TWI738052B - 於特定植物組織中沉默八氫蕃茄紅素合成酶基因表現之ｄｎａ卡匣構築體及其方法 - Google Patents

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Abstract

本發明揭示一種可以沉默或降低八氫蕃茄紅素合成酶基因於特定組織表現的方法與DNA卡匣構築體，此DNA卡匣構築體包含一核苷酸序列，該核苷酸序列轉錄後的RNA片段可用以調控特定組織中八氫蕃茄紅素合成酶基因之訊息RNA(messenger RNA,mRNA)的含量，以達到調控花色、氣味、或其他需要類胡蘿蔔素產物之植物生理機制。

Description

於特定植物組織中沉默八氫蕃茄紅素合成酶基因表現之DNA卡匣構築體及其方法
本發明係關於沉默八氫蕃茄紅素合成酶(phytoene synthase,PSY)基因表現，以控制文心蘭花色領域及用於調節PSY基因表現之核苷酸片段組合物及方法，且更特定言之係關於藉由基因轉殖一段DNA卡匣構築體而在特定組織中產生RNA干擾片段，因此下調PSY基因於植株特定組織中的表現。
文心蘭(Oncidium)是台灣主要的外銷切花之一，台灣文心蘭切花的生產有85%是外銷至其他國家，而日本是台灣文心蘭切花主要的外銷市場，台灣文心蘭切花亦占日本文心蘭切花總輸入量的第一位。然而，品種單一是目前切花文心蘭產業中很嚴重的困難之一，因此本發明的願景為創造多樣化、具差異性的品種，例如開發多樣化花色以滿足不同外銷國家及外銷市場之需求，以開創新的廣大市場。台灣文心蘭切花以黃花文心蘭為主，目前主流品系皆是由南西文心蘭(Oncidesa Gower Ramsey)經由組織培養變異而得。然而，南西文心蘭因其來自遠緣交配(distant hybridization)，經由遠緣交配所獲得的第一代雜交種(hybrid)之基因組發生 重大改變，同源染色體在配對過程中不平衡甚至發生部分缺失(chromosome deletion)，導致南西文心蘭無法進行有性繁殖，均需以組織培養的方式進行幼苗生產，也難以用傳統雜交方式產生多樣化的新品系，為了突破此現象，本發明利用RNA干擾技術藉由基因轉殖之方法，開發不同花色品系文心蘭。
顏色是植物性商品中重要的特性之一，構成高等植物的花色主要由甜菜素(betalains)、類黃酮(flavonoids)與類胡蘿蔔素(carotenoids)等色素產生而成。南西品系文心蘭花朵之黃色唇瓣部位是由類胡蘿蔔素所組成，主要成分為violaxanthin(堇菜黃質)、9-cis-violaxanthin、neoxanthin(新黃素)以及少量之lutein，而花朵上方之紅褐色斑點是由花青素(anthocyanins)所組成，主要成分為cyanidin(矢車菊色素)、delphinidin(花翠素)、及少量之peonidin(芍藥色素)。其中植物的類胡蘿蔔素生合成機制中，八氫蕃茄紅素合成酶(phytoene synthase,PSY)為關鍵速率決定酵素，可將兩個geranylgeranyl diphosphate合成為一個phytoene(八氫蕃茄紅素)，是類胡蘿蔔素生合成路徑中最上游之化合物，後續phytoene再經由phytoene desaturase、ζ-carotene desaturase去飽和化形成lycopene(茄紅素)，並經由下游酵素進一步催化形成各種不同的產物。因此八氫蕃茄紅素合成酶是類胡蘿蔔素生成途徑中重要的酶之一，經由抑制八氫蕃茄紅素合成酶基因(OgPSY)之表現，可抑制下游類胡蘿蔔素生成，進而調控花色。
RNA干擾原理或RNAi最初由Fire等人所發現，彼等以雙股RNA(dsRNA)注射進入線蟲(Caenorhabidites elegan)體中，發現蟲體中某些基因表現會被阻斷。在植物方面，利用反義股RNA改變花色生成途徑 而創造出不同顏色花朵之案例，如利用反義股RNA抑制矮牽牛花(Petunia hybrid)中chalcone synthase(PhCHS)的基因表達而產生白色矮牽牛(Van der Krol et al.,1990)；如利用反義股RNA抑制非洲菊(Gerbera hybrida)之chalcone synthase(GCHS)基因表達而創造出橙色非洲菊。目前為止，利用RNAi干擾技術於調整類胡蘿蔔素以改變花色之案例僅出現於基因轉殖菊花中，藉由減弱(knockdown)CCD4使白色菊花轉變成鮮明黃色之花色。另外，由於類胡蘿蔔素為植物生長之重要元素，若嚴重缺乏則會使植物面臨許多生長與發育的問題，例如光合作用，因此選擇適當之啟動子來驅動調控類胡蘿蔔素色素生成機制中的催化酵素之基因，如phytoene desaturase、Lycopene ε-cyclase、或Lycopene β-cyclase等酵素之基因，能使特定基因於特定組織中專一性表達，僅達到改變花色之目的，但仍然維持植株正常生長之生理機能，此為技術之重要關鍵。
本發明之目的即在於利用特定啟動子在文心蘭花朵中產生干擾性RNA片段，以減弱或抑制文心蘭花朵中八氫蕃茄紅素合成酶基因表現，因此減少類胡蘿蔔素之生成，進而達到改變花色之目的，此等利用干擾性RNA技術於觀賞植物上的應用，與前述案例用於調控不同的基因與植物種類完全不同。
本發明較佳實施例之主要目的係提供一種可以沉默或降低文心蘭八氫蕃茄紅素合成酶基因表現的方法，其提供一種可以沉默文心蘭八氫蕃茄紅素合成酶基因的DNA卡匣構築體，此DNA卡匣構築體為一核苷酸序列，該核苷酸序列轉錄後的RNA片段可用以調控文心蘭中八氫蕃茄紅 素合成酶基因之訊息RNA(messenger RNA,mRNA)的含量，因此達到調控花色、氣味、或其他需要類胡蘿蔔素產物之植物生理機制。
為了達成上述目的，本發明且該核苷酸序列所轉錄產生的mRNA係以八氫蕃茄紅素合成酶mRNA為互補結合的目標，因為其與八氫蕃茄紅素合成酶mRNA結合成雙股的RNA後，干擾八氫蕃茄紅素合成酶基因之mRNA，使之無法進一步轉譯成酶，因此，類胡蘿蔔素的生合成反應受到影響。該核苷酸序列為一啟動子與一段可轉錄出干擾性RNA片段的DNA卡匣構築體。該啟動子包含SEQ ID NO：1之核苷酸序列。
本發明較佳實施例提出一DNA卡匣構築體，此DNA卡匣構築體包含一個啟動子(P)，之後在3’端接續一段SEQ ID NO：3之DNA片段，再接續一段含有GUS基因的內含子片段(intronGUS核苷酸序列)，及一段方向倒置的SEQ ID NO：3之DNA片段，最後接上一段NOS基因的終止片段(T-NOS核苷酸序列)。其中上述之重組質體或載體，包括但不限於特定之啟動子、內含子、或終結片段，或其他適用本發明之重組質體或載體。其中，一段核苷酸序列，置於一段啟動子Pchrc之後，此一段核苷酸序列，包括兩小段各約150個核苷酸之SEQ ID NO：3的核苷酸片段，兩者呈反向排列，中間夾著一段GUS-intron核苷酸片段，此一核苷酸序列片段在啟動子Pchrc的驅動之下可以轉錄產生髮夾結構的RNA分子。此RNA片段具有與目標mRNA，如八氫蕃茄紅素合成酶基因之mRNA，因核苷酸序列互補而形成雙股RNA結構。
編碼SEQ ID NO：3為編碼SEQ ID NO：2中自第51個核苷酸起之150個核苷酸長度之核苷酸序列。
本發明較佳實施例提供一核苷酸序列，包含編碼SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3；及與SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3之序列互補的核苷酸序列。
本發明較佳實施例之該核苷酸序列包含於一載體或一穿梭載體。
本發明較佳實施例之該核苷酸序列包含於一擬原球體(PLB,Protocorm-like body)。
本發明較佳實施例之該載體可經轉殖導入至一植物細胞或擬原球體。
本發明較佳實施例之該核苷酸序列提供於一植物組織。
為了達成上述目的，本發明較佳實施例之文心蘭八氫蕃茄紅素合成酶基因之調降及沉默方法包含：提供至少一DNA卡匣構築體，此DNA卡匣構築體的核苷酸序列包含一特定啟動子與一段可轉錄成髮夾型干擾RNA片段的特定核苷酸片段；將該核苷酸序列導入至一植物細胞(或PLB)，以獲得一轉殖植物細胞(或PLB)；及利用該已轉殖植物細胞再生發育成為植株，並達到改變植株花色之目的。
本發明較佳實施例之核苷酸序列經由基因選殖技術(gene cloning)而獲得。
本發明較佳實施例之該已轉殖植物細胞用以改變一植物體內特定組織中之八氫蕃茄紅素合成酶表現量。
本發明較佳實施例利用該已轉殖值物細胞再生為一轉殖植物。
本發明較佳實施例之該植物細胞選自一蘭科植物細胞。
圖1、沉默八氫蕃茄紅素合成酶基因的DNA卡匣構築體示意圖。
圖2、沉默八氫蕃茄紅素合成酶基因的DNA卡匣構築體圖。LB/RB：T-DNA的左/右邊界、P：啟動子
圖3、花朵照片，由左至右分別顯示為野生型(WT)Oncidesa Gower Ramsey“Honey Angel”的花朵、已轉殖植物Oncidesa Gower Ramsey“Honey Snow MF-1”、與已轉殖植物Oncidesa Gower Ramsey“Honey Snow MF-5”。
圖4、花朵組織中類胡蘿蔔素含量圖，黑色圖示為野生型(WT)Oncidesa Gower Ramsey“Honey Angel”、灰色圖示為已轉殖植物Oncidesa Gower Ramsey“Honey Snow MF-1”、與白色圖式為已轉殖植物Oncidesa Gower Ramsey“Honey Snow MF-5”。橫軸所顯示之四種類胡蘿蔔素種類為9-順式菫菜黃質(9-cis-violaxanthin)、新黃素(neoxanthin)、菫菜黃質(violaxanthin)及β-胡蘿蔔素(β-carotene)。
圖5，利用半定量即時聚合酶連鎖反應(Semi-quantitative real-time PCR analysis)分析野生型(WT)Oncidesa Gower Ramsey“Honey Angel”(a)、已轉殖植物Oncidesa Gower Ramsey“Honey Snow MF-1”(b)、與已轉殖植物Oncidesa Gower Ramsey“Honey Snow MF-5”(c)植株中各部位之八氫番茄紅素聚合酶調控基因(PSY)表現量。簡稱分別為：花朵(F)、HPTII(hygromycin phosphotransferase II gene)。
圖6，利用北方墨點法(Northern blot analysis)分析各植物組織之小RNA分子(small RNA,SiRNA)之表現量，由左而右分別為已轉殖植物Oncidesa Gower Ramsey“Honey Snow MF-5”花朵組織、已轉殖植物Oncidesa Gower Ramsey“Honey Snow MF-1”花朵組織、已轉殖植物Oncidesa Gower Ramsey“Honey Snow MF-5”葉組織，與野生種(WT)Oncidesa Gower Ramsey“Honey Angel”花朵組織。
為了充分瞭解本發明，於下文將舉例較佳實施例並配合所附圖式作詳細說明，且其並非用以限定本發明。
本發明較佳實施例之文心蘭八氫蕃茄紅素合成酶基因適用於提供其基因產物(gene product)或其編碼蛋白質，但其並非用以限定本發明之範圍。再者，本發明較佳實施例之文心蘭八氫蕃茄紅素合成酶基因及其調控方法適用於以各種基因工程進行基因轉殖(gene transformation)於各種植物細胞或擬原球體，但其並非用以限定本發明之範圍。
舉例而言，本發明較佳實施例所採用之文心蘭為黃花品種(如：檸檬綠文心蘭；Oncidesa Gower Ramsey“Honey Angel”)，但本發明適用其他各種文心蘭品種，其並非用以限定本發明之範圍。
本發明較佳實施例之一種沉默文心蘭八氫蕃茄紅素合成酶基因表現之技術，係一種產生干擾性RNA的DNA卡匣構築體，其結構示意圖如第2圖揭示，建構一可轉錄出嵌合髮夾RNA之轉移DNA(T-DNA)卡匣，然後組合於載體中，此DNA卡匣構築體包含一個啟動子，在其3’端接續包含SEQ ID NO：3之正向置放的核苷酸序列，與intronGUS內含子片段 (intronGUS核苷酸序列)，再接續一段SEQ ID NO：3之方向倒置的核苷酸序列，再接續NOS基因之終止片段之T-NOS核苷酸序列。其中上述之重組質體或載體，包括但不限於特定之啟動子或內含子片段，或其他適用本發明之重組質體或載體。
1.自檸檬綠文心蘭(Oncidesa Gower Ramsey“Honey Angel”)釣取啟動子。其方法是將檸檬綠文心蘭的總RNA利用Oligotex mRNA Kit(Qiagen)純化出Poly(A)+RNA。根據Clontech廠商提供的操作方法，利用快速擴增技術(Rapid Amplification of cDNA Ends,RACE)，自cDNA之5’端與3’端末端擴增出全長的DNA，取得檸檬綠文心蘭chromoplast specific carotenoid associated protein(CHRC)基因之全長cDNA核苷酸序列。本發明所使用之啟動子選殖方式，為利用分子生物學的基因步移技術(GenomeWalker Universal Kit,Clontech)自CHRC cDNA擴增出此基因之啟動子片段Pchrc，共1704bp(圖1)。
2.選擇具有RNA干擾功能的DNA片段。對照NCBI數據庫中的四種單子葉植物種(水稻，小麥，玉米，蝴蝶蘭)的八氫番茄紅素合成酶核苷酸序列進行同源性分析，發現150bp八氫番茄紅素合成酶調控基因的cDNA區域(開放閱讀框(open reading frame)的+51bp~+200bp)，含有22-bp 100%同源性的保守序列在相應的互補DNA(cDNA)序列中，選擇此片段作為RNA干擾功能之核苷酸序列。
3.基因轉殖與栽培方法。將含本發明之DNA卡匣構築體的載體DNA，利用農桿菌攜帶此載體DNA，並感染文心蘭(Onc.Gower Ramsey“Honey Angel”)的擬原球體 (Protocorm-like body,PLB)，並利用含適當濃度抗生素之培養基篩選轉殖後的擬原球體，再以出芽(shooting)及生根(rooting)之培養基加以誘導再生成為完整植株，植株以盆栽種植兩年，以觀察其花色。上述之轉殖的方法包括但不限於：農桿菌媒介法、基因重組病毒感染法、跳躍子載體轉殖法、基因槍轉殖法、電穿孔、顯微注射法、花粉管法、脂質體媒介轉殖法、超音波媒介轉殖法、碳化矽纖維媒介轉殖法等為本發明所屬技術領域人士熟悉的；蘭花組織培養之方法亦為本發明所屬技術領域人士熟悉的，故不再贅述。
《實例1：文心蘭花色調控》
如圖3所示，由左至右分別顯示為野生型(WF)Oncidesa Gower Ramsey“Honey Angel”的花朵、經轉植入本發明DNA卡匣構築體核苷酸序列之已轉殖株Oncidesa Gower Ramsey“Honey Snow MF-1”、與經轉植入本發明DNA卡匣構築體核苷酸序列之已轉殖植株Oncidesa Gower Ramsey“Honey Snow MF-5”，可看出MF-1為淡白色花色，MF-5為雪白色花色。
為維持產品的表型穩定，本實例是利用包含30ppm潮黴素(hygromycin)之半濃度量(1/2)的Murashige & Skoog(MS)培養基培養已轉殖植株Oncidesa Gower Ramsey“Honey Snow MF-1”與Oncidesa Gower Ramsey“Honey Snow MF-5”的P0階段微小的分生組織芽。經過擬原球體分化和植株分蘗生長作用，兩株系(line)於培植2年後各產出兩千株P1幼苗於溫室種植。幼苗生長溫度為30℃/25℃(白天/夜晚)，光強度控制在光合光子通量密度(PPFD)約為300μmolm-2 s-1之環境。
《實例2：文心蘭花朵中類胡蘿蔔素含量》
如圖4所示，已轉殖植物Oncidesa Gower Ramsey“Honey Snow MF-1”與Oncidesa Gower Ramsey“Honey Snow MF-5”之類胡蘿蔔素都大幅降低，前述兩者的9-cis-violaxanthin含量皆為野生型的40%，而Oncidesa MF-1的新黃素(neoxanthin)、菫菜黃質(violaxanthin)及β-胡蘿蔔素(β-carotene)皆為野生型的30%；呈現純白色花色之Oncidesa MF-5中，此三種色素的含量皆僅為野生型的1-3%，此結果顯示經由轉殖入本發明之DNA卡匣核苷酸序列能有效控制類胡蘿蔔素生成，以達控制花色之效果。
《實例3：文心蘭組織中之基因表現量》
圖5顯示八氫番茄紅素合成酶基因(OgPSY)表現量，可見野生型文心蘭的OgPSY表現量高，已轉殖植株Oncidesa Gower Ramsey“Honey Snow MF-1”與Oncidesa Gower Ramsey“Honey Snow MF-5”看不到條帶，顯示其表現量明顯降低，而野生型依然表現OgPSY。從圖6亦可顯示已轉殖植株Oncidesa MF-1與Oncidesa MF-5之siRNA(小分子的干擾RNA)表現強烈，從基因表現量可以判斷結果。此亦顯示本發明能成功干擾OgPSY表現，達到控制色素與花色之目的。
<110> 葉開溫
<120> 於特定植物組織中沉默八氫蕃茄紅素合成酶基因表現之DNA構築體及其方法
<140> TW 108132149
<141> 2019-09-06
<160> 3
<210> 1
<211> 1704
<212> DNA
<213> Oncidium.
<400> 1
Figure 108132149-A0305-02-0015-1
<223> Nucleotide
本序列為OgCHRC promoter部分區域，其中：
1、轉錄起始點為第1704bp，接續SEQ ID NO：3的5′端
2、第1672bp至1678bp為TATA box
3、第1598bp至1601bp為CAAT box
4、第505bp至510bp及第702bp至707bp為putative repeated elements(ATAGAA)
<210> 2
<211> 1383
<212> cDNA
<213> Oncidium.
<400> 2
Figure 108132149-A0305-02-0016-2
<210> 3
<211> 150
<212> cDNA
<213> Oncidium.
<400> 3
Figure 108132149-A0305-02-0016-3
沉默八氫蕃茄紅素合成酶基因的DNA卡匣構築圖。本發明較佳實施例之一種於植物特定組織中表現出干擾mRNA之小分子RNA片段，以沉默八氫蕃茄紅素合成酶基因之DNA卡匣，此DNA卡匣包含的核苷酸片段，可以在植物特定組織中轉錄成一種干擾性RNA片段，其結構示意圖如第2圖揭示，建構一個DNA卡匣載體，包含一個啟動子(P)，之後在3’端接續一段SEQ ID NO：3之DNA片段，再接續一段含有GUS基因的內含子片段(intronGUS核苷酸序列)，再接續一段方向倒置的SEQ ID NO：3之DNA片段，最後接上一段NOS基因的終止片段(T-NOS核苷酸序列)。其中上述之重組質體或載體，包括但不限於特定之啟動子、內含子、或終結片段，或其他適用本發明之重組質體或載體。

Claims (7)

  1. 一種調控文心蘭花色之DNA卡匣構築體，其包含：由幾段核苷酸序列所組合而成，該DNA卡匣構築體可於植物特定組織中，干擾八氫番茄紅素合成酶基因之mRNA，以達花色調控之目的，該DNA卡匣包含一啟動子與一段可產生髮夾型干擾性RNA的DNA核苷酸序列，該啟動子包含SEQ ID NO：1核苷酸序列，且該啟動子能使特定基因於特定組織中專一性表達，僅達到改變花色之目的，但仍維持植株正常生長之生理機能，該一段可產生髮夾型干擾性RNA的DNA核苷酸序列，可經由該啟動子之驅動下，於特定組織中轉錄產生髮夾型干擾性RNA序列以干擾八氫番茄紅素合成酶基因之mRNA，使之無法進一步轉譯成酶，並由下列核苷酸序列所組成：正向置放的PSY核苷酸序列、intronGUS核苷酸序列、方向倒置的PSY核苷酸序列、及NOS基因之終止片段(T-NOS核苷酸序列)，其中該PSY核苷酸序列包含SEQ ID NO：3核苷酸序列。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之DNA卡匣構築體，其中該核苷酸序列包含於一載體或一穿梭載體或一擬原球體，其中該載體可經轉殖導入至一植物細胞，或一擬原球體。
  3. 如申請專利範圍1所述之DNA卡匣構築體，該SEQ ID NO：3核苷酸序列為SEQ ID NO：2核苷酸序列中自第51個核苷酸起之150個核苷酸長度之核苷酸序列。
  4. 一種調控文心蘭花色之DNA卡匣構築方法，其包含：由幾段核苷酸序列所組合而成，該DNA卡匣構築體可於植物特定 組織中，干擾八氫番茄紅素合成酶基因之mRNA，以達花色調控之目的，該DNA卡匣包含一啟動子與一段可產生髮夾型干擾性RNA的DNA核苷酸序列，該啟動子包含SEQ ID NO：1核苷酸序列，且該啟動子能使特定基因於特定組織中專一性表達，僅達到改變花色之目的，但仍維持植株正常生長之生理機能，該一段可產生髮夾型干擾性RNA的DNA核苷酸序列，可經由該啟動子之驅動下，於特定組織中轉錄產生髮夾型干擾性RNA序列以干擾八氫番茄紅素合成酶基因之mRNA，使之無法進一步轉譯成酶，並由下列核苷酸序列所組成：正向置放的PSY核苷酸序列、intronGUS核苷酸序列、方向倒置的PSY核苷酸序列、及NOS基因之終止片段(T-NOS核苷酸序列)，其中該PSY核苷酸序列包含SEQ ID NO：3核苷酸序列，其包含：提供至少一DNA卡匣構築體，此DNA卡匣構築體的核苷酸序列包含一特定啟動子與一段可轉錄成髮夾型干擾RNA片段的特定核苷酸片段，將該核苷酸序列導入(或轉殖)至一植物細胞，以獲得一轉殖植物細胞，及利用該已轉殖植物細胞再生發育成為值株，並達到改變植株花色之目的。
  5. 依申請專利範圍第4項所述之一種調控文心蘭花色之DNA卡匣構築方法，其中該核苷酸序列經由基因選殖方式獲得。
  6. 依申請專利範圍第4項所述之一種調控文心蘭花色之DNA卡匣構築方法，其中該已轉殖植物細胞用以改變一植物體內控制類胡蘿蔔色素之一種八氫番茄紅素合成酶表現量。
  7. 依申請專利範圍第4項所述之一種調控文心蘭花色之DNA卡匣構築方 法，利用該已轉殖蘭科植物細胞再生發育成為轉殖植物。
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