DE10127882A1 - Expressionskonstrukte zur transgenen Expression von Nukleinsäuren - Google Patents
Expressionskonstrukte zur transgenen Expression von NukleinsäurenInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft Expressionskonstrukte und Vektoren, die pflanzliche Promotoren mit einer Expressionsspezifität für Keimblätter und/oder weitere pflanzliche embryonale Gewebe enthalten, sowie deren Verwendung zur transgenen Expression von Nukleinsäuresequenzen in Organismen, bevorzugt in Pflanzen. Die Erfindung betrifft ferner mit diesen Expressionskonstrukte oder Vektoren transformierte transgene Pflanzen, davon abgeleitete Kulturen, Teile oder Vermehrungsgut, sowie die Verwendung derselben zur Herstellung von Nahrungs-, Futtermitteln, Saatgut, Pharmazeutika oder Feinchemikalien.
Description
Die Erfindung betrifft Expressionskonstrukte und Vektoren,
die pflanzliche Promotoren mit einer Expressionsspezifität
für Keimblätter und/oder weitere pflanzliche embryonale Gewebe
enthalten, sowie die Verwendung dieser Expressionskonstrukte oder
Vektoren zur transgenen Expression von Nukleinsäuresequenzen in
Organismen, bevorzugt in Pflanzen. Die Erfindung betrifft ferner
mit diesen Expressionskonstrukten oder Vektoren transformierte
transgene Pflanzen, davon abgeleitete Kulturen, Teile oder Ver
mehrungsgut, sowie die Verwendung derselben zur Herstellung
von Nahrungs-, Futtermitteln, Saatgut, Pharmazeutika oder Fein
chemikalien.
Verschiedene Methoden zum Einschleusen von Genen in das Genom von
Pflanzen sind bekannt (Halford NG, Shewry PR, Br Med Bull 2000;
56 (1): 62-73). Ziel ist die Herstellung von Pflanzen mit vorteil
haften, neuen Eigenschaften zum Beispiel zur Steigerung der
landwirtschaftlichen Produktivität, zur Qualitätssteigerung bei
Nahrungsmitteln oder zur Produktion bestimmter Chemikalien oder
Pharmazeutika (Dunwell JM (2000) J Exp Bot 51 Spec No: 487-96).
Oft sind die natürlichen Abwehrmechanismen der Pflanze zum Bei
spiel gegen Pathogene unzureichend. Die Einführung fremder Gene
aus Pflanzen, Tieren oder mikrobiellen Quellen kann die Abwehr
verstärken. Beispiele sind der Schutz gegen Insektenfrass in
Tabak durch Expression des Bacillus thuringiensis Endotoxin unter
Kontrolle des 35 S CaMV Promotors (Vaeck et al. (1987) Nature
328: 33-37) oder der Schutz des Tabaks gegen Pilzbefall durch
Expression einer Chitinase aus der Bohne unter Kontrolle des
CaMV Promotors (Broglie et al. (1991) Science 254; 1194-1197).
Ferner kann durch die Einführung fremder Gene eine Herbizid
resistenz erzielt werden, was die Anbaubedingungen optimiert
und Ernteverluste verringert (Ott KH et al. (1996) J Mol Biol
263 (2): 359-368). Auch kann die Qualität der Erzeugnisse ver
bessert werden. So kann die Haltbarkeit und Lagerfähigkeit von
Ernteerzeugnissen zum Beispiel durch Inaktivierung bestimmter
Reifungsgene erhöht werden. Gezeigt wurde dies zum Beispiel an
der Tomate durch Inaktivierung der Polygalacturonase (Hamilton AJ
et al. (1995) Curr Top Microbiol Immunol 197: 77-89).
Eine Grundvoraussetzung für die transgene Expression bestimmter
Gene in Pflanzen ist die Bereitstellung pflanzenspezifischer
Promotoren. Verschiedene pflanzliche Promotoren sind bekannt.
Bekannt sind zum Beispiel konstitutive Promotoren wie der
Promotor der Nopalinsynthase aus Agrobacterium, der TR-Doppel
promotor oder der Promotor des 35S-Transkriptes des Blumenkohl
mosaikvirüs (CaMV) (Odell et al. (1985) Nature 313: 810-812), der
OCS (Octopin Synthase) Promotor aus Agrobacterium, der Ubiquitin
Promotor (Callis et al. (1990) J Biol Chem 265: 12486-12493), die
Promotoren der vakuolärer ATPase Untereinheiten oder der Promotor
eines prolinreichen Proteins aus Weizen (WO 91/13991). Nachteilig
bei diesen Promotoren ist, dass sie in fast allen Geweben der
Pflanze konstitutiv aktiv sind. Eine gezielte Expression von
Genen in bestimmten Pflanzenteilen oder zu bestimmten Ent
wicklungszeitpunkten ist mit diesen Promotoren nicht möglich.
Promotoren mit Spezifitäten für die Antheren, Ovarien, Blüten,
Blätter, Stengel, Wurzeln und Samen sind beschrieben. Die
Stringenz der Spezifität, als auch die Expressionsaktivität
dieser Promotoren ist sehr unterschiedlich. Zu nennen sind
Promotoren, die eine blattspezifische Expression gewährleisten,
wie der Promotor der zytosolischen FBPase aus Kartoffel
(WO 97/05900), der SSU Promotor (small subunit) der Rubisco
(Ribulose-1,5-bisphosphatcarboxylase) oder der ST-LSI Promotor
aus Kartoffel (Stockhaus et al. (1989) EMBO J 8: 2445-2245).
Weitere Promotoren sind beispielsweise Promotoren mit Spezifität
für Knollen, Speicherwurzeln oder Wurzeln, wie beispielsweise der
Patatin Promotor Klasse I (B33), der Promotor des Cathepsin D
Inhibitors aus Kartoffel, der Promotor der Stärke Synthase
(GBSS1) oder der Sporamin Promotor, fruchtspezifische Promotoren,
wie beispielsweise der fruchtspezifische Promotor aus Tomate
(EP-A 409625), fruchtreifungspezifische Promotoren, wie bei
spielsweise der fruchtreifungspezifische Promotor aus Tomate
(WO 94/21794), blütenspezifische Promotoren, wie beispielsweise
der Phytoen-Synthase Promotor (WO 92/16635) oder der Promotor des
P-rr Gens (WO 98/22593).
Ein entwicklungsabhängig regulierter Promotors ist unter anderem
bei Baerson et al. beschrieben (Baerson SR, Lamppa GK (1993)
Plant Mol Biol 22(2): 255-67).
Es sind Promotoren beschrieben mit Gewebespezifität für das
Mesophyll und die Pallisadenzellen in Blättern (Broglie et al.
(1984) Science 234: 838-845), den sich teilenden Spross und das
Wurzelmeristem (Atanassova et al. (1992) Plant J 2: 291-300),
Pollen (Guerrero et al. (1990) Mol Gen Genet 224: 161-168), Samen
endosperm (Stalberg et al. (1993) Plant Mol Biol 23: 671-683),
Wurzelepidermis (Suzuki et al. (1993) Plant Mol Biol 21: 109-119),
sowie für das Wurzelmeristem, Wurzelgefäßgewebe und Wurzel
knötchen (Bogusz et al. (1990) Plant Cell 2: 633-641).
Bekannt sind ferner Promotoren, die eine Expression in Samen und
pflanzlichen Embryonen steuern. Samenspezifische Promotoren sind
zum Beispiel der Promotor des Phaseolins (US 5,504,200, Bustos mm
et al. (1989) Plant Cell 1 (9): 839-53), des 25 Albumingens
(Joseffson LG et al. (1987) J Biol Chem 262: 12196-12201), des
Legumins (Shirsat A et al. (1989) Mol Gen Genet 215 (2): 326-331),
des USP (unknown seed protein; Bäumlein H et al. (1991) Molecular
& General Genetics 225 (3): 459-67) des Napin Gens (Stalberg K,
et al. (1996) Planta 199: 515-519), des Saccharosebindeproteins
(WO 00/26388) oder der LeB4-Promotor (Bäumlein H et al. (1991)
Mol Gen Genet 225: 121-128). Diese steuern eine samenspezifische
Expression von Speicherproteinen.
Die eingeschränkte Zelltypspezifität der sogenannten "samen
spezifischen Promotoren" ist aus der Literatur für die oben
genannten Promotoren bekannt: Unter Verwendung eines USP
Promotor-GUS Fusionskonstruktes wurde eine Nebenaktivität des
USP Promotors in keimenden Sämlingen von Arabidopsis gefunden,
insbesondere in den Kotyledonen und in der Wurzel mit abnehmender
Intensität in Richtung der Wurzelspitze. Weitere Nebenaktivitäten
wurden in den Wurzelhaaren, den Gefäßbündeln, den Mesophyllzellen
und den epidermalen Zellen des Cotyledons und des Hypocotyl
gefunden (Bäumlein et al. (1991) Mol Gen Genet 225: 459-467).
In späteren Stadien der Entwicklung (2 Wochen) wurden Neben
aktivitäten in den Gefäßbündeln der Wurzeln mit der höchsten
Aktivität in den Wurzelhaubenzellen und dem Wurzelmeristem. Dies
bedeutet, dass diese Aktivität Konsequenz einer de novo Synthese
und nicht Folge einer Restaktivität von während der Embryogenese
exprimierter β-Glucoronidase Aktivität ist (Bäumlein et al. (1991)
Mol Gen Genet 225: 459-4671). Ähnliche Nebenaktivitäten wurden
bei Studien mit dem USP-Promotor in Tabak gefunden. Weitere,
detaillierte Untersuchungen der USP-Promotoraktivität in Arabi
dopsis zeigten darüberhinaus Nebenaktivitäten im Pollen und den
Blütenorganen. In transgenen Tabak und Arabidopsis Pflanzen, die
ein Legumin B4 Promotor-GUS Fusionskonstrukt enthielten, wurde
eine Anfärbung der Endospermzellen in Nachbarschaft zum Embryo
gefunden (Bäumlein et al. (1991) Mol Gen Genet 225: 121-128).
Für den USP und Legumin B4 Promotor wurde eine Nebenaktivität
im Pollen beobachtet. Bezüglich ein weiterer, samenspezifischer
Promotor namens DC3 wurde eine Induzierbarkeit durch exogene
Abscisinsäure (ABA) und Wassermangel in allen Organen eines
entsprechenden transgenen Tabakpflanze berichtet (Vivekananda
et al. (1992) Plant Physiol 100: 576-581).
Eine Promotoraktivität mit einer Spezifität für bestimmte Zellen
innerhalb des Samens ist lediglich für die Samenhülle beschrieben
worden: Ein kryptischer Promotor mit Spezifität für die Samen
hülle wurde durch "T-DNA tagging" in Tabak identifiziert
(Fobert PR et al. (1994) Plant Journal 6 (4): 567-77; US 5,824,863;
WO 99/53067). Kryptische Promotoren oder Pseudopromotoren sind
an sich inaktive Sequenzen innerhalb des Genoms, die jedoch eine
expressionregulierende Funktionalität bekommen, wenn sie in der
Nähe von Genen positioniert werden.
Die im Stand der Technik beschriebenen, sogenannten "samen
spezifischen" Promotoren weisen einen oder mehr der nachfolgenden
Nachteile auf:
- 1. Mangelhafte Samenspezifität:
Die oben erwähnte Nebenaktivität der bekannten, sogenannten "samenspezifischen" Promotoren in anderen Pflanzenorganen ist unvorteilhaft, da auch dort die Expression heterogener Nukleinsäuren bzw. Proteine erfolgen kann. Dies kann sich nachteilig auf das Pflanzenwachstum oder den Pflanzenwert auswirken, kann aber auch unvorteilhafte Auswirkungen auf die Umwelt haben. So hatte eine unspezifische Expression von Bacillus thuringiensis Endotoxinen nicht nur den gewünschten Effekt auf Fraßinsekten durch Expression in der Wurzel, sondern auch infolge einer Expression im Pollen bedeutende Schäden im Bestand des Monarchfalters zur Folge, der den Pollen als Hauptnahrungsquelle nutzt (Losey JE et al. (1999) Nature 399, 214). - 2. Mangelhaftes Zeitprofil:
Die im Stand der Technik bekannten sogenannten "samen spezifischen" Promotoren zeigen oft einen zu späten Beginn ihrer Aktivität und/oder eine anhaltende Aktivität in die Keimungsphase hinein. Damit können in der frühen Phase der Embryogenese keine wünschenswerten Effekte erzielt werden, was gerade hier - aufgrund der Empfindlichkeit des Embryos gegen biotische und ablotische Stressfaktoren - vorteilhaft wäre. Eine frühzeitig während der Samenentwicklung einset zende Promotoraktivität kann vorteilhaft sein, nicht hingegen eine Nebenaktivität in bereits keimenden Sämlingen, was zu einer Störung der Keimung führen könnte. - 3. Mangelnde Homogenität der Expression im Samen:
Wie oben erwähnt ist die Expressionsaktivität vieler im Stand der Technik bekannter, sogenannter "samenspezifischer" Promotoren nicht homogen über den Keimling verteilt, sondern weist Gradienten innerhalb desselben oder Präferenzen für einzelne Zelltypen auf. Damit kann eine unter dem Promotor exprimierte Nukleinsäure oder Protein seinen potentiellen, vorteilhaften Effekt nicht auf den gesamten Samen gleichmäßig ausüben, was ggf. zu Effizienzverlusten führen kann. - 4. Mangelnde Anwendbarkeit auf viele Pflanzenarten:
Die im Stand der Technik beschriebenen sogenannten "samen spezifischen" Promotoren sind oft nicht in allen Arten aktiv. So weist der Napin-Promotor beispielsweise keine Aktivität in Lein auf (Hjördis Voss (2000) Versuche zur gentechnologischen Modifizierung von Triacylglycerolen durch Expression hetero loger Lipoxygenasen in transgenem Lein. Dissertation, Fach bereich Biologie der Universität Hamburg).
Für die Anwendung eines samenspezifischen Promotors in der Land
wirtschaft und Pflanzenforschung sind nachfolgende Eigenschaften
wünschenswert:
- 1. Das Expressionsprofil des Promotors sollte zu einem definierten Zeitpunkt beginnen und vor der Keimung enden. Dies ist insbesondere für Genaktivitäten relevant, die eine Anreicherung von Speicherproteinen oder -verbindungen bewirken sollen.
- 2. Eine uniforme Expression innerhalb des Embryos ist wünschens wert, um eine optimale Nutzung des exprimierten Merkmals ("Trait") zu gewährleisten, wohingegen eine Nebenaktivität im Endosperm nicht erwünscht ist.
- 3. Alternativ kann eine auf ein embryonales Organ (wie z. B. die Kotyledonen) beschränkte Promotoraktivität für Anwendungen vorteilhaft sein, bei denen eine Kompartimentierung erstrebenswert ist.
- 4. Nebenaktivitäten eines Promotors im Pollen sind nicht wünschenswert, zum Beispiel um Umweltschäden zu vermeiden (wie bei der Schädigung des Monarchfalterbestandes durch Bt-Toxin exprimierende Pflanzen geschehen; s. o.).
Trotz der Vielzahl bekannter pflanzlicher Promotoren, wurde
bislang kein Promotor mit den oben aufgezählten gewünschten
Eigenschaften beschrieben. Insbesondere ist kein Promotor mit
Spezifität für die Keimblätter (Kotyledonen) des pflanzlichen
Embryos bekannt. Auch sind keine samenspezifischen Promotoren
bekannt, die eine sehr frühe Expression im Samenembryo verleihen
und gleichzeitig keine unerwünschten Nebenaktivitäten wie im
Pollen aufweisen.
Es bestand daher die Aufgabe, entsprechende Promotoren zu
identifizieren.
Diese Aufgabe wurde durch Bereitstellung von Expressions
konstrukten basierend auf dem Promotor des LOX5 Gens aus
Arabidopsis thaliana (infolge AtLOX5) gemäß SEQ ID NO: 1, 2
oder 3 gelöst. Der Promotor des AtLOX5-Gens hat eine expressions
regulierende Spezifität mit nachfolgenden bislang in dieser
Kombination nicht beschriebenen vorteilhaften Eigenschaften:
- 1. Eine früh einsetzende, sehr starke Expressionsaktivität im
Embryo, vor allem in den Keimblättern.
Vorteile:- - Der pflanzliche Embryo ist vor allem in den ersten Tagen der Embryogenese besonders anfällig gegen biotische und ablotische Stressfaktoren. Durch seine früh ein setzende Promotoraktivität bieten die erfindungsgemäßen Expressionskonstrukte die Möglichkeit, durch eine gezielte Expression nachfolgend beschriebener Nuklein säuren bzw. Proteine einen Schutz gegen diese Stress faktoren aufzubauen bzw. Schäden zu kompensieren.
- - Die Keimblätter des Samenembryos sind das Hauptspeicher organ und eine starke Expression dort ist besonders wünschenswert und vorteilhaft, da so beispielsweise der Nährwert eines als Nahrungs- bzw. Futtermittel ver wendeten Samens (z. B. eines Getreides) gezielt gesteigert oder modifiziert werden kann.
- 2. Homogene Expressionsaktivität innerhalb des Keimblattes.
Vorteil: Gleichmäßiger Effekt des zu exprimierenden Merkmals ("Trait"), dadurch erhöhte Effizienz und Vermeidung von nach teiligen Effekten durch lokale über- bzw. Unterexpression. - 3. Eine nicht-detektierbare Nebenaktivität in anderen Pflanzen
organen insbesondere im Pollen.
Vorteile: Vermeidung von potentiellen, unvorteilhaften Effekten auf Pflanzenwachstum, -eigenschaften oder -wert bzw. auf die Umwelt. - 4. Eine spezifische Wirksamkeit in einer breiten Anzahl
von Pflanzenarten.
Vorteile: Steigerung der Effizienz in der Pflanzen biotechnologie durch breite Anwendbarkeit von Expressions konstrukten.
Das Genprodukt des AtLOX5 Gens zählt zu der Familie der 9-Lipoxy
genasen. Eine partielle mRNA ist unter der Accession-No AJ302043
in der GenBAnk hinterlegt (AJ302043: Arabidopsis thaliana partial
mRNA for lipoxygenase (LOX5 gene)). Das Gen von AtLOX5 ist
bekannt. Seine Sequenz wurde im Rahmen des Arabidopsis thaliana
Genomprojektes ermittelt und liegt - eingebettet in einen
größeren genomischen Klon (Arabidopsis thaliana genomic DNA,
chromosome 3, P1 clone: MCB17, Genbank Acc.-No: AB022215.1),
der 83205 Nukleotide umfasst - vor. Die Promotor-Sequenz ein
schließlich der 5'-untranslatierten Region des AtLOX5-Gen hat
eine Länge von 1368 Nukleotiden und umfasst die Basen No. 45985
bis 47352 des obigen genomischen Klons.
Weder die pflanzenphysiologische Bedeutung noch das Expressions
muster des AtLOX5 Gens oder Proteins sind beschrieben. Bislang
ist kein Lipoxygenasepromotor beschrieben oder identifiziert
worden, der eine samenspezifische Expression aufweist.
Ein erster Gegenstand der Erfindung betrifft daher Expressions
konstrukte zur transgenen Expression von Nukleinsäuren umfassend
- a) den Promotor des AtLOX5 Gens gemäß SEQ ID NO: 1, oder
- b) eine Deletionsvariante des LOX5 Gens aus Arabidopsis thaliana gemäß SEQ ID NO: 2 oder 3, oder
- c) ein funktionelles Äquivalent oder äquivalentes Fragment von a), das im wesentlichen die gleiche Promotoraktivität wie a) besitzt,
wobei a) oder b) funktionell mit einer transgen zu exprimierenden
Nukleinsäuresequenz verknüpft sind.
Ferner betrifft die Erfindung Verfahren zur transgenen Expression
von Nukleinsäuren, dadurch gekennzeichnet, dass eine Nuklein
säuresequenz in funktioneller Verknüpfung mit
- a) dem Promotor des LOXS Gens aus Arabidopsis thaliana gemäß SEQ ID NO: 1, oder
- b) einer Deletionsvariante des LOX5 Gens aus Arabidopsis thaliana gemäß SEQ ID NO: 2 oder 3, oder
- c) einem funktionelle Äquivalent oder äquivalente Fragment von a) oder b), das im wesentlichen die gleichen Promotor aktivitäten wie a) oder b) besitzt,
transgen exprimiert wird.
Expression umfasst die Transkription der transgen zu exprimieren
den Nukleinsäuresequenz, kann aber - im Falle eines offenen Lese
rasters in "sense"-Orientierung - auch die Translation der trans
kribierten RNA der transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz
in ein korrespondierendes Polypeptid umfassen.
Expressionskassette zur transgenen Expression von Nukleinsäuren
oder Verfahren zur transgenen Expression von Nukleinsäuren um
fasst alle solche durch gentechnische Methoden zustande gekommene
Konstruktionen oder Verfahren, in denen sich entweder
- a) der Promotor des AtLOX5 Gens gemäß SEQ ID NO: 1, eine Deletionsvariante des LOXS Gens aus Arabidopsis thaliana gemäß SEQ ID NO: 2 oder 3, oder ein von ihm abgeleitetes funktionelles Äquivalent oder äquivalente Fragment derselben, oder
- b) die zu exprimierende Nukleinsäuresequenz, oder
- c) (a) und (b)
sich nicht in ihrer natürlichen, genetischen Umgebung (d. h. an
ihrem natürlichen chromosomalen Locus) befinden oder durch gen
technische Methoden modifiziert wurden, wobei die Modifikation
beispielhaft eine Substitutionen, Additionen, Deletionen,
Inversion oder Insertionen eines oder mehrerer Nukleotidreste
sein kann.
Die erfindungsgemäßen Expressionskonstrukte, von ihnen abge
leitete Vektoren oder die erfindungsgemäßen Verfahren können
funktionelle Äquivalente zu der unter SEQ ID NO: 1 beschriebenen
Sequenz des AtLOX5 Promotors umfassen. Funktionell äquivalente
Sequenzen umfassen auch all die Sequenzen, die von dem komple
mentären Gegenstrang der durch SEQ ID NO: 1, 2 oder 3 definierten
Sequenz abgeleitet sind und im wesentlichen die gleiche Promotor
aktivität aufweisen.
Funktionelle Äquivalente in bezug auf den AtLOX5 Promotor meint
insbesondere natürliche oder künstliche Mutationen der unter
SEQ ID NO: 1 beschriebenen AtLOX5 Promotorsequenz oder der davon
abgeleiteten Deletionsvarianten gemäß SEQ ID NO: 2 und 3 sowie
seine Homologen aus anderen Pflanzengattungen und -arten, welche
weiterhin im wesentlichen die gleiche Promotoraktivität auf
weisen.
Eine Promotoraktivität wird im wesentlichen als gleich bezeich
net, wenn die Transkription eines beliebigen zu exprimierenden
Gens unter Kontrolle eines bestimmten von SEQ ID NO: 1 oder der
von den Deletionsvarianten gemäß SEQ ID NO: 2 und 3 abgeleiteten
Promotors im Zielkompartiment der Expression (also vor allem in
den Keimblättern) stattfindet. Dabei kann die Expressionshöhe
sowohl nach unten als auch nach oben im Vergleich zu einem Ver
gleichswert abweichen. Bevorzugt sind dabei solche Sequenzen,
deren Expressionshöhe, gemessen anhand der transkribierten mRNA
oder dem infolge translatierten Protein, unter ansonsten unver
änderten Bedingungen quantitativ um nicht mehr als 50, bevorzugt
25%, besonders bevorzugt 10% von einem Vergleichswert erhalten
mit dem durch SEQ ID NO: 1, 2 oder 3 beschriebenen Promotor un
terscheidet. Besonders bevorzugt sind solche Sequenzen, deren
Expressionshöhe, gemessen anhand der transkribierten mRNA oder
dem infolge translatierten Protein, unter ansonsten unveränderten
Bedingungen quantitativ um mehr als 50%, bevorzugt 100%,
besonders bevorzugt 500%, ganz besonders bevorzugt 1000% einen
Vergleichswert erhalten mit dem durch SEQ ID NO: 1, 2 oder 3
beschriebenen Promotor übersteigt. Bevorzugt ist als Vergleichs
wert die Expressionshöhe der natürlichen AtLOX5 mRNA oder des
natürlichen AtLOX5 Proteins aus Arabidopsis thaliana. Bevorzugt
ist ferner als Vergleichswert die Expressionshöhe erhalten mit
einer beliebigen, aber bestimmten Nukleinsäuresequenz, bevorzugt
solchen Nukleinsäuresequenzen, die für leicht guantifizierbare
Proteine kodieren. Ganz besonders bevorzugt sind dabei Reporter-
Proteine (Schenborn E, Groskreutz D. Mol Biotechnol. 1999;
13 (1): 29-44) wie das "green fluorescence protein" (GFP) (Chui
WL et al., Curr Biol 1996, 6: 325-330; Leffel SM et al., Bio
techniques. 23 (5): 912-8, 1997), die Chloramphenicoltransferase,
eine Luziferase (Millar et al., Plant Mol Biol Rep 1992
1O: 324-414) oder die β-Galactosidase, ganz besonders bevorzugt
ist die β-Glucuronidase (Jefferson et al., EMBO J. 1987, 6,
3901-3907).
Ansonsten unveränderte Bedingungen bedeutet, dass die Expression,
die durch eine der zu vergleichenden Expressionskonstrukte
initiiert wird, nicht durch Kombination mit zusätzlichen
genetischen Kontrollsequenzen, zum Beispiel Enhancer-Sequenzen,
modifiziert wird.
Funktionelle Äquivalente umfassen auch solche Promotorvarianten,
deren Funktion, verglichen mit dem AtLOX5 Promotor gemäß
SEQ ID NO: 1, 2 oder 3, abgeschwächt oder verstärkt ist. Dabei
ist die Promotoraktivität mindestens 50% höher, bevorzugt min
destens 100% höher, besonders bevorzugt mindestens 300% höher,
ganz besonders bevorzugt mindestens 500% höher als ein unter
ansonsten unveränderten Bedingungen erhaltener Vergleichswert
mit dem AtLOX5 Promotor gemäß SEQ ID NO: 1, 2 oder 3. Bevorzugt
unterschreitet die Aktivität die des AtLOX5 Promotors gemäß
SEQ ID NO: 1 um nicht mehr als 80%, bevorzugt nicht mehr als
50%, besonders bevorzugt nicht mehr als 20%, ganz besonders
bevorzugt nicht mehr als 10%.
Mutationen umfassen Substitutionen, Additionen, Deletionen,
Inversion oder Insertionen eines oder mehrerer Nukleotidreste.
Somit werden beispielsweise auch solche Nukleotidsequenzen
durch die vorliegende Erfindung mit umfasst, welche man durch
Modifikation des AtLOX5 Promotors gemäß SEQ ID NO: 1, 2 oder 3,
erhält. Ziel einer solchen Modifikation kann die weitere Ein
grenzung der darin enthaltenen Sequenz oder z. B. auch die Ein
fügung weiterer Restriktionsenzymschnittstellen, die Entfernung
überflüssiger DNA oder das Hinzufügen weiterer Sequenzen, zum
Beispiel weiterer regulatorischer Sequenzen, sein.
Wo Insertionen, Deletionen oder Substitutionen, wie z. B.
Transitionen und Transversioneri, in Frage kommen, können an sich
bekannte Techniken, wie in vitro-Mutagenese, "primer repair"
Restriktion oder Ligation verwendet werden. Durch Manipulationen,
wie z. B. Restriktion, "chewing-back" oder Auffüllen von Über
hängen für "blunt ends" können komplementäre Enden der Fragmente
für die Ligation zur Verfügung gestellt werden. Zu analogen
Ergebnissen kann man auch unter Verwendung der Polymeraseketten
reaktion (PCR) unter Verwendung spezifischer Oligonukleotid-
Primer kommen.
Funktionelle Äquivalente, abgeleitet von einer RI-DNA zum
Beispiel durch Substitution, Insertion oder Deletion von
Nukleotiden, haben eine Homologie von mindestens 20%, bevor
zugt 50%, vorzugsweise mindestens 70%, besonders bevorzugt
mindestens 90%, ganz besonders bevorzugt mindestens 95%,
und zeichnen sich durch im wesentlichen gleiche Eigenschaften
wie des AtLOX5 Promotor gemäß SEG ID NO: 1, 2 oder 3 aus.
Unter Homologie zwischen zwei Nukleinsäuren wird die Identität
der Nukleinsäuresequenz über die jeweils gesamte Sequenzlänge
verstanden, die durch Vergleich mit Hilfe des Programmalgorithmus
GAP (Wisconsin Package Version 10.0, University of Wisconsin,
Genetics Computer Group (GCG), Madison, USA) unter Einstellung
folgender Parameter berechnet wird:
Gap Weight: 12
Length Weight: 4
Average Match: 2,912
Average Mismatch: -2,003
Gap Weight: 12
Length Weight: 4
Average Match: 2,912
Average Mismatch: -2,003
Beispielhaft wird unter einer Sequenz, die eine Homologie
von mindestens 50% auf Nukleinsäurebasis mit der Sequenz
SEQ ID NO. 1 aufweist, eine Sequenz verstanden, die bei einem
Vergleich mit der Sequenz SEQ ID NO. 1, 2 oder 3 nach obigem
Programmalgorithmus mit obigem Parametersatz eine Homologie
von mindestens 50% aufweist.
Weitere Beispiele für die in den erfindungsgemäßen Expressions
konstrukte oder Expressionsvektoren zum Einsatz kommenden
Promotorsequenzen lassen sich beispielsweise aus verschiedenen
Organismen, deren genomische Sequenz bekannt ist, wie beispiels
weise aus Arabidopsis thaliana, Brassica napus, Nicotiana
tabacum, Solanum tuberosum, Helianthium anuus, Linum sativum
durch Homologievergleiche aus Datenbanken leicht auffinden.
Funktionelle Äquivalente meint ferner DNA Sequenzen, die unter
Standardbedingungen mit der Nukleinsäuresequenz kodierend für
den AtLOX5 Promotor gemäß SEQ ID NO: 1, 2 oder 3 oder der zu
ihr komplementären Nukleinsäuresequenzen hybridisieren und
die im wesentlichen gleichen Eigenschaften haben. Standard
hybridisierungsbedingungen ist breit zu verstehen und meint
stringente als auch weniger stringente Hybridisierungs
bedingungen. Solche Hybridisierungsbedingungen sind unter
anderem bei Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T et al., in
Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2. Auflage, Cold Spring
Harbor Laboratory Press, 1989, Seiten 9.31-9.57) oder in Current
Protocols in Molecular Biology, John Wiley , N. Y. (1989),
6.3.1-6.3.6. beschrieben.
Beispielhaft können die Bedingungen während des Waschschrittes
ausgewählt sein aus dem Bereich von Bedingungen begrenzt von
solchen mit geringer Stringenz (mit ungefähr 2X SSC bei 50°C) und
solchen mit hoher Stringenz (mit ungefähr 0.2X SSC bei 50°C bevor
zugt bei 65°C) (20X SSC: 0,3M Natriumcitrat, 3M NaCl, pH 7,0).
Darüberhinaus kann die Temperatur während des Waschschrittes von
niedrig stringenten Bedingungen bei Raumtemperatur, ungefähr 22°C,
bis zu stärker stringenten Bedingungen bei ungefähr 65°C angehoben
werden. Beide Parameter, Salzkonzentration und Temperatur, können
gleichzeitig variiert werden, auch kann einer der beiden Para
meter konstant gehalten und nur der andere variiert werden.
Während der Hybridisierung können auch denaturierende Agenzien
wie zum Beispiel Formamid oder SDS eingesetzt werden. In Gegen
wart von 50% Formamid wird die Hybridisierung bevorzugt bei 42°C
ausgeführt. Einige beispielhafte Bedingungen für Hybridisierung
und Waschschritt sind infolge gegeben:
- 1. Hybridisierungbedingungen mit zum Beispiel
- a) 4X SSC bei 65°C, oder
- b) 6X SSC, 0,5% SDS, 100 µg/ml denaturierter, fragmentierte Lachssperma-DNA bei 65°C, oder
- c) 4X SSC, 50% Formamid, bei 42°C, oder
- d) 6X SSC, 0,5% SDS, 100 µg/ml denaturierter, fragmentierte Lachssperma-DNA, 50% Formamid bei 42°C, oder
- e) 2X oder 4X SSC bei 50°C (schwach stringente Bedingung), oder
- f) 2X oder 4X SSC, 30 bis 40% Formamid bei 42°C (schwach stringente Bedingung).
- 2. Waschschritte mit zum Beispiel
- a) 0,1X SSC bei 65°C, oder
- b) 0,1X SSC, 0,5% SDS bei 68°C, oder
- c) 0,1X SSC, 0,5% SDS, 50% Formamid bei 42°C, oder
- d) 0,2X SSC, 0,1% SDS bei 42°C, oder
- e) 2X SSC bei 65°C (schwach stringente Bedingung).
Verfahren zur Herstellung erfindungsgemäßer funktioneller
Äquivalente umfasst bevorzugt die Einführung von Mutationen in
den AtLOX5 Promotor gemäß SEQ ID NO: 1, 2 oder 3. Eine Mutagenese
kann ungerichtet ("random") erfolgen, wobei die mutagenisierten
Sequenzen anschließend bezüglich ihrer Eigenschaften nach einer
"trial-by-error" Prozedur durchmustert werden. Besonders vorteil
hafte Selektionskriterien umfassen beispielsweise die Stabilität
der DI-RNA, die Höhe der resultierenden Expression der ein
geführten Nukleinsäuresequenz oder die Fähigkeit zu Replizieren.
Alternativ können nicht-essentielle Sequenzen des AtLOX5
Promotors deletiert werden ohne die genannten Eigenschaften
signifikant zu beeinträchtigen. Derartige Deletionsvarianten
stellen funktionell äquivalente Teile des Promoters beschrieben
durch SEQ ID NO: 1 dar.
Die Eingrenzung der AtLOX5 Promotorsequenz auf bestimmte,
essentielle regulatorische Regionen kann auch mit Hilfe von
Suchroutine zur Suche von Promotorelementen vorgenommen werden.
Oft sind in den für die Promotoraktivität relevanten Regionen
bestimmte Promotorelemente gehäuft vorhanden. Diese Analyse kann
beispielsweise mit Computerprogrammen wie dem Programm PLACE
("Plant Cis-acting Regulatory DNA Elements") vorgenommen werden
(K. Higo et al., (1999) Nucleic Acids Research 27: 1, 297-300).
Beispielsweise umfassen funktionell äquivalente Teile in bezug
auf den AtLOX5 Promotor gemäß SEQ ID NO: 1 die Deletionsvarianten
gemäß SEQ ID NO: 2 und 3.
Verfahren zur Mutagenisierung von Nukleinsäuresequenzen sind dem
Fachmann bekannt und schließen beispielhaft die Verwendung von
Oligonukleotiden mit einer oder mehr Mutationen im Vergleich
zu der zu mutierenden Region ein (z. B. im Rahmen einer "Site
specific mutagenesis"). Typischerweise kommen Primer mit ungefähr
15 bis ungefähr 75 Nukleotiden oder mehr zum Einsatz, wobei
bevorzugt ca. 10 bis ca. 25 oder mehr Nukleotidreste an beiden
Seiten der zu verändernden Sequenz lokalisiert sind. Details und
Durchführung besagter Mutageneseverfahren sind dem Fachmann ge
läufig (Kunkel et al., Methods Enzymol, 154: 367-382, 1987; Tomic
et al. (1990) Nucl Acids Res 12: 1656; Upender, Raj, Weir (1995)
Biotechniques 18 (I): 29-30; US 4,237,224). Eine Mutagenese kann
auch durch Behandlung von beispielsweise Vektoren, die eine
der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen enthalten, mit
mutagenisierenden Agentien wie Hydroxylamin realisiert werden.
Die in den erfindungsgemäßen Expressionskonstrukten enthaltenen
transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenzen können mit
weiteren genetischen Kontrollsequenzen neben dem AtLOX5 Promotor
funktionell verknüpft sein.
Unter einer funktionellen Verknüpfung versteht man zum Beispiel
die seguentielle Anordnung des AtLOX5 Promotors, der transgen zu
exprimierenden Nukleinsäuresequenz und ggf. weiterer regulativer
Elemente wie zum Beispiel einem Terminator derart, dass jedes der
regulativen Elemente seine Funktion bei der transgenen Expression
der Nukleinsäuresequenz, je nach Anordnung der Nukleinsäure
sequenzen zu sense oder anti-sense RNA, erfüllen kann. Dazu ist
nicht unbedingt eine direkte Verknüpfung im chemischen Sinne
erforderlich. Genetische Kontrollsequenzen, wie zum Beispiel
Enhancer-Sequenzen, können ihre Funktion auch von weiter ent
fernten Positionen oder gar von anderen DNA-Molekülen aus auf
die Zielsequenz ausüben. Bevorzugt sind Anordnungen, in denen
die transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz hinter der als
Promotor fungierenden Sequenz positioniert wird, so dass beide
Sequenzen kovalent miteinander verbunden sind. Bevorzugt ist
dabei der Abstand zwischen der Promotorsequenz und der transgen
zu exprimierende Nukleinsäuresequenz geringer als 200 Basenpaare,
besonders bevorzugt kleiner als 100 Basenpaare, ganz besonders
bevorzugt kleiner als 50 Basenpaare.
Die Herstellung einer funktionellen Verknüpfung kann mittels
gängiger Rekombinations- und Klonierungstechniken realisiert
werden, wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E. F. Fritsch und
J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring
Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) sowie in T. J.
Silhavy, M. L. Berman und L. W. Enquist, Experiments with Gene
Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY
(1984) und in Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Mole
cular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience
(1987) beschrieben sind. Zwischen beide Sequenzen können aber
auch weitere Sequenzen positioniert werden, die zum Beispiel die
Funktion eines Linkers mit bestimmten Restriktionsenzymschnitt
stellen oder eines Signalpeptides haben. Auch kann die Insertion
von Sequenzen zur Expression von Fusionsproteinen führen.
Der Begriff der genetischen Kontrollsequenzen ist breit zu ver
stehen und meint all solche Sequenzen, die einen Einfluss auf
das Zustandekommen oder die Funktion der erfindungsgemäßen
Expressionskassette haben. Genetische Kontrollsequenzen modi
fizieren zum Beispiel die Transkription und Translation in
prokaryotischen oder eukaryotischen Organismen. Vorzugsweise
umfassen die erfindungsgemäßen Expressionskonstrukte 5'-strom
aufwärts von der jeweiligen transgen zu exprimierenden Nuklein
säuresequenz den AtLOX5 Promotor und 3'-stromabwärts eine
Terminatorsequenz als zusätzliche genetische Kontrollsequenz,
sowie gegebenenfalls weitere übliche regulative Elemente,
und zwar jeweils funktionell verknüpft mit der transgen zu
exprimierenden Nukleinsäuresequenz.
Genetische Kontrollsequenzen umfassen auch weitere Promotoren,
Promotorelemente oder Minimalpromotoren, die die expressions
teuernden Eigenschaften modifizieren können. So kann durch
genetische Kontrollsequenzen zum Beispiel die gewebespezifische
Expression zusätzlich abhängig von bestimmten Stressfaktoren
erfolgen. Entsprechende Elemente sind zum Beispiel für Wasser
stress, Abscisinsäure (Lam E und Chua NH, J Biol Chem 1991;
266 (26); 17131-17135) und Hitzestress (Schöffl F et al., Mole
cular & General Genetics 217 (2-3): 246-53, 1989) beschrieben.
Es können ferner weitere Promotoren funktionell mit der zu
exprimierenden Nukleinsäuresequenz verknüpft sein, die eine
Expression in weiteren Pflanzengeweben oder in anderen
Organismen, wie zum Beispiel E. coli Bakterien ermöglichen.
Als Pflanzenpromotoren kommen im Prinzip alle oben beschriebenen
Promotoren in Frage. Vorstellbar ist zum Beispiel, dass eine
bestimmte Nukleinsäuresequenz durch einen Promotor (zum Beispiel
den AtLOX5 Promotor) in einem Pflanzengewebe als sense-RNA trans
kribiert und in das entsprechende Protein translatiert wird,
während die gleiche Nukleinsäuresequenz durch einen anderen
Promotor mit einen anderen Spezifität in einem anderen Gewebe
zu anti-sense-RNA transkibiert und das entsprechende Protein
herunterreguliert wird. Dieses kann durch eine erfindungs
gemäße Expressionskassette realisiert werden, indem der eine
Promotor vor die transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz
positioniert wird und der andere Promotor dahinter.
Genetische Kontrollsequenzen umfassen ferner auch die 5'-untrans
latierte Region, Introns oder die nichtkodierende 3'-Region von
Genen, bevorzugt des AtLOX5-Gens. Es ist gezeigt worden, dass
diese eine signifikante Funktionen bei der Regulation der Ge
nexpression spielen können. So wurde gezeigt, dass 5'-untrans
latierte Sequenzen die transiente Expression heterologer Gene
verstärken können. Sie können ferner die Gewebsspezifität fördern
(Rouster J et al., Plant J. 1998, 15: 435-440). Umgekehrt unter
drückt die 5'-untranslatierte Region des opaque-2 Gens die
Expression. Eine Deletion der entsprechenden Region führt zu
einer Erhöhung der Genaktivität (Lohmer S et al., Plant Cell
1993, 5: 65-73). Die unter SEQ ID NO: 1 angegebene Nukleinsäure
sequenz enthält den Abschnitt des AtLOX5-Gens, der den Promotor
und die 5'-untranslatierte Region bis vor das ATG-Startcodon
des AtLOX5 Proteins repräsentiert. Die unter SEQ ID NO: 2 und 3
angegebenen Sequenzen umfassen ebenfalls die 5'-untranslatierte
Region bis vor das ATG-Startcodon.
Die Expressionskassette kann vorteilhafterweise eine oder mehrere
sogenannte "enhancer Sequenzen" funktionell verknüpft mit dem
Promotor enthalten, die eine erhöhte transgene Expression der
Nukleinsäuresequenz ermöglichen. Auch am 3'-Ende der transgen zu
exprimierenden Nukleinsäuresequenzen können zusätzliche vorteil
hafte Sequenzen inseriert werden, wie weitere regulatorische
Elemente oder Terminatoren. Die transgen zu exprimierenden
Nukleinsäuresequenzen können in einer oder mehreren Kopien
im Genkonstrukt enthalten sein.
Als Kontrollsequenzen sind weiterhin solche zu verstehen, die
eine homologe Rekombination bzw. Insertion in das Genom eines
Wirtsorganismus ermöglichen oder die Entfernung aus dem Genom
erlauben. Bei der homologen Rekombination kann zum Beispiel
der natürliche Promotor eines bestimmten Gens gegen den AtLOX5
Promotor ausgetauscht werden. Methoden wie die cre/lox-Techno
logie erlauben eine gewebespezifische, unter Umständen induzier
bare Entfernung der Expressionskassette aus dem Genom des Wirts
organismus (Sauer B. Methods. 1998; 14 (4): 381-92). Hier werden
bestimmte flankierende Sequenzen dem Zielgen angefügt (lox-
Sequenzen), die später eine Entfernung mittels der cre-
Rekombinase ermöglichen.
Der einzuführende Promotor kann mittels homologer Rekombination
vor das transgen zu exprimierende Zielgen plaziert werden, indem
der Promotor mit DNA-Sequenzen verknüpft wird, die zum Beispiel
zu endogenen Sequenzen homolog sind, die dem Leseraster des Ziel
gens vorgelagert sind. Derartige Sequenzen sind als genetische
Kontrollsequenzen zu verstehen. Nachdem eine Zelle mit dem ent
sprechenden DNA-Konstrukt transformiert wurde, können die beiden
homologen Sequenzen interagieren und so die Promotorsequenz an
dem gewünschten Ort vor dem Zielgen platzieren, so dass die
Promotorsequenz nun in funktioneller Verknüpfung mit dem Zielgen
steht und eine erfindungsgemäße Expressionskassette bildet. Die
Auswahl der homologen Sequenzen bestimmt den Insertionsort des
Promotors. Hierbei kann die Expressionskassette durch homologe
Rekombination mittels einer einfachen oder einer doppelten-rezi
proken Rekombination generiert werden. Bei der einfach reziproken
Rekombination wird nur eine einzelne Rekombinationssequenz ver
wendet und es erfolgt Insertion der gesamten eingeführten DNA.
Bei der doppelt-reziproken Rekombination ist die einzuführende
DNA durch zwei homologe Sequenzen flankiert und es erfolgt die
Insertion des flankierten Bereiches. Letzteres Verfahren ist
geeignet, um wie oben beschrieben den natürlichen Promotor eines
bestimmten Gens gegen den AtLOX5 Promotor auszutauschen und so
den Expressionsort und -zeitpunkt dieses Gens zu modifizieren.
Die funktionelle Verknüpfung stellt eine erfindungsgemäße
Expressionskassette dar.
Zur Selektion erfolgreich homolog rekombinierter oder auch
transformierter Zellen ist es in der Regel erforderlich, einen
selektionierbaren Marker zusätzlich einzuführen, der den erfolg
reich rekombinierten Zellen eine Resistenz gegen ein Biozid
(zum Beispiel ein Herbizid), einen Metabolismusinhibitor wie
2-Desoxyglucose-6-phosphat (WO 98/45456) oder ein Antibiotikum
verleiht. Der Selektionsmarker erlaubt die Selektion der
transformierten Zellen von untransformierten (McCormick et al.,
Plant Cell Reports 5 (1986), 81-84).
Homologe Rekombination ist ein relativ seltenes Ereignis
in höheren Eukaryoten, vor allem in Pflanzen. Zufällige
Integrationen in das Wirtsgenom überwiegen. Eine Möglichkeit die
zufällig integrierten Sequenzen zu entfernen und so Zellklone mit
einer korrekten homologen Rekombination anzureichern, besteht
in der Verwendung eines sequenzspezifischen Rekombinations
systems wie in US 6,110,736 beschrieben. Dieses besteht aus drei
Elementen: zwei Paaren von spezifischen Rekombinationssequenzen
und einer sequenzspezifischen Rekombinase. Diese Rekombinase
katalysiert eine Rekombination lediglich zwischen den beiden
Paaren von spezifischen Rekombinationsequenzen. Das eine Paar
dieser spezifischen DNA-Sequenzen wird außerhalb der zu inte
grierenden DNA-Sequenz, d. h. außerhalb der beiden homologen
DNA-Sequenzen lokalisiert. Im Falle einer korrekten homologen
Rekombination werden diese Sequenzen nicht mit in das Genom über
tragen. Im Falle einer zufälligen Integration insertieren sie in
der Regel zusammen mit dem Rest des Konstruktes. Unter Einsatz
einer speziellen Rekombinase und eines Konstruktes enthaltend
ein zweites Paar der spezifischen Sequenzen können die zufällig
insertierten Sequenzen herausgeschnitten oder durch Inversion in
aktiviert werden, während die korrekt über homologe Rekombination
insertierten Sequenzen im Genom verbleiben. Eine Vielzahl von
sequenzspezifischen Rekombinationssystemen kann verwendet werden,
beispielhaft sind das Cre/lox-System des Bacteriophagen P1, das
FLP/FRT System der Hefe, die Gin Recombinase des Mu Phagen, die
Pin Rekombinase aus E. coli und das R/RS System des pSR1 Plasmids
genannt. Bevorzugt sind das Bacteriophagen P1 Cre/lox und das
Hefe FLP/FRT System. Hier interagiert die Rekombinase (Cre oder
FLP) spezifisch mit ihren jeweiligen Rekombinationssequenzen
(34bp lox-Sequenz bzw. 47bp FRT-Sequenz) um die zwischengelager
ten Sequenzen zu deletieren oder zu invertieren. Das FLP/FRT und
cre/lox Rekombinasesystem wurde bereits in pflanzlichen Systemen
angewendet (Odell et al., Mol. Gen. Genet., 223: 369-378, 1990).
Als Kontrollsequenzen geeignete Polyadenylierungssignale sind
pflanzliche Polyadenylierungssignale, vorzugsweise solche, die
im wesentlichen T-DNA Polyadenylierungssignale aus Agrobacterium
tumefaciens, insbesondere des Gens 3 der T-DNA (Octopin Synthase)
des Ti-Plasmids pTiACHS entsprechen (Gielen et al., EMBO J. 3
(1984), 835 ff) oder funktionelle Äquivalente davon. Beispiele
für besonders geeignete Terminatorsequenzen sind der OCS (Octo
pin-Synthase)-Terminator und der NOS (Nopalin-Synthase)-Termina
tor.
Die erfindungsgemäßen Expressionskönstrukte und die von ihnen
abgeleiteten Vektoren können weitere Funktionselemente enthalten.
Der Begriff Funktionselement ist breit zu verstehen und meint all
solche Elemente, die einen Einfluss auf Herstellung, Vermehrung
oder Funktion der erfindungsgemäßen Expressionskonstrukte oder
von diesen abgeleitete Vektoren oder Organismen haben. Beispiel
haft aber nicht einschränkend seien zu nennen:
- a) Selektionsmarker sind in der Regel erforderlich, um erfolg
reich homolog rekombinierte oder transformierte Zellen zu
selektionieren. Der mit dem Expressionskonstrukt eingebrachte
selektionierbaren Marker verleiht den erfolgreich rekombi
nierten oder transformierten Zellen eine Resistenz gegen
ein Biozid (zum Beispiel ein Herbizid wie Phosphinotricin,
Glyphosat oder Bromoxynil), einen Metabolismusinhibitor
wie 2-Desoxyglucose-6-phosphat (WO 98/45456) oder ein
Antibiotikum, wie zum Beispiel Kanamycin, G 418, Bleomycin,
Hygromycin, verleiht. Der Selektionsmarker erlaubt die
Selektion der transformierten Zellen von untransformierten
(McCormick et al., Plant Cell Reports 5 (1986), 81-84).
Besonders bevorzugte Selektionsmarker sind solche die
eine Resistenz gegen Herbizide verleihen. Beispielhaft
als Selektionsmarker seien genannt:
- - DNA Sequenzen, die für Phosphinothricinacetyltransferasen (PAT) kodieren, welche die freie Aminogruppe des Glutaminsynthaseinhibitors Phosphinothricin (PPT) acetylierten und damit eine Detoxifizierung des PPT erreicht (de Block et al. 1987, EMBO J. 6, 2513-2518) (auch Bialophos®resistenzgen (bar) genannt)
- - 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphatsynthasegene (EPSP Synthasegene), die eine Resistenz gegen Glyphosat® (N-(phosphonomethyl)glycin) verleihen,
- - das für das Glyphosat® degradierende Enzyme kodierende gox Gen (Glyphosatoxidoreduktase),
- - das deh Gen (kodierend für eine Dehalogenase, die Dalapon® inaktiviert),
- - Sulfonylurea- und Imidazolinon inaktivierende Aceto lactatsynthasen
- - bxn Gene, die für Bromoxynil® degardierende Nitrilase enzyme kodieren
- - das Kanamycin- bzw. G418-Resistenzgen (NPTII). Das NPTII Gen codiert für eine Neomycinphosphotransferase, die durch eine Phosphorylierungsreaktion die inhibierende Wirkung von Kanamycin, Neomycin, G418 und Paromomycin reduziert.
- - das DOGR1-Gen. Das Gen DOGR1 wurde aus der Hefe Saccharo myces cerevisiae isoliert (EP 0 807 836). Es codiert für eine 2-Desoxyglukose-6-phosphat Phosphatase, die Resistenz gegenüber 2-DOG verleiht (Randez-Gil et al. 1995, Yeast 11, 1233-1240).
- b) Reportergene, die für leicht quantifizierbare Proteine
kodieren und über Eigenfarbe oder Enzymaktivität eine
Bewertung der Transformationseffizienz, des Expressionsortes
oder -zeitpunktes gewährleisten. Ganz besonders bevorzugt
sind dabei Gene kodierend für Reporter-Proteine (siehe auch
Schenborn E, Groskreutz D. Mol Biotechnol. 1999; 13 (1): 29-44)
wie
- - "green fluorescence protein" (GFP) (Chui WL et al., Curr Biol 1996, 6: 325-330; Leffel SM et al., Biotechniques. 23 (5): 912-8, 1997; Sheen et al. (1995) Plant Journal 8 (5): 777-784; Haseloff et al. (1997) Proc Natl Acad Sci USA 94 (6): 2122-2127; Reichel et al. (1996) Proc Natl Acad Sci USA 93 (12): 5888-5893; Tian et al. (1997) Plant Cell Rep 16: 267-271; WO 97/41228).
- - Chloramphenicoltransferase,
- - Luziferase (Millar et al., Plant Mol Biol Rep 1992 10: 324-414; Ow et al. (1986) Science, 234: 856-859); erlaubt Bioluminescenzdetektion.
- - β-Galactosidase, kodiert für ein Enzym für das ver schiedenen chromogene Substrate zur Verfügung stehen.
- - β-Glucuronidase (GUS) (Jefferson et al., EMBO J. 1987, 6, 3901-3907) oder das uidA Gen, das ein Enzym für ver schiedene chromogene Substrate kodiert.
- - R-Locus Genprodukt : Protein, das die Produktion von Anthocyaninpigmenten (rote Färbung) in pflanzlichen Gewebe reguliert und so eine direkte Analyse der Promotoraktivität ohne Zugabe zusätzlicher Hilfsstoffe oder chromogener Substrate ermöglicht (Dellaporta et al., In: Chromosome Structure and Function: Impact of New Concepts, lBth Stadler Genetics Symposium, 11: 263-282, 1988).
- - β-Lactamase (Sutcliffe (1978) Proc Natl Acad Sci USA 75: 3737-3741), Enzym für verschiedene chromogene Substrate (z. B. PADAC, eine chromogenes Cephalosporin).
- - xylE Genprodukt (Zukowsky et al. (1983) Proc Natl Acad Sci USA 80: 1101-1105), Catecholdioxygenase, die chromo gene Catechole umsetzen kann.
- - Alpha-Amylase (Ikuta et al. (1990) Bio/technol. 8: 241-242).
- - Tyrosinase (Katz et al. (1983) J Gen Microbiol 129: 2703-2714), Enzym, das Tyrosin zu DOPA und Dopaquinon oxidiert, die infolge das leicht nachweisbare Melanin bilden.
- - Aequorin (Prasher et al. (1985) Biochem Biophys Res Commun 126 (3): 1259-1268), kann in der Calcium-sensitiven Bioluminescenzdetektion verwendet werden.
- c) Replikationsursprünge, die eine Vermehrung der erfindungs gemäßen Expressionskonstrukte oder Vektoren in zum Beispiel E. coli gewährleisten. Beispielhaft seien genannt ORI (origin of DNA replication), der pBR322 ori oder der P15A ori (Sambrook et al.: Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).
- d) Elemente zum Beispiel "Bordersequenzen", die einen Agro bakterien-vermittelte Transfer in Pflanzenzellen für die Übertragung und Integration ins Pflanzengenom ermöglichen, wie zum Beispiel die rechte oder linke Begrenzung der T-DNA oder die vir-Region.
- e) Multiple Klonierungsregionen (MCS) erlauben und erleichtern die Insertion eines oder mehrerer Nukleinsäuresequenzen. Bezüglich der Nukleinsäurekodierend für die DI-RNA kann die MCS kann theoretisch innerhalb unterschiedlicher Regionen der cDNA liegen. Bevorzugt wird jedoch die Region zwischen dem 1. und 2. Segment der DI-RNA. Dies ist günstig für die Stabilität des Konstruktes.
Die Spezifität der erfindungsgemäßen Expressionskonstrukte und
Vektoren für die Keimblätter bzw. des Embryos als solchen ist
besonders vorteilhaft. Die pflanzlichen Keimblätter sind das
Hauptspeicherorgan bei z. B. Ölsaatpflanzen und somit bevorzugter
Angriffspunkt von Schädlingen aber auch besonders empfindlich
gegen Umweltschäden. Bekannt ist die Akkumulation von Glucosino
laten in Pflanzen der Gattung der Cardales insbesondere der
Ölsaaten zum Schutz vor Schädlingen (L. Rask et al.; Plant
Molecular biology (2000) 42, 93-113 and R. Menard et al.; Phyto
chemistry (1999) 52, 29-35). Oft sind die natürlichen Abwehr
mechanismen der Pflanze zum Beispiel gegen Pathogene unzu
reichend. Die Einführung fremder Gene aus Pflanzen, Tieren, oder
mikrobiellen Quellen kann die Abwehr verstärken. Beispiel sind
der Schutz gegen Insektenfrass in Tabak durch Expression des
Bacillus thuringiensis Endotoxin unter Kontrolle des 35 S CaMV
Promotors (Vaeck et al., Nature 1987, 328, 33-37) oder der Schutz
des Tabaks gegen Pilzbefall durch Expression einer Chitinase aus
der Bohne unter Kontrolle des CaMV Promotors (Broglie et al.,
Science 1991, 254, 1194-1197).
Für eine hohe Effizienz solcher gentechnischer Ansätze ist
eine konzentrierte Expression der entsprechenden transgen zu
exprimierenden Nukleinsäuresequenz vor allem in den Keimblättern
bzw. dem gesamten Keimling. Eine konstitutive Expression in der
gesamten Pflanze kann den Effekt zum Beispiel durch eine Ver
dünnung in Frage stellen oder das Wachstum der Pflanze bzw.
die Qualität des Pflanzenproduktes beeinträchtigen. Im Falle der
Akkumulation von Glucosinolaten zum Schutz vor Freßfeinden kann
ein gesteigerter bzw. veränderter Metabolismus in der gesamten
Pflanze gravierende Auswirkungen auf die Wüchsigkeit haben
(Reintanz B et al. (2001) Plant Cell 13: 351-367). Eine auf die
Keimblätter oder den Embryo beschränkte Expression ist hier
besonders vorteilhaft, um diese Nebeneffekte gering zu halten.
Außerdem kann es durch eine konstitutive Expression verstärkt zum
Abschalten des Transgens kommen ("gene silencing"). Hierzu sind
Promotoren mit Spezifität für den Keimling besonders vorteilhaft,
Promotoren mit Spezifität für die Keimblätter sind ganz besonders
vorteilhaft.
Dem Fachmann ist eine Vielzahl von Nukleinsäuren bzw. Proteinen
bekannt, deren rekombinante Expression in den embryonalen Keim
blättern vorteilhaft sind. Ferner sind dem Fachmann eine Vielzahl
von Genen bekannt, durch deren Reprimierung oder Ausschaltung
mittels Expression einer entsprechenden antisense-RNA ebenfalls
vorteilhafte Effekte erreicht werden können. Beispielhaft jedoch
nicht einschränkend für vorteilhafte Effekte seien zu nennen:
- - Erzielen einer Resistenz gegen ablotische Stressfaktoren (Hitze, Kälte, Trockenheit, erhöhte Feuchtigkeit, Umwelt gifte, UV-Strahlung)
- - Erzielen einer Resistenz gegen biotische Stressfaktoren (Pathogene, Viren, Insekten und Krankheiten)
- - Verbesserung von Nahrungs- oder Futtereigenschaften
- - Verbesserung der Wachstumsrate oder des Ertrages.
Für die in diesen Anwendungen einsetzbarer Nukleinsäuresequenzen
oder Polypeptide seien beispielhaft aber nicht einschränkend zu
nennen:
- 1. Verbesserter Schutz des pflanzlichen Embryos gegen ablotische Stressfaktoren wie Trockenheit, Hitze, oder Kälte zum Bei spiel durch Überexpression von dem "antifreeze polypeptides aus Myoxocephalus Scorpius (WO 00/00512); Myoxocephalus octodecemspinosus, dem Arabidopsis thaliana Transkriptions aktivator CBF1, Glutamatdehydrogenasen (WO 97/12983, WO 98/11240), einem späten Embryogenesegen (LEA) zum Beispiel aus Gerste (WO 97/13843), Calcium-abhängigen Proteinkinase genen (WO 98/26045), Calcineurinen (WO 99/05902), Farnesyl transferasen (WO 99/06580), Pei ZM et al., Science 1998, 282: 287-290), Ferritin (Deak M et al., Nature Biotechnology 1999, 17: 192-196), Oxalatoxidase (WO 99/04013; Dunwell JM Bio technology and Genetic Engeneering Reviews 1998, 15: 1-32), DREBIA-Faktor (dehydration response element B 1A; Kasuga M et al., Nature Biotechnology 1999, 17: 276-286), Genen der Mannitol- oder Trehalosesynthese wie der Trehalosephosphat synthase oder der Trehalosephosphatphosphatase (WO 97/42326), oder durch Inhibition von Genen wie der Trehalase (WO 97/50561). Besonders bevorzugt sind Nukleinsäuren, die für den transkriptionellen Aktivator CBF1 aus Arabidopsis thaliana (GenBank Acc.-No.: U77378) oder das "antifreeze protein" aus Myoxocephalus octodecemspinosus (GenBank Acc.-No.: AF306348) oder funktionelle Äquivalente derselben kodieren.
- 2. Modifikation der Speicherreserven, zum Beispiel Stärke- oder Lipidmodifikation, durch Expression von bestimmten Enzymen zur Initiierung von Fermentationsprozessen nach dem Maischen des Saatgutes. Vorteilhaft ist hier besonders die in dem intakten Saatkorn unterschiedliche Kompartimentierung der Speicherreserven in den Keimblätternund der zu exprimierenden Enzyme im Endosperm, die erst durch einen Prozess wie das Maischen miteinander in Kontakt gebracht werden. Beispiele sind eine verbesserte Mobilisierung der Stärke durch Expression einer Stärkeinvertase aus Hefe oder die Modi fikation des Lipidgehaltes durch Expression von Lipasen, bevorzugt von Triacylglycerol-Lipasen. Besonders bevorzugt sind Nukleinsäuren die für das tglA Gen der Triacylglycerol- Lipase aus Aspergillus oryzae (GenBank Acc.-No.: AB039325) oder die SUC2 Invertase aus Saccharomyces cerevisiae (GenBank Acc.-No.: V01311) oder funktionelle Äquivalente derselben kodieren.
- 3. Expression von Stoffwechselenzymen zur Verwendung im Futter- und Nahrungsmittelbereich, zum Beispiel die Expression von Phytase und Cellulasen. Besonders bevorzugt sind Nuklein säuren wie die künstliche für eine mikrobielle Phytase kodierende cDNA (GenBank Acc.-No.: A19451) oder funktionelle Äquivalente derselben.
- 4. Erreichen einer Resistenz zum Beispiel gegen Pilze, Insekten, Nematoden und Krankheiten durch gezielte Absonderung oder Anreicherung bestimmter Metaboliten oder Proteine in der Epidermis des Embryos. Beispielhaft seien genannt Glucosinolate (Abwehr von Herbivoren), Chitinasen oder Glucanasen und andere Enzyme die die Zellwand von Parasiten zerstören, Ribosom-inaktivierende Proteine (RIPs) und andere Proteine der pflanzlichen Resistenz- und Stressreaktion, wie sie bei Verletzung oder mikrobiellen Befall von Pflanzen oder chemisch durch zum Beispiel Salicylsäure, Jasmonsäure oder Ethylen induziert werden, Lysozyme aus nicht-pflanzlichen Quellen wie zum Beispiel T4 Lysozym oder Lysozm aus ver schiedenenen Säugern, insektizide Proteine wie Bacillus thuringiensis Endotoxin, α-Amylaseinhibitor oder Protease inhibitoren (cowpea Trypsininhibitor), Glucanasen, Lectine wie Phytohemagglutinin, Schneeglöckchenlectin, Weizenkeim agglutinin, RNAsen oder Ribozyme. Besonders bevorzugt sind Nukleinsäuren, die für die chit42 Endochitinase aus Trichoderma harzianum (GenBank Acc.-No.: 578423) oder für das N-hydroxylierende, multifunktionelle Cytochrom P-450 (CYP79) Proteine aus Sorghum bicolor (GenBank Acc.-No.: U32624) oder funktionelle Äquivalente derselben kodieren.
- 5. Erzeugen von konjugierten Fettsäuren, Hydroxyfettsäuren bzw. Peroxiden im Samenöl mit dem Ziel das Öl als Industrie rohstoff zum Erhalt dieser Substanzen bzw. zur Weiter verarbeitung zu Lacken und Linoleum zum Beispiel durch Expression einer Lipoxygenase. Bevorzugt sind Nukleinsäuren wie die AtLOX5 (Genbank Acc.No. AJ302043) oder eine Lipoxy genase aus Gurke (Patent Nr. WO0060093, Genbank Acc.No. X92890).
- 6. Erreichen von höheren Lipidgehalten durch
- a) niedrigere Stärkegehalte in Zellen des Keimlings durch Inhibierung von Enzymen des Kohlenhydratstoffwechsels, zum Beispiel durch anti-sense expression der cDNA von ADP-glucose-pyrophosphorylasen oder durch
- b) veränderte z. B. niedrigere Proteingehalte in Zellen des Keimlings durch Inhibierung von Speicherproteingenen wie cruciferin. Bevorzugt sind Nukleinsäuren wie die ADP glucose-phosphorylase aus Brassica napus (WO 9911805, Genbank Acc.No. AJ271162) oder Cruciferin A aus Brassica napus (Genbank Acc.No. X14555)
- 7. Erreichen einer erhöhten Speicherfähigkeit in Zellen des Keimlings, die normalerweise weniger Speicherproteine oder -lipide enthalten mit dem Ziel, den Ertrag an diesen Substan zen zu erhöhen, zum Beispiel durch Expression eine Acetyl-CoA Carboxylase. Bevorzugt sind Nukleinsäuren, die für die Acetyl-CoA Carboxylase (Accase) aus Medicago sativa (GenBank Acc.-No.: L25042) oder funktionelle Äquivalente derselben kodieren.
- 8. Expression von Genen, die eine Akkumulation von Fein chemikalien, wie von Tocopherolen, Tocotrienolen oder Carotinoiden im Samen bzw. in den Keimblättern bewirken. Beispielhaft sei die Phytoendesaturase genannt. Bevorzugt sind Nukleinsäuren, die für die Phytoendesaturase aus Narcissus pseudonarcissus (GenBank Acc.-No.: X78815) oder funktionelle Äquivalente derselben kodieren.
- 9. Verlängern oder Aufheben der Ruhephase durch Expression von Transkriptionsfaktoren, die in die Regulation von Dormanz relevanten Genen eingreifen. Beispielhaft sei die Über expression des ABI3 Proteins (abscisic acid insensitive gene) oder des Viviparous-1 Protein (VP-1) zu nennen. Die Keimzeit veränderung kann eine Ertragserhöhung und eine verkürzte Embryonalentwicklung bedingen. Bevorzugt sind Nukleinsäuren, die für das Viviparous-1 Protein aus Zea mays (GenBank Acc.- No.: M60214) oder das ABI3 Protein (abscisic acid insensitive gene) aus Arabidopsis thaliana (GenBank Acc.-No.: X68141) oder funktionelle Äquivalente derselben kodieren.
- 10. Erzeugung von sterilen Pflanzen durch Verhinderung der Befruchtung und/oder der Keimung mit Hilfe cler Expression eines geeigneten Inhibitors zum Beispiel eines Toxins im Samen.
- 11. Produktion von Neutraceuticals wie zum Beispiel poly ungesättigten Fettsäuren wie beispielsweise Arachidonsäure oder EP (Eicosapentaensäure) oder DHA (Docosahexaensäure) durch Expression von Fettsäureelongasen und/oder -desaturasen oder Produktion von Proteinen mit verbessertem Nahrungswert wie zum Beispiel mit einem hohen Anteil an essentiellen Aminosäuren (z. B. das methioninreiche 2S Albumingens der Brasilnuss). Bevorzugt sind Nukleinsäuren, die für das methioninreiche 2S Albumin aus Bertholletia excelsa (GenBank Acc.-No.: AB044391), die Δ6-Acyllipiddesaturase aus Physco mitrella patens (GenBank Acc.-No.: AJ222980; Girke et al 1998, The Plant Journal 15: 39-48), die Δ6-Desaturase aus Mortierella alpina (Sakuradani et al 1999 Gene 238: 445-453), die Δ5-Desaturase aus Caenorhabditis elegans (Michaelson et al. 1998, FEBS Letters 439: 215-218), die Δ5-Fettsäure desaturase (des-5) aus Caenorhabditis elegans (GenBank Acc.- No.: AF078796), die Δ5-Desaturase aus Mortierella alpina (Michaelson et al. JBC 273: 19055-19059), die Δ6-Elongase aus Caenorhabditis elegans (Beaudoin et al. 2000, PNAS 97: 6421-6426), die Δ6-Elongase aus Physcomitrella patens (Zank et al. 2000, Biochemical Society Transactions 28: 654-657) oder funktionelle Äquivalente derselben kodieren.
- 12. Produktion von Pharmazeutika, wie zum Beispiel Antikörpern oder Vakzinen wie beschrieben bei Hood EE, Jilka JM. Curr Opin Biotechnol. 1999 Aug; 10 (4): 382-6; Ma JK, Vine ND. Curr Top Microbiol Immunol. 1999; 236: 275-92.
- 13. Modifikation des Faseranteils in Nahrungsmitteln auf Samenbasis durch zum Beispiel Expression von antisense- Transkripten der Coffeinsäure-O-methyltransferase oder des Cinnamoylalkoholdehydrogenase Gens.
- 14. Inhibition der Reifung des Keimlings durch Expression von zum Beispiel Ribonukleasegenen oder Transkriptionsfaktoren zum Erzielen einer erhöhten Samengrösse, zur Reduktion der relativen Biomasse der Samenhülle und zur Erleichterung der Enthüllung des Samens. Beispielhaft sei hier eine Über expression des ANT (AINTEGUMENTA) Gens genannt. Bevorzugt sind Nukleinsäuren, die für das AINTEGUMENTA Gen aus Arabi dopsis thaliana (GenBank Acc.-No.: U40256) oder funktionelle Äquivalente desselben kodieren.
Weitere Beispiele für vorteilhafte Gene sind zum Beispiel genannt
bei Dunwell JM, Transgenic approaches to crop improvement, J Exp
Bot. 2000; 51 Spec No; Seite 487-96.
Ferner können funktionelle Analoga der genannten Nukleinsäuren
bzw. Proteine exprimiert werden. Funktionelle Analoga meint hier
all die Sequenzen, die im wesentlichen die gleiche Funktion haben
d. h. zu der Funktion (zum Beispiel einer Substratumsetzung oder
einer Signaltransduktion) befähigt sind wie auch das beispielhaft
genannte Protein. Dabei kann das funktionelle Analogon sich in
anderen Merkmalen durchaus unterscheiden. Es kann zum Beispiel
eine höhere oder niedrigere Aktivität haben oder auch über
weitere Funktionalitäten verfügen.
Funktionelle Analoga meint ferner Sequenzen, dis für Fusions
proteine bestehend aus einem der bevorzugten Proteine und anderen
Proteinen zum Beispiel einem weiteren bevorzugten Protein oder
aber auch einer Signalpeptidsequenz kodieren.
Die Expression des Zielgenes ist in jedem gewünschten Zell
kompartiment, wie z. B. dem Endomembransystem, der Vakuole und
den Chloroplasten möglich. Durch Nutzung des sekretorischen Weges
sind gewünschte Glykosylierungsreaktionen, besondere Faltungen
u. ä. möglich. Auch die Sekretion des Zielproteins zur Zell
oberfläche bzw. die Sezernierung ins Kulturmedium, beispielsweise
bei Nutzung suspensionskultivierter Zellen oder Protoplasten ist
möglich. Die dafür notwendigen Targetsequenzen können sowohl in
einzelnen Vektorvariationen berücksichtigt werden als auch durch
Verwendung einer geeigneten Klonierungsstrategie gemeinsam mit
dem zu klonierenden Zielgen in den Vektor mit eingebracht werden.
Als Targetsequenzen können sowohl Gen eigene, sofern vorhanden,
oder heterologe Sequenzen genutzt werden. Zusätzliche, heterologe
zur funktionellen Verknüpfung bevorzugte aber nicht darauf be
schränkte Sequenzen sind weitere Targeting-Sequenzen zur Gewähr
leistung der subzellulären Lokalisation im Apoplasten, in der
Vakuole, in Plastiden, im Mitochondrium, im Endoplasmatischen
Retikulum (ER), im Zellkern, in Ölkörperchen oder anderen
Kompartimenten; sowie Translationsverstärker wie die 5'-Leader
sequenz aus dem Tabak-Mosaik-Virus (Gallie et al., Nucl. Acids
Res. 15 (1987), 8693-8711) und dergleichen. Das Verfahren, an
sich nicht in den Plastiden lokalisierte Proteine, gezielt in die
Plastiden zu transportieren ist beschrieben (Klosgen RB und Weil
JH (1991) Mol Gen Genet 225 (2): 297-304; Van Breusegem F et al.
(1998) Plant Mol Biol. 38 (3): 491-496). Bevorzugte Sequenzen sind:
- a) kleine Untereinheit (SSU) der Ribulosebisphosphatcarboxylase (Rubisco ssu) aus Erbse, Mais, Sonnenblume,
- b) Transitpeptide abgeleitet von Genen der pflanzlichen Fett säurebiosynthese wie das Transitpeptid des plastidären "Acyl Carrier Protein" (ACP), die Stearyl-ACP-Desaturase, β-Keto acyl-ACP Synthase oder die Acyl-ACP-Thioesterase,
- c) das Transitpeptid für GBSSI ("Starch Granule Bound Synthase L"),
- d) LHCP II Gene.
Die Zielsequenzen können mit anderen, von dem Transitpeptid
kodierenden Sequenzen verschiedenen, Targeting-Sequenzen
verknüpft sein, um eine subzellulären Lokalisation im Apo
plasten, in der Vakuole, in Plastiden, im Mitochondrium, im
Endoplasmatischen Retikulum (ER), im Zellkern, in Ölkörperchen
oder anderen Kompartimenten zu gewährleisten. Ferner können
sowie Translationsverstärker wie die 5'-Leadersequenz aus dem
Tabak-Mosaik-Virus (Gallie et al., Nucl. Acids Res. 15 (1987),
8693-8711) und dergleichen zum Einsatz kommen.
Dem Fachmann ist ferner bekannt, dass er die oben beschriebenen
Gene nicht direkt unter Verwendung der für diese Gene kodierenden
Nukleinsäuresequenzen exprimieren oder zum Beispiel durch anti
sense reprimieren muss. Er kann auch zum Beispiel künstliche
Transkriptionsfaktoren vom Typ der Zinkfingerproteine verwenden
(Beerli RR et al., Proc Natl Acad Sci USA 2000; 97 (4): 1495-500).
Diese Faktoren lagern sich in den regulatorischen Bereichen der
zu exprimierenden oder zu reprimierenden endogenen Gene an und
bewirken, je nach Gestaltung des Faktors, eine Expression oder
Repression des endogenen Gens.
Die erfindungsgemäßen Expressionskonstrukte können ebenso zur
Unterdrückung bzw. Reduktion von Replikation oder/und Translation
von Targetgenen durch "gene silencing" eingesetzt werden. Die
erfindungsgemäß bevorzugte Strategie umfasst die Verwendung von
Nukleinsäuresequenzen eingefügt in eine transgene DI-RNA, welche
zu einer antisense-Nukleinsäuresequenz transkribierbar sind, die
beispielsweise zur Verminderung der Expression eines Zielprotein
befähigt sind.
Bevorzugte Gene bzw. Proteine, deren Suppression einen vorteil
haften Phänotyp bedingt, sind dem Fachmann bekannt und umfassen
beispielhaft, aber nicht einschränkend:
- 1. Zum Erreichen von höheren Lipidgehalten durch
- a) niedrigere Stärkegehalte in Zellen des Keimlings durch Inhibierung von Enzymen des Kohlenhydratstoffwechsels, zum Beispiel durch anti-sense Expression der cDNA von ADP-glucose-pyrophosphorylasen oder durch
- b) veränderte z. B. niedrigere Proteingehalte in Zellen des Keimlings durch Inhibierung von Speicherproteingenen wie cruciferin. Bevorzugt sind Nukleinsäuren wie die ADP- Glucose-phosphorylase aus Brassica napus (WO9911805, Genbank Acc.-No. AJ271162)oder Cruciferin A aus Brassica napus (Genbank Acc.-No. X14555). Suppression der Δ-12-Desaturasen in Brassica napus bzw. B. juncea (Genbank Acc-No. X91139) zur Erzeugung von Hoch-Öl säurevarietäten (P. A. Stoutjesdijk et al. (2000) Biochem Soc Transactions 28: 938-940).
Eine "antisense" Nukleinsäure meint zunächst eine Nuklein
säuresequenz die ganz oder teilweise zu zumindest einem Teil
des "sense"-Stranges besagten Zielproteins komplementär ist.
Dem Fachmann ist bekannt, dass er alternative cDNA oder das
korrespondierendes Gen als Ausgangsmatrize für entsprechende
antisense-Konstrukte verwenden kann. Bevorzugt ist die "anti
sense" Nukleinsäure komplementär zu dem kodierenden Bereich des
Zielproteins oder einem Teil desselben. Die "antisense" Nuklein
säure kann aber auch zu der nicht-kodierenden Region oder einem
Teil derselben komplementär sein. Ausgehend von der Sequenz
information zu einem Zielprotein, kann eine antisense Nuklein
säure unter Berücksichtigung der Basenpaarregeln von Watson und
Crick in der dem Fachmann geläufigen Weise entworfen werden. Eine
antisense Nukleinsäure kann komplementär zu der gesamten oder
einem Teil der Nukleinsäuresequenz eines Zielproteins sein. In
einer bevorzugten Ausführungsform ist die antisense Nukleinsäure
ein Oliginukleotid mit einer Länge von zum Beispiel 15, 20, 25,
30, 35, 40, 45 oder 50 Nukleotiden.
Die antisense Nukleinsäure umfasst in einer bevorzugten Aus
führungsform α-anomere Nukleinsäuremoleküle. α-Anomere Nuklein
säuremoleküle bilden besondere doppelsträngige Hybride mit
komplementärer RNA in denen im Unterschied zu den normalen
β-Einheiten die Stränge parallel zu einander verlaufen (Gaultier
et al. (1987) Nucleic Acids. Res. 15: 6625-6641).
Ebenso umfasst ist die Verwendung der oben beschriebenen
Sequenzen in sense-Orientierung, was wie dem Fachmann geläufig
ist, zu einer Kosuppression führen kann. In Tabak, Tomate und
Petunie ist demonstriert worden, dass die Expression von sense-
RNA zu einem endogenen Gen, die Expression desselben vermindern
oder ausschalten kann, ähnlich wie es für antisense Ansätze
beschrieben wurde (Goring et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA,
88: 1770-1774, 1991; Smith, Watson, Bird. Ray. Schuch, Grierson,
Mol. Gen. Genet., 224: 447-481, 1990.; Napoli, Lemieux, Jorgensen,
Plant Cell, 2: 279-289, 1990; Van der Krol, Mur, Beld, Mol,
Stuitje, Plant Cell, 2: 291-99, 1990). Dabei kann das ein
geführte Konstrukt das zu vermindernde Gen ganz oder nur teil
weise representieren. Die Möglichkeit zur Translation ist nicht
erforderlich.
Ganz besonders bevorzugt ist auch die Verwendung von Verfahren
wie der Genregulation mittels doppelsträngiger BNA ("double
stranded RNA interference"). Entsprechende Verfahren sind dem
Fachmann bekannt und im Detail beschrieben (z. B. Matzke MA et al.
(2000) Plant Mol Biol 43: 401-415; Fire A. et al (1998) Nature
391: 806-811; WO 99/32619; WO 99/53050; WO 00/68374; WO 00/44914;
WO 00/44895; WO 00/49035; WO 00/63364). Auf die in den ange
gebenen Zitaten beschriebenen Verfahren und Methoden wird aus
drücklich Bezug genommen. Hier wird durch gleichzeitige Ein
bringung von Strang- und Gegenstrang eine hocheffiziente Unter
drückung nativer Gene bewirkt.
Vorteilhaft kann die antisense-Strategie mit einem Ribozym-Ver
fahren gekoppelt werden. Ribozyme sind katalytisch aktive RNA
Sequenzen, die gekoppelt an die antisense Sequenzen, die Ziel
sequenzen katalytisch spalten (Tanner NK. FEMS Microbiol Rev.
1999; 23 (3): 257-75). Dies kann die Effizienz einer anti-sense
Strategie erhöhen. Die Expression von Ribozymen zur Verminderung
bestimmter Proteine ist dem Fachmann bekannt und beispiels
weise beschrieben in EP-A1 0 291 533, EP-A1 0 321 201 und
EP-A1 0 360 257. Geeignete Zielsequenzen und Ribozyme können zum
Beispiel wie bei Steinecke (Ribozymes, Methods in Cell Biology
50, Galbraith et al eds Academic Press, Inc. (1995), 449-460)
beschrieben, durch Sekundärstrukturberechnungen von Ribozym- und
Ziel-RNA sowie durch deren Interaktion bestimmt werden (Bayley CC
et al., Plant Mol Biol. 1992; 18 (2): 353-361; Lloyd AM and Davis
RW et al., Mol Gen Genet. 1994 Mar; 242 (6): 653-657). Beispielhaft
sind "hammerhead"-Ribozyme zu nennen (Haselhoff and Gerlach
(1988) Nature 334: 585-591). Bevorzugte Ribozyme basieren
auf Derivaten der Tetrahymena L-19 IVS RNA (US 4,987,071;
US 5,116,742). Weitere Ribozyme mit Selektivität für eine L119
mRNA können selektioniert werden (Bartel D und Szostak JW (1993)
Science 261: 1411-1418).
In einer weiteren Ausführungsform kann Verminderung der Ziel
protein-Expression unter Verwendung von Nukleinsäuresequenzen
bewirkt werden, die komplementär zu regulativen Elementen
der Zielprotein-Gene sind, mit diesen eine triple-helikale
Struktur ausbilden und so die Gen-Transkription verhindern
(Helene C (1991) Anticancer Drug Des. 6 (6): 569-84; Helene C et
al. (1992) Ann NY Acad Sci 660: 27-36; Maher LJ (1992) Bioassays
14 (12): 807-815).
Dem Fachmann sind verschiedene Wege bekannt, um zu einer
erfindungsgemäßen Expressionskassette zu gelangen.
Die Herstellung einer erfindungsgemäßen Expressionskassette
erfolgt beispielsweise durch Fusion des AtLOX5-Promotors oder
eines funktionellen Äquivalentes oder funktionell äquivalenten
Teils gemäß SEQ-ID NO: 1 oder eines funktionellen Äquivalentes
mit einer zu exprimierenden Nukleotidsequenz, gegebenenfalls
einer für eine Transitpeptid kodierenden Sequenz, vorzugsweise
ein chloroplastenspezifisches Transitpeptid, welches vorzugs
weise zwischen dem Promotor und der jeweiligen Nukleotid
sequenz angeordnet ist, sowie einem Terminator- oder Poly
adenylierungssignal. Dazu verwendet man gängige Rekombinations-
und Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in T. Maniatis,
E. F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY
(1989) sowie in T. J. Silhavy, M. L. Berman und L. W. Enquist,
Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory,
Cold Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F. M. et al.,
Current Protocols in Molecular Biology, Greene Fublishing
Assoc. and Wiley Interscience (1987) beschrieben sind.
Unter einer Expressionskassette sind aber auch solche
Konstruktionen zu verstehen, bei denen der Promotor, ohne
dass er zuvor mit einer zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz
funktionell verknüpft wurde, zum Beispiel über eine gezielte
homologe Rekombination oder eine zufällige Insertion in ein.
Wirtsgenom eingeführt wird, dort regulatorische Kontrolle über
mit ihm dann funktionell verknüpfte Nukleinsäureaequenzen über
nimmt und die transgene Expression derselben steuert. Durch
Insertion des Promotors - zum Beispiel durch eine homologe
Rekombination - vor eine für ein bestimmtes Polypeptid kodierende
Nukleinsäure erhält man eine erfindungsgemäße Expressions
kassette, die die Expression des bestimmten Polypeptides selektiv
in den Keimblättern des pflanzlichen Embryos steuert. Ferner kann
die Insertion des Promotors auch derart erfolgen, dass antisense-
RNA zu der für ein bestimmtes Polypeptid kodierenden Nuklein
säure exprimiert wird. Damit wird selektiv die Expression des
bestimmten Polypeptides in den Keimblättern des pflanzlichen
Embryos herunterreguliert oder ausgeschaltet.
Analog kann auch eine transgen zu exprimierende Nukleinsäure
sequenz zum Beispiel durch eine homologe Rekombination hinter den
endogenen, natürlichen AtLOX5-Promotor plaziert werden, wodurch
man eine erfindungsgemäße Expressionskassette erhält, die die
Expression der transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz in
den Keimblättern des pflanzlichen Embryos steuert.
Erfindungsgemäß sind ferner Vektoren, die die oben beschriebenen
Expressionskonstrukte enthalten. Vektoren können beispielhaft
Plasmide, Cosmide, Phagen, Viren oder auch Agrobacterien sein.
Ein anderer Gegenstand der Erfindung betrifft transgene
Organismen, transformiert mit wenigstens einer erfindungs
gemäßen Expressionskassette oder einem erfindungsgemäßen Vektor,
sowie Zellen, Zellkulturen, Gewebe, Teile - wie zum Beispiel bei
pflanzlichen Organismen Blätter, Wurzeln usw. - oder Vermehrungs
gut abgeleitet von solchen Organismen.
Unter Organismus, Ausgangs- oder Wirtsorganismen werden pro
karyotische oder eukaryotische Organismen, wie beispielsweise
Mikroorganismen oder pflanzliche Organismen verstanden. Bevor
zugte Mikroorganismen sind Bakterien, Hefen, Algren oder Pilze.
Bevorzugte Bakterien sind Bakterien der Gattung Escherichia,
Erwinia, Agrobacterium, Flavobacterium, Alcaligenes oder Cyano
bakterien zum Beispiel der Gattung Synechocystis.
Bevorzugt sind vor allem Mikroorganismen, welche zur Infektion
von Pflanzen und damit zur Übertragung der erfindungsgemäßen
Konstrukte befähigt sind. Bevorzugte Mikroorganismen sind solche
aus der Gattung Agrobacterium und insbesondere der Art Agro
bacterium tumefaciens.
Bevorzugte Hefen sind Candida, Saccharomyces, Hansenula oder
Pichia.
Bevorzugte Pilze sind Aspergillus, Trichoderma, Ashbya,
Neurospora, Fusarium, Beauveria oder weitere in Indian Chem
Engr. Section B. Vol 37, No 1, 2 (1995) auf Seite 15, Tabelle 6
beschriebene Pilze.
Als transgene Organismen bevorzugte Wirts- oder Ausgangs
organismen sind vor allem Pflanzen. Eingeschlossen sind im Rahmen
der Erfindung alle Gattungen und Arten höherer und niedrigerer
Pflanzen des Pflanzenreiches. Eingeschlossen sind ferner die
reifen Pflanzen, Saatgut, Sprossen und Keimlinge, sowie davon
abgeleitete Teile, Vermehrungsgut und Kulturen, zum Beispiel
Zellkulturen. Reife Pflanzen meint Pflanzen zu jedem beliebigen
Entwicklungsstadium jenseits des Keimlings. Keimling meint eine
junge, unreife Pflanze in einem frühen Entwicklungsstadium.
Einjährige, mehrjährige, monocotyledone und dicotyledone Pflanzen
sind bevorzuge Wirtsorganismen für die Herstellung transgener
Pflanzen. Die Expression von Genen ist ferner vorteilhaft bei
allen Schmuckpflanzen, Nutz- oder Zierbäumen, Blumen, Schnitt
blumen, Sträuchern oder Rasen. Beispielhaft aber nicht ein
schränkend seien zu nennen Angiospermen, Bryophyten wie zum Bei
spiel Hepaticae (Leberblümchen) und Musci (Moose); Pteridophyten
wie Farne, Schachtelhalm und Lycopoden; Gymnospermen wie Koni
feren, Cycaden, Ginkgo und Gnetalen; Algen wie Chlorophyceae,
Phaeophpyceae, Rhodophyceae, Myxophyceae, Xanthophyceae, Bacilla
riophyceae (Diatomeen) und Euglenophyceae.
Pflanzen im Rahmen der Erfindung umfassen beispielhaft und nicht
einschränkend die Familien der Rosaceae wie Rose, Ericaceae wie
Rhododendrons und Azaleen, Euphorbiaceae wie Weihnachtssterne
und Kroton, Caryophyllaceae wie Nelken, Solanaceae wie Petunien,
Gesneriaceae wie das Usambaraveilchen, Balsaminaceae wie das
Springkraut, Orchidaceae wie Orchideen, Iridaceae wie Gladiolen,
Iris, Freesie und Krokus, Compositae wie Ringelblume, Geraniaceae
wie Geranien, Liliaceae wie der Drachenbaum, Moraceae wie Ficus,
Araceae wie Philodendron und andere mehr.
Beispielhaft aber nicht einschränkend für Blütenpflanzen seien zu
nennen die Familien der Leguminosae wie Erbse, Alfalfa und Soja;
Gramineae wie Reis, Mais, Weizen; Solanaceae wie Tabak und andere
mehr; die Familie der Umbelliferae, besonders die Gattung Daucus,
ganz besonders die Art carota (Karrotte) und Apium, ganz be
sonders die Art graveolens dulce (Selarie) und andere mehr; die
Familie der Solanacea, besonders die Gattung Lycopersicon, ganz
besonders die Art esculentum (Tomate) und die Gattung Solanum,
ganz besonders die Art tuberosum (Kartoffel) und melongena
(Aubergine) und andere mehr; und die Gattung Capsicum, ganz
besonders die Art annum (Pfeffer) und andere mehr; die Familie
der Leguminosae, besonders die Gattung Glycine, ganz besonders
die Art max (Sojabohne) und andere mehr; und die Familie der
Cruciferae, besonders die Gattung Brassica, ganz besonders die
Arten campestris (Rübe), oleracea cv Tastie (Kohl), oleracea cv
Snowball Y (Blumenkohl) und oleracea cv Emperor (Broccoli); und
der Gattung Arabidopsis, ganz besonders die Art thaliana und
andere mehr; die Familie der Compositae, besonders die Gattung
Lactuca, ganz besonders die Art Sativa (Salat) und andere mehr.
Die erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen sind insbesondere
ausgewählt unter monokotylen Kulturpflanzen, wie zum Beispiel
Getreidearten wie Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Mais,
Reis oder Hafer sowie dem Zuckerrohr. Ferner sind die erfindungs
gemäßen transgenen Pflanzen insbesondere ausgewählt unter
dikotylen Kulturpflanzen, wie zum Beispiel
Brassicacae wie Raps, Kresse, Arabidopsis, Kohlarten oder Canola, Leguminosae wie Soja, Alfalfa, Erbse, Luzerne, Bohnengewächsen oder Erdnuss
Solanaceae wie Kartoffel, Tabak, Tomate, Aubergine oder Paprika, Asteraceae wie Sonnenblume, Tagetes, Salat oder Calendula, Cucurbitaceae wie Melone, Kürbis oder Zucchini,
sowie Lein, Baumwolle, Hanf, Flachs, Roter Pfeffer, Möhre, Karotte, Zuckerrübe und den verschiedenen Baum-, Nuss- und Weinspecies.
Brassicacae wie Raps, Kresse, Arabidopsis, Kohlarten oder Canola, Leguminosae wie Soja, Alfalfa, Erbse, Luzerne, Bohnengewächsen oder Erdnuss
Solanaceae wie Kartoffel, Tabak, Tomate, Aubergine oder Paprika, Asteraceae wie Sonnenblume, Tagetes, Salat oder Calendula, Cucurbitaceae wie Melone, Kürbis oder Zucchini,
sowie Lein, Baumwolle, Hanf, Flachs, Roter Pfeffer, Möhre, Karotte, Zuckerrübe und den verschiedenen Baum-, Nuss- und Weinspecies.
Besonders bevorzugt sind Arabidopsis thaliana, Nicotiana tabacum,
Tagetes erecta, Calendula officinalis sowie alle Gattungen und
Arten, die als Nahrungs- oder Futtermittel zum Einsatz kommen,
wie die beschriebenen Getreidearten, oder sich zur Herstellung
von Ölen eignen, wie Ölsaaten (wie zum Beispiel Raps), Nussarten,
Soja, Sonnenblume, Kürbis und Erdnuss.
Pflanzliche Organismen im Sinne der Erfindung sind weiterhin
weitere photosynthetisch aktive befähigte Organismen, wie zum
Beispiel Algen oder Cyanobakterien, sowie Moose.
Bevorzugte Algen sind Grünalgen, wie beispielsweise Algen der
Gattung Haematococcus, Phaedactylum tricornatum, Volvox oder
Dunaliella.
Die Herstellung eines transformierten Organismus oder einer
transformierten Zelle erfordert, dass die entsprechende DNA
in die entsprechende Wirtszelle eingebracht wird. Für diesen
Vorgang, der als Transformation bezeichnet wird, steht eine Viel
zahl von Methoden zur Verfügung (siehe auch Keown et al. 1990
Methods in Enzymology 185: 527-537). So kann die DNA beispielhaft
direkt durch Mikroinjektion oder durch Bombardierung mit DNA
beschichteten Mikropartikeln eingeführt werden. Auch kann
die Zelle chemisch, zum Beispiel mit Polyethylenglycol, permea
bilisiert werden, so dass die DNA durch Diffusion in die Zelle
gelangen kann. Die DNA kann auch durch Protoplastenfusion mit
anderen DNA-enthaltenden Einheiten wie Minicells, Zellen, Lyso
somen oder Liposomen erfolgen. Elektroporation ist eine weitere
geeignete Methode zur Einführung von DNA, bei der die Zellen
reversibel durch einen elektrischen Impuls permeabilisert werden.
Bei Pflanzen werden dabei die beschriebenen Methoden zur Trans
formation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder
Pflanzenzellen zur transienten oder stabilen Transformation
genutzt. Geeignete Methoden sind vor allem die Protoplasten
transformation durch Polyethylenglykol-induzierte DNA-Aufnahme,
das biolistische Verfahren mit der Genkanone, die sogenannte
particle bombardment Methode, die Elektroporation, die Inkubation
trockener Embryonen in DNA-haltiger Lösung und die Mikro
injektion.
Neben diesen "direkten" Transformationstechniken kann eine
Transformation auch durch bakterielle Infektion mittels Agro
bacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes durchgeführt
werden. Diese Stämme enthalten ein Plasmid (Ti bzw. Ri Plasmid).,
das auf die Pflanze nach Agrobaterium-Infektion übertragen wird.
Ein Teil dieses Plasmids, genannt T-DNA (transferred DNA), wird
in das Genom der Pflanzenzelle integriert.
Die Agrobacterium-vermittelte Transformation ist am besten für
dicotyledone, diploide Pflanzenzellen geeignet, wohingegen die
direkten Transformationstechniken sich für jeden Zelltyp eignen.
Die Einführung einer erfindungsgemäßen Expressionskassette in
Zellen, bevorzugt in pflanzliche Zellen, kