ｍｇ／ｋｇ以下の用量、１０ｍｇ／ｋｇ以下の用量、または５ｍｇ／ｋｇ以下の用量で投与される。これらの実施形態において、本オリゴヌクレオチドまたは組成物は、筋内もしくは皮下注入によりまたは静脈内に投与することができる。

いくつかの実施形態において、本方法は、治療後のｍｉＲＮＡ阻害剤を捕捉または除去する（clearing）ことをさらに含む。たとえば、阻害剤の機能を減衰または停止するために、阻害剤に相補的なヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドを治療後に投与してもよい。

実施例
実施例１：ｍｉＲＮＡ２０８ファミリーを標的とするｍｉＲＮＡ阻害剤のin vitro活性
ｍｉＲＮＡ２０８ファミリー（ｍｉＲ２０８ａ、ｍｉＲ−２０８ｂ、およびｍｉＲ−４９９）を標的として一群のｍｉＲＮＡ阻害剤（一本鎖オリゴヌクレオチド）を合成した。配列および修飾の様式を表１に示す。塩基コードの説明を表２に提供する。一群は、１１ヌクレオチド〜１６ヌクレオチドの範囲内の複数の長さの逆相補阻害剤を含む。本オリゴヌクレオチド中のＬＮＡ修飾の数さらにはＬＮＡ修飾の位置を変化させた。

最初に、デュアルルシフェラーゼアッセイ読取りを利用して少数の一群をＨｅＬａ細胞で試験した。アッセイでは、ｐｓｉＣＨＥＣＴＭ−２構築物（Promega）を使用した（図１）。ＨｅＬａ細胞は、ｍｉＲ−２０８ファミリーを発現しないので、プラスミドと共に対応するミミックも共トランスフェクトした。

結果から、ＬＮＡ様式は、ｍｉＲ−２０８ファミリーのｍｉＲＮＡの阻害剤としてin vitroで本質的に異なる活性を有することが示される。いくつかのとくに強力な設計物を図２に示す。たとえば、Ｍ−１０６７３は、Ｍ−１０１０１と同数のＬＮＡ修飾（１６のうち９）を有するにもかかわらず、１ｎＭでｍｉＲ−２０８ａのより大きい阻害を示した。これらの結果を考慮して、すべて９つのＬＮＡ修飾（残りはＤＮＡヌクレオシドである）を有する１６ヌクレオチド長の他の限られた一群の阻害剤を合成し試験した。図３〜５は、ｍｉＲ−２０８ａ、ｍｉＲ−２０８ｂ、およびｍｉＲ−４９９（それぞれ）に対するデュアルルシフェラーゼレポートでのこれらの阻害剤の結果を示している。Ｍ−１０６７３は、ｍｉＲ−２０８ａだけでなく、ｍｉＲ−２０８ｂおよびｍｉＲ−４９９に対しても阻害を示した。１６ｍｅｒ阻害剤中にはｍｉＲ−２０８ａとｍｉＲ−２０８ｂとの間に２つのミスマッチが存在する。

次いで、より完全な一群の阻害剤設計物を構築した。これらの分子の構造を表１に示す。

実施例２：ｍｉＲＮＡ２０８ファミリーを標的とするｍｉＲＮＡ阻害剤のin vivo活性
ｍｉＲ−２０８ファミリーを標的とする３つの阻害剤を合成し、ｍｉＲ−２０８ａおよびｍｉＲ−２０８ｂのレベルに及ぼす影響に関して正常マウスで試験した。低圧尾静脈注入を介して２．５、１０、および２５ｍｇ／ｋｇをマウス（ｎ＝４）に投与し、４日間後、ｑＰＣＲによりｍｉＲＮＡレベルに関して心臓組織を分析した。結果（図６）は、in vitroデュアルルシフェラーゼの結果とよく相関した。これらの結果から、治療効果を得るのに用量を少なくとも１／１０倍に低減可能であることが示唆される（２５ｍｐｋから２．５ｍｐｋへ）。

以上の初期の実験から、ｍｉＲ−２０８ファミリーのｍｉＲＮＡに対する効力を増強する特有のＬＮＡ含有修飾モチーフ（ＬＮＡの数および位置を含む）が存在することが実証される。

以下でさらに説明するダール食塩感受性ラットモデルで、Ｍ−１０１０１およびＭ−１０６７３を試験した。図７および８は、Ｍ−１０１０１で最良の生存率および体重制御を示している。

実施例３：ｍｉＲ−２０８の治療的阻害は心不全時に心臓機能および生存率を改善する
これまで、心臓特異的ｍｉＲ−２０８ａの遺伝子欠失は、ストレスに応答して病的心臓リモデリングおよびＭｙｈ７のアップレギュレーションを予防すると報告された。この実施例は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（表１のＭ−１０１０１）の全身送達が心臓でｍｉＲ−２０８ａの強力かつ持続的なサイレンシングを誘導することを示している。ダール高血圧ラットにおける高血圧症起因性心不全時の抗ｍｉＲ−２０８ａの皮下送達によるｍｉＲ−２０８ａの治療上の阻害は、病的ミオシンスイッチングおよび心臓リモデリングを用量依存的に予防すると同時に、心臓機能、全身の健康状態、および生存率を改善する。転写プロフィーリングは、ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａが心臓遺伝子発現に顕著な影響を引き起こすことを示し、一方、血漿分析は、ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａ治療によるｍｉＲＮＡの循環レベルの有意な変化を示す。これらの試験から、心臓ｍｉＲＮＡを変調するオリゴヌクレオチドベースの治療の可能性が示され、心疾患時の心臓機能およびリモデリングの操作のための強力な治療標的としてｍｉＲ−２０８が確証される。

心臓への慢性および急性のストレスは、心筋細胞肥大、線維症、心力不全、筋細胞変性、およびアポトーシスを伴う病的リモデリング応答をもたらし、その結果、心不全および突然死になることが多い（１）。古典的な薬理学的治療戦略により心不全患者でリモデリングを低減して生存率を延長することが可能であるが、この治療は、最終的には、疾患の進行の予防に有効でない。病的肥大および心不全の顕著な特徴は、心房性ナトリウム利尿因子（ＡＮＦ）、Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、および収縮タンパク質の胎児性アイソフォーム、たとえば、骨格αアクチンおよびＭｙｈ７（βミオシン重鎖、β−ＭＨＣ）をコード化するものを含む一群の胎児性心臓遺伝子の再活性化である（２）。Ｍｙｈ６（α−ＭＨＣ）のダウンレギュレーションおよびＭｙｈ７のアップレギュレーションは、種に関係なく心臓傷害に対する通常の応答である（３〜５）。Ｍｙｈ６とＭｙｈ７との比の比較的わずかな増加は、ヒトおよび齧歯動物において、心臓の収縮力および性能に有益な効果を有することが示されている（６〜８）。これらのプロセスを治療的に操作する可能な方法の探索で、心臓リモデリングおよびミオシンスイッチングを制御する機序を理解することに多くの関心が払われてきた。

これまでに、心疾患のヒトモデルおよびマウスモデルで、病的心肥大、心不全、および心筋梗塞に関連するｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）のシグネチャー発現様式が同定された（９〜１０）。マウスでの機能獲得および機能喪失の試験では、筋細胞の成長、収縮性、エネルギー代謝、線維症、および血管新生の制御を含めて、心臓生物学の多くの側面でこれらのｍｉＲＮＡの重要かつ予想外な機能が明らかにされてきた（１１で再検討される）。特に興味深いのは、Ｍｙｈ６遺伝子のイントロン内にコードされるｍｉＲＮＡのｍｉＲ−２０８であり、これは、心臓ストレス応答を制御する（１２〜１３）。マウスにおいてｍｉＲ−２０８の遺伝子欠失があると、いくつかの形の心臓ストレスに応答して、ベースライン時に明白な表現型を誘導できないが、ｍｉＲ−２０８ヌルマウスは、実質上、心筋細胞肥大や線維症を示さず、Ｍｙｈ７発現をアップレギュレートすることができなかった（１２）。

成人心臓では、ｍｉＲ−２０８は、Ｍｙｈ７の発現だけでなく、近縁のミオシンアイソフォームＭｙｈ７ｂの発現にも、不可欠である（１４）。注目すべき点として、これらの遺伝子は両方とも、遅筋型ミオシンをコードし、イントロンｍｉＲＮＡ（それぞれｍｉＲ−２０８ｂおよびｍｉＲ−４９９）を含む（１５〜１６）。ｍｉＲ−２０８（本発明者らはｍｉＲ−２０８ａとして参照する）、ｍｉＲ−２０８ｂ、およびｍｉＲ−４９９は、ミオシン遺伝子から生じる関連ｍｉＲＮＡであるので、本発明者らは、まとめてｍｙｏｍｉＲとして参照する（１７）。マウスでの機能獲得および機能喪失の実験に通して、本発明者らは、ｍｉＲ−２０８ａの遺伝子欠失が、成人心臓内のＭｙｈ７ｂ／ｍｉＲ−４９９発現を用量依存的に低減することを示した（１８）。ｍｉＲ−４９９突然変異型動物は、ストレスに応答してＭｙｈ７発現や心臓リモデリングに影響を示さず、ｍｉＲ−４９９の再導入は、ｍｉＲ−２０８ａ突然変異型マウスで観測される心臓への影響を除去するので（１８）、本発明者らは、ｍｉＲ−２０８ａおよびｍｉＲ−４９９の組み合わせた低減が、ｍｉＲ−２０８ａ突然変異型動物で観測される心臓保護作用に関与すると結論付ける。

心臓の機能および機能不全に対するｍｉＲＮＡの重要性から、心疾患の場合にｍｉＲＮＡの生物学を治療的に活用する可能性が示唆される。一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、相補的塩基対を介してin vivoでｍｉＲＮＡを不活性化するのに有効であり、病的ｍｉＲＮＡを不活性化するのに潜在的に有効な手段になることが示されている（１９〜２３）。ここで、本発明者らは、ｍｉＲ−２０８ａに対する非接合ロックド核酸（ＬＮＡ）修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドの全身送達が、心臓でのｍｉＲ−２０８ａの特異的、強力、かつ持続的なサイレンシングを誘導するのに十分であることを示す。さらに、ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａは、ストレス起因性リモデリング、機能悪化、および心臓ミオシンスイッチングを用量依存的に予防すると同時に、心不全のラットモデル（ダール食塩感受性ラット）で全般的健康状態および生存率を改善する。遺伝子発現解析から、以上に規定された標的遺伝子の変化を含めて、ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａ治療に応答して特定の遺伝子発現変化が示された。興味深いことに、高血圧ラットにおけるａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａのこれらの生理学的作用は、循環ｍｉＲＮＡの血漿中レベルの有意な変化に反映されている。全体として、これら試験から、心疾患の場合のａｎｔｉｍｉＲの全身送達の効力が示唆され、心不全時の重要な治療標的としてｍｉＲ−２０８が確証される。

in vivoでのｍｉＲ−２０８ａのａｎｔｉｍｉＲ媒介サイレンシング
in vivoで心筋細胞におけるｍｉＲ−２０８ａ阻害の治療可能性を調べるために、本発明者らは、ｍｉＲ−２０８ａに対する非接合ＬＮＡ含有ａｎｔｉｍｉＲ（ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａ（表２のＭ−１０１０１））を設計した。ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａは、成熟ｍｉＲ−２０８ａの５’領域の塩基２〜１７を標的とし、ホスホロチオエートリンケージにより結合されたＬＮＡおよびＤＮＡの組合せを含む。０．１〜３３ｍｇ／ｋｇの範囲内の用量でマウスにａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａを静脈内（ｉ．ｖ．）送達した１週間後のリアルタイムＰＣＲおよびノーザンブロット分析は、ｍｉＲ−２０８ａの用量応答性サイレンシングを示したが、類似の化学物質のミスマッチａｎｔｉｍｉＲの注入は、ｍｉＲ−２０８ａの阻害を示さなかった（図１２）。特に、本発明者らは、１６ｍｅｒのＬＮＡ ａｎｔｉｍｉＲの存在下でｍｉＲ−２０８のアップシフトを観測したが、これは、ｍｉＲ−２０８ａとＬＮＡ ａｎｔｉｍｉＲとの間の安定なヘテロ二本鎖の形成を反映する。他の２つのｍｙｏｍｉＲのｍｉＲ−２０８ｂおよびｍｉＲ−４９９のリアルタイム分析は、１回注入の７日後、阻害を示さず、本発明者らは、Ｍｙｈ７の変化をなんら観測しなかった（データは示されていない）。

さらなる投与経路を介してａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａを送達する可能性を調べるために、本発明者らは、２５ｍｇ／ｋｇのａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａをマウスにｉ．ｖ．、腹腔内（ｉ．ｐ．）、または皮下（ｓ．ｃ．）注入し、１、４、７、および１４日目にｍｉＲ−２０８ａ阻害を測定した。３つの投与経路はすべて、異なる送達方法間で血漿、心臓、肝臓、および腎臓でのａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａ検出の有意差を生じることなく（図示せず）、ｍｉＲ−２０８ａのロバストな阻害を示した（図１３）。

長期間のｍｉＲ−２０８ａ阻害はin vivoでＭｙｈ７制御をもたらす
ｍｉＲ−２０８ａノックアウトマウスで見られたように、ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａの単回投与は、７日後、Ｍｙｈ７に対する効果を確立できなかったので、本発明者らは、ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａ投与後の効率的Ｍｙｈ７制御に必要とされる用量および時間の決定に着手した。３３ｍｇ／ｋｇのａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａの３回連続投与は、少なくとも６週間にわたりｍｉＲ−２０８ａをロバストに阻害した（図１４）。ｍｉＲ−２０８により制御されることがわかっているｍｉＲ−４９９は（１８）、ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａ投与１〜６週間後、ｍｉＲ−４９９の３５％低減から７５％低減へ、発現の時間依存性低減を示した（図１４Ａ）。さらに、Ｍｙｈ７ ｍＲＮＡ発現は、ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａ治療４週間後から始まって有意に低減されたことから、ｍｉＲ−２０８ａおよびｍｉＲ−４９９のレベルの特異的閾値がＭｙｈ７発現に必要であることが示唆され（図１４Ｂ）、これは、Ｍｙｈ７タンパク質の低減と併行的に起こった（図１４Ｃ）。ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａに応答するＭｙｈ７ ｍＲＮＡの初期スパイクは、増大されたＭｙｈ７タンパク質に翻訳されない。

Ｍｙｈ７発現に及ぼす影響がｍｉＲ−２０８ａおよびｍｉＲ−４９９の両方の低減に基づくかを確認するために、本発明者らは、ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａおよびａｎｔｉｍｉＲ−４９９のカクテルをそれぞれ３３ｍｇ／ｋｇで連続３日間にわたりマウスに注入した。ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａ／−４９９による治療は、６週間にわたりｍｉＲ−２０８ａおよびｍｉＲ−４９９のロバストな阻害を引き起こし、Ｍｙｈ７のｍＲＮＡおよびタンパク質のかなり急速な制御を示し、治療２週間後まで発現が低減された（図１４Ａ〜Ｃ）。心臓、肝臓、腎臓、および血漿でのａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａを定量化するサンドイッチハイブリダイゼーションアッセイを用いたａｎｔｉｍｉＲ分布データから、３３ｍｇ／ｋｇまたは３×３３ｍｇ／ｋｇのａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａのいずれかを投与した６週間後、かなりの量のａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａが依然として検出可能であることが示された（図１５）。

ｍｉＲ−２０８の治療的サイレンシングは、心臓リモデリングを低減すると同時に、心不全時の心臓機能および生存率を改善する
これまでのデータから、ｍｉＲ−２０８ａの遺伝子欠失が心臓保護効果をもたらすことが示されたので、本発明者らは、ｍｉＲ−２０８ａ阻害の治療的妥当性の試験をめざした。この目的のために、本発明者らは、８週齢から始めて、低食塩（ＬＳ）食（０．２５％ＮａＣｌ）または高食塩（ＨＳ）食（８．０％ＮａＣｌ）が給餌されたダール食塩感受性ラットを使用した。１週間のＨＳの後、生理食塩水、２５ｍｇ／ｋｇのａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａ、または２５ｍｇ／ｋｇのスクランブルコントロールオリゴを２週間ごとにラットに皮下投与した。３〜４週間のＨＳ食の後、生理食塩水およびコントロールの治療動物は、不動および不快感および死の目視可能な徴候を示し、一方、ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａの皮下送達は、これらの症状を有意に緩和していることが可能であった（図１６）。健康の指標として、本発明者らは、試験期間中、体重をモニターした。生理食塩水またはコントロールオリゴのいずれかが注入されたＨＳ食のダールラットは、ＬＳ食コントロールと比較して、体重増加の有意な低減を呈した。しかしながら、ＨＳ／ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａ治療ラットは、同程度の体重増加を示した（図１６Ｂ）。ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａ治療動物が８％ＨＳ食のより少ない摂取により体重を維持していた可能性を除外するために、食物摂取をモニターしたが、すべてのＨＳ摂食群間で同程度の摂取を示した（図示せず）。

ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａに応答して観測される保護作用についてさらなる知見を得るために、９週間の４．０％ＮａＣｌ食を用いて、後続試験を行い、その間、ラットは、生理食塩水、５もしくは２５ｍｇ／ｋｇのａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａ、または２５ｍｇ／ｋｇのａｎｔｉｍｉＲコントロールのいずれかを２週間ごとに摂取した。体重分析から、ＨＳ食のダールラットは、ＬＳ食コントロールと比較して、体重増加の有意な低減を呈し、一方、ＨＳ／ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａ治療ラットは、体重増加の増大を維持することが示唆された（図１７Ａ）。ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａ治療ダールラットの心エコー検査を用いた機能評価から、拡張機能の測定で有意な用量依存性改良が示された。ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａ治療ラットは、ＨＳ食８週間後、ＨＳ／生理食塩水コントロールと比較して、等容弛綬時間（ＩＶＲＴ）の有意な減少を呈し、さらにはＨＳ／生理食塩水コントロールと比較して、僧帽弁早期対能動期充満速度比（mitral valve early to active filling velocity ratio）（ＭＶ Ｅ／Ａ）の標準化を呈した（図１７Ｂ）。心筋細胞サイズの定量化から、ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａによる治療後、心筋細胞肥大の有意な減少が示された（図１８Ａ、Ｂ）。加えて、ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａ治療は、ピクロシリウスレッド染色の定量化により評価したとき、ＨＳ食により誘導された細動脈周囲線維症を低減した（図１８Ａ、Ｂ）。

ｍｉＲ−２０８ａ阻害は心不全時のミオシンスイッチを逆にする
分子変化および細胞変化を伴うａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａ治療後に観測される生理学的変化を比較するために、本発明者らは、ＨＳ治療後、ｍｙｏｍｉＲ発現を調べた。ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａは、最終注入２週間後に左室および右室の両方でｍｉＲ−２０８ａの用量依存性阻害を引き起こしたが、コントロールオリゴは、生理食塩水と比較して差を示さなかった（図１９Ａ、左のパネル）。ｍｉＲ−４９９はまた、ｍｉＲ−２０８ａの持続的阻害後に発現の用量依存性低減を示した（図１９Ａ、中間のパネル）。ｍｉＲ−２０８ｂは、ＨＳ／生理食塩水およびＨＳ／コントロール治療動物の両方で誘導されたが、ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａ治療は、ｍｉＲ−２０８ｂレベルの用量依存性低減をもたらした（図１９Ａ、右のパネル）。ノーザンブロット分析から、ｍｉＲ−４９９およびｍｉＲ−２０８ｂのこの制御が確認された（図１９Ｂ）。

宿主遺伝子の制御を評価するために、本発明者らは、Ｍｙｈ６、Ｍｙｈ７、およびＭｙｈ７ｂのｍＲＮＡレベルを調べた。Ｍｙｈ７は、ＨＳ／生理食塩水群およびＨＳ／コントロール群の両方でＨＳに応答して有意に増大された。この増大は、ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａに応答して用量依存的に減弱された。加えて、ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａ治療は、ＨＳ／生理食塩水群およびＨＳ／コントロール群の両方で観測されたＭｙｈ６ ｍＲＮＡの発現の減少を標準化した（図２０Ａ）。Ｍｙｈ７ｂの発現は、ｍｉＲ−４９９レベルを反映し、ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａ治療による用量依存性低減を呈する。さらに、Ｍｙｈ７の用量依存性制御は、ウェスタンブロット（図２０Ｂ）により確認された。

ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａは、心臓コンダクタンスまたは毒性徴候の変化を誘導しない
ｍｉＲ−２０８ａの遺伝子欠失は、生存能に影響を及ぼしたり、全形態的心臓欠陥を引き起こしたりすることはなく、既報では、ｍｉＲ−２０８ａは、適正な心臓電気生理学に必要とされると言及された。本発明者らは、ｍｉＲ−２０８ノックアウト動物でなんら明白な異常を観測しなかったが、ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａ治療が、心臓コンダクタンス効果をもたらすか確証するためには、本発明者らは、野生型マウスおよび疾患ラットの両方でＥＣＧを測定した。ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａ治療の後、両方の種が、長期間にわたりに適正な心臓電気生理を示した（図示せず）。

投与経路に関係なく、すべてのマウスおよびラットは、ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａまたはコントロールオリゴに良好に耐えて、試験全体を通じて、活性レベルおよびグルーミングにより決定したとき、正常挙動を呈した。生理食塩水と比較して、ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａまたはコントロールオリゴは、投与６週間後まで、心臓、腎臓、肝臓、肺、または脾臓を含めて、体重またはさらなる組織重量中のベースライン変化を誘導しなかった（図示せず）。ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａ治療もコントロールオリゴ治療も、ラットにおいてアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）肝酵素の血清中レベルを変化させなかったことから（図示せず）、本オリゴヌクレオチドがなんら明白な肝臓毒性を誘導しないことが示唆される。

ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａは特定の遺伝子発現変化を誘導する
遺伝子発現変化に及ぼすｍｉＲ−２０８ａ阻害の影響を確認するために、本発明者らは、生理食塩水、ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａ、またはコントロールオリゴのいずれかが注入されたＨＳ食のダールラットでマイクロアレイ分析を行った。コントロールオリゴ治療動物と比較して、ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａ治療動物は、１３１の遺伝子の有意な変化を示した。１５の遺伝子だけ（６７％の偽陽性発見率）は、生理食塩水およびコントロールオリゴが注入された動物間で有意差があったことから、本オリゴヌクレオチド化学物質自体による遺伝子発現に及ぼす影響の欠如が示唆される。ヒートマップで視覚的に実証されるように、コントロールオリゴおよびａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａで治療された心臓間で有意に変化した１３１の遺伝子の発現の階層的クラスタリングは、ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａ治療後にアップレギュレートおよびダウンレギュレートされた遺伝子のロバストなクラスタリングを示し、コントロールオリゴ治療後に遺伝子発現応答が存在しないことが確証された（図示せず）。遺伝子アレイ分析から、コントロールオリゴと比較して、ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａに応答してＭｙｈ７およびＭｙｈ７ｂの有意なダウンレギュレーションが確認され（それぞれ、−１．３１、ｐ＝０．００５、および−２．３８、ｐ＝０．０３７ ）、一方、これまでに特性解析された標的Ｔｈｒａｐ１は増大された（１．５６およびｐ＝０．４９）。アレイ上で検出された１３５１８の遺伝子のうち、２８９の遺伝子は、ｍｉＲ−２０８標的であると生物情報学的に予測された。これらの予測された標的のうち、２８の遺伝子は、マイクロアレイにより、ａｎｔｉｍｉＲ−２０８治療で発現増大を示し、そのいくつかは、リアルタイムＰＣＲにより確認された（図示せず）。８週間にわたり生理食塩水、ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａ、またはコントロールオリゴで治療されたダール高血圧ラットの心臓サンプルで遺伝子発現解析を行ったので、本発明者らは、遺伝子発現変化の残りが、ｍｉＲ−２０８ａ阻害の直接的遺伝子制御効果の二次的なものであろうと推測する。

ラットゲノムに対するａｎｔｉｍｉＲ配列のＢＬＡＳＴ解析から、ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａの配列は、４つのコード配列に近い相同性（少なくとも１４塩基の相補性）を示すことが示されたが、これらの遺伝子はいずれも、マイクロアレイ分析により決定したとき、制御されなかった。全体として、これらの分析から、ＬＮＡ修飾オリゴは、化学物質クラスにより誘導される遺伝子発現変化を伴うことなく、ｍｉＲ−２０８ａをきわめて特異的に標的とすることが示唆される。

ｍｉＲ−４９９は、ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａの有効性に関する血漿中バイオマーカーである
種々の疾患状況時の血漿中ｍｉＲＮＡの検出は、診断の大きな将来性を示している。ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａの有効性と相関する特異的ｍｉＲＮＡが存在することを確認するために、本発明者らは、ＨＳ治療時、一群の筋肉関連ｍｉＲＮＡを調べた。ｍｉＲ−１および−１３３などの試験されたいくつかの筋肉特異的ｍｉＲＮＡは、試験群間で有意差を示さなかった（図示せず）。注目すべき点として、ｍｉＲ−４９９は、高食塩下で血漿中検出の中程度の増加を示すにすぎなかったが、ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａ治療動物で有意に低減されたことから、ｍｉＲ−４９９は、ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａの有効性の血漿ベースのマーカーとして作用可能であることが示唆される。加えて、これまでに血漿中レベルがヒト心不全に相関付けられたｍｉＲ−４２３−５ｐは（２４）、ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａで治療された動物において低減されることが判明した。

考察
本明細書に提示されたデータから、ｍｉＲ−２０８の治療的阻害は、心臓リモデリングの大幅な低減をもたらすことが示唆され、これは、心疾患時の生存率および心臓機能の有意な改善と一致する。

アンチセンスオリゴヌクレオチドは、in vivoでｍｉＲＮＡを効果的にサイレンシングするために使用することができる（１９〜２３）。これらのａｎｔｉｍｉＲは、in vivo安定性、目標のｍｉＲＮＡに対する特異性および高い結合親和性を確保するために化学修飾である。ＬＮＡは、オリゴヌクレオチドとの熱力学的に強い二本鎖形成を引き起こすと同時に、相補的ＲＮＡまたはＤＮＡオリゴヌクレオチドに対する特異性を向上させる核酸修飾である（１９〜２０）。高い結合親和性の結果として、ＬＮＡ修飾ａｎｔｉｍｉＲの生物学的活性は、より短いオリゴヌクレオチド（８〜１６塩基）を用いて到達される（２５）。近年、齧歯動物および非ヒト霊長動物で治療的適用可能性が報告され、非接合ＬＮＡａｎｔｉｍｉＲの全身送達は、肝臓発現ｍｉＲ−１２２を強力にアンタゴナイズし、慢性感染チンパンジー（２３）においてＣ型肝炎ウィルス起因性肝臓病変の改善をもたらした。

本試験の主要な知見は、ＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドの全身送達が、心臓でｍｉＲ−２０８の強力かつ持続的なサイレンシングを誘導するのに有効であることである。ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａの全身送達後の持続的なｍｉＲ−２０８ａ阻害および近縁ｍｉＲ−２０８ｂに及ぼす影響の不在から、in vivo安定性および特異性が示唆される。持続的なｍｉＲ−２０８ａサイレンシングおよび経時的な下流のＭｙｈ７制御に基づいて、ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａは、心臓細胞に蓄積して、Ｍｙｈ６転写により産生されるｍｉＲ−２０８ａの新たに形成されたすべてのコピーをサイレンシングできる可能性があると思われる。この効果は、心筋細胞の代謝回転の全般的欠如によりさらに裏付けられ、ａｎｔｉｍｉＲにより標的とされた細胞の一部での低減による希釈を予防する。

直接標的に及ぼすｍｉＲＮＡの遺伝子制御の影響は、かなり即時的であるが、ｍｉＲ−２０８ａ阻害は、Ｍｙｈ７ｂおよびＭｙｈ７発現に及ぼす影響を確認するまでに、数週間を必要とする。本発明者らの仮説によれば、下流の生物学的作用の遅延は、多くの直接的および間接的な標的遺伝子の発現の変化が必要であることに起因し、その変化を誘導するために効果の組合せが必要とされる。ｍｉＲ−１２２阻害に応答して同等の現象が観測された。これは、血漿中コレステロールの低下を誘導するが、ａｎｔｉｍｉＲ治療の数週間後に初めて起こり、一方、遺伝子発現変化は、即時的である（１９〜２０）。それにもかかわらず、Ｍｙｈ７ｂおよびＭｙｈ７発現に及ぼす影響は、ｍｉＲ−２０８遺伝子欠失で観測される影響を表現型模写することから（１２）、ｍｉＲ−２０８ａが効果的にサイレンシングされることが示唆される。

ダール高血圧ラットにおけるａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａの治療効果は、皮下送達がin vivoでａｎｔｉｍｉＲを心臓に効果的に送達するのに十分であり、かつｍｉＲ−２０８ａ阻害が心疾患時の心臓リモデリング、機能悪化、および致死率を予防するという強力な証拠を提供する。これら効果がｍｉＲ−２０８ａ阻害に基づいて心筋細胞に及ぼす効果のみから生じるのか、または現在知られていないｍｉＲ−２０８ａ阻害に応答する心外性効果が存在するのかは、依然として不明のままであるが、用量応答性およびコントロール化学物質で治療された動物での効果の不在から、観測された効果が、ｍｉＲ−２０８ａレベルの低下に基づくものであることが強く示唆される。進行中の実験から、この治療効果が、心不全の複数のモデルで確証可能であるか、ならびにｍｉＲ−２０８ａおよびｍｉＲ−４９９に対する併行的なａｎｔｉｍｉＲの組合せ投与が、観測された効果をより迅速に解明するかが示唆されるであろう。初期の齧歯動物データは、非常に希望のもてるものと思われ、有害な副作用は、ａｎｔｉｍｉＲ治療で観測されなかったが、種々の状況でそのような作用剤の長期安全性を調べるために、広範な分析が必要とされるであろう。

近年、ｍｉＲＮＡは、ヒトおよび動物の血清および血漿で検出され、心疾患を含めて種々の疾患の診断バイオマーカーとしてｍｉＲＮＡを用いる可能性が開かれている（２４，２６〜２８）。血漿中ｍｉＲＮＡ分析から、いくつかの他のｍｉＲＮＡ変化に加えて、ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａ治療は、血清中ｍｉＲ−４９９の検出低減をもたらし、それと併行して、ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａ治療に応答してＭｙｈ７ｂ／ｍｉＲ−４９９の心臓発現の低減が起こることが示される。心臓中および血漿中のｍｉＲ−４９９レベルとａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａの有効性との間の相関を仮定すれば、これらのデータから、血漿中ｍｉＲ−４９９レベルは、患者に移行したとき、心臓へのａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａの効果的な送達のバイオマーカーとして作用され得る。

ミオシンおよび後続のｍｙｏｍｉＲの発現は、種間で有意に異なる。より小さい齧歯動物の心臓では、Ｍｙｈ６／ｍｉＲ−２０８ａが主なミオシン／ｍｙｏｍｉＲアイソフォームであるが、より大きい哺乳動物は、より多くのＭｙｈ７／ｍｉＲ２０８ｂを発現する（１７）。ｍｉＲ−２０８ａおよび２０８ｂはオーバーラップシード配列を有するが、それらは、それらの３’領域の３つの塩基が異なる。より大きい種で同等の治療効果を確証するためにｍｉＲ−２０８ａ、ｍｉＲ−２０８ｂ、または両方のｍｉＲ−２０８アイソフォームの阻害が必要とされるかを確証するために、より大きい哺乳動物での後続の薬動学的試験および有効性試験が必要とされるであろう。加えて、ｍｉＲ−２０８阻害の治療的使用は、おそらく、心不全患者において現行の標準のケアとの組合せ治療になるであろうから、これらの現行の治療と組み合わせたとき、ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａが、これらの薬剤の有益な効果を高めるか評価することが重要であろう。

まとめると、この試験から、ＬＮＡベースのａｎｔｉｍｉＲの皮下送達は、心臓を効果的に標的とすることができ、心疾患時の標的としてｍｉＲ−２０８をさらに確証することが実証される。

方法
動物処置。すべての動物プロトコルは、Institutional Animal Care and Use Committee of miRagen Therapeutics, Inc.により承認された。

動物およびＬＮＡ修飾ａｎｔｉｍｉＲの送達。ＬＮＡ−ａｎｔｉｍｉＲオリゴヌクレオチドは、成熟ｍｉＲ−２０８ａ配列の５’領域に完全に相補的な非接合および完全にホスホロチオレート化されたオリゴヌクレオチドとしてmiRagen Therapeutics, Inc.で合成した。ＬＮＡコントロールオリゴヌクレオチドは、Ｃ．エレガンス（C. elegans）特異的ｍｉＲＮＡに対する配列からなるものであった。別段の指定がないかぎり、オリゴヌクレオチド化学物質のin vivo送達は、成体雄Ｃ５６Ｂ１６マウスまたは成体雄ダール食塩感受性ラット（Harlan, Indianapolis）のいずれかに、尾静脈を介して低圧静脈内（ｉ．ｖ．）注入により達成した。すべての化学物質を同等の最終体積の生理食塩水に溶解させて注入し、その後、化学物質の明確な副作用に関して動物を調べた。指定の時点で組織サンプルを採取し、分子的または組織学的検査に供した。８週齢でダールラットを０．２５ＮａＣｌで維持し、または４％もしくは８％ＮａＣｌ食で配置した（Harlan, Indianapolis）。

定量的リアルタイムＰＣＲ分析。in vivoリアルタイムＰＣＲ分析のために、Trizol（Invitrogen）を用いて心臓組織からＲＮＡを取り出し、その後、各組織サンプルからの２μｇのＲＮＡを用いて、製造業者の仕様（Invitrogen）に従ってSuper Script II逆転写酵素によりｃＤＮＡを産生した。ｍｉＲ−２０８のレベルを検出するために、１０〜１００ｎｇの全ＲＮＡを用いて、製造業者の推奨基準に従ってTaqman ｍｉｃｒｏＲＮＡアッセイ（Applied Biosystems, ABI）によりＲＴ−ＰＣＲを行った。ABIから購入したTaqmanプローブを用いて定量的リアルタイムＰＣＲにより遺伝子の一部の発現を分析した。

ノーザンブロット分析。Trizol試薬（Gibco/BRL）を用いて心臓組織サンプルから全ＲＮＡを単離した。上述のように、ｍｉｃｒｏＲＮＡを検出するノーザンブロットを行った。Ｕ６プローブは、ローディングコントロールとして機能した（IDT）。心筋細胞または心臓組織からの１０μｇの全ＲＮＡを２０％アクリルアミド変性ゲル上に充填し、電気泳動によりZeta-probe GTゲノムブロット膜（Ｂio-Rad）に移した。転写後、ブロットを架橋して、８０℃で１時間焼成した。ｍｉＲＮＡ検出感度を最大化するために、Starfire Oligos Kit（IDT, Coralville, IA）およびα-32P dATP（AmershamまたはPerkin Elmer）を用いて、オリゴヌクレオチドプローブを標識した。Rapid-hyb緩衝液(Amersham）中３９℃でプローブを膜に一晩ハイブリダイズさせ、その後、０．１％ＳＤＳを含む０．５×ＳＳＣを用いて３９℃で１０分間２回洗浄した。ブロットを露出させて、PhosphorImager分析（GE HealthCare Life Sciences）により定量化し、Ｕ６プローブをローディングコントロールとして機能させた（ABI）。phosphorimagerおよびImageQuant（Bio-Rad）を用いて、放射性シグナルの強度により発現の変化倍率を定量化した。

ウェスタンブロット分析。ウェスタンブロット分析のために、記載のように、ミオシンを心臓細胞または組織から取り出した（２９）。４〜１５％グラジエントゲル上に０．１μｇのタンパク質溶解物を充填することによりＭＨＣアイソフォームを検出し、ＳＤＳ ＰＡＧＥにより分離し、Ｍｙｈ７にきわめて特異的なマウスモノクローナル抗ミオシン（遅筋型、骨格Ｍ８４２１）（Sigma, MO）を用いてウェスタンブロッティングを行った。

生体内分布アッセイ。血漿および組織のサンプル中のａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａの定量化のために、サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイを使用した。２’ＯｍｅおよびＬＮＡ修飾ヌクレオチドを用いて、ハイブリダイゼーションアッセイ用プローブを合成した。それらは、ｂＴＥＧ−ｍＵ；ｌＡ；ｍＡ；ｌＧ；ｍＡ；ｌＣ；ｍＧ（捕獲プローブ）およびｍＡ；ｌＧ；ｍＣ；ｌＡ；ｍＡ；ｌＡ；ｍＡ；ｌＡ；ｍＧ−６ＦＡＭ（検出プローブ）である。抗蛍光-POD Ｆａｂフラグメント（Roche）、およびＴＭＢペルオキシダーゼ基質（KPL）を用いて、検出を達成した。４パラメーター（４−ＰＬ）の非線形ロジスティック回帰分析を用いて、標準曲線を作成した。アッセイの動作濃度範囲は、２〜５３６ｎｇ／ｍｌであった。６．０の速度設定でMP FastPre-24を用いて、３Ｍ ＧＩＴＣ緩衝液（３Ｍグアニジンイソチオシアネート、０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）中で２×３０秒間ホモジナイズすることにより、１００ｍｇ／ｍｌで組織サンプルを調製した。試験のために血漿サンプルおよび組織ホモジネートを１Ｍ ＧＩＴＣ緩衝液（１Ｍグアニジンイソチオシアネート、０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）中に最小で５０倍希釈した。

心エコー検査。３０ＭＨｚトランスデューサーを有するVisual Sonic Ultrasoundシステムを用いて鎮静ラット（２〜２．５％イソフルラン）で二次元経胸壁心エコー検査により心臓機能を評価した。心臓を乳頭筋レベルで傍胸骨短軸図で画像化し、Ｍモード測定値を記録し、心拍数、壁厚さ、ならびに拡張末期および収縮末期の寸法を決定する。内径短縮率（拡張末期寸法−拡張末期寸法に標準化された収縮末期寸法として定義される）を心収縮機能の指標として使用した。心尖部四室像から経僧帽弁フロードップラーを用いて、Ｅ／Ａ比、等容弛綬時間、およびＥ波速度の減速時間を測定することにより、拡張機能を評価した。

表面ＥＣＧ測定。２００ｍＬ／分 Ｏ_２中２％イソフルランを用いてマウスを麻酔し、ノーズコーンを介して５００ｍＬ／分吸気中２％イソフルランを用いてラットを麻酔した。Homeothermic Warming System（Kent Scientific）またはヒートランプおよび加温プラットフォーム（Visual Sonics）を介してマウスおよびラットの体温を３７〜３８℃に維持した。皮下針電極およびIworxデータ取得システムを用いて１ｋＨｚでサンプリングして、第ＩＩ誘導心電図を１０分間記録した。Labscribeソフトウェア（Iworx）を用いて、２、４、６、８、および１０分後にトレースを解析し、正常洞調律に関して検査し、コンピューター化技術を用いて、各時点で約４０鼓動を解析し、信号間隔（ＨＲ、ＰＲ、ＱＲＳ、ＱＴ、およびＱＴｃ）を定量化した。

組織診断。組織診断に使用する組織をクレブス・ヘンゼライト溶液中でインキュベートし、４％パラホルムアルデヒド中で固定し、切片にし、標準的技術（３０）によりヘマトキシリン＋エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色およびピクロシリウスレッド染色のために処理し、またはｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのために処理した。動物１匹あたり約１００個の心筋細胞の断面画像をＨ＆Ｅ染色切片から取り込んだ。Image-Pro Plusソフトウェアを用いて心筋細胞断面積を測定し、各動物に対して平均値を決定した。各動物のピクロシリウスレッド染色切片から、心外膜領域、心筋中層領域、および心内膜領域の血管周囲線維症画像を取得した。Image-Pro plusソフトウェアを用いて血管周囲線維症を含む全血管壁領域を決定した。全血管壁領域から管腔領域を差し引いた。色領域分割により血管周囲線維症を決定し、全血管壁基準の％として報告した。

