BRPI0608829A2

BRPI0608829A2 - método para a expressão transgênica com especificidade intensificada em uma planta, uso de um construto de ácido nucleico quimérico, seqüência de ribonucleotìdeo quimérica, construto de expressão, vetor de expressão, organismo não-humano ou célula transformada, semente transformada, e, preparação farmacêutica

Info

Publication number: BRPI0608829A2
Application number: BRPI0608829-5A
Authority: BR
Inventors: Peifeng Ren; Hee-Sook Song; John Mcmillan
Original assignee: Basf Plant Science Gmbh
Priority date: 2005-04-19
Filing date: 2006-04-13
Publication date: 2011-03-15
Also published as: CA2604807C; EP1874936A1; US20090293148A1; CN101203611A; AU2006237317A1; AU2006237317B8; US20160152994A1; CN101203611B; CA2604807A1; US9085774B2; EP1874936B1; AU2006237317B2; WO2006111512A1; US10676752B2; ZA200709897B; IL186542A0

Abstract

METODO PARA A EXPRESSãO TRANSGêNICA COM ESPECIFICIDADE INTENSIFICADA EM UMA PLANTA, USO DE UM CONSTRUTO DE áCIDO NUCLEICO QUIMERICO, SEQUENCIA D RIBONUCLEOTìDEO QUIMERICA, CONSTRUTO DE EXPRESSãO, VETOR DE EXPRESSãO, ORGANISMO NãO-HUMANO OU CéLULA TRANSFORMADA, SEMENTE TRANSFORMADA, E, PREPARAçãO FARMACêUTICA A presente invenção está no campo da genética, especialmente da genética de plantas, e proporciona agentes capazes de controlarem a expressão de gene. A presente invenção especificamente proporciona sequências de microRNAs naturalmente ocorrentes, tecido-especificamente expressados. A invenção adicionalmente proporciona construtos de expressão transgênicos compreendendo seqUências codificadoras de citados microRNAs. Pela incorporação da seqUência codificadora de microRNA a expressão de citado construto de expressão é especificamente silenciada no tecido onde o microRNA naturalmente ocorrente é naturalmente expressado. Deste modo o perfil de expressão resultante do promotor é modulado e mutação de atividade subnormal é reduzida. A invenção adicionalmente proporciona um método para modular expressão transgênica pela incorporação de seqUências codificadoras de microRNAs em construtos de expressão transgênicos. As composições e os métodos da invenção podem ser usados para intensificar o desempenho de colheitas relevantes agrícolas e para terapia, profilaxia, pesquisa e diagnóstico em doenças e distúrbios, que afligem espécies de mamífero.

Description

"MÉTODO PARA A EXPRESSÃO TRANSGÊNICA COMESPECIFICIDADE INTENSIFICADA EM UM ORGANISMOEUCARIÓTICO, SEQÜÊNCIA DE RIBONUCLEOTÍDEO QUIMÉRICA,CONSTRUTO DE EXPRESSÃO, VETOR DE EXPRESSÃO,ORGANISMO NÃO-HUMANO OU CÉLULA TRANSFORMADA,SEMENTE TRANSFORMADA, E, PREPARAÇÃO FARMACÊUTICA"

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção está no campo da genética, especialmenteda genética de plantas, e proporciona agentes capazes de silenciarem genesespecíficos. A presente invenção especificamente proporciona moléculas deRNA policistrônico capazes de gerarem agentes de RNA de fita dupla(dsRNA), métodos para utilizar tais moléculas e células e organismo,especialmente plantas, contendo tais moléculas.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Muitos fatores afetam a expressão de gene em plantas e outrosorganismos eucarióticos. Recentemente, RNAs pequenos, de 21-26nucleotídeos, têm emergido como reguladores importantes de expressão degene eucariótico. Os RNAs regulatórios pequenos conhecidos caem dentro deduas classes básicas. Uma classe de RNAs pequenos é a de RNAsinterferentes curtos (siRNAs). Estes desempenham papéis essenciais nosilenciamento de RNA, um processo de degradação de RNA seqüência-específico que é disparado pelo RNA de fita dupla (dsRNA) (veja Vance eVaucheret (2001) Science 292:2277-2280, e Zamore (2001) Nat Struct Biol8:746-750 para revisões recentes sobre silenciamento de RNA em plantas eanimais, respectivamente). Silenciamento de RNA desempenha um papelnatural em defesa contra ácidos nucleicos estranhos incluindo resistência avírus em plantas e controle de transposons em numerosos organismos.siRNAs são de fita dupla com projeções 3' pequenas e derivam de dsRNAsmais longos que induzem silenciamento. Servem como guias para dirigir adestruição de RNAs alvo e têm estado implicados como iniciadores naamplificação de dsRNA via a atividade de uma RNA polimerase dependentede RNA celular. Em plantas, si-tipo RNAs também têm estado associadoscom silenciamento de gene transcricional (TGS) induzido por dsRNA, umprocesso no qual dsRNA com homologia às regiões de promotor disparametilação de DNA e inibe transcrição. Os RNAs pequenos associados comTGS, diferentemente de siRNAs verdadeiros, não estão envolvidos emdegradação de RNA.

Outro grupo de RNAs pequeno é conhecido como RNAstemporais curtos (stRNAs) e mais amplamente como micro-RNAs (miRNAs).miRNAs têm emergido como reguladores de expressão de gene baseados emRNA, evolutivamente conservados, em animais e plantas. miRNAs (aprox. 21a 25 nt) decorrem de precursores maiores com uma estrutura de haste-alça quesão transcritos dos genes não codificadores de proteína. miRNAs são de fitaúnica, e seu acúmulo é desenvolvimentalmente regulado e/ou regulado porestímulos ambientais. Derivam de RNAs precursores parcialmente de fitadupla que são transcritos de genes que não codificam proteína. Os miRNAsparecem ser transcritos como precursores de grampo de cabelo RNA, que sãoprofessados em suas formas maduras, de cerca de 21 nt por Dicer (Lee RD, eAmbros, V. Science 294: 862-864 (2001)). miRNA seleciona um mRNAespecífico para suprimir expressão de gene em nível pós-transcricional (i.e.degrada mRNA) ou em nível de tradução (i.e. inibe a síntese de proteína).microRNAs (miRNAs) têm emergido como evolutivamente conservados. Hávárias centenas de miRNAs que têm sido recentemente identificados por meiode análise computacional e abordagens experimentais de muitas espécies deplanta e de animal. Um corpo de miRNAs está bem conservado dentro doreino vegetal ou do reino animal, mas alguns são específicos para espécie ougênero.

Genes de miRNA são primeiro transcritos por Pol II RNApolimerase resultando em pri-miRNA com estrutura Cap na extremidade 5' epoli causa em extremidade 3'. Pri-miRNA é sujeito à clivagem por umaenzima semelhante à RNase III, Dicer, para gerar miRNA maduro. miRNA éentão recrutado em RISC (complexo silenciador induzido por RNA) eseleciona um mRNA específico em citoplasma e suprime expressão de geneem nível pós-transcricional (i.e. degrada mRNA). miRNA também podeinibir síntese de proteína após seleção de um mRNA em uma maneiraseqüência-específica. O mecanismo de tal inibição de tradução é para serdescoberto. Tem sido mostrado tanto em animal quanto em planta, quepareamento da região 5' de miRNA 5' em seu mRNA alvo é crucial para asações de miRNA (Mallory A et al., EMBO Journal 23:3356-3364, 2004;Doench J e Sharp P, Genes & Development 504-511, (2004)).

Assim, foi realizado que grampo de cabelo RNAsendogenamente codificados, pequenos poderiam estavelmente regular aexpressão de gene via elementos do maquinário de RNAi. Como stRNAs (ediferentemente de siRNAs envolvidos em silenciamento de RNA), a maioriade miRNAs é faltante de complementaridade completa com qualquer mRNAalvo putativo. Embora suas funções sejam, até agora, não conhecidas, éconsiderado como hipótese que regulam a expressão de gene durante odesenvolvimento, talvez em nível de desenvolvimento. Contudo, dados osvastos números destes RNAs regulatórios pequenos, é provável que sejamfuncionalmente mais diversos e regulem a expressão de gene em mais do queum nível. Em planta, os genes alvo de miRNA são, em sua maioria, fatores detranscrição que são requeridos para identidade de meristema, divisão celular,separação de órgão, e polaridade de órgão. Alguns miRNAs possuem padrãotemporal de expressão e/ou específico para tecido. McManus et al. (RNA8:842-850 (2002)) também estudaram miméticos de miRNA contendo 19nucleotídeos de duplex de RNA não interrompido, um comprimento de alçade 12 nucleotídeos e uma protuberância assimétrica composta de uma únicauridina em oposição à uridina dupla. miRNA sintético pode ser quertransfectado em células quer expressado na célula sob o controle de umpromotor de RNA polimerase III e causa a expressão diminuída de umaseqüência de nucleotídeos alvo específica (McManus et al. (2002) RNA8:842-850, aqui incorporado como referência).

Em planta, têm havido evidências crescentes de quemicroRNAs selecionam genes envolvidos em muitos aspectos de crescimentoe desenvolvimento de planta tais como identidade de meristema, divisãocelular, separação de órgão e polaridade de órgão. Por exemplo, miR164seleciona genes de NAC-domai, que codifica uma família de fatores detranscrição incluindo (CUP-SHAPED COTYLEDON1, CUCl e CUC2).Expressão de versão resistente a miR164 do CUCl mRNA do promotorCUCl causa alterações em desenvolvimento floral, e vegetativo embriônicode Arabidopsis (Mallory A et al., Current Biology 14:1035-1046, (2004)).miR166 medeia polaridade de folha em Arabidopsis e milho (Juarez M et al.,Nature 428: 84-88, (2004) e Kidner C e Martlenssen R, Nature 428: 81-84,(2004)). MiRl 72 direciona desenvolvimento de flor através de regulaçãoda expressão de gene APETALA2 (Chen X, Science, 303: 2022-2025(2004)). MiRNAs também regula a expressão de gene de planta em respostaaos estímulos ambientais tal como estresse abiótico. Por exemplo, aexpressão de miR395, o miRNA selecionador de sulfurilase, é aumentada sobfalta de sulfato (Jone-Rhoades MW e Bartel D, Molecular Cell 14: 787-799,(2004)). Expressão de miR319c é supra-regulada por frio e não pordesidratação, NaCl ou ABA (Sunkar R e Zhu JK, The Plant Cell16:2001:2019, (2004)). Alguns miRNAs possuem padrões temporais deexpressão e/ou tecidos-específicos únicos. Por exemplo, miR398b éexpressado predominantemente em folha de Arabidopsis (Sunkar R e ZhuJK., The Plant Cell 16:2001:2019, 2004)

Em animais, miRNAs também desempenham um papel chaveem crescimento e desenvolvimento. Por exemplo, em mamíferos, miR181modula diferenciação de linhagem hematopiética (Chen CZ et al., Science303:83-86, (2004)), e miR196 dirige a clivagem de HOXB8 mRNA (Yekta Set al., Science 304:594-596, (2004)). Em humano, miR-124 é expressadoapenas em cérebro com possível papel em diferenciação neuronal (SempereL.F. et al., Genome Biology 5:R13 (2004)) enquanto que miR-1 é expressadoem músculo (Lagos-Quintana. M et al., Current Biology, (2002))

Em planta, aplicações de miRNAs até agora descritas são:

1) sobreexpressão e/ou expressão ectópica de um dado miRNA paracaracterizar sua função ou gerar fenótipos desejados (Palatnik J etal., Nature 425: 257-263, (2003));

2) engenharia com um precursor de miRNA para produzir novomiRNA selecionador de gene-de-interesse (W02004009779;

3) engenharia de mRNA para ser resistente ao reconhecimento e àclivagem de miRNA (i.e. mutação silenciosa - pela mudança denucleotídeos nos códons para o mesmo aminoácido) (Palatnik J etal., Nature 425: 257-263, 2003; Mallory A et al., Current Biology14:1035-1046, (2004)).

US 20040268441 descreve construtos precursores demicroRNA que podem ser planejados para modularem a expressão dequalquer seqüência de nucleotídeos de interesse, quer um gene de plantaendógeno quer alternativamente um transgene.

Um dos maiores obstáculos em vários campos debiotecnologia (incluindo mas não limitados à terapia genética e àbiotecnologia de planta) é a dificuldade de alcançar especificidade de tecidoou célula. Transcrição é um processo essencial para cada organismo vivo paraconverter informação genética abstrata em realidade física. Promotor é umcomponente maior para conduzir transcrição. Alguns promotores são ativosem cada tecido (e.g. promotores de actina) enquanto que outros promotoressão ativos apenas em tecidos limitados. E bastante freqüente que um dadopromotor seja predominantemente ativo em um tipo de tecido mas fracamenteexpressado em alguns outros tecidos, os denominados promotores mutadossubnormais. Aqueles promotores são indesejáveis para aplicação agrícola efarmacêutica porque expressão não intencionada de gene-de-interesseresultada de promotores mutados subnormais poderia causar efeitosprejudiciais em colheitas ou pacientes. Certamente não atenderia orequerimento de agência regulatória.

Por exemplo nematódeos parasíticos de planta causam doençasem todas as colheitas de importância econômica, resultando em perdas anuaisestimadas de 100 bilhões de dólares americanos na agricultura mundial. NosEUA, nematódeo de cisto de feijão-soja é a peste de número 1 - infectandoquase todos os estados de produção de feijão-soja (aproximadamente 80milhões de acres) e causa até 30% de perda de rendimento a cada ano.Medidas de controle químico são inadequadas e ambientalmente adversas.Tecnologia de planta transgênica oferece um potencial grande, contudo, aindanão tem sido alcançado sucesso significativo. Um problema maior é asatividades de mutação de atividade subnormal de promotor 'específico' desítio de alimentação de nematódeo. Embora tal promotor (e.g. TobRB7) possadirigir moléculas fitotóxicas para 'matar' as células alimentadoras e aliviar ainfecção de nematódeo, a expressão de mutação de atividade subnormaldestas moléculas fitotóxicas em outros tecidos (e.g. flor) causa efeitosprejudiciais sobre as plantas hospedeiras. Assim, uma nova abordagem paracontrolar expressão de mutação de atividade subnormal está em demanda alta.

Por exemplo um problema maior em quimioterapia e terapiade radiação para câncer é a dificuldade de alcançar extermínio de célulaespecífica de tumor. A incapacidade de radiação ou de agentesquimioterapêuticos citotóxicos de distinguir entre células de tumor e célulasnormais necessariamente limita a dosagem que pode ser aplicada. Como umresultado, relapso de doença devido às célula de tumor sobreviventesresiduais é freqüentemente observado, e assim há uma necessidade clara deestratégias não-cirúrgicas alternativas. Desenvolvimento de técnicas deterapia genética está abordando realização clínica para o tratamento dedoenças neoplásicas e metabólicas, e numerosos genes exibindo atividade deanti-tumor têm sido identificados. Contudo, a utilidade dos métodos de terapiagenética tem sido limitada devido à toxicidade sistêmica de polipeptídeosanti-tumor codificados pelos construtos de terapia genética (Spriggs & Yates(1992) em Bentler, ed., Tumor Necrosis Factor: The Molecules and TheirEmerging Roles in Medicine, pp. 383-406 Raven Press, New York, N.Y.;Sigel & Puri (1991) J Clin Oncol 9:694-704; Ryffel (1997) Immunopathol83:18-20). Problemas com as estratégias de terapia genética do estadocorrente da técnica incluem a incapacidade para liberar o gene terapêuticoespecificamente para as células alvo. Isto acarreta toxicidade em células quenão são os alvos intencionados. Por exemplo, manipulação de gene p53suprime o crescimento de ambas células de tumor e células normais, e aadministração intravenosa de fator alfa de necrose de tumor (TNF.alfa.) induztoxicidade sistêmica com tais manifestações clínicas como febre ehipertensão. Tentativas têm sido feitas para suplantar estes problemas. Estasincluem tais estratégias como o uso de promotores específicos para tecidopara limitar a expressão de gene em tecidos específicos e o uso de calor(Voellmy R., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 82:4949-4953 (1985)) oupromotores e intensificadores induzíveis por radiação ionizante (Trainman, R.H., et al., Cell 46: 567-574 (1986); Prowess, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sei.USA 85, 7206-7210 (1988)) para intensificar a expressão do gene terapêuticoem uma maneira temporal e espacialmente controlada.

Vetores adenovirais possuem numerosos atributos que ostornam veículos de liberação de gene úteis para terapia genética sistêmica.Idealmente, um tal sistema seria planejado de modo que vetor sistemicamenteadministrado se alojaria especificamente nas células de tumor alvo seminfecção ectópica de células normais. Contudo, um bloqueio impróprio paraesta abordagem é o fato de que os vetores adenovirais administradossistemicamente são seqüestrados em sua maioria no fígado. Portanto medidasque especificamente controlem a distribuição de expressão de transgeneliberada têm que ser sobrepostas sobre o vetor básico para aplicabilidadeótima de vetores adenovirais.

Infelizmente, para a maioria dos presentes sistemas deexpressão a expressão de ingrediente ativo não está restringida aos sítios detumor devido à 'mutação de atividade subnormal' dos promotores disponíveislimitando deste modo a eficiência de tais abordagens. Promotores específicospara tecido podem adicionar outro grau de seletividade de expressão detransgene mas há poucos destes que têm sido validados in vivo e estão todossujeitos a algum grau de 'mutação de atividade subnormal' ou ativação nãoespecífica. Um mecanismo versátil para expressão de gene controlável éportanto elevadamente desejável para terapia genética.

Um mecanismo para controlar expressão de gene deveidealmente incluir controle tanto especial quanto temporal de expressão degene. Uma estratégia existente emprega um sinal quimicamente regulado, porexemplo o sistema de expressão de gene induzível por tetraciclina (Gossen &Bujard (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89:5547-5551; Gossen & Bujard(1993) Nuc Acids Res 21(18):4411-4412; Gossen et al. (1995) Science268:1766-1769). Uma abordagem similar envolve a provisão de radiação deionização para ativar um promotor radiossensível, e.g. o promotor EGR-I(Weischelbaum et al. (1994) Câncer Res 54:4266-4269; Hallahan et al. (1995)Nat Med 1(8):786-791; Joki et al. (1995) Hum Gen Ther 6:1507-1513). Umplanejamento alternativo baseia-se em controle endógeno de expressão degene. Por exemplo, o promotor CEA é seletivamente expressado em célulasde câncer (Hauck & Stanners (1995) J Biol Chem 270:3602; Richards et al.(1995) Human Gene Ther 6:881-893).

No passado, várias abordagens têm sido tentadas parasolucionar o problema de mutação de atividade subnormal em expressão degene de planta sem muito sucesso. Pela condução de uma série de deleção deseqüência de promotor, pode-se eliminar a seqüência na região de promotorque contribui para a expressão de mutação de atividade subnormal. Porexemplo, uma versão deletada de promotor TbRB 7 dirige a expressão de generepórter GUS em células alimentadoras de nematódeo na raiz sob infecção denematódeo. Expressão de mutação de atividade subnormal, contudo, emtecido de flor ainda não está solucionada (Opperman CH et al., Science263:221-223, (1994)). Pela preparação de um promotor quimérico, i.e. umpromotor mínimo (e.g. promotor 35S) mais elementos regulatóriosespecíficos para tecido, pode-se restringir a expressão de gene em tecidosdesejados. Contudo, se elementos regulatórios específicos para tecido foremmutados para atividade subnormal, o promotor quimérico também serámutado para atividade subnormal.

US 20030045495 está descrevendo sistemas induzíveismodificados para expressão seletiva de genes terapêuticos por hipertermia.Contudo, hipotermia também é difícil de ser aplicada em células discretas ou áreas de tecido pequenas.

US 20010049828 está descrevendo um método e um sistemapara controlar a expressão de produtos transgenes em tecidos específicos emum animal transgênico. O sistema é baseado em uma interação de váriostransativadores. A atividade de transativador é controlada por anti-senso queestá sob controle de promotores específicos para tecido, suprimindo destemodo a expressão em certos tecidos. O sistema é bastante complicado ebaseia-se em vários construtos de expressão e fatores de transcriçãotransgênicos. Um sistema similar é descrito em US 20020065243.

US 20020022018 descreveu o controle de especificidade paratecido pelo emprego de distribuição ou deleção específica para tecido doconstruto de expressão no organismo alvo pela expressão específica paratecido de uma recombinase Cre em vários pedaços devido aos sítios LoxP queestão estrategicamente posicionados dentro da estrutura principal do vetor.

Conseqüentemente, transgene indesejado bem como expressão de gene viralsão prevenidos. Contudo, devido à mutação de atividade subnormal dopromotor que dirige a expressão de Cre, é esperado que a expressão sejaabaixada também no próprio tecido alvo, diminuindo deste modo a eficiênciatotal desta abordagem.

Embora cada um destes sistemas acima mencionados exibaminducibilidade solucionando deste modo o problema com o controle temporalde expressão de gene, a precisão especial da indução de gene ainda é faltante.Todos os sistemas na arte até agora são elevadamente complexos e/outambém redutores de expressão eficiente nas células alvo. Assim, aindapermanece necessidade substancial de melhoria de controle ou especificidadepara tecido de mutação de atividade subnormal de promotor. A presenteinvenção proporciona tal meio e métodos atendendo deste modo estanecessidade e este desejo antigos na arte.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Uma primeira modalidade da invenção refere-se a um métodopara expressão transgênica com especificidade intensificada em umorganismo eucariótico o citado método compreendendo as etapas de:

a) proporcionar um construto de expressão compreendendo umaseqüência de promotor funcional em citado organismo eucariótico efuncionalmente ligada no mesmo uma seqüência de nucleotídeos aser expressada em uma seqüência de RNA quimérica, a citadaseqüência de nucleotídeos compreendendo:

i) pelo menos uma seqüência capaz de conferir um fenótipopreferido ou um efeito benéfico ao citado organismoeucariótico, e

ii) pelo menos uma seqüência substancialmente complementar auma seqüência de microRNA naturalmente expressada emcitado organismo eucariótico, na qual o citado microRNA énaturalmente expressado em tecidos, às vezes, e/ou sobcondições ambientais, onde expressão não é desejada, mas nãoé ou é substancialmente menos expressada em tecidos, àsvezes, e/ou sob condições ambientais, onde tal expressão édesejada,

na qual pelo menos uma de seqüência i) e seqüência ii) sãoheterólogas uma em relação à outra, e

b) introduzir o citado construto de expressão em um organismoeucariótico.

Preferivelmente, o citado organismo eucariótico é um humano,um animal ou uma planta.

Várias posições são possíveis para uma a seqüência sendosubstancialmente complementar ao microRNA (daqui em diante também a"etiqueta microRNA") na seqüência de nucleotídeos a ser expressada.Preferivelmente, a seqüência sendo substancialmente complementar aomicroRNA está posicionada em uma localização da seqüência de nucleotídeosa ser expressada correspondendo à região não traduzida 5' ou à região nãotraduzida 3' de citada seqüência.

A seqüência de nucleotídeos a ser expressada pode possuirvárias formas e/ou funções. Por exemplo, pode compreender uma matriz deleitura aberta codificadora de uma proteína. Alternativamente, pode codificarum RNA funcional selecionado do grupo consistindo de RNA de anti-senso,RNA de senso, RNA de fita dupla ou ribozimas. Citado RNA funcional épreferivelmente atenuador de expressão de um gene endógeno.

Para permitir especificidade de expressão intensificada, omicroRNA (ao qual a seqüência compreendida na seqüência de nucleotídeos aser expressada é substancialmente complementar) é preferivelmente nãoconstutivamente expressado, mas é variado em expressão em pelo menos umparâmetro selecionado do grupo consistindo de tecido, fatores especial, detempo, de desenvolvimento, ambientais ou outros fatores exógenos.

Preferivelmente, o microRNA é tecido-especificamente expressado,espacialmente regulado, desenvolvimentalmente regulado e/ou regulado porfatores de estresse biótico ou abiótico.

O construto de expressão para a expressão da seqüência denucleotídeos compreendendo a etiqueta-microRNA pode ser RNA, RNA podeser de fita única ou de fita dupla. Preferivelmente o construto de expressão éDNA, com maior preferência DNA de fita dupla. O construto de expressãopode ser parte ou um construto de vetor maior. Preferivelmente, o construtode expressão é um plasmídeo.

Vários promotores podem ser usados para expressão daseqüência de nucleotídeos compreendendo a etiqueta - microRNA. Ospromotores podem ser - por exemplo -selecionados do grupo consistindo depromotores constitutivos, promotores específico para tecidos ou tecido-preferenciais, e promotores induzíveis. Um promotor específico para tecidoneste contexto, significa - preferivelmente - que é mutado para atividadesubnormal (i.e. possuindo atividade de expressão em tecido diferente depreferido ou principal) em uma extensão pequena mas mensurável.

A invenção possui amplas oportunidades de aplicação, nocampo de tanto plantas, de humano quanto de animais.

Em uma modalidade preferida, o organismo eucariótico é umaplanta e o promotor é um promotor funcional em plantas. Para plantas, aseqüência de nucleotídeos expressada preferivelmente modula a expressão deum gene envolvido em feições agronômicas, resistência à doença, resistênciaa herbicida, e/ou características de grão. A pessoa experiente na arte estáciente de numerosas seqüências de nucleotídeos que podem ser usadas nocontexto e para as quais uma especificidade de expressão intensificada évantajosa. Por exemplo, a seqüência de nucleotídeos expressada podemodular a expressão de um gene selecionado do grupo consistindo de genesenvolvidos na síntese e/ou na degradação de proteínas, peptídeos, ácidosgraxos, lipídeos, ceras, óleos, amidos, açúcares, carboidratos, aromatizantes,odores, toxinas, carotenóides, hormônios, polímeros, flavinóides, proteínas dearmazenagem, ácidos fenólicos, alcalóides, ligninas, taninos, celuloses,glicoproteínas, e glicopeptídeos.

Várias aplicações em plantas são aqui contempladas para asquais é vantajosa a modulação do perfil de expressão em certas direções. Estamodulação é alcançada pela seleção da etiqueta-microRNA em um modo, queo perfil de expressão do miRNA naturalmente ocorrente se ajusta aos tecidos,tempos, e/ou sob condições ambientais onde nenhuma expressão ou expressãomenor deve ser alcançada. Por exemplo, o microRNA possui um perfil deexpressão natural na planta selecionado do grupo consistindo de:

a) expressão substancialmente constitutiva mas não expressão emsemente,

b) expressão predominante em sementes mas não em outros tecidos,

b) expressão induzida por seca ou por outro estresse abiótico,

c) expressão induzida por patógeno de planta,

c) expressão temporal (e.g., durante polinização, germinação,desenvolvimento iniciais etc.), e

d) expressão quimicamente induzida.

Preferivelmente, o microRNA é um microRNA de plantaselecionado do grupo consistindo de:

a) as seqüências como descritas pela SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8,9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26,27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44,45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 225, 226, 227, 228, 229,230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242,243, 245, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255,256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, e 266 eb) derivados das seqüências descritas pela SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6,7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25,26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43,44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 225, 226, 227, 228,229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241,242, 243, 245, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254,255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, e 266.

Em uma modalidade preferida, o citado derivado possui umaidentidade de pelo menos 70%, preferivelmente de pelo menos 80% ou 85%,com maior preferência de pelo menos 90%, mais preferivelmente de pelomenos 95% em relação à seqüência descrita por qualquer uma de SEQ IDNO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22,23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43,44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 225, 226, 227, 228, 229, 230,231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 245, 245,246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260,261, 262, 263, 264, 265, e 266.

Outras aplicações da invenção aqui proporcionadas são usadasem animais (especialmente mamíferos) ou humano. São especialmentepreferidas as aplicações farmacêuticas. Assim, em outra modalidade preferidada invenção o organismo alvo é um mamífero (com maior preferência um serhumano) e o promotor é um promotor funcional em mamíferos (com maiorpreferência em humanos). A seqüência de nucleotídeos expressadacompreendendo a etiqueta-miRNA preferivelmente modula (e.g., expressas,sobre-expressa, ou suprime) a expressão de um gene selecionado do grupoconsistindo de genes envolvidos em uma doença de humano ou de animal oué um gene terapêutico. Alternativamente, seqüências ou genes exógenospodem ser expressados os quais possuem um efeito curativo sobre oorganismo alvo. A doença é preferivelmente selecionada do grupo de doençasimunológicas, câncer, diabetes, neurodegeneração, e doenças do metabolismo.

A pessoa experiente na arte está ciente de numerosas seqüências, que podemser usadas neste contexto. O gene modulado pode ser selecionado do grupoconsistindo de proteína de retinoblastoma, p53, angiostatina, leptina,hormônios, fatores de crescimento, citocinas, insulina, hormônios decrescimento, alfa-interferon, beta-glicocerebrosidase, albumina de soro,hemoglobina, e colágeno. Genes terapêuticos podem ser selecionados dogrupo consistindo de fator alfa de necrose de tumor. Neste contexto ainvenção aqui descrita é um método melhorado para terapia genética outerapia mediada por nucleotídeo.

Vários promotores são correntemente usados na arte paraexpressarem seqüências em organismo de animal, de mamífero ou dehumano. Eles são em sua maioria faltantes de especificidade para tecido epodem ser vantajosamente combinados com o ensinamento aquiproporcionado. Por exemplo o promotor pode ser selecionado do grupoconsistindo de promotor perbB2, promotor de proteína ácida de soro de leite,promotor de estromelisina 3, promotor de antígeno específico de próstata,promotor de probasina.

Várias aplicações em organismo de animal, de mamífero ou dehumanos são aqui contempladas para as quais é vantajosa a modulação doperfil de expressão em certas direções. Esta modulação é alcançada pelaseleção da etiqueta-microRNA em um modo, que o perfil de expressão domiRNA naturalmente ocorrente se ajusta aos tecidos, tempos, e/ou sobcondições ambientais onde nenhuma expressão ou expressão menor deve seralcançada. Por exemplo, o microRNA possui um perfil de expressão naturalno organismo de animal, de mamífero ou de humano selecionado do grupoconsistindo de:

a) expressão tecido-específica em um tecido selecionado do grupoconsistindo de tecido cerebral, tecido hepático, tecido muscular,tecido neuronal, e tecido tumoral,

b) expressão induzida por estresse,

c) expressão induzida por patógeno,

d) expressão induzida por crescimento tumorgênico ou porcrescimento neoplásico, e

e) expressão dependente da idade.

Preferivelmente, o microRNA é um microRNA de animal, demamífero ou de humano selecionado do grupo consistindo de:

a) as seqüências como descritas pela SEQ ED NO: 56, 57, 58, 59, 60,61, 62, e 63, e

b) derivados das seqüências descritas pela SEQ ID NO: 56, 57, 58, 59,60, 61,62, e 63, e

c) a seqüência de RNA complementar a uma seqüência como descritapor qualquer uma de SEQ ID NO: 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98,99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112,113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125,126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138,139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151,152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164,165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177,178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190,191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203,204, 205, 206, 207, ou 208, e

d) derivados de seqüência de RNA complementar a uma seqüênciacomo descrita por qualquer uma de SEQ ID NO: 90, 91, 92, 93, 94,95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109,110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122,123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135,136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148,149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161,162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174,175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187,188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200,201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, ou 208.

Em uma modalidade preferida, o citado derivado possui umaidentidade de pelo menos 70%, preferivelmente de pelo menos 80% ou 85%,com maior preferência de pelo menos 90%, mais preferivelmente de pelomenos 95% em relação a um miRNA como descrita por qualquer uma deSEQ ID NO: 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, e 63 ou uma seqüência de RNAcomplementar a uma seqüência como descrita por qualquer uma de SEQ IDNO: 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106,107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121,122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136,137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151,152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166,167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181,182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196,197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, ou 208.

O RNA quimérico expressado pelo método da invenção (i.e. oRNA compreendendo a etiqueta-miRNA expressada) é considerado novo.Assim outra modalidade da invenção refere-se à seqüência deribonucleotídeos quimérica compreendendo:

i) pelo menos uma seqüência capaz de conferir um fenótipopreferido ou efeito benéfico a um organismo eucariótico, eii) pelo menos uma seqüência substancialmente complementar auma seqüência de microRNA naturalmente ocorrente em umorganismo eucariótico,

na qual pelo menos uma de seqüência i) e seqüência ii) sãoheterólogas uma em relação à outra.

As seqüências i) e/ou ii) na seqüência de ribonucleotídeosquimérica são preferivelmente definidas como acima para o método dainvenção.

Além disso, os construtos de expressão para a expressão decitada seqüência de ribonucleotídeos quimérica (que são empregados nométodo da invenção) são considerados novos. Assim outra modalidade dainvenção refere-se a um construto de expressão compreendendo umaseqüência de promotor funcional em um organismo eucariótico efuncionalmente ligada na mesma uma seqüência de nucleotídeos, a citadaseqüência compreendendo:

ii) pelo menos uma seqüência substancialmente complementar auma seqüência de microRNA naturalmente ocorrente emcitado organismo eucariótico,

O construto de expressão e seus elementos são preferivelmentedefinidos como acima para o método da invenção.

Outra modalidade da invenção refere-se a um vetor deexpressão compreendendo um construto de expressão da invenção.Preferivelmente, o vetor de expressão é um vetor de expressão eucariótico.Mais preferivelmente o vetor de expressão eucariótico é um vetor viral, umvetor plasmídeo ou um vetor binário.

Ainda outra modalidade da invenção refere-se a um organismo(preferivelmente um organismo de não-humano) ou célula transformado(a)compreendendo seqüência de ribonucleotídeos quimérica, um construto deexpressão ou um vetor de expressão da invenção. Preferivelmente, o citadoconstruto de expressão ou vetor de expressão é inserido (pelo menos emparte) no genoma da célula ou do organismo. Preferivelmente, a citada célulaou o citado organismo é selecionada(o) do grupo de organismo e células demamífero, de bactéria, de fungo, de nematódeo ou de planta. Outramodalidade da invenção refere-se à semente transformada da planta dainvenção.

Ainda outra modalidade da invenção refere-se a umapreparação farmacêutica de pelo menos um construto de expressão, umaseqüência de ribonucleotídeos quimérica, ou um vetor de acordo com ainvenção.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

De modo que o assunto no qual as características, vantagens eobjetivos da invenção citados acima, bem como outros que se tornarão claros,seja alcançado e entendido em detalhe, descrições mais particulares dainvenção resumidamente sumariadas acima podem ter por referência certasmodalidades da mesma que são ilustradas nos desenhos anexados. Estesdesenhos formam parte do relatório descritivo. É para ser notado, entretanto,que os desenhos anexados ilustram as modalidades preferidas da invenção eportanto não são para serem entendidos como limitantes em seu escopo.

Fig. 1 Biogênese e modo de ação de miRNAs em planta(Bartel D, CeII 116:281-297, 2004)

Etapa 1: Um gene de miRNA é transcrito em Pri-miRNA porPol II. Há uma evidência crescente de que, pelo menos, alguns transcritospossuem a estrutura Cap na terminação 5' e estão poliadenililados naterminação 3'. O Pri-miRNA de vida curta forma uma estrutura de haste-alçae rapidamente entra na Etapa 2.

Etapa 2: Pri-miRNA é processado em Pre-miRNA por Dicer-Iresultando na exposição de uma extremidade de miRNA maduro.

Etapa 3: Pre-miRNA é processado em duplex de miRNAmaduro:miRNA* (aprox. 22 nt) por DCLl ou outro gene.

Etapa 4: miRNA é exportado do núcleo para dentro docitoplasma. Provavelmente, HASTY, o ortólogo de planta de Exportina-5 demamífero, é requerido para tal processo de exportação.

Etapas 5, 6: Um miRNA de fita única é eventualmenteincorporado em RISC (complexo silenciador induzido por RNA) e se ligaespecificamente em mRNA alvo com sítios perfeitos ou quase perfeitoscomplementares ao miRNA.

Etapa 7: miRNA inibe a expressão de gene em níveis de pós-transcrição ou níveis de tradução.

Fig. 2 Padrões de expressão específica de precursores demiRNA de milho em banco de dados de expressão de gene de Zea mays.

A: Expressão de precursor de miR166 em folhas e estigma

B: Expressão predominante de precursor de miR167 emsementes

C: Expressão de precursor de miR159 em qualquer localmenos sementes

D: Expressão induzida por estresse de precursor de miR160Fig. 3 Intensificação de expressão específica em sementemiR159 de milho é expressado em todos os tecidos exceto(Fig. 3 - A). Se o gene-de-interesse (GOI) for intencionado para expressarapenas em sementes com promotor 'específico de semente' mutado paraatividade subnormal, pode-se incorporar uma etiqueta-miRNA (5'-AGAGCTCCCTTCAATCCAAA-3', que é complementar ao miR159) em3 'UTR após o GOI para preparar um vetor binário genético para controlar aexpressão de mutação de atividade subnormal do GOI em tecidos de não-semente por miR159 endógeno (Fig. 3-B). O GOI é apenas eficientementeexpressado em sementes, mas seu mRNA é quebrado (simbolizado portesouras) em outros tecidos, onde miRNA159 endógeno é expressado.

Fig. 4 Intensificação de especificidade de expressão emtecidos de não-semente (prevenção de expressão em sementes)

miR167 de milho é predominantemente expressado emsementes (Fig. 4-a). Se o gene-de-interesse (GOI) NÃO for intencionado paraexpressar em sementes (e.g., genes conferindo atividades de pesticida), maspromoter usado é mutado para atividade subnormal em sementes, pode-seincorporar uma etiqueta (5' -TGAAGCTGCC AGC ATGATCT-3',complementar ao miR167) na 3' UTR após o GOI para preparar um vetorgenético para controlar expressão indesejável do GOI em sementes pormiR167 endógeno (Fig. 4-B). O GOI é apenas eficientemente quebrado emsementes (simbolizado por tesouras), onde o miRNA167 endógeno éexpressado, em outros tecidos o GOI é expressado.

Fig. 5 Um vetor genérico para controlar mutação de atividadesubnormal de expressão de GOI

A invenção aqui descrita pode ser realizada para regularexpressão de transgene em maneira espacial e/ou temporal. Algumas feições(e.g. para alimento de animal) requerem que o gene-de-interesse (GOI)expresse em certos estágios (e.g. embriões precoces ou tardios). CertosmiRNAs poderiam ser regulados em diferentes estágios de desenvolvimento.Portanto, pode-se incorporar sítios alvos de miRNA que são complementaresao miRNA X (específico para tecido) e/ou miRNA Y(desenvolvimentalmente específico), de modo que expressão de GOI possaser controlada em um modo mais desejável.

DEFINIÇÕESAbreviações: BAP - 6-benzil-amino-purina; 2,4-D - ácido 2,4-dicloro-fenóxi-acético; MS - meio de Mura-shige e Skoog; NAA - ácido 1-naftaleno-acético; MES, ácido 2-N-morfolino-etano-sulfônico, IAA - ácidoindol-acético; Kan - sulfato de canamicina; GA3 - ácido giberélico;

Timentin™: ticarcilina dissódica / clavulanato de potássio.

E para ser entendido que esta invenção não é limitada àmetodologia, aos protocolos, às linhagens celulares, às espécies ou aosgêneros de planta, aos construtos, e aos reagentes particulares descritos comotais. Também é para ser entendido que a terminologia aqui usada é para opropósito de descrever apenas modalidades particulares, e não é intencionadapara limitar o escopo da presente invenção que será limitado apenas pelasreivindicações anexadas. Tem ser observado que como aqui usadas e nasreivindicações anexadas, as formas no singular "um", "uma", "e", e "o", "a"incluem a referência no plural a não ser que o contexto dite claramente deoutro modo. Assim, por exemplo, referência a "um vetor" é uma referência aum ou mais vetores e inclui seus equivalentes conhecidos por aquelas pessoasexperientes na arte, e assim por diante. O termo "cerca de" é aqui usado parasignificar aproximadamente, a grosso modo, ao redor de, ou na região de.Quando o termo "cerca de" for usado conjuntamente com uma faixanumérica, ele modificará aquela faixa pela extensão dos limites acima eabaixo dos valores numéricos descritos. Em geral, o termo "cerca de" é aquiusado para modificar um valor numérico acima e abaixo do valor enunciadopor uma variância de 20 por cento, preferivelmente de 10 por cento para maisou para menos (mais alto ou mais baixo). Como aqui usada, a palavra "ou"significa qualquer membro de uma lista particular e também inclui qualquercombinação de membros daquela lista. As palavras "compreender","compreendendo", "compreendem", "compreende", "incluir", "incluindo","incluem" e "inclui" quando usadas neste relatório descritivo e nasreivindicações seguintes são intencionadas para especificarem a presença ou aadição de uma ou mais outras características, números inteiros, componentes,ou etapas, mas não impedem a presença ou a adição de uma ou maiscaracterísticas, números inteiros, componentes, etapas ou grupos dos mesmos.Para clareza, certos termos usados neste relatório descritivo são definidos eusados como segue:

Feição agronomicamente valiosa: o termo "feiçãoagronomicamente valiosa" refere-se a qualquer fenótipo em um organismo deplanta que é útil ou vantajoso para produção de alimentos ou produtosalimentícios, incluindo partes de planta e produtos de planta. Produtosagrícolas não-alimentícios tais como papel, etc. também estão incluídos. Umalista parcial de feições agricolamente valiosas inclui resistência à peste, vigor,tempo de desenvolvimento (tempo para colheita), conteúdo de nutrienteintensificado, padrões de crescimento novos, aromatizantes ou cores,tolerância ao sal, ao calor, à seca e ao frio, e semelhante. Preferivelmente,feições agricolamente valiosas não incluem genes marcadores selecionáveis(e.g., genes codificadores de resistência a herbicida ou a antibiótico usadosapenas para facilitar a detecção ou a seleção de células transformadas), genesde biossíntese de hormônio acarretando a produção de um hormônio de planta(e.g., auxinas, giberlinas, citoquininas, ácido abscísico e etileno que sãousados apenas para seleção), ou genes repórter (e.g., luciferase, glicuronidase,cloranfenicol-acetil-transferase (CAT, etc.). Tais feições agronomicamentevaliosas podem incluir melhoria de resistência à peste (e.g., Melchers et al.(2000) Curr Opin Plant Biol 3(2): 147-52), vigor, tempo de desenvolvimento(tempo para colheita), conteúdo de nutriente intensificado, padrões decrescimento novos, aromatizantes ou cores, tolerância a sal, ao calor, à sec, eao frio (e.g., Sakamoto et al. (2000) J Exp Bot 51(342):81-8; Saijo et al.(2000) Plant J 23(3): 319-327; Yeo et al.(2000) Mol Cells 10(3):263-8;Cushman et al. (2000) Curr Opin Plant Biol 3(2): 117-24), e semelhante.

Aquelas pessoas experientes na arte reconhecerão que há numerosospolinucleotídeos a serem escolhidos para conferir estas e outras feiçõesagronomicamente valiosas.

Alterar: "alterar" ou "modular" a expressão de uma seqüênciade nucleotídeos em uma célula (e.g., uma célula de planta) significa que onível de expressão da seqüência de nucleotídeos em uma célula apósaplicação de um método da presente invenção é diferente de sua expressão nacélula antes da aplicação do método. Em uma modalidade preferida, alterar aexpressão significa que a expressão da seqüência de nucleotídeos na planta éreduzida após a aplicação de um método da presente invenção emcomparação com antes da aplicação do método. "Redução da" ou "reduzir a"expressão de um gene alvo é para ser entendido no sentido amplo ecompreende a prevenção ou o bloqueio parcial ou essencialmente completa(o)da expressão do gene alvo ou do RNA5 mRNA, rRNA, tRNA derivado domesmo e/ou do produto proteína codificado por ele em uma célula, umorganismo ou uma parte, tecido, órgão, célula ou semente da mesma, cujaprevenção ou cujo bloqueio pode ser baseada(o) em mecanismos biológicos-celulares diferentes. O termo "reduzida(o)" significa aqui mais baixo,preferivelmente significativamente mais baixo, com maior preferência aexpressão da seqüência de nucleotídeos não é detectável. Como aqui usado,"uma redução" do nível de um agente tal como uma proteína ou um mRNAsignifica que o nível é reduzido em relação a uma célula ou a um organismofaltante de uma molécula de RNA quimérica da invenção capaz de reduzir oagente. Como aqui usado, "redução pelo menos parcial" do nível de umagente (tal como um RNA, mRNA, rRNA, tRNA expressado pelo gene alvoe/ou do produto proteína codificado por ele) significa que o nível é reduzidoem pelo menos 25%, preferivelmente em pelo menos 50%, em relação a umacélula ou a um organismo faltante de uma molécula de RNA quimérica capazde reduzir o citado agente. Como aqui usado, "uma redução substancial " donível de um agente tal como uma proteína ou um mRNA significa que o nívelé reduzido em relação a uma célula ou a um organismo faltante de umamolécula de RNA quimérica da invenção capaz de reduzir o agente, onde aredução do nível do agente é de pelo menos 75%, preferivelmente de pelomenos 85%. Como aqui usado, "uma eliminação efetiva" de um agente talcomo uma proteína ou um mRNA é em relação a uma célula ou a umorganismo faltante de uma molécula de RNA quimérica da invenção capaz dereduzir o agente, onde a redução do nível do agente é maior do que 95%,preferivelmente maior do que 98%. A redução pode ser determinada pelosmétodos com os quais o técnico experiente está familiarizado. Assim, aredução da quantidade de proteína pode ser determinada por exemplo por umadetecção imunológica da proteína. Além do mais, podem ser empregadastécnicas bioquímicas tais como hibridização de Northern, ensaio de proteçãode nuclease, transcrição reversa (RT-PCR quantitativa), ELISA (ensaioimunoabsorvente ligado à enzima), Western blotting, radioimunoensaio (RIA)ou outros imunoensaios e análise de célula ativada por fluorescência (FACS).Dependendo do tipo do produto proteína reduzido, sua atividade ou o efeitosobre o fenótipo do organismo ou da célula também pode ser determinado.

Métodos para determinar a quantidade de proteína são conhecidos pelotécnico experiente. Exemplos, que podem ser mencionados são: o método demicro-Biureto (Goa J (1953) Scand J Clin Lab Invest 5:218-222), o métodode Folin-Ciocalteau (Lowry OH et ai. (1951) J Biol Chem 193:265-275) oumedição da absorção de CBB G-250 (Bradford MM (1976) Analyt Biochem72:248-254). Em outra modalidade preferida, alterar a expressão significa quea expressão da seqüência de nucleotídeos na planta é aumentada apósaplicação de um método da presente invenção em comparação com antes daaplicação do método.

Seqüência de aminoácidos: como aqui usado, o termo"seqüência de aminoácidos" refere-se a uma lista de abreviações, letras,caracteres ou palavra representando resíduos de aminoácido. Aminoácidospodem ser referidos aqui quer por seus símbolos de três letras comumenteconhecidos quer por símbolos de uma letra recomendados pela IUPAC-IUBBiochemical Nomenclature Commission. Nucleotídeos, igualmente, podemser referidos pelos seus códigos de uma letra comumente aceitos.

Animal: os termos "animal" ou "organismo de animal"referem-se aos invertebrados e vertebrados não-humanos. Vertebradospreferidos compreendem, por exemplo, espécies de peixes, mamíferos não-humanos tais como gado bovino, cavalos, ovelhas, cabras, camundongo, ratoou porco, e pássaros tais como galinha ou ganso. Células de animal preferidasincluem células CHO, COS, HEK293. Invertebrados compreendemnematódeos ou outros vermes, e insetos. Invertebrados compreendem célulasde inseto tais como células de Drosophila S2 e Spodoptera Sf9 ou Sf21.Ainda mais preferidos são nematódeos, que são capazes de atacar animais ouhumanos, tais como aqueles dos gêneros Ancylostoma, Ascaridia, Ascaris,Bunostomum, Caenorhabditis, Capillaria, Chabertia, Cooperia,Dictyocaulus, Haemonchus, Heterakis, Nematodirus, Oesophagostomum,Ostertagia, Oxyuris, Parascaris, Strongylus, Toxascaris, Trichuris,Trichostrongylus, Tfhehonema, Toxoeara ou Uneinaria. Ainda maispreferidos são aqueles que são capazes de atacar organismos de planta taiscomo, por exemplo, Bursaphalenchus, Crieonemella, Diiylenehus,Ditylenehus, Globodera, Helieoty lenehus, Heterodera, Longidorus,Melodoigyne, Naeobbus, Paratylenehus, Pratylenehus, Radopholus,Rotelynehus, Tylenchus ou Xiphinema. Insetos preferidos compreendemaqueles dos gêneros Coleoptera, Diptera, Lepidoptera e Homoptera.

Antiparalelo: "antiparalelo" refere-se aqui a duas seqüênciasde nucleotídeos pareadas através de ligações de hidrogênio entre resíduos debases complementares com ligações fosfodiéster correndo na direção 5'-3' emuma seqüência de nucleotídeos e na direção 3'-5' na outra seqüência denucleotídeos.Anti-senso: o termo "anti-senso" refere-se a uma seqüência denucleotídeos que está invertida em relação à sua orientação normal paratranscrição e assim expressa um transcrito de RNA que é complementar auma molécula de mRNA de gene alvo expressada dentro da célula hospedeira(e.g., pode hibridizar na molécula de mRNA de gene alvo através dopareamento de bases de Watson-Crick). Uma fita de anti-senso pode serconstruída em numerosas maneiras diferentes, desde que ela seja capaz deinterferir com a expressão de um gene alvo. Por exemplo, a fita de anti-sensopode ser construída pela inversão da região codificadora (ou de uma porçãoda mesma) do gene alvo em relação à sua orientação normal para transcriçãopara permitir a transcrição de seu complemento, (e.g., RNAs codificados pelogene de anti-senso e de senso pode ser complementar). Em adição, a fita deoligonucleotídeo de anti-senso não necessita possuir o mesmo padrão deíntron ou de exon que o do gene alvo, e segmentos não codificadores do genealvo podem ser igualmente efetivos na obtenção de supressão de anti-senso daexpressão de gene alvo como segmentos codificadores. No contexto desilenciamento de gene o termo "anti-senso" é entendido para significar umácido nucleico possuindo uma seqüência complementar a uma seqüência alvo,por exemplo uma seqüência de RNA mensageiro (mRNA) cujo bloqueio daexpressão é desejado para ser iniciado pela hibridização com a seqüênciaalvo.

Célula: o termo "célula" ou "célula de planta" como aquiusado refere-se preferivelmente a uma única célula. O termo "células" refere-se a uma população de células. A população de células pode ser umapopulação pura compreendendo um tipo de célula. Igualmente, a populaçãopode compreender mais do que um tipo de célula. Na presente invenção, nãohá limite sobre o número de tipos de célula que uma população de célulaspode compreender. As células podem estar sincronizadas ou nãosincronizadas. Uma célula dentro do significado desta invenção pode estarisolada {e.g., em cultura de suspensão) ou compreendida em um tecido, órgãoou organismo em qualquer estágio de desenvolvimento.

Região codificadora: como aqui usado o termo "regiãocodificadora" quando usado em referência a um gene estrutural refere-se àsseqüências de nucleotídeos que codificam os aminoácidos encontrados nopolipeptídeo nascente como um resultado de tradução de uma molécula demRNA. A região codificadora é ligada, em eucariotos, no lado-5' pelo tripletode nucleotídeos "ATG" que codifica a metionina iniciadora e no lado-3' porum de três tripletos que especificam códons de terminação (i.e., TAA, TAG,TGA). Em adição ao conteúdo de íntrons, formas genômicas de um genetambém incluem seqüências localizadas em ambas as extremidades-5' e -3'das seqüências que estão presentes no transcrito de RNA. Estas seqüênciassão referidas como regiões ou seqüências "flanqueadoras" (estas seqüênciasflanqueadoras estão localizadas 5' ou 3' em relação as seqüências nãotraduzidas presentes no transcrito de mRNA). A região flanqueadora-5' podeconter seqüências regulatórias tais como promotores e intensificadores quecontrolam ou influenciam a transcrição do gene. A região flanqueadora-3'pode conter seqüências que dirigem a terminação da transcrição, clivagempós-transcricional e poliadenilação.

Complementar: "complementar" ou "complementaridade"refere-se a duas seqüências de nucleotídeos que compreendem seqüências denucleotídeos antiparalelas capazes de parearem uma com a outra (pelasregras de pareamento de bases) sob formação de ligações de hidrogênio entreos resíduos de bases complementares nas seqüências de nucleotídeosantiparalelas. Por exemplo, a seqüência 5'-AGT-3' é complementar àseqüência 5-ACT-3'. Complementaridade pode ser "parcial" ou "total".Complementaridade "parcial" é onde uma ou mais bases de ácido nucleiconão são combinadas de acordo com as regras de pareamento de bases.Complementaridade "total" ou "completa" entre ácidos nucleicos é onde todasas bases da ácido nucleico são combinadas umas com as outras sob as regrasde pareamento de bases. O grau de complementaridade entre fitas de ácidonucleico tem efeitos significativos sobre eficiência e força de hibridizaçãoentre fitas de ácido nucleico. Um "complemento" de uma seqüência de ácidonucleico como aqui usado refere-se a uma seqüência de nucleotídeos cujosácidos nucleicos mostram complementaridade total aos ácidos nucleicos daseqüência de ácido nucleico.

DNA cromossômico: o termo "DNA cromossômico" ou"seqüência de DNA cromossômico" é para ser entendido com o DNAgenômico do núcleo celular independente do estado do ciclo celular. DNAcromossômico pode ser portanto organizado em cromossomos ou cromátides,podem estar condensados ou desenrolados. Uma inserção no DNAcromossômico pode ser demonstrada e analisada por vários métodosconhecidos na arte como e e.g., análise por reação em cadeia de polimerase(PCR)3 análise por Southern blot, hibridização in situ com fluorescência(FISH), e PCR in situ.

Rearranjo de DNA: rearranjo de DNA é um método pararápida, fácil e eficientemente introduzir mutações ou rearranjos,preferivelmente aleatoriamente, em uma molécula de DNA ou para gerartrocas de seqüências de DNA entre duas ou mais moléculas de DNA,preferivelmente aleatoriamente. A molécula de DNA resultante do rearranjode DNA é uma molécula de DNA rearranjada que é uma molécula de DNAnão naturalmente ocorrente derivada de pelo menos uma molécula de DNAmolde. O DNA rearranjado codifica uma enzima modificada com respeito àenzima codificada pelo DNA molde, e preferivelmente possui uma atividadebiológica alterada com relação à enzima codificada pelo DNA molde.

RNA de fita dupla: uma molécula de "RNA de fita dupla","molécula de RNAi", ou molécula de "dsRNA" compreende um fragmento deRNA de senso de uma seqüência de nucleotídeos e um fragmento de RNA deanti-senso da seqüência de nucleotídeos, que ambos compreendem seqüênciasde nucleotídeos complementares entre si, permitindo deste modo que osfragmentos de RNA de senso e de anti-senso pareiem e formem uma moléculade RNA de fita dupla. Preferivelmente os termos referem-se a uma moléculaRNA de fita dupla capaz de, quando introduzida em uma célula ou em umacélula de um organismo, pelo menos parcialmente reduzir o nível de umaespécie de mRNA presente em uma célula ou em uma célula de umorganismo. Como aqui usado, "RNA interferente", "RNAi, e "dsRNAi"referem-se ao silenciamento gene-específico que é induzido pela introduçãode uma molécula de RNA de fita dupla.

Endógeno: uma seqüência de nucleotídeos "endógena" refere-se a uma seqüência de nucleotídeos, que está presente no genoma da célulanão transformada (e.g., uma célula de planta ou de mamífero).

Essencial: um gene "essencial" é um gene codificador de umaproteína tal como e.g. uma enzima biossintética, um receptor, uma proteínade transdução de sinal, um produto de gene estrutural, ou uma proteína detransporte que é essencial para o crescimento ou a sobrevivência doorganismo ou da célula (e.g., uma planta).

Exon: o termo "exon" como aqui usado refere-se no sentidonormal do termo para significar um segmento de moléculas de ácido nucleico,normalmente DNA, que codifica parte de ou toda uma proteína expressada.

Expressão: "expressão" refere-se à biossíntese de um produtode gene, preferivelmente à transcrição e/ou tradução de uma seqüência denucleotídeos, por exemplo um gene endógeno ou um gene heterólogo, emuma célula. Por exemplo, no caso de um gene estrutural, expressão envolvetranscrição do gene estrutural em mRNA e - opcionalmente - a traduçãosubseqüente de mRNA em um ou mais polipeptídeos. No caso de construtosde anti-senso, por exemplo, expressão pode se referir à transcrição apenas doDNA de anti-senso.Construto de expressão / construto de expressão: "Construto deexpressão" e "construto de expressão" como aqui usados são sinônimos esignificam uma seqüência de DNA capaz de dirigir a expressão de umaseqüência de nucleotídeos particular em uma célula hospedeira apropriada(e.g., uma célula de planta ou de mamífero), compreendendo um promotorfuncional em citada célula hospedeira no qual ele será introduzido,operavelmente ligado na seqüência de nucleotídeos de interesse que está -opcionalmente - operavelmente ligada nos sinais de terminação. Se traduçãofor requerida, ela tipicamente também compreenderá seqüências requeridaspara tradução apropriada da seqüência de nucleotídeos. A região codifícadorapode codificar uma proteína de interesse mas também pode codificar umRNA funcional de interesse, por exemplo RNA de anti-senso, dsRNA, ou umRNA não traduzido, na direção de senso ou de anti-senso. O construto deexpressão compreendendo a seqüência de nucleotídeos de interesse pode sequimérico, significando que pelo menos um de seus componentes éheterólogo com respeito a pelo menos um de seus outros componentes. Oconstruto de expressão também pode ser um, que é naturalmente ocorrentemas tem sido obtido em uma forma recombinante útil para expressãoheteróloga. Tipicamente, contudo, o construto de expressão é heterólogo comrespeito ao hospedeiro, i.e., a seqüência de DNA particular do construto deexpressão não ocorre naturalmente na célula hospedeira e tem que ter sidointroduzida na célula hospedeira em um ancestral da célula hospedeira por umevento de transformação. A expressão da seqüência de nucleotídeos noconstruto de expressão pode estar sob o controle de um promotor constitutivoou de um promotor induzível, que inicia a transcrição apenas quando a célulahospedeira for exposta a algum estímulo externo particular.

Gene estranho: o termo "gene estranho" refere-se a qualquerácido nucleico (e.g., seqüência de gene) que é introduzido no genoma de umacélula por manipulações experimentais e pode incluir seqüências de geneencontradas naquela célula desde que o gene introduzido contenha algumamodificação (e.g., uma mutação pontual, a presença de um gene marcadorselecionável, etc.) em relação ao gene naturalmente ocorrente.

Gene: o termo "gene" refere-se a uma região codificadoraoperavelmente unida às seqüências regulatórias apropriadas capazes deregularem a expressão do produto de gene (e.g., um polipeptídeo ou RNAfuncional) em alguma maneira. Um gene inclui regiões regulatórias nãotraduzidas de DNA {e.g., promotores, intensificadores, repressores, etc.)anteriores (a montante) e posteriores (a jusante) à região codificadora (matrizde leitura aberta, ORF) bem como, onde aplicável, seqüências interventoras(i.e., íntrons) entre regiões codificadoras individuais (i.e., éxons). O termo"gene estrutural" como aqui usado é intencionado para significar umaseqüência de DNA que é transcrita em mRNA que é então traduzido em umaseqüência de aminoácidos característica de um polipeptídeo específico.

Organismo geneticamente modificado: o termo "organismogeneticamente modificado" ou "GMO" refere-se a qualquer organismo quecompreende DNA heterólogo ou um transgene. Organismos exemplaresincluem plantas, animais e microorganismos.

Genoma e DNA genômico: os termos "genoma" ou "DNAgenômico" referem-se à informação genética herdável de um organismohospedeiro. O citado DNA genômico compreende o DNA do núcleo (tambémreferido como DNA cromossômico) mas também o DNA de plastídeos (e.g.,cloroplastos) e de outras organelas celulares (e.g·, mitocôndria).Preferivelmente os termos genoma ou DNA genômico referem-se ao DNAcromossômico do núcleo.

RNA grampo de cabelo: como aqui usado "RNA grampo decabelo" refere-se a qualquer molécula de RNA de fita dupla de auto-anelamento. Em sua representação mais simples, um RNA grampo de cabeloconsiste de uma haste de fita dupla composta por fitas de RNA deanelamento, conectadas por uma alça de RNA de fita dupla, e é tambémreferido como um "RNA cabo de panela". Contudo, o termo "RNA grampode cabelo" também é intencionado para incluir estruturas de RNA secundáriasmais complicadas compreendendo seqüências de RNA de fita dupla de auto-anelamento, mas também alças e protuberâncias internas. A estruturasecundária específica adaptada será determinada pela energia livre damolécula de RNA, e pode ser predita para situações diferentes usandoprograma de computador apropriado tal como FOLDRNA (Zuker e Stiegler(1981) Nucleic Acids Res 9(1): 133-48; Zuker, M. (1989) Methods Enzymol.180, 262-288).

Heterólogo: o termo "heterólogo" com respeito a um ácidonucleico ou DNA refere-se a uma seqüência de nucleotídeos que está ligadaem, ou é manipulada para se tornar ligada em, uma seqüência de ácidonucleico na qual ela não está ligada na natureza, ou na qual ela está ligada emuma localização diferente da na natureza. Um construto de expressãoheterólogo compreendendo uma seqüência de ácido nucleico e pelo menosuma seqüência regulatória (tal como um promotor ou um sinal de terminaçãode transcrição) ligada na mesma por exemplo é um construto originado pormanipulações experimentais no qual quer a) a citada seqüência de ácidonucleico, quer b) a citada seqüência regulatória quer c) ambas (i.e. (a) e (b))não está localizada em seu ambiente genético natural (nativo) ou tem sidomodificada por manipulações experimentais, um exemplo de umamodificação sendo uma substituição, adição, deleção, inversão ou inserção deum ou mais resíduos de nucleotídeos. Ambiente genético natural refere-se aolocus cromossômico natural no organismo de origem, ou à presença em umabiblioteca genômica. No caso de uma biblioteca genômica, o ambientegenômico natural da seqüência de ácido nucleico é preferivelmente retida,pelo menos em parte. O ambiente flanqueia a seqüência de ácido nucleicopelo menos em um lado e possui uma seqüência de pelo menos 50 pb,preferivelmente pelo menos 500 pb, especialmente preferivelmente pelomenos 1.000 pb, muito especialmente preferivelmente pelo menos 5.000 pb,em comprimento. Um construto de expressão naturalmente ocorrente - porexemplo a combinação naturalmente ocorrente de um promotor com o genecorrespondente - torna-se um construto de expressão transgênico quando émodificado por métodos "artificiais" sintéticos, não naturais tais como, porexemplo, mutagenização. Tais métodos têm sido descritos (US 5.565.350;WO 00/15815). Por exemplo uma seqüência de ácido nucleico codificadorade proteína operavelmente ligada em um promotor, que não é o promotornativo desta seqüência, é considerada heteróloga com respeito ao promotor.Preferivelmente, DNA heterólogo não é endógeno à ou não está naturalmenteassociado com a célula na qual ele é introduzido, mas tem sido obtido deoutra célula. DNA heterólogo também inclui uma seqüência de DNAendógena, que contém alguma modificação, múltiplas cópias nãonaturalmente ocorrentes de uma seqüência de DNA endógena, ou umaseqüência de DNA que não está naturalmente associada com outra seqüênciade DNA fisicamente ligada na mesma. Geralmente, embora nãonecessariamente, DNA heterólogo codifica RNA e proteínas que não sãonormalmente produzidos pela célula na qual ele é expressado.

Seqüência de DNA homóloga: uma seqüência de DNAnaturalmente associada com uma célula hospedeira ou outra seqüência deDNA.

Hibridização: o termo "hibridização" como aqui usado inclui"qualquer processo pelo qual uma fita de ácido nucleico se une com uma fitacomplementar por meio de pareamento de bases" (J. Coombs (1994)Dictionary of Biotechnology, Stockton Press, New York). Hibridização e aforça de hibridização (i.ea força de associação entre os ácidos nucleicos) sãoafetadas por fatores tais como o grau de complementaridade entre os ácidosnucleicos, a estringência das condições envolvidas, a Tm do híbrido formado,e a razão de G:C dentro dos aminoácidos. Como aqui usado, o termo "Tm" éusado para se referir à "temperatura de fusão". A temperatura de fusão é atemperatura na qual uma população de moléculas de ácido nucleico de fitadupla se torna meio dissociada em fitas únicas. A equação para calcular a Tmde ácidos nucleicos é bem conhecida na arte. Como indicado pelas referênciaspadrão, uma estimativa simples do valor de Tm pode ser calculada pelaequação: Tm=81,5+0,41(% G+C), quando um ácido nucleico estiver emsolução aquosa de NaCl 1 N [veja e.g., Anderson e Young, Quantitative FilterHybridization, em Nucleic Acid Hybridization (1985)]. Outras referênciasincluem computações mais sofisticadas, que levam em consideraçãocaracterísticas de seqüência e estruturais para o cálculo de Tm. Condiçõesestringentes, são conhecidas por aquelas pessoas experientes na arte e podemser encontradas em Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Condições de estringência baixa quandousadas em referência à hibridização de ácido nucleico compreendemcondições equivalentes à ligação ou hibridização a 68°C em uma soluçãoconsistindo de 5x SSPE (NaCl 43,8 g/L, NaH2PO4-H2O 6,9 g/L e EDTA 1,85g/L, pH ajustado para 7,4 com NaOH), SDS 1%, 5x reagente de Denhard [50xDenhardfs contém o seguinte por 500 mL: 5 g de Ficoll (Type 400,Pharmacia), 5 g de BSA (Fraction V; Sigma)] e 100 μg/mL de DNA deesperma de salmão desnaturado seguido por lavagem (preferivelmente poruma vez de 15 minutos, com maior preferência por duas vezes de 15 minutos,mais preferivelmente por três vezes de 15 minutos) em uma soluçãocompreendendo IxSSC (lx SSC é NaCl 0,15 M mais citrato de sódio0,015 M) e SDS 0,1% na temperatura ambiente - preferivelmente 37°C -quando uma sonda de DNA de preferivelmente cerca de 100 a cerca de 1.000nucleotídeos em comprimento é empregada. As condições de estringênciamédia quando usadas em referência à hibridização de ácido nucleicocompreendem condições equivalentes à ligação ou hibridização a 68°C emuma solução consistindo de 5x SSPE (NaCl 43,8 g/L, NaH2PO4-H2O 6,9 g/L eEDTA 1,85 g/L, pH ajustado para 7,4 com NaOH), SDS 1%, 5x reagente deDenhardtt [50x Denhardfs contém o seguinte por 500 mL: 5 g de Ficoll (Type400, Pharmacia), 5 g de BSA (Fraction V; Sigma)] e 100 μg/mL de DNA deesperma de salmão desnaturado seguido por lavagem (preferivelmente poruma vez de 15 minutos, com maior preferência por duas vezes de 15 minutos,mais preferivelmente por três vezes de 15 minutos) em uma soluçãocompreendendo O5IxSSC (lx SSC é NaCl 0,15 M mais citrato de sódio0,015 M) e SDS 1% na temperatura ambiente ou - preferivelmente 37°C -quando uma sonda de DNA de preferivelmente cerca de 100 a cerca de 1.000nucleotídeos em comprimento é empregada. Condições de estringência altaquando suadas em referência à hibridização de ácido nucleico compreendecondições equivalentes à ligação ou hibridização a 68°C em uma soluçãoconsistindo de 5x SSPE, SDS 1%, 5x reagente de Denhardt de 100 μg/mL deDNA de esperma de salmão desnaturado seguido por lavagem(preferivelmente por uma vez de 15 minutos, com maior preferência por duasvezes de 15 minutos, mais preferivelmente por três vezes de 15 minutos) emuma solução compreendendo 0,lx SSC, e SDS 1% a 68°C, quando uma sondade preferivelmente cerca de 100 a cerca de 1.000 nucleotídeos é empregada.

O termo "equivalente" quando feito em referência a uma condição dehibridização quando se refere a uma condição de hibridização de interessesignifica que a condição de hibridização e a condição de hibridização deinteresse resultam em hibridização de seqüências de ácido nucleico quepossuem a mesma faixa percentual (%) de homologia. Por exemplo, se umacondição de hibridização de interesse resulta em hibridização de uma primeiraseqüência de ácido nucleico com outras seqüências de ácido nucleico quepossuem de 80% a 90% de homologia com a primeira seqüência de ácidonucleico, então a outra condição de hibridização é citada como sendoequivalente à condição de hibridização de interesse se esta outra condição dehibridização também resultar em hibridização da primeira seqüência de ácidonucleico com as outras seqüências de ácido nucleico que possuem de 80% a90% de homologia com a primeira seqüência de ácido nucleico. Quandousada em referência à hibridização de ácido nucleico a arte sabe bem quenumerosas condições equivalentes podem ser empregadas para compreendercondições de estringência quer baixa quer alta; fatores tais como comprimentoe natureza (composição de base, DNA5 RNA) da sonda e natureza do alvo(composição de base, DNA, RNA, presente em solução ou imobilizada, etc.) ea concentração dos sais e outros componentes (e.g., a presença ou ausência deformamida, sulfato de dextrano, poli(etileno-glicol)) são considerados e asolução de hibridização pode ser variada para gerar condições dehibridização de estringência quer baixa quer alta diferentes de, masequivalentes às, condições listadas acima. Aquelas pessoas experientes na artesabem que embora estringências mais altas possam ser preferidas para reduzirou eliminar ligação não específica, estringências menores podem serpreferidas para detectar um número grande de seqüências de ácido nucleicopossuindo homologias diferentes.

"Identidade": o termo "identidade" é uma relação entre duasou mais seqüências de polipeptídeo ou duas ou mais seqüências de moléculade ácido nucleico, conforme determinada por comparação das seqüências. Naarte, "identidade" também significa o grau de relação de seqüências entreseqüências de polipeptídeo ou de molécula de ácido nucleico, conformedeterminada pela combinação entre as fitas de tais seqüências. "Identidade"como aqui usado pode ser medida entre seqüências de ácido nucleico demesmo tipo ribonucleico (tal como entre seqüências de DNA e de DNA) ouentre tipos diferentes (tal como entre seqüências de RNA e de DNA). Deveser entendido que na comparação de uma seqüência de RNA com umaseqüência de DNA, uma seqüência de RNA "idêntica" conteráribonucleotídeos onde a seqüência de DNA contém desoxirribonucleotídeos, eadicionalmente que a seqüência de RNA conterá uma uracila em posiçõesonde a seqüência de DNA contém timidina. No caso de uma identidade sermedida entre seqüências de RNA e de DNA, as bases uracila de seqüências deRNA são consideradas idênticas às bases timidina de seqüências de DNA.

"Identidade" pode ser prontamente calculada por métodos conhecidosincluindo, mas não limitados a, àqueles descritos em ComputationalMolecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York(1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed.,Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, PartI, Griffin, A. M. e Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey (1994);Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press(1987); Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds.,Stockton Press, New York (1991); e Carillo, H., e Lipman, D., SIAM J.Applied Math, 48:1073 (1988). Métodos para determinar a identidade sãoplanejados para darem a combinação mais alta entre as seqüências testadas.

Além disso, métodos para determinar a identidade são codificados emprogramas publicamente disponíveis. Programas de computador que podemser usados para determinar a identidade entre duas seqüências incluem, masnão são limitados a, GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research12(1):387 (1984); conjunto de cinco programas BLAST, três planejados parainquirições de seqüências de nucleotídeos (BLASTN, BLASTX, eTBLASTX) e dois planejados para inquirições de seqüência de proteína(BLASTP e TBLASTN) (Coulson, Trends in Biotechnology, 12:76-80(1994); Birren et al., Genome Analysis, 1:543-559 (1997)). O programaBLASTX está publicamente disponível em NCBI e outras fontes (BLASTManual, Altschul, S., et al., NCBINLM NIH, Bethesda, Md. 20894; Altschul,S., et al, J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990)). O bem conhecido algoritmo deSmith Waterman também pode ser usado para determinar identidade.Parâmetros para comparação de seqüências de polipeptídeo tipicamenteincluem os seguintes:

- Algoritmo: Needleman e Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443-453(1970)

- Matriz de comparação: BLOSUM62 de Hentikoff eHentikoff, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89:10915-10919 (1992)

- Penalidade de lacuna: 12

- Penalidade de comprimento de lacuna: 4

Um programa, que pode ser usado com estes parâmetros, estápublicamente disponível como o programa "gap" de Genetics ComputerGroup, Madison, Wis. Os parâmetros acima juntamente com nenhumapenalidade para lacuna de extremidade são os parâmetros pré-estabelecidospara comparações de peptídeos. Parâmetros para comparação de seqüênciasde molécula de ácido nucleico incluem os seguintes:

- Algoritmo: Needleman e Wunsch, J. Mol. Bio. 48:443-453(1970)

Matriz de combinação: combinações-+10; máscombinações=0

- Penalidade de lacuna: 50

- Penalidade de comprimento de lacuna: 3

Como aqui usado, "identidade % " é determinada usando osparâmetros acima como os parâmetros pré-estabelecidos para comparações deseqüências de moléculas de ácido nucleico e o programa "gap" de GCG,versão 10.2.

Infectar: os termos "infectar" e "infecção" com uma bactériaou vírus referem-se à co-incubação de uma amostra biológica alvo, (e.g.,célula, tecido, etc.) com a bactéria ou o vírus sob condições tais que asseqüências de ácido nucleico contidas dentro da bactéria ou do vírus sãointroduzidas em uma ou mais células da amostra biológica alvo.

Intron: o termo "íntron" como aqui usado refere-se ao sentidonormal do termo com o significado de um segmento de moléculas de ácidonucleico, normalmente DNA, que não codificam parte de uma ou de toda umaproteína expressada, e que, em condições endógenas, é transcrito emmoléculas de RNA, mas que é removido por editoração do RNA endógenoantes de o RNA ser traduzido em uma proteína. A editoração, i.e. remoção deíntron, ocorre em um sítio de editoração definido, e.g., tipicamente pelomenos cerca de 4 nucleotídeos, entre cDNA e a seqüência de íntron. Porexemplo, sem limitação, os segmentos de íntron de senso e de anti-senso aquiilustrados, que formam um RNA de fita dupla não continham sítios deeditoração.

Isogênico: organismos (e.g., plantas), que são geneticamenteidênticos, exceto aqueles que podem diferir pela presença ou ausência de umaseqüência de DNA heteróloga.

Isolado: o termo "isolado" como aqui usado significa que ummaterial tem sido removido pela mão de homem e existe à parte de seuambiente original, nativo e portanto não é um produto de natureza. Ummaterial isolado ou uma molécula isolada (tal como uma molécula de DNAou enzima) pode existir em uma forma purificada ou pode existir em umambiente não nativo tal como, por exemplo, em uma célula hospedeiratransgênica. Por exemplo, um polipeptídeo ou polinucleotídeo naturalmenteocorrente presente em um animal vivo não está isolado, mas o mesmopolipeptídeo ou polinucleotídeo, separado de alguns ou de todos os materiaiscoexistentes no sistema natural, está isolado. Tais polinucleotídeos podem serparte de um vetor e/ou tais polinucleotídeos ou polipeptídeos poderiam serparte de uma composição, e seriam isolados pelo fato de que um tal vetor ouuma tal composição não é parte de seu ambiente original. Preferivelmente, otermo "isolado" quando usado em relação a um ácido nucleico, como em uma"seqüência de ácido nucleico isolada" refere-se a uma seqüência de ácidonucleico que é identificada e separada de pelo menos um ácido nucleicocontaminante com o qual ela está ordinariamente associada em sua fontenatural. Ácido nucleico isolado é ácido nucleico presente em uma forma ouambiente que é diferente daquela na qual ele é encontrado na natureza. Emcontraste, ácidos nucleicos não isolados são ácidos nucleicos tais como DNÁe RNA, que são encontrados no estado que existem na natureza. Por exemplo,uma dada seqüência de DNA (e.g., um gene) é encontrada no cromossomo dacélula hospedeira em proximidade dos genes vizinhos; seqüências de RNA,tal como seqüência de mRNA específica codificadora de uma proteínaespecífica, são encontradas na célula como uma mistura com numerososoutros mRNAs, que codificam uma multitude de proteínas. Contudo, umaseqüência de ácido nucleico isolada compreendendo por exemplo SEQ IDNO: 1 inclui, por meio de exemplo, tais seqüências de ácido nucleico emcélulas que ordinariamente contêm SEQ ID NO: 1 onde a seqüência de ácidonucleico está em uma localização cromossômica ou extracromossômicadiferente daquela das células naturais, ou está diferentemente flanqueada poruma seqüência de ácido nucleico diferente daquela encontrada na natureza. Aseqüência de ácido nucleico isolada pode estar presente na forma de fita únicaou de fita dupla. Quando uma seqüência de ácido nucleico isolada for para serutilizada para expressar uma proteína, a seqüência de ácido nucleico conteráum mínimo de pelo menos uma porção de fita de senso ou codificadora (i.e., aseqüência de ácido nucleico pode ser de fita única). Alternativamente, podeconter ambas as fitas de senso e de anti-senso (i.e., a seqüência de ácidonucleico pode ser de fita dupla).

Mamífero: o termo "mamífero" é intencionado para incluir seusignificado normal. Embora a invenção seja mais desejavelmenteintencionada para eficácia em humanos, também pode ser empregada emmamíferos domésticos tais como caninos, felinos, e eqüinos, bem como emmamíferos de interesse particular, e.g., animais de zoológico, animais defazenda e semelhante.Proteína madura: proteína que é normalmente selecionada parauma organela celular, tal como um cloroplasto, e da qual o peptídeo detrânsito tem sido removido.

Promotor mínimo: elementos de promotor, particularmente umelemento TATA, que estão inativos ou que possuem atividade de promotorelevadamente reduzida na ausência de ativação a montante. Na presença deum fator de transcrição adequado, o promotor mínimo funciona para permitira transcrição.

Não-codificadoras: o termo "não-codificadoras" refere-se àsseqüências de moléculas de ácido nucleico que não codificam parte de uma outoda uma proteína expressada. Seqüências não-codificadoras incluem mas nãosão limitadas a íntrons, regiões de promotor, regiões não traduzidas 3', eregiões não traduzidas 5'.

Ácidos nucleicos e nucleotídeos: os termos "ácidos nucleicos"e "nucleotídeos" referem-se aos ácidos nucleicos ou nucleotídeosnaturalmente ocorrentes ou sintéticos ou naturais. Os termos "ácidosnucleicos" e "nucleotídeos compreendem desoxirribonucleotídeos ouribonucleotídeos ou qualquer análogo de nucleotídeo e polímeros ou híbridosdos mesmos na forma de fita quer única quer dupla, quer de senso quer deanti-senso. A não ser que seja indicado de outro modo, uma seqüência deácido nucleico particular também implicitamente inclui suas variantesconservativamente modificadas (e.g., substituições de códon degenerado) eseqüências complementares, bem como a seqüência explicitamente indicada.O termo "ácido nucleico" é usado aqui intercambiavelmente com "gene","cDNA, "mRNA", "oligonucleotídeo," e "polinucleotídeo". Análogos denucleotídeo incluem nucleotídeos possuindo modificações na estruturaquímica da base, do açúcar e/ou fosfato, incluindo, mas não limitada a,modificações de pirimidina de posição-5, modificações de purina de posição-8, modificações em aminas exocíclicas de citosina, substituição de 5-bromo-uracila, e semelhante; e modificações de açúcar de posição-2', incluindo masnão limitadas a, ribonucleotídeos açúcar-modificados nos quais o 2'-OH estásubstituído por um grupo selecionado de H, OR, R, halo, SH, SR, NH2, NHR,NR2, ou CN. shRNAs também podem compreender elementos não-naturaistais como bases não-naturais, e.g., ionosina e xantina, açúcares não-naturais,e.g., 2'-metóxi-ribose, ou ligações fosfodiéster não-naturais, e.g.,metilfosfonatos, fosforotioatos e peptídeos.

Seqüência de ácido nucleico: a frase "seqüência de ácidonucleico" refere-se a um polímero de fita única ou de fita dupla de bases dedesoxirribonucleotídeo ou de ribonucleotídeo lidas da extremidade-5' para aextremidade-3'. Inclui DNA cromossômico, plasmídeos de auto-replicação,polímeros infecciosos de DNA ou RNA e DNA ou RNA que desempenhamum papel primariamente estrutural. "Seqüência de ácido nucleico" também serefere a uma lista constitutiva de abreviações, letras, caracteres ou palavras,que representam nucleotídeos. Em uma modalidade, um ácido nucleico podeser uma "sonda" que é um ácido nucleico relativamente curto, normalmentemenor do que 100 nucleotídeos em comprimento. Muitas vezes uma sonda deácido nucleico é de cerca de 50 nucleotídeos em comprimento a cerca de 10nucleotídeos em comprimento. Uma "região alvo" de um ácido nucleico éuma porção de um ácido nucleico que é identificada para ser de interesse.Uma "região codificadora" de um ácido nucleico é a porção do ácidonucleico, que é transcrita e traduzida em uma maneira seqüência-específicapara produzir uma proteína ou em um polipeptídeo particular quando postasob o controle de seqüências regulatórias apropriadas. É citado que a regiãocodificadora codifica uma tal proteína ou um tal polipeptídeo.

Seqüência de nucleotídeos de interesse: o termo "seqüência denucleotídeos d interesse" refere-se a qualquer seqüência de nucleotídeos, cujamanipulação pode ser considerada desejável por qualquer razão (e.g., conferirqualidades melhoradas), por uma pessoa ordinariamente experiente na arte.Tais seqüências de nucleotídeos incluem, mas não são limitadas a, seqüênciascodificadores de genes estruturais (e.g., genes repórter, genes marcadores deseleção, genes de resistência à droga, fatores de crescimento, etc.), eseqüências regulatórias não-codificadoras que não codificam um mRNA ouproduto proteína, (e.g., seqüência de promotor, seqüência de poliadenilação,seqüência de terminação, seqüência de intensificador, etc.). Uma seqüência deácido nucleico de interesse pode preferivelmente codificar uma feiçãoagronomicamente valiosa.

Oligonucleotídeo: o termo "oligonucleotídeo" refere-se a umoligômero ou polímero de ácido ribonucleico (RNA) ou ácidodesoxirribonucleico (DNA) ou seus miméticos, bem como oligonucleotídeospossuindo porções naturalmente ocorrentes que funcionam de modo similar.Tais oligonucleotídeos modificados ou substituídos são muitas vezes referidossobre formas nativas por causa de propriedades desejáveis tais como, porexemplo, captação celular intensificada, afinidade intensificada por alvo deácido nucleico e estabilidade aumentada na presença de nucleases. Umoligonucleotídeo preferivelmente inclui dois ou mais nucleomonômeroscovalentemente copulados uns nos outros por ligações (e.g., fosfodiésteres) ouligações substitutas.

Ligação operável: o termo "ligação operável" ou"operavelmente ligado" é para ser entendido como significando, por exemplo,o arranjo seqüencial de um elemento regulatório (e.g. um promotor) com umaseqüência de ácido nucleico a ser expressada e, se apropriados, outroselementos regulatórios (tais como e.g., um terminador) em um tal modo quecada um dos elementos regulatórios pode atender à sua função intencionadapara permitir, modificar, facilitar ou diferentemente influenciar a expressão decitada seqüência de ácido nucleico. A expressão pode resultar dependendo doarranjo das seqüências de ácido nucleico em relação ao RNA de senso ou deanti-senso. Para este fim, ligação direta no sentido químico não énecessariamente requerida. Seqüências de controle genético tais como, porexemplo, seqüências de intensificador, também podem exercer sua funçãosobre a seqüência alvo das posições que estão mais afastadas, ou de fatooutras moléculas de DNA. Arranjos preferidos são aqueles nos quais aseqüência de ácido nucleico a ser expressada recombinantemente éposicionada atrás da seqüência atuando como promotor, de modo que as duasseqüências sejam ligadas covalentemente uma na outra. A distância entre aseqüência de promotor e a seqüência de ácido nucleico a ser expressadarecombinantemente é preferivelmente menor do que 200 pares de bases,especialmente menor do que 100 pares de bases, muito especialmentepreferivelmente menor do que 50 pares de base. Em uma modalidadepreferida, a seqüência de ácido nucleico a ser transcrita está localizada atrásdo promotor em uma tal maneira que o início da transcrição é idêntico aocomeço desejado do RNA quimérico da invenção. Ligação operável, e umconstruto de expressão, podem ser gerados por meio de técnicas de clonageme recombinação costumeiras (e.g., em Maniatis T, Fritsch EF e Sambrook J(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ndEd., Cold Spring HarborLaboratory, Cold Spring Harbor (NY); Silhavy et al. (1984) Experiments withGene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY);Ausubel et al. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, GreenePublishing Assoc. and Wiley Interscience; Gelvin et al. (Eds) (1990) PlantMolecular Biology Manual; Kluwer Academic Publisher, Dordrecht, PaísesBaixos). Contudo, outras seqüências que, por exemplo, atuam como um linkercom sítios de clivagem específicos para enzimas de restrição, ou como umpeptídeo de sinal, também podem estar posicionados entre as duas seqüências.Preferivelmente, o construto de expressão, consistindo de uma ligação depromotor e seqüência de ácido nucleico a ser expressada, pode existir em umaforma integrada em vetor e ser inserido em um genoma de planta, porexemplo, por transformação.Órgão: o termo "órgão" com respeito a uma planta (ou "órgãode planta") significa partes de uma planta e pode incluir (mas não deve serlimitado a) por exemplo raízes, frutos, brotos, caule, folhas, anteras, sépalas,pétalas, pólen, sementes, etc. O termo "órgão" com respeito a um animal("órgão de animal") significa partes de um animal e pode incluir (mas nãodeve ser limitado a) órgãos externos (tais como braços, pernas, cabeça, etc.)ou órgãos internos (tais como coração, rim, fígado, estômago, etc.).

Projeção: uma "projeção" é uma seqüência de nucleotídeos defita única relativamente curta sobre a extremidade 5'- ou 3'-hidroxila de umamolécula de oligonucleotídeo de fita dupla (também referida como uma"extensão", "extremidade protuberante", ou "extremidade pegajosa").

Planta: os termos "planta" ou "organismo de planta" referem-se a qualquer organismo, que é capaz de fotossíntese, e às células, tecidos,partes ou material de propagação (tais como sementes ou frutos) derivados damesma. Incluídos dentro do escopo da invenção estão todos os gêneros eespécies de plantas superiores e inferiores do Reino Vegetal. Plantas anuais,perenes, monocotiledôneas e dicotiledôneas e gimnospermas são preferidas.Uma "planta" refere-se a qualquer planta ou parte e uma planta em qualquerestágio de desenvolvimento. Plantas maduras referem-se às plantas emqualquer estágio de desenvolvimento além do estágio de muda. São incluídasplanta madura, semente, brotos e mudas, e partes, material de propagação (porexemplo tubérculos, sementes ou frutos) e culturas, por exemplo culturas decélula ou culturas de calo) derivados da mesma. Muda refere-se a uma plantajovem, imatura em um estágio de desenvolvimento inicial. Também sãoincluídas podas, culturas de célula ou de tecido e sementes. Como usadoconjuntamente com a presente invenção, o termo "tecido de planta" inclui,mas não é limitado a, plantas inteiras, células de planta, órgãos de planta,sementes de planta, protoplastos, calo, culturas de célula, e quaisquer gruposde células de planta organizados em unidades estruturais e/ou funcionais.Preferivelmente, o termo "planta" como aqui usado refere-se a umapluralidade de células de planta, que estão grandemente diferenciadas em umaestrutura que está presente em qualquer estágio de um desenvolvimento deplanta. Tais estruturas incluem um ou mais órgãos de planta incluindo, masnão são limitados a, fruto, broto, caule, folha, flor, pétala, etc. Maispreferivelmente, o termo "planta" inclui plantas inteiras, estruturas / órgãosvegetativos de broto (e.g. folhas, caules e tubérculos), raízes, flores eestruturas / órgãos florais (e.g. brácteas, sépalas, pétalas, estames, carpelos,anteras e óvulos), sementes (incluindo embrião, endosperma, e capa desemente) e frutos (o ovário maduro), tecidos de planta (e.g. tecido vascular,tecido moído, e semelhante) e células (e.g. células guarda, células de ovo,tricomas e semelhante), e progênie da mesma. A classe de plantas que podeser usada no método da invenção é geralmente tão ampla quanto a classe deplantas inferiores e superiores suscetíveis às técnicas de transformação,incluindo angiospermas (plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas),gimnospermas, samambaias, e algas multicelulares. Inclui plantas de umavariedade de níveis de ploidia, incluindo aneuploidia, poliploidia, diploidia,haploidia e hemizigoto. Estão incluídos dentro do escopo da invenção todosos gêneros e espécies de plantas inferiores e superiores do reino vegetal. Estãoincluídas em adição as plantas maduras, sementes, brotos e mudas, e partes,material de propagação (por exemplo sementes e fruto) e culturas, porexemplo culturas de célula, derivados da mesma. São preferidas as plantas eos materiais de planta das seguintes famílias de planta: Amaranthaceae,Brassicaceae, Carophyllaceae, Chenopodiaceae, Compositae, Cucurbitaceae,Labiatae, Leguminosae, Papilionoideae, Liliaceae, Linaceae, Malvaceae,Rosaceae, Saxifragaceae, Scrophulariaceae, Solanaeeae, Tetragoniaceae.Plantas anuais, perenes, monocotiledôneas e dicotiledôneas são organismoshospedeiros preferidos para a geração de plantas transgênicas. O uso dosistema de recombinação, ou do método de acordo com a invenção éadicionalmente vantajoso em todas as plantas ornamentais, sivicultura,árvores frutíferas, ou árvores ornamentais, flores, flores podadas, arbustos outurfa. A citada planta pode incluir - mas não deve ser limitada a - briófitos taiscomo, por exemplo, Hepaticae (hepáticas) e Musci (musgos); pteridófitas taiscomo samambaias, rabo de cavalo e licopódios; gimnospermas tais comoconíferas, cicadáceas, ginkgo e Gnetaeae; algas tais como Chlorophyceae,Phaeophpyceae, Rhodophyceae, Myxophyceae, Xanthophyceae,Bacillariophyceae (diatomáceas) e Euglenophyeeae. Plantas para ospropósitos da invenção podem compreender as famílias de Rosaceae tal comorosa, Ericaceae tais como rododendros e azaléas, Euphorbiaceae tais comopoinsetias e cróton, Caryophyllaceae tais como craveiros, Solanaceae taiscomo petúnias, Gesneriaeeae tal como violeta africana, Balsaminaceae talcomo não-me-toques, Orehidaeeae tais como orquídeas, Iridaceae tais comogladíolos, íris, frésia e croco, Compositae tal como tagetes, Geraniaceae talcomo gerânio, Liliaeeae tal como Draehaena, Moraceae tal como ficus,Araceae tal como filodendro e muitas outras. As plantas transgênicas deacordo com a invenção são adicionalmente selecionadas em particular dentreplantas de colheita de dicotiledôneas tais como, por exemplo, das famíliasLeguminosae tais como ervilha, alfafa e feijão-soja; da família Umbelliferae,particularmente do gênero Daueus (muito particularmente a espécie carota(cenoura)) e Apium (muito particularmente a espécie graveolens var. dulce(aipo)) emuitas outras; da família Solanaceae, particularmente do gêneroLyeopersicon, muito particularmente a espécie eseulentum (tomateiro) e dogênero Solanum, muito particularmente a espécie tuberosum (batateira) emelongena (aubergine), tobaco e muitas outras; e do gênero Capsieum, muitoparticularmente a espécie annum (pimenta) e muitas outras; da famíliaLeguminosae, particularmente do gênero Glycine, muito particularmente aespécie max (feijão-soja) e muitas outras; e da família Cruciferae,particularmente do gênero Brassiea, muito particularmente a espécie napus(colza), campestris (beterraba), oleracea cv Tastie (repolho), oleracea cvSnowball Y (couve-flor) e oleracea cv Emperor (brócolis); e do gêneroArabidopsis, muito particularmente a espécie thaliana e muitas outras; dafamília Compositae, particularmente do gênero Lactuca, muitoparticularmente a espécie sativa (alface) e muitas outras. As plantastransgênicas de acordo com a invenção são selecionadas em particular dentreplantas de colheita de monocotiledôneas, tais como, por exemplo, cereais taiscomo trigo, cevada, sorgo, e milhete, centeio, triticale, milho, arroz ou aveia ecana-de-açúcar. Adicionalmente preferidas são as árvores tais como macieira,pereira, marmeleiro, ameixeira, cerejeira, pessegueiro, nectarina,damasqueiro, mamoeiro-papaya, mangueirão, e outras espécies lenhosasincluindo árvores coníferas e decíduas tais como álamo, pinheiro, sequóia,cedro, carvalho, etc. São especialmente preferidas Arabidopsis thaliana,Nicotiana tabacum, colza, feijão-soja, milho (maize), trigo, linho, batateira etagetes.

Construto de polinucleotídeo: o termo "construto depolinucleotídeo" refere-se a um ácido nucleico pelo menos parcialmentecriado por métodos recombinantes. O termo "construto de DNA" refere-se aum construto de polinucleotídeo consistindo de desoxirribonucleotídeos. Oconstruto pode ser de fita única ou - preferivelmente - de fita dupla. Oconstruto pode ser circular ou linear. O técnico experiente está familiarizadocom uma variedade de modos para obter um construto de DNA. Construtospodem ser preparados por meio de técnica de clonagem e de recombinaçãocostumeiras como são descritas, por exemplo, em Maniatis T, Fritsch EF eSambrook J (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., ColdSpring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY); Silhavy et al. (1984)Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold SpringHarbor (NY); Ausubel et al. (1987) Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience; Gelvin et al. (Eds) (1990)Plant Molecular Biology Manual; Kluwer Academic Pub-lisher, Dordrecht,The Netherlands.

Polipeptídeo: os termos "polipeptídeo", "peptídeo","oligopeptídeo", "polipeptídeo", "produto de gene", "produto de expressão" e"proteína" são aqui usado intercambiavelmente para se referirem a umpolímero ou oligômero de resíduos de aminoácido consecutivos.

Pré-proteína: proteína, que é normalmente selecionada parauma organela celular, tal como cloroplasto, e ainda compreendendo seupeptídeo de trânsito.

Promotor: os termos "promotor", "elemento de promotor," ou"seqüência de promotor" são equivalentes e como aqui usados, referem-se auma seqüência de DNA que quando ligada em uma seqüência de nucleotídeosde interesse é capaz de controlar a transcrição da seqüência de nucleotídeos deinteresse em mRNA. Um promotor está tipicamente, embora nãonecessariamente, localizado 5' (i.e., a montante) de uma seqüência denucleotídeos de interesse (e.g., próxima do sítio de iniciação de transcrição deum gene estrutural) cuja transcrição em mRNA ele controla, e proporcionaum sítio para ligação específica por RNA polimerase e outros fatores detranscrição para iniciação de transcrição. Uma seqüência de polinucleotídeoserá "heteróloga a" um organismo ou uma segunda seqüência depolinucleotídeo se ela se originar de uma espécie estranha, ou, se da mesmaespécie, estiver modificada de sua forma original. Por exemplo, um promotoroperavelmente ligado em uma seqüência codificadora heteróloga refere-se auma seqüência codificadora de uma espécie diferente daquela da qual opromotor foi derivado, ou, se da mesma espécie, uma seqüência codificadoraque não está naturalmente associada com o promotor (e.g. uma seqüênciacodificadora geneticamente engenhada ou um alelo de um ecótipo ouvariedade diferente). Promotores adequados podem ser derivados de genes decélulas hospedeiras onde expressão deve ocorrer ou dos patógenos para estascélulas hospedeiras (e.g., plantas ou patógenos de planta como vírus deplanta). Se um promotor for um promotor induzível, então a velocidade detranscrição aumentará em resposta a um agente indutor. Em contraste, avelocidade de transcrição não será regulada por um agente indutor se opromotor for um promotor constitutivo. Também, o promotor pode serregulado em uma maneira preferida de tecido ou específica para tecido de talmodo que ele seja apenas ativo em transcrição da região codificadoraassociada em um tipo(s) de tecido específico tais como folhas, raízes oumeristema. O termo "específico para tecido" como se aplica a um promotorrefere-se a um promotor que é capaz de dirigir a expressão seletiva de umaseqüência de nucleotídeos de interesse em um tipo específico de tecido (e.g.,pétalas) na ausência relativa de expressão da mesma seqüência denucleotídeos de interesse em um tipo de tecido diferente (e.g., raízes).Especificidade para tecido de um promotor pode ser avaliada, por exemplo,por ligação operável de um gene repórter na seqüência de promotor de umaplanta de tal modo que o construto repórter seja integrado em cada tecido daplanta transgênica resultante, e por detecção da expressão do gene repórter(e.g., detecção de mRNA, proteína, ou da atividade de uma proteínacodificada pelo gene repórter) em tecidos diferentes da planta transgênica. Adetecção de um nível maior de expressão do gene repórter em um ou maistecidos em relação ao nível de expressão do gene repórter em outros tecidosmostra que o promotor é específico para os tecidos nos quais níveis maioresde expressão são detectados. O termo "específico para tipo de célula" comoaplicado a um promotor refere-se a um promotor, que é capaz de dirigir aexpressão seletiva de uma seqüência de nucleotídeos de interesse em um tipoespecífico de célula na ausência relativa de expressão de mesma seqüência denucleotídeos de interesse em um tipo de célula diferente dentro do mesmotecido. O termo "específico para tipo de célula" quando aplicado a umpromotor também significa um promotor capaz de promover expressãoseletiva de uma seqüência de nucleotídeos de interesse em uma região dentrode um tecido único. Especificidade para tipo de célula de um promotor podeser avaliada usando métodos bem conhecidos na arte, e.g., coloração deatividade de GUS ou coloração imuno-histoquímica. O termo "constitutivo"quando feito em referência a um promotor significa que o promotor é capazde dirigir a transcrição de uma seqüência de ácido nucleico operavelmenteligada na ausência de um estímulo (e.g., choque térmico, agentes químicos,luz, etc.). Tipicamente, promotores constitutivos são capazes de dirigir aexpressão de um transgene em substancialmente qualquer célula e qualquertecido. Em contraste, um promotor "regulável" é um que é capaz de dirigirum nível de transcrição de uma seqüência de ácido nucleico operavelmenteligada na presença de um estímulo (e.g., choque térmico, agentes químicos,luz, etc.) que é diferente do nível de transcrição da seqüência de ácidonucleico operavelmente ligada na ausência do estímulo.

Purificado: como aqui usado, o termo "purificado" refere-se àsmoléculas, quer seqüências de ácido nucleico quer seqüências de aminoácidosque estão removidas de seu ambiente natural, isoladas ou separadas.Moléculas "substancialmente purificadas" estão pelo menos 60% livres,preferivelmente pelo menos 75% livres, e com maior preferência pelo menos90% livres de outros componentes com os quais elas estão naturalmenteassociadas. Uma seqüência de ácido nucleico purificada pode ser umaseqüência de ácido nucleico isolada.

Recombinante: o termo "recombinante" com respeito aospolipeptídeos ou às proteínas produzidas por técnicas de DNA recombinante ,i.e., produzidos de células transformadas por um construto de DNArecombinante exógeno codificador do polipeptídeo ou da proteína desejada.Polipeptídeo e ácidos nucleicos recombinantes também podem compreendermoléculas, que como tasi não existem na natureza mas estão modificadas,mudadas, mutadas ou diferentemente manipuladas pelo homem.Preferivelmente, um "polipeptídeo recombinante" é um polipeptídeo nãonaturalmente ocorrente que difere em seqüência de um polipeptídeonaturalmente ocorrente em pelo menos um resíduo de aminoácido. Métodospreferidos para produzir o citado ácido nucleico e/ou polipeptídeorecombinante compreendem mutagênese dirigida ou não dirigida, rearranjo deDNA ou outros métodos de recombinação recursiva.

Senso: o termo "senso" é entendido para significar um ácidonucleico possuindo uma seqüência que é homóloga ou idêntica a umaseqüência alvo, por exemplo uma seqüência que liga em um fator detranscrição de proteína e que está envolvida na expressão de um dado gene.De acordo com uma modalidade preferida, o ácido nucleico compreende umgene-de-interesse e elementos possuindo a expressão de citado gene-de-interesse.

Aumento significativo ou diminuição significativa: umaumento ou uma diminuição, por exemplo em atividade enzimática ou emexpressão de gene, que é maior do que a margem de erro inerente à técnica demedição, preferivelmente um aumento ou uma diminuição em cerca de 2vezes ou mais da atividade da expressão ou enzima de controle na célula decontrole, com maior preferência um aumento ou uma diminuição de cerca de5 vezes ou mais, e mais preferivelmente um aumento ou uma diminuição emcerca de 10 vezes ou mais.

Estabilizar: "estabilizar" a expressão de uma seqüência denucleotídeos em uma célula de planta significa que o nível de expressão daseqüência de nucleotídeos após aplicação de um método da presente invençãoé aproximadamente o mesmo em células de mesmo tecido em plantasdiferentes de mesma geração ou em todas as gerações múltiplas quando asplantas são crescidas sob condições iguais ou comparáveis.

Substancialmente complementar: em seu sentido mais amplo,o termo "substancialmente complementar", quando aqui usado com respeito auma seqüência de nucleotídeos em relação a uma seqüência de nucleotídeosde referência ou alvo, significa uma seqüência de nucleotídeos possuindo umapercentagem de identidade entre a seqüência de nucleotídeossubstancialmente complementar e a seqüência complementar exata de citadaseqüência de nucleotídeos de referência ou alvo de pelo menos 60%, maisdesejavelmente de pelo menos 70%, mais desejavelmente de pelo menos 80%ou 85%, preferivelmente de pelo menos 90%, com maior preferência de pelomenos 93%, ainda com maior preferência de pelo menos 95% ou 96%, aindacom maior preferência de pelo menos 97% ou 98%, ainda com maiorpreferência de pelo menos 99% ou mais preferivelmente 100% (o últimosendo equivalente ao termo "idêntico" neste contexto). Preferivelmenteidentidade é avaliada sobre um comprimento de pelo menos 19 nucleotídeos,preferivelmente pelo menos 50 nucleotídeos, mais preferivelmente ocomprimento inteiro da seqüência de ácido nucleico em relação à seqüênciade referência (se não especificado de outro modo abaixo). Comparações deseqüências são realizadas usando a análise pré-estabelecida GAP comUniversity of Wisconsin GCG, SEQWEB application of GAP, baseado noalgoritmo de Needleman e Wunsch (Needleman e Wunsch (1970) J Mol.Biol. 48: 443-453; como definido acima). Uma seqüência de nucleotídeos"substancialmente complementar" a uma seqüência de nucleotídeos dereferência hibridiza na seqüência de nucleotídeos de referência sob condiçõesde estringência baixa, preferivelmente condições de estringência média, maispreferivelmente condições de estringência alta (como definidas acima).

Substancialmente idêntico: em seu sentido amplo, o termo"substancialmente idêntico", quando aqui usado com respeito a umaseqüência de nucleotídeos, significa uma seqüência de nucleotídeoscorrespondendo a uma seqüência de nucleotídeos de referência ou alvo, naqual a percentagem de identidade entre a seqüência de nucleotídeossubstancialmente idêntica e a seqüência de nucleotídeos de referência ou alvoé desejavelmente de pelo menos 60%, mais desejavelmente pelo menos 70%,mais desejavelmente pelo menos 80% ou 85%, preferivelmente pelo menos90%, com maior preferência pelo menos 93%, ainda com maior preferênciapelo menos 95% ou 96%, ainda com maior preferência pelo menos 97% ou98%, ainda com maior preferência pelo menos 99% ou mais preferivelmente100% (o último sendo equivalente ao termo "idêntico" neste contexto).Preferivelmente identidade é avaliada sobre um comprimento de pelo menos19 nucleotídeos, preferivelmente pelo menos 50 nucleotídeos, maispreferivelmente o comprimento inteiro de seqüência de ácido nucleico emrelação à citada seqüência de referência (se não especificado de outro modoabaixo). Comparações de seqüências são realizadas usando a análise pré-estabelecida GAP com a University of Wisconsin GCG, SEQWEBapplication of GAP, baseada no algoritmo de Needleman e Wunsch(Needleman e Wunsch (1970) J Mol. Biol. 48: 443-453; como definidoacima). Uma seqüência de nucleotídeos "substancialmente idêntica" a umaseqüência de nucleotídeos de referência hibridiza na seqüência complementarexata da seqüência de nucleotídeos de referência (i.e. sua fita correspondenteem uma molécula de fita dupla) condições de estringência baixa,preferivelmente condições de estringência média, mais preferivelmentecondições de estringência alta (como definidas acima). Homólogos de umaseqüência de nucleotídeos específica incluem seqüências de nucleotídeos quecodificam uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 24% idêntica,com maior preferência de pelo menos 35% idêntica, ainda com maiorpreferência de pelo menos 50% idêntica, ainda com maior preferência de pelomenos 65% idêntica à seqüência de aminoácidos de referência, conformemedida usando os parâmetros descritos acima, na qual a seqüência deaminoácidos codificada pelo homólogo possui a mesma atividade biológicaque a proteína codificada pelo nucleotídeo específico. O termo"substancialmente idêntico", quando aqui usado com respeito a umpolipeptídeo, significa uma proteína correspondendo a um polipeptídeo dereferência, na qual o polipeptídeo possui substancialmente as mesmasestrutura e função que as da proteína de referência, e.g. onde ocorrem apenasmudanças em seqüência de aminoácidos não afetando a função depolipeptídeo. Quando usada para um polipeptídeo ou uma seqüência deaminoácidos a percentagem de identidade entre seqüência de aminoácidos oude polipeptídeo substancialmente similar e de referência desejavelmente épelo menos 24%, mais desejavelmente pelo menos 30%, mais desejavelmentepelo menos 45%, preferivelmente pelo menos 60%, com maior preferência depelo menos 75%, ainda com maior preferência de pelo menos 90%, ainda commaior preferência de pelo menos 95%, ainda com maior preferência de pelomenos 99%, usando parâmetros de análise GAP pré-estabelecidos comodescritos acima. Homólogos são seqüências de aminoácidos que são pelomenos 24% idênticas, com maior preferência de pelo menos 35% idênticas,ainda com maior preferência de pelo menos 50% idênticas, ainda com maiorpreferência de pelo menos 65% idênticas à seqüência de aminoácidos ou depolipeptídeo de referência, conforme medido usando parâmetros descritosacima, na qual a seqüência de aminoácidos codificada pelo homólogo possui amesma atividade biológica que a do polipeptídeo de referência.

Sintético: como aqui usado, "sintético" significa feitototalmente por meio químico, e.g. por intermédio de anelamento deoligonucleotídeos complementares quimicamente sintetizados em vez de pormeios biológicos, e.g. por amplificação de um molde quimicamentesintetizado usando a reação em cadeia de polimerase (PCR) ou outras reaçõesbiológicas mediadas por enzima tal como ligação ou fosforilação. Emmodalidades preferidas, os oligonucleotídeos são sintetizados usandomáquinas de síntese de oligonucleotídeo comerciais, incluindo mas nãolimitadas aos Sintetizadores ABI 394 e ABI 3900 DNA/RNA disponíveis naApplied Biosystems, Inc. ou outros sintetizadores comercialmenteequivalentes.

Gene alvo: os termos "alvo", "gene alvo" e "seqüência denucleotídeos alvo" são usados equivalentemente. Como aqui usado, um genealvo pode ser qualquer gene-de-interesse presente em um organismoeucariótico (tal como uma planta). Um gene alvo pode ser endógeno ouintroduzido. Por exemplo, um gene alvo é um gene de função conhecida ou éum gene cuja função é desconhecida, mas cuja seqüência de nucleotídeos totalou parcial é conhecida. Alternativamente, a função de um gene alvo e suaseqüência de nucleotídeos são ambas desconhecidas. Um gene alvo é um genenativo da célula eucariótica ou é um gene heterólogo que tem sidopreviamente introduzido na célula eucariótica ou em uma célula parental decitada célula eucariótica, por exemplo por transformação genética. Um genealvo heterólogo é estavelmente integrado no genoma da célula eucariótica ouestá presente na célula eucariótica como uma molécula extracromossômica,e.g. como uma molécula extracromossômica autonomamente replicante. Umgene alvo pode incluir polinucleotídeos compreendendo uma região quecodifica uma região de polipeptídeo ou de polinucleotídeo que regulareplicação, transcrição, tradução, ou outro processo importante na expressãoda proteína alvo. ou um polinucleotídeo compreendendo uma região quecodifica o polipeptídeo alvo e uma região que regula expressão dopolipeptídeo alvo; ou regiões não codificadoras tais como 5' ou 3' UTR ouíntrons. Um gene alvo pode se referir, por exemplo, a uma molécula demRNA produzida por transcrição de um gene-de-interesse. Ainda mais, otermo "corresponde", como em "um RNA quimérico compreendendo umaseqüência que corresponde a uma seqüência de gene alvo", significa que asduas seqüências são complementares ou homólogas ou possuem tal outrarelação biologicamente racional entre elas (e.g., baseado na seqüência denucleomonômeros e suas propriedades de pareamento de bases). O "genealvo" ao qual uma molécula de RNA quimérica da invenção é direcionadapode estar associado com uma condição patológica. Por exemplo, o gene podeser um gene associado a patógeno, e.g., um gene viral, um gene associado atumor, um gene defectivo (e.g., um gene anormal causador de câncer), ou umgene associado a uma doença autoimune. O gene alvo também pode ser umgene heterólogo expressado em uma célula recombinante ou um organismogeneticamente alterado. Pela determinação ou modulação (e.g., inibição) dafunção de um tal gene, informação valiosa e benefícios terapêuticos emmedicina, medicina veterinária, e biologia podem ser obtidos.

Tecido: o termo "tecido" com respeito a um organismo (e.g.,uma planta; "tecido de planta") significa arranjo de células múltiplasincluindo tecidos de organismo diferenciados e não diferenciados. Tecidospodem constituir parte de um órgão (e.g., a epiderme de uma folha de plantaou uma pele de animal) mas também pode constituir tecidos de tumor (e.g.,tecido de calo) e vários tipos de células em cultura (e.g., células individuais,protoplastos, embriões, caules, corpos semelhantes a protocormo, etc.). Otecido pode estar in vivo (e.g, in planta), em cultura de órgão, cultura detecido, ou cultura de célula.

Transformação: o termo "transformação" como aqui usadorefere-se à introdução de material genético (e.g., um transgene ou moléculasde ácido nucleico heterólogas) em uma célula, um tecido ou organismo.Transformação de uma célula pode ser estável ou transiente. O termo"transformação transiente" ou "transientemente transformado" refere-se àintrodução de um ou mais transgenes em uma célula na ausência deintegração do transgene para dentro do genoma da célula hospedeira. Atransformação transiente pode ser detectada, por exemplo, por ensaioimunoabsorvente ligado à enzima (ELISA), que detecta a presença de umpolipeptídeo codificado por um ou mais dos. Alternativamente, transformaçãotransiente pode ser detectada pela detecção da atividade da proteína (e.g., β-glicuronidase) codificada pelo transgene (e.g., o gene uid A). O termo"transformante transiente" refere-se a uma célula que possui transientementeincorporados um ou mais transgenes. Em contraste, o termo "transformaçãoestável" ou "estavelmente transformado" refere-se à introdução e à integraçãode um ou mais transgenes no genoma de uma célula, preferivelmenteresultando em integração cromossômica e hereditariedade estável porintermédio de meiose. Transformação estável de uma célula pode serdetectada por hibridização de Southern blot de DNA genômico da célula comseqüências de ácido nucleico, que são capazes de ligar em um ou mais dostransgenes. Alternativamente, transformação estável de uma célula tambémpode ser detectada pela reação em cadeia de polimerase de DNA genômico dacélula para amplificar as seqüências de transgene. O termo "transformanteestável" refere-se a uma célula, que possui estavelmente integrados um oumais transgenes no DNA genômico. Assim, um transformante estável édistinguido de um transformante transiente pelo fato de que, enquanto o DNAgenômico do transformante estável contém um ou mais transgenes, DNAgenômico do transformante transiente não contém um transgene.Transformação também inclui introdução de material genético em células deplanta na forma de vetores virais de planta envolvendo replicaçãoepicromossômica e expressão de gene, que podem exibir propriedadesvariáveis com respeito à estabilidade meiótica. Células, tecidos, ou plantastransformadas são entendidos como incluindo não apenas o produto final deum processo de transformação, mas também sua progênie transgênica.

Transgene: o termo "transgene" como aqui usado refere-se aqualquer seqüência de ácido nucleico, que é introduzida no genoma de umacélula por manipulações experimentais. Um transgene pode ser uma"seqüência de DNA endógena", ou uma "seqüência de DNA heteróloga" (i.e.,"DNA estranho"). O termo " seqüência de DNA endógena" refere-se a umaseqüência de nucleotídeos, que é naturalmente encontrada na célula na qualela é introduzida desde que não contenha alguma modificação (e.g., umamutação pontual, a presença de um gene marcador selecionável, etc.) emrelação à seqüência naturalmente ocorrente.

Transgênico: o termo "transgênico" quando se referindo a umacélula, tecido, ou organismos, significa transformado, preferivelmenteestavelmente transformado, com uma molécula de DNA recombinante quepreferivelmente compreende um promotor adequado operavelmente ligadoem uma seqüência de DNA de interesse.

Não afetado: como aqui usado, "essencialmente não afetado"refere-se a um nível de um agente tal como uma proteína ou um transcrito demRNA que é quer não alterado por um evento particular quer alterado apenasem uma extensão que não afeta a função fisiológica daquele agente. Em umaspecto preferido, o nível de agente que é essencialmente não afetado estádentro de 20%, com maior preferência dentro de 10%, e ainda maispreferivelmente dentro de 5% do nível no qual ele é encontrado em umacélula ou organismo que é faltante de uma molécula de ácido nucleico capazde seletivamente reduzir outro agente. Como aqui usado, "substancialmentenão afetado" refere-se a um nível de um agente tal como uma proteína ou umtranscrito de RNA no qual o nível que está substancialmente não afetado estádentro de 49%, com maior preferência dentro de 35%, e mais preferivelmentedentro de 24% do nível no qual ele é encontrado em uma célula ou organismoque é faltante de uma molécula de ácido nucleico capaz de seletivamentereduzir outro agente. Como aqui usado, "parcialmente não afetado" refere-se aum nível no qual um agente tal como uma proteína ou um transcrito demRNA no qual o nível do agente que é parcialmente não afetado está dentrode 80%, com maior preferência dentro de 65%, e mais preferivelmente dentrode 50% do nível no qual ele é encontrado em uma célula ou organismo que éfaltante de uma molécula de ácido nucleico capaz de seletivamente reduziroutro agente.

Vetor: como aqui usado, o termo "vetor" refere-se a umamolécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucleico no qualela tem sido ligada. Um tipo de vetor é um vetor integrado genômico, ou"vetor integrado", que pode se tornar integrado no DNA cromossômico dacélula hospedeira. Outro tipo de vetor é um vetor epissomal, i.e., um ácidonucleico codificador capaz de replicação extracromossômica. Vetores capazesde dirigir a expressão de genes nos quais estão operavelmente ligados sãoaqui referidos como "vetores de expressão". No presente relatório descritivo,"plasmídeo" e "vetor" são usados intercambiavelmente a não ser quediferentemente claro do contexto. Vetores de expressão planejados paraproduzir RNAs como aqui descritos in vitro ou in vivo podem conterseqüências sob o controle de qualquer RNA polimerase, incluindo RNApolimerase mitocondrial, RNA pol I, RNA pol II, e RNA pol III. Estes vetorespodem ser usados para transcrever a moléculas de RNA desejada na célula deacordo com esta invenção. Vetores podem ser desejavelmente planejados parautilizarem uma RNA polimerase mitocondrial endógena (e.g., RNApolimerase mitocondrial de humano, na qual tais vetores podem utilizar opromotor mitocondrial de humano correspondente). Polimerasesmitocondriais podem ser usadas para gerarem mensagens bloqueadas (pormeio de expressão de uma enzima bloqueadora) ou desbloqueadas in vivo.Transcritos de RNA pol I, RNA pol II, e RNA pol III também podem sergerados in vivo. Tais RNAs podem estar bloqueados ou não, e se desejado,bloqueio citoplásmico pode ser realizado por vários meios incluindo o uso deuma enzima bloqueadora tal como uma enzima bloqueadora de vacínia ouuma enzima bloqueadora de alfavírus. O vetor DNA é planejado para conterum dos promotores ou promotores múltiplos em combinação (promotoresmitocondriais, de RNA poli, II, ou pol III, ou virais, bacterianos ou debacteriófago juntamente com polimerases cognatas). Preferivelmente, onde opromotor é RNA pol II, a seqüência codificadora da molécula de RNA possuiuma matriz de leitura aberta maior do que cerca de 300 nts para evitardegradação nos núcleos. Tais plasmídeos ou vetores podem incluir seqüênciasde plasmídeo de bactérias, vírus ou fagos. Tais vetores incluem vetorescromossômicos, epissomais, e derivados de vírus e.g., vetores derivados deplasmídeos bacterianos, bacteriófagos, epissomos de levedura, elementoscromossômicos de levedura, e vírus, vetores derivados de combinações dosmesmos, tais como aqueles derivados de plasmídeo e elementos genéticos debacteriófago, cosmídeos e fagomídeos. Assim, um vetor exemplar é um vetorde fago de fita única ou de fita dupla. Outro vetor exemplar é um vetor viralde DNA ou de RNA de fita única ou de fita dupla. Tais vetores podem serintroduzidos em células como polinucleotídeos, preferivelmente DNA, portécnicas bem conhecidas para introdução de DNA e RNA em células. Osvetores, no caso de vetores de fago e virais também podem ser epreferivelmente são introduzidos em células como vírus empacotados ouencapsulados por técnicas bem conhecidas para infecção e transdução.Vetores virais podem ser competentes em replicação ou defectivos emreplicação. No último caso, propagação viral geralmente ocorre apenas emcélulas hospedeiras complementares.

Tipo selvagem: o termo "tipo selvagem", "natural" ou de"origem natural " significa com respeito a um organismo, polipeptídeo, ouseqüência de ácido nucleico, que o citado organismo é naturalmente ocorrenteou disponível em pelo menos um organismo naturalmente ocorrente que nãoestá mudado, mutado, ou diferentemente manipulado pelo homem.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Uma primeira modalidade da invenção refere-se a um métodopara a expressão transgênica com especificidade intensificada em umorganismo eucariótico o citado método compreendendo as etapas de:

na qual pelo menos uma de seqüência i) e seqüência ii) sãoheterólogas uma em relação à outra, eb) introduzir o citado construto de expressão em um organismoeucariótico.

Não é incomum que alguns promotores 'específicos paratecido' possuindo mutação de atividade subnormal de expressão em outrostecidos que poderia resultar em fenótipo indesejável tal como fitotoxicidade.Em outros casos, tem sido provado muito desafiador a geração de promotorespecífico para tecido para certa aplicação (e.g. promotores 'específicos parasincício' para alcançar resistência a nematódeo em plantas). Dado que algunsmiRNAs possuem padrão temporal de expressão e/ou específico para tecido,poder-se-ia planejar um vetor genérico com uma etiqueta-miRNA (umaseqüência curta substancialmente complementar ou complementar a um dadomiRNA endógeno) na 3'UTR de um construto de expressão (e.g.,compreendido em um vetor binário), de modo que mutação de atividadesubnormal de expressão de transgene nos tecidos onde miRNA sãoexpressados será reduzido ou eliminado.

A característica inventiva, essencial, da invenção aqui descritaé a incorporação de "pelo menos uma seqüência substancialmentecomplementar a uma seqüência de microRNA naturalmente expressada emcitado organismo eucariótico" (i.e. o organismo alvo, onde a especificidade deexpressão intensificada deve ser alcançada). A citada seqüência - daqui emdiante a "etiqueta microRNA" - suprime ou diminui a expressão ou acarretarádegradação intensificada (deste modo suprimindo ou diminuição deexpressão) de seqüência de RNA quimérica em tecidos, às vezes, e/ou sobcondições ambientais onde o miRNA endógeno é expressado.

Sem ser limitado a qualquer mecanismo de ação funcionalespecífico, é considerado que o miRNA endógeno interage com a etiqueta-miRNA na seqüência de RNA quimérica, induzindo deste modo suadegradação (ou silenciamento de gene). É surpreendentemente verificado queeste silenciamento é restringido ao tecido, tempo e/ou sob condição ambientalonde o miRNA endógeno é naturalmente expressado e é verificado que não seespalha em todo o organismo.

1. A etiqueta-miRNA da invenção

1.1 Propriedades gerais

A etiqueta-miRNA uma seqüência, que é substancialmentecomplementar a uma seqüência de microRNA (miRNA) naturalmenteexpressada em um organismo eucariótico (i.e. um miRNA endógeno). Ostermos miRNA (ou microRNA) naturalmente ocorrente e miRNA (oumicroRNA) endógeno possuem o mesmo significado e são aqui usadosintercambiavelmente.

As etiquetas-miRNA da invenção são complementares ousubstancialmente complementares a um miRNA endógeno. Embora ainvenção não dependa das etiquetas -miRNA de um tamanho específico, asetiquetas-miRNA possuirão um comprimento similar ao comprimento dosmiRNAs endógenos, tais miRNAs conhecidos na arte tipicamentecompreendem entre cerca de 15 e 30 nucleotídeos. Assim, a etiqueta-miRNApreferivelmente será uma seqüência pequena compreendendo cerca de 15 acerca de 30 nucleotídeos, cerca de 20 a cerca de 28 nucleotídeos, maisespecificamente cerca de 21-24 nucleotídeos. Geralmente a etiqueta-miRNAserá completamente complementar ao miRNA endógeno, contudo, máscombinações podem ser toleradas, assim é contemplado que a etiqueta-miRNA é substancialmente complementar ao miRNA naturalmenteexpressado em um organismo eucariótico. O termo substancialmentecomplementar como usado neste contexto (i.e. para a complementaridadeentre a etiqueta-miRNA e um miRNA endógeno) significa, que geralmente de1 a cerca de 6 más combinações podem ocorrer, mais especificamente cercade 2 a 3 nucleotídeos mal combinados podem estar incluídos na etiqueta-miRNA em comparação com a seqüência de miRNA endógeno.Alternativamente, o complemento da etiqueta-miRNA pode possuir e aidentidade em relação à seqüência de miRNA endógeno de pelo menos 60%ou 70%, preferivelmente pelo menos 80% ou 85%, com maior preferência depelo menos 90%, mais preferivelmente de pelo menos 95%. Embora osnucleotídeos mal combinados possam ocorrer em toda a seqüência de miRNA(i.e. em qualquer posição), preferivelmente, estão localizados na regiãopróxima ou na região 3' do miRNA endógeno. A região 3' do miRNAendógeno é complementar à região 5' da etiqueta miRNA.

Conseqüentemente, as más combinações estão preferivelmente na região 5' daetiqueta-miRNA. Tem sido demonstrado, que por exemplo, 3 mascombinações mais uma oscilação (wobble) G::U podem ser engenhados naregião 3' de miRNA sem afetar sua função (Mallory et al., EMBO Journal,23:3356-3364, (2004)). Conseqüentemente, na modalidade mais preferida otermo substancialmente complementar significa que 3,5 más combinações(i.e. 3 combinações más combinações verdadeiras mais uma oscilação(wobble) G:U contada como 0,5) podem ocorrer entre a etiqueta-miRNA e omiRNA endógeno. Nesta maneira, uma seqüência de miRNA pode serplanejada para modular a expressão de qualquer seqüência alvo.

1.2 Identificação de miRNAs adequados paraplanejamento de etiqueta miRNA

Para permitir especificidade de expressão intensificada, omicroRNA (em relação ao qual a seqüência compreendida em uma seqüênciade nucleotídeos a ser expressada é substancialmente complementar) épreferivelmente não constitutivamente expressado, mas é variado emexpressão em pelo menos um parâmetro selecionado do grupo consistindo detecido, fator espacial, fator de tempo, fator de desenvolvimento, fatorambiental e outros fatores exógenos. Preferivelmente, o microRNA éexpressado especificamente ou preferivelmente em tecido, espacialmenteregulado, desenvolvimentalmente regulado, e/ou regulado por outros fatorestais como fatores de estresse biótico ou abiótico.

Um miRNA expressado preferivelmente ou especificamenteem tecido é aqui entendido como um miRNA que não é expressado na mesmaextensão em todos os tecidos de um organismo em um dado instante de tempo(tal perfil de expressão pode ou não mudar no decorrer do tempo (e.g.,durante o desenvolvimento ou o envelhecimento) ou sob outras condições(fatores exógenos tal como estresse). Preferivelmente, o miRNA é expressadoapenas em um ou uns poucos tecidos, enquanto que ele não é expressado emuma quantidade significativa (e.g., uma quantidade que é prontamentedetectável por métodos de detecção de RNA padrão tal como Northern blot)em outros tecidos.

Um miRNA regulado por outros fatores pode incluir miRNAsque são supra- ou infra-regulados (em um, mais ou todos os tecidos) sobinteração do organismo com um fator, preferivelmente um fator exógeno,mais preferivelmente um estímulo de estresse. Tal estímulo de estresse podecompreender fatores de estresses abiótico e biótico. Dado o fato de quemiR160 de milho (veja Exemplos para detalhes) é um microRNA induzidopor estresse, é muito possível que alguns outros miRNAs sejam induzidos poruma variedade de estímulos ambientais (e.g. estresse biótico, e agentesquímicos). Usando estratégias similares propostas acima, pode-se controlar aexpressão de transgene em resposta aos estímulos ambientais em certos tecidos.

Há várias abordagens para identificar e isolar miRNAs emvários organismos e tecidos. Por exemplo, após isolamento de RNA total deum organismo ou de tipos de tecido ou de célula específicos, RNA é resolvidosobre um gel de poliacrilamida 15% desnaturante. Um fragmento de gel querepresenta a faixa de tamanho de 15 a 26 nucleotídeos é excisado, RNApequeno é eluído, e recuperado. Subseqüentemente, RNA pequeno é ligadoem adaptadores de oligonucleotídeo quimérico de DNA/RNA 5' e 3'. Reaçãode transcrição reversa é realizada usando iniciador de RT seguido por PCRcom iniciador apropriado. Produtos de PCR são então clonados em vetor paraseqüenciamento(Sunkar R e Zhu JK, The Plant Cell 16:2001:2019, 2004).Várias outras técnicas e métodos têm sido aplicados para detectar miRNA emum organismo ou tecidos tais como análise por Northern blot, PAGE baseadaem proteção de ribonucleases, determinação de perfil de miRNA baseada emmicroarranjo e análise de qRT-PCR Tagman.

Há vários modos de "planejar" uma etiqueta-miRNA paraalcançar um certo perfil de expressão. Por exemplo, primeiro, escolhe-semiRNA expressado no(s) tecido(s) (ou às vezes ou sob condições) onde háuma expressão vazada de gene-de-interesse, que deve ser evitada. Segundo,determina-se a seqüência complementar de miRNA e insere-se tais seqüênciasde nucleotídeos curtas no gene-de-interesse (e.g., a região 5'UTR, a região 3'UTR, ou até mesmo a região codificadora sem afetar a função do gene-de-interesse).

1.2 Localização dentro de RNA quimérico expressado

Várias posições são possíveis para a seqüência sendosubstancialmente complementar ao microRNA (daqui em diante também a"etiqueta microRNA") na seqüência de nucleotídeos a ser expressada.Preferivelmente, a seqüência sendo substancialmente complementar aomicroRNA está posicionada em uma localização da seqüência de nucleotídeosa ser expressada correspondendo à região não traduzida 5' ou à região nãotraduzida 3' de citada seqüência

1.3 Produção e/ou expressão de RNA quimérico dainvenção

Os termos "RNA quimérico" ou "molécula de RNAquimérica" ou "seqüência de ribonucleotídeos quimérica" são aqui usadosintercambiavelmente e são intencionados para significar uma molécula depolinucleotídeo, que está pelo menos em parte consistindo deribonucleotídeos, que compreende:

i) pelo menos uma seqüência substancialmente complementar a umaseqüência de microRNA naturalmente ocorrente em um organismoeucariótico, e

i) pelo menos uma outra seqüência (preferivelmente uma seqüênciacapaz de conferir um fenótipo preferido ou efeito benéfico a umorganismo eucariótico),

na qual pelo menos uma de seqüência i) e seqüência ii) sãoheterólogas uma em relação à outra (i.e. não estão covalentemente ligadas nanatureza ou em uma célula ou um organismo natural (i.e. não geneticamentemodificada(o)).

O fato de que a seqüência de RNA quimérica da invenção está"pelo menos em parte consistindo de ribonucleotídeos" significa - porexemplo - que a seqüência de RNA quimérica pode compreender basesdiferentes de ribonucleotídeo. Como descrito abaixo, a molécula de RNAquimérica da invenção também pode ser obtida por síntese química. Por estemétodo, resíduos de ribonucleotídeos diferentes de naturais (e.g., resíduosmodificados) podem ser incorporados).

As moléculas de RNA quiméricas expressadas pelo método dainvenção (i.e. o RNA compreendendo a etiqueta-miRNA) são como taisconsideradas novas e inventivas. Não apenas construtos de expressão podemser usados, mas também as moléculas de RNA quiméricas como tais possuempotencial forte para aplicabilidade industrial, especialmente no campo deaplicação farmacêutica, onde atividade de um fármaco baseado em RNA édesejada para atuar apenas sobre certo tecido, em certos tempos ou sob certascondições.

Assim outra modalidade da invenção refere-se a umaseqüência de ribonucleotídeos quimérica compreendendo:

i) pelo menos uma seqüência capaz de conferir um fenótipo preferidoou efeito benéfico a um organismo eucariótico, e

ii) pelo menos uma seqüência substancialmente complementar a umaseqüência de microRNA naturalmente ocorrente em um organismoeucariótico,

As seqüências i) e/ou ii) em citada seqüência deribonucleotídeos quimérica são preferivelmente definidas como para ométodo da invenção.

A molécula de RNA quimérica (i.e. a molécula de RNAcompreendendo a etiqueta miRNA) pode ser produzida e aplicada à célulahospedeira ou ao organismo hospedeiro por vários meios, familiares para apessoa experiente na arte. As moléculas de RNA quiméricas da invençãopodem ser produzidas ou sintetizadas por qualquer método conhecido na arte,e.g., usando expressão recombinante, síntese enzimática ou síntese química.As moléculas de RNA podem ser sintetizadas in vitro (e.g., usando sínteseenzimática e síntese química) ou in vivo (usando tecnologia de DNArecombinante bem conhecida na arte).

Por exemplo, o RNA quimérico pode ser produzido fora dacélula alvo eucariótica ou pode ser produzida recombinantemente (e.g., porum construto de expressão) dentro da célula alvo. Em uma modalidade, amolécula de RNA quimérica da invenção pode ser produzida por métodos desíntese enzimática ou métodos de síntese química in vitro. Em outramodalidade, a molécula de RNA quimérica pode ser gerada em uma culturarecombinante, e.g., células bacterianas, isolada das mesmas, e usada nosmétodos discutidos abaixo. Em outra modalidade outro agente (tal como umvetor ou construto de expressão) gera a molécula de RNA quimérica in vivoapós liberação para o organismo ou célula alvo. O organismo ou célula alvo épreferivelmente um organismo ou uma célula de mamífero, célula de plantaou organismo ou célula de animal (tal como nematódeo).

Por exemplo a molécula de RNA quimérica pode ser:

a) expressada de um construto de expressão ou de um vetor deexpressão no organismo alvo ou na célula alvo, ou

b) expressada de um construto de expressão em um sistema detranscrição in vivo ou in vitro, no qual a molécula de RNAquimérica é purificada do citado sistema de transcrição eintroduzida no organismo alvo ou na célula alvo (e.g., poralimentação ou injeção), ou

c) síntese química da molécula de RNA quimérica introduzida nacélula alvo ou no organismo alvo (e.g., por alimentação ou injeção).

1.3.1 Expressão do RNA quimérico por expressão recombinanteA molécula de RNA quimérica da invenção pode ser preparadapor expressão recombinante. Assim, em uma modalidade da invenção o RNAquimérico é produzido na célula por um construto de expressão ou vetor deexpressão. A molécula de RNA quimérica pode ser preparada (e.g.,expressada) diretamente no organismo alvo ou na célula alvo eucariótica,onde ela pode desempenhar totalmente sua função sem a necessidade deintrodução adicional. Alternativamente a molécula de RNA quimérica podeser expressada em outra célula, opcionalmente purificada, esubseqüentemente liberada para dentro do organismo alvo ou da célula alvo.

Assim, a molécula de RNA desta invenção pode ser preparada em ummicroorganismo recombinante, e.g., bactérias e levedura ou em um organismoou uma célula hospedeira recombinante, e.g., células de planta ou demamífero, e - opcionalmente - isolada de suas culturas por técnicasconvencionais. Veja, e.g., as técnicas descritas em Sambrook et al,MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed.; ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989, que éexemplar de manuais de laboratório que detalham estas técnicas, e as técnicasdescritas em US 5.824.538; 5.877.159 e 65.643,771, aqui incorporadas comoreferências.

Onde as moléculas de RNA da invenção são formadas in vivoelas são preferivelmente produzidas empregando um construto de expressãoou vetor de expressão. Mais preferivelmente o vetor ou construto deexpressão compreende uma seqüência de ácido nucleico, preferivelmente umamolécula de DNA de fita dupla, codificadora de pelo menos uma dasmoléculas de RNA quiméricas descritas acima, operavelmente ligada em umaseqüência regulatória de transcrição (um promotor) que é capaz de realizar atranscrição de citada seqüência de ácido nucleico na célula alvo ou hospedeiraescolhida para produzir um RNA quimérico da invenção. Como discutido,numerosos promotores podem ser usados na prática da invenção. Ospromotores podem ser selecionados baseado no resultado desejado. Assim, aseqüência de nucleotídeos para expressão do , RNA quimérico pode sercombinada com promotores constitutivos, preferidos para tecido, induzíveis,desenvolventes, ou outros promotores para expressão em plantas dependendodo resultado desejado. Promotores específicos são descritos abaixo.

Tais construtos de expressão para expressão de citadaseqüência de ribonucleotídeos quimérica (que são empregados no método dainvenção) são considerados novos e inventivos. Assim outra modalidade dainvenção refere-se a um construto de expressão compreendendo umaseqüência de promotor funcional em um organismo eucariótico efuncionalmente ligada na mesma uma seqüência de nucleotídeos, a citadaseqüência compreendendo:

i) pelo menos uma seqüência capaz de conferir um fenótipo preferidoou um efeito benéfico ao citado organismo eucariótico, e

ii) pelo menos uma seqüência substancialmente complementar a umaseqüência de microRNA naturalmente ocorrente em citadoorganismo eucariótico,

O uso e a produção de um construto de expressão sãoconhecidos na arte (veja também WO 97/32016; Patentes U.S. 5.593.874,5.698.425, 5.712.135, 5.789.214, e 5.804.693; e as referência lá citadas).Para transcrição de um transgene in vivo ou de um construtode expressão, uma região regulatória (e.g., promotor, intensificador,silenciador, aceptor e doador de editoração, poliadenilação) pode ser usadapara transcrever o RNA quimérico. Transcrição pode ser selecionada portranscrição específica em um órgão, tecido, ou tipo de célula; estimulação deuma condição ambiental (e.g., infecção, estresse, temperatura, indutoresquímicos); e/ou transcrição engenhosa em uma idade ou um estágio dedesenvolvimento. As fitas de RNA podem ou não ser poliadeniladas; as fitasde RNA podem ou não ser capazes de serem traduzidas em um polipeptídeopor uma aparelhagem de tradução da célula. Vários promotores podem serusados para expressão da seqüência de nucleotídeos compreendendo aetiqueta-microRNA. Os promotores podem - por exemplo - ser selecionadosdo grupo consistindo de promotores constitutivos, promotores específicospara tecidos ou tecido-preferenciais, e promotores induzíveis. Um promotorespecífico para tecido neste contexto - preferivelmente - significa que estámutado para atividade subnormal (i.e. possuindo atividade de expressão emtecido diferente do preferido ou principal) em uma extensão pequena masmensurável. Exemplos mais específicos de construtos de expressão preferidossão descritos abaixo para a aplicação específica.

A seqüência de nucleotídeos a ser expressada para formar amolécula de RNA quimérica pode possuir várias formas e/ou funções. Porexemplo, ela pode compreender uma matriz de leitura aberta codificadora deuma proteína. Alternativamente, ela pode codificar um RNA funcionalselecionado do grupo consistindo de RNA de anti-senso, RNA de senso, RNAde fita dupla ou ribozimas. O citado RNA funcional é preferivelmenteexpressão atenuada de um gene endógeno. Para expressão de uma funçãoRNA, é desejável que as seqüências, que permitem a expressão de proteína,e.g.,regiões Kozak, etc., não estejam incluídas nestes construtos de expressãoda invenção.O construto de expressão para a expressão da seqüência denucleotídeos compreendendo a etiqueta-microRNA pode ser DNA, RNA epode ser de fita única ou dupla. Preferivelmente o construto de expressão éDNA, mais preferivelmente DNA de fita dupla. O construto de expressãopode ser parte de um construto de vetor maior. Preferivelmente, o construtode expressão está em um plasmídeo. O construto de expressão estápreferivelmente compreendido em um vetor de expressão. Assim outramodalidade da invenção refere-se a um vetor de expressão compreendendoum construto de expressão da invenção. O vetor de expressão pode ser umamolécula de DNA ou de RNA, pode ser de fita única ou de fita dupla, podeser um plasmídeo ou outro tipo de vetor (como definido acima e especificadopara as várias aplicações e campo técnico abaixo detalhado). Maispreferivelmente o vetor de expressão é um vetor de DNA plasmídeo circular,de fita dupla. Uma outra modalidade da invenção refere-se a um vetor deexpressão compreendendo um construto de expressão da invenção. Exemplosde vetores (veja acima em seção de DEFINIÇÃO para detalhes) podem serplasmídeos, cosmídeos, fagos, vírus senão Agrobacteria. Preferivelmente, ovetor é um vetor de expressão eucariótico. Mais preferivelmente, o vetor deexpressão eucariótico é um vetor viral ou vetor plasmídeo. Em certasmodalidades, os vetores ou construtos de expressão são epissomais, e.g., etransfecção é transiente. Em outras modalidades, os vetores ou construtos deexpressão estão cromossomicamente integrados, e.g., para produzir umalinhagem celular estavelmente transfectada. Vetores preferidos para formartais linhagens celulares estáveis são descritos em US 6.025.192 eWO/9812339, que são aqui incorporadas como referências. Vetores paraexpressão em E.coli são preferivelmente pQE70, pQE60 e pQE-9 (QIAGEN,Inc.); vetores pBluescript, vetores Phagescript, pNH8A, pNHlóa, pNH18A,pNH46A (Stratagene Cloning Systems, Inc.); ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3,pDR540, pRIT5 (Pharmacia Biotech, Inc.).Como descrito acima (e para células e organismos específicosabaixo em mais detalhe), o vetor e construto de expressão pode serintroduzido em organismos ou células. Ainda outra modalidade da invençãorefere-se a um organismo não-humano ou célula transformada(o)compreendendo um construto de expressão ou um vetor de expressão dainvenção. Preferivelmente, o citado construto de expressão ou vetor deexpressão é inserido no genoma (preferivelmente o DNA cromossômico ouplasmídeo) de citada(o) célula ou organismo. Preferivelmente, a citada(o)célula ou organismo é selecionada(o) do grupo de organismos e células demamífero, de bactéria, de fungo, de nematódeo ou de planta. Outramodalidade da invenção refere-se aos tecidos, parte do e material depropagação do organismo transformado da invenção. No caso de plantastransformadas o material de propagação é preferivelmente sementetransformada.

O construto de expressão pode ser inserido no vetor(preferivelmente um vetor plasmídeo) via um sítio de clivagem de restriçãoadequado. O vetor resultante é primeiro introduzido em E.coli. E.colicorretamente transformados são selecionados, crescidos, e o vetorrecombinante é obtido por métodos com os quais o técnico experiente estáfamiliarizado. Análise de restrição e seqüenciamento podem ser empregadospara verificar a etapa de clonagem. Vetores preferidos são aqueles, quepossibilitam uma integração estável do construto de expressão no genomahospedeiro. Construtos de vetor e promotores adequados são descritos noPedido de Patente U.S. 20040220130.

Os vetores planejados para produzir o RNA quimérico dainvenção podem ser desejavelmente planejados para gerarem dois ou mais,incluindo numerosos RNA quiméricos diferentes. Esta abordagem é desejávelpelo fato de que um vetor único pode produzir muitos RNA quiméricosindependentemente operativos em vez de uma única molécula de RNAquimérica de uma única unidade de transcrição e pela produção de umamultiplicidade de RNA quiméricos diferentes. Vários meios podem serempregados para alcançar isto, incluindo seqüências autocatalíticas bem comoseqüências para clivagem para criar sítios de editoração predeterminados e/oualeatórios.

A construção de construtos de polinucleotídeo geralmenterequer o uso de vetores capazes de se replicarem em bactérias. Uma pletora dekits está comercialmente disponível para a purificação de plasmídeos debactérias. Para seu uso apropriado, seguindo as instruções do fabricante (veja,por exemplo, EasyPrep™, FlexiPrep™, ambos de Pharmacia Biotech;StrataClean™, de Stratagene; e, QIAprep™, Qiagen). Os plasmídeos isoladose purificados podem se então adicionalmente manipulados para produziroutros plasmídeos, usados para transfectar células ou incorporados em outrossistemas de vetor (e.g., Agrobacterium tumefaciens) para infectar etransformar organismo ou células alvo (preferivelmente plantas).

Ainda outro vetor adequado (ou agentes de liberação) paraintroduzir um RNA quimérico da invenção em uma célula alvo incluem vírusvivos, atenuados ou mortos, inativados, e particularmente vírus recombinantestransportando a seqüência de polinucleotídeo de RNA requerida discutidaacima. Tais vírus podem ser planejados similarmente aos vírus recombinantespresentemente usados para liberar genes para células para terapia genética esemelhante, mas preferivelmente não possuem a capacidade para expressaruma proteína ou fragmento funcional de uma proteína. Dentre vírus ouseqüências virais úteis que podem ser manipulados para proporcionar amolécula de DNA requerida à célula de mamífero in vivo estão, semlimitação, alfavírus, adenovírus, vírus adeno-associados, baculovírus, deltavírus, pox vírus, vírus da hepatite, vírus do herpes, papova vírus (tal comoSV40), poliovírus, vírus da pseudo-raiva, retrovírus, vírus da vacínia, vírus deRNA de fitas positiva e negativa, viróides, e virusóides, ou suas porções.Estes vários agentes de liberação viral podem ser planejados pela aplicação detécnicas convencionais tais como descritas em M. Di Nocola et al, CâncerGene Ther., 5(6):350-6 (1998), dentre outras, com os ensinamentos dapresente invenção. Um construto viral empacotado em uma partícula viralrealizaria tanto a introdução eficiente de um construto de expressão na célulaquanto a transcrição de construto de RNA quimérico codificado peloconstruto de expressão.

Outro agente de liberação para proporcionar as moléculas deRNA quiméricas da invenção na célula alvo ou no organismo alvo incluicélulas doadoras vivas, atenuadas ou mortas, inativadas que têm sidotransfectadas ou infectadas com uma molécula de RNA sintética com umvetor ou construto de expressão como descrito acima. Estas células doadoraspodem ser então administradas ou alimentadas ao organismo alvo (e.g., ummamífero ou um patógeno tal como um nematódeo), como descrito emdetalhe abaixo, para estimular o mecanismo no organismo alvo que medeiaeste efeito inibitório. Estas células doadoras são desejavelmente célulaseucarióticas, tais como células de mamífero C127, 3T3, CHO, HeLa, célula293 de rim de humano, linhagens de célula BHK, e células COS-7, epreferivelmente são de mesma espécie de mamífero como o recipientemamífero, ou células de planta. Tais células doadoras podem ser preparadasusando técnicas similares àquelas descritas em, e.g., Emerich et al, J.Neurosci., 16: 5168-81 (1996). Ainda mais preferido, as células doadoraspodem ser colhidas do mamífero específico a ser tratado e transformadas emcélulas doadoras por mutação ex vivo, relacionada às técnicas de transferênciaadotivas, tais como aquelas descritas em D. B. Kohn et al, Nature Med.4(7):775-80 (1998). Células doadoras também podem ser de espécie de não-mamífero, se desejado.

1.3.2 Produção de RNA quimérico da invenção por sínteseenzimáticaA molécula de RNA quimérica de acordo com esta invençãopode ser liberada à célula alvo ou ao organismo alvo como uma molécula, quefoi preparada in vitro por síntese enzimática.

Assim, outra modalidade da invenção refere-se a um métodopara gerar um RNA quimérico da invenção compreendendo:

(i) proporcionar um sistema de transcrição in vitro incluindo umconstruto de expressão para o RNA quimérico da invenção, e

(ii) isolar o citado RNA quimérico da invenção.

Sistemas de transcrição procarióticos e - preferivelmente -eucarióticos podem ser empregados. Além disso, sistemas baseados emenzimas isoladas e sistemas baseados em extratos celulares podem serutilizados. RNA polimerases eucarióticas, procarióticas ou de bacteriófago(tais como, por exemplo, T3, T7 ou SP6 RNA polimerase) podem ser usadaspara este propósito. Métodos adequados para expressão in-vitro de RNA sãodescritos (WO 97/32016; US 5.593.874; US 5.698.425, US 5.712.135, US5.789.214, US 5.804.693). Sistemas enzimáticos baseados em enzimasisoladas podem ser usados, por exemplo, as RNA polimerases de bacteriófagoT7, T3 ou SP6 de acordo com métodos convencionais descritos por tais textoscomo o "Promega Protocols and Applications Guide", (3rd ed. 1996), eds.Doyle, ISBN No. 1-882274-57-1.

Conseqüentemente, a invenção também proporciona um kitque inclui reagentes para atenuar a expressão de um gene alvo em uma célula.O kit contém um molde de DNA compreendendo um promotor(preferivelmente um promotor T7, um promotor T3 ou um promotor SP6)operavelmente ligado em uma seqüência de nucleotídeos codificadora de umRNA quimérico da invenção. O kit opcionalmente contém iniciadores deamplificação para amplificar a seqüência de DNA do molde de DNA enucleotídeo-trifosfatos (i.e., ATP, GTP, CTP e UTP) para formar RNA.Também opcionalmente, o kit contém uma RNA polimerase, capaz de ligar opromotor no molde de DNA e causar transcrição da seqüência de nucleotídeosna qual o promotor está operavelmente ligado; uma coluna de purificaçãopara purificar RNA de fita única, tal como uma coluna de exclusão detamanho; um ou mais tampões, por exemplo um tampão para anelar RNAs defita única para dar RNA de fita dupla; e RNAse A ou RNAse T para purificarRNA de fita dupla.

Nos casos onde um sistema de transcrição eucariótica éempregado (tais como lisatos de reticulócitos de coelho ou germe de trigo;veja Movahedzadeh et al, "In vitro transcription and translation," emMethods in Molecular Biology, V. 235, N. Casali, A. Preston, Eds., Totowa,NJ: Humana Press, p. 247-55; Lamla et al., Acta Biochim Pol, 48:453-65,2001) é esperado que a remoção correta do elemento de RNA removívelresulte em liberação do RNA quimérico, que pode ser purificado do sistema.

Antes da introdução em uma célula, um tecido ou órgão, umRNA quimérico que tem sido sintetizado in vitro, quer química querenzimaticamente, pode ser purificado quer completamente quer em parte damistura reacional, por exemplo por extração, precipitação, cromatografia oucombinações destes métodos.

1.3.3 Produção de RNA quimérico da invenção por síntesequímica

As moléculas de RNA quiméricas da invenção também podemser sintetizadas - inteiramente ou em parte - por síntese química. Síntesequímica de oligonucleotídeos lineares é bem conhecida na arte e pode serrealizada por técnicas em solução ou em fase sólida. Preferivelmente, sínteseé por métodos em fase sólida. Procedimentos de síntese adequados incluemmas não são limitados aos métodos de fosforamidito, triéster de fosfito, H-fosfonato, e fosfotriéster, tipicamente por métodos de síntese automática. Taisprotocolos de síntese de oligonucleotídeo podem ser encontrados, e.g., em US5.830.653; WO 98/13526; Stec et al. 1984. J. Am. Chem. Soe. 106:6077; Stecet al. 1985. J. Org. Chem. 50:3908; Stec et al. J. Chromatog. 1985. 326:263;LaPlanehe et al. 1986. Nuc. Acid. Res. 1986. 14:9081; Fasman G. D., 1989.Praetieal Handbook of Bioehemistry and Molecular Biology. 1989. CRCPress, Boca Raton, Fla.; Lamone. 1993. Biochem. Soe. Trans. 21:1; US5.013.830; US 5.214.135; US 5.525.719; Kawasaki et al. 1993. J. Med.Chem. 36:831; WO 92/03568; US 5,276,019; US 5,264,423. Métodosalternativos para síntese química in vitro das moléculas de RNA da invençãosão descritos [veja, e.g., Xu et al, Nucl. Acids Res., 24(18):3643-4 (1996);Naryshkin et al, Bioorg. Khim., 22(9):691-8 (1996); Grasby et al, Nucl. AcidsRes., 21(19):4444-50 (1993); Chaix el al, Nucl. Acids Res., 17(18):7381-93(1989); Chou et al, Biochem., 2(6):2422-35 (1989); Odai et al, Nucl. AcidsSymp, Ser., 21:105-6 (1989); Naryshkin et al, Bioorg. Khim, 22(9):691-8(1996); Sun et al, RNA, 3(11):1352-1363 (1997); X. Zhang et al, Nucl. AcidsRes., 25(20):3980-3 (1997); Grvaznov et al, Nucl. Acids Res., 26 (18):4160-7(1998); Kadokura et al, Nucl. Acids Symp Ser, 37:77-8 (1997); Davison et al,Biomed. Pept. Proteins, Nucl. Acids, 2(1): 1-6 (1996); Mudrakovskaia et al,Bioorg. Khim., 17(6):819-22 (1991)].

O método de síntese selecionado pode depender docomprimento do oligonucleotídeo desejado e tal escolha está dentro dacapacidade do técnico ordinário. Por exemplo, o método de fosforamidito e detriéster de fosfito podem produzir oligonucleotídeos possuindo 175 ou maisnucleotídeos enquanto que o método de H-fosfonato funciona bem paraoligonucleotídeos menores do que 100 nucleotídeos. Se bases modificadasforem incorporadas no oligonucleotídeo, e particularmente se ligações defosfodiéster modificadas forem usadas, então os procedimentos serãoalterados de acordo com os procedimentos conhecidos. Com relação a isto,Uhlmann et al. (1990, Chemical Reviews 90:543-584) proporcionamreferências e descrevem procedimentos para preparar oligonucleotídeos combases modificadas e ligações de fosfodiéster modificadas. Outros métodosexemplares para preparação de oligonucleotídeos são ensinados emSonveaux. 1994. "Protecting Groups in Oligonucleotide Synthesis"; Agrawal.Methods in Molecular Biology 26:1. Método de síntese exemplares tambémsão ensinados em "Oligonucleotide Synthesis - A Practical Approach" (Gait,M. J. IRL Press at Oxford University Press. 1984). Além disso,oligonucleotídeos lineares de seqüência definida, incluindo algumasseqüências com nucleotídeos modificados, estão prontamente disponíveis emvárias fontes comerciais.

A molécula de RNA quimérica da invenção pode incluirmodificações quer na estrutura principal de fosfato-açúcar quer nonucleosídeo. Por exemplo, as ligações de fosfodiéster de RNA natural podemser modificadas para incluírem pelo menos um de um heteroátomo denitrogênio ou de enxofre. Modificações em estrutura de RNA podem serajustadas para permitirem inibição genética específica ao mesmo tempoevitando uma resposta de pânico geral em alguns organismos por dsRNA.Igualmente, bases podem ser modificadas para bloquear a atividade deadenosina deaminase. Em uma modalidade da invenção a molécula de RNAquimérica possui blocos terminais em uma ou em ambas as extremidades.

O RNA quimérico da invenção pode incluir "morfolino-oligonucleotídeos." Morfolino-oligonucleotídeos são não-iônicos e funcionampor um mecanismo independente de RNase H. Cada uma das 4 bases 4genéticas (Adenina, Citosina, Guanina, e Timina/Uracila) dos morfolino-oligonucleotídeos está ligada em um anel de morfolina de 6 membros. Osmorfolino-oligonucleotídeos são preparados pela união de 4 tipos desubunidade diferentes por, e.g., ligações de inter-subunidade defosforodiamidato. Morfolino-oligonucleotídeos possuem muitas vantagensincluindo: resistência completa às nucleases (Antisense & Nuc. Acid DrugDev. 1996. 6:267); seleção previsível (Biochemica Biophysica Acta. 1999.1489:141); atividade confiável em células (Antisense & Nuc. Acid Drug Dev.1997. 7:63); especificidade de seqüência excelente (Antisense & Nuc. AcidDrug Dev. 1997. 7:151); atividade de não-anti-senso mínima (BiochemicaBiophysica Acta. 1999. 1489:141); e liberação por raspagem ou osmóticasimples (Antisense & Nuc. Acid Drug Dev. 1997. 7:291). Morfolino-oligonucleotídeos também são preferidos por causa de sua não-toxicidade emdoses altas. Uma discussão da preparação de morfolino-oligonucleotídeospode ser encontrada em Antisense & Nuc. Acid Drug Dev. 1997. 7:187.

Outra modalidade da invenção inclui dúplices nos quais máscombinações de nucleomonômero-nucleomonômero estão presentes em umafita de senso 2'-Ometilada (e são consideradas fáceis de desenrolar). Comoum outro exemplo, o uso de RNA 2'-0-metilado pode ser beneficamenteusado em circunstâncias nas quais é desejável minimizar respostas de estressecelular. RNA possuindo 2'-0-metil-nucleomonômeros pode não serreconhecido pelo maquinário celular que como considerado reconhece RNAnão modificado. O uso de RNA 2'-0-metilado ou parcialmente 2'-0-metiladopode evitar a resposta de interferon aos ácidos nucleicos de fita dupla, aomesmo tempo mantendo a inibição de RNA alvo. Esta interferência de RNA("stealth RNAi") é útil para evitar respostas de interferon ou outras respostasde estresse celular, tanto em seqüências de RNAi curtas (e.g., siRNA), quandoem seqüências de RNAi mais longas que podem induzir a resposta deinterferon. Outras modificações químicas em adição à 2'-0-metilaçãotambém podem alcançar este efeito.

Seqüências de RNAi mais longas que podem induzir a respostade interferon.

Em certas modalidades, as moléculas de RNA quiméricas dainvenção compreendem terminações 3' e 5' (exceto moléculas circulares). Emuma modalidade, as terminações 3' e 5' podem ser substancialmenteprotegidas das nucleases e.g., por modificação das ligações 3' ou 5' (e.g., US5.849.902 e WO 98/13526). Por exemplo, oligonucleotídeos podem sertornados resistentes pela inclusão de um "grupo bloqueador". O termo "grupobloqueador" como aqui usado refere-se aos substituintes (e.g., gruposdiferentes de OH) que podem ser ligados em oligonucleotídeos ounucleomonômeros, quer como grupos protetores quer como grupos copulantespara síntese (e.g., FITC, propila, fosfato, hidrogeno-fosfonato, oufosforamidito). "Grupos bloqueadores" também incluem "gruposbloqueadores de extremidade" ou "grupos bloqueadores de exonuclease" queprotegem as terminações 5' e 3' do oligonucleotídeo, incluindo nucleotídeosmodificados e estruturas resistentes à não-nucleotídeo exonuclease. Gruposbloqueadores de extremidade exemplares incluem estruturas bloqueadoras(e.g., a estrutura bloqueadora 7-metil-guanosina), nucleomonômerosinvertidos, e.g., com inversões de extremidade 3'-3! ou 5'-5' (veja, e.g.,Ortiagao et ai. 1992. Antisense Res. Dev. 2:129), grupos metil-fosfonato,fosforamidito, grupos de não-nucleotídeo (e.g., Iinkers de não-nucleotídeo,linkers amino, conjugados) e semelhante. O nucleomonômero 3' terminalpode compreender um grupo de açúcar modificado. O nucleomonômeroterminal 3' compreende um 3'-O que pode opcionalmente ser substituído porum grupo bloqueador que previne degradação por 3'-exonuclease dooligonucleotídeo. Por exemplo, a 3'-hidroxila pode ser esterificada em umnucleotídeo por meio de uma ligação de internucleotídeo 3'-3'. Por exemplo, oradical alquiloxila pode ser metoxila, etoxila, ou isopropoxila, epreferivelmente, etoxila. Opcionalmente, o nucleotídeo 3'-3'-ligado naterminação 3' pode ser ligado por uma ligação substituta. Para reduzir adegradação por nuclease, a ligação 5' mais 3-5' pode ser uma ligaçãomodificada, e.g., uma ligação fosforotioato ou uma ligação P-alquiloxifosfotriéster. Opcionalmente, o grupo hidroxila terminal 5' pode seresterificado com um grupo contendo fósforo, e.g. fosfato, fosfotrotioato, ou P-etóxifosfato.

Em outra modalidade da invenção a molécula de RNAquimérica da invenção pode compreender um ou mais linkers flexíveis. Taislinkers podem ser usados para combinar ou fusionar dois ou mais RNAquiméricos menores juntos em uma molécula de RNA quimérica maior. Umlinker é proporcionado com grupos funcionais em cada extremidade que podeser adequadamente protegida ou ativada. Os grupos funcionais sãocovalentemente ligados em cada molécula de RNA, e.g., via uma ligação éter,éster, carbamato, fosfato-éster ou amina quer na 5'-hidroxila quer na 3'-hidroxila. As ligações preferidas são ligações de éster fosfato similares àsligações de oligonucleotídeo típicas. Por exemplo, hexaetilenoglicol pode serprotegido em uma terminação com um grupo protetor fotolábil (i.e., NVOCou MeNPOC) e ativadio em outra terminação com 2-cianoetil-N,N-diisopropilamino-clorofosfito para formar um fosforamidito. Outros métodosde formação de ligações éter, carbamato ou amina são conhecidos por aquelaspessoas experientes na arte e reagentes e referências particulares podem serencontrados em tais textos como March, "Advanced Organic Chemistry", 4ΛEd., Wiley-Interscience, New York, N.Y., 1992. Em geral, os linkers flexíveissão moléculas de não-nucleotídeo incluindo espaçadores, fixadores,bioconjugados, cromóforos, grupos repórter, RNAs marcados com corante, eanálogos de oligonucleotídeo não naturalmente ocorrentes. Linkers,espaçadores, bioconjugados, fixadores, e cromóforos preferidos são maisespecificamente descritos em Pedido de Patente U.S. 20040058886, aquiincorporado como referência.

Em uma modalidade, a molécula de RNA quimérica dainvenção, que é almejada para funcionar em silenciamento de gene, podeincluir um agente que aumenta a afinidade por sua seqüência alvo. O termo"agente intensificador de afinidade" inclui agentes que aumentam a afinidadede uma molécula de RNA quimérica da invenção por seu alvo. Tais agentesincluem, e.g., agentes intercalantes e nucleomonômeros de afinidade alta.Agentes intercalantes interagem fortemente e não especificamente com ácidosnucleicos. Agentes intercalantes servem para estabilizar os dúplices de RNA-DNA e assim aumentam a afinidade da molécula de RNA quimérica dainvenção por seus alvos. Agentes intercalantes são mais comumente ligadosna extremidade 3' ou 5' de oligonucleotídeos. Exemplos de agentesintercalantes incluem acridina, clorambucil, benzopiridoquinoxalina,benzopiridoindol, benzofenantridina, e fenazínio. Os agentes também podemconferir outras características ao oligonucleotídeo, por exemplo, aumentarresistência às endonucleases e exonucleases.

Em uma modalidade, um nucleomonômero de afinidade alta éincorporado em uma molécula de RNA quimérica da invenção. A linguagem"nucleomonômero de afinidade alta" como aqui usada inclui bases ouanálogos de base modificados que se ligam em uma base complementar emuma molécula de ácido nucleico alvo com afinidade maior do que uma basenão modificada, por exemplo, ao se terem interações energeticamente maisfavoráveis com a base complementar, e.g., pela formação de ligações dehidrogênio com a base complementar. Por exemplo, análogos denucleomonômero de afinidade alta tal como aminoetióxi-fenoxazina (tambémreferida como um clamp G), que forma quatro ligações de hidrogênio comguanina estão incluídos no termo "nucleomonômero de afinidade alta". Umnucleomonômero de afinidade alta é ilustrado abaixo (veja, e.g., Flanagan, etal., 1999. Proc. Natl. Acad. Sei. 96:3513). Outros nucleomonômeros deafinidade alta exemplares são conhecidos na arte e incluem bases 7-alquenil-,7-alquinil-, 7-heteroaromático-, ou 7-alquinil-heteroaromático-substituídas ousemelhante que podem ser substitutas de adenosina ou guanosina emoligonucleotídeos (veja, e.g., US 5.594.121). Também, tem sido verificadoque deazapurinas 7-substituídas conferem propriedades de ligaçãointensificada aos oligonucleotídeos, i.e., ao permitir que eles se liguem comafinidade mais alta em moléculas de ácido nucleico alvo complementares emcomparação com os oligonucleotídeos da presente invenção usando técnicaspadrão.

Em outra modalidade, um agente que aumenta a afinidade deuma molécula de RNA quimérica da invenção por seu alvo compreende umagente intercalante. Como aqui usada, a linguagem "agente intercalante"inclui agentes que podem se ligar em uma hélice dupla de DNA. Quandocovalentemente ligado em uma molécula de RNA quimérica da invenção, umagente intercalante intensifica a ligação do oligonucleotídeo em sua seqüênciaalvo de DNA genômica complementar. O agente intercalante também podeaumentar a resistência às endonucleases e exonucleases. Agentes intercalantesexemplares são ensinados por Helene e Thuong (1989. Genome 31:413), eincluem e.g., derivados de acridina (Lacoste et al. 1997. Nucleic AcidsResearch. 25:1991; Kukreti et al. 1997. Nucleic Acids Research. 25:4264);derivados de quinolina (Wilson et al. 1993. Biochemistry 32:10614);derivados de benzo[f]quino[3,4-b]quioxalina (Marchand et al. 1996.Biochemistry. 35:5022; Escude et al. 1998. Proc. Natl. Acad. Sei. 95:3591).Agentes intercalantes podem ser incorporados em uma molécula de RNAquimérica da invenção usando qualquer ligação conveniente. Por exemplo,acridina ou psoraleno podem ser ligados no oligonucleotídeo por intermédiode qualquer grupo -OH ou -SH disponível, e.g., na posição 5' terminal dooligonucleotídeo, nas posições 2' dos grupos açúcar, ou um OH, NH2,COOH, ou SH incorporado na posição-5 de pirimidinas usando métodospadrão.

Em uma modalidade, os construtos de duplex de fita dupla dainvenção podem ser adicionalmente estabilizados contra nucleases pelaformação de estruturas de alça na extremidade 5' ou 3' da fita de senso ou deanti-senso do construto. Estrutura de alça adequada e outras estruturasadequadas para estabilização de uma molécula de RNA da invenção são porexemplo descritas no Pedido de Patente U.S. 20040014956.

A molécula de RNA quimérica da invenção (ou um vetor ouconstruto de expressão para a sua produção) pode ser derivada, quimicamentemodificada, combinada com e/ou ligada em vários agentes para intensificarsua atividade ou especificidade. Tais agentes incluem mas não são limitadosaos agentes de conjugação (e.g., para melhoria da captação celular),transportadores de proteína (e.g., para melhoria da captação celular e acúmulocelular maior), agentes encapsulantes (tais como lipossomos; e.g., parafacilitar a seleção ou captação celular), agentes complexantes (tal comolipídeo catiônico, e.g., para aumentar a captação celular), oligopeptídeosbásicos, peptídeos transportadores (e.g., fator de transcrição HIV TAT,lactoferrina, proteína Herpes VP22), e agentes selecionadores (para seleçãode um receptor celular). Agentes de conjugação, transportadores de proteína,agentes encapsulantes, agentes complexantes, oligopeptídeos básicos ,peptídeos transportadores, e agentes selecionadores adequados são descritospor exemplo em Pedido de Patente U.S. 20040014956. Maneiras adicionaispara contatar uma molécula de RNA quimérica da invenção com esta célulaalvo são descritas abaixo no contexto da aplicação farmacêutica.Alternativamente, o RNA quimérico pode ser liberado para o organismo alvopor ingestão ou infecção de um organismo transgênico compreendendo umconstruto de expressão para o RNA quimérico. Veja e.g., US 6.506.559.Métodos para aumentar a estabilidade das moléculas de RNA da invençãocontra a degradação por nuclease (e.g., por nucleases celulares e nucleases desoro e nucleases encontradas em outros fluidos corporais) são descritos noPedido de Patente U.S. 20040014956.

Se sintetizada quimicamente ou por síntese enzimática in vitro,a molécula de RNA quimérica da invenção pode ser purificada antes daintrodução na célula. Por exemplo, RNA pode ser purificado de uma misturapela extração com um solvente ou uma resina, precipitação, eletroforese (e.g.,eletroforese em gel de poliacrilamida), cromatografia (e.g., cromatografia emgel e cromatografia líquida de pressão alta) ou ou uma combinação dosmesmos. Alternativamente, o RNA quimérico pode ser usado com nenhumaou uma purificação mínima para se evitarem perdas devido ao processamentoda amostra. O RNA quimérico pode ser seco para armazenagem oudissolvido em uma solução aquosa. A qualidade das moléculas de RNAquiméricas sintetizadas pode ser verificada por eletroforese capilar e HPLCaniônica forte desnaturante HPLC (SAX-HPLC) usando, e.g., o método deBergot e Egan. 1992. J. Chrom. 599:35.

1.4 Introdução do RNA quimérico em células e organismo

O RNA quimérico da invenção ou seus agentes de liberação oude produção (e.g., vetores ou construtos de expressão) (daqui em diante juntoso "agente RNA") pode ser introduzido em um organismo ou em uma célulaem várias maneiras com as quais o técnico experiente está familiarizado."Introduzir " é para ser entendido no sentido amplo e compreende, para ospropósitos da presente invenção, todos aqueles métodos que são adequadospara introduzir direta ou indiretamente, em um organismo ou em uma célula,um compartimento, um tecido, um órgão ou uma semente da mesma, umagente RNA da invenção, ou gerá-lo(s) na(o) mesma(o). A introdução podeocasionar a presença transiente de um agente RNA, senão uma presençaestável.

Assim um outro aspecto da invenção refere-se às células ou aoorganismo (e.g., planta, animal, protozoário, vírus, bactéria, ou fungo), quecompreende pelo menos um RNA quimérico da invenção, ou um agente RNA(e.g., um construto de expressão ou vetores de expressão codificadores decitada molécula de RNA quimérica). Em certas modalidades, a célula estásuspensa em cultura; enquanto que em outras modalidades a célula está em(ou parte de) um organismo inteiro (e.g., um microorganismo, planta ou umanimal, tal como um mamífero não-humano). A célula pode ser de naturezaprocariótica ou eucariótica. Preferivelmente, o construto de expressão écompreendido de DNA genômico, com maior preferência está dentro de DNAplastídico ou cromossômico, mais preferivelmente no DNA cromossômico dacélula.

A célula possuindo o gene alvo pode ser de linhagemgerminativa ou somática, totipotente ou pluripotente, se dividindo ou não-se-dividindo, de parênquima ou epitélio, imortalizada ou transformada, ousemelhante. A célula pode ser um gameta ou um embrião; se um embrião, elapode ser um embrião unicelular ou uma célula constituinte ou células de umembrião multicelular. O termo "embrião" assim também inclui tecido fetal. Acélula possuindo o gene alvo pode ser uma célula indiferenciada, tal comouma célula-caule, ou uma célula diferenciada, tal como uma célula de umórgão ou tecido, incluindo tecido fetal, ou qualquer outra célula presente emum organismo. Tipos de célula que são diferenciados incluem adipócitos,fibroblastos, miócitos, cardiomiócitos, endotélio, neurônios, glia, célulassangüíneas, megacariócitos, linfócitos, macrófagos, neutrófilos, eisonófilos,basófilos, mastócitos, leucócitos, granulócitos, queratinócitos, condrócitos,osteoblastos, osteoclastos, hepatócitos, e células de glândulas endócrina eexócrina.

Procariotes preferidos são principalmente bactérias tais comobactérias do gênero Escherichia, Corynebacterium, Bacillus, Clostridium,Proionibacterium, Butyrivibrio, Eubacterium, Lactobacillus, Erwinia,Agrobacterium, Flavobacterium, Alcaligenes, Phaeodactylum, Colpidium,Mortierella, Entomophthora, Mucor, Crypthecodinium or Cyanobacteria, porexemplo do gênero Syneehocystis. Microorganismos que são preferidos sãoprincipalmente aqueles que são capazes de infectar plantas e portanto detransferirem os construtos de acordo com a invenção. Microorganismospreferidos são aqueles do gênero Agrobacterium e em particular as espéciesAgrobacterium tumefaciens e rhizogenes.

Organismos e células eucarióticos compreendem organismose/ou células de planta e de animal (preferivelmente não-humano) emicroorganismos eucarióticos tais como, por exemplo, leveduras, algas oufungos. Um organismo transgênico correspondente pode ser gerado porexemplo pela introdução de sistemas de expressão em questão em um zigoto,célula-caule, protoplasto ou outra célula adequada que é derivada doorganismo. Um animal transgênico que expressa um RNA quimérico dainvenção de um construto de expressão recombinante pode ser produzido pelaintrodução do construto em um zigoto, uma célula-caule embrionária, ououtra célula multipotente derivada do organismo apropriado. Um construtoviral empacotado em uma partícula viral realizaria tanto introdução eficientede um construto de expressão dentro da célula quanto a transcrição de RNAcodificado pelo construto de expressão. Vetores adequados são conhecidos naarte (veja e.g., Shi, Y. 2003. Trends Genet 2003 Jan 19:9; Reichhart JMe/al.Genesis. 2002. 34(1-2): 160-4, Yu et al. 2002. Proc Natl Acad Sci U S A99:6047; Sui et al. 2002. Proc Natl Acad Sci U S A 99:5515).

A planta pode ser uma monocotiledônea, dicotiledônea ougimnosperma; o animal pode ser um vertebrado ou invertebrado. Organismosde planta e de animal preferidos são especificados acima na seção deDEFINIÇÃO. Fungos preferidos são Aspergillus, Trichoderma, Ashbya,Neurospora, Fusarium, Beauveria ou outros fungos descritos em Indian ChemEngr. Section B. Vol 37, No 1,2 (1995), página 15, Tabela 6. Especialmentepreferido é o fungo filamentoso Hemiascomycete Ashbya gossypii. Leveduraspreferidas são Candida, Saccharomyces, Hansenula ou Pichia, especialmentepreferidas são Saccharomyces cerevisiae ou Pichia pastoris (No. de acesso emATCC: 201178). Organismos de animal especialmente preferidos sãonematódeos.

Preferidos como organismos são organismos de planta. Plantaspreferidas são selecionadas em particular dentre plantas de colheita. Maispreferidas são:

a) Plantas que são adequadas para produção de óleo tais como, colza,girassol, gergelim, cártamo (Carthamus tinctorius), oliveira, feijão-soja, milho, amendoim, feijão-soja, milho, amendoim, Rícino,palma oleosa, trigo, cacaueiro, ou várias espécies de nogueiras taiscomo, nogueira, coqueiro ou amendoeira. Especialmente preferidasdentre estas, por sua vez, são plantas dicotiledôneas, em particularcolza e girassol.

b) Plantas, que servem para a produção de amido, tais como, porexemplo, milho, trigo ou batateira.

c) Plantas, que são usadas como gêneros alimentícios e/ou rações e/ouplanta útil e nas quais uma resistência a patógenos seria vantajosatais como, por exemplo, cevada, centeio são usadas como gênerosalimentícios e/ou gêneros de ração e/ou planta útil e nas quais umaresistência a patógenos seria vantajosa tais como, por exemplo,cevada, centeio, arroz, batateira, algodoeiro, linho, ou linhaça.

d) Plantas, que podem servir para a produção de compostos dequímica fina tais como, por exemplo, vitaminas e/ou carotenóide talcomo, por exemplo, colza.

Variedades de planta podem ser excluídas, particularmentevariedades de planta registráveis de acordo com Direitos dos Procriadores dePlantas. E para se observado que uma planta não necessita ser consideradauma "variedade de planta" simplesmente porque ela contém estavelmentedentro de seu genoma um transgene, introduzido em uma célula da planta oude um seu ancestral. Em adição a uma planta, a presente invençãoproporciona qualquer clone de uma tal planta, semente, ou progênie auto-fertilizada ou híbrida e descendentes, e qualquer parte ou propágulo dequalquer um destes, tais como podas e semente, que podem ser usados nareprodução ou propagação, sexual ou assexual. Também é incluída pelainvenção uma planta que é uma prole sexual ou assexualmente propagada,clone ou descendente de uma tal planta, ou qualquer parte ou propágulo decitada planta, prole, clone ou descendente. Plantas geneticamentemodificadas de acordo com a invenção, que podem ser consumidas porhumanos ou animais, também podem ser usadas como alimento ou gênerosalimentícios, por exemplo diretamente ou após processamento conhecido naarte. A presente invenção também proporciona as partes do organismoespecialmente plantas, particularmente partes de armazenagem oureprodutivas. Partes de planta, sem limitação, incluem semente, endosperma,óvulo, pólen, raízes, tubérculos, caules, folhas, talos, frutos, bagas, nozes,cascas, vagens, sementes e flores. Em uma modalidade particularmentepreferida da presente invenção, a parte de planta é uma semente.

O agente RNA (e.g., a molécula de RNA quimérica dainvenção) é tipicamente introduzida ou administrada em uma quantidade quepermite a liberação de pelo menos uma cópia por célula. Quantidades maiores(por exemplo pelo menos 5, 10, 100, 500 ou 1000 cópias por célula) pode, seapropriadas, afetarem um fenótipo mais eficiente (e.g., expressão maior ousupressão maior dos genes alvo). A quantidade de agente RNA administrada auma célula, um tecido, ou um organismo depende da natureza da célula, dotecido, ou do organismo, da natureza do gene alvo, e da natureza do agenteRNA, e pode ser prontamente otimizada para obter o nível desejado deexpressão ou inibição.

Preferivelmente pelo menos cerca de 100 moléculas,preferivelmente pelo menos cerca de 1.000 moléculas, com maior preferênciapelo menos cerca de 10.000 moléculas de agente RNA, mais preferivelmentede pelo menos cerca de 100.000 moléculas de agente RNA são introduzidas.No caso de administração de agente RNA a uma cultura de células ou àscélulas em tecido, por métodos diferentes de injeção, por exemplo, porimbibição, eletroporação, ou transfecção mediada por lipídeo, as células sãopreferivelmente expostas aos níveis similares de agente RNA no meio.

Por exemplo o agente RNA pode ser introduzido em célulasvia transformação, transfecção, injeção, projeção, conjugação, endocitose, efagocitose. Métodos preferidos para introdução compreende mas não sãolimitados a:

a) métodos de introdução direta ou física da molécula de RNAquimérica da invenção na célula alvo ou no organismo alvo, e

b) métodos de introdução indireta de RNA quimérico da invenção nacélula alvo ou no organismo alvo (e.g., por uma primeira introduçãode um construto de expressão e uma subseqüente expressãointracelular).

1.4.1 Introdução direta ou física de RNA em células alvo ouem organismo alvo

No caso de RNA quimérico da invenção (um agente RNA) serproduzido fora da célula alvo ou do organismo alvo, ele pode ser contatadocom (i.e., trazido para contato com, também aqui referido como administradoou liberado para) e capturado por um ou mais de célula ou o organismo alvo(preferivelmente humano, patógeno ou células de planta ou organismos). Ocontato pode ser in vitro, e.g., em um tubo de ensaio ou em uma placa decultura, (e pode ou não ser introduzido em um indivíduo) ou in vivo, e.g., emum indivíduo tal como um indivíduo mamífero, patógeno ou planta. Opatógeno é preferivelmente um nematódeo.

O RNA quimérico da invenção (ou um agente RNA) pode serdiretamente introduzido na célula (i.e., intracelularmente); ou introduzidoextracelularmente em uma cavidade, espaço intersticial, na circulação de umorganismo, introduzido oralmente, ou pode ser introduzido por banho de umorganismo em uma solução contendo o RNA quimérico da invenção (ou umagente RNA). Métodos para introdução oral incluem misturação direta deRNA com alimento do organismo, bem como abordagens engenhadas nasquais uma espécie que é usada como alimento é engenhada para expressar umRNA quimérico da invenção (ou um agente RNA), então alimentado aoorganismo a ser afetado.

Métodos físicos de introdução de ácidos nucleicos inclueminjeção de uma solução de RNA quimérico da invenção (ou um agente RNA)diretamente dentro da célula ou injeção extracelular dentro do organismo. Porexemplo, no caso de um embrião ou uma célula, o RNA quimérico dainvenção (ou um agente RNA) é convenientemente administrado pormicroinjeção; outros métodos de introdução de ácidos nucleicos em umacélula incluem bombardeio por partículas cobertas com o RNA quimérico dainvenção (ou um agente RNA), imbibição da célula ou do organismo em umasolução do RNA quimérico da invenção (ou um agente RNA), eletroporaçãode membranas celulares na presença do RNA quimérico da invenção (ou umagente RNA), liberação mediada por lipossomo do RNA quimérico dainvenção (ou um agente RNA) e transfecção mediada por agentes químicostal como fosfato de cálcio.

O agente RNA quimérico da invenção (ou um agente RNA)pode ser introduzido juntamente com componentes que intensificam acaptação de RNA pela célula, ou diferentemente aumentam suafuncionalidade. Liberação para dentro de células pode ser intensificada pormétodos reconhecidos da arte adequados incluindo métodos conhecidos naarte usando fosfato de cálcio, DMSO, glicerol ou dextrano, eletroporação, oupor transfecção, e.g., usando lipossomos ou composições lipídicas catiônicas,aniônicas ou neutras (veja e.g., WO 90/14074; WO 91/16024; WO 91/17424;US 4.897.355; Bergan et ai. 1993. Nucleic Acids Research. 21:3567).Também conjugados de policátion ou poliamina usando compostos tais comopolilisina, protamina, ou NI, N12-bis (etil) espermina (veja, e.g., Bartzatt, R.etal. 1989. Biotechnol. Appl. Biochem. 11:133; Wagner E. et al 1992. Proc.Natl. Acad. Sei. 88:4255) podem ser empregados. No caso de uma cultura decélulas ou de um explante de tecido, as células são convenientementeincubadas em uma solução contendo o RNA quimérico da invenção (ou umagente RNA) ou por transfecção mediada por lipídeo; no caso de uma plantaou um animal inteiro, o RNA quimérico da invenção (ou um agente RNA) éconvenientemente introduzido por injeção ou perfusão em uma cavidade ouespaço intersticial de um organismo, ou sistemicamente via administraçãooral, tópica, parenteral (incluindo administração subcutânea, intramuscular eintravenosa), vaginal, retal, intranasal, oftálmica, ou intraperitoneal.

Em adição, o RNA quimérico da invenção (ou um agenteRNA) pode ser administrado via um dispositivo de liberação prolongadaimplantável. Métodos para introdução oral incluem misturação direta de RNAcom alimento do organismo, bem como abordagens engenhadas nas quaisuma espécie que é usada como alimento é engenhada para expressar umRNA, então alimentada ao organismo a ser afetado. O RNA quimérico dainvenção (ou um agente RNA) pode ser pulverizado sobre uma planta ou umaplanta pode ser geneticamente engenhada para expressar o RNA em umaquantidade suficiente para matar um pouco do ou todo o patógeno conhecidopor infectar a planta.

1.4.2 Introdução indireta de RNA

Alternativamente, o agente RNA pode ser fornecido a umacélula indiretamente pela introdução (e.g. por transformação ou transfecção)de um ou mais construtos de expressão ou vetores de expressão que codificama molécula de RNA quimérica da invenção. A expressão do RNA quiméricoda invenção pode ser transiente ou - por exemplo após integração no genoma(por exemplo usando marcadores de seleção) do organismo - estável.Preferivelmente para aplicação farmacêutica, o agente RNA é introduzidotransientemente, e não estavelmente integrado no genoma. Preferivelmentepara aplicações em plantas, o sistema de expressão de RNA quimérico éintegrado estavelmente no genoma - por exemplo o DNA cromossômico ou oDNA das organelas (por exemplo os plastídeos (e.g., cloroplastos),mitocôndria e semelhante) - de uma célula. Integração no DNAcromossômico é preferida.

Vetores e construtos de expressão são geralmente descritosacima (veja seção de DEFINIÇÃO e seção 1.3.1). Construtos de expressãopreferidos são descritos em mais detalhe abaixo para aplicações específicas dacomposição e dos métodos da presente invenção. Métodos para fornecer umacélula com RNA pela introdução de um vetor ou construto de expressão doqual ela pode ser transcrita são descritos em WO 99/32619. Principalmentetambém todos os métodos para introdução direta de moléculas de RNA emcélulas como descritas acima podem ser empregadas para introdução demoléculas de ácido nucleico parecendo-se com o vetor ou construto deexpressão.

2. Aplicações de RNA quimérico da invenção

A invenção possui amplas oportunidades de aplicação,preferivelmente no campo de plantas, humanos e animais. Geralmente, osmétodos e o tema da invenção podem ser usados para aumentar ou diminuir aespecificidade mais alta da expressão de qualquer gene ou seqüência deinteresse incluindo ácidos nucleicos, proteína e peptídeos imunogênicos outerapêuticos para controlar expressão de gene, genes para reproduzir rotasenzimáticas para síntese química, genes para desviar uma rota enzimática paraexpressão intensificada de um intermediário particular ou produto final,processos industriais, e semelhante.

Em uma modalidade preferida, o organismo eucariótico é umaplanta e o promotor é um promotor funcional em plantas. Para plantas, aseqüência de nucleotídeos expressada preferivelmente modula a expressão deum gene envolvidos em feições agronômicas, resistência à doença, resistênciaa herbicida, e/ou características de grão. A pessoa experiente na arte estáciente de numerosas seqüências de nucleotídeos que podem ser usadas nocontexto e para as quais uma especificidade de expressão aumentada évantajosa. A seqüência de nucleotídeos alvo compreende qualquer seqüênciade nucleotídeos ou gene-de-interesse, incluindo genes, seqüênciasregulatórias, etc. Genes de interesse incluem aqueles codificadores de feiçõesagronômicas, resistência a inseto, resistência à doença, resistência aherbicida, esterilidade, características de grão, e semelhante. Os genes podemestar envolvidos em metabolismo de óleo, amido, carboidratos, nutrientes, etc.Genes ou feições de interesse incluem, mas não são limitados a, feiçõesrelacionadas com ambiente ou estresse, feições relacionadas com doenças, efeições que afetam o desempenho agronômico. As seqüências alvo tambémincluem genes responsáveis pela síntese e/ou degradação de proteínas,peptídeos, ácidos graxos, lipídeos, ceras, óleos, amidos, açúcares,carboidratos, aromatizantes, odores, toxinas, carotenóides, hormônios,polímeros, flavonóides, proteínas de armazenagem, ácidos fenólicos,alcalóides, ligninas, taninos, celuloses, glicoproteínas, glicolipídeos, etc.

Várias aplicações em plantas são aqui contempladas para asquais modulação do perfil de expressão em certas direções é vantajosa. Estamodulação é alcançada por seleção de etiqueta-microRNA em uma maneira,que o perfil de expressão do miRNA naturalmente ocorrente ajusta-se aostecidos, tempos, e/ou sob condições ambientais onde nenhuma expressão ouexpressão menor deve ser alcançada. Por exemplo, o microRNA possui umperfil de expressão natural na planta selecionado do grupo consistindo de:

a) expressão substancialmente constitutiva mas não expressão emsemente,

b) expressão predominante em sementes mas não em outros tecidos,

c) expressão induzida por seca ou por outro estresse abiótico,

d) expressão induzida por patógeno de planta,

e) expressão temporal (e.g., durante polinização, germinação,desenvolvimento inicial etc.), e

f) expressão quimicamente induzida.

a) as seqüências como descritas pela SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8,9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26,27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44,45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 225, 226, 227, 228, 229,230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242,243, 245, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255,256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, e 266, e

b) derivados das seqüências descritas pela SEQ ED NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6,7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25,26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43,44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 225, 226, 227, 228,229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241,242, 243, 245, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254,255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, e 266.

Um derivado é preferivelmente uma seqüência, que cumpretotalmente o mesmo propósito endógeno funcional (e.g., certas funções decontrole de gene) em um organismo de uma espécie diferente (i.e. diferente daespécie onde o miRNA descrito é derivado). Citados derivados podem possuircertas más combinações com respeito às seqüências especificamentedescritas, preferivelmente um derivado é caracterizado por possuir umaidentidade de pelo menos 70%, preferivelmente pelo menos 80% ou 85%,com maior preferência de pelo menos 90%, mais preferivelmente de pelomenos 95% em relação a uma seqüência descrita por qualquer uma de SEQID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42,43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 225, 226, 227, 228, 229, 230,231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 245, 245,246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260,261, 262, 263, 264, 265, e 266. As más combinações com o miRNAespecificado podem ser em todo a seqüência mas estão preferivelmente naregião 3' do miRNA (correspondendo à região 5'da etiqueta-miRNAcomplementar). Aplicações mais específicas em plantas são descritas aquiabaixo.

Outras aplicações da invenção aqui proporcionadas são usadasem animais (especialmente mamíferos) ou humano. São especialmentepreferidas as aplicações farmacêuticas. Assim, em outra modalidade preferidada invenção o organismo alvo é um mamífero (mais preferivelmente um serhumano) e o promotor é um promotor funcional em mamíferos (maispreferivelmente em humanos). A seqüência de nucleotídeos expressadacompreendendo etiqueta-miRNA preferivelmente modula (e.g., expressa,sobre-expressa, ou suprime) a expressão de um gene selecionado do grupoconsistindo de genes envolvidos em uma doença de humano ou de animal oué um gene terapêutico. Alternativamente, podem ser expressados genes ouseqüências exógenas que possuem um efeito curativo sobre o organismoalvo.A doença é preferivelmente selecionada do grupo de doençasimunológicas, câncer, diabetes* neurodegeneração, e doenças do metabolismo.

A pessoa experiente na arte está ciente de numerosas seqüências que podemser usadas neste contexto. O gene modulado pode ser selecionado do grupoconsistindo de proteína de retinoblastoma, p53, angiostatina, leptina,hormônios, fatores de crescimento, citocinas, insulina, hormônios decrescimento, alfa-interferon, beta-glicocerebrosidase, albumina de soro,hemoglobina, e colágeno. Genes terapêuticos podem ser selecionados dogrupo consistindo de fator alfa de necrose de tumor (ADD). Neste contexto ainvenção aqui descrita é um método melhorado para terapia genética outerapia mediada por nucleotídeo.

Vários promotores são correntemente usados na arte paraexpressar seqüências em organismo de animal, de mamífero ou de humano.Eles são em sua maioria faltantes de especificidade para tecido e podem servantajosamente combinados com o ensinamento aqui proporcionado. Porexemplo o promotor pode ser selecionado do grupo consistindo de promotorperbB2, promotor de proteína ácida de soro de leite, promotor deestromelisina 3, promotor de antígeno específico de próstata, promotor deprobasina.

Várias aplicações em organismo de animal, de mamífero ou dehumanos são aqui contempladas para as quais modulação do perfil deexpressão em certas direções é vantajosa. Esta modulação é alcançada pelaseleção da etiqueta-microRNA em uma maneira, que o perfil de expressão domiRNA naturalmente ocorrente se ajusta aos tecidos, tempos, e/ou sobcondições ambientais onde nenhuma expressão ou expressão menos deve serrealizada. Por exemplo, o microRNA possui um perfil de expressão natural noorganismo de animal, de mamífero ou de humano selecionado do grupoconsistindo de:

a) expressão tecido-específica em um tecido selecionado do grupoconsistindo de tecido cerebral, tecido hepático, tecido muscular,tecido neuronal, e tecido tumoral.

b) expressão induzida por estresse,

c) expressão induzida por patógeno,

e) expressão dependente da idade.

Preferivelmente, o microRNA é um microRNA de animal, demamífero ou de humano. Centenas de miRNAs têm sido clonados de órgãosde camundongo e de humano e de linhagens celulares, e numerosos miRNAsadicionais têm sido preditos com algoritmos computacionais (Lagos-QuintanaM et al. Science 2001, 294:853-858; Lagos-Quintana M et ai. Curr Biol2002, 12:735-739; Lagos-Quintana M et al. RNA 2003, 9:175-179; Lim LP etal. Science 2003, 299:1540; Mourelatos Z et al. Genes Dev 2002, 16:720-728;Dostie J et al RNA 2003, 9:180-186). Vários destes microRNAs e seu perfil deexpressão são descritos na arte (veja por exemplo Sempere LF et al. GenomeBiology 2004, 5:R13; eletronicamente disponíveis online emhttp://genomebiology.eom/2004/5/3/R13): aqui incorporado como referênciainteiramente incluindo as referências lá citadas). Sempere et al.caracterizaram a expressão de 119 miRNAs em órgãos de adulto decamundongo e de humano usando análise por Northern blot. Destes, 30miRNAs foram especificamente expressados ou grandemente enriquecidosem um órgão particular (cérebro, pulmão, fígado ou músculo esquelético).Um total de miRNAs expressados em cérebro (incluindo ortólogos lin-4 e Iet-7) foram coordenadamente supra-regulados em ambas as células decarcinoma de humano e de camundongo durante diferenciação neuronal.miRNAs de humano e de camundongo muitas vezes demonstram umahomologia alta (cerca de 90%) e podem ser intercambiáveis (veja Fig. 5 emSempere et al. 2004).

Um total de 17 dos miRNAs expressados foi detectadoexclusivamente em um órgão de camundongo particular; estes incluíram: setemiRNAs específicos de cérebro (miR-9, -124a, -124b, -135,-153,-183,-219),seis miRNAs específicos de pulmão (miR-18, -19a, -24, -32, -130, -213), doismiRNAs específicos de baço (miR-189, -212), um miRNA específico defígado (miR-122a), e um miRNA específico de coração (miR-208) (Sempereet al. 2004; Figure 2). Os miRNAs específicos de cérebro, de fígado e decoração indicados também foram detectados em sua maioria em órgãoscorrespondentes de humanos. Dentre os 75 miRNAs que foram detectados emdois ou mais órgãos de camundongo, os níveis de 14 destes foram detectadosem um órgão de camundongo particular em níveis de pelo menos duas vezesmais altos do que em qualquer outro órgão; estes incluíram: sete miRNAsenriquecidos em cérebro (miR-9*, -125a, -125b, -128,-132,-137, -139), trêsmiRNAs enriquecidos em músculo esquelético (miR-ld, -133, -206), doismiRNAs enriquecidos em rim (miR- 30b, -30c), e um miRNA enriquecidoem baço (miR-99a). Todos os miRNAs enriquecidos em cérebro eenriquecidos em músculo esquelético tiveram níveis elevados similares nosórgãos correspondentes de humano. Há uma conservação alta de expressãodestes miRNAs específicos de órgão e enriquecidos em órgão entrecamundongo e humano.

Um grupo se seis miRNAs foi expressado primariamente embaço de camundongo (miR-127, -142-a, -142- s, -151, -189, -212). Um grupode cinco miRNAs foi expressado em fígado de camundongo e de humano(miR-122a, -152, -194, -199, -215) com alguma expressão espalhada emoutros órgãos incluindo pulmão e rim.

Um grupo de sete miRNAs foi expressado em rim e pulmão decamundongo (miR-18, -20, -24, -32, -141, -193, - 200b). Juntos, os últimosdois grupos podem refletir um papel de miRNAs em um tipo de célulaepitelial porque fígado, pulmão, e rim são órgãos contendo tecidos epiteliais.

Um grupo de 17 miRNAs foi expressado em cérebro decamundongo e de humano (miR-7, - 9, -9*, -124a, -124b, -125a, -125b, -128,-132, -135, -137, -139, -153, -149, -183, -190, -219) com expressão espalhadaem outros órgãos.

Um grupo de seis miRNAs foi expressado em coração emúsculo esquelético de camundongo e de humano: miR-lb, -ld, -133 e - 206tiveram expressão elevada em coração e músculo esquelético com expressãobaixa em outros órgãos e miR-143 e -208 foram quase exclusivamentedetectados em coração e músculo esquelético.

Um grupo de cinco miRNAs mostrou expressão abundanteatravés de órgãos (let-7a, -7b, miR-30b, - 30c).

As seqüências de miRNA são bem conhecidas na arte edescritas por exemplo em Sempere et ai. 2004 e os dados adicionaiseletronicamente disponíveis para este ensaio. Por exemplo algumas dasetiquetas-miRNA são aqui especificadas: hsa-miR-19a (SEQ ID NO: 90), hsa-let7b (SEQ ID NO: 91), hsa-miR-100 (SEQ ID NO: 92), hsa-miR-103-1(SEQ ID NO: 93), hsa-miR-107 (SEQ ID NO: 94), hsa-miR-IOa (SEQ IDNO: 95), hsa-miR-124b (SEQ ID NO: 96), hsa-miR-129a (SEQ ID NO: 97),hsa-miR-139 (SEQ ID NO: 98), hsa-miR-147 (SEQ ID NO: 99), hsa-miR-148(SEQ ID NO: 100), hsa-miR-15a (SEQ ID NO: 101), hsa-miR-16 (SEQ IDNO: 102), hsa-miR-18 (SEQ ID NO: 103), hsa-miR-192 (SEQ ID NO: 104),hsa-miR-196 (SEQ ID NO: 105), hsa-miR-199a (SEQ ID NO: 106), hsa-let7a(SEQ ID NO: 107), hsa-miR-24 (SEQ ID NO: 108), hsa-miR-20 (SEQ IDNO: 109), hsa-miR-208 (SEQ ID NO: 110), hsa-miR-210 (SEQ ID NO: 111),hsa-miR-212 (SEQ ID NO: 112), hsa-miR-213 (SEQ ID NO: 113), hsa-miR-214 (SEQ ID NO: 114), hsa-miR-215 (SEQ ID NO: 115), hsa-miR-216 (SEQID NO: 116), hsa-miR-217 (SEQ ID NO: 117), hsa-miR-218 (SEQ ID NO:118), hsa-miR-219 (SEQ ID NO: 119), hsa-miR-22 (SEQ ID NO: 120), hsa-miR-220 (SEQ ID NO: 121), hsa-miR-221 (SEQ ID NO: 122), hsa-miR-222(SEQ ID NO: 123), hsa-miR-23a (SEQ ID NO: 124), hsa-miR-19b (SEQ IDNO: 125), hsa-miR-96 (SEQ ID NO: 126), hsa-miR-26b (SEQ ID NO: 127),hsa-miR-27a (SEQ ID NO: 128), hsa-miR-28 (SEQ ID NO: 129), hsa-miR-29(SEQ ID NO: 130), hsa-miR-29b (SEQ ID NO: 131), hsa-miR-30a (SEQ IDNO: 132), hsa-miR-30c (SEQ ID NO: 133), hsa-miR-30d (SEQ ID NO: 134),hsa-miR-30e (SEQ ID NO: 135), hsa-miR-32 (SEQ ID NO: 136), hsa-miR-33(SEQ ID NO: 137), hsa-miR-7 (SEQ ID NO: 138), hsa-miR-91 (SEQ ID NO:139), hsa-miR-92 (SEQ ID NO: 140), hsa-miR-93 (SEQ ID NO: 141), hsa-miR-95 (SEQ ID NO: 142), hsa-miR-98 (SEQ ID NO: 143), hsa-miR-26a(SEQ ID NO: 144). Estas seqüências especificam a etiqueta-miRNApotencial. O miRNA correspondente é a seqüência complementar em RNA.

Preferivelmente, o microRNA é um microRNA de animal, demamífero ou de humano selecionado do grupo consistindo de:a) as seqüências como descritas pela SEQ ID NO: 56, 57, 58, 59, 60,61, 62, e 63, e

Um derivado é preferivelmente uma seqüência, que realiza omesmo propósito endógeno funcional (e.g., certas funções de controle degene) em um organismo de uma espécie diferente (i.e. diferente da espécieonde o miRNA descrito é derivado). Citados derivados podem possuir certasmás combinações com respeito às seqüências especificamente descritas,preferivelmente um derivado é caracterizado possuindo uma identidade depelo menos 70%, preferivelmente pelo menos 80% ou 85%, com maiorpreferência de pelo menos 90%, mais preferivelmente de pelo menos 95% emrelação a uma seqüência descrita por qualquer uma de SEQ ID NO: 56, 57,58, 59, 60, 61, 62, e 63 ou uma seqüência de RNA complementar a umaseqüência como descrita por qualquer uma de SEQ ID NO: 90, 91, 92, 93, 94,95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111,112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126,127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141,142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156,157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171,172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186,187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201,202, 203, 204, 205, 206, 207, ou 208. As más combinações com o miRNAespecificado podem estar na seqüência inteira mas estão preferivelmente naregião 3' (correspondendo à região 5' da etiqueta miRNA).

Outra modalidade da invenção refere-se a uma preparaçãofarmacêutica de pelo menos um construto de expressão, uma seqüência deribonucleotídeos quimérica, ou um vetor de acordo com a invenção.

Aplicações mais específicas em animais e humanos,especialmente no campo de aplicações farmacêuticas são descritas aquiabaixo.

Como mencionado acima o método e o tema da invençãopodem ser empregados para aumentar a especificidade de expressão paraseqüência de nucleotídeos quimérica, que podem codificar:

i) uma proteína (i.e. por compreender uma matriz de leitura aberta(ORF),ii) um RNA funcional (e.g., um RNA de anti-senso, de senso, de fitadupla ou de ribozima), que é preferivelmente empregado em umaabordagem de silenciamento de gene.

2.1 Expressão com especificidade intensificada

O método para expressão ou sobre-expressão de seqüências denucleotídeos em vários organismos é bem conhecido pela pessoa experientena arte (Maniatis T, Fritsch EF e Sambrook J (1989) Molecular Cloning: ALaboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold SpringHarbor (NY); Silhavy et al. (1984) Experiments with Gene Fusions, ColdSpring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY); Ausubel et al. (1987)Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and WileyInterscience; veja seção 3.3 para alguns detalhes).

2.2 Silenciamento de gene com especificidade intensificada

As moléculas de RNA quiméricas da invenção, os construtosde expressão e os vetores de expressão para sua expressão, e o organismotransgênico compreendendo as citadas moléculas poderiam ser utilizados emsilenciamento de gene (i.e. para atenuar, reduzir ou suprimir expressão degenes alvo em organismo ou células alvo). Para isto RNA quimérico podecompreender seqüências, que são capazes de proporcionar um RNA de anti-senso (para silenciamento de gene mediado por RNA de anti-senso), RNA defita dupla (para silenciamento de gene mediado por dsRNA) ou senso-RNA(para silenciamento de gene por co-supressão).

Os métodos da invenção acarretarão resultados melhores e/oueficiências mais altas quando comparados com os métodos usando seqüênciasde nucleotídeos de RNA de senso, de anti-senso ou de fita dupla.

Outra modalidade da invenção refere-se à composição paraalterar, preferivelmente reduzir ou atenuar, a expressão de um gene alvo,compreendendo pelo menos um RNA quimérico da invenção. Ainda outramodalidade da invenção refere-se a um método para atenuar (ou reduzir ousuprimir) expressão de pelo menos um gene alvo em uma célula eucariótica,compreendendo introduzir uma molécula de RNA quimérica da invenção (ouum vetor ou construto de expressão codificador da mesma) nas células emuma quantidade suficiente para atenuar a expressão do gene alvo, na qual amolécula de RNA quimérica compreende pelo menos uma seqüência deribonucleotídeos que é substancialmente idêntica a pelo menos uma parte daseqüência de nucleotídeos do gene alvo.

Qualquer gene sendo expressado em uma célula(preferivelmente em uma célula eucariótica) pode ser selecionado. Um geneque é expressado na célula é um que é transcrito para dar um RNA (e.g., ummRNA) e, opcionalmente, uma proteína. Preferivelmente o gene alvo é umgene eucariótico, mais preferivelmente um gene de mamífero, de nematódeo,de fungo ou de planta. Preferivelmente o gene alvo é um gene endógeno dacélula ou um gene heterólogo relativo ao genoma da célula, tal como um genede patógeno. Preferivelmente, o gene de um patógeno é de um patógeno capazde infectar um organismo eucariótico. Mais preferivelmente, o citadopatógeno é selecionado do grupo de vírus, bactérias, fungos e nematódeos.

O RNA quimérico pode ser produzido fora da célula (i.e. acélula hospedeira na qual o silenciamento de gene deve ser alcançado), oupode ser recombinantemente produzido por um construto de expressão ouvetor de expressão dentro da célula. A célula hospedeira é preferivelmenteuma célula eucariótica, com maior preferência uma célula de nematódeo, demamífero ou de planta.

Preferivelmente, a expressão do gene alvo é atenuada (oureduzida ou suprimida) em pelo menos cerca de 10%, preferivelmente pelomenos cerca de 30%, com maior preferência de pelo menos cerca de 50%,ainda com maior preferência de pelo menos cerca de 70%, maispreferivelmente de pelo menos cerca de 90%.

Para alcançar o silenciamento de gene o RNA quimérico dainvenção compreende pelo menos uma seqüência de ribonucleotídeos que ésubstancialmente idêntica (como definido acima), preferivelmente idêntica, apelo menos uma parte de pelo menos um gene alvo. Preferivelmente, a citadaparte de um gene alvo possuindo identidade substancial em relação à citadaseqüência de ribonucleotídeos possui um comprimento de pelo menos 15nucleotídeos, preferivelmente pelo menos 19 nucleotídeos, com maiorpreferência de pelo menos 50 nucleotídeos, ainda com maior preferência depelo menos 100 nucleotídeos, mais preferivelmente de pelo menos 250nucleotídeos. Mais preferivelmente, a citada seqüência de nucleotídeos possuiuma identidade de pelo menos 65%, preferivelmente pelo menos 80%, commaior preferência de pelo menos 90%, mais preferivelmente 95%, ainda maispreferivelmente 100% em relação a uma seqüência de pelo menos 15nucleotídeos, preferivelmente pelo menos 19 nucleotídeos, com maiorpreferência de pelo menos 50 nucleotídeos, ainda mais preferivelmente 100nucleotídeos, mais preferivelmente de pelo menos 250 nucleotídeos de pelomenos um gene alvo. Preferivelmente, a citada primeira seqüência deribonucleotídeos hibridiza (preferivelmente sob condições estringentes, commaior preferência sob condições de estringência baixa, mais preferivelmentesob condições de estringência alta) em uma seqüência do gene alvo.

Em uma modalidade preferida a seqüência de nucleotídeos ésubstancialmente idêntica, preferivelmente idêntica, a uma parte da seqüênciacodificadora ou da seqüência não codificadora do gene alvo (preferivelmenteum gene eucariótico, tal como um gene de mamífero ou de planta). Aseqüência não codificadora pode ser a seqüência não traduzida 5' ou 3' ou osíntrons mas também pode ser uma seqüência não traduzida. Seqüências nãocodificadoras com seqüência alvo são preferidas nos casos onde o gene alvocodifica um membro de uma família de genes (i.e. genes diferentescodificadores de proteínas muito similares).

O gene alvo pode ser um gene endógeno ou um gene exógenoou estranho (i.e., um transgene ou um gene patógeno). Por exemplo, umtransgene que está presente no genoma de uma célula como um resultado daintegração genômica do construto de liberação viral pode ser regulado usandoRNA quimérico de acordo com a invenção. O gene estranho pode serintegrado no genoma hospedeiro (preferivelmente o DNA cromossômico), ouele pode estar presente em um construto genético extracromossômico talcomo um plasmídeo ou cosmídeo. Por exemplo, o gene alvo pode estarpresente no genoma da célula no qual o RNA quimérico é introduzido, ou nogenoma de um patógeno, tal como um vírus, uma bactéria, um fungo ou umprotozoário, que é capaz de infectar tal organismo ou célula.

O organismo ou célula eucariótica no(a) qual o RNAquimérico da invenção pode ser liberado pode ser derivado de qualquerorganismo eucariótico, tal como por exemplo sem limitação, plantas ouamimais, tais como mamíferos, insetos, nematódeos, fungos, algas, peixes, epássaros. Igualmente, a molécula de RNA quimérica da invenção ou osvetores ou construtos de expressão para sua expressão podem ser usados parasuprimir ou reduzir qualquer gene alvo em qualquer organismo eucariótico.Em algumas modalidades da invenção também são úteis organismosprocarióticos compreendendo o RNA quimérico da invenção. Por exemploorganismo ou células procarióticas podem ser usados para produzir ouamplificar o RNA quimérico da invenção ou um vetor ou construto deexpressão codificador do mesmo. Além disso, o organismo procariótico podeser utilizado como veículos para introduzir o RNA quimérico da invenção emanimais e.g. por alimentação. Também, organismos procarióticos, porexemplo Agrobacteria, podem ser vantajosamente empregados como veículospara a transformação de, por exemplo, organismos de planta.

Assim um outro aspecto da invenção refere-se às células e aoorganismo (e.g., planta, animal, protozoário, vírus, bactéria, ou fungo), quecompreende pelo menos um RNA quimérico da invenção, ou um construto deexpressão ou vetores de expressão codificadores de citada molécula de RNAquimérica (como definido acima com mais detalhe).

Outra modalidade da presente invenção refere-se a um métodopara atenuar (ou reduzir) a expressão de pelo menos um gene alvo em umacélula eucariótica, compreendendo introduzir uma molécula de RNAquimérica da invenção na célula em uma quantidade suficiente para atenuar aexpressão do gene alvo, no qual a molécula de RNA quimérica compreendepelo menos uma seqüência de ribonucleotídeos que é substancialmenteidêntica, preferivelmente idêntica, a pelo menos parte da seqüência denucleotídeos do gene alvo. Dependendo do gene alvo particular e da dose deRNA quimérico liberada, o método pode parcial ou completamente inibir aexpressão do gene na célula. Preferivelmente o RNA quimérico da invenção écapaz de efetivamente eliminar, substancialmente reduzir, ou pelo menosparcialmente reduzir o nível de um transcrito de RNA (preferivelmentemRNA) ou de uma proteína codificada pelo gene alvo (ou família de genes).

Preferivelmente, a expressão do gene alvo (conforme medida pela proteína ouRNA expressado) é reduzida, inibida ou atenuada em pelo menos 10%,preferivelmente pelo menos 30% ou 40%, preferivelmente pelo menos 50%ou 60%, com maior preferência de pelo menos 80%, mais preferivelmente depelo menos 90% ou 95%. Os níveis de produtos alvo tais como transcritos ouproteínas pode ser diminuído em todo um organismo tal como uma planta ouum mamífero, ou tal diminuição em produtos alvo pode estar localizada emum ou mais órgãos ou tecidos específicos do organismo. Por exemplo, osníveis de produtos podem ser diminuídos em um ou mais dos tecidos e órgãosde uma planta incluindo sem limitação: raízes, tubérculos, caules, folhas,talos, frutos, bagas, nozes, cascas, vagens, sementes e flores. Um órgãopreferido é uma semente de uma planta.

A expressão de dois ou mais genes pode ser atenuadaconcorrentemente pela introdução de dois ou mais RNA quiméricos ou umRNA capaz de proporcionar (e.g., pelo subseqüente processamento de RNA)mais do que uma molécula de RNA quimérica na célula em quantidadessuficientes para atenuar a expressão de seus respectivos genes alvo.

Para suplantar a resposta de estresse de proteína cinaseindependente de seqüência PKR disparada por dsRNA, modificações sãofeitas em uma molécula de RNA quimérica, que normalmente ativariam a rotade interferon de tal modo que a rota de interferon não seja ativada. Em certasmodalidades, as células podem ser tratadas com um agente (s) que inibe a(s)resposta(s) de dsRNA geral pelas células hospedeiras, como por exemplopode ocasionar apoptose independente de seqüência. Por exemplo, as célulaspodem ser tratadas com agentes que inibem a proteína cinase dependente dedsRNA conhecida como PKR (proteína cinase RNA-ativada). Igualmente,sobreexpressão de agentes, que ectopicamente ativam eIF2a pode ser usada.Outros agentes, que podem ser usados para suprimir a resposta de PKR,incluem inibidores de fosforilação IzkB de IkB, inibidores de ubiquitinaçãoIkB , inibidores de degradação IkB , inibidores de translocação nuclear NFkB ,e inibidores de interação de interação de NF-kB com elementos de respostakB. Outros inibidores de resposta de dsRNA independente de seqüência emcélulas incluem o produto de gene do vírus de vacínia E3L. O produto degene E3L contém dois domínios distintos. Tem sido mostrado que umdomínio carbóxi-terminal conservado se liga em dsRNA e inibe a resposta dedsRNA antiviral por células. Expressão de pelo menos aquela porção do geneE3L na célula hospedeira, ou o uso de polipeptídeo ou de peptídeomiméticosdo mesmo, pode ser usado para suprimir a resposta de dsRNA geral.Inibidores de caspase sensibilizam células para extermínio por dsRNA.Conseqüentemente, expressão ou ativação ectópica de caspases na célulahospedeira pode ser usada para suprimir a resposta de dsRNA geral.

3. Aplicações específicas

A aplicação subseqüente das composições e dos métodos deacordo com a invenção pode ser mencionada por meio de exemplo, mas nãopor limitação:

3.1 Aplicações em biotecnologia de planta

O método de acordo com a invenção é preferivelmenteempregado para os propósitos de biotecnologia de planta para geração deplantas com propriedades vantajosas. Assim, a adequabilidade das plantas oude suas sementes como gênero alimentício ou ração pode ser melhorada, porexemplo via uma modificação das composições e/ou do conteúdo demetabólitos, em particular de proteínas, óleos, vitaminas e/ou amido.

Também, velocidade de crescimento, rendimento ou resistência a fatores deestresse biótico ou abiótico podem ser aumentadas. As aplicaçõessubseqüentes no campo de biotecnologia de planta são particularmentevantajosas.

Um outro aspecto da invenção refere-se a uma planta ou célulade planta transgênica compreendendo um RNA quimérico da invenção, ou umconstruto de expressão ou vetor de expressão para expressão de citado RNAquimérico. Outra modalidade refere-se ao uso do organismo transgênico deacordo com a invenção (e.g., a planta transgênica) e das células, culturas decélula, partes - tais como, por exemplo, no caso de organismos de plantatransgênica raízes, folhas e semelhante - derivados deles e material depropagação transgênica tais como sementes ou frutos para a produção degêneros alimentícios ou rações, fármacos ou compostos de química fina, taiscomo, por exemplo, enzimas, vitaminas, aminoácidos, açúcares, ácidosgraxos, aromatizantes naturais ou sintéticos, aromas e colorantes.

Especialmente preferida é a produção de triacilglicerídeos, lipídeos, óleos,ácidos graxos, amidos, tocoferóis e tocotrienóis e carotenóides. Plantasgeneticamente modificadas de acordo com a invenção que podem serconsumidas por humanos e animais também podem ser usadas como gênerosalimentícios ou rações, por exemplo diretamente ou após sofrerem umprocessamento que é per se conhecido.

3.1.1 Genes alvo de planta para expressão comespecificidade intensificada

3.1.1.1. Resistência a herbicida

Os genes (bar e pat) codificadores de fosfinotricinaacetiltransferase, genes de EPSP sintase tolerante a glifosato, o gene gox deenzima degradadora de glifosato codificador de glifosato óxido-redutase, deh(codificador de uma enzima desalogenase que inativa dalapon), resistência aherbicida (e.g., sulfonil-uréia e imidazolinona) acetolactase sintase, e genesbxn (codificadores de uma enzima nitrilase que degrada bromoxinil) são bonsexemplos de genes resistentes a herbicida para uso em transformação. Osgenes bar e pat codificam uma enzima, fosfinotricina acetiltransferase (PAT),que inativa o herbicida fosfinotricina e evita que este composto iniba asenzimas glutamina sintetase. A enzima 5-enol-piruvil-shiquimato-3-fosfatosintase (EPSP Sintase), é normalmente inibida pelo herbicida N-(fosfonometil)-glicina (gli-fosato). Contudo, são conhecidos os genes quecodificam enzimas EPSP Sintase resistentes a glifosato. O gene deh codifica aenzima dalapon desalogenase e confere resistência ao herbicida dalapon. Ogene bxn codifica uma enzima nitrilase específica que converte bromoxinilem um produto de degradação não-herbicida.

Para esta aplicação qualquer uma etiqueta-miRNA, quepermite a expressão específica intensificada em folhas verdes é preferida paraplanejamento de etiqueta-miRNA. Por exemplo, Arabidopsis miR160bexpressado em raiz ou flor, mas não em folhas é bom para tal aplicação.

3.1.1.2 Resistência a inseto

Um aspecto importante da presente invenção refere-se àintrodução de genes que conferem resistência a inseto em plantas. Genes deresistência a inseto potenciais que podem ser introduzidos incluem genes detoxina cristal de Bacillus thuringiensis ou genes Bt (Watrud 1985). Genes Btpodem proporcionar resistência a pestes lepidópteros ou coleópteros taiscomo Broca do Milho Europeu (ECB) e verme da raiz do milho (CRW).Genes de toxina Bt para uso em tais modalidades incluem os genes CrylA(b)e CrylA(c). Genes de endotoxina de outras espécies de B. thuringiensis queafetam o crescimento ou o desenvolvimento de inseto também podem serempregados sob este aspecto. Inibidores de protease também podemproporcionar resistência a inseto (Johnson 1989), e assim possuirão utilidadeem transformação de planta. O uso de um gene de inibidor II de protease,pinll, de tomateiro ou de batateira é previsto para ser particularmente útil.

Ainda mais vantajoso é o uso de um gene pinll em combinação com um genede toxina Bt, cujo efeito combinado tem sido descoberto pelos presentesinventores para produzir atividade inseticida sinérgica. Outros genes quecodificam inibidores do sistema digestivo de inseto, ou aqueles que codificamenzimas ou co-fatores que facilitam a produção de inibidores, também podemser úteis. Este grupo pode ser exemplificado por inibidores de amilase ecistatina, tais como aqueles de trigo e de cevada.

Também, genes codificadores lectinas podem conferirpropriedades inseticidas alternativas ou adicionais. Lectinas (originalmentechamadas fitoemaglutininas) são proteínas multivalentes ligantes decarboidrato que possuem a capacidade para aglutinar células vermelhas dosangue de uma variedade de espécies. Lectinas têm sido identificadasrecentemente como agentes inseticidas com atividade contra gorgulhos, ECBe verme de raiz (Murdock 1990; Czapla & Lang, 1990). Genes de lectinacontemplados para serem úteis incluem, por exemplo, aglutinina de germe detrigo e de cevada (WGA) e lectinas de arroz (Gatehouse 1984), com WGAsendo preferida.

Genes controladores da produção de polipeptídeos pequenosou grandes ativos contra insetos quando introduzidos nas pestes de interesse,tais como, e.g., peptídeos líticos, hormônios de peptídeo e toxinas e venenos,formam outro aspecto da invenção. Por exemplo, é contemplado que aexpressão de esterase hormônio juvenil dirigidas na direção de pestes deinseto, também podem resultar em atividade inseticida, ou talvez em causarcessação de metamorfose (Hammock 1990).

As plantas transgênicas expressando genes que codificamenzimas que afetam a integridade da cutícula de inseto formam ainda outroaspecto da invenção. Tais genes incluem aqueles codificadores, e.g., dequitinase, proteases, lipases e também genes para a produção de nicomicina,um composto que inibe a síntese de quitina, a introdução de qualquer um dosquais é contemplada para produzir plantas de milho resistentes a inseto. Genesque codificam atividades que afetam muda de inseto, tais como aqueles queafetam a produção de ecdisteróide UDP-glicosil transferase, também caemdentro do escopo dos transgenes úteis da presente invenção.

Genes que codificam enzimas que facilitam a produção decompostos que reduzem a qualidade nutricional da planta hospedeira parapestes de inserto também estão incluídos na presente invenção. Pode serpossível, por exemplo, conferir atividade inseticida a uma planta pelaalteração de sua composição de esterol. Esteróis são obtidos por insetos desua dieta e são usados para síntese de hormônio e estabilidade de membrana.Portanto alterações em composição de esterol de planta pela expressão degenes novos, e.g., aqueles que diretamente promovem a produção de esteróisindesejáveis ou aqueles que convertem esteróis desejávei em formasindesejáveis, poderia ter um efeito negativo sobre o desenvolvimento e/oucrescimento de inseto e como conseqüência dotar a planta com atividadeinseticida. Lipoxigenases são enzimas de planta naturalmente ocorrentes quecomo tem sido mostrado exibem efeitos anti-nutricionais sobre insertos ereduzem a qualidade nutricional da dieta deles. Portanto, outras modalidadesda invenção referem-se às plantas transgênicas com atividade de lipoxigenaseintensificada que podem ser resistentes para alimentar inseto.A presente invenção também proporciona métodos ecomposições pelos quais se alcançam mudanças qualitativas e quantitativasem metabólitos secundários de planta. Um exemplo refere-se à transformaçãode plantas para produzir DIMBOA que, é contemplado, conferirá resistência àbroca de milho europeu, ao verme de raiz e às outras pestes de inseto demilho. Genes candidatos que são particularmente considerados para uso sobeste aspecto incluem aqueles genes no locux bx conhecidos por estaremenvolvidos na rota de síntese de DIMBOA (Dunn 1981). A introdução degenes que podem regular a produção de maisina, e de genes envolvidos naprodução de dhurrina em sorgo, também é contemplada para ser usada nafacilitação de resistência contra verme de espiga e verme de raiz,respectivamente.

Tripsacum dactyloides é uma espécie de gramínea que éresistente a certos insetos, incluindo o verme da raiz de milho. É antecipadoque genes codificadores de proteínas que são tóxicas para insetos estãoenvolvidos na biossíntese de compostos tóxicos para insetos serão isolados deTripsacum e que estes genes novos serão úteis para conferirem resistência aosinsetos. E sabido que a base da resistência a inseto em Tripsacum é genética,porque a citada resistência tem sido transferida para Zea mays viacruzamentos sexuais (Branson & Guss, 1972).

Outros genes codificadores de proteínas caracterizadas pelofato de possuírem atividade inseticida potencial também podem ser usadoscomo transgenes de acordo com isso. Tais genes incluem, por exemplo, oinibidor de tripsina de feijão-de-corda (CpTI; Hilder 1987) que pode serusado como repressor de verme da raiz; genes codificadores de avermectina(Campbell 1989; Ikeda 1987) que podem provar-se particularmente úteiscomo um repressor de verme da raiz de milho; genes de proteína inativadorade ribossomo; e até mesmo genes que regulam as estruturas de planta. Milhotransgênico incluindo genes de anticorpo anti-inseto e genes que codificamenzimas que convertem um inseticida não-tóxico (pró-inseticida) aplicadofora da planta em inseticida dentro da planta também são contemplados.

Para aplicação quer de uma etiqueta-miRNA, que permiteexpressão específica intensificada em tecido, que apresenta o lado de entradaou de interação para o inseto (ou outro patógeno) (e.g., a epiderme) quer deuma etiqueta-miRNA correspondendo a um miRNA, que é endogenamentesuprimida pelo fator de estresse induzido por patógeno ou inseto é preferidapara ser empregada para planejamento da etiqueta-miRNA. Por exemplo,miR167 de milho é predominantemente expressado em semente, uso deetiqueta Zm miR167 em um construto de transgene expressando moléculasinseticidas pode prevenir expressão de mutação de atividade subnormal detais moléculas nas sementes. Algumas delas (e.g. lectina) são alérgenospotenciais para humano.

3.1.1.3 Resistência ao estresse ou ambiente

Melhoria da capacidade de uma planta para tolerar váriosestresses ambientais tais como, mas não limitados a, seca, excesso deumidade, frio, congelamento, temperatura alta, sal, e estresse oxidativo,também pode ser efetuada por meio da expressão de genes heterólogos, ousobre-expressão de genes homólogos. Benefícios podem ser realizados emtermos de resistência aumentada às temperaturas de congelamento por meioda introdução de uma proteína de "anti-congelamento" tal como aquela deWinter Flounder (Cutler 1989) ou seus derivados de gene sintético.Tolerância ao frio melhorada também pode ser conferida por intermédio deexpressão aumentada de glicerol-3-fosfato acetiltransferase em cloroplastos(Murata 1992; Wolter 1992). Resistência ao estresse oxidativo (muitas vezesexacerbado por condições tais como temperaturas frias em combinação comintensidades luminosas altas) pode ser conferida pela expressão de superóxidodismutase (Gupta 1993), e pode ser melhorada por glutationa redutase(Bowler 1992). Tais estratégias podem permitir a tolerância ao congelamentoem campos recém emergidos bem como estender variedades de rendimentomaior de maturidade tardia para zonas de maturidade relativa precoce.

Expressão de genes novos que favoravelmente afetam oconteúdo de água da planta, o potencial de água total, o potencial osmótico, eturgor pode intensificar a capacidade da planta para tolerar seca. Como aquiusados, os termos "resistência à seca " e "tolerância à seca" são usados para sereferirem à resistência ou tolerância aumentada das plantas ao estresseinduzido por uma redução da disponibilidade de água, em comparação comcircunstâncias novas, e a capacidade da planta de funcionar e sobreviver emambientes com menos água, e desempenharem em uma maneira relativamentesuperior. Neste aspecto da invenção é proposto, por exemplo, que a expressãode um gene codificador da biossíntese de solutos osmoticamente ativos podeconferir proteção contra seca. Dentro desta classe de genes estão os DNAscodificadores de manitol desidrogenase (Lee e Saier, 1982) e trealose-6-fosfato sintase (Kaasen 1992). Por meio de ação subseqüente de fosfatasesnativas na célula ou pelas introdução e co-expressão de uma fosfataseespecífica, estes genes introduzidos resultarão no acúmulo quer de manitolquer de trealose, respectivamente, ambos os quais têm sido bemdocumentados como compostos protetores capazes de mitigarem os efeitos deestresse. Tem sido verificado acúmulo de manitol em tabaco transgênico eresultados preliminares indicam que plantas expressando níveis altos destemetabólito são capazes de tolerar um estresse osmótico aplicado (Tarczynski1992).

Similarmente, a eficácia de outros metabólitos na proteçãoquer de função de enzima (e.g. alanopina ou ácido propiônico) quer deintegridade de membrana (e.g., alanopina) tem sido documentada (Loomis1989), e portanto a expressão de gene codificador da biossíntese destescompostos pode conferir resistência à seca em uma maneira similar oucomplementar à do manitol. Outros exemplos de metabólitos naturalmenteocorrentes que são osmoticamente ativos e/ou proporcionam algum efeitoprotetor direto durante seca e/ou dessecação incluem açúcares e derivados deaçúcar tais como frutose, eritritol (Coxson 1992), sorbitol, dulcitol (Karsten1992), glicosilglicerol (Reed 1984; Erdmann 1992), sacarose, estaquiose(Koster & Leopold 1988; Blackman 1992), ononitol e pinitol (Vernon &Bohnert 1992), e rafinose (Bernal-Lugo & Leopold 1992). Outros solutososmoticamente ativos que não são açúcares incluem, mas não são limitados a,prolina e glicina-betaína (Wyn-Jones e Storey, 1981). Crescimentocontinuado de copa e aptidão reprodutiva aumentada durante tempos deestresse podem ser aumentados pelas introdução e expressão de genes taiscomo aqueles controladores de compostos osmoticamente ativos discutidosacima e outros compostos, como representados em uma modalidade exemplarpela enzima mioinositol O-metiltransferase.

É contemplado que a expressão de proteínas específicastambém pode aumentar a tolerância à seca. Três classes de ProteínasEmbriônicas Tardias têm sido apontadas baseadas em similaridadesestruturais (veja Dure 1989). Todas as três classes destas proteínas têm sidodemonstradas em sementes madurando (i.e., desssecando). Dentro destes 3tipos de proteínas, o Tipo-II (tipo-deidrina) têm sido geralmente implicado emtolerância à seca e/ou dessecação em partes vegetativas de planta (e.g..Mundy e Chua, 1988; Piatkowski 1990; Yamaguchi-Shinozaki 1992).Recentemente, foi verificado que a expressão de um Tipo-III LEA (HVA-I)em tabaco influencia a altura, a maturidade e a tolerância à seca da planta(Fitzpatrick, 1993). Expressão de genes estruturais de todos os três grupospode portanto conferir tolerância à seca. Outros tipos de proteínas induzdasdurante estresse de água incluem tiol proteases, aldolases e transportadoras detransmembrana (Guerrero 1990), que podem conferir várias funções do tipo -reparo / proteção durante o estresse de seca. A expressão de um gene queafeta a biossíntese de lipídeo e como conseqüência a composição damembrana também pode ser útil para conferir à planta resistência à seca.

Muitos genes que melhoram a resistência à seca possuemmodos de ação complementares. Assim, combinações destes genes podem terefeitos aditivos e/ou sinérgicos na melhoria da resistência à seca em milho.Muitos destes genes também melhoram a tolerância (ou resistência) aocongelamento; os estresses físicos incorridos durante o congelamento e a secasão similares em natureza e podem ser mitigados em modo similar, beneficiopode ser conferido via expressão constitutiva destes genes, mas o meiopreferido de expressão destes genes novos podem ser por meio do uso de umpromotor induzido por turgor (tais como os promotores para os genesinduzidos por turgor descritos em Guerrero et al. 1990 e Shagan 1993).Padrões de expressão temporal e espacial destes genes podem permitir que omilho suporte melhor o estresse.

Expressão de genes que estão envolvidos com feiçõesmorfológicas específicas que permitem extrações de água de solo seco seriabenéfica. Por exemplo, introdução e expressão de genes que alteram ascaracterísticas de raiz podem intensificar a captação de água. Expressão degenes que intensificam a aptidão reprodutiva durante os tempos de estresseseria de valor significativo. Por exemplo, expressão de DNAs que melhoram asincronia de soltura de pólen e receptividade das partes femininas da flor, i.e.,prolongamentos plumosos (estigmas) dos estiletes (silks), seria benéfica. Emadição, expressão de genes que minimizam o aborto da semente durantetempos de estresse aumentaria a quantidade de grãos a serem colhidos e comoconseqüência é valiosa. Regulação de níveis de citoquina emmonocotiledôneas, tal como milho, pelas introdução e expressão de um genede isopentenil transferase com seqüências regulatórias apropriadas podemelhorar o rendimento e a resistência ao estresse de monocotiledônea. (Gan1995).

Dado o papel total da água na determinação do rendimento, écontemplado que a permissão de que as plantas utilizem água de modo maiseficiente, por meio da introdução e da expressão de genes novos, melhorará odesempenho total até mesmo quando a disponibilidade de água do solo nãofor limitante. Pela introdução de genes que melhoram a capacidade dasplantas para maximizar o uso de água através de uma variedade total deestresses relacionados com disponibilidade de água, estabilidade derendimento ou consistência de desempenho de rendimento pode ser realizada.

Proteção melhorada da planta contra fatores de estresseabiótico tais como seca, calor ou frio, também pode ser alcançada - porexemplo - por sobre-expressão de polipeptídeos anti-congelamento deMyoxocephalus Scorpius (WO 00/00512), Myoxocephalusoctodecemspinosus, o ativador de transcrição CBFl de Arabidopsis thaliana,glutamato desidrogenases (WO 97/12983, WO 98/11240), genes de proteínacinase dependente de cálcio (WO 98/26045), calcineurinas (WO 99/05902),caseína cinase de levedura (WO 02/052012), farnesiltransferases (WO99/06580; Pei ZM et al. (1998) Science 282:287-290), ferritina (Deak M et al.(1999) Nature Biotechnology 17:192-196), oxalato oxidase (WO 99/04013;Dunwell JM (1998) Biotechn Genet Eng Rev 15:1-32), fator DREBlA("dehydration response element B IA"; Kasuga M et al. (1999) NatureBiotech 17:276-286), genes de síntese de manitol ou de trealose tais comotrealose-fosfate sintase ou trealose-fosfato fosfatase (WO 97/42326) ou pelainibição de genes tal como trealase (WO 97/50561).

Para esta aplicação quer uma etiqueta-miRNA, que permite aexpressão específica intensificada em tecido sensível ao estresse (e.g.,embrião ou muda) quer uma etiqueta-miRNA correspondendo a um miRNA,que é endogenamente suprimido pelo fator de estresse é preferida para serempregada para planejar a etiqueta-miRNA.

3.1.1.4 Resistência à doença

Se for proposto que a resistência aumentada às doenças podeser realizada por meio da introdução de genes em período de plantas. Épossível produzir resistência às doenças causadas por vírus, bactérias, fungos,patógenos de raiz, insetos e nematódeos. Também é contemplado que ocontrole de organismos produtores de micotoxina pode ser realizado pormeio da expressão de genes introduzidos.

Resistência aos vírus pode ser produzida por meio daexpressão de genes novos. Por exemplo, tem sido demonstrado que aexpressão de uma proteína de capa viral em uma planta transgênica podeconferir resistência à infecção da planta contra aquele vírus e talvez outrosvírus proximamente relacionados (Cuozzo 1988, Hemenway 1988, Abel1986). E contemplado que a expressão de genes de anti-senso selecionadosem funções virais essenciais pode conferir resistência ao citado vírus. Porexemplo, um gene de anti-senso selecionado no gene responsável pelareplicação do ácido nucleico viral pode inibir a citada replicação e acarretar aresistência ao vírus. E crido que a interferência em outras funções virais pormeio do uso de genes de anti-senso também pode aumentar a resistência aosvírus. Além disso é proposto que pode ser possível alcançar resistência aosvírus por meio de outras abordagens incluindo, mas não limitadas ao uso devírus satélite.

E proposto que resistência aumentada às doenças causadas porbactérias e fungos pode ser realizada por intermédio da introdução de genesnovos. E contemplado que genes codificadores de denominados "antibióticosde peptídeo", proteínas relacionadas à patogênese (PR), resistência à toxina, eproteínas que afetam as interações de hospedeiro-patógeno tais comocaracterísticas morfológicas serão úteis. Antibióticos de peptídeo sãoseqüências de polipeptídeo que são inibidoras do crescimento de bactérias ede outros microrganismos. Por exemplo, as classes de peptídeos referidascomo cecropinas e magaininas inibem o crescimento de muitas espécies debactérias e de fungos. É proposto que a expressão de proteínas PR em plantaspode ser útil na conferência de resistência à doença bacteriana Estes genessão induzidos após ataque de patógeno sobre uma planta hospedeira e têmsido divididos em pelo menos cinco classes de proteínas (Boi 1990). Incluídasdentre as proteínas PR estão as P-l,3-glicanases, quitinases, e osmotina eoutras proteínas que como crido funcionam em resistência da planta contraorganismos causadores de doença. Têm sido identificados outros genes quepossuem propriedades antifüngicas, e.g., UDA (lectina de urtiga) e heveína(Broakgert 1989; Barkai-Golan 1978). É sabido que certas doenças de plantasão causadas pela produção de fitotoxinas. Resistência a estas doençaspoderia ser alcançada por meio da expressão de um gene novo que codificauma enzima capaz de degradar ou diferentemente inativar a fitotoxina.Expressão de genes novos que alteram as interações da planta hospedeira epatógeno pode ser útil na redução da capacidade do organismo de doença parainvadir os tecidos da planta hospedeira, e.g., um aumento na cerosidade dacutícula da folha ou outras características morfológicas.

Nematódeos parasíticos de planta são uma causa de doença emmuitas plantas. E proposto que seria possível tornar a planta resistente a estesorganismos por meio da expressão de genes novos. É antecipado que ocontrole de infestações de nematódeo seria realizado pela alteração dacapacidade do nematódeo de reconhecer ou atacar uma planta hospedeira e/oupermitir que a planta produza compostos nematicidas, incluindo mas nãolimitados às proteínas.

Além disso, uma resistência aos fungos, insetos, nematódeos edoenças, pode ser alcançada pelo acúmulo selecionado de certos metabólitosou proteínas. Tais proteínas incluem mas não são limitadas a glicosinolatos(defesa contra herbívoros), quitinases ou glicanases e outras enzimas quedestroem a parede celular de parasitas, proteínas inativadoras de ribossomo(RIPs) e outras proteínas de resistência e de reação ao estresse da planta sãoinduzidas quando as plantas são feridas ou atacadas por micróbios, ouquimicamente, por exemplo, por ácido salicílico, ácido jasmônico ou etileno,ou lisozimas de fontes de não-planta tais como, endotoxina de Bacillusthuringiensis, inibidor de a-amilase ou inibidores de protease (inibidor detripsina de feijão-de-corda), lectinas tal como aglutinina de germe de trigo,RNAses ou ribozimas. Outros exemplos são ácidos nucleicos que codificam aendoquitinase chit42 de Trichoderma harzianum (GenBank Acc. No.:S78423) ou a proteína multifuncional, N-hidroxiladora citocromo P-450(CYP79) de Sorghum bicolor (GenBank Acc. No.: U32624), ou equivalentesfuncionais destas. O acúmulo de glicosinolatos como proteção contra pestes(Rask L et al. (2000) Plant Mol Biol 42:93-113; Menard R et al. (1999)Phytochemistry 52:29-35), a expressão de endotoxinas de Bacillusthuringiensis (Vaeck et al. (1987) Nature 328:33-37) ou a proteção contraataque por fungos, pela expressão de quitinasee, por exemplo de feijões(Broglie et al. (1991) Science 254:1194-1197), é vantajoso. Resistência àspestes tais como, por exemplo, a peste do arroz Nilaparvata lugens em plantasde arroz pode ser alcançada pela expressão de lectina aglutinina de campainhabranca (Galanthus nivalis) (Rao et al. (1998) Planta J 15(4):469-77). Aexpressão de genes sintétios crylA(b) e crylA(c), que codificam D-endotoxinas de Bacillus thuringiensis específicas de lepidópteros podeacarretar a resistência às pestes de inseto em várias plantas (Goyal RK et al.(2000) Crop Protection 19(5):307-312). Outros genes alvo que são adequadospara defesa contra patógeno compreendem "proteína inibidora depoligalacturonase" (PGIP), taumatina, invertase e peptídeos antimicrobianostal como lactoferrina (Lee TJ et al. (2002) J Amer Soc Horticult Sci127(2): 158-164).

Para esta aplicação quer uma etiqueta-miRNA, que permiteexpressão específica intensificada em tecido, que apresenta o lado de entradaou de interação para o patógeno (e.g., a epiderme) quer uma etiqueta-miRNAcorrespondendo a um miRNA, que é endogenamente suprimida pelo fator deestresse induzido pelo patógeno é preferida para planejar a etiqueta-miRNA.Por exemplo, miR167 de milho é predominantemente expressado emsementes, uso de uma etiqueta Zm miR167 em um construto transgênicoexpressando moléculas de anti-patógeno pode prevenir expressão de mutaçãode atividade subnormal de tais moléculas nas sementes.

3.1.1.5 Eliminação/redução de micotoxina

Produção de micotoxinas, incluindo aflatoxina e fumonisina,por fungos associados com plantas é um fator significativo para tornar o grãoinútil. Estes organismos füngicos não causam sintomas de doença e/ouinterferem com o crescimento da planta, mas produzem compostos químicos(micotoxinas) que são tóxicos para animais. Inibição do crescimento destesfungos reduziria a síntese destas substâncias tóxicas e, portanto, reduziria asperdas de grãos devido à contaminação com micotoxina. Genes novos podemser introduzidos em plantas que inibiriam a síntese da micotoxina seminterferirem com o crescimento fungico. Expressão de um gene novo quecodifica uma enzima capaz de tornar a micotoxina não tóxica seria útil com oobjetivo de alcançar contaminação reduzida de grão com micotoxina. Oresultado de qualquer um destes mecanismos seria uma presença reduzida demicotoxinas sobre grão.

Para esta aplicação quer uma etiqueta-miRNA, que permiteexpressão específica intensificada em tecido, que apresenta lado de entrada oude interação para o patógeno fungico (e.g., a epiderme) que uma etiqueta-miRNA correspondendo a um miRNA, que é endogenamente suprimido pelofator de estresse induzido pelo patógeno fungico é preferida para serempregada para planejar a etiqueta-miRNA. Alternativamente, a etiqueta-miRNA, que garante expressão intensificada preferencial ou específica emsemente pode ser empregada. Por exemplo, miR156 de milho é expressadoem todas as partes menos em sementes, uso de etiqueta miR156 poderiaintensificar expressão específica em semente.3.1.1.6 Qualidade ou composição do grão

Genes podem ser introduzidos em plantas, particularmente emcereais comercialmente importantes tais como milho, trigo ou arroz, paramelhorar o grão para o qual o cereal é primariamente crescido. Uma amplavariedade de plantas transgênicas novas produzidas nesta maneira pode serprevista dependendo do uso final particular do grão.

Por exemplo, o uso maior de grão de milho é para ração oualimento. Introdução de genes que alteram a composição do grão podeintensificar sobremaneira o valor da ração ou do alimento. Os componentesprimários do grão de milho são amido, proteína, e óleo. Cada um destescomponentes primários do grão de milho podem ser melhorados pelaalteração de seu nível ou de sua composição. Vários exemplos podem sermencionados para propósitos ilustrativos mas em nenhuma maneiraproporcionam uma lista exaustiva de possibilidades.

A proteína de muitos grãos de cereais é sub-ótima parapropósitos de ração e de alimento especialmente quando se alimentam porcos,aves domésticas, e humanos. A proteína é deficiente em vários aminoácidosque são essenciais na dieta destas espécies, requerendo a adição desuplementos no grão. Aminoácidos essenciais limitantes incluem lisina,metionina, triptofano, treonina, valina, arginina, e histidina. Algunsaminoácidos tornam-se limitantes apenas após o grão ser suplementado comoutras adições para formulações de ração. Por exemplo, quando o grão ésuplementado com farinha de feijão-soja para atender aos requerimentos delisina, a metionina torna-se limitante. Os níveis destes aminoácidos essenciaisem sementes e grãos pode ser elevado por mecanismos que incluem, mas nãosão limitados a, introdução de genes para aumentar a biossíntese dosaminoácidos, diminuir a degradação de aminoácidos, aumentar aarmazenagem de aminoácidos em proteínas, ou aumentar o transporte deaminoácidos para as sementes ou os grãos.Um mecanismo para aumentar a biossíntese de aminoácidos éintroduzir genes que desregulam as rotas de biossíntese de aminoácido de talmodo que a planta não pode mais controlar adequadamente os níveis que sãoproduzidos. Isto pode ser feito pelas etapas de desregulação ou de desvio narota de biossíntese de aminoácido que são normalmente reguladas pelos níveisdo produto final de aminoácido da rota. Exemplos incluem a introdução degenes que codificam versões desreguladas das enzimas aspartoquinase ouácidodi-hidro-dipicolínico (DHDP)-sintase para aumentar a produção delisina e de treonina, e antranilato sintase para aumentar a produção detriptofano. Redução do catabolismo de aminoácidos pode ser realizada pelaintrodução de seqüências de DNA que reduzem ou eliminam a expressão degenes codificadores de enzimas que catalisam etapas nas rotas catabólicas talcomo a enzima lisina-cetoglutarato redutase.

A composição de proteína do grão pode ser alterada paramelhorar o balanço de aminoácidos em uma variedade de modos incluindoelevação de expressão de proteínas nativas, diminuição de expressão daquelascom composição insatisfatória, mudança da composição de proteínas nativas,ou introdução de genes codificadores de proteínas inteiramente novaspossuindo composição superior. Pode ser introduzido DNA que diminui aexpressão de membros da família de zeína de proteínas de armazenagem. EsteDNA pode codificar ribozimas ou seqüências de anti-senso direcionadas paraconferirem expressão de proteínas zeína ou expressão de reguladores deexpressão de zeína tal como produto de gene opaque-2. A composição deproteína do grão pode ser modificada por meio de fenômeno de cossupressão,i.e. de expressão de um gene endógeno por meio da expressão de umfragmento de gene ou gene estrutural idêntico introduzido por meio detransformação (Goring 1991). Adicionalmente, o DNA introduzido podecodificar enzimas que degradam zeínas. Os decréscimos na expressão dezeína que são alcançados podem ser acompanhados por aumentos emproteínas com composição de aminoácidos mais desejáveis ou aumentos emoutros constituintes maiores de semente tal como amido. Alternativamente,pode ser introduzido um gene quimérico que compreende uma seqüênciacodificadora para uma proteína nativa de composição de aminoácidoadequada tal como para uma das proteínas de globulina ou zeína de 10 kD demilho e um promotor ou outra seqüência regulatória planejado para elevar aexpressão de citada proteína. A seqüência codificadora de citado gene podeincluir códons adicionais ou substitutos para aminoácidos essenciais. Alémdisso, uma seqüência codificadora obtida de outra espécie, ou, uma seqüênciaparcial ou completamente sintética codificadora de uma seqüência depeptídeo completamente incomum planejada para aumentar a composição deaminoácido da semente pode ser empregada.

A introdução de genes que alteram o conteúdo de óleo do grãopode ser valiosa. Aumentos em conteúdo de óleo podem resultar em aumentosem conteúdo de energia metabolizável e de densidade das sementes para usosem ração e alimento. Os genes introduzidos podem codificar enzimas queremovem ou reduzem as etapas reguladoras ou limitantes de velocidade embiossíntese de ácido graxo ou de lipídeo.Tais genes podem incluir, mas nãosão limitados a, àqueles que codificam acetil-CoA carboxilase, ACP-aciltransferase, P-cetoacil-ACP sintase, mais outras atividades de biossíntesede ácido graxo bem conhecidas. Outras possibilidades são genes quecodificam proteínas que não possuem atividade enzimática tal como proteínacarreadora de acila. Exemplos adicionais incluem 2-acetiltransferase,complexo de oleosina piruvato desidrogenase, acetil CoA sintetase, ATPcitrato liase, ADP-glicose pirofosforilase e genes dos bifuncionais carnitina-CoA-acetil-CoA. E antecipado que a expressão de genes relacionados com abiossíntese de óleo será direcionada para o plastídeo, usando uma seqüênciade peptídeo de trânsito de plastídeo e preferivelmente expressada no embriãoda semente. Podem ser introduzidos genes que alteram o balanço de ácidosgraxos presentes no óleo proporcionando uma ração mais saudável ounutritiva. O DNA introduzido também pode codificar seqüências quebloqueiam a expressão de enzimas envolvidas na biossíntese de ácido graxo,alterando as proporções de ácidos graxos presentes no grão tal como descritoabaixo.

Podem ser introduzidos genes que intensificam o valornutritivo do componente amido do grão, por exemplo pelo aumento do graude ramificação, resultando em utilização melhorada do amido em vacas peloretardamento de seu metabolismo. Além de afetar os constituintes maiores dogrão, podem ser introduzidos genes que afetam uma variedade de outrosaspectos nutritivos, de processamento, ou outros aspectos de qualidade dogrão como usado para ração ou alimento. Por exemplo, pigmentação do grãopode ser aumentada ou diminuída. Intensificação ou estabilidade depigmentação amarela são desejáveis em algumas rações de animal e podemser alcançadas pela introdução de genes que resultam em produçãointensificada de xantofilas e carotenos pela eliminação de etapas limitantes develocidade em sua produção. Tais genes podem codificar formas alteradas dasenzimas fitoeno sintase, fitoeno desaturase, ou licopene sintase.Alternativamente, grão branco não pigmentado é desejável para a produção demuitos produtos alimentícios e pode ser produzido pela introdução de DNAque bloqueia ou elimina as etapas em rotas de produção de pigmento.

Ração ou alimento compreendendo alguns grão de cerealpossui quantidades insuficientes de vitaminas e tem quen ser suplementada(o)para proporcionar valor nutritivo adequado. Introdução de genes queintensificam a biossíntese de vitamina em sementes pode ser previstaincluindo, por exemplo, vitaminas A, E, B12, colina, e semelhante. Porexemplo, grão de milho também não possui conteúdo de mineral suficientepara valor nutritivo ótimo. Genes que afetam o acúmulo ou a disponibilidadede compostos contendo fósforo, enxofre, cálcio, manganês, zinco, e ferrodentre outros seriam valiosos. Um exemplo pode ser a introdução de um geneque reduziu a produção de ácido fítico ou codificou a enzima fitase queintensifica a decomposição de ácido fítico. Estes genes aumentariam os níveisde fosfato disponível na dieta, reduzindo a necessidade de suplementação commineral fosfato.

Numerosos outros exemplos de melhoria de cereais parapropósitos de ração e alimento poderiam ser descritos. As melhorias podemnem sempre necessariamente envolver o grão, mas podem, por exemplo,melhorar o valor do grão para silagem. Introdução de DNA para realizar istopoderia incluir seqüências que alteram a produção de lignina tais comoaquelas que resultam no fenótipo de "nervura central das folhas marrom"associado com valor superior para gado bovino.

Em adição às melhorias diretas em valor de ração ou dealimento, também podem ser introduzidos genes que melhoram oprocessamento do grão e melhoram o valor dos produtos resultantes doprocessamento. O método primário de processamento de certos grãos talcomo milho é via moagem úmida. Milho pode ser melhorado por meio daexpressão de genes novos que aumentam a eficiência e reduzem o custo doprocessamento tal como pela diminuição do tempo de molhamento.

Melhoria do valor de produtos de moagem úmida pode incluiralteração da qualidade e da quantidade de amido, óleo, farinha de glúten demilho, ou de componentes da ração de glúten de milho. Elevação do amidopode ser alcançada por meio da identificação e da eliminação das etapaslimitantes de velocidade na biossíntese de amido ou pelo decréscimo dosníveis dos outros componentes do grão resultando em aumentos proporcionaisem amido. Um exemplo da primeira pode ser a introdução de genescodificadores de enzimas ADP-glicose pirofosforilase com atividaderegulatória alterada ou que são expressadas em nível maior. Exemplos daúltima incluem inibidores seletivos de, por exemplo, biossíntese de proteínaou de óleo expressada durante estágios mais tardios do desenvolvimento dasemente.

As propriedades de amido podem ser beneficamente alteradaspela mudança da razão de amilose para amilopectina, do tamanho dasmoléculas de amido, ou de seu padrão de ramificação. Por meio destasmudanças pode ser modificada uma ampla variedade de propriedades queincluem, mas não são limitadas a, mudanças em temperatura de gelatinização,calor de gelatinização, clareza dos filmes e das pastas, e semelhante. Pararealizar estas mudanças nas propriedades, genes que codificam atividade desintase de amido solúvel ou ligado em grânulo ou atividade de enzima deramificação podem ser introduzidos sozinhos ou em combinação. DNA talcomo construtos de anti-senso também podem ser usados para diminuir osníveis de atividade endógena destas enzimas. Os genes ou construtosintroduzidos podem possuir seqüências regulatórias que sincronizam suaexpressão em intervalos específicos em biossíntese de amido edesenvolvimento de grânulo de amido. Além disso, pode ser aconselhávelintroduzir e expressar genes que resultam em derivação in vivo, ou outramodificação, dos grupos de glicose da molécula de amido. A ligaçãocovalente de qualquer molécula pode ser prevista, limitada apenas pelaexistência de enzimas que catalisam as derivações e a acessibilidade dossubstratos apropriados no grânulo de amido. Exemplos de derivaçõesimportantes podem incluir a adição de grupos funcionais tais como gruposaminas, carboxilas, ou fosfato que proporcionam sítios para derivações invitro subseqüentes ou afetam as propriedades do amido por meio daintrodução de cargas iônicas. Exemplos de outras modificações podem incluirmudanças diretas das unidades de glicose tal como perda de grupos hidroxilaou sua oxidação para grupos aldeído ou carboxila.

Óleo é outro produto da moagem úmida de milho e de outrosgrãos, cujo valor pode ser melhorado pelas introdução e expressão de genes.A quantidade de óleo que pode ser extraída pela moagem úmida pode serelevada por abordagens como descrito para ração e alimento acima.Propriedades de óleo também podem ser alteradas para melhorar seudesempenho na produção e o uso de óleo de cozinhar, gorduras hidrogenadas,lubrificantes ou outros produtos derivados de óleo ou melhoria de seusatributos para a saúde quando usados em aplicações relacionadas comalimento. Também podem ser sintetizados ácidos graxo novos que sobextração podem servir como materiais iniciais para sínteses químicas. Asmudanças em propriedades de óleo podem ser alcançadas pela alteração dotipo, do nível, ou do arranjo de lipídeo dos ácidos graxos presentes no óleo.Isto por sua vez pode ser realizado pela adição de genes que codificamenzimas que catalisam a síntese de ácidos graxos novos e de lipídeospossuindo-os ou pelo aumento de níveis de ácidos graxos nativos ao mesmotempo possibilitando a redução de níveis de precursores. Alternativamentepodem ser introduzidas seqüências de DNA que tornam mais lentas oubloqueiam as etapas em biossíntese de ácido graxo resultando no aumento deintermediários precursores de ácido graxo. Genes que poderiam seradicionados incluem dessaturases, epoxidases, hidratases, desidratases, eoutras enzimas que catalisam reações envolvendo intermediários de ácidograxo. Exemplos representativos de etapas catalíticas que poderiam serbloqueadas incluem as dessaturações de ácido esteárico a oleico e de ácidooleico a linolênico resultando em acúmulos respectivos de ácidos esteárico eoleico.

Melhorias em outros produtos maiores de moagem úmida decereal, farinha de glúten e ração de glúten, também podem ser alcançadas pelaintrodução de genes para obter plantas novas. Possibilidades representativasincluem mas não são limitadas àquelas descritas acima para a melhoria dovalor de alimento e de ração.

Em adição pode ser adicionalmente considerado que a plantaseja usada para a produção ou a fabricação de compostos biológicos úteis queeram quer não produzidos, quer não produzidos no mesmo nível, na planta.As plantas novas produtoras destes compostos são tornadas possíveis pelasintrodução e expressão de genes pelos métodos de transformação. Aspossibilidades incluem, mas não são limitadas a, qualquer composto biológicoque é presentemente produzido por um organismo tais como proteínas, ácidosnucleicos, metabólitos intermediários e primários, polímeros de carboidrato,etc. Os compostos podem ser produzidos pela planta, extraídos de colheitae/ou processamento, e usados para qualquer propósito útil presentementereconhecido tal como fármacos, fragrâncias, enzimas industriais para nomearalguns.

Outras possibilidades para exemplificar a variedade de feiçõesou propriedades de grão potencialmente codificadas pelos genes introduzidosnas plantas transgênicas incluem grão com menos suscetibilidade à quebrapara propósitos de exportação ou tamanho de grit maior quando processadospor moagem seca por meio da introdução de genes que intensificam a síntesede gama-zeína, milho de pipoca com explosão melhorada, qualidade e volumede expansão por meio de genes que aumentam a espessura do pericarpo,milho com grão mais branco para usos de alimento por intermédio daintrodução de genes que efetivamente bloqueiam a expressão de enzimasenvolvidas nas rotas de produção de pigmento, e qualidade melhorada debebidas alcoólicas ou de milho verde pela introdução de genes que afetam oaroma tal como o gene de enrugamento (codificador de sacarose sintase) paramilho verde.

Para aplicações baseadas em semente, uma etiqueta-miRNA,que garante expressão intensificada preferencial ou específica em sementepode ser empregada.

3.1.1.7 Qualidade ou composição de semente ou de tubérculoVárias feições podem ser vantajosamente expressadasespecialmente em sementes ou tubérculos para melhorar a composição ou aqualidade. Tais feições incluem mas não são limitadas a:

Expressão de enzimas metabólicas para uso no setor de alimento-e-ração, por exemplo, de fitases e celulases. São especialmentepreferidos os ácidos nucleicos tais como o cDNA artificial quecodifica uma fitase microbiana (GenBank Acc. No.: A19451) ouseus equivalentes funcionais.

Expressão de genes que acarretam um acúmulo de compostos dequímica fina tais como tocoferóis, tocotrienóis ou carotenóides. Umexemplo é fitoeno desaturase. São preferidos ácidos nucleicos quecodificam a fotoeno dessaturase de Narcissus pseudonarcissus(GenBank Acc. No.: X78815) ou seus equivalentes funcionais.Produção de nutracêuticos tais como, por exemplo, ácidos graxospoliinsaturados (por exemplo ácido araquidônico, ácidoeicosapentaenóico ou ácido docosahexaenóico) pela expressão deácido graxo elongases e/ou dessaturases, ou produção de proteínascom valor nutricional melhorado tais como, por exemplo, com umconteúdo alto de aminoácidos essenciais (por exemplo o gene dealto-metionina 2S albumina de castanha-do-pará). São preferidos osácidos nucleicos que codificam alta-metionina 2 S albumina deBertholletia excelsa (GenBank Acc. No.: AB044391), a A6-acil-lipid dessaturase de Physcomitrella patens (GenBank Acc. No.:AJ222980; Girke et al. (1998) Planta J 15:39-48), a A6-dessaturasede Mortierella alpina (Sakuradani et al. 1999 Gene 238:445-453), aA5-dessaturase de Caenorhabditis elegans (Michaelson et al. 1998,FEBS Letters 439:215-218), a A5-ácido graxo dessaturase (des-5)de Caenorhabditis elegans (GenBank Acc. No.: AF078796), a A5-dessaturase de Mortierella alpina (Michaelson et al. JBC273:19055-19059), a Á 6-elongase de Caenorhabditis elegans(Beaudoin et al. 2000, PNAS 97:6421-6426), a A6-elongase dePhyscomitrella patens (Zank et al. 2000, Biochemical SocietyTransaetions 28:654-657), ou os equivalentes funcionais destas.Produção de proteínas e enzimas de qualidade alta para propósitosindustriais (por exemplo enzimas, tais como lipases) ou comofármacos (tais como, por exemplo, antibióticos, fatores decoagulação do sangue, interferons, linfocinas, fator de estimulaçãode colônia, ativadores de plasminogênio, hormônios ou vacinas,como descrito por Hood EE, Jilka JM (1999) Curr Opin Biotechnol10(4):382-6; Ma JK, Vine ND (1999) Curr Top Microbiol Immunol236:275-92). Por exemplo, tem sido possível a produção de avidinarecombinante de albúmen de galinha e b-glicuronidase bacteriana(GUS) em uma grande escala em plantas de milho transgênicas(Hood et al. (1999) Adv Exp Med Biol 464:127-47. Review).Obtenção de uma capacidade de armazenagem aumentada emcélulas que normalmente compreendem menos lipídeos dearmazenagem ou proteínas de armazenagem, com o propósito deaumentar o rendimento destas substâncias, por exemplo pelaexpressão de acetil-CoA carboxylase. Ácidos nucleicos preferidossão aqueles que codificam a acetil-CoA carboxilase de Medicagosativa (ACCase) (GenBank Acc. No.: L25042), ou seusequivalentes funcionais.

Redução dos níveis de atividade de enzima a-glicano fosforilase detubérculo de tipo-L (GLTP) ou a-glicano fosforilase de tubérculode tipo-H (GHTP) preferivelmente dentro do tubérculo de batateira(veja US 5.998.701). A conversão de amidos em açúcares emtubérculos de batateira, particularmente quando armazenadosabaixo de 1°C., é reduzida em tubérculos exibindo atividade deenzima GLTP ou GHTP reduzida. Redução de adoçamento-frio embatateiras permite a armazenagem de batateira em temperaturasmais frias, resultando em dormência prolongada, incidênciareduzida de doença, e vida de armazenagem aumentada. Reduçãode atividade de GLTP ou de GHTP dentro de tubérculo de batateirapode ser realizada por tais técnicas como supressão de expressão degene usando RNA de anti-senso homólogo ou de fita dupla, o usode co-supressão, seqüências de silenciamento regulatórias. A plantade batateira possuindo características de armazenagem fria,compreendendo uma planta de batateira transformada com umcassete de expressão possuindo uma seqüência de promotor TPToperavelmente ligado em uma seqüência de DNA compreendendopelo menos 20 nucleotídeos de um gene codificador de uma a-glicano fosforilase selecionada do grupo consistindo de a-glicanofosforilase de tubérculo de tipo-L (GLTP) ou a-glicano fosforilasede tubérculo de tipo-H (GHTP).

Outros exemplos de genes vantajosos são mencionados porexemplo em Dunwell JM, "Transgenic approaches to crop improvement", JExp Bot. 2000; 51 Spec No; páginas 487-96.

Para aplicações baseadas em semente, uma etiqueta-miRNA,que garante expressão preferencial ou específica em semente ou em tubérculointensificada pode ser empregada. Por exemplo, miR156 de milho éexpressado em todas as partes menos em sementes, uso de etiqueta miR156poderia intensificar expressão específica em semente.

3.1.1.8 Características agronômicas de plantaDois dos fatores determinantes de se as plantas podem sercrescidas são a temperatura diária média durante a estação de crescimento e aduração de tempo entre as estações frias. Dentro das áreas onde é possívelcrescer uma planta particular, há várias limitações sobre o tempo máximo queé permitido crescer até a maturidade e ser colhida. A planta a ser crescida emuma área particular é selecionada para a sua capacidade de maturar e secarpara o conteúdo de umidade capaz de ser colhido dentro do período de tempocom máximo rendimento possível. Portanto, plantas de maturidades variadassão desenvolvidas para localizações de crescimento diferentes. À parte danecessidade de secar suficientemente para permitir colheita é o desejo de seter ocorrência de secagem máxima no campo para minimizar a quantidade deenergia requerida para secagem adicional após a colheita. Também quantomais prontamente o grão puder secar, mais tempo estará disponível paracrescimento e enchimento de semente. Genes que influenciam a maturidadee/ou a secagem podem ser identificados e introduzidos em linhagens de plantausando técnicas de transformação para criar novas variedades adaptadas paralocalizações de crescimento diferentes ou para a mesma localização decrescimento mas possuindo rendimento melhorado em proporção de umidadena colheita. Expressão de genes que estão envolvidos em regulação dedesenvolvimento de planta pode ser especialmente útil, e.g., os genes debainha áspera e liguleless que têm sido identificados em plantas.

Podem ser introduzidos em plantas genes que melhorariam aestabilidade e as outras características de crescimento de planta. Por exemplo,expressão de genes novos que conferem pedúnculos mais fortes, sistemas deraiz melhorados, ou previnem ou reduzem a queda de espigas seriam degrande valor para o agricultor de milho. Introdução e expressão de genes queaumentam a quantidade total de fotoassimilado disponível, por exemplo, poraumento da intercepção e/ou distribuição de luz seriam vantajosas. Em adiçãoa expressão de genes que aumentam a eficiência de fotossíntese e/ou copafoliar aumentaria ainda mais os ganhos em produtividade. Tais abordagenspermitiriam populações de plantas aumentadas no campo.

Retardamento da senescência vegetativa de estação tardiaaumentaria o fluxo de assimilado no grão e assim aumentaria o rendimento.Sobre-expressão de genes dentro de plantas que estão associados com"permanência verde" ou a expressão de qualquer gene que retarda asenescência seria vantajosa. Por exemplo, um mutante de não-amarelecimentotem sido identificado em Festuca pratensis (Davies 1990). Expressão destegene bem como de outras pode prevenir degradação prematura de clorofila eassim manter a função da copa.

3.1.1.9 Utilização de nutriente

A capacidade para utilizar minerais e nutrientes disponíveispode ser um fator limitante no crescimento de muitas plantas. É proposto queseria possível alterar a captação de nutrientes, tolerância aos extremos de pH,mobilização através de planta, piscinas de armazenagem, e disponibilidadepara atividades metabólicas pela introdução de genes novos. Estasmodificações permitiriam que uma planta utilize mais eficientemente osnutrientes disponíveis. E contemplado que um aumento na atividade, porexemplo, de uma enzima que está normalmente presente na planta e envolvidaem utilização de nutriente aumentaria a disponibilidade de um nutriente. Umexemplo de uma tal enzima seria fitase. Também é contemplado que aexpressão de um gene novo pode tornar disponível uma fonte de nutriente quepreviamente não era acessível, e.g., uma enzima que libera um componente devalor nutriente de uma molécula mais complexa, talvez uma macromolécula.

Para aplicações baseadas em semente, uma etiqueta-miRNA,que garante expressão intensificada preferencial ou específica em sementepode ser empregada. Por exemplo, miR156 de milho é expressado em todas aspartes menos em sementes, uso de etiqueta miR156 poderia intensificarexpressão específica em semente.

3.1.1.10 Esterilidade masculina

Esterilidade masculina é útil na produção de semente híbrida.É proposto que esterilidade masculina pode ser produzida por meio deexpressão de genes novos. Por exemplo, tem sido mostrado que a expressãode genes que codificam proteínas que interferem com o desenvolvimento degametófito e/ou inflorescência masculina resulta em esterilidade masculina.Tem sido demonstrado que genes de ribonuclease quimérica que expressamem anteras de tabaco e de colza transgênicos acarretam esterilidade masculina(Mariani 1990). Por exemplo, foram descobertas numerosas mutações emmilho que conferem esterilidade citoplásmica masculina. Uma manipulaçãoem particular, referida como citoplasma T, também correlaciona-se comsensibilidade à queima das folhas de milho do sul. Foi identificada umaseqüência de DNA, chamada TURF-13 (Levings 1990), que estácorrelacionada com citoplasma T. Seria possível por meio da introdução deTURF-13 via transformação separar esterilidade masculina de sensibilidade àdoença. Visto que é necessária a capacidade para restaurar a fertilidademasculina para propósitos de procriação e a produção de grãos, é propostoque os genes codificadores de restauração de fertilidade masculina tambémsejam introduzidos.

Para esta aplicação, ma etiqueta-miRNA, que garanteexpressão preferência ou específica em pólen pode ser empregada.

3.1.2 Genes alvo de planta para silenciamento comespecificidade intensificada

DNA pode ser introduzido em plantas para o propósito deexpressar transcritos de RNA que funcionam para afetar o fenótipo de plantaainda não traduzido em proteína. Dois exemplos são RNA de anti-senso eRNA com atividade de ribozima. Ambos podem servir com possíveis funçõesna redução ou eliminação de expressão de genes de planta introduzidos ounativos.

Podem ser construídos ou isolados genes, que quandotranscritos, produzem RNA de anti-senso ou RNA de fita dupla que écomplementar a todos ou parte(s) de um RNA(s) mensageiro(s)selecionado(s). A produção de RNA de anti-senso reduz a produção doproduto polipeptídeo do RNA mensageiro. O produto polipeptídeo pode serqualquer proteína codificada pelo genoma da planta. Os genes acimamencionados ser referirão aos genes de anti-senso. Um gene de anti-sensoassim pode ser introduzido em uma planta por métodos de transformação paraproduzir uma planta transgênica nova com expressão reduzida de umaproteína selecionada de interesse. Por exemplo, a proteína pode ser umaenzima que catalisa uma reação na planta. Redução da atividade da enzimapode reduzir ou eliminar produzir da reação que incluem qualquer produtoenzimaticamente sintetizado na planta tais como ácidos graxos, aminoácidos,carboidratos, ácidos nucleicos e semelhante. Alternativamente, a proteínapode ser uma proteína de armazenagem, tal como uma zeína, ou uma proteínaestrutural, cuja expressão diminuída pode acarretar mudanças em composiçãode aminoácido de semente ou mudanças morfológicas da plantarespectivamente. As possibilidades citadas acima são proporcionadas apenaspor meio de exemplo e não representam a variedade total de aplicações.

Expressão de RNA de anti-senso ou RNA de fita dupla por umdos cassetes de expressão da invenção é especialmente preferida. Tambémexpressão de RNA de senso pode ser empregada para silenciamento (co-supressão) de gene. Este RNA é preferivelmente um RNA não-traduzível.Regulação de gene por RNA de fita dupla ("interferência de RNA de fitadupla"; dsRNAi) é bem conhecida na arte e descrita para vários organismosincluindo plantas (e.g., Matzke 2000; Fire A et al 1998; WO 99/32619; WO99/53050; WO 00/68374; WO 00/44914; WO 00/44895; WO 00/49035; WO00/63364).

Também podem ser construídos ou isolados genes, que quandotranscritos produzem RNA enzimas, ou ribozimas, que podem atuar comoendorribonucleases e catalisar a clivagem de moléculas de RNA comseqüências selecionadas. A clivagem de RNA's mensageiros pode resultar naprodução reduzida de seus produtos de polipeptídeo codificados. Estes genespodem ser usados para preparar plantas transgênicas novas que os possuem.As plantas transgênicas podem possuir níveis reduzidos de polipeptídeosincluindo mas não limitados aos polipeptídeos citados acima que podem serafetados pelo RNA de anti-senso.

Também é possível que genes possam ser introduzidos paraproduzir plantas transgênicas novas que possuem expressão reduzida de umproduto de gene nativo por um mecanismo de co-supressão. Tem sidodemonstrado em tabaco, tomateiro, e petúnia (Goring 1991; Smith 1990;Napoli 1990; van der Krol 1990) que expressão de transcrito de senso de umgene negativo reduzirá ou eliminará a expressão do gene nativo em umamaneira similar àquela observada para genes de anti-senso. O geneintroduzido pode codificar toda ou parte da proteína nativa selecionada massua tradução pode não ser requerida para redução dos níveis daquela proteínanativa.

Os possíveis genes alvo enunciados são para serem entendidospor meio de exemplo, mas não por limitação.

3.1.2.1 Proteção melhorada contra fatores de estresseabiótico (calor, frio, seca, umidade aumentada, toxinas ambientais, radiaçãoUV). E preferido reduzir a expressão dos genes, que estão envolvidos emreações de estresse.

Para esta aplicação quer uma etiqueta-miRNA, que permiteexpressão específica intensificada em tecido sensível (embrião, muda), queruma etiqueta-miRNA correspondendo a um miRNA,que é endogenamentesuprimida pelo fator de estresse é preferida para ser empregada para planejar aetiqueta-miRNA.

3.1.2.2 Modificação da composição e/ou do conteúdo deácidos graxos, lipídeos ou óleos

Uma modificação dos conteúdos de ácido graxo ou dacomposição de ácido graxo, preferivelmente em uma colheita oleosa tal comocolza ou girassol, pode ser alcançada, por exemplo, pela redução da expressãogenética de genes da biossíntese de ácido graxo, preferivelmente daquelesselecionados do grupo consistindo de genes codificadores de acetiltransacilases, proteínas transportadoras de acila ("proteína carreadora deacila"), dessaturases tais como estearil dessaturases ou D12-dessaturasesmicrossômicas, em particular genes Fad2-1, malonil transacilase, |3-cetoacil-ACP sintetases, 3-ceto-ACP redutases, enoil-ACP hidrases, tioesterases talcomo acil-ACP tioesterases, enoil-ACP redutases. Várias outras abordagensvantajosas para modificar a composição de lipídeo são descritas (Shure M etal. (1983) Cell 35:225-233; Preiss et a/.(1987) Tailoring Genes for CropImprovement (Bruening et al., eds.), Plenum Press, S. 133-152; Gupta et al(1988) Plant Mol Biol. 10:215-224; Olive et al. (1989) Plant Mol Biol12:525-538; Bhattacharyya et al. (1990) Cell 60:155-122; Dunwell JM (2000)J Exp Botany 5 ISpec No:487-96; Brar DS et al. (1996) Biotech Genet EngRev 13:167-79; Kishore GM and Somerville CR (1993) Curr Opin Biotech4(2): 152-8). São preferidos, em particular, os genes Fad2 (por exemploaqueles descritos por Genbank Acc. No.: AF124360 (Brassica carinata),AF042841 (Brassica rapa), L26296 (Arabidopsis thaliana), A65102 (Corylusavellana)). Outros genes e métodos vantajosos para modificar o conteúdo delipídeo são descritos, por exemplo em US 5,530,192 e WO 94/18337.Conteúdo de lipídeo elevado também pode ser alcançado pela redução doconteúdo de amido, por exemplo como o resultado da expressão reduzida deenzimas do metabolismo de carboidrato (por exemplo ADP-glicosepirofosforilases).

Para esta aplicação quer uma etiqueta-miRNA, que permiteexpressão específica intensificada em sementes é preferida para planejamentoda etiqueta-miRNA. Por exemplo, miR156 de milho é expressado em todas aspartes menos em sementes, uso de etiqueta miR156 poderia intensificarexpressão específica em semente.3.1.2.3 Modificação da composição de carboidrato

Uma modificação da composição de carboidrato pode seralcançada por exemplo pela redução da expressão genética de genes demetabolismo de carboidrato ou de genes da biossíntese de carboidrato, porexemplo genes da biossíntese de amilose, pectinas, celulose ou carboidratosda parede celular. Uma multiplicidade de processos celulares (maturação,armazenabilidade, composição de amido ou conteúdo de amido e semelhante)pode ser deste modo influenciada em uma maneira vantajosa. Genes alvo quepodem ser mencionados por meio de exemplo, mas não por limitação, sãofosforilases, amido sintetases, Q-enzimas, sacarose-6-fosfato sintetases,sacarose-6-fosfato fosfatases, ADP-glicose pirofosforilases, enzimasramificadoras, enzimas desramificadoras e várias amilases. Os genescorrespondentes são descritos (Dunwell JM (2000) J Exp Botany 5 ISpecNo:487-96; Brar DS et ai. (1996) Biotech Genet Eng Rev 13:167-79; KishoreGM and Somerville CR (1993) Curr Opin Biotech 4(2): 152-8). Genesvantajosos para influenciarem o metabolismo de carboidrato - são descritosem WO 92/11375, WO 92/11376, US 5,365,016 e WO 95/07355.

Para esta aplicação quer uma etiqueta-miRNA, que permiteexpressão específica intensificada em sementes é preferida para planejar aetiqueta-miRNA. Por exemplo, miR156 de milho é expressado em todas aspartes menos em sementes, uso de etiqueta miR156 poderia intensificarexpressão específica em semente.

3.1.2.4 Modificação da cor ou pigmentação

Uma modificação da cor ou pigmentação, preferivelmente deplantas ornamentais, pode ser alcançada por exemplo pela redução daexpressão genética de genes da biossíntese de flavonóides tais como, porexemplo, dos genes de calcona sintases, calconaisomerases, fenil-alaninaamônia liases, desidrocaempferol (flavona) hidroxilases tais como flavanona3-hidroxilases ou flavanona2-hidroxilases, disidroflavonol redutases, di-hidroflavanol 2-hidroxilases, flavonóide 3'-hidroxilases, flavonóide 5'-hidroxilases, flavonóide glicosiltransferases (por exemploglicosiltransferasestais como UDPG: flavonóide 3-O-glicosiltransferases,UDPGiflavonol 7-O-glicosiltransferases ou ramnosiltransferases), flavonóidemetiltransferases (tais como, por exemplo, SAM:antocianidina-3-(p-cumaroil)rutinosídeo-5-glicosídeo-3',5'-0-metiltransferases) e flavonóideaciltransferases (Hahlbrock (1981) Biochemistry of Plants, Vol.7, Conn (Ed.);Weiring e de Vlaming (1984) "Petunia", KC Sink (Ed.), Springer-Verlag,New York). São particularmente adequadas as seqüências descritas em EP-Al 522 880.

Para esta aplicação quer uma etiqueta-miRNA, que permiteexpressão específica intensificada em flores e suas partes é preferida paraplanejar a etiqueta-miRNA. Por exemplo, miR156I de arroz é expressado emraiz e em broto, uso de etiqueta miR156I pode intensificar expressãoespecífica de gene-de-interesse em flores.

3.1.2.5. Redução do conteúdo de proteína de armazenagem

A redução da expressão genética de genes codificadores deproteínas de armazenagem (SP aqui abaixo) possui um número grande devantagens tais como, por exemplo, a redução do potencial alérgico oumodificação na composição ou quantidade de outros metabólitos. Proteínas dearmazenagem são descritas, inter alia, em EP-A 0 591 530, WO 87/47731,WO 98/26064, EP-A 0.620.281; Kohno-Murase J et al. (1994) Plant Mol Biol26(4): 1115-1124. SP servem para a armazenagem de carbono, nitrogênio, eenxofre, que são requeridos para o crescimento heterotrófico rápido nagerminação de sementes ou pólen. Na maioria dos casos, não possuematividade enzimática. SP são sintetizadas no embrião apenas durante odesenvolvimento da semente e, neste processo, acumulam-se primeiramentenos vacúolos de armazenagem de proteína (PSV) ode células diferentementediferenciadas no embrião ou endosperma. Proteínas de armazenagem podemser classificadas em subgrupos, como a função de outras propriedadescaracterísticas, tais como, por exemplo, seu coeficiente de sedimentação ou asolubilidade em soluções diferentes (água, solução salina, álcool). Ocoeficiente de sedimentação pode ser determinado por meio deultracentrifugação na maneira com a qual o técnico experiente estáfamiliarizado (por exemplo como descrito em Correia JJ (2000) Methods inEnzymology 321:81-100). NO total, quatro famílias grandes de genes paraproteínas de armazenagem podem ser designadas, devido às suas seqüências:albuminas 2S (semelhante à napina), globulinas 7S (semelhante à faseolina),globulinas 11S/12S (semelhante à legumina/cruciferina) e zeína prolaminas.

Albuminas 2 S são encontradas selvagemente em sementes dedicotiledôneas, incluindo famílias de plantas comerciais importantes taiscomo Fabaceae (por exemplo feijão-soja), Brassicaceae (por exemplo colza),Euphorbiaceae (por exemplo Rícino) ou Asteraceae (por exemplo girassol).Albuminas 2S são proteínas globulares compactas com resíduos de cisteínaconservados que freqüentemente formam heterodímeros. Globulinas 7Socorrem na forma trimérica e não compreendem resíduos de cisteína. Apóssua síntese, são clivadas em fragmentos menores e glicosiladas, como é o casocom as albuminas 2S. Apesar das diferenças em tamanho de polipeptídeo, asglobulinas 7 S diferentes estão elevadamente conservadas e podem serprovavelmente traçadas para uma proteína precursora compartilhada, como éo caso com as albuminas 2S. Apenas quantidades pequenas de globulinas 7Ssão encontradas em monocotiledôneas. Em dicotiledôneas, sempre totalizammenos do que globulinas 11S/12S. Globulinas 11S/12S constituem a fraçãoprincipal das proteínas de armazenagem em dicotiledôneas, em adição àsalbuminas 2S. O alto grau de similaridade das diferentes globulinas IlS degêneros de planta diferentes, por sua vez, permite a conclusão de umaproteína precursora compartilhada no curso da evolução. A proteína dearmazenagem é preferivelmente selecionada das classes de albuminas 2 S(semelhante à napina), globulinas 7 S (semelhante à faseolina), globulinas11S/12S (semelhante à legumina/cruciferina) ou zeína prolaminas. Globulinas11S/12S especialmente preferidas compreendem globulinas Sll de colza,feijão-soja e Arabidopsis, girassol, linho, gergelim, açafrão, oliveira, feijão-soja ou várias espécies de nogueiras. Zeína prolaminas especialmentepreferidas compreendem aquelas de plantas monocotiledôneas, em particularde milho, arroz, aveia, cevada ou trigo.

3.1.2.6. Obtenção de uma resistência aos patógenos deplanta

Os métodos e os meios da invenção serão especialmenteadequados para obter resistência a patógeno (e.g., vírus ou nematódeo), emorganismos ou células eucarióticas, particularmente em células de planta e emplantas. E esperado que as moléculas de RNA quiméricas (ou as moléculasde dsRNA derivadas das mesmas) produzidas por transcrição em umorganismo hospedeiro (e.g., uma planta), possam ser sistemicamenteespalhadas em todo o organismo. Assim é possível reduzir a expressão defenótipo de um ácido nucleico em células de um descendente não-transgênicode uma planta graftizada em um estoque transgênico compreendendo os genesmiméticos da invenção (ou vice versa) um método que pode ser importanteem horticultura, viticultura ou em produção de frutos.

Uma resistência da planta a patógenos tais como aracnídeos,fungos, insetos, nematódeos, protozoários, vírus, bactérias e doenças pode seralcançada pela redução da expressão genética de genes que são essenciaispara o crescimento, a sobrevivência, e certos estágios de desenvolvimento(por exemplo pupação) ou a multiplicação de um certo patógeno. Umaredução adequada pode acarretar uma inibição completa das etapas acima,mas também um atraso das mesmas. Isto podem ser genes de planta que, porexemplo, permitem que o patógeno entre, mas também podem ser geneshomólogos ao patógeno. Preferivelmente, o RNA quimérico (ou o dsRNAderivado do mesmo) é direcionado contra os genes do patógeno. Por exemplo,plantas podem ser tratadas com formulações adequadas de agentesmencionados, por exemplo pulverizadas ou polvilhadas, as próprias plantas,contudo também podem compreender os agentes na forma de um organismotransgênico e passadas sobre os patógenos, por exemplo na forma de umveneno estomacal. Vários genes essenciais de uma variedade de patógenossão conhecidos pelo técnico experiente (por exemplo para resistência anematódeo: WO 93/10251, WO 94/17194).

Assim, um aspecto desta invenção proporciona um métodoonde o gene alvo para supressão codifica uma proteína em um patógeno deplanta (e.g., um inseto ou nematódeo). Em um aspecto, um métodocompreende introduzir no genoma de uma planta selecionada para patógenoum construto de ácido nucleico compreendendo DNA que é transcrito em umRNA quimérico a forma pelo menos uma molécula de dsRNA que é efetivapara reduzir a expressão de um gene alvo dentro do patógeno quando opatógeno (e.g., inseto ou nematódeo) ingerir ou infectar células de citadaplanta. Em uma modalidade preferida, a supressão de gene é fatal para opatógeno.

Mais preferidos como patógeno são patógenos fungicos taiscomo Phytophthora infestans, Fusarium nivale, Fusarium graminearum,Fusarium culmorum, Fusarium oxysporum, Blumeria graminis, Magnaporthegrisea, Sclerotinia sclerotium, Septoria nodorum, Septoria tritici, Alternariabrassicae, Phoma lingam, bacterial pathogens such as Corynebacteriumsepedonicum, Erwinia carotovora, Erwinia amylovora, Streptomyces seabies,Pseudomonas syringae pv. tabaci, Pseudomonas syringae pv. phaseolicola,Pseudomonas syringae pv. tomato, Xanthomonas campestris pv.malvacearum and Xanthomonas campestris pv. oryzae, and nematódeos suchas Globodera rostochiensis, G. pallida, Heterodera schachtii, Heteroderaavenae, Ditylenchus dipsaci, Anguina tritici e Meloidogyne hapla.

Resistência aos vírus pode ser obtida por exemplo pelaredução da expressão de uma proteína de capa viral, uma replicase viral, umaprotease viral e semelhante. Um grande número de vírus de planta e genesalvo adequados são conhecidos pelo técnico experiente. Os métodos e ascomposições da presente invenção são especialmente úteis para se obteremplantas resistentes a nematódeo (para genes alvo veja e.g., WO 92/21757, WO93/10251, WO 94/17194).

Também é proporcionado pela invenção um método para obterorganismos resistentes a patógeno, particularmente plantas, compreendendoas etapas de proporcionar células do organismo com uma molécula de RNAquimérica da invenção, a citada molécula de RNA quimérica capaz deproporcionar em uma célula eucariótica uma molécula de RNA pelo menosparcialmente de fita dupla, a citada molécula de RNA quiméricacompreendendo:

a) pelo menos uma primeira seqüência de ribonucleotídeos que ésubstancialmente idêntica a pelo menos uma parte de umaseqüência de nucleotídeos alvo de pelo menos um gene de umpatógeno, e

b) pelo menos uma segunda seqüência de ribonucleotídeos que ésubstancialmente complementar à citada primeira seqüência denucleotídeos e é capaz de hibridizar em citada primeira seqüênciade nucleotídeos para formar uma estrutura de RNA de fita dupla, e

c) pelo menos uma terceira seqüência de ribonucleotídeos localizadaentre a citada primeira e a citada segunda seqüências deribonucleotídeos compreendendo pelo menos um elemento de RNAremovível, que pode ser removido pelo mecanismo deprocessamento de RNA de uma célula eucariótica sem juntarsubseqüentemente covalentemente as seqüências resultantescompreendendo a citada primeira e a citada segunda seqüências deribonucleotídeos, respectivamente.

Preferivelmente, a citada primeira seqüência deribonucleotídeos possui entre 65% e 100% de identidade de seqüências,preferivelmente entre 75% e 100%, com maior preferência entre 85% e 100%,mais preferivelmente entre 95% e 100%, com pelo menos parte da seqüênciade nucleotídeos do genoma de um patógeno. Mais preferivelmente opatógeno é selecionado do grupo de vírus, bactérias, fungos, e nematódeos.

Para esta aplicação quer uma etiqueta-miRNA, que permiteexpressão específica intensificada em tecido, que funciona como sítio deentrada para o patógeno (e.g., epiderme) quer uma etiqueta-miRNAcorrespondendo a um miRNA, que é endogenamente suprimida pelo estresseinduzido por patógeno é preferida para ser empregada para planejar aetiqueta-miRNA.

3.1.2.7. Prevenção de quebra de caule

Uma suscetibilidade reduzida à quebra de caule pode serobtida por exemplo pela redução da expressão genética de genes dometabolismo de carboidrato (veja acima). Genes vantajosos são descritos(WO 97/13865, inter alia) e compreendem celulases e poligalacturonasesespecíficas para tecido.

Para esta aplicação quer uma etiqueta-miRNA, que permiteexpressão específica intensificada em caule é preferida para planejar aetiqueta-miRNA. Por exemplo, miR166 de milho é expressado em folhas eestigma, uso de etiqueta miR166 pode intensificar expressão específica degene-de-interesse em caule.3.1.2.8. Atraso da maturação de fruto

Maturação de fruto atrasada pode ser alcançada por exemplopela redução da expressão genética de genes selecionados do grupoconsistindo de poligalacturonases, pectina esterases, (3-(l-4)glicanases(celulases), P-galactanases ((3-galactosidases), ou genes de biossíntese deetileno, tal como 1-aminociclopropano-l-carboxilato sintase, genes dabiossíntese de carotenóide tais como, por exemplo, genes da biossíntese deprefitoeno ou de fitoeno, por exemplo fitoeno dessaturases. Outros genesvantajosos estão, por exemplo, em WO 91/16440, WO 91/05865, WO91/16426, WO 92/17596, WO 93/07275 ou WO 92/04456, US 5.545.366).

Para esta aplicação quer uma etiqueta-miRNA, que permiteexpressão específica intensificada em frutos é preferida para planejar aetiqueta-miRNA.

3.1.2.9. Alcançar esterilidade masculina. Genes alvoadequados são descritos em WO 94/29465, W089/10396, WO 92/18625,inter alia. Uma aplicação particular para redução da expressão fenotípica deum transgene em uma célula de planta, inter alia, tem sido descrita para arestauração de fertilidade masculina, a última sendo obtida pela introdução deum transgene compreendendo um DNA de esterilidade masculina (WO94/09143, WO 91/02069). O ácido nucleico de interesse é especificamente oDNA de esterilidade masculina.

Para esta aplicação quer uma etiqueta-miRNA, que permiteexpressão específica intensificada em pólen é preferida para planejar aetiqueta-miRNA.

3.1.2.10. Redução de constituintes de planta tóxicos ouindesejados tais como, por exemplo, glicosinolatos. Genes alvo adequados sãodescritos (em WO 97/16559, inter alia). Para esta aplicação quer umaetiqueta-miRNA, que permite expressão específica intensificada em sementesé preferida para planejar a etiqueta-miRNA. Por exemplo, miR156 de milho éexpressado em todas as partes menos em sementes, uso de etiqueta miR156poderia intensificar expressão específica em semente.

3.1.2.11. Retardo de sintomas de senescência. Genes alvoadequados são, inter alia, cinamoil-CoA:NADPH redutases ou cinamoilálcool desidrogenases. Outros genes alvo são descritos (em WO 95/07993,inter alia).

3.1.2.12. Modificação da lignificação e/ou do conteúdo delignina, principalmente em espécies de árvore. Genes alvo adequados sãodescritos em WO 93/05159, WO 93/05160, inter alia.

3.1.2.13. Modificação do conteúdo de fubras em gênerosalimentícios, preferivelmente em sementes, pela redução da expressão deácido cofeico O-metiltransferase ou de cinamoil álcool desidrogenase.

3.1.2.14. Modificação da qualidade da fibra em algodoeiro.Genes alvo adequados são descritos em US 5.597.718, inter alia.

3.1.2.15. Redução da suscetibilidade à contusão, por exemplo,de batateiras pela redução por exemplo de polifenil oxidase (WO 94/03607) esemelhante.

3.1.2.16. Intensificação de biossíntese de vitamina E, porexemplo pela redução da expressão de genes da rota catabólica dehomogentisato tal como, por exemplo, homogentisato 1,2-dioxigenase (HGD;EC No.: 1.13.11.5), maleil-acetoacetato isomerase (MAAI; EC No.: 5.2.1.2.)ou fumaril-acetoacetato hidrolase (FAAH; EC No.: 3.7.1.2).

3.1.2.17. Redução do conteúdo de nicotina por exemplo emtabaco pela expressão reduzida de, por exemplo, N-metil-putrescina oxidase eputrescina N-metiltransferase.

3.1.2.18. Redução do conteúdo de cafeína em grão de café(e.g., Coffea arabica) pela redução da expressão genética de genes dabiossíntese de cafeína tal como 7-metilxantina 3-metiltransferase.

3.1.2.19. Redução do conteúdo de teofilina em chá (Camelliasinensis) pela redução da expressão genética de genes da biossíntese deteofilina tal como, por exemplo, 1-metilxantina 3-metiltransferase.

3.1.2.20. Aumento do conteúdo de metionina pela redução dabiossíntese de treonina, por exemplo pela redução da expressão de treoninasintase (Zeh M et al.{2001) Plant Physiol 127(3):792-802).

Além disso o método e os compostos da invenção podem serusados para obter resistência ao despedaçamento (WO 97/13865), para obterpadrões de cor de flor modificados (EP 522 880, US 5.231.020), para reduzira presença de metabólitos (secundários) indesejados em organismos, taiscomo glicosinolatos (W097/16559) ou conteúdo de clorofila (EP 779 364)em plantas, para modificar o perfil de metabólitos sintetizados em uma célulaeucariótica ou em organismos eucarióticos por engenharia metabólica e.g. porredução da expressão de genes particulares envolvidos em metabolismo decarboidrato (WO 92/11375, WO 92/11376, US 5,365,016, WO 95/07355) oubiossíntese de lipídeo (WO 94/18337, US 5,530,192) etc. Outros exemplos degenes vantajosos são mencionados por exemplo em Dunwell JM, "Transgenicapproaches to crop improvement", J Exp Bot. 2000;51 Spec No; páginas 487-96.

Cada uma das aplicações acima mencionadas pode ser usadacomo tal em si mesma. Naturalmente, também é possível usarsimultaneamente mais do que uma das abordagens acima mencionadas. Se,neste contexto, todas as abordagens forem usadas, a expressão de pelo menosdois genes diferentes como definidos acima será reduzida. Neste contexto,estes genes alvo podem se originar de um único grupo de genes que épreferido para um uso, se não são designados para grupos de uso diferentes.

3.1.3 Tecnologia de expressão & transformação de planta

Um RNA quimérico da invenção pode ser expressado dentrode uma célula de planta usando tecnologia de DNA recombinanteconvencional. Geralmente, esta envolve inserção de seqüência denucleotídeos codificadora de RNA quimérico da invenção em um construto deexpressão ou vetor de expressão usando procedimentos de clonagem padrãoconhecidos na arte.

3.1.3.1. Requerimentos para construção de construtos deexpressão em planta

O construto de expressão ou construto de expressão dainvenção compreende uma ou mais seqüências de controle genético (ouseqüências regulatórias) operavelmente ligadas em uma seqüência de ácidonucleico codificadora de RNA quimérico da invenção. Estas seqüências decontrole genético regulam a expressão do RNA quimérico em célulashospedeiras. Seqüências de controle genético são descritas, por exemplo, em"Goeddel; Gene Expressão Technology: Methods in Enzymology 185,Academic Press, San Diego, CA (1990)" ou "Gruber e Crosby, em: Methodsin Plant Molecular Biology and Biotechnolgy, CRC Press, Boca Raton,Florida, eds.: Glick e Thompson, Chapter 7, 89-108" e nas referências lácitadas. Seqüências intencionadas para expressão em plantas sãooperavelmente ligadas em um promotor adequado funcional em plantas. Taisconstrutos de expressão opcionalmente compreendem outras seqüênciasrequeridas ou selecionadas para a expressão do transgene. Tais seqüênciasincluem, mas não são restritas a, terminadores de transcrição, seqüênciasestranhas para intensificação de expressão. Estes construtos de expressão sãofacilmente transferidos para os vetores de transformação de planta descritosinfra.

3.1.3.1.1. Promotores

A seqüência de ácido nucleico codificadora do RNAquimérico da invenção está preferivelmente operavelmente ligada em umpromotor específico para planta. O termo "promotor específico para planta"significa principalmente qualquer promotor que é capaz de governar aexpressão de genes, em particular de genes ou seqüências de ácido nucleicoestranhos, em plantas ou partes de planta, células de planta, tecidos de planta,culturas de planta. Neste contexto, a especificidade de expressão de citadopromotor específico para planta pode ser por exemplo constitutiva, específicapara tecido, induzível ou específica para desenvolvimento. Os seguintes sãopreferidos:

3.1.3.1.1.1 Promotores constitutivos

Onde a expressão de um gene em todos os tecidos de umaplanta transgênica ou de outro organismo for desejada, pode-se usar umpromotor "constitutivo, que é geralmente ativo sob a maioria das condiçõesambientais e estados de desenvolvimento ou de diferenciação celular.Promotores úteis para plantas também incluem aqueles obtidos de plasmídeosTi ou Ri, de células de planta, vírus de planta ou outros organismos cujospromotores verificados são funcionais em plantas. Promotores bacterianosque funcionam em plantas, e assim são adequados para uso nos métodos dainvenção incluem o promotor de octopina sintetase, o promotor de nopalinasintase, o promotor de manopina sintetase. O promotor controlador daexpressão do RNA quimérico da invenção (e/ou marcador selecionável) podeser constitutivo. Promotores constitutivos adequados para uso em plantasincluem, por exemplo, a região de iniciação de transcrição do vírus domosaico da couve-flor (CaMV) 35S (Franck et al. (1980) Cell 21:285-294;Odell et al (1985) Nature 313:810-812; Shewmaker et al. (1985) Virology140:281-288; Gardner et al (1986) Plant Mol Biol 6:221-228), a região deiniciação de transcrição de 19S (US 5.352.605 e WO 84/02913), e promotoresde região VI, o promotor- l'ou -2' derivado de T-DNA de Agrobacteriumtumefaciens, e outros promotores activos em células de planta que sãoconhecidos por aquelas pessoas experientes na arte. Outros promotoresadequados incluem o promotor de transcrito de comprimento total do vírus domosaico de Figwort, promotores de actina (e.g., o promotor de actina dearroz; McElroy et al (1990) Plant Cell 2: 163-171), promotores de histona,promotores de tubulina, ou o promotor de manopina sintase (MAS). Outrospromorotes constitutivos de planta incluem vários promotores de ubiquitinaou de poli-ubiquitina (Sun e Callis (1997) Planta J 11(5): 1017-1027,Cristensen et al. (1992) Plant Mol Biol 18:675-689; Christensen et cá. (1989)Planta Mol. Biol. 12: 619-632; Bruce et al. (1989) Proc Natl Acad Sci USA86:9692-9696; Holtorf et al (1995) Plant Mol Biol 29:637-649), ospromorores mas, Mac ou DoubleMac (US 5.106.739; Comai et al. (1990)Plant Mol Biol 15:373-381), o promotor de ubiquitina (Holtorf et al. (1995)Plant Mol Biol 29:637-649), o promotor de subunidade pequena (SSU) deRubiseo (US 4.962.028), o promotor de legumina B (GenBank Acc. No.X03677), o promotor de nopalina sintase (NOS) de Agrobacterium, opromotor de TR dual, o promotor de octopina sintase (OCS) deAgrobacterium, o promotor Smas, o promotor de cinamil álcooldesidrogenase (US 5.683.439), os promotores das subunidades de ATPasevacuolar, o promotor pEMU (Last et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 81, 581-588); o promotor MAS (Velten et al. (1984) EMBO J. 3(12): 2723-2730), opromotor de histona H3 de milho (Lepetit et al (1992) Mol. Gen. Genet. 231:276-285; Atanassova et al. (1992) Planta J 2(3): 291-300), o promotor de p-conglicina, o promotor de faseolina, o promotor ADH, os promotores dechoque térmico, o promotor de nitrilase de Arabidopsis thaliana (WO03/008596; GenBank Acc. No.: U38846, nucleotídeos 3,862 a 5,325 se não5342), promotor de uma proteína rica em prolina de trigo (WO 91/13991), opromotor do gene ptxA de Pisum sativum, e outras regiões de iniciação detranscrição de vários genes de planta conhecidos por aquelas pessoasexperientes na arte.

Contudo, tem sido observado que por causa da eficiência altado RNA quimérico da invenção, o método da presente invenção não se baseiana presença de regiões de promotor forte para dirigir a produçãotranscricional do RNA quimérico. Em outras palavras, uma variedade inteirade promotores, particularmente de promotores expressáveis em planta, estádisponível para dirigir a transcrição.

