WO2003008596A2 - Expressionskassetten zur transgenen expression von selektionsmarkern - Google Patents

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WO2003008596A2
WO2003008596A2 PCT/EP2002/007485 EP0207485W WO03008596A2 WO 2003008596 A2 WO2003008596 A2 WO 2003008596A2 EP 0207485 W EP0207485 W EP 0207485W WO 03008596 A2 WO03008596 A2 WO 03008596A2
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plant
transgenic
expression
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Helke Hillebrand
Irene Kunze
Karin Herbers
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Sungene Gmbh & Co. Kgaa
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8209—Selection, visualisation of transformants, reporter constructs, e.g. antibiotic resistance markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells

Definitions

  • the invention relates to expression cassettes and vectors which contain selection marker genes under the control of the plant constitutive nitrilase 1 (NITl) promoter from Arabidopsis thaliana, and to the use of these expression constructs or vectors for the selection of transgenic organisms, preferably plants.
  • the invention further relates to transgenic plants transformed with these expression cassettes or vectors, cultures, parts or propagation material derived therefrom, and the use thereof for the production of foodstuffs, animal feed, seeds, pharmaceuticals or fine chemicals.
  • the aim of biotechnological work on plants is to produce plants with improved properties, for example to increase agricultural productivity.
  • the production of transgenic plants is a fundamental technique of plant biotechnology and therefore an indispensable prerequisite for plant ... basic research and for the production of plants with improved, new properties for agriculture, for increasing the quality of food or for producing certain chemicals or pharmaceuticals (Dunwell JM, J Exp Bot. 2000; 51 Spec No: 487-96).
  • a basic requirement for the transgenic expression of certain genes in plants is - due to the low efficiency of the transformation of plants - the possibility of distinguishing transformed from non-transformed plants.
  • Various ' so-called selection markers are available to the person skilled in the art for this purpose.
  • the expression of these genes gives an appropriately transformed plant resistance to antibiotics (such as kanamycin) or herbicides (such as phosphinothricin or glyphosate).
  • antibiotics such as kanamycin
  • herbicides such as phosphinothricin or glyphosate
  • An essential prerequisite for expressing these selection marker genes is the provision of plant-specific promoters.
  • Constitutive promoters are known. There can be constitutive promoters that allow local and temporally limited expression in different parts of a plant and specific promoters that only express in certain parts or cells of a plant (e.g. root, seeds, pollen, leaves, etc.) or allow only at certain times of development, differentiate become. Constitutive promoters are preferred for the expression of selection markers. They enable efficient, early selection, usually already at the cell culture stage (for example in a callus culture), which cannot be guaranteed with tissue or development-dependent promoters.
  • the TR double promoter the promoters of the vacuolar ATPase subunits, the Ppcl promoter from Mesembryanthemum cryctallinum (Cushman et al. (1993) Plant Mol Biol 21: 561-566) or the promoter of a proline-rich protein from wheat (WO 91 / 13991).
  • the constitutive promoters currently predominantly used in plants are almost exclusively viral or Agrobac erium isolated promoters. Specifically, these are the nopaline synthase (nos) promoter (Shaw et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12 (20): 7831-7846), the mannopine synthase (mas) promoter (Co ai et al.
  • the CaMV 35S promoter which is often used as a constitutive promoter, shows variations in activity in different plants and in different tissues of the same plant (Atanassova et al. (1998) Plant Mol Biol 37: 275-85; Battraw and Hall (1990) Plant Mol Biol 15: 527-538; Holtorf et al. (1995) Plant Mol Biol 29: 637-646; Jefferson et al. (1987) EMBO J 6: 3901-3907).
  • Another disadvantage of the 35S promoter is that the infection of the cauliflower mosaic virus and its typical pathogenic variants changes the expression of the transgene. Plants that express the BAR gene under the control of the 35S promoter are no longer resistant after infection with the virus that typically occurs in nature (AI-Kaff et al. (2000) Natur Biotechnology 18: 995-99) ,
  • the Sugarcane bacilliform badnavirus (ScBV) has been described (Schenk et al. (1999) Plant Mol Biol 39 (6): 1221-1230), which mediates an expression pattern similar to the CaMV.
  • the activity of the ScBV promoter was determined in transient expression analyzes with various dicotyledonous plants, including Nicotiana tabacum and N. benthamiana, sunflower and rapeseed, and monocotyledonous plants, here using banana, corn and millet.
  • the ScBV promoter mediated expression level was comparable to that of the ubiquitin promoter from maize (see below).
  • the ScBV promoter-mediated expression rate was tested in transgenic banana and tobacco plants and showed essentially constitutive expression in both plant species.
  • the most common promoters for the expression of selection markers in plants are the nos promoter, but also the mas and ocs promoter, all of which have been isolated from Agrobacterium strains.
  • the expression pattern mediated by the maize ubiquitin promoter has been described for the Ubi-1 and Ubi-2 promoters from maize (Christensen et al. (1992) Plant Mol Biol 18 (4): 675-689). While the Ubi-1 promoter has good expression activity in maize and other monocotyledon plants, in dicotyledon tobacco plants it shows only 10% of the activity which was achieved in comparable experiments with the 35S viral promoter. Furthermore, it was shown that the maize Ubi-1 promoter is suitable for the overexpression of genes in monocot plant systems and is also sufficiently strong to mediate herbicide resistance by expression of selection markers (Christensen and Quail (1996) Transgenic Res 5 (3): 213-218).
  • the Ubi-1 promoter was found to be unsuitable for dicotyledon expression systems.
  • a comparison of the organ specificity and strength of various constitutive promoters was carried out by Holtorf (Holtorf et al. (1995) Plant Mol Biol 29 (4): 637-646) using stably transformed Arabidopsis plants.
  • the CaMV35S promoter showed the highest expression rate.
  • TMV omega element the expression rate of the promoter could be
  • McElroy and co-workers reported a r ⁇ as-ier-ending .construct_for transforming monocotyledonous plants on the rice actin-1 (Actl) promoter (McElroy et al. (1991) Mol Gen Genet
  • the promoter of an S-adenosyl-L-methionine synthetase is also described as a constitutive promoter (WO 00/37662).
  • the main disadvantage here is the dependence of the level of expression on the methionine concentration (see WO 00/37662;
  • WO 99/31258 describes chimeric, constitutive plant promoters which are composed of different elements of different promoters with complementary expression patterns, 40 so that the combination of individual tissue specificities leads additively to a constitutive expression pattern.
  • Nitrilases from Arabidopsis thaliana are organized in a small gene family, of which the nitrilase 1 (nitl) gene 45 is the predominant isoform.
  • Nitrilases are key enzymes in auxin biosynthesis and catalyze the conversion of indole-3-acetonitrile to indole-3-acetic acid (Bartel and Fink (1994) Proc Natl Acad Sei USA 91: 6649-6653; Bartling et al. (1994) Proc Natl Acad Sei USA 91: 6021-6025).
  • Expression analyzes showed that the Nitl mRNA occurs mainly in the leaves of the rosette, but also in the roots, flowers, shoot axes and pods.
  • a promoter analysis with a nitl promoter / GUS reporter fusion construct showed an expression coordinated with the hormone metabolism in tobacco (Hillebrand et al. (1996) Gene 170: 197-200).
  • a blue coloration was shown in the leaf buds and, in the case of further leaf development, in the tips of the young leaves.
  • Leaves 10 cm long show a homogeneous distribution of the dye. Cuts through shoot axes only turned blue when they were near developing leaves and buds. This development-dependent pattern is also evident in roots, where only the root tips and young roots were colored.
  • Other studies showed expression of the NIT1 mRNA in leaves and stems of the mature plant and in the root of older plants or root tip of younger plants.
  • Promoters of viral origin can be influenced by virus infections of the transgenic plant and express the desired property _then_ ⁇ ⁇ cht_more (.Al-Kaff et.al .. (2000) .. Natur Biotechnology 18: 995-99).
  • the number of promoters suitable for the expression of selection markers in plants is small and they are usually of viral or bacterial origin.
  • Pollen / anther expression Many of the promoters mentioned (such as, for example, 35S CaMV) show a strong activity in the pollen or the anthers. This can have an unfavorable environmental impact. Nonspecific expression of Bacillus thuringiensis endotoxins not only had the desired effect on feeding insects through expression in the root, but also as a result of an expression in pollen resulted in significant damage to the population of the monarch butterfly, which uses pollen as the main food source (Losey JE et al. (1999) Nature 399, 214). An ideal constitutive promoter for the expression of selection markers should have as many of the following properties as possible:
  • the object on which the present invention is based was therefore to provide plant regulatory sequences which fulfill as many of the abovementioned properties as possible, above all to impart ubiquitous and development-independent (constitutive) expression of a downstream selection marker gene which is sufficient to im To express selection marker genes sufficiently high during the transformation of plants in order to be able to distinguish the transformed cells from the non-transformed cells on the basis of the selection advantage achieved by transformation.
  • plant regulatory sequences which fulfill as many of the abovementioned properties as possible, above all to impart ubiquitous and development-independent (constitutive) expression of a downstream selection marker gene which is sufficient to im
  • selection marker genes sufficiently high during the transformation of plants in order to be able to distinguish the transformed cells from the non-transformed cells on the basis of the selection advantage achieved by transformation.
  • no promoter with the desired properties listed above has so far been Described shafts. The task was therefore to identify corresponding promoters.
  • the sequence of the NIT1 promoter largely corresponds to the sequence from position 3 to 1879 of the sequence of the NITl gene in the database under Genbank Acc.-No: X86454 or one in GenBank under Acc.-No. Sequence stored in Y07648 (version Y07648.2 from 20.12.1999; base pair 2456 to 4340; the gene starting from bp 4345 is annotated with "nitrilase 1").
  • glucuronidase reporter experiments promoter activity - comparable in intensity to that of corresponding plants transformed with the 35S promoter / GUS constructs - was detected in numerous tissues. In contrast to the 35S promoter, no blue staining could be detected in the anthers / pollen.
  • a first subject of the invention therefore relates to transgenic expression cassettes for the expression of nucleic acid sequences coding for a selection marker containing in the 5 '-3' direction
  • a) or b) are functionally linked to one another in such a way that transgenic expression of the nucleic acid sequence coding for a selection marker in a plant cell or a plant organism is made possible.
  • the invention relates to methods for the selection of transformed plant cells or plant organisms, ⁇ wherein - a — transgenic expression cassette containing in 5 '-3' direction
  • a promoter according to SEQ ID NO: 1 or a functional equivalent or equivalent fragment thereof, which has essentially the same promoter activity as the promoter according to SEQ ID NO: 1, and
  • a) or b) are functionally linked to one another in such a way that transgenic expression of the nucleic acid sequence coding for a selection marker in a plant cell or plant organisms is made possible, is introduced into said plant cell or plant organism, and the selection marker is expressed and a selection of the transformed plant cells or plant organisms is exercised.
  • "Expression” encompasses the transcription and / or the translation of the transcribed RNA of the nucleic acid sequence to be expressed transgenically, coding for a selection marker into a corresponding polypeptide.
  • transgenic expression means all such constructions or methods that have been brought about by genetic engineering methods, in which either
  • NITl promoter according to SEQ ID NO: 1 or a functional equivalent or equivalent fragment thereof, or
  • nucleotide residues are not in their natural, genetic environment (i.e. at their natural chromosomal locus) or have been modified by genetic engineering methods, whereby the modification can be, for example, a substitution, addition, deletion, inversion or insertion of one or more nucleotide residues.
  • the expression cassettes according to the invention, vectors derived from them or the methods according to the invention can comprise functional equivalents to the NIT1 promoter sequence described under SEQ ID NO: 1.
  • Functionally equivalent sequences also include all the sequences which are derived from the complementary counter strand of the sequence defined by SEQ ID N0: 1 and which have essentially the same promoter activity.
  • NITl promoter Functional equivalents in relation to the NITl promoter means in particular natural or artificial mutations of the NITl promoter sequence described under SEQ ID NO: 1 as well as its homologues from other plant genera and species, which continue to have essentially the same promoter activity.
  • a promoter activity is essentially said to be the same if the transcription of a specific gene to be expressed under the control of a specific promoter derived from SEQ ID NO: 1 under otherwise unchanged conditions has a localization within the plant which is at least 50%, preferably at least 70% , particularly preferably at least 90% very particularly preferably at least 95% congruent is obtained with a comparison expression using one of the NITl promoters described by SEQ ID NO: 1.
  • the level of expression can vary both downwards and upwards compared to a comparison value.
  • sequences whose expression level, measured on the basis of the transcribed mRNA or the protein translated as a result, under otherwise unchanged conditions quantitatively by no more than 50%, preferably 25%, particularly preferably 10%, of a comparison value with that obtained by SEQ ID NO : 1 described NITl promoter differs.
  • Particularly preferred are those sequences whose expression level, measured on the basis of the transcribed mRNA or the protein translated as a result, under otherwise unchanged conditions, quantitatively by more than 50%, preferably 100%, particularly preferably 500%, very particularly preferably 1000%, is compared with that by
  • SEQ ID NO: 1 described NITl promoter exceeds.
  • the expression level of the natural mRNA of the respective gene or of the natural gene product is preferred.
  • the level of expression obtained with any, but certain, nucleic acid sequence preferably those nucleic acid sequences which code for easily quantifiable proteins.
  • reporter ⁇ " ⁇ proteins” Schoenbron E - Groskreutz D (1999) -mol Biotechnol- 13 (l): 29-44) such as (GFP) (Chui WL et the "green fluorescence protein” al. (1996) Curr Biol 6: 325-330; Leffel SM et al.
  • Unchanged conditions means that the expression which is initiated by one of the expression cassettes to be compared is not modified by combination with additional genetic control sequences, for example enhancer sequences.
  • Unchanged conditions also means that all general conditions such as, for example, plant type, stage of development of the plants, breeding conditions, assay conditions (such as buffer, temperature, substrates etc.) are kept identical between the expressions to be compared.
  • Mutations include substitutions, additions, deletions, inversions or insertions of one or more nucleotide residues.
  • the present invention also encompasses those nucleotide sequences which are obtained by modifying the NIT1 promoter according to SEQ ID NO: 1. The aim of such a modification may be to further narrow down the sequence contained therein or, for example, to insert further ones Restriction enzyme interfaces, the removal of superfluous DNA or the addition of further sequences, for example further regulatory sequences.
  • Transitions and transversions in question, techniques known per se, such as in vitro mutagenesis, "primer repair", restriction or ligation can be used. Through manipulations, such as Restriction, “chewing-back” or filling of overhangs for "blunt ends”, complementary ends of the fragments can be made available for the ligation. Analogous results can also be obtained using the polymerase chain reaction (PCR) using specific oligonucleotide primers.
  • PCR polymerase chain reaction
  • GAP Garnier ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇
  • Deletion of nucleotides preferably comprises those sequences which have a homology of at least 50%, preferably 70%, preferably at least 80%, particularly preferably at least 90%, very particularly preferably at least 95%, most preferably 99% over a length of at least 100 base pairs, preferably at least 200 base pairs, particularly preferably of at least 300 base pairs, very particularly preferably of at least 400 base pairs, most preferably of at least 500 base pairs.
  • promoter sequences used in the expression cassettes or vectors according to the invention can be found, for example, in various organisms whose genomic sequence is known, for example from Arabidopsis thaliana, Brassica napus, Nicotiana tabacum, Solanum tuberosum, Helianthiu anuus, Linum sativum Often find homology comparisons in databases.
  • Both the promoter sequence of the Nitl promoter according to SEQ ID NO.-1 and the coding sequence of the NITl gene (GenBank Acc.-No .: X86454) can be used for the search.
  • Functional equivalents also means DNA sequences which hybridize under standard conditions with the nucleic acid sequence coding for the NIT1 promoter according to SEQ ID NO: 1 or with the nucleic acid sequences complementary to it and which have essentially the same properties.
  • Standard hybridization conditions are to be understood broadly and therefore mean stringent as well as less stringent hybridization conditions.
  • Such hybridization conditions are described, inter alia, by Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T et al. , in Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, pp. 9.31-9.57) or in Current Protocols in Molecular Biology, John Wi ⁇ ey & Sons, N.Y. (1989), 6.3-.1-6.3.6. besehrieben.
  • the conditions during the washing step can be selected from the range of conditions limited by those with low stringency (with approximately 2X SSC at 50 ° C.) and those with high stringency (with approximately 0.2X SSC at 50 ° C., preferably at 65 ° C) (20X SSC: 0.3 M sodium citrate, 3 M NaCl, pH 7.0).
  • the temperature during the washing step can be raised from low stringent conditions at room temperature, about 22 ° C, to more stringent conditions at about 65 ° C. Both parameters, salt concentration and temperature, can be varied simultaneously, one of the two parameters can be kept constant and only the other can be varied. Denaturing agents such as formamide or SDS can also be used during hybridization. In the presence of 50% formamide, the hybridization is preferably carried out at 42 ° C.
  • a method for producing functional equivalents according to the invention preferably includes the introduction of mutations into the NIT1 promoter according to SEQ ID NO: 1.
  • Mutagenesis can be carried out in an undirected ("random") manner, the properties of the mutagenized sequences then being followed by a "trial-by-error""Procedure to be screened.
  • Particularly advantageous selection criteria include, for example, increased resistance to an antibiotic, herbicide or biocide against which the selection marker to be expressed confers resistance, or the level of the resulting expression of the guided nucleic acid sequence coding for the selection marker.
  • the latter can be analyzed at the transcriptional level (for example by Northern blot) or translation level (for example by immuno / Western blot) in the manner familiar to the person skilled in the art.
  • non-essential sequences of the promoter according to the invention can be deleted without significantly impairing the properties mentioned.
  • deletion variants represent functionally equivalent parts of the promoter described by SEQ ID NO: 1.
  • the promoter sequence can also be limited to specific, essential regulatory regions with the aid of a search routine for searching promoter elements. Certain promoter elements are often present in abundance in the regions relevant to promoter activity. This analysis can be carried out, for example, with computer programs such as the program PLACE ("Plant Curing Regulatory DNA Elements”; Higo K et al. (1999) Nucleic Acids Research 27 (1): 297-300) or the BIOBASE database “Transfac” (Biological Databases GmbH, Braunschweig).
  • PLACE Plant Curing Regulatory DNA Elements
  • Methods for mutagenizing nucleic acid sequences include, for example, the use of oligonucleotides with one or more mutations compared to the region to be mutated (for example as part of a "site-specific utagenesis").
  • primers with approximately 15 to approximately 75 nucleotides or more are used, preferably approximately 10 to approximately 25 or more nucleotide residues being located on both sides of the sequence to be changed.
  • the details and implementation of said mutagenesis methods are known to the person skilled in the art (Kunkel et al. (1987) Methods Enzymol, 154: 367-382; Tomic et al.
  • Mutagenesis can also be achieved by treating, for example, vectors that contain one of the nucleic acid sequences according to the invention can be realized with mutagenizing agents such as hydroxylamine.
  • nucleic acid sequences to be expressed transgenically to be expressed in the expression cassettes according to the invention and coding for selection markers can be functionally linked to further genetic control sequences in addition to one of the promoters according to the invention or its equivalent or equivalent part.
  • a functional link is understood to mean, for example, the sequential arrangement of the promoter, the nucleic acid sequence to be expressed transgenically, coding for a selection marker and, if appropriate, further regulatory elements such as, for example, a terminator such that each of the regulatory elements
  • nucleic acid sequence 15 can perform its function in the transgenic expression of the nucleic acid sequence, depending on the arrangement of the nucleic acid sequences to sense or anti-sense RNA. This does not necessarily require a direct link in the chemical sense. Genetic control sequences, such as enhancer sequences, can
  • nucleic acid sequence to be expressed transgenically is positioned behind the sequence which acts as a promoter, so that both sequences are covalently linked.
  • the distance between the promoter sequence and the nucleic acid sequence to be expressed transgenically is preferably less than 200 base pairs, particularly preferably less than 100 base pairs, very particularly preferably less than 50 base pairs.
  • a functional link can be established using common recombination and cloning techniques, as described, for example, in Maniatis T, Fritsch EF and Sambrook J (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold
  • sequences 40 are written. However, further sequences can also be positioned between the two sequences, which for example have the function of a linker with certain restriction enzyme interfaces or a signal peptide. The insertion of sequences can also lead to the expression of fusion proteins.
  • genetic control sequences is to be understood broadly and means all those sequences which have an influence on the formation or the function of the expression cassette according to the invention. Genetic control sequences modify, for example, transcription and translation in prokaryotic or eukaryotic organisms.
  • the expression cassettes according to the invention preferably comprise 5 'upstream of the respective nucleic acid sequence to be expressed transgenically, one of the promoters according to the invention and 3' downstream a terminator sequence as an additional genetic control sequence, and, if appropriate, further customary regulatory elements, in each case functionally linked to the nucleic acid sequence to be expressed ,
  • Genetic control sequences also include further promoters, promoter elements or minimal promoters which can modify or expand the expression-controlling properties. Genetic control sequences can, for example, additionally express the expression depending on certain stress factors or chemical stimulants. Corresponding elements are, for example, for water stress, abscisic acid (Lam E and Chua NH (1991) J Bio-l Chem 266 (26) -: 17131-171-35) and heat stress (Schöffl F et al. (1989) Mol Gen Genetics 217 (2-3): 246-53).
  • promoters can be functionally linked to the nucleic acid sequence to be expressed, which enable expression in other plant tissues or in other organisms, such as E. coli bacteria.
  • Genetic control sequences also include the 5 'untranslated region, introns or the non-coding 3' region of genes, preferably nit genes. It has been shown that these can play a significant role in regulating gene expression. It has been shown that 5 'untranslated sequences can increase the transient expression of heterologous genes. They can also promote tissue specificity (Rouster J et al. (1998) Plant J. 15: 435-440). Conversely, the 5 'untranslated region of the opaque-2 gene suppresses expression. Deletion of the corresponding region leads to an increase in gene activity (Lohmer S et al. (1993) Plant Cell 5: 65-73).
  • the expression cassette can advantageously contain one or more so-called “enhancer sequences” functionally linked to the promoter, which increase the transgene expression of the. Enable nucleic acid sequence. Also at the 3 'end of the transgene
  • nucleic acid sequences expressing additional advantageous sequences can be inserted, such as further regulatory elements or terminators.
  • the nucleic acid sequences to be expressed transgenically can be contained in one or more copies in the expression cassette.
  • Control sequences are also to be understood as those which enable homologous recombination or insertion into the genome of a host organism or which allow removal from the genome. For example, with homologous recombination
  • the natural promoter of a specific gene can be exchanged for one of the promoters according to the invention.
  • Methods such as cre / lox technology allow tissue-specific, possibly inducible, removal of the expression cassette from the genome of the host organism (Sauer B. (1998) Methods.
  • flanking sequences are added to the target gene (lox sequences), which later enable removal using the cre recombinase.
  • the recombinase technique can also be used to increase the efficiency of homologous recombination. Appropriate methods are known to the person skilled in the art
  • Polyadenylation signals suitable as control sequences in plants are functional polyadenylation signals and - preferably - those which essentially contain T-DNA polyadenylation signals from Agrobacterium turne f aciens, in particular gene 3 of T-DNA (octopine synthase) of the Ti plasmid pTiACHS correspond (Gielen et al. (1984) EMBO J 3: 835ff) or functional equivalents thereof.
  • the expression cassette contains a terminator sequence which is functional in plants.
  • Terminator sequences which are functional in plants generally mean those sequences which are able to bring about the termination of the transcription of a DNA sequence in plants.
  • suitable terminator sequences are the OCS (octopine synthase) terminator and the NOS (nopalin synthase) terminator.
  • OCS octopine synthase
  • NOS nopalin synthase
  • f-laja.zliche-.termator sequences are particularly preferred.
  • Plant terminator sequences generally mean those sequences which are part of a natural plant gene.
  • terminators of the potato cathepsin D inhibitor gene (GenBank Acc. No.: X74985; Terminator: SEQ ID NO: 16) or the terminator of the storage protein gene VfLElB3 (GenBank Acc. No .: Z26489; Terminator: SEQ ID NO: 17) from the field bean. These terminators are at least equivalent to the viral or T-DNA terminators described in the prior art.
  • the plasmid pSUN5NPTIICat (SEQ ID NO: 15) contains the plant terminator of the cathepsin D inhibitor gene from potato.
  • Selection markers include both positive selection markers, which confer resistance to an antibiotic, herbicide or biocide, and negative selection markers, which confer sensitivity to these, as well as markers which give the transformed organism a growth advantage (for example by expression of key genes of the cytokine biosynthesis; Ebinuma H et al. (2000) Proc Natl Acad Sei USA 94: 2117-2121). In the case of positive selection, only those organisms that express the corresponding selection marker thrive, whereas in negative selection these are included. When producing transgenic plants, the use of a positive selection marker is preferred. It is also preferred the use of selection markers that give growth advantages. Negative selection markers can be used advantageously when it comes to removing certain genes or genomic sections from an organism (for example as part of a cross-breeding process).
  • the selectable marker introduced with the expression cassette gives the successfully recombined or transformed cells resistance to a biocide (for example a herbicide such as phosphinothricin, glyphosate, imidazolinone or sulfonylurea herbicides or bromoxynil), a metabolism inhibitor such as 2-deoxyglucose-6-phosphate WO 98/45456) or an antibiotic, such as, for example, kanamycin, G 418, bleomycin, hygromycin.
  • a biocide for example a herbicide such as phosphinothricin, glyphosate, imidazolinone or sulfonylurea herbicides or bromoxynil
  • a metabolism inhibitor such as 2-deoxyglucose-6-phosphate WO 98/45456
  • an antibiotic such as, for example, kanamycin, G 418, bleomycin, hygromycin.
  • the selection marker permits the selection of the
  • the selectable marker introduced with the expression cassette gives the successfully recombined or transformed cells resistance to a biocide (for example a herbicide such as phosphinothricin, glyphosate or bromoxynil), a metabolism inhibitor such as 2-deoxyglucose-6-phosphate (WO 98/45456) or Antibiotic, such as, for example, tetracycline, ampicillin, kanamycin, G 418, neomycin, bleomycin or hygromycin.
  • a biocide for example a herbicide such as phosphinothricin, glyphosate or bromoxynil
  • a metabolism inhibitor such as 2-deoxyglucose-6-phosphate (WO 98/45456) or Antibiotic, such as, for example, tetracycline, ampicillin, kanamycin, G 418, neomycin, bleomycin or hygromycin.
  • Antibiotic such as, for example, tetracycline, amp
  • PPT phosphinothricin acetyltransferases
  • PPT glutamine synthase inhibitor
  • bar Bialophos ® resistance gene
  • the bar gene coding for a phosphinothricin acetyltransferase (PAT) can be isolated from, for example, Streptomyces hygroscopicus or S. viridochromogenes.
  • Polypeptides according to SEQ ID NO: 3 for example, encoded by a nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 2.
  • the genes confer resistance to the herbicide bialaphos or glufosinate and are frequent users in transgenic plants (Vickers JE et al. (1996). Plant Mol Miol Reporter 14: 363-368; Thompson CJ et al. (1987) EMBO J 6: 2519-2523).
  • EEPSP synthase genes which confer resistance to glyphosate (N- (phosphonomethyl) glycine).
  • the unselective herbicide glyphosate has 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthase (EPSPS) as its molecular target.
  • EPSPS 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthase
  • the EPSPS gene of Agrobacterium sp. strain CP4 has a natural tolerance to glyphosate, which can be transferred to corresponding transgenic plants.
  • the CP4 EPSPS gene was derived from Agrobacterium sp. strain CP4 cloned (Padgette SR et al. (1995) Crop Science 35 (5): 1451-1461). Sequences of 5-enolpyrvylshikimate-3-phosphate synthases, the
  • aroA gene is also preferred (M10947 S. typhimurium aroA locus 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (aroA protein) gene).
  • glyphosate oxidoreductase coding for the glyphosate® degrading enzyme.
  • GOX for example, the glyphosate oxidoreductase from Achromobacter sp. Catalyzed the cleavage of a CN bond in the glyphosate, which is thus converted to aminomethylphosphonic acid (AMPA) and glyoxylate.
  • AMPA aminomethylphosphonic acid
  • GOX can thereby confer resistance to glyphosate (Padgette SR et al. (1996) J Nutr. 1996 Mar; 126 (3): 702-16; Shah D et al. (1986) Science 233: 478-481).
  • deh gene (coding for a dehalogenase which inactivates Dalapon®), (GenBank Acc. -No.: AX022822, AX022820 and W099 / 27116)
  • - bxn genes coding for bromoxynil-degrading nitrilase enzymes.
  • the nitrilase from Klebsiella ozanenae Sequences can be found in the genebank, for example, under Acc.-No: E01313 (DNA encoding bromoxynil-specific nitrilase) and J03196 (K. pneumoniae bro oxynil-specific nitrilase (bxn) gene, complete cds).
  • Neomycin phosphotransferases confer resistance to antibiotics (aminoglycosides) such as neomycin, G418, hygromycin, paromomycin or kanamycin by reducing their inhibitory effect through a phosphorylation reaction.
  • antibiotics aminoglycosides
  • the nptll gene is particularly preferred. Sequences can be obtained from GenBank (AF080390 mini transposon mTn5-GNm; AF080389 mini transposon mTn5-Nm, complete sequence).
  • the gene is already part of numerous expression vectors and can be isolated from them using methods familiar to the person skilled in the art (such as, for example, polymerase chain reaction) (AF234316 pCAMBIA-2301; AF234315 pCAMBIA-2300, AF234314 pCAMBIA-2201).
  • the NPTII gene codes for an aminoglycoside 3 'O-phosphotransferase from E. coli, Tn5 (GenBank Acc: -No: U00004 position 1401-2300; Beck et al. (1982) Gene 19 327-336).
  • the gene D0G R 1 was isolated from the yeast Saccharomyces cerevisiae (EP 0 807 836). It encodes a 2-deoxyglucose-6-phosphate phosphatase that confers resistance to 2-D0G (Randez-Gil et al. 1995, Yeast 11, 1233-1240; Sanz et al. (1994) Yeast 10: 1195-1202, Sequence: GenBank Acc.-No .: NC001140 Chromosome VIII, Saccharomyces cervisiae Position 194799-194056).
  • herbicides for sulfonyl urine Substance herbicides may be mentioned, for example, amidosulforon, azim-sulfuron, chlorimuronethyl, chlorosulfuron, cinosulfuron, imazosulforon, oxasulforon, prosulforon, rimsulforon, sulfosulforon. Numerous other active substances of the classes mentioned are known to the person skilled in the art. Are suitable
  • Nucleic acid sequences such as, for example, the sequence for the Arabidopsis thaliana Csr 1.2 gene (EC 4.1.3.18) filed under GenBank Acc-No .: X51514 (Sathasivan K et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18 (8): 2188). Acetolactate synthases that confer resistance to imidazolinone herbicides are also described under GenBank Acc.-No .:
  • acetolactate synthase according to SEQ ID NO: 5 is preferred, for example encoded by a nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 4.
  • Hygromycin phosphotransferases (X74325 P. pseudomallei gene for hygromycin phosphotransferase) which confer resistance to the antibiotic hygromycin.
  • the gene is part of numerous expression vectors and can be isolated from them using methods known to the person skilled in the art (such as, for example, polymerase chain reaction) (AF294981 pINDEX4; AF234301 pCAMBIA-1380; AF234300 pCAMBIA-1304; AF234299 pCAM-BIA-1303; AF234298 pCAMBIA); AF354046 pCAMBIA-1305.;
  • X65876 S. ordonez genes class D tetA and tetR for tetracycline resistance and repressor proteins X51366 Bacillus cereus plasmid pBC16 tetracycline resistance gene.
  • the gene is already part of numerous expression vectors and can be isolated from these using methods familiar to the person skilled in the art (such as, for example, polymerase chain reaction)
  • Streptomycin various resistance genes are described e.g. with the GenBank Acc.-No. : AJ278607 Corynebacterium acetoacidophilum ant gene for streptomycin adenylyl transferase.
  • the corresponding resistance gene is part of numerous cloning vectors (e.g. L36849 cloning vector pZEO) and can be isolated from these using methods familiar to the person skilled in the art (such as, for example, polymerase chain reaction).
  • cloning vectors e.g. L36849 cloning vector pZEO
  • the ipt gene is a key enzyme in cytokine biosynthesis. Its overexpression facilitates the regeneration of plants (eg selection on cytokine-free medium). ' The procedure for using the ipt gene is described (Ebinuma H et al. (2000) Proc Natl Acad Sei USA 94: 2117-2121; Ebinuma, H et al. (2000) Selection of Marker-free transgenic plants using the onco- genes (ipt, rol A, B, C) of Agrobacterium as selectable markers, In Molecular Biology of Woody Plants. Kluwer Academic Publishers).
  • EP-A 0 601 092 Various other positive selection markers which give the transformed plants a growth advantage over non-transformed ones, and methods for their use are described, inter alia, in EP-A 0 601 092.
  • Examples include ⁇ -glucuronidase (in conjunction with, for example, cytotoxic kininglucuronide), mannose-6-phosphate isomerase (in connection with mannose), UDP-galactose-4-epimerase (in connection with eg galactose), with mannose-6-phosphate isomerase in connection with mannose being particularly preferred.
  • Negative selection markers enable, for example, the selection of organisms with successfully deleted sequences which comprise the marker gene (Koprek T et al. (1999) The Plant Journal 19 (6): 719-726).
  • the negative selection marker introduced into the plant converts a compound which otherwise has no adverse effect on the plant into a compound with an adverse effect.
  • genes which per se have an adverse effect such as, for example, TK thymidine kinase (TK) and Diphtheria Toxin A fragment (DT-A), the codA gene product coding for a cytosine deaminase (Gleave AP et al.
  • concentrations of antibiotics, herbicides, biocides or toxins used for the selection must be adapted to the respective test conditions or organisms.
  • Examples of plants to be mentioned are kanamycin (Km) 50 mg / 1, hygromycin B 40 mg / 1, phosphinothricin (Ppt) 6 mg / 1.
  • Functional analogs of the nucleic acids mentioned can be expressed coding for selection markers.
  • Functional analogs here means all the sequences that have essentially the same function i.e. are able to select transformed organisms.
  • the functional analogue can differ in other characteristics. For example, it may have a higher or lower activity, or it may have other functionalities.
  • Functional analogs furthermore mean sequences which code for fusion proteins consisting of one of the preferred selection markers and other proteins, for example a further preferred selection marker or else a signal peptide sequence.
  • the selection marker can be expressed in any desired cell compartment, such as the endomembrane system, the vacuole and the chloroplasts. By using the secretory path, desired glycosylation reactions, special folds etc. are possible. Secretion of the target protein to the cell surface or secretion into the culture medium, for example when using suspension-cultured cells or protoplasts, is also possible.
  • the necessary target sequences can be taken into account both in single vector variations as well as by using a suitable cloning the Common the target gene to be cloned be inserted into the vector with 'with'.
  • target genes if available, or heterologous sequences can be used as target sequences.
  • Additional, heterologous sequences which are preferred for functional linkage, but are not limited to these, are further targeting sequences to ensure subcellular localization in the apoplast, in the vacuole, in plastids, in the mitochondrion, in the endoplasmic reticulum (ER), in the cell nucleus, in oil corpuscles or others compartments; and translation enhancers such as the 5 'leader sequence from the tobacco mosaic virus (Gallie et al., Nucl. Acids Res. 15 (1987), 8693-8711) and the like.
  • SSU Small subunit of ribulose bisphosphate carboxylase
  • Transit peptides derived from genes of vegetable fatty acid biosynthesis such as the transit peptide of the plastid "acyl carrier protein" (ACP), the stearyl-ACP desaturase, ⁇ -ketoacyl-ACP synthase or the acyl-ACP thioesterase.
  • ACP acyl carrier protein
  • stearyl-ACP desaturase stearyl-ACP desaturase
  • ⁇ -ketoacyl-ACP synthase or the acyl-ACP thioesterase.
  • the target sequences can be linked to other targeting sequences different from the transit peptide, in order to achieve subcellular localization in the apoplast, in the vacuole, in plastids, in the mitochondrion, in the endoplasmic reticulum (ER), in the cell nucleus, in oil cells or other compartments.
  • translation enhancers such as the 5 'leader sequence from the tobacco Mosaic virus (Gallie et al. (1987) Nucl Acids Res 15: 8693-8711) and the like can be used.
  • the expression cassettes according to the invention and the vectors derived from them can contain further functional elements.
  • the term functional element is to be understood broadly and means all those elements which have an influence on the production, multiplication or function of the expression cassettes according to the invention or of vectors or organisms derived therefrom. Examples include, but are not limited to:
  • Reporter genes which code for easily quantifiable proteins and which, by means of their own color or enzyme activity, ensure an assessment of the transformation efficiency, the location or time of expression.
  • Genes coding for reporter proteins are very particularly preferred (see also Schenborn E, Groskreutz D. Mol Biotechnol. 1999; 13 (l): 29-44) such as
  • GFP green fluorescence protein
  • Chlora phenicol transferase (Fromm et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 5824-5828),
  • Luciferase (Millar et al., Plant Mol Biol Rep 1992 10: 324-414; Ow et al. (1986) Science, 234: 856-859); allows bioluminescence detection.
  • GUS ⁇ -glucuronidase
  • uidA ⁇ -glucuronidase
  • ⁇ -lactamase (Sutcliffe (1978) Proc Natl Acad Sei USA 75: 3737-3741), enzyme for various chromogenic substrates (e.g. PADAC, a chromogenic cephalosporin).
  • Co mun 126 (3): 1259-1268 can be used in calcium sensitive bioluminescence detection.
  • origin of replication which is an increase in the expression cassettes or vectors according to the invention in, for example
  • E. coli examples are ORI (origin of DNA replication), the pBR322 ori or the P15A ori (Sambrook et al .: Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, '1989) ,
  • MCS Multiple cloning regions
  • An expression cassette according to the invention is produced, for example, by fusing the nitl promoter according to SEQ-ID NO: (or a functional equivalent or a functionally equivalent part) with a nucleotide sequence to be expressed coding for a selection marker, optionally one for a sequence encoding a transit peptide, preferably a chloroplast-specific transit peptide, which is preferably arranged between the promoter and the respective nucleotide sequence, and a terminator or polyadenylation signal.
  • an expression cassette is also to be understood as such constructions in which a nucleic acid sequence to be expressed transgenically is encoded for a selection marker, for example by means of a homologous recombination behind the endogenous, natural NITI promoter (or one of its functional equivalents, for example from other plant species) is obtained, thereby obtaining an expression cassette according to the invention which controls the expression of the nucleic acid sequence to be expressed transgenically coding for a selection marker in the manner according to the invention
  • Vectors according to the invention also contain the expression cassettes described above.
  • Vectors can be, for example, plasmids, cosmids, phages, viruses or even agrobacteria.
  • Another object of the invention relates to transgenic organisms, - transformed with at least one expression cassette according to the invention or a vector according to the invention, as well as cells, cell cultures, tissues, parts - such as leaves, roots etc. in plant organisms - or propagation material derived from such organisms.
  • Organism starting or host organisms are understood to mean prokaryotic or eukaryotic organisms, such as, for example, microorganisms or plant organisms.
  • Preferred microorganisms are bacteria, yeast, algae or fungi.
  • Preferred bacteria are bacteria of the genus Escherichia, Erwinia, Agrobacterium, Flavobacterium, Alcaligenes or cyano-bacteria, for example of the genus Synechocystis.
  • microorganisms which are capable of infecting plants and thus of transmitting the cassettes according to the invention.
  • Preferred microorganisms are those from the genus Agrobacterium and especially from the species Agrobacterium tumefaciens.
  • Preferred yeasts are Candida, Saccharomyces, Hansenula or 5 Pichia.
  • Preferred mushrooms are Aspergillus, Trichoderma, Ashbya, Neurospora, Fusarium, Beauveria or others in Indian Chem Engr. Section B. Vol 37, No 1,2 (1995) on page 15, table 6
  • Plants are particularly preferred host or starting organisms as transgenic organisms. Included in the scope of the invention are all genera and species of higher and lower plants in the plant kingdom. Also included are
  • Mature plants mean plants at any stage of development beyond the seedling. Seedling means a young, immature plant at an early stage of development.
  • angiosperms examples include, but are not limited to, angiosperms, bryophytes such as hepaticae (liverwort) and musci (mosses); Pteridophytes such as ferns, horsetail and lycopods; Gymnosperms such as conifers, cycads, ginkgo and gnetals; Algae such as chloro-
  • Preferred monocotyledon plants are particularly selected from the monocotyledonous crop plants, such as the Graineae family such as rice, corn, wheat or other cereals such as barley, millet, rye, triticale or oats, and sugar cane and all types of grasses.
  • the Graineae family such as rice, corn, wheat or other cereals such as barley, millet, rye, triticale or oats, and sugar cane and all types of grasses.
  • Preferred dicotyledonous plants are in particular selected from the dicotyledonous crop plants, such as, for example
  • Asteraceae such as sunflower, tagetes or calendula and others
  • - Cruciferae especially the genus Brassica, especially the species napus (rape), campestris (turnip), oleracea cv Tastie (cabbage), oleracea cv Snowball Y (cauliflower) and oleracea cv Emperor (broccoli) and other types of cabbage; and the genus Arabidopsis, especially the species thaliana as well as cress or canola and others,
  • Cucurbitaceae such as melon, pumpkin or zucchini and others
  • - Leguminosae especially the genus Glycine, especially the type max (soybean) soy, as well as alfalfa, peas, beans or peanuts and others
  • Rubiaceae preferably of the subclass Lamiidae .w., For example Coffea arabica or Coffea liberica (coffee shrub) and others,
  • Solanaceae especially the genus Lycopersicon, especially the species esculentum (tomato) and the genus Solanum, especially the species tuberosum (potato) and melongena (eggplant) as well as tobacco or peppers and others,
  • Sterculiaceae preferably of the subclass Dilleniidae such as Theobroma cacao (cocoa bush) and others,
  • Theaceae preferably of the subclass Dilleniidae, such as, for example, Camellia sinensis or Thea sinensis (tea bush) and others,
  • Examples include, but are not limited to, angiosperms, bryophytes such as hepaticae (liverwort) and musci (mosses); Pteridophytes such as ferns, horsetail and lycopods; Gymno-
  • Arabidopsis thaliana Most preferred are Arabidopsis thaliana, Nicotiana tabacum, Tagetes erecta, Calendula officinalis and Brassica napus as well as all genera and species that are used as food or feed
  • oilseeds such as
  • Example rapeseed types of nuts, soy, sunflower, pumpkin and peanut.
  • Plant organisms in the sense of the invention are further photosynthetically active capable organisms, such as algae or cyanobacteria, and mosses.
  • Preferred algae are green algae. such as - for example algae of the genus Haematococcus, Phaedactylum tricornatum, Volvox or Dunaliella.
  • the DNA can be introduced directly by microinjection or by bombardment with DNA-coated microparticles.
  • the cell can also be chemically permeabilized, for example with polyethylene glycol, so that the DNA reaches the cell by diffusion
  • the DNA can also be obtained by protoplast fusion with others
  • DNA-containing units such as mini cells, cells, lysosomes or liposomes.
  • Electroporation is another suitable one Method of introducing DNA in which the cells are reversibly permeabilized by an electrical impulse.
  • Suitable methods are above all the protoplast transformation by polyethylene glycol-induced DNA uptake, the biolistic method with the gene gun, the so-called particle bombardment method, the electroporation, the incubation of dry embryos in DNA-containing solution and the microinction.
  • a transformation can also be carried out by bacterial infection using Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes. These strains contain a plasmid (Ti or Ri plasmid) which is transferred to the plant after Agrobacterium infection. Part of this plasmid, called T-DNA (transferred DNA), is integrated into the genome of the plant cell.
  • Ti or Ri plasmid plasmid
  • T-DNA transferred DNA
  • the Agrobacterium -mediated transformation is best suited for dicotyledonous, diploi-de plant cells, whereas the direct transformation techniques are suitable for every cell type.
  • Cells preferably in plant cells, can be beneficial under
  • the expression cassette is introduced by means of plasmid vectors.
  • Preferred vectors are those which enable stable integration of the expression cassette into the host genome.
  • plasmid In the case of injection or electroporation of DNA into plant cells, there are no special requirements for the plasmid used. Simple plasmids such as the pUC series can be used. If complete plants are to be regenerated from the transformed cells, it is necessary that an additional selectable marker gene is located on the plasmid.
  • Transformation techniques are described for various monocot and dicotyledonous plant organisms. Furthermore, various possible plasmid vectors are available for the introduction of foreign genes into plants, which usually have an origin of replication for propagation in E. coli and a marker gene for a selection of transformed bacteria. Examples are pBR322, pUC series, Ml3mp series, pACYC184 etc.
  • the expression cassette can be inserted into the vector via a suitable restriction site.
  • the resulting plasmid is first introduced into E. coli. Correctly transformed E. coli are selected, grown and the recombinant plasmid obtained using methods familiar to the person skilled in the art. Restriction analysis and sequencing can be used to check the cloning step.
  • Transformed cells i.e. those which contain the introduced DNA integrated into the DNA of the host cell can be selected by untransformed ones if a selectable marker is part of the introduced DNA.
  • Any gene that can confer resistance to antibiotics or herbicides can act as a marker, for example.
  • the expression cassette must be integrated in special plasmids, either in a shuttle or intermediate vector or in a binary vector. If, for example, a Ti or Ri plasmid is to be used for the transformation, at least the right boundary, but mostly the right and the left boundary of the Ti or Ri plasmid T-DNA as flanking region, is connected to the expression cassette to be inserted.
  • Binary vectors are preferably used. Binary vectors can replicate in both E.coli and Agrobacterium. They usually contain a selection marker gene and a linker or polylinker flanked by the right and left T-DNA restriction sequences.
  • the selection marker gene allows selection of transformed agrobacteria and is, for example, the nptll gene which confers resistance to kanamycin.
  • the Agrobacterium which acts as the host organism in this case, should already contain a plasmid with the vir region. This is for the transfer of the T-DNA to the plant cell is required. An Agrobacterium transformed in this way can be used to transform plant cells.
  • T-DNA for the transformation of plant cells has been intensively investigated and described (EP 120516; Hoekema, In: The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters BV, Alblasserdam, Chapter V; Fraley et al., Crit. Rev. Plant. Sei ., 4: 1-46 and An et al. (1985) EMBO J 4: 277-287).
  • Various binary vectors are known and some are commercially available, for example pBIN19 (Clontech Laboratories, Inc. USA).
  • plant explants are co-cultivated with Agrobacterium turnefaciens or Agrobacterium rhizogenes.
  • infected plant material e.g. leaf, root or stem parts, but also protoplasts or suspensions of plant cells
  • whole plants can be regenerated using a suitable medium, which may contain antibiotics or biocides for the selection of transformed cells.
  • the integrated expression cassette contains a selection marker which gives the transformed plant resistance to a biocide (for example a herbicide), a metabolism inhibitor such as 2-DOG or an antibiotic such as kanamycin, G 418, bleomycin, hygromycin or phosphinothricin etc.
  • a biocide for example a herbicide
  • 2-DOG a metabolism inhibitor
  • an antibiotic such as kanamycin, G 418, bleomycin, hygromycin or phosphinothricin etc.
  • the selection marker allows the selection of transformed cells from untransformed (McCormick et al., Plant Cell Reports 5 (1986), 81-84).
  • the plants obtained can be grown and crossed in the customary manner. Two or more generations should be cultivated to ensure that genomic integration is stable and inheritable.
  • the construct to be expressed is preferably cloned into a vector which is suitable for transforming Agrobacterium tume faciens, for example pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984), 8711).
  • a transformed plant cell has been made, a whole plant can be obtained using methods known to those skilled in the art. This is based on the example of callus cultures. The formation of shoots and roots can be induced in a known manner from these still undifferentiated cell masses. The sprouts obtained can be planted out and grown.
  • the effectiveness of the expression of the transgenically expressed nucleic acids can be determined, for example, in vitro by sprout meristem propagation using one of the selection methods described above.
  • Genetically modified plants according to the invention that can be consumed by humans and animals can also be used, for example, directly or after preparation known per se as food or feed.
  • Another object of the invention relates to the use of the transgenic organisms according to the invention described above and the cells, cell cultures, parts derived therefrom - such as roots, leaves, etc.
  • transgenic plant organisms. -, and transgenic propagation material such as seeds or fruits, for the production of food or feed, pharmaceuticals or fine chemicals.
  • This process is widely applicable to fine chemicals such as enzymes, vitamins, amino acids, sugars, fatty acids, natural and synthetic flavors, aromas and colors.
  • the production of tocopherols and tocotrienols and carotenoids is particularly preferred.
  • the transformed host organisms and the isolation from the host organisms or from the growth medium are grown using methods known to those skilled in the art.
  • SEQ ID NO: 7 oligonucleotide primer nit5 5 -CATCAAGATCTTGGTGATGTAGCAA-3 '30
  • SEQ ID NO: 8 oligonucleotide primer ubi5 5 * -CCAAACCATGGTAAGTTTGTCTAAAGCTTA-3 *
  • SEQ ID NO: 9 Oligonucleotide primer ubi3 35 5 ⁇ -CGGATCCTTTTGTGTTTCGTCTTCTCTCACG-3 x
  • SEQ ID NO: 10 oligonucleotide primer sqs5 5 -GTCTAGAGGCAAACCACCGAGTGTT-3 v
  • SEQ ID NO: 14 binary plasmid pSUN3PatNos (S.e GmbH & Co KGaA)
  • SEQ ID NO: 18 Truncated promoter (1478 bp) of the Arabidopsis thaliana NITl gene
  • Arabidopsis thaliana promoter with the 35S promoter.
  • the tobacco lines UH76 and UH77 contain the GUS gene under the control of the 35S promoter.
  • the UH127 line contains the GUS gene under the control of the NITl promoter from Arabidopsis thalma.
  • WT represents the untransformed wild tobacco type.
  • oligonucleotides can be carried out, for example, in a known manner using the phosphoamidite method (Voet, Voet, 2nd edition, Wiley Press New York, pages 896-897).
  • the cloning steps carried out in the context of the present invention such as restriction cleavages, agarose gel electrophoresis, purification of DNA fragments, transfer of nucleotides, Acids on nitrocellulose and nylon membranes, linking of DNA fragments, transformation of E. coli cells, cultivation of bacteria, multiplication of phages and sequence analysis of recombinant DNA are carried out as in Sambrook et al. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press; ISBN 0-87969-309-6.
  • the sequencing of recombinant DNA molecules takes place with a laser fluorescence DNA sequencer from ABI according to the method of Sanger (Sanger et al. (1977) Proc Natl Acad Sei USA 74: 5463-5467).
  • Example 1 Isolation of genomic DNA from Arabidopsis thaliana (CTAB method)
  • the mixture is extracted at room temperature with 1 ml of chloroform / octanol (24: 1, shaken with IM Tris / HCl, pH 8.0) by slow inverting and centrifuged for 5 min at 8,500 rpm (7,500 xg) and room temperature.
  • the aqueous phase is then extracted again with 1 ml of chloroform / octanol, centrifuged and mixed thoroughly by inverting with 1/10 volume of CTAB II buffer preheated to 65 ° C.
  • the mixture is mixed by carefully swirling with 1 ml of chloroform / octanol mixture (see above) and centrifuged for 5 min at 8,500 rpm (7,500 xg) and room temperature to separate the phases again.
  • the aqueous lower phase is transferred to a fresh Eppendorf tube and the upper organic phase is centrifuged again in a fresh Eppendorf tube for 15 min at 8,500 rpm (7,500 xg) and room temperature.
  • the resulting aqueous phase is combined with the aqueous phase from the previous centrifugation step and exactly the same volume of preheated CTAB HI buffer is added to the entire batch. This is followed by incubation at 65 ° C until the DNA precipitates in flakes.
  • the sediment resulting from the subsequent centrifugation step (5 min, 2000 rpm (500 xg), 4 ° C.) is mixed with 250 ⁇ l of CTAB IV buffer preheated to 65 ° C. and added for at least 30 min or until the sediment has completely dissolved Incubated at 65 ° C. Then the solution for precipitating the DNA mixed with 2.5 volumes of ice-cold ethanol and incubated for 1 h at -20 ° C. Alternatively, the batch can be mixed with 0.6 volumes of isopropanol and centrifuged immediately for 15 min at 8,500 rpm (7,500 xg) and 4 ° C without further incubation.
  • the sedimented DNA is washed twice with 1 ml of 80% ice-cold ethanol by inverting the Eppendorf tube, centrifuged again after each washing step (5 min, 8,500 rpm (7,500 xg), 4 ° C) and then air-dried for approx. 15 min , Finally, the DNA is resuspended in 100 ⁇ l TE with 100 ⁇ g / ml RNase and incubated for 30 min at room temperature. After a further incubation phase at 4 ° C overnight, the DNA solution is homogeneous and can be used for further experiments.
  • Solution IV (high-salt TE) (for 200 ml): 10 M Tris / HC1 pH 8.0, (0.242 g)
  • the mixture is shaken twice with 1 M TrisHCl pH 8.0 and stored protected from light.
  • Example 2 Transformation of tobacco, rapeseed and potatoes Tobacco was transformed by infection with Agrobacterium turne faciens. according to the method developed by Horsch (Horsch et al. (1985) Science 227: 1229-1231). All constructs used for the transformation were transformed into Agrobacterium tumefaciens using the freeze / thaw method (repeated thawing and freezing). The Agrojbacteriuz ⁇ colonies containing the desired construct were selected on mannitol / glutamate medium with 50 ⁇ g / ml kanamycin, 50 ⁇ g / l ampicilin and 25 ⁇ g / ml rifampicin.
  • Rapeseed was transformed using the petioles transformation according to Moloney et al. (Moloney MM et al. (1989) Plant Cell Reports 8: 238-242).
  • Potatoes were transformed using the Kunze et al. (Kunze I et al. (2001) Molecular Breeding 7: 221-227).
  • the putative Nitrilasel promoter was amplified by PCR from genomic Arabidopsis thaliana DNA with the primers nit3 and nit5.
  • nit3 SEQ ID NO: 6
  • the resulting PCR fragment was cloned into the Smal cut plasmid pUC18 (pNit22) and verified by sequence analysis.
  • the starting plasmid for analyzes with the glucuronidase gene is the plasmid pGUSINT37.
  • the 35S-GUS intron cassette was cut out of the binary plasmid p35SGUSINT (G. Vancanneyt et al. (1989) Mol. Gen. Genet. 220: 245-50) by digestion with PstI. The ends of the fragment were smoothed by Klenow "fill-in” and the fragment was cloned into the vector pUCl8 cut Smal. This construct is called pGUSINT37.
  • the BamHI fragment from the pNit22 vector was cloned into the BamHI cut, dephosphorylated plasmid pGUSINT37.
  • the construct obtained is called pNitlGUSINT.
  • the NIT1 promoter was cloned as a BamHI fragment before the phosphinothricin resistance gene into the .BamHI cut, dephosphorylated plasmid pSUN3PatNos (Surgie GmbH & Co KGaA, SEQ ID NO: 14).
  • the resulting plasmid was transformed into tobacco.
  • the NIT1 promoter was cloned as an Xhol fragment before the NptII resistance gene in the Xhol-cut, dephosphorylated plasmid pSUN5NptIICat (Surgie GmbH & Co KGaA, SEQ ID NO: 15).
  • the resulting plasmid called pS5NitNptII, was transformed into tobacco, rapeseed and potato.
  • the Nitl promoter was combined with the bar gene (UH126) and cloned into the vector pSUN3, which contains the nptll gene under the control of the nos promoter.
  • the plasmid pSUNl4 served as comparison controls
  • PPZP200 carries. All three constructs were found in the Agrobacterium tumefaciens
  • the bar gene equipped with the nitrilase promoter provided regeneration efficiencies comparable to those of the 35S promoter construct.
  • the Nitl promoter was combined with the NptII gene.
  • the resulting construct pS5NitNptII was shown in
  • Example 2 described, were used. The selective rain
  • the Nptll gene equipped with the nitrilase promoter provided regeneration efficiencies comparable to those of NOS promoter constructs.
  • the results demonstrate that the isolated nucleic acid sequence has the desired advantageous promoter properties, i.e. it shows a promoter activity which is suitable for expressing selection markers effectively.
  • the ubiquitin promoter was amplified by PCR from genomic Arabidopsis thaliana DNA with the primers ubi5 and ubi3.
  • the resulting PCR fragment was cloned as a HindII / BamHI fragment into the plasmid pGUSINT37 cut with HindIII / BamHI (pUBI42GUS) and verified by means of sequence analysis.
  • the ubiquitin promoter was cloned as a BamHI / HindiII fragment before the phosphinothricin resistance gene in the BamHI / HindiII cut plasmid pSUN3PatNos.
  • the resulting plasmid pSUN3UBIPat was used to transform tobacco using Agrobacterium tumefaciens strain EHA101. The selective regeneration of the tobacco plants took place on the one hand on phosphinothricin (5 mg / 1) and on the other hand as a control on kanamycin (100 mg / 1).
  • the ubiquitin promoter is not suitable for the expression of a selective marker for Agrobacterium tumefaciens-mediated gene transfer followed by tissue regeneration.
  • the squalene synthase promoter was amplified by PCR from genomic Arabidopsis thaliana DNA with the primers sqs5 and sqs3.
  • sqs5 (SEQ ID NO: 10): 5 x -GTCTAGAGGCAAACCACCGAGTGTT-3 sqs3 (SEQ ID NO: 11): 5 v -CGGTACCTGTTTCCAGAAAATTTTGATTCAG-3
  • the resulting PCR fragment was cloned as an Xfoall / BamHI fragment into the plasmid pGUSINT37 _ .. cut with Xfoall / BamHI (pSQSPGUS) and verified by means of sequence analysis.
  • the squalene synthase promoter was cloned as a BamKI / SalI fragment before the phosphinothricin resistance gene in the BamEl / Saln plasmid pSUN3PatNos cut.
  • the resulting plasmid pSUN3SQSPat was used to transform tobacco using the Agrobacterium tumefaciens strain EHA101.
  • the selective regeneration of the tobacco plants took place on the one hand on phosphinothricin (5 mg / l) and on the other hand as a control on kanamycin (100 mg / l).
  • the squalene synthase promoter is not suitable for the expression of a selective marker for the Agrobacterium tumefaciens -mediated gene transfer with subsequent regeneration of tissues.
  • Comparative Example 3 Testing the promoter activity of the ubiquitin and squalene synthase promoter using a particle gun
  • Microcarriers 25 ⁇ g gold, Hereus 0.3 to 3 ⁇ m were treated with 10 ⁇ g plasmid DNA, 2.5 M CaC12, and 0.1 M spermidine, washed with alcohol and under a vacuum of 26 inches and one
  • 25 synthase promoter is significantly weaker than that of the CaMV3SS promoter.

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Abstract

Die Erfindung betrifft Expressionskassetten und Vektoren, die Selektionsmarker-Gene unter Kontrolle des pflanzlichen konstitutiven Nitrilase 1 (NIT1) Promotors aus Arabidopsis thaliana enthalten, sowie die Verwendung dieser Expressionskonstrukte oder Vektoren zur Selektion transgener Organismen, bevorzugt Pflanzen. Die Erfindung betrifft ferner mit diesen Expressionskassetten oder Vektoren transformierte transgene Pflanzen, davon abgeleitete Kulturen, Teile oder Vermehrungsgut, sowie die Verwendung derselben zur Herstellung von Nahrungs-, Futtermitteln, Saatgut, Pharmazeutika oder Feinchemikalien.

Description

Expressionskassetten zur transgenen Expression von Selektions- markern
Beschreibung
Die Erfindung betrifft Expressionskassetten und Vektoren, die Selektionsmarker-Gene unter Kontrolle des pflanzlichen konstitutiven Nitrilase 1 (NITl) Promotors aus Arabidopsis thaliana enthalten, sowie die Verwendung dieser Expressions- konstrukte oder Vektoren zur Selektion transgener Organismen, bevorzugt Pflanzen. Die Erfindung betrifft ferner mit diesen Expressionskassetten oder Vektoren transformierte transgene Pflanzen, davon abgeleitete Kulturen, Teile oder Vermehrungsgut, sowie die Verwendung derselben zur Herstellung von Nahrungs-, Futtermitteln, Saatgut, Pharmazeutika oder Feinchemikalien.
Ziel biotechnologischer Arbeiten an Pflanzen ist die Herstellung von Pflanzen mit verbesserten Eigenschaften zum Beispiel zur Steigerung der landwirtschaftlichen Produktivität. Die Herstellung transgener Pflanzen ist eine grundlegende Technik der Pflanzenbiotechnologie und damit eine unerlässliche Voraussetzung für die pflanzliche ...Grundlagenforschung sowie für die Herstellung von Pflanzen mit verbesserten, neuen Eigenschaften für die Landwirtschaft, zur Qualitätssteigerung bei Nahrungsmitteln oder zur Produktion bestimmter Chemikalien oder Pharmazeutika (Dunwell JM, J Exp Bot. 2000; 51 Spec No:487-96).
Eine Grundvoraussetzung für die transgene Expression bestimmter Gene in Pflanzen- ist - aufgrund der geringen Effizienz der Transformation von Pflanzen - die Möglichkeit, transformierte von nicht transformierten Pflanzen zu unterscheiden. Dazu stehen dem Fachmann verschiedene ' sogenannte Selektionsmarker zur Verfügung. Die Expression dieser Gene verleiht einer entsprechend trans- formierten Pflanze eine Resistenz gegen Antibiotika (wie z.B. Kanamycin) oder Herbizide (wie z.B. Phosphinothricin oder Glyphosat) . Eine wesentliche Voraussetzung, um diese Selektionsmarker-Gene zu exprimieren, ist die Bereitstellung pflanzenspezifischer Promotoren.
Verschiedene pflanzliche Promotoren sind bekannt. Dabei kann zwischen konstitutiven Promotoren, die eine lokal und zeitlich nur wenig beschränkte Expression in verschiedenen Teilen einer Pflanze ermöglichen, und spezifischen Promotoren, die eine Expression nur in bestimmten Teilen oder Zellen einer Pflanze (z.B. Wurzel, Samen, Pollen, Blättern etc.) oder nur zu bestimmten Zeitpunkten der Entwicklung gestatten, unterschieden werden. Konstitutive Promotoren sind für die Expression von Selektionsmarkern bevorzugt. Sie ermöglichen eine effiziente, frühe Selektion, meist schon im Zellkulturstadium (beispielsweise in einer Kalluskultur) was mit gewebe- oder entwicklungs- abhängigen Promotoren nicht gewährleistet werden kann.
Konstitutive, in Pflanzen funktionelle Promotoren sind bislang relativ selten beschrieben. Zu nennen sind der TR-Doppelpromotor, die Promotoren der vakuolären ATPase Untereinheiten, der Ppcl Promotor aus Mesembryanthemum cryctallinum (Cushman et al. (1993) Plant Mol Biol 21:561-566) oder der Promotor eines prolinreichen Proteins aus Weizen (WO 91/13991) .
Die derzeit in Pflanzen überwiegend verwendeten konstitutiven Promotoren sind fast ausschließlich virale oder aus Agrobac erium isolierte Promotoren. Dabei handelt es sich im einzelnen um den Nopalinsynthase (nos) Promotor (Shaw et al. (1984) Nucleic Acids Res . 12 (20) : 7831-7846) , den Mannopinsynthase (mas) Promotor (Co ai et al . (1990) Plant Mol Biol 15 (3):373-381) und den Octopinsynthase ( ocs) Promotor (Leisner and Gelvin (1988) Proc Natl Acad Sei USA 85 (5) :2553-2557) aus Agrobacteriυm tumefaciens oder der CaMV35S Promotor aus dem Blumenkohl-Mosaikvirus. Letzterer ist der am häufigsten verwendete Promotor in Expressionssystemen mit ubiquitärer und andauernder Expression (Odell et al.(1985) Nature 313:810-812; Battraw and Hall (1990) Plant Mol Biol 15:527-538; Benfey et al . (1990) EMBO J 9(69) :1677-1684; US 5,612,472). Der häufig als konstitutiver Promoter angewandte CaMV 35S Promotor zeigt jedoch Variationen in der Aktivität in unterschiedlichen Pflanzen und in unter- schiedlichen Geweben derselben Pflanze (Atanassova et al . (1998) Plant Mol Biol 37:275-85; Battraw and Hall (1990) Plant Mol Biol 15:527-538; Holtorf et al . (1995) Plant Mol Biol 29:637-646; Jefferson et al. (1987) EMBO J 6:3901-3907). Ein weiterer Nachteil des 35S Promotors ist, das bei einer Infektion mit dem Blumenkohlmosaikvirus und seinen typischen pathogenen Varianten die Expression des Transgens verändert wird. So sind Pflanzen, die das BAR Gen unter der Kontrolle des 35S Promotors exprimieren nicht mehr resistent nach Infektion mit dem Virus, der in der Natur typischerweise vorkommt (AI-Kaff et al . (2000) Natur Bio- technology 18:995-99).
Als Alternative zum CaMV 35S Promotor aus dem Bereich viraler Promotoren wurde der Sugarcane bacilliform badnavirus (ScBV) beschrieben (Schenk et al . (1999) Plant Mol Biol 39 (6) : 1221-1230) , der ein dem CaMV ähnliches Expressionsmuster vermittelt. Die Aktivität des ScBV Promotors wurde in transienten Expressionsanalysen mit verschiedenen zweikei blättrigen Pflanzen, darunter Nicotiana tabacum und N. benthamiana , Sonnenblume und Raps, und einkeimblättrigen Pflanzen, hier anhand von Banane, Mais und Hirse, analysiert. In den transienten Analysen in Mais war das ScBV Promotor vermittelte Expressionsniveau vergleichbar mit dem des Ubiquitin-Promotors aus Mais (s. unten) . Weiterhin wurde die ScBV Promotor-vermittelte Expressionsrate in transgenen Bananen- und Tabakpflanzen getestet und zeigte in beiden Pflanzenspezies im wesentlichen konstitutive Expression.
Als gängige Promotoren zur Expression von Selektionsmarkern in Pflanzen werden vor allem der nos-Promotor, aber auch der mas- und ocs-Promotor verwendet, die allesamt aus Agrobacterϊum- Stämmen isoliert wurden.
Der Verwendung viraler Sequenzen wird seitens des Verbrauchers oft mit großem Vorbehalt begegnet . Diese Bedenken werden nicht zuletzt durch Untersuchungen genährt, die die Sicherheit des 35S CaMV Promotors - aufgrund eines möglichen horizontalen Gentransfers bedingt durch einen Rekombinations-"Hot Spot" - in Frage stellen (Ho MW et al . (1999) Microbial Ecology in Health and Disease 11:194-197; Cummins J et al. (2000) Nature Bio- technology 18:363). Ein Ziel künftiger biotechnologischer Arbeiten an -Pflanzen ist-daher—der-_Ersatz-_vάraler -genetischer Elemente durch regulatorische pflanzliche Elemente, um so nah wie möglich am pflanzlichen System zu bleiben.
Aufgrund der herrschenden Bedenken hinsichtlich viraler Promotoren gibt es umfangreiche Bemühungen, diese durch pflanzliche Promotoren zu ersetzen. Ein den viralen Elementen vergleichbarer Promotor pflanzlicher Herkunft ist bislang jedoch hoch 'nicht beschrieben worden.
Das vom Mais-Ubiquitin Promotor vermittelte Expressionsmuster wurde für die Ubi-1 and Ubi-2 Promotoren aus Mais beschrieben (Christensen et al . (1992) Plant Mol Biol 18 (4) : 675-689) . Während der Ubi-1 Promotor in Mais und anderen monokotylen Pflanzen gute Expressionsaktivität aufweist, zeigt er in dikotylen Tabakpflanzen nur 10 % der Aktivität, die in vergleichbaren Experimenten mit dem viralen 35S Promotor erzielt worden war. Ferner wurde gezeigt, dass der Mais Ubi-1 Promotor für die Überexpression von Genen in monokotylen P lanzensystemen geeignet ist und darüber hinaus auch hinreichend stark ist, um eine Herbizid- Resistenz durch Expression von Selektionsmarkern zu vermitteln (Christensen and Quail (1996) Transgenic Res 5 (3) : 213-218) . Für dikotyle Expressionssysteme erwies sich der Ubi-1 Promotor als ungeeignet . Ein Vergleich der Organspezifität und Stärke verschiedener konstitutiver Promotoren wurde von Holtorf (Holtorf et al. (1995) Plant Mol Biol 29 (4) : 637-646) anhand stabil transformierter Arabidopsis-Pflanzen durchgeführt. Die Studie umfasste u.a. 5 den CaMV35S-Promotor, den blattspezifischen Thionin-Promotor aus Gerste und den Arabidopsis Ubiquitin-Promotor (UBQl) . Die höchste Expressionsrate zeigte der CaMV35S-Promotor . Anhand der Verwendung eines zusätzlichen translationalen Enhancers (TMV omega element) konnte die Expressionsrate des Promotors bei un-
10 veränderter Organspezifität um das Zwei- bis Dreifache gesteigert werden. Der blattspezifische Thionin-Promotor aus Gerste war in der Mehrzahl der transformierten Linien inaktiv, während der UBQl Promotor aus Arabidopsis mittlere Expressionsraten ergab. Entgegen den Befunden von Callis und Holtorf (Callis et al. (1990)
15 J Biol Chem 265:186- 12493; Holtorf S et al . (1995) Plant Mol Biol 29:637-747), ergaben eigene Untersuchungen, dass der Arabidopsis Ubiquitin Promotor für die Expression von Selektions- markergenen ungeeignet ist und seine allgemeine Anwendbarkeit aus diesem Grund in Frage gestellt werden muss (s. Vergleichs-
20 beispiel 1 und 3) .
McElroy und Mitarbeiter berichteten von einem auf dem Reis Actin-1 (Actl) Promotor rαas-ier-enden .Konstrukt_zur Transformation monokotyler Pflanzen (McElroy et al. (1991) Mol Gen Genet
25 231:150-160). Insgesamt wurde aus den zuvor beschriebenen
Untersuchungen geschlussfolgert, dass die auf dem Actl-Promotor basierenden Expressionsvektoren dazu geeignet sind, eine hinreichend starke und konstitutive Expression von Fremd-DNA in transformierten Zellen monokotyler Pflanzen zu steuern.
30
Als konstitutiver Promotor ist ferner der Promotor einer S-Adenosyl-L-Methionin Synthetase beschrieben (WO 00/37662) . Nachteilig ist hier vor allem eine Abhängigkeit der Expressionsstärke von der Methioninkonzentration (siehe WO 00/37662;
35 Fig. 7) .
WO 99/31258 beschreibt chimäre, konstitutive pflanzliche Promotoren, die sich aus verschiedenen Elementen verschiedener Promotoren mit komplementären Expressionsmustern zusammensetzen, 40 so dass die Kombination einzelner Gewebespezifitäten additiv zu einem konstitutiven Expressionsmuster führt .
Die Nitrilasen aus Arabidopsis thaliana sind in einer kleinen Genfamilie organisiert, von denen das Nitrilase 1 (Nitl) Gen 45 die vorherrschende Isoform darstellt. Nitrilasen sind Schlüsselenzyme der Auxinbiosynthese und katalysieren die Konversion von Indol-3-acetonitril zu Indol-3-essigsäure (Bartel und Fink (1994) Proc Natl Acad Sei USA 91:6649-6653; Bartling et al . (1994) Proc Natl Acad Sei USA 91:6021-6025). Expressionsanalysen zeigten, dass die Nitl-mRNA vornehmlich in den Blättern der Rosetten, aber auch in den Wurzeln, Blüten, Sprossachsen und Schoten vor- kommt. Eine Promotoranalyse mit einem Nitl-Promotor/GUS-Reporter Fusionskonstrukt zeigte in Tabak eine mit dem Hormonstoffwechsel koordinierte Expression (Hillebrand et al. (1996) Gene 170:197-200). Es wurde eine Blaufärbung in den Blattknospen und bei weiterer Blattentwicklung in den Spitzen der jungen Blättern gezeigt. Blätter von 10 cm Länge zeigen eine homogene Verteilung des Farbstoffs . Schnitte durch Sprossachsen zeigten nur eine Blaufärbung, wenn sie sich in der Nähe sich entwickelnder Blätter und Knospen befanden. Dieses entwicklungsabhängige Muster zeigt sich auch in Wurzeln, wo nur die Wurzelspitzen und junge Wurzeln gefärbt waren. Andere Arbeiten zeigten eine Expression der NITl mRNA in Blättern und Stengeln der reifen Pflanze sowie in der Wurzel älterer Pflanzen bzw. Wurzelspitze jüngerer Pflanzen. Die Expression korreliert mit der Lokalisation der Auxin-Biosynthese (Bartel B et al. (1994) Proc. Natl Acad Sei USA 91:6649-6653). Aufgrund dieses gewebe- und entwicklungsabhängigen Expressionsmusters wäre der Promotor schlecht geeignet für Expression von Selektionsmarkern. Hier ist eine Selektion in einem sehr frühen Stadium wünschenswert— Vxιr.teilhaf±_ist .ferner eine effiziente Selektion von dedifferentierten Zellen (beispielsweise in ver- schiedenen Kailus-Phasen) aus Gewebekultur und weiteren Entwicklungsstadien, die für eine Gewebekultur geeignet sind. Zudem ist eine Expression in möglichst allen Gewebeteilen erforderlich, um eine effiziente Selektion zu gewährleisten.
