WO2004065537A2 - Expressionskassette mit promotoren der stärkesynthase 3 zur expression von nukleinsäuren in stärkehaltigen geweben von pflanzen - Google Patents

Expressionskassette mit promotoren der stärkesynthase 3 zur expression von nukleinsäuren in stärkehaltigen geweben von pflanzen Download PDF

Info

Publication number
WO2004065537A2
WO2004065537A2 PCT/EP2004/000241 EP2004000241W WO2004065537A2 WO 2004065537 A2 WO2004065537 A2 WO 2004065537A2 EP 2004000241 W EP2004000241 W EP 2004000241W WO 2004065537 A2 WO2004065537 A2 WO 2004065537A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
nucleic acid
sequences
acid sequence
sequence
seq
Prior art date
Application number
PCT/EP2004/000241
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2004065537A3 (de
Inventor
Ute Heim
Karin Herbers
Uwe Sonnewald
Eric Glickmann
Original Assignee
Sungene Gmbh & Co. Kgaa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sungene Gmbh & Co. Kgaa filed Critical Sungene Gmbh & Co. Kgaa
Priority to US10/542,516 priority Critical patent/US7563944B2/en
Priority to CA002513289A priority patent/CA2513289A1/en
Priority to EP04702308A priority patent/EP1604027A2/de
Publication of WO2004065537A2 publication Critical patent/WO2004065537A2/de
Publication of WO2004065537A3 publication Critical patent/WO2004065537A3/de

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
    • C12N15/823—Reproductive tissue-specific promoters
    • C12N15/8234—Seed-specific, e.g. embryo, endosperm

Definitions

  • the invention relates to methods for transgenic expression of nucleic acid sequences predominantly in starch-containing tissues of plants, preferably in fruits, roots, seeds or tubers, the nucleic acid sequence being expressed under the control of a starch synthase 3 promoter.
  • transgenic expression cassettes and vectors comprising a promoter of a starch synthase 3, and the use thereof for the production of food, feed, seeds, pharmaceuticals or fine chemicals.
  • the aim of biotechnological work on plants is to produce plants with improved properties, for example to increase agricultural productivity.
  • Transcriptional regulatory sequences or promoters that regulate the expression of genes in plants are essential elements of plant biotechnology.
  • Various promoters that have been used successfully for the expression of heterologous genes in plants are available and include both plant promoters (such as the promoters of the heat shock protein hsp80 from cauliflower; US 5,612,472) and promoters from other non-plant sources, such as plant promoters Viruses (eg the 35S promoter of the cauliflower mosaic virus) or plants infecting bacteria (eg the promoter of octopin synthase from Agrobacterium; Leisner and Gelvin (1988) Proc Natl Acad Sei USA 85 (8) .2553-2557).
  • plant promoters such as the promoters of the heat shock protein hsp80 from cauliflower; US 5,612,472
  • promoters from other non-plant sources such as plant promoters Viruses
  • constitutive promoters are often used for the expression of heterologous nucleic acid sequences in transgenic plants, which regulate the expression of a gene product in the plant largely at any time and in any tissue.
  • a targeted expression of genes in certain parts of plants or at certain times of development is not possible with these promoters.
  • the transgenic protein to be expressed is thus expressed in places and at times when it is not required, which, for example, consumes energy unnecessarily, causes metabolic changes and can thus have an adverse effect on the growth of the plant.
  • tissue and development-specific promoters are of great interest.
  • Various such promoters are known.
  • the promoter of the "sucrose-binding protein-like gene" (SBP) from Vicia faba mediates strong and specific expression in seeds of rapeseed and other plants (WO 00/26388).
  • fruits, seeds, beets or tubers are of high agro-economic relevance. They serve to store proteins, oils and carbohydrates (especially starch). Such tissues are usually photosynthetically inactive and are also referred to as sink tissues or sink organs. They rely on the import of photoassimilates from the photosynthetically active parts of plants (source organs or source tissues). Both classic breeding and biotechnological processes were used to improve specific aspects of fruit and tuber quality. High quality, ripe fruits result from a number of coordinated biochemical and metabolic changes that can occur not only during ripening but also during fruit development. These changes determine the final quality and the amount of fruit.
  • Examples of altered properties, for example, in tomato fruits, are increased sucrose import, conversion of starch, accumulation of various organic acids, modifications ⁇ of pigments and changes in fungicidal and insecticidal compounds.
  • Such results can be achieved by overexpressing genes / proteins or by inhibition using double-stranded RNA, antisense RNA or co-suppression.
  • sink tissues act as a storage location for the most important plant raw materials, promoters that enable selective expression in these tissues are of particular interest for plant biotechnology and allow a targeted modification of these tissues and their ingredients.
  • the promoters mentioned show ⁇ expression only in the late phases of fruit development and can therefore only be used to a limited extent.
  • the promoters TFM7 and TFM9 (US 5,608,150) are active during the fruit development in green and yellow stages.
  • the fruit-specific regulation of the actinidine promoter from kiwi has been demonstrated for expression in petunias (Lin et al. (1993) Plant Mol Biol 23: 489-499).
  • Thi-1, MADS2 and a promoter fusion between Thi-1 and the actin promoter of the melon regulate the expression of heterologous genes specifically in apples (WO 00/66610).
  • promoters are, for example, promoters with a specificity for tubers, storage roots or roots, such as the tuber-specific patatin promoter class I (Bevan et al. (1986) Nucl Acids Res 14: 4625-4638), the promoter of the cathepsin D inhibitor Potato (Herbers et al. (1994) Plant Mol. Biol. 26: 73-83), the starch synthase promoter (GBSS1) or the Spora in promoter.
  • Other genes with specific high activity in tubers are, for example, the promoter of the gene for ADP glucose pyrophosphorylase (Müller-Röber et al. (1990) Mol Gen Genet 224: 136-146), sucrose synthase (Salanoubat and Belliard (1987) Gene 60:47 -56; Salanoubat and Belliard (1989)
  • the promoters do not have the desired level of expression and / or are only active in a few plant species.
  • a large number of biosynthetic enzymes such as e.g. the starch synthases (EC 2.4.1.21) are involved.
  • Starch synthases serve to extend the chain of ⁇ -1,4-glucans by transferring glucosyl units from ADP-glucose to the non-reducing ends of existing ⁇ -1,4-glucans.
  • GBSS granule bound starch synthase
  • three further classes of starch synthases in plants are described SSI (wheat: Li et al. (1999) Theor Appl Genet 98: 1208-1216; GenBank Acc.-No .: U48227; rice : Baba, et al.
  • a first subject of the invention relates to methods for the targeted, transgenic expression of nucleic acid sequences in at least one starch-containing tissue of a plant, the following steps being included
  • transgenic expression cassette into plant cells, the transgenic expression cassette containing at least the following elements
  • promoter sequences and a further nucleic acid sequence are functionally linked to one another and said further nucleic acid sequence is heterologous with respect to the promoter sequence
  • Another object of the invention therefore relates to an isolated nucleic acid sequence comprising the promoter of starch synthase 3 from potato.
  • Said isolated 5 nucleic acid sequence preferably comprises a nucleic acid sequence selected from
  • fragments of at least 25 contiguous nucleotides preferably at least 50 contiguous nucleotides, particularly preferably at least 100 contiguous nucleotides of the sequence according to SEQ ID NO: 1 or 44 or the sequences complementary thereto, 3.
  • Sequences which have a homology of at least 50%, preferably 70%, preferably at least 80%, particularly preferably at least 90%, very particularly preferably at least 95%, most preferably 99% of the sequence according to SEQ ID NO: 1 or 44 or the sequences complementary thereto, wherein the homology extends over a length of at least 100 base pairs, preferably at least 200 base pairs, particularly preferably of at least 300 base pairs, very particularly preferably of at least 400 base pairs, most preferably over the entire length of the sequence according to SEQ ID NO: 1 or 44 stretches.
  • homology between two nucleic acids is understood to mean the identity of the nucleic acid sequence over the respectively specified sequence length, which is determined by comparison using the program algorithm GAP (Wisconsin Package Version 10.0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), Madison, USA) is calculated by setting the following parameters:
  • Gap Weight 12 Length Weight: 4
  • transgenic expression cassettes such as e.g. can be used in the method according to the invention.
  • the transgenic expression cassettes preferably comprise for the targeted, transgenic expression of nucleic acid sequences in at least one starch-containing tissue of a plant,
  • the expression cassettes according to the invention can contain further genetic control sequences and / or additional functional elements.
  • the transgenic expression cassettes can preferably enable expression of a protein encoded by said nucleic acid sequence and / or expression of a sense RNA, antisense RNA or double-stranded RNA encoded by said nucleic acid sequence by means of the nucleic acid sequence to be expressed.
  • the invention further relates to transgenic expression vectors which contain one of the expression cassettes according to the invention.
  • the invention further relates to transgenic organisms which contain one of the expression cassettes or expression vectors according to the invention.
  • the organism can be selected from the group consisting of bacteria, yeasts, fungi, non-human animal and plant organisms or cells, cell cultures, parts, tissues, organs or propagation material derived from them, the organism is preferably selected from the group of agricultural useful plants.
  • the expression of the nucleic acid sequence to be expressed transgenically in at least one starch-containing tissue e.g. the potato tuber, beet, root, seed or tomato fruit
  • the expression of the nucleic acid sequence to be expressed transgenically in at least one starch-containing tissue is preferably higher than in another tissue.
  • Another object relates to the use of the isolated nucleic acid sequences, transgenic expression vectors or transgenic organisms according to the invention for the transgenic expression of nucleic acids and / or proteins. It is particularly preferred to use the said transgenic organisms or cells, cell cultures, parts, tissues, organs or propagation material derived therefrom for the production of foodstuffs, animal feed, seeds, pharmaceuticals or fine chemicals, the fine chemicals preferably enzymes, vitamins, amino acids, Sugar, saturated or unsaturated fatty acids, natural or synthetic flavors, aromas or colors.
  • the invention also encompasses processes for producing said foodstuffs, animal feed, seeds, pharmaceuticals or fine chemicals using the transgenic organisms according to the invention or cells, cell cultures, parts, tissues, organs or objects derived therefrom.
  • a particular advantage of the starch synthase 3 pro otor according to the invention is their activity in starchy tissues, preferably during the entire development and storage of potato tubers and its high activity in green tomato fruits.
  • the expression of the natural starch synthase 3 from potato ie the expression activity of the non-transgenic, homologous combination of the starch synthase 3 promoter and the coding region of the starch synthase 3 gene
  • the heterologous transgenic expression cassettes provided in the context of this invention show no relevant expression in leaves, which is of great importance for numerous biotechnological applications.
  • the promoters of starch synthase-3 provided in the context of this invention, in particular the SSS3 promoter from potato, mediate both a high expression during the entire tuber development into the late storage phase and a high tissue specificity, which is of significant value for the use underlines in transgenic plants.
  • SSS3 promoter also produces strong expression in the fruit, predominantly in the green fruit. Weak side activities were only found in 'pollen and seeds. Of particular interest is a pronounced activity after the harvest and during storage of the trange plants (especially tubers). This makes the promoters according to the invention suitable for so-called "post-harvest” applications.
  • the SSS3 promoter according to the invention is of particular value for plant biotechnology. Due to the function of the soluble starch synthase-3 in the starch metabolism and the expression pattern found, it can be expected that the promoter in all starch-containing tissues is preferably active in fruits, seeds, beets and tubers of other plants. The use in approaches which serve to modify the carbohydrate and / or starch metabolism is very particularly advantageous here. Because of their fruit or tuber specificity, the promoters according to the invention can be used in particular to improve the quality of the developing fruit or tuber or to influence the ripening process.
  • Nucleic acid sequences are preferably expressed transgenically under the control of the promoters according to the invention, which modulate the sugar or starch metabolism, modify the ingredients, improve nutritional values, change the sink-source relationships, taste components, pathogen resistance, tissue consistency, etc bein influence.
  • an SSS3 promoter can be used to modify flavanoids and carotenoids. Specific uses are listed below.
  • the genes which are regulated by the promoter according to the invention can be plant genes, fruit- and tuber-specific genes or heterologous genes whose expression in the fruit or tubers is desired.
  • Promoter of a starch synthase-3 gene or "starch synthase-3 promoter” (as a result also of the SSS3 promoter) generally means the natural regulatory region of a gene coding for a starch synthase-3.
  • the starch synthase-3 is also known as soluble starch synthase-3 ("soluble starch synthase 3, SSS3).
  • promoters which have a sequence region of at least 250 base pairs, preferably at least 500 base pairs, particularly preferably 1000 base pairs, most preferably at least 2000 base pairs in the 5 'direction in front of the ATG start codon of said genomic sequences encoding a starch kesynthase-3.
  • strong synthase means any enzymatically active peptide, polypeptide, oligopeptide, protein or enzyme molecule which is at least capable of transferring a glucosyl unit from ADP-glucose to an ⁇ -1,4-glucan molecule, as well as fra- elements of said enzymatically active molecules.
  • Starch synthase-3 "soluble starch synthase 3" or “SSS3” means a starch synthase according to the above definition which also has one or more of the following properties:
  • nucleotide sequence comprising at least 20 nucleotides of a sequence according to SEQ ID NO: 5, 7, 9, 11, 13, 15 or 17;
  • nucleotide sequence comprising a sequence which has at least 85% or more homology to a sequence according to SEQ ID NO: 5, 7, 9, 11, 13, 15 or 17;
  • It comprises a sequence of at least 10 contiguous amino acids, preferably at least 20 contiguous amino acids, particularly preferably at least 50 contiguous Amino acids of a sequence as shown in SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16 or 18;
  • amino acid sequence encoding the starch synthase comprises at least one sequence motif selected from the group consisting of:
  • NGIDPDIWDP SEQ ID NO: 29
  • GI L / V / I
  • NGIDPDIWDP Y / L
  • T / N D
  • N / K FIP
  • SSS3 proteins Other motifs characteristic of SSS3 proteins can easily be derived from a comparison of known SSS3 protein or nucleic acid sequences (see FIG. 7).
  • GAP Garnier Weight: 8 ⁇ Length Weight: 2
  • a sequence which has a homology of at least 85% on a protein basis with the sequence SEQ ID NO: 6 over the entire length is understood to be a sequence which, when compared with the sequence SEQ ID NO: 6, according to the above program algorithm with the above parameter set has a homology of at least 85%.
  • the SSS3 promoter means nucleotide sequences which comprise a nucleic acid sequence selected from
  • fragments of at least 25 contiguous nucleotides preferably at least 50 contiguous nucleotides, particularly preferably at least 100 contiguous nucleotides of a sequence according to SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 or 44 or the sequences complementary thereto,
  • Base pairs particularly preferably from at least 300 base pairs, very particularly preferably from at least 400 base pairs, most preferably from at least 500 base pairs.
  • an SSS3 promoter comprises the potato SSS3 promoter according to SEQ ID NO 1 or 44 or fragments thereof with a length of at least 50 nucleotides, preferably 100 nucleotides.
  • an SSS3 promoter has essentially the same promoter activity as one of the promoters according to SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 or 44, preferably like the promoter according to SEQ ID NO: 1 or 44 deviate below and upwards compared to a comparison value.
  • Preference is given to sequences whose level of expression, measured on the basis of the transcribed mRNA or as a result Translated protein, under otherwise unchanged conditions, quantitatively by no more than 50%, preferably 25%, particularly preferably 10%, obtained from a comparison value obtained using the promoters described by SEQ ID NO: 1 or 44.
  • a promoter activity is said to be “essentially the same” with respect to an SSS3 promoter if the transcription of a certain nucleic acid sequence to be expressed transgenically shows a targeted expression in at least one starch-containing tissue under the control of the functionally equivalent promoter under otherwise unchanged conditions.
  • Starch-containing tissues means tissues which have a starch content at least at a point in time during their development which can be demonstrated by means of a strength test. Staining with Lugol's solution is preferred as proof of strength (Lugol's solution: e.g. dissolve 2 g KJ in 5 ml water, dissolve 1 g iodine in it and add 300 ml water). The coloring takes place until a recognizable shade of blue (approx. 15 min at RT) and can be stopped by washing with water.
  • the starch content can also be measured photometrically using the method described in Hajirezaei et al. (1994, Planta 192: 16-30).
  • starchy tissue storage tissue of a vegetable tuber, beet or fruit such as e.g. the potato tuber, the beet or tomato fruit.
  • Starchy tissue also includes “sink tissue” of starch-producing plants.
  • sink fabric means fabrics that are net importers of photosynthetically fixed carbon dioxide and are generally not photosynthetically active. Examples of sink fabrics are: roots, fruits, beets, tubers and seeds.
  • “Selective” 'preferably means in relation to expression in a starch-containing tissue that the expression under control of the promoters of the invention preferably in the first fabric at least ten times, most preferably at least 5 five, tens of times, most preferably at least one hundred times is than in a second tissue, the starch content in the first tissue (determined, for example, by dyeing with Lugol's solution) at least twice, preferably at least five times, particularly preferably at least ten times, on
  • starch content in the second fabric Most preferably at least fifty times the starch content in the second fabric.
  • “specifically” means that expression under the control of one of the promoters according to the invention in a starchy “sink” tissue such as the tubers is preferably at least ten times, very particularly preferably
  • 15 is at least 50 times, most preferably at least 100 times, than in a "source fabric" such as the leaves.
  • “Otherwise unchanged conditions” means that the expression which is initiated by one of the transgenic expression cassettes to be compared is not modified by combination with additional genetic control sequences, for example enhancer sequences. Unchanged conditions also means that all framework conditions such as plant type, stage of development of plants, breeding conditions, assay conditions (such as buffer, temperature, substrates etc.) are kept identical between the expressions to be compared.
  • the expression within at least one specific starch-containing tissue is preferably essentially constant over all development stages.
  • “Substantially constant” in this context means preferably that the standard deviation of expression between the different development times of each tissue based on the statistical mean of the expression of all 35 development time points is less than '50%, preferably 20%, more preferably 10%, most preferably 5%.
  • the invention further relates to the use of at least one nucleic acid sequence or a part thereof in methods for identifying and / or isolating promoters of genes which code for said nucleic acid sequence, said nucleic acid sequence coding for an amino acid sequence which has at least one sequence motif according to SEQ ID NO: 19, 20, 21, 22,
  • Said nucleic acid sequence preferably codes for an amino acid sequence comprising a sequence according to SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16 or 18. Particularly preferably, said nucleus
  • 15 small acid sequence a sequence according to SEQ ID NO: 5, 7, 9, 11, 13, 15 or 17.
  • Part in relation to the nucleic acid sequence preferably means a sequence of at least 15 bases, preferably 25 bases, particularly preferably 50 bases, on most preferably 100 bases.
  • the invention also encompasses methods for identifying and / or isolating promoters of SSS3 genes, with at least one nucleic acid sequence or a part thereof being used in the identification and / or isolation, said nucleic acid sequence coding for an amino acid sequence which min.
  • Said nucleic acid sequence preferably codes for an amino acid sequence comprising a sequence according to SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16 or
  • said nucleic acid sequence comprises a sequence according to SEQ ID NO: 5, 7, 9, 11, 13, 15 or 17. “Part” in relation to the nucleic acid sequence preferably means a sequence of at least 15 bases, preferably 25 bases, more preferably 50 bases, most preferably 10E bases. In a preferred one
  • the method according to the invention is based on the polymerase chain reaction, wherein said nucleic acid sequence or a part thereof is used as a primer.
  • RNA sequence for example a gene transcript such as, for example, a cDNA
  • iPCR inverse PCR
  • / 'TAIL PCR Thermal Asymmetry Interlaced PCR
  • the large number of ring-shaped DNA molecules which are formed also contain those which contain the known sequence (for example the sequence coding for the homologous protein). Based on this, the ring-shaped molecule can be amplified by PCR using a pair of primers in which both primers can attach to the known sequence section.
  • the "TAIL-PCR” is based on the use of, on the one hand, a set of successively shortened, highly specific primers which attach to the known genomic sequence (for example the sequence coding for the homologous protein), and on the other hand a set of shorter random primers with a low melting temperature, so that there is a more sequence-unspecific attachment to the known genomic sequence flanking genomic DNA.
  • the attachment of the primers to the DNA to be amplified can be designed in such a way that a specific amplification of the desired target sequence is possible.
  • Promoter sequences can be easily found, for example, in various organisms whose genomic sequence is known, such as, for example, Arabidopsis thaliana, Brassica napus, Nicotiana tabacum, Solanum tuberosum, Helianthium a nuus, Linum sativum by comparing homology in databases.
  • genomic sequence such as, for example, Arabidopsis thaliana, Brassica napus, Nicotiana tabacum, Solanum tuberosum, Helianthium a nuus, Linum sativum by comparing homology in databases.
  • SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 or 44 For this purpose, one can preferably start from the coding regions of the genes whose promoters are described by SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 or 44.
  • the corresponding homologous genes can be found in others Plant species by screening databases or Genbanke ⁇ (using appropriate gene probes) can be easily identified in the manner familiar to those skilled in the art.
  • the invention further relates to methods for producing a transgenic expression cassette with specificity for starch-containing tissues, comprising the following steps:
  • nucleic acid sequence codes for an amino acid sequence which has at least one sequence according to SEQ ID NO: 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 , 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 or 39 or a variation given for these sequences
  • Said nucleic acid sequence preferably codes for an amino acid sequence comprising a sequence according to SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16 or 18. Particularly preferably said nucleic acid sequence comprises a sequence according to SEQ ID NO: 5, 7, 9, 11, 13 , 15 or
  • Part in relation to the nucleic acid sequence preferably means a sequence of at least 15 bases, preferably 25 bases, particularly preferably 50 bases, most preferably 100 bases.
  • the method according to the invention is based on the polymerase chain reaction, the said nucleotide
  • Suitable SSS3 promoters also include natural or artificial mutations of the promoter sequences described under SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 or 44. "Mutation” means substitution, addition, deletion, inversion or insertion of one or more nucleotide residues.
  • the present invention also encompasses those nucleotide sequences which are obtained by modifying an SSS3 promoter according to SEQ ID NO: 1,
  • the aim of such a modification can be to further narrow down the sequence contained therein or e.g. also inserting or removing restriction endonuclease sections, removing unnecessary DNA or adding
  • Transition means a base pair exchange of a purine / pyrimidine pair into another purine / pyrimidine pair (eg AT against GC).
  • Transversion means a base pair exchange of a purine / pyrimidine pair for a pyrimidine / purine pair (eg AT against TA).
  • Deletion means the removal of one or more base pairs.
  • Insertion means the introduction of one or more base pairs.
  • Manipulations such as restriction, "chewing-back” or filling in overhangs for "blunt ends” can provide complementary ends of the fragments for the ligation.
  • Analogous results can also be obtained using the polymerase chain reaction (PCR) using specific oligonucleotide primers.
  • Methods for mutagenizing nucleic acid sequences include, for example, the use of oligonucleotides with one or more mutations in comparison to the region to be mutated (e.g. as part of a "site-specific mutagenesis").
  • primers with approximately 15 to approximately 75 nucleotides or more are used, preferably approximately 10 to approximately 25 or more nucleotide residues being located on both sides of the sequence to be changed.
  • the details and implementation of said mutagenesis methods are known to the person skilled in the art (Kunkel et al. (1987) Methods Enzymol 154: 367-382; Tomic et al.
  • Mutagenesis can also be achieved by treating, for example, transgenic expression vectors which contain one of the nucleic acid sequences according to the invention with mutagenizing agents such as hydroxylamine.
  • non-essential sequences of a promoter according to the invention can be deleted without significantly impairing the essential properties mentioned.
  • deletion variants represent functionally equivalent fragments to the promoters described by SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 or 44.
  • the promoter sequence can be limited to specific, essential regulatory regions, for example using search routines to search for promoter elements , Certain prompter elements are often present in the regions relevant to promoter activity. This analysis can be carried out, for example, using computer programs such as the PLACE program ("Plant Curing Regulatory DNA Elements"; Higo K et al.
  • Said fragments according to the invention preferably comprise at least 25 contiguous nucleotides, preferably at least 50 contiguous nucleotides, particularly preferably at least 100 contiguous nucleotides of one of the sequences according to SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 or 44.
  • Functions equivalent fragments of one of the promoters according to the invention for example the promoters described by SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 or 44 - at least 200 base pairs, very particularly preferably at least 500 base pairs, most preferably at least 1000 base pairs of the 3 'end of the respective promoter according to the invention - for example the promoters described by SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 or 44 - the length from the start of the transcription ("ATG" codon) being calculated upstream in the 5 'direction.
  • Suitable SSS3 promoters also comprise DNA sequences which hybridize under standard conditions with one of the nucleic acid sequences according to SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 or 44 or with the nucleic acid sequences complementary to these and which have essentially the same promoter properties.
  • hybridization conditions is to be understood broadly and means both stringent and less stringent hybridization conditions. Such hybridization conditions are described, inter alia, in Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T et al., In Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, pages 9.31-9.57 or in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1989), 6.3.1-6.3.6. described.
  • the conditions during the washing step can be selected from the range of conditions limited by those with low stringency (with approximately 2X SSC at 50 ° C.) and those with high stringency (with approximately 0.2X SSC at 50 ° C., preferably at 65 ° C) (20X SSC: 0.3M
  • the temperature during the washing step can be raised from low stringent conditions at room temperature, about 22 ° C, to more stringent conditions at about 65 ° C. Both parameters, salt concentration and temperature, can be varied simultaneously, one of the two parameters can also be kept constant and only the other can be varied.
  • the hybrid denaturing agents such as formamide or SDS can also be used. In the presence of 50% formamide, the hybridization is preferably carried out at 42 ° C.
  • 0.1X SSC at 65 ° C
  • 0.1X SSC 0.5% SDS at 68 ° C
  • 0.1X SSC 0.5% SDS, 50% formamide at 42 ° C
  • 0.2X SSC 0.1% SDS at 42 ° C
  • e) 2X SSC at 65 ° C (weakly stringent condition)
  • 40 mM sodium phosphate buffer pH 7.0 1% SDS, 2 mM EDTA.
  • Methods for producing functional equivalents according to the invention preferably include the introduction of mutations into one of the promoters according to, SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 or 44. Mutagenesis can take place in an undirected manner ("random"), the mutagenized ones Sequences are then screened for their properties according to a "trial-and-error" procedure. Particularly advantageous selection criteria include, for example, the level of the resulting expression of the nucleic acid sequence introduced in a starchy tissue.
  • “Expression” means the transcription of the nucleic acid sequence to be expressed transgenically, but can - in the case of an open reading frame in “sense” orientation — also include the translation of the transcribed RNA of the nucleic acid sequence to be expressed transgenically into a corresponding polypeptide.
  • "Transgene” means - for example in relation to a transgenic expression cassette, a transgenic expression vector, a transgenic organism or a method for transgenic expression of nucleic acids - all such constructions which have been obtained by genetic engineering methods or methods using the same, in which either
  • an SSS3 promoter for example a promoter according to SQ ID NO: 1, 2, 3, 4 or 44, or
  • transgenic nucleic acid sequence to be expressed in functional linkage with the SSS3 promoter according to a), or
  • the SSS3 promoter sequence according to the invention contained in the expression cassettes is heterologous with respect to the further nucleic acid sequence to be functionally linked and transgenically expressed.
  • heterologous means that the further nucleic acid sequence does not code for the gene which is naturally under the control of said promoter.
  • Natural genetic environment means the natural chromosomal locus in the organism of origin or the presence in a genomic library.
  • the natural, genetic environment of the nucleic acid sequence is preferably at least partially preserved.
  • the environment flanks the nucleic acid sequence at least on one side and has a sequence length of at least 50 bp, preferably at least 500 bp, particularly preferably at least 1000 bp, very particularly preferably at least 5000 bp.
  • transgenic expression construct for example, the naturally occurring combination of the SSS3 promoter from caramel according to SEQ ID NO: 1 or 44 and the coding sequence of the potato SSS3 gene becomes a transgenic expression construct if this is achieved by non-natural, synthetic ( "artificial") methods such as an in vitro mutagenization is changed. Corresponding methods are described (US 5,565,350; WO 00/15815; see also above).
  • transgenic expression “transgenic expression”), “transgene” preferably means all those expressions which have been implemented using a transgenic expression cassette, transgenic expression vector or transgenic organism - in accordance with the definitions given above.
  • At least one of the promoters according to the invention is functionally linked to at least one transgene. expressing nucleic acid sequence.
  • a functional link is understood, for example, to mean the sequential arrangement of one of the promoters according to the invention (described, for example, by SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 or 44) with a tranigenic nucleic acid sequence to be expressed and, if appropriate, further genetic control sequences such as, for example a terminator or a polyadenylation sequence such that the promoter can fulfill its function in the transgenic expression of the nucleic acid sequence under suitable conditions and the expression of the nucleic acid sequence (ie transcription and optionally translation) takes place.
  • Suitable conditions preferably means the presence of the expression cassette in a plant cell, preferably a plant cell comprised of a starchy tissue of a plant.
  • nucleic acid sequence to be expressed transgenically is positioned behind one of the promoters according to the invention (e.g. described by SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 or 44), so that both sequences are covalently linked to one another.
  • the distance between the promoter sequence and the nucleic acid sequence to be expressed transgenically is preferably less than 200 base pairs, particularly preferably less than 100 base pairs, very particularly preferably less than 50 base pairs.
  • the production of a functional link as well as the production of a transgenic expression construct can be realized by means of common recombination and cloning techniques, as described for example in Maniatis T, Fritsch EF and Sambrook J (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Sprung Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY), in Silhavy TJ, Berman ML and Enquist LW (1984) Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY) and in Ausubel FM et al. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience.
  • a suitable method in this context is, for example GATEWAY TM cloning technology based on recombination (Invitrogen Ine.).
  • sequences can be positioned between the promoter and the nucleic acid sequence to be expressed transgenically, which for example have the function of a linker with certain restriction enzyme interfaces or a signal peptide.
  • the insertion of sequences can also lead to the expression of fusion proteins.
  • a transgenic expression cassette according to the invention is produced, for example, by fusing one of the promoters according to SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 or 44 according to the invention with a nucleotide sequence to be expressed transgenically, optionally a sequence coding for a transit peptide, preferably a chloroplast-specific transit peptide, which is preferably arranged between the promoter and the respective nucleotide sequence, and optionally a terminator or polyadenylation signal.
  • the transgenic expression construct consisting of a linkage of promoter and nucleic acid sequence to be expressed, can preferably be integrated in a vector and inserted into a plant genome by, for example, transformation.
  • an expression cassette is also to be understood to mean constructions in which one of the promoters according to the invention (described, for example, by SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 or 44), without it having been functionally linked beforehand to a nucleic acid sequence to be expressed, for example via a targeted homologous recombination or a random insertion into a host genome, there takes over regulatory control over endogenous nucleic acid sequences then functionally linked to it and controls the transgenic expression thereof.
  • an expression cassette according to the invention which selectively controls the expression of the specific polypeptide in a starchy tissue.
  • the natural promoter of an endogenous gene can also be exchanged for one of the promoters according to the invention (e.g. described by SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 or 44) and the expression behavior of the endogenous gene can be modified in this way.
  • the insertion of the promoter can also be carried out in such a way that antisense RNA is expressed to form the nucleic acid coding for a specific polypeptide. This will selectively express sion of the particular polypeptide down-regulated or switched off in the starchy tissue.
  • a nucleic acid sequence to be expressed transgenically - for example by homologous recombination - can code behind the sequence for one of the promoters according to the invention (for example described by SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 or 44), which are in in their natural chromosomal context, are placed in such a way that an expression cassette according to the invention is obtained which controls the expression of the nucleic acid sequence to be expressed transgenically in the starch-containing tissue.
  • transgenic expression cassettes according to the invention can comprise further genetic control sequences.
  • control sequences is to be understood broadly and means all those sequences which have an influence on the formation or the function of a transgenic expression cassette according to the invention. Genetic control sequences modify, for example, transcription and translation in prokaryotic or
  • the transgenic expression cassettes according to the invention preferably comprise 3 'downstream of the respective nucleic acid sequence to be expressed transgenically, a terminator sequence as an additional genetic control sequence, and, if appropriate, further customary regulatory elements
  • Genetic control sequences also include other promoters, promoter elements or minimal promoters that express
  • Genetic control sequences can, for example, also result in tissue-specific expression depending on certain stress factors.
  • Corresponding elements are, for example, for water stress, abscisic acid (La E and 'Chua NH, J Biol Chem 1991;
  • promoters can also be functionally linked to the nucleic acid sequence to be expressed, which is a transgenic
  • Plant-specific promoters basically means any promoter that expresses genes, especially foreign
  • the expression can be constitutive, inducible or development-dependent, for example. Constitutive promoters, tissue-specific promoters, development-dependent promoters, chemically-inducible stress-inducible or pathogen-inducible promoters are preferred. Corresponding promoters are generally known to the person skilled in the art.
  • control sequences can be found, for example, in the promoters of gram-positive bacteria such as amy and SP02 or in the yeast or fungal promoters ADCl, MFa, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH.
  • Genetic control sequences also include the 5'-untranslated regions, introns or non-coding 3 'regions of genes such as the actin-1 intron, or the Adhl-S introns 1, 2 and 6 (general: The Maize Handbook, Chapter 116, Freeling and Walbot, Eds., Springer, New York (1994)), preferably the genes with the locus At2g46720, At3g01980 and Atlg63140 from Arabidopsis thaliana. It can be shown that such regions can play a significant role in the regulation of gene expression. It has been shown that 5 'untranslated sequences can increase the transient expression of heterologous genes.
  • An example of translation enhancers is the 5 'leader sequence from the tobacco mosaic virus (Gallie et al.
  • the promoter sequences given under SEQ ID NO: 2, 3 and 4 contain the section of the respective SSS3 genes which represents the promoter and the 5 untranslated region up to the ATG start codon of the SSS3 protein.
  • the promoter sequences given under SEQ ID: 1 and 44 contain the promoter including 10 75 bp of the 5 untranslated region of the cDNA.
  • the transgenic expression construct can advantageously contain one or more so-called “enhancer sequences” functionally linked to the promoter that contain an increased transgenic
  • nucleic acid sequences to be expressed transgenically can be in a
  • Polyadenylation signals suitable as control sequences are plant polyadenylation signals and - preferably - those which essentially comprise T-DNA polyadenylation signals
  • the transgenic expression cassette contains a terminator sequence which is functional in plants.
  • Terminator sequences which are functional in plants generally mean those sequences which are able to terminate the transcript in plants.
  • Suitable terminator sequences are the OCS (octopine synthase) terminator and the NOS (nopalin synthase) terminator.
  • OCS octopine synthase
  • NOS nopalin synthase
  • plant terminator sequences are particularly preferred. Plant terminator sequences generally mean those sequences which are part of a
  • Gens from potato GenBank Acc. No .: X74985
  • VfLElB3 GenBank Acc. No.: Z26489
  • Control sequences are also to be understood as those which enable homologous recombination or insertion into the genome of a host organism or which allow removal from genome 45.
  • homologous recombination for example, the natural promoter of a specific gene can be exchanged for one of the promoters according to the invention.
  • promoters according to the invention can be placed by means of homologous recombination in front of an endogenous target gene to be expressed transgenically, by linking the promoter to DNA sequences which are, for example, homologous to endogenous sequences which are upstream of the reading frame of the target gene.
  • Such sequences are to be understood as genetic control sequences.
  • cre / lox technology allow tissue-specific, possibly inducible, removal of the transgenic expression cassette from the genome of the host organism (Sauer B (1998) Methods (Duluth) 14 (4): 381-92).
  • certain flanking sequences are added to the target gene (lox sequences) which later enable removal by means of the cre recombinase.
  • lox sequences For the selection of successfully homologous recombined or also transformed cells, it is generally necessary to additionally introduce a selectable marker (see below).
  • Homologous, recombination is a relatively rare occurrence in higher eucapryotes, especially in plants. Random integrations into the host genome predominate.
  • One way of removing the randomly integrated sequences and thus enriching cell clones with a correct homogeneous recombination is to use a sequence-specific recombination system as described in US Pat. No. 6,110,736.
  • the transgenic expression of the proteins encoded by the nucleic acid sequences under the control of an SSS3 promoter is possible in any desired cell compartment, such as the endomembrane system, the vacuole and the chloroplasts.
  • desired glycosylation reactions, special folds, etc. are possible.
  • the signal peptide sequences necessary for this as genetic control sequences can be provided both in individual transgenic expression cassettes, and can be introduced into the transgenic expression cassette together with the nucleic acid sequence to be expressed, using a suitable cloning strategy. Both gene-specific or heterologous sequences can be used as signal or transit peptide sequences.
  • Additional, heterologous sequences preferred but not limited to the functional linkage are further targeting sequences to ensure subcellular localization in the apoplast, in the vacuole, in plastids, in mitochondria, in the endoplasmic reticulum (ER), in the cell nucleus, in Oil corpuscles or other compartments; and translation enhancers such as the 5 'leader sequence from tobacco mosaic virus (Gallie et al. (1987) Nucl Acids Res 15: 8693-8711) and the like.
  • transit peptides derived from genes of plant fatty acid biosynthesis such as the transit peptide of the plastid "acyl carrier protein" (ACP), the stearyl-ACP desaturase, ⁇ -keto-acyl-ACP synthase or the acyl-ACP thioesterase,
  • ACP acyl carrier protein
  • stearyl-ACP desaturase stearyl-ACP desaturase
  • ⁇ -keto-acyl-ACP synthase or the acyl-ACP thioesterase
  • the target sequences can be linked to other targeting sequences that differ from the transit peptide in order to achieve subcellular localization in the apoplast, in the vacuole, in plastids, in mitochondria, in the endoplasmic reticulum (ER), in the cell nucleus, in oil corpuscles or others To ensure comparisons.
  • transgenic expression cassettes according to the invention and the transgenic expression vectors derived from them can contain further functional elements.
  • functional element is to be understood broadly and means all those elements which have an influence on the production, multiplication or function of the transgenic expression cassettes according to the invention or transgenic expression vectors or organisms derived therefrom. Examples include, but are not limited to:
  • selection marker includes both positive selection markers that are resistant to an antibiotic, or herbicide. lend other biocide, as well as negative selection markers, which give sensitivity to these, as well as markers which give the transformed organism a growth advantage (for example by expression of key genes of cytokine biosynthesis; Ebinuma H et al. (2000) Proc Natl Acad Sei USA 94 : 2117-2121). With positive selection, only those thrive Organisms that express the corresponding selection marker, while negative selections enter into it. When producing transgenic plants, the use of a positive selection marker is preferred. In addition, preference is given to using selection markers which give growth advantages. Negative selection markers can be used advantageously when it comes to removing certain genes or genomic sections from an organism (for example as part of a cross-breeding process).
  • the selectable marker introduced with the transgenic expression cassette gives the successfully transformed cells resistance to a biocide, for example a herbicide (such as phosphinothricin, glyphosate or bromoxynil), a metabolism inhibitor (such as 2-deoxyglucose-6-phosphate; WO 98/45456) ) or an antibiotic (such as tetracycline, ampicillin, kanamycin, G 418, neomycin, bleomycin or hygromycin).
  • a biocide for example a herbicide (such as phosphinothricin, glyphosate or bromoxynil), a metabolism inhibitor (such as 2-deoxyglucose-6-phosphate; WO 98/45456) ) or an antibiotic (such as tetracycline, ampicillin, kanamycin, G 418, neomycin, bleomycin or hygromycin).
  • a biocide for example a herbicide (such as phosphino
  • PPT phosphinothricin acetyltransferases
  • the bar / PAT gene can be isolated, for example, from Streptomyces hygroscopicus or S. viridochrom ⁇ genes. Corresponding sequences are known to the person skilled in the art (Streptomyces hygroscopicus GenBank Acc.-No .: X17220 and X05822; Streptomyces viridochromogenes GenBank Acc.-No .: M22827 and X65195; US 5,489,520). Furthermore, synthetic genes for expression in plastids are described (Genbank Acc.-No .: AJ028212).
  • EPSP synthase genes which confer resistance to Glyphosat ® (N- (phosphonome-thyDglycin).
  • the unselective herbicide glyphosate has 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthase (EPSPS) as its molecular target This has a key function in the
  • Strain CP4 has a natural tolerance to glyphosate, which can be transferred to corresponding transgenic plants.
  • the CP4 EPSPS gene was derived from Agrobacterium sp.
  • Strain CP4 cloned (Padgette SR et al. (1995) Crop Science 35 (5): 1451-1461).
  • 5-enolpyrvylshikimate-3-phosphate synthases which are glyphosate tolerant, as described for example in US 5,510,471; US 5,776,760; US 5,864,425; US 5,633,435; US 5,627; 061; US 5,463,175; EP 0 218 571 are preferred, the sequences described in each of the patents also being stored in the GenBank. Further sequences are described under GenBank Accession X63374. The aroA gene is also preferred (GenBank Acc. No.: M10947).
  • glyphosate oxidoreductase coding for the glyphosate® degrading enzyme.
  • GOX for example the glyphosate oxidoreductase from Achromobacter sp. Catalyzes the cleavage of a C-N bond in the glyphosate, which is thus converted to aminomethylphosphonic acid (AMPA) 'and glyoxylate.
  • AMPA aminomethylphosphonic acid
  • GOX can thereby confer resistance to glyphosate (Padgette SR et al. (1996) J Nutr 126 (3): 702-16; Shah D et al. (1986) Science 233: 478-481).
  • deh gene (coding for a Dalapon® inactivating dehalogenase; WO 99/27116; GenBank Acc. -No.: AX022822, AX022820)
  • nitrilase from Klebsieila ozanenae. Sequences can be found in GenBank under Genbank Acc.-No: E01313 and J03196.
  • Neomycin phosphotransferases confer resistance to antibiotics (aminoglycosides) such as neomycin, G418, hygmycin, paromomycin or kanamycin by reducing their inhibitory effect through a phosphorylation reaction.
  • antibiotics aminoglycosides
  • the nptll gene (Genbank Acc.-No .: AF080390; AF080389).
  • the gene is already part of it numerous expression vectors and can be isolated from them using methods familiar to the person skilled in the art (such as, for example, polymerase chain reaction) (Genbank Acc.-No .: AF234-316 pCAMBIA-2301; AF234315 pCAMBIA-2300, AF234314 pCAMBIA-2201).
  • the NPTII gene codes for an ainoglycoside-3'O-phosphotransferase from E. coli, Tn5 (GenBank Acc.-No: U00004 position 1401-2300; Beck et al. (1982) Gene 19 327-336).
  • DOG ⁇ l gene was isolated from the yeast Saccharomyces cerevisiae (EP 0 807 836) and codes for a 2-deoxyglucose-6-phosphate phosphatase which confers resistance to 2-DOG (Randez-Gil et al. ( 1995) Yeast 11: 1233-1240; Sanz et al. (1994) Yeast 10: 1195-1202; GenBank Acc.-No .: NG001140 position 194799-194056).
  • sulfonylurea and imidazolinone inactivating acetolactate synthases which confer resistance to imidazolinone / sulfonylurea herbicides.
  • the active substances imazamethabenzmethyl, imazamox, imazapyr, imazaquin, imazethapyr may be mentioned as examples of imidazolinone herbicides.
  • Examples of sulfonylurea herbicides are amidosulforon, azimsulfuron, chlorimuroethyl, chlorosulfuron, cinosulfuron, imazosulforon, oxasulforon, prosulforon, rimsulforon, sulfosulforon. The skilled person is familiar with numerous others
  • Hygromycin phosphotransferases e.g. GenBank Acc. -No .: X74325, which confer resistance to the antibiotic hygromycin.
  • the gene is a component of numerous expression vectors and can be isolated from these using methods familiar to the person skilled in the art (such as, for example, polymerase chain reaction) (GenBank Acc. No .: AF294981 pINDEX4; AF234301 pCAMBIA-1380; AF23 .
  • chloramphenicol chloramphenicol acetyl transferase
  • Tetracycline various resistance genes are described e.g. GenBank Acc.-No .: X65876, X51366.
  • the gene is already part of numerous expression vectors and can be isolated from these using methods familiar to the person skilled in the art (such as, for example, polymerase chain reaction)
  • Streptomycin various resistance genes are described e.g. with GenBank Acc.-No .: AJ278607.
  • the corresponding resistance gene is part of numerous cloning vectors (e.g. GenBank Acc. -No .: L36849 Cloning vector pZEO) and can be isolated from these using methods familiar to the person skilled in the art (such as, for example, polymerase chain reaction).
  • cloning vectors e.g. GenBank Acc. -No .: L36849 Cloning vector pZEO
  • ipt gene is a key enzyme in cytokine biosynthesis. Its overexpression facilitates the regeneration of plants (e.g. selection on cytokine-free medium).
  • the procedure for using the ipt gene is described (Ebinuma H et al. (2000) Proc Natl Acad Sei USA 94: 2117-2121; Ebinuma, H et al. (2000) Selection of Marker-free transgenic plants using the oncogenes (ipt, rol A, B, C) of Agrobacterium as selectable markers, In Molecular Biology of Woody Plants. Kluwer Academic Publishers).
  • EP-A 0 601 092 Various other positive selection markers which give the transformed plants a growth advantage over non-transformed ones, and methods for their use are described, inter alia, in EP-A 0 601 092.
  • Examples include ⁇ -glucuronidase (in connection with, for example, cytokinin glucuronide), Mannose-6-phosphate isomerase (in use binding with mannose), UDP-galactose-4-epimerase (in connection with eg galactose), with mannose-6-phosphate isomerase being particularly preferred in connection with mannose.
  • Negative selection markers allow, for example, the selection of organisms with successfully deleted sequences that comprise the marker gene (Koprek T et al. (1999) The Plant Journal
  • the negative selection marker introduced into the plant converts a compound which otherwise has no adverse effect on the plant into a compound with an adverse effect.
  • Genes are also suitable which are disadvantageous per se
  • TK thymidine kinase (TK), Diphfcheria Toxin A fragment (DT-A), the codA gene product coding for a cytosine deaminase (Gleave AP et al. (1999) Plant Mol Biol. 40 ( 2): 223-35; Perera RJ et al. (1993) Plant Mol Biol 23 (4):
  • Reporter genes code for easily quantifiable proteins and 30 guarantee an assessment of the transformation efficiency, the expression location or time via their own color or enzyme activity (see also Schenborn E, Groskreutz D. Mol Biotechnol. 1999; 13 (1): 29-44). Examples include:
  • GFP green fluorescence protein
  • Chloramphenicol transferase (Fromm et al. (1985) Proc Natl Acad Sei USA 82: 5824-5828),
  • GUS ⁇ -glucuronidase
  • uidA ⁇ -glucuronidase
  • R-Locus gene product protein that regulates the production of anthocyanin pigments (red coloring) in plant tissue and thus enables a direct analysis of the promoter activity without the addition of additional auxiliaries or chromogenic substrates (Dellaporta et al. (1988) In: Chromosome Structure and Function: Impact of New Concepts, 18th Stadler Genetics Symposium, 11: 263-282).
  • Tyrosinase (Katz et al. (1983) J Gen Microbiol 129: 2703-2714) an enzyme that oxidizes tyrosine to DOPA and dopaquinone, which as a result form the easily detectable melanin.
  • Aequorin (Prasher et al. (1985) Biochem Biophys Res Commun 126 (3): 1259-1268) can be used in calcium-sensitive bioluminescence detection.
  • Replication origins ensure the multiplication of 'transgenic expression cassettes of the invention or transgenic expression vectors in eg E. coli or Agrobacterium.
  • Examples are ORI (origin of DNA replication), the pBR322 ori or the P15A ori (Sambrook et al .: Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).
  • Examples of replication origins that are functional in Agrobacterium are pRK2, pRi, PVSl or pSA.
  • Borders sequences (such as the right or left border of the T-DNA) enable an agrobacterium-mediated transfer in plant cells for the transfer and integration into the plant genome. 5) Multiple cloning regions (MCS) allow and facilitate the insertion of one or more nucleic acid sequences.
  • transgenic expression vectors which contain the transgenic expression cassettes described above.
  • Vectors generally means structures capable of replication, which are preferably host-specific, and which permit the uptake of nucleic acid sequences and their transfer into other cells.
  • Vectors can be, for example, plasmids, cosmids, phages, viruses or even agrobacteria. Vectors which are particularly suitable in the context of plant biotechnology are described below.
  • the transgenic expression cassettes can be inserted into the vector (preferably a plasmid vector) via a suitable restriction site.
  • the resulting vector can first be introduced into E. coli and amplified. Correctly transformed E.coli are selected, grown and the recombinant vector with the expert! common methods. Restriction analysis and sequencing can be used to check the cloning step.
  • Preferred vectors are those which permit stable integration of the expression cassette into the host genome.
  • the host genome means the entire genetic information of the host and includes, for example, both the chromosomal DNA of the cell nucleus and the DNA of the plastids and mitochondria.
  • the insertion is preferably carried out in "the chromosomal DNA of the cell nucleus.
  • the transgenic expression cassette is introduced into a cell or an organism by means of plasmid vectors.
  • introduction comprises all methods which are suitable for directly or indirectly inserting a nucleic acid sequence (for example an expression cassette according to the invention) into an organism (for example a plant) or a cell, compartment, tissue, organ or propagation material (eg seeds or fruits) of the same or to generate them there.
  • a nucleic acid sequence for example an expression cassette according to the invention
  • the introduction can lead to a temporary (transient) or else to a permanent (stable) presence of said nucleic acid sequence.
  • Introduction includes, for example, methods such as transfection, transduction or transformation.
  • the organisms used in the processes are grown or cultivated in a manner known to the person skilled in the art, depending on the host organism.
  • RNA can be introduced directly by microinjection or by bombardment with DNA-coated microparticles, or the cell can be permeabilized chemically, for example with polyethylene glycol, so that the DNA can get into the cell by diffusion
  • Protoplast fusion with other DNA-containing units such as minicells, cells, lysosomes or liposomes.
  • Electroporation is another suitable method for introducing DNA, in which the cells are reversibly eabilized by an electrical impulse. Appropriate procedures are described
  • Preferred vectors for E. coli are pQE70, pQE60 and pQE-9 (QIAGEN, Inc.); pBluescript vectors, Phagescript vectors, pNH8A, pNHl ⁇ a, pNHl ⁇ A, pNH46A (Stratagene Cloning Systems, Inc.); ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia Biotech,
  • Transformation techniques can also be carried out by bacterial infection using Agrobacterium (e.g. EP . 0 116 718), viral infection using viral vectors (EP 0 067 553; US 4,407,956; WO 95/34668; WO 93/03161) or using pollen (EP 0 270 356; WO 85/01856; US 4,684,611).
  • Agrobacterium e.g. EP . 0 116 718
  • viral infection EP 0 067 553; US 4,407,956; WO 95/34668; WO 93/03161
  • pollen EP 0 270 356; WO 85/01856; US 4,684,611.
  • the strains Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes mostly used for Agrobacterium transformation contain a plasmid (Ti or Ri plasmid) which is transferred to the plant after Agrobacterium infection. Part of this plasmid, called T-DNA (transferred DNA), is integrated into the genome of the plant cell.
  • T-DNA transferred DNA
  • the transformation is preferably carried out using agrobacteria which contain "disarmed" Ti plasmid vectors, the natural ability of which for gene transfer to plants to be used (EP-A 0 270 355; EP-A 0 116 718).
  • Binary vectors mini-ti plasmids
  • Various binary vectors are known and some are commercially available, for example pBIN19 (Bevan et al. (1984) Nucl Acids Res 12: 8711f .; Clontech Laboratories, Inc. USA) or pSUN derivatives (SunGene GmbH &Co.KGaA; WO 02 / 00900).
  • the expression cassette according to the invention can be inserted into these binary vectors and - as described below - integrated into the plant genome.
  • plant explants are co-cultivated with Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes.
  • infected plant material e.g. leaf, root or stem parts, but also
  • Protoplasts or suspensions of plant cells can regenerate whole plants using a suitable medium, which may contain antibiotics or biocides for the selection of transformed cells, for example.
  • the plants obtained can then be screened for the presence of the introduced DNA, here the transgenic expression cassette according to the invention.
  • the integrated transgenic expression cassette contains a selection marker which gives the transformed plant resistance to a biocide (for example a herbicide), a metabolism inhibitor such as 2-DOG or an antibiotic such as kanamycin, G 418, bleomycin, hygromycin or phosphinothricin etc. gives.
  • the selection marker allows the selection of transformed cells from untransformed ones (McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5: 81-84).
  • the plants obtained can be grown and crossed in a conventional manner. Two or more generations should be cultivated to ensure that genomic integration is stable and inheritable.
  • Agrobacterium transformation is widely used for the transformation of dicotyledons, but is also increasingly being applied to monocotyledons (Toriyama et al. (1988) Bio / Technology 6: 1072-1074; Zhang et al. (1988) Plant Cell Rep 7 : 379-384; Zhang et al. (1988) Theor Appl Genet 76: 835-840; Shi amoto et al.
  • strains of Agrobacterium tumefaciens are able to transfer genetic material - e.g. the expression cassettes according to the invention - e.g. the strains EHA101 [pEHAl01], EHA105 [pEHAl05], LBA4404 [pAL4404], C58Cl [pMP90] and C58Cl [pGV2260] (Hood et al. (1993) Transgenic Res 2: 208-218; Hoekema et al. (1983) Nature 303: 179-181; Koncz and Schell (1986) Gen Genet 204: 383-396; Deblaere et al. (1985) Nucl Acids Res 13: 4777-4788).
  • the expression cassette is to be integrated into special plasmids, either into an intermediate vector (English: shuttle or intermediate vector) or into a binary vector.
  • Binary vectors which can replicate both in E. coli and in Agrobacterium are preferably used. They usually contain a selection marker gene and a linker or polylinker, flanked by the right and left T-DNA restriction sequences. They can be transformed directly into Agrobacterium (Holsters et al. (1978) Mol Gen Genet 163: 181-187).
  • the agrobacterium which acts as the host organism in this case should already contain a plasmid with the vir region. This is necessary for the transfer of T-DNA to the plant cell.
  • An agrobacterium transformed in this way can be used to transform plant cells.
  • T-DNA for the transformation of plant cells has been intensively investigated and described (EP-A 0 120 516; Hoekema, In: The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters BV, Alblasserdam, Chapter V; An et al. (1985) EMBO J 4: 277-287).
  • Various binary vectors are known and some are commercially available such as pBI101.2 or pBIN19 (Clontech Laboratories, Inc. USA; Bevan et al. (1984) Nucl Acids Res 12: 8711), pBinAR, PPZP200 or pPTV.
  • the agrobacteria transformed with such a vector can then be used in a known manner to transform plants, in particular crop plants, such as e.g. of rapeseed can be used, for example by bathing wounded leaves or leaf pieces in an agrobacterial solution and then cultivating them in suitable media.
  • agrobacteria The transformation of plants by agrobacteria is described (White FF (1993) Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, edited by SD Kung and R Wu, Academic Press, pp. 15-38 ; Jenes B et al. (1993) Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, edited by SD Kung and R. Wu, Academic Press, pp.
  • transgenic plants From the transformed cells of the wounded leaves or leaf pieces, transgenic plants can be regenerated in a known manner, which plants contain the above-described expression systems according to the invention.
  • Stably transformed cells may be selected from untransformed cells when a selectable marker is part of the introduced DNA.
  • a selectable marker for example, any gene that can confer resistance to a biocide (for example an antibiotic or herbicide (see above) can act as a marker. See above).
  • Transformed cells which express such a marker gene are able, in the presence of The selection marker allows the selection of transformed cells from untransformed ones (McCorick et al. (1986) Plant Cell Reports 5: 81-84).
  • the plants obtained can be used in the usual way Bred and bred wisely, and two or more generations should be cultivated to ensure that genomic integration is stable and inheritable.
  • a whole plant can be obtained using methods known to those skilled in the art.
  • callus cultures individual cells (e.g. protoplasts) or leaf disks are used here (Vasil et al. (1984) Cell Culture and Somatic Cel Genetics of Plants, Vol I, II and III, Laboratory Procedures and Their Applications, Academic Press; Weissbach and Weissbach (1989) Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press).
  • Undifferentiated callus cell masses can induce the formation of shoots and roots in a known manner.
  • the sprouts obtained can be planted out and grown.
  • Appropriate methods have been described (Fennell et al. (1992) Plant Cell Rep. 11: 567-570; Stoeger et al (1995) Plant Cell Rep. 14: 273-278; Jahne et al. (1994) Theor Appl Genet 89: 525-533).
  • the effectiveness of the expression of the transgenically expressed nucleic acids can be determined, for example, in vitro. Sprout meristem increase can be determined using one of the selection methods described above. In addition, a change in the type and level of expression of a target gene and the effect on the phenotype of the plant can be tested on test plants in greenhouse experiments.
  • Another object of the invention relates to transgenic organisms (transformed with at least one transgenic expression cassette according to the invention or a transgenic expression vector according to the invention), as well as cells, cell cultures, tissues, parts - such as leaves, roots etc. in plant organisms - or propagation material derived from such organisms.
  • Organism starting or host organisms are understood to mean prokaryotic or eukaryotic organisms, such as, for example, microorganisms or plant organisms.
  • Preferred microorganisms are bacteria, yeast, algae or fungi.
  • Preferred bacteria are bacteria of the genus Escherichia, Erwinia, Agrobacterium, Flavobacterium, Alcaligenes or cyano-bacteria, for example of the genus Synechocystis.
  • microorganisms which are used to infect plants and thus to transmit the cassettes according to the invention . are qualified.
  • Preferred microorganisms are those from the genus Agrobacterium and in particular from the Agrobacterium tumefaciens species.
  • Preferred yeasts are Candida, Saccharomyces, Hansenula or Pichia.
  • Preferred mushrooms are Aspergillus, Trichoderma, Ashbya, Neur.ospora, Fusarium, Beauveria or others in Indian Chem Engr. Section B. Vol 37, No 1,2 (1995) on page 15, table described mushrooms.
  • Host or starting organisms preferred as transgenic organisms are primarily plant organisms.
  • Plant organism or cells derived therefrom generally includes every cell tissue, parts or propagation material (such as seeds or fruits) of an organism capable of photosynthesis. Included in the scope of the invention are all genera and species of higher and lower plants in the plant kingdom. Annual, perennial, monocot and dicot plants are preferred.
  • Plant in the context of the invention means all genera and species of higher and lower plants in the plant kingdom. Included under the term are the mature plants, seeds, sprouts and seedlings, as well as parts derived therefrom, propagation material (for example bulbs, seeds or fruits), plant organs, tissues, protoplasts, callus and other cultures, for example cell or callus cultures , as well as all other types of groupings from plant cells to functional or structural units. Mature plants mean plants at any stage of development beyond the seedling. Seedling means a young, immature plant at an early stage of development.
  • Plant organisms in the sense of the invention are further photosynthetically active organisms, such as algae, cyanobacteria and mosses.
  • Preferred algae are green algae, such as algae of the genus Haematococcus, Phaedactylum tricornatum, Volvox or Dunaliella. Synechocystis, Chlamydomonas and Scenedes us are particularly preferred.
  • plant organisms in the context of the invention are all genera and species of higher and lower plants in the plant kingdom. Also included are the ripe plants, seeds, tubers, beets, fruits, sprouts and seedlings, as well as parts, propagation material and cultures derived from them, for example cell cultures. Mature plants mean plants at any stage of development beyond the seedling. Seedling means a young, immature plant at an early stage of development.
  • genes are preferred host organisms for the production of transgenic plants.
  • the expression of genes is furthermore advantageous in all ornamental plants, useful or ornamental trees, flowers, cut flowers, shrubs' or turf. Examples include, but are not limited to, angiosperms, bryophytes such as hepaticae (liverwort) and musci (mosses); Pteridophytes such as ferns, horsetail .
  • Gymnosperms like Conifers, cycads, ginkgo and gnetals
  • Algae such as Chlorophyceae, Phaeophpyceae, Rhodophyceae, Myxophyceae, Xanthophyceae, Bacillariophyceae (diatoms) and Euglenophyceae.
  • Plants from the following plant families are preferred: Amaranthaceae, Asteraceae, Brassicaceae, Carophyllaceae, Chenopodiaceae, Compos-itae, Cruciferae, Cucurbitaceae, Labiatae, Leguminosae, Papilionoideae, Liliaceae, Linaceae, Malvaceae, Rosaceaeeeaaceae, Rosaceaeeeae, Rosaceaeeeae, Rosaceaeeeae, Rosaceaeeeae, Rosaceaeeeae, Rosaceaeeeae, Rosaceaeeeae, Rosaceaeeeae, Rosaceaeeeae, Rosaceaeeeae, Rosaceaeeeae, Rosaceaeeae, Rosaceaeeae, Rosaceaeeae Theaceae, Umbelliferae.
  • Preferred monocotyledonous plants are selected in particular from the monocotyledonous crop plants, such as, for example, the family of the Gramineae such as rice, corn, wheat or other types of cereals such as barley, millet, rye, triticale or oats, and sugar cane and all types of grasses.
  • the family of the Gramineae such as rice, corn, wheat or other types of cereals such as barley, millet, rye, triticale or oats, and sugar cane and all types of grasses.
  • Preferred dicotyledonous plants are in particular selected from the dicotyledonous crop plants, such as, for example
  • - Cruciferae especially the genus Brassica, especially the species napus (rape), campestris (turnip), oleracea cv Tastie (cabbage), oleracea cv Snowball Y (cauliflower) and oleracea cv Emperor (broccoli) and other types of cabbage; and the genus Arabidopsis, especially the species thaliana as well as cress or canola and others,
  • Cucurbitaceae such as melon, 'pumpkin or zucchini and others
  • Leguminosae especially the genus Glycine, especially the type max (soybean) soy as well as alfalfa, peas, beans or peanuts and others
  • Rubiaceae preferably of the subclass Lamiidae such as, for example, Coffea arabica or Coffea liberica (coffee shrub) and others,
  • - Solanaceae especially the genus Lycopersicon, especially the species esculentum (tomato), the genus Solanum, especially the species tuberosum (potato) and melongena (eggplant) and the genus Capsicum, especially the kind annum (pepper), as well as tobacco and others,
  • Sterculiaceae preferably the subclass Dilleniidae such as Theobroma cacao (cocoa powder) and others,
  • Theaceae preferably of the subclass Dilleniidae, such as, for example, Camellia sinensis or Thea sinensis (tea bush) and others,
  • Beta vulgaris preferably the genus Beta vulgaris, in particular the species Beta vulgaris ssp. vulgaris var. altissima L. (sugar beet) and others;
  • plants of the Solanaceae family particularly the genus Lycopersicon, very particularly the species esculentum (tomato), the genus Sölanum, very particularly the species tuberosum (potato) and melongena (eggplant), the family Chenopodiaceae, in particular the genus Beta vulgaris, in particular the species Beta vulgaris ssp. vulgaris var. altissima L.
  • transgenic organisms described above cell cultures, parts - such as roots, leaves etc. in transgenic plant organisms - and transgenic propagation material such as seeds, tubers, beets or fruits.
  • Genetically modified plants according to the invention that can be consumed by humans and animals can also be used, for example, directly or after preparation known per se as food or feed.
  • a large number of nucleic acids or proteins are known to the person skilled in the art, the expression of which, controlled by the transgenic expression cassettes according to the invention, is advantageous.
  • Target genes which play a role in sugar or starch metabolism, in sink-source relationships, in the balance of organic acids, as taste components and in resistance to biotic stress factors (pathogens such as viruses, for example) are particularly suitable in the context of the present invention , Insects or fungi), in the resistance to abiotic stress factors (heat, cold, dryness, increased moisture, environmental toxins, UV radiation), in the consistency of the tissues or in water / pH conditions, in the improvement of food or feed properties, the improvement of the germination and / or storage properties as well as the improvement of the growth rate or the yield.
  • pathogens such as viruses, for example
  • starch content is of particular interest for tomatoes and potatoes.
  • a normal tomato consists of about 80 to 95% water, while starch - as the actually relevant ingredient for the production of, for example, tomato paste, ketchup - is broken down during ripening and has only a small proportion. Even a small increase in the starch content (and thus the proportion of the soluble components ("solubles") would be of considerable economic importance.
  • the starch content of the tomato is significantly higher at 20%, but then decreases during development due to the mobilization of the starch and In the case of potatoes, an increased proportion of starch has a particularly advantageous effect on the deep-frying properties.
  • the SSS3 promoters according to the invention could, for example, be used to suppress invertase activities, which are presumably involved in the expression of the characteristic "cold sweetening" acc. (Menendez et al. (2002) Genetics 162: 1423-14349. These gene activities can be suppressed, for example, by means of double-stranded RNA,., Cosuppression, antisense RNA or by expression of an invertase inhibitor.
  • nucleic acid sequences whose expression under the control of one of the promoters according to the invention offers advantageous effects:
  • Myoxocephalus Scorpius (WO 00/00512), Myoxocephalus octodecemspinosus, the Arabidopsis thaliana transcription activator CBF1, glutamate dehydrogenases (WO 97/12983, WO 98/11240), calcium-dependent protein kinase genes (WO 98/26045), calcineurins (WO 99/29045) ), Yeast casein kinase (WO 02/052012), farnesyl transferases (WO 99/06580; Pei ZM et al. (1998) Science 282: 287-290), ferritin (Deak M et al.
  • nucleic acids such as the artificial 1 cDNA coding for a microbial phytase (GenBank Acc.-No .: A19451) or functional equivalents thereof are particularly preferred.
  • RNAsen or ribozymes.
  • Further examples are nucleic acids which are used for the chit42 endochitinase from Trichoderma harzianum (GenBank Acc.-No .: S78423) or for the N-hydroxylating, multifunctional cytochrome P-450 (CYP79) protein from Sorghum bicolor (GenBank Acc.-No .: U32624) or encode their functional equivalents.
  • glucosinolates in foods to protect against pests is advantageous (Rask L et al. (2000) Plant Mol Biol 42: 93-113; Menard R et al. (1999) Phytochemistry 52: 29-35), expression of Bacillus thuringiensis endotoxins (Vaeck et al. (1987) Nature 328: 33-37) or protection against fungal attack by expression of chitinases, for example from the bean (Broglie et al. (1991) Science 254: 1194-1197).
  • cry ⁇ A (b) and cry ⁇ A (c) genes coding for Lepidoptera-specific ⁇ -endotoxins from Bacillus thuringiensis can cause resistance to insect pests in various plants (Goyal RK et al. (2000) Crop Protection 19 (5 ): 307-312).
  • Target genes which are furthermore suitable for defense against pathogens include "polygalacturonase inhibiting protein” (PGIP), thaumatin, invertase and antimicrobial peptides such as lactoferrin (Lee TJ et al. (2002) J Amer Soc Horticult Sei 127 (2): 158-164).
  • PGIP polygalacturonase inhibiting protein
  • thaumatin thaumatin
  • invertase invertase
  • antimicrobial peptides such as lactoferrin
  • genes which cause an accumulation of fine chemicals such as tocopherols, tocotrienols, vitamin C or carotenoids.
  • the phytoendaturase is one example. Preferred are nucleic acids which code for the phytoendesaturase from Narcissus pseudonarcissus (GenBank Acc.-No .: X78815) or functional equivalents thereof.
  • the production of vitamin C can be modified and increased, for example, via the expression of GDP-mannose-3 ', 5' -epimerase (WO 02/103001).
  • the carotenoid content in plants, for example potatoes can be increased by the expression of a protein which has the enzymatic activity of a zeaxanthin epoxidase (WO 02/103021). 5.
  • nutraceuticals such as, for example, polyunsaturated fatty acids (for example arachidonic acid, eicosapentaenoic acid or docosahexaenoic acid) by expression of fatty acid elongases and / or desaturases or production of proteins with improved nutritional value, for example with a high proportion of essential amino acids (for example the methionine-rich 2S albumingen of Brazil nut).
  • polyunsaturated fatty acids for example arachidonic acid, eicosapentaenoic acid or docosahexaenoic acid
  • proteins with improved nutritional value, for example with a high proportion of essential amino acids (for example the methionine-rich 2S albumingen of Brazil nut).
  • Preferred nucleic acids are those for the methionine-rich 2S albumin from Bertholletia excelsa (GenBank Acc.-No.: AB044391), the ⁇ 6-acyl lipid desaturase from Physcomitrella patens (GenBank Acc.-No .: AJ222980; Girke et al. (1998) Plant J 15: 39-48), the ⁇ 6 desaturase from Mortierell . a alpina (Sakuradani et al 1999 Gene 238: 445-453), the ⁇ 5-desaturase from Caenorhabditis elegans (Michaelson et al.
  • GDH glutamate dehydrogenase
  • nucleic acids which code for Medicago sativa acetyl-CoA carboxylase (Accase) (GenBank Acc.-No .: L25042) or functional equivalents thereof. Further examples are described in Herbers & Sonnewald (1999) Curr Opinion Biotech- ' nol 10 163-168; Biesgen & Herbers (2000) J Plant Biotechnol 2: 1-12; Biesgen et al. (2002) Phytochemistry Reviews 1: 79-85.
  • Accase Medicago sativa acetyl-CoA carboxylase
  • the SSS3 promoter can e.g. can be used for the expression of a starch isynthase from wheat in order to modify the content or the composition of vegetable starch, which can serve for the optimization of food, the development of coatings, adhesives or packaging materials, and applications in the construction industry (WO 00/66745). Further possible uses are described in DE06483010 and WO 02/086112.
  • the SSS3 promoter is particularly suitable for reducing the accumulation of sugars by expressing a phosphofructosekinase. This can be exploited especially when storing the potato at low temperature in order to suppress the so-called "cold sweetening" (US 6,489,539).
  • the carbohydrate metabolism is modulated by the expression or repression of vegetable sugar transporters (WO 02/0199217).
  • Further advantageous examples are invertase inhibitor (Börnke et al. (1999) Nature Biotech 17: 708-711), sucrose isomerase (Börnke et al. (2002) Planta 214: 356-364, "Starch-related R1 protein” (Lorberth et al. (1998) Nature Biotechnolbgy 16 (5): 473-7, Ritte et al. (2000) Plant Journal 21 (4): 387-91). '
  • the SSS3 promoter can also be used to express proteins in starchy tissues, such as potato tubers, to increase nutritional value (Chakraborty et al. (2000) Proc Natl Acad Sei USA 97: 3724-3729).
  • Pectin can be modified by the expression of an endo-1,4- ⁇ -D-galactanase (S0rensen et al. (2000) Proc Natl Acad Sei USA 97: 7639-7644).
  • the content of storage substances such as lipids, fatty acids, starch or seed proteins can be modulated by the expression of “lipid metabolism proteins” (LMP) (WO 02/099076).
  • LMP lipid metabolism proteins
  • the SSS3 promoter can be used for the expression of a xylanase in order to control the growth and death and the ripening of plants (US Pat. No. 6,495,743).
  • Functional analogs of the nucleic acids or proteins mentioned can also be expressed.
  • Functional analogs here means all the sequences that have essentially the same function i.e. are capable of the function (for example a substrate conversion or a signal transduction) as well as the protein mentioned by way of example.
  • the functional analogue can differ in other characteristics. For example, it may have a higher or lower activity, or it may have other functionalities.
  • Functional analogs also mean sequences which code for fusion proteins consisting of one of the preferred proteins and other proteins, for example another preferred protein or else a signal peptide sequence.
  • Effects can also be achieved by expression of a corresponding zinc finger transcription factor under the control of one of the promoters according to the invention.
  • the expression of certain Myb transcription factors can, for example, modulate the flavonoid bisoythesis (Moyano et al. (1996) Plant Cell 8: 1519-32). Further. Examples of the regulation of secondary metabolism are described (Memelink (2001) Advances in Biochemical Engineering-Biotechnology 72: 103-25).
  • the transgenic expression cassettes according to the invention can also be used to reduce (suppression) transcription and / or translation of target genes by "gene silencing" the.
  • the transgenic expression cassettes according to the invention can express nucleic acids which bring about PTGS ("post-transcriptional gene silencing") or TGS ("transcriptional silencing") effects and thus a reduction in the expression of endogenous genes. Said reduction can, for example, by expression of an "antisense" RNA (including EP-Al 0 458 367; EP-AI 0 140 308; van der Krol AR et al. (1988) BioTechniques 6 (10): 658-676; de Lange 'P et al.
  • RNA double-stranded RNA, each of which has homology to the endogenous target gene to be reduced.
  • the expression of a corresponding "sense" RNA can also reduce the expression of endogenous genes by means of so-called co-suppression (EP-Al 0 465 572).
  • the expression of a double-stranded RNA is particularly preferred for reducing the gene expression of a target gene.
  • WO 99/32619 and WO 99/53050 describe methods for inhibiting individual target genes using an RNA having a double-stranded structure, the target gene and the region of the RNA duplex having at least a partial identity (see also: Montgomery-MK et al (1998) Proc Natl Acad Sei USA 95: 15502-15507;
  • RNA interference RNA interference
  • Preferred applications in which the reduction (suppression) of gene expression requires an advantageous phenotype include, by way of example, but not by way of limitation:
  • a modification of the carbohydrate composition can be achieved, for example, by reducing the gene expression of genes of carbohydrate metabolism or carbohydrate biosynthesis .
  • genes of carbohydrate metabolism or carbohydrate biosynthesis for example the biosynthesis of amylose, pectins, cellulose or cell wall carbohydrates.
  • target genes which may be mentioned include, but are not limited to, phosphorylases, starch synthetases, branching enzymes (“branching enzymes”), lipoxygenases (Griffiths A et al. (1999) Postharvest Biology & Technology 17 (3): 163-173), debranching Enzymes and various amylases.
  • the fusion of an SSS3 promoter with an antisense-oriented sequence of one or both subunits of ADP-glucose pyrophosphorylase is able to inhibit the activity thereof in the early development of fruits and tubers and to increase the ratio between soluble sugars and starches ,
  • a shift in the amylose / amylopectin ratio in starch can be brought about by suppression of both isoforms of the branching enzyme which are responsible for the ⁇ ⁇ 1,6-glycosidic linkage.
  • Appropriate procedures are described (for example in Schwall GP et al. (2000) Nat Biotechnol 18 (5): 551-554).
  • Nucleic acid sequences such as that of the Starch branching enzyme II of the potato (GenBank Acc.-No .: AR123356; US 6,169,226) or its homologs from other genera and species are preferably used for this purpose.
  • Another application is the suppression of endogenous activities (enzymes, signal transduction, phytohormone etc.) by immunomodulation.
  • Delayed fruit ripening or a modified ripening phenotype can be achieved, for example, by reducing the gene expression of genes selected from the group consisting of polygalacturonases, pectin esterases, ⁇ - (1-4) glucanases (cellulases), ⁇ -galactanases ( ⁇ -galactosidases), or genes of ethylene biosynthesis such as 1-amino-cyclopropane-1-carboxylate synthase, adenosyl methionine hydrolase
  • SAMase aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase, aminocyclopropane-1-carboxylate oxidas, genes of carotenoid biosynthesis such as e.g. Prephytoene or phytoene biosynthesis genes, for example phyto-desaturases, as well as O-methyltransferases, aeyl-carrier protein (ACP), elongation factor, auxin-induced gene, cysteine
  • the reduction in the gene expression of genes coding for storage proteins has numerous advantages, such as, for example, reducing the allergenic potential or changing the composition or amount of other metabolites such as, for example, oil or starch content.
  • Resistance to plant pathogens such as arachnids, fungi, insects, nematodes, protozoa, viruses, bacteria and diseases can be achieved by reducing the gene expression of genes that are necessary for growth, survival, certain stages of development (for example pupation) or reproduction a particular pathogen is essential. A corresponding reduction can result in a complete inhibition of the aforementioned steps, but can also delay them.
  • These can be plant genes, which allow the pathogen to penetrate, for example, but can also be genes inherent in the pathogen.
  • the transgenically expressed nucleic acid sequence (for example the double-stranded RNA) is preferably directed against genes of the pathogen.
  • the transgenically expressed nucleic acid sequence (eg the double-stranded RNA) itself, but also the transgenic expression cassettes or transgenic organisms, can act as an anti-pathogenic agent.
  • the plants themselves can contain the agents in the form of a transgenic organism and pass them on to the pathogens, for example in the form of a feeding poison.
  • Various essential genes of various pathogens are known to the person skilled in the art (for example for nematode resistance WO 93/10251, WO 94/17194).
  • Virus resistance can be achieved, for example, by reducing the expression of a virile coat protein, a viral replicase, a viral protease, etc. Numerous plant viruses and corresponding target genes are known to the person skilled in the art. 8.
  • target genes are described (inter alia in WO 97/16559).
  • the target genes preferred for the reduction of 14-1.6 kDa allergenic proteins are described, for example, by Tada Y et al. (1996) FEBS Lett 391 (3): 341-345 or Nakamura R (1996) Biosci Biotechnol Bioche 60 (8): 1215-1221.
  • Corresponding target genes include Cinnamoyl-CoA: NADPH reductases or cinnamoyl alcohol holding hydrogenases. Further target genes are described (inter alia in WO 95/07993).
  • an “antisense” nucleic acid initially means a nucleic acid sequence that is completely or partially complementary to at least part of the “sense” strand of said target protein. It is known to the person skilled in the art that he can alternatively use the cDNA or the corresponding gene as the starting template for corresponding antisense constructs.
  • the “antisense” nucleic acid is preferably complementary to the coding region of the target protein or a part thereof. However, the "antisense” nucleic acid can also be complementary to the non-coding region or a part thereof.
  • an antisense nucleic acid can be designed in the manner familiar to the person skilled in the art, taking into account the base pair rules of Watson and Crick.
  • an antisense nucleic acid can be complementary to all or part of the nucleic acid sequence of a target protein.
  • the antisense nucleic acid is an oligonucleotide with a length of, for example, 25, 30, 35, 40, 45 or 50 nucleotides.
  • the antisense strategy can advantageously be coupled with a ribozyme method.
  • Ribozymes are catalytically active RNA sequences which, coupled to the antisense sequences, catalytically cleave the target sequences (Tanner NK (1999) FEMS Microbiol Rev 23 (3): 257-75). This can increase the efficiency of an anti-sense strategy.
  • the expression of ribozymes to reduce tuned proteins are known to the person skilled in the art and are described, for example, in EP-Al 0 291 533, EP-Al 0 321 201 and EP AI 0 360 257.
  • Suitable target sequences and ribozymes can be obtained, for example, as in the case of Steinecke (Ribozymes, Methods in Cell Biology 5 50, Galbraith et al eds Academic Press, Inc. (1995), 449-460) " , can be determined by secondary structure calculations of ribozyme and target RNA and by their interaction (Bayley CC et al. (1992) Plant Mol Biol 18 (2 ) - 353-361; Lloyd AM and Davis RW et al. (1994) Mol Gen Genet 242 (6): 653-657)
  • ribozymes 10 to call "hammerhead” ribozymes (Haselhoff and Gerlach (1988) Nature 334: 585-591).
  • Preferred ribozymes are based on derivatives of the Tetrahymena L-19 IVS RNA (US 4,987,071; US 5,116,742). Additional ribozymes with selectivity for an L119 mRNA can be selected (Bartel D and Szostak JW (1993) Science
  • the introduced construct can represent the gene to be reduced in whole or in part. The possibility of translation is not necessary.
  • double stranded RNA interference double stranded RNA interference
  • Appropriate methods are known to the person skilled in the art and are described in detail (for example Matzke MA et al. (2000) Plant Mol Biol 43: 401-415; Fire A. et al (1998) Nature 391: 806-811; WO 99/32619; WO 99753050; WO 00/68374; WO 00/44914;
  • Another object of the invention relates to the use of the novel above-described transgenic organisms, and cell 1 of them, cell cultures, parts - such as, for example, the case of transgenic plant organisms roots, leaves
  • transgenic propagation material such as seeds or fruits, for the production of food or feed, pharmaceuticals or fine chemicals.
  • Also preferred is a process for the recombinant production of pharmaceuticals or fine chemicals in host organisms a host organism being transformed with one of the expression cassettes described above and this expression cassette containing one or more structural genes which code for the desired fine chemical or catalyze its biosynthesis, the transformed Host organism is grown and the desired fine chemical is isolated from the growth medium.
  • This process is widely applicable to fine chemicals such as enzymes, vitamins, amino acids, sugars, fatty acids, natural and synthetic flavors, aromas and colors.
  • the production of tocopherols and tocotrienols and carotenoids such as astaxanthin is particularly preferred.
  • the transformed host organisms are grown and isolated from the host organisms or from the growth medium using methods known to those skilled in the art.
  • SEQ ID NO: 1 promoter of the SSS3 gene from potato (Solanum tuberosum)
  • SEQ ID NO: 2 promoter of the SSS3 gene from Arabidopsis thaliana
  • SEQ ID NO: 3 promoter of the SSS3 gene from rice (Oryza sativa)
  • SEQ ID NO: 4 promoter of the SSS3 gene from wheat (Triticum aesti um)
  • SEQ ID NO: 5 nucleic acid sequence coding for starch synthase 3 (SSS3) from potato (Solanum tuberosum)
  • SEQ ID NO: 6 amino acid sequence coding for starch synthase 3 (SSS3) from potato (Solanum tuberosum)
  • SEQ ID NO: 7 nucleic acid sequence coding for strong synthase 3 (SSS3) from Arabidopsis thaliana
  • SSS3 amino acid sequence coding for Arabidopsis thaliana starch synthase 3
  • SEQ ID NO: 9 nucleic acid sequence coding for starch synthase 3 (SSS3) from rice (Oryza sativa)
  • SEQ ID NO: 10 amino acid sequence coding for starch synthase 3 (SSS3) from rice (Oryza sativa)
  • SEQ ID NO: 11 nucleic acid sequence coding for strong synthase 3 (SSS3) from wheat (Triticum aestivum)
  • SEQ ID NO: 12 amino acid sequence coding for starch synthase 3 (SSS3) from wheat (Triticum aestivum)
  • SEQ ID NO: 13 nucleic acid sequence coding for strong synthase 3 (SSS3) from wheat (Aegilops tauschii) 14.
  • SEQ ID NO: 15 nucleic acid sequence coding for starch synthase 3 (SSS3) from the asparagus / Catjang bean (Vigna unguiculata)
  • SEQ ID NO: 17 nucleic acid sequence coding for starch synthase 3 (SSS3) from maize (Zea mays)
  • SEQ ID NO: 19 to 39 sequence motifs for strong synthase 3 proteins
  • SEQ ID NO: 40 oligonucleotide primer R-DSS3-263 (27 mer)
  • SEQ ID NO: 41 oligonucleotide primer R-DSS3-317 (27 mer)
  • SEQ ID NO: 42 oligonucleotide primer L-DS3 (44mer)
  • SEQ ID NO: 43 oligonucleotide primer R-DS3: (38 mer)
  • SEQ ID NO: 44 promoter of the SSS3 gene from potato (Solanum tuberosum; polymorphic to SEQ ID NO: 1)
  • SEQ ID NO: 45 oligonucleotide primer S'actin AC1 (23mer)
  • SEQ ID NO: 46 oligonucleotide primer 3'actin AC2 (23mer)
  • SEQ ID NO: 47 oligonucleotide primer L-SSS3-G50 (24mer)
  • SEQ ID NO: 48 oligonucleotide primer R-GUS-G809 (22 mer)
  • Fig. 2 GUS activity in tubers from 5 potato lines (2, 12, 14, 15 and 17) transformed with SSS3 promoter: GUS construct.
  • ⁇ L leaves; G: developing tubers; R2: 45 days storage at room temperature; R3: 90 days storage at room temperature.
  • Fig. 3 PCR amplification of the cDNA (primer in the 5 'untranslated region of the SSS3 promoter and in the GUS gene)
  • H20 negative control
  • pDSSS-Bi-Hp4 Plasmid DNA as a positive control, cDNA after 45 days (left) and after 90 days
  • Fig. 4 Green fruits of lines 1 (A), 2 (B), 6 (C), 21 (D), 30 (E), WT (F), orange fruit of line 23 (G), blue-colored Seeds, undyed cuts through petioles (I), bud (J) and flower (K) and flower (K) colored in the anthers and colored pollen (L) from tomato plants transformed with pSun0301_SSS3
  • Fig. 5 GUS activity in the green fruits of tomato lines, transformed with pSun0301_SSS3. Error bars always show the standard error
  • Fig. 6 Comparison of GUS activity in selected lines of transgenic tomato plants (white bars: green fruits, black bars: red fruits; error bars each show the standard error).
  • Fig. 7a-f Comparison ("Alignment") of SSS3 protein sequences from potato (STSSS3), Arabidopsis thaliana (AtSSS3), asparagus / Catjang bean (Vigna unguiculata; VUSSS3), Aegilops tauschii (AtaSSS3), wheat (Triticum aestivum; TASSS3), rice (OS SSS3), maize (ZM SSS3).
  • Identical amino acids have a gray background and are highlighted by the "Conensus” sequence that is additionally indicated.
  • the strain DH5 ⁇ (Hanahan D (1983) J Mol Biol 166: 557-580)
  • the agrobacterial strains LBA4404 and C58C1 [pGV2260] were transformed directly according to An G (1987) Mol Gen Genet 207: 210-216 using the freeze-thaw method.
  • Cotyledons of seven to ten day old seedlings of the Mi ⁇ rotome line serve as the starting explant for the transformation.
  • the culture medium according to Murashige and Skoog (Murashige and Skoog, 1962, Physiol. Plant. 15, 473-497) with 2% sucrose, pH 6.1 is used for germination. Germination takes place at 21 ° C with little light (20 - 100 ⁇ E).
  • the cotyledons are NEN divided crosswise and placed on the medium MSBN (MS, pH 6.1, 3% sucrose + 1 mg / 1 BAP, 0.1 mg / 1 NAA), which had been loaded with suspension-cultivated tobacco cells the day before.
  • the tobacco cells are air-bubble-free covered with sterile filter paper.
  • the explants are precultured on the medium described for three to five days.
  • the explants are then infected with the Agrobacterium tumefaciens strain LBA4404, which carries the binary plasmid with the gene to be transformed, as follows:
  • the strain which has been cultivated overnight in YEB medium with the antibiotic for the binary plasmid at 28 ° C. is centrifuged.
  • the bacterial pellet is resuspended with liquid MS medium (3% sucrose, pH 6.1) and adjusted to an optical density of 0.3 (at 600 nm).
  • the precultivated explants are transferred to the suspension and incubated for 30 minutes at room temperature with gentle shaking.
  • the explants are then dried with sterile filter paper and placed back on their preculture medium for the three-day co-culture (21 ° C).
  • the explants are transferred to MSZ2 medium (MS pH 6.1 + 3% sucrose, 2 mg / 1 zeatin, 100 mg / 1 kanamycin, 160 mg / 1 timentin) and for selective regeneration at 21 ° C stored under low light conditions (20 - 100 ⁇ E, light rhythm 16h / 8h).
  • MSZ2 medium MS pH 6.1 + 3% sucrose, 2 mg / 1 zeatin, 100 mg / 1 kanamycin, 160 mg / 1 timentin
  • the explants are transferred every two to three weeks until shoots form. Small shoots can be separated from the explant and rooted on MS (pH 6.1 + 3% sucrose) 160 mg / 1 timentin, 30 mg / 1 kanamycin, 0.1 mg / 1 IAA. Rooted plants are transferred to the greenhouse.
  • the genomic DNA of transgenic potato and tomato plants was isolated using the DNA isolation kit from Macherey & Nagel. In a first step, the transgenic lines were identified via PCR with gene-specific primers. The integration of the foreign DNA was examined using "Southerriblot” analyzes of 20 ⁇ g DNA after a suitable restriction cleavage.
  • the following method was used to obtain genomic potato DNA to isolate the SSS3 promoter: mortar and pestle were cooled with liquid nitrogen and 5 g of young leaf material were homogenized to a fine powder. This powder was transferred to a 50 ml centrifuge tube. With 15ml freshly prepared "of extraction buffer, the material was shaken vigorously. After addition of 1 ml 20% SDS, pH 7.2 the mixture at 65 ° C for 10 min was incubated. Next, 5 ml 5M potassium acetate was added, for an additional 30 min on ice incubated and then centrifuged at 12000 rpm. The supernatant was filtered through a Miracloth membrane and transferred to a fresh centrifuge tube and centrifuged again as described above.
  • Extraction buffer 100 mM Tris-HCl pH 8.0 500 mM NaCl
  • the first step was to produce uncloned, adapter-ligated genomic DNA Fragments, so-called Genome Walker libraries, for which the genomic DNA from Solanum tuberosum cultivar Desiree was used.
  • the enzyme Hpal was used as a restriction enzyme in accordance with the instructions (“library DNA”).
  • the following primers were derived for the amplification of the promoter fragment.
  • Primer R-DSS3-263 (27 mer): 5 'TGC ATT GGA GAC ACT TGT GCA ACT CAA 3' (SEQ ID NO: 40)
  • the PCR reaction was carried out on the Perkin Elmer GeneAmp PCR System 2400 Thermal Cycler.
  • 3 ul of the 1st PCR reaction was diluted with 97 ul water and used for the 2nd PCR reaction.
  • Tth polymerase mix 1.0 ul Primer AP2 from the kit 1 ⁇ l
  • Primers were derived from the sequence of the amplified product and a new PCR was carried out starting from genomic DNA in order to ensure that it was the actual genomic promoter region of the SSS3 gene.
  • a 1.1 kb fragment was amplified using the high fidelity PfuTurbo DNA polymerase (Stratagene) under the following conditions.
  • the primers (derived and ordered on 3-8-00) contain the restriction sites Sall, Xbal, Smal and BamHI for later cloning.
  • L-DS3 (5 'primer for promoter amplification, 44mer) 5' GTC GAC TCT AGA GGA AGA AAT CTT CTC TGT CTA AAA AAT TGA CG 3 '(SEQ ID NO: 42; the primer starts with Sall and Xbal restriction sites; in bold letters) •
  • R-DS3 (3 'primer for promoter amplification, 38mer)
  • the 3 'end of the isolated SSS3 promoter ends at position 75 of the cDNA sequence of the SSS3 gene (Acc. No. X94400), this is 131 bp upstream from the start codon ATG.
  • the sequence is without the attached interfaces' by SEQ ID NO: reproduced 1 and 44 respectively.
  • Genomic potato DNA ( ⁇ 100ng) 1.0 ⁇ l
  • the PCR reaction was separated on a 1% agarose gel and the 1.1 kb PCR fragment was isolated as described above. This fragment was cloned into the vector pCR blunt (Invitrogen, Zero blunt PCR Cloning Kit, # K2700-20). The sequence data showed that two slightly different promoters were isolated.
  • the corresponding plasmids were named pDSSS-Hp4 (Seq ID 25 NO: 1) and pDSSS-Hp6 (SEQ ID NO: 44). In addition to a few base pair exchanges and smaller deletions, they differ in an additional Xbal site (SEQ ID NO: 44) in the plasmid pDSSS-Hp6.
  • the binary vector pBIlOl (Jefferson et al. (1987) EMBO J 6: 3901-3907) was used for the transformation into potato and the promoters were cloned in front of the GUS gene.
  • the plasmid pDSSS-Hp4 was cut with Xbal and BamHI.
  • the 1.1 kb promoter fragment was isolated and ligated into the pBIlOl cut with the same enzymes.
  • the resulting plasmid was named pDSSS3-Bi-Hp4 and was included in the agrobact
  • the plasmid pDSSS-Hp6 was cut with the restriction enzymes Sall and BamHI. The 1.1 kb promoter fragment was isolated and ligated into pBIlOl 45 cut with the same enzymes. The resulting plasmid was named pDSSS3-Bi-Hp6 . and transformed into the agrobacterial strain C58C1 [pGV2260]. The agrobacterial colonies were grown on Km50 / Amp50 / Rif25 ( ⁇ g / ml) selected. With these strains the transformation into potato took place.
  • the promoter In order to determine the properties of the promoter, it is necessary to place the promoter in front of a so-called reporter gene which enables expression activity to be determined.
  • the bacterial ⁇ -glucuronidase may be mentioned (Jefferson et al. (1987) EMBO J 6: 3901-3907).
  • the ⁇ -glucuronidase activity can be determined in planta using a chromogenic substrate such as 5-bromo-4-chloro-3-indolyl- ⁇ -D-glucuronic acid (X-Gluc) as part of an activity staining.
  • X-Gluc 5-bromo-4-chloro-3-indolyl- ⁇ -D-glucuronic acid
  • a second assay allows a quantitative determination of the GUS activity in the examined tissue.
  • MUG 4-methyl-umbelliferyl-ß-D-glucuronide
  • MU methyl-umbelliferone
  • the analyzed transgenic plants which were transformed with the plasmid pDSSS3-Bi-Hp6, showed activity only in the tubers. .
  • Table 1 GUS activity in developing tubers and mature leaves from selected SSSIII :: GUS lines. The lines were obtained by transformation with pDSSS-BiHp4. Average values of 4 measurements are shown. The values are given in Picomol MU / mg protein / min; Line 10 is a negative control.
  • the activity of the SSS3 promoter during tuber storage 5 was determined using the fluorometric GUS assay described. Samples of developing tubers were taken as well as 45 and 90 days after the tubers had been stored. The results of the best 5 lines are shown in Fig. 2. The values for the adult leaves are also shown for comparison. 10 In most lines, GUS activity in the tubers that were stored for 45 days was approximately 2 times higher than in the developing tubers. During further storage, the Gus activity in the tubers continued to increase slightly.
  • the line with the strongest activity is line 15.
  • a GUS activity of 63391437 pM MU / min mg protein was measured. After 45 days of storage at room temperature, the GUS activity was 108431329 and after 90 days was 123441681. This activity was thus 2x higher than in growing tubers and
  • the mRNA of the glucuronidase was detected by RT-PCR.
  • the cDNA of the potato tubers was determined using the Bauer 30 et al. isolated (Plant Physiol. 105: 585-592, 1994).
  • the actin gene which was amplified using the following primers, served as a positive control.
  • the mRNA is shown as a negative control to check the amplification of genomic DNA and the cDNA of the tubers, isolated from lines 2, 9, 12, 15 and 17, after 45 and 90 days, respectively.
  • the ' amplificates (1.1 kb) show that the method works and the expression of the actin gene is comparable in all transgenic lines and that no genomic DNA is available.
  • Primers were derived for the detection of the expression of the GUS gene, mediated by the SSS3 promoter.
  • L-SSS3, -G50 corresponds to the 5 untranslated region of the ⁇ SSS3 gene which is also present in the binary plasmid pDSSS3-Bi-Hp4.
  • the 3 ⁇ primer R-GUS-G809 was derived from the GUS gene.
  • the PCR mix and the PCR conditions were the same as for the amplification of the actin gene with the exception that the PCR reaction was carried out in 25 ⁇ l with 0.125 ⁇ l TaKaRa Taq polymerase and 1 ⁇ l primer.
  • Example 11 Cloning 'of the promoter into the binary vector SSS3 pSUN0301 for analysis of the expression pattern in tomato
  • the plasmid pDSSS-Hp4 was cut with the restriction enzymes BamHI and EcoRI and the resulting fragment of 1kb length in the binary plasmid pSUN0301 (derivative of pSUN; SunGene GmbH S. Co KgaA, WO 0200900) before the GUS gene contained there.
  • the resulting plasmid was named pSUN0301_SSS3 and verified by sequence analysis. After transformation into the agro-bacterial strain LBA4.404, a tomato transformation was carried out using the protocol described above ( v) .
  • Example 12 Tissue-specific analysis of the. transgenic lines
  • Example 13 Quantitative determination of the strength of the SSS3 promoter in green fruits of transgenic tomato plants
  • FIG. 6 shows the evaluation of the quantitative analysis of the GUS activity in the green fruits of tomato lines, which were transformed with the pSUN0301_SSS3 construct.
  • the diagram shows the high expression of the SSS3 promoter, which is suitable for expressing other genes especially in green fruits.
  • Example 14 Comparison of Gus expression in green immature and red, ripe fruits of transgenic tomato plants
  • the GUS activity in the immature, green fruits of the tomatoes, transformed with the pSun0301_SSS3 construct, is significantly higher than in the ripe red fruits.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

Die Erfindung betrifft Verfahren zur transgenen Expression von Nukleinsäuresequenzen vorwiegend in stärkehaltigen Geweben von Pflanzen, bevorzugt in Früchten, Wurzeln, Samen oder Knollen, wobei die Nukleinsäuresequenz unter Kontrolle eines Promotors einer Stärkesynthase 3 exprimiert wird. Erfindungsgemäß sind ferner transgene Expressionskassetten und Vektoren umfassend einen Promotor einer Stärkesynthase 3, sowie die Verwendung derselben zur Herstellung von Nahrungs-, Futtermitteln, Saatgut, Pharmazeutika oder Feinchemikalien.

Description

Expressionskassette zur Expression von Nukleinsäuren in stärkehaltigen Geweben von Pflanzen
Beschreibung
Die Erfindung betrifft Verfahren zur transgenen Expression von Nukleinsauresequenzen vorwiegend in stärkehaltigen Geweben von Pflanzen, bevorzugt in Früchten, Wurzeln, Samen oder Knollen, wobei die Nukleinsauresequenz unter Kontrolle eines Promotors einer St rkesynthase 3 exprimiert wird. Erfindungsgemäß sind ferner transgene Expressionskassetten und Vektoren umfassend einen Promotor einer Starkesynthase 3 , sowie die Verwendung derselben zur Herstellung von Nahrungs-, Futtermitteln, Saatgut, Pharmazeu- tika oder Feinchemikalien.
Ziel biotechnologischer Arbeiten an Pflanzen ist die Herstellung von Pflanzen mit verbesserten Eigenschaften zum Beispiel zur Steigerung der landwirtschaftlichen Produktivität. Transkriptio- nell-e regulatorische Sequenzen oder Promotoren, welche die Expression von Genen in Pflanzen regulieren, sind essentielle Elemente der Pflanzenbiotechnologie. Verschiedene Promotoren, die erfolgreich für die Expression heterologer Gene in Pflanzen verwendet wurden, sind verfügbar und umfassen sowohl pflanzliche Promotoren (wie z.B. die Promotoren des Hitzeschockproteins hsp80 aus Blumenkohl; US 5,612,472) als auch Promotoren aus anderen nicht-pflanzliehen Quellen, wie beispielsweise Promotoren pflanzlicher Viren (z.B. der 35S Promotor des Blumenkohl Mosaik Virus) oder Pflanzen infizierender Bakterien (z.B. der Promotor der Oc- topin-Synthase aus Agrobakterium; Leisner and Gelvin (1988) Proc Natl Acad Sei USA 85 (8) .2553-2557) .
Für die Expression von heterologen Nukleinsauresequenzen in transgenen Pflanzen werden häufig sogenannte konstitutive Promo- toren eingesetzt, welche in der Pflanze weitgehend zu jeder Zeit und in jedem Gewebe die Expression eines Genproduktes regulieren. Eine gezielte Expression von Genen in bestimmten Pflanzenteilen oder zu bestimmten Entwicklungszeitpunkten ist mit diesen Promotoren nicht möglich. So wird das transgen zu exprimierende Pro- tein an Orten und zu Zeiten exprimiert, wo es nicht erforderlich ist, was beispielsweise unnötig Energie verbraucht, metabolische Veränderungen verursacht und sich so nachteilig auf das Wachstum der Pflanze auswirken kann. Auch aus Gründen der ProduktZulassung und -akzeptanz ist es wünschenswert, ein transgenes Protein nur dort zu exprimieren, wo es aufgrund seines angestrebten Effektes benötigt wird. Zu diesem Zweck genießen gewebe- und entwicklungsspezifische Promotoren ein großes Interesse. Verschiedene solche Promotoren sind bekannt. So vermittelt der Promotor des "Sucrose bindenden Protein ähnlichen Gens" (SBP) aus Vicia faba eine starke und spezifische Expression in Samen von Raps und anderen Pflanzen • (WO 00/26388) .
Früchte, Samen, Rüben oder Knollen sind als wichtige Speicherorgane pflanzlicher Organismen von hoher agro-ökonomischer Rele- vanz. Sie dienen der Speicherung von Proteinen, Ölen und Kohlenhydraten (insbesondere Stärke) . Derartige Gewebe sind in der Regel photosynthetisch inaktiv und werden auch als Sink-Gewebe oder Sink-Organe bezeichnet. Sie sind auf den Import von Photoassimi- laten aus den photosynthetisch aktiven Pflanzenteilen (Source- Organen oder Source-Geweben) angewiesen. Sowohl klassische Züchtung ,als auch biotechnologische Verfahren wurden für die Verbesserung spezifischer Aspekte der Frucht- und Knollenqualität verwendet. Qualitativ hochwertige, reife Früchte resultieren aus einer Zahl von koordinierten biochemischen und metabolischen Änderungen, welche nicht nur während der Reifung, sondern auch während der Fruchtentwicklung auftreten können. Diese Änderungen bestimmen die Endqualität und die Menge der Früchte. Beispiele für veränderte Eigenschaften beispielsweise bei Tomatenfrüchten sind eine Erhöhung des Saccharoseimportes, Umwandlung von Stärke, Akkumulation von verschiedenen organischen Säuren, Modifikationen ■ von Pigmenten und Änderungen in fungiziden und insektiziden Verbindungen. Solche Ergebnisse können durch die Überexpression von Genen/Proteinen oder durch Hemmung mittels doppelsträngiger RNA, antisense-RNA bzw. Co-Suppression erreicht werden. Da Sink-Gewebe als Speicherort der wichtigsten pflanzlichen Rohstoffe fungieren, sind Promotόren, die eine selektive Expression in diesen Geweben ermöglichen, von besonderem Interesse für die Pflanzenbiotechnologie, und erlauben eine gezielte Modifikation dieser Gewebe und ihrer Inhaltstoffe.
Verschiedene Promotoren, welche für die Expression von Nukleinsauresequenzen in Früchten, Samen oder Knollen verwendet werden können, sind dem Fachmann bekannt. Zu nennen ist der Promotor des genomischen Klons 2A11 aus Tomate (Pear et. al. (1989) Plant Mol Biol 13:639-651; WO 91/19806). Der 2All Promotor kontrolliert jedoch die Expression in den sehr frühen Stadien und ist relativ schwach. Die Ethylen induzierbaren E4 und E8 Promotoren aus Tomate (US 5,859,330; Deickmann et al. (1988) EMBO J 7:3315-3320) sowie der Promotor der Polygalacturonase (US 6,127,179) sind ebenfalls als fruchtspezifisch beschrieben. Die genannten Promotoren zeigen aber eine^ Expression nur in den späten Phasen der Fruchtentwicklung und können daher nur limitiert eingesetzt wer- den. Die Promotoren TFM7 und TFM9 (US 5,608,150) sind während der Fruchtentwicklung in grünen und gelben Stadien aktiv. Die fruchtspezifische Regulation des Actinidin Promotors aus Kiwi konnte für die Expression in Petunien nachgewiesen werden (Lin et al. (1993) Plant Mol Biol 23:489-499). Thi-1, MADS2 und eine Promotorfusion zwischen Thi-1 und dem Actin Promotor der Melone regulieren die Expression heterologer Gene spezifisch in Äpfeln (WO 00/66610) .
Weitere Promotoren sind beispielsweise Promotoren mit einer Spe- zifität für Knollen, Speicherwurzeln oder Wurzeln, wie beispielsweise der knollenspezifische Patatin Promotor Klasse I (Bevan et al. (1986) Nucl Acids Res 14:4625-4638), der Promotor des Cathepsin D Inhibitors aus Kartoffel (Herbers et al. (1994) Plant Mol. Biol. 26: 73-83), der Promotor der Stärke Synthase (GBSS1) oder der Spora in Promotor. Andere Gene mit spezifischer hoher Aktivität in Knollen sind beispielsweise der Promotor des Gens der ADP Glukosepyrophosphorylase (Müller-Röber et al. (1990) Mol Gen Genet 224:136-146), der Sucrosesynthase (Salanoubat und Belliard (1987) Gene 60:47-56; Salanoubat und Belliard (1989)
Gene 84:181-185), die Promotoren des 22 kD Protein Komplexes und des Proteinaseinhibitors (Hannapel (1990) Plant Physiol 94:919-925) und anderer Klasse I Patatine (B33) (EP-Al 0 375 092; Rocha-Sosa et al. (1989) EMBO J 8:23-29). Ein Nachteil des Pata- tin 1 Promoters besteht darin, dass er durch hohe Saccharose Konzentrationen auch in anderen Geweben als der Knolle induziert wird (Jefferson R et al (1990) Plant Mol Biol 14:995-1006).
Die im Stand der Technik beschriebenen Promotoren weisen einen oder mehrere der nachfolgenden Nachteile auf:
1) Die Promotoren weisen nicht die gewünschte Expressionsstärke auf und/oder sind nur in wenigen Pflanzenarten aktiv.
2) Die Promotoren sind nur sehr früh oder sehr spät während der Frucht- oder Knollenentwicklung aktiv.
3 ) Das Expressionsmuster stimmt nicht mit den Erwartungen überein d.h. es zeigen sich beispielsweise unerwünschte Expres- sionsaktivitäten in weiteren Geweben.
4) Die Expression vieler der genannten Promotoren ist Ethylen abhängig.
Darüberhinaus ist die Zahl der vorhandenen Promotoren stark begrenzt. Insbesondere bei Ansätzen, die eine Expression mehrerer heterologer Nukleinsauresequenzen erfordern, kann dies zum limi- tierenden' Faktor werden. Die Expression von verschiedenen hetero- logen Sequenzen in einem pflanzlichen Organismus unter dem gleichen Promotor kann zu einer "Abschaltung" ("epigenic silencing") der entsprechenden transgenen Expressionskassetten führen (Mette et eCL . (1999) EMBO J 18:241-248).
In die Synthese von Stärke, die in den Piastiden von höheren Pflanzen erfolgt, sind eine Vielzahl von biosynthetischen Enzymen wie z.B. die Stärkesynthasen (EC 2.4.1.21) involviert. Stärke- synthasen dienen der Kettenverlängerung von α-1, 4-Glukanen mittels Transfer von Glucosyleinheiten von ADP-Glukose auf die nicht-re- duzierenden Enden vorliegender α-1, 4-Glukane . Neben der "Granule bound Starch Synthase" (GBSS) sind drei weitere Klassen von Stärkesynthasen in Pflanzen beschrieben SSI (Weizen: Li et al. (1999) Theor Appl Genet 98:1208-1216; GenBank Acc.-No.: U48227; Reis: Baba ,et al. (1993) Plant Physiol 103:565-573; Kartoffel: Genbank Acc.-No.: Y10416), SS2 (Erbse: Dry et al . (1992) Plant J 2:193-202; Kartoffel: Edwards et al. (1995) Plant J 8:283-294; Mais: Harn et al. (1998) Plant Mol Biol 37:639-649; GenBank Acc- No..U66377) und SS3 (Kartoffel: Abel et al. (1996) Plant J
10:981-91, Marshall et al. (1996) Plant Gell 8:1121-1135; Mais: Gao et al. (1998) Plant Cell 10:399-412).
Verschiedene Publikationen beschreiben die Isolierung und Charak- terisierung von löslichen Stärkesynthasen aus der Kartoffelknolle, von der drei Isoformen in der löslichen Fraktion von Extrakten von Kartoffelknollen bekannt sind. Bekannt sind z.B. die Isoform 3 (Marshall et al. (1996) Plant J 10:981-991; GenBank Acc.-Nr.: X95759; EP 0779363-A3), die SSI Isoform (GenBank Acc- Nr.: Y10416; Kossmann et al. (1999) Planta 208:503-11), die vorwiegend in Blättern und nur wenig in Knollen exprimiert wird. Ferner sind lösliche Starkesynthase 3 beschrieben aus Kartoffel (GenBank Acc.-Nr.: X94400; Abel et al. (1996) Plant J 10:981-91), Mais (GenBank Acc.-Nr.: AF023159,' A93359), Reis (GenBank Acc- Nr.:D16202), Weizen (GenBank Acc. Nr.: AJ292522 Triticum aesti- vum; AF258609 Aegilops tauschii) , der Spargel/Cat ang-Bohne (Vi- gna unguiculata; GenBank Acc. Nr.: AJ225088) , und Arabidopsis (GenBank Acc. Nr.: AC007296) . Die Expression der Kartoffel SSS3 erfolgt nach Abel et al . vorwiegend in den Knollen, aber auch in den "sink und.source" Blättern. Promotoren der SSS3-Gene oder diese umfassende transgene Expressionskonstrukte sind nicht beschrieben.
Es stellte sich daher die Aufgabe, neue Promotoren und von diesen abgeleitete transgene Expressionskassetten bereit zustellen, die eine transgene Expression von Nukleinsauresequenzen während der gesamten Entwicklungszeit der Knollen, von jüngsten Stadien bis zur Lagerung der Knollen gewährleisten und eine hohe Spezifität für stärkehaltige Gewebe aufweisen. Diese Aufgabe wird durch die vorliegende Erfindung gelöst.
Ein erster Gegenstand der Erfindung betrifft Verfahren zur gezielten, transgenen Expression von Nukleinsauresequenzen in mindestens einem stärkehaltigen Gewebe einer Pflanze, wobei nachfolgende Schritte umfasst sind
0 1. Einbringen einer transgenen Expressionskassette in pflanzliche Zellen, wobei die transgene Expressionskassette mindestens nachfolgende Elemente enthält
a) mindestens eine Promotorsequenz eines Gens kodierend für 5 eine Starkesynthase 3, und
b) mindestens eine weitere Nukleinsauresequenz,
wobei mindestens eine der besagten Promotorsequenzen und eine ° weitere Nukleinsauresequenz funktioneil miteinander verknüpft sind und besagte weitere Nukleinsauresequenz in Bezug auf die Promotorsequenz heterolog ist, und
2. Auswahl von transgenen Zellen, die besagte Expressionskas- 5 sette stabil in das Genom integriert enthalten, und
3. Regeneration von vollständigen Pflanzen aus besagten transgenen Zellen, wobei mindestens eine der weiteren Nukleinsauresequenz gezielt in einem stärkehaltigen Gewebe exprimiert 0 wird.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft daher eine isolierte Nukleinsauresequenz umfassend den Promotor der Starkesynthase 3 aus Kartoffel. Bevorzugt umfasst besagte isolierte 5 Nukleinsauresequenz eine Nukleinsauresequenz ausgewählt aus
1. der Sequenzen gemäß SEQ ID NO:. 1 oder 44 oder den dazu komplementären Sequenzen,
0 2. Fragmenten von mindesten 25 zusammenhängenden Nukleotiden, bevorzugt mindestens 50 zusammenhängenden Nukleotiden, besonders bevorzugt mindestens 100 zusammenhängenden Nukleotiden der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder 44 oder den dazu komplementären Sequenzen, 3. Sequenzen, die eine Homologie aufweisen von mindestens 50 %, bevorzugt 70 %, vorzugsweise mindestens 80 %, besonders bevorzugt mindestens 90 %, ganz besonders bevorzugt mindestens 95 %, am meisten bevorzugt 99% zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder 44 oder den dazu komplementären Sequenzen, wobei sich die Homologie über eine Länge von mindestens 100 Basenpaaren, bevorzugt mindestens 200 Basenpaaren, besonders bevorzugt von mindestens 300 Basenpaaren, ganz besonders bevorzugt von mindestens 400 Basenpaaren, am meistens bevorzugt über die gesamte Länge der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder 44 erstreckt .
Unter Homologie zwischen zwei Nukleinsäuren wird im Rahmen dieser Erfindung die Identität der Nukleinsauresequenz über die jeweils angegebene Sequenzlänge verstanden, die durch Vergleich mit Hilfe des Programmalgorithmus GAP (Wisconsin Package Version 10.0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG) , Madison, USA) unter Einstellung folgender Parameter berechnet wird:
, Gap Weight: 12 Length Weight: 4
Average Match: 2,912 Average Mismatch:-2 , 003
Beispielhaft wird unter einer Sequenz, die eine Homologie von mindestens 50 % auf Nukleinsäurebasis mit der Sequenz SEQ ID
NO: 1 über die gesamte Länge der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 aufweist, eine Sequenz verstanden, die bei einem Vergleich mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 nach obigem Programmalgorithmus mit obigem Parametersatz eine Homologie von mindestens 50 % aufweist.
Ein weiterer Gegenstand betrifft transgene Expressionskassetten, wie sie z.B. in dem erfindungsgemäßen Verfahren zum Einsatz kommen können. Bevorzugt umfassen die transgenen Expressionskassetten zur gezielten, transgenen Expression von Nukleinsäuresequen- zen in mindestens einem stärkehaltigen Geweben einer Pflanze,
a) mindestens eine Promotorsequenz eines Gens kodierend für eine Starkesynthase 3 , und
b) mindestens eine weitere Nukleinsauresequenz,
wobei mindestens eine Promotorsequenz und eine weitere Nukleinsauresequenz funktionell miteinander verknüpft sind und die weitere Nukleinsauresequenz in Bezug auf die Promotorsequenz heterolog ist. Die erfindungsgemäßen Expressionskassetten können weitere genetische Kontrollsequenzen und/oder zusätzliche Funktionselemente enthalten. Bevorzugt können die transgenen Expressionskassetten durch die transgen zu exprimierende Nukleinsauresequenz die Expression eines von besagter Nukleinsauresequenz kodierten Proteins, und/oder die Expression eines von besagter Nukleinsauresequenz kodierter sense-RNA, antisense-RNA oder doppeisträngigen RNA ermöglichen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft transgene Expressionsvektoren, die eine der erfindungsgemäßen Expressionskassetten enthalten.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft transgene Organis- men, die eine der erfindungsgemäßen Expressionskassetten oder Expressionsvektoren enthalten. Der Organismus kann ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Bakterien, Hefen, Pilzen, nichtmenschlichen tierischen und pflanzlichen Organismen oder von diesen abgeleitete Zellen, Zellkulturen, Teile, Gewebe, Organe oder Vermehrungsgut, bevorzugt ist der Organismus ausgewählt aus der Gruppe der landwirtschaftlichen Nutzpflanzen. Bevorzugt ist in besagten Pflanzen die Expression der transgen zu exprimierenden Nukleinsauresequenz in mindestens einem stärkehaltigen Gewebe (z.B. der Kartoffelknolle, Rübe, Wurzel, des Samen oder der Toma- tenfrucht) , höher als in einem anderen Gewebe.
Ein weiterer Gegenstand betrifft die Verwendung der erfindungsgemäßen isolierten Nukleinsauresequenzen, transgenen Expressionsvektoren oder transgenen Organismen zur transgenen Expression von Nukleinsäuren und/oder Proteinen. Insbesonders bevorzugt ist die Verwendung der besagten transgenen Organismen oder von diesem abgeleitete Zellen, Zellkulturen, Teile, Gewebe, Organe oder Vermehrungsgut zur Herstellung von Nahrungs-, Futtermitteln, Saatgut, Pharmazeutika oder Feinchemikalien, wobei die Feinchemika- lien bevorzugt Enzyme, Vitamine, Aminosäuren, Zucker, gesättigte oder ungesättigte Fettsäuren, natürliche oder synthetische Geschmacks-, Aroma- oder Farbstoffe sind. Erfindungsgemäß umfasst sind ferner Verfahren zur Herstellung besagter Nahrungs-, Futtermitteln, Saatgut, Pharmazeutika oder Feinchemikalien unter Ein- satz der erfindunsggemäßen transgenen Organismen oder von diesen abgeleitete Zellen, Zellkulturen, Teile, Gewebe, Organe oder Ver- mehr,μngsgut. Ein besonderer Vorteil der erfindungsgemäßen Starkesynthase 3- Pro otoren ist ihre Aktivität in stärkehaltigen Geweben, bevorzugt während der gesamten Entwicklung und Lagerung von Kartoffelknollen und seine hohe Aktivität in grünen Tomatenfrüchten.
Die Expression der natürlichen Starkesynthase 3 aus Kartoffel (d.h. die Expressionsaktivität der nicht transgenen, homologen Kombination des Starkesynthase 3-Promotors und der kodierenden Region des Starkesynthase 3-Gens) zeigt eine signifikante Expres- sion auch in den Blättern (Abel et al. (1996) Plant J 10:981-91). Im Unterschied dazu zeigen die im Rahmen dieser Erfindung bereitgestellten heterologen transgenen Expressionskassetten keine relevante Expression in Blättern, was für zahlreiche biotechnologische Anwendungen von großer Bedeutung ist.
Die im Rahmen dieser Erfindung bereitgestellten Promotoren der Stärkesynthase-3 (SSS3), insbesondere der SSS3-Promotor aus Kartoffel, vermittelt sowohl eine hohe Expression während der gesamten Knollenentwicklung bis in die späte Speicherphase als auch eine hohe Gewebespezifität, was den signifikanten Wert für die Nutzung in transgenen Pflanzen unterstreicht. Eine Analyse in Tomate hat ergeben, daß der SSS3-Promoter ebenfalls in den Früchten, vorwiegend in den grünen Früchten, eine starke Expression bewirkt. Schwache Nebenaktivitäten wurden nur in' Pollen und Samen gefunden. Von besonderem Interesse ist eine ausgeprägte Aktivität nach der Ernte und während der Lagerung der trangenen Pflanzen (insbesondere Knollen) . Dies macht die erfindungsgemäßen Promotoren geeignet für sogenannte "Post-Harvest" Anwendungen.
Aufgrund seiner hohen Expressionsaktivität und Spezifität ist der erfindungsgemäße SSS3-Promotor von besonderem Wert für die Pflanzenbiotechnologie. Durch die Funktion der löslichen Stärke Syn- thase-3 im Stärkemetabolismus und dem gefundenen Expressionsmuster kann erwartet werden, daß der Promotor in allen stärkehalti- gen Geweben bevorzugt in Früchten, Samen, Rüben und Knollen anderer Pflanzen aktiv ist. Ganz besonders vorteilhaft ist hier die Verwendung in Ansätzen, die der Modifikation des Kohlenhydrat- und/oder Stärkemetabolismus dienen. Die erfindungsgemäßen Promotoren können aufgrund ihrer Frucht- bzw. Knollenspezifität insbe- sondere zur Verbesserung der Qualität der sich entwickelnden Frucht oder Knolle oder zur Beeinflussung des Reifungsprozeß eingesetzt werden. Dabei werden bevorzugt Nukleinsauresequenzen transgen unter Kontrolle der erfindungsgemäßen Promotoren exprimiert, die eine Modulation des Zucker- oder Stärkemetabolismus, eine Modifikation von Inhaltsstoffen, eine Verbesserung von Nährwerten, eine Veränderung der "sink-source"-Relationen, Geschmackskomponenten, Pathogenresistenz , Gewebekonsistenz etc beinflussen. In den Tomatenfrüchten kann ein SSS3-Promotor beispielsweise zur Modifikation von Flavanoiden und Carotinoiden verwendet werden. Spezifische Anwendungsformen sind weiter unten aufgeführt. Die Gene, die durch den erfindungsgemäßen Promotor reguliert werden, können pflanzliche Gene, frucht- und knollenspezifische Gene oder heterologe Gene, deren Expression in den Früchten oder Knollen erwünscht ist, sein.
"Promotor eines Stärkesynthase-3 Gens" oder "Stärkesynthase-3 Promotor" (infolge auch SSS3-Promotor) meint allgemein die natürliche regulatorische Region eines Gens kodierend für eine Stärke- synthase-3. Die Stärkesynthase-3 ist auch als lösliche Starkesynthase oder lösliche Stärkesynthase-3 ("soluble starch synthase 3, SSS3) bekannt. Entsprechende Bezeichnungen sind synonym zu verstehen. Bevorzugt sind Promotoren, die einen Sequenzbereich von mindestens 250 Basenpaaren, bevorzugt mindestens 500 Basenpaaren, besonders bevorzugt 1000 Basenpaaren, am meisten bevorzugt mindestens 2000 Basenpaaren in 5 '-Richtung vor dem ATG- Startkodon der besagten genomischen Sequenzen kodierend für eine Stär-kesynthase-3 umfassen.
"Starkesynthase" meint im Rahmen dieser Erfindung jedes enzyma- tisch aktive Peptid, Polypeptid, Oligopeptid, Protein oder Enzym Molekül, welches zumindest befähigt ist, eine Glucosyleinheit von ADP-Glukose auf ein α-1, 4-Glukanmolekül zu übertragen, sowie Fra- gemente besagter enzymatisch aktiver Moleküle.
"Stärkesynthase-3", "lösliche Starkesynthase 3" oder "SSS3" meint eine Starkesynthase gemäß obiger Definition, die weiterhin eine oder mehr nachfolgender Eigenschaften aufweist:
1. sie ist kodiert durch eine Nukleotidsequenz umfassend mindestens 20 Nukleotide einer Sequenz gemäß SEQ ID NO: 5, 7, 9, 11, 13, 15 oder 17;
2. sie ist kodiert durch eine Nukleotidsequenz umfassend eine Sequenz, die eine Homologie von mindestens 85% oder mehr zu einer Sequenz gemäß SEQ ID NO: 5, 7, 9, 11, 13, 15 oder 17 aufweist;
3. sie umfasst eine Aminosäuresequenz mit einer Homologie von mindestens 85% zu einer der Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16 oder 18;
4. sie umfasst eine Sequenz von mindestens 10 zusammenhängenden Aminosäuren, bevorzugt mindestens 20 zusammenhängenden Aminosäuren, besonders bevorzugt mindestens 50 zusammenhängenden Aminosäuren einer Sequenz gemäß SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16 oder 18;
und wobei die Aminosäuresequenz kodierend für die Starkesynthase mindestens ein Sequenzmotiv umfasst ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
(a) NE(P/S)DVXI(K/M)GAFN (SEQ ID NO: 19),
(b) PK(E/Q)AY(R/K)XDFVFFNG (SEQ ID NO: 20), (c) DWVFADGP (SEQ ID NO: 21),
(d) FL(V/L)SQK(H/D) (V/DVYTEPL (SEQ ID NO: 22),
(e) YNP(A/S)NT(V/N)L(N/T)GKPE(V/I)WFRXS-FN (SEQ ID NO: 23) ,
(f) DAYMMDFVFSE (SEQ ID NO: 24),
(g) KVGGL(G/A)DWTS, (SEQ ID NO: 25), , bevorzugt AKVGGL(G/A)DWTSLSRA
(SEQ ID NO: 26) , i(h) HCHDWSSAPV(A/S)WL (SEQ ID NO: 27),
(i) FTIHNLEFGA (SEQ ID NO: 28),
(j) NGIDPDIWDP (SEQ ID NO: 29), bevorzugt GI (L/V/I)NGIDPDIWDP (Y/L) (T/N) D(N/K) FIP
(SEQ ID NO: 30) , (k) VG(I/V)ITRLT(A/H)QKG (SEQ ID NO: 31), bevorzugt VG(Ϊ/V) ITRLT(A/H)QKGIHLIKHA (SEQ ID NO: 32), (1) NGQWLLGSA (SEQ ID NO: 33), bevorzugt TLERNGQWLLGSAPD (SEQ ID NO: 34) ,
(m) LTYDEPLSHLIY (SEQ ID NO: 35),
(n) DFI(L/I)VPSIFEPCGLTQL, (SEQ ID NO: 36), bevorzugt AG(S/A)DFI (L/I)VPSIFEPCGLTQL(V/I)AMRYG
(SEQ ID NO: 37) , (h) DTVFDVD(H/N)DK (SEQ ID NO: 38), und
(i) VMEQDWSWNRP (SEQ ID NO: 39)
Weitere für SSS3-Proteine charakteristische Motive können leicht aus einem Vergleich bekannter SSS3-Protein- oder Nukleinsauresequenzen abgeleitet werden (vgl. Fig.7).
Unter Homologie zwischen zwei Polypeptiden wird die Identität der Aminosäuresequenz über die jeweilige Sequenzlänge verstanden, die durch Vergleich mit Hilfe des Programmalgorithmus GAP (Wisconsin Package Version 10.0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG) , Madison, USA) unter Einstellung folgender Parameter berechnet wird: Gap Weight: 8 ■ Length Weight: 2
Average Match: 2,912 Average Mismatch:-2, 003
Beispielhaft wird unter einer Sequenz, die eine Homologie von mindestens 85 % auf Proteinbasis mit der Sequenz SEQ ID NO: 6 über die gesamte Länge- aufweist, eine Sequenz verstanden, die bei einem Vergleich mit der 'Sequenz SEQ ID NO: 6 nach obigem Programmalgorithmus mit obigem Parametersatz eine Homologie von min- destens 85 % aufweist.
Insbesondere meint SSS3-Promotor Nukleotidsequenzen, die eine Nukleinsauresequenz umfassen ausgewählt aus
1. den Sequenzen SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 oder 44, oder den dazu komplementären Sequenzen,
2. Fragmenten von mindesten 25 zusammenhängenden Nukleotiden, bevorzugt mindestens 50 zusammenhängenden Nukleotiden, beson- .ders bevorzugt mindestens 100 zusammenhängenden Nukleotiden einer Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 oder 44 oder den dazu komplementären Sequenzen,
3. Sequenzen, die eine Homologie aufweisen von mindestens 50 %, bevorzugt 70 %, vorzugsweise mindestens 80 %, besonders bevorzugt mindestens 90 %, ganz besonders bevorzugt mindestens 95 %, am meisten bevorzugt 99% zu einer der Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 oder 44 oder den dazu komplementären Sequenzen, wobei sich die Homologie über eine Länge von mindestens 100 Basenpaaren, bevorzugt mindestens 200
Basenpaaren, besonders bevorzugt von mindestens 300 Basenpaaren, ganz besonders bevorzugt von mindestens 400 Basenpaaren, am meistens bevorzugt von mindestens 500 Basenpaaren erstreckt .
Am meisten bevorzugt umfasst ein SSS3-Promotor den Promotor der SSS3 aus Kartoffel gemäß SEQ ID NO 1 oder 44 oder Fragmente desselben mit einer Länge von mindestens 50 Nukleotiden, bevorzugt 100 Nukleotiden.
Besonders bevorzugt hat ein SSS3-Promotor im wesentlichen die gleiche Promotoraktivität wie einer der Promotoren gemäß SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 oder 44, bevorzugt wie der Promotor gemäß SEQ ID NO : 1 oder 44. Dabei kann die Expressionshöhe sowohl nach unten als auch nach oben im Vergleich zu einem Vergleichswert abweichen. Bevorzugt sind dabei solche Sequenzen, deren Expressionshöhe, gemessen anhand der transkribierten mRNA oder dem infolge translatierten Protein, unter ansonsten unveränderten Bedingungen quantitativ um nicht mehr als 50%, bevorzugt 25%, besonders bevorzugt 10 % von einem Vergleichswert erhalten mit den durch SEQ ID NO: 1 oder 44 beschriebenen Promotoren unterscheidet. Beson- ders bevorzugt sind solche Sequenzen, deren Expressionshöhe, gemessen anhand der transkribierten mRNA oder dem infolge translatierten Protein, unter ansonsten unveränderten Bedingungen quantitativ um mehr als 50%-, bevorzugt 100%, besonders bevorzugt 500%, ganz besonders bevorzugt 1000% einen Vergleichswert erhal- ten mit dem durch SEQ ID NO: 1 oder 44 beschriebenen Promotor übersteigt .
Eine Promotoraktivität wird als "im wesentlichen gleich" in Bezug auf einen SSS3-Promotor bezeichnet, wenn die Transkription einer bestimmten transgen zu exprimierenden Nukleinsauresequenz unter Kontrolle des besagten funktioneil äquivalenten Promotors unter ansonsten unveränderten Bedingungen eine gezielte Expression in mindestens einem stärkehaltigen Gewebe zeigt .
"Stärkehaltige Gewebe" meint Gewebe, die zumindest zu einem Zeitpunkt ihrer Entwicklung einen Stärkegehalt aufweisen, der mittels eines Stärkenachweises nachweisbar ist. Bevorzugt ist als Stärkenachweis eine Färbung mit Lugol' scher Lösung (Lugol'sche Lsg. : z.B. 2 g KJ in 5 ml Wasser lösen, darin 1 g Jod lösen und 300 ml Wasser dazugegeben) . Die Färbung erfolgt bis zu einem erkennbaren Blauton (ca. 15 min bei RT) und kann durch Waschen mit Wasser abgestoppt werden. Der Stärkegehalt kann auch photometrisch mittels der bei Hajirezaei et al. (1994, Planta 192: 16-30) beschriebenen Methode bestimmt werden.
Besonders bevorzugt meint "stärkehaltige Gewebe" Speichergewebe einer pflanzlichen Knolle, Rübe oder Frucht wie wie z.B. der Kartoffelknolle, der Rübe oder Tomatenfrucht. "Stärkehaltiges Gewebe" umfasst weiterhin "Sink-Gewebe" stärkeproduzierender Pflanzen. "Sink-Gewebe" meint Gewebe, die Nettoimporteure von photosynthetisch fixiertem Kohlendioxid sind und in der Regel nicht photosynthetisch aktiv sind, Beispielhaft für Sink-Gewebe sind zu nennen: Wurzeln, Früchte, Rüben, Knollen und Samenkörner.
Die Expression unter Kontrolle eines der erfindungsgemäßen Promotoren in einem Kohlenhydrat-speichernden, -synthetisierenden oder -metabolisierenden Sink-Gewebe oder einem Stärke-Sink-Gewebe, bevorzugt mindestens das doppelte, ganz besonders bevorzugt mindestens das fünffache, am meisten bevorzugt mindestens das zehn- fache als in einem anderen Gewebe, beispielsweise einem Source- Gewebe . "Gezielt"' meint in Bezug auf die Expression in einem stärkehaltigen Gewebe bevorzugt, dass die Expression unter Kontrolle eines der erfindungsgemäßen Promotoren in einem ersten Gewebe bevorzugt mindestens das zehnfache, ganz besonders bevorzugt mindestens das 5 fünf,zigfache, am meisten bevorzugt mindestens das hundertfache beträgt als in einem zweiten Gewebe, wobei der Stärkegehalt in dem ersten Gewebe (beispielsweise ermittelt durch Färbung mit Lugol 'scher Lösung) mindestens das zweifache, bevorzut mindestens das fünffache, besonders bevorzugt mindestens das zehnfache, am
10 meisten bevorzugt mindestens das fünfzigfache des Stärkegehaltes in dem zweiten Gewebe beträgt. Beispielsweise meint "gezielt" , dass die Expression unter Kontrolle eines der erfindungsgemäßen Promotoren in einem stärkehaltigen "Sink"-Gewebe wie den Knollen bevorzugt mindestens das zehnfache, ganz besonders bevorzugt
15 mindestens das fünfzigfache, am meisten bevorzugt mindestens das hundertfache beträgt als in einem "Source-Gewebe" wie den Blättern.
"Ansonsten unveränderte Bedingungen" bedeutet, dass die Expres- 20 sion, die durch eine der zu vergleichenden transgenen Expressionskassetten initiiert wird, nicht durch Kombination mit zusätzlichen genetischen Kontrollse uenzen, zum Beispiel Enhancer- Sequenzen, modifiziert wird. Unveränderte Bedingungen bedeutet ferner, dass alle Rahmenbedingungen wie beispielsweise Pflanzen- 25 art, EntwicklungsStadium der Pflanzen, Zuchtbedingungen, Assay- bedingungen (wie Puffer, Temperatur, Substrate etc.) zwischen den zu vergleichenden Expressionen identisch gehalten werden.
Bevorzugt ist die Expression innerhalb mindestens eines be- 30 stimmten stärkehaltigen Gewebes über alle Entwicklungsstufen im wesentlichen konstant. "Im wesentlichen konstant" bedeutet dabei bevorzugt, dass die Standartabweichung der Expression zwischen den einzelnen EntwicklungsZeitpunkten des jeweiligen Gewebes bezogen auf den statistischen Mittelwert der Expression über alle 35 Entwicklungszeitpunkte geringer ist als '50 %, bevorzugt 20 %, besonders bevorzugt 10 %, ganz besonders bevorzugt 5 %.
Bevorzugt werden im Rahmen der Ermittlung der Expressionshöhe solche Nukleinsauresequenzen in funktioneller Verknüpfung mit dem
40 zu prüfenden Promotor eingesetzt, die für leicht quantifizierbare Proteine kodieren. Ganz besonders bevorzugt sind dabei Reporterproteine (Schenborn E, Groskreutz D (1999) Mol Biotechnol 13(1): 29-44) wie "green fluorescence protein" (GFP) (Chui WL et al . (1996) Curr Biol 6:325-330; Leffel SM et al.(1997) Biotechniques
45 23 (5) :912-8) , Chloramphenicoltransferase, Luziferase (Millar et al. (1992.) Plant Mol Biol Rep 10:324-414), ß-Glucuronidase oder ß-Galactosidase. Ganz besonders bevorzugt ist die ß-Glucuronidase (Jefferson et al. (1987) EMBO J 6:3901-3907).
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung 5 mindestens einer Nukleinsauresequenz oder eines Teils derselben in Verfahren zur Identifikation und/oder Isolation von Promotoren von Genen, die für besagte Nukleinsauresequenz kodieren, wobei besagte Nukleinsauresequenz für eine Aminosäuresequenz kodiert, die mindestens ein Sequenzmotiv gemäß SEQ ID NO: 19, 20, 21, 22,
10 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 oder 39 oder eine für diese Sequenzen angegebene Variation umfasst . Bevorzugt kodiert besagte Nukleinsauresequenz für eine Aminosäuresequenz umfassend eine Sequenz gemäß SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16 oder 18. Besonders bevorzugt umfasst besagte Nu-
15 kleinsäuresequenz eine Sequenz gemäß SEQ ID NO: 5, 7, 9, 11, 13, 15 oder 17. "Teil" meint in Bezug auf die Nukleinsauresequenz bevorzugt eine Sequenz von mindestens 15 Basen, bevorzugt 25 Basen, besonders bevorzugt 50 Basen, am meisten bevorzugt 100 Basen.
20 Erfindungsgemäß umfasst sind ferner Verfahren zur Identifikation und/oder Isolation von Promotoren von SSS3-Genen, wobei bei der Identifikation und/oder Isolation mindestens eine Nukleinsauresequenz oder ein Teil derselben zum Einsatz kommt, wobei besagte Nukleinsauresequenz für eine Aminosäuresequenz kodiert, die min-
25 destens eine Sequenz gemäß SEQ ID NO: 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 oder 39 oder eine für diese Sequenzen angegebene Variation umfasst . Bevorzugt kodiert besagte Nukleinsauresequenz für eine Aminosäuresequenz umfassend eine Sequenz gemäß SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16 oder
30 18. Besonders bevorzugt umfasst besagte Nukleinsauresequenz eine Sequenz gemäß SEQ ID NO: 5, 7, 9, 11, 13, 15 oder 17. "Teil" meint in Bezug auf die Nukleinsauresequenz bevorzugt eine Sequenz von mindestens 15 Basen, bevorzugt 25 Basen, besonders bevorzugt 50 Basen, am meisten bevorzugt 1Ö0 Basen. In einer bevorzugten
35 Ausführungsform basiert das erfindungsgemäße Verfahren auf der Polymerasekettenreaktion, wobei die besagte Nukleinsauresequenz oder ein Teil derselben als Primer eingesetzt wird.
Dem Fachmann sind verschiedene Verfahren bekannt, um ausgehend 40 von einer Nukleinsauresequenz (z.B. einem Gentranskript wie beispielsweise einer cDNA) den Promotor des entsprechenden Gens zu iderψifizieren und zu isolieren. Dazu stehen beispielsweise prinzipiell alle Methoden zur Amplifikation flankierender chromosoma- ler Sequenzen zur Verfügung. Die beiden am häufigsten genutzten 45 Verfahren sind die inverse PCR ("iPCR") und die "Thermal Asymmetrie Interlaced PCR" (/'TAIL PCR"). Für die "iPCR" wird genomische DNA des Organismus, aus dem der funktioneil äquivalente Promotor zu isolieren ist, mit einem gegebenen Restriktionsenzym komplett verdaut und anschließend werden in einem verdünnten Ansatz die einzelnen Fragmente rückli- gier,t, also mit sich selbst zu einem ringförmigen Molekül verbunden. In der Vielzahl enstehender ringförmiger DNA-Moleküle befinden sich auch solche, die die bekannte Sequenz (beispielsweise die Sequenz kodierend für das homologe Protein) enthalten. Ausgehend davon kann das ringförmige Molekül mittels PCR amplifiziert werden, indem ein Primerpaar verwendet wird, bei dem beide Primer sich an den bekannten Sequenzabschnitt anlagern können.
Die "TAIL-PCR" beruht auf der Verwendung von einerseits einem Satz sukzessive verkürzter hochspezifischer Primer, die sich an die bekannte genomische Sequenz (beispielsweise die Sequenz kodierend für das homologe Protein) anlagern, und andererseits einem Satz kürzerer Zufallsprimer mit geringer Schmelztemperatur, so dass eine sequenzunspezifischere Anlagerung an die bekannte genomische Sequenz flankierende genomische DNA erfolgt. Die Anla- gerung der Primer an die zu amplifizierende DNA kann mit einer solchen Primerkombimation so gestaltet werden, dass eine spezifische Amplifikation der gewünschten Zielsequenz möglich wird.
Eine weitere Möglichkeit unbekannte Sequenzabschnitte zu amplifi- zieren, bietet die sogenannte „Genome Walking" Technologie (Clon- tech) . Dabei werden sogenannte ungeklonte, Adaptor-ligierte Bibliotheken von genomischen DNA Fragmenten hergestellt . Mittels genspezifischer und adaptorspezifischer Primer werden dann in mehreren PCR Schritten die gewünschten, unbekannte DNA Sequenzen enthaltenden PCR Produkte amplifiziert.
Beispiele für die in den erfindungsgemäßen transgenen Expressionskassetten oder transgenen Expressionsvektoren zum Einsatz kommenden. PromotorSequenzen lasseh sich beispielsweise in ver- schiedenen Organismen, deren genomische Sequenz bekannt ist, wie beispielsweise Arabidopsis thaliana, Brassica napus, Nicotiana tabacum, Solanum tuberosum, Helianthium a nuus, Linum sativum durch Homologievergleiche in Datenbanken leicht auffinden. Bevorzugt kann man dazu von den kodierenden Regionen der Gene ausge- hen, deren Promotoren durch SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 oder 44 beschrieben sind. Ausgehend von beispielsweise den cDNA Sequenzen dies-er Gene beschrieben durch SEQ ID NO: 5, 7, 9 oder 11 oder den davon abgeleiteten Proteinsequenzen beschrieben durch SEQ ID NO: 6, 8, 10 oder 12 können die entsprechenden homologen Gene in an- deren Pflanzenarten durch Durchmusterung von Datenbanken oder Genbankeή (unter Verwendung von entsprechenden Gensonden) leicht in der dem Fachmann geläufigen Weise identifiziert werden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft Verfahren zur Her- 5 Stellung einer transgenen Expressionskassette mit Spezifität für stärkehaltige Gewebe, umfassend nachfolgende Schritte:
1. Isolation eines Promotors mit Spezifität für stärkehaltige Gewebe, wobei bei der Isolation mindestens eine Nukleinsäure-
10 sequenz oder ein Teil derselben zum Einsatz kommt, wobei besagte Nukleinsauresequenz für eine Aminosäuresequenz kodiert, die mindestens eine Sequenz gemäß SEQ ID NO: 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 oder 39 oder eine für diese Sequenzen angegebene Variation
15 umfasst .
II. .Funktionelle Verknüpfung besagten Promotors mit einer weiteren Nukleinsauresequenz, wobei besagte Nukleinsauresequenz in Bezug auf den Promotor heterolog ist .
20
Bevorzugt kodiert besagte Nukleinsauresequenz für eine Aminosäuresequenz umfassend eine Sequenz gemäß SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16 oder 18. Besonders bevorzugt umfasst besagte Nukleinsauresequenz eine Sequenz gemäß SEQ ID NO: 5, 7, 9, 11, 13, 15 oder
25 17. "Teil" meint in Bezug auf die Nukleinsauresequenz bevorzugt eine Sequenz von mindestens 15 Basen, bevorzugt 25 Basen, besonders bevorzugt 50 Basen, am meisten bevorzugt 100 Basen. In einer Bevorzugten Ausführungsform basiert das erfindungsgemäße Verfahren auf der Polymerasekettenreaktion, wobei die besagte Nuklein-
30 säuresequenz oder ein Teil derselben als Primer eingesetzt wird. Im Rahmen der funktioneilen Verknüpfung können dem Fachmann bekannte Verfahren wie .z.B. Ligation etc. eingesetzt werden (s.u.).
Geeignete SSS3-Promotoren umfassen umfassen auch natürliche oder 35 künstliche Mutationen der unter SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 oder 44 beschriebenen Promotorsequenzen. "Mutation" meint Substitution, Addition, Deletion, Inversion oder Insertion eines oder mehrerer Nukleotidreste. Somit werden beispielsweise auch solche Nukleo- tidsequenzen durch die vorliegende Erfindung mit umfasst, welche 40 man durch Modifikation eines SSS3-Promotors gemäß SEQ ID NO: 1,
2 , 3 , 4 oder 44 erhält . Ziel einer solchen Modifikation kann die weitere Eingrenzung der darin enthaltenen Sequenz oder z.B. auch das Einfügen oder Entfernen von Restriktionsendonukleaseschnitt- steilen, die Entfernung überflüssiger DNA oder das Hinzufügen
45 weiterer Sequenzen, zum Beispiel weiterer regulatorischer Sequenzen, sein. Wo Insertionen, Deletionen oder Substitutionen, wie z.B. Transitionen und Transversionen, in Frage kommen, können an sich bekannte Techniken, wie in vitro-Mutagenese, "primer repair" , Restriktion oder Ligation verwendet werden. Transition meint einen Basenpaaraustausch eines Purin/Pyrimidin-Paares in ein anderes Purin/Pyrimidin-Paar (z.B. A-T gegen G-C) . Transver- sion meint einen Basenpaaraustausch eines Purin/Pyrimidin-Paares gegen ein Pyrimidin/Purin-Paar (z.B. A-T gegen T-A) . Deletion meint die Entfernung eines oder mehrerer Basenpaare. Insertion meint die Einführung eines oder mehrerer Basenpaare. Durch Manipulationen, wie z.B. Restriktion, "chewing-back" oder Auffüllen von Überhängen für "blunt ends" können komplementäre Enden der Fragmente für die Ligation zur Verfügung gestellt werden. Zu analogen Ergebnissen kann man auch unter Verwendung der Polymerase- kettenreaktion (PCR) unter Verwendung spezifischer Oligonukleo- tid-Primer kommen.
Verfahren zur Mutagenisierung von Nukleinsauresequenzen sind dem Fachmann bekannt und schließen beispielhaft die Verwendung von Oligonukleotiden mit einer oder mehr Mutationen im Vergleich zu der zu mutierenden Region ein (z.B. im Rahmen einer "site- specific mutagenesis") . Typischerweise kommen Primer mit ungefähr 15 bis ungefähr 75 Nukleotiden oder mehr zum Einsatz, wobei bevorzugt ca. 10 bis ca. 25 oder mehr Nukleotidreste an beiden Seiten der zu verändernden Sequenz lokalisiert sind. Details und Durchführung besagter Mutageneseverfahren sind dem Fachmann geläufig (Kunkel et al. (1987) Methods Enzymol 154:367-382; Tomic et al. (1990) Nucl Acids Res 12:1656; Upender et al . (1995) Bio- techniques 18(l):29-30; US 4,237,224). Eine Mutagenese kann auch durch Behandlung von beispielsweise transgenen Expressionsvektoren, die eine der erfindungsgemäßen Nukleinsauresequenzen enthal- ten, mit mutagenisierenden Agentien wie Hydroxylamin realisiert werden.
Alternativ können nicht-essentielle Sequenzen eines erfindungsgemäßen Promotors deletiert werden, ohne die genannten wesentli- chen Eigenschaften signifikant zu beeinträchtigen. Derartige Deletionsvarianten stellen funktioneil äquivalente Fragmente zu den Promotoren beschrieben durch SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 oder 44 dar. Die Eingrenzung der Promotorsequenz auf bestimmte, essentielle regulatorische Regionen kann z.B. mit Hilfe von Suchrouti- nen zur Suche von Promotorelementen vorgenommen werden. Oft sind in den für die Promotoraktivität relevanten Regionen bestimmte Promptorelemente gehäuft vorhanden. Diese Analyse kann beispielsweise mit Computerprogrammen wie dem Programm PLACE ("Plant Cis- acting Regulatory DNA Elements"; Higo K et al . (1999) Nucl Acids Res 27(1): 297-300), der BIOBASE Datenbank "Transfac" (Biologische Datenbanken GmbH,^ Braunschweig; Wingender E et al. (2001) Nucleic Acids Res 29(l):281-3) oder Datenbank PlantCARE (Lescot M et al. (2002) Nucleic Acids Res 30(l):325-7) vorgenommen werden. Ferner können einzelne Fragmente besagter Promotoren verwendet werden, um beispielsweise in Kombination mit anderen regulatorischen Elementen synthetische Promotoren zu generieren oder vor- teilhaft zu optimieren.
Besagte erfindungsgemäße Fragmente umfassen bevorzugt mindestens 25 zusammenhängende Nukleotide, bevorzugt mindestens 50 zusammenhängende Nukleotide, besonders bevorzugt mindestens 100 zusammen- hängende Nukleotide einer der Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 oder 44.
Funktionen äquivalenten Fragmente eines der erfindungsgemäßen Promotoren - beispielsweise der Promotoren beschrieben durch SEQ ID NO:, 1, 2, 3, 4 oder 44 - mindestens 200 Basenpaare, ganz besonders bevorzugt mindestens 500 Basenpaare, am meisten bevorzugt mindestens 1000 Basenpaare des 3 '-Endes des jeweiligen erfindungsgemäßen Promotors - beispielsweise der Promotoren beschrieben durch SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 oder 44 -, wobei die Länge vom Trai}skriptionsstart ("ATG"-Kodon) in 5 '-Richtung stromaufwärts gerechnet wird.
Geeignete SSS3-Promotoren umfassen ferner DNA Sequenzen, die unter Standardbedingungen mit einer der Nukleinsauresequenzen gemäß SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 oder 44 oder der zu diesen komplementären Nukleinsauresequenzen hybridisieren und die im wesentlichen gleichen Promotoreigenschaften haben.
Der Begriff der Standardhybridisierungsbedingungen ist breit zu verstehen und meint sowohl stringente als auch weniger stringente Hybridisierungsbedingungen. Solche Hybridisierungsbedingungen sind unter anderem bei Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T et al., in Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Seiten 9.31-9.57 oder in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. beschrieben. Beispielhaft können die Bedingungen während des Waschschrittes ausgewählt sein aus dem Bereich von Bedingungen begrenzt von solchen mit geringer Stringenz (mit ungefähr 2X SSC bei 50°C) und solchen mit hoher Stringenz (mit un- gefähr 0,2X SSC bei 50°C bevorzugt bei 65°C) (20X SSC: 0,3 M
Natriumeitrat, 3 M NaCl, pH 7.0). Darüber hinaus kann die Temperatur während des Waschschrittes von niedrig stringenten Bedingungen bei Raumtemperatur, ungefähr 22°C, bis zu stärker stringenten Bedingungen bei ungefähr 65°C angehoben werden. Beide Parame- ter, Salzkonzentration und Temperatur, können gleichzeitig variiert werden, auch kann einer der beiden Parameter konstant gehalten und nur der andere variiert werden. Während der Hybridi- sierung können auch denaturierende Agenzien wie zum Beispiel For- mamid oder SDS eingesetzt werden. In Gegenwart von 50% Formamid wird die Hybridisierung bevorzugt bei 42°C ausgeführt. Einige beispielhafte Bedingungen für Hybridisierung und Waschschritt sind infqlge gegeben:
(1) Hybridisierungsbedingungen mit zum Beispiel
a) 4X SSC bei 65°C, oder b) 6X SSC, 0,5% SDS, 100 μg/ml denaturierte, fragmentierte Lachssperma-DNA bei 65°C, oder c) 4X SSC, 50% Formamid, bei 42°C, oder d) 2X oder 4X SSC bei 50°C (schwach stringente Bedingung) , oder e^ 2X oder 4X SSC, 30 bis 40% Formamid bei 42°C (schwach stringente Bedingung) , oder tf) 6x SSC bei 45°C, oder, g) 0,05 M Natriumphosphatpuffer pH 7,0, 2 mM EDTA, 1% BSA und 7% SDS.
(2) Waschschritte mit zum Beispiel
a) 0,1X SSC bei 65°C, oder b) 0,1X SSC, 0,5% SDS bei 68°C, oder c) 0,1X SSC, 0,5% SDS, 50% Formamid bei 42°C, oder d) 0,2X SSC, 0,1% SDS bei 42°C, oder e) 2X SSC bei 65°C (schwach stringente Bedingung) , oder f) 40 mM Natriumphosphatpuffer pH 7,0, 1% SDS, 2 mM EDTA.
Verfahren zur Herstellung erfindungsgemäßer funktioneller Äquivalente umfassen bevorzugt die Einführung von Mutationen in einen der Promotoren gemäß ,SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 oder 44. Eine Mutage- nese kann ungerichtet ("random") erfolgen, wobei die mutageni- sierten Sequenzen anschließend bezüglich ihrer Eigenschaften nach einer "trial-and-error" Prozedur durchmustert werden. Besonders vorteilhafte Selektionskriterien umfassen beispielsweise die Höhe der resultierenden Expression der eingeführten Nukleinsauresequenz in einem stärkehaltigen Gewebe.
"Expression" meint die Transkription der transgen zu exprimieren- den Nukleinsauresequenz, kann aber - im Falle eines offenen Leserasters in "sense"-Orientierung - auch die Translation der transkribierten RNA der transgen zu exprimierenden Nukleinsauresequenz in ein korrespondierendes Polypeptid mit einschließen. "Transgen" meint - beispielsweise in Bezug auf eine transgene Expressionskassette, einen transgenen Expressionsvektor, einen transgenen Organismus oder Verfahren zur transgenen Expression von Nukleinsäuren - -alle solche durch gentechnische Methoden zu- stände gekommene Konstruktionen oder Verfahren unter Verwendung derselben, in denen entweder
a) ein SSS3-Promotor (beispielsweise ein Promotor gemäß SQ ID NO: 1, 2, 3, 4 oder 44), oder
b) die transgen zu exprimierende Nukleinsauresequenz in funktio- neller Verknüpfung mit dem SSS3-Promotor gemäß a) , oder
c) (a) und (b)
sich nicht in ihrer natürlichen, genetischen Umgebung befinden oder !durch gentechnische Methoden modifiziert wurden, wobei die Modifikation beispielhaft eine Substitution, Addition, Dele- tion, Inversion oder Insertion eines oder mehrerer Nukleotidreste sein kann. Bevorzugt ist die in den Expressionskassetten enthaltene erfindungsgemäße SSS3-Promotorsequenz (z.B. die Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 oder 44) heterolog in Bezug auf die mit ihr funktioneil verknüpfte, transgen zu exprimierende weitere Nukleinsauresequenz. "Heterolog" meint in diesem Zusammenhang, dass die weitere Nukleinsauresequenz nicht für das Gen kodiert, das natürlicherweise unter der Kontrolle des besagten Promotors steht .
"Natürliche genetische Umgebung" meint den natürlichen chromoso- malen Locus in dem Herkunftsorganismus oder das Vorliegen in einer genomischen Bibliothek. Im Fall einer genomischen Bibliothek ist die natürliche, genetische Umgebung der Nukleinsauresequenz bevorzugt zumindest noch teilweise erhalten. Die Umgebung flankiert die Nukleinsauresequenz zumindest an einer Seite und hat eine Sequenzlänge von mindestens 50 bp, bevorzugt mindestens 500 bp, besonders bevorzugt mindestens 1000 bp, ganz besonders bevorzugt mindestens 5000 bp. Ein natürlich vorkommendes Expressions- konstrukt - beispielsweise die natürlich vorkommende Kombination des SSS3-Promotors aus Karoffel gemäß SEQ ID NO: 1 oder 44 und der kodierenden Sequenz des Kartoffel SSS3-Gens wird zu einem transgenen Expressionskonstrukt, wenn diese durch nicht-natürliche, synthetische ("künstliche") Verfahren wie beispielsweise einer in vitro Mutagenisierung geändert wird. Entsprechende Verfahren sind beschrieben (US 5,565,350; WO 00/15815; siehe auch oben) . "Transgen" meint in Bezug auf eine Expression ("transgene Expression" ) bevorzugt all solche unter Einsatz einer transgenen Expressionskassette, transgenen Expressionsvektor oder transgenen Organismus - entsprechend dem oben gegebenen Definitionen - rea- lisierten Expressionen.
In erfindungsgemäßen transgenen Expressionskassetten steht mindestens einer der erfindungsgemäßen Promotoren (z.B. beschrieben durch SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 oder 44) in funktioneller Verknüpfung mit mindestens einer transgen zu. exprimierenden Nukleinsauresequenz.
Unter einer funktionellen Verknüpfung versteht man zum Beispiel die sequentielle Anordnung eines der erfindungsgemäßen Promotoren (z.B...beschrieben durch SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 oder 44) mit einer tranigen zu exprimierenden Nukleinsauresequenz und ggf. weiterer genetischer Kontrollsequenzen wie zum Beispiel einem Terminator oder einer Polyadenylierungssequenz derart, dass der Promotor seine Funktion bei der transgenen Expression der Nukleinsäurese- quenz unter geeigneten Bedingungen erfüllen kann und die Expression der Nukleinsauresequenz (d.h. Transkription und gegebenenfalls Translation) erfolgt. "Geeignete Bedingungen" meint dabei bevorzugt das Vorliegen der Expressionskassette in einer pflanzlichen Zelle, bevorzugt einer pflanzlichen Zelle umfasst von ei- nem stärkehaltigen Gewebe einer Pflanze.
Bevorzugt sind Anordnungen, in denen die transgen zu exprimierende Nukleinsauresequenz hinter einem der erfindunsggemäßen Promotoren (z.B. beschrieben durch SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 oder 44) positioniert wird, so dass beide Sequenzen kovalent miteinander verbunden sind. Bevorzugt ist dabei der Abstand zwischen der Promotorsequenz und der transgen zu exprimierende Nukleinsauresequenz geringer als 200 Basenpaare, besonders bevorzugt kleiner als 100 Basenpaare, ganz 'besonders bevorzugt kleiner als 50 Basenpaare.
Die Herstellung einer funktioneilen Verknüpfung als auch die Herstellung eines transgenen Expressionskonstruktes kann mittels gängiger Rekombinations- und Klonierungstechniken realisiert werden, wie sie beispielsweise in Maniatis T, Fritsch EF und Sambrook J (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Sprung Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY) , in Silhavy TJ, Berman ML und Enquist LW (1984) Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY) und in Ausubel FM et al . (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc . and Wiley Interscience beschrieben sind. Ein in diesem Rahmen geeignetes Verfahren ist beispielsweise die auf Rekombination basierende GATEWAY™-Cloning Technologie (Invi- trogen Ine . ) .
Zwischen Promotor und transgen zu exprimierender Nukleinsäure- sequenz können aber weitere Sequenzen positioniert werden, die zum Beispiel die Funktion eines Linkers mit bestimmten Restriktionsenzymschnittstellen oder eines Signalpeptides haben. Auch kann die Insertion von Sequenzen zur Expression von Fusionsproteinen führen.
Die Herstellung einer erfindungsgemäßen transgenen Expressionskassette erfolgt beispielsweise durch Fusion eines der erfindungsgemäßen Promotoren gemäß SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 oder 44 mit einer transgen zu exprimierenden Nukleotidsequenz, gegebenenfalls einer ,-für ein Transitpeptid kodierenden Sequenz, vorzugsweise ein chloroplastenspezifisches Transitpeptid, welches vorzugsweise zwischen dem Promotor und der jeweiligen Nukleotidsequenz angeordnet ist, sowie optional einem Terminator- oder Polyadenylie- rungssignal. Bevorzugt kann das transgene Expressionskonstrukt, bestehend aus einer Verknüpfung von Promoter und zu exprimieren- der Nukleinsauresequenz, integriert in einem Vektor vorliegen und durch zum Beispiel Transformation in ein pflanzliches Genom insertiert werden.
Unter einer Expressionskassette sind aber auch solche Konstruktionen zu verstehen, bei denen einer der erfindungsgemäßen Promotoren (z.B. beschrieben durch SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 oder 44), ohne dass er zuvor notwendigerweise mit einer zu exprimierenden Nukleinsauresequenz funktioneil verknüpft wurde, zum Beispiel über eine gezielte homologe Rekombination oder eine zufällige Insertion in ein Wirtsgenom eingeführt wird, dort regulatorische Kontrolle über mit ihm dann funktioneil verknüpfte endogene Nukleinsauresequenzen übernimmt und die transgene Expression derselben steuert. Durch Insertion des Promotors - zum Beispiel durch eine homologe Rekombination - vor eine für ein bestimmtes Polypeptid kodierende Nukleinsäure erhält man eine erfindungsge- mässe Expressionskassette, die die Expression des bestimmten Polypeptides selektiv in einem stärkehaltigen Geweben steuert . Auch kann beispielsweise der natürliche Promotor eines endogenen Gens gegen einen der erfindungsgemäßen Promotoren (z.B. beschrieben durch SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 oder 44) ausgetauscht und so das Expressionsverhalten des endogenen Gens modifiziert werden.
Ferner kann die Insertion des Promotors auch derart erfolgen, dass antisense-RNA zu der für ein bestimmtes Polypeptid kodierenden Nukleinsäure exprimiert wird. Damit wird selektiv die Expres- sion des bestimmten Polypeptides in dem stärkehaltigem Gewebe herunterreguliert oder ausgeschaltet.
Analog kann auch eine transgen zu exprimierende Nukleinsäure- 5 sequenz - zum Beispiel durch eine homologe Rekombination - hinter die Sequenz kodierend für einen der erfindungsgemäßen Promotoren (z.B. beschrieben durch SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 oder 44), die sich in ihrem natürlichen chromosomalen Kontext befindet, so plaziert werden, dass man eine erfindungsgemässe Expressionskassette er- 10 hält, die die Expression der transgen zu exprimierenden Nuklein- säureseuquenz in dem stärkehaltigen Gewebe steuert.
Die erfindungsgemäßen transgenen Expressionskassetten können weitere genetische Kontrollsequenzen umfassen. Der Begriff der gene-
15 tischen Kontrollsequenzen ist breit zu verstehen und meint all solche Sequenzen, die einen Einfluss auf das Zustandekommen oder die Funktion einer erfindungsgemäßen transgenen Expressionskassette haben. Genetische Kontrollsequenzen modifizieren zum Beispiel die Transkription und Translation in prokaryotischen oder
20 eukaryotischen Organismen. Vorzugsweise umfassen die erfindungsgemäßen transgenen Expressionskassetten 3 ' -stromabwärts von der jeweiligen transgen zu exprimierenden Nukleinsauresequenz eine Terminatorsequenz als zusätzliche genetische Kontrollsequenz, sowie gegebenenfalls weitere übliche regulative Elemente, und zwar
25 jeweils funktionell verknüpft mit der transgen zu exprimierenden Nukleinsauresequenz .
Genetische Kontrollsequenzen umfassen auch weitere Promotoren, Promotorelemente oder Minimalpromotoren, die die expressions-
30 steuernden Eigenschaften modifizieren können. So kann durch genetische Kontrollsequenzen zum Beispiel die gewebespezifische Expression zusätzlich abhängig von bestimmten Stressfaktoren erfolgen. Entsprechende Elemente sind zum Beispiel für Wasser- stress, Abscisinsäure (La E und 'Chua NH, J Biol Chem 1991;
35 266(26) : 17131-17135) und Hitzestress (Schoffl F et al. (1989) Mol Gen Genetics 217 (2-3) .: 246-53) beschrieben.
Es können ferner weitere Promotoren funktionell mit der zu exprimierenden Nukleinsauresequenz verknüpft sein, die eine transgene
40 Expression in weiteren Pflanzengeweben oder in anderen Organismen, wie zum Beispiel E. coli Bakterien ermöglichen. Als Promotoren kommen im Prinzip alle pflanzenspezifischen Promotoren in Frage. Pflanzenspezifische Promotoren meint grundsätzlich jeden Promotor, der die Expression von Genen, insbesondere Fremd-
45 genen, in Pflanzen oder Pflanzenteilen, -zellen, -geweben, -kulturen steuern kann. Dabei kann die Expression beispielsweise konstitutiv, induzierbar oder entwicklungsabhängig sein. Bevorzugt sind konstitutive Promotoren, gewebespezifische Promotoren, entwicklungsabhängige Promotoren, chemisch-induzierbare stress-induzierbare oder pathogen-induzierbare Promotoren. Entsprechende Promotoren sind dem Fachmann allgemein bekannt.
Weitere vorteilhafte Kontrollsequenzen sind beispielsweise in den Promotoren gram-positiver Bakterien wie amy und SP02 oder in den Hefe- oder Pilzpromotoren ADCl, MFa, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH zu finden.
Prinzipiell können alle natürlichen Promotoren mit ihren Regulationssequenzen wie die oben genannten für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden. Darüber hinaus können auch synthetische Promotoren vorteilhaft verwendet werden.
Genetische Kontrollsequenzen umfassen ferner auch die 5'-untrans- latierte Regionen, Introns oder nichtkodierende 3 '-Regionen von Genen wie beipielsweise das Actin-1 Intron, oder die Adhl-S Introns 1, 2 und 6 (allgemein: The Maize Handbook, Chapter 116, Freeling and Walbot, Eds . , Springer, New York (1994)), bevorzugt der Gene mit dem Genlocus At2g46720, At3g01980 und Atlg63140 aus Arabidopsis thaliana. Es kann gezeigt werden, dass derartige Regionen eine signifikante Funktion bei der Regulation der Genexpression spielen können. So wurde gezeigt, dass 5 ' -untransla- tierte Sequenzen die transiente Expression heterologer Gene verstärken können. Beispielhaft für Translationsverstärker sei die 5 ' -Leadersequenz aus dem Tabak-Mosaik-Virus zu nennen (Gallie et al. (1987) Nucl Acids Res 15:8693-8711) und dergleichen. Sie können ferner die Gewebsspezifität fördern (Rouster J et al . (1998) Plant J 15:435-440). Umgekehrt unterdrückt die 5'-untrans- latierte Region des opaque-2 Gens die Expression. Eine Deletion der entsprechenden Region führt zu einer Erhöhung der Genaktivität (Lohmer S et al. (1993) Plant Cell 5:65-73).
In transgenen Reiszellen führte die Verwendung des Actl-Introns in Kombination mit dem 35S-Promotor zu einer gegenüber dem isolierten 35S-Promotor um das zehnfache gesteigerten Expressionsrate (McElroy et al . (1991) Mol Gen Genet 231 (1) :150-160) . Eine Optimierung der Sequenzumgebung der Translations-Initiations- stelle des GUS-Reportergens resultierte in einer vierfachen Steigerung der GUS-Expression in transformierten Reiszellen. Eine Kombination der optimierten Translati.ons-Initiationsstelle und des Actl-Introns resultierte in einer 40-fachen Steigerung der GUS-Expression durch den CaMV35S-Promotor in transformierten Reiszellen; ähnliche Ergebnisse wurden anhand von transformierten Maiszellen erzielt. Insgesamt wurde aus den zuvor beschriebenen Untersuchungen geschlussfolgert, dass die auf dem Actl-Promotor basierenden Expressionsvektoren dazu geeignet sind, eine hinreichend starke und konstitutive Expression von Fremd-DNA in transformierten Zellen monokotyler Pflanzen zu steuern.
5 Die „unter SEQ ID NO: 2, 3 und 4 angegebenen Promotorsequenzen enthalten den Abschnitt der jeweiligen SSS3 Gene, der den Promotor und die 5 untranslatierte Region bis vor das ATG-Startcodon des SSS3 Proteins repräsentiert. Die unter SEQ ID: 1 und 44 angegebenen Promotorsequenzen enthalten den Promotor einschließlich 10 75 bp der 5 untranslatierten Region der cDNA.
Das transgene Expressionskonstrukt kann vorteilhafterweise eine oder mehrere sogenannte "enhancer Sequenzen" funktionell verknüpft mit dem Promoter enthalten, die eine erhöhte transgene
15 Expression der Nukleinsauresequenz ermöglichen. Auch am 3 '-Ende der transgen zu exprimierenden Nukleinsauresequenzen können zusätzliche vorteilhafte Sequenzen inseriert werden, wie weitere regulatorische Elemente oder Terminatoren. Die transgen zu exprimierenden Nukleinsauresequenzen können in einer
20 oder mehreren Kopien im Genkonstrukt enthalten sein.
Als Kontrollsequenzen geeignete Polyadenylierungssignale sind pflanzliche Polyadenylierungssignale sowie - vorzugsweise - solche, die im wesentlichen T-DNA Polyadenylierungssignalen aus
25 Agrobakterium turne faciens entsprechen. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform enthält die transgene Expressionskassette eine in Pflanzen funktioneile Terminatorsequenz . In Pflanzen funktioneile Terminatorsequenzen meint allgemein solche Sequenzen, die in der Lage sind, in Pflanzen den Abbruch der Transkrip-
30 tion einer DNA-Sequenz zu bewirken. Beispiele für geeignete Terminatorsequenzen sind der OCS (Octopin-Synthase) -Terminator und der NOS (Nopalin-Synthase) -Terminator. Besonders bevorzugt sind jedoch pflanzliche Terminatorsequenzen. Pflanzliche Terminatorsequenzen meint allgemein solche Sequenzen, die Bestandteil eines
35 natürlichen pflanzlichen Gens sind. Besonders bevorzugt sind dabei der Terminator des Cathepsin D Inhibitor. Gens aus Kartoffel (GenBank Acc. No.: X74985) oder der Terminator des Speicherproteingens VfLElB3 (GenBank Acc. No. : Z26489) aus der Ackerbohne. Diese Terminatoren sind den im Stand der Technik beschriebenen
40 viralen oder T-DNA Terminatoren mindestens gleichwertig.
Als Kontrollseguenzen sind weiterhin solche zu verstehen, die eine homologe Rekombination bzw. Insertion in das Genom eines Wirtsorganismus ermöglichen oder die Entfernung aus dem Genom 45 erlauben. Bei der homologen Rekombination kann zum Beispiel der natürliche Promotor eines bestimmten Gens gegen einen der erfindungsgemäßen Promotoren ausgetauscht werden. Einer der er- findungsge äßen Promotoren kann - wie oben beschrieben - mittels homologer Rekombination vor ein transgen zu exprimierendes endogenes Zielgen platziert werden, indem der Promotor mit DNA-Sequenzen verknüpft wird, die zum Beispiel zu endogenen Sequenzen homolog sind, die dem Leseraster des Zielgens vorgelagert sind. Derartige Sequenzen sind als genetische Kontrollsequenzen zu verstehen. Methoden wie die cre/lox-Technologie erlauben eine gewebespezifische, unter Umständen induzierbare Entfernung der transgenen Expressionskassette aus dem Genom des Wirtsorganismus (Sauer B (1998) Methods (Duluth) 14 (4) :381-92) . Hier werden bestimmte flankierende Sequenzen dem Zielgen angefügt (lox-Sequen- zen) , die später eine Entfernung mittels der cre-Rekombinase ermöglichen. Zur Selektion erfolgreich homolog rekombinierter oder auch transformierter Zellen ist es in der Regel erforderlich, ei- nen selektionierbaren Marker (s.u.) zusätzlich einzuführen. Homologe , Rekombination ist ein relativ seltenes Ereignis in höheren Eukapryoten, vor allem in Pflanzen. Zufällige Integrationen in das Wirtsgenom überwiegen. Eine Möglichkeit die zufällig integrierten Sequenzen zu entfernen und so Zellklone mit einer korrekten homo- logen Rekombination anzureichern, besteht in der Verwendung eines sequenzspezifischen RekombinationsSystems wie in US 6,110,736 beschrieben.
Die transgene Expression der durch die Nukleinsauresequenzen kodierten Proteine unter Kontrolle eines SSS3-Promotor ist in jedem gewünschten Zellkompartiment, wie z.B. dem Endomembransystem, der Vakuole und den Chloroplasten möglich. Durch Nutzung des sekretorischen Weges sind gewünschte Glykosylierungsreaktionen, besondere Faltungen u.a. möglich. Die dafür als genetische Kon- trollsequenzen notwendigen Signalpeptidsequenzen können sowohl bereits in einzelnen transgenen Expressionskassetten bereitgestellt werden, als auch durch Verwendung einer geeigneten Klonie- rungsstrategie gemeinsam mit der transgen zu exprimierenden Nukleinsauresequenz in die transgene Expressionskassette einge- bracht werden. Als Signal- oder Transitpeptidsequenzen können sowohl geneigene oder heterologe Sequenzen genutzt werden. Zusätzliche, heterologe zur funktionellen Verknüpfung bevorzugte aber nicht darauf beschränkte Sequenzen sind weitere Targeting-Sequenzen zur Gewährleistung der subzellulären Lokalisation im Apopla- sten, in der Vakuole, in Plastiden, in Mitochondrien, im Endo- plasmatischen Retikulum (ER) , im Zellkern, in Ölkörperchen oder anderen Kompartimenten; sowie Translationsverstärker wie die 5 ' -Leadersequenz aus dem Tabak-Mosaik-Virus (Gallie et al. (1987) Nucl Acids Res 15:8693-8711) und dergleichen. Das Verfahren, an sich nicht in den Plastiden lokalisierte Proteine, gezielt in die Plastiden zu transportieren, ist beschrieben (Klosgen RB und Weil JH (1991) Mol Gen Genet 225 (2) :297-304; Van Breusegem F et al. (1998) Plant Mol Biol 38 (3 ) :491-496) . Bevorzugte Sequenzen sind:
a) das Transitpeptid des SSS3-Proteins,
b) das Transitpeptid der kleinen Untereinheit (SSU) der Ribulo- sebisphosphatcarboxylase (Rubisco ssu) aus beispielsweise Erbse, Mais oder Sonnenblume,
c) Transitpeptide abgeleitet von Genen der pflanzlichen Fettsäurebiosynthese wie das Transitpeptid des plastidären "Acyl Carrier Protein" (ACP) , die Stearyl-ACP-Desaturase, ß-Keto- acyl-ACP Synthase oder die Acyl-ACP-Thioesterase,
d) das Transitpeptid der GBSSI ("Granule Bound Starch Synthase I")
e) das Transitpeptid der LHCP II Gene
f) das Transitpeptide der Transketolase (EP-AI 0 723 017) .
Die Zielsequenzen können mit anderen, von dem Transitpeptid kodierenden Sequenzen verschiedenen, Targeting-Sequenzen verknüpft sein, um eine subzellulären Lokalisation im Apoplasten, in der Vakuole, in Plastiden, in Mitochondrien, im Endoplasmatisehen Retikulum (ER) , im Zellkern, in Ölkörperchen oder anderen Kompar- timenten zu gewährleisten.
Die erfindungsgemäßen transgenen Expressionskassetten und die von ihnen abgeleiteten transgenen Expressionsvektoren können weitere Funktionselernente enthalten. Der Begriff Funktionselernent ist breit zu verstehen und meint all solche Elemente, die einen Ein- fluss auf Herstellung, Vermehrung oder Funktion der erfindungsgemäßen transgenen Expressionskassetten oder von diesen abgeleitete transgene Expressionsvektoren oder Organismen haben. Beispielhaft aber nicht einschränkend seien zu nennen:
1. Selektionsmarker
Der Begriff "Selektionsmarker" umfasst sowohl positive Selektionsmarker, die eine Resistenz gegen ein Antibiotikum, Herbizid oder. nderes Biozid verleihen, als auch negative Selektionsmarker, die eine Sensitivität gegen eben diese verleihen, als auch Marker die dem transformierten Organismus einen Wachstumsvorteil gewähren (beispielsweise durch Expression von Schlüsselgenen der Cytokinbiosynthese; Ebinuma H et al. (2000) Proc Natl Acad Sei USA 94:2117-2121) . Bei der positiven Selektion gedeihen nur die Organismen, die den entsprechenden Selektionsmarker exprimieren, während bei der negativen Selektion eben diese eingehen. Bei der Herstellung transgener Pflanzen ist die Verwendung eines positiven Selektionsmarkers bevorzugt . Bevorzugt ist f rner die Verwen- düng von Selektionsmarkern, die Wachstumsvorteile verleihen. Negative Selektionsmarker können vorteilhaft verwendet werden, wenn es darum geht, bestimmte Gene oder Genomabschnitte aus einem Organismus zu entfernen- (beispielsweise im Rahmen eines Kreuzungsprozesses) .
i) Positive Selektionsmarker:
Der mit der transgenen Expressionskassette eingebrachte selektio- nierbare Marker verleiht den erfolgreich transformierten Zellen eine Resistenz gegen ein Biozid, zum Beispiel ein Herbizid (wie Phosphinothricin, Glyphosat oder Bromoxynil) , einen Metabolismusinhibitor (wie 2-Desoxyglucose-6-phosphat; WO 98/45456) oder ein Antibiotikum (wie z.B. Tetracycline, Ampicillin, Kanamycin, G 418, Neomycin, Bleomycin oder Hygromycin) . Der Selektionsmarker erlaubt die Selektion der transformierten Zellen von untransfor- mierten (McCormick et al.(1986) Plant Cell Reports 5: 81-84). Besonders bevorzugte Selektionsmarker sind solche, die eine Resistenz gegen Herbizide verleihen. Beispielhaft als Selektionsmarker seien zu nennen:
- DNA Sequenzen, die für Phosphinothricinacetyltransferasen (PAT) kodieren (auch Bialophos®-Resistenzgen (bar) genannt) , welche die freie Aminogruppe des Glutaminsynthaseinhibitors Phosphinothricin (PPT) acetylieren und damit eine Detoxifi- zierung des PPT erreichen (de Block et al. (1987) EMBO J
6:2513-2518; Vickers JE et al . (1996) Plant Mol Biol Reporter 14:363-368; Thompson CJ et al . (1987) EMBO J 6:2519-2523). Das bar/PAT Gen kann beispielsweise aus Streptomyces hygro- scopicus oder S. viridochromόgenes isoliert werden. Entspre- chende Sequenzen sind.dem Fachmann bekannt (Streptomyces hygroscopicus GenBank Acc.-No.: X17220 und X05822; Streptomyces viridochromogenes GenBank Acc.-No.: M22827 und X65195; US 5,489,520). Ferner sind synthetische Gene für die Expression in Plastiden beschrieben (Genbank Acc.-No.: AJ028212) .
- 5~Enolpyruvylshikimat-3-phosphatsynthasegene (EPSP Synthase- gene) , die eine Resistenz gegen Glyphosat® (N- (phosphonome- thyDglycin) verleihen. Das unselektive Herbizid Glyphosat hat die 5-Enolpyruvyl-3-phosphoshikimatsynthase (EPSPS) als molekulares Target. Diese hat eine Schlüsselfunktion in der
Biosynthese aromatischer Aminosäuren in Pflanzen (Steinrucken HC et al. (1980) Biochem Biophys Res Commun 94:1207-1212; Levin JG und Sprinson DB (1964) J Biol Chem 239:1142-1150; Cole DJ (1985) Mode of action of glyphosate; A literature analysis, p. 48-74. In: Grossbard E und Atkinson D (eds.) The herbicide glyphosate. Buttersworths, Boston). Glyphosat-tole- rante EPSPS Varianten werden bevorzugt als Selektionsmarker verwendet (Padgette SR et al. (1996). New weed control oppor- tunities : development of soybeans with a Roundup Ready™ gene . In: Herbicide Resistant Crops (Duke SO, ed.), pp. 53-84. CRC Press, Boca Raton, FL; Saroha MK und Malik VS (1998) J Plant Biochemistry and Biotechnology 7:65-72). Das EPSPS Gen des
Agrobakterium sp. Stamm CP4 hat eine natürliche Toleranz gegen Glyphosat, die auf entsprechende transgene Pflanzen transferiert werden kann. Das CP4 EPSPS Gen wurde aus Agrobakterium sp. Stamm CP4 kloniert (Padgette SR et al. (1995) Crop Science 35 (5) : 1451-1461) . 5-Enolpyrvylshikimate-3-phos- phate-synthasen, die Glyphosat-tolerant sind, wie beispielsweise beschrieben in US 5,510,471; US 5,776,760; US 5,864,425; US 5,633,435; US 5, 627; 061; US 5,463,175; EP 0 218 571, sind bevorzugt, wobei die jeweils in den Paten- ten beschriebenen Sequenzen auch in der GenBank hinterlegt sind. Weitere Sequenzen sind beschrieben unter GenBank Accession X63374. Ferner ist das aroA Gen bevorzugt (GenBank Acc.- No. : M10947) .
- das für das Glyphosat® degradierende Enzyme kodierende gox Gen (Glyphosatoxidoreduktase) . GOX (beispielsweise die Gly- phosatoxidoreductase aus Achromobacter sp.) katalysiert die Spaltung einer C-N Bindung im Glyphosat, welches so zu Amino- methylphosphonsäure (AMPA)' und Glyoxylat umgesetzt wird. GOX kann dadurch eine Resistenz gegen Glyphosat vermitteln (Padgette SR et al. (1996) J Nutr 126 (3) : 702-16; Shah D et al . (1986) Science 233:478-481).
das deh Gen (kodierend für eine Dalapon® inaktivierende Deha- logenase; WO 99/27116; GenBank Acc . -No. : AX022822, AX022820)
- bxn Gene, die für Bromoxynil® degradierende Nitrilaseenzyme kodieren. Beispielsweise die Nitrilase aus Klebsieila ozanenae. Sequenzen sind in der GenBank beispielsweise unter den Genbank Acc.-No: E01313 und J03196 zu finden.
Neomycinphosphotransferasen (npt) verleihen eine Resistenz gegen Antibiotika (Aminoglykoside) wie Neomycin, G418, Hygro- mycin, Paromomycin oder Kanamycin, indem sie durch eine Phosphorylierungsreaktion deren inhibierende Wirkung reduzieren.. Besonders bevorzugt ist das nptll Gen (Genbank Acc.-No.: AF080390; AF080389) . Zudem ist das Gen bereits Bestandteil zahlreicher Expressionsvektoren und kann unter Verwendung von dem Fachmann geläufigen Verfahren (wie beispielsweise Poly- merasekettenreaktion) aus diesen isoliert werden (Genbank Acc.-No.: AF234-316 pCAMBIA-2301; AF234315 pCAMBIA-2300, AF234314 pCAMBIA-2201) . Das NPTII Gen kodiert für eine A i- noglycosid-3'O-phosphotransferase aus E.coli, Tn5 (GenBank Acc.-No: U00004 Position 1401-2300; Beck et al. (1982) Gene 19 327-336) .
- das DOG^l-Gen wurde aus der Hefe Saccharomyces cerevisiae isoliert (EP 0 807 836) und kodiert für eine 2-Desoxy- glukose-6-phosphatphosphatase, die eine Resistenz gegenüber 2-DOG verleiht (Randez-Gil et al. (1995) Yeast 11:1233-1240; Sanz et al. (1994) Yeast 10:1195-1202; GenBank Acc.-No.: NG001140 Position 194799-194056).
- Sulfonylharnstoff- und Imidazolinon inaktivierende Acetolac- tatsynthasen, die eine Resistenz gegen Imidazolinon/Sulfonyl- harnstoff-Herbizide verleihen. Beispielhaft seien für Imida- zolinon-Herbizide die Wirkstoffe Imazamethabenzmethyl, Imaz- zamox, Imazapyr, Imazaquin, Imazethapyr zu nennen. Für Sulfo- nylharnstoff-Herbizide seien beispielhaft Amidosulforon, Azimsulfuron, Chlorimuro ethyl, Chlorsulfuron, Cinosulfuron, Imazosulforon, Oxasulforon, Prosulforon, Rimsulforon, Sulfo- sulforon zu nennen. Dem Fachmann sind zahlreiche weitere
Wirkstoffe der genannten Klassen bekannt. Geeignet sind beispielsweise die unter der GenBank Acc-No. : X51514 hinterlegte Sequenz für das Arabidopsis thaliana Csr 1.2 Gen (EC 4.1.3.18) (Sathasivan K et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18(8): 2188). Acetolactatesynthasen die eine Resistenz gegen Imidazolinon-Herbizide verleihen sind ferner beschrieben unter den GenBank Acc . -No . : AB049823, AF094326, X07645, X07644 , A19547, A19546, A19545, 105376 (EP 0 257 993), 10537.3 (EP 0 257 993), AL133315.
- Hygromycinphosphotransferasen (z.B. GenBank Acc . -No . : X74325) , die eine Resistenz gegen das Antibiotikum Hygromycin verleihen. Das Gen ist Bestandteil zahlreicher Expressionsvektoren und kann unter Verwendung von dem Fachmann geläufi- gen Verfahren (wie beispielsweise Polymerasekettenreaktion) aus diesen isoliert werden (GenBank Acc.-No.: AF294981 pIN- DEX4; AF234301 pCAMBIA-1380; AF23.4300 pCAMBIA-1304; AF234299 pCAMBIA-1303; AF234298 pCAMBIA-1302; AF354046 pCAMBIA-1305. ; AF354045 pCAMBIÄ-1305.1) - Resistenzgene gegen
a) Chloramphenicol (Chloramphenicolacetyltransferase) ,
b) Tetracyclin, verschiedene Resistenzgene sind beschrieben z.B. GenBank Acc.-No.: X65876, X51366. Zudem ist das Gen bereits Bestandteil zahlreicher Expressionsvektoren und kann unter Verwendung von dem Fachmann geläufigen Verfahren (wie beispielsweise Polymerasekettenreaktion) aus diesen isoliert werden
c) Streptomycin, verschiedene Resistenzgene sind beschrieben z.B. mit der GenBank Acc.-No.: AJ278607.
d Zeocin, das entsprechende Resistenzgen ist Bestandteil zahlreicher Klonierungsvektoren (z.B. GenBank Acc . -No . : L36849 Cloning vector pZEO) und kann unter Verwendung von dem Fachmann geläufigen Verfahren (wie beispielsweise Polymerasekettenreaktion) aus diesen isoliert werden.
e) Ampicillin (ß-Lactamase Gen; Datta N, Rich ond MH. (1966) Biochem J 98(l):204-9; Heffron F et al (1975) J. Bacte- riol 122: 250-256; das Amp Gen wurde zuerst zur Herstellung des E. coli Vektors pBR322 kloniert; Bolivar F et al. (1977) Gene 2:95-114). Die Sequenz ist Bestandteil zahlreicher Klonierungsvektoren und kann unter Verwendung von dem Fachmann geläufigen Verfahren (wie beispielsweise Polymerasekettenreaktion) aus diesen isoliert werden.
- Gene wie die Isopentenyltransferase aus Agrobakterium tumefa- ciens (strain:P022) (Genbank Acc.-No.: AB025109) . Das ipt Gen ist ein Schlüsselenzym der Cytokin-Biosynthese. Seine Überexpression erleichtert die Regeneration von Pflanzen (z.B. Selektion auf Cytokin-freiem Medium) . Das Verfahren zur Nutzung des ipt Gens ist beschrieben (Ebinuma H et al. (2000) Proc Natl Acad Sei USA 94:2117-2121; Ebinuma ,H et al. (2000) Selection of Marker-free transgenic plants using the onco- genes (ipt, rol A, B, C) of Agrobakterium as selectable markers , In Molecular Biology of Woody Plants . Kluwer Academic Publishers) .
- Verschiedene weitere positive Selektionsmarker, die den transformierten Pflanzen einen Wachstumsvorteil gegenüber nicht-transformierten verleihen, sowie Verfahren zu ihrer Verwendung sind u.a. beschrieben in EP-A 0 601 092. Beispielhaft, sind zu nennen ß-Glucuronidase (in Verbindung mit z.B. Cytokininglucuronid) , Mannose-6-phosphat-Isomerase (in Ver- bindüng mit Mannose) , UDP-Galaktose-4-Epimerase (in Verbindung mit z.B. Galactose) , wobei Mannose-6-phosphat-Iso- merase in Verbindung mit Mannose besonders bevorzugt ist.
5 ii)„ Negative Selektionsmarker
Negative Selektionsmarker ermöglichen beispielsweise die Selektion von Organismen it erfolgreich deletierten Sequenzen, die das Markergen umfassen (Koprek T et al. (1999) The Plant Journal
10 19 (6) :719-726) . Bei der negativen Selektion wird beispielsweise durch den in die Pflanze eingebrachten negativen Selektionsmarker eine Verbindung, die ansonsten für die Pflanze keine nachteilige Wirkung hat, in eine Verbindung mit nachteiliger Wirkung umgesetzt. Ferner sind Gene geeignet, die per se eine nachteilige
15 Wirkung haben. Als negative Selektionsmarker seien beispielhaft j doch nicht einschränkend zu nennen TK thymidine kinase (TK) , Diphfcheria Toxin A Fragment (DT-A) , das codA Genprodukt kodierend für eine Cytosindeaminase (Gleave AP et al. (1999) Plant Mol Biol. 40(2) :223-35; Perera RJ et al. (1993) Plant Mol Biol 23(4):
20 793-799; Stougaard J; (1993) Plant J 3:755-761), das Cytochrom P450 Gen (Koprek et al. (1999) Plant J 16:719-726), Gene kodierend für eine Haloalkandehalogenase (Naested H (1999) Plant J. 18:571-576), das iaaH Gen (Sundaresan V et al. (1995) Genes & Development 9:1797-1810) oder das tms2 Gen (Fedoroff NV & Smith DL
25 (1993) Plant J 3:273-289).
2 ) Reportergene
Reportergene kodieren für leicht quantifizierbare Proteine und 30 gewährleisten über Eigenfarbe oder Enzymaktivität eine Bewertung der Transformationseffizienz, des Expressionsortes oder -Zeitpunktes (siehe auch Schenborn E, Groskreutz D. Mol Biotechnol. 1999; 13 (1) :29-44) . Beispielhaft seien zu nennen:
35 - "green fluorescence protein" (GFP) (Chui WL et al. (1996), Curr Biol 6:325-330; Leffel SM et al. (1997) Biotechniques 23(5):912-8; Sheen et al.(1995) Plant J 8 (5) :777-784; Haseloff et al.(1997) Proc Natl Acad Sei USA 94 (6) :2122-2127; Reiche! et al.(1996) Proc Natl Acad Sei USA 93 (12) : 5888-5893 ;
40 Tian et al. (1997) Plant Cell Rep 16:267-271; WO 97/41228).
- Chloramphenicoltransferase (Fromm et al. (1985) Proc Natl Acad Sei USA 82:5824-5828),
45 Luziferase (Millar et al. (1992) Plant Mol Biol Rep 10:324- 414; Ow et al. (1986) Science 234:856-859); erlaubt Biolumi- nescenzdetektion.
- ,-ß-Galactosidase, kodiert für ein Enzym für das verschiedenen chromogene Substrate zur Verfügung stehen.
ß-Glucuronidase (GUS) (Jefferson et al. (1987) EMBO J 6:3901- 3907) oder das uidA Gen, das ein Enzym für verschiedene chro- mogene Substrate kodiert.
R-Locus Genprodukt : Protein, das die Produktion von Anthocya- ninpigmenten (rote Färbung) in pflanzlichen Gewebe reguliert und so eine direkte Analyse der Promotoraktivität ohne Zugabe zusätzlicher Hilfsstoffe oder chromogener Substrate ermöglicht (Dellaporta et al. (1988) In: Chromosome Structure and Function: Impact of New Concepts, 18th Stadler Genetics Symposium, 11:263-282) .
- .Tyrosinase (Katz et al.(1983) J Gen Microbiol 129:2703-2714) ein Enzym, das Tyrosin zu DOPA und Dopaquinon oxidiert, die infolge das leicht nachweisbare Melanin bilden.
Aequorin (Prasher et al. (1985) Biochem Biophys Res Commun 126 (3) :1259-1268) , kann in der Calcium-sensitiven Biolumine- scenzdetektion verwendet werden.
3 ) Replikationsursprünge
Replikationsursprünge gewährleisten die Vermehrung der erfindungsgemäßen' transgenen Expressionskassetten oder transgenen Expressionsvektoren in zum Beispiel E. coli oder Agrobakterien. Beispielhaft seien genannt ORI (origin of DNA replication) , der pBR322 ori oder der P15A ori (Sambrook et al.: Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) . Beispielshaft für in Agrobakterium funktionelle Replikationsursprünge seien pRK2, pRi, PVSl oder pSA zu nennen.
4) Bordersequenzen
"Bordersequenzen" (wie z.B. die rechte oder linke Begrenzung der T-DNA) ermöglichen einen Agrobakterien-vermittelten Transfer in Pflanzenzellen für die Übertragung und Integration ins Pflanzen- genom. 5) Multiple Klonierungsregionen (MCS) erlauben und erleichtern die Insertion eines oder mehrerer Nukleinsauresequenzen.
Erfindungsgemäß sind ferner transgene Expressionsvektoren, die die,., oben beschriebenen transgenen Expressionskassetten enthalten. Vektoren meint allgemein replikationsfähige Strukturen, die bevorzugt wirtspezifisch- sind, und die Aufnahme von Nukleinsauresequenzen und deren Transfer in andere Zellen ermöglichen. Vektoren können beispielhaft Plasmide, Cosmide, Phagen, Viren oder auch Agrobakterien sein. Im Rahmen der Pflanzenbiotechnologie insbesondere geeignete Vektoren sind unten beschrieben. Die transgenen Expressionskassetten können in den Vektor (bevorzugt ein Plasmid- vektor) über eine geeignete Restriktionsschnittstelle insertiert werden. Der entstandene Vektor kann zunächst in E.coli eingeführt und amplifiziert werden. Korrekt transformierte E.coli werden se- lektioniert, gezüchtet und der rekombinante Vektor mit dem Fachmann! geläufigen Methoden gewonnen. Restriktionsanalyse und Sequenzierung können dazu dienen, den Klonierungsschritt zu überprüfen. Bevorzugt sind solche Vektoren, die eine stabile Integra- tion der Expressionskassette in das Wirtsgenom ermöglichen.
Wirtsgenom meint in diesem Zusammenhang die gesamte Erbinformation des Wirts und umfasst beispielhaft sowohl die chromosomale DNA des Zellkerns, als auch die DNA der Plastiden und Mitochondrien. Bevorzugt erfolgt die Insertion jedoch in" die chromosomale DNA des Zellkerns.
In einer vorteilhaften Ausführungsform wird die Einführung der transgenen Expressionskassette in eine Zelle oder einen Organismus mittels Plasmidvektoren realisiert.
"Einführen" umfasst im Rahmen der Erfindung alle Verfahren, die dazu geeignet sind, eine Nukleinsauresequenz (beispielsweise eine erfindungsgemäße Expressionskassette) direkt oder indirekt, in einen Organismus (z.B. ein Pflanze) oder eine Zelle, Komparti- ment, Gewebe, Organ oder Vermehrungsmaterial (z.B. Samen oder Früchte) derselben einzuführen oder dort zu .generieren. Direkte und indirekte Verfahren sind umfasst. Das Einbringen kann zu einer vorübergehenden (transienten) oder aber auch zu einer dauerhaften (stabilen) Präsenz besagter Nukleinsauresequenz füh- ren. Einführen umfasst beispielsweise Verfahren wie Transfektion, Transduktion oder Transformation. Die in den Verfahren verwendeten .Organismen werden je nach Wirtsorganismus in dem Fachmann bekannter Weise angezogen bzw. gezüchtet.
Die Herstellung eines transformierten Organismus (bzw. einer transformierten Zelle oder Gewebes) erfordert, dass die entsprechende DNA (z.B. der Expressionsvektor) oder RNA in die entspre- chende Wirtszelle eingebracht bzw. eingeführt wird. Für diesen Vorgang, der als Transformation (oder Transduktion bzw. Transfektion) bezeichnet wird, steht eine Vielzahl von Methoden zur Verfügung (Keown et al.- (1990) Methods" in Enzymology 185:527-537). 5 So Jζann die DNA oder RNA beispielhaft direkt durch Mikroinjektion oder durch Bombardierung mit DNA-beschichteten Mikropartikeln eingeführt werden. Auch kann die Zelle chemisch, zum Beispiel mit Polyethylenglycol, permeabilisiert werden, so dass die DNA durch Diffusion in die Zelle gelangen kann. Die DNA kann auch durch
10 Protoplastenfusion mit anderen DNA-enthaltenden Einheiten wie Minicells, Zellen, Lysosomen oder Liposomen erfolgen. Elektropo- ration ist eine weitere geeignete Methode zum Einführen von DNA, bei der die Zellen reversibel durch einen elektrischen Impuls per eabilisert werden. Entsprechende Verfahren sind beschrieben
15 (beispielsweise bei Bilang et al. (1991) Gene 100:247-250; Scheid et al. (1991) Mol Gen Genet 228:104-112; Guerche et al . (1987) Plant Science 52:111-116; Neuhause et al. (1987) Theor Appl Genet 75:30-36; Klein et al. (1987) Nature 327:70-73; Howell et al . (1980) Science 208:1265; Horsch et al.(1985) Science
20 227:,1229-1231; DeBlock et al. (1989) Plant Physiology 91:694-701; Methods for Plant Molecular Biology (Weissbach and Weissbach, eds.) Academic Press Inc. (1988); and Methods in Plant Molecular Biology (Schuler and Zielinski, eds.) Academic Press Inc. (1989)) .
25
Als Vektoren für E.coli sind bevorzugt pQE70, pQE60 und pQE-9 (QIAGEN, Inc.); pBluescript Vektoren, Phagescript Vektoren, pNH8A, pNHlδa, pNHlδA, pNH46A (Stratagene Cloning Systems, Inc.); ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia Biotech,
30 Inc.). Zahlreiche Vektoren zur Transformation von Säuger und anderen eukaryotischen und prokaryotischen Organismen sind dem fachmann bekannt. Prinzipiell sind für die Transformation eukaro- tischer oder prokaryotischer Zellen ähnliche Verfahren wie für die "direkte" Tranformation von pflanzlichen Zellen (s.u.) anzu-
35 wenden. Insbesondere Verfahren wie die Calciumphosphat- oder Li- posomen-vermittelte Transformation oder aber.. Elektroporation sind bevorzugt .
Verschiedene Methoden und Vektoren zum Einschleusen von Genen in 40 das Genom von Pflanzen sowie zur Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen sind bekannt (Plant Molecular Biol,ogy and Biotechnology (CRC Press, Boca Raton, Florida) , Kapitel 6/7, S. 71-119 (1993); White FF (1993) Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in: Transgenic Plants, Bd. 1, Enginee- 45 ring and Utilization, Hrsgb. : Kung und Wu R, Academic Press, 15-38; Jenes B et al . J1993) Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsgb. : Kung und R. Wu, Academic Press, S.128-143; Potrykus (1991) Annu Rev Plant Physiol Plant Molec Biol 42:205-225; Haiford NG, Shewry PR (2000) Br Med Bull 56 (1) : 62-73) . Dazu zählen beispielhaft die oben erwähnten. Bei- Pflanzen werden dabei die beschriebenen Methoden zur Transformation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen zur transienten oder stabilen Transformation genutzt. Geeignete Methoden sind vor allem die Protoplastentransformation durch Polyethylenglykol-induzierte DNA-Aufnahme, Calciumphosphat-vermittelte. Transformation, DEAE- Dextran-ver ittelte Transformation, Liposomen vermittelte Transformation (Freeman et al. (1984) Plant Cell Physiol. 29:1353ff; US 4,536,475),. biolistische Verfahren mit der Genkanone ("parti- cle bombardment" Methode; US 5,100,792; EP-A 0 444 882; EP-A 0 434 616; Fromm ME et al . (1990) Bio/Technology 8(9):833-9; Gordon-Kamm et al. (1990) Plant Cell 2:603), die Elektroporation, die Inkubation trockener Embryonen in DNA-haltiger Lösung, Elektroporation (EP-A 290 395, WO 87/06614), Mikroinjektion (WO 92/09696, WO 94/00583, EP-A 0 331 083, EP-A 0 175 966) oder andere Methoden der direkten DNA-Einführung (DE 4 005 152, WO 90/12096, US 4,684,611). Physikalische Methoden der DNA-Einführung in pflanzliche Zellen sind im Überblick dargestellt bei Oard (1991) Biotech Adv 9:1-11.
Im Falle dieser "direkten" Transformationsmethoden sind keine besonderen Anforderungen an das verwendete Plasmid gestellt. Einfache Plasmide wie die der pUC-Reihe, pBR322, M13mp Reihe, pACYC184 etc. können verwendet werden. Sollen vollständige Pflanzen aus den transformierten Zellen regeneriert werden, so ist es erforderlich, dass sich auf dem Plasmid ein zusätzliches selek- tionierbares Markergen befindet.
Neben diesen "direkten". Transformationstechniken kann eine Transformation auch durch bakterielle Infektion mittels Agrobakterium (z.B. EP .0 116 718), virale Infektion mittels viraler Vektoren (EP 0 067 553; US 4,407,956; WO 95/34668; WO 93/03161) oder mittels Pollen (EP 0 270 356; WO 85/01856; US 4,684,611) durchgeführt werden.
Die für die Agrobakterium-Transformation meist verwendeten Stämme Agrobakterium tumefaciens oder Agrobakterium rhizogenes enthalten ein Plasmid (Ti bzw. Ri Plasmid) , das auf die Pflanze nach Agrobakterium-Infektion übertragen wird. Ein Teil dieses Plasmids, genannt T-DNA (transferred DNA) , wird in das Genom der Pflanzenzelle integriert. Bevorzugt erfolgt die Transformation mittels Agrobakterien, die "entwaffnete" (disarmed) Ti-Plasmidvektoren enthalten, wobei deren natürliche Fähigkeit zum Gentransfer auf Pflanzen genutzt wird (EP-A 0 270 355; EP-A 0 116 718) . Alterna- tiv können durch Agrobakterium auch binäre Vektoren (Mini-Ti- Plasmide) auf Pflanzen übertragen und in deren Genom integriert werden. Verschiedene binäre Vektoren sind bekannt und teilweise kommerziell erhältlich wie zum Beispiel pBINl9 (Bevan et al . (1984) Nucl Acids Res 12:8711f.; Clontech Laboratories, Inc. USA) oder pSUN Derivate (SunGene GmbH & Co.KGaA; WO 02/00900) . In diese binären Vektoren kann die erfindungsgemäße Expressionskas- sette insertiert und - wie im folgenden beschrieben - in das pflanzliche Genom integriert werden.
Die Verwendung von T-DNA zur Transformation pflanzlicher Zellen ist intensiv untersucht und beschrieben (Horsch RB et al. (1985) Science 225 :1229ff. ; Fraley et al. (1983) Proc Natl Acad Sei USA 80: 4803-4807; Bevans et al. (1983) Nature 304:184-187; Jenes B et al^.(1993) Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. ,1, Engineering and Utilization, Kung SD und Wu R Ed., Academic Press, S.128-143; Potrykus (1991) Annu Rev Plant Physiol Plant Molec Biol 42:205-225; EP 120 516; Hoekema, In: The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam, Chapter V; and An et al. (1985) EMBO J 4:277-287).
Für den Transfer der DNA in die pflanzliche Zelle werden pflanzliche Explantate mit Agrobakterium tumefaciens oder Agrobakterium rhizogenes kokultiviert . Ausgehend von infiziertem Pflanzen- material (z.B. Blatt-, Wurzel- oder Stengelteile, aber auch
Protoplasten oder Suspensionen von Pflanzenzellen) können ganze Pflanzen unter Verwendung eines geeigneten Mediums, dass zum Beispiel Antibiotika oder Biozide zur Selektion transformierter Zellen enthalten kann, regeneriert werden. Die erhaltenen Pflanzen können dann auf die Präsenz der eingeführten DNA, hier der erfindurigsgemäßen transgenen Expressionskassette, durchmustert werden. Sobald.die DNA in das Wirtsgenom integriert ist, ist der entsprechende Genotyp in der Regel stabil und die entsprechende Insertion wird auch iii den Nachfolgegenerationen wie- dergefunden. In der Regel enthält die integrierte transgene Expressionskassette einen Selektionsmarker, der der transformierten Pflanze eine Resistenz gegen ein Biozid (zum Beispiel ein Herbizid) , einen Metabolismusinhibitor wie 2-DOG oder ein Antibiotikum wie Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin oder Phosphinothricin etc . verleiht . Der Selektionsmarker erlaubt die Selektion von transformierten Zellen von untransformierten (McCormick et al-. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84). Die erhaltenen Pflanzen können in üblicher Weise gezüchtet und gekreuzt werden. Zwei oder mehr Generationen sollten kultiviert werden, um sicherzustellen, dass die genomische Integration stabil und vererblich- ist . Agrobakterium-Transformation ist weit verbreitet für die Transformation von Dicotyledonen, wird aber auch zunehmend auf Monoco- tyledonen angewandt (Toriyama et al. (1988) Bio/Technology 6: 1072-1074; Zhang et- al. (1988) Plant Cell Rep 7:379-384; Zhang et al. (1988) Theor Appl Genet 76:835-840; Shi amoto et al .
(1989) Nature 338:274-276; Datta et al. (1990) Bio/Technology 8: 736- 740; Christou et al. (1991) Bio/Technology 9:957-962; Peng et al. (1991) International Rice Research Institute, Manila, Philippines 563-574; Cao et al. (1992) Plant Cell Rep 11:585-591; Li et al. (1993) Plant Cell Rep 12:250-255; Rathore et al. (1993) Plant Mol Biol 21:871-884; Fromm et al . (1990) Bio/Technology 8:833-839; Gordon-Kamm et al. (1990) Plant Cell 2:603-618; D'Hal- luin et al . (1992) Plant Cell 4:1495-1505; Walters et al. (1992) Plant Mol Biol 18:189-200; Koziel et al. (1993) Biotechnology 11:194-200; Vasil IK (1994) Plant Mol Biol 25:925-937; Weeks et al. (1993) Plant Physiol 102:1077-1084; Somers et al. (1992) Bio/ Technology 10:1589-1594; WO 92/14828; Hiei et al . (1994) Plant J 6:271-282) .
Viele Stämme von Agrobakterium tumefaciens sind in der Lage, genetisches Material - beispielsweise die erfindungsgemäßen Expressionskassetten - zu übertragen, wie z.B. die Stämme EHA101[pEHAl01] , EHA105 [pEHAl05] , LBA4404 [pAL4404] , C58Cl[pMP90] und C58Cl[pGV2260] (Hood et al . (1993) Transgenic Res 2:208-218; Hoekema et al . (1983) Nature 303:179-181; Koncz and Schell (1986) Gen Genet 204:383-396; Deblaere et al. (1985) Nucl Acids Res 13: 4777-4788) .
Werden Agrobakterien verwendet, so ist die Expressionskassette in spezielle Plasmide zu integrieren, entweder in einen Zwischenvektor (englisch: Shuttle or intermediate vector) oder einen binären Vektor. Bevorzugt werden binäre Vektoren verwendet, die sowohl in E.coli als auch in Agrobakterium replizieren können. Sie enthalten in der Regel ein Selektionsmarkergen und einen Linker oder Polylinker, flankiert von der rechten und linken T-DNA Begrenzungssequenz . Sie können direkt in Agrobakterium transformiert werden (Holsters et al. (1978) Mol Gen Genet 163:181-187). Das in diesem Fall als Wirtsorganismus fungierende Agrobakterium sollte bereits ein Plasmid mit der vir-Region enthalten. Diese ist für die Übertragung der T-DNA auf die pflanzliche Zelle erforderlich. Ein so transformiertes Agrobakterium kann zur Transformation pflanzlicher Zellen verwendet werden. Die Verwendung von T-DNA zur Transformation pflanzlicher Zellen ist intensiv untersucht und beschrieben (EP-A 0 120 516; Hoekema, In: The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B.V. , Alblasserdam, Chapter V; An et al . (1985) EMBO J 4:277-287). Verschiedene binäre Vektoren sind bekannt und teilweise kommerziell erhältlich wie zum Beispiel pBI101.2 oder pBINl9 (Clontech Laboratories, Inc. USA; Bevan et al.(1984) Nucl Acids Res 12:8711), pBinAR, PPZP200 oder pPTV.
Die „mit einem solchen Vektor transformierten Agrobakterien können dann in bekannter Weise zur Transformation von Pflanzen, insbesondere von Kulturpflanzen, wie z.B. von Raps, verwendet werden, indem beispielsweise verwundete Blätter oder Blattstücke in einer Agrobakterienlösung gebadet und anschliessend in geeigneten Medien kultiviert werden. Die Transformation von Pflanzen durch Agrobakterien ist beschrieben (White FF (1993) Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von SD Kung und R Wu, Academic Press, S. 15-38; Jenes B et al. (1993) Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von S.D. Kung und R. Wu, Academic Press, S.128-143; Potrykus (1991) Annu Rev Plant Physiol Plant Molec Biol 42:205-225). Aus den transformierten Zellen der verwundeten Blätter bzw. Blattstücke können in bekannter Weise transgene Pflanzen regeneriert werden, die integriert die oben beschriebenen erfindungsgemässen ExpressionsSysteme enthalten.
Stabil transformierte Zellen' (d.h. solche, die die eingeführte DNA integriert in die DNA der Wirtszelle enthalten) können von untransformierten selektioniert werden, wenn ein selektionier- barer Marker Bestandteil der eingeführten DNA ist. Als Marker kann beispielhaft jedes Gen fungieren, dass eine Resistenz gegen ein Biozid (z.B. ein Antibiotikum oder Herbizid (s.o.) zu verleihen vermag (s.o.). Transformierte Zellen, die ein solches Marker- gen exprimieren, sind in der Lage, in der Gegenwart von Konzentrationen eines entsprechenden Biozids zu überleben, die einen untransformierten Wildtyp abtöten. Der Selektionsmarker erlaubt die Selektion von transformierten Zellen von untransformierten (McCor ick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84). Die erhal- tenen Pflanzen können in üblicher Weise gezüchtet und gekreuzt werden. Zwei oder mehr Generationen sollten kultiviert werden, um sicherzustellen, dass die genomische Integration stabil und vererblich ist.
Sobald eine transformierte Pflanzenzelle hergestellt wurde, kann eine vollständige Pflanze unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Verfahren erhalten werden. Hierbei geht man beispielhaft von Kalluskulturen, einzelnen Zellen (z.B. Protoplasten) oder Blattscheiben aus (Vasil et al. (1984) Cell Culture and Somatic Cel Genetics of Plants, Vol I, II and III, Laboratory Procedures and Their Applications, Academic Press; Weissbach and Weissbach (1989) Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press). Aus diesen noch undifferenzierten Kallus-Zellmassen kann die Bildung von Spross und Wurzel in bekannter Weise induziert werden. Die erhaltenen Sprösslinge können ausgepflanzt und gezüchtet werden. Entsprechende Verfahren sind beschrieben (Fennell et al. (1992) Plant Cell Rep. 11: 567-570; Stoeger et al (1995) Plant Cell Rep. 14:273-278; Jahne et al. (1994) Theor Appl Genet 89:525-533).
Die Wirksamkeit der Expression der transgen expri ierten Nukleinsäuren kann beispielsweise in vitro durch. Sprossmeristemvermeh- rung unter Verwendung einer der oben beschriebenen Selektionsmethoden ermittelt werden. Zudem kann eine in Art und Höhe veränderte Expression eines Zielgens und die Auswirkung auf den Phäno- typ der Pflanze an Testpflanzen in Gewächshausversuchen getestet werden.
Ein anderer Gegenstand der Erfindung betrifft transgene Organismen, (transformiert mit wenigstens einer erfindungsgemäßen transgenen Expressionskassette oder einem erfindungsgemäßen transgenen Expressionsvektor, sowie Zellen, Zellkulturen, Gewebe, Teile - wie .zum Beispiel bei pflanzlichen Organismen Blätter, Wurzeln usw.- oder Vermehrungsgut abgeleitet von solchen Organismen.
Unter Organismus, Ausgangs- oder Wirtsorganismen werden pro- karyotische oder eukaryotische Organismen, wie beispielsweise Mikroorganismen oder pflanzliche Organismen verstanden. Bevorzugte Mikroorganismen sind Bakterien, Hefen, Algen oder Pilze.
Bevorzugte Bakterien sind Bakterien der Gattung Escherichia, Erwinia, Agrobakterium, Flavobacterium, Alcaligenes oder Cyano- bakterien zum Beispiel der Gattung Synechocystis .
Bevorzugt sind vor allem Mikroorganismen, welche zur Infektion von Pflanzen und damit zur Übertragung der erfindungsgemäßen Kassetten. befähigt sind. Bevorzugte Mikroorganismen sind solche aus der Gattung Agrobakterium und insbesondere der Art Agrobakterium tumefaciens-.
Bevorzugte Hefen sind Candida, Saccharomyces, Hansenula oder Pichia.
Bevorzugte Pilze sind Aspergillus, Trichoderma, Ashbya, Neur.ospora, Fusarium, Beauveria oder weitere in Indian Chem Engr. Section B. Vol 37, No 1,2 (1995) auf Seite 15, Tabelle beschriebene Pilze. Als transgene Organismen bevorzugte Wirts- oder Ausgangsorganismen sind vor allem pflanzliche Organismen. "Pflanzlicher Organismus" oder von diesem abgeleitete Zellen umfasst allgemein jede Zelle Gewebe,- Teile oder Vermehrungsgut (wie Samen oder Früchte) eines zur Photosynthese befähigten Organismus. Eingeschlossen sind im Rahmen der Erfindung alle Gattungen und Arten höherer und niederer Pflanzen des Pflanzenreiches. Einjährige, mehrjährige, monocotyledone und dicotyledone Pflanzen sind bevorzugt .
"Pflanze" im Rahmen der Erfindung meint alle Gattungen und Arten höherer und niederer Pflanzen des Pflanzenreiches . Eingeschlossen unter dem Begriff sind die reifen Pflanzen, Saatgut, Sprosse und Keimlinge, sowie davon abgeleitete Teile, Ver- mehrungsgut (zum Beispiel Knollen, Samen oder Früchte) , Pflanzenorgane, Gewebe, Protoplasten, Kallus und andere Kulturen, zum Beispiel Zeil- oder Kalluskulturen, sowie alle anderen Arten von Gruppierungen von Pflanzenzellen zu funktionellen oder strukturellen Einheiten. Reife Pflanzen meint Pflanzen zu jedem beliebi- gen, EntwicklungsStadium jenseits des Keimlings. Keimling meint eine junge, unreife Pflanze in einem frühen Entwicklungsstadium.
Pflanzliche Organismen im Sinne der Erfindung sind weiterhin weitere photosynthetisch aktive Organismen, wie zum Beispiel Al- gen, Cyanobakterien sowie Moose. Bevorzugte Algen sind Grünalgen, wie beispielsweise Algen der Gattung Haematococcus , Phaedactylum tricornatum, Volvox oder Dunaliella. Insbesondere bevorzugt sind Synechocystis, Chlamydomonas und Scenedes us.
Eingeschlossen sind als pflanzliche Organismen im Rahmen der Erfindung alle Gattungen und Arten höherer und niedrigerer Pflanzen des Pflanzenreiches. Eingeschlossen sind ferner die reifen Pflanzen, Saatgut, Knollen, Rüben, Früchte, Sprossen und Keimlinge, sowie davon abgeleitete Teile, Vermehrungsgut und Kulturen, zum Beispiel Zellkulturen. Reife Pflanzen meint Pflanzen zu jedem beliebigen Entwicklungsstadium jenseits des Keimlings. Keimling meint eine junge, unreife Pflanze in einem frühen Entwicklungsstadium.
Einjährige, mehrjährige, monocotyledone und dicotyledone Pflanzen sind bevorzuge Wirtsorganismen für die Herstellung transgener Pflanzen. Die Expression von Genen ist ferner vorteilhaft bei allen Schmuckpflanzen, Nutz- oder Zierbäumen, Blumen, Schnittblumen, Sträuchern 'oder Rasen. Beispielhaft aber nicht ein- schränkend seien zu nennen Angiospermen, Bryophyten wie zum Beispiel Hepaticae (Leberblümchen) und Musci (Moose) ; Pteridophyten wie Farne, Schachtelhalm. und Lycopoden; Gymnospermen wie Koniferen, Cycaden, Ginkgo und Gnetalen; Algen wie Chlorophyceae, Phaeophpyceae, Rhodophyceae, Myxophyceae, Xanthophyceae, Bacillariophyceae (Diatomeen) und Euglenophyceae.
Bevorzugt sind Pflanzen nachfolgender Pflanzenfamilien: Amaranthaceae, Asteraceae, Brassicaceae, Carophyllaceae, Chenopodiaceae, Compos-itae, Cruciferae, Cucurbitaceae, Labiatae, Leguminosae, Papilionoideae, Liliaceae, Linaceae, Malvaceae, Rosaceae, Rubiaceae, Saxifragaceae, Scrophulariaceae, Solanacea, Sterculiaceae, Tetragoniacea, Theaceae, Umbelliferae.
Bevorzugte monokotyle Pflanzen sind insbesondere ausgewählt aus den monokotylen Kulturpflanzen, wie zum Beispiel der Familie der Gramineae wie Reis, Mais, Weizen oder andere Getreidearten wie Gerste, Hirse, Roggen, Triticale oder Hafer sowie dem Zuckerrohr sowie alle Arten von Gräsern.
Bevorzugte dikotyle Pflanzen sind insbesondere ausgewählt aus den dikotylen Kulturpflanzen, wie zum Beispiel
Asteraceae wie Sonnenblume, Tagetes oder Calendula und andere mehr,
- Compositae, besonders die Gattung Lactuca, ganz besonders die Art sativa (Salat) und andere mehr,
- Cruciferae, besonders die Gattung Brassica, ganz besonders die Arten napus (Raps) , campestris (Rübe) , oleracea cv Tastie (Kohl) , oleracea cv Snowball Y (Blumenkohl) und oleracea cv Emperor (Broccoli) und weitere Kohlarten; und der Gattung Arabidopsis , ganz besonders die Art thaliana sowie Kresse oder Canola und andere mehr,
Cucurbitaceae wie Melone, ' Kürbis oder Zucchini und andere mehr,
Leguminosae besonders die Gattung Glycine, ganz besonders die Art max (Sojabohne) Soja sowie Alfalfa, Erbse, Bohnengewächsen oder Erdnuss und andere mehr
- Rubiaceae, bevorzugt der Unterklasse Lamiidae wie beispielsweise Coffea arabica oder Coffea liberica (Kaffestrauch) und andere mehr,
- Solanaceae besonders die Gattung Lycopersicon, ganz besonders die Art esculentum (Tomate) , die Gattung Solanum, ganz besonders die Art tuberosum (Kartoffel) und melongena (Aubergine) und die Gattung Capsicum, ganz besonders die Art annum (Pfeffer) , sowie Tabak und andere mehr,
- Sterculiaceae, .bevorzugt der Unterklasse Dilleniidae wie bei- spielsweise Theobroma cacao (Kakaostrauch) und andere mehr,
- Theaceae, bevorzugt der Unterklasse Dilleniidae wie beispielsweise Camellia sinensis oder Thea sinensis (Teestrauch) und andere mehr,
- Umbelliferae, besonders die Gattung Daucus (ganz besonders die Art carota (Karotte) und Apium (ganz besonders die Art graveolens dulce (Sellerie) und andere mehr;
- Chenopodiaceae, bevorzugt die Gattung Beta vulgaris, insbesondere die Art Beta vulgaris ssp. vulgaris var. altissima L. (Zuckerrübe) und andere mehr;
sowie Lein, Baumwolle, Hanf, Flachs, Gurke, Spinat und den ver- schiedenen Baum-, Nuss- und Weinarten, insbesondere Banane und Kiwi.
Am meisten bevorzugt sind Pflanzen der Familie Solanaceae besonders die Gattung Lycopersicon, ganz besonders die Art esculentum (Tomate) , die Gattung Sölanum, ganz besonders die Art tuberosum (Kartoffel) und melongena (Aubergine) , der Familie Chenopodiaceae insbesondere die Gattung Beta vulgaris, insbesondere die Art Beta vulgaris ssp. vulgaris var. altissima L. (Zuckerrübe) und andere mehr, die Familie Leguminosae besonders die Gattung Glycine, ganz besonders die Art max (Sojabohne) sowie Alfalfa, Erbse, Bohnengewächsen besonders die Gattung Vicia oder Erdnuss und andere mehr und andere Pflanzen mit stärkehaltigen Samen, Knollen, Rüben, Früchten oder Geweben. Aus diesen wiederum bevorzugt sind Tomate, Kartoffel, Aubergine, Sojabohne, Alfalfa, Erbse, Ackerbohne, Fut- terrrübe, Zuckerrübe und Erdnuss.
Erfindungsgemäß sind ferner von den oben beschriebenen transgenen Organismen abgeleitete Zellen, Zellkulturen, Teile - wie zum Beispiel bei transgenen pflanzlichen Organismen Wurzeln, Blätter etc.-, und transgenes Vermehrungsgut wie Saaten, Knollen, Rüben oder Früchte. Von Menschen und Tieren verzehrbare erfindungsgemäße, genetisch veränderte Pflanzen können auch beispielsweise direkt oder nach an sich bekannter Aufbereitung als Nahrungsmittel oder Futtermittel verwendet werden. Dem Fachmann ist eine Vielzahl von Nukleinsäuren bzw. Proteinen bekannt, deren Expression gesteuert durch die erfindungsgemäßen transgenen Expressionskassetten vorteilhaft ist. Ferner sind dem Fachmann eine Vielzahl von Genen bekannt, durch deren Reprimie- rung oder Ausschaltung mittels transgener Expression beispielsweise einer entsprechenden doppelsträngigen RNA oder einer antisense-RNA ebenfalls vorteilhafte Effekte erreicht werden können. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind insbesondere solche Zielgene geeignet, die eine Rolle spielen im Zucker- oder Stärke- metabolismus, bei sink-source Relationen, bei der Balance von organischen Säuren, als Geschmackskomponenten, bei der Resistenz gegen biotische Stressfaktoren (Pathogene wie z.B. Viren, Insekten oder Pilze) , bei der Resistenz gegen abiotische Stressfaktoren (Hitze, Kälte, Trockenheit, erhöhte Feuchtigkeit, Umwelt- gifte,, UV-Strahlung) , bei der Konsistenz der Gewebe oder bei Wasser/pH Verhältnissen, bei der Verbesserung von Nahrungs- oder Futtereigenschaften, die Verbesserung der Keimungs- und/oder Lagereigenschaften sowie bei der Verbesserung der Wachstumsrate oder des Ertrages .
Die Steigerung des Stärkegehaltes ist insbesondere für Tomate und Kartoffel von besonderem Interesse. Eine normale Tomate besteht zu etwa 80 bis 95% aus Wasser, während Stärke - als der eigentlich relevante Bestandteil für die Herstellung von beispielsweise Tomatenmark, Ketchup - während der Reifung abgebaut wird und nur einen geringen Anteil hat . Selbst eine geringfügige Erhöhung des Stärkeanteils (und damit de Anteils der lösliches Bestandteile ("solubles") wäre von erheblicher wirtschaftlicher Bedeutung. In frühen Reifestadien liegt der Stärkegehalt der Tomate mit 20% deutlich höher, sinkt dann jedoch während der Entwicklung durch Mobilisierung der Stärke und Umsetzung in Zucker ab. Bei Kartoffel wirkt sich ein erhöhter Stärkeanteil insbesondere vorteilhaft auf die Frittiereigenschaften aus .
Die hohe Aktivität des SSS3-Promotors in den frühen Stadien der Knollenentwicklung (Stärkeaufbau) eignet sich hervorragend, um die Stärkequalität zu beeinflussen. Für die praktische Kartoffelzüchtung ist die Veredelung (Chips, Pommes frites, Trockenprodukte) ein vielversprechender Anwendungsbereich. Da Keimhemmungs- mittel immer kritischer gesehen werden, bietet sich eine 4°C-Lage- rung an, bei der sich jedoch die unerwünschten reduzierenden Zuk- ker ,bilden ("cold sweetening" ) . Je nach Sorte und Lagerzeit bilden sich dann bei Erhitzung unerwünschte braune und bitter schmeckende Maillardprodukte (wohl auch Acryla id aus Asparagin und red. Zuckern) . Deshalb liegt auf dem Züchtungsziel "Unterdrückung, der Bildung reduzierender Zucker" ein großes Interesse. Die erfindungsgemäßen SSS3-Promotoren könnte z.B. verwendet wer- den um Invertaseaktivitäten zu unterdrücken, die vermutlich an der Ausprägung des Merkmals "cold sweetening" beteiligt sind gem. (Menendez et al . (2002) Genetics 162:1423-14349. Die Unterdrük- kung dieser Genaktivitäten kann z.B. mittels doppelsträngiger RNA,., Cosuppression, antisense RNA oder durch die Expression eines Invertaseinhibitors erfolgen.
Nachfolgend seien beispielhaft jedoch nicht einschränkend Nukleinsäurensequenzen genannt, deren Expression unter Kontrolle eines der erfindungsgemäßen Promotoren vorteilhafte Effekte bietet:
1. Verbesserter Schutz der Pflanze gegen abiotische Stressfaktoren wie Trockenheit, Hitze, oder Kälte zum Beispiel durch Überexpression von "antifreeze"-Polypeptiden aus
Myoxocephalus Scorpius (WO 00/00512), Myoxocephalus octo- decemspinosus , dem Arabidopsis thaliana Transkriptionsaktivator CBF1, Glutamatdehydrogenasen (WO 97/12983, WO 98/11240) , Calcium-abhängigen Proteinkinasegenen (WO 98/26045), Calcineurinen (WO 99/05902), Caseinkinase aus Hefe (WO 02/052012), Farnesyltransferasen (WO 99/06580; Pei ZM et al . (1998) Science 282: 287-290), Ferritin (Deak M et al. (1999) Nature Biotechnology 17:192-196), Oxalatoxidase (WO 99/04013; Dunwell JM (1998) Biotechn Genet Eng Rev 15:1-32), DREBlA-Faktor ("dehydration response element B 1A" ,- Kasuga M et al. (1999) Nature Biotech 17:276-286), Genen der Mannitol- oder Trehalosesynthese wie der Trehalosephosphat- synthase oder der Trehalosephosphatphosphatase (WO 97/42326) oder durch Inhibition von Genen wie der Trehalase (WO 97/50561) .
2. Expression von Stoffwechselenzymen zur Verwendung im Futter- und Nahrungsmittelbereich z.B. von Phytasen und Cellulasen. Besonders bevorzugt sind Nukleinsäuren wie die künstliche für eine mikrobielle Phytase kodierende1 cDNA (GenBank Acc.-No.: A19451) oder funktionelle Äquivalente derselben.
3. Erreichen einer Resistenz zum Beispiel gegen Pilze, Insekten, Nematoden und Krankheiten durch gezielte Absonderung oder Anreicherung bestimmter Metaboliten oder Proteine. Beispielhaft seien genannt Antikörper gegen Pathogen-Proteine, Su- crose Isomerase, Glukosinolate (Abwehr von Herbivoren) , Chi- tinasen oder Glukanasen und andere Enzyme, die die Zellwand von Parasiten zerstören, Ribosom-inaktivierende Proteine (RIPs) und andere Proteine der pflanzlichen Resistenz- und ■ Stressreaktion, wie sie bei Verletzung oder mikrobiellem Befall von Pflanzen oder chemisch durch zum Beispiel Salicyl- säure, Jasmonsäure oder Ethylen induziert werden, Lysozyme aus nicht-pflanzliehen Quellen wie zum Beispiel T4 Lysozym oder Lysozym aus verschiedenen Säugern, insektizide Proteine wie Bacillus thuringiensis Endotoxin, α-Amylaseinhibitor oder Proteaseinhibitoren (cowpea Trypsininhibitor) , Lectine wie
Weizenkeimagglutinin, RNAsen oder Ribozyme. Weitere Beispiele sind Nukleinsäuren, die für die chit42 Endochitinase aus Tri- choderma harzianum (GenBank Acc.-No.: S78423) oder für das N-hydroxylierende, multifunktionelle Cytochrom P-450 (CYP79) Protein aus Sorghum bicolor (GenBank Acc.-No.: U32624) oder funktionelle Äquivalente derselben kodieren.
Vorteilhaft ist die Akkumulation von Glukosinolaten in Lebensmitteln zum Schutz vor Schädlingen (Rask L et al.(2000) Plant Mol Biol 42:93-113; Menard R et al . (1999) Phytochemis- try 52:29-35), die Expression von Bacillus thuringiensis Endotoxinen (Vaeck et al. (1987) Nature 328:33-37) oder der Schutz gegen Pilzbefall durch Expression von Chitinasen z.B. aus der Bohne (Broglie et al. (1991) Science 254:1194-1197).
Die Expression synthetischer cryΙA(b) and cryΙA(c) Gene, die für Lepidopteren-spezifische Δ-Endotoxine aus Bacillus thuringiensis kodieren, kann in verschiedenen Pflanzen eine Resistenz gegen Schadinsekten bewirken (Goyal RK et al. (2000) Crop Protection 19 (5) : 307-312 ) .
Weiterhin zur Pathogen Abwehr geeignete Zielgene umfassen "Polygalacturonase inhibiting protein" (PGIP) , Thaumatin, Invertase sowie antimikrobielle Peptide wie Lactoferrin (Lee TJ et al . (2002) J Amer Soc Horticult Sei 127(2): 158-164) .
4. Expression von Genen, die eine Akkumulation von Feinchemikalien, wie von Tocopherolen, Tocotrienolen, Vitamin C oder Carotinoiden bewirken. Beispielhaft sei die Phytoendesa- turase genannt. Bevorzugt sind Nukleinsäuren, die für die Phytoendesaturase aus Narcissus pseudonarcissus (GenBank Acc.-No.: X78815) oder funktionelle Äquivalente derselben kodieren. Die Produktion von Vitamin C kann beipielsweise über die Expression von GDP-mannose-3 ' , 5 ' -epimerase modifiziert und erhöht werden (WO 02/103001) . Der Carotenoidgehalt in Pflanzen beispielweise Kartoffeln kann durch die Expression eines Proteins, welches die enzymatische Aktivität einer Zeaxanthin-epoxidase besitzt, erhöht werden (WO 02/103021) . 5. Produktion von Nutraceuticals wie zum Beispiel polyungesättigten Fettsäuren (z.B. Arachidonsäure, Eicosapentaensäure oder Docosahexaensäure) durch Expression von Fettsäureelonga- sen und/oder -desaturasen oder Produktion von Proteinen mit verbessertem Nährwert wie zum Beispiel mit einem hohen Anteil an essentiellen Aminosäuren (z.B. das methioninreiche 2S Albumingen der Brasilnuss) . Bevorzugt sind Nukleinsäuren, die für das methioninreiche 2S Albumin aus Bertholletia excelsa (GenBank Acc.-No. :AB044391) , die Δ6-Acyllipiddesatu- rase aus Physcomitrella patens (GenBank Acc.-No.: AJ222980; Girke et al. (1998) Plant J 15:39-48), die Δ6-Desaturase aus Mortierell.a alpina (Sakuradani et al 1999 Gene 238:445- 453), die Δ5-Desaturase aus Caenorhabditis elegans (Michaelson et al. 1998, FEBS Letters 439:215-218), die Δ5-Fettsäuredesatu- rase (des-5) aus Caenorhabditis elegans (GenBank Acc.-No. : AF078796) , die Δ5-Desaturase aus Mortierella alpina !(Michaelson et al. JBC 273:19055 - 19059), die Δ6-Elongase aus Caenorhabditis elegans (Beaudoin et al. 2000, PNAS 97:6421-6426), die Δ6-Elongase aus Physcomitrella patens (Zank et al. 2000, Biochemical Society Transactions
28:654-657) oder funktionelle Äquivalente derselben kodieren.
Die Überexpression von Glutamatdehydrogenase (GDH) führt beispielsweise zu einer Akkumulation von freien" Aminosäuren und zu einer Erhöhung der Ausbeute in transgenen Kartoffeln (WO 03/000041) . Eine Produktion von Polyfructanen (levans) in Pflanzen kann durch die Überexpression einer bakteriellen Su- crase in transgenen Pflanzen erreicht werden (US 6,501,005) . Der Gehalt und die Struktur von Sterol-Glycosiden wurde durch die Expression einer Sterolglucosyltransferase modifiziert (US 6,498,239) .
6. Produktion von hochwertigen Proteinen und Enzymen zu industriellen Zwecken (wie beispielsweise Enzymen wie Lipasen) oder als Pharmazeutika (wie zum Beispiel Antikörpern, Blutgerinnungsfaktoren, Interferonen, Lymphokinen, "colony Stimulation factor", Plasminogenaktiyatoren, Hormonen oder Vakzinen wie beschrieben bei Hood EE, Jilka JM (1999) Curr Opin Bio- technol 10(4):382-6; Ma JK, Vine ND (1999) Curr Top Microbiol Immunol 236:275-92). Beispielsweise konnte rekombinantes Avi- din aus Hühnereiweiß und bakterieller ß-Glucuronidase (GUS) in großen Maßstab in transgenen Maispflanzen produziert werden (Hood et al. (1999) Adv Exp Med Biol 464:127-47). Die Expression von monoklonalen Antikörpern gegen cariogene Orga- nismen in essbaren Früchten von Pflanzen ist im Patent WO 02/102975 beschrieben. 8. Erreichen einer erhöhten Speicherfähigkeit in Zellen, die normalerweise weniger Speicherproteine oder -lipide enthalten mit dem Ziel, den Ertrag an diesen Substanzen zu erhöhen, zum Beispiel durch -Expression eine Acetyl-CoA Carboxylase. Die Expression einer Acetyl-CoA Carboxylase führt zu einer Veränderung der Qualität und Quantität hinsichtlich Öl- und Fettsäureproduktion in Pflanzen (WO 94/17188) . Bevorzugt sind Nukleinsäuren, die für die Acetyl-CoA Carboxylase (Accase) aus Medicago sativa (GenBank Acc.-No.: L25042) oder funktionelle Äquivalente derselben kodieren. Weitere Beispiele sind beschrieben in Herbers & Sonnewald (1999) Curr Opinion Biotech-' nol 10 163-168; Biesgen & Herbers (2000) J Plant Biotechnol 2:1-12; Biesgen et al. (2002) Phytochemistry Reviews 1:79-85.
9. Modifkation des Kohlenhydratstoffwechsels :
Der SSS3-Promotor kann z.B. für die Expression einer Stärke- isynthase aus Weizen verwendet werden, um den Gehalt oder die Komposition von pflanzlicher Stärke zu modifizieren, was der Optimierung von Nahrungsmitteln, der Entwicklung von Be- Schichtungen, Klebern oder Verpackungsmaterialien, und Anwendungen in der Bauindustrie dienen kann (WO 00/66745). Weitere Anwendungsmöglichkeiten sind in DE06483010 und WO 02/086112 beschrieben. Der SSS3 Promoter ist insbesondere geeignet durch die Expression einer Phosphofructosekinase die Akkumu- lation von Zuckern zu reduzieren. Dies kann vor allem bei der Lagerung der Kartoffel bei niedriger Temperatur ausgenutzt werden, um das sogenannte "cold sweetening" zu unterdrücken (US 6,489,539). Durch die Expression oder Repression von pflanzlichen Zuckertransportern wird der Kohlenhydratstoff- Wechsel moduliert (WO 02/0199217) . Weitere vorteilhafte Beispiele sind Invertaseinhibitor (Börnke et al. (1999) Nature Biotech 17:708-711), Sucroseisomerase (Börnke et al . (2002) Planta 214:356-364, "Starch-related Rl Protein" (Lorberth et al. (1998) Nature Biotechnolbgy 16(5): 473-7, Ritte et al. (2000) Plant Journal 21 (4) : 387-91) .'
10. Der SSS3-Promotor kann auch zur Expression von Proteinen in stärkehaltigen Geweben, wie z.B. Kartoffelknollen, verwendet werden, um den Nährwert zu erhöhen (Chakraborty et al. (2000) Proc Natl Acad Sei USA 97:3724-3729) . Durch die Expression einer endo-1, 4-ß-D-Galactanase kann Pectin modifiziert werden (S0rensen et al. (2000) Proc Natl Acad Sei USA 97: 7639-7644) . Beispielsweise kann durch die Expression von "Lipid Metabolismus Proteine" (LMP) der Gehalt an Speicher- Stoffen, wie Lipide, Fettsäuren, Stärke oder Samenproteine moduliert werden (WO 02/099076) . Durch Überexpression der plastidären Adenylatekinase in transgenen Kartoffelpflanzen kann der Stärkegehalt und der Ertrag erhöht werden (Regierer et al. (2002) Nature Biotechnology 20:1256) .
11. Der SSS3 Promoter kann für die Expression einer Xylanase ver- wendet werden, um das Wachstum und Absterben sowie die Fruchtreifung von Pflanzen zu kontrollieren (US 6,495,743).
Weitere Beispiele für vorteilhafte Gene sind zum Beispiel genannt bei Dunwell JM, Transgenic approaches to crop improvement, J Exp Bot. 2000; 51 Spec No; Seite 487-96.
Ferner können funktionelle Analoga der genannten Nukleinsäuren bzw. Proteine exprimiert werden. Funktionelle Analoga meint hier all die Sequenzen, die im wesentlichen die gleiche Funktion haben d.h. zu der Funktion (zum Beispiel einer Substratumsetzung oder einer, Signaltransduktion) befähigt sind wie auch das beispielhaft genannte Protein. Dabei kann das funktionelle Analogon sich in anderen Merkmalen durchaus unterscheiden. Es kann zum Beispiel eine höhere oder niedrigere Aktivität haben oder auch über weitere Funktionalitäten verfügen. Funktionelle Analoga meint ferner Sequenzen, die für Fusionsproteine bestehend aus einem der bevorzugten Proteine und anderen Proteinen zum Beispiel einem weiteren bevorzugten Protein oder aber auch einer Signalpeptid- sequenz kodieren.
Dem Fachmann ist ferner bekannt, dass er die oben beschriebenen Gene nicht direkt unter Verwendung der für diese Gene kodierenden Nukleinsauresequenzen exprimieren oder zum Beispiel durch antisense reprimieren muss . Er kann auch zum Beispiel künstliche Transkriptionsfaktoren vom Typ der Zinkfingerproteine verwenden (Beerli RR et al . (2000) Proc Natl Acad Sei USA 97 (4) : 1495-500) . Diese Faktoren lagern sich in den regulatorischen Bereichen der zu exprimierenden oder zu reprimierenden endogenen Gene an und bewirken, je nach Gestaltung des 'Faktors, eine Expression oder Repression des endogenen Gens. So kann man die gewünschten
Effekte auch durch Expression eines entsprechenden Zinkfinger- Transkriptionsfaktors unter Kontrolle eines der erfindungsgemäßen Promotoren erreichen. Durch die Expression bestimmter Myb Transkriptionsfaktoren kann beispielsweise die Flavonoidbisoynthese moduliert werden (Moyano et al. (1996) Plant Cell 8:1519-32). Weitere. Beispiele der Regulation des Sekundärstoffwechsels sind beschrieben (Memelink (2001) Advances in Biochemical Engineering- Biotechnology 72:103-25).
Die erfindungsgemäßen transgenen Expressionskassetten können ebenso zur Verminderung (Suppression) von Transkription oder/und Translation von Zielgenen durch "gene silencing" eingesetzt wer- den. So können die erfindungsgemäßen transgenen Expressionskassetten Nukleinsäuren exprimieren, die ein PTGS ( "post transkrip- tional gene silencing" ) oder TGS ("transcriptional silencing") Effekte und so eine- Verminderung der Expression endogener Gene bewirken. Besagte Verminderung kann beispielsweise durch Expression einer "antisense"-RNA (u.a. EP-Al 0 458 367; EP-AI 0 140 308; van der Krol AR et al. (1988) BioTechniques 6(10) :658-676; de Lange' P et al . (1995) Curr Top Microbiol Immu- nol 197:57-75) oder einer doppelsträngigen RNA, die jeweils Homo- logie zu dem zu vermindernden endogenen Zielgen aufweisen, erreicht werden. Auch die Expression einer entsprechenden "sense"-RNA kann mittels sogenannter Co-Suppression eine Verminderung der Expression endogener Gene bewirken (EP-Al 0 465 572) . Insbesondere bevorzugt ist die Expression einer doppelsträngigen RNA zur Verminderung der Genexpression eines Zielgens .
WO 99/32619 und WO 99/53050 beschreiben Verfahren zur Inhibition einzelner Zielgene unter Verwendung einer RNA mit doppelsträngi- ger Struktur, wobei das Zielgen und die Region der RNA Duplex zumindest eine teilweise Identität aufweisen (siehe auch: Montgom- ery-MK et al . (1998) Proc Natl Acad Sei USA 95:15502- 15507;
Sharp PA (1999) Genes & Development 13 (2) :139-141; Fire A et al. (1998) Nature 391:806-11). Das Verfahren wird heute auch als "RNA-Interference" (RNAi) bezeichnet.
Bevorzugte Anwendungen, bei denen die Verminderung (Suppression) der Genexpression einen vorteilhaften Phänotyp bedingt, umfassen beispielhaft, aber nicht einschränkend:
1. Modifikation der Kohlenhydratzusammensetzung
Eine Modifikation der Kohlehydratzusammensetzung kann beispielsweise erreicht werden durch Verminderung der Genexpression von Genen des Kohlenhydratstoffwechsels oder der Kohlehhydratbio- synthese,. beispielsweise der Biosynthese von Amylose, Pektinen, Cellulose oder Zellwandkohlenhydraten. Dadurch kann eine Vielzahl zellulärer Prozesse (Reifung, Stärkezusammensetzung oder -gehalt etc.) in vorteilhafter Weise beeinflusst werden. Als Zielgene seien beispielhaft jedoch nicht einschränkend zu nennen Phos- phorylasen, Stärkesynthetasen, Verzweigungsenzyme ("Branching- Enzyme"), Lipoxygenasen (Griffiths A et al. (1999) Postharvest Biology & Technology 17 (3) : 163-173 ) , Debranching-Enzyme sowie diverse Amylasen. Die entsprechenden .Gene sind beschrieben (Dunwell JM (2000) J Exp Botany 5lSpec No:487-96; Brar DS et al . (1996) Biotech Genet Eng Rev 13:167-79; Kishore GM und Somerville CR (1993) Curr Opin Biotech 4(2):152-8). Vorteilhafte Gene zur Beeinflussung des Kohlenhydratstoffwechsels - insbesondere der Stärkebiosynthese - sind, beschrieben in WO 92/11375, WO 92/11376, US 5,365,016, WO 95/07355 und WO 02/097101. Die Fusion eines SSS3-Promotors mit einer in antisense orientierten Sequenz einer oder beider Untereinheiten der ADP-Glucose-Pyrophosphorylase vermag die Aktivität derselben in der frühen Entwicklung von Früch- ten „und Knollen zu hemmen und und das Verhältnis zwischen löslichen Zuckern und Stärke zu erhöhen.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform, kann eine Verschiebung des Amylose/Amylopektinverhältnisses in der Stärke durch Suppression beider Isoformen des Verzweigungsenzyms, die für die α^l, 6-glykosidische Verknüpfung verantwortlich sind, bewirkt werden. Entsprechende Vorgehensweisen sind beschrieben (beispielsweise bei Schwall GP et al. (2000) Nat Biotechnol 18 (5) : 551-554) . Bevorzugt werden dazu Nukleinsauresequenzen wie die des Starch branching enzyme II der Kartoffel (GenBank Acc.- No.: AR123356; US 6,169,226) oder dessen Homologe aus anderen Gattungen und Arten verwendet. Eine weitere Anwendung ist die Unterdrückung von endogenen Aktivitäten (Enzymen, Signaltransduk- tion, Phytohormon etc.) durch Immunomodulation.
Insbesondere vorteilhaft ist die Verminderung der Stärkemobilisierung und Umsetzung zu Zuckern bei niedrigen Temperaturen ("cold-sweetening") mittels Verminderung der Expression einer Glukanphosphorylase (systematischer Name: 1, 4-α-D-Glukan:phos- phate-α-D-glucosyltransferase; US 5,998,710).
2. Verzögerung der Fruchtreifung
Eine verzögerte Fruchtreifung oder ein modifizierter Reifungsphä- notyp (verlängerte Reifung, spätere Senescence) kann beispie sweise erreicht werden durch Verminderung der Genexpression von Genen ausgewählt aus .der Gruppe bestehend aus Polygalacturonasen, Pectinesterasen, ß-(l-4)Glukanasen (Cellulasen) , ß-Galactanasen (ß-Galactosidasen) , oder Gene der Ethylenbiosynthese wie 1-Amino- cyclopropan-1-carboxylatsynthase, Adenosylmethioninhydrolase
(SAMase) , Aminocyclopropan-1-carboxylatdeaminase, Aminocyclopro- pan-1-carboxylatoxidas , Gene der Carotinoidbiosynthese wie z.B. Gene der Prephytoen- oder Phytoenbiosynthese beispielsweise Phy- toendesaturasen, sowie O-Methyltransferasen, Aeyl-carrier Protein (ACP) , Elongationsfaktor, Auxin-induziertes Gen, Cysteine-
(thiol)proteinasen, Stärkephosphorylasen, Pyruvatdecarboxylasen, Chal.conreduktasen, Proteinkinasen, "auxin-related gene", Sucrose- transporter, "meristem Pattern gene". Weitere vorteilhafte Gene sind beschrieben, bespielsweise in WO 91/16440, WO 91/05865, WO 91/16426, WO 92/17596, WO 93/07275 oder WO 92/04456. Insbesondere bevorzugt ist die^ Verminderung der Expression der Polygalak- turonase zur Verhinderung. von Zellabbau und "Matschig"-werden von Pflanzen und Früchten beispielsweise von Tomaten. Bevorzugt werden dazu Nukleinsauresequenzen wie die des Polygalakturonase-Gens der Tomate (GenBank Acc.-No.: X14074) oder dessen Homologe verwendet.
3. Verbesserter Schutz gegen abiotische Stressfaktoren (Hitze, Kälte, Trockenheit, erhöhte Feuchtigkeit, Umweltgifte, UV- Strahlung) . Bevorzugt werden Gene in ihrer Expression vermindert, die an Stressreaktionen beteiligt sind.
Verminderung des Gehaltes von Speicherproteinen
Die Verminderung der Genexpression von Genen kodierend für Speicherproteine (infolge SP) hat zahlreiche Vorteile, wie beispiels- weise -Verminderung des allergenen Potentials oder Veränderung in der Zusammensetzung oder Menge anderer Metabolite wie beispielsweise Öl- oder Stärkegehalt.
5. Erreichen einer Resistenz gegen pflanzliche Pathogene
Eine Resistenz gegen pflanzliche Pathogene wie Arachniden, Pilze, Insekten, Nematoden, Protozoen, Viren, Bakterien und Krankheiten kann erreicht werden .durch Verminderung der Genexpression von Genen, die für das Wachstum, Überleben, bestimmte Entwicklungsstu- fen (beispielsweise Verpuppung) oder die Vermehrung eine bestimmten Pathogens essentiell sind. Eine entsprechende Verminderung kann eine vollständige Inhibition vorgenannter Schritte aber auch eine Verzögerung derselben bewirken. Dies können pflanzliche Gene sein, die dem Pathogen beispielsweise das Eindringen ermöglichen, können aber auch pathogen-eigene Gene sein. Bevorzugt ist die transgen exprimierte Nukleinsauresequenz (z.B. die doppelsträn- gige RNA) gegen Gene des Pathogens gerichtet. Als anti-pathogenes Agens kann dabei die transgen exprimierte Nukleinsauresequenz (z.B. die doppelsträngige RNA) selber, jedoch auch die transgenen Expressionskassetten oder transgenen Organismen wirken. Die Pflanzen selber können in Form eines transgenen Organismus die Agentien beinhalten und diese - beispielsweise in Form eines Fraßgiftes - an die Pathogene weitergeben. Verschiedene essentielle Gene diverser Pathogene sind dem Fachmann bekannt (z.B. für Nematodenresistenz WO 93/10251, WO 94/17194) . Eine Virusresistenz kann beispielsweise durch Verminderung der Expression eines virilen Hüllproteins, einer viralen Replikase, einer viralen Pro- tease etc. erreicht werden. Zahlreiche Pflanzenviren und entsprechende Zielgene sind dem Fachmann bekannt. 8. Verminderung unerwünschter, allergener oder toxischer Pflanzeninhaltsstoffe wie z.B. Glucosinolaten. Entsprechende Zielgene sind beschrieben (u.a. in WO 97/16559) . Die zur Verminderung von 14-1.6 kDa allergenen Proteinen bevorzugten Ziel- gene sind beispielsweise beschrieben bei Tada Y et al. (1996) FEBS Lett 391(3): 341-345 oder Nakamura R (1996) Biosci Bio- technol Bioche 60 (8) :1215-1221.
9. Verzögerung von Alterserscheinungen. Entsprechende Zielgene sind u.a. Cinnamoyl-CoA:NADPH-Reduktasen oder Cinnamoylalko- holdehydrogenasen. Weitere Zielgene sind beschrieben (u.a. in WO 95/07993) .
10. Verminderung der Stoßanfälligkeit von beispielsweise Kartof- fein durch Verminderung beispielsweise der Polyphenoloxidase
,(W0 94/03607) etc.
11. Erhöhung des Methioningehaltes durch Verminderung der Threo- ninbiosynthese, beispielsweise durch Verminderung der Expres- sion der Threoninsynthase (Zeh M et al. (2001) Plant Physiol 127(3) :792-802) .
Eine "antisense" Nukleinsäure meint zunächst eine Nukleinsauresequenz die ganz oder teilweise zu zumindest einem Teil des "sense"-Stranges besagten Zielproteins komplementär ist. Dem Fachmann ist bekannt, dass er alternativ die cDNA oder das korrespondierende Gen als Ausgangsmatrize für entsprechende anti- sense-Konstrukte verwenden kann. Bevorzugt ist die "antisense" Nukleinsäure komplementär zu dem kodierenden Bereich des Ziel- proteins oder einem Teil desselben. Die "antisense" Nukleinsäure kann aber auch zu der nicht-kodierenden Region oder einem Teil derselben komplementär sein. Ausgehend von der Sequenzinformation zu einem Zielprotein, kann eine antisense Nukleinsäure unter Berücksichtigung der Basenpaarregeln von Watson und Crick in der dem Fachmann geläufigen Weise entworfen- werden. Eine antisense Nukleinsäure kann komplementär zu der gesamten oder einem Teil der Nukleinsauresequenz eines Zielproteins sein. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die antisense Nukleinsäure ein Oligo- nukleotid mit einer Länge von zum Beispiel 25, 30, 35, 40, 45 oder 50 Nukleotiden.
Vorteilhaft kann die antisense-Strategie mit einem Ribozym-Ver- fahren gekoppelt werden. Ribozyme sind katalytiseh aktive RNA Sequenzen, die gekoppelt an die antisense Sequenzen, die Ziel- Sequenzen katalytiseh spalten (Tanner NK (1999) FEMS Microbiol Rev 23 (3) :257-75) . Dies kann die Effizienz einer anti-sense Strategie erhöhen. Die Expression von Ribozymen zur Verminderung be- stimmter Proteine ist dem Fachmann bekannt und beispielsweise beschrieben in EP-Al 0 291 533, EP-Al 0 321 201 und EP AI 0 360 257. Geeignete Zielsequenzen und Ribozyme können zum Beispiel wie bei Steinecke (Ribozymes, Methods in Cell Biology 5 50, Galbraith et al eds Academic Press, Inc. (1995), 449-460) "beschrieben, durch Sekundärstrukturberechnungen von Ribozym- und Ziel-RNA sowie durch deren Interaktion bestimmt werden (Bayley CC et al.(1992) Plant Mol Biol 18 (2) -.353-361; Lloyd AM and Davis RW et al. (1994) Mol Gen Genet 242 (6) : 653-657) . Beispielhaft sind
10 "hammerhead"-Ribozyme zu nennen (Haselhoff and Gerlach (1988) Nature 334:585-591). Bevorzugte Ribozyme basieren auf Derivaten der Tetrahymena L-19 IVS RNA (US 4,987,071; US 5,116,742). Weitere Ribozyme mit Selektivität für eine L119 mRNA können selek- tioniert werden (Bartel D und Szostak JW (1993) Science
15 261:1411-1418) .
Ebenso umfasst ist die Verwendung der oben beschriebenen Sequenzen in sense-Orientierung, was wie dem Fachmann geläufig ist, zu einer Kosuppression führen kann. Die Expression von
20 sense-RNA zu einem endogenen Gen kann die Expression desselben vermindern oder ausschalten, ähnlich wie es für antisense Ansätze beschrieben wurde (Goring et al. (1991) Proc. Natl Acad Sei USA, 88:1770-1774; Smith et al.' (1990) Mol Gen Genet 224:447-481; Napoli et al. (1990) Plant Cell 2:279-289; Van der Krol et al .
25 (1990) Plant Cell 2:291-299). Dabei kann das eingeführte Kon- strukt das zu vermindernde Gen ganz oder nur teilweise repräsentieren. Die Möglichkeit zur Translation ist nicht erforderlich.
Ganz besonders bevorzugt ist auch die Verwendung von Verfahren
30 wie der Genregulation mittels doppelsträngiger RNA ("double- stranded RNA interference" ) . Entsprechende Verfahren sind dem Fachmann bekannt und im Detail beschrieben (z.B. Matzke MA et al. (2000) Plant Mol Biol 43:401-415; Fire A. et al (1998) Nature 391:806-811; WO 99/32619; WO 99753050; WO 00/68374; WO 00/44914;
35 WO 00/44895; WO 00/49035; WO 00/63364)'. Auf die in den angegebenen Zitaten beschriebenen Verfahren und Methoden wird ausdrücklich Bezug genommen. Hier wird durch gleichzeitige Einbringung von Strang- und Gegenstrang eine hocheffiziente Unterdrückung na iver Gene bewirkt.
40
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung der oben beschriebenen erfindungsgemässen, transgenen Organismen und der1 von ihnen abgeleitete Zellen, Zellkulturen, Teile - wie zum Beispiel bei transgenen pflanzlichen Organismen Wurzeln, Blätter
45 etc . - , und transgenes Vermehrungsgut wie Saaten oder Früchte , zur Herstellung von Nahrungs- oder Futtermitteln, Pharmazeutika oder Feinchemikalien.
Bevorzugt ist ferner ein Verfahren zur rekombinanten Herstellung von Pharmazeutika oder Feinchemikalien in Wirtsorganismen, wobei ein Wirtsorganismus mit einer der oben beschriebenen Expressionskassetten transformiert wird und diese Expressionskassette ein oder mehrere Strukturgene enthält, die für die gewünschte Fein- chemikalie kodieren oder deren Biosynthese katalysieren, der transformierte Wirtsorganismus gezüchtet wird und die gewünschte Feinchemikalie aus dem Züchtungsmedium isoliert wird. Dieses Verfahren ist für Feinchemikalien wie Enzyme, Vitamine, Aminosäuren, Zucker, Fettsäuren, natürliche und synthetische Geschmacks-, Aroma- und Farbstoffe breit anwendbar. Besonders bevorzugt ist die Produktion von Tocopherolen und Tocotrienolen sowie Caroti- noiden wie beispielsweise Astaxanthin. Die Züchtung der transformierten WirtsOrganismen sowie die Isolierung aus den Wirtsorganismen bzw. aus dem Züchtungsmedium erfolgt mit dem Fachmann bekannten Verfahren. Die Produktion von Pharmazeutika, wie zum Bei- spiel Antikörpern oder Vakkzinen ist beschrieben bei Hood EE & Jilka JM (1999) Curr Opin Biotechnol 10 (4)382-6; Ma JK & Vine ND (1999) Curr Top Microbiol Immunol 236:275-92.
Sequenzen
SEQ ID NO: 1 Promotor des SSS3-Gens aus Kartoffel (Solanum tuberosum)
SEQ ID NO: 2 Promotor des SSS3-Gens aus Arabidopsis thaliana
3. SEQ ID NO: 3 Promotor des SSS3-Gens aus Reis (Oryza sativa)
SEQ ID NO: 4 Promotor des SSS3-Gens aus Weizen (Triticum aesti um)
5. SEQ ID NO: 5 Nukleinsauresequenz kodierend für Starkesynthase 3 (SSS3) aus Kartoffel (Solanum tuberosum)
SEQ ID NO: 6 Aminosäuresequenz kodierend für Starkesynthase 3 (SSS3) aus Kartoffel (Solanum tuberosum)
7. SEQ ID NO: 7 Nukleinsauresequenz kodierend für Starkesynthase 3 (SSS3) aus Arabidopsis thaliana
8. SEQ ID NO: 8 Aminosäuresequenz kodierend für Starkesynthase 3 (SSS3) aus Arabidopsis thaliana
9. SEQ ID NO: 9 Nukleinsauresequenz kodierend für Starkesynthase 3 (SSS3) aus Reis (Oryza sativa)
10. SEQ ID NO: 10 Aminosäuresequenz kodierend für Starkesynthase 3 (SSS3) aus Reis (Oryza sativa)
11. SEQ ID NO: 11 Nukleinsauresequenz kodierend für Starkesynthase 3 (SSS3) aus Weizen (Triticum aestivum)
12. SEQ ID NO: 12 Aminosäuresequenz kodierend für Starkesynthase 3 (SSS3) aus Weizen (Triticum aestivum)
13. SEQ ID NO : 13 Nukleinsauresequenz kodierend für Starkesynthase 3 (SSS3) aus Weizen (Aegilops tauschii) 14. SEQ ID NO: 14 Aminosäuresequenz kodierend für Starkesynthase 3 (SSS3) aus Weizen (Aegilops tauschii)
15. SEQ ID NO: 15 Nukleinsauresequenz kodierend für Starkesynthase 3 (SSS3) aus der Spargel/Catjang- Bohne (Vigna unguiculata)
16. SEQ ID NO: 16 Aminosäuresequenz kodierend für Stärke- synthase 3 (SSS3) aus Spargel/Catjang-
Bohne (Vigna unguiculata)
17. SEQ ID NO: 17 Nukleinsauresequenz kodierend für Starkesynthase 3 (SSS3) aus Mais (Zea mays)
18. SEQ ID NO: 18 Aminosäuresequenz kodierend für Starkesynthase 3 (SSS3) aus Mais (Zea mays)
19-39. SEQ ID NO: 19 bis 39: Sequenzmotive für Starkesynthase 3 Proteine
40. SEQ ID NO: 40 Oligonukleotidprimer R-DSS3-263 (27 mer)
5 ' -TGCATTGGAGACACTTGTGCAACTCAA-3 '
41. SEQ ID NO: 41 Oligonukleotidprimer R-DSS3-317 (27 mer)
5 ' -TGTGGTTCCATGAGAGACAAACCCAAG-3 '
42. SEQ ID NO: 42 Oligonukleotidprimer L-DS3 (44mer)
5 ' -GTCGACCTAGAGGAAGAAATCTTCTCTGTCTAAAAAATTGACG-3 '
43. SEQ ID NO: 43 Oligonukleotidprimer R-DS3 : (38 mer)
5 ' -CCCGGGATCCTCTCTCCCTCTCTGTATCTGTGCTGCAA-3 '
44. SEQ ID NO: 44 Promotor des SSS3-Gens aus Kartoffel (Solanum tuberosum; polymorph zu SEQ ID NO: 1)
45. SEQ ID NO: 45 Oligonukleotidprimer S'actin AC1 (23mer)
5 ' -ATGGCAGACGGTGAGGATATTCA-3 '
46. SEQ ID NO: 46 Oligonukleotidprimer 3'actin AC2 (23mer)
5 '-GCCTTTGCÄATCCACATCTGTTG-3 '
47. SEQ ID NO: 47 Oligonukleotidprimer L-SSS3-G50 (24mer)
5 ' -GCAGCACAGATACAGAGAGGGAGA-3 '
48. SEQ ID NO: 48 Oligonukleotidprimer R-GUS-G809 (22 mer)
5 ' -TGGCTGTGACGCACAGTTCATA-3 ' Beschreibung der Abbildungen
1. Fig. 1:
A: Nachweis mittels Xgluc Färbung der unter Kontrolle des
Kartoffel SSS3-Promotors exprimierten Glueuronidase-Aktivität in Knollen der Linien 1, 15 und 17. Dies korreliert mit dem Auftreten von Stärke in diesem Gewebe (Fig.lB).
B: Nachweis der Korrelation der unter Kontrolle des Kartoffel SSS3-Promotors exprimierten Glueuronidase-Aktivität und der Stärkeproduktion (X-Gluc-Färbung linker Schnitt; Stärkefärbung rechter Schnitt) von Kartoffelknollen der Linie IS-
2. Fig.2: GUS Aktivität in Knollen von 5 Kartoffellinien (2, 12, 14, 15 und 17) transformiert mit SSS3-Promoter:GUS Konstrukt. ιL: Blätter; G: sich entwickelnde Knollen; R2 : 45 Tage Lagerung bei Raumtemperatur; R3 : 90 Tage Lagerung bei Raumtemperatur .
3. Fig.3: PCR Amplifikation der cDNA (Primer im 5' untransla- tierten Bereich des SSS3 Promotors und im GUS Gen)
H20: Negativkontrolle; pDSSS-Bi-Hp4 : Plasmid DNA als Positiv- kontrolle, cDNA nach 45 Tagen (links) und nach 90 Tagen
(rechts) Lagerung der Knollen der Linien 2, 9, 12, 15 bzw. 17; cDNA solara: Wildtyp Kontrolle
4. Fig.4: Grüne Früchte der Linien 1 (A) , 2 (B) , 6 (C) , 21 (D) , 30 (E) , WT (F) , orangene Frucht der Linie 23 (G) , blaugefärbte Samen, ungefärbte Schnitte durch Blattstiele (I) , in den Antheren gefärbte Knospe (J) und Blüte (K) und gefärbter Pollen (L) von Tomatenpflanzen transformiert mit pSun0301_SSS3
5. Fig.5: GUS Aktivität in den grünen Früchten von Tomatenlinien, transformiert mit pSun0301_SSS3. Fehlerbalken zeigen jeweils den Standardfehler
6. Fig.6: Vergleich der GUS-Aktivität in ausgewählten Linien transgener Tomatenpflanzen (weiße Balken: grüne Früchte, schwarze Balken: röte Früchte; Fehlerbalken zeigen jeweils den Standardfehler) .
7. Fig.7a-f: Vergleich ("Alignment") von SSS3-Proteinsequenzen aus Kartoffel (STSSS3), Arabidopsis thaliana (AtSSS3), Spargel/Catjang-Bohne (Vigna unguiculata; VUSSS3), Aegilops tauschii (AtaSSS3) , Weizen (Triticum aestivum; TASSS3), Reis (OS SSS3), Mais (ZM SSS3). Identische Aminosäuren sind grau unterlegt und durch die zusätzlich angegebene "Conensus" -Sequenz hervorgehoben.
Beispiele
Allgemeine Methoden
Rekombinante DNA Techniken wurden entsprechend Maniatis et al . , Molecular Cloning - A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Lab. , Cold Spring Harbor, New York, 1982) durchgeführt. Die eingesetzten Enzyme wurden nach Vorschrift angewendet. Zur Klonierung wurden die Vektoren pCR2.1 und pCR-BLUNT (Invitrogen) verwendet. Für die Pflanzentransformation wurden der Vektor pBIlOl (Jefferson et al. (1987) EMBO J 6:3901-3907 und pSUN3 (SunGene GmbH & Co KgaA, WO 0?/00900) eingesetzt. Für die Transformation in E. coli wurde der Stamm DH5α (Hanahan D (1983) J Mol Biol 166:557-580) verwendet. Die Agrobakterienstäm e LBA4404 und C58C1 [pGV2260] wurden nach An G (1987) Mol Gen Genet 207:210-216 mittels Frost-Tau-Methode direkt transformiert.
Beispiel 1: Transformation von Kartoffel und Tomate
1.1 Kartoffel
20 kleine, mit einem Skalpell verwundete Blätter einer Kartoffel- Sterilkultur wurden in 10 ml MS-Medium mit 2% Saccharose gelegt, welches 50μl einer unter Selektion gewachsenen Ag-roJbacterium tu- mefaciens - Übernachtkultur enthielt. Nach 5-minütigem, leichtem Schütteln wurden die Petrischalen bei 25°C im Dunkeln inkubiert. Nach zwei Tagen wurden die Blätter auf MS-Medium mit 1.6% Glu- cose, 2 mg/1 Zeatinribose, 0.02 mg/1 Giberellinsäure, 500 mg/1 Claforan, 50 mg/1 Kanamycin und 0.8% Bacto-Agar ausgelegt. Nach einwöchiger Inkubation bei 25°C und 3000 Lux wurde die Claforan- konzentration im Medium halbiert. Eine weitere Woche Kultivierung erfolgt unter bekannten Bedingungen (Rocha-Sosa et al. (1989) EMBO J. 8:23-29) .
1.2 Tomate
Als Ausgangsexplantat für die Transformation dienen Kotyledonen sieben bis zehn Tage alter Keimlinge der Linie Miσrotom. Für die Keimung wird das Kulturmedium nach Murashige und Skoog (Murashige and Skoog, 1962, Physiol. Plant. 15, 473-497) mit 2% Saccharose, pH 6,1 verwendet. Die Keimung findet bei 21°C bei wenig Licht (20 - 100 μE) statt. Nach sieben bis zehn Tagen werden die Kotyledo- nen quer geteilt und auf das Medium MSBN (MS, pH 6,1, 3% Saccharose + 1 mg/1 BAP, 0,1 mg/1 NAA) gelegt, das am Vortag mit suspensionskultivierten Tabakzellen beschickt wurde. Die Tabakzellen werden luftblasenfr.ei mit sterilem Filterpapier abgedeckt. Die Vorkultur der Explantate auf dem beschriebenen Medium erfolgt für drei bis fünf Tage. Anschließend werden die Explantate mit dem Agrobakterium tumefaciens Stamm LBA4404, der das binäre Plasmid mit dem zu transformierenden Gen trägt, wie folgt infiziert: Der Stamm, der über Nacht in YEB Medium mit dem Antibiotikum für das Binärplasmid bei 28°C kultiviert bei worden ist, wird zentrifu- giert. Das Bakterienpellet wird mit flüssigem MS Medium (3% Saccharose, pH 6,1) resuspendiert und auf eine optische Dichte von 0,3 (bei 600 nm) eingestellt. Die vorkultivierten Explantate werden in die Suspension überführt und für 30 Minuten bei Zimmertem- peratur unter leichtem Schütteln inkubiert. Anschließend werden die Explantate mit sterilem Filterpapier getrocknet und für die dreitägige Co-Kultur (21°C) auf ihr Vorkulturmedium zurück gelegt.
Nach der Co-kultur werden die Explantate auf MSZ2 Medium (MS pH 6,1 + 3% Saccharose, 2 mg/1 Zeatin, 100 mg/1 Kanamycin, 160 mg/1 Timentin) transferiert und für die selektive Regeneration bei 21°C unter Schwachlicht Bedingungen (20 - 100 μE, Lichtrhythmus 16h/8h) aufbewahrt. Aller zwei bis drei Wochen erfolgt der Transfer der Explantate bis sich Sprosse bilden. Kleine Sprosse können vom Explantat abgetrennt werden und auf MS (pH 6,1 + 3% Saccharose) 160 mg/1 Timentin, 30 mg/1 Kanamycin, 0,1 mg/1 IAA bewurzelt werden. Bewurzelte Pflanzen werden ins Gewächshaus überführt .
Beispiel 2 : Isolierung genomischer DNA
Die genomische DNA transgener Kartoffel und Tomaten Pflanzen wurde mit Hilfe des DNA - Isolierungskit der Firma Macherey & Nagel isoliert. In einem ersten Schritt wurden die transgenen Linien über PCR mit genspezifischen Primern identifiziert. Die Integration der Fremd-DNA wurde mittels "Southerriblot" - Analysen von 20μg DNA nach geeigneter Restriktionsspaltung untersucht.
Für die Gewinnung genomischer Kartoffel DNA zu Isolierung des SSS3-Promotors wurde folgende Methode angewendet: Mörser und Pistil wurden mit flüssigen Stickstoff gekühlt und 5 g junges Blatt Material zu einem feinen Pulver homogenisiert. Dieses Pulver wurde in ein 50ml Zentrifugenröhrchen überführt. Mit 15ml frisch präpariertem" Extraktionspuffer wurde das Material intensiv geschüttelt. Nach Zugabe von 1ml 20% SDS pH 7,2 wurde das Gemisch bei 65°C für 10 min inkubiert. Anschließend wurde 5ml 5M Kalium- acetat hinzugefügt, für weitere 30 min auf Eis inkubiert und an- schließend bei 12000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde durch eine Miracloth Membran filtriert und in ein frisches Zentrifugen- röhrchen überführt und wieder wie oben beschrieben zentrifugiert. Zum Überstand wurde dann 10 ml Isopropanol gegeben, gemischt, in- 5 kubiert bei -20°C für 30 min und erneut bei 8000 rpm zentrifu- giert. Der Überstand wurde abgegossen und das Pellet in dem umgedrehten Röhrchen für 1-0 min getrocknet. Das Pellet wurde dann in 700μl 50xTE Puffer gelöst, in ein Eppendorf Röhrchen überführt, 5μl RNase (lOmg/ml) dazu gegeben und 30 min bei 37°C verdaut.
10
Nach Zugabe von 75 μl 3 M Natriumacetat und Mischen wurde bei 13000 rpm für 15 min zentrifugiert, der Überstand in ein neues Röhrchen überführt, 500μl Isopropanol dazugegeben, gemischt und bei Raumtemperatur für 5 min gefällt und für 15 min bei 13000 rpm
15 zentrifugiert. Das Pellet wird für einige Minuten bei Raumtempa- ratur getrocknet. Die DNA wird in 400μl TE Puffer bei 4°C über Nach.t gelöst.
Lösungen:
20
Extraktionspuffer: 100 mM Tris-HCl pH 8,0 500 mM NaCl
10 mM ß-Mercaptoethanol 25 50 mM EDTA pH 8,0
50xTE
50 mM Tris-HCl pH 8,0 10 mM EDTA pH 8,0 30
TE Puffer
10 mM Tris-HCl pH 8,0
1 mM EDTA pH 8 , 0
35 Beispiel 3 : Isolierung des Promotors der löslichen Stärke Synthase 3 aus Kartoffel
Ausgehend von der von Abel et al. (Plant Journal 10:981-91) 1996 publizierten cDNA Sequenz der löslichen Stärke Synthase Isoform 3
40 von Solanum tuberosum cultivar Desiree, Acc . Nr. X94400 wurden Primer abgeleitet, um mit einem sogenannten „Genome Walking" Experiment den gewünschten SSS3-Promotor zu isolieren. Für dieses Experiment wurde der Universal Genome Walker Kit von Clontech Laboratories, (Katalog Nr. K1807-1) verwendet. Dieser Kit kann be-
45 nutzt werden, um zu einer bekannten Sequenz eine benachbarte unbekannte Sequenz zu isolieren. Der erste Schritt bestand in der Herstellung von ungeklonten, adaptor-ligierten genomischen DNA Fragmenten, sogenannte Genome Walker Bibliotheken für die die genomische DNA von Solanum tuberosum cultivar Desiree verwendet wurde. Als Restriktionsenzym wurde hierfür das Enzym Hpal entsprechend der Vorschrift benutzt („Library DNA") .
Folgende Primer wurden für die Amplifikation des Promotorfragmentes abgeleitet .
Primer R-DSS3-263 (27 mer) : 5' TGC ATT GGA GAC ACT TGT GCA ACT CAA 3' (SEQ ID NO: 40)
Primer R-DSS3-317 (27 mer) :
5' TGT GGT TCC ATG AGA GAC AAA CCC AAG 3' (SEQ ID NO: 41)
und d e PCR unter folgenden Bedingungen durchgeführt:
1. PCR:
Mix:
Library DNA 1,4 μl Steriles Wasser 18,0 μl
10X PCR Reaktion Puffer 2,5 μl dNTP (10 mM each) 0,5 μl
Mg(OAc)2 1,1 μl
Tth Polymerase Mix 0 , 5 μl Primer API vom Kit 0,5 μl
Primer R-DSS3-263 (10 pmol) 0 , 5 μl
Die PCR Reaktion wurde am Perkin Eimer GeneAmp PCR System 2400 Thermal Cycler durchgeführt.
PCR Bedingungen:
7 Zyklen: 94°C für 2 sec; 68°C für 4 min 38 Zyklen: 94°C für 2 sec; 63°C für 4 min 1 Zyklus; 63°C für 6 min; 4°C bis zur Weiterverwendung
2. PCR:
3 μl der 1. PCR Reaktion wurde mit 97 μl Wasser verdünnt und für die 2. PCR Reaktion verwendet .
Mix:
Verdünnte DNA von der 1. PCR 2,0 μl
Steriles Wasser 36,8 μl
10X PCR Reaktion Puffer 5,0 μl dNTP (10 M each) 1,0 μl
Mg(OAc)2. 2,2 μl
Tth Polymerase Mix 1,0 μl Primer AP2 vom Kit 1 μl
Primer R-DSS3-263 (10 pmol) 1 μl
PCR conditions : 7 cycles: 94°C für 2 sec; 68°C für 4 min
25 cycles 94°C für 2 sec; 63°C für 4 min
1 cycle 63°C für 6 min; 4°C bis zur Weiterverarbeitung
Nach Trennung auf einem 1% Agarose (IX TAE) Gel für 4 Stunden bei 70V wurde ein 1,2 kb Fragment erhalten. Diese Bande wurde mit dem „Quiagel Purification Kit" von Quiagen isoliert und mittels des TA Klonierungs Kit von Invitrogen in den pCR2.1 Vektor kloniert . Das erzeugte Plasmid wurde als pDSSS3-Hp263-l bezeichnet. Dieses Plasmid wurde sequenziert und aufgrund der Übereinstimmung mit dem bekannten Teil der Sequenz verifiziert.
Beispiel 4: Klonierung des SSS3-Promotors in das Plasmid pCR- BLUNT
Von, der Sequenz des amplifizierten Produktes wurden Primer abgeleitet und eine erneute PCR ausgehend von genomischer DNA durchgeführt, um sicher zustellen, daß es sich um die tatsächliche genomische Promotorregion des SSS3 Gens handelt. Unter Verwendung der high fidelity PfuTurbo DNA Polymerase (Stratagene) wurde ein 1,1 kb großes Fragment unter folgenden Bedingungen amplifiziert.
Die Primer (abgeleitet und bestellt am 3-8-00) enthalten die Restriktion Orte Sall, Xbal, Smal und BamHI für die spätere Klonierung.
L-DS3 : (5' Primer für die Promotor Amplifikation, 44mer) 5 ' GTC GAC TCT AGA GGA AGA AAT CTT CTC TGT CTA AAA AAT TGA CG 3 ' (SEQ ID NO: 42; Der Primer startet mit Sall und Xbal Restriktionsorten; in fetten Buchstaben) •
R-DS3 : (3' Primer für die Promotor Amplifikation, 38mer)
5' CCC GGG ATC CTC TCT CCC TCT CTG TAT CTG TGC TGC AA 3'
(SEQ ID NO: 43; Der Primer startet mit Smal und BamHI Orten; in fetten Buchstaben) .
Das 3 'Ende des isolierten SSS3-Promotors endet bei der Position 75 der cDNA Sequenz des SSS3 Gens (Acc. Nr. X94400) , dies ist 131 bp upstream vom Startcodon ATG. Die Sequenz ist ohne die angefügten Schnittstellen 'durch SEQ ID NO: 1 bzw. 44 wiedergegeben. PCR Mix : '
Genomische Kartoffel DNA (~100ng) 1,0 μl
Steriles Wasser 37,8 μl
10X PCR Pfu Polymerase Mix 5,0 μl
5 dNTξ (10 mM each) 1,0 μl
MgCl2 (25 mM) 2 , 2 μl
Pfu Polymerase Mix 1,0 μl (2,5U)
Primer R-DS3 (10 pmol) 1,0 μl
Primer L-DS3 (10 pmol) 1,0.μl 10
PCR Bedingungen für die Amplifikation von genomischer Kartoffel (Desiree) DNA:.
1 Zyklus: 94°C für 1 min 15 10 Zyklen: 94°C für 30 sec; 70°C für 4 min 40 Zyklen: 94°C für 30 sec; 66°C für 4 min 1 Zyklus: 66°C für 4 min; 4°C bis zur Weiterverarbeitung
Die PCR Reaktion wurde auf einem 1% Agarose Gel aufgetrennt und 20 das ,1,1 kb große PCR Fragment wie oben beschrieben isoliert. Diese Fragment wurde in den Vektor pCR-Blunt (Invitrogen, Zero blunt PCR Cloning Kit, #K2700-20) kloniert. Die Sequenzdaten zeigten, daß zwei leicht von einander abweichende Promotoren isoliert wurden Die entsprechenden Plasmide wurden pDSSS-Hp4 (Seq ID 25 NO: 1) und pDSSS-Hp6 (SEQ ID NO: 44) genannt. Neben einigen Ba- senpaaraustauschen und kleineren Deletionen unterscheiden sie sich durch einen zusätzlichen Xbal-Ort (SEQ ID NO: 44) im Plasmid pDSSS-Hp6.
30 Beispiel 5: Klonierung der Promotoren in den Binärvektor pBIlOl
Für die Transformation in Kartoffel wurde der Binärvektor pBIlOl (Jefferson et al.(1987) EMBO J 6:3901-3907) verwendet und die Promotoren vor das GUS Gen kloniert .
35
Das Plasmid pDSSS-Hp4 wurde mit Xbal und BamHI geschnitten. Das 1,1 kb große Promotorfragment wurde isoliert und in den mit den gleichen Enzymen geschnittenen pBIlOl ligiert. Das resultierende Plasmid wurde als pDSSS3-Bi-Hp4 bezeichnet und in den Agrobakte-
40 rienstam C58Cl[pGV2260] transformiert.
Das .Plasmid pDSSS-Hp6 wurde mit den Restriktionsenzymen Sall und BamHI geschnitten. Das 1,1 kb große Promotorfragment wurde isoliert und in den mit den gleichen Enzymen geschnittenen pBIlOl 45 ligiert. Das resultierende Plasmid wurde als pDSSS3-Bi-Hp6 bezeichnet.und in den Agrobakterienstamm C58C1 [pGV2260] transformiert. Die Agrobakterien Kolonien wurden auf Km50/Amp50/Rif25 (μg/ml) selektiert. Mit diesen Stämmen erfolgte die Transformation in Kartoffel .
Beispiel 6 : Nachweis der gewebespezifischen Expression
Um die Eigenschaften des Promotors zu bestimmen, ist es erforderlich, den Promotor vor ein so genanntes Reportergen zu setzen, welches eine Bestimmung der Expressionsaktivität ermöglicht . Beispielsweise sei die bakterielle ß-Glucuronidase genannt (Jefferson et al. (1987) EMBO J 6:3901-3907). Die ß-Glucuronidase Aktivität kann in planta mittels eines chromogenen Substrates wie 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-ß-D-Glucuronsäure (X-Gluc) im Rahmen einer Aktivitätsfärbung bestimmt werden. Für die Untersuchung der Gewebespezifität wird das pflanzliche Gewebe präpariert, mit der X-Gluc-Reaktionslösung versehen und bei 37°C gefärbt.
Ein izweiter Assay erlaubt eine quantitative Bestimmung der GUS Aktivität in dem untersuchten Gewebe. Für die quantitative Aktivitätsbestimmung wird als Substrat für die ß-Glucuronidase MUG (4-Methyl-umbelliferyl-ß-D-glucuronid) verwendet, das in MU (Me- thyl-umbelliferon) und Glucuronsäure gespalten wird.
Beispiel 7 : Ergebnisse der GUS Analyse zur Gewebespezifität der transgenen Kartoffelpflanzen
Alle transgenen Kartoffelpflanzen, die mit dem Plasmid pDSSS3-Bi- Hp4 transformiert wurden, zeigten eine starke Expression der Glu- curonidase in den Knollen. Die Knollen der besten Linien zeigten bereits 30 min nach Beginn des' Enzymnachweises (X-Gluc) eine blaue Färbung bei Raumtemperatur. Überraschenderweise zeigte sich die Färbung' auch während der sehr frühen Knollenentwicklung. Bereits in Knollen mit 5 mm Länge konnte die Aktivität der Glucuro- nidase nachgewiesen werden (Fig.lA). Dies korreliert mit dem Auftreten von Stärke in diesem Gewebe (Fig.lB) . Keine Färbung wurde in der Kartoffelschale beobachtet.
Eine detaillierte Analyse der GUS Expression des SSS3-Hp4 Promotors in der Kartoffelpflanze wurde mittels der oben beschriebenen histochemischen Methode mit X-Gluc durchgeführt. Dabei wurden die verschiedenen Gewebetypen mit der X-Gluc -Lösung inkubiert und die Blaufärbung registriert. Die Analysen zeigten, daß der Promotor, .eine Expression ausschließlich in stärkehaltigen Geweben vermittelt. Eine moderate Aktivität wurde in Schnitten durch die In- ternodien, begrenzt auf den Bereich unterhalb der Blattknospe, beobachtet. Eine schwache Aktivität zeigten auch die Ovarien und der Pollen in den Blüten einzelner Linien. In Wurzeln, Sproßachse oder Blattstielen wurde nie eine Färbung beobachtet . In einigen Linien wurde auch schwache (6 von 18) bis moderate (2 von 18) GUS Färbungen in den Blättern gefunden. Quantitative Analysen . zeigten, das gegenüber den sehr starken Aktivitäten in den Knollen, die Aktivitäten in den Blättern nur sehr gering sind.
Die analysierten transgenen Pflanzen, die mit dem Plasmid pDSSS3-Bi-Hp6 transformiert wurden, zeigten ausschließlich in den Knollen eine Aktivität . ,
Beispiel 8 : Quantitative Bestimmung der Stärke des SSS3-Hp4 Promotors
Die quantitative Analyse der Aktivität des SSS3-Hp4 Promotors dieser Linien wurde mittels des fluorometrischen GUS Assays durchgeführt. Die Daten von 10 Linien sind in der Tabelle 1 dargestellt.
Figure imgf000067_0001
Tabelle 1: GUS Aktivität in sich entwickelnden Knollen und reifen Blättern von ausgewählten SSSIII::GUS Linien. Die Linien wurden erhalten durch Transformation mit pDSSS-BiHp4. Wiedergegeben sind Mittelwerte von jeweils 4 Messungen. Die Werte sind in Picomol MU/mg protein/min angegeben; Linie 10 ist eine Negativkontrolle.
Wachsende Knollen mit einem Gewicht von 10 g sowie Blattmaterial (source Blätter, von einem Zeitpunkt, wo die Menge der Stärke ma- ximal sein sollte) wurden für die Analyse verwendet . Die Daten stimmen mit den histochemischen Daten überein. In reifen Blättern variiert die Aktivität,• wenn sie überhaupt gemessen werden konrite, sehr stark, ist aber dann ca. 50 mal geringer als in den Knollen. Beispiel '9 : Analyse der Aktivität des SSS3-Promotors während der Knollenlagerung
Die Aktivität des SSS3-Promotors während der Knollenlagerung 5 wurde mittels des beschriebenen fluorometrischen GUS Assays bestimmt. Dabei wurden Proben von sich entwickelnden Knollen sowie 45 und 90 Tage nach Einlagerung der Knollen genommen. Die Ergebnisse der besten 5 Linien sind in Fig.2 dargestellt. Zum Vergleich sind auch die Werte für die adulten Blätter dargestellt. 10 In den meisten Linien war die GUS Aktivität in den Knollen, die 45 Tage gelagert wurden, ungefähr 2 mal höher als in den sich entwickelnden Knollen. Während der weiteren Lagerung stieg die Gus Aktivität in den Knollen weiter leicht an.
15 Die Linie mit der stärksten Aktivität ist die Linie 15. Während des Knollenwachstums wurde eine GUS Aktivität von 63391437 pM MU/ min mg Protein gemessen. Nach 45 Tage Lagerung bei Raumtemparatur betrug die GUS Aktivität 108431329 und nach 90 Tagen 123441681. Diese Aktivität war damit 2x höher als in wachsenden Knollen und
20 140x höher als in Blättern.
Beispiel 10: Analyse der Expression des SSS3-Promotors mit RT-PCR
Um Auszuschließen, daß die hohe GUS Aktivität in den Knollen 25 durch die Einlagerung und die hohe Stabilität von Glucuronidase verursacht ist, wurde über RT-PCR die mRNA der Glucuronidase nachgewiesen.
Die cDNA der Kartoffelknollen wurde über die Methode nach Bauer 30 et al. isoliert (Plant Physiol. 105: 585-592, 1994). Als Positivkontrolle diente das Actin Gen, welches mittels folgender Primer amplifiziert wurde.
5Xactin AC1 (23mer) 35 5' ATG GCA GAC GGT GAG GAT ATT CA 3' (SEQ ID NO: 45)
3 'actin AC2 (23mer)
5' GCC TTT GCA ATC CAC ATC TGT TG 3' (SEQ ID NO 46)
40 Mix:
H20 37 μl cDNA. 1 μl lOx PCR Puffer 5 μl dNTP (2,5 mM each) 4 μl
45 Primer AC1 (10 pmol) 1,25 μl
Primer AC2 (10 pmol) 1,25 μl
Takara Tag Polymerase 0,5 μl (2.5 U) PCR Bedingungen: 1 cycle: 95°C für 5 min
35 cycles: 95°C für 5 sec; 52°C für 40 sec; 72°C für 70 sec 1 cycle. 72°C for ,3min; 4°C bis zur Weiterverarbeitung
Dargestellt sind mRNA als Negativkontrolle, um die Amplifikation genomischer DNA nachzuprüfen und die cDNA.der Knollen, isoliert von den Linien 2, 9, 12, 15 und 17 jeweils nach 45 und 90 Tagen. Die' Amplifikate (1,1 kb) zeigen, dass die Methode funktioniert und die Expression des Actin Gens in allen transgenen Linien vergleichbar und keine genomische DNA vorhanden ist.
Für den Nachweis der Expression des GUS Gens, vermittelt durch den SSS3-Promotor, wurden Primer abgeleitet. Der 5X Primer L-SSS3,-G50 korrespondiert zu der 5 λ -untranslatierten Region des SSS3 Gens, welche auch in dem Binärplasmid pDSSS3-Bi-Hp4 vorhanden ist. Der 3λPrimer R-GUS-G809 wurde vom GUS Gen abgeleitet. Der PCR -Mix und die PCR Bedingungen waren die gleichen wie bei der Amplifikation des Actin Gens mit der Ausnahme, daß die PCR Reaktion in 25μl mit 0,125μl TaKaRa Taq Polymerase und lμl Primer durchgeführt wurde.
Primer L-SSS3-G50 (24 mer) : '
5' GCA GCA CAG ATA CAG AGA GGG AGA 3' (SEQ ID NO: 47)
Primer R-GUS-G809 (22 mer) :
5'TGG CTG TGA CGC ACA GTT CAT A 3' (SEQ ID NO: 48)
Zum Nachweis der mRNA der Glucuronidase wurden 0. lμg der cDNA der Knollen der Linien 2, 9, 12, 15 und 17 sowie als Negativkontrolle des Wildtyps verwendet. Um Kontamination der mRNA mit genomische DNA auszuschließen, wurde ebenfalls 0.2μg DNase behandelte mRNA als Matrize verwendet. Von jeder Linie wurde cDNA aus Knollen nach 45 Tagen und nach 90 Tagen soliert. Links ist das Ergebnis der Amplifikation der mRNA. bzw. cDNA nach 45 Tagen und rechts nach 90 Tagen aufgetragen. Das erwartete PCR Produkt von 0.5 kb Länge wurde nach Auftrennung auf einem 1% Agarose-Gel sichtbar. Das Ergebnis zeigte, daß die Menge der cDNA in jeder Präparation ähnlich und keine Kontamination mit genomischer DNA zu erkennen war (Fig.4) .
Beispiel 11: Klonierung' des SSS3-Promotors in den Binärvektor pSUN0301 zur Analyse des Expressionsmusters in Tomate
Das Plasmid pDSSS-Hp4 wurde mit den Restriktionsenzymen BamHI und EcoRI geschnitten und das resultierende Fragment von lkb Länge in das Binärplasmid pSUN0301 (Derivat vom pSUN; SunGene GmbH S. Co KgaA, WO 0200900) vor das dort enthaltene GUS Gen kloniert. Das resultierende Plasmid wurde als pSUN0301_SSS3 bezeichnet und über eine Sequenzanalyse verifiziert. Nach Transformation in den Agro- bakterienstamm LBA4.404 wurde eine Tomatentransformation mittels desv)oben beschriebenen Protokolls durchgeführt.
Beipiel 12 : Gewebespezifische Analyse der. transgenen Linien
Mittels X-Gluc Färbung wurde in den transgenen Tomatenpflanzen ausschließlich eine Färbung in den Antheren, Pollen und Samen sowie eine sehr starke Färbung in den grünen Tomatenfrüchten beobachtet . Reife Früchte zeigen eine schwächere Färbung als die grünen Früchte (Fig.5). In Blättern, Wurzeln, Blüten- und Kelchblättern, in Blattstielen und Sproßachsen wurden nie GUS Färbun- gen festgestellt .
Beispiel 13: Quantitative Bestimmung der Stärke des SSS3-Promotors in grünen Früchten transgener Tomatenpflanzen
Fig., 6 zeigt die Auswertung der quantitativen Analyse der GUS Aktivität in den grünen Früchten von Tomatenlinien, die mit dem pSUN0301_SSS3 Konstrukt transformiert wurden. Das Diagramm zeigt die hohe Expression des SSS3-Promotors, die geeignet ist auch andere Gene gerade in den grünen Früchten hoch zu exprimieren.
Beispiel 14: Vergleich der Gus Expression in grünen unreifen und roten, reifen Früchten transgener Tomatenpflanzen
Wie aus der Fig. 7 ersichtlich ■ ist die GUS Aktivität in den unreifen, grünen Früchten der Tomaten, transformiert mit dem pSun0301_SSS3 Konstrukt, deutlich höher als in den reifen roten Früchten.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur gezielten, transgenen Expression von Nuklein- säuresequenzen in mindestens einem stärkehaltigen Geweben einer Pflanze, wobei nachfolgende Schritte umfasst sind
I. Einbringen einer transgenen Expressionskassette in pflanzliche Zellen, wobei die transgene Expressionskas- sette mindestens nachfolgende Elemente enthält
a) mindestens eine Promotorsequenz eines Gens kodierend für eine Starkesynthase 3 , und
b) mindestens eine weitere Nukleinsauresequenz,
wobei mindestens eine der besagten Promotorsequenzen und eine weitere Nukleinsauresequenz funktionell miteinander verknüpft sind und die weitere Nukleinsauresequenz in Bezug auf die Promotorsequenz heterolog ist, und
II. Auswahl von transgenen Zellen, die besagte Expressionskassette stabil in das Genom integriert enthalten, und
III . Regeneration von vollständigen Pflanzen aus besagten transgenen Zellen, wobei mindestens eine der weiteren Nukleinsauresequenzen gezielt in einem stärkehaltigen Gewebe exprimiert wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Promotorsequenz eines
Gens kodierend für eine Starkesynthase 3 einen Sequenzbereich von mindestens 250 Basenpaaren in 5 '-Richtung vor dem ATG- Startkodon der genomischen Sequenzen kodierend für eine Stär- kesynthase-3 umfasst.
12 S. Fig. + Sequ. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2 , wobei die Starkesynthase befähigt ist, eine Glucosyleinheit von ADP-Glukose auf ein α-1 , 4-Glukanmolekül zu übertragen und weiterhin eine oder mehr nachfolgender Eigenschaften aufweist:
1. sie ist kodiert durch eine Nukleotidsequenz umfassend mindestens 20- ukleotide einer Sequenz gemäß SEQ ID NO: 5, 7, 9, 11, 13, 15 oder 17;
2. sie ist kodiert durch eine Nukleotidsequenz umfassend eine Sequenz, die eine Homologie von mindestens 85% oder mehr zu einer Sequenz gemäß SEQ ID NO: 5, 7, 9, 11, 13, 15 oder 17 aufweist;
3^. sie umfasst eine Aminosäuresequenz mit einer Homologie von mindestens 85% zu einer der Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16 oder 18;
sie umfasst eine Sequenz von mindestens 10 zusammenhängenden Aminosäuren, bevorzugt mindestens 20 zusammenhängenden Aminosäuren, besonders bevorzugt mindestens 50 zusammenhängenden Aminosäuren einer Sequenz gemäß SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16 oder 18;
und wobei die Aminosäuresequenz kodierend für die Starkesynthase mindestens ein Sequenzmotiv umfasst ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus :
( a) NE ( P/S ) DVXI (K/M) GAFN
(b) PK (E/Q) AY (R/K) XDFVFFNG
( c ) DWVFADGP
( d) FL (V/L) SQK (H/D) (V/D VYTEPL
( e ) YNP (A/S ) GKPE (V/D WFRXSFN
( f ) DAYMMDFVFSE
( g) KVGGL (G/A) DWTS
(h) HCHDWSSAPV ( A/ S ) WL
( i ) FTIHNLEFGA
( j ) NGIDPDIWDP
(k) VG ( I/V) ITRLT (A/H) QKG
(1 ) NGQWLLGSA
(m) LTYDEPLSHLIY
(n) DFI ( L/ 1 ) VP'SIFEPCGLTQL
(h) DTVFDVDHDK, und
( i ) VMEQDWSWNRP .
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3 , wobei der Starkesynthase 3 Promotor mindestens eine Nukleinsauresequenz umfasst ausgewählt aus
1. den Sequenzen SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 oder 44, oder den dazu komplementären Sequenzen,
2. Fragmenten von mindesten 25 zusammenhängenden Nukleotiden, bevorzugt mindestens 50 zusammenhängenden Nukleoti- den, besonders bevorzugt mindestens 100 zusammenhängenden Nukleotiden einer Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 oder 44 oder den dazu komplementären Sequenzen,
3. Sequenzen, die eine Homologie aufweisen von mindestens 50 % zu einer der Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 oder 44 oder den dazu komplementären Sequenzen, wobei sich die Homologie über eine Länge von mindestens 100 Basenpaaren erstreckt .
5. "Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Starkesynthase 3 Promotor die Nukleinsauresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder 44 oder ein Fragment von mindestens 25 zusammenhängenden Nukleotiden derselben umfasst.
6. Verfahren zur Identifikation und/oder Isolation von Promotoren von Genen, die bevorzugt für einen Promotor mit Spezifität für ein stärkehaltiges Gewebe kodieren, wobei bei der Identifikation und/oder Isolation mindestens eine Nukleinsauresequenz oder ein Teil derselben zum Einsatz kommt, wobei besagte Nukleinsauresequenz für eine Aminosäuresequenzen kodiert, die mindestens eine Sequenz gemäß SEQ ID NO: 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 oder 39 oder eine Variation dieser Sequenzen umfasst.
7. Verfahren nach .Anspruch 6 , wobei besagte Nukleinsauresequenz eine Sequenz gemäß SEQ ID NO:.5, 7, 9, 11, 13, 15 oder 17 oder einer Teil von mindestens 15 zusammenhängenden Basen besagter Sequenzen umfasst.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 oder 7 , wobei das Verfahren unter Einsatz der Polymerasekettenreaktion durchgeführt wird und die besagte Nukleinsauresequenz oder ein Teil derselben als Primer eingesetzt wird.
9. Verfahren zur Herstellung einer- transgenen Expressionskassette, bevorzugt mit Spezifität für mindestens ein stärkehaltiges Gewebe einer Pflanze, umfassend nachfolgende Schritte:
I. Isolation eines Promotors mit Spezifität für mindestens ein stärkehaltiges Gewebe einer Pflanze, wobei bei der Isolation mindestens eine Nukleinsauresequenz oder ein Teil derselben zum Einsatz kommt, wobei besagte Nukleinsauresequenz für eine Aminosäuresequenzen kodiert, die mindestens eine Sequenz gemäß SEQ ID NO: 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 oder 39 oder eine Variation dieser Sequenzen umfasst.
IP. Funktionelle Verknüpfung besagten Promotors mit einer weiteren Nukleinsauresequenz, wobei besagte Nukleinsauresequenz in Bezug auf den Promotor heterolog ist.
10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei besagte Nukleinsauresequenz «eine Sequenz gemäß SEQ ID NO: 5, 7, 9, 11, 13, 15 oder 17 oder einer Teil von mindestens 15 zusammenhängenden Basen besagter Sequenzen umfasst.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 oder 10 , wobei das Ver- fahren unter Einsatz der Polymerasekettenreaktion durchgeführt wird und die besagte Nukleinsauresequenz oder ein Teil derselben als Primer eingesetzt wird.
12. Isolierte Nukleinsauresequenz umfassend den Promotor der Starkesynthase 3 aus Kartoffel.
13. Isolierte Nukleinsauresequenz nach Anspruch 12, wobei der Promotor der Starkesynthase 3 aus Kartoffel mindestens eine Nukleinsauresequenz umfasst ausgewählt aus
i. der Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 1 oder 44 oder den dazu komplementären Sequenzen,.
ii. Fragmenten von mindesten 25 zusammenhängenden Nukleotiden der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder 44 oder den dazu komplementären Sequenzen,
iii. Sequenzen, die eine Homologie aufweisen von mindestens 50 % zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder 44 oder den dazu komplementären Sequenzen, wobei sich die Homologie über eine Länge von von mindestens 100 Basenpaaren der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder 44 erstreckt.
14. Transgene Expressionskassette zur gezielten, transgenen Ex- «pression von Nukleinsauresequenzen mindestens einem stärkehaltigen Geweben einer Pflanze, umfassend
a) mindestens eine Promotorsequenz eines Gens kodierend für eine Starkesynthase 3, und
b) mindestens eine weitere Nukleinsauresequenz, und
wobei mindestens eine der besagten Promotorsequenzen und eine weitere Nukleinsauresequenz funktionell miteinander verknüpft sind und die weitere Nukleinsauresequenz in Bezug auf die Promotorsequenz heterolog ist.
15. Transgene Expressionskassette nach Anspruch 14, wobei die Promotorsequenz eines Gens kodierend für eine Starkesynthase '3 einen Sequenzbereich von mindestens 250 Basenpaaren in
5 ' -Richtung vor dem ATG-Startkodon der genomischen Sequenzen kodierend für eine Stärkesynthase-3 umfasst.
16. Transgene Expressionskassette nach Anspruch 14 oder 15, wobei die die Starkesynthase 3 wie in Anspruch 3 charakterisiert ist.
17. Transgene Expressionskassette nach einem der Ansprüche 14 bis 16, wobei der Starkesynthase 3 Promotor mindestens eine Nu- kleinsäuresequenz umfasst ausgewählt aus
1. den Sequenzen SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 oder 44, oder den dazu komplementären Sequenzen,
2. Fragmenten von mindesten 25 zusammenhängenden Nukleotiden, bevorzugt mindestens 50 zusammenhängenden Nukleotiden, besonders bevorzugt mindestens 100 zusammenhängenden Nukleotiden einer Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1, 2 , 3 , 4 oder 44 oder den dazu komplementären Sequenzen,
3. Sequenzen, die eine Homologie aufweisen von mindestens 50 % zu einer der Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 oder 44 oder den dazu komplementären Sequenzen, wobei sich die Homologie über eine Länge von von mindestens 100 Basen- paaren erstreckt.
18. Transgene Expressionskassette nach einem der Ansprüche 14 bis
17, wobei der Starkesynthase 3 Promotor die Nukleinsauresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder 44 oder ein Fragment von mindestens 25 zusammenhängenden Nukleotiden derselben umfasst.
5
19. Transgene Expressionskassette nach einem der Anspruch 14 bis
18, wobei
a) die zu exprimierende Nukleinsauresequenz mit weiteren 10 genetischen KontrollSequenzen funktionell verknüpft ist, oder
b) die Expressionskassette zusätzliche Funktionselemente enthält, oder
15 d) a) und b) gegeben sind.
20. Transgene Expressionskassette nach einem der Ansprüchen 14 bis 19 , wobei die transgen zu exprimierende Nukleinsäurese-
20 quenz
a) die Expression eines von besagter Nukleinsauresequenz kodierten Proteins, oder
25 b) die Expression eines von besagter Nukleinsauresequenz kodierter sense-RNA, anti-sense-RNA oder doppelsträngigen RNA ermöglicht .
21. Transgener Expressionsvektor enthaltend eine Expressionskas- 30 sette gemäss einem der Ansprüche 14 bis 20.
22. Transgener Organismus transformiert mit einer Expressionskas- sette gemäß den Ansprüchen 14 bis 20 oder einem Expressions- vekor- gemäß Anspruch 21.
35
23. Transgener Organismus nach Anspruch 22 ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Bakterien, Hefen, Pilzen, nicht-menschlichen tierischen und pflanzlichen Organismen oder von diesen abgeleitete Zellen, Zellkulturen, Teile, Gewebe, Organe oder
40 Vermehrungsgut.
24. Transgener Organismus nach Anspruch 22 oder 23 ausgewählt aus der Gruppe der landwirtschaftlichen Nutzpflanzen.
45 25. Verwendung eines transgenen Organismus nach einem der Ansprüche 22 bis 24 oder von diesem abgeleitete abgeleitete Zellen, Zellkulturen, Teile,- Gewebe, Organe oder Vermehrungsgut zur Herstellung von Nahrungs-, Futtermitteln, Saatgut, Pharmazeutika oder Feinchemikalien.
26. Verfahren zur Herstellung von Pharmazeutika oder Feinchemika- lien in transgenen Organismen nach einem der Ansprüche 22 bis 24 oder von diesem abgeleitete Zellen, Zellkulturen, Teile, Gewebe, Organe oder Vermehrungsgut , wobei der transgene Organismus oder von diesem abgeleitete Zellen, Zellkulturen, Teile, Gewebe, Organe oder Vermehrungsgut gezüchtet oder kul- tiviert werden und das gewünschte Pharmazeutikon oder die gewünschte Feinchemikalie isoliert wird.
PCT/EP2004/000241 2003-01-20 2004-01-15 Expressionskassette mit promotoren der stärkesynthase 3 zur expression von nukleinsäuren in stärkehaltigen geweben von pflanzen WO2004065537A2 (de)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US10/542,516 US7563944B2 (en) 2003-01-20 2004-01-15 Expression cassette for nucleic acids in plant tissue containing starch
CA002513289A CA2513289A1 (en) 2003-01-20 2004-01-15 Expression cassette with promotors of starch synthesis 3 for the expression of nucleic acids in plant tissue containing starch
EP04702308A EP1604027A2 (de) 2003-01-20 2004-01-15 Expressionskassette mit promotoren der stärkesynthase 3 zur expression von nukleinsäuren in stärkehaltigen geweben von pflanzen

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE10302324.0 2003-01-20
DE10302324 2003-01-20

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2004065537A2 true WO2004065537A2 (de) 2004-08-05
WO2004065537A3 WO2004065537A3 (de) 2005-01-13

Family

ID=32747473

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP2004/000241 WO2004065537A2 (de) 2003-01-20 2004-01-15 Expressionskassette mit promotoren der stärkesynthase 3 zur expression von nukleinsäuren in stärkehaltigen geweben von pflanzen

Country Status (4)

Country Link
US (1) US7563944B2 (de)
EP (1) EP1604027A2 (de)
CA (1) CA2513289A1 (de)
WO (1) WO2004065537A2 (de)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102004057291C5 (de) * 2004-11-26 2010-08-26 Südzucker AG Mannheim/Ochsenfurt Lagerungsinduzierte Promotoren

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008151149A2 (en) * 2007-06-01 2008-12-11 Solazyme, Inc. Production of oil in microorganisms
ES2583639T3 (es) 2008-11-28 2016-09-21 Terravia Holdings, Inc. Producción de aceites específicos en microorganismos heterótrofos
JP5996527B2 (ja) 2010-05-28 2016-09-21 テラヴィア ホールディングス， インコーポレイテッド 用途に応じた油を含む食品成分
SG10201509035WA (en) 2010-11-03 2015-12-30 Solazyme Inc Microbial Oils With Lowered Pour Points, Dielectric Fluids Produced Therefrom, And Related Methods
JP6071904B2 (ja) 2011-02-02 2017-02-01 テラヴィア ホールディングス， インコーポレイテッド 組み換え油産生微生物から生成される用途に応じた油
SG11201406711TA (en) 2012-04-18 2014-11-27 Solazyme Inc Tailored oils
CA2921035A1 (en) 2013-08-14 2015-02-19 Kansas State University Research Foundation Expression of thermostable starch synthase genes improves the yield in heat stress
WO2015051319A2 (en) 2013-10-04 2015-04-09 Solazyme, Inc. Tailored oils
CN106574255A (zh) 2014-07-10 2017-04-19 泰拉瑞亚控股公司 酮脂酰acp合酶基因及其用途

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000066745A1 (en) * 1999-04-29 2000-11-09 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Novel genes encoding wheat starch synthases and uses therefor

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3843627A1 (de) 1988-12-21 1990-07-05 Inst Genbiologische Forschung Kartoffelknollenspezifische transkriptionale regulation
US5859330A (en) 1989-12-12 1999-01-12 Epitope, Inc. Regulated expression of heterologous genes in plants and transgenic fruit with a modified ripening phenotype
JP3325022B2 (ja) 1990-06-18 2002-09-17 モンサント カンパニー 植物中の増加された澱粉含量
US5498830A (en) 1990-06-18 1996-03-12 Monsanto Company Decreased oil content in plant seeds
GB9525353D0 (en) 1995-12-12 1996-02-14 Nat Starch Chem Invest Potato soluble starch synthase
US6127179A (en) 1996-04-17 2000-10-03 Dellapenna; Dean Gene promoter for tomato fruit
HUP0103618A3 (en) * 1998-09-10 2003-12-29 Monsanto Uk Ltd Cambridge Isoforms of starch branching enzyme ii (sbe-iia and sbe-iib) from wheat
DE19852195C2 (de) 1998-11-04 2000-11-02 Inst Pflanzengenetik & Kultur Neue Expressionskassette zur Expression von beliebigen Genen in Pflanzensamen
AU4492900A (en) 1999-04-30 2000-11-17 Agritope, Inc. Apple promoters for expression of transgenes in plants

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000066745A1 (en) * 1999-04-29 2000-11-09 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Novel genes encoding wheat starch synthases and uses therefor

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ABEL G J ET AL: "Cloning and functional analysis of a cDNA encoding a novel 139 kDa starch synthase from potato (Solanum tuberosum L.)" PLANT JOURNAL, BLACKWELL SCIENTIFIC PUBLICATIONS, OXFORD, GB, Bd. 10, Nr. 6, Dezember 1996 (1996-12), Seiten 981-991, XP002121809 ISSN: 0960-7412 in der Anmeldung erwähnt *
LI Z ET AL: "THE STRUCTURE AND EXPRESSION OF THE WHEAT STARCH SYNTHASE III GENE. MOTIFS IN THE EXPRESSED GENE DEFINE THE LINEAGE OF THE STARCH SYNTHASE III GENE FAMILY" PLANT PHYSIOLOGY, AMERICAN SOCIETY OF PLANT PHYSIOLOGISTS, ROCKVILLE, MD, US, Bd. 123, Nr. 2, Juni 2000 (2000-06), Seiten 613-624, XP001084970 ISSN: 0032-0889 -& DATABASE EMBL [Online] T. aestivum starch synthase III m RNA 29. Juli 2000 (2000-07-29), LI ET AL.: "THE STRUCTURE AND EXPRESSION OF THE WHEAT STARCH SYNTHASE III GE-NE" XP002288572 gefunden im EBI Database accession no. AF258608 *
MARSHALL JACQUELINE ET AL: "Identification of the major starch synthase in the soluble fraction of potato tubers" PLANT CELL, Bd. 8, Nr. 7, 1. Juli 1996 (1996-07-01), Seiten 1121-1135, XP002060103 ISSN: 1040-4651 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102004057291C5 (de) * 2004-11-26 2010-08-26 Südzucker AG Mannheim/Ochsenfurt Lagerungsinduzierte Promotoren
US8093457B2 (en) 2004-11-26 2012-01-10 Kws Saat Ag Storage-induced promoter

Also Published As

Publication number Publication date
CA2513289A1 (en) 2004-08-05
WO2004065537A3 (de) 2005-01-13
US20060130182A1 (en) 2006-06-15
EP1604027A2 (de) 2005-12-14
US7563944B2 (en) 2009-07-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1409697B1 (de) Expressionskassetten zur transgenen expression von nukleinsäuren
EP1604027A2 (de) Expressionskassette mit promotoren der stärkesynthase 3 zur expression von nukleinsäuren in stärkehaltigen geweben von pflanzen
EP1711612B1 (de) Expressionskassetten zur bidirektionalen transgenen expression von nukleinsäuren in pflanzen
EP1537218B1 (de) Transgene expressionskassetten zur expression von nukleinsäuren in nicht-reproduktiven blütengeweben von pflanzen
DE10133407A1 (de) Expressionskassetten zur transgenen Expression von Nukleinsäuren
WO2003008596A2 (de) Expressionskassetten zur transgenen expression von selektionsmarkern
EP1539967B1 (de) Expressionskassetten zur expression von nukleinsäuren in kohlenhydrat-speichernden sink-geweben von pflanzen
US20090068163A1 (en) Transgenic expression cartridges for expressing nucleic acids in the flower tissue of plants
DE10225066A1 (de) Neue Expressionssysteme für Pflanzen
WO2004027069A1 (de) Transgene expressionskassetten zur expression von nukleinsäuren in der pflanzlichen blüte
KR20200000018A (ko) 식물 종자의 배 특이적 ＯｓＮＦＹ１６ 프로모터 및 이의 용도
DE10212893A9 (de) Verfahren zum Erhöhen des Ölgehaltes in Pflanzen
DE10207582A1 (de) Expressionskassetten zur transgenen Expression von Nukleinsäuren
DE10159455A1 (de) Expressionskassetten zur transgenen Expression von Nukleinsäuren
DE10053519A1 (de) Expressionskassetten zur transgenen Expression von Nukleinsäuren in der pflanzlichen embryonalen Epidermis und der Blüte
DE10131789A1 (de) Promotor für die spezifische Expression in Transferzellen pflanzlicher Embryonen
EP1554388A1 (de) Transgene expressionskassetten zur expression von nukleinsäuren in der pflanzlichen blüte
DE10127882A1 (de) Expressionskonstrukte zur transgenen Expression von Nukleinsäuren
Buddharak et al. A protocol for Agrobacterium-mediated transformation of Kalanchoë blossfeldiana with a flavonoid 3', 5'hydroxylase (F3'5'H) gene

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): BW GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IT LU MC NL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

DPEN Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed from 20040101)
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2004702308

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2513289

Country of ref document: CA

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2006130182

Country of ref document: US

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 10542516

Country of ref document: US

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2004702308

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 10542516

Country of ref document: US