遺伝子発現解析。サービスプロバイダー（Expression Analysis, Durham, NC）により、Illumina RatRef-12 BeadChipアレイを用いて、マイクロアレイプロフィーリングを行った。上述のように、全ＲＮＡを心臓組織から単離した。PADE（Permutation Analysis of Differential Expression）を用いて、サービスプロバイダーにより、差次的遺伝子発現の分析を行った。遺伝子プローブが１２アレイすべてで検出ｐ値＜０．０５を有していない場合、その遺伝子を後続の分析から削除したことに留意されたい。差次的発現グラフは、サービスプロバイダーにより提供された。Cluster 3.0を用いて遺伝子クラスタリングを行い、ヒートマップ画像をJava（登録商標） TreeViewで作成した。www.pantherdb.orgに見られるオンラインのツールを用いて、遺伝子オントロジー解析を行った。targetscan.org（TargetScan）、pictar.mdc-berlin.de（Pictar）、およびmicroma.org（miRanda）を用いて、ラット中の予測ｍｉＲ−２０８遺伝子標的を見いだした。miRandaにより予測されたすべての遺伝子標的のうち、＜−０．１のmirsvrスコアを有するものを解析に組み入れた。ｍｉＲ−２０８標的を同定するために、差次的発現のために≦０．０５のｐ値カットオフを使用した。

血漿からの定量的リアルタイムＰＣＲ分析。製造業者のプロトコルにより、Trizol LS Reagent（Invitrogen）を用いて、血漿サンプルからのＲＮＡを単離した。ＲＮＡ単離前、２５０ｐｍｏｌの２つの異なる合成Ｃ．エレガンス（C. elegans）ｍｉＲＮＡ配列を添加して、標的ｍｉＲＮＡの標準化内部コントロールとして機能させた。使用したＣ．エレガンス（C. elegans）配列は、ｃｅｌ−ｍｉＲ−２（ＵＡＵＣＡＣＡＧＣＣＡＧＣＵＵＵＧＡＵＧＵＧＣ（配列番号９２））およびｃｅｌ−ｌｉｎ−４（ＵＣＣＣＵＧＡＧＡＣＣＵＣＡＡＧＵＧＵＧＡ（配列番号９３））（Dharmacon）であった。上述のように、初期血漿体積に等しい最終体積で最終ＲＮＡペレットを再懸濁させ、５μｌを後続のＲＴ−ＰＣＲ反応に使用した。

統計解析。一元配置ＡＮＯＶＡおよびニューマン・クールズ多重比較事後検定を用いて有意性を決定した。Ｐ＜０．０５は、統計的に有意とみなした。

実施例４：非ヒト霊長動物における阻害剤投与
ａｎｔｉｍｉｒ１０１０１および１０７０７を２５ｍｇ／ｋｇの用量で伏在静脈によりアフリカミドリザル（約３ｋｇ）に３回投与した。４週間後に組織を採取し、阻害剤に関してアッセイした。結果を図２２に示す。右のパネルは、薬剤血漿クリアランスを示している。左のパネルは、組織中および血漿中の分布を示している（暗色棒、Ｍ−１０１０１、明色棒、Ｍ−１０７０７）。

図２３は、ｍｉＲＮＡ標的阻害を示している。左のパネルは、左室でのｍｉＲ−２０８ａ発現の変化を示している（左から右へ：未治療、Ｍ−１０１０１、１０７０７、１０５９１）。右のパネルは、左室でのｍｉＲ−２０８ｂの変化を示している（左から右へ：未治療、Ｍ−１０１０１、Ｍ−１０７０７、Ｍ−１０５９１）。Ｍ−１０１０１とＭ−１０７０７との差はわずか２ヌクレオチドにすぎないが、ａｎｔｉｍｉＲは、それらの標的ｍｉＲ（それぞれｍｉＲ−２０８ａおよびｍｉＲ−２０８ｂ）に特異的である。

図２４は、治療後のＭｉｒ−４９９レベルを示している。レベルは、左室（ＬＶ）、右室（ＲＶ）、および中隔に対して示されている。棒は、左から右へ、未治療、Ｍ−１０１０１、Ｍ−１０７０７、およびＭ−１０５９１である。

実施例５：ａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａ治療の分子的分析
７つのａｎｔｉｍｉＲ−２０８ａ化学物質。ここで選択されたものは、in vivoで有効性を示したものであり、それぞれ、９つのＬＮＡおよび７つのＤＮＡヌクレオチドを有する。化合物を２５ｍｇ／ｋｇ ｓ．ｃ．でマウスに投与し、４日目に摘出した。ｍｉＲおよび標的の発現を測定した。化合物は、Ｍ−１０１０１、Ｍ−１０６８０、Ｍ−１０６８１、Ｍ−１０６８２、Ｍ−１０６８３、Ｍ−１０６７３、およびＭ−１１１８４であった（表１参照）。

肝臓および腎臓の毒性マーカーは、生理食塩水から有意な増大を示さなかった（データは示されていない）。

化合物は、さまざまなレベルの標的脱抑制を示す。Ｍ−１０１０１およびＭ−１０６８３は、特に有効であった。図２５は、ｍｉＲ−２０８ａおよびＤｙｎｌｔ１の発現を示している。図２６は、Ｄｙｎｌｔ１、Ｖｃｐｉｐ、およびＴｍｂｉｍ６の発現を示している。図２７は、Ｔｈｒａｐ１およびｓｐ３の発現を示している。図２８は、Ｐｕｒｂ、Ｇａｔａ４、およびＳｏｘ６の発現を示している。

図２９に示されるように、ａｎｔｉｍｉｒ−２０８ａ治療は、無ストレス齧歯動物（ＳＤラット）において血漿中ｍｉＲ−１９ｂレベルを増大させる。

ダール食塩感受性ラットモデルを用いて示されるように、標的脱抑制度は、ストレス度に依存する。図３０は、４％食塩および６％食塩でのＤｙｎｌｔ１発現の結果を示している。Ｄｙｎｌｔ１は、６％でよりロバストな脱抑制を示す。図３１は、標的Ｖｃｐｉｐ１の結果を示している。図３２は、標的Ｔｍｂｉｍ６の結果を示している。

図３３〜３９は、心臓の異なる領域でのｍｉＲ阻害度を示しており、より多くのストレスを受けた領域がより大きい影響を示すことを示している。図３３は、ｍｉＲ−２０８ａ、ｍｉＲ−２０８ｂ、およびｍｉＲ−４９９の阻害を示している。図３４は、ミオシンマーカーの脱抑制を示している。図３５は、特定の心臓ストレスマーカーの発現度を示している。図３６は、Ｄｙｎｌｔ１、Ｖｃｐｉｐ、Ｔｍｂｉｍ６、およびＣｂｘｌの脱抑制を示している。図３７は、Ｔｈｒａｐ１、Ｓｏｘ６、ｓｐ３、およびｐｕｒ−ｂｅｔａの発現を示している。図３８に示されるように、閉塞（infarted）領域は、Ｄｙｎｌｔ１の最大の脱抑制を示した。図３９は、Ｍ−１０１０１による心臓の異なる領域での標的の脱抑制を示している。

Claims (47)