3.1.3.1.1.2 Promotores específicos para tecido

Alternativamente podem ser empregados promotores queregulam a expressão em apenas um ou alguns tecidos ou órgãos, tais comofolhas, raízes, frutos, anteras, ovários, pólen, meristema, caules ou flores, ousuas partes. Por exemplo, o promotor ES específico para tecido de tomateiro éparticularmente útil para dirigir expressão de gene de modo que um produtode gene desejado seja localizado em frutos (veja, e.g., Lincoln et al. (1988)Proc Natl Acad Sci USA 84:2793-2797; Deikman et al. (1988) EMBO J7:3315-3320; Deikman et al. (1992) Plant Physiol 100:2013-2017).Promotores adequados específicos para semente incluem aqueles derivadosdos seguintes genes: MACl de milho (Sheridan et al. (1996) Genetics142:1009-1020), Cat3 de milho (GenBank No. L05934), o gene codificadorde oleosina de 18kD de milho (GenBank No. J05212) viviparous-1 deArabidopsis (Genbank Acc.-No. U93215), o gene codificador de oleosina deArabidopsis (Genbank Acc.-No. Zl7657), Atmycl de Arabidopsis (Urao et al.(1996) Plant Mol Biol 32:571-576), a família de genes de proteína dearmazenagem em semente 2S de Arabidopsis (Conceicao et al. (1994) Planta5:493-505) o gene codificador de oleosina 20kD de Brassica napus (GenBankNo. M63985), napina de Brassica napus (GenBank No. J02798, Joseffson etal. (1987) J Biol Chem 262:12196-12201), a família de genes de napina (e.g.,de Brassica napus-, Sjodahl et al. (1995) Planta 197:264-271), US 5,608,152;Stalberg et al. (1996) Planta 199:515-519), o gene codificador da proteína dearmazenagem 2S de Brassica napus (Dasgupta et al. (1993) Gene 133: 301-302), os genes codificadores de oleosina A (Genbank Acc.-No. U09118) eoleosina B (Genbank No. U09119) de feijão-soja, o gene codificador deproteína de peso molecular baixo rica em enxofre do feijão-soja (Choi et al.(1995) Mol Gen Genet 246:266-268), o gene de faseolina (US 5.504.200,Bustos et al. (1989) Plant Cell l(9):839-53; Murai et al. (1983) Science 23:476-482; Sengupta-Gopalan et al. (1985) Proc. Nat1I Acad. Sei. USA 82:3320-3324 (1985)), o gene de albumina 2S, o gene de legumina (Shirsat et al.(1989) Mol Gen Genet 215(2):326-331), o gene de USP (proteínadesconhecida de semente), o gene de proteína ligante de sacarose(WO 00/26388), o gene de legumina B4 (LeB4; Fiedler et al. (1995)Biotechnology (NY) 13(10):1090-1093), Baumlein et al. (1992) Planta J2(2):233-239; Báumlein et al. (1991a) Mol Gen Genet 225(3):459-467;Baumlein et al. (1991b) Mol Gen Genet 225:121-128), o gene de oleosina deArabidopsis (WO 98/45461), o gene Bce4 de Brassica (WO 91/13980), genescodificadores de "glutenina de peso molecular alto" (HMWG), gliadina,enzima ramificadora, ADP-glicose pirofosfatase (AGPase) ou amido sintase.Além disso promotores preferidos são aqueles que permitem expressãoespecífica em semente em monocotiledôneas tais como milho, cevada, trigo,centeio, arroz e semelhante. Promotores que podem ser vantajosamenteempregados são o promotor do gene lpt2 ou Iptl (WO 95/15389, WO95/23230) ou os promotores descritos em WO 99/16890 (promotores do genede hordeína, do gene de glutelina, do gene de orizina, do gene de prolamina,do gene de gliadina, do gene de zeína, do gene de casirina ou do gene desecalina). São adicionalmente preferidos um promotor induzido por luz eespecífico para folha tal como aquele de cab ou Rubisco (Timko et al. (1985)Nature 318: 579-582; Simpson et al. (1985) EMBO J 4:2723-2729); umpromotor específico para antera tal como aquele de LAT52 (Twell et al.(1989) Mol Gen Genet 217:240-245); um promotor específico para pólen talcomo aquele de Zml3 (Guerrero et al. (1993) Mol Gen Genet 224:161 -168); eum promotor preferido para microesporo tal como aquele de apg (Twell et al.(1983) Sex. Planta Reprod. 6:217-224). Outros promotores adequados são,por exemplo, promotores específicos para tubérculos, raízes de armazenagemou raízes tais como, por exemplo, o promotor de patatina de classe Ir (B33), opromotor de inibidor de catepsina D de batateira, o promotor de amido sintase(GBSSl) ou o promotor de esporamina, e promotores específicos de fruto taiscomo, por exemplo, o promotor específico de fruto do tomateiro (EP-A 409625). Promotores que são adicionalmente adequados são aqueles quegarantem expressão específica em folha. Promotores que podem sermencionado são promotor de FBPase citosólica de batateira (WO 98/18940),o promotor de SSU (subunidade pequena) de Rubisco (ribulose-l,5-bisfosfatocarboxilase) e o promotor ST-LSI de batateira (Stockhaus et al. (1989)EMBO J 8(9):2445-2451). Outros promotores preferidos são aqueles quegovernam a expressão em sementes e em embriões de planta. Outrospromotores adequados são, por exemplo, promotores específicos paramaturação de fruto tal como promotor específico para maturação de fruto dotomateiro (WO 94/21794), promotores específicos para flores tal como opromotor de fitoeno sintase promotor (WO 92/16635) ou o promotor do genePl-rr (WO 98/22593) ou outro promotor específico de nódulo tal comodescrito em EP-A 249676 podem ser usados vantajosamente. O promotortambém pode ser um promotor específico para seiva, tal como o promotorisolado de um gene TrpA de planta como descrito em WO 93/07278.

3.1.3.1.1.3 Promotores quimicamente induzíveis

Um construto de expressão também pode conter um promotorquimicamente induzível (artigo de revisão: Gatz et al. (1997) Annu Rev PlantPhysiol Plant Mol Biol 48:89-108), por meio do qual a expressão daseqüência de ácido nucleico codificadora do RNA quimérico da invenção naplanta pode ser controlada em um instante de tempo particular. Taispromotores tais como, por exemplo, um promotor induzível por ácidosalicílico (WO 95/19443), um promotor induzível por benzenossulfonamida(EP 0 388 186), um promotor induzível por tetraciclina (Gatz et al. (1991)Mol Gen Genetics 227:229-237), um promotor induzível por ácido abscísicoEP O 335 528) ou um promotor induzível por etanol-ciclo-hexanona (WO93/21334) podem ser igualmente usados. Também é adequado o promotor dogene de isoforma II de glutationa-S transferase (GST-II-27), que pode serativado por agentes protetores exogenamente aplicados tais como, porexemplo, N,N-dialil-2,2-dicloro-acetamida (WO 93/01294) e que é operávelem um grande número de tecidos de ambas monocotiledôneas edicotiledôneas. Outros promotores induzíveis exemplares que podem serutilizados na presente invenção incluem aquele do sistema ACEl queresponde ao cobre (Mett et al. PNAS 90: 4567-4571 (1993)); ou o promotorIn2 de milho que responde aos agentes protetores contra herbicidabenzenossulfonamida (Hershey et al. (1991) Mol Gen Genetics 227:229-237;Gatz et al. (1994) Mol Gen Genetics 243:32-38). Um promotor que respondea um agente indutor ao qual as plantas não normalmente respondem pode serutilizado. Um promotor induzivel exemplar é o promotor induzível de umgene de hormônio esteróide, cuja atividade transcricional é induzida por umhormônio glicocorticosteróide (Schena et al. (1991) Proc Nat'l Acad Sci USA88:10421). Outros promotores preferidos são promotores induzidos porestresse biótico ou abiótico, tais como, por exemplo, o promotor induzível porpatógeno do gene PRPl (Ward et al. (1993) Plant Mol Biol 22:361-366), opromotor hsp80 induzível por calor do tomateiro (US 5.187.267), o promotorde alfa-amilase induzível por frio da batateira (WO 96/12814) ou o promotorponll induzido por ferimento (EP-Al 0 375 091).

3.1.3.1.1.4 Promotores induzíveis por patógeno ou porestresse

Pode-se usar um promotor que dirige o controle ambiental daexpressão. Exemplos de condiç~eos ambientais que podem afetar atranscrição por promotores induzíveis incluem fatores de estresse biótico ouabiótico ou outras condições ambientais, por exemplo, ataque de patógeno,condições anaeróbicas, etileno ou a presença de luz.

Promotores induzíveis por estresse biótico ou abiótico incluemmas não são limitados ao promotor induzível por patógeno do gene PRPl(Ward et ai. (1993) Plant Mol Biol 22:361-366), o promotor induzível porcalor hsp70 ou hsp80 do tomateiro (US 5,187,267), o promotor de alfa-amilase induzível por frio da batateira (WO 96/12814), o promotor PPDKinduzível por luz ou o promotor pinll induzível por ferimento (EP375091).Promotores induzíveis por patógeno compreendem aqueles dos genes que sãoinduzidos como o resultado do ataque por patógenos tais como, por exemplo,genes de proteínas PR, proteínas S AR, b-l,3-glicanase, quitinase esemelhante (por exemplo Redolfi et al. (1983) Neth J Planta Pathol 89:245-254; Uknes, et al. (1992) The Plant Cell 4:645-656; Van Loon (1985) PlantaMol Viral 4:111-116; Marineau et al. (1987) Plant Mol Biol 9:335-342;Matton et al. (1987) Molecular Planta-Microbe Interactions 2:325-342;Somssich et al. (1986) Proc Natl Acad Sci USA 83:2427-2430; Somssich etal. (1988) Mol Gen Genetics 2:93-98; Chen et al. (1996) Planta J 10:955-966;Zhang e Sing (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91:2507-2511; Warner, et al.(1993) Planta J 3:191-201; Siebertz et al. (1989) Plant Cell 1:961-968(1989)).Também são compreendidos os promotores induzíveis por ferimento taiscomo aquele do gene pinll (Ryan (1990) Ann Rev Phytopath 28:425-449;Duan et al. (1996) Nat Biotech 14:494-498), dos genes wunl e wun2 (US5,428,148), dos genes winl e win2 (Stanford et al. (1989) Mol Gen Genet215:200-208), de sistemina (McGurl et al (1992) Science 225:1570-1573), dogene WIPl (Rohmeier et al. (1993) Plant Mol Biol 22:783-792; Eckelkamp etal. (1993) FEBS Letters 323:73-76), do gene MPI (Corderok et al. (1994) ThePlanta J 6(2):141-150) e semelhante.

3.1.3.1.1.5 Promotores dependentes de desenvolvimento

Outros promotores adequados são, por exemplo, promotoresespecíficos para maturação de frutos, tais como, por exemplo, promotorespecífico para maturação de frutos do tomateiro (WO 94/21794, EP409 625). Promotores dependentes de desenvolvimento incluem parcialmenteos promotores específicos para tecido descritos acima porque tecidosindividuais são, naturalmente, formados como uma função dodesenvolvimento. Um promotor regulado por desenvolvimento é, inter alia,descrito (Baerson e Lamppa (1993) Plant Mol Biol 22(2):255-67).

3.1.3.1.1.6 Outros promotores e elementos de promotoradequados

Promotores também podem incluir outros promotores,elementos de promotor ou promotores mínimos capazes de modificar ascaracterísticas governantes de expressão. Assim, por exemplo, a expressãoespecífica em tecido pode ocorrer em adição como uma função de certosfatores de estresse, devido às seqüências de controle genético. Tais elementossão, por exemplo, descritos para estresse aquoso, ácido abscísico (Lam e Chua(1991) J Biol Chem 266(26): 17131 -17135) e estresse de calor (Schoffl et al.(1989) Molecular & General Genetics 217(2-3):246-53).

3.1.3.1.2 Outros elementos de controle genético

Seqüências de controle genético são adicionalmente paraserem entendidas como aqueles que permitem a remoção das seqüências deinseridas do genoma. Métodos baseados no sistema cre/lox (Dale e Ow (1991)Proc Nat'l Acad Sci USA 88:10558-10562; Sauer (1998) Methods 14(4):381-92; Odell et al. (1990) Mol Gen Genet 223:369-378), FLP/FRT (Lysnik et al.(1993) NAR 21:969-975), ou no sistemaAc/Ds (Lawson et al. (1994) MolGen Genet 245:608-615; Wader et al. (1987) em TOMATO TECHNOLOGY189-198 (Alan R. Liss, Inc.); US 5.225.341; Baker et al. (1987) EMBO J 6:1547-1554) permitem uma remoção - se induzível e/ou específica para tecidoapropriada - de uma seqüência de DNA específica do genoma do organismohospedeiro. Seqüências de controle podem neste contexto significar asseqüências flanqueadoras específicas (e.g., seqüências lox), que mais tardepermitem remoção (e.g., por meio da cre recombinase).

3.1.3.1.2.1 Terminadores transcricionaisVários terminadores transcricionais estão disponíveis para usoem construtos de expressão. Estes são responsáveis pela terminação datranscrição além do transgene e sua correta poliadenilação. Terminadores detranscrição apropriados são aqueles que são conhecidos para funcionarem emplantas e incluem o terminador CaMV 35S, o terminador tml, o terminadorOCS (octopina sintase) e o terminador NOS (nopalina sintase) e o terminadorpea rbcS E9. Estes podem ser usados tanto em monocotiledôneas quanto emdicotiledôneas.

3.1.3.1.2.2 Seqüências para a intensificação ou a regulaçãode expressão

Seqüências de controle genético adicionalmente tambémcompreendem as regiões não traduzidas 5', íntrons ou regiões 3' nãocodificadoras dos genes, tais como, por exemplo, o íntron de actina-1, ou osíntros 1, 2 e 6 de Adhl-S (referência geral: "The Maize Handbook", Chapter116, Freeling and Walbot, Eds., Springer, New York (1994)). Tem sidodemonstrado que podem desempenhar um papel significativo na regulação deexpressão de gene e tem sido mostrado que intensificam a expressão,particularmente em células de monocotiledôneas. It Assim, tem sidodemonstrado que as seqüências não traduzidas 5' podem intensificar aexpressão transiente de genes heterólogos. Um exemplo que pode sermencionado de tais intensificadores de tradução é a seqüência líder 5' dovírus do mosaico do tabaco (Gallie et al. (1987) Nucl Acids Res 15:8693-8711) e semelhante. Podem adicionalmente promover especificidade paratecido (Rouster J et al. (1998) Planta J 15:435-440).

3.1.3.2. Construção de vetores de transformação de planta

O construto de expressão para a expressão da molécula deRNA quimérica da invenção é preferivelmente compreendido de um vetor deexpressão. Numerosos vetores de transformação para transformação de plantasão conhecidos pela pessoa experiente nas artes de transformação de planta. Aseleção de vetor dependerá da técnica de transformação preferida e da espéciealvo para transformação.

3.1.3.2.1 Elementos de vetor

Construtos de expressão e os vetores derivados dos mesmospodem compreender outros elementos funcionais. O termo elementofuncional é para ser entendido no sentido amplo e significa todos aqueleselementos, que possuem um efeito sobre a geração, multiplicação ou funçãodos vetores, construtos de expressão, ou organismos transgênicos de acordocom a invenção. O seguinte pode ser mencionado por meio de exemplo, masnão por limitação:

3.1.3.2.1.1. Genes marcadores selecionáveis

Genes marcadores selecionáveis são úteis para selecionar eseparar células bem sucedidamente transformadas. Preferivelmente, dentro dométodo da invenção um marcador pode ser empregado para seleção em umhospedeiro procariótico, enquanto que outro marcador pode ser empregadopara seleção em um hospedeiro eucariótico, particularmente a espécie deplanta hospedeira. O marcador pode conferir resistência contra um biocida,tais como antibióticos, toxinas, metais pesados, ou semelhante, ou podefuncionar por complementação, conferindo prototrofia a um hospedeiroauxotrófico. Genes marcadores selecionáveis preferidos para plantas podemincluir mas não são limitados aos seguintes:

3.1.3.2.1.1.1. Marcadores de seleção negativa

Marcadores de seleção negativa conferem uma resistência aum composto biológico tal como um inibidor metabólico (e.g., 2-desóxiglicose-6-fosfato, WO 98/45456), antibióticos (e.g., canamicina, G 418,bleomicina ou higromicina) ou herbicidas (e.g., fosfinotricina ou glifosato).Marcadores de seleção negativa especialmente preferidos são aqueles queconferem resistência a herbicidas. Estes marcadores podem ser usados - alémde sua função como marcador - para conferirem uma feição de resistência aherbicida à planta resultante. Exemplos, que podem ser mencionados, são:

Fosfinotricina acetiltransferases (PAT; também chamada resistênciaa Bialophos; bar; de Block et al. (1987) EMBO J 6:2513-2518; EPO 333 033; US 4,975,374)

Gene de 5-enolpiruvilshiquimato-3-fosfato sintase (EPSPS; US5,633,435) ou de glifosato óxido-redutase (US 5,463,175)conferindo resistência à Glifosato (N-fosfonometil glicina) (Shah etal. (1986) Science 233: 478)

Enzimas degradadoras de glifosate (Glifosate óxido-redutase; gox),Desalogenases inativadoras de dalapon (deh)Acetolactato sintases inativadoras de sulfoniluréia - e imidazolinona(por exemplo variantes de ALS mutadas com, por exemplo, amutação S4 e/ou Hra

Nitrilases degradadoras de bromoxinil (bxn)Genes de resistência à canamicina- ou G418 (NPTII; NPTI)codificadores de e.g., neomicina fosfotransferases (Fraley et ai.(1983) Proc Natl Acad Sci USA 80:4803), que expressa umaenzima conferidora de resistência ao antibiótico canamicina e osantibióticos relacionados neomicina, paromomycina, gentamicina, eG418,

2-Desóxiglicose-6-fosfato fosfatase (Produto de gene-DOGRl; WO98/45456; EP O 807 836) conferidora de resistência contra 2-desóxiglicose (Randez-Gil et al. (1995) Yeast 11:1233-1240)Higromicina fosfotransferase (HPT), que medeia resistência àhigromicina (Vanden Elzen et al. (1985) Plant Mol Biol. 5:299).Disidrofolato redutase (Eichholtz et al. (1987) Somatic Cell andMolecular Genetics 13, 67-76)

Genes marcadores de seleção negativa adicionais de origembacteriana que conferem resistência aos antibióticos incluem o gene aadA,que confere resistência ao antibiótico espectinomicina, gentamicina acetiltransferase, estreptomicina fosfotransferase (SPT), aminoglicosídeo-3-adeniltransferase e o determinante de resistência à bleomicina (Svab et al. (1990)Planta Mol. Biol. 14:197; Jones et «/.(1987) Mol. Gen. Genet. 210:86; Hille etal. (1986) Planta Mol. Biol. 7:171 (1986); Hayford et al. (1988) Plant Physiol.86:1216).

São especialmente preferidos os marcadores de seleçãonegativa que conferem resistência contra os efeitos tóxicos impostos pelos D-aminoácidos como e.g., D-alanina e D-serina (WO 03/060133; Erikson et al.Nat Biotechnol. 22(4):455-8 (2004)). São especialmente preferidos comomarcador de seleção negativa neste contexto o gene daol (EC: 1.4. 3.3 :GenBank Acc.-No.: U60066) da levedura Rhodotorula gracilis(Rhodosporidium toruloides) e o gene gene dsdA (D-serina desidratase (D-serina desaminase) de E. coli [EC: 4.3. 1.18; GenBank Acc.-No.: JO1603).Dependendo do D-aminoácido empregado os marcadores de D-aminoácidooxidase podem ser empregados como marcador de função dual oferecendoseleção negativa (e.g., quando combinado com por exemplo D-alanina ou D-serina) ou contra-seleção (e.g., quando combinado com D-Ieucina ou D-isoleucina).

3.1.3.2.1.1.2. Marcador de seleção positiva

Marcadores de seleção positiva são conferidores de umavantagem de crescimento a uma planta transformada em comparação comuma não transformada. Genes como isopenteniltransferase de Agrobacteriumtumefaciens (cepa:P022; Genbank Acc.-No.: AB025109) podem - como umaenzima chave da biossíntese de citoquininas - facilitar a regeneração deplantas transformadas (e.g., pela seleção sobre meio livre de citoquinina).Métodos de seleção correspondentes são descritos (Ebinuma et al. (2000a)Proc Natl Acad Sci USA 94:2117-2121; Ebinuma et al. (2000b) "Selection ofMarker-free transgenic plants using the oncogenes (ipt, rol A, B, C) ofAgrobacterium as selectable markers", em Molecular Biology of WoodyPlants. Kluwer Academic Publishers). Marcadores de seleção positiva, queconferem uma vantagem de crescimento a uma planta transformada emcomparação com uma não transformada, são descritos e.g., em EP-A O 601092. Marcadores de seleção de estimulação de crescimento podem incluir(mas não devem ser limitados a) P-Glicuronidase (em combinação com e.g.,citoquinina glicuronídeo), manose-6-fosfato isomerase (em combinação commanose), UDP-galactose-4-epimerase (em combinação com e.g., galactose),nos quais manose-6-fosfato isomerase em combinação com manose éespecialmente preferida.

3.1.3.2.1.1.3. Marcador de contra-seleção

Marcadores de contra-seleção são especialmente adequadospara selecionar organismos com seqüências deletadas definidascompreendendo os citados marcadores (Koprek et al. (1999) Planta J 19(6):719-726). Exemplos de marcador de contra-seleção compreendem timidinacinases (TK), citosina desaminases (Gleave et al. (1999) Plant Mol Biol.40(2):223-35; Perera et al. (1993) Planta Mol. Biol 23(4): 793-799; Stougaard(1993) Planta J 3:755-761), proteínas de citocromo P450 (Koprek et al.(1999) Planta J 19(6): 719-726), haloalcano desalogenases (Naested (1999)Planta J 18:571-576), produtos de gene iaaH (Sundaresan et al. (1995) GeneDevelop 9: 1797-1810), citosina desaminase codA (Schlaman e Hooykaas(1997) Planta J 11:1377-1385), ou produtos de gene tms2 (Fedoroff e Smith(1993) Planta J 3:273- 289).

3.1.3.2.1.2. Genes repórter

Genes repórter codificam proteínas prontamente quantificáveise, via sua cor ou atividade enzimática, tornam possível uma avaliação daeficácia de transformação, o sítio de expressão ou o tempo de expressão. Sãomuito especialmente preferidos neste contexto os genes codificadores deproteínas repórter (Schenborn e Groskreutz (1999) Mol Biotechnol 13(1):29-44) tais como proteína fluorescente verde (GFP) (Haseloff et al. (1997) ProcNatl Acad Sci USA 94(6):2122-2127; Sheen et al. (1995) Planta J 8(5):777-784; Reichel et al.(1996) Proe Natl Acad Sei USA 93(12):5888-5893; Chui etal. (1996) Curr Biol 6:325-330; Leffel et al. (1997) Biotechniques. 23(5):912-8; Tian et al. (1997) Plant Cell Rep 16:267-271; WO 97/41228), cloranfenicoltransferase, uma lueiferase (Millar et al. (1992) Plant Mol Biol Rep 10:324-414; Ow et al. (1986) Science 234:856-859), o gene de aequorina (Prasher etal. (1985) Biochem Biophys Res Commun 126(3): 1259-1268), P-galactosidase, gene de locus R (codificador de uma proteína que regula aprodução de pigmentos de antocianina (coloração vermelha) em tecido deplanta e assim torna possível a análise direta da atividade de promotor semadição de outras substâncias auxiliares ou substratos cromogênicos(Dellaporta et al. (1988) em: "Chromosome Structure and Function: Impact ofNew Concepts", 18th Stadler Genetics Symposium, 11:263-282; Ludwig et al.(1990) Science 247:449), com p-glicuronidase (GUS) sendo muitoespecialmente preferida (Jefferson (1987b) Planta Mol. Bio. Rep., 5:387-405;Jefferson et al. (1987) EMBO J 6:3901-3907). Expressão de p-glicuronidase(GUS) é detectada por uma cor azul durante incubação do tecido com ácido 5-bromo-4-cloro-3-indolil-P-D-glicurônico, expressão de lueiferase (LUX)bacteriana é selecionada por emissão de luz; expressão de lueiferase devagalume (LUC) é detectada por emissão de luz após incubação comluciferina; e expressão de galactosidase é detectada por uma cor azul brilhanteapós a coloração do tecido com 5-bromo-4-cloro-3-indolil-P-D-galactopiranosídeo.Genes repórter também podem ser usados comomarcadores classificáveis como alternativas aos marcadores de resistência aoantibiótico. Tais marcadores são usados para detectar a presença ou paramedir o nível de expressão do gene transferido. O uso de marcadoresclassificáveis em plantas para identificar ou etiquetar células geneticamentemodificadas funciona bem apenas quando eficiência de modificação da célulafor alta.

3.1.3.2.1.3. Origens de replicação

Origens de replicação que garantem amplificação dos vetoresou construtos de expressão de acordo com a invenção, em por exemplo, E.coli. Exemplos que podem ser mencionados são ORI (origem de replicação deDNA), o pBR322 ori ou o Pl5A ori (Maniatis T, Fritsch EF e Sambrook J(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold SpringHarbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY)). Exemplos adicionais parasistemas de replicação funcionais em E. coli, são ColE 1, pSClOl,pACYC 184, ou semelhante. Em adição ou no lugar do sistema de replicaçãode E. coli, um sistema de replicação de ampla variedade de hospedeiros podeser empregado, tais como os sistemas de replicação dos plasmídeos deIncompatibilidade P-1; e.g., pRK290. Estes plasmídeos são particularmenteefetivos com os plasmídeos-Ti armados e desarmados para transferência de T-DNA para a planta hospedeira.

3.1.3.2.1.4. Elementos, que são necessários para transformaçãomediada por Agrobacterium, tais como, por exemplo, a borda direita e/ou -opcionalmente - esquerda do T-DNA ou a região vir.

3.1.3.2.1.5. Sítios de clonagem múltipla (MCS) para permitir efacilitar a inserção de uma ou mais seqüências de ácido nucleico.

3.1.3.2.2 Vetores para transformação de planta

3.1.3.2.2.1 Vetores adequados para transformação deAgrobacterium

Se Agrobacteria forem usadas, o construto de expressão seráintegrado em vetores plasmídeo específicos, quer em um vetor bifuncional,intermediário quer em um vetor binário. Se um plasmídeo Ti ou Ri for usadopara a transformação, pelo menos a borda direita, mas na maioria dos caos aborda direita e esquerda, do T-DNA plasmídeo Ti ou Ri estará flanqueando aregião com o construto de expressão a ser introduzido no genoma de planta. Épreferido usar vetores binários para a transformação de Agrobacterium.Vetores binários são vetores capazes de replicação tanto em E.coli quantoemAgrobacterium. Preferivelmente compreendem um gene marcador deseleção e um linker ou polilinker flanqueado pela direita e - opcionalmente -esquerda pela seqüência de borda de T-DNA. Podem ser transformadosdiretamente em Agrobacterium (Holsters et ai. (1978) Mol Gen Genet163:181-187). Um gene marcador de seleção pode ser incluído no vetor quepermite uma seleção de Agrobacteria transformadas (e.g., o gene nptIII). AAgrobacterium, que atua como um organismo hospedeiro neste caso, já devecompreender um plasmídeo desarmado (i.e., não-oncogênico) com a regiãovir. Esta região é requerida para transformação do T-DNA na célula daplanta. O uso de T-DNApara a transformação de células de planta tem sidoestudado e descrito extensivamente (EP 120 516; Hoekema, em: "The BinaryPlanta Vector System", Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam, ChapterV; An et ai. (1985) EMBO J 4:277-287). Vários vetores binários sãoconhecidos e estão disponíveis para transformação usando Agrobacterium,como tal, por exemplo, pBI101.2 ou pBIN19 (Clontech Laboratories, Inc.USA; Bevan et a/.(1984) Nucl Acids Res 12:8711), pBinAR, pPZP200 oupPTV.

3.1.3.2.2.2 Vetores adequados para transformação de Não-Agrobacterium

Transformação sem o uso de Agrobacterium tumefaciens evitao requerimento de seqüências de T-DNA no vetor de transformação escolhidoe conseqüentemente vetores faltantes destas seqüências podem ser utilizadosem adição aos vetores tais como aqueles descritos acima que contêmseqüências de T-DNA. Técnicas de transformação que não se baseiam emAgrobacterium incluem transformação via bombardeio de partículas, captaçãode protoplasto (e.g. PEG e eletroporação) e microinjeção. A escolha de vetordepende em grande parte da seleção preferida da espécie sendo transformada.Vetores típicos adequados para transformação de não- Agrobacteriumincluem pCIB3064, pSOG19, e pSOG35. (Veja, por exemplo, US 5.639.949).

3.1.3.3. Técnicas de transformação

3.1.3.3.1 Técnicas gerais

Uma vez tendo sido estabelecido um construto de expressão ouvetor de expressão da invenção, ele pode ser transformado em uma célula deplanta. São conhecidos variados métodos para introdução de seqüências deácido nucleico (e.g., vetores) no genoma de plantas e para a regeneração dasplantas a partir de tecidos de planta ou de células de planta ("Plant MolecularBiology and Biotechnology" (CRC Press, Boca Raton, Florida), chapter 6/7,pp. 71-119 (1993); White FF (1993) "Vectors for Gene Transfer in HigherPlants"; em: "Transgenic Plants", vol. 1, "Engineering and Utilization", Ed.:Kung e Wu R, Academic Press, 15-38; Jenes B et al. (1993) "Techniques forGene Transfer", em: "Transgenic Plants", vol. 1, "Engineering andUtilization," Ed.: Kung e R. Wu, Academic Press, pp. 128-143; Potrykus(1991) Annu Rev Plant Physiol Planta Molec Biol 42:205-225; Halford NG,Shewry PR (2000) Br Med Bull 56(l):62-73).

Métodos de transformação podem incluir métodos detransformação direta e indireta. Métodos diretos adequados incluem captaçãode DNA induzida por poli(etileno-glicol), transformação mediada porlipossomo (US 4.536.475), métodos biolísticos usando a pistola de gene("bombardeio de partículas"; Fromm ME et al. (1990) Bio/Technology.8(9):833-9; Gordon-Kamm et al. (1990) Plant Cell 2:603), eletroporação,incibação de embriões secos em solução compreendendo DNA, emicroinjeção. No caso destes métodos de transformação direta, o plasmídeousado não necessita de quaisquer requerimentos particulares. Plasmídeosúnicos, tais como aqueles da série pUC, pBR322, série M13mp, pACYC184 esemelhante podem ser usados. Se plantas intactas forem regeneradas dascélulas transformadas, um gene marcador selecionável adicional estarápreferivelmente localizado no plasmídeo. As técnicas de transformação diretasão igualmente adequados para plantas dicotiledôneas e monocotiledôneas.

Transformação também pode ser realizada por infecçãobacteriana por meio de Agrobacterium (por exemplo EP O 116 718), infecçãoviral por meio de vetores virais (EP O 067 553; US 4.407.956; WO 95/34668;WO 93/03161) ou por meio de pólen (EP 0 270 356; WO 85/01856; US4.684.611). Técnicas de transformação baseadas em Agrobacterium(especializada para plantas dicotiledôneas) são bem conhecidas na arte. Acepa de Agrobacterium (e.g., Agrobacterium tumefaeiens ou Agrobaeteriumrhizogenes) compreende um plasmídeo (plasmídeo Ti ou Ri) e um elementode T-DNA que é transferido para a planta após infecção com Agrobaeterium.O T-DNA (DNA transferido) é integrado no genoma da célula de planta. O T-DNA pode estar localizado no plasmídeo Ri ou Ti ou estar separadamentecompreendido em um denominado vetor binário. Métodos para atransformação mediada por Agrobaeterium são descritor, por exemplo, emHorsch RB et ai. (1985) Science 225:1229f. A transformação mediada porAgrobaeterium é mais adequada para planta dicotiledôneas mas também temsido adotada para plantas monocotiledôneas. A transformação de plantas porAgrobacteria é descrita por (White FF, "Vectors for Gene Transfer in HigherPlants"; em "Transgenic Plants", Vol. 1, "Engineering and Utilization",editado por S.D. Kung e R. Wu, Academic Press, 1993, pp. 15 - 38; Jenes Bet al.{ 1993) "Techniques for Gene Transfer", em: "Transgenic Plants", Vol. 1,"Engineering and Utilization", editado por S.D. Kung e R. Wu, AcademicPress, pp. 128-143; Potrykus (1991) Annu Rev Plant Physiol Planta MolecBiol 42:205- 225).

Transformação pode resultar em expressão e transformaçãoestáveis ou transientes. Embora uma seqüência de nucleotídeos da presenteinvenção possa ser inserida em qualquer planta ou célula de planta caindodentro destas classes amplas (como especificado acima na seçãoDEFINIÇÃO), é particularmente útil em células de planta de colheita.

Vários tecidos são adequados como material inicial (explante)para o processo de transformação mediada por Agrobacterium incluindo masnão limitados a calo (US 5.591.616; EP-Al 604 662), embriões imaturos (EP-Al 672 752), pólen (US 54.929.300), ápice de broto (US 5.164.310), outransformação inplanta (US 5.994.624). O método e o material aqui descritospodem ser combinados com virtualmente todos os métodos de transformaçãomediada por Agrobacterium conhecidos na arte. Combinações preferidasincluem - mas não são limitadas - aos seguintes materiais iniciais e métodos:

Tabela 1: Métodos de transformação de planta

<table>table see original document page 173</column></row><table><table>table see original document page 174</column></row><table>

3.1.3.3.2. Transformação de plastídeo

Em outra modalidade preferida, uma seqüência denucleotídeos da presente invenção (preferivelmente um construto deexpressão para molécula de RNA quimérica da invenção) é diretamentetransformada no genoma de plastídeo. Expressão de plastídeo, na qual genessão inseridos por recombinação homóloga nas várias milhares de cópias degenoma de plastídeo circular presente em cada célula de planta, se beneficiada vantagem do enorme número de cópias sobre genes expressados no núcleopara permitir níveis altos de expressão. Em uma modalidade preferida, aseqüência de nucleotídeos é inserida em um vetor selecionador de plastídeo etransformada no genoma de plastídeo de uma planta hospedeira desejada.Plantas homoplásmicas para genomas de plastídeo contendo a seqüência denucleotídeos são obtidas, e são preferivelmente capazes de de expressão altada seqüência de nucleotídeos.

Tecnologia de transformação de plastídeo é por exemploextensivamente descrita em Patentes U.S. 5.451.513, 5.545.817, 5.545.818, e5.877.462 em pedido PCT de no. WO 95/16783 e WO 97/32977, e emMcBride et ai. (1994) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91, 7301-7305, todas aquiincorporadas em sua totalidade com referências. A técnica básica paratransformação de plastídeo envolve introdução de regiões de DNA deplastídeo clonado flanqueando um marcador selecionável junto com aseqüência de nucleotídeos em um tecido alvo adequado, e.g., usandotransformação biolística ou de protoplasto (e.g., transformação mediada porPEG ou cloreto de cálcio). As regiões flanqueadoras de 1 a 1,5, chamadasseqüências selecionadoras, facilitam a recombinação homóloga com ogenoma de plastídeo e assim permitem a substituição ou modificação deregiões específicas do plastoma. Inicialmente, mutações pontuais nos genesrpsl2 e 16S rRNA de cloroplasto conferidores de resistência àespectinomicina e/ou estreptomicina são utilizadas como marcadoresselecionáveis para transformação (Svab et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sei.USA 87, 8526-8530; Staub et al. (1992) Plant Cell 4, 39-45). A presença desítios de clonagem entre estes marcadores permitiu a criação de um vetorselecinador de plastídeo para introdução de genes estranhos (Staub et al.(1993) EMBO J. 12, 601-606). Aumentos substanciais em freqüência detransformação são obtidos pela substituição dos genes recessivos deresistência a antibiótico de proteína-r ou rRNA por um marcador selecionáveldominante, o gene aadA bacteriano codificador da enzima destoxificadora deespectinomicina aminogliosídeo-3'-adeniltransferase (Svab et al. (1993) Proc.Natl. Acad. Sc. USA 90, 913-917). Outros marcadores selecionáveis úteispara transformação de plastídeo são conhecidos na arte e estão incluídosdentro do escopo da invenção.

Para usar os métodos de acordo com a invenção, o técnicoexperiente possui ferramentas bem conhecidas disponíveis, tais como vetoresde expressão com promotores que são adequados para plantas, e métodos paraa transformação e a regeneração de plantas.

3.1.3.4. Técnicas de seleção e de regeneração

Para selecionar células que têm sofrido transformação bemsucedida, é preferido introduzir um maredor selecionável que confere, àscélulas que têm sofrido transformação bem sucedida, uma resistência a umbiocida (por exemplo um herbicida), um inibidor de metabolismo tal como 2-desóxiglicose-6-fosfato (WO 98/45456) ou um antibiótico. O marcador deseleção permite que as células transformadas sejam selecionadas de célulasnão transformadas (McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84).Marcadores de seleção adequados são descritos acima.

Plantas transgênicas podem ser regeneradas na maneiraconhecida a partir das células transformadas. As plântulas resultantes podemser plantadas e crescidas na maneira costumeira. Preferivelmente, duas oumais gerações devem ser cultivadas para garantir que a integração genômica éestável e hereditária. Métodos adequados são descritos (Fennell et al. (1992)Plant Cell Rep. 11: 567-570; Stoeger et al (1995) Plant Cell Rep. 14:273-278;Jahne et al. (1994) Theor Appl Genet 89:525-533).

3.2 Métodos e composições farmacêuticas (terapêuticas ouprofiláticas)

A especificidade dos compostos, as composições e os métodosda invenção também podem ser aproveitados por aquelas pessoas experientesna arte para usos profiláticos ou farmacêuticos e são adequados para apreparação de fármacos para o tratamento de doenças de animal e de humanoe para a produção de fármacos.

Assim, a invenção adicionalmente proporciona um métodopara tratar ou prevenir uma doença ou infecção em um animal ou em um serhumano, preferivelmente um mamífero. Ainda outra modalidade da invençãorefere-se a uma preparação farmacêutica compreendendo pelo menos umRNA quimérico da invenção. Preferivelmente, a citada preparaçãocompreende:

i) pelo menos uma proteína que possui um efeito profilático outerapêutico sobre o organismo alvo (preferivelmente um animal ouhumano) ou

ii) pelo menos uma molécula de RNA funcional, que atenua aexpressão de pelo menos um gene alvo relacionado com doença.

Ainda outra modalidade refere-se a um RNA quimérico dainvenção, um construto de expressão ou vetor de expressão para suaexpressão, ou um organismo (preferivelmente um organismo não-humano)compreendendo a citada molécula de RNA quimérica para uso como umfármaco, preferivelmente para o tratamento de uma ou mais doenças deanimal ou de humano. Ainda outra modalidade refere-se ao uso de um RNAquimérico da invenção, um construto de expressão ou vetor de expressão parasua expressão, ou um organismo não-humano compreendendo a citadamolécula de RNA quimérica para a preparação de um fármaco,preferivelmente para o tratamento de uma ou mais doenças de animal ou dehumano.

O RNA quimérico da invenção (ou um vetor ou construto deexpressão para sua expressão) é administrado ao animal ou ser humano (e.g.,o mamífero) em uma quantidade terapêutica ou profilaticamente efetiva (e.g.,uma quantidade suficiente para atenuar a expressão de um gene alvo, cujaexpressão está associada com a doença ou infecção; ou - no caso deexpressão de proteína - uma quantidade adequada para acarretar o efeitoassociado com a proteína terapêutica). No caso de supressão de gene dedoença, a expressão do gene alvo (ou alternativamente a atividade da proteínaalvo expressada pelo mesmo) é inibida em pelo menos cerca de 10%,preferivelmente em pelo menos cerca de 30%, com maior preferência em pelomenos 50% ou mais.

Uma variedade de distúrbios pode ser tratada, incluindoinfecções por organismos patogênicos heterólogos, patógenos querextracelulares quer intracelulares. Adicionalmente, as composições destainvenção são úteis na prevenção de infecção com um patógeno, ou prevençãoda ocorrência de distúrbios causados por reativação de um patógeno latente.Estas composições também são úteis para o tratamento de câncerespatogenicamente induzidos. A composição e os métodos da invenção sãoespecialmente adequados para tratar doenças virais (i.e., HIV, Hepatite C).Isto aplica-se especialmente às abordagens de silenciamento de gene.

Assim, os métodos da presente invenção empregam umconstruto de terapia genética compreendendo uma molécula de ácido nucleicoque codifica um polipeptídeo possuindo uma atividade biológica terapêutica(também referido aqui como "polipeptídeo terapêutico"), incluindo mas nãolimitada às moléculas imunoestimulantes, antígenos / produtos de genesupressor de tumor, antimetabólitos, produtos de gene suicida, e fatores anti-angiogênicos. Veja Mackensen et al. (1997) Cytokine Growth Factor Rev8(2):119-128; Walther & Stein (1999) Mol Biotechnol 13(l):21-28; Kirk &Mule (2000) Hum Gene Ther 11(6):797-806; e ras referências lá citadas.

Além disso outras doenças e distúrbios (não relacionados compatógeno) podem ser tratados. Exemplos de doenças que podem ser tratadaspelas composições de oligonucleotídeo incluem: câncer, retinopatias, doençasautoimunes, doenças inflamatórias (i.e., distúrbios relacionados com ICAM-1,Psoríase, Colite Ulcerativa, doença de Crohn), doenças cardiovasculares (talcomo hipertensão), doenças do sistema nervoso periférico ou central taiscomo mal de Alzheimer, doença de Parkinson ou esclerose múltipla, e doençagenética dominante autossômica tal como coréia de Huntington. (Porexemplo, veja US 6.506.559; US 2002/0.173.478 Al; US 2002/0.086.356 Al;Shuey, et al., "RNAi: gene-silencing in therapeutic intervention." DrugDiscov. Today 2002 Oct 15;7(20): 1040-6; Aoki, et al., "Clin. Exp.Pharmacol. Physiol. 2003 Jan;30(l-2):96-102; Cioca, et al, "RNAinterference is a functional pathway with therapeutic potential in humanmyeloid leukemia cell lines". Câncer Gene Ther. 2003 Feb; 10(2): 125-33). Hánumerosas condições médicas para as quais terapia de silenciamento de geneé relatada como sendo adequada (veja, e.g., US 5.830.653) bem comoinfecção por vírus sincicial respiratório (WO 95/22,553) vírus de influenza(WO 94/23,028), e malignidades (WO 94/08,003). Outros exemplos de usosclínicos de seqüências de anti-senso são revistos, e.g., em Glaser. 1996.Genetic Engineering News 16:1. Alvos exemplares para clivagem poroligonucleotídeos incluem, e.g., proteína cinase Ca, ICAM-1, c-raf cinase,p53, c-myb, e o gene de fusão bcr/abl encontrado em leucemia mielogênica.O método da invenção pode ser adicionalmente usado para reduzir ouprevenir a resposta de rejeição de tecido de transplante (e.g., porsilenciamento de proteínas MHC). Um RNA quimérico que atenua aexpressão de um gene no tecido de transplanta que pode gerar uma respostaimune no recipiente é administrado ao tecido de transplante.

Também, o método de acordo com a invenção torna possível otratamento paralelo de mais do que uma doença, tal como, por exemplo, umadoença cardiovascular e uma doença do sistema nervoso central, o que não égeralmente possível quando abordagens tradicionais são usadas. Taisabordagens são vantajosas são especialmente no caso de doenças múltiplascomo as que ocorrem freqüentemente na idade avançada. Um exemplo quepode ser mencionado é o tratamento paralelo de hipertensão e, por exemplo,mal de Alzheimer ou demência senil.

Os compostos e as composições da invenção podem serutilizados em composições farmacêuticas pela adição de uma quantidadeefetiva de composto ou composição em um veículo ou diluentefarmaceuticamente adequado. Uso dos compostos oligoméricos e dosmétodos da invenção também pode ser profilaticamente útil.

3.2.1 Doenças e distúrbios preferidos para serem tratadospelas composições e pelos métodos da invenção

O método de acordo com a invenção é particularmenteadequado para o tratamento dos distúrbios e das doenças mencionados abaixo.

3.2.1.1 Infecções patogênicas

Infecção com patógenos, tais como, por exemplo, doençasvirais ou bacterianas, em cujo caso o RNA quimérico (ou o derivado dsRNAdo mesmo) atenua a expressão de um gene bacteriano ou viral.Especificamente alguns dos vírus mais desejáveis para tratar com este métodoincluem, sem limitação, vírus de espécies Retrovírus, Herpesvírus,Hepadenovírus, Poxvírus, Parvovírus, Papilomavírus, e Papovavírus,especialmente HIV, HBV, HSV, CMV, HPV, HTLV e EBV. O RNAquimérico usado neste método proporciona à célula (e.g., de um mamífero)uma molécula de RNA pelo menos parcialmente de fita dupla como descritaacima, que é substancialmente idêntica a uma seqüência de polinucleotídeo devírus necessária para replicação e/ou patogênese do vírus em uma célula demamífero infectada. Dentre tais seqüências de polinucleotídeo alvo estão asseqüências codificadoras de proteína para proteínas necessárias para apropagação do vírus, e.g., os genes pol, env, gp41e gag de HIV, os genes Ll eE2 de HPV6, os genes Ll e E2de HPVl 1, os genes E6 e E7de HPV16, osgenes E6 e E7 de HPV18, os antígenos de superfície de HBV, o antígeno denúcleo de HBV, transcriptase reversa de HBV, o gene gD de HSV, o genevpló de HSV, os genes gC, gH, gL e gB de HSV, os genes ICPO, ICP4 eICP6 de HSV, os genes gB, gC e GH de Varicela zóster, e as seqüênciascromossômicas de BCR-abl, e seqüências de polinucleotídeo virais nãocodificadoras que proporcionam funções regulatórias necessárias paratransferência da infecção de célula para célula, e.g., o HIV LTR, e outrasseqüências de promotor viral,tais como promotor HSV vpló, promotor HSV-ICPO, HSV-ICP4, promotores ICP6 e gD, o promotor de antígeno desuperfície de HBV, o promotor pré-genômico de HBV, dentre outros. Acomposição (e.g., um agente dsRNA tal como a molécula de RNA quiméricada invenção) é administrada com um facilitador ou intensificador de captaçãode polinucleotídeo e um veículo farmaceuticamente aceitável opcional. Aquantidade ou dosagem que é administrada ao mamífero é efetiva para reduzirou inibir a função da seqüência viral nas células do mamífero.

O método pode ser usado para tratar animais (e.g., mamíferos)já infectados com um vírus com o objetivo de interromper ou inibir umafunção de gene viral essencial para a replicação e/ou a patogênese do vírus.Em ainda outra modalidade desta invenção, as composições descritas acimapodem ser empregadas em um método para prevenir infecção viral (e.g., emum mamífero). Quando o RNA quimérico da invenção é administrado antesda exposição do mamífero ao vírus, é esperado que a molécula de RNAenxógena permaneça no mamífero e funcione para inibir qualquer seqüênciaviral homóloga que é depois apresentada ao mamífero.Assim, as composiçõesda presente invenção podem ser usadas para inibir ou reduzir a função de umaseqüência de polinucleotídeo viral para uso em vacina. Ainda umamodalidade análoga dos métodos "anti-virais" da invenção inclui um métodopara tratamento ou profilaxia de um câncer viralmente induzido em ummamífero (tais cânceres incluem carcinoma cervical induzido pelo vírus HPVE6/E7, e cânceres induzidos por EBV).

As composições desta invenção também podem serempregadas para o tratamento ou a profilaxia de infecção por um patógenonão-viral, quer intracelular quer extracelular. Como aqui usado, o termo"patógeno intracelular" significa que se refere a um vírus, uma bactéria, umprotozoário ou outro organismo patogênico que, por pelo menos em parte deseu ciclo de vida ou de reprodução, existe dentro de uma célula hospedeira edentro da mesma produz ou causa a produção de proteínas patogênicas.Patógenos intracelular que incluem um estágio no ciclo de vida onde sãopatógenos intracelulares incluem, sem limitação, Listeria, Chlamydia,Leishmania, Brucella, Mycobacteria, Shigella, e também Plasmodia, e.g., oagente causador de malária, P. falciparum. Patógenos extracelulares sãoaqueles que se replicam e/ou propagam fora da célula de mamífero, e.g.,Gonorrhoeae, e Borrellia, dentre outros. De acordo com esta modalidade, talinfecção por um patógeno pode ser tratada ou possivelmente evitada pelaadministração a um indivíduo mamífero, quer já infectado querantecipadamente à exposição ao patógeno, com uma composição comodescrita acima com um segundo agente opcional que facilita a captação depolipeptídeo em uma célula, em um veículo farmaceuticamente aceitável.Neste caso, a molécula de RNA da composição possui uma seqüência depolinucleotídeo que é substancialmente idêntica a uma seqüência depolinucleotídeo alvo do patógeno que é necessária para replicação e/oupatogênese do patógeno em um mamífero infectado ou em uma célula demamífero infectada. Como acima, a quantidade da composição administrada éuma quantidade efetiva para reduzir ou inibir a função da seqüênciapatogênica no mamífero. As dosagens, os tempos, as rotas de administração esemelhante são descritas abaixo.

Assim uma modalidade da invenção relaciona-se a um métodopara reduzir a suscetibilidade das células hospedeiras ou de organismoshospedeiros à infecção pelo patógeno, compreendendo introduzir umRNAquimérico da invenção nas citadas células hospedeiras ou nos citadosorganismos hospedeiros em uma quantidade suficiente para atenuar aexpressão de um ou mais genes necessários para a expressão pelo citadopatógeno. Preferivelmente, o patógeno é um vírus, um fungo ou umnematódeo. Preferivelmente, a célula hospedeira é uma planta ou um animal,preferivelmente um mamífero, com maior preferência uma célula de humano.

Uma pessoa experiente na arte, dada esta descrição, podeprontamente selecionar gêneros e famílias virais, ou patógenos incluindopatógenos de protozoário procarióticos e eucarióticos bem como parasitasmulticelulares, para os quais composições terapêuticas ou profiláticas deacordo com a presente invenção podem ser preparadas. Veja, e.g., as tabelasde tais patógenos em textos de imunologia geral e em US 5.593.972, aquiincorporada como referência.

3.2.1.2 Câncer

Tratamento de câncer (por exemplo tumores sólidos e/ouleucemias) e distúrbios hereditátios. Dentre as condições particularmentesuscetíveis ao tratamento ou à profilaxia de acordo com esta invençãoencontram-se aquelas condições que são caracterizadas pela presença de umaseqüência de polinucleotídeo aberrante, cuja função é necessária para ainiciação ou propagação do distúrbio, mas pode ser inibida sem causar danoou diferentemente indevidamente adversamente prejudicar a saúde doorganismo (e.g. o mamífero). Cânceres de mamífero que são caracterizadospela presença de seqüências de polinucleotídeo anormais e normais (paradetalhes veja, e.g., W094/13793) incluem leucemia mielógena (CML) eleucemia linfoblástica aguda (ALL), onde a seqüência anormal é uma fusãode dois genes normais i.e., bcr-abl. Em tais cânceres ou doenças, tal comoCML, o mamífero afligido também possui uma cópia normal do gene ou daseqüência de polinucleotídeo, e as diferenças entre os genes ou as seqüênciasanormais e normais são diferenças na seqüência de nucleotídeos. Porexemplo, para CML, a seqüência anormal é a fusão bcr-abl, enquanto que aseqüência normal é bcr e abi. Assim, o método acima pode ser empregadocom a seqüência de polinucleotídeo alvo sendo a seqüência que abarca afusão. Um método de tratamento ou profilaxia de um tal câncer em ummamífero compreende administrar ao mamífero uma composição destainvenção na qual o polinucleotídeo alvo é uma seqüência de polinucleotídeode um gene anormal causador de câncer em um mamífero que também possuiuma cópia normal do gene, e na qual as diferenças entre o gene anormal e ogen normal são diferenças na seqüência de polinucleotídeo. O técnicoexperiente na arte está familiarizado com um grande número de genes alvopotenciais para terapia do câncer (por exemplo oncogenes tais como ABL1,BCL1, BCL2, BCL6, CBFA2, CBL, CSF1R, ERBA, ERBB, EBRB2, FGR,FOS, FYN, HRAS, JUN, LCK, LYN, MYB, MYC, NRAS, RET ou SRC;genes supressores de tumor tais como BRCAl ou BRCA2; moléculas deadesão; ciclina cinases e seus inibidores). Uma lista exemplar de genes alvopotenciais, incluindo genes de desenvolvimento, oncogenes, e enzimas, e umalista de cânceres que podem ser tratados de acordo com a presente invençãopodem ser encontradas em WO 99/32619. Um gene alvo candidato derivadode um patógeno poderia, por exemplo, causar imunossupressão do hospedeiroou estar envolvido em replicação do patógeno, transmissão do patógeno, oumanutenção da infecção.

Outra modalidade da invenção proporciona um método para otratamento de câncer (e.g., câncer de mama, câncer de ovário, e câncer depróstata local ou metastásico) compreendendo: administração ao paciente devetor ou construto de expressão (ou de uma sua variante) da invençãocontendo um gene citotóxico.

Angiogênese e resposta imune suprimida desempenham umpapel central na patogênese de doença maligna e da metástase, invasão, ecrescimento de tumor. Assim, preferivelmente o polipeptídeo terapêuticopossui uma capacidade para induzir uma resposta imune e/ou uma respostaanti-angiogênica in vivo. Em uma modalidade, um construto de terapiagenética da presente invenção codifica um gene terapêutico que exibeatividades imunoestimulatória e anti-angiogênica, por exemplo, IL12 (vejaDias et al. (1998) Int J Câncer 75(1): 151-157, e as referências citadas aquiabaixo), interferon-alfa (O1Byrne et al. (2000) Eur J Câncer 36(2): 151-169, eas referências lá citadas), ou uma quimiocina (Nomura & Hasegawa (2000)Anticancer Res 20(6A):4073-4080, e as referências lá citadas). Em outramodalidade, um construto de terapia genética da presente invenção codificaum produto de gene com atividade imunoestimulatória e um produto de genepossuindo atividade anti-angiogênica. Veja, e.g. Narvaiza et al. (2000) JImmunol 164:3112-3122. Em outra modalidade, a invenção compreende umconstruto de terapia genética codificador de um polipeptídeo IL2. IL12 é umamolécula imunoestimulatória que mostra atividade terapêutica em umavariedade de cânceres, incluindo câncer renal, câncer de mama, câncer debexiga, e melanoma maligno. A atividade de anti-tumor de IL2 estárelacionada com sua capacidade para expandir e ativar células NK e células Tque expressam receptores de IL2. Veja, e.g., Margolin (2000) Semin Oncol27(2): 194-203; Gore (1996) Câncer Biother Radiopharm 11 (5):281-283;Deshmukh et al. (2001) J Neurosurgery 94(2):287-292; Larchian et al. (2000)Clin Câncer Res 6(7):2913-2920; Horiguchi et al. (2000) Gene Ther7(10):844-851; e as referências lá citadas. IL2 também tem sido usada comsucesso quando co-adaministrada com vacinas de anti-tumor. Veja Overwijket al. (2000) Câncer J Sci Am 6 Suppl l:S76-80, e as referências lá citadas.

3.2.2 Formulações e administração

O RNA quimérico da invenção pode ser usado e aplicadodiretamente em um animal ou humano em necessidade de terapia ouprofilaxia ou pode ser aplicado indiretamente por meio de um vetor ouconstruto de expressão.

3.2.2.1 Vetores de terapia genética viral

A presente invenção também proporciona vetores ouconstrutos de terapia genética. O vetor particular empregado de acordo comos métodos da presente invenção não é intencionado para ser uma limitaçãodo método para expressão induzida por calor de genes terapêuticos porhipertermia. Assim, qualquer vetor adequado para liberação de construto deterapia genética pode ser usado.

O vetor pode ser um vetor viral ou um vetor não-viral. Vetoresvirais adequados incluem adenovírus, vírus adeno-associados (AAVs),retrovírus, retrovírus pseudotipificados, vírus do herpes, vírus da vacínia,vírus da floresta Semiliki, e baculovírus. Vetores não-virais adequadoscompreendem plasmídeos, emulsões de óleo em água, polietilenoiminas,dendrímeros, micelas, microcápsulas, lipossomos, e lipídeos catiônicos.Veículos poliméricos para construtos de terapia genética podem ser usadoscomo descrito em Goldman et al (1997) Nat Biotechnol 15:462 e PatentesU.S. de Nos. 4.551.482 e 5.714.166. Veículos de peptídeo são descritos emPatente U.S. 5.574.172. Onde apropriado, dois ou mais tipos de vetorespodem ser usados juntos. Por exemplo, um vetor plasmídeo pode ser usadoconjuntamente com lipossomos. Correntemente, uma modalidade preferida dapresente invenção prevê o uso de um adenovírus, um plasmídeo, ou umlipossomo, cada um descrito mais detalhadamente aqui abaixo.

Como desejado, vetores, especialmente vetores virais, podemser selecionados para alcançar integração do ácido nucleico do construto dainvenção, no genoma das células a serem transformadas ou transfectadas.Inclusão de um ligante no complexo possuindo afinidade por um marcadorcelular específico também pode intensificar a liberação dos complexos paraum alvo in vivo. Ligantes incluem anticorpos, marcadores de superfíciecelular, peptídeos virais, e semelhante, que atuam para hospedar oscomplexos na vasculatura de tumor ou nas células endoteliais associadas coma vasculatura do tumor, ou nas próprias células de tumor. Um complexo podecompreender um construto ou um polipeptídeo terapêutico secretadocodificado por um construto. Um ligante de anticorpo pode ser um anticorpoou fragmento de anticorpo específico para um marcador de tumor tal comoHer2/neu (homólogo 2 de oncogene viral de leucemia eritroblástica aviária v-erb-b2), CEA (antígeno carcinomoembriogênico), receptor de ferritina, ou ummarcador associado com vasculatura de tumor (integrinas, fator de tecido, ouisoforma de beta-fibronectina). Anticorpos ou outros ligantes podem sercopulados em veículos tais como lipossomos e vírus, como é conhecido naarte. Veja, e.g., Neri et al. (1997) Nat BioTechnology 15:1271; Kirpotin et al.(1997) Biochemistry 36:66; Cheng (1996) Human Gene Therapy 7:275;Pasqualini et al. (1997) Nat Biotechnology 15:542; Park et al. (1997) ProcAm Ass Canc Res 38:342 (1997); Nabel (1997) " Vectors for Gene Therapy"em "Current Protocols in Human Genetics" em CD-ROM, John Wiley &Sons, New York, N.Y.; U.S. Pat. No. 6,071,890; e Patente Européia de No. O439 095. Alternativamente, pseudotipificação de um retro vírus pode ser usadapara selecionar um vírus para uma célula particular (Marin et al. (1997) MolMed Today 3:396).

Vetores virais da invenção estão preferivelmente desabilitados,e.g. são deficientes em replicação. Isto é, são faltantes de um ou mais genesfuncionais requeridos para sua replicação, o que previne sua replicaçãodescontrolada in vivo e evita efeitos colaterais indesejáveis de infecção viral.Preferivelmente, todo o genoma viral é removido exceto os elementosgenômicos mínimos requeridos para empacotar o genoma viral incorporandoo gene terapêutico no capsídeo ou na capa viral. Por exemplo, é desejáveldeletar todo o genoma viral exceto as Repetições Terminais Longas (LTRs)ou as Repetições Terminais Inventadas (ITRs) e um sinal de empacotamento.No caso de adenovírus, deleções são tipicamente feitas na região El eopcionalmente em uma ou mais das regiões E2, E3 e/ou E4. No caso deretrovírus, genes requeridos para replicação, tais como env e/ou gag/polpodem ser deletados. Deleção de seqüências pode ser realizada por meiorecombinante, por exemplo, envolvendo digestão com enzimas de restriçãoapropriadas, seguida por religação. Também podem ser usados vetores viraisauto-destrutíveis ou auto-limitantes competentes em replicação.

Construtos de ácido nucleico da invenção podem serincorporados em genomas virais por qualquer meio conhecido na arte.Tipicamente, tal incorporação será realizada pela ligação do construto em umsítio de restrição apropriado no genoma do vírus. Genomas virais podem serentão empacotados em capsídeos ou capas virais por qualquer procedimentoadequado. Em particular, qualquer linhagem celular empacotadora pode serusada para gerar vetores virais da invenção. Estas linhagens empacotadorascomplementam os genomas virais deficientes em replicação da invenção,porque incluem, tipicamente incorporado em seus genomas, genes que têmsido deletados do genoma deficiente em replicação. Assim, o uso de linhagemempacotadoras permite que os vetores virais da invenção sejam gerados emcultura.

Linhagens empacotadoras adequadas para retrovírus incluemderivados de células PA317, células psi.-2, células CRE, células CRIP,células E-86-GP, e células 293GP. Células de linagem 293 podem ser usadaspara adenovírus e vírus adeno-associados.

Métodos adequados para introdução de um construto deterapia genética em células incluem injeção direta em uma célula ou massa decélulas, transferência de gene mediada por partícula, eletroporação,transfecção por DEAE-Dextrano, transfecção mediada por lipossomo,infecção viral, e suas combinações. Um método de liberação é selecionadobaseado em considerações tais como o tipo de vetor, a toxicidade do genecodificado, e a condição a ser tratada.

3.2.2.2 Construtos de expressão adequados

Vários promotores podem ser empregados para expressar amolécula de RNA quimérica da invenção para alcançar um efeito profiláticoou terapêutico benéfico. Pelos métodos e pelo tema da invenção aquiproporcionados a expressão torna-se mais específica, que é preferivelmenteintencificadora dos efeitos benéficos e diminuidora de efeitos colaterais.

O promotor pode ser um promotor induzível por calor ou luz,ou um promotor quimicamente induzível (e.g., um promotor induzível porantibiótico (tetraciclina ou seus derivados), atuando sobre uma proteína defusão com um elemento responsivo à tetraciclina).

Os construtos também podem compreender um promotorinduzível por calor. Qualquer promotor induzível por calor pode ser usado deacordo com os métodos da presente invenção, incluindo, mas não limitados aum elemento responsivo ao calor em um gene de choque térmico (e.g., hsp20-30, hsp27, hsp40, hspóO, hsp70, e hsp90). Veja Easton et al. (2000) CellStress Chaperones 5(4):276-290; Csermely et al. (1998) Pharmacol Ther79(2): 129-168; Ohtsuka & Hata (2000) Int J Hyperthermia 16(3):231-245; eas referências lá citadas. Similaridade de seqüência em relação às proteínas dechoque térmico e aos elementos de promotor responsivo ao calor também temsido reconhecida em genes inicialmente caracterizados com respeito a outrasfunções, e as seqüências de DNA que conferem inducibilidade ao calor sãoadequadas para uso nos vetores de terapia genética descritos. Por exemplo,expressão de genes responsivos à glicose (e.g., grp94, grp78, mortalina/grp75)(Merrick et al. (1997) Câncer Lett 119(2):185-190; Kiang et al. (1998)FASEB J 12(14): 1571-16-579), calreticulina (Szewczenko-Pawlikowski et al.(1997) Mol Cell Biochem 177(1-2): 145-152); clusterina (Viard et al. (1999) JInvest Dermatol 112(3):290-296; Michel et al. (1997) Biochem J 328(Ptl):45-50; Clark & Griswold (1997) J Androl 18(3):257-263), gene dehistocompatibilidade de classe I (HLA-G) (Ibrahim et al. (2000) Cell StressChaperones 5(3):207-218), e a isoforma de protease Kunitz de proteínaprecursora amilóide (Shepherd et al. (2000) Neuroscience 99(2):317-325) sãosupra-regulados em resposta ao calor.

No caso de clusterina, um elemento de 14 pares de bases que ésuficiente para inducibilidade térmica tem sido delineado (Michel et al.(1997) Biochem J 328(Ptl):45-50). Similarmente, tem sido mostrado que umaunidade de duas seqüências compreendendo um elemento de 10 pares debases e um elemento de 14 pares de bases na região de promotor decalreticulina confere inducibilidade térmica (Szewczenko-Pawlikowski et al.(1997) Mol Cell Biochem 177(1-2):145-152).

Outro promotor responsivo a um estímulo não-térmico quepode ser usado. Por exemplo, o promotor de mortalina é induzido por dosesbaixas de radiação ionizante (Sadekova (1997) Int J Radiat Biol 72(6):653-660), o promotor hsp27 é ativado por agonistas de receptor de 17-beta-estradiol e estrogênio (Porter et al. (2001) J Mol Endocrinol 26(l):31-42), Opromotor HLA-G é induzido por arsenito, promotores hsp podem ser ativadospor terapia fotodinâmica (Luna et al. (2000) Câncer Res 60(6): 1637-1644).

Um promotor adequado pode incorporar fatores tal comoativação específica para tecido. Por exemplo, hsp70 é transcricionalmentedebilitado em células de neuroblastoma estressadas (Drujan & De Maio(1999) 12(6):443-448). O promotor de mortalina, que é supra-regulado emtumores de cérebro de humano (Takano et al. (1997) Exp Cell Res 237(1):38-45). Um promotor empregado em métodos da presente invenção pode mostrarsupra-regulação seletiva em células de tumor como descrito, por exemplo,para mortalina (Takano et al. (1997) Exp Cell Res 237(l):38-45), hsp27 ecalreticulina (Szewczenko-Pawlikowski et al. (1997) Mol Cell Biochem177(1-2):145-152; Yu et al. (2000) Electrophoresis 21(14):3058-3068), grp94e grp78 (Gazit et al. (1999) Breast Câncer Res Treat 54(2): 135-146), hsp27,hsp70, hsp73, e hsp90 (Cardillo et al. (2000) Anticancer Res 20(6B):4579-4583; Strik et al. (2000) Anticancer Res 20(6B):4457-4552).

3.2.2.3 Formulações para captação de RNA e DNA

Para o propósito de aplicações farmacêuticas é preferido que amolécula de RNA quimérica da invenção seja aplicada ou administradadiretamente ao organismo alvo ou à célula alvo. São descritos na arte váriosmeios para aplicação de RNA como ingrediente ativo farmacêutico.

Como aqui usado "administração" refere-se ao contato decélulas (e.g., quer na forma isolada quer compreendida em um organismo)com o agente farmacêutico e pode ser realizado in vitro ou in vivo. Comrespeito às aplicações in vivo, as formulações da presente invenção podem seradministradas a um paciente em uma variedade de formas adaptadas à rota deadministração escolhida, e.g., parenteral, oral, ou intraperitonealmente.Administração parenteral, que é preferida, inclui administração pelasseguintes rotas: intravenosa; intramuscular; intersticial; intraarterial;subcutânea; intraocular; intrasinovial; transepitelial, incluindo transdermal;pulmonar via inalação; oftálmica; sublingual e bucal; tópica, incluindoofíálmica; dermal; ocular; retal; e inalação nasal via insuflação.Preferivelmente as preparações farmacêuticas para os vários modos deadministração (tais como aplicação parenteral, transmucosal, transdermal,oral, ou tópica) são bem conhecidos na arte e são por exemplo descritos noPedido de Patente U.S. 20040014956. O agente farmacêutico da invençãopode ser administrado sistemicamente a um indivíduo. Absorção sistêmicarefere-se à entrada de drogas na corrente sangüínea seguida por distribuiçãoem todo o corpo. Rotas de administração que acarretam absorção sistêmicaincluem: intravenosa, intraperitoneal, e intranasal. O método de liberaçãoescolhido resultará em entrada nas células. Métodos de liberação escolhidosincluem lipossomos (10-400 nm), hidrogeles, polímeros de liberaçãocontrolada, e outros veículos farmaceuticamente aplicáveis, e microinjeção oueletroporação (para tratamentos ex vivo). Veículos de liberação de drogapodem ser escolhidos e.g., para administração in vitro, sistêmica, ou tópica.Estes veículos podem ser planejados para servirem como reservatório deliberação lenta ou para liberarem seu conteúdo diretamente para a célula alvo.Uma vantagem do uso de alguns veículos de liberação de droga direta é quemoléculas múltiplas são liberadas por captação. Alguns exemplos de taisveículos de liberação de droga especializados que caem dentro desta categoriasão lipossomos, hidrogeles, ciclodextrinas, nanocápsulas biodegradáveis, emicroesferas bioadesivas. Em uma modalidade, tratamento in vitro de célulascom oligonucleotídeos pode ser usado para terapia ex vivo de célulasremovidas de um indivíduo (e.g., para tratamento de leucemia ou infecçãoviral) ou para tratamento de células que não se originam no indivíduo, massão para serem administradas ao indivíduo (e.g., para eliminar expressão deantígeno de transplante sobre células a serem transplantadas em umindivíduo). Em adição, tratamento in vitro de células pode ser usado emambientes não terapêuticos, e.g., para avaliar função de gene, para estudarregulação de gene e síntese de proteína ou para avaliar melhorias feitas emoligonucleotídeos planejados para modular expressão de gene ou síntese deproteína. Tratamento in vivo de células pode ser útil em certos ambientesclínicos onde é desejável inibir a expressão de uma proteína.

Composições para uso farmacêutico desta invençãodesejavelmente contêm uma molécula de RNA quimérica, ou um construto deexpressão para sua produção (daqui em diante o "agente farmacêutico").Qualquer um dos agentes farmacêuticos pode ser usado sozinho ou emcombinação com um veículo farmaceuticamente aceitável e com componentesopcionais adicionais para liberação farmacêutica. Como aqui usado, "veículofarmaceuticamente aceitável" inclui solventes, meios de dispersão,revestimentos, agentes antibacterianos e antifungicos, agentes de liberação deabsorção e isotônicos apropriados e semelhante. O uso de tais meios e agentespara substâncias farmacêuticas ativas é bem conhecido na arte. Veículosfarmaceuticamente aceitáveis adequados facilitam a administração ascomposições de polinucleotídeo desta invenção, mas são não-fisiologicamenteinertes e/ou não-nocivos. Veículos podem ser selecionados por uma pessoaexperiente na arte. Tais veículos incluem mas não são limitados a, soluçãosalina estéril, fosfato, solução salina tamponada, dextrose, água esterilizada,glicerol, etanol, lactose, sacarose, fosfato de cálcio, gelatina, dextrano, ágar,pectina, óleo de amendoim, azeite de oliva, óleo de gergelim, e água ecombinações dos mesmos. Adicionalmente, o veículo ou diluente pode incluirum material de liberação temporalmente prolongada, tal como monoestearatode glicerol ou diestearato de glicerol sozinho ou com uma cera. Em adição,formulações de polímero de liberação lenta podem ser usados. A formulaçãonão apenas deve ser adequada para a forma do agente de liberação, mastambém para o modo de administração. Seleção de um veículo apropriado deacordo com o modo de administração é rotineiramente realizada por aquelaspessoas experientes na arte. Componentes adicionais para o veículo podemincluir mas não são limitados a adjuvantes, conservantes, estabilizadoresquímicos, ou outras proteínas antigênicas. Conservantes exemplaresadequados incluem clorobutanol, sorbato de potássio, ácido sórbico, dióxidode enxofre, gaiato de propila, os parabenos, etil-vanilina, glicerina, fenol, eparaclorofenol. Ingredientes estabilizadores que podem ser usados incluem,por exemplo, sacarose, gelatina, vermelho de fenol, N-Z amina, difosfato demonopotássio, lactose, hidrolisado de lactalbumina, e leite em pó. Umadjuvante convencional é usado para atrair leucócitos ou intensificar umaresposta imune. Citados adjuvantes incluem dentre outros, Ribi, óleo minerale água, hidróxido de alumínio, Amphigen, Avridina, L121/esqualeno, D-lactídeo-polilactídeo/glicosídeo, plióis plurônicos, muramil dipeptídeo,Bordetella morta, e saponinas, tal como Quil A.

O agente farmacêutico pode ser incorporado em lipossomos oulipossomos modificados com poli(etileno-glicol) ou misturado com lipídeoscatiônicos para administração parenteral. Incorporação de substânciasadicionais em lipossomo, por exemplo, anticorpos reativos contra proteínas demembrana encontradas sobre células alvo específicas, podem ajudar adirecionar os oligonucleotídeos para tipos de célula específicos. Lipossomospodem ser preparados por qualquer uma de uma variedade de técnicas que sãoconhecidas na arte. Veja e.g., Betageri et al. (1993) "Liposome Drug DeliverySystems", Technomic Publishing, Lancaster; Gregoriadis, ed. (1993)"Liposome Technology", CRC Press, Boca Raton, Fla.; Janoff, ed. (1999)"Liposomes: Rational Design", M. Dekker, New York, N.Y.; Lasic & Martin(1995) "Stealth Liposomes", CRC Press, Boca Raton, Fla.; Nabel (1997)"Vectors for Gene Therapy" em "Current Protocols in Human Genetics" emCD-ROM, John Wiley & Sons, New York, N.Y.; e Patentes U.S. 4.235.871;4.551.482; 6.197.333; e 6.132.766. Aprisionamento de um agente ativo dentrode lipossomos da presente invenção também pode ser realizado usandoqualquer método convencional na arte. Na preparação de composições delipossomo, estabilizadores tais como antioxidantes e outros aditivos podemser usados. Outros veículos lipídicos também podem ser usados de acordocom a invenção reivindicada, tais como micropartículas lipídicas, micelas,suspensões lipídicas, e emulsões lipídicas. Veja, e.g., Labat-Moleur et al.(1996) Gene Therapy 3:1010-1017; US 5.011.634; 6.056.938; 6.217886;5.948.767; e 6.210.707.

A composição da invenção também pode envolverpolinucleotídeos liofilizados, que podem ser usados com outros excipientesfarmaceuticamente aceitáveis para desenvolvimento de formas de dosagemem suspensão, em líquido ou em pó, incluindo aquelas para aplicaçõesintranasal ou pulmonar. Veja, e.g., "Remington: The Science and Practice ofPharmacy", Vol. 2, l9 sup th edition (1995), e.g., Chapter 95 Aerosols; e Pedidode Patente Internacional de No. PCT/US99/05547, cujos ensinamentos sãoaqui incorporados como referência.

Em algumas modalidades preferidas, as composiçõesfarmacêuticas da invenção são preparadas para administração a indivíduosmamífero na forma de, por exemplo, líquidos, emulsões, pós, aerossóis,tabletes, cápsulas, supositórios, cápsulas ou tabletes entericamente revestidos.O curso ótimo de administração ou de liberação do agente farmacêutico podevariar dependendo do resultado desejado e/ou do indivíduo a ser tratado.

As preparações farmacêuticas da presente invenção podem serpreparadas e formuladas como emulsões ou microemulsões. Emulsões sãonormalmente sistemas heterogêneos da um líquido dispersado em outro naforma de gotículas normalmente ultrapassando 0,1 |im em diâmetro. Asemulsões da presente invenção podem conter excipientes tais comoemulsificadores, estabilizadores, corantes, gorduras, óleos, ceras, ácidosgraxos, alcoóis graxos, ésteres graxos, umectantes, colóides hidrofílicos, eantioxidantes também podem estar presentes em emulsões conforme anecessidade. Estes excipientes podem estar presentes como quer uma soluçãoem fase aquosa, fase oleosa quer em si mesmos como uma fase separada.Exemplos adequados para emulsificadores e conservantes são dados noPedido de Patente U.S. 20040014956. Uma microemulsão é um sistema deágua, óleo e anfifilo que é uma solução líquida única opticamente isotrópica etermodinamicamente estável. Microemulsões típicas são preparadas primeiropor dispersão de um óleo em uma solução aquosa de tensoativo e então adiçãode uma quantidade suficiente de um 4o componente, geralmente um álcool decadeia intermediária para formar um sistema transparente. Exemplosadequados para tensoativos e cotensoativos são descritos em Pedido dePatente U.S. 20040014956. Microemulsões são particularmente de interessedo ponto de vista de solubilização de droga e absorção intensificada dedrogas. Microemulsões baseadas em lipídeo (tanto de óleo/água quanto deágua/óleo) têm sido propostas para intensificar a biodisponibilidade oral dedrogas. É esperado que as formulações e composições de microemulsão dapresente invenção facilitarão a absorção sistêmica aumentada de agentesfarmacêuticos da invenção do trato gastrointestinal, bem como melhorarão acaptação celular local de oligonucleotídeos dentro do trato gastrointestinal,vagina, cavidade bucal e outras áreas de administração.

Em uma modalidade, a presente invenção emprega váriosintensificadores de penetração para efetuar a liberação eficiente de agentesfarmacêuticos da invenção (especialmente ácidos nucleicos, particularmenteoligonucleotídeos) para a pele de humanos e animais. Intensificadores depenetração adequado são descritos em Pedido de Patente U.S. 20040146902,aqui incorporado como referência.

A dosagem útil a ser administrada e o modo particular deadministração variarão dependendo de fatores tais como o tipo de célula, oupara uso in vivo, a idade, o peso e animal particular ou a região do mesmo sertratado(a), o oligonucleotídeo particular e o método de liberação usado, o usoterapêutico ou diagnóstico contemplado, e a forma da formulação, porexemplo, suspensão, emulsão, micela ou lipossomo, como serão prontamenteevidentes para aquelas pessoas experientes na arte. Tipicamente, a dosagem éadministrada em doses menores e aumentada até que o efeito desejado sejaalcançado. A dosagem do agente farmacêutico pode ser ajustada paraotimamente reduzir a expressão do gene alvo, e.g., conforme medida pelaleitura da estabilidade de RNA ou por uma resposta terapêutica, semexperimentação indevida. A dose exata de um oligonucleotídeo e o número dedoses administradas dependerão dos dados gerados experimentalmente e dostestes clínicos. Vários fatores tais como o efeito desejado, o veículo deliberação, a indicação da doença, e a rota de administração, afetarão adosagem. Dosagens podem ser prontamente determinadas por uma pessoaordinariamente experiente na arte e formuladas nas composiçõesfarmacêuticas individuais. Preferivelmente, a duração do tratamento seestenderá por pelo menos todo o curso dos sintomas da doença. Por exemplo,as composições da presente invenção, quando usadas como composiçõesfarmacêuticas, podem compreender cerca de 1 ng a cerca de 20 mg de agentefarmacêutico da invenção (e.g., as moléculas de RNA sintéticas ou os agentesde liberação que podem ser moléculas de DNA, plasmídeos, vetores virais,vírus recombinantes, e misturas dos mesmos). As composições da presenteinvenção nas quais os agentes de liberação são células ou bactérias doadoraspodem ser liberadas em dosagens entre cerca de 1 célula/dose e cerca de IO7células/dose. Similarmente, onde o agente de liberação é um vírusrecombinante vivo, uma composição baseada em vetor adequada contém entreIXlO2 pfu e IXlO12 pfu por dose.

O agente farmacêuticos da invenção pode ser combinado comqualquer outra droga, preferivelmente para a mesma indicação médica. Porexemplo para agentes farmacêuticos que possuem propriedades de anti-câncero agente pode ser combinado com um ou mais agentes quimioterapêuticos(e.g., tais como daunorubicina, idarubicina, mitomicina C, 5-fluorouracila (5-FU), metotrexato (MTX), taxol, vincristina, e cisplatina) que funcionam porum mecanismo de não-anti-senso.

Ensinamentos adequados adicionais para composiçõesfarmacêuticas e sua preparação, administração e dosagem em relação aoscompostos de oligonucleotídeo que podem ser utilizados dentro do escopo dapresente invenção são dados no Pedido de Patente U.S. de No. 20040146902

Em uma modalidade, os agentes farmacêuticos da invenção(e.g., oligonucleotídeos) podem ser administrados a indivíduos. Exemplos deindivíduos incluem mamíferos, e.g., humanos e outros primatas; vacas,porcos, cavalos, e animais de fazenda (agrícola); cães, gatos, e outros animaisde estimação domésticos; camundongos, ratos, e animais não-humanostransgênicos.

3.3. Aplicações biotecnológicas

Os métodos e as composições de acordo com a invençãopodem ser aplicados vantajosamente em aplicações e métodosbiotecnológicos, incluindo mas não limitados à otimização de rotasmetabólicas e.g., em leveduras, fungos ou outros microorganismoseucarióticos ou células eucarióticas que são usados em fermentação para aprodução de compostos de química fina tais como aminoácidos (por exemplolisina ou metionina), vitaminas (tais como vitamina B2, vitamina C, vitaminaE), carotenóides, óleos e gorduras, ácidos graxos poliinsaturados, biotina esemelhante.

Vetores preferidos para expressão em eucariotoscompreendem pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTl e pSG (Stratagene Inc.);pSVK3, pBPV, pMSG e pSVL (Pharmacia Biotech, Inc.). Vetores induzíveisque podem ser mencionados são pTet-tTak, pTet-Splice, pcDNA4/TO,pcDNA4/TO /LacZ, pcDNA6/TR, pcDNA4/TO/Myc-His /LacZ,pcDNA4/TO/Myc-His A, pcDNA4/TO/Myc-His B, pcDNA4/TO/Myc-His C,pVgRXR (Invitrogen, Inc.) ou a série pMAM (Clontech, Inc.; GenBankAccession No.: U02443). Estes vetores já proporcionam o elemento decontrole regulatório induzível, por exemplo para uma expressãoquimicamente induzível de uma enzima DSBI. A seqüência de ácido nucleicocodificadora de uma enzima DSBI pode ser inserida diretamente nestesvetores. Vetores para expressão em levedura compreendem por exemplopYES2, pYDl, pTEFl/Zeo, pYES2/GS, pPICZ, pGAPZ, pGAPZalph, pPIC9,pPIC3.5, PHTL-D2, PHIL-Slj pPIC3SK, pPIC9K e PA0815 (Invitrogen, Inc.).Em princípio, para a transformação de célula de animal ou de células delevedura, métodos similares como a transformação "direta" de células deplanta para para serem aplicados. Em particular, métodos tais como atransformação mediada por fosfato de cálcio ou por lipossomo se nãoeletroporação são preferidos. Marcadores de seleção que podem ser usadossão, em princípio, muitos dos sistemas de seleção que também são preferidospara plantas. Especialmente preferidos são para célula de mamífero aresistência à neomicina (G418), a resistência à higromicina, resistência àzeocina ou a resistência à puromicina. A resistência à ampicilina, a resistênciaà canamicina ou a resistência à tetraciclina são especialmente preferidos paraprocariotos.

Dependendo do organismo hospedeiro, os organismos usadosno método são crescidos ou cultivados em uma maneira com a qual o técnicoexperiente está familiarizado. Como uma regra, microorganismos sãocrescidos em um meio líquido compreendendo uma fonte de carbono,normalmente na forma de açúcares, uma fonte de nitrogênio, normalmente naforma de fontes de nitrogênio orgânico tais como extratos de levedo ou saistal como sulfato de amônio, elementos traço tais como sais de ferro, demanganês e de magnésio, e, se apropriadas, vitaminas, em temperaturas deentre 0°C e 100°C, preferivelmente entre IO0C e 60°C, ao mesmo tempopassando oxigênio. O pH do meio líquido pode ser mantido em um valorconstante, isto é, regulado durante o período de cultivo, se não, não. A culturapode ser no modo em batelada, em semi-batelada, ou contínuo. Nutrientespodem ser proporcionados no início da fermentação ou alimentados no modosemi-contínuo ou contínuo.

4. Exemplificação

Aquelas pessoas experientes na arte reconhecerão, ou serãocapazes de verificar usando não mais do que experimentação de rotina, muitosequivalentes às modalidades específicas da invenção aqui descrita. Taisequivalentes são intencionados para serem incluídos pelas reivindicaçõesapendidas. Os conteúdos inteiros de patentes, de pedidos de patentepublicados e de outras referências aqui citadas são por meio desta aquiincorporadas em suas totalidades como referências.

A invenção, agora sendo geralmente descrita, será maisprontamente entendida por referências aos seguintes exemplos, que sãoincluídos meramente para os propósitos de ilustração de certos aspectos e decertas modalidades da presente invenção e não são intencionados paralimitarem a invenção.

EXEMPLOS

Métodos gerais:

A não ser que seja especificado de outra maneira, todos oscompostos químicos são obtidos de Fluka (Buchs), Merck (Darmstadt), Roth(Karlsruhe), Serva (Heidelberg) e Sigma (Deisenhofen). Enzimas de restrição,enzimas modificadoras de DNA e kits de biologia molecular biology foram deAmersham-Pharmacia (Freiburg), Biometra (Gõttingen), Roche (Mannheim),New England Biolabs (Schwalbach), Novagen (Madison, Wisconsin, USA),Perkin-Elmer (Weiterstadt), Qiagen (Hilden), Stratagen (Amsterdam, Países-Baixos), Invitrogen (Karlsruhe) e Ambion (Cambridgeshire, UnitedKingdom). Os reagentes usados foram empregados de acordo com asinstruções do fabricante.

A prática da presente invenção empregará, a não ser que sejaindicado de outra maneira, técnicas convencionais de biologia de célula,cultura de célula, biologia moleculaar, microbiologia, DNA recombinante, eimunologia, que estão dentro da capacidade da arte. Tais técnicas sãoexplicadas totalmente na literatura. Veja, por exemplo, Molecular Cloning ALaboratory Manual, 2nd Ed., ed. by Sambrook, J. et al. (Cold Spring HarborLaboratory Press (1989)); Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Ed., ed.by Ausubel, F. et al. (Wiley, N.Y. (1995)); DNA Cloning, Volumes I e II (D.N. Glover ed., 1985); Oligonucleotídeo Synthesis (M. J. Gait ed. (1984));Mullis et al. Patente U.S. de No: 4.683.195; Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S. J. Higgins eds. (1984)); o tratado, Methods In Enzymology(Academic Press, Inc., N.Y.); Immunochemical Methods In Cell AndMolecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London(1987)); Handbook OfExperimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weire C. C. Blackwell, eds. (1986)); e Miller, J. Experiments in MolecularGenetics (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1972)).

A síntese química de oligonucleotídeos pode ser realizada porexemplo na maneira conhecida usando o método de fosfoamidito (Voet, Voet,2nd edition, Wiley Press New York, páginas 896-897). As etapas de clonagemrealizadas para o propósito da presente invenção tais como, por exemplo,clivagens de restrição, eletroforese em gel de agarose, purificação defragmentos de DNA, transferência de ácidos nucleicos para membranas denitrocelulose e de náilon, ligação de fragmentos de DNA, transformação decélulas de E. coli, culturas bacterianas, propagação de fagos e análise deseqüência de DNA recombinante, são realizadas como descrito em Sambrooket al. (1989) Cold Spring Harbor Laboratoiy Press; ISBN 0-87969-309-6.Moléculas de DNA recombinante são seqüenciadas usando um seqüenciadorde DNA por fluorescência de laser ABI pelo método de Sanger (Sanger et al.(1977) Proc Natl Acad Sci USA 74:5463-5467).

EXEMPLO 1: Transformação mediada por Agrobacteriumem plantas dicotiledôneas e monocotiledôneas

1.1 Transformação e regeneração de plantas Arabidopsisthaliana (CoIumbia) transgênicas

Para gerar plantas Arabidopsis transgênicas, Agrobacteriumtumefaciens (cepa C58C1 pGV2260) é transformada com vários construtos devetor GUS / promotor ptxA ou SbHRGP3. As cepas agrobacterianas sãosubseqüentemente usadas para gerar plantas transgênicas. Para este fim, umacolônia única de Agrobacterium transformada é incubada durante a noite a28°C em uma cultura de 4 mL (meio: meio YEB com 50 μg/mL decanamicina e 25 μg/mL de rifampicina). Esta cultura é subseqüentementeusada para inocular uma cultura de 400 mL no mesmo meio, e esta é incubadadurante a noite (28°C, 220 rpm) e centrifugada (rotor GSA, 8.000 rpm, 20min). A pelota é ressuspensa em meio de infiltração (meio 1/2 MS; 0,5 g/LMES, pH 5,8; 50 g/L de sacarose). A suspensão é introduzida em uma caixade planta (Duchefa), e 100 mL de SILWET L-77 (heptametiltrissiloxanomodificado com poli(óxido de alquileno); Osi Specialties Inc., Cat. P030196)foram adicionados para uma concentração final de 0,02%. Em um dessecador,a caixa de planta com 8 a 12 plantas é exposta a um vácuo por 10 a 15minutos, seguido por aeração espontânea. Isto é repetido duas ou 3 vezes.Logo após isso, todas as plantas são plantadas em potes de flores com soloúmido e crescidas sob condições durante o dia (temperatura diurna de 22°C a24°C, temperatura noturna de 19°C; umidade atmosférica relativa de 65%). Assementes são colhidas após 6 semanas.

Como uma alternativa, plantas Arabidopsis transgênicaspodem ser obtidas por transformação de raiz. Brotos de raiz brancos deplantas com uma idade máxima de 8 semanas são usados. Para este fim,plantas que são mantidas sob condições estéreis em meio 1 MS (1% desacarose; lOOmg/L de inositol; 1,0 mg/L de tiamina; 0,5 mg/L de piridoxina;0,5 mg/L de ácido nicotínico; 0,5 g de MES, pH 5,7; 0,8 % de ágar) sãousadas. Raízes são crescidas sobre meio indutor de calo por 3 dias (lx meioB5 de Gamborg; 2% de glicose; 0,5 g/L de mercaptoetanol; 0,8% de ágar; 0,5mg/L de 2,4-D (ácido 2,4-dicloro-fenóxi-acético); 0,05 mg/L de cinetina).Seções de raiz de 0,5 cm de comprimento são transferidas para dentro de 10mL a 20 mL de meio líquido indutor de calo (composição como descritaacima, mas sem a suplementação de ágar), inoculadas com 1 mL da culturaagrobacteriana noturna descrita acima (crescida a 28°C, 200 rpm em LB) eagitadas por 2 minutos. Após ter sido permitida remoção de excesso de meio,os explantes de raiz são transferidos para meio indutor de calo com ágar,subseqüentemente para meio líquido indutor de calo sem ágar (com 500 mg/Lbetabactil, SmithKline Beecham Pharma GmbH, Munique), incubados comagitação e finalmente transferidos para meio indutor de broto (5 mg/L defosfato de 2-isopenteniladenina; 0,15 mg/L de ácido indol-3-acético; 50 mg/Lde canamicina; 500 mg/L de betabactil). Após 5 semanas, e após 1 ou 2mudanças de meio, os brotos verdes pequenos são transferidos para meio degerminação (meio 1 MS; 1% de sacarose; 100 mg/L de inositol; 1,0 mg/L detiamina; 0,5 mg/L de piridoxina; 0,5 mg/L de ácido nicotínico; 0,5 g de MES,pH 5,7; 0,8% de ágar) e regenerados em plantas.

1.2 Transformação e regeneração de plantas de colheira

A transformação de planta mediada por Agrobacterium usandotécnicas de transformação e de regeneração padrão também pode ser realizadapara os propósitos de transformação de plantas de colheita (Gelvin &Schilperoort (1995) Plant Molecular Biology Manual, 2nd Edition, Dordrecht:Kluwer, Academic Publ. ISBN 0-7923-273 l-4;Glick & Thompson (1993)Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Boca Raton: CRCPress, ISBN 0-8493-5164-2)

Por exemplo, colza pode ser transformada por transformaçãode cotilédone ou de hipocótilo (Moloney et al. (1989) Plant Cell Reports 8:238-242, de Block et al. (1989) Plant Physiol. 91:694-701). O uso deantibióticos para a seleção de Agrobacteria e plantas depende do vetor binárioe da cepa de Agrobaeterium usados para a transformação. A seleção de colzaé geralmente realizada usando canamicina como marcador de plantaselecionável. A transferência de gene mediada por Agrobaeterium em linho{Linum usitatissimum) pode ser realizada usando por exemplo uma técnicadescrita por Mlynarova et al. ((1994), Plant Cell Report 13: 282-285). Atransformação de soja pode ser realizada usando, por exemplo, uma técnicadescrita em EP-Al 0424 047 ou em EP-Al 0397 687, US 5.376.543, US5.169.770. A transformação de milho ou outras plantas monocotiledôneaspode ser realizada usando, por exemplo, uma técnica descrita em US5.591.616.

A transformação de plantas usando bombardeio de partículas,captação de DNA mediada por poli(etileno-glicol) ou via a técnica de fibra decarbonato de silício é descrita, por exemplo, por Freeling & Walbot (1993)"The Maize handbook" ISBN 3-540-97826-7, Springer Verlag New York).

EXEMPLO 2: Detecção de expressão de gene repórter

Estes experimentos são realizados pelo bombardeio de tecidosde planta ou de células de cultura (Exemplo 2.1), por introdução de DNA emprotoplastos de planta mediada por PEG (ou metodologia similar) s (Exemplo2.2), ou por transformação mediada por Agrobaeterium (Exemplo 2.3). Otecido alvo para estes experimentos pode ser tecidos de planta (e.g. tecidofoliar tem sido descrito para melhor suportar tradução mediada por IRES(Urwin, et al., 2000), células de planta cultivadas {e.g. milho BMS), ouembriões de planta para protocolos de Agrobaeterium.

2.1 Ensaio transiente usando bombardeio de microprojétil

Os construtos de plasmídeo são isolados usando o kit deplasmídeo Qiagen (cat. no. 12143). DNA é precipitado sobre partículas deouro de 0,6 μηι (Bio-Rad cat. no. 165-2262) de acordo com o protocolodescrito por Sanford et al. (1993) e acelerado sobre tecidos alvo {e.g. folhasde milho de duas semanas de idade, células cultivadas BMS, etc.) usando umdispositivo de sistema PDS-1000/He (Bio-Rad). Todas as etapas deprecipitação e bombardeio de DNA são realizadas sob condições estéreis natemperatura ambiente.

Dois mg de partículas de ouro (2 mg/3 balas) são ressuspensosem etanoll00% seguido por centrifugação em uma Centrífuga BeckmanMicrofuge 18a 2000 rpm em um tubo Eppendorf. A pelota é lavada uma vezem água destilada estéril, centrifugada, e ressuspensa em 25 |jL de 1 μg/μL deDNA total. Os seguintes reagentes são adicionados no tubo: 220 μΐ. deH20,250 μΐ, de CaCl2 2,5M, 50 μΐ, de espermidina, base livre Ο,ΙΜ. A solução deDNA é brevemente agitada e posicionada sobre gelo por 5 min seguido porcentrifugação a 500 rpm por 5 min em uma Centrífuga Beckman Microfuge18. O sobrenadante é removido. A pelota é ressuspensa em 600 μΐ, de etanolseguido por centrifugação por 1 min a 14.000 rpm. A pelota final éressuspensa em 36 μΐ. de etanol e usada imediatamente ou armazenada sobregelo até 4 h antes do bombardeio. Para bombardeio, folhas de milho de duassemanas de idade são cortadas em aproximadamente 1 cm de comprimento eposicionadas sobre papel de filtro Whatman esterilizado de 5,08 centímetrosde diâmetro. No caso de células cultivadas BMS, 5 mL de suspensão decélulas de uma semana de idade são lentamente filtrados a vácuo sobre papelde filtro de 5,08 centímetros de diâmetro posicionado sobre uma unidade defiltro para remover o líquido em excesso. Os papéis de filtro suportando osmateriais de planta são deixados em meio de indução osmótica (N6 1-100-25,manitol 0,2 M, sorbitol 0,2 M) a 27°C no escuro por 2-3 horas antes dobombardeio. Uns poucos minutos antes do tiroteio, os filtros são removidosdo meio e deixados sobre placas de Petri abertas estéreis para permitir que asuperfície de calos parcialmente secasse. Para manter a posição de materiaisde planta, uma tela de malha de arame esterilizada é deixada sobre o topo daamostra. Cada placa é atingida com 10 μΐ, de solução de ouro-DNA uma veza 15.168 kPa para os materiais foliares e duas vezes a 7.584 kPa para ascélulas cultivadas BMS. Após o bombardeio, os filtros suportando asamostras são transferidos para cima de meios basais MS e incubados por 2dias no escuro a 27°C antes dos ensaios transientes. Os níveis de expressãotransiente do gene repórter são determinados por quantificação da expressãode genes repórter ou por RT-PCR usando os protocolos na arte com o objetivode determinar os candidatos a terminador potencialmente fortes e firmes.

2.2 Ensaio transiente usando protoplastos

Isolamento de protoplastos é realizado pelo seguinte protocolodesenvolvido por Sheen (1990). Muda de milho são mantidas no escuro a25°C por 10 dias e iluminadas por 20 horas antes da preparação deprotoplasto.

A parte do meio das folhas é cortada em tiras de 0,5 mm (cercade 6 cm de comprimento) e incubada em uma solução de enzima contendo1% (p/v) de celulose RS, 0,% (p/v) de macerozyme RlO (ambas da YaknltHonsha, Nishinomiya, Japão), manitol 0,6 M, Mes 10 mM (pH 5,7), CaCl2 1mM, MgCl2I mM, β-mercapto-etanollO mM, e BSA 0,1% (p/v) por 3 h a230C seguido por agitação suave a 80 rpm por 10 min para liberar osprotoplastos. Protoplastos são colhidos por centrifugação a 100 χ g por 2 min,lavados uma vez em solução fria de manitol 0,6 M, centrifugados, eressuspensos em manitol frio 0,6 M (2 χ IO6AnL). Um total de 50 μg de DNAplasmídeo em um volume total de 100 μί de água estéril é adicionado em 0,5mL de uma suspensão de protoplastos de milho (1 χ IO6 células/mL) emisturado suavemente. 0,5 mL de solução de PEG (40 % de PEG 4000,CaNO3 100 mM, 0,5 manitol) é adicionado e pré-aquecido para 70°C comagitação suave seguido pela adição de 4,5 mL de solução de MM (manitol 0,6M, MgCl215 mM, e 0,1 % de MES). Esta mistura é incubada por 15 minutosna temperatura ambiente. Os protoplastos são lavados duas vezes porpelotização a 600 rpm por 5 min e ressuspensão em 1,0 mL de solução MMB[manitol 0,6 M, Mes 4 mM (pH 5,7), e sais de vírus do mosaico de Bromus(BMV) (opcionais)] e incubados no escuro a 25 0C por 48 r. Após a etapa delavagem final, colher os protoplastos em 3 mL de meio MMB, e incubar noescuro a 25 0C por 48 h. Níveis de expressão transiente do gene repórter sãodeterminados por quantificação de expressão de genes repórter ou por RT-PCR usando os protocolos na arte com o objetivo de determinar os candidatosa terminador potencialmente forte e firme.

2.3 Detecção de gene repórter GUS

Para identificar as características do promotor e dos elementosessenciais do último, que acarretm sua especificidade para tecido, é necessárioposicionar o próprio promotor e vários de seus fragmentos na frente do que éconhecido como um gene repórter, que permite a determinação da atividadede expressão. Um exemplo, que pode ser mencionado, é a β-glicuronidasebacteriana (Jefferson et al. EMBO J 6:3901-3907 (1987). A atividade de β-glicuronidase pode ser detectada em planta por meio de um substratocromogênico tal como ácido 5-bromo-4-cloro-3-indolil-P-D-glicurônico emuma coloração de atividade (Jefferson et al. Plant Mol Biol Rep 5:387-405(1987)). Para estudar a especificidade para tecido, o tecido de planta écortado, embebido, colorido e analisado como descrito (por exemploBaumlein et al. (1991a) Mol Gen Genet 225(3):459-467, Baumlein et al(1991b) Mol Gen Genet 225:121 -128).

Um segundo ensaio permite a determinação quantitativa daatividade de GUS no tecido estudado. Para a determinação quantitativa,MUG (4-metil-umbeliferil-P-D-glicuronídeo) é usado como o substrato paraβ-glicuronidase, e o KlUG é clivado em MU (metil-umbeliferona) e ácidoglicurônico.

Para fazer isto, um extrato de proteína do tecido desejado éprimeiro preparado e o substrato de GUS é então adicionado no extrato. Osubstrato pode ser medido fluorimetricamente apenas após GUS ter sidoreagido. Amostras que são subseqüentemente medidas em um fluorímetro sãomedidas em vários instantes de tempo. Este ensaio pode ser realizado porexemplo com embriões de linho em vários estágios de desenvolvimento (21,24 ou 30 dias após a floração). Para este fim, em cada caso um embrião émoído para um pó em um vaso de reação de 2 mL em nitrogênio líquido como auxílio de um moinho de moagem por vibração (Tipo: Retsch MM 2000).

Após adição de 100 pL de tampão EGL (KPO4 0,1 M, pH 7,8; EDTA 1 mM;5% de glicerol; DTT 1 M), a mistura é centrifugada por 10 minutos a 25°C e14.000 χ g. O sobrenadante é removido e recentrifugado. De novo, osobrenadante é transferido para um vaso de reação novo e mantido sobre geloaté uso posterior. 25 μι deste extrato de proteína são tratados com 65 μΙ, detampão EGL (sem DTT) e empregados no ensaio de GUS. 10 μι do substratoMUG (4-metil-umbeliferil-P-D-glicuronídeo 10 mM) são agora adicionados,a mistura é agitada, e 30 μΕ são removidos imediatamente como valor zero etratados com 470 μΕ de tampão Stop (Na2CO3 0,2 M). Este procedimento érepetido para todas as amostras em um intervalo de 30 segundos. As amostrasobtidas foram armazenadas no refrigerador até serem medidas. Outras leiturasforam obtidas após lhe após 2 h. Uma série de calibração que continhaconcentrações de 0,1 mM a 10 mM de MU (4-metil-umbeliferona) foiestabelecida para a medição fluorimétrica. Se os valores de amostra estavamforam destas concentrações, menos extrato de proteína foi empregado (10 pL,1 μΕ, 1 μΕ de uma diluição 1:10), e intervalos mais curtos foram medidos (0h, 30 min, 1 h). A medição foi realizada em uma excitação de 365 nm e umaemissão de 445 nm em uma aparelhagem Fluoroscan II (Labsystem). Comouma alternativa, a clivagem de substrato pode ser monitoradafluorimetricamente sob condições alcalinas (excitação a 365 nm, medição deemissão a 455 nm; Spectro Fluorimeter BMG Polarstar+) como descrito emBustos et ai (1989) Plant Cell 1(9):839-53. Todas as amostras foramsubmetidas a uma determinação de concentração de proteína pelo método deBradford (1976) Anal. Biochem. 72:248-254, permitindo assim umaidentificação da atividade de promotor e da força de promotor em váriostecidos e plantas.

2.4 Detecção de gene de proteína fluorescente

Vários genes de proteína fluorescente, e.g. DsRed5 ZsGreen,ZsYellow, ZsCyan e AcGFP (BD Biosciences) são derivados de espéciesnovas de coral de recife e de água-viva. Tem sido mostrado que estasproteínas fluorescentes podem ser usadas como repórteres em múltiplasespécies de planta (Wenck A. et al., Plant Cell Report5 22:244-251, 2003). Osmateriais de planta (e.g. folhas e raízes) trazendo proteínas fluorescentespodem ser visualizados usando microscópio de epifluorescência comconjuntos de filtros apropriados. Além disso, a intensidade da proteínafluorescente, que indica o nível de expressão da proteína, é analisado por uminstrumento de imagem de fluorescência tal como Typhoon 9400 (AmershamBiosciences) em uma maneira quantitativa seguindo a instrução recomendadapelo fabricante.

EXEMPLO 3: Análise de expressão para microRNAs

Análise é realizada em nível de RNA (e.g., por análise deNorthern blot ou qPCR em tempo real). Alternativamente perfis de expressãopodem ser avaliados pela representação de seqüências de miRNA específicasem bibliotecas de cDNA específico para tecido não normalizado e podem -por exemplo - ser avaliados em silico por "contagem" do número deseqüências de cDNA para um miRNA específico em citada biblioteca.

3.1 Hibridização de Northern:

Um método adequado para determinar a quantidade detranscrição de um gene é realizar uma análise de Northern blot (por meio dereferência, veja Ausubel et al. (1988) Current Protocols in Molecular Biology,Wiley: New York, ou a seção de exemplo mencionada acima), onde uminiciador que é planejado de tal modo que se liga no gene-de-interesse e estámarcado com um marcador (normalmente um marcador radioativo ou ummarcador quimioluminescente) de modo que, quando o RNA total de umacultura do organismo é extraído, separado sobre um gel, transferido para umamatriz estável e incubado com sua sonda, a ligação e a extensão da ligação dasonda indica a presença e também a quantidade de mRNA para este gene.

Esta informação também indica o grau de transcrição do gene transformado.RNA total celular pode ser preparado de células, tecidos ou órgãos em umapluralidade de métodos, todos os quais são conhecidos na arte, tal como, porexemplo, o método descrito por Bormann, E.R., et ai. (1992) Mol. Microbiol.6:317-326.

Para realizar a hibridização de RNA, 20 μg de RNA total ou 1μg de poli(A)+ RNA são separados por meio de eletroforese em gel em gelesde agarose com uma concentração de 1,25% usando formaldeído, comodescrito em Amasino (1986, Anal. Biochem. 152, 304), aplicado comomancha por capilar em membranas de náilon positivamente carregadas(Hybond N+, Amersham, Braunschweig) usando IOx SSC, imobilizado porluz UV e pré-hibridizado por 3 horas a 68°C usando tampão de hibridização(10% p/v de sulfato de dextrano, NaCl 1 M, 1% de SDS, 100 mg de DNA deesperma de arenque). A sonda de DNA foi marcada com o kit demarcação Highprime DNA (Roche, Mannheim, Alemanha) durante a pré-hibridização, usando alfa-32P-dCTP (Amersham Pharmacia, Braunschweig,Alemanha). Após a sonda de DNA marcado ter sido adicionada, ahibridização foi realizada no mesmo tampão a 68°C durante a noite. As etapasde lavagem foram realizadas duas vezes por 15 minutos usando 2 X SSC eduas vezes por 30 minutos usando 1 X SSC, 1% de SDS, a 68°C. Os filtrosvedados foram expostos a -70°C durante um período de 1 a 14 dias.

3.2 RT-qPCR

Após RNA total ser isolado de um organismo ou de tecidosespecíficos ou tipos de células, RNA é resolvido sobre um gel depoliacrilamida a 15% desnaturante. Um fragmento de gel que representa afaixa de tamanho de 15 a 26 nucleotídeos foi excisado, RNA pequeno foieluído, e recuperado. Subseqüentemente, RNA pequeno é ligado emadaptadores de oligonucleotídeo quimérico de RNA/DNA 3' e 5'. Reação detranscrição reversa foi realizada usando iniciador de RT seguida por PCR cominiciadores apropriados. Produtos de PCR são então clonados em vetor paraseqüenciamento (Sunkar R e Zhu JK, The Plant Cell 16:2001:2019, 2004)

3.3 Resultados

As seguintes tabelas apresentam alguns dos perfis deexpressão encontrados para vários miRNAs tanto de planta e de animalquanto de espécies de mamífero. Durante a clonagem e o seqüenciamentosubseqüente de miRNA, alguns clones de miRNA têm mostrado nucleotídeosdiferentes nas extremidades (especialmente extremidade 3'), que sãorepresentados aqui por letras minúsculas. A extremidade 3' de miRNA énormalmente menos importante.<table>table see original document page 211</column></row><table><table>table see original document page 212</column></row><table><table>table see original document page 213</column></row><table><table>table see original document page 214</column></row><table><table>table see original document page 215</column></row><table><table>table see original document page 216</column></row><table><table>table see original document page 217</column></row><table><table>table see original document page 218</column></row><table><table>table see original document page 219</column></row><table>Tabela 6: miRNAs de milho identificados em banco de dados de Hyseq

<table>table see original document page 220</column></row><table><table>table see original document page 221</column></row><table>

EXEMPLO 4: Construção de vetor para transformação deplanta

Um típico vetor binário ou vetor de transformação de plantacontém dois construtos de expressão em planta: um para marcador de seleçãoe o outro para o gene-de-interesse. Cada cassete consiste de um promotor, umgene a ser expressado e um terminador. O construto de expressão pode serconstruído em um vetor binário via procedimentos de clonagem molecularpadrão, PCR ou via sistema Gateway (Invitrogen, CA)

4.1 Isolamento de promotores

DNA genômico de milho e de arroz é extraído usando oQiagen DNAeasy Plant Mini Kit (Qiagen). As regiões de promotor foramisoladas do DNA genômico usando PCR convencional. Aproximadamente0,1 μg de DNA genômico digerido foi usado para a reação PCR regular (vejaabaixo). Os iniciadores foram planejados baseados em seqüências de DNAgenômico de milho ou arroz a montante das seqüências de promotor, ouseqüências genômicas de milho, candidatas EST, descritas em bancos dedados públicos (e.g. cafeoil CoA-O- metiltransferase [CCoAMTl] de arroz,número de acesso no GenBank de AB023482; proteína desconhecida dearroz, AP002818; glicoproteína rica em hidróxi-prolina [HRGP] de milho,AJl31535; Iactato desidrogenase [LDH] de milho, Zl 1754; CloroplastoProteína 12-semelhante de arroz, NP914106.1). 1 μΐ, de DNA genômicodigerido diluído foi usado como o molde de DNA na reação PCR primária. Areação compreendeu iniciadores direto (5') e inverso (3') na mistura contendoTampão 3 seguindo o protocolo descrito por um Expand Long PCR kit (Cat.no. 1681-842, Roche-Boehringer Mannheim). O DNA isolado é empregadocomo DNA molde em uma reação de amplificação por PCR usando osseguintes iniciadores:Tabela 7: Seqüências de iniciadores para isolamento da região de promotor

<table>table see original document page 222</column></row><table>

As regiões de promotor são amplificadas na solução de reação[1 χ tampão de reação PCR (Roche Diagnostics), 5 μΐ. de DNA genômico(corresponde a aproximadamente 80 ng, 2,5 mM de cada dATP, dCTP, dGTPe dTTP (Invitrogen: dNTP mix), 1 nL de iniciador 5' (100 μΜ) 1 \yL deiniciador 3' (100 μΜ), 1 \\L de Taq DNA polimerase 5 U/μΙ. (RocheDiagnostics), em um volume final 100 pL] sob programa de termocicladorPCR otimizado (T3 Thermocycler Biometra; 1 ciclo com 180 s em 95°C, 30ciclos com 40 s em 95°C, 60 s em 53 0C e 2 min em 72°C, e 1 ciclo com 5 minem Il0C antes da interrupção da reação a 4°C).

O produto PCR foi aplicado em um gel de agarose 1% (p/v) eseparado em 80V seguido por excisão do gel e purificado com o auxílio doQiagen Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden, Alemanha). Se apropriado, oeluato de 50 μΐ, pode ser evaporado. O produto de PCR foi clonadodiretamente no vetor pCR4-TOPO (Invitrogen) seguindo as instruções dofabricante, i.e. o produto de PCR obtido é inserido em um vetor possuindoprojeções (overhangs) T com suas projeções (overhangs) A e umatopoisomerase.

4.2 Isolamento de terminador de interesse incluindo aregião não traduzida 3

Fragmento de DNA genômico contendo as regiões nãotraduzidas 3' de interesse foram isolados usando iniciadores específicos deseqüências baseados nas seqüências que descritas em bancos de dadospúblicos (Número de acesso do GenBank de AB023482, AJ131535, Zl 1754;Tabela 8). Isolamento de DNA genômico de planta e amplificação por PCRconvencional usando os iniciadores específicos de seqüência foramconduzidos usando os protocolos na arte (Sambrook, 1987).

Tabela 8: Seqüências de iniciador para isolamento de região determinador

<table>table see original document page 223</column></row><table>

As seqüências de iniciador dadas na tabela acima representama parte-3' do iniciador real usado. Os citados iniciadores compreenderamadicionalmente um adaptador de sítio de restrição Sacl (5'- GAGCTC -3')para o iniciador direto e um adaptador de sítio de restrição PmeI (5'-GTTTAAAC -3') para o iniciador inverso (adicionado nos iniciadoresespecíficos de seqüência para propósito de clonagem posterior.

4.3 Vetor baseado em pUC (promotor de interesse::íntron(IME):: GUS:: terminador)

O vetor base (pBPSMM270) compreende múltiplos sítios declonagem (MCS) seguidos pelo primeiro íntron Zm.ubiquitina, a GUSintORP (incluindo o íntron de invertase de [PIV]2 para prevenir expressãobacteriana), e terminador de nopalina sintase (NOS) em ordem (5' para 3').Intron de ubiquitina de milho pode ser substituído por um íntron de interesseque funciona em intensificação mediada por íntron em BglI e Xmal.

O fragmento de DNA genômico contendo o promotor deinteresse (promotor Os.CCoAMTl, Os.SI, Zm.HRGP, Zm.LDH, ouOs.CP12) no vetor Topo (Invitrogen) foi digerido com PacI e Ascl seguidopor subclonagem a montante de íntron Zm.ubiquitina no construto GUS.

O fragmento de PCR contendo o terminador de interesse (e.g.DNA genômico de arroz de 1.092 pb incluindo o terminador CCoAMT1;DNA genômico de milho de 558 pb incluindo o terminador HRGP, DNAgenômico de milho de 477 pb incluindo o terminador LDH) foi digerido comenzimas Sael e PmeI. Região de terminador de nopalina sintase foi substituídapelo terminador de interesse.

Com o objetivo de incluir uma etiqueta miRNA na região determinador, as seqüências complementares (a até 21 pb) dos miRNAs deinteresse (Tabela 9) são quimicamente sintetizadas incluindo um sítio deenzima de restrição Sacl em ambas as extremidades 5' e 3'da seqüênciaseguido por subclonagem entre o gene GUS e o terminador de interesse. Aetiqueta pode ser inserida em 5'UTR ou 3'UTG ou na região codificadora dogene-de-interesse sem afetar a função do gene.

Tabela 9: Seqüências de etiqueta BPS miRNA e os padrões de expressão

<table>table see original document page 224</column></row><table>

4.4 Transformação de vetor binário (construtos depromotor sem uma etiqueta miRNA)

Os cassetes quiméricos GUS nos vetores baseados em pUCforam digeridos com AseI ou Pacl (5') e Pmel (3') e subclonados em umvetor binário de monocotiledônea contendo um cassete de marcadorselecionável de planta (pBPSMM344) em sítios Ascl ou Pacl (5') e PmlI (3')para gerar construtos de promotor para transformação de planta (Tabela 10).

Tabela 10: Construtos de promotor sem uma etiqueta miRNA em um vetorbinário

<table>table see original document page 225</column></row><table>

Os promotores descritos acima são preferivelmentemelhorados para especificidade de promotor mais alta com etiquetas miRNAcomo segue: o promotor Os CCoAMT com íntron ubiquitina (pBPSMM271)ou o promotor Zm LDH com íntron ubiquitina (pBPSMM272) são fortementeativos em raízes e semente. Pelo uso de uma etiqueta Zm miR167, aexpressão em semente é eliminada e gene-de-interesse torna-sepredominantemente expressado em raízes.

O promotor Os CP12 com íntron ubiquitina é fortemente ativoem folhas, mas médio em endosperma, e nenhuma atividade é observada emraízes e embriões. Pelo uso de etiqueta Zm miR167, a expressão emendosperma é eliminada e o gene-de-interesse se torna expressadopredominantemente em folhas. Alternativamente, pelo uso de uma etiquetaZm miR166h, expressão em folhas é reduzida ou eliminada e o gene-de-interesse é expressado predominantemente em endosperma.

O promotor Os SI com íntron ubiquitina é fortemente ativo emraízes e semente, mas fracamente em folhas. Pelo uso de uma etiqueta ZmmiR166h, expressão em folhas é eliminada e o gene-de-interesse épredominantemente expressado em raízes.

Uma etiqueta miRNA pode ser introduzida no início doterminador após o códon de terminação do gene GUS usando métodos declonagem padrão e PCR. Por exemplo, a inserção pode ser realizada pelautilização de um sítio de SacI incomum (Sac I e Pac I são sítios incomunspara remover terminador NOS de pBPSMM271). A etiqueta-miRNA paramiR166h é incorporada na região de terminador NOS por PCR com osseguintes iniciadores:

Iniciador direto (SEQ ID NO: 209): 5 '-GGGAGCTCGGGGAATGAAGCCTGGTCCGAgaatttccccgatcgttcaaacatttggca

(O sítio SacI está sublinhado; a etiqueta miR166h está emnegrito.

Iniciador inverso (SEQ ID NO: 210): 5' TCGGACCGTTAATTAACACAAACTGAAGGC

O sítio Pac I está sublinhado.

O DNA molde é o vetor antes da inserção da etiqueta-miRNA.O produto de PCR é subseqüentemente cortado com enzimas de restrição SacI e Pac I. Este fragmento é então 'trocados' por fragmento Sac I-Pac I emMM271 por subclonagem. Esta estratégia pode ser usada para engenharetiquetas miRNA em terminador NOS de outros vetores binários tais comopBPS MM 272, MM232 e MM304.

Exemplo 5: Engenharia de vetor binário com etiquetasmiRNA específicas para tecido para selecionar DsRed mRNA alvo

Um vetor binário, pBPSLM185 (SEQ ID NO: 212), contémum construto de gene repórter de expressão: promotor ScBV (1398pb), umDsRed cDNA de comprimento total (678pb) e um terminador NOS (253pb).Promotor ScBV foi associado com badnavírus baciliforme de cana-de-açúcar(Schenk et al., Plant Mol Biol. 39:1221-1230, (2004))). DsRed é proteínafluorescente vermelha de coral de recife Discosoma sp. (Baird, G. S., et al., Proc.Natl. Acas. Sci USA 97:11984-11989, (2000)). Terminador NOS é região nãotraduzida 3'de gene de nopalina sintase de Agrobacterium. Em milhotransgênico transportando o construto LMl85, fluorescência vermelha fortefoi prontamente detectada através de plantas por análise de microscopia defluorescência. A análise quantitativa de expressão de DsRed foi realizada pelouso de um instrumento de imagem (Typhoon 9400, Amersham Biosciences).

A expressão ubíqua de DsRed foi resultada do promotor ScBV que é ativo emtodos os tecidos de milho.

Para reduzir ou eliminar a expressão de DsRed em estigma efolha de milho, um vetor binário modificado LM185, PR100, é construído.Em vetor PRl 00, uma 'etiqueta' ou seqüência de nucleotídeos curta é clonadana região de terminador NOS por PCR usando LMl 85 DNA como um molde.

Iniciador direto (SEQ ID NO: 209): 5 -GGGAGCTCGGGGAATGAAGCCTGGTCCGAgaatttccccgatcgttcaaacatttggca

(o sítio SacI está sublinhado; a etiqueta miR166h está emnegrito).

Iniciador inverso (SEQ ID NO: 211): 5' GATCTGGCCGGCCGGGCCCGAATTC

O sítio FseI está sublinhado.

O produto de PCR é subseqüentemente cortado com enzimasde restrição Sac I e FseI. Este fragmento é então 'trocado' por fragmento SacI-FseI em LMl 85 por subclonagem. O produto de PCR resultante contém 'etiqueta 1' no início do terminador NOS. Os sítios de restrição em cadaextremidade do produto de PCR facilitam a subclonagem de tal terminadorNOS modificado no vetor binário após seqüência codificadora de DsRed. Estaestratégia aplica-se à introdução de quaisquer etiquetas miRNA em cassete deexpressão. A seqüência de 'etiqueta 1', 5' GGGGAATGAAGCCTGGTCCGA 3' (SEQ ID NO: 82) é completamente complementar a miRNAmiR166h de milho, 5' TCGGACCAGGCTTCATTCCCC 3'. Milhotrangênico trazendo PRlOO expressa DsRed mRNA com uma 'etiqueta 1' emtodo tecido de milho. Devido ao fato de miR166h ser apenas expressado emfolhas e estigmas, miR166h reconhece e liga na 'etiqueta' especificamente emDsRed mRNA nas folhas e nos estigmas. Como um resultado, níveis deDsRed mRNA nestes tecidos são reduzidos ou eliminados por meio desilenciamento de gene mediado por miRNA. A fluorescência vermelha éreduzida ou indetectável em folhas e estigmas mas não é afetada em outrostecidos.

Tem sido mostrada tanto em animal quanto em planta,complementaridade entre região 5' e miRNA (e.g. posição 2-8 nt) e sítio alvode miRNA é crucial para ação de miRNA (Mallory et al., EMBO Journal,23:3356-3364, (2004), Doench J e Sharp P, Genes & Development 504-511,(2004) ), enquanto que região 3' de miRNA (e.g. posição 12-19 nt) pode sermal combinada em seu sítio alvo. Tal má combinação pode reduzir e eficáciade silenciamento de gene mediado por miRNA.

Um vetor binário, PRl01, é igual a PR100 exceto que 'etiqueta2' é usada no lugar de 'etiqueta 1'. A 'etiqueta 2', 5' GGGGAATGAAGCgTGGaCCGA 3' (SEQ ID NO: 82) contém duas mutações'C para g' e 'Tpara a' comparando com 'etiqueta 1'. Isto resulta em duas más combinaçõesentre 'etiqueta 2' e miR166h. Milho transgênico trazendo PRlOl temreduzido fluorescência vermelha em folhas e estigmas. Além disso, análisequantitativa sobre eventos múltiplos de milho transgênico trazendo PR100 ouPRlOl usando um instrumento de imagem (e.g. Typhoon 9400) mostra queestatisticamente a intensidade de fluorescência vermelha de milho PR100 émenor do que a de milho PR101 em folhas e estigmas. Isto é porque acomplementaridade perfeita entre 'etiqueta 1' e miR166h em PR100 causaredução grande de expressão de DsRed, enquanto que más combinações entre'etiqueta 2' e miR166h em PR101 causam redução menor de expressão deDsRed em folhas e estigmas.

Exemplo 6: Engenharia de vetor binário com etiquetasmiRNA específicas para tecido para selecionar um gene de feição oumarcador de seleção

Sementes são o produto agronômico mais relevante, que épesadamente usado para propósitos de alimentação e de ração. Contudo,expressão de transgenes em sementes é na maioria dos casos não necessárianem benéfica. Por exemplo, feições como resistência a herbicida, resistênciacontra insetos, fungos, ou nematódeo, resistência ao frio ou à seca nãonecessitam ser expressadas em sementes, porque a expressão é apenasrequerida em raízes ou tecidos verdes. Expressão em sementes pode possuiruma ou mais das seguintes desvantagens:

1. Expressão desnecessária de características em sementes podeacarretar taxas de germinação menores ou consumo pelo menosdesnecessário da capacidade de transcrição / tradução resultando emperda de rendimento ou afetando negativamente a composição dasemente.

2. Expressão desnecessária de feições em sementes pode elevarbarreiras mais altas em procedimentos de desregulação (porque umaquantidade mais substancial do produto transgênico é compreendidaem materiais de ração ou de alimento).

3. Expressão desnecessária de feições em sementes pode afetarnegativamente a aceitação do consumidor.

Flores compreendem órgão reprodutivos de plantas (carpelos eestames). Expressão nestes tecidos é para algumas feições tambémconsiderada desvantajosa. Por exemplo, expressão da proteína Bt (conferindoresistência contra broca de raiz de milho e outras pestes de inseto) sob umpromotor constitutivo forte resultou em expressão em pólen e foi discutidapara possuir um efeito tóxico sobre insetos transferidores de pólen benéficoscomo as borboletas monarca.

Uma mutação pontual de um único nucleotídeo em geneAHAS (aceto-hidróxi-ácido sintase) gera resistência ao herbicidaimidazolinona. Uma versão mutada de AHAS também é usada como ummarcador de seleção para transformação de colheita para aplicação comercial.Para eliminar marcador AHAS nas sementes, um vetor binário trazendoetiqueta miR-167 pode ser construído. miR167 de milho épredominantemente expressado em sementes incluindo estágios diferentes dedesenvolvimento de semente. Em um vetor binário PRl 02, promotor Ubidirige expressão de AHAS. Após AHAS cDNA, uma 'etiqueta' ou seqüênciade nucleotídeos curta é clonada em terminador NOS por PCR e procedimentode clonagem padrão. A seqüência 'etiqueta 3', 5' ACAGATCATGCTGGCAGCTTCA 3' (SEQ ID NO: 80) é completamente complementar a miRNAmiR167 de milho, 5' TGAAGCTGCCAGCATGATCTGT 3'. Milhotransgênico trazendo PRl02 expressa AHAS mRNA com uma 'etiqueta 3'emtodo tecido de milho. Devido ao fato de miR167 ser predominantementeexpressado em sementes, miR167 reconhece e liga a 'etiqueta'especificamente em AHAS mRNA nas sementes. Como um resultado, níveisde AHAS mRNA em sementes são reduzidos ou eliminados por meio desilenciamento de gene mediado por miRNA. A expressão de AHAS em outrostecidos é grandemente não afetada determinada por análise de Western blotusando um anticorpo especificamente reconhece uma AHAS mutada.

EXEMPLO 7. De expressão constitutiva para expressãoespecífica em semente ou específica em tecido vegetativo

7.1 Expressão constitutiva [sem uma etiqueta miRNA]

Em comparação com promotor de ubiquitina de milho(promotor Zm.ubiquitina:: íntron Zm.ubiquitina) e promotor de vírusbaciliforme de cana-de-açúcar (pBPSMM247), promotor CCoAMTl de arrozem combinação com íntron Zm.ubiquitina e terminator CCoAMTl(pBPSMM325) mostrou expressão ubíqua e constitutiva forte em todos ostecidos e órgãos em estágios de desenvolvimento diferentes. Expressãoubíqua forte também pode ser detectada em plantas in vitro.

Tabela 11: Expressão de GUS controlada por candidatos a promotorconstitutivo de monocotiledônea

<table>table see original document page 231</column></row><table>

*Controles positivos como promotor constitutivo (pBPSMM232=promotorZm.ubiquitina: :íntron Zm.ubiquitina: :GUS (PIV2)::terminador NOS;

pBPSMM247=promotor de vírus baciliforme de cana-de-açúcar: :GUS (PIV2) ::terminadorNOS); pBP SMM3 25=promotor Os.CCoAMTl:: íntron Zm.ubiquitina:: GUS(PIV)2::terminador Os.CCoAMTl; uma faixa de níveis de expressão de GUS medida porensaio histoquímico (- a +++++), ND: ainda não determinado

7.2 Expressão específica em semente ou específica emtecido vegetativo controlada por etiqueta miRNA na região dePara controlar a expressão quer específica em semente querespecífica em raiz, BPS.MRT1 ou BPS.MRT2 é inserido entre o gene GUSgene e o terminador NOS em sítio Sacl em pBPSMM271, pBPSMM272,pBPSMM331, pBPSET003, ou pBPSET007 para gerar pBPSPR007 oupBPSPR008, pBPRPR009 ou pBPSPROlO, pBPRPROll ou pBPSPR012,pBPRPR013 ou pBPSPR014, ou pBPRPR015 ou pBPSPROló,respectivamente. Um construto quimérico composto de uma etiqueta miRNApode ser transformado em plantas monocotiledôneas ou dicotiledôneas taiscomo arroz, cevada, milho, trigo, raigrás, Arabidoposis, canola, feijão-soja,tabaco, mas não é restrito a estas espécies de planta. Quaisquer métodos paramelhorar a expressão em plantas monocotiledôneas são aplicáveis tais comoadição de íntron ou exon com íntron em 5'UTR quer editorado quer nãoeditorado. Métodos padrão para transformação na arte podem ser usados serequeridos. Plantas transformadas são selecionadas sob o agente de seleção deinteresse e regeneradas usando métodos conhecidos. Esquema de seleção éexaminado em estágios de desenvolvimento inicial de tecidos ou de células decultura de tecido. Níveis de expressão de gene podem ser determinados emestágios diferentes de desenvolvimento e em gerações diferentes (plantas TO aT2 ou outras gerações). Resultados da avaliação em plantas acarretam adeterminação de genes apropriados a serem usados neste construto depromotor.

EXEMPLO 9. De expressão preferível em endosperma eem folha para expressão específica em folha ou endosperma

9.1 Expressão proferível em folha e endosperma [sem umaetiqueta miRNA]

Promotor Os.CP12::íntron Zm.ubiquitina::GUS(PIV2)::terminador NOS (pBPSMM304) mostrou expressão forte em folhas eendosperma, mas não em raízes ou embrião.

Tabela 13: Expressão de GUS controlada pelo promotor de monocotiledôneaconstruto de promotor.

EXEMPLO 10: Determinação de perfil de microRNAmaduro

Determinação de perfil de expressão de miRNA maduro emtecidos de milho foi obtida usando os 46 ensaios de miRNA de Arabidopsisthaliana (Ath) desenvolvidos por Applied Biosystems (Chen et ai. 2005,Nucleic Acids Research. 33:el79). Tabela 14 representa as 46 seqüências demiRNA que foram usadas para a determinação do perfil.

RNA total de 11 amostras de milho diferentes (Tabela 14) foiextraído com reagente Trizol seguindo a instrução recomendada pelofabricante (Invitrogen 15596-026). Subunidade C de gliceraldeído-3-fosfatodesidrogenase (GADPH) de milho foi usada como um controle interno paranormalizar a expressão de miRNA dentre as diferentes amostras de tecido.

Tabela 14. Seqüência de miRNA para a determinação de perfil

<table>table see original document page 233</column></row><table><table>table see original document page 234</column></row><table>

Tabela 15. Materiais de milho usados para a determinação de perfil demiRNA

<table>table see original document page 234</column></row><table><table>table see original document page 235</column></row><table><table>table see original document page 236</column></row><table><table>table see original document page 237</column></row><table>EXEMPLO 11. Construção de vetores binários cometiquetas miRNA

Baseado em determinação de perfil de expressão de miRNA,vários vetores binários foram construídos em tal modo que uma seqüência denucleotídeos curta quase complementar ao miRNA foi incorporada em 3'UTR de dsRed. RPR40 (SEQ ID NO: 216) foi um controle negativo no qualexpressão de dsRed esteve sob o controle de promotor ScBV e de terminadorNOS. Dois sítios de enzima de restrição incomuns, Sac I e Ava II, localizadosentre o códon de terminação de tradução 'TAG' de dsRed e o terminadorNOS foram usados para inserir uma seqüência de nucleotídeos curta para criarRPR41, RPR42, RPR43, RPR44 e RPR45, respectivamente. Cada seqüênciade nucleotídeos curta foi determinada por análise da região de mRNApotencialmente selecionada por miRNA. Por exemplo, milho brilhoso 15 éselecionado por miR172 na região 5' CTGCAGCATCATCAGGATTCC 3'(i.e. etiqueta miRNA) que é quase complementar ao miR172, 5'AGAAUCUUGAUGAUGCUGCAC 3'. Um oligo curto (SEQ ID NO: 220)contendo a região alvo miR172 mais 5 nt a montante e a jusante, e sítios Sac Ie Ava II foi quimicamente sintetizado. Este oligo curto foi então subclonadoem RPR40 para criar RPR42.

Tabela 17. Vectores e etiquetas miRNA usdos para controle de mutação deatividade subnormal

<table>table see original document page 238</column></row><table><table>table see original document page 239</column></row><table>

EXEMPLO 12 Silenciamento de gene de DsRed2etiquetado com miRNA em calo de milho

12.1 Geração de calos transgênicos

Embriões de milho imaturos foram transformados comAgrobacterium contendo qualquer um dos plasmídeos RPR40, RPR41, ouRPR42. Os procedimentos de transformação e de seleção são modificados deIshida et ai. (1996, Nature Biotech 14:745-749). Embriões imaturos foramexcisados e colocados em meio de infecção. Meio de infecção foi removido esubstituído por uma suspensão de Agrobacterium pré-induzida por 1-4 horasem meio de infecção contendo acetosiringona 200 μΜ. Agrobaeterium eembriões permaneceram em líquido por 30 minutos para infecção. Apósinfecção, solução de Agrobaeterium foi removida e os embriões foramdeixados sobre meio de co-cultura (modificado de Ishida com a adição de 150mg/L L-cisteína). Co-cultura foi permitida ocorrer por 2-3 Dias. Após co-cultua, os embriões foram deixados sobre um meio de recuperação contendoantibióticos para inibir o crescimento de Agrobaeterium por 7-10 Dias. Osembriões que formaram calo foram deixados sobre um meio de seleção capazde suprimir o crescimento de tecido não transformado.

12.2 Identificação de calos transgênicos e análise denúmero de cópias

O número de cópias de transgene em calos de milhotransformados com RPR40 e RPR41 foi determinado por análise TaqMan(Ingham et al„ 2001, Biotechniques 31:132-4, 136-40). A sonda TaqMan foiescolhida para selecionar terminador NOS, que está localizado a jusante deDsRed2s como uma região comum nestes construtos. Apenas caules de milhotransgênicos foram usados para a seguinte análise de expressão para DsRed2.

12.3 Isolamento de RNA de calo de milho transgênicoTecidos de calor foram moídos em um almofariz com pilão emnitrogênio líquido pela adição de 600 pL de solução de lise/ligação (mirVanamiRNA Isolation Kit, Ambion, Inc. Austin, TX) com o objetivo de extrair oRNA total baseado em protocolo de isolamento de RNA total de mirVana. ORNA isolado foi DNase-tratado com DNA-free (Ambion, Inc) seguindo oprotocolo do fabricante.

12.4 Quantificação de DsRed RNA

DsRed2 e os cDNAs de primeira fita GpCl de milho endógenoforam sintetizados do RNA isolado de caules transgênicos de milho RPR40 eRPR41. RNA foi reversamente transcrito com o ImProm-II ReverseTranscription System (Promega, Madison, WI) usando iniciadores específicosDsRed e GpCle seguindo o protocolo do fabricante. Os níveis relativos deDsRed2 RNA dos caules transgênicos RPR40 e RPR41 foram determinadospor Taqman PCR quantitativa usando sondas específicas para DsRed2 eGpC 1. cDNA de primeira fita sintetizado de RNA total de calo foi usadocomo molde. O ensaio TaqMan foi realizado como para a análise do númerode cópias. Para comparar as quantidades relativas de DsRed2 RNA entrecaules, os dados foram primeiro normalizados para controle endógeno deGpCl interno. Quantificação de DsRed2 RNA foi repetida 3 vezes para cadaamostra de RNA.

12.5 Fluorescência é reduzida em caules de milhoexpressando DsRed2 etiquetada com os sítios de ligação de 319 e 172miRNA

Caules transgênicos putativos contendo os plasmídeos RPR40,RPR41, e RPR42 foram examinados para fluorescência de DsRed2 sob ummicroscópio (Zeiss Stemi SVl 1) equipado com filtro de rodamina e UV. Aintensidade de fluorescência foi registrada como alta, média, baixa e nenhuma(veja Tabela 18).Tabela 18. Expressão fluorescente de DsRed2 de caules transgênicos

<table>table see original document page 241</column></row><table>

12.5 DsRed2 RNA etiquetado com miRNA ésignificativamente reduzido em caules de milho

Cada agrupamento de caules analisados foi confirmado paraser transgênico por TaqMan PCR quantitativa. Este ensaio tambémproporcionou um número de cópias de construtos de DsRed2 integrados emcada agrupamento de caules. Para comparar os níveis relativos de DsRed2RNA nas populações de caules RPR40 e RPR41, RNA foi isolado de caulespositivos transgênicos individuais e a quantidade de DsRed2 RNA foideterminada por análise TaqMan quantitativa. O DsRed2 RNA é grandementereduzido em caules transgênicos RPR41 comparados com caules RPR40(Tabela 19). A diferença em níveis de DsRed2 RNA entre populações decaules RPR40 e RPR41 é significativa com um valor de ρ de 0,0026.

Tabela 19. Expressão de DsRed2 mRNA de caules transgênicos

<table>table see original document page 241</column></row><table>LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> BASF Plant Science GmbH

<120> Métodos melhorados de controle

<130> PF 56539 PCT

<160> 266

<170> PatentIn versão 3.3

<210> 1

<211> 21

<212> RNA

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 1

ugccuggcuc ccuguaugcc a

<210> 2

<211> 24

<212> RNA

<213> Arabidopsis thaliana

<4 00> 2

uugaagagga cuuggaacuu cgau

<210> 3

<211> 21

<212> RNA

<213> Arabidopsis thaliana

<4 00> 3

ugaagcugcc agcaugaucu a

<210> 4

<211> 21

<212> RNA

<213> Arabidopsis thaliana

<4 00> 4

agaaucuuga ugaugcugca u

<210> 5

<211> 20

<212> RNA

<213> Arabidopsis thaliana

<4 00> 5

uuggacugaa gggagcuccc

de expressão de gene

21

24

21

<210> 6

<211> 21

<212> RNA

<213> Oryza sativa<400> 6

ugacagaaga gagugagcac a

21

<210> 7

<211> 21

<212> RNA

<213> Oryza sativa

<4 00> 7

cgacagaaga gagugagcau a 21

<210> 8

<211> 21

<212> RNA

<213> Oryza sativa

<210> 9

<211> 21

<212> RNA

<213> Oryza sativa

<400> 9

ugccuggcuc ccugaaugcc a 21

<210> 10

<211> 21

<212> RNA

<213> Oryza sativa

<210> 11

<211> 21

<212> RNA

<213> Oryza sativa

<4 00> 11

uggagaagca gggcacgugc a 21

<210> 12

<211> 21

<212> RNA

<213> Oryza sativa

<4 00> 8

uuuggauuga agggagcucu g

21

<4 00> 10

ucgauaaacc ucugcaucca g

21

<4 00> 12

uggagaagca gggcacgugc u

21

<210> 13<211> 21<212> RNA

<213> Oryza sativa<400> 13

ucggaccagg cuucauuccc c

21

<210> 14

<211> 21

<212> RNA

<213> Oryza sativa

<4 00> 14

ugaagcugcc agcaugaucu g 21

<210> 15

<211> 21

<212> RNA

<213> Oryza sativa

<210> 16

<211> 21

<212> RNA

<213> Oryza sativa

<4 00> 16

uagccaagga ugacuugccu a 21

<210> 17

<211> 21

<212> RNA

<213> Oryza sativa

<210> 18

<211> 21

<212> RNA

<213> Oryza sativa

<4 00> 18

ugauugagcc gugccaauau c 21

<210> 19

<211> 21

<212> RNA

<213> Oryza sativa

<4 00> 15

ucgcuuggug cagaucggga c

21

<4 00> 17

uagccaagga ugacuugccu g

21

<4 00> 19

uuauugagug cagcguugau g

21

<210> 20<211> 21<212> RNA

<213> Oryza sativa<400> 20

uguguucuca ggucaccccu u

21

<210> 21

<211> 21

<212> RNA

<213> Oryza sativa

<400> 21

ugccaaagga aauuugcccc g 21

<210> 22

<211> 20

<212> RNA

<213> Zea mays

<210> 23

<211> 21

<212> RNA

<213> Zea mays

<400> 23

uuuggauuga agggagcucu a 21

<210> 24

<211> 21

<212> RNA

<213> Zea mays

<210> 25

<211> 21

<212> RNA

<213> Zea mays

<4 00> 25

ucggaccagg cuucauuccc c 21

<210> 26

<211> 22

<212> RNA

<213> Zea mays

<400> 22

ugacagaaga gagugagcac

20

<4 00> 24

ugccuggcuc ccuguaugcc a

21

<400> 26

ugaagcugcc agcaugaucu gg

22

<210> 27<211> 21<212> RNA

<213> Zea mays<400> 27

ugauugagcc gcgccaauau

<210> 28

<211> 20

<212> RNA

<213> Zea

<400> 28agcucaggag

<210> 29

<211> 20

<212> RNA

<213> Zea

<4 00> 29aagcucagga

<210> 30

<211> 21

<212> RNA

<213> Zea

<4 00> 30agcucaggag

<210> 31

<211> 20

<212> RNA

<213> Zea

<4 00> 31ugacagaaga

<210> 32

<211> 21

<212> RNA

<213> Zea

<4 00> 32uugacagaag

<210> 33

<211> 21

<212> RNA

<213> Zea

<4 00> 33gugacagaag

<210> 34

<211> 21

<212> RNA

<213> Zea

mays

ggauagcgcc

mays

gggauagcgc

mays

ggauagcgcc

mays

gagugagcac

mays

agagugagca

mays

agagugagca

mays<400> 34

ugacagaaga gagugagcac a

21

<210> 35

<211> 21

<212> RNA

<213> Zea mays

<400> 35

uuuggauuga agggagcucu a 21

<210> 36

<211> 21

<212> RNA

<213> Zea mays

<210> 37

<211> 21

<212> RNA

<213> Zea mays

<4 00> 37

ucuuuggauu gaagggagcu c 21

<210> 38

<211> 20

<212> RNA

<213> Zea mays

<210> 39

<211> 21

<212> RNA

<213> Zea mays

<4 00> 39

ugccuggcuc ccuguaugcc a 21

<210> 40

<211> 22

<212> RNA

<213> Zea mays

<4 00> 36

uuuggauuga agggagcucu u

21

<4 00> 38

uuuggauuga agggagcucu

20

<4 00> 40

ugccuggcuc ccuguaugcc au

22

<210> 41<211> 20<212> RNA

<213> Zea mays<400> 41

gccuggcucc cuguaugcca

20

<210> 42

<211> 21

<212> RNA

<213> Zea mays

<4 00> 42

ucggaccagg cuucauuccc c 21

<210> 43

<211> 22

<212> RNA

<213> Zea mays

<210> 44

<211> 22

<212> RNA

<213> Zea mays

<4 00> 44

uucggaccag gcuucauucc cc 22

<210> 45

<211> 21

<212> RNA

<213> Zea mays

<210> 46

<211> 22

<212> RNA

<213> Zea mays

<4 00> 46

ugaagcugcc agcaugaucu gg 22

<210> 47

<211> 20

<212> RNA

<213> Zea mays

<4 00> 43

ucggaccagg cuucauuccc cc

22

<4 00> 45

uucggaccag gcuucauucc c

21

<4 00> 47

ugaagcugcc agcaugaucu

20

<210> 48<211> 21<212> RNA

<213> Zea mays<400> 48

ugaagcugcc agcaugaucu g

21

<210> 49

<211> 22

<212> RNA

<213> Zea mays

<400> 49

ugaagcugcc agcaugaucu au 22

<210> 50

<211> 22

<212> RNA

<213> Zea mays

<210> 51

<211> 22

<212> RNA

<213> Zea mays

<4 00> 51

gugaagcugc cagcaugauc ua 22

<210> 52

<211> 21

<212> RNA

<213> Zea mays

<210> 53

<211> 21

<212> RNA

<213> Zea mays

<4 00> 53

ugauugagcc gcgccaauau c 21

<210> 54

<211> 20

<212> RNA

<213> Zea mays

<4 00> 50

augaagcugc cagcaugauc ua

22

<4 00> 52

ugauugagcc gugccaauau c

21

<4 00> 54

ugauugagcc gcgccaauau

20

<210> 55<211> 21<212> RNA

<213> Zea mays<400> 55

aagcucagga gggauagcgc c

<210> 56

<211> 21

<212> RNA

<213> Mus musculus

<400> 56

uggaauguaa agaaguaugu a

<210> 57

<211> 23

<212> RNA

<213> Mus musculus

<4 00> 57

ucuuugguua ucuagcugua uga

<210> 58

<211> 23

<212> RNA

<213> Mus musculus

<4 00> 58

uggaguguga caaugguguu ugu

<210> 59

<211> 22

<212> RNA

<213> Mus musculus

<4 00> 59

uuaaggcacg cggugaaugc ca

<210> 60

<211> 22

<212> RNA

<213> Mus musculus

<4 00> 60

ucacagugaa ccggucucuu uu

<210> 61

<211> 22

<212> RNA

<213> Mus musculus

<4 00> 61

uguaacagca acuccaugug ga

<210> 62

<211> 22

<212> RNA

<213> Mus musculus<400> 62

uggaauguaa ggaagugugu gg

<210> 63

<211> 21

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 63

uugugcuuga ucuaaccaug u

<210> 64

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador oligonucleotídeo<400> 64

caactactgc acggtaaaag tgatagg

<210> 65

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Iniciador oligonucleotídeo<400> 65

gcagcttgct tcgatctctc gctcgcc

<210> 66

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Iniciador oligonucleotídeo<400> 66

tgcctcgatt cgaccgtgta atggaat

<210> 67

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Iniciador oligonucleotídeo<400> 67

actcctggct tccttccgat ctggact

<210> 68<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Iniciador oligonucleotideo

<400> 68

ccggtgacct tcttgcttct tcgatcg

<210> 69

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Iniciador oligonucleotideo<4 00> 69

cctctctctc acacacactc tcagtaa

<210> 70

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Iniciador oligonucleotideo<4 00> 70

aacaaatggc gtacttatat aaccaca

<210> 71

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Iniciador oligonucleotideo<4 00> 71

cgggcggaat gggatgggat tacgtgt

<210> 72

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Iniciador oligonucleotideo<4 00> 72

tttgtattta ggtccctaac gccctc

<210> 73

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> Iniciador oligonucleotideo<400> 73

tgttgatgcg gatttctgcg tgtgat

<210> 74

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Iniciador oligonucleotideo<4 00> 74

gccgatgccc aagaactagt catttta

<210> 75

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Iniciador oligonucleotideo<4 00> 75

attaacacgt caaccaaacc gccgtcc

<210> 76

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Iniciador oligonucleotideo<4 00> 76

aaagcgatgc ctaccatacc acactgc

<210> 77

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Iniciador oligonucleotideo<4 00> 77

tgcccacatt tattatggtt ttacaccc

<210> 78

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Iniciador oligonucleotideo<400> 78

tgatcacatc accgtctctc ttcattaa

28

<210> 79

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Iniciador oligonucleotideo

<4 00> 79

tatcccagtc tcgatattgt catccgct 28

<210> 80

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> etiqueta-miRNA

<210> 81

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> etiqueta-miRNA

<4 00> 81

tagagctccc ttcaatccaa a 21

<210> 82

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> etiqueta-miRNA

<210> 83

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> etiqueta-miRNA

<4 00> 80

acagatcatg ctggcagctt ca

22

<4 00> 82

ggggaatgaa gcctggtccg a

21

<4 00> 83

ggggaatgaa gcgtggaccg a

21<210> 84

<211> 4880

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> construto de expressão pBPSMM232

<220>

<221> promotor

<222> (298) .. (2278)

<223> intron e promotor de Zm ubiquitina (1981bp)<220>

<221> caracteristica_misc

<222> (2305)..(4305)

<223> beta-glicuronidase GUS(2001bp)<220>

<221> caracteristica_misc

<222> (4365)..(4365)

<223> sitio de inserção de etiqueta miRNA (Sac I)<220>

<221> terminador

<222> (4376) .. (4628)

<223> terminador NOS(253 bp)

<400> 84

cgttcttccg aatagcatcg gtaacatgag caaagtctgc cgccttacaa cggctctccc 60

gctgacgccg tcccggactg atgggctgcc tgtatcgagt ggtgattttg tgccgagctg 120

ccggtcgggg agctgttggc tggctggtgg caggatatat tgtggtgtaa acaaattgac 180

gcttagacaa cttaataaca cattgcggac gtttttaatg tactgaattg actagtggcg 240

cgccaagctt gcatgcctgc aggtcgactc tagaggatcc ccatcgaatt cctgcagtgc 300

agcgtgaccc ggtcgtgccc ctctctagag ataatgagca ttgcatgtct aagttataaa 360

aaattaccac atattttttt tgtcacactt gtttgaagtg cagtttatct atctttatac 420

atatatttaa actttactct acgaataata taatctatag tactacaata atatcagtgt 480

tttagagaat catataaatg aacagttaga catggtctaa aggacaattg agtattttga 540

caacaggact ctacagtttt atctttttag tgtgcatgtg ttctcctttt tttttgcaaa 600

tagcttcacc tatataatac ttcatccatt ttattagtac atccatttag ggtttagggt 660

taatggtttt tatagactaa tttttttagt acatctattt tattctattt tagcctctaa 720

attaagaaaa ctaaaactct attttagttt ttttatttaa taatttagat ataaaataga 780

ataaaataaa gtgactaaaa attaaacaaa taccctttaa gaaattaaaa aaactaagga 840

aacatttttc ttgtttcgag tagataatgc cagcctgtta aacgccgtcg acgagtctaa 900

cggacaccaa ccagcgaacc agcagcgtcg cgtcgggcca agcgaagcag acggcacggc 960atctctgtcg ctgcctctgg acccctctcg agagttccgc tccaccgttg gacttgctcc 1020gctgtcggca tccagaaatt gcgtggcgga gcggcagacg tgagccggca cggcaggcgg 1080cctcctcctc ctctcacggc accggcagct acgggggatt cctttcccac cgctccttcg 1140ctttcccttc ctcgcccgcc gtaataaata gacaccccct ccacaccctc tttccccaac 1200ctcgtgttgt tcggagcgca cacacacaca accagatctc ccccaaatcc acccgtcggc 1260acctccgctt caaggtacgc cgctcgtcct cccccccccc ccctctctac cttctctaga 1320tcggcgttcc ggtccatggt tagggcccgg tagttctact tctgttcatg tttgtgttag 1380atccgtgttt gtgttagatc cgtgctgcta gcgttcgtac acggatgcga cctgtacgtc 1440agacacgttc tgattgctaa cttgccagtg tttctctttg gggaatcctg ggatggctct 1500agccgttccg cagacgggat cgatttcatg attttttttg tttcgttgca tagggtttgg 1560tttgcccttt tcctttattt caatatatgc cgtgcacttg tttgtcgggt catcttttca 1620tgcttttttt tgtcttggtt gtgatgatgt ggtctggttg ggcggtcgtt ctagatcgga 1680gtagaattct gtttcaaact acctggtgga tttattaatt ttggatctgt atgtgtgtgc 1740catacatatt catagttacg aattgaagat gatggatgga aatatcgatc taggataggt 1800atacatgttg atgcgggttt tactgatgca tatacagaga tgctttttgt tcgcttggtt 1860gtgatgatgt ggtgtggttg ggcggtcgtt cattcgttct agatcggagt agaatactgt 1920ttcaaactac ctggtgtatt tattaatttt ggaactgtat gtgtgtgtca tacatcttca 1980tagttacgag tttaagatgg atggaaatat cgatctagga taggtataca tgttgatgtg 2040ggttttactg atgcatatac atgatggcat atgcagcatc tattcatatg ctctaacctt 2100gagtacctat ctattataat aaacaagtat gttttataat tattttgatc ttgatatact 2160tggatgatgg catatgcagc agctatatgt ggattttttt agccctgcct tcatacgcta 2220tttatttgct tggtactgtt tcttttgtcg atgctcaccc tgttgtttgg tgttacttct 2280gcagcccggg taggtcagtc ccttatgtta cgtcctgtag aaaccccaac ccgtgaaatc 2340aaaaaactcg acggcctgtg ggcattcagt ctggatcgcg aaaactgtgg aattggtcag 2400cgttggtggg aaagcgcgtt acaagaaagc cgggcaattg ctgtgccagg cagttttaac 2460gatcagttcg ccgatgcaga tattcgtaat tatgcgggca acgtctggta tcagcgcgaa 2520gtctttatac cgaaaggttg ggcaggccag cgtatcgtgc tgcgtttcga tgcggtcact 2580cattacggca aagtgtgggt caataatcag gaagtgatgg agcatcaggg cggctatacg 2640ccatttgaag ccgatgtcac gccgtatgtt attgccggga aaagtgtacg taagtttctg 2700cttctacctt tgatatatat ataataatta tcattaatta gtagtaatat aatatttcaa 2760atattttttt caaaataaaa gaatgtagta tatagcaatt gcttttctgt agtttataag 2820tgtgtatatt ttaatttata acttttctaa tatatgacca aaatttgttg atgtgcaggt 2880atcaccgttt gtgtgaacaa cgaactgaac tggcagacta tcccgccggg aatggtgatt 2940accgacgaaa acggcaagaa aaagcagtct tacttccatg atttctttaa ctatgccgga 3000atccatcgca gcgtaatgct ctacaccacg ccgaacacct gggtggacga tatcaccgtg 3060gtgacgcatg tcgcgcaaga ctgtaaccac gcgtctgttg actggcaggt ggtggccaat 3120ggtgatgtca gcgttgaact gcgtgatgcg gatcaacagg tggttgcaac tggacaaggc 3180actagcggga ctttgcaagt ggtgaatccg cacctctggc aaccgggtga aggttatctc 3240tatgaactgt gcgtcacagc caaaagccag acagagtgtg atatctaccc gcttcgcgtc 3300ggcatccggt cagtggcagt gaagggcgaa cagttcctga ttaaccacaa accgttctac 3360tttactggct ttggtcgtca tgaagatgcg gacttgcgtg gcaaaggatt cgataacgtg 3420ctgatggtgc acgaccacgc attaatggac tggattgggg ccaactccta ccgtacctcg 3480cattaccctt acgctgaaga gatgctcgac tgggcagatg aacatggcat cgtggtgatt 3540gatgaaactg ctgctgtcgg ctttaacctc tctttaggca ttggtttcga agcgggcaac 3600aagccgaaag aactgtacag cgaagaggca gtcaacgggg aaactcagca agcgcactta 3660caggcgatta aagagctgat agcgcgtgac aaaaaccacc caagcgtggt gatgtggagt 3720attgccaacg aaccggatac ccgtccgcaa ggtgcacggg aatatttcgc gccactggcg 3780gaagcaacgc gtaaactcga cccgacgcgt ccgatcacct gcgtcaatgt aatgttctgc 3840gacgctcaca ccgataccat cagcgatctc tttgatgtgc tgtgcctgaa ccgttattac 3900ggatggtatg tccaaagcgg cgatttggaa acggcagaga aggtactgga aaaagaactt 3960ctggcctggc aggagaaact gcatcagccg attatcatca ccgaatacgg cgtggatacg 4020ttagccgggc tgcactcaat gtacaccgac atgtggagtg aagagtatca gtgtgcatgg 4080ctggatatgt atcaccgcgt ctttgatcgc gtcagcgccg tcgtcggtga acaggtatgg 4140aatttcgccg attttgcgac ctcgcaaggc atattgcgcg ttggcggtaa caagaaaggg 4200atcttcactc gcgaccgcaa accgaagtcg gcggcttttc tgctgcaaaa acgctggact 4260ggcatgaact tcggtgaaaa accgcagcag ggaggcaaac aatgaatcaa caactctcct 4320ggcgcaccat cgtcggctac agcctcggga attgctaccg agctcgaatt tccccgatcg 4380ttcaaacatt tggcaataaa gtttcttaag attgaatcct gttgccggtc ttgcgatgat 4440tatcatataa tttctgttga attacgttaa gcatgtaata attaacatgt aatgcatgac 4500gttatttatg agatgggttt ttatgattag agtcccgcaa ttatacattt aatacgcgat 4560agaaaacaaa atatagcgcg caaactagga taaattatcg cgcgcggtgt catctatgtt 4620actagatcgg gaattggcat gcaagcttgg cactggccgt cgttttacaa cgtcgtgact 4680gggaaaaccc tggcgttacc caacttaatc gccttgcagc acatccccct ttcgccagct 4740ggcgtaatag cgaagaggcc cgcaccgatc gcccttccca acagttgcgc agcctgaatg 4800gcgaatgcta gagcagcttg agcttggatc agattgtcgt ttcccgcctt cagtttgtgt 4860taattaacgg tccgaggcct 4880

<210> 85

<211> 4960

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> construto de expressão pBPSMM271

<220>

<221> promotor

<222> (227) .. (1260)

<223> promotor Os CCoAMTl (1034bp)

<220>

<221> intron

<222> (1319)..(2369)

<223> intron de Zm ubiquitina (1051bp)<220>

<221> caracteristica_misc

<222> (2389)..(4389)

<223> gene GUS beta-glicuronidase (2001bp)<220>

<221> caracteristica_misc

<222> (4450)..(4450)

<223> sitio de inserção de etiqueta miRNA (Sac I)<220>

<221> terminador

<222> (4461)..(4713)

<223> terminador NOS (253 bp)

<4 00> 85

gatgggctgc ctgtatcgag tggtgatttt gtgccgagct gccggtcggg gagctgttgg 60

ctggctggtg gcaggatata ttgtggtgta aacaaattga cgcttagaca acttaataac 120

acattgcgga cgtttttaat gtactgaatt gactagtggc gcgccaagct tgcatgcctg 180

caggtcgact ctagtaacgg ccgccagtgt gctggaattc gcccttcaac tactgcacgg 240

taaaagtgat aggaatcggt cggaaacagt attaatgttt ttattatttt tacaaaaacg 300

aattgaaata attggaaatt ttcatattta tatattaaac tattcagtat caacttcaat 360

tcgacgtcaa tagaaattag aaaagcataa ttatacacag taataggcgt tcaagatatt 420

attgttatta tttagttttg tggaaatggt atcaacgtga tcggaaaatt ttgtacatgt 480

tttcaccctg cgggatatct caattccttc tcctccctct accgccatat cagcacacgt 540

tttagagcac caatcataac ccataaatcc gtgggctact cacttattta atttatatgt

600gaattcgtga cctgactcac tcacatacta tcaaaaattt gtctcagtca cccatctcct 660tctttcctgg tccgataagg gtttatccta cggttcgacg gttatcacga tagtcgtgcg 720gttactgagg tataccgtga tttaaaaata tgataaagtt accgcaggtt ttaactgcgc 780ggtttggtaa acctgttcct cctcaccaac cttctcctcc ggtctcctta tgtgtctcac 840cgaggcgagc cgccgcgaga ccgcatggac gcggtccacg cacctggcgg tgcacctcct 900cctccccggc gaagaagacg tggaggagag taaatgagca atcaggccca cggcccaatc 960gccgtccacc acccaccacc ctcagcgacc caaaaccacc tcaccaaccc aactctgtac 1020cgtactgtac ccgccctccc ctcccactga cactccgggc ccacctgtcg gcgcgactct 1080tccacggtcc ccttctctcc tcagagattt tttccacgca ttttttaatt tttttttctg 1140cagttcacat gctcttctcc cactcttccg ccgcgctata taaaccgcgc gaggcgtcgt 1200tgcctcgtcg gcgaagtcaa tccggcgatc cccggcgagc gagagatcga agcaagctgc 1260aagggcgaat tctgcagata tccatcacac tggcggccgc tcgagcatgc atctagagga 1320tctcccccaa atccacccgt cggcacctcc gcttcaaggt acgccgctcg tcctcccccc 1380ccccccctct ctaccttctc tagatcggcg ttccggtcca tggttagggc ccggtagttc 1440tacttctgtt catgtttgtg ttagatccgt gtttgtgtta gatccgtgct gctagcgttc 1500gtacacggat gcgacctgta cgtcagacac gttctgattg ctaacttgcc agtgtttctc 1560tttggggaat cctgggatgg ctctagccgt tccgcagacg ggatcgattt catgattttt 1620tttgtttcgt tgcatagggt ttggtttgcc cttttccttt atttcaatat atgccgtgca 1680cttgtttgtc gggtcatctt ttcatgcttt tttttgtctt ggttgtgatg atgtggtctg 1740gttgggcggt cgttctagat cggagtagaa ttctgtttca aactacctgg tggatttatt 1800aattttggat ctgtatgtgt gtgccataca tattcatagt tacgaattga agatgatgga 1860tggaaatatc gatctaggat aggtatacat gttgatgcgg gttttactga tgcatataca 1920gagatgcttt ttgttcgctt ggttgtgatg atgtggtgtg gttgggcggt cgttcattcg 1980ttctagatcg gagtagaata ctgtttcaaa ctacctggtg tatttattaa ttttggaact 2040gtatgtgtgt gtcatacatc ttcatagtta cgagtttaag atggatggaa atatcgatct 2100aggataggta tacatgttga tgtgggtttt actgatgcat atacatgatg gcatatgcag 2160catctattca tatgctctaa ccttgagtac ctatctatta taataaacaa gtatgtttta 2220taattatttt gatcttgata tacttggatg atggcatatg cagcagctat atgtggattt 2280ttttagccct gccttcatac gctatttatt tgcttggtac tgtttctttt gtcgatgctc 2340accctgttgt ttggtgttac ttctgcagcc cgggtaggtc agtcccttat gttacgtcct 2400gtagaaaccc caacccgtga aatcaaaaaa ctcgacggcc tgtgggcatt cagtctggat 2460cgcgaaaact gtggaattgg tcagcgttgg tgggaaagcg cgttacaaga aagccgggca 2520attgctgtgc caggcagttt taacgatcag ttcgccgatg cagatattcg taattatgcg 2580ggcaacgtct ggtatcagcg cgaagtcttt ataccgaaag gttgggcagg ccagcgtatc 2640gtgctgcgtt tcgatgcggt cactcattac ggcaaagtgt gggtcaataa tcaggaagtg 2700atggagcatc agggcggcta tacgccattt gaagccgatg tcacgccgta tgttattgcc 2760gggaaaagtg tacgtaagtt tctgcttcta cctttgatat atatataata attatcatta 2820attagtagta atataatatt tcaaatattt ttttcaaaat aaaagaatgt agtatatagc 2880aattgctttt ctgtagttta taagtgtgta tattttaatt tataactttt ctaatatatg 2940accaaaattt gttgatgtgc aggtatcacc gtttgtgtga acaacgaact gaactggcag 3000actatcccgc cgggaatggt gattaccgac gaaaacggca agaaaaagca gtcttacttc 3060catgatttct ttaactatgc cggaatccat cgcagcgtaa tgctctacac cacgccgaac 3120acctgggtgg acgatatcac cgtggtgacg catgtcgcgc aagactgtaa ccacgcgtct 3180gttgactggc aggtggtggc caatggtgat gtcagcgttg aactgcgtga tgcggatcaa 3240caggtggttg caactggaca aggcactagc gggactttgc aagtggtgaa tccgcacctc 3300tggcaaccgg gtgaaggtta tctctatgaa ctgtgcgtca cagccaaaag ccagacagag 3360tgtgatatct acccgcttcg cgtcggcatc cggtcagtgg cagtgaaggg cgaacagttc 3420ctgattaacc acaaaccgtt ctactttact ggctttggtc gtcatgaaga tgcggacttg 3480cgtggcaaag gattcgataa cgtgctgatg gtgcacgacc acgcattaat ggactggatt 3540ggggccaact cctaccgtac ctcgcattac ccttacgctg aagagatgct cgactgggca 3600gatgaacatg gcatcgtggt gattgatgaa actgctgctg tcggctttaa cctctcttta 3660ggcattggtt tcgaagcggg caacaagccg aaagaactgt acagcgaaga ggcagtcaac 3720ggggaaactc agcaagcgca cttacaggcg attaaagagc tgatagcgcg tgacaaaaac 3780cacccaagcg tggtgatgtg gagtattgcc aacgaaccgg atacccgtcc gcaaggtgca 3840cgggaatatt tcgcgccact ggcggaagca acgcgtaaac tcgacccgac gcgtccgatc 3900acctgcgtca atgtaatgtt ctgcgacgct cacaccgata ccatcagcga tctctttgat 3960gtgctgtgcc tgaaccgtta ttacggatgg tatgtccaaa gcggcgattt ggaaacggca 4020gagaaggtac tggaaaaaga acttctggcc tggcaggaga aactgcatca gccgattatc 4080atcaccgaat acggcgtgga tacgttagcc gggctgcact caatgtacac cgacatgtgg 4140agtgaagagt atcagtgtgc atggctggat atgtatcacc gcgtctttga tcgcgtcagc 4200gccgtcgtcg gtgaacaggt atggaatttc gccgattttg cgacctcgca aggcatattg 4260cgcgttggcg gtaacaagaa agggatcttc actcgcgacc gcaaaccgaa gtcggcggct 4320tttctgctgc aaaaacgctg gactggcatg aacttcggtg aaaaaccgca gcagggaggc 4380aaacaatgaa tcaacaactc tcctggcgca ccatcgtcgg ctacagcctc gggaattgcg 4440taccgagctc gaatttcccc gatcgttcaa acatttggca ataaagtttc ttaagattga 4500atcctgttgc cggtcttgcg atgattatca tataatttct gttgaattac gttaagcatg 4560taataattaa catgtaatgc atgacgttat ttatgagatg ggtttttatg attagagtcc 4620cgcaattata catttaatac gcgatagaaa acaaaatata gcgcgcaaac taggataaat 4680tatcgcgcgc ggtgtcatct atgttactag atcgggaatt ggcatgcaag cttggcactg 4740gccgtcgttt tacaacgtcg tgactgggaa aaccctggcg ttacccaact taatcgcctt 4800gcagcacatc cccctttcgc cagctggcgt aatagcgaag aggcccgcac cgatcgccct 4860tcccaacagt tgcgcagcct gaatggcgaa tgctagagca gcttgagctt ggatcagatt 4920gtcgtttccc gccttcagtt tgtgttaatt aacggtccga 4960

<210> 86

<211> 5000

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> construto de expressão pBPSMM272

<220>

<221> promotor

<222> (255)..(1316)

<223> Promotor Zm LDH (1062bp)

<220>

<221> íntron

<222> (1355) .. (2405)

<223> íntron de ubiquitina (1051bp)

<220>

<221> caracteristica_misc<222> (2425) .. (4425)

<223> beta-glucuronidase GUS (2001bp)<220>

<221> caracteristica_misc<222> (4486) .. (4486)

<223> Sitio de inserção de etiqueta miRNA (Saci)<220>

<221> terminador<222> (4497) .. (4749)

<223> terminador NOS (253 bp): 4497-4749<400> 86

cccggactga tgggctgcct gtatcgagtg gtgattttgt gccgagctgc cggtcgggga 60

gctgttggct ggctggtggc aggatatatt gtggtgtaaa caaattgacg cttagacaac 120ttaataacac attgcggacg tttttaatgt actgaattga ctagtggcgc gccaagcttg 180catgcctgca ggtcgactct agatgcatgc tcgagcggcc gccagtgtga tggatatctg 240cagaattcgc ccttaacaaa tggcgtactt atataaccac aatgtactgg tgctgcgtca 300ttattttata ctacgcatat attattataa gtagagaaag ctcacaaaac catgcgcgcg 360cccccctgtt tgtttcggtc gctaattaca ccctttgtat cgttggttga tgatggtctc 420caccggccgt acgagtcatc gatcgttgat ttatttttat caccgacttg cacgcctttc 480gaacaaagac gcaacaaagg aaagcgaaag cgtcacgaac gaggttgttc cctgacagtt 540gttcgactaa tacaactgca agacactgaa taagcagtaa aaatcaatat agattaaagt 600taaacgaaca tgctcaacat cgaatactac tcatatgtgt tattattaag agaataccac 660caaggtagaa aagttaaagg acctaaactg ttgtgccggg agagttgtgc gacgaacaga 720tgtaaatatg ataaaataag ttcaaagttc atatagatag cacgatcaca cttagggcta 780gtttgaagcc ataaaaatgg aagagattaa atgagataaa attcacttat ttaattttaa 840ataagaagag agttttaacc cctctaattc tctccagtat tttagctcct aaactagctc 900ttacagcagt aaaagaccct tgatggtagc gtatgcaaag agaaggaact attcaatgaa 960ttgttttttt aatcactagt agtatggtgg gtaactgtcg tcaaccggcc ctatctactt 1020cagtttagtg aagcactaaa ccgcaccttg gtatgttcaa atttaagatt ttttttgaaa 1080cgaaacaatt ttaaccagcg gctccaaacc ggtgaagtgg tttggtcttt ggtgtggggc 1140cagggtatta atggaattga atatataaag agcagggtgg tggacctttc ccctcccacg 1200agtcgagtag ccattgccca ttgccattcc ttccttcctc cacagagaaa tccgatccgc 1260ggagatttga cccaaccaga tcatatcaca cacgtaatcc catcccattc cgcccgaagg 1320gcgaattcca gcacactggc ggccgttact agtggatctc ccccaaatcc acccgtcggc 1380acctccgctt caaggtacgc cgctcgtcct cccccccccc ccctctctac cttctctaga 1440tcggcgttcc ggtccatggt tagggcccgg tagttctact tctgttcatg tttgtgttag 1500atccgtgttt gtgttagatc cgtgctgcta gcgttcgtac acggatgcga cctgtacgtc 1560agacacgttc tgattgctaa cttgccagtg tttctctttg gggaatcctg ggatggctct 1620agccgttccg cagacgggat cgatttcatg attttttttg tttcgttgca tagggtttgg 1680tttgcccttt tcctttattt caatatatgc cgtgcacttg tttgtcgggt catcttttca 1740tgcttttttt tgtcttggtt gtgatgatgt ggtctggttg ggcggtcgtt ctagatcgga 1800gtagaattct gtttcaaact acctggtgga tttattaatt ttggatctgt atgtgtgtgc 1860catacatatt catagttacg aattgaagat gatggatgga aatatcgatc taggataggt 1920atacatgttg atgcgggttt tactgatgca tatacagaga tgctttttgt tcgcttggtt 1980gtgatgatgt ggtgtggttg ggcggtcgtt cattcgttct agatcggagt agaatactgt 2040ttcaaactac ctggtgtatt tattaatttt ggaactgtat gtgtgtgtca tacatcttca 2100tagttacgag tttaagatgg atggaaatat cgatctagga taggtataca tgttgatgtg 2160ggttttactg atgcatatac atgatggcat atgcagcatc tattcatatg ctctaacctt 2220gagtacctat ctattataat aaacaagtat gttttataat tattttgatc ttgatatact 2280tggatgatgg catatgcagc agctatatgt ggattttttt agccctgcct tcatacgcta 2340tttatttgct tggtactgtt tcttttgtcg atgctcaccc tgttgtttgg tgttacttct 2400gcagcccggg taggtcagtc ccttatgtta cgtcctgtag aaaccccaac ccgtgaaatc 2460aaaaaactcg acggcctgtg ggcattcagt ctggatcgcg aaaactgtgg aattggtcag 2520cgttggtggg aaagcgcgtt acaagaaagc cgggcaattg ctgtgccagg cagttttaac 2580gatcagttcg ccgatgcaga tattcgtaat tatgcgggca acgtctggta tcagcgcgaa 2640gtctttatac cgaaaggttg ggcaggccag cgtatcgtgc tgcgtttcga tgcggtcact 2700cattacggca aagtgtgggt caataatcag gaagtgatgg agcatcaggg cggctatacg 2760ccatttgaag ccgatgtcac gccgtatgtt attgccggga aaagtgtacg taagtttctg 2820cttctacctt tgatatatat ataataatta tcattaatta gtagtaatat aatatttcaa 2880atattttttt caaaataaaa gaatgtagta tatagcaatt gcttttctgt agtttataag 2940tgtgtatatt ttaatttata acttttctaa tatatgacca aaatttgttg atgtgcaggt 3000atcaccgttt gtgtgaacaa cgaactgaac tggcagacta tcccgccggg aatggtgatt 3060accgacgaaa acggcaagaa aaagcagtct tacttccatg atttctttaa ctatgccgga 3120atccatcgca gcgtaatgct ctacaccacg ccgaacacct gggtggacga tatcaccgtg 3180gtgacgcatg tcgcgcaaga ctgtaaccac gcgtctgttg actggcaggt ggtggccaat 3240ggtgatgtca gcgttgaact gcgtgatgcg gatcaacagg tggttgcaac tggacaaggc 3300actagcggga ctttgcaagt ggtgaatccg cacctctggc aaccgggtga aggttatctc 3360tatgaactgt gcgtcacagc caaaagccag acagagtgtg atatctaccc gcttcgcgtc 3420ggcatccggt cagtggcagt gaagggcgaa cagttcctga ttaaccacaa accgttctac 3480tttactggct ttggtcgtca tgaagatgcg gacttgcgtg gcaaaggatt cgataacgtg 3540ctgatggtgc acgaccacgc attaatggac tggattgggg ccaactccta ccgtacctcg 3600cattaccctt acgctgaaga gatgctcgac tgggcagatg aacatggcat cgtggtgatt 3660gatgaaactg ctgctgtcgg ctttaacctc tctttaggca ttggtttcga agcgggcaac 3720aagccgaaag aactgtacag cgaagaggca gtcaacgggg aaactcagca agcgcactta 3780caggcgatta aagagctgat agcgcgtgac aaaaaccacc caagcgtggt gatgtggagt 3840attgccaacg aaccggatac ccgtccgcaa ggtgcacggg aatatttcgc gccactggcg 3900gaagcaacgc gtaaactcga cccgacgcgt ccgatcacct gcgtcaatgt aatgttctgc 3960gacgctcaca ccgataccat cagcgatctc tttgatgtgc tgtgcctgaa ccgttattac 402040804140420042604320438044404500456046204680474048004860492049805000

<210> 87

<211> 4857

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> construto de expressão pBPSMM304

<220>

<221> terminador

<222> (426)..(678)

<223> complemento de terminador NOS (253 bp)<220>

<221> caracteristica_misc

<222> (694)..(694)

<223> Sitio de inserção de etiqueta miRNA (Sac I)<220>

<221> caracteristica_misc

<222> (749) .. (2749)

<223> beta-glicuronidase GUS (2001bp)<220>

<221> íntron

<222> (2769)..(3819)

ggatggtatgctggcctggcttagccgggcctggatatgtaatttcgccgatcttcactcggcatgaactggcgcaccatgttcaaacatttatcatatacgttatttattagaaaacaatactagatcgtgggaaaacctggcgtaataggcgaatgctttaattaacg

tccaaagcggaggagaaacttgcactcaatatcaccgcgtattttgcgacgcgaccgcaatcggtgaaaacgtcggctacttggcaataaatttctgttggagatgggttaatatagcgcggaattggcactggcgttacgcgaagaggcagagcagcttgtccgaggcc

cgatttggaagcatcagccggtacaccgacctttgatcgcctcgcaaggcaccgaagtcgaccgcagcagagcctcgggaagtttcttaaaattacgttatttatgattagcaaactaggtgcaagcttgccaacttaatccgcaccgatgagcttggat

acggcagagaattatcatcaatgtggagtggtcagcgccgatattgcgcggcggcttttcggaggcaaacattgcgtaccgattgaatccagcatgtaatgagtcccgcaataaattatcgcactggccgcgccttgcagcgcccttccccagattgtcg

aggtactggaccgaatacggaagagtatcatcgtcggtgattggcggtaatgctgcaaaaaatgaatcaagagctcgaattgttgccggtaattaacatgattatacattgcgcgcggtgtcgttttacacacatcccccaacagttgcgtttcccgcct

aaaagaacttcgtggatacggtgtgcatggacaggtatggcaagaaagggacgctggactcaactctcctttccccgatccttgcgatgataatgcatgataatacgcgatcatctatgtacgtcgtgactttcgccagccagcctgaattcagtttgtg<223> complemento de intron de Zm ubiquitina (1051bp)<220>

<221> promotor

<222> (3859)..(4856)

<223> promotor Os CP12 (998bp) (complemento)

<400> 87

tacaacggct ctcccgctga cgccgtcccg gactgatggg ctgcctgtat cgagtggtga 60ttttgtgccg agctgccggt cggggagctg ttggctggct ggtggcagga tatattgtgg 120tgtaaacaaa ttgacgctta gacaacttaa taacacattg cggacgtttt taatgtactg 180aattgactag tggcgcgccc acaaactgaa ggcgggaaac gacaatctga tccaagctca 240agctgctcta gcattcgcca ttcaggctgc gcaactgttg ggaagggcga tcggtgcggg 300cctcttcgct attacgccag ctgcgaaagg ggatgtgctg caagcgatta agttggtaac 360gccagggttt cccagtcacg acgttgtaaa acgacggcca gtgccaagct tgcatgccaa 420ttcccgatct agtaacatag atgacaccgc gcgcgataat ttatcctagt ttgcgcgcta 480tattttgttt tctatcgcgt attaaatgta taattgcggg actctaatca taaaaaccca 540tctcataaat aacgtcatgc attacatgtt aattattaca tgcttaacgt aattcaacag 600aaattatatg ataatcatcg caagaccggc aacaggattc aatcttaaga aactttattg 660ccaaatgttt gaacgatcgg ggaaattcga gctcggtagc aattcccgag gctgtagccg 720acgatggtgc gccaggagag ttgttgattc attgtttgcc tccctgctgc ggtttttcac 780cgaagttcat gccagtccag cgtttttgca gcagaaaagc cgccgacttc ggtttgcggt 840cgcgagtgaa gatccctttc ttgttaccgc caacgcgcaa tatgccttgc gaggtcgcaa 900aatcggcgaa attccatacc tgttcaccga cgacggcgct gacgcgatca aagacgcggt 960gatacatatc cagccatgca cactgatact cttcactcca catgtcggtg tacattgagt 1020gcagcccggc taacgtatcc acgccgtatt cggtgatgat aatcggctga tgcagtttct 1080cctgccaggc cagaagttct ttttccagta ccttctctgc cgtttccaaa tcgccgcttt 1140ggacatacca tccgtaataa cggttcaggc acagcacatc aaagagatcg ctgatggtat 1200cggtgtgagc gtcgcagaac attacattga cgcaggtgat cggacgcgtc gggtcgagtt 1260tacgcgttgc ttccgccagt ggcgcgaaat attcccgtgc accttgcgga cgggtatccg 1320gttcgttggc aatactccac atcaccacgc ttgggtggtt tttgtcacgc gctatcagct 1380ctttaatcgc ctgtaagtgc gcttgctgag tttccccgtt gactgcctct tcgctgtaca 1440gttctttcgg cttgttgccc gcttcgaaac caatgcctaa agagaggtta aagccgacag 1500cagcagtttc atcaatcacc acgatgccat gttcatctgc ccagtcgagc atctcttcag 1560cgtaagggta atgcgaggta cggtaggagt tggccccaat ccagtccatt aatgcgtggt 1620cgtgcaccat cagcacgtta tcgaatcctt tgccacgcaa gtccgcatct tcatgacgac 1680caaagccagt aaagtagaac ggtttgtggt taatcaggaa ctgttcgccc ttcactgcca 1740ctgaccggat gccgacgcga agcgggtaga tatcacactc tgtctggctt ttggctgtga 1800cgcacagttc atagagataa ccttcacccg gttgccagag gtgcggattc accacttgca 1860aagtcccgct agtgccttgt ccagttgcaa ccacctgttg atccgcatca cgcagttcaa 1920cgctgacatc accattggcc accacctgcc agtcaacaga cgcgtggtta cagtcttgcg 1980cgacatgcgt caccacggtg atatcgtcca cccaggtgtt cggcgtggtg tagagcatta 2040cgctgcgatg gattccggca tagttaaaga aatcatggaa gtaagactgc tttttcttgc 2100cgttttcgtc ggtaatcacc attcccggcg ggatagtctg ccagttcagt tcgttgttca 2160cacaaacggt gatacctgca catcaacaaa ttttggtcat atattagaaa agttataaat 2220taaaatatac acacttataa actacagaaa agcaattgct atatactaca ttcttttatt 2280ttgaaaaaaa tatttgaaat attatattac tactaattaa tgataattat tatatatata 2340tcaaaggtag aagcagaaac ttacgtacac ttttcccggc aataacatac ggcgtgacat 2400cggcttcaaa tggcgtatag ccgccctgat gctccatcac ttcctgatta ttgacccaca 2460ctttgccgta atgagtgacc gcatcgaaac gcagcacgat acgctggcct gcccaacctt 2520tcggtataaa gacttcgcgc tgataccaga cgttgcccgc ataattacga atatctgcat 2580cggcgaactg atcgttaaaa ctgcctggca cagcaattgc ccggctttct tgtaacgcgc 2640tttcccacca acgctgacca attccacagt tttcgcgatc cagactgaat gcccacaggc 2700cgtcgagttt tttgatttca cgggttgggg tttctacagg acgtaacata agggactgac 2760ctacccgggc tgcagaagta acaccaaaca acagggtgag catcgacaaa agaaacagta 2820ccaagcaaat aaatagcgta tgaaggcagg gctaaaaaaa tccacatata gctgctgcat 2880atgccatcat ccaagtatat caagatcaaa ataattataa aacatacttg tttattataa 2940tagataggta ctcaaggtta gagcatatga atagatgctg catatgccat catgtatatg 3000catcagtaaa acccacatca acatgtatac ctatcctaga tcgatatttc catccatctt 3060aaactcgtaa ctatgaagat gtatgacaca cacatacagt tccaaaatta ataaatacac 3120caggtagttt gaaacagtat tctactccga tctagaacga atgaacgacc gcccaaccac 3180accacatcat cacaaccaag cgaacaaaaa gcatctctgt atatgcatca gtaaaacccg 3240catcaacatg tatacctatc ctagatcgat atttccatcc atcatcttca attcgtaact 3300atgaatatgt atggcacaca catacagatc caaaattaat aaatccacca ggtagtttga 3360aacagaattc tactccgatc tagaacgacc gcccaaccag accacatcat cacaaccaag 3420acaaaaaaaa gcatgaaaag atgacccgac aaacaagtgc acggcatata ttgaaataaa 3480ggaaaagggc aaaccaaacc ctatgcaacg aaacaaaaaa aatcatgaaa tcgatcccgt 3540ctgcggaacg gctagagcca tcccaggatt ccccaaagag aaacactggc aagttagcaa 3600tcagaacgtg tctgacgtac aggtcgcatc cgtgtacgaa cgctagcagc acggatctaa 3660cacaaacacg gatctaacac aaacatgaac agaagtagaa ctaccgggcc ctaaccatgg 3720accggaacgc cgatctagag aaggtagaga gggggggggg gggaggacga gcggcgtacc 3780ttgaagcgga ggtgccgacg ggtggatttg ggggagatcc tctagagtcg acctgcaggc 3840atgcaagctt ggcgcgcctg ttgatgcgga tttctgcgtg tgatgtgggc gtttgtagct 3900gttgcgacga ggcgttcgtt gcacggattg aagagatggg gtttatatat atatagctcc 3960gtggggtggg ggagaagggg agagaggatt cgacgacgtg cactcgtttc ttatcgcctc 4020ctcagccaat cgtcgtgtgc cacgtgggct gtattttgag atatttcatg cgaaatgggg 4080acttggcaaa ggagatcttt ttcttttccc ttgggtgaat ctaaggtgag agaagcagtt 4140ttaatttgac cgtgaaaaca tgagcagatg actgtgggtg tgtacatgta tgcagaagtt 4200caggttggat acgaaattga tgtagaggtt cgtgttgtgc cagcaaagaa tggcttgtag 4260ggaagtgaac tcggtctaag gccagaaaga tcactttcgg tctcgaaaat atctgagata 4320ctatggaaaa gtttggtgaa gaacggacaa aatgaaacgt cctagatatc tcaactattt 4380tggtggaaca gagttattta gtgtacaggt gcagaggtgc tcaaattatt tggtgagtag 4440caaattattt ttcattttgc ccaataggtg cgtatggttc tttctttgta aagtttttag 4500attgggacta agctagctcg gatcaagagc ggaattgagg tggtaagaga agtggaaacc 4560agatggcctt gaagttgtcc ccgcaacctg gacttcctga gttcggacca acaagacaag 4620cctcttgcaa ggcccagtta cagccggatt agtcgcttat aggcccacag ttgactgggc 4680cttaggccca tgctgccacc ctgccgagaa ttttttttat ttttacattt tttgattaaa 4740atatttaaaa ataatttttc attccgaaaa tttacaaatc tagtcgtgcc tcacgtcctc 4800ctagagggct tttttcaaat cacccttcca gagggcgtta gggacctaaa tacaaag 4857<210> 88 <211> 4725

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> construto de expressão pBPSMM331<220>

<221> terminador

<222> (481)..(733)

<223> complemento de terminador NOS (253 bp)<220>

<221> caracteristica_misc

<222> (749)..(749)

<223> Sitio de inserção de etiqueta miRNA (Sac I)<220>

<221> caracteristica_misc

<222> (804)..(2804)

<223> GUS (2001bp): complemento

<220>

<221> íntron

<222> (2824) .. (3874)

<223> intron de Zm ubiquitina (1051bp): complemento<220>

<221> promotor

<222> (3912)..(4725)

<223> complemento de promotor Os SI (814bp)

<4 00> 88 gttgccgttc ttccgaatag catcggtaac atgagcaaag tctgccgcct tacaacggct 60ctcccgctga cgccgtcccg gactgatggg ctgcctgtat cgagtggtga ttttgtgccg 120agctgccggt cggggagctg ttggctggct ggtggcagga tatattgtgg tgtaaacaaa 180ttgacgctta gacaacttaa taacacattg cggacgtttt taatgtactg aattgactag 240tggcgcgccc acaaactgaa ggcgggaaac gacaatctga tccaagctca agctgctcta 300gcattcgcca ttcaggctgc gcaactgttg ggaagggcga tcggtgcggg cctcttcgct 360attacgccag ctggcgaaag ggggatgtgc tgcaaggcga ttaagttggg taacgccagg 420gttttcccag tcacgacgtt gtaaaacgac ggccagtgcc aagcttgcat gccaattccc 480gatctagtaa catagatgac accgcgcgcg ataatttatc ctagtttgcg cgctatattt 540tgttttctat cgcgtattaa atgtataatt gcgggactct aatcataaaa acccatctca 600taaataacgt catgcattac atgttaatta ttacatgctt aacgtaattc aacagaaatt 660atatgataat catcgcaaga ccggcaacag gattcaatct taagaaactt tattgccaaa 720tgtttgaacg atcggggaaa ttcgagctcg gtagcaattc ccgaggctgt agccgacgat 780ggtgcgccag gagagttgtt gattcattgt ttgcctccct gctgcggttt ttcaccgaag 840ttcatgccag tccagcgttt ttgcagcaga aaagccgccg acttcggttt gcggtcgcga 900gtgaagatcc ctttcttgtt accgccaacg cgcaatatgc cttgcgaggt cgcaaaatcg 960gcgaaattcc atacctgttc accgacgacg gcgctgacgc gatcaaagac gcggtgatac 1020atatccagcc atgcacactg atactcttca ctccacatgt cggtgtacat tgagtgcagc 1080ccggctaacg tatccacgcc gtattcggtg atgataatcg gctgatgcag tttctcctgc 1140caggccagaa gttctttttc cagtaccttc tctgccgttt ccaaatcgcc gctttggaca 1200taccatccgt aataacggtt caggcacagc acatcaaaga gatcgctgat ggtatcggtg 1260tgagcgtcgc agaacattac attgacgcag gtgatcggac gcgtcgggtc gagtttacgc 1320gttgcttccg ccagtggcgc gaaatattcc cgtgcacctt gcggacgggt atccggttcg 1380ttggcaatac tccacatcac cacgcttggg tggtttttgt cacgcgctat cagctcttta 1440atcgcctgta agtgcgcttg ctgagtttcc ccgttgactg cctcttcgct gtacagttct 1500ttcggcttgt tgcccgcttc gaaaccaatg cctaaagaga ggttaaagcc gacagcagca 1560gtttcatcaa tcaccacgat gccatgttca tctgcccagt cgagcatctc ttcagcgtaa 1620gggtaatgcg aggtacggta ggagttggcc ccaatccagt ccattaatgc gtggtcgtgc 1680accatcagca cgttatcgaa tcctttgcca cgcaagtccg catcttcatg acgaccaaag 1740ccagtaaagt agaacggttt gtggttaatc aggaactgtt cgcccttcac tgccactgac 1800cggatgccga cgcgaagcgg gtagatatca cactctgtct ggcttttggc tgtgacgcac 1860agttcataga gataaccttc acccggttgc cagaggtgcg gattcaccac ttgcaaagtc 1920ccgctagtgc cttgtccagt tgcaaccacc tgttgatccg catcacgcag ttcaacgctg 1980acatcaccat tggccaccac ctgccagtca acagacgcgt ggttacagtc ttgcgcgaca 2040tgcgtcacca cggtgatatc gtccacccag gtgttcggcg tggtgtagag cattacgctg 2100cgatggattc cggcatagtt aaagaaatca tggaagtaag actgcttttt cttgccgttt 2160tcgtcggtaa tcaccattcc cggcgggata gtctgccagt tcagttcgtt gttcacacaa 2220acggtgatac ctgcacatca acaaattttg gtcatatatt agaaaagtta taaattaaaa 2280tatacacact tataaactac agaaaagcaa ttgctatata ctacattctt ttattttgaa 2340aaaaatattt gaaatattat attactacta attaatgata attattatat atatatcaaa 2400ggtagaagca gaaacttacg tacacttttc ccggcaataa catacggcgt gacatcggct 2460tcaaatggcg tatagccgcc ctgatgctcc atcacttcct gattattgac ccacactttg 2520ccgtaatgag tgaccgcatc gaaacgcagc acgatacgct ggcctgccca acctttcggt 2580ataaagactt cgcgctgata ccagacgttg cccgcataat tacgaatatc tgcatcggcg 2640aactgatcgt taaaactgcc tggcacagca attgcccggc tttcttgtaa cgcgctttcc 2700caccaacgct gaccaattcc acagttttcg cgatccagac tgaatgccca caggccgtcg 2760agttttttga tttcacgggt tggggtttct acaggacgta acataaggga ctgacctacc 2820cgggctgcag aagtaacacc aaacaacagg gtgagcatcg acaaaagaaa cagtaccaag 2880caaataaata gcgtatgaag gcagggctaa aaaaatccac atatagctgc tgcatatgcc 2940atcatccaag tatatcaaga tcaaaataat tataaaacat acttgtttat tataatagat 3000aggtactcaa ggttagagca tatgaataga tgctgcatat gccatcatgt atatgcatca 3060gtaaaaccca catcaacatg tatacctatc ctagatcgat atttccatcc atcttaaact 3120cgtaactatg aagatgtatg acacacacat acagttccaa aattaataaa tacaccaggt 3180agtttgaaac agtattctac tccgatctag aacgaatgaa cgaccgccca accacaccac 3240atcatcacaa ccaagcgaac aaaaagcatc tctgtatatg catcagtaaa acccgcatca 3300acatgtatac ctatcctaga tcgatatttc catccatcat cttcaattcg taactatgaa 3360tatgtatggc acacacatac agatccaaaa ttaataaatc caccaggtag tttgaaacag 3420aattctactc cgatctagaa cgaccgccca accagaccac atcatcacaa ccaagacaaa 3480aaaaagcatg aaaagatgac ccgacaaaca agtgcacggc atatattgaa ataaaggaaa 3540agggcaaacc aaaccctatg caacgaaaca aaaaaaatca tgaaatcgat cccgtctgcg 3600gaacggctag agccatccca ggattcccca aagagaaaca ctggcaagtt agcaatcaga 3660acgtgtctga cgtacaggtc gcatccgtgt acgaacgcta gcagcacgga tctaacacaa 3720acacggatct aacacaaaca tgaacagaag tagaactacc gggccctaac catggaccgg 3780aacgccgatc tagagaaggt agagaggggg ggggggggag gacgagcggc gtaccttgaa 3840gcggaggtgc cgacgggtgg atttggggga gatcctctag agtcgacctg caggcatgca 3900agcttggcgc gcctaactcc tggcttcctt ccgatctgga ctggagagga gctgattgga 3960tcggatcgag caggtcgtcg gggaaggagt gagggggagt ctctctctct ctctgccaag 4020gaccaaggta ggtcaatgcc tcagccagat cccatagcca taaacccttg ttttgttaaa 4080gggcattcac aatgggccga cgtggcattc agcctcaacc caaaaaagcg aagactagta 4140ttcctttgcc tcgtcgtcca accgcgcgcc ctcctcagct cagtgggacc cacaccaccg 4200ctagaggaga gaggagaggg ggcgaagcag ccgaactcca ggggaggagg gcgccgaccg 4260ccgcctcgca tccgcccgtc gccgtctccc gctccaagtc gtctgcccgc cgccgacatg 4320ccgccgccgc cctgctgctc cgagcagccc cgccgctcgg gggggagagg agggggtggt 4380gcgccggcga gcgcatcccg ccgctcggcg ctgtcgccct gccgtcgctc caccactgct 4440tggtccggcg ccgtcgccgt ctccgcgcgc caggctctct gcggtggggg aaaggaagag 4500aggggggaga gagaggggaa agtgaaagag aagtgaaaat gtggtagtcc accataccta 4560cttgtatcgt ggtcttgtag attttgcact gtggaacata tggcttaaca tagttgttgg 4620tctaggtgac ataccaggaa caccaaagtg tggagagtgg cttgtggggg tgggggccca 4680ccaccttcat tccattacac ggtcgaatcg aggcagcgat cgctt 4725

<210> 89

<211> 7150

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> construto de expressão pBPSMM325<220>

<221> promotor

<222> (305) .. (1338)

<223> promotor Os CCoAMTl (1034bp)<220>

<221> íntron

<222> (1345) .. (2395)

<223> íntron de Zm ubiquitina :(1051bp)<220>

<221> caracteristica_misc

<222> (2407) .. (4407)

<223> beta-glicuronidase GUS (2001bp)<220>

<221> terminador

<222> (4446)..(5549)

<223> terminador CCoAMTl (1104 bp)

<220>

<221> caracteristica_misc<222> (4793) .. (4793)

<223> inserção de etiqueta miRNA (AgeI)<4 00> 89

gtttcaaacc cggcagctta gttgccgttc ttccgaatag catcggtaac atgagcaaag 60

tctgccgcct tacaacggct ctcccgctga cgccgtcccg gactgatggg ctgcctgtat 120

cgagtggtga ttttgtgccg agctgccggt cggggagctg ttggctggct ggtggcagga 180

tatattgtgg tgtaaacaaa ttgacgctta gacaacttaa taacacattg cggacgtttt 240

taatgtactg aattgactag tggcgcgccc acaaacctta aggcgatcgc gctgaggcgg 300

accgcaacta ctgcacggta aaagtgatag gaatcggtcg gaaacagtat taatgttttt 360

attattttta caaaaacgaa ttgaaataat tggaaatttt catatttata tattaaacta 420

ttcagtatca acttcaattc gacgtcaata gaaattagaa aagcataatt atacacagta 480

ataggcgttc aagatattat tgttattatt tagttttgtg gaaatggtat caacgtgatc 540

ggaaaatttt gtacatgttt tcaccctgcg ggatatctca attccttctc ctccctctac 600

cgccatatca gcacacgttt tagagcacca atcataaccc ataaatccgt gggctactca 660

cttatttaat ttatatgtga attcgtgacc tgactcactc acatactatc aaaaatttgt 720

ctcagtcacc catctccttc tttcctggtc cgataagggt ttatcctacg gttcgacggt 780

tatcacgata gtcgtgcggt tactgaggta taccgtgatt taaaaatatg ataaagttac 840

cgcaggtttt aactgcgcgg tttggtaaac ctgttcctcc tcaccaacct tctcctccgg 900

tctccttatg tgtctcaccg aggcgagccg ccgcgagacc gcatggacgc ggtccacgca 960

cctggcggtg cacctcctcc tccccggcga agaagacgtg gaggagagta aatgagcaat 1020

caggcccacg gcccaatcgc cgtccaccac ccaccaccct cagcgaccca aaaccacctc 1080

accaacccaa ctctgtaccg tactgtaccc gccctcccct cccactgaca ctccgggccc 1140

acctgtcggc gcgactcttc cacggtcccc ttctctcctc agagattttt tccacgcatt 1200

ttttaatttt tttttctgca gttcacatgc tcttctccca ctcttccgcc gcgctatata 1260aaccgcgcga ggcgtcgttg cctcgtcggc gaagtcaatc cggcgatccc cggcgagcga 1320

gagatcgaag caagctgcga gctcgatctc ccccaaatcc acccgtcggc acctccgctt 1380

caaggtacgc cgctcgtcct cccccccccc ccctctctac cttctctaga tcggcgttcc 1440

ggtccatggt tagggcccgg tagttctact tctgttcatg tttgtgttag atccgtgttt 1500

gtgttagatc cgtgctgcta gcgttcgtac acggatgcga cctgtacgtc agacacgttc 1560

tgattgctaa cttgccagtg tttctctttg gggaatcctg ggatggctct agccgttccg 1620

cagacgggat cgatttcatg attttttttg tttcgttgca tagggtttgg tttgcccttt 1680

tcctttattt caatatatgc cgtgcacttg tttgtcgggt catcttttca tgcttttttt 1740

tgtcttggtt gtgatgatgt ggtctggttg ggcggtcgtt ctagatcgga gtagaattct 1800

gtttcaaact acctggtgga tttattaatt ttggatctgt atgtgtgtgc catacatatt 1860

catagttacg aattgaagat gatggatgga aatatcgatc taggataggt atacatgttg 1920

atgcgggttt tactgatgca tatacagaga tgctttttgt tcgcttggtt gtgatgatgt 1980

ggtgtggttg ggcggtcgtt cattcgttct agatcggagt agaatactgt ttcaaactac 2040

ctggtgtatt tattaatttt ggaactgtat gtgtgtgtca tacatcttca tagttacgag 2100

tttaagatgg atggaaatat cgatctagga taggtataca tgttgatgtg ggttttactg 2160

atgcatatac atgatggcat atgcagcatc tattcatatg ctctaacctt gagtacctat 2220

ctattataat aaacaagtat gttttataat tattttgatc ttgatatact tggatgatgg 2280

catatgcagc agctatatgt ggattttttt agccctgcct tcatacgcta tttatttgct 2340

tggtactgtt tcttttgtcg atgctcaccc tgttgtttgg tgttacttct gcagccccgg 2400

ggatccatgt tacgtcctgt agaaacccca acccgtgaaa tcaaaaaact cgacggcctg 24 60

tgggcattca gtctggatcg cgaaaactgt ggaattggtc agcgttggtg ggaaagcgcg 2520

ttacaagaaa gccgggcaat tgctgtgcca ggcagtttta acgatcagtt cgccgatgca 2580

gatattcgta attatgcggg caacgtctgg tatcagcgcg aagtctttat accgaaaggt 2640

tgggcaggcc agcgtatcgt gctgcgtttc gatgcggtca ctcattacgg caaagtgtgg 2700

gtcaataatc aggaagtgat ggagcatcag ggcggctata cgccatttga agccgatgtc 2760

acgccgtatg ttattgccgg gaaaagtgta cgtaagtttc tgcttctacc tttgatatat 2820

atataataat tatcattaat tagtagtaat ataatatttc aaatattttt ttcaaaataa 2880

aagaatgtag tatatagcaa ttgcttttct gtagtttata agtgtgtata ttttaattta 2940

taacttttct aatatatgac caaaatttgt tgatgtgcag gtatcaccgt ttgtgtgaac 3000

aacgaactga actggcagac tatcccgccg ggaatggtga ttaccgacga aaacggcaag 3060

aaaaagcagt cttacttcca tgatttcttt aactatgccg gaatccatcg cagcgtaatg 3120ctctacacca cgccgaacac ctgggtggac gatatcaccg tggtgacgca tgtcgcgcaa 3180gactgtaacc acgcgtctgt tgactggcag gtggtggcca atggtgatgt cagcgttgaa 3240ctgcgtgatg cggatcaaca ggtggttgca actggacaag gcactagcgg gactttgcaa 3300gtggtgaatc cgcacctctg gcaaccgggt gaaggttatc tctatgaact gtgcgtcaca 3360gccaaaagcc agacagagtg tgatatctac ccgcttcgcg tcggcatccg gtcagtggca 3420gtgaagggcg aacagttcct gattaaccac aaaccgttct actttactgg ctttggtcgt 3480catgaagatg cggacttgcg tggcaaagga ttcgataacg tgctgatggt gcacgaccac 3540gcattaatgg actggattgg ggccaactcc taccgtacct cgcattaccc ttacgctgaa 3600gagatgctcg actgggcaga tgaacatggc atcgtggtga ttgatgaaac tgctgctgtc 3660ggctttaacc tctctttagg cattggtttc gaagcgggca acaagccgaa agaactgtac 3720agcgaagagg cagtcaacgg ggaaactcag caagcgcact tacaggcgat taaagagctg 3780atagcgcgtg acaaaaacca cccaagcgtg gtgatgtgga gtattgccaa cgaaccggat 3840acccgtccgc aaggtgcacg ggaatatttc gcgccactgg cggaagcaac gcgtaaactc 3900gacccgacgc gtccgatcac ctgcgtcaat gtaatgttct gcgacgctca caccgatacc 3960atcagcgatc tctttgatgt gctgtgcctg aaccgttatt acggatggta tgtccaaagc 4020ggcgatttgg aaacggcaga gaaggtactg gaaaaagaac ttctggcctg gcaggagaaa 4080ctgcatcagc cgattatcat caccgaatac ggcgtggata cgttagccgg gctgcactca 4140atgtacaccg acatgtggag tgaagagtat cagtgtgcat ggctggatat gtatcaccgc 4200gtctttgatc gcgtcagcgc cgtcgtcggt gaacaggtat ggaatttcgc cgattttgcg 4260acctcgcaag gcatattgcg cgttggcggt aacaagaaag ggatcttcac tcgcgaccgc 4320aaaccgaagt cggcggcttt tctgctgcaa aaacgctgga ctggcatgaa cttcggtgaa 4380aaaccgcagc agggaggcaa acaatgaaga tcctctagag tcgacctgca ggcatgcaag 4440cttggcgcgc cgccgatgcc caagaactag tcattttaaa tttataaatt ataactaaat 4500tgtataattt ttgccttttt tttttaattt gcaagctact ggaaaatgtt atttaatata 4560tgtataaatg tcgagacaat aatattattg cattataaat tgacctggtt tttgttagct 4620ttcgttgcgc gtgagaatgg tgagtgtgtg ctgctgatga aactcgaatg ttcacttttg 4680ttgtcttgtc cagctttgct aaactttggc agcattagca aagctgtttt gttctgtttc 4740tgaattgttc ttggattgaa atctctaata ttgacttgat aattaaattt gaccggtttt 4800tggcagtaaa ttccttcagt attggcagct caaactgaat tcttctacta atagtttagt 4860gcttgtggag agtgtagtcg tgtagagtgg actggactaa ttcagatctt tacttggtta 4920gctgaagatg gcatccgtta tctgaattct tcagtagttg gtggataatg acaactcgat 4980gtagagagat aatttgctgc atgttagttt ggaagtagct tcaaaggatt taattctcag 5040cgtccgaagt cttaagtaca gttggtttgg agagctgttc ctgtgaagac ttttatgatt 5100tgtgctagtt atgtcatcac atgatcactt caattatcac ttatcgatct agtgagacca 5160accatacata ccatacaaag gtaaaaagtg ttcaaactgg attgaacaag ttctgtctcc 5220atatagatcc tactaaaatg catacatgtt gtagcaatcc catttcatcc aaaccaaaca 5280aaatctcttt cattcggctc taaccaatca aacagagcca tttgtatccc ccgaaccaaa 5340ccagccgagc atggatgagg gatcgagggc atccgagcaa ccaaacaggc ccaaagtgaa 5400tgctttggtc gattttcgat ttgttcccta cgaatccaat tttagtcctt cagccagaag 5460accagataca attgatccct caactatcaa aacaagtgca gatgagctcc ctcgacagtt 5520tggacggcgg tttggttgac gtggttaatt aacggtccga ggcctcctca gcaagctgtt 5580aacgcgatcg cagcgcctta aggggccgct ctagattagt gtacggaata aaagtcctaa 5640ttcattcttt ttcttatacg tcaccgtttt ctacatttag aaaaatgaag tgggaatcaa 5700ttgaaacaat tgatagcttt aaatatcaag ctgtcttctc caggaccagg ccccagcaca 5760tcggcgtgga aagcgctagg ccccagaaca actcgtcaat cgtcatggca aataatgaca 5820cattgagccg atttgatgca tggaacagac taataaggaa ctcaaatctc tttggagatt 5880gaatgattga gatgaaaatg aattaatatt ttttctcaat cccctccaat gctaagaaag 5940tttgagtttc caaattagct ttagagggcg tttagatccc ttcgttttag agaaattaga 6000attcactcaa taaaataact tatttaattt ggaatttgat attcaaccac ttttcaaagt 6060ttagatatag gtctatctca aattcatagg gtggatgatg gaaatgattt tatgcattaa 6120tagaatttgt ttctactgtg taacttacat gacactcttc atctcactcc tgtatagtaa 6180aaatgtagca tataaatatc tccgacatct tgataataat agtatacaaa tatattttgc 6240ataaaaccga attaacttaa ttgatatatg ccaaaattac tattattaga atggaattta 6300attccaatga tccaaaccac gaaaatggat caggtaacta attcagtcaa atgcctcatt 6360ttttttcact cccctcaaac cacgaaaatg ccattctggt ttgtaaaata gtttgaaatt 6420gcagccctag cattattcca tacatcatat gttgagttga aattaccaat ataataataa 6480ctaaaaaagg aaaaaaatag cgaaaacaaa agcaaggacc agttggacac ttaaatttgg 6540caacagaagc caattcagaa ccactgcata gcagtgctta ttatcttatt tatatgtagc 6600aaaaggcact taaatgatct cttatgacac atgccagaag gaaaacaaca gactacacaa 6660ttacaaggtc ggaagctaca taggattacc ataacagata gctgacggcc tacaaaaaaa 6720gatagaatac aggagaacat cacacagata aaaacatatc acccttgtac tagcagggag 6780gcggtgcttg ctggatttta gatcagttgc ttgctggatt ttagatcagt acacagtcct 6840gccatcacca tccaggatca tatccttgaa agccccacca ttagggatca taggcaacac 6900atgctcctgg tgtgggacga ttatatccaa gaggtacggc cctggagtct cgagcatctt 6960

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<211> 22

<212> DNA

<213> Homo sapiens

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<211> 22

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<4 00> 92

cacaagttcg gatctacggg tt 22

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<211> 23

<212> DNA

<213> Homo sapiens

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tcatagccct gtacaatgct gct 23

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<212> DNA

<213> Homo sapiens

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tgatagccct gtacaatgct gct 23

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<211> 23

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 95

cacaaattcg gatctacagg gta 23<210> 96

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<212> DNA

<213> Homo sapiens

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<213> Homo sapiens

<400> 97

gcaagcccag accgcaaaaa g

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<212> DNA

<213> Homo sapiens

<4 00> 98

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<213> Homo sapiens

<4 00> 99

gcagaagcat ttccacacac

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<212> DNA

<213> Homo sapiens

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acaaagttct gtagtgcact ga

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<212> DNA

<213> Homo sapiens

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cacaaaccat tatgtgctgc ta

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<211> 22

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<4 00> 102

cgccaatatt tacgtgctgc ta<210> 103

<211> 22

<212> DNA

<213> Homo sapiens

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tatctgcact agatgcacct ta

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> Homo sapiens

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ccaacaacat gaaactacct a

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<212> DNA

<213> Homo sapiens

<4 00> 106

aacaggtagt ctgaacactg gg

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<211> 22

<212> DNA

<213> Homo sapiens

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aactatacaa cctactacct ca

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<211> 22

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<4 00> 108

ctgttcctgc tgaactgagc ca

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<211> 22

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<4 00> 109

tacctgcact ataagcactt ta<210> 110

<211> 22

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 110

acaagctttt tgctcgtctt at

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<211> 21

<212> DNA

<213> Homo sapiens

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<211> 21

<212> DNA

<213> Homo sapiens

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ggccgtgact ggagactgtt a

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<212> DNA

<213> Homo sapiens

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aacccaccga cagcaatgaa tgtt

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<212> DNA

<213> Homo sapiens

<4 00> 114

ctgcctgtct gtgcctgctg t

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<212> DNA

<213> Homo sapiens

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gtctgtcaat tcataggtca t

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<211> 21

<212> DNA

<213> Homo sapiens

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<212> DNA

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<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

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<213> Homo sapiens

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<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 120

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<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 121

aaagtgtcag atacggtgtg g

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<212> DNA

<213> Homo sapiens

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<211> 24

<212> DNA

<213> Homo sapiens<400> 123

gagacccagt agccagatgt agct 24

<210> 124

<211> 21

<212> DNA

<213> Homo sapiens

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ggaaatccct ggcaatgtga t 21

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<211> 23

<212> DNA

<213> Homo sapiens

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tcagttttgc atggatttgc aca 23

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<212> DNA

<213> Homo sapiens

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<211> 21

<212> DNA

<213> Homo sapiens

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<211> 22

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<211> 22

<212> DNA

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aaccgatttc agatggtgct ag

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<212> DNA

<213> Homo sapiens

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actgatttca aatggtgcta

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<211> 22

<212> DNA

<213> Homo sapiens

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gctgcaaaca tccgactgaa ag

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<212> DNA

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gctgagagtg taggatgttt aca

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gcaacttagt aatgtgcaat a

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caatgcaact acaatgcac

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acaggccggg acaagtgcaa ta

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ctacctgcac gaacagcact tt

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<211> 22

<212> DNA

<213> Homo sapiens

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tgctcaataa atacccgttg aa

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<212> DNA

<213> homo sapiens

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aacaatacaa cttactacct ca

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<211> 22

<212> DNA

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agcctatcct ggattacttg aa 22

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<211> 22

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 145

ctacgcgtat tcttaagcaa ta 22

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<211> 20

<212> DNA

<213> Mus musculus

<4 00> 146

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<211> 22

<212> DNA

<213> Mus musculus

<4 00> 147

acacaaattc ggttctacag gg 22

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<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

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<210><211><212>

14922DNA

<213> Artificial

<220>

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22

<210> 150

<211> 23

<212> DNA

<213> Mus musculus

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cacaggttaa agggtctcag gga

23<210> 151

<211> 22

<212> DNA

<213> Mus musculus

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tcacaagtta gggtctcagg ga 22

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<211> 21

<212> DNA

<213> Mus musculus

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gcattattac tcacggtacg a 21

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<211> 22

<212> DNA

<213> Mus musculus

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agccaagctc agacggatcc ga 22

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<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

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aaaagagacc ggttcactgt ga 22

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<211> 22

<212> DNA

<213> Mus musculus

<4 00> 155

agcaagccca gaccgcaaaa ag 22

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<211> 20

<212> DNA

<213> Mus musculus

<4 00> 156

gcccttttaa cattgcactg 20

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<211> 22

<212> DNA

<213> Mus musculus<400> 157

cgaccatggc tgtagactgt ta

<210> 158

<211> 22

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 158

acagctggtt gaaggggacc aa

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<211> 21

<212> DNA

<213> Mus

<400> 159ccctctggtc

musculus

aaccagtcac a

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<211> 23

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 160

tcacatagga ataaaaagcc ata

<210> 161

<211> 23

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 161

tccatcatca aaacaaatgg agt

<210> 162

<211> 22

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 162

tgtgagttct accattgcca aa

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<211> 21

<212> DNA

<213> Mus

<400> 163ccatctttac

musculus

cagacagtgt t

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<211> 22

<212> DNA

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ccataaagta ggaaacacta ca

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<211> 20

<212> DNA

<213> Mus

<4 00> 165gtagtgcttt

musculus

ctactttatg

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<211> 22

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<213> Mus musculus

<4 00> 166

tgagctacag tgcttcatct ca

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<211> 22

<212> DNA

<213> Mus musculus

<4 00> 167

ctagtacatc atctatactg ta

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<212> DNA

<213> Mus musculus

<4 00> 168

aagggattcc tgggaaaact ggac

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<212> DNA

<213> Mus musculus

<4 00> 169

aacccatgga attcagttct ca

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ggagtgaaga cacggagcca ga

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cactggtaca agggttggga ga

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<213> Mus musculus

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cctcaaggag cctcagtcta g

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<211> 21

<212> DNA

<213> Mus musculus

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<212> DNA

<213> Mus musculus

<4 00> 174

tcacttttgt gactatgcaa

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<211> 22

<212> DNA

<213> Mus musculus

<4 00> 175

cgaaggcaac acggataacc ta

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<211> 22

<212> DNA

<213> Mus musculus

<4 00> 176

cccctatcac aattagcatt aa

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<211> 22

<212> DNA

<213> Mus musculus

<4 00> 177

tgtaaaccat gatgtgctgc ta

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<212> DNA

<213> Mus musculus<400> 178

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<212> DNA

<213> Mus musculus

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<212> DNA

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tcttcccatg cgctatacct Ct

<210> 181

<211> 22

<212> DNA

<213> Mus musculus

<4 00> 181

acccttatca gttctccgtc ca

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<211> 18

<212> DNA

<213> Mus musculus

<4 00> 182gaactgcctt tctctcca

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<211> 23

<212> DNA

<213> Mus musculus

<4 00> 183

aagcccaaaa ggagaattct ttg

<210> 184

<211> 22

<212> DNA

<213> Mus musculus

<4 00> 184

ccggctgcaa cacaagacac ga

<210> 185

<211> 22

<212> DNA

<213> Mus musculus<400> 185

accctccacc atgcaaggga tg 22

<210> 186

<211> 23

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 186

actgatatca gctcagtagg cac 23

<210> 187

<211> 22

<212> DNA

<213> Mus musculus

<4 00> 187

acctaatata tcaaacatat ca 22

<210> 188

<211> 22

<212> DNA

<213> Mus musculus

<4 00> 188

agctgctttt gggattccgt tg 22

<210> 189

<211> 21

<212> DNA

<213> Mus musculus

<4 00> 189

ctgggacttt gtaggccagt t 21

<210> 190

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Complementar a mmu-miR-194

<4 00> 190

tccacatgga gttgctgtta ca 22

<210> 191

<211> 21

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 191

gccaatattt ctgtgctgct a 21

<210> 192<211> 22

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 192

aaccaatgtg cagactactg ta 22

<210> 193

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Complementar a mmu-miR-lb

<4 00> 193

tacatacttc tttacattcc a 21

<210> 194

<211> 23

<212> DNA

<213> Mus musculus

<4 00> 194

aatacatact tctttacatt cca 23

<210> 195

<211> 23

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 195

gtcatcatta ccaggcagta tta 23

<210> 196

<211> 21

<212> DNA

<213> Mus musculus

<4 00> 196

agaacaatgc cttactgagt a 21

<210> 197

<211> 23

<212> DNA

<213> Mus musculus

<4 00> 197

cagtgaattc taccagtgcc ata 23

<210> 198

<211> 22

<212> DNA

<213> Mus musculus

<4 00> 198

cgcaaggtcg gttctacggg tg

22<210> 199

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Complementar a mmu-miR-206<400> 199

ccacacactt ccttacattc ca 22

<210> 200

<211> 23

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 200

gagggaggag agccaggaga age 23

<210> 201

<211> 23

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 201

gtggtaatcc ctggcaatgt gat 23

<210> 202

<211> 20

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 202

cagaacttag ccactgtgaa 20

<210> 203

<211> 22

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 203

taaccgattt caaatggtgc ta 22

<210> 204

<211> 21

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 204

gctgagtgta ggatgtttac a 21

<210> 205

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> Complementar a mmu-miR-9<4 00> 205

tcatacagct agataaccaa aga 23

<210> 206

<211> 21

<212> DNA

<213> Mus musculus

<4 00> 206

actttcggtt atctagcttt a 21

<210> 207

<211> 20

<212> DNA

<213> Mus musculus

<4 00> 207

acaagatcgg atctacgggt 20

<210> 208

<211> 21

<212> DNA

<213> Mus musculus

<4 00> 208

ctagtggtcc taaacatttc a 21

<210> 209

<211> 59

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador oligonucleotideo<4 00> 209

gggagctcgg ggaatgaagc ctggtccgag aatttccccg atcgttcaaa catttggca 59

<210> 210

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador oligonucleotideo

<4 00> 210

tcggaccgtt aattaacaca aactgaaggc 30

<210> 211

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> iniciador oligonucleotídeo

<400> 211

gatctggccg gccgggcccg aattc

<210> 212

<211> 12587

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> construto de vetor pBPSLM185

<220>

<221> região_rep

<222> (42)..(66)

<223> região de repetição de borda de T-DNA esquerda<220>

<221> promotor

<222> (157)..(2144)

<223> Ubiquitina de milho mais íntron promotor<220>

<221> CDS

<222> (2178)..(4094)

<223> ZmAHAS L2 S653(At)N (XI12) cds. S621N.<220>

<221> terminador

<222> (4095)..(5310)

<223> seqüência AHASL2 [XI12] 31/UTR de milho com terminador.<220>

<221> promotor

<222> (5368)..(6765)

<223> promotor de vírus baciliforme de cana-de-açúcar [ScBV]<220>

<221> CDS

<222> (6784)..(7461)

<223> proteína fluorescente vermelha de Discosoma sp. [drFP583;l]<220>

<221> terminador

<222> (7493)..(7745)

<223> Terminador de Nopalina Sintase poli-A<220>

<221> região_rep

<222> (7775)..(7919)

<223> RB completo de pSBll

<220>

<221> origem_rep

<222> (10197) .. (10477)

<223> origem de replicação de pBR322 [ecoli] de AF234316 pCambia2301

<220><221> CDS

<222> (11336) .. (12151)

<223> gene/CDS de seleção de resistência à canamicina paramicroorganismo.

<400> 212 tttgtgccga gctgccggtc ggggagctgt tggctggctg gtggcaggat atattgtggt 60gtaaacaaat tgacgcttag acaacttaat aacacattgc ggacgttttt aatgtactga 120attggatccg cccgggcggt accaagcttc cgcggctgca gtgcagcgtg acccggtcgt 180gcccctctct agagataatg agcattgcat gtctaagtta taaaaaatta ccacatattt 240tttttgtcac acttgtttga agtgcagttt atctatcttt atacatatat ttaaacttta 300ctctacgaat aatataatct atagtactac aataatatca gtgttttaga gaatcatata. 360aatgaacagt tagacatggt ctaaaggaca attgagtatt ttgacaacag gactctacag 420ttttatcttt ttagtgtgca tgtgttctcc tttttttttg caaatagctt cacctatata 480atacttcatc cattttatta gtacatccat ttagggttta gggttaatgg tttttataga 540ctaatttttt tagtacatct attttattct attttagcct ctaaattaag aaaactaaaa 600ctctatttta gtttttttat ttaatagttt agatataaaa tagaataaaa taaagtgact 660aaaaattaaa caaataccct ttaagaaatt aaaaaaacta aggaaacatt tttcttgttt 720cgagtagata atgccagcct gttaaacgcc gtcgacgagt ctaacggaca ccaaccagcg 780aaccagcagc gtcgcgtcgg gccaagcgaa gcagacggca cggcatctct gtcgctgcct 840ctggacccct ctcgagagtt ccgctccacc gttggacttg ctccgctgtc ggcatccaga 900aattgcgtgg cggagcggca gacgtgagcc ggcacggcag gcggcctcct cctcctctca 960cggcaccggc agctacgggg gattcctttc ccaccgctcc ttcgctttcc cttcctcgcc 1020cgccgtaata aatagacacc ccctccacac cctctttccc caacctcgtg ttgttcggag 1080cgcacacaca cacaaccaga tctcccccaa atccacccgt cggcacctcc gcttcaaggt 1140acgccgctcg tcctcccccc ccccccccct ctctaccttc tctagatcgg cgttccggtc 1200catggttagg gcccggtagt tctacttctg ttcatgtttg tgttagatcc gtgtttgtgt 1260tagatccgtg ctgctagcgt tcgtacacgg atgcgacctg tacgtcagac acgttctgat 1320tgctaacttg ccagtgtttc tctttgggga atcctgggat ggctctagcc gttccgcaga 1380cgggatcgat ttcatgattt tttttgtttc gttgcatagg gtttggtttg cccttttcct 1440ttatttcaat atatgccgtg cacttgtttg tcgggtcatc ttttcatgct tttttttgtc 1500ttggttgtga tgatgtggtc tggttgggcg gtcgttctag atcggagtag aattctgttt 1560caaactacct ggtggattta ttaattttgg atctgtatgt gtgtgccata catattcata 1620gttacgaatt gaagatgatg gatggaaata tcgatctagg ataggtatac atgttgatgc 1680gggttttact gatgcatata cagagatgct ttttgttcgc ttggttgtga tgatgtggtg 1740tggttgggcg gtcgttcatt cgttctagat cggagtagaa tactgtttca aactacctgg 1800

tgtatttatt aattttggaa ctgtatgtgt gtgtcataca tcttcatagt tacgagttta 1860

agatggatgg aaatatcgat ctaggatagg tatacatgtt gatgtgggtt ttactgatgc 1920

atatacatga tggcatatgc agcatctatt catatgctct aaccttgagt acctatctat 1980

tataataaac aagtatgttt tataattatt tcgatcttga tatacttgga tgatggcata 2040

tgcagcagct atatgtggat ttttttagcc ctgccttcat acgctattta tttgcttggt 2100

actgtttctt ttgtcgatgc tcaccctgtt gtttggtgtt acttctgcag ggtacggatc 2160

cactagttct agaaacc atg gcc acc gcc gcc gcc gcg tct acc gcg ctc 2210

Met Ala Thr Ala Ala Ala Ala Ser Thr Ala Leu15 10

act ggc gcc act acc gct gcg ccc aag gcg agg cgc cgg gcg cac ctc 2258

Thr Gly Ala Thr Thr Ala Ala Pro Lys Ala Arg Arg Arg Ala His Leu15 20 25

ctg gcc acc cgc cgc gcc ctc gcc gcg ccc ate agg tgc tca gcg gcg 2306

Leu Ala Thr Arg Arg Ala Leu Ala Ala Pro Ile Arg Cys Ser Ala Ala30 35 40

tca ccc gcc atg ccg atg gct ccc ccg gcc acc ccg ctc cgg ccg tgg 2354

Ser Pro Ala Met Pro Met Ala Pro Pro Ala Thr Pro Leu Arg Pro Trp45 50 55

ggc ccc acc gat ccc cgc aag ggc gcc gac ate ctc gtc gag tcc ctc 2402

Gly Pro Thr Asp Pro Arg Lys Gly Ala Asp Ile Leu Val Glu Ser Leu60 65 70 75

gag cgc tgc ggc gtc cgc gac gtc ttc gcc tac ccc ggc ggc gcg tcc 2450

Glu Arg Cys Gly Val Arg Asp Val Phe Ala Tyr Pro Gly Gly Ala Ser80 85 90

atg gag ate cac cag gea ctc acc cgc tcc ccc gtc ate gcc aac cac 2498

Met Glu Ile His Gln Ala Leu Thr Arg Ser Pro Val Ile Ala Asn His95 100 105

ctc ttc cgc cac gag caa ggg gag gcc ttt gcg gcc tcc ggc tac gcg 2546

Leu Phe Arg His Glu Gln Gly Glu Ala Phe Ala Ala Ser Gly Tyr Ala110 115 120

cgc tcc tcg ggc cgc gtc ggc gtc tgc ate gcc acc tcc ggc ccc ggc 2594

Arg Ser Ser Gly Arg Val Gly Val Cys Ile Ala Thr Ser Gly Pro Gly125 130 135

gcc acc aac ctt gtc tcc gcg ctc gcc gac gcg ctg ctc gat tcc gtc 2642

Ala Thr Asn Leu Val Ser Ala Leu Ala Asp Ala Leu Leu Asp Ser Val140 145 150 155

ccc atg gtc gcc ate acg gga cag gtg ccg cga cgc atg att ggc acc 2690

Pro Met Val Ala Ile Thr Gly Gln Val Pro Arg Arg Met Ile Gly Thr160 165 170

gac gcc ttc cag gag acg ccc ate gtc gag gtc acc cgc tcc ate acc 2738

Asp Ala Phe Gln Glu Thr Pro Ile Val Glu Val Thr Arg Ser Ile Thr175 180 185aag cac aac tac ctg gtc ctc gac gtc gac gac ate ccc cgc gtc gtg 2786

Lys His Asn Tyr Leu Val Leu Asp Val Asp Asp Ile Pro Arg Val Val190 195 200

cag gag gct ttc ttc ctc gcc tcc tet ggt cga ccg ggg ccg gtg ctt 2834

Gln Glu Ala Phe Phe Leu Ala Ser Ser Gly Arg Pro Gly Pro Val Leu205 210 215

gtc gac ate ccc aag gac ate cag cag cag atg gcg gtg cct gtc tgg 2882

Val Asp Ile Pro Lys Asp Ile Gln Gln Gln Met Ala Val Pro Val Trp220 225 230 235

gac aag ccc atg agt ctg cct ggg tac att gcg cgc ctt ccc aag ccc 2930

Asp Lys Pro Met Ser Leu Pro Gly Tyr Ile Ala Arg Leu Pro Lys Pro240 245 250

cct gcg act gag ttg ctt gag cag gtg ctg cgt ctt gtt ggt gaa tcc 2978

Pro Ala Thr Glu Leu Leu Glu Gln Val Leu Arg Leu Val Gly Glu Ser255 260 265

cgg cgc cct gtt ctt tat gtt ggc ggt ggc tgc gea gea tet ggt gag 3026

Arg Arg Pro Val Leu Tyr Val Gly Gly Gly Cys Ala Ala Ser Gly Glu270 275 280

gag ttg cga cgc ttt gtg gag ctg act gga ate ccg gtc aca act act 3074

Glu Leu Arg Arg Phe Val Glu Leu Thr Gly Ile Pro Val Thr Thr Thr285 290 295

ctt atg ggc ctc ggc aac ttc ccc age gac gac cca ctg tet ctg cgc 3122

Leu Met Gly Leu Gly Asn Phe Pro Ser Asp Asp Pro Leu Ser Leu Arg300 305 310 315

atg cta ggt atg cat ggc acg gtg tat gea aat tat gea gtg gat aag 3170

Met Leu Gly Met His Gly Thr Val Tyr Ala Asn Tyr Ala Val Asp Lys320 325 330

gcc gat ctg ttg ctt gea ctt ggt gtg cgg ttt gat gat cgt gtg aca 3218

Ala Asp Leu Leu Leu Ala Leu Gly Val Arg Phe Asp Asp Arg Val Thr335 340 345

ggg aag att gag gct ttt gea age agg gct aag att gtg cac gtt gat 3266

Gly Lys Ile Glu Ala Phe Ala Ser Arg Ala Lys Ile Val His Val Asp350 355 360

att gat ccg gct gag att ggc aag aac aag cag cca cat gtg tcc ate 3314

Ile Asp Pro Ala Glu Ile Gly Lys Asn Lys Gln Pro His Val Ser Ile365 370 375

tgt gea gat gtt aag ctt gct ttg cag ggc atg aat gct ctt ctt gaa 3362

Cys Ala Asp Val Lys Leu Ala Leu Gln Gly Met Asn Ala Leu Leu Glu380 385 390 395

gga age aca tca aag aag age ttt gac ttt ggc tca tgg aac gat gag 3410

Gly Ser Thr Ser Lys Lys Ser Phe Asp Phe Gly Ser Trp Asn Asp Glu400 405 410

ttg gat cag cag aag agg gaa ttc ccc ctt ggg tat aaa aca tet aat 3458

Leu Asp Gln Gln Lys Arg Glu Phe Pro Leu Gly Tyr Lys Thr Ser Asn415 420 425

gag gag ate cag cca caa tat gct att cag gtt ctt gat gag ctg acg 3506

Glu Glu Ile Gln Pro Gln Tyr Ala Ile Gln Val Leu Asp Glu Leu Thr430 435 440aaa ggc gag gcc ate ate ggc aca ggt gtt ggg cag cac cag atg tgg 3554

Lys Gly Glu Ala Ile Ile Gly Thr Gly Val Gly Gln His Gln Met Trp445 450 455

gcg gea cag tac tac act tac aag cgg cca agg cag tgg ttg tet tca 3602

Ala Ala Gln Tyr Tyr Thr Tyr Lys Arg Pro Arg Gln Trp Leu Ser Ser460 465 470 475

gct ggt ctt ggg gct atg gga ttt ggt ttg ccg gct gct gct ggt gct 3650

Ala Gly Leu Gly Ala Met Gly Phe Gly Leu Pro Ala Ala Ala Gly Ala480 485 490

tet gtg gcc aac cca ggt gtt act gtt gtt gac ate gat gga gat ggt 3698

Ser Val Ala Asn Pro Gly Val Thr Val Val Asp Ile Asp Gly Asp Gly495 500 505

age ttt etc atg aac gtt cag gag cta gct atg ate cga att gag aac 3746

Ser Phe Leu Met Asn Val Gln Glu Leu Ala Met Ile Arg Ile Glu Asn510 515 520

ctc ccg gtg aag gtc ttt gtg cta aac aac cag cac ctg ggg atg gtg 3794

Leu Pro Val Lys Val Phe Val Leu Asn Asn Gln His Leu Gly Met Val525 530 535

gtg cag tgg gag gac agg ttc tat aag gcc aac aga gcg cac aca tac 3842

Val Gln Trp Glu Asp Arg Phe Tyr Lys Ala Asn Arg Ala His Thr Tyr540 545 550 555

ttg gga aac cca gag aat gaa agt gag ata tat cca gat ttc gtg acg 3890

Leu Gly Asn Pro Glu Asn Glu Ser Glu Ile Tyr Pro Asp Phe Val Thr560 565 570

ate gcc aaa ggg ttc aac att cca gcg gtc cgt gtg aca aag aag aac 3938

Ile Ala Lys Gly Phe Asn Ile Pro Ala Val Arg Val Thr Lys Lys Asn575 580 585

gaa gtc cgc gea gcg ata aag aag atg ctc gag act cca ggg ccg tac 3986

Glu Val Arg Ala Ala Ile Lys Lys Met Leu Glu Thr Pro Gly Pro Tyr590 595 600

ctc ttg gat ata ate gtc cca cac cag gag cat gtg ttg cct atg ate 4034

Leu Leu Asp Ile Ile Val Pro His Gln Glu His Val Leu Pro Met Ile605 610 615

cct aat ggt ggg gct ttc aag gat atg ate ctg gat ggt gat ggc agg 4082

Pro Asn Gly Gly Ala Phe Lys Asp Met Ile Leu Asp Gly Asp Gly Arg620 625 630 635

act gtg tac tga tctaaaatcc agcaagcaac tgatctaaaa tccagcaagc 4134

Thr Val Tyr

accgcctccc tgctagtaca agggtgatat gtttttatct gtgtgatgtt ctcctgtatt 4194

ctatcttttt ttgtaggccg teagetatet gttatggtaa tcctatgtag cttccgacct 4254tgtaattgtg tagtctgttg ttttccttct ggcatgtgtc ataagagatc atttaagtgc 4314cttttgctac atataaataa gataataagc actgctatgc agtggttctg aattggcttc 4374

tgttgccaaa tttaagtgtc caactggtcc ttgcttttgt tttegetatt tttttccttt 4434tttagttatt attatattgg taatttcaac tcaacatatg atgtatggaa taatgctagg 4494

gctgcaattt caaactattt tacaaaccag aatggcattt tcgtggtttg aggggagtga 4554

aaaaaaatga ggcatttgac tgaattagtt acctgatcca ttttcgtggt ttggatcatt 4614

ggaattaaat tccattctaa taatagtaat tttggcatat atcaattaag ttaattcggt 4674

tttatgcaaa atatatttgt atactattat tatcaagatg tcggagatat ttatatgcta 4734

catttttact atacaggagt gagatgaaga gtgtcatgta agttacacag tagaaacaaa 4794

ttctattaat gcataaaatc atttccatca tccaccctat gaatttgaga tagacctata 4854

tctaaacttt gaaaagtggt tgaatatcaa attccaaatt aaataagtta ttttattgag 4914

tgaattctaa tttctctaaa acgaagggat ctaaacgccc tctaaagcta atttggaaac 4 974

tcaaactttc ttagcattgg aggggattga gaaaaaatat taattcattt tcatctcaat 5034

cattcaatct ccaaagagat ttgagttcct tattagtctg ttccatgcat caaatcggct 5094

caatgtgtca ttatttgcca tgacgattga cgagttgttc tggggcctag cgctttccac 5154

gccgatgtgc tggggcctgg tcctggagaa gacagcttga tatttaaagc tatcaattgt 5214

ttcaattgat tcccacttca tttttctaaa tgtagaaaac ggtgacgtat aagaaaaaga 5274

atgaattagg acttttattc cgtacactaa tctagagcgg ccgcaagctt gtacaacgcg 5334

taccggttaa ttaaggtacc caattgcata tgtaatcctg gctagcaaca ctgaactatg 5394

ccagaaacca catcaaagat atgggcaagc ttcttggccc attatatcca aagacctcag 5454

agaaaggtga gcgaaggctc aattcagaag attggaagct gatcaatagg atcaagacaa 5514

tggtgagaac gcttccaaat ctcactattc caccagaaga tgcatacatt atcattgaaa 5574

cagatgcatg tgcaactgga tggggagcag tatgcaagtg gaagaaaaac aaggcagacc 5634

caagaaatac agagcaaatc tgtaggtatg ccagtggaaa atttgataag ccaaaaggaa 5694

cctgtgatgc agaaatctat ggggttatga atggcttaga aaagatgaga ttgttctact 5754

tggacaaaag agagatcaca gtcagaactg acagtagtgc aatcgaaagg ttctacaaca 5814

agagtgctga acacaagcct tctgagatca gatggatcag gttcatggac tacatcactg 5874

gtgcaggacc agagatagtc attgaacaca taaaagggaa gagcaatggt ttagctgaca 5934

tcttgtccag gctcaaagcc aaattagctc agaatgaacc aacggaagag atgatcctgc 5994

ttacacaagc cataagggaa gtaattcctt atccagatca tccatacact gagcaactca 6054

gagaatgggg aaacaaaatt ctggatccat tccccacatt caagaaggac atgttcgaaa 6114

gaacagagca agcttttatg ctaacagagg aaccagttct actctgtgca tgcaggaagc 6174

ctgcaattca gttagtgtcc agaacatctg ccaacccagg aaggaaattc ttcaagtgcg 6234

caatgaacaa atgccattgc tggtactggg cagatctcat tgaagaacac attcaagaca 6294

gaattgatga atttctcaag aatcttgaag ttctgaagac cggtggcgtg caaacaatgg 6354aggaggaact tatgaaggaa gtcaccaagc tgaagataga agagcaggag ttcgaggaat 6414accaggccac accaagggct atgtcgccag tageegeaga agatgtgcta gatctccaag 6474acgtaagcaa tgacgattga ggaggcattg acgtcaggga tgaccgcagc ggagagtact 6534gggcccattc agtggatgct ccactgagtt gtattattgt gtgcttttcg gacaagtgtg 6594ctgtccactt tcttttggca cctgtgccac tttattcctt gtctgccacg atgcctttgc 6654ttagcttgta agcaaggatc gcagtgcgtg tgtgacacca ccccccttcc gacgctctgc 6714ctatataagg caccgtctgt aagctcttac gatcatcggt agttcaccaa gggggtaccg 6774

gtcgccacc atg gcc tcc tcc gag aac gtc ate acc gag ttc atg cgc ttc 6825Met Ala Ser Ser Glu Asn Val Ile Thr Glu Phe Met Arg Phe640 645 650

aag gtg cgc atg gag ggc acc gtg aac ggc cac gag ttc gag ate gag 6873

Lys Val Arg Met Glu Gly Thr Val Asn Gly His Glu Phe Glu Ile Glu655 660 665

ggc gag ggc gag ggc cgc ccc tac gag ggc cac aac acc gtg aag ctg 6921

Gly Glu Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly His Asn Thr Val Lys Leu670 675 680

aag gtg acc aag ggc ggc ccc ctg ccc ttc gcc tgg gac ate ctg tcc 6969

Lys Val Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp Ile Leu Ser685 690 695 700

ccc cag ttc cag tac ggc tcc aag gtg tac gtg aag cac ccc gcc gac 7017

Pro Gln Phe Gln Tyr Gly Ser Lys Val Tyr Val Lys His Pro Ala Asp

705 710 715

ate ccc gac tac aag aag ctg tcc ttc ccc gag ggc ttc aag tgg gag 7065

Ile Pro Asp Tyr Lys Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe Lys Trp Glu720 725 730

cgc gtg atg aac ttc gag gac ggc ggc gtg gcg acc gtg acc cag gac 7113

Arg Val Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Val Ala Thr Val Thr Gln Asp735 740 745

tcc tcc ctg cag gac ggc tgc ttc ate tac aag gtg aag ttc ate ggc 7161

Ser Ser Leu Gln Asp Gly Cys Phe Ile Tyr Lys Val Lys Phe Ile Gly750 755 760

gtg aac ttc ccc tcc gac ggc ccc gtg atg cag aag aag acc atg ggc 7209

Val Asn Phe Pro Ser Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Met Gly

765 770 775 780

tgg gag gcc tcc acc gag cgc ctg tac ccc cgc gac ggc gtg ctg aag 7257

Trp Glu Ala Ser Thr Glu Arg Leu Tyr Pro Arg Asp Gly Val Leu Lys

785 790 795

ggc gag acc cac aag gcc ctg aag ctg aag gac ggc ggc cac tac ctg 7305

Gly Glu Thr His Lys Ala Leu Lys Leu Lys Asp Gly Gly His Tyr Leu800 805 810

gtg gag ttc aag tcc ate tac atg gcc aag aag ccc gtg cag ctg ccc 7353

Val Glu Phe Lys Ser Ile Tyr Met Ala Lys Lys Pro Val Gln Leu Pro815 820 825ggc tac tac tac gtg gac gcc aag ctg gac ate acc tcc cac aac gag 7401

Gly Tyr Tyr Tyr Val Asp Ala Lys Leu Asp Ile Thr Ser His Asn Glu

830 835 840

gac tac acc ate gtg gag cag tac gag cgc acc gag ggc cgc cac cac 744 9

Asp Tyr Thr Ile Val Glu Gln Tyr Glu Arg Thr Glu Gly Arg His His845 850 855 860

ctg ttc ctg tag cggccgccct gcagggagct cgaatttccc cgatcgttca 7501

Leu Phe Leu

aacatttggc aataaagttt cttaagattg aatcctgttg ccggtcttgc gatgattatc 7561atataatttc tgttgaatta cgttaagcat gtaataatta acatgtaatg catgacgtta 7621tttatgagat gggtttttat gattagagtc ccgcaattat acatttaata cgcgatagaa 7681aacaaaatat agcgcgcaaa ctaggataaa ttatcgcgcg cggtgtcatc tatgttacta 7741gatcgggaat tcgggcccgg ccggccagat cttgattgtc gtttcccgcc ttcagtttaa 7801actatcagtg tttgacagga tatattggcg ggtaaaccta agagaaaaga gcgtttatta 7861gaataatcgg atatttaaaa gggcgtgaaa aggtttatcc gttcgtccat ttgtatgtgc 7921atgccaacca cagggttccc ctcgggagtg cttggcattc cgtgcgataa tgacttctgt 7981tcaaccaccc aaacgtcgga aagcctgacg acggagcagc attccaaaaa gatcccttgg 8041ctcgtctggg tcggctagaa ggtcgagtgg gctgctgtgg cttgatccct caacgcggtc 8101gcggacgtag cgcagcgccg aaaaatcctc gatcgcaaat ccgacgctgt cgaaaagcgt 8161gatctgcttg tcgctctttc ggccgacgtc ctggccagtc atcacgcgcc aaagttccgt 8221cacaggatga tctggcgcga gttgctggat ctcgccttca atccgggtct gtggcgggaa 8281ctccacgaaa atatccgaac gcagcaagat cgtcgaccaa ttcttgaaga cgaaagggcc 8341tcgtgatacg cctattttta taggttaatg tcatgataat aatggtttct tagacgtcag 8401gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt 8461caaatatgta tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa 8521ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt 8581gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt 8641tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt 8701ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg 8761tattatcccg tgttgacgcc gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga 8821atgacttggt tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa 8881gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga 8941caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa 9001ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca 9061ccacgatgcc gggggggggg gggggggaca tgaggttgcc ccgtattcag tgtcgctgat 9121ttgtattgtc tgaagttgtt tttacgttaa gttgatgcag atcaattaat acgatacctg 9181cgtcataatt gattatttga cgtggtttga tggcctccac gcacgttgtg atatgtagat 9241gataatcatt atcactttac gggtcctttc cggtgatccg acaggttacg gggcggcgac 9301ctcgcgggtt ttcgctattt atgaaaattt tccggtttaa ggcgtttccg ttcttcttcg 9361tcataactta atgtttttat ttaaaatacc ctctgaaaag aaaggaaacg acaggtgctg 9421aaagcgagct ttttggcctc tgtcgtttcc tttctctgtt tttgtccgtg gaatgaacaa 9481tggaaccccc cccccccccc cctgcagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg 9541gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag 9601ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg 9661gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct 9721cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac 9781agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact 9841catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga 9901tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt 9961cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct 10021gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc 10081taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgtcc 10141ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc 10201tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg 10261ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt 10321cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg 10381agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg 10441gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt 10501atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag 10561gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt 10621gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta 10681ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt 10741cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcctga tgcggtattt tctccttacg catctgtgcg 10801gtatttcaca ccgcatatgg tgcactctca gtacaatctg ctctgatgcc gcatagttaa 10861gccagtatac actccgctat cgctacgtga ctgggtcatg gctgcgcccc gacacccgcc 10921aacacccgct gacgcgccct gacgggcttg tctgctcccg gcatccgctt acagacaagc 10981

tgtgaccgtc tccgggagct gcatgtgtca gaggttttca ccgtcatcac cgaaacgcgc 11041

gaggcagcag atcccccgat caagtagata cactacatat atctacaata gacatcgagc 11101

cggaaggtga tgtttacttt cctgaaatcc ccagcaattt taggccagtt tttacccaag 11161

acttcgcctc taacataaat tatagttacc aaatctggca aaagggttga ccgggggggg 11221

ggggaaagcc acgttgtgtc tcaaaatctc tgatgttaca ttgcacaaga taaaaatata 11281

tcatcatgaa caataaaact gtctgcttac ataaacagta atacaagggg tgtt atg 11338

Met

age cat att caa cgg gaa acg tet tgc tcg agg ccg cga tta aat tcc 11386Ser His Ile Gln Arg Glu Thr Ser Cys Ser Arg Pro Arg Leu Asn Ser865 870 875 880

aac atg gat gct gat tta tat ggg tat aaa tgg gct cgc gat aat gtc 11434Asn Met Asp Ala Asp Leu Tyr Gly Tyr Lys Trp Ala Arg Asp Asn Val885 890 895

ggg caa tca ggt gcg aca ate tat cga ttg tat ggg aag ccc gat gcg 11482Gly Gln Ser Gly Ala Thr Ile Tyr Arg Leu Tyr Gly Lys Pro Asp Ala900 905 910

cca gag ttg ttt ctg aaa cat ggc aaa ggt age gtt gcc aat gat gtt 11530Pro Glu Leu Phe Leu Lys His Gly Lys Gly Ser Val Ala Asn Asp Val915 920 925

aca gat gag atg gtc aga cta aac tgg ctg acg gaa ttt atg cct ctt 11578Thr Asp Glu Met Val Arg Leu Asn Trp Leu Thr Glu Phe Met Pro Leu930 935 940

ccg acc ate aag cat ttt ate cgt act cct gat gat gea tgg tta etc 11626Pro Thr Ile Lys His Phe Ile Arg Thr Pro Asp Asp Ala Trp Leu Leu945 950 955 960

acc act gcg ate ccc ggg aaa aca gea ttc cag gta tta gaa gaa tat 11674Thr Thr Ala Ile Pro Gly Lys Thr Ala Phe Gl-n Val Leu Glu Glu Tyr965 970 975

cct gat tca ggt gaa aat att gtt gat gcg ctg gea gtg ttc ctg cgc 11722Pro Asp Ser Gly Glu Asn Ile Val Asp Ala Leu Ala Val Phe Leu Arg980 985 990

cgg ttg cat tcg att cct gtt tgt aat tgt cct ttt aac age gat cgc 11770Arg Leu His Ser Ile Pro Val Cys Asn Cys Pro Phe Asn Ser Asp Arg995 1000 1005

gta ttt cgt ctc gct cag gcg caa tca cga atg aat aac ggt ttg 11815

Val Phe Arg Leu Ala Gln Ala Gln Ser Arg Met Asn Asn Gly Leu1010 1015 1020

gtt gat gcg agt gat ttt gat gac gag cgt aat ggc tgg cct gtt 11860

Val Asp Ala Ser Asp Phe Asp Asp Glu Arg Asn Gly Trp Pro Val1025 1030 1035

gaa caa gtc tgg aaa gaa atg cat aag ctt ttg cca ttc tca ccg 11905

Glu Gln Val Trp Lys Glu Met His Lys Leu Leu Pro Phe Ser Pro1040 1045 1050gat tca gtc gtc act cat ggt gat ttc tca ctt gat aac ctt attAsp Ser Val Val Thr His Gly Asp Phe Ser Leu Asp Asn Leu Ile1055 1060 1065

11950

ttt gac gag ggg aaa tta ata ggt tgt att gat gtt gga cga gtcPhe Asp Glu Gly Lys Leu Ile Gly Cys Ile Asp Val Gly Arg Val1070 1075 1080

11995

gga ate gea gac cga tac cag gat ctt gcc ate cta tgg aac tgcGly Ile Ala Asp Arg Tyr Gln Asp Leu Ala Ile Leu Trp Asn Cys1085 1090 1095

12040

ctc ggt gag ttt tet cct tca tta cag aaa cgg ctt ttt caa aaaLeu Gly Glu Phe Ser Pro Ser Leu Gln Lys Arg Leu Phe Gln Lys1100 1105 1110

12085

tat ggt att gat aat cct gat atg aat aaa ttg cag ttt cat ttgTyr Gly Ile Asp Asn Pro Asp Met Asn Lys Leu Gln Phe His Leu1115 1120 1125

12130

atg ctc gat gag ttt ttc taa tcagaattgg ttaattggtt gtaacactggMet Leu Asp Glu Phe Phe1130

12181

cagagcatta cgctgacttg acgggacggc ggctttgttg aataaatcga acttttgctg 12241

agttgaagga tcagatcacg catcttcccg acaacgcaga ccgttccgtg gcaaagcaaa 12301

agttcaaaat caccaactgg tccacctaca acaaagctct catcaaccgt ggctccctca 12361

ctttctggct ggatgatggg gcgattcagg gatcacaggc agcaacgctc tgtcatcgtt 12421

acaatcaaca tgctaccctc cgcgagatca tccgtgtttc aaacccggca gcttagttgc 12481

cgttcttccg aatagcatcg gtaacatgag caaagtctgc cgccttacaa cggctctccc 12541

gctgacgccg tcccggactg atgggctgcc tgtatcgagt ggtgat 12587

<210> 213

<211> 638

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Construto sintético<4 00> 213

Met Ala Thr Ala Ala Ala Ala Ser Thr Ala Leu Thr Gly Ala Thr Thr15 10 15

Ala Ala Pro Lys Ala Arg Arg Arg Ala His Leu Leu Ala Thr Arg Arg20 25 30

Ala Leu Ala Ala Pro Ile Arg Cys Ser Ala Ala Ser Pro Ala Met Pro35 40 45

Met Ala Pro Pro Ala Thr Pro Leu Arg Pro Trp Gly Pro Thr Asp Pro50 55 60

Arg Lys Gly Ala Asp Ile Leu Val Glu Ser Leu Glu Arg Cys Gly Val65 70 75 80

Arg Asp Val Phe Ala Tyr Pro Gly Gly Ala Ser Met Glu Ile His Gln85 90 95

Ala Leu Thr Arg Ser Pro Val Ile Ala Asn His Leu Phe Arg His Glu100 105 110

Gln Gly Glu Ala Phe Ala Ala Ser Gly Tyr Ala Arg Ser Ser Gly Arg115 120 125

Val Gly Val Cys Ile Ala Thr Ser Gly Pro Gly Ala Thr Asn Leu Val130 135 140

Ser Ala Leu Ala Asp Ala Leu Leu Asp Ser Val Pro Met Val Ala Ile145 150 155 160

Thr Gly Gln Val Pro Arg Arg Met Ile Gly Thr Asp Ala Phe Gln Glu165 170 175

Thr Pro Ile Val Glu Val Thr Arg Ser Ile Thr Lys His Asn Tyr Leu180 185 190

Val Leu Asp Val Asp Asp Ile Pro Arg Val Val Gln Glu Ala Phe Phe195 200 205

Leu Ala Ser Ser Gly Arg Pro Gly Pro Val Leu Val Asp Ile Pro Lys210 215 220

Asp Ile Gln Gln Gln Met Ala Val Pro Val Trp Asp Lys Pro Met Ser225 230 235 240

Leu Pro Gly Tyr Ile Ala Arg Leu Pro Lys Pro Pro Ala Thr Glu Leu245 250 255

Leu Glu Gln Val Leu Arg Leu Val Gly Glu Ser Arg Arg Pro Val Leu260 265 270

Tyr Val Gly Gly Gly Cys Ala Ala Ser Gly Glu Glu Leu Arg Arg Phe275 280 285

Val Glu Leu Thr Gly Ile Pro Val Thr Thr Thr Leu Met Gly Leu Gly290 295 300Asn Phe Pro Ser Asp Asp Pro Leu Ser Leu Arg Met Leu Gly Met His305 310 315 320

Gly Thr Val Tyr Ala Asn Tyr Ala Val Asp Lys Ala Asp Leu Leu Leu325 330 335

Ala Leu Gly Val Arg Phe Asp Asp Arg Val Thr Gly Lys Ile Glu Ala340 345 350

Phe Ala Ser Arg Ala Lys Ile Val His Val Asp Ile Asp Pro Ala Glu355 360 365

Ile Gly Lys Asn Lys Gln Pro His Val Ser Ile Cys Ala Asp Val Lys370 375 380

Leu Ala Leu Gln Gly Met Asn Ala Leu Leu Glu Gly Ser Thr Ser Lys385 390 395 400

Lys Ser Phe Asp Phe Gly Ser Trp Asn Asp Glu Leu Asp Gln Gln Lys405 410 415

Arg Glu Phe Pro Leu Gly Tyr Lys Thr Ser Asn Glu Glu Ile Gln Pro420 425 430

Gln Tyr Ala Ile Gln Val Leu Asp Glu Leu Thr Lys Gly Glu Ala Ile435 440 445

Ile Gly Thr Gly Val Gly Gln His Gln Met Trp Ala Ala Gln Tyr Tyr450 455 460

Thr Tyr Lys Arg Pro Arg Gln Trp Leu Ser Ser Ala Gly Leu Gly Ala465 470 475 480

Met Gly Phe Gly Leu Pro Ala Ala Ala Gly Ala Ser Val Ala Asn Pro485 490 495

Gly Val Thr Val Val Asp Ile Asp Gly Asp Gly Ser Phe Leu Met Asn500 505 510

Val Gln Glu Leu Ala Met Ile Arg Ile Glu Asn Leu Pro Val Lys Val515 520 525

Phe Val Leu Asn Asn Gln His Leu Gly Met Val Val Gln Trp Glu Asp530 535 540

Arg Phe Tyr Lys Ala Asn Arg Ala His Thr Tyr Leu Gly Asn Pro Glu545 550 555 560Asn Glu Ser Glu Ile Tyr Pro Asp Phe Val Thr Ile Ala Lys Gly Phe565 570 575

Asn Ile Pro Ala Val Arg Val Thr Lys Lys Asn Glu Val Arg Ala Ala580 585 590

Ile Lys Lys Met Leu Glu Thr Pro Gly Pro Tyr Leu Leu Asp Ile Ile595 600 605

Val Pro His Gln Glu His Val Leu Pro Met Ile Pro Asn Gly Gly Ala610 615 620

Phe Lys Asp Met Ile Leu Asp Gly Asp Gly Arg Thr Val Tyr

625

630

635

<210> 214

<211> 225

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Construto sintético

<4 00> 214

Met Ala Ser Ser Glu Asn Val Ile Thr Glu Phe Met Arg Phe Lys Val15 10 15

Arg Met Glu Gly Thr Val Asn Gly His Glu Phe Glu Ile Glu Gly Glu20 25 30

Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly His Asn Thr Val Lys Leu Lys Val35 40 45

Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp Ile Leu Ser Pro Gln50 55 60

Phe Gln Tyr Gly Ser Lys Val Tyr Val Lys His Pro Ala Asp Ile Pro65 70 75 80

Asp Tyr Lys Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe Lys Trp Glu Arg Val85 90 95

Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Val Ala Thr Val Thr Gln Asp Ser Ser100 105 110

Leu Gln Asp Gly Cys Phe Ile Tyr Lys Val Lys Phe Ile Gly Val Asn115 120 125Phe Pro Ser Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Met Gly Trp Glu130 135 140

Ala Ser Thr Glu Arg Leu Tyr Pro Arg Asp Gly Val Leu Lys Gly Glu145 150 155 160

Thr His Lys Ala Leu Lys Leu Lys Asp Gly Gly His Tyr Leu Val Glu165 170 175

Phe Lys Ser Ile Tyr Met Ala Lys Lys Pro Val Gln Leu Pro Gly Tyr180 185 190

Tyr Tyr Val Asp Ala Lys Leu Asp Ile Thr Ser His Asn Glu Asp Tyr195 200 205

Thr Ile Val Glu Gln Tyr Glu Arg Thr Glu Gly Arg His His Leu Phe210 215 220

Leu225

<210> 215

<211> 271

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Construto sintético<4 00> 215

Met Ser His Ile Gln Arg Glu Thr Ser Cys Ser Arg Pro Arg Leu Asn15 10 15

Ser Asn Met Asp Ala Asp Leu Tyr Gly Tyr Lys Trp Ala Arg Asp Asn20 25 30

Val Gly Gln Ser Gly Ala Thr Ile Tyr Arg Leu Tyr Gly Lys Pro Asp35 40 45

Ala Pro Glu Leu Phe Leu Lys His Gly Lys Gly Ser Val Ala Asn Asp50 55 60

Val Thr Asp Glu Met Val Arg Leu Asn Trp Leu Thr Glu Phe Met Pro65 70 75 80

Leu Pro Thr Ile Lys His Phe Ile Arg Thr Pro Asp Asp Ala Trp Leu85 90 95

Leu Thr Thr Ala Ile Pro Gly Lys Thr Ala Phe Gln Val Leu Glu Glu100 105 110

Tyr Pro Asp Ser Gly Glu Asn Ile Val Asp Ala Leu Ala Val Phe Leu115 120 125

Arg Arg Leu His Ser Ile Pro Val Cys Asn Cys Pro Phe Asn Ser Asp130 135 140

Arg Val Phe Arg Leu Ala Gln Ala Gln Ser Arg Met Asn Asn Gly Leu145 150 155 160

Val Asp Ala Ser Asp Phe Asp Asp Glu Arg Asn Gly Trp Pro Val Glu165 170 175

Gln Val Trp Lys Glu Met His Lys Leu Leu Pro Phe Ser Pro Asp Ser180 185 190

Val Val Thr His Gly Asp Phe Ser Leu Asp Asn Leu Ile Phe Asp Glu195 200 205

Gly Lys Leu Ile Gly Cys Ile Asp Val Gly Arg Val Gly Ile Ala Asp210 215 220

Arg Tyr Gln Asp Leu Ala Ile Leu Trp Asn Cys Leu Gly Glu Phe Ser225 230 235 240

Pro Ser Leu Gln Lys Arg Leu Phe Gln Lys Tyr Gly Ile Asp Asn Pro245 250 255

Asp Met Asn Lys Leu Gln Phe His Leu Met Leu Asp Glu Phe Phe260 265 270

<210> 216

<211> 12590

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> vetor binário para expressar dsRed em milho

<220>

<221> região_rep

<222> (42)..(66)

<223> Região de repetição de borda de T-DNA esquerda<220>

<221> promotor

<222> (157) .. (2144)

<223> promotor de Ubiquitina de milho: íntron de Ubiquitina de milho<220><221> CDS

<222> (2178)..(4094)

<223> ZmAHAS L2 S653(At)N (XI12) cds

<220>

<221> terminador

<222> (4095)..(5310)

<223> seqüência de AHASL2 [XI12] 3'/UTR de milho com terminador<220>

<221> promotor

<222> (5368)..(6765)

<223> Promotor de vírus baciliforme de cana-de-açúcar [ScBV]<220>

<221> CDS

<222> (6784)..(7461)

<223> proteína fluorescente vermelha de Discosoma sp.[drFP583;1]<220>

<221> terminador

<222> (7496) .. (7748)

<223> Terminador de Nopalina Sintase poli-A.<220>

<221> região_rep

<222> (7778)..(7922)

<223> RB completo de pSBll

<220>

<221> origem_rep<222> (10200) .. (10480)

<223> origem de replicação de pBR322[ecoli] de AF234316 pCambia2301<220>

<221> CDS

<222> (11339) .. (12154)

<223> Gene de seleção de resistência à canamicina para microorganismo.<4 00> 216

tttgtgccga gctgccggtc ggggagctgt tggctggctg gtggcaggat atattgtggt 60

gtaaacaaat tgacgcttag acaacttaat aacacattgc ggacgttttt aatgtactga 120attggatccg cccgggcggt accaagcttc cgcggctgca gtgcagcgtg acccggtcgt 180gcccctctct agagataatg agcattgcat gtctaagtta taaaaaatta ccacatattt 240tttttgtcac acttgtttga agtgcagttt atctatcttt atacatatat ttaaacttta 300ctctacgaat aatataatct atagtactac aataatatca gtgttttaga gaatcatata 360aatgaacagt tagacatggt ctaaaggaca attgagtatt ttgacaacag gactctacag 420ttttatcttt ttagtgtgca tgtgttctcc tttttttttg caaatagctt cacctatata 480atacttcatc cattttatta gtacatccat ttagggttta gggttaatgg tttttataga 540ctaatttttt tagtacatct attttattct attttagcct ctaaattaag aaaactaaaa 600ctctatttta gtttttttat ttaatagttt agatataaaa tagaataaaa taaagtgact 660aaaaattaaa caaataccct ttaagaaatt aaaaaaacta aggaaacatt tttcttgttt 720cgagtagata atgccagcct gttaaacgcc gtcgacgagt ctaacggaca ccaaccagcg 780aaccagcagc gtcgcgtcgg gccaagcgaa gcagacggca cggcatctct gtcgctgcct 840ctggacccct ctcgagagtt ccgctccacc gttggacttg ctccgctgtc ggcatccaga 900aattgcgtgg cggagcggca gacgtgagcc ggcacggcag gcggcctcct cctcctctca 960cggcaccggc agctacgggg gattcctttc ccaccgctcc ttcgctttcc cttcctcgcc 1020cgccgtaata aatagacacc ccctccacac cctctttccc caacctcgtg ttgttcggag 1080cgcacacaca cacaaccaga tctcccccaa atccacccgt cggcacctcc gcttcaaggt 1140acgccgctcg tcctcccccc ccccccccct ctctaccttc tetagategg cgttccggtc 1200catggttagg gcccggtagt tctacttctg ttcatgtttg tgttagatcc gtgtttgtgt 1260tagatccgtg ctgctagcgt tcgtacacgg atgcgacctg tacgtcagac acgttctgat 1320tgctaacttg ccagtgtttc tctttgggga atcctgggat ggctctagcc gttccgcaga 1380cgggatcgat ttcatgattt tttttgtttc gttgcatagg gtttggtttg cccttttcct 1440ttatttcaat atatgccgtg cacttgtttg tcgggtcatc ttttcatgct tttttttgtc 1500ttggttgtga tgatgtggtc tggttgggcg gtcgttctag atcggagtag aattctgttt 1560caaactacct ggtggattta ttaattttgg atctgtatgt gtgtgccata catattcata 1620gttacgaatt gaagatgatg gatggaaata tcgatctagg ataggtatac atgttgatgc 1680gggttttact gatgcatata cagagatgct ttttgttcgc ttggttgtga tgatgtggtg 1740tggttgggcg gtcgttcatt cgttctagat cggagtagaa tactgtttca aactacctgg 1800tgtatttatt aattttggaa ctgtatgtgt gtgtcataca tcttcatagt tacgagttta 1860agatggatgg aaatatcgat ctaggatagg tatacatgtt gatgtgggtt ttactgatgc 1920atatacatga tggcatatgc ageatetatt catatgctct aaccttgagt acctatctat 1980tataataaac aagtatgttt tataattatt tcgatcttga tatacttgga tgatggcata 2040tgcagcagct atatgtggat ttttttagcc ctgccttcat acgctattta tttgcttggt 2100actgtttctt ttgtcgatgc tcaccctgtt gtttggtgtt acttctgcag ggtacggatc 2160

cactagttct agaaacc atg gcc acc gcc gcc gcc gcg tct acc gcg ctc 2210

Met Ala Thr Ala Ala Ala Ala Ser Thr Ala Leu15 10

act ggc gcc act acc gct gcg ccc aag gcg agg cgc cgg gcg cac ctc 2258

Thr Gly Ala Thr Thr Ala Ala Pro Lys Ala Arg Arg Arg Ala His Leu15 20 25

ctg gcc acc cgc cgc gcc ctc gcc gcg ccc ate agg tgc tca gcg gcg 2306

Leu Ala Thr Arg Arg Ala Leu Ala Ala Pro Ile Arg Cys Ser Ala Ala30 35 40

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Ser Pro Ala Met Pro Met Ala Pro Pro Ala Thr Pro Leu Arg Pro Trpggc ccc acc gat ccc cgc aag ggc gcc gac ate ctc gtc gag tcc ctc 2402

Gly Pro Thr Asp Pro Arg Lys Gly Ala Asp Ile Leu Val Glu Ser Leu60 65 70 75

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Glu Arg Cys Gly Val Arg Asp Val Phe Ala Tyr Pro Gly Gly Ala Ser80 85 90

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Leu Phe Arg His Glu Gln Gly Glu Ala Phe Ala Ala Ser Gly Tyr Ala110 115 120

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Arg Ser Ser Gly Arg Val Gly Val Cys Ile Ala Thr Ser Gly Pro Gly125 130 135

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Ala Thr Asn Leu Val Ser Ala Leu Ala Asp Ala Leu Leu Asp Ser Val140 145 150 155

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Pro Met Val Ala Ile Thr Gly Gln Val Pro Arg Arg Met Ile Gly Thr160 165 170

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Asp Ala Phe Gln Glu Thr Pro Ile Val Glu Val Thr Arg Ser Ile Thr175 180 185

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Lys His Asn Tyr Leu Val Leu Asp Val Asp Asp Ile Pro Arg Val Val190 195 200

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Gln Glu Ala Phe Phe Leu Ala Ser Ser Gly Arg Pro Gly Pro Val Leu205 210 215

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Val Asp Ile Pro Lys Asp Ile Gln Gln Gln Met Ala Val Pro Val Trp220 225 230 235

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Asp Lys Pro Met Ser Leu Pro Gly Tyr Ile Ala Arg Leu Pro Lys Pro240 245 250

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Pro Ala Thr Glu Leu Leu Glu Gln Val Leu Arg Leu Val Gly Glu Ser255 260 265

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Arg Arg Pro Val Leu Tyr Val Gly Gly Gly Cys Ala Ala Ser Gly Glu270 275 280

gag ttg cga cgc ttt gtg gag ctg act gga ate ccg gtc aca act act 3074

Glu Leu Arg Arg Phe Val Glu Leu Thr Gly Ile Pro Val Thr Thr Thr285 290 295

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3122Leu Met Gly Leu Gly Asn Phe Pro Ser Asp Asp Pro Leu Ser Leu Arg300 305 310 315

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Met Leu Gly Met His Gly Thr Val Tyr Ala Asn Tyr Ala Val Asp Lys320 325 330

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Ala Asp Leu Leu Leu Ala Leu Gly Val Arg Phe Asp Asp Arg Val Thr335 340 345

ggg aag att gag gct ttt gca age agg gct aag att gtg cac gtt gat 3266

Gly Lys Ile Glu Ala Phe Ala Ser Arg Ala Lys Ile Val His Val Asp350 355 360

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Ile Asp Pro Ala Glu Ile Gly Lys Asn Lys Gln Pro His Val Ser Ile365 370 375

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Cys Ala Asp Val Lys Leu Ala Leu Gln Gly Met Asn Ala Leu Leu Glu380 385 390 395

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Gly Ser Thr Ser Lys Lys Ser Phe Asp Phe Gly Ser Trp Asn Asp Glu400 405 410

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Glu Glu Ile Gln Pro Gln Tyr Ala Ile Gln Val Leu Asp Glu Leu Thr430 435 440

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Lys Gly Glu Ala Ile Ile Gly Thr Gly Val Gly Gln His Gln Met Trp445 450 455

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Ala Ala Gln Tyr Tyr Thr Tyr Lys Arg Pro Arg Gln Trp Leu Ser Ser460 465 470 475

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Ala Gly Leu Gly Ala Met Gly Phe Gly Leu Pro Ala Ala Ala Gly Ala480 485 490

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Ser Val Ala Asn Pro Gly Val Thr Val Val Asp Ile Asp Gly Asp Gly495 500 505

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Leu Pro Val Lys Val Phe Val Leu Asn Asn Gln His Leu Gly Met Val525 530 535

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Val Gln Trp Glu Asp Arg Phe Tyr Lys Ala Asn Arg Ala His Thr Tyr540 545 550 555ttg gga aac cca gag aat gaa agt gag ata tat cca gat ttc gtg acg 3890

Leu Gly Asn Pro Glu Asn Glu Ser Glu Ile Tyr Pro Asp Phe Val Thr

560 565 570

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Ile Ala Lys Gly Phe Asn Ile Pro Ala Val Arg Val Thr Lys Lys Asn575 580 585

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Glu Val Arg Ala Ala Ile Lys Lys Met Leu Glu Thr Pro Gly Pro Tyr590 595 600

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Leu Leu Asp Ile Ile Val Pro His Gln Glu His Val Leu Pro Met Ile605 610 615

cct aat ggt ggg gct ttc aag gat atg ate ctg gat ggt gat ggc agg 4082

Pro Asn Gly Gly Ala Phe Lys Asp Met Ile Leu Asp Gly Asp Gly Arg

620 625 630 635

act gtg tac tga tctaaaatcc agcaagcaac tgatctaaaa tccagcaagc 4134

Thr Val Tyr

accgcctccc tgctagtaca agggtgatat gtttttatct gtgtgatgtt ctcctgtatt 4194ctatcttttt ttgtaggccg teagetatet gttatggtaa tcctatgtag cttccgacct 4254tgtaattgtg tagtctgttg ttttccttct ggcatgtgtc ataagagatc atttaagtgc 4314cttttgctac atataaataa gataataagc actgctatgc agtggttctg aattggcttc 4374tgttgccaaa tttaagtgtc caactggtcc ttgcttttgt tttegetatt tttttccttt 4434tttagttatt attatattgg taatttcaac tcaacatatg atgtatggaa taatgctagg 4494gctgcaattt caaactattt tacaaaccag aatggcattt tcgtggtttg aggggagtga 4554aaaaaaatga ggcatttgac tgaattagtt acctgatcca ttttcgtggt ttggatcatt 4614ggaattaaat tccattctaa taatagtaat tttggcatat atcaattaag ttaattcggt 4674tttatgcaaa atatatttgt atactattat tatcaagatg tcggagatat ttatatgcta 4734catttttact atacaggagt gagatgaaga gtgtcatgta agttacacag tagaaacaaa 4794ttctattaat gcataaaatc atttccatca tccaccctat gaatttgaga tagacctata 4854tctaaacttt gaaaagtggt tgaatatcaa attccaaatt aaataagtta ttttattgag 4914tgaattctaa tttctctaaa acgaagggat ctaaacgccc tctaaagcta atttggaaac 4974tcaaactttc ttagcattgg aggggattga gaaaaaatat taattcattt tcatctcaat 5034cattcaatct ccaaagagat ttgagttcct tattagtctg ttccatgcat caaatcggct 5094caatgtgtca ttatttgcca tgacgattga cgagttgttc tggggcctag cgctttccac 5154gccgatgtgc tggggcctgg tcctggagaa gacagcttga tatttaaagc tatcaattgt 5214ttcaattgat tcccacttca tttttctaaa tgtagaaaac ggtgacgtat aagaaaaaga 5274atgaattagg acttttattc cgtacactaa tctagagcgg ccgcaagctt gtacaacgcg 5334taccggttaa ttaaggtacc caattgcata tgtaatcctg gctagcaaca ctgaactatg 5394ccagaaacca catcaaagat atgggcaagc ttcttggccc attatatcca aagacctcag 5454agaaaggtga gcgaaggctc aattcagaag attggaagct gatcaatagg atcaagacaa 5514tggtgagaac gcttccaaat ctcactattc caccagaaga tgcatacatt atcattgaaa 5574cagatgcatg tgcaactgga tggggagcag tatgcaagtg gaagaaaaac aaggcagacc 5634caagaaatac agagcaaatc tgtaggtatg ccagtggaaa atttgataag ccaaaaggaa 5694cctgtgatgc agaaatctat ggggttatga atggcttaga aaagatgaga ttgttctact 5754tggacaaaag agagatcaca gtcagaactg acagtagtgc aatcgaaagg ttctacaaca 5814agagtgctga acacaagcct tctgagatca gatggatcag gttcatggac tacatcactg 5874gtgcaggacc agagatagtc attgaacaca taaaagggaa gagcaatggt ttagctgaca 5934tcttgtccag gctcaaagcc aaattagctc agaatgaacc aacggaagag atgatcctgc 5994ttacacaagc cataagggaa gtaattcctt atccagatca tccatacact gagcaactca 6054gagaatgggg aaacaaaatt ctggatccat tccccacatt caagaaggac atgttcgaaa 6114gaacagagca agcttttatg ctaacagagg aaccagttct actctgtgca tgcaggaagc 6174ctgcaattca gttagtgtcc agaacatctg ccaacccagg aaggaaattc ttcaagtgcg 6234caatgaacaa atgccattgc tggtactggg cagatctcat tgaagaacac attcaagaca 6294gaattgatga atttctcaag aatcttgaag ttctgaagac cggtggcgtg caaacaatgg 6354aggaggaact tatgaaggaa gtcaccaagc tgaagataga agagcaggag ttcgaggaat 6414accaggccac accaagggct atgtcgccag tageegeaga agatgtgcta gatctccaag 6474acgtaagcaa tgacgattga ggaggcattg acgtcaggga tgaccgcagc ggagagtact 6534gggcccattc agtggatgct ccactgagtt gtattattgt gtgcttttcg gacaagtgtg 6594ctgtccactt tcttttggca cctgtgccac tttattcctt gtctgccacg atgcctttgc 6654ttagcttgta agcaaggatc gcagtgcgtg tgtgacacca ccccccttcc gacgctctgc 6714ctatataagg caccgtctgt aagctcttac gatcatcggt agttcaccaa gggggtaccg 6774

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Ser Ser Leu Gln Asp Gly Cys Phe Ile Tyr Lys Val Lys Phe Ile Gly750 755 760

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Gly Glu Thr His Lys Ala Leu Lys Leu Lys Asp Gly Gly His Tyr Leu800 805 810

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Leu Phe Leu

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<210> 217

<211> 638

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Construto sintético

<4 00> 217

Met Ala Thr Ala Ala Ala Ala Ser Thr Ala Leu Thr Gly Ala Thr Thr15 10 15

Ala Ala Pro Lys Ala Arg Arg Arg Ala His Leu Leu Ala Thr Arg Arg20 25 30

Ala Leu Ala Ala Pro Ile Arg Cys Ser Ala Ala Ser Pro Ala Met Pro35 40 45

Met Ala Pro Pro Ala Thr Pro Leu Arg Pro Trp Gly Pro Thr Asp Pro50 55 60

Arg Lys Gly Ala Asp Ile Leu Val Glu Ser Leu Glu Arg Cys Gly Val65 70 75 80

Arg Asp Val Phe Ala Tyr Pro Gly Gly Ala Ser Met Glu Ile His Gln85 90 95

Ala Leu Thr Arg Ser Pro Val Ile Ala Asn His Leu Phe Arg His Glu100 105 110

Gln Gly Glu Ala Phe Ala Ala Ser Gly Tyr Ala Arg Ser Ser Gly Arg115 120 125

Val Gly Val Cys Ile Ala Thr Ser Gly Pro Gly Ala Thr Asn Leu Val130 135 140

Ser Ala Leu Ala Asp Ala Leu Leu Asp Ser Val Pro Met Val Ala Ile145 150 155 160

Thr Gly Gln Val Pro Arg Arg Met Ile Gly Thr Asp Ala Phe Gln Glu165 170 175Thr Pro Ile Val Glu Val Thr Arg Ser Ile Thr Lys His Asn Tyr Leu180 185 190

Val Leu Asp Val Asp Asp Ile Pro Arg Val Val Gln Glu Ala Phe Phe195 200 205

Leu Ala Ser Ser Gly Arg Pro Gly Pro Val Leu Val Asp Ile Pro Lys210 215 220

Asp Ile Gln Gln Gln Met Ala Val Pro Val Trp Asp Lys Pro Met Ser225 230 235 240

Leu Pro Gly Tyr Ile Ala Arg Leu Pro Lys Pro Pro Ala Thr Glu Leu245 250 255

Leu Glu Gln Val Leu Arg Leu Val Gly Glu Ser Arg Arg Pro Val Leu260 265 270

Tyr Val Gly Gly Gly Cys Ala Ala Ser Gly Glu Glu Leu Arg Arg Phe275 280 285

Val Glu Leu Thr Gly Ile Pro Val Thr Thr Thr Leu Met Gly Leu Gly290 295 300

Asn Phe Pro Ser Asp Asp Pro Leu Ser Leu Arg Met Leu Gly Met His305 310 315 320

Gly Thr Val Tyr Ala Asn Tyr Ala Val Asp Lys Ala Asp Leu Leu Leu325 330 335

Ala Leu Gly Val Arg Phe Asp Asp Arg Val Thr Gly Lys Ile Glu Ala340 345 350

Phe Ala Ser Arg Ala Lys Ile Val His Val Asp Ile Asp Pro Ala Glu355 360 365

Ile Gly Lys Asn Lys Gln Pro His Val Ser Ile Cys Ala Asp Val Lys370 375 380

Leu Ala Leu Gln Gly Met Asn Ala Leu Leu Glu Gly Ser Thr Ser Lys385 390 395 400

Lys Ser Phe Asp Phe Gly Ser Trp Asn Asp Glu Leu Asp Gln Gln Lys405 410 415

Arg Glu Phe Pro Leu Gly Tyr Lys Thr Ser Asn Glu Glu Ile Gln Pro420 425 430Gln Tyr Ala Ile Gln Val Leu Asp Glu Leu Thr Lys Gly Glu Ala Ile435 440 445

Ile Gly Thr Gly Val Gly Gln His Gln Met Trp Ala Ala Gln Tyr Tyr450 455 460

Thr Tyr Lys Arg Pro Arg Gln Trp Leu Ser Ser Ala Gly Leu Gly Ala465 470 475 480

Met Gly Phe Gly Leu Pro Ala Ala Ala Gly Ala Ser Val Ala Asn Pro485 490 495

Gly Val Thr Val Val Asp Ile Asp Gly Asp Gly Ser Phe Leu Met Asn500 505 510

Val Gln Glu Leu Ala Met Ile Arg Ile Glu Asn Leu Pro Val Lys Val515 520 525

Phe Val Leu Asn Asn Gln His Leu Gly Met Val Val Gln Trp Glu Asp530 535 540

Arg Phe Tyr Lys Ala Asn Arg Ala His Thr Tyr Leu Gly Asn Pro Glu545 550 555 560

Asn Glu Ser Glu Ile Tyr Pro Asp Phe Val Thr Ile Ala Lys Gly Phe565 570 575

Asn Ile Pro Ala Val Arg Val Thr Lys Lys Asn Glu Val Arg Ala Ala580 585 590

Ile Lys Lys Met Leu Glu Thr Pro Gly Pro Tyr Leu Leu Asp Ile Ile595 600 605

Val Pro His Gln Glu His Val Leu Pro Met Ile Pro Asn Gly Gly Ala610 615 620

Phe Lys Asp Met Ile Leu Asp Gly Asp Gly Arg Thr Val Tyr625 630 635

<210> 218

<211> 225

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Construto sintético

<400>

218Met Ala Ser Ser Glu Asn Val Ile Thr Glu Phe Met Arg Phe Lys Val15 10 15

Arg Met Glu Gly Thr Val Asn Gly His Glu Phe Glu Ile Glu Gly Glu20 25 30

Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly His Asn Thr Val Lys Leu Lys Val35 40 45

Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp Ile Leu Ser Pro Gln50 55 60

Phe Gln Tyr Gly Ser Lys Val Tyr Val Lys His Pro Ala Asp Ile Pro65 70 75 80

Asp Tyr Lys Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe Lys Trp Glu Arg Val85 90 95

Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Val Ala Thr Val Thr Gln Asp Ser Ser100 105 110

Leu Gln Asp Gly Cys Phe Ile Tyr Lys Val Lys Phe Ile Gly Val Asn115 120 125

Phe Pro Ser Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Met Gly Trp Glu130 135 140

Ala Ser Thr Glu Arg Leu Tyr Pro Arg Asp Gly Val Leu Lys Gly Glu145 150 155 160

Thr His Lys Ala Leu Lys Leu Lys Asp Gly Gly His Tyr Leu Val Glu165 170 175

Phe Lys Ser Ile Tyr Met Ala Lys Lys Pro Val Gln Leu Pro Gly Tyr180 185 190

Tyr Tyr Val Asp Ala Lys Leu Asp Ile Thr Ser His Asn Glu Asp Tyr195 200 205

Thr Ile Val Glu Gln Tyr Glu Arg Thr Glu Gly Arg His His Leu Phe210 215 220

Leu225

<210><211><212>

219271PRT<213> Artificial

<220>

<223> Construto sintético<400> 219

Met Ser His Ile Gln Arg Glu Thr Ser Cys Ser Arg Pro Arg Leu Asn1 5 10 15

Ser Asn Met Asp Ala Asp Leu Tyr Gly Tyr Lys Trp Ala Arg Asp Asn20 25 30

Val Gly Gln Ser Gly Ala Thr Ile Tyr Arg Leu Tyr Gly Lys Pro Asp35 40 45

Ala Pro Glu Leu Phe Leu Lys His Gly Lys Gly Ser Val Ala Asn Asp50 55 60

Val Thr Asp Glu Met Val Arg Leu Asn Trp Leu Thr Glu Phe Met Pro65 70 75 80

Leu Pro Thr Ile Lys His Phe Ile Arg Thr Pro Asp Asp Ala Trp Leu85 90 95

Leu Thr Thr Ala Ile Pro Gly Lys Thr Ala Phe Gln Val Leu Glu Glu100 105 110

Tyr Pro Asp Ser Gly Glu Asn Ile Val Asp Ala Leu Ala Val Phe Leu115 120 125

Arg Arg Leu His Ser Ile Pro Val Cys Asn Cys Pro Phe Asn Ser Asp130 135 140

Arg Val Phe Arg Leu Ala Gln Ala Gln Ser Arg Met Asn Asn Gly Leu145 150 155 160

Val Asp Ala Ser Asp Phe Asp Asp Glu Arg Asn Gly Trp Pro Val Glu165 170 175

Gln Val Trp Lys Glu Met His Lys Leu Leu Pro Phe Ser Pro Asp Ser180 185 190

Val Val Thr His Gly Asp Phe Ser Leu Asp Asn Leu Ile Phe Asp Glu195 200 205

Gly Lys Leu Ile Gly Cys Ile Asp Val Gly Arg Val Gly Ile Ala Asp210 215 220Arg Tyr Gln225

Asp Leu Ala Ile230

Leu Trp Asn Cys Leu Gly Glu235

Phe Ser240

Pro Ser Leu Gln Lys Arg Leu

Phe Gln Lys Tyr Gly Ile Asp250

Asn Pro255

245

Asp Met Asn Lys Leu Gln Phe His260

Leu Met265

Leu Asp Glu Phe Phe270

<210> 220

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Um oligo curto contém etiqueta miR172<220>

<221> RNA_misc

<222> (10) .. (30)

<223> Quase complementar a miR172

<400> 220

agctcgccgc tgcagcatca tcaggattcc cactgctag 39

<210> 221

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> etiqueta miR 319

<220>

<221> caracteristica_misc

<222> (10)..(29)

<223> Quase complementar a miR 319

<400> 221

agctggatgc agagctccct tcaatccaaa gagcctag 38

<210> 222

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> etiqueta miR 396a

<220>

<221> caracteristica_misc

<222> (10)..(31)

<223> Complementar a miR 396a

<400>

222agctgagggc agttcaataa agctgtggga aattgctag

<210> 223

<211> 43

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> etiqueta miR 398a

<220>

<221> caracteristica_misc

<222> (11)..(31)

<223> Quase complementar a miR 398a

<4 00> 223

agctctcctc aaggggtgac ctaagaacac caccaccacc

<210> 224

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> etiqueta miR 167

<220>

<221> caracteristica_misc

<222> (10)..(31)

<223> Quase complementar a miR 167d

<4 00> 224

agctccctgt tagatcaggc tggcagcttg tatttcctag

<210> 225

<211> 20

<212> RNA

<213> Arabidopsis thaliana

<4 00> 225

ugacagaaga gagugagcac

<210> 226

<211> 21

<212> RNA

<213> Arabidopsis thaliana

<4 00> 226

cgacagaaga gagugagcac a

<210> 227

<211> 21

<212> RNA

<213> Arabidopsis thaliana

<4 00> 227uugacagaag aaagagagca c

<210> 228<211> 21<212> RNA

<213> Arabidopsis thaliana<400> 228

uugacagaag auagagagca c

<210> 229<211> 20<212> RNA

<213> Arabidopsis thaliana<4 00> 229

ucccaaaugu agacaaagca

<210> 230<211> 21<212> RNA

<213> Arabidopsis thaliana<4 00> 230

uuuggauuga agggagcucu a

<210> 231<211> 21<212> RNA

<213> Arabidopsis thaliana<4 00> 231

uuuggauuga agggagcucu u

<210> 232<211> 21<212> RNA

<213> Arabidopsis thaliana<4 00> 232

uuuggauuga agggagcucc u

<210> 233<211> 21<212> RNA

<213> Arabidopsis thaliana<4 00> 233

uugaaaguga cuacaucggg g

<210> 234

<211> 21

<212> RNA

<213> Arabidopsis thaliana

<4 00> 234ucgauaaacc ucugcaucca g

<210> 235<211> 21<212> RNA

<213> Arabidopsis thaliana<400> 235

uggagaagca gggcacgugc a

<210> 236<211> 21<212> RNA

<213> Arabidopsis thaliana<400> 236

uggagaagca gggcacgugc g

<210> 237<211> 21<212> RNA

<213> Arabidopsis thaliana<4 00> 237

ucggaccagg cuucaucccc c

<210> 238<211> 21<212> RNA

<213> Arabidopsis thaliana<4 00> 238

ucggaccagg cuucauuccc c

<210> 239<211> 21<212> RNA

<213> Arabidopsis thaliana<4 00> 239

uuaagcugcc agcaugaucu u

<210> 240<211> 22<212> RNA

<213> Arabidopsis thaliana<4 00> 240

ugaagcugcc agcaugaucu gg

<210> 241

<211> 21

<212> RNA

<213> Arabidopsis thaliana

<4 00> 241ucgcuuggug caggucggga a

<210> 242<211> 21<212> RNA

<213> Arabidopsis thaliana<400> 242

cagccaagga ugacuugccg a

<210> 243<211> 21<212> RNA

<213> Arabidopsis thaliana<400> 243

cagccaagga ugacuugccg g

<210> 244<211> 21<212> RNA

<213> Arabidopsis thaliana<400> 244

ugagccaagg augacuugcc g

<210> 245<211> 21<212> RNA

<213> Arabidopsis thaliana<400> 245

uagccaagga ugacuugccu g

<210> 246<211> 21<212> RNA

<213> Arabidopsis thaliana<400> 246

ugauugagcc gugucaauau c

<210> 247<211> 21<212> RNA

<213> Arabidopsis thaliana<400> 247

ugauugagcc gcgccaauau c

<210> 248

<211> 21

<212> RNA

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 248uugagccgug ccaauaucac g

<210> 249<211> 22<212> RNA

<213> Arabidopsis thaliana<400> 249

uucgcuugca gagagaaauc ac

<210> 250<211> 20<212> RNA

<213> Arabidopsis thaliana<400> 250

uuggacugaa gggagcuccc

<210> 251<211> 20<212> RNA

<213> Arabidopsis thaliana<4 00> 251

uuggacugaa gggagcuccu

<210> 252<211> 21<212> RNA

<213> Arabidopsis thaliana<400> 252

uccaaaggga ucgcauugau c

<210> 253<211> 20<212> RNA

<213> Arabidopsis thaliana<400> 253

uuggcauucu guccaccucc

<210> 254<211> 21<212> RNA

<213> Arabidopsis thaliana<400> 254

cugaaguguu ugggggaacu c

<210> 255

<211> 21

<212> RNA

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 255cugaaguguu uggggggacu c

<210> 256<211> 21<212> RNA

<213> Arabidopsis thaliana<400> 256

uuccacagcu uucuugaacu g

<210> 257<211> 21<212> RNA

<213> Arabidopsis thaliana<400> 257

uuccacagcu uucuugaacu u

<210> 258<211> 21<212> RNA

<213> Arabidopsis thaliana<400> 258

ucauugagug cagcguugau g

<210> 259<211> 21<212> RNA

<213> Arabidopsis thaliana<400> 259

ucauugagug caucguugau g

<210> 260<211> 21<212> RNA

<213> Arabidopsis thaliana<400> 260

uguguucuca ggucaccccu u

<210> 261<211> 21<212> RNA

<213> Arabidopsis thaliana<400> 261

uguguucuca ggucaccccu g

<210> 262

<211> 21

<212> RNA

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 262ugccaaagga gauuugcccu g

<210> 263<211> 21<212> RNA

<213> Arabidopsis thaliana<400> 263

ugccaaagga gaguugcccu g

<210> 264<211> 21<212> RNA

<213> Arabidopsis thaliana<400> 264

ugccaaagga gauuugcccc g

<210> 265<211> 21<212> RNA

<213> Arabidopsis thaliana<400> 265

ugccaaagga gauuugccuc g

<210> 266

<211> 21

<212> RNA

<213> Arabidopsis thaliana

<4 00> 266

ugccaaagga gauuugcccg g

Claims

1. Método para a expressão transgênica com especificidadeintensificada em um organismo eucariótico, caracterizado pelo fato decompreender as etapas de:a) proporcionar um construto de expressão compreendendo umaseqüência de promotor funcional em citado organismo eucariótico efuncionalmente ligada no mesmo uma seqüência de nucleotídeos aser expressada em uma seqüência de RNA quimérica, a citadaseqüência de nucleotídeos compreendendo:i) pelo menos uma seqüência capaz de conferir um fenótipopreferido ou um efeito benéfico ao citado organismoeucariótico, eii) pelo menos uma seqüência substancialmente complementar auma seqüência de microRNA naturalmente expressada emcitado organismo eucariótico, na qual o citado microRNA énaturalmente expressado em tecidos, às vezes, e/ou sobcondições ambientais, onde expressão não é desejada, mas nãoé ou é substancialmente menos expressada em tecidos, àsvezes, e/ou sob condições ambientais, onde tal expressão édesejada,na qual pelo menos uma de seqüência i) e seqüência ii) sãoheterólogas uma em relação à outra, eb) introduzir o citado construto de expressão em um organismoeucariótico.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que o citado organismo eucariótico é um humano, um animal ou umaplanta.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizadopelo fato de que a seqüência sendo substancialmente complementar aomicroRNA está posicionada em uma localização da seqüência de nucleotídeosa ser expressada correspondendo à região não traduzida 5' ou à região nãotraduzida 3' de citada seqüência.

4. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 3, caracterizadopelo fato de que a seqüência sendo substancialmente complementar aomicroRNA possui uma identidade de pelo menos 60% ou não maior do que 6má combinações sobre sua seqüência inteira em comparação com ocomplemento da seqüência de microRNA.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelofato de que as citadas más combinações estão na região correspondendo àregião 3' de citado microRNA.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-5, caracterizado pelo fato de que a seqüência de nucleotídeos a ser expressadacompreende uma matriz de leitura aberta codificadora de uma proteína.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-5, caracterizado pelo fato de que a seqüência de nucleotídeos a ser expressadaé codificadora de um RNA funcional selecionado do grupo consistindo deRNA de anti-senso, RNA de senso, RNA de fita dupla ou ribozimas.

8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelofato de que o RNA funcional está atenuando a expressão de um geneendógeno.

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-8, caracterizado pelo fato de que o microRNA é tecido-especificamenteexpressado, espacialmente regulado, desenvolvimentalmente regulado, e/ouregulado por fatores de estresse biótico ou abiótico.

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 9, caracterizado pelo fato de que o citado construto de expressão é DNA.

11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 10, caracterizado pelo fato de que o citado construto de expressão está emum plasmídeo.

12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1ali, caracterizado pelo fato de que o citado promotor é selecionado do grupoconsistindo de promotores constitutivos, promotores específico para tecidosou tecido-preferenciais, e promotores induzíveis.

13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 12, caracterizado pelo fato de que o organismo eucariótico é uma planta e opromotor é um promotor funcional em plantas.

14. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizadopelo fato de que a seqüência de nucleotídeos expressada modula a expressãode um gene envolvidos em feições agronômicas, resistência à doença,resistência a herbicida, e/ou características de grão.

15. Método de acordo com a reivindicação 13 ou 14,caracterizado pelo fato de que a seqüência de nucleotídeos expressada modulaa expressão de um gene selecionado do grupo consistindo de genesenvolvidos na síntese e/ou na degradação de proteínas, peptídeos, ácidosgraxos, lipídeos, ceras, óleos, amidos, açúcares, carboidratos, aromatizantes,odores, toxinas, carotenóides, hormônios, polímeros, falvinóides, proteínas dearmazenagem, ácidos fenólicos, alcalóides, ligninas, taninos, celuloses,glicoproteínas, e glicopeptídeos.

16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 15, caracterizado pelo fato de que o microRNA possui um perfil deexpressão natural na planta selecionado do grupo consistindo de:a) expressão substancialmente constitutiva mas não expressão emsemente,b) expressão predominante em sementes mas não em outros tecidos,c) expressão induzida por seca ou por outro estresse abiótico,d) expressão induzida por patógeno de planta,e) expressão temporal, ef) expressão quimicamente induzida.

17. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações13 a 16, caracterizado pelo fato de que o microRNA é um microRNA deplanta selecionado do grupo consistindo de:a) as seqüências como descritas pela SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8,-9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26,-27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44,-45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 225, 226, 227, 228, 229,-230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242,-243, 245, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255,-256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, e 266 eb) derivados das seqüências descritas pela SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6,-7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25,-26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43,-44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 225, 226, 227, 228,-229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241,-242, 243, 245, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254,-255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, e 266.

18. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações-17, caracterizado pelo fato de que o microRNA derivado possui umaidentidade de pelo menos 70% a um miRNA como descrita por qualquer umade SEQ ID NO: 1,2, 3,4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19,-20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,-41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 225, 226, 227, 228,-229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243,-245, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258,-259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, e 266.

19. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 12, caracterizado pelo fato de que o organismo alvo é um organismo deanimal, de mamífero ou de humano e o promotor é um promotor funcional emorganismo de animal, de mamífero ou de humano, respectivamente.

20. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizadopelo fato de que a seqüência de nucleotídeos expressada modula a expressãode um gene selecionado do grupo consistindo de genes envolvidos em umadoença de humano ou de animal ou é um gene terapêutico.

21. Método de acordo com a reivindicação 19 ou 20,caracterizado pelo fato de que a doença é selecionada do grupo de doençasimunológicas, câncer, diabetes, neurodegeneração, e doenças do metabolismo.

22. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 21, caracterizado pelo fato de que o gene modulado é selecionado dogrupo consistindo de proteína de retinoblastoma, p53, angiostatina, leptina,hormônios, fatores de crescimento, citocinas, insulina, hormônios decrescimento, alfa-interferon, beta-glicocerebrosidase, albumina de soro,hemoglobina, e colágeno.

23. Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizadopelo fato de que o citado gene terapêutico é fator alfa de necrose de tumor.

24. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 23, caracterizado pelo fato de que o promotor é selecionado do grupoconsistindo de promotor perbB2, promotor de proteína ácida de soro de leite,promotor de estromelisina 3, promotor de antígeno específico de próstata,promotor de probasina.

25. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 24, caracterizado pelo fato de que o microRNA possui um perfil deexpressão natural no organismo de animal, de mamífero ou de humanoselecionado do grupo consistindo de:a) expressão tecido-específica em um tecido selecionado do grupoconsistindo de tecido cerebral, tecido hepático, tecido muscular,tecido neuronal, e tecido tumoral.b) expressão induzida por estresse,c) expressão induzida por patógeno,d) expressão induzida por crescimento tumorgênico ou porcrescimento neoplásico, ee) expressão dependente da idade.

26. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações-19 a 25, caracterizado pelo fato de que o microRNA é um microRNA deanimal, de mamífero ou de humano selecionado do grupo consistindo de:a) as seqüências como descritas pela SEQ ID NO: 56, 57, 58, 59, 60,-61, 62, e 63, eb) derivados das seqüências descritas pela SEQ ID NO: 56, 57, 58, 59,-60, 61,62, e 63, ec) a seqüência de RNA complementar a uma seqüência como descritapor qualquer uma de SEQ ID NO: 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98,-99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112,-113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125,-126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138,-139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151,-152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164,-165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177,-178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190,-191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203,-204, 205, 206, 207, ou 208, ed) derivados de seqüência de RNA complementar a uma seqüênciacomo descrita por qualquer uma de SEQ ID NO: 90, 91, 92, 93, 94,-95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109,-110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122,-123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135,-136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148,-149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161,-162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174,-175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187,-188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200,-201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, ou 208.

27. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 26, caracterizado pelo fato de que o microRNA derivado possui umaidentidade de pelo menos 70% em relação a um miRNA como descrita porqualquer uma de SEQ ID NO: 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, e 63 ou umaseqüência de RNA complementar a uma seqüência como descrita porqualquer uma de SEQ ID NO: 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101,-102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116,-117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131,-132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146,-147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161,-162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176,-177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191,-192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206,-207, ou 208.

28. Seqüência de ribonucleotídeo quimérica, caracterizadapelo fato de compreender:i) pelo menos uma seqüência capaz de conferir um fenótipo preferidoou efeito benéfico a um organismo eucariótico, eii) pelo menos uma seqüência substancialmente complementar a umaseqüência de microRNA naturalmente ocorrente em um organismoeucariótico,na qual pelo menos uma de seqüência i) e seqüência ii) sãoheterólogas uma em relação à outra.

29. Seqüência de ribonucleotídeo quimérica de acordo com areivindicação 28, caracterizada pelo fato de que as seqüências i) e/ou ii) sãodefinidas como em qualquer uma das reivindicações 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 14, 15,- 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, ou 27.

30. Construto de expressão, caracterizado pelo fato decompreender uma seqüência de promotor funcional em um organismoeucariótico e funcionalmente ligada na mesma uma seqüência de nucleotídeosa ser expressa, a citada seqüência compreendendo:i) pelo menos uma seqüência capaz de conferir um fenótipo preferidoou um efeito benéfico ao citado organismo eucariótico, eii) pelo menos uma seqüência substancialmente complementar a umaseqüência de microRNA naturalmente ocorrente em citadoorganismo eucariótico,na qual pelo menos uma de seqüência i) e seqüência ii) sãoheterólogas uma em relação à outra.

31. Construto de expressão de acordo com a reivindicação 30,caracterizado pelo fato de que o construto de expressão e seus elementos sãodefinidos como em qualquer uma das reivindicações 1 a 28.

32. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato decompreender um construto de expressão como definido na reivindicação 30ou 31.

33. Vetor de expressão de acordo com a reivindicação 32,caracterizado pelo fato de ser um vetor de expressão eucariótico.

34. Vetor de expressão de acordo com a reivindicação 32,caracterizado pelo fato de que o vetor de expressão eucariótico é um vetorviral, um vetor plasmídeo ou um vetor binário.

35. Organismo não-humano ou célula transformada,caracterizadofa) pelo fato de compreender uma seqüência de ribonucleotídeosquimérica de acordo com a reivindicação 28 ou 29, um construto de expressãode acordo com qualquer uma das reivindicações 30 ou 31 ou um vetor deexpressão de acordo com qualquer uma das reivindicações 32 a 34.

36. Organismo não-humano ou célula transformada de acordocom a reivindicação 35, caracterizado(a) pelo fato de compreender citadoconstruto de expressão ou vetor de expressão inserido em seu genoma.

37. Organismo não-humano ou célula transformada de acordocom a reivindicação 35 ou 36, caracterizadofa) pelo fato de o citadoorganismo ou a citada célula é selecionado(a) do grupo de organismo ecélulas de mamífero, de bactéria, de fungo, de nematódeo ou de planta.

38. Semente transformada, caracterizada pelo fato de ser daplanta de acordo com a reivindicação 37.

39. Preparação farmacêutica, caracterizada pelo fato de ser depelo menos um construto de expressão de acordo com a reivindicação 30 ou 31, uma seqüência de ribonucleotídeos quimérica de acordo com areivindicação 28 ou 29, ou um vetor de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 32 a 34.