Die im Stand der Technik beschriebenen, sogenannten "konstitutiven" Promotoren weisen einen oder mehrere der nachfolgenden Nachteile auf :
1. Mangelhafte Homogenität der Expression: Die bekannten, sogenannten "konstitutiven" Promotoren zeigen vielfach eine unterschiedliche Expressionshöhe je nach Gewebe- oder Zelltyp. Zudem ist die Expressionseigenschaft oft stark von dem Insertionsort des Wirtsgenoms abhängig. Dies hat zur Folge, dass die durch heterologe Expression zu erzielenden Effekte nicht in dem gleichen Ausmaß homogen in der Pflanze erreicht werden können. Es kann zu Unter- oder Überdosierungen kommen. Dies kann sich nachteilig auf das Pflanzenwachstum oder den Pflanzenwert auswirken. 2. Mangelhaftes Zeitprofil:
Die im Stand der Technik bekannten sogenannten "konstitutiven" Promotoren zeigen oft einen zu späten Beginn ihrer Aktivität und/oder ein zu frühes Abflachen der Aktivität. Damit können zum Beispiel in der frühen Phase der Embryogenese keine wünschenswerten Effekte erzielt werden, was gerade hier - aufgrund der Empfindlichkeit des Embryos gegen biotische und abiotische Stressfaktoren - vorteilhaft wäre.
3. Mangelnde Anwendbarkeit auf viele Pflanzenarten:
Die im Stand der Technik beschriebenen sogenannten "konstitutiven" Promotoren sind oft nicht in allen Arten in gleicher Weise aktiv.
4. Beim Vorliegen mehrerer Expressionskassetten mit jeweils dem gleichen "konstitutiven" Promotor in einem Organismus kann es zu Wechselwirkungen zwischen denselben und sogar zum Abschalten ("Gene Silencing") einzelner Expressionskassetten kommen (Mette et al. (1999) EMBO J. 18:241-248).
5. Promotoren viralen Ursprungs können durch Virusinfektionen der transgenen Pflanze beeinflusst werden und die gewünschte Eigenschaft _dann_α±cht_mehr ausprägen (.Al-Kaff et.al.. (2000).. Natur Biotechnology 18:995-99).
6. Die öffentliche Akzeptanz gegenüber der Verwendung von Promotoren und Elementen aus pflanzlichen Systemen.ist höher als bei viralen Systemen.
7. Die Zahl der für die Expression von Selektionsmarkern in Pflanzen geeigneten Promotoren ist gering und sie sind gewöhnlicher Weise viralen oder bakteriellen Ursprungs .
8. Pollen/Antheren-Expression: Viele der genannten Promotoren (wie beispielsweise 35S CaMV) zeigen eine starke Aktivität im Pollen oder den Staubbeuteln (Antheren) . Dies kann unvorteilhafte Auswirkungen auf die Umwelt haben. So hatte eine unspezifische Expression von Bacillus thuringiensis Endo- toxinen nicht nur den gewünschten Effekt auf Fraßinsekten durch Expression in der Wurzel, sondern auch infolge einer Expression im Pollen bedeutende Schäden im Bestand des Monarchfalters zur Folge, der den Pollen als Hauptnahrungs- uelle nutzt (Losey JE et al . (1999) Nature 399, 214). Ein idealer konstitutiver Promotor zur Expression von Selektionsmarkern sollte möglichst zahlreiche der nachfolgenden Eigenschaften haben:
a) Möglichst homogene lokale und zeitliche Genexpression d.h. eine Expression in möglichst vielen Zelltypen oder Geweben eines Organismus während der verschiedenen Phasen des Entwicklungszyklus. Vorteilhaft ist ferner eine effiziente Selektion von dedifferentierten Zellen (beispielsweise in verschiedenen Kallus-Phasen) aus Gewebekultur und weiteren
Entwicklungsstadien, die für eine Gewebekultur geeignet sind.
b) Möglichst breite Anwendbarkeit auf verschiedene Pflanzenarten bzw. Anwendbarkeit auf Arten, in denen mit den bisher bekannten "konstitutiven" Promotoren keine Expression erreicht werden kann.
c) Um eine Kombination von mehreren Transgenen in einer Pflanze zu realisieren, ist es wünschenswert, mehrere Transformationen hintereinander zu schalten oder ein
Konstrukt mit mehreren Promotor-Kassetten zu verwenden, ohne dass durch die mehrmalige Verwendung identischer regulatorischer Sequenzen Sιleirc±ng-Effekte erzeugt, werden...
d) Einen pflanzlichen Ursprung zur Vermeidung von Akzeptanzproblemen beim Konsumenten und eventuellen zukünftigen Zulassungsproblemen.
e) Nebenaktivitäten eines Promotors in den Antheren/Pollen sind nicht wünschenswert, zum Beispiel um Umweltschäden zu vermeiden (s.o.) .
Die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende Aufgabe bestand also in der Bereitstellung von pflanzlichen regulatorischen Sequenzen, die möglichst viele der oben genannten Eigenschaften erfüllen, vor allem eine ubiquitäre und entwicklungsunabhängige (konstitutive) Expression eines nachgeschalteten Selektions- marker-Gens vermitteln, die ausreicht, um im Rahmen der Transformation von Pflanzen Selektionsmarkergene hinreichend hoch zu exprimieren, um die transformierten Zellen aufgrund des per Transformation erzielten Selektionsvorteils von den nicht transformierten Zellen unterscheiden zu können. Trotz verschiedener pflanzlicher Promotoren für die eine konstitutive Expression zumindest in einzelnen Arten beansprucht wird, wurde bislang kein Promotor mit den oben aufgezählten gewünschten Eigen- Schäften beschrieben. Es bestand daher die Aufgabe, entsprechende Promotoren zu identifizieren.
Diese Aufgabe wurde durch Bereitstellung von Expressions- kassetten, in denen Selektionsmarker unter der Kontrolle des Nitrilase 1 (infolge NITl) Promotors aus Arabidopsis thaliana stehen, gelöst.
Die Sequenz des NITl Promotors entspricht größtenteils der Sequenz von Position 3 bis 1879 der Sequenz des NITl Gens in der Datenbank unter Genbank Acc.-No: X86454 bzw. einer in der GenBank unter der Acc.-No. Y07648 hinterlegten Sequenz (Version Y07648.2 vom 20.12.1999; Basenpaar 2456 bis 4340; das Gen beginnend ab bp 4345 ist mit "nitrilase 1" annotiert) . Unter Verwendung von Glucuronidase-Reporter-Versuchen wurde eine Promotoraktivität - vergleichbar intensiv wie bei entsprechenden mit dem 35S Promotor/GUS-Konstrukten transformierten Pflanzen - in zahlreichen Geweben detektiert. Im Gegensatz zum 35S Promotor konnte keine Blaufärbung in den Antheren/Pollen nachgewiesen werden. Entgegen dem aus den Literaturbefunden abgeleiteten Vorbehalten gegen eine Eignung des Promotors zur effektiven Expression von Selektionsmarkern (zum Beispiel aufgrund der
Figure imgf000009_0001
entwlcklungsabhängigen Expression.) , konnte eine hocheffiziente Selektion durch Kombination mit beispielsweise dem Phosphinothricin-Resistenzgen (bar/pat) demonstriert werden.
Weiterhin wurden im Rahmen der genannten Arbeiten der Arabidopsis thaliana Ubiquitin-Promotor (Holtorf et al. (1995) Plant Mol Biol 29:637-646) und der Squalen Synthase-Promotor (Kribii et al . (1997) Eur J Biochem 249:61-69) untersucht, die aber beide überraschenderweise nicht geeignet waren, Selektionsmarkergen- Expression zu vermitteln, obwohl die Literaturdaten der Ubi- quitin-Promotoren aus Monokotylen (siehe oben) hatten vermuten lassen, dass insbesondere der Ubiquitin-Promotor einer dikotylen Pflanze als Promotor eines Selektionsmarkersystems hätte funktionieren müssen (siehe Vergleichsbeispiele 1 und 3) . Ähnliches gilt für den Squalensynthase-Promotor, dessen Charakterisierung hätte erwarten lassen, dass ausreichend hohe Expressions- raten für die erfolgreiche Steuerung eines Selektionsmarkergens erzielt werden können (Del Arco and Boronat (1999) 4th European Symposium on Plant Isoprenoids, 21.-23.4.1999, Barcelona, Spanien) (siehe Vergleichsbeispiele 2 und 3). Ein erster Gegenstand der Erfindung betrifft daher transgene Expressionskassetten zur Expression von Nukleinsäuresequenzen kodierend für einen Selektionsmarker enthaltend in 5 ' -3 ' Richtung
a) einen Promotor gemäß SEQ ID NO: 1 oder ein funktionelles Äquivalent oder äquivalentes Fragment desselben, das im wesentlichen die gleiche Promotoraktivität wie der Promotor gemäß SEQ ID NO: 1 besitzt, und
b) eine transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz kodierend für einen Selektionsmarker, und
c) eine in pflanzlichen Zellen oder pflanzlichen Organismen funktionelle Terminatorsequenz,
wobei a) oder b) fuhktionell miteinander so verknüpft sind, dass eine transgene Expression der Nukleinsäuresequenz kodierend für einen Selektionsmarker in einer pflanzlichen Zelle oder einem pflanzlichen Organismus ermöglicht wird.
Ferner betrifft die Erfindung Verfahren zur Selektion transformierter pflanzlicher Zellen oder pflanzlicher Organismen, ■wobei--eine—transgene Expressionskassette enthaltend in 5 '-3' Richtung
a) einen Promotor gemäß SEQ ID NO: 1, oder ein funktionelles Äquivalent oder äquivalentes Fragment desselben, das im wesentlichen die gleiche Promotoraktivität wie der Promotor gemäß SEQ ID NO: 1 besitzt, und
b) eine transgen zu ' exprimierende Nukleinsäuresequenz kodierend für einen Selektionsmarker, und
c) eine in Pflanzen funktionelle Terminatorsequenz,
wobei a) oder b) funktionell miteinander so verknüpft sind, dass eine transgene Expression der Nukleinsäuresequenz kodierend für einen Selektionsmarker in einer pflanzlichen Zelle oder pflanzlichen Organismen ermöglicht wird, in besagte pflanzliche Zelle oder besagten pflanzlichen Organismus eingebracht wird, und die Expression des Selektionsmarkers erfolgt und eine Selektion der transformierten pflanzlichen Zellen oder pflanzlichen Organismen ausgeübt wird. "Expression" umfasst die Transkription und/oder die Translation der transkribierten RNA der transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz kodierend für einen Selektionsmarker in ein korrespondierendes Polypeptid.
"Transgen" meint in Bezug auf eine Expressionskassette zur transgenen Expression von Nukleinsäuren kodierend für einen Selektionsmarker oder die Verknüpfung von NITl-Promotor und Nukleinsäuren kodierend für einen Selektionsmarker alle solche durch gentechnische Methoden zustande gekommene Konstruktionen oder Verfahren, in denen sich entweder
a) der NITl Promotor gemäß SEQ ID NO: 1 oder ein funktionelles Äquivalent oder äquivalente Fragment derselben, oder
b) die zu exprimierende Nukleinsäuresequenz kodierend für einen Selektionsmarker, oder
c) (a) und (b)
sich nicht in ihrer natürlichen, genetischen Umgebung (d.h. an ihrem natürlichen chromosomalen Locus) befinden oder durch gen- techni-sche Methoden modifiziert wurden, wobei die_Modifikation _ beispielhaft eine Substitution, Addition, Deletion, Inversion oder Insertion eines oder mehrerer Nukleotidreste sein kann.
Die erfindungsgemäßen Expressionskassetten, von ihnen abgeleitete Vektoren oder die erfindungsgemäßen Verfahren können funktionelle Äquivalente zu den unter SEQ ID NO: 1 beschriebenen NITl Promotorsequenz umfassen. Funktioneil äquivalente Sequenzen umfassen auch all die Sequenzen, die von dem komplementären Gegenstrang den durch SEQ ID N0:1 definierten Sequenz abgeleitet sind und im wesentlichen die gleiche Promotoraktivität aufweisen.
Funktionelle Äquivalente in bezug auf den NITl Promotor meint insbesondere natürliche oder künstliche Mutationen der unter SEQ ID NO: 1 beschriebenen NITl Promotorsequenz sowie seine Homologen aus anderen Pflanzengattungen und -arten, welche weiterhin im wesentlichen die gleiche Promotoraktivität aufweisen.
Eine Promotoraktivität wird im wesentlichen als gleich bezeichnet, wenn die Transkription eines bestimmten zu exprimierenden Gens unter Kontrolle eines bestimmten von SEQ ID NO : 1 abgeleiteten Promotors unter ansonsten unveränderten Bedingungen eine Lokalisation innerhalb der Pflanze aufweist, die zu mindestens 50 %, bevorzugt mindestens 70 %, besonders bevorzugt mindesten 90 % ganz besonders bevorzugt mindestens 95 % deckungsgleich ist mit einer Vergleichsexpression erhalten unter Verwendung eines des durch SEQ ID NO: 1 beschriebenen NITl Promotors. Dabei kann die Expressionshöhe sowohl nach unten als auch nach oben im Vergleich zu einem Vergleichswert abweichen. Bevorzugt sind dabei solche Sequenzen, deren Expressionshöhe, gemessen anhand der transkribierten mRNA oder dem infolge translatierten Protein, unter ansonsten unveränderten Bedingungen quantitativ um nicht mehr als 50 %, bevorzugt 25 %, besonders bevorzugt 10 % von einem Vergleichswert erhalten mit dem durch SEQ ID NO: 1 beschriebenen NITl Promotor unterscheidet. Besonders bevorzugt sind solche Sequenzen, deren Expressionshöhe, gemessen anhand der transkribierten mRNA oder dem infolge translatierten Protein, unter ansonsten unveränderten Bedingungen quantitativ um mehr als 50 %, bevorzugt 100 %, besonders bevorzugt 500 %, ganz besonders bevorzugt 1000 % einen Vergleichswert erhalten mit dem durch
SEQ ID NO:l beschriebenen NITl Promotor übersteigt. Bevorzugt ist als Vergleichswert die Expressionshöhe der natürliche mRNA des jeweiligen Gens oder des natürlichen Genproduktes. Bevorzugt ist ferner als Vergleichswert die Expressionshöhe erhalten mit einer beliebigen, aber bestimmten Nukleinsäuresequenz, bevorzugt solchen Nukleinsäuresequenzen, die für leicht quantifizierbare Proteine kodieren. Ganz besonders bevorzugt sind dabei Reporter- ~"Proteine~~"(Schenborn E,- Groskreutz D (1999) -Mol Biotechnol- 13(l):29-44) wie das "green fluorescence protein" (GFP) (Chui WL et al. (1996) Curr Biol 6:325-330; Leffel SM et al . (1997) Bio- techniques 23 (5): 912- 918), die Chlora phenicoltransferase, eine Luziferase (Millar et al. (1992) Plant Mol Biol Rep 10:324-414) oder die ß-Galactosidase, ganz besonders bevorzugt ist die ß-Glucuronidase (Jefferson et al. (1987) EMBO J 6:3901-3907).
Ansonsten unveränderte Bedingungen bedeutet, dass die Expression, die durch eine der zu vergleichenden Expressionskassetten initiiert wird, nicht durch Kombination mit zusätzlichen genetischen Kontrollsequenzen, zum Beispiel Enhancer-Sequenzen, modifiziert wird. Unveränderte Bedingungen bedeutet ferner, dass alle Rahmehbedingungen wie beispielsweise Pflanzenart, Entwicklungsstadium der Pflanzen, Zuchtbedingungen, Assaybedingungen (wie Puffer, Temperatur, Substrate etc.) zwischen den zu vergleichenden Expressionen identisch gehalten werden.
Mutationen umfassen Substitutionen, Additionen, Deletionen, Inversionen oder Insertionen eines oder mehrerer Nukleotidreste . Somit werden beispielsweise auch solche Nukleotidsequenzen durch die vorliegende Erfindung mit umfasst, welche man durch Modifikation des NITl Promotors gemäß SEQ ID NO: 1 erhält. Ziel einer solchen Modifikation kann die weitere Eingrenzung der darin enthaltenen Sequenz oder z.B. auch die Einfügung weiterer Restriktionsenzymschnittstellen, die Entfernung überflüssiger DNA oder das Hinzufügen weiterer Sequenzen, zum Beispiel weiterer regulatorischer Sequenzen, sein.
Wo Insertionen, Deletionen oder Substitutionen, wie z.B.
Transitionen und Transversionen, in Frage kommen, können an sich bekannte Techniken, wie in vitro-Mutagenese, "primer repair", Restriktion oder Ligation verwendet werden. Durch Manipulationen, wie z.B. Restriktion, "chewing-back" oder Auffüllen von Über- hängen für "blunt ends" können komplementäre Enden der Fragmente für die Ligation zur Verfügung gestellt werden. Zu analogen Ergebnissen kann man auch unter Verwendung der Polymeraseketten- reaktion (PCR) unter Verwendung spezifischer Oligonukleotid- Pri er komme .
Unter Homologie zwischen zwei Nukleinsäuren wird die Identität der Nukleinsäuresequenz über die jeweils gesamte Sequenzlänge verstanden, die durch Vergleich mit Hilfe des Programmalgorithmus GAP (Wisconsin Package Version 10.0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG) , Madison, USA) unter Einstellung folgender Parameter berechnet wird:
Gap Weϊgnt : 12 Length Weight : 4
Average Match: 2,912 Average Mis atch: -2 , 003
Beispielhaft wird unter einer Sequenz, die eine Homologie von mindestens 50 % auf Nukleinsäurebasis mit der Sequenz gemäß SEQ ID NO. 1 aufweist, eine Sequenz verstanden, die bei einem Vergleich mit der' Sequenz SEQ ID NO. 1 nach obigem Programmalgorithmus mit obigem Parametersatz eine Homologie von mindestens 50 % aufweist.
Funktionelle Homologe zu dem NITl Promotor gemäß SEQ ID NO: 1 abgeleitet zum Beispiel durch Substitution, Insertion oder
Deletion von Nukleotiden umfasst bevorzugt solche Sequenzen, die eine Homologie aufweisen von mindestens 50 %, bevorzugt 70 %, vorzugsweise mindestens 80 %, besonders bevorzugt mindestens 90 %, ganz besonders bevorzugt mindestens 95 %, am meisten bevorzugt 99 % über eine Länge von von mindestens 100 Basenpaaren, bevorzugt mindestens 200 Basenpaaren, besonders bevorzugt von mindestens 300 Basenpaaren, ganz besonders bevorzugt von mindestens 400 Basenpaaren, am meistens bevorzugt von mindestens 500 Basenpaaren. Weitere Beispiele für die in den erfindungsgemäßen Expressionskassetten oder Vektoren zum Einsatz kommenden Promotorsequenzen lassen sich beispielsweise in verschiedenen Organismen, deren genomische Sequenz bekannt ist, wie beispielsweise aus Arabi- dopsis thaliana, Brassica napus, Nicotiana tabacum, Solanum tuberosum, Helianthiu anuus, Linum sativum durch Homologievergleiche in Datenbanken leicht auffinden. Für die Suche kann sowohl die Promotorsequenz des Nitl Promotors gemäß SEQ ID NO.-l verwendet werden, also auch die kodierende Sequenz des NITl Gens (GenBank Acc.-No. : X86454) .
Funktionelle Äquivalente meint ferner DNA Sequenzen, die unter Standardbedingungen mit der Nukleinsäuresequenz kodierend für den NITl Promotor gemäß SEQ ID NO:l oder der zu ihr komplementären Nukleinsäuresequenzen hybridisieren und die im wesentlichen gleichen Eigenschaften haben. Standardhybridisierungsbedingungen ist breit zu verstehen und meint somit stringente als auch weniger stringente Hybridisierungsbedingungen. Solche Hybridi- sierungsbedingungen sind unter anderem bei Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T et al . , in Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, S. 9.31-9.57) oder in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiϊey & Sons, N.Y. (1989), 6.3-.1-6.3.6. besehrieben.
Beispielhaft können die ' Bedingungen während des Waschschrittes ausgewählt sein aus dem Bereich von Bedingungen begrenzt von solchen mit geringer Stringenz (mit ungefähr 2X SSC bei 50°C) und solchen mit hoher Stringenz (mit ungefähr 0,2X SSC bei 50°C bevorzugt bei 65°C) (20X SSC: 0,3 M Natriumeitrat-, 3 M NaCl, pH7,0). Darüber hinaus kann die Temperatur während des Waschschrittes von niedrig stringenten Bedingungen bei Raumtemperatur, ungefähr 22°C, bis zu stärker stringenten Bedingungen bei ungefähr 65°C angehoben werden. Beide Parameter, Salzkonzentration und Temperatur, können gleichzeitig variiert werden, auch kann einer der beiden Para- meter konstant gehalten und nur der andere variiert werden. Während der Hybridisierung können auch denaturierende Agenzien wie zum Beispiel Formamid oder SDS eingesetzt werden. In Gegenwart von 50 % Formamid wird die Hybridisierung bevorzugt bei 42°C ausgeführt. Einige beispielhafte Bedingungen für Hybridisierung und Waschschritt sind infolge gegeben:
(1) Hybridisierungsbedingungen mit zum Beispiel
a) 4X SSC bei 65°C, oder
6X SSC, 0,5 % SDS, 100 μg/ml denaturierte, fragmentierte Lachssperma-DNA bei 65°C, oder c) 4X SSC, 50 % Formamid, bei 42°C, oder
d) 6X SSC, 0,5 % SDS, 100 μg/ml denaturierte, fragmentierte Lachssperma-DNA, 50 % Formamid bei 42°C, oder
e) 2X oder 4X SSC bei 50°C (schwach stringente Bedingung) , oder
f) 2X oder 4X SSC, 30 bis 40 % Formamid bei 42°C (schwach stringente Bedingung).
g) 6x SSC bei 45°C, oder,
h) 50 % Formamid, 4x SSC bei 42°C, oder
i) 50 % (vol/vol) Formamid, 0,1 % Rinderserumalbumin, 0,1 % Ficoll, 0,1 % Polyvinylpyrrolidon, 50 mM Natriumphosphat- puffer pH 6,5, 750 mM NaCl, 75 mM Natriumeitrate bei 42°C, oder
j) 0,05 M Natriumphosphatpuffer pH 7,0, 2 mM EDTA, 1 % BSA und 7 % SDS.
2) Waschschritte mit zum Beispiel
a) 0,1X SSC bei 65°C, oder
b) 0,1X SSC, 0,5 % SDS bei 68°C, oder
c) 0,1X SSC, 0,5 % SDS, 50 % Formamid bei 42°C, oder
d) 0,2X SSC, 0,1 % SDS bei 42°C, oder
e) 2X SSC bei 65°C (schwach stringente Bedingung) .
f) 40 mM Natriumphosphatpuffer pH 7,0, 1 % SDS, 2mM EDTA.
Verfahren zur Herstellung erfindungsgemäßer funktioneller Äquivalente umfasst bevorzugt die Einführung von Mutationen in den NITl Promotor gemäß SEQ ID NO: 1. Eine Mutagenese kann ungerichtet ("random") erfolgen, wobei die mutagenisierten Sequenzen anschließend bezüglich ihrer Eigenschaften nach einer "trial-by-error" Prozedur durchmustert werden. Besonders vorteilhafte Selektionskriterien umfassen beispielsweise eine erhöhte Resistenz gegenüber einem Antibiotikum, Herbizid oder Biozid, gegen das der zu exprimierende Selektionsmarker Resistenz verleiht, oder die Höhe der resultierenden Expression der ein- geführten Nukleinsäuresequenz kodierend für den Selektionsmarker. Letztere kann auf Transkriptionsebene (beispielsweise durch Northern-Blot) oder Translationsebene (beispielsweise durch Immuno/Western-Blot) in der dem Fachmann geläufigen Weise analysiert werden.
Alternativ können nicht-essentielle Sequenzen des erfindungs- gemäßen Promotors deletiert werden ohne die genannten Eigenschaften signifikant zu beeinträchtigen. Derartige Deletionsvarianten stellen funktioneil äquivalente Teile des Promotors beschrieben durch SEQ ID NO: 1 dar.
Die Eingrenzung der Promotorsequenz auf bestimmte, essentielle regulatorische Regionen kann auch mit Hilfe von Suchroutine zur Suche von Promotorelementen vorgenommen werden. Oft sind in den für die Promotoraktivität relevanten Regionen bestimmte Promotorelemente gehäuft vorhanden. Diese Analyse kann beispielsweise mit Computerprogrammen wie dem Programm PLACE ("Plant Cis- acting Regulatory DNA Elements"; Higo K et al . (1999) Nucleic Acids Research 27 (1) :297-300) oder der BIOBASE Datenbank "Trans- fac" (Biologische Datenbanken GmbH, Braunschweig) vorgenommen werden.
Auf diese Weise, wie auch beispielsweise durch sukzessive Verkür- zung und Analyse von Promotorsequenzen, kann der Fachmann zu äquivalenten Fragmenten des Promotor gemäß SEQ ID NO: 1 oder eines funktionellen Äquivalentes desselben gelangen. Derartige Sequenzen sind aufgrund ihrer reduzierten Sequenzlänge leichter zu handhaben und daher bevorzugt. Beispielhaft für derartige ver- kürzte Sequenzen sind die durch SEQ ID NO: 18 und 19 beschriebenen Sequenzen. Diese zeichnen sich durch im wesentlichen gleiche Promotoreigenschaften wie der Promotor gemäß SEQ ID NO: 1 aus.
Verfahren zur Mutagenisierung von Nukleinsäuresequenzen sind dem Fachmann bekannt und schließen beispielhaft die Verwendung von Oligonukleotiden mit einer oder mehr Mutationen im Vergleich zu der zu mutierenden Region ein (z.B. im Rahmen einer "Site- specific utagenesis" ) . Typischerweise kommen Primer mit ungefähr 15 bis ungefähr 75 Nukleotiden oder mehr zum Einsatz, wobei bevorzugt ca. 10 bis ca. 25 oder mehr Nukleotidreste an beiden Seiten der zu verändernden Sequenz lokalisiert sind. Details und Durchführung besagter Mutageneseverfahren sind dem Fachmann geläufig (Kunkel et al . (1987) Methods Enzymol, 154:367-382; Tomic et al. (1990) Nucl Acids Res 12:1656; Upender, Raj , Weir (1995) Biotechniques 18(l):29-30; US 4,237,224). Eine Mutagenese kann auch durch Behandlung von beispielsweise Vektoren, die eine der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen enthalten, mit mutagenisierenden Agentien wie Hydroxylamin realisiert werden.
Die in den erfindungsgemäßen Expressionskassetten enthaltenen 5 transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenzen kodierend für Selektionsmarker können mit weiteren genetischen Kontroll- sequenzen neben einem der erfindungsgemäßen Promotor oder seinem Äquivalent oder äquivalenten Teil funktioneil verknüpft sein.
10 Unter einer funktioneilen Verknüpfung versteht man zum Beispiel die sequentielle Anordnung des Promotors, der transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz kodierend für einen Selektionsmarker und ggf. weiterer regulativer Elemente wie zum Beispiel einem Terminator derart, dass jedes der regulativen Elemente
15 seine Funktion bei der transgenen Expression der Nukleinsäuresequenz, je nach Anordnung der Nukleinsäuresequenzen zu sense oder anti-sense RNA, erfüllen kann. Dazu ist nicht unbedingt eine direkte Verknüpfung im chemischen Sinne erforderlich. Genetische Kontrollsequenzen, wie zum Beispiel Enhancer-Sequenzen, können
20 ihre Funktion auch von weiter entfernten Positionen oder gar von anderen DNA-Molekülen aus auf die Zielsequenz ausüben. Bevorzugt sind Anordnungen, in denen die transgen zu exprimierende - - Nukleinsäuresequenz hinter der als Promotor- fungierenden- Sequenz- positioniert wird, so dass beide Sequenzen kovalent itein-
25 ander verbunden sind. Bevorzugt ist dabei der Abstand zwischen der Promotorsequenz und der transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz geringer als 200 Basenpaare, besonders bevorzugt kleiner als 100 Basenpaare, ganz besonders bevorzugt kleiner als 50 Basenpaare.
30
Die Herstellung einer funktionellen Verknüpfung kann mittels gängiger Rekombinations- und Klonierungstechniken realisiert werden, wie sie beispielsweise in Maniatis T, Fritsch EF und Sambrook J(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold
35 Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY sowie in
Silhavy TJ, Ber an ML und En uist LW(1984) Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY und in Ausubel FM et al. (1987) Current- Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience be-
40 schrieben sind. Zwischen beide Sequenzen können aber auch weitere Sequenzen positioniert werden, die zum Beispiel die Funktion eines Linkers mit bestimmten Restriktionsenzymschnittstellen oder eines Signalpeptides haben. Auch kann die Insertion von Sequenzen zur Expression von Fusionsproteinen führen.
45 Der Begriff der genetischen Kontrollsequenzen ist breit zu verstehen und meint all solche Sequenzen, die einen Einfluss auf das Zustandekommen oder die Funktion der erfindungs- gemäßen Expressionskassette haben. Genetische Kontrollsequenzen modifizieren zum Beispiel die Transkription und Translation in prokaryotischen oder eukaryotischen Organismen.
Vorzugsweise umfassen die erfindungsgemäßen Expressionskassetten 5' -stromaufwärts von der jeweiligen transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz einen der erfindungsgemäßen Promotoren und 3 ' -stromabwärts eine Terminatorsequenz als zusätzliche genetische Kontrollsequenz, sowie gegebenenfalls weitere übliche regulative Elemente, und zwar jeweils funktioneil verknüpft mit der transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz.
Genetische Kontrollsequenzen umfassen auch weitere Promotoren, Promotorelemente oder Minimalpromotoren, die die expressions- steuernden Eigenschaften modifizieren oder erweitern können. So kann durch genetische Kontrollsequenzen zum Beispiel die Expression zusätzlich abhängig von bestimmten Stressfaktoren oder chemischen Stimulantien erfolgen. Entsprechende Elemente sind zum Beispiel für Wasserstress, Abscisinsäure (Lam E und Chua NH (1991) J Bio-l Chem 266 (26 )-: 17131-171-35) und Hitzestr-ess (Schöffl F et al. (1989) Mol Gen Genetics 217 (2-3 ) :246-53) beschrieben.
Es können ferner weitere Promotoren funktioneil mit der zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz verknüpft sein, die eine Expression in weiteren Pflanzengeweben oder in anderen Organismen, wie zum Beispiel E. coli Bakterien ermöglichen.
Genetische Kontrollsequenzen umfassen ferner auch die 5 '-untranslatierte Region, Introns oder die nichtkodierende 3 '-Region von Genen, bevorzugt Nit-Gens . Es ist gezeigt worden, dass diese eine signifikante Funktionen bei der Regulation der Genexpression spielen können. So wurde gezeigt, dass 5 ' -untranslatierte Sequenzen die transiente Expression heterologer Gene verstärken können. Sie können ferner die Gewebespezifität fördern (Rouster J et al.(1998) Plant J. 15:435-440). Umgekehrt unterdrückt die 5 ' -untranslatierte Region des opaque-2 Gens die Expression. Eine Deletion der entsprechenden Region führt zu einer Erhöhung der Genaktivität (Lohmer S et al . (1993) Plant Cell 5:65-73).' Die unter SEQ ID NO: 1 angegebene Nukleinsäuresequenz enthält den Abschnitt des NITl-Gens, der den Promotor und die 5'-untrans- latierte Region bis vor das ATG-Startcodon des NITl Proteins aus Arabidopsis thaliana repräsentiert. McElroy und Mitarbeiter (McElroy et al. (1991) Mol Gen Genet 231 (1) : 150-160) berichteten von einem auf dem Reis Actin 1 (Actl) Promotor basierenden Konstrukt zur Transformation monokotyler Pflanzen. In transgenen Reiszellen führte die Verwendung des 5 Actl-Introns in Kombination mit dem 35S-Promotor zu einer gegenüber dem isolierten 35S-Promotor um das Zehnfache gesteigerten Expressionsrate. Eine Optimierung der Sequenzumgebung der Translationsinitiationsstelle des Reportergen-Gens (GUS) resultierte in einer vierfachen Steigerung der GUS-Expression
10 in transformierten Reiszellen. Eine Kombination der optimierten Translations-Initiationsstelle und des Actl-Introns resultierte in einer 40-fachen Steigerung der GUS-Expression durch den CaMV35S-Promotor in transformierten Reiszellen; ähnliche Ergebnisse wurden anhand von transformierten Maiszellen erzielt. i5 Insgesamt wurde aus den zuvor beschriebenen Untersuchungen gesσhlussfolgert, dass die auf dem Actl-Promotor basierenden Expressionsvektoren dazu geeignet sind, eine hinreichend starke und konstitutive Expression von Fremd-DNA in transformierten Zellen monokotyler Pflanzen zu steuern.
20
Die Expressionskassette kann vorteilhafterweise eine oder mehrere sogenannte "enhancer Sequenzen" funktionell verknüpft mit dem Promotor enthalten, die eine erhöhte..transgene Expression der . Nukleinsäuresequenz ermöglichen. Auch am 3 ' -Ende der transgen zu
25 exprimierenden Nukleinsäuresequenzen können zusätzliche vorteilhafte Sequenzen inseriert werden, wie weitere regulatorische Elemente oder Terminatoren. Die transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenzen können in einer oder mehreren Kopien in der Expressionskassette enthalten sein.
30
Als Kontrollsequenzen sind weiterhin solche zu verstehen, die eine homologe Rekombination bzw. Insertion in das Genom eines Wirtsorganismus ermöglichen oder die Entfernung aus dem Genom erlauben. Bei der homologen Rekombination kann zum Beispiel
35 der natürliche Promotor eines bestimmten Gens gegen einen der er indungsgemäßen Promotor ausgetauscht werden. Methoden wie die cre/lox-Technologie erlauben eine gewebespezifische, unter Umständen induzierbare Entfernung der Expressionskassette aus dem Genom des Wirtsorganismus (Sauer B. (1998) Methods .
40 14 (4) :381-92) . Hier werden bestimmte flankierende Sequenzen dem Zielgen angefügt (lox-Sequenzen) , die später eine Entfernung mittels der cre-Rekombinase ermöglichen. Die Rekombinase-Technik kann auch zur Erhöhung der Effizienz der homologen Rekombination verwendet werden. Entsprechende Verfahren sind dem Fachmann
45 bekannt (US 6,110,736). Eine Vielzahl von sequenzspezifischen Rekombinationssystemen kann verwendet werden, beispielhaft sind das Cre/lox-System des Bacteriophagen Pl, das FLP/FRT System der Hefe, die Gin Recombinase des Mu Phagen, die Pin Rekombinase aus E. coli und das R/RS System des pSRl Plasmids genannt. Bevorzugt sind das Bacteriophagen Pl Cre/lox und das Hefe FLP/FRT System. Das FLP/FRT und cre/lox Rekombinasesystem wurde bereits in pflanzlichen Systemen angewendet (Odell et al . (1990) Mol Gen Genet 223:369-378)
Als KontrollSequenzen geeignete Polyadenylierungssignale sind in Pflanzen funktionelle Polyadenylierungssignale sowie - vor- zugsweise - solche, die im wesentlichen T-DNA Polyadenylierungs- signalen aus Agrobacterium turne f aciens , insbesondere des Gens 3 der T-DNA (Octopin Synthase) des Ti-Plas ids pTiACHS entsprechen (Gielen et al.(1984) EMBO J 3:835ff) oder funktionelle Äquivalente davon.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform enthält die Expressionskassette eine in Pflanzen funktionelle Terminatorsequenz . In Pflanzen funktionelle Terminatorsequenzen meint allgemein solche Sequenzen, die in der Lage sind, in Pflanzen den Abbruch der Transkription einer DNA-Sequenz zu bewirken. Beispiele für geeignete Terminatorsequenzen sind der OCS (Octopin- Synthase) -Terminator und der NOS (Nopalin-Synthase) -Terminator. Besonders bevorzugt -sind j.edoch- f-laja.zliche-.Terminatorsequenzen. Pflanzliche Terminatorsequenzen meint allgemein solche Sequenzen, die Bestandteil eines natürlichen pflanzlichen Gens sind.
Besonders bevorzugt sind dabei der Terminators des Cathepsin D Inhibitor Gens aus Kartoffel (GenBank Acc . No. : X74985;. Terminator: SEQ ID NO: 16) oder des Terminators der Speicherproteingens VfLElB3 (GenBank Acc. No.: Z26489; Terminator: SEQ ID NO: 17) aus der Ackerbohne. Diese Terminatoren sind den im Stand der Technik beschriebenen viralen' oder T-DNA Terminatoren mindestens gleichwertig. Das Plasmid pSUN5NPTIICat (SEQ ID NO: 15) enthält den pflanzlichen Terminator des Cathepsin D Inhibitor Gens aus Kartoffel.
Selektionsmarker umfasst sowohl positive Selektionsmarker, die eine Resistenz gegen ein Antibiotikum, Herbizid oder Biozid verleihen, als auch negative Selektionsmarker, die eine Sensitivität gegen eben diese verleihen, als auch Marker die dem transformierten Organismus einen Wachstumsvorteil gewähren (beispielsweise durch Expression von Schlüsselgenen der Cytokin- biosynthese; Ebinuma H et al . (2000) Proc Natl Acad Sei USA 94:2117-2121). Bei der positiven Selektion gedeihen nur die Organismen, die den entsprechenden Selektionsmarker exprimieren, während bei der negativen Selektion eben diese eingehen. Bei der Herstellung transgener Pflanzen ist die Verwendung eines positiven Selektionsmarkers bevorzugt. Bevorzugt ist ferner die Verwendung von Selektionsmarkern, die Wachstumsvorteile verleihen. Negative Selektionsmarker können vorteilhaft verwendet werden, wenn es darum geht, bestimmt Gene oder Genomabschnitte aus einem Organismus zu entfernen (beispielsweise im Rahmen eines Kreuzungsprozesses) .
Der mit der Expressionskassette eingebrachte selektionierbare Marker verleiht den erfolgreich rekombinierten oder transformierten Zellen eine Resistenz gegen ein Biozid (zum Beispiel ein Herbizid wie Phosphinothricin, Glyphosat, Imidazolinon- oder Sulfonylharnstoff-Herbizide oder Bromoxynil) , einen Metabolismusinhibitor wie 2-Desoxyglucose-6-phosphat (WO 98/45456) oder ein Antibiotikum, wie zum Beispiel Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin. Der Selektionsmarker erlaubt die Selektion der transformierten Zellen von untransformierten (McCormick et al., Plant Cell Reports 5 (1986), 81-84). Besonders bevorzugte Selektionsmarker sind solche die eine Resistenz gegen Herbizide verleihen. Dem Fachmann sind zahlreiche derartiger Selektionsmarker und die für diese kodierenden Sequenzen bekannt. Nach- folgend seien beispielhaft jedoch nicht einschränkend zu nennen:
i) Positive Selektionsmarker:
Der mit der Expressionskassette eingebrachte selektionierbare Marker verleiht den erfolgreich rekombinierten oder transformierten Zellen eine Resistenz gegen ein Biozid (zum Beispiel ein Herbizid wie Phosphinothricin, Glyphosat oder Bromoxynil) , einen Metabolismusinhibitor wie 2-Desoxyglucose-6-phosphat (WO 98/45456) oder ein Antibiotikum, wie zum Beispiel Tetra- cycline, Ampicillin, Kanamycin, G 418, Neomycin, Bleomycin oder Hygromycin. Der Selektionsmarker erlaubt die Selektion der transformierten Zellen von untransformierten (McCormick et al., Plant Cell Reports 5 (1986), 81-84). Besonders bevorzugte Selektionsmarker sind solche, die eine Resistenz gegen Herbizide verleihen. Beispielhaft als Selektionsmarker seien genannt:
- DNA Sequenzen, die für Phosphinothricinacetyltransferasen (PAT) kodieren, welche die freie Aminogruppe des Glutamin- synthaseinhibitors Phosphinothricin (PPT) acetylieren und damit eine Detoxifizierung des PPT erreichen (de Block et al . 1987, EMBO J. 6, 2513-2518) (auch Bialophos® resistenzgen (bar) genannt) . Das bar Gen kodierend für eine Phosphino- thricinacetyltransferase (PAT) kann aus beispielsweise Streptomyces hygroscopicus oder S. viridochromogenes isoliert werden. Entsprechende Sequenzen sind dem Fachmann bekannt (aus Streptomyces hygroscopicus GenBank Acc.-No.: X17220 und X05822, aus ' Streptomyces viridochromogenes GenBank Acc.-No.: M 22827 und X65195; US 5,489,520). Ferner sind synthetische Gene beispielsweise für die Expression in Piastiden beschrieben. Ein synthetisches Pat Gen ist beschrieben in Becker et al . (1994) The Plant J. 5:299-307. Ganz besonders bevorzugt ist ebenfalls die Expression des
Polypeptides gemäß SEQ ID NO: 3 beispielsweise kodiert durch eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2. Die Gene verleihen Resistenz gegen das Herbizid Bialaphos oder Glufosinat und sind vielbenutzer Marker in transgenen Pflanzen (Vickers JE et al. (1996). Plant Mol Miol Reporter 14:363-368; Thompson CJ et al. (1987) EMBO J 6:2519-2523).
5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphatsynthasegene (EPSP Synthase- gene) , die eine Resistenz gegen Glyphosat (N- (phosphono- methyl)glycin) verleihen. Das unselektive Herbizid Glyphosat hat die 5-Enolpyruvyl-3-phosphoshikimatsynthase (EPSPS) als molekulares Target. Diese hat eine Schlüsselfunktion in der Biosynthese aromatischer Aminosäuren in Mikroben und Pflanzen, jedoch nicht in Säugern (Steinrucken HC et al. (1980) Biochem. Biophys . Res . Commun. 94:1207-1212; Levin JG und. Sprinson DB (1964) J. Biol. Chem. 239: 1142-1150; Cole DJ
(1985) Mode of action of glyphosate a literature analysis, p. 48-74. In: Grossbard E und Atkinson D (eds.) . The herbicide --glyphosate. Butterswor-ths, Boston.). Gl-yphosat-tolerante EPSPS Varianten werden bevorzugt als Selektionsmarker verwendet (Padgette SR et al. (1996). New weed control opportunities: development of soybeans with a Roundup Ready™ gene. In: Herbicide Resistant Crops (Duke, S.O., ed.), pp. 53-84. CRC Press, Boca Raton, FL; Saroha MK und Malik VS (1998) J Plant Biochemistry and Biotechnology 7:65-72). Das EPSPS Gen des Agrobacterium sp. strain CP4 hat eine natürliche Toleranz gegen Glyphosat, die auf entsprechende transgene Pflanzen transferiert werden kann. Das CP4 EPSPS Gen wurde aus Agrobacterium sp. strain CP4 kloniert (Padgette SR et al. (1995)Crop Science 35 (5) : 1451-1461) . Sequenzen von 5-Enolpyrvylshikimate-3-phosphate-synthasen, die
Glyphosat-tolerant sind, wie beispielsweise beschrieben in US 5,510,471; US 5,776,760; US 5,864,425; US 5,633,435; US 5, 627; 061; US 5,463,175; EP 0 218 571, sind sowohl in den Patenten beschriebenen als auch in der GenBank hinter- legt. Weitere Sequenzen sind beschrieben unter GenBank
Accession X63374. Ferner ist das aroA Gen bevorzugt (M10947 S. typhimurium aroA locus 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (aroA protein) gene) .
das für das Glyphosat® degradierende Enzyme kodierende gox Gen (Glyphosatoxidoreduktase) . GOX (beispielsweise die Glyphosatoxidoreductase aus Achromobacter sp.) katalysiert die Spaltung einer C-N Bindung im Glyphosat, welches so zu Aminomethylphosphonsäure (AMPA) und Glyoxylat umgesetzt wird. GOX kann dadurch eine Resistenz gegen Glyphosat vermitteln (Padgette SR et al. (1996) J Nutr. 1996 Mar; 126 (3) : 702-16; Shah D et al. (1986) Science 233: 478-481).
- das deh Gen (kodierend für eine Dehalogenase, die Dalapon® inaktiviert), (GenBank Acc. -No. : AX022822, AX022820 sowie W099/27116)
- bxn Gene, die für Bromoxynil degradierende Nitrilase- enzy e kodieren. Beispielsweise die Nitrilase aus Klebsiella ozanenae. Sequenzen sind in der Genbank beispielsweise unter den Acc.-No: E01313 (DNA encoding bromoxynil specific nitrilase) und J03196 (K. pneumoniae bro oxynil-specific nitrilase (bxn) gene, complete cds) zu finden.
- Neomycinphosphotransferasen verleihen eine Resistenz gegen Antibiotika (Aminoglykoside) wie Neomycin, G418, Hygromycin, Paromomycin oder Kanamycin, indem sie durch eine Phosphorylierungsreaktion deren inhibierende Wirkung reduzieren. Besonders bevorzugt ist das nptll Gen. Sequenzen können aus der GenBank erhalten werden (AF080390 Mini- transposon mTn5-GNm; AF080389 Minitransposon mTn5-Nm, complete sequence) . Zudem ist das Gen bereits Bestandteil zahlreicher Expressionsvektoren und kann unter Verwendung von dem Fachmann geläufigen Verfahren (wie beispielsweise Polymerasekettenreaktion) aus diesen isoliert werden (AF234316 pCAMBIA-2301; AF234315 pCAMBIA-2300 , AF234314 pCAMBIA-2201) . Das NPTII Gen kodiert für eine Aminoglycosid- 3 'O-phosphotransferase aus E.coli, Tn5 (GenBank Acc:-No: U00004 Position 1401-2300; Beck et al . (1982) Gene 19 327-336) .
- das D0GR1-Gen. Das Gen D0GR1 wurde aus der Hefe Saccharomyces cerevisiae isoliert (EP 0 807 836) . Es codiert für eine 2-Desoxyglukose-6-phosphat Phosphatase, die Resistenz gegenüber 2-D0G verleiht (Randez-Gil et al. 1995, Yeast 11, 1233-1240; Sanz et al . (1994) Yeast 10:1195- 1202, Sequenz: GenBank Acc.-No.: NC001140 Chromosom VIII, Saccharomyces cervisiae Position 194799-194056) .
Sulfonylurea- und Imidazolinon inaktivierende Acetolactat- synthasen, die eine Resistenz gegen Imidazolinon/Sulfonyl- urea-Herbizide verleihen. Beispielhaft seien für Imidazolin- on-Herbizide die Wirkstoffe I azamethabenz-methyl, Imazza ox, Imazapyr, Imazaquin, Imazethapyr zu nennen. Für Sulfonylharn- stoff-Herbizide seien beispielhaft Amidosulforon, Azim- sulfuron, Chlorimuronethyl, Chlorsulfuron, Cinosulfuron, Imazosulforon, Oxasulforon, Prosulforon, Rimsulforon, Sulfo- sulforon zu nennen. Dem Fachmann sind zahlreiche weitere Wirkstoffe der genannten Klassen bekannt. Geeignet sind
Nukleinsäuresequenzen wie beispielsweise die unter der GenBank Acc-No.: X51514 abgelegte Sequenz für das Arabidopsis thaliana Csr 1.2 Gen (EC 4.1.3.18) (Sathasivan K et al . (1990) Nucleic Acids Res . 18(8):2188). Acetolactatesynthasen, die eine Resistenz gegen Imidazolinon-Herbizide verleihen, sind ferner beschrieben unter den GenBank Acc.-No.:
a) AB049823 Oryza sativa ALS mRNA for acetolactate synthase, complete cds, herbicide resistant biotype b) AF094326 Bassia scoparia herbicide resistant acetolactate synthase precursor (ALS) gene, complete cds c) X07645 Tobacco acetolactate synthase gene, ALS SuRB (EC 4.1.3.18) d) X07644 Tobacco acetolactate synthase gene, ALS SuRA (EC 4.1.3.18) e) A19547 Synthetic nucleotide mutant acetolactate synthase f) A19546 Synthetic nucleotide mutant acetolactate synthase g) A19545 Synthetic "nucleotide" mutant acetolactate synthase h) 105376 Sequence 5 from Patent EP 0257993 i) 105373 Sequence 2 from Patent EP 0257993 j) AL133315
Bevorzugt ist die Expression einer Acetolactatsynthase gemäß SEQ ID NO: 5, beispielsweise kodiert durch eine Nukleinsäure- sequenz gemäß SEQ ID NO: 4.
- Hygromycinphosphotransferasen (X74325 P. pseudomallei gene for hygromycin phosphotransferase) die eine Resistenz gegen das Antibiotikum Hygromycin verleihen. Das Gen ist Bestandteil zahlreicher Expressionsvektoren und kann unter Verwendung von dem Fachmann geläufigen Verfahren (wie beispielsweise Polymerasekettenreaktion) aus diesen isoliert werden (AF294981 pINDEX4; AF234301 pCAMBIA-1380; AF234300 pCAMBIA-1304; AF234299 pCAM- BIA-1303; AF234298 pCAMBIA-1302; AF354046 pCAMBIA-1305. ;
AF354045 pCAMBIA-1305.1)
- Resistenzgene gegen
a) Chloramphenicol (Chloramphenicolacetyltransferase) , b) Tetracyclin, verschiedene Resistenzgene sind beschrieben z.B. X65876 S. ordonez genes class D tetA and tetR for tetracycline resistance and repressor proteins X51366 Bacillus cereus plasmid pBC16 tetracycline resistance gene. Zudem ist das Gen bereits Bestandteil zahlreicher Expressionsvektoren und kann unter Verwendung von dem Fachmann geläufigen Verfahren (wie beispielsweise Polymerasekettenreaktion) aus diesen isoliert werden
c) Streptomycin, verschiedene Resistenzgene sind beschrieben z.B. mit der GenBank Acc.-No. :AJ278607 Corynebacterium acetoacidophilum ant gene for streptomycin adenylyl- transferase.
d) Zeocin, das entsprechende Resistenzgen ist Bestandteil zahlreicher Klonierungsvektoren (z.B. L36849 Cloning vector pZEO) und kann unter Verwendung von dem Fachmann geläufigen Verfahren (wie beispielsweise Polymerasekettenreaktion) aus diesen isoliert werden.
e) Ampicillin (ß-Lactamase Gen; Datta N, Richmond MH.
(1966) Bioche J. 98(l):204-9; Heffron F et al (1975) • J-.- Baefeeriol-~122 : 250—2S6; das Ap Gen wurde zuerst zur Herstellung des E. coli Vektors pBR322 kloniert; Bolivar F et al. (1977) Gene 2:95-114). Die Sequenz ist Bestandteil zahlreicher Klonierungsvektoren und kann unter Verwendung von dem Fachmann geläufigen Verfahren (wie beispielsweise Polymerasekettenreaktion) aus diesen isoliert werden.
Gene wie die Isopentenyltransferase aus Agrobacterium tumefaciens (strain:P022) (Genbank Acc.-No. : AB025109) . Das ipt Gen ist ein Schlüsselenzym der Cytokin-Biosynthese . Seine Überexpression erleichtert die Regeneration von Pflanzen (z.B. Selektion auf Cytokin-freiem Medium) . 'Das Verfahren zur Nutzung des ipt Gens ist beschrieben (Ebinuma H et al . (2000) Proc Natl Acad Sei USA 94:2117-2121; Ebinuma, H et al . (2000) Selection of Marker-free transgenic plants using the onco- genes (ipt, rol A, B, C) of Agrobacterium as selectable markers, In Molecular Biology of Woody Plants. Kluwer Academic Publishers) .
Verschiedene weitere positive Selektionsmarker, die den transformierten Pflanzen einen Wachstumsvorteil gegenüber nicht-transformierten verleihen, sowie Vefahren zu ihrer Verwendung sind u.a. beschrieben in EP-A 0 601 092. Beispielhaft sind zu nennen ß-Glucuronidase (in Verbindung mit z.B. Cyto- kininglucuronid) , Mannose-6-phosphat-Isomerase (in Verbindung mit Mannose) , UDP-Galaktose-4-Epimerase (in Verbindung mit z.B. Galactose) , wobei Mannose-6-phosphat-Isomerase in Verbindung mit Mannose besonders bevorzugt ist.
ii) Negative Selektionsmarker ermöglichen beispielsweise die Selektion von Organismen mit erfolgreich deletierten Sequenzen, die das Markergen umfassen (Koprek T et al. (1999) The Plant Journal 19 (6) :719-726) . Bei der negativen Selektion wird beispielsweise durch den in die Pflanze eingebrachten negativen Selektionsmarker eine Verbindung, die ansonsten für die Pflanze keine nachteilige Wirkung hat, in eine Verbindung mit nachteiliger Wirkung umgesetzt. Ferner sind Gene geeignet, die per se .eine nachteilige Wirkung haben, wie zum Beispiel TK thymidine kinase (TK) und Diphtheria Toxin A Fragment (DT-A) , das codA Genprodukt kodierend für eine Cytosindeaminase (Gleave AP et al. (1999) Plant Mol Biol 40(2) :223-35; Perera RJ et al . (1993) Plant Mol Biol 23(4): 793-799; Stougaard J (1993) Plant J 3:755-761), das Cytochrom P450 Gen (Koprek et al . (1999) Plant J. 16:719-726), Gene kodierend für eine Haloalkan Dehalogenase (Naested H (1999) Plant J. 18:571-576), das iaaH Gen (Sundaresan V et al . (1995-)-.Genes~&.. Development 9.: 1797-1810) oder das.tms2 Gen (Fedoroff NV & Smith DL 1993, Plant J 3: 273-289).
Die jeweils für die Selektion verwendeten Konzentrationen der Antibiotika, Herbizide, Biozide oder Toxine müssen an die jeweiligen Testbedingungen bzw. Organismen angepasst werden. Beispielhaft seien für Pflanzen zu nennen Kanamycin (Km) 50 mg/1, Hygromycin B 40 mg/1, Phosphinothricin (Ppt) 6 mg/1.
Ferner können funktionelle Analoga der genannten Nukleinsäuren kodierend für Selektionsmarker exprimiert werden. Funktionelle Analoga meint hier all die Sequenzen, die im wesentlichen die gleiche Funktion haben d.h. zu einer Selektion transformierter Organismen befähigt sind. Dabei kann das funktionelle Analogon sich in anderen Merkmalen durchaus unterscheiden. Es kann zum Beispiel eine höhere oder niedrigere Aktivität haben oder auch über weitere Funktionalitäten verfügen.
Funktionelle Analoga meint ferner Sequenzen, die für Fusionsproteine kodieren bestehend aus einem der bevorzugten Selektionsmarker und anderen Proteinen zum Beispiel einem weiteren bevorzugten Selektionsmarker oder aber auch einer Signalpeptidsequenz . Die Expression des Selektionsmarkers ist in jedem gewünschten Zellkompartiment, wie z.B. dem Endomembransystem, der Vakuole und den Chloroplasten möglich. Durch Nutzung des sekretorischen Weges sind gewünschte Glykosylierungsreaktionen, besondere Faltungen u.a. möglich. Auch die Sekretion des Zielproteins zur Zelloberfläche bzw. die Sezernierung ins Kulturmedium, beispielsweise bei Nutzung suspensionskultivierter Zellen oder Protoplasten ist möglich. Die dafür notwendigen Targetsequenzen können sowohl in einzelnen Vektorvariationen berücksichtigt werden als auch durch Verwendung einer geeigneten KlonierungsStrategie gemeinsa ' mit' dem zu klonierenden Zielgen in den Vektor mit eingebracht werden. Als Targetsequenzen können sowohl Gen eigene, sofern vorhanden, oder heterologe Sequenzen genutzt werden. Zusätzliche, heterologe zur funktionellen Verknüpfung bevorzugte aber nicht darauf beschränkte Sequenzen sind weitere Targeting- Sequenzen zur Gewährleistung der subzellulären Lokalisation im Apoplasten, in der Vakuole, in Piastiden, im Mitochondrium, im Endoplas atischen Retikulum (ER) , im Zellkern, in Ölkörperchen oder anderen Kompartimenten; sowie Translationsverstärker wie die 5 ' -Leadersequenz aus dem Tabak-Mosaik-Virus (Gallie et al., Nucl. Acids Res. 15 (1987), 8693-8711) und dergleichen. Das Verfahren, an sich nicht in den Piastiden lokalisierte Proteine, gezielt in dϊe~"Plasti~den zu transportieren, ist beschrieben (Klosgen RB_ und Weil JH (1991) Mol Gen Genet 225 (2) :297-304; Van Breusege F et al. (1998) Plant Mol Biol 38 (3) .-491-496) . Bevorzugte Sequenzen sind:
a) kleine Untereinheit (SSU) der Ribulosebisphosphatcarboxylase (Rubisco ssu) aus Erbse, Mais, Sonnenblume
b) Transitpeptide abgeleitet von Genen der pflanzlichen FettsäurebioSynthese wie das Transitpeptid des plastidären "Acyl Carrier Protein" (ACP) , die Stearyl-ACP-Desaturase, ß-Ketoacyl-ACP Synthase oder die Acyl-ACP-Thioesterase.
c) das Transitpeptid für GBSSI ("Granule Bound Starch Synthase I")
d) LHCP II Gene.
Die Zielsequenzen können mit anderen, von dem Transitpeptid kodierenden Sequenzen verschiedenen, Targeting-Sequenzen verknüpft sein, um eine subzellulären Lokalisation im Apoplasten, in der Vakuole, in Piastiden, im Mitochondrium, im Endo- plasmatischen Retikulum (ER) , im Zellkern, in Ölkörperchen oder anderen Kompartimenten zu gewährleisten. Ferner können Translationsverstärker wie die 5 '-Leadersequenz aus dem Tabak- Mosaik-Virus (Gallie et al. (1987) Nucl Acids Res 15:8693-8711) und dergleichen zum Einsatz kommen.
Die erfindungsgemäßen Expressionskassetten und die von ihnen abgeleiteten Vektoren können weitere Funktionselemente enthalten. Der Begriff Funktionselement ist breit zu verstehen und meint all solche Elemente, die einen Einfluss auf Herstellung, Vermehrung oder Funktion der erfindungsgemäßen Expressionskassetten oder von diesen abgeleitete Vektoren oder Organismen haben. Beispielhaft aber nicht einschränkend seien zu nennen:
a) Reportergene, die für leicht quantifizierbare Proteine kodieren und über Eigenfarbe oder Enzymaktivität eine Bewertung der Transformationseffizienz, des Expressionsortes oder -Zeitpunktes gewährleisten. Ganz besonders bevorzugt sind dabei Gene- kodierend für Reporter-Proteine (siehe auch Schenborn E, Groskreutz D. Mol Biotechnol . 1999; 13(l):29-44) wie
- "green fluorescence protein" (GFP) (Chui WL et al., Curr
Biol 1996, 6:325-330; Leffel SM et al . , Biotechniques.
23(5):912-8, 1997; Sheen et al.(1995) Plant Journal -8 ("5 ): 777—78-4; Haseloff et al . (1997 ) -Proc Natl Acad- Sei .._
USA 94(6) :2122-2127; Reichel et al.(1996) Proc Natl Acad Sei USA 93(12) :5888-5893; Tian et al. (1997) Plant Cell
Rep 16:267-271; WO 97/41228).
- Chlora phenicoltransferase (Fromm et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:5824-5828),
Luziferase (Millar et al., Plant Mol Biol Rep 1992 10:324-414; Ow et al . (1986) Science, 234:856-859); erlaubt Bioluminescenzdetektion.
- ß-Galactosidase, kodiert für ein Enzym für das verschiedene chromogene Substrate zur Verfügung stehen.
ß-Glucuronidase (GUS) (Jefferson et al . , EMBO J. 1987, 6, 3901-3907) oder das uidA Gen, das ein Enzym für ver- schiedene chromogene Substrate kodiert.
- R-Locus Genprodukt: Protein, das die Produktion von Anthocyaninpigmenten (rote Färbung) in pflanzlichen r Gewebe reguliert und so eine direkte Analyse der Promotoraktivität ohne Zugabe zusätzlicher Hilfsstoffe oder chromogener Substrate ermöglicht (Dellaporta et al . , In: Chromosome Structure and Function: Impact of New Concepts, 18th Stadler Genetics Symposium, 11:263-282, 1988) .
ß-Lactamase (Sutcliffe (1978) Proc Natl Acad Sei USA 75:3737-3741), Enzym für verschiedene chromogene Substrate (z.B. PADAC, eine chromogenes Cephalosporin) .
- xylE Genprodukt (Zukowsky et al. (1983) Proc Natl Acad Sei USA 80:1101-1105), Catecholdioxygenase, die chromo- gene Catechole umsetzen kann.
Alpha-A ylase (Ikuta et al. (1990) Bio/technol. 8:241-242) .
- Tyrosinase (Katz et al. (1983) J Gen Microbiol
129:2703-2714), Enzym, das Tyrosin zu DOPA und Dopaquinon oxidiert, die infolge das leicht nachweisbare Melanin bilden.
- Aequorin (Prasher et al. (1985) Biochem Biophys Res
Co mun 126 (3) : 1259-1268) , kann in der Calcium-sensitiven Bioluminescenzdetektion verwendet werden.
b) Replikationsursprünge, die eine Vermehrung der erfindungs- gemäßen Expressionskassetten oder Vektoren in zum Beispiel
E. coli gewährleisten. Beispielhaft seien genannt ORI (origin of DNA replication) , der pBR322 ori oder der P15A ori (Sambrook et al.: Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY,' 1989) .
c) Elemente zum Beispiel "Bordersequenzen", die einen Agro- bakterien-vermittelte Transfer in Pflanzenzellen für die Übertragung und Integration ins Pflanzengenom ermöglichen, wie zum Beispiel die rechte oder linke- Begrenzung der T-DNA oder die vir-Region.
d) Multiple Klonierungsregionen (MCS) erlauben und erleichtern die Insertion eines oder mehrerer Nukleinsäuresequenzen.
Dem Fachmann sind verschiedene Wege bekannt, um zu einer erfindungsgemäßen Expressionskassette zu gelangen. Die Herstellung einer erfindungsgemäßen Expressionskassette erfolgt beispielsweise durch Fusion des Nitl Promotors gemäß SEQ-ID NO: (oder eines funktionellen Äquivalentes oder funktionell äquivalenten Teils) mit einer zu exprimierenden Nukleotidsequenz kodierend für einen Selektionsmarker, gegebenenfalls einer für ein Transitpeptid kodierenden Sequenz, vorzugsweise ein chloro- plastenspezifisches Transitpeptid, welches vorzugsweise zwischen dem Promotor und der jeweiligen Nukleotidsequenz angeordnet ist, sowie einem Terminator- oder Polyadenylierungssignal. Dazu ver- wendet man gängige Rekombinations- und Klonierungsteehniken, wie sie beispielsweise in Maniatis T, Fritsch EF und Sambrook J (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY sowie in Silhavy TJ, Ber an ML und Enquist LW (1984) Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY und in Ausubel FM et al. (19879 Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience beschrieben sind.
Unter einer Expressionskassette sind aber auch solche Konstruktionen zu verstehen, bei denen eine transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz kodierend für einen Selektionsmarker zum Beispiel durch eine homologe Rekombination hinter den endogenen, natürlichen NITl-Promotor (oder eins seiner funktionellen Äquivalente beispielsweise aus anderen Pflanzen- arten) platziert wird, wodurch man eine erfindungsgemäße Expressionskassette erhält, die die Expression der transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz kodierend für einen Selektionsmarker in der erfindungsgemäßen Weise steuert
Erfindungsgemäß sind ferner Vektoren, die die oben beschriebenen Expressionskassetten enthalten. Vektoren können beispielhaft Plasmide, Cosmide, Phagen, Viren oder auch Agrobakterien sein.
Ein anderer Gegenstand der Erfindung betrifft transgene Organismen,- -transformiert mit wenigstens einer erfindungsgemäßen Expressionskassette oder einem erfindungsgemäßen Vektor, sowie Zellen, Zellkulturen, Gewebe, Teile - wie zum Beispiel bei pflanzlichen Organismen Blätter, Wurzeln usw.- oder Vermehrungsgut abgeleitet von solchen Organismen.
Unter Organismus, Ausgangs- oder Wirtsorganismen werden pro- karyotische oder eukaryotische Organismen, wie beispielsweise Mikroorganismen oder pflanzliche Organismen verstanden. Bevorzugte Mikroorganismen sind Bakterien, Hefen, Algen oder Pilze.
Bevorzugte Bakterien sind Bakterien der Gattung Escherichia, Erwinia, Agrobacterium, Flavobacterium, Alcaligenes oder Cyano- bakterien zum Beispiel der Gattung Synechocystis .
Bevorzugt sind vor allem Mikroorganismen, welche zur Infektion von Pflanzen und damit zur Übertragung der erfindungsgemäßen Kassetten befähigt sind. Bevorzugte Mikroorganismen sind solche aus der Gattung Agrobakterium und insbesondere der Art Agro- bakterium tumefaciens .
Bevorzugte Hefen sind Candida, Saccharomyces, Hansenula oder 5 Pichia.
Bevorzugte Pilze sind Aspergillus, Trichoderma, Ashbya, Neurospora, Fusarium, Beauveria oder weitere in Indian Chem Engr. Section B. Vol 37, No 1,2 (1995) auf Seite 15, Tabelle 6
10 beschriebene Pilze.
Als transgene Organismen bevorzugte Wirts- oder Ausgangsorganismen sind vor allem Pflanzen. Eingeschlossen sind im Rahmen der Erfindung alle Gattungen und Arten höherer und niedrigerer Pflanzen des Pflanzenreiches . Eingeschlossen sind ferner die
15 reifen Pflanzen, Saatgut, Sprossen und Keimlinge, sowie davon abgeleitete Teile, Vermehrungsgut und Kulturen, zum Beispiel Zellkulturen. Reife Pflanzen meint Pflanzen zu jedem beliebigen Entwicklungsstadium jenseits des Keimlings. Keimling meint eine junge, unreife Pflanze in einem frühen EntwicklungsStadium.
20
Einjährige, mehrjährige, monocotyledone und dicotyledone Pflanzen sind bevorzuge WirtsOrganismen für die Herstellung transgener --- Pflanzen. Die Expression von Genen., ist ferner vorteilhaf _b.ei allen Schmuckpflanzen, Nutz- oder Zierbäumen, Blumen, Schnitt-
25 blumen, Sträuchern oder Rasen. Beispielhaft aber nicht einschränkend seien zu nennen Angiospermen, Bryophyten wie zum Beispiel Hepaticae (Leberblümchen) und Musci (Moose) ; Pterido- phyten wie Farne, Schachtelhalm und Lycopoden; Gymnospermen wie Koniferen, Cycaden, Ginkgo und Gnetalen; Algen wie Chloro-
30 phyceae, Phaeophpyceae, Rhodophyceae, Myxophyceae, Xanthophyceae, Bacillariophyceae (Diatomeen) und Euglenophyceae.
Bevorzugt sind Pflanzen nachfolgender Pflanzenfamilien: Amarant- haceae, Asteraceae, Brassicaceae, Carophyllaceae, Chenopodiaceae, 35 Compositae, Cruciferae, Cucurbitaceae, Labiatae, Leguminosae, Papilionoideae, Liliaceae, Linaceae, Malvaceae, Rosaceae, Rubiaceae, Saxifragaceae, Scrophulariaceae, Solanacea, Ster- culiaceae, Tetragoniacea, Theaceae, Umbelliferae.
40 Bevorzugte monokotyle Pflanzen sind insbesondere ausgewählt aus den monokotylen Kulturpflanzen, wie zum Beispiel der Familie der Gra ineae wie Reis, Mais, Weizen oder andere Getreidearten wie Gerste, Hirse, Roggen, Triticale oder Hafer sowie dem Zuckerrohr sowie alle Arten von Gräsern.
45 Bevorzugte dikotyle Pflanzen sind insbesondere ausgewählt aus den dikotylen Kulturpflanzen, wie zum Beispiel
- Asteraceae wie Sonnenblume, Tagetes oder Calendula und andere mehr,
- Co positae, besonders die Gattung Lactuca, ganz besonders die Art sativa (Salat) und andere mehr,
- Cruciferae, besonders die Gattung Brassica, ganz besonders die Arten napus (Raps), campestris (Rübe), oleracea cv Tastie (Kohl) , oleracea cv Snowball Y (Blumenkohl) und oleracea cv Emperor (Broccoli) und weitere Kohlarten; und der Gattung Arabidopsis, ganz besonders die Art thaliana sowie Kresse oder Canola und andere mehr,
- Cucurbitaceae wie Melone, Kürbis oder Zucchini und andere mehr,
- Leguminosae besonders die Gattung Glycine, ganz besonders die Art max (Sojabohne) Soja sowie Alfalfa, Erbse, Bohnengewächsen oder Erdnuss und andere mehr
---Rubiaceae, bevorzugt der Unterklasse Lamiidae .wie., beispiels- weise Coffea arabica oder Coffea liberica (Kaffestrauch) und andere mehr,
' - Solanaceae besonders die Gattung Lycopersicon, ganz besonders die Art esculentum (Tomate) und die Gattung Solanum, ganz besonders die Art tuberosum (Kartoffel) und melongena (Aubergine) sowie Tabak oder Paprika und andere mehr,
- Sterculiaceae, bevorzugt der Unterklasse Dilleniidae wie beispielsweise Theobroma cacao (Kakaostrauch) und andere mehr,
- Theaceae, bevorzugt der Unterklasse Dilleniidae wie beispielsweise Camellia sinensis oder Thea sinensis (Teestrauch) und andere mehr,
- U belliferae, besonders die Gattung Daucus (ganz besonders die Art carota (Karrotte) ) und Apium (ganz besonders die Art graveolens dulce (Seiarie) ) und andere mehr; und die Gattung Capsicum, ganz besonders die Art annum (Pfeffer) und andere mehr, sowie Lein, Soya, Baumwolle, Hanf, Flachs, Gurke, Spinat, Möhre, Zuckerrübe und den verschiedenen Baum-, Nuss- und Weinarten, insbesondere Banane und Kiwi.
5, Umfasst sind ferner Schmuckpflanzen, Nutz- oder Zierbäumen, Blumen, Schnittblumen, Sträuchern oder Rasen. Beispielhaft aber nicht einschränkend seien zu nennen Angiospermen, Bryophyten wie zum Beispiel Hepaticae (Leberblümchen) und Musci (Moose) ; Pteridophyten wie Farne, Schachtelhalm und Lycopoden; Gymno-
10 spermen wie Koniferen, Cycaden, Ginkgo und Gnetalen, die Familien der Rosaceae wie Rose, Ericaceae wie Rhododendrons und Azaleen, Euphorbiaceae wie Weihnaσhtssterne und Kroton, Caryophyllaceae wie Nelken, Solanaceae wie Petunien, Gesneriaceae wie das Usambaraveilchen, Balsa inaceae wie das Springkraut, Orchidaceae
15 wie Orchideen, Iridaceae wie Gladiolen, Iris, Freesie und Krokus, Co positae wie Ringelblume, Geraniaceae wie Geranien, Liliaceae wie der Drachenbaum, Moraceae wie Ficus, Araceae wie Philodendron und andere mehr.
20 Am meisten bevorzugt sind Arabidopsis thaliana, Nicotiana taba- cum, Tagetes erecta, Calendula officinalis und Brassica napus sowie alle Gattungen und Arten, die als Nahrungs- oder Futter-
- - ittel zum Einsatz kommen, wie -die beschriebenβn-Getreidearten,-— . oder sich zur Herstellung von Ölen eignen, wie Ölsaaten (wie zum
25 Beispiel Raps), Nussarten, Soja, Sonnenblume, Kürbis und Erdnuss.
Pflanzliche Organismen im Sinne der Erfindung sind weiterhin weitere photosynthetisch aktive befähigte Organismen, wie zum Beispiel Algen .oder Cyanobakterien, sowie Moose. 30
Bevorzugte Algen sind Grünalgen, . wie - beispielsweise Algen der Gattung Haematococcus, Phaedactylum tricornatum, Volvox oder Dunaliella.