1. ヒトｍｉＲ−２０８ａまたはヒトｍｉＲ−２０８ｂのヌクレオチド配列に実質的に相補的であるヌクレオチド配列を含み、かつロックドヌクレオチドと非ロックドヌクレオチドとの混合物を有する、オリゴヌクレオチドであって、
   前記オリゴヌクレオチドの長さならびにロックドヌクレオチドの数および位置は、前記オリゴヌクレオチドが、in vitroルシフェラーゼアッセイにおいて約５０ｎＭ以下のオリゴヌクレオチド濃度で、または、マウスモデルにおいて２５ｍｇ／ｋｇ以下の用量で、ｍｉＲ−２０８ａ、ｍｉＲ−２０８ｂ、および／またはｍｉＲ−４９９の活性を低減するようなものである、オリゴヌクレオチド。
2. 少なくとも７つのヌクレオチドがロックドヌクレオチドであり、かつ少なくとも１つのヌクレオチドが非ロックドヌクレオチドである、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
3. 前記オリゴヌクレオチドが約８〜約１８ヌクレオチド長である、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
4. 前記オリゴヌクレオチドが約１６ヌクレオチド長である、請求項３に記載のオリゴヌクレオチド。
5. 前記ヌクレオチド配列がｍｉＲ−２０８ａまたはｍｉＲ−２０８ｂのヌクレオチド配列に完全に相補的である、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
6. 配列番号１または配列番号２のヌクレオチド配列を含む、請求項５に記載のオリゴヌクレオチド。
7. 配列番号３または配列番号４のヌクレオチド配列を有する、請求項５に記載のオリゴヌクレオチド。
8. 前記オリゴヌクレオチドが、３超の隣接する非ロックドヌクレオチドを有する一続きのヌクレオチドを含んでいない、請求項１〜７のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
9. 前記オリゴヌクレオチドが、２超の隣接する非ロックドヌクレオチドを有する一続きのヌクレオチドを含んでいない、請求項８に記載のオリゴヌクレオチド。
10. 前記オリゴヌクレオチドが、隣接する非ロックドヌクレオチドの１つの出現を有する、請求項８または９に記載のオリゴヌクレオチド。
11. 前記ｍｉＲ−２０８ａまたは前記ｍｉＲ−２０８ｂのシード領域に相補的な領域が、少なくとも４つのロックドヌクレオチドを含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
12. 少なくとも９つのロックドヌクレオチドを含む、請求項７に記載のオリゴヌクレオチド。
13. 少なくとも１１のロックドヌクレオチドを含む、請求項１２に記載のオリゴヌクレオチド。
14. 少なくとも３つの非ロックドヌクレオチドを含む、請求項７に記載のオリゴヌクレオチド。
15. ９つのロックドヌクレオチドと７つの非ロックドヌクレオチドとを含む、請求項１４に記載のオリゴヌクレオチド。
16. １１のロックドヌクレオチドと５つの非ロックドヌクレオチドとを含む、請求項１４に記載のオリゴヌクレオチド。
17. 少なくとも位置１、６、１０、１３、および１５がロックドヌクレオチドである、請求項７に記載のオリゴヌクレオチド。
18. 位置１、５、６、８、１０、１１、１３、１５、および１６がロックドヌクレオチドであり、かつ残りの位置が非ロックドヌクレオチドである、請求項７に記載のオリゴヌクレオチド。
19. 位置１、３、４、５、６、８、１０、１３、１５、および１６がロックドヌクレオチドであり、かつ残りの位置が非ロックドヌクレオチドである、請求項７に記載のオリゴヌクレオチド。
20. 位置１、４、５、７、９、１０、１２、１４、および１６がロックドヌクレオチドであり、かつ残りの位置が非ロックドヌクレオチドである、請求項７に記載のオリゴヌクレオチド。
21. ロックド配置でないヌクレオチドが２’デオキシである、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
22. 少なくとも１つの非ロックドヌクレオチドが２’Ｏ−アルキルまたは２’ハロである、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
23. 前記ロックドヌクレオチドが２’−４’メチレン架橋を有する、請求項１〜２２のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
24. ５’および／または３’キャップ構造を有する、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
25. １つまたは複数のホスホロチオエートリンケージを含む、請求項１〜２４のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
26. 前記オリゴヌクレオチドが、完全に、ホスホロチオエートリンケージされる、請求項２５に記載のオリゴヌクレオチド。
27. １〜３つのホスフェートリンケージを有する、請求項２５に記載のオリゴヌクレオチド。
28. 化合物１０１０１、１０６７３、１０６７４、１０６７７、１０６７９、１０６８３、１０７０７、または１０６８０の構造を有する、請求項７に記載のオリゴヌクレオチド。
29. ペンダント親油性基をさらに含む、請求項１〜２８のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
30. 有効量の、請求項１〜２９のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドまたはその薬学的に許容可能な塩と、薬学的に許容可能な担体または希釈剤と、を含む医薬組成物。
31. 前記薬学的に許容可能な担体が、コロイド分散系、高分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、またはリポソームを含む、請求項３０に記載の医薬組成物。
32. 前記薬学的に許容可能な担体または希釈剤が、生理食塩水から本質的になる、請求項３０に記載の医薬組成物。
33. 細胞を、請求項１〜２９のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドもしくは請求項３０〜３２のいずれか１項に記載の組成物に接触させることを含む、細胞においてｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂの活性を低減または阻害する方法。
34. 前記細胞においてｍｉＲ−４９９の活性も低減または阻害される、請求項３３に記載の方法。
35. 前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項３３または３４に記載の方法。
36. 前記細胞が心臓細胞である、請求項３５に記載の方法。
37. 前記細胞がin vivoまたはex vivoにある、請求項３３に記載の方法。
38. 請求項３０または３２に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、ｍｉＲ−２０８ａ、ｍｉＲ−２０８（ｂ）、および／またはｍｉＲ−４９９に関連するかまたはそれにより介される対象の病状を予防または治療する方法。
39. 前記病状が心臓病状である、請求項３８に記載の方法。
40. 前記心臓病状が、病的心肥大、心筋梗塞、または心不全である、請求項３８に記載の方法。
41. 前記医薬組成物が、非経口投与によりまたは心臓組織中への直接注入により投与される、請求項３８〜４０のいずれか１項に記載の方法。
42. 前記非経口投与が、静脈内、皮下、腹腔内、または筋内である、請求項４１に記載の方法。
43. 前記組成物が、経口投与、経皮投与、持続放出投与、制御放出投与、遅延放出投与、坐剤投与、カテーテル投与、または舌下投与により投与される、請求項３８〜４２のいずれか１項に記載の方法。
44. 前記対象がヒトである、請求項３８〜４３のいずれか１項に記載の方法。
45. 前記オリゴヌクレオチドが１０ｍｇ／ｋｇ以下の用量で送達される、請求項３８〜４４のいずれか１項に記載の方法。
46. 前記オリゴヌクレオチドが生理食塩水中に製剤化されて皮下投与される、請求項４５に記載の方法。
47. 前記オリゴヌクレオチドが、Ｍ−１０１０１、Ｍ−１０６７３、Ｍ−１０６７４、Ｍ−１０６７７、Ｍ−１０６７９、Ｍ−１０６８３、Ｍ−１０７０７、およびＭ−１０６８０で表される化合物から選択される、請求項４６に記載の方法。

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