35 Die Herstellung eines transformierten Organismus oder einer transformierten Zelle erfordert, dass die entsprechende DNA in die entsprechende Wirtszelle eingebracht wird. Für diesen Vorgang, der als Transformation bezeichnet wird, steht eine Vielzahl von Methoden zur Verfügung (siehe auch Keown et al . (1990)
40 Methods in Enzymology 185:527-537) . So kann die DNA beispielhaft direkt durch Mikroinjektion oder durch Bombardierung mit DNA-beschichteten Mikropartikeln eingeführt werden. Auch kann die Zelle chemisch, zum Beispiel mit Polyethylenglycol , permeabilisiert werden, so dass die DNA durch Diffusion in die Zelle gelangen
45 kann. Die DNA kann auch durch Protoplastenfusion mit anderen
DNA-enthalt nden Einheiten wie Minicells, Zellen, Lysosomen oder Liposomen erfolgen. Elektroporation ist eine weitere geeignete Methode zur Einführung von DNA, bei der die Zellen reversibel durch einen elektrischen Impuls permeabilisert werden.
Bei Pflanzen werden dabei die beschriebenen Methoden zur Trans- formation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen zur transienten oder stabilen Transformation genutzt. Geeignete Methoden sind vor allem die Protoplasten- transformation durch Polyethylenglykol-induzierte DNA-Aufnähme, das biolistische Verfahren mit der Genkanone, die sogenannte particle bombardment Methode, die Elektroporation, die Inkubation trockener Embryonen in DNA-haltiger Lösung und die Mikro- in ektion.
Neben diesen "direkten" Transformationstechniken kann eine Trans- formation auch durch bakterielle Infektion mittels Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes durchgeführt werden. Diese Stämme enthalten ein Plasmid (Ti bzw. Ri Plasmid) , das auf die Pflanze nach Agrobacterium-Infektion übertragen wird. Ein Teil dieses Plasmids, genannt T-DNA (transferred DNA) , wird in das Genom der Pflanzenzelle integriert.
Die Agrobacterium-vermittelte Transformation ist am besten für dicotyledone, diploi-de Pflanzenzellen geeigner-,, wohingegen die.. direkten Transformationsteehniken sich für jeden Zelltyp eignen.
Die Einführung einer erfindungsgemäßen Expressionskassette in
Zellen, bevorzugt in pflanzliche Zellen, kann vorteilhaft unter
Verwendung von Vektoren realisiert werden.
In einer vorteilhaften Ausführungsform wird die Einführung der Expressionskassette mittels Plasmidvektoren realisiert. Bevorzugt sind solche Vektoren, die eine stabile Integration der Expressionskassette in das Wirtsgenom ermöglichen.
Im Falle von Injektion oder Elektroporation von DNA in pflanzliche Zellen sind keine besonderen Anforderungen an das verwendete Plasmid gestellt . Einfache Plasmide wie die der pUC-Reihe können verwendet werden. Sollen vollständige Pflanzen aus den transformierten Zellen regeneriert werden, so ist er erforder- lieh, das sich auf dem Plasmid ein zusätzliches selektionierbares Markergen befindet.
Transformationstechniken sind für verschiedene monokotyle und dikotyle pflanzliche Organismen beschrieben. Ferner stehen ver- schiedene mögliche Plasmidvektoren für die Einführung fremder Gene in Pflanzen zur Verfügung, die in der Regel einen Repli- kationsursprung für eine Vermehrung in E . coli und ein Markergen für eine Selektion transformierter Bakterien enthalten. Beispiele sind pBR322, pUC Reihe, Ml3mp Reihe, pACYC184 etc.
Die Expressionskassette kann in den Vektor über eine geeignete Restriktionsschnittstelle eingeführt werden. Das entstandene Plasmid wird zunächst in E.coli eingeführt. Korrekt transformierte E.coli werden selektioniert, gezüchtet und das rekombi- nante Plasmid mit dem Fachmann geläufigen Methoden gewonnen. Restriktionsanalyse und Sequenzierung können dazu dienen, den Klonierungsschritt zu überprüfen.
Transformierte Zellen d.h. solche, die die eingeführte DNA integriert in die DNA der Wirtszelle enthalten, können von untransformierten selektioniert werden, wenn ein selektionier- barer Marker Bestandteil der eingeführten DNA ist. Als Marker kann beispielhaft jedes Gen fungieren, dass eine Resistenz gegen Antibiotika oder Herbizide zu verleihen vermag. Transformierte Zellen, die ein solches Markergen exprimieren, sind in der Lage, in der Gegenwart von Konzentrationen eines entsprechenden Anti- biotikums oder Herbizides zu überleben, die einen untransformierten Wildtyp abtöten. Beispiel sind das bar Gen, dass Resistenz gegen das Herbizid Phosphinothricin verleiht (Rathore KS et al. (1993 ).~Plant Mol- Biol 21-(5-)-: 321=384) , „das nptl . Gen,. „ dass Resistenz gegen Kanamycin verleiht, das hpt Gen, das Resistenz gegen Hygromycin verleiht, oder das EPSP-Gen, das Resistenz gegen das Herbizid Glyphosat verleiht.
Je nach Methode der DNA-Einführung können weitere Gene auf dem Vektorplasmid erforderlich sein. Werden Agrobacteria verwendet, so ist die Expressionskassette in spezielle Plasmide zu inte- grieren, entweder in einen Zwischenvektor (englisch: Shuttle or intermediate vector) oder einen binären Vektor. Wenn zum Beispiel ein Ti oder Ri Plasmid zur Transformation verwendet werden soll, ist zumindest die rechte Begrenzung, meistens jedoch die rechte und die linke Begrenzung der Ti oder Ri Plasmid T-DNA als flankierende Region mit der einzuführenden Expressionskassette verbunden. Bevorzugt werden binäre Vektoren verwendet. Binäre Vektoren können sowohl in E.coli als auch in Agrobacterium replizieren. Sie enthalten in der Regel ein Selektionsmarkergen und einen Linker oder Polylinker flankiert von der rechten und linken T-DNA Begrenzungssequenz . Sie können direkt in Agrobacterium transformiert werden (Holsters et al.,Mol. Gen. Genet. 163 (1978), 181-187). Das Selektionsmarkergen erlaubt eine Selektion transformierter Agrobakteria und ist zum Beispiel das nptll Gen, das eine Resistenz gegen Kanamycin verleiht. Das in diesem Fall als WirtsOrganismus fungierende Agrobacterium sollte bereits ein Plasmid mit der vir-Region enthalten. Diese ist für die Über- tragung der T-DNA auf die pflanzliche Zelle erforderlich. Ein so transformiertes Agrobacterium kann zur Transformation pflanzlicher Zellen verwendet werden.
Die Verwendung von T-DNA zur Transformation pflanzlicher Zellen ist intensiv untersucht und beschrieben (EP 120516; Hoekema, In: The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam, Chapter V; Fraley et al. , Crit. Rev. Plant. Sei., 4:1-46 and An et al . (1985) EMBO J 4:277-287). Verschiedene binäre Vektoren sind bekannt und teilweise kommerziell erhältlich wie zum Beispiel pBIN19 (Clontech Laboratories, Inc. USA).
Für den Transfer der DNA in die pflanzliche Zelle werden pflanzliche Explantate mit Agrobacterium turnefaciens oder Agrobacterium rhizogenes kokultiviert. Ausgehend von infiziertem Pflanzenmaterial (z.B. Blatt-, Wurzel- oder Stengelteile, aber auch Protoplasten oder Suspensionen von Pflanzenzellen) können ganze Pflanzen unter Verwendung eines geeigneten Mediums, dass zum Beispiel Antibiotika oder Biozide zur .Selektion transformierter Zellen enthalten kann, regeneriert werden. Die erhaltenen
Pflanzen können dann auf die Präsenz der eingeführten DNA, hier der erfindungsgemäßen Expressionskassette, durchmustert werden. Sobald die DNA- in das- Wirtsgenom--integriert_ist, ist~.der entsprechende Genotyp in der Regel stabil und die entsprechende Insertion wird auch in den Nachfolgegenerationen wiedergefunden. In der Regel enthält die integrierte Expressionskassette einen Selektionsmarker, der der transformierten Pflanze eine Resistenz gegen ein Biozid (zum Beispiel ein Herbizid) , einen Metabolismusinhibitor wie 2-DOG oder ein Antibiotikum wie Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin oder Phosphinothricin etc. verleiht. Der Selektionsmarker erlaubt die Selektion von transformierten Zellen von untransformierten (McCormick et al . , Plant Cell Reports 5 (1986), 81-84). Die erhaltenen Pflanzen können - in üblicher Weise gezüchtet und gekreuzt werden. Zwei oder mehr Generationen soll- ten kultiviert werden, um sicherzustellen, dass die genomische Integration stabil und vererblich ist.
Die genannten Verfahren sind beispielsweise in B. Jenes et al . , Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von S.D. Kung und R. Wu, Academic Press (1993), 128-143 sowie in Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205-225) beschrieben. Vorzugsweise wird das zu exprimierende Konstrukt in einen Vektor kloniert, der geeignet ist, Agrobakterium tume- faciens zu transformieren, beispielsweise pBinl9 (Bevan et al . , Nucl. Acids Res. 12 (1984), 8711). Sobald eine transformierte Pflanzenzelle hergestellt wurde, kann eine vollständige Pflanze unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Verfahren erhalten werden. Hierbei geht man beispielhaft von Kalluskulturen aus. Aus diesen noch undifferenzierten Zell- massen kann die Bildung von Spross und Wurzel in bekannter Weise induziert werden. Die erhaltenen Sprösslinge können ausgepflanzt und gezüchtet werden.
Die Wirksamkeit der Expression der transgen exprimierten Nuklein- säuren kann beispielsweise in vitro durch Sprossmeristemvermehrung unter Verwendung einer der oben beschriebenen Selektionsmethoden ermittelt werden.
Erfindungsgemäß sind ferner von den oben beschriebenen transgenen Organismen abgeleitete Zellen, Zellkulturen, Teile - wie zum
Beispiel bei transgenen pflanzlichen Organismen Wurzeln, Blätter etc.-, und transgenes Vermehrungsgut wie Saaten oder Früchte.
Von Menschen und Tieren verzehrbare erfindungsgemäße, genetisch veränderte Pflanzen können auch beispielsweise direkt oder nach an sich bekannter Aufbereitung als Nahrungsmittel oder Futtermittel verwendet werden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung der oben beschriebenen erfindungsgemäßen, transgenen Organismen und der von ihnen abgeleitete Zellen, Zellkulturen, Teile - wie zum Beispiel bei transgenen pflanzlichen Organismen Wurzeln, Blätter etc . - , und transgenes Vermehrungsgut wie Saaten oder Früchte , zur Herstellung von Nahrungs- oder Futtermitteln, Pharmazeutika oder Feinchemikalien.
Bevorzugt ist ferner ein Verfahren zur rekombinanten Herstellung von Pharmazeutika oder Feinchemikalien in Wirtsorganismen wobei ein Wirtsorganismus mit einer der oben beschriebenen Expressions- kassetten transformiert wird und diese Expressionskassette ein oder mehrere Strukturgene enthält; die für die gewünschte Fein- chemikalie kodieren oder die Biosynthese der gewünschten Fein- chemikalie katalysieren, der transformierte Wirtsorganismus gezüchtet wird' und die gewünschte Feinchemikalie aus dem Züchtungs- medium isoliert wird. Dieses Verfahren ist für Feinchemikalien wie Enzyme, Vitamine, Aminosäuren, Zucker, Fettsäuren, natürliche und synthetische Geschmacks-, Aroma- und Farbstoffe breit anwendbar. Besonders bevorzugt ist die Produktion von Tocopherolen und Tocotrienolen sowie Carotinoiden. Die Züchtung der trans- formierten Wirtsorganismen sowie die Isolierung aus den Wirtsorganismen bzw. aus dem Züchtungsmedium erfolgt mit dem Fachmann bekannten Verfahren. Die Produktion von Pharmazeutika, wie zum Beispiel Antikörpern oder Vakzinen ist beschrieben bei Hood EE, Jilka JM (1999) Curr Opin Biotechnol 10 (4) -.382-6; Ma JK, Vine ND (1999) Curr Top Microbiol Immunol 236:275-92.
5 Sequenzen
1. SEQ ID NO: 1
Promotor and 5 ' -untranslatierte Region des Arabidopsis thaliana NITl-Promotors . 10
2. SEQ ID NO: 2
Nukleinsäure kodierend für eine Phosphinothricinacetyl- transferase.
15 3 . SEQ ID NO : 3
Aminosäuresequenz kodierend für eine Phosphinothricinacetyl- transferase .
4. SEQ ID NO: 4
20 Nukleinsäure kodierend für eine Acetolactatsynthase .
5. SEQ ID NO: 5
-Aminosäuresequenz kodierend für-eine Acetolactatsynthase.
25 6. SEQ ID NO: 6 - Oligonukleotid-Primer nit3 ' 5 λ -CCGGATCCACTCGAGTCTTTGTTTTTTACTTTGG-3 N
7. SEQ ID NO : 7 - Oligonukleotid-Primer nit5 5 -CATCAAGATCTTGGTGATGTAGCAA-3 ' 30
8. SEQ ID NO: 8 - Oligonukleotid-Primer ubi5 5 * -CCAAACCATGGTAAGTTTGTCTAAAGCTTA-3 *
9. SEQ ID NO: 9 - Oligonukleotid-Primer ubi3 35 5 λ -CGGATCCTTTTGTGTTTCGTCTTCTCTCACG-3 x
10. SEQ ID NO: 10 - Oligonukleotid-Primer sqs5 5 -GTCTAGAGGCAAACCACCGAGTGTT-3 v
40 11. SEQ ID NO: 11 - Oligonukleotid-Primer sqs3 5 * -CGGTACCTGTTTCCAGAAAATTTTGATTCAG-3 λ
12. SEQ ID NO: 12
Binärplasmid pSUN3 (Sungene GmbH & Co KGaA) 45 13. SEQ ID NO : 13
Binärplasmid pSUNl4 (Sungene GmbH & Co KGaA)
14. SEQ ID NO: 14 Binärplasmid pSUN3PatNos (Sungene GmbH & Co KGaA)
15. SEQ ID NO: 15
Binärplasmid pSun5NptIICat (SunGene GmbH & Co KGaA)
16. SEQ ID NO: 16
Nukleinsäuresequenz des Terminators des Cathepsin D Inhibitor Gens aus Kartoffel (GenBank Acc. No.: X74985)
17. SEQ ID NO: 17
Nukleinsäuresequenz des Terminators der Speicherproteingens VfLElB3 aus der Ackerbohne (GenBank Acc. No . : Z26489)
18. SEQ ID NO: 18 Verkürzter Promotor (1478 bp) des Arabidopsis thaliana NITl-Gens
- 19. SEQ ID NO: 19 — -
Verkürzter Promotor (1330 bp) des Arabidopsis thaliana NITl-Gens
Abbildungen
Fig.l: Vergleich der Expressionsstärke des isolierten NIT1-
Promotors aus Arabidopsis thaliana mit dem 35S Promotor. Die Tabaklinien UH76 und UH77 enthalten das GUS Gen unter der Kontrolle des 35S Promotors. Die Linie UH127 enthält das GUS-Gen unter Kontrolle des NITl-Promotors aus Arabidopsis thalma . WT stellt den untransformierten Tabak-Wildtyp dar.
Beispiele
Allgemeine Methoden:
Die chemische Synthese von Oligonukleotiden kann beispielsweise, in bekannter Weise, nach der Phosphoamiditmethode (Voet, Voet, 2. Auflage, Wiley Press New York, Seite 896-897) erfolgen. Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführten Klonierungs- schritte wie z.B. Restriktionsspaltungen, Agarosegelelektro- phorese, Reinigung von DNA-Fragmenten, Transfer von Nuklein- säuren auf Nitrozellulose und Nylonmembranen, Verknüpfen von DNA-Fragmenten, Transformation von E. coli Zellen, Anzucht von Bakterien, Vermehrung von Phagen und Sequenzanalyse rekombinanter DNA werden wie bei Sambrook et al. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press; ISBN 0-87969-309-6 beschrieben durchgeführt. Die Sequenzierung rekombinanter DNA-Moleküle erfolgt mit einem Laserfluoreszenz-DNA-Sequenzierer der Firma ABI nach der Methode von Sanger (Sanger et al . (1977) Proc Natl Acad Sei USA 74:5463-5467).
Beispiel 1: Isolierung von genomischer DNA aus Arabidopsis thaliana (CTAB-Methode)
Zur Isolierung genomischer DNA aus Arabidopsis thaliana werden ca. 0,25 g Blattmaterial junger Pflanzen im vegetativen Stadium in flüssigem Stickstoff zu feinem Pulver gemörsert. Das pulverisierte Pflanzenmaterial wird zusammen mit 1 ml 65°C-warmem CTAB I-Puffer (CTAB: Hexadecyltrimethylammoniumbromid, auch genannt Cetyltrimethylammoniumbromid; Sigma Kat.-Nr.: H6269) und 20 μl ß-Mercaptoethanol in einen vorgewärmten zweiten Mörser gegeben und nach vollständiger Homogenisierung wird der Extrakt in ein 2 ml Eppendorf-Gefäß überführt und für 1 h bei 65°C unter regelmäßiger, vorsichtiger..Durchmischung.inkubiert. Nach Abkühlung auf. Raumtemperatur wird der Ansatz mit 1 ml Chloroform/Octanol (24:1, mit IM Tris/HCl, pH 8,0 ausgeschüttelt) durch langsames Invertieren extrahiert und zur Phasentrennung für 5 min bei 8,500 rpm (7,500 x g) und Raumtemperatur zentrifugiert . Anschließend wird die wässrige Phase erneut mit 1 ml Chloroform/Octanol extrahiert, zentrifugiert und durch Invertieren mit 1/10 Volumen auf 65°C vor- gewärmtem CTAB II-Puffer sorgfältig gemischt. Anschließend wird der Ansatz durch vorsichtiges Schwenken mit 1 ml Chloroform/Octa- nol-Gemisch (siehe oben) versetzt und zur erneuten Phasentrennung für 5 min bei 8,500 rpm (7,500 x g) und Raumtemperatur zentrifugiert . Die wässrige untere Phase wird in ein frisches Eppen- dorf-Gefäß überführt und die obere organische Phase wird in einem frischen Eppendorf-Gefäß erneut für 15 min bei 8,500 rpm (7,500 x g) und Raumtemperatur zentrifugiert. Die hieraus resultierende wässrige Phase wird mit der wässrigen Phase des vorherigen Zen- trifugationsschrittes vereinigt und der gesamte Ansatz mit exakt demselben Volumen vorgewärmtem CTAB HI-Puffer versetzt. Es folgt eine Inkubation bei 65°C, bis die DNA in Flocken ausfällt. Dies kann bis zu 1 h dauern oder durch Inkubation bei 37°C über Nacht erfolgen. Das aus dem anschließenden Zentrifugationsschritt (5 min, 2000 rpm (500 x g) , 4°C) resultierende Sediment wird mit 250 μl auf 65°C vorgewärmtem CTAB IV-Puffer versetzt und für mindestens 30 min bzw. bis zur vollständigen Auflösung des Sediments bei 65°C inkubiert. Anschließend wird die Lösung zur Fällung der DNA mit 2 , 5 Volumina eiskaltem Ethanol vermischt und für lh bei -20°C inkubiert. Alternativ kann der Ansatz mit 0.6 Volumina Iso- propanol vermischt und ohne weitere Inkubation sofort für 15 min bei 8,500 rpm (7,500 x g) und 4°C zentrifugiert werden. Die sedimentierte DNA wird durch Invertieren des Eppendorf-Gefäßes zweimal mit je 1 ml 80%igem eiskaltem Ethanol gewaschen, nach jedem Waschschritt erneut zentrifugiert (5 min, 8,500 rpm (7,500 x g) , 4°C) und anschließend für ca. 15 min luftgetrocknet. Abschließend wird die DNA in 100 μl TE mit 100 μg/ml RNase resuspendiert und für 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die DNA Lösung ist nach einer weiteren Inkubationsphase über Nacht bei 4°C homogen und kann für weiterführende Experimente verwendet werden.
Lösungen für CTAB:
Lösung I (für 200 ml) :
100 mM Tris/HCl pH 8,0 (2,42 g)
1,4 M NaCl (16,36 g) 20 mM EDTA (8,0 ml von 0,5 M Stammlösung)
2 % (w/v) CTAB (4,0 g) Jeweils vor der Verwendung werden frisch zugesetzt: 2 % ß-Mercapt.oethanol .(2.0—μl für__l ιαl Lösung I) .
Lösung II (für 200 ml) : 0,7 M NaCl (8,18 g) 10 % (w/v) CTAB (20 g)
Lösung III (für 200 ml) : 50 mM Tris/HCl pH 8,0 (1,21 g)
10 mM EDTA (4 ml 0,5 M von 0,5 M Stammlösung) 1 % (w/v) CTAB (2,0 g)
Lösung IV (High-salt TE) (für 200 ml) : 10 M Tris/ HC1 pH 8 , 0 (0,242 g)
0,1 mM EDTA (40 μl 0.5 M Stammlösung) 1 M NaCl (11, 69 g)
Chloroform/Octanol (24:1) (für 200 ml) : 192 ml Chloroform 8 ml Octanol
Die Mischung wird 2x mit 1 M TrisHCl pH 8 , 0 ausgeschüttelt und vor Licht geschützt gelagert .
Beispiel 2: Transformation von Tabak, Raps und Kartoffeln Die Transformation von Tabak erfolgte über Infektion mit Agrobacterium turne faciens . gemäß der von Horsch entwickelten Methode (Horsch et al. (1985) Science 227: 1229-1231). Alle zur Transformation verwendeten Konstrukte wurden anhand der Gefrier/ Tau-Methode (wiederholtes Auftauen und Einfrieren) in Agrobacterium tumefaciens transformiert. Die das gewünschte Konstrukt enthaltenden Agrojbacteriuzπ-Kolonien wurden auf Mannitol/Glutamat- Medium mit 50 μg/ml Kanamycin, 50 μg/ l Ampicilin und 25 μg/ml Rifampicin selektioniert.
Zur Transformation von Tabakpflanzen (Nicotiana tabacum L. cv. Samsun NN) wurden 10 ml einer unter Selektion gewachsenen Übernachtkultur von Agrobacterium tumefaciens abzentrifugiert, der Überstand verworfen, und die Bakterien im gleichen Volumen Anti- biotika-freien Mediums resuspendiert. In einer sterilen Petri- schale wurden Blattscheiben steriler Pflanzen (Durchmesser ca.
1 cm) in dieser Bakterienlösung gebadet. Anschließend wurden die Blattscheiben in Petrischalen auf MS-Medium (Murashige und Skoog (1962) Physiol Plant 15:473ff.) mit 2 % Saccharose und 0,8 % Bacto-Agar ausgelegt. Nach 2tägiger Inkubation im Dunkeln bei 25°C wurden- sie auf MS-Medium mit 100 mg/1 Kanamycin, 500 mg/1 Claforan, 1 mg/1 Benzylaminopurin (BAP) , 0,2 mg/1 Naphtylessig- säure (NAA)--r-4-7-6 % Glukose und.0,8-% Bacto-Agar übertrage . und die Kultivierung (16 Stunden Licht/8 Stunden Dunkelheit) fort- gesetzt. Wachsende Sprosse wurden auf hormonfreies MS-Medium mit
2 % Saccharose, 250 mg/1 Claforan und 0,8 % Bacto-Agar überführt.
Die Transformation von Raps erfolgte mittels der Petiolentrans- formation nach Moloney et al . (Moloney MM et al. (1989) Plant Cell Reports 8:238-242).
Die Transformation von Kartoffel erfolgte mittels der Methode nach Kunze et al. (Kunze I et al . (2001) Molecular Breeding 7: 221-227) .
Beispiel 3: Untersuchungen zur Eignung des Nitrilase 1 (NITl) Promotors
a) Klonierung des NITl Promotor aus Arabidopsis thaliana
Der putative Nitrilasel Promotor wurde mittels PCR aus genomischer Arabidopsis thaliana DNA mit den Primern nit3 und nit5 amplifiziert .
nit3 (SEQ ID NO: 6) :
5 -CCGGATCCACTCGAGTCTTTGTTTTTTACTTTGG-3 v nit5 (SEQ ID NO: 7) :
5 v -CATCAAGATCTTGGTGATGTAGCAA-3 λ
Reaktionsansatz :
37,5 μl H20
5 μl 10X Reaktionspuffer ("genomic PCR")
4 μl dNTP mix (jeweils 2,5 mM) 2,2 μl 25 mM Mg(OAc) (Endkonzentration 1,1 mM)
1 μl Primer nit3 (10 μM)
1 μl Primer nit5 (10 μM)
0,5 μl Pfu-turbo Polymerase Mix
1 μl Genomische Arabidopsis DNA (ca. 250 ng)
PCR-Bedingungen:
1 Zyklus mit 5 min. bei 95°C 25 Zyklen mit 94°C für 30 sec, 50°C für 60 sec und 72°C für 1 min.
1 Zyklus mit 50°C für 60 sec, 72°C für 10 min., anschließend Kühlung auf 4°C bis zur Weiterverarbeitung.
Das entstandene PCR Fragment wurde in das Smal geschnittene Plasmid pUC18 kloniert (pNit22) und mittels Sequenzanalyse verifiziert.
b) Konstruktion der NITl-Promotor-Expressionskassetten
Ausgangsplasmid für Analysen mit dem Glucuronidasegen ist das Plasmid pGUSINT37. Zur Herstellung des Plasmids pGUSINT37 wurde die 35S-GUS-Intron Kassette aus dem Binärplasmid p35SGUSINT (G. Vancanneyt et al . (1989) Mol. Gen. Genet. 220: 245-50) durch Verdau mit PstI herausgeschnitten. Die Enden des Fragmentes wurden durch Klenow-"Fill-In" geglättet und das Fragment in den Smal geschnittenen Vektor pUCl8 kloniert . Dieses Konstrukt trägt die Bezeichnung pGUSINT37.
Für die Fusion mit dem GUS Gen wurde das BamHI Fragment aus dem pNit22 Vektor in das BamHI geschnittene, dephosphorylierte Plasmid pGUSINT37 kloniert. Das erhaltene Konstrukt trägt die Bezeichnung pNitlGUSINT.
Das EcoRI/Sall Fragment aus dem Vektor pNitlGUSINT, das die NitlP/GUS Kassette enthält, wurde in das Binärplasmid pSUN3
(Sungene GmbH & Co KGaA; SEQ ID NO: 12) gespalten mit EcoRI/Sall , integriert. Das resultierende Plasmid pSUN3NitlGUS wurde in Tabak und in Raps transformiert. Die erzeugten Tabakpflanzen wurden UH127, die erzeugten Rapspflanzen BN127 genannt.
Für die Vermittlung von Resistenz gegen Phosphinothricin wurde der NITl Promotor als BamHI Fragment vor das Phosphinothricin- Resistenzgen in das .BamHI geschnittene, dephosphorylierte Plasmid pSUN3PatNos (Sungene GmbH & Co KGaA, SEQ ID NO: 14) kloniert. Das resultierende Plasmid mit der Bezeichnung pSUN3NitlPat wurde in Tabak transformiert.
Für die Vermittlung von Resistenz gegen Kanamycin wurde der NITl Promotor als Xhol Fragment vor das Nptll-Resistenzgen in das Xhol geschnittene, dephosphorylierte Plasmid pSUN5NptIICat (Sungene GmbH & Co KGaA, SEQ ID NO: 15) kloniert. Das resultierende Plasmid mit der Bezeichnung pS5NitNptII wurde in Tabak, Raps und in Kartoffel transformiert.
c) Ergebnisse der GUS Analyse der transgenen Tabak- und Rapspflanzen
Die mit dem Konstrukt pSUN3NitlGUS transformierten Tabak- und Rapspflanzen (Linie UH127 bzw. BN127) wurden sowohl histochemisch als auch quantitativ auf "die Expression des GUS Gens unter der Kontrolle des NITl Promotors analysiert.
Eine Blaufärbung, vergleichbar intensiv wie bei entsprechenden mit dem 35S Promotor/GUS-Konstrukten transformierten Pflanzen, wurde in den , sink' und , source Blättern, Knospen und Kelchblättern detektiert . ' In den Spitzen der Blütenblätter wurde gelegentlich eine schwache Färbung gefunden. Im Gegensatz zum 35S Promotor konnte keine Blaufärbung in den Antheren (Staubbeuteln) nachgewiesen werden. Nur vereinzelt zeigten beim Tabak Pollenkörner eine schwache Blaufärbung. Die Wurzeln der in vi tro Pflanzen zeigten ebenfalls eine Blaufärbung.
Bei der quantitativen Analyse wurde die Aktivität des NITl Promotors mit der Aktivität des 35S Promotors verglichen. Parallel zu den mit pSUN3NitlGUS transformierten Pflanzen (U127) wurden Tabakpflanzen der Linien UH76 und UH77 angezogen, die das GUS Gen unter der Kontrolle des 35S Promotors enthielten. Die Glucuronidaseaktivität wurden nach Extraktion von Blattmaterial durch den Umsatz von 4-Methylumbelliferyl- ß-D-glucuronid quantitativ bestimmt (Jefferson et al . (1987) EMBO J 6:3901-3907). Die Analysen zeigten, dass die Stärke des isolierten Promotors des Gens der Nitrilase 1 aus Arabidopsis thaliana mit dem 35S Promotor vergleichbar ist (Fig.l). d) Ergebnisse der Analyse der Phosphinothricinresistenz der transgenen Tabakpflanzen
Für die Untersuchung der NITl-Promotor gestützten Vermittlung von Resistenz gegen Phosphinothricin wurde der Nitl-Promotor mit dem bar Gen (UH126) kombiniert und in den Vektor pSUN3 , der das nptll Gen unter Kontrolle des nos Promotors enthält, kloniert .
Als Vergleichskontrollen dienten das Plasmid pSUNl4
(SEQ ID NO: 13 ) , das das pat Gen unter der Kontrolle des nosP als selektiven Marker enthält, sowie das Konstrukt UH39, das das bar Gen unter Kontrolle des 35S Promotors im Vektor
PPZP200 trägt. Alle drei Konstrukte wurden in den Agrobakterium tumefaciens
Stamm EHA101 [pEHAlOl] transformiert.
Die resultierenden Stämme sind für die Transformation, wie unter Beipiel 1 beschrieben, eingesetzt worden. Die selektive Regeneration wurde in Gegenwart von 5 mg/1 Phosphinothricin erreicht. Etwa 4 Wochen nach Versuchsstart wurde die Regenerations- effizienz erfasst (Tab. 1) .
Tabelle 1:
Figure imgf000045_0001
Sprosse wurden in Gegenwart von 5 mg/1 PPT bewurzelt (Tab. 2 ]
Tabelle 2:
Figure imgf000045_0002
Figure imgf000046_0001
Das mit dem Nitrilasepromotor ausgerüstete bar Gen lieferte nach Transformation Regenerationseffizienzen, die mit denen des 35S-Promotorkonstruktes vergleichbar sind.
10 Um die Selektion während der Keimung der Samen zu prüfen, wurden reife Samen der transgenen Tabaklinien (UH126) auf MS Medium mit 10mg/l Phosphinothricin ausgelegt. Dabei zeigte sich, dass die Nachkommen, die die Nit/bar Kassette enthielten, keimen und sich zu normalen Pflanzen entwickeln konnten. Somit ist der Nitrilasel
-^ Promoter auch während der Keimungsphase aktiv und kann auch hier selektive Marker exprimieren.
Die Ergebnisse demonstrieren, dass die isolierte Nukleinsäuresequenz die gewünschten vorteilhaften Promotoreigenschaften ^u besitzt, d.h. sie zeigt eine Promotoraktivität, die geeignet ist Selektionsmarker effektiv zu exprimieren und weist keine Aktivität im Pollen auf . •
e) Ergebnisse der Analyse der Kanamycinresistenz der transgenen
25 Tabak-, Raps und Kartoffelpflanzen
Für die Untersuchung der NITl-Promotor gestützten Vermittlung von Resistenz gegen Kanamycin wurde der Nitl-Promotor mit dem Nptll Gen kombiniert. Das resultierende Konstrukt pS5NitNptII wurde in
30 die Agrobakterium tumefaciens Stämme GV3101[mp90] für die Transformation in Tabak und Raps und in C58C1 [Gv2260] für die Transformation in Kartoffel transformiert.
35 Die resultierenden Stämme sind für die Transformation, wie unter
Beispiel 2 beschrieben, eingesetzt worden. Die selektive Regene-
• ration wurde in Gegenwart von 100 mg/1 (18 mg/1 Raps und 50mg/l
Kartoffel) Kanamycin erreicht. Etwa 4 Wochen nach Versuchsstart wurde die Regenerationseffizienz erfasst . Nach erfolgter Spros- ' 0 sknospenbildung bzw. der Bewurzelung der Sprosse auf kanamycin- haltigen Medium wurden die resistenten Transforanten gezählt und deren Zahlen verglichen. Eine PCR anhand genomischer DNA der regenerierten Pflanzen, mit der das Nptll Gen nachgewiesen wurde, zeigte den hohen Anteil der transgenen Pflanzen. 5
Figure imgf000046_0002
Figure imgf000047_0001
Bei der Kartoffeltransformation ergab eine Analyse der Spross- knopsenbildung, dass bei der Verwendung des nos-Promotors bzw. des Nitl-Promotors zur Expression des Nptll Gens jeweils 85 % der Explantate Sprossknospen bilden. Die Analyse der transgenen Pflanzen mittels PCR auf Integration des Nptll Gens zeigte bei 96 % der nosP-Nptll Pflanzen und 100 % der Nitl-P-Nptll Pflanzen die Transgenizität .
Das mit dem Nitrilasepromotor ausgerüstete Nptll Gen lieferte nach Transformation Regenerationseffizienzen, die mit denen von NOS-Promotorkonstrukten vergleichbar sind. Die Ergebnisse demonstrieren, dass die isolierte Nukleinsäuresequenz die gewünschten vorteilhaften Promotoreigenschaften besitzt, d.h. sie zeigt eine Promotoraktivität, die geeignet ist Selektionsmarker effektiv zu exprimieren.
Vergleichsbeispiel 1: Untersuchungen zur Eignung des Ubiquitin-Promotors
a) Klonierung des Ubiquitin Promotor aus Arabidopsis thaliana
Der Ubiquitin Promotor wurde mittels PCR aus genomischer Arabidopsis thaliana DNA mit den Primern ubi5 und ubi3 amplifiziert .
ubi5 (SEQ ID NO: 8) :
5 λ -CCAAACCATGGTAAGTTTGTCTAAAGCTTA-3 v
ubi3 (SEQ ID NO: 9) :
5 -CGGATCCTTTTGTGTTTCGTCTTCTCTCACG-3 λ
Reaktionsansatz :
37,5 μl H20
5 μl 10X Reaktionspuffer ("genomic PCR") 4 μl dNTP mix (jeweils 2,5 mM)
2,2 μl 25 mM Mg(0Ac)2 (Endkonzentration 1,1 mM)
1 μl Primer ubi3 (10 μM)
1 μl Primer ubi5 (10 μM)
0,5 μl Pfu-turbo polymerase mix 1 μl Genomische Arabidopsis DNA (ca. 250 ng) PCR-Bedingungen :
1 Zyklus mit 5 min. bei 94°C
25 Zyklen mit 94°C für 30 sec, 52°C für 1 min. und 72°C für 1 min.
1 Zyklus mit 52°C für 1 min. und 72°C für 10 min., anschließend Kühlung auf 4°C bis zur Weiterverarbeitung.
Das entstandene PCR Fragment wurde als HindiII/BamHI Fragment in das mit Hindlll/BamHI geschnittene Plasmid pGUSINT37 kloniert (pUBI42GUS) und mittels Sequenzanalyse verifiziert.
b) Klonierung des Ubiquitin Promotors vor das PAT-Gen
pur die Untersuchung der Ubiquitin-Promotor gestützten Vermittlung von Resistenz gegen Phosphinothricin wurde der Ubiquitin -Promotor als BamHI/HindiII Fragment vor das Phosphinothricin Resistenzgen in das BamHI/HindiII geschnittene Plasmid pSUN3PatNos kloniert. Das resultierende Plasmid pSUN3UBIPat wurde unter Verwendung des Agrobacterium tumefaciens Stamm EHA101 zur Tabaktransformation verwendet. Die selektive Regeneration der Tabakpflänzchen erfolgte einerseits auf Phosphinothricin (5 mg/1) und andererseits zur Kontrolle auf Kanamycin (100 mg/1) .
c) Ergebnisse der Analyse der Phosphinothricinresistenz der transgenen Tabakpflanzen
Im Gegensatz zur Selektion auf Kanamycin, die normal verlief, konnten unter Selektion auf Phosphinothricin keine Kalli oder Sprosse erhalten werden. So ist der Ubiquitin Promotor nicht geeignet für die Expression eines selektiven Markers für den Agrobacterium tumefaciens-vermittelten Gentransfer mit anschließender Regeneration von Geweben.
Vergleichsbeispiel 2 : Untersuchungen zur Eignung des Squalen
Synthase (SQS) Promotors
a) Klonierung des Squalen Synthase (SQS) Promotors aus Arabidopsis thaliana
Der Squalen Synthase Promotor wurde mittels PCR aus genomischer Arabidopsis thaliana DNA mit den Primern sqs5 und sqs3 ampli- fiziert .
sqs5 (SEQ ID NO: 10): 5 x -GTCTAGAGGCAAACCACCGAGTGTT-3 sqs3 (SEQ ID NO: 11): 5 v-CGGTACCTGTTTCCAGAAAATTTTGATTCAG-3
Reaktionsansatz
37,5 μl H20
5 μl 10X Reaktionspuffer ("genomic PCR")
4 μl dNTP mix (jeweils 2,5 mM)
2,2 μl 25 mM Mg(OAc) (Endkonzentration 1,1 mM)
1 μl Primer sqs3 (10 μM) (10 μM)
1 μl Primer sqs5 (10 μM) 0,5 μl Pfu-turbo polymerase mix 1 μl Genomische Arabidopsis DNA (ca. 250 ng)
PCR- -Bedingungen
•1 ZZyykklluuss mit 5 min. bei 94°C 25 ZZyykklleenn mit 94°C für 30 sec, 52°C für 1 min. und 72°C für 1 min. 1 Zyklus mit 52°C für 1 min. und 72°C für 10 min., anschliessend Kühlung auf 4°C bis zur Weiterverarbeitung.
Das entstandene PCR Fragment wurde als Xfoall/BamHI Fragment in das- mit Xfoall/BamHI geschnittene Plasmid pGUSINT37_..kloniert (pSQSPGUS) und mittels Sequenzanalyse verifiziert.
b) Klonierung des Squalen Synthase Promotors vor das PAT-Gen
Für die Untersuchung der Squalen Synthase -Promotor gestützten Vermittlung von Resistenz -gegen Phosphinothricin wurde der Squalen Synthase-Promotor als BamKI/Sall Fragment vor das Phosphinothricin Resistenzgen in das BamEl/Sall geschnittene Plasmid pSUN3PatNos kloniert. Das resultierende Plasmid pSUN3SQSPat wurde unter Verwendung des Agrobacterium tumefaciens Stamm EHA101 zur Tabaktransformation verwendet. Die selektive Regeneration der Tabakpflänzchen erfolgte einerseits auf Phosphinothricin (5mg/l) und andererseits zur Kontrolle auf Kanamycin (100mg/l) .
c) Ergebnisse der Analyse der Phosphinothricinresistenz der' transgenen Tabakpflanzen
Im Gegensatz zur Selektion auf Kanamycin, die normal verlief, konnten unter Selektion auf Phosphinothricin keine Kalli oder Sprosse erhalten werden. So ist der Squalensynthase-Promotor nicht geeignet für die Expression eines selektiven Markers für den Agrobacterium tumefaciens-venαittelten Gentransfer mit anschließender Regeneration von Geweben.
Vergleichsbeispiel 3 : Testung der Promotoraktivität des 5 Ubiquitin- und Squalen Synthase-Promotors mittels Partikelkanone
Um transient die Aktivität des Ubiquitin- und des Squalen Synthase-Promotors zu testen, wurden sterile Tabakblätter mit
10 Plasmid-DNA der Plasmide pUBl42GUS, pSQSPGUS und pGUSINT37 mit der Partikelkanone "Biolistics" von BioRad beschossen. Dabei wurden Microcarrier (25 μg Gold, Hereus 0,3 bis 3 μm) mit 10 μg Plasmid DNA, 2,5 M CaC12, und 0,1 M Spermidine behandelt, mit Alkohol gewaschen und bei einem Vakuum von 26 inch und einem
15 Druck von 1100 psi auf die Blätter, die auf MS-Medium lagen, geschossen. Die Explantate wurden anschließend für 24 h in MS-Medium mit 2 % Sucrose inkubiert und dann mit X-gluc histochemisch gefärbt .
20 Der Ubiquitin-Promotor und der Squalen Synthase-Promotor zeigten hierbei im Gegensatz zum Vergleichskonstrukt pGUSINT37, wo das GUS Gen unter der Kontrolle des 35S Promotors exprimiert wurde,
— - nur sehr wenige und sehr_schwache Punkte mit...Gπs.-F_ärbung_._ .
Dies zeigt, dass die Aktivität des Ubiquitin- und des Squalen
25 Synthase-Promotors deutlich schwächer ist, als die des CaMV3SS- Promotors .
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Claims

Patentansprüche
1. Transgene Expressionskassette zur Expression von Nuklein- säuresequenzen kodierend für Selektionsmarker enthaltend in 5 ' -3 ' Richtung
a) einen Promotor gemäß SEQ ID NO: 1, oder ein funktionelles Äquivalent oder äquivalentes Fragment desselben, das im wesentlichen die gleiche Promotoraktivität wie der
Promotor gemäß SEQ ID NO: 1 besitzt, und
b) eine transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz kodierend für einen Selektionsmarker, und
c) eine in pflanzlichen Zellen oder pflanzlichen Organismen funktionelle Terminatorsequenz,
wobei a) oder b) funktionell miteinander so verknüpft sind, dass eine transgene Expression der Nukleinsäuresequenz kodierend für einen Selektionsmarker in einer pflanzlichen Zelle oder einem pflanzlichen Organismus ermöglicht wird.
2. Transgene Expressionskassette nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das äquivalente Fragment durch eine Sequenz mit der SEQ ID NO: 18 oder 19 beschrieben wird.
3. Transgene Expressionskassette nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Selektionsmarker ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus positiven Selektionsmarkern,
-negativen Selektionsmarkern und Faktoren die einen Wachstumsvorteil gewähren.
4. Transgene Expressionskassette nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Selektionsmarker ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Proteinen die eine Resistenz gegen Antibiotika, Metabolismus-Inhibitoren, Herbizide oder Biozide verleihen.
5. Transgene Expressionskassette nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Selektionsmarker ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Proteinen die eine Resistenz verleihen gegen Phosphinothricin, Glyphosat, Bromoxynil, Dalapon, 2-Desoxyglucose-6-phosphat, Tetracycline, Ampicillin, Kanamycin, G 418, Neomycin, Paromomycin, Bleomycin, Zeocin, Hygromycin, Chloramphenicol, Sulfonyl- harnstoff-Herbizide, Imidazolinon-Herbizide.
6. Transgene Expressionskassette nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Selektionsmarker ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Phosphino- thricinacetyltransferasen, 5-Enolpyruvylshikimat-3- phosphatsynthasen, Glyphosatoxidoreduktasen, Dehalogenase , Nitrilasen, Neomycinphosphotransferasen, D0GR1-Genen, Acetolactatsynthasen, Hygromycinphosphotransferasen, Chloramphenicolacetyltransferasen, Streptomycinadenylyl- transferasen, ß-Lactamasen, tetA Genen, tetR Genen, Iso- pentenyltransferasen, Thymidinkinasen, Diphtheriatoxin A, Cytosindea inase (codA) , Cytochrom P450, Haloalkande- halogenasen, iaaH Gene, tms2 Gene, ß-Glucuronidasen, Mannose-6-phosphat-Isomerasen, UDP-Galaktose-4-Epimerasen..
7. Transgene Expressionskassette nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Selektionsmarker kodiert wird durch Nukleinsäuresequenzen
i) beschrieben durch SEQ ID NO: 2 oder 3, oder
ii) beschrieben durch oder enthalten in den Sequenzen beschrieben durch die GenBank Acc.-No.: X17220, X05822, M22827, X65195, AJ028212, X17220, X05822 M22827, X65195, AJ028212, X63374, M10947, AX022822, AX022820, E01313, J03196, AF080390, AF234316, AF080389, AF234315, AF234314, U00004, NC001140, X51514, AB049823, AF094326, X07645,
X07644, A195'47, A19546, A19545, 105376, 105373, X74325, AF294981, AF234301, AF234300, AF234299, AF234298, AF354046, AF354045, X65876, X51366, AJ278607, L36849, AB025109, AL133315.
8. Transgene Expressionskassette nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass
a) die zu exprimierende Nukleinsäuresequenz kodierend für einen Selektionsmarker mit weiteren genetischen Kontrollsequenzen funktionell verknüpft ist, oder b) die Expressionskassette zusätzliche Funktionselemente enthält, oder
c) a) und b) gegeben sind.
9. Transgene Expressionskassette nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Terminatorsequenz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus dem OCS (Octopin- Synthase) -Terminator, dem NOS (Nopalin-Synthase) -Termina- tor,dem Terminator des Cathepsin D Inhibitor Gens aus Kartoffel und dem Terminator der Speicherproteingens VfLElB3 aus der Ackerbohne .
10. Vektoren enthaltend eine Expressionskassette gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9.
11. Verfahren zur Selektion transformierter pflanzlicher Zellen oder pflanzlicher Organismen, dadurch gekennzeichnet, dass eine transgene Expressionskassette enthaltend in 5 '-3' Richtung
a) einen Promotor gemäß SEQ ID NO: 1 oder ein funktionelles Äquivalent oder äquivalentes .Fragment, desselben, _ das im wesentlichen die gleiche Promotoraktivität wie der Promotor gemäß SEQ ID NO: 1 besitzt, und
b) eine transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz kodierend für einen Selektionsmarker, und
c) eine in Pflanzen funktionelle Terminatorsequenz,
wobei a) oder b) funktionell miteinander so verknüpft sind, dass eine transgene Expression der Nukleinsäuresequenz kodierend für einen Selektionsmarker in einer pflanzlichen Zelle oder pflanzlichen Organismen ermöglicht wird,
in besagte pflanzliche Zelle oder besagten pflanzlichen Organismus eingebracht wird, die Expression des Selektions- markers erfolgt und eine Selektion der transformierten pflanzlichen Zellen oder pflanzlichen Organismen ausgeübt wird.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das äquivalente Fragment durch eine Sequenz mit der SEQ ID NO: 18 oder 19 beschrieben wird.
13. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Selektionsmarker ausgewählt ist aus den in den Ansprüchen 2, 3, 4, 5 oder 6' beschriebenen Gruppen von Selektionsmarkern.
5
14. Transgener Organismus transformiert mit einer Expressionskassette gemäß den Ansprüchen 1 bis 9 oder einem Vektor gemäß Anspruch 10.
10 15. Transgener Organismus nach Anspruch 14 ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Bakterien, Hefen, Pilzen, tierischen und pflanzlichen Organismen
16. Transgener Organismus nach einem der Ansprüche 14 oder 15 15 ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Arabidopsis, Tomate, Tabak, Kartoffeln, Mais, Raps, Weizen, Gerste, Sonnenblumen, Hirse, Rübe, Roggen, Hafer, Zuckerrübe, Bohnengewächse und Soja.
20 17. Zellkulturen, Teile oder transgenes Vermehrungsgut abgeleitet von einem transgenen Organismus nach einem der Ansprüche 14 bis 16.
18. Verwendung eines transgenen Organismus nach einem der 25 Ansprüche 14 bis 16 oder von diesem abgeleitete Zellkulturen, Teile oder transgenes Vermehrungsgut nach Anspruch 17 zur Herstellung von Nahrungs-, Futtermitteln, Saatgut, Pharmazeutika oder Feinchemikalien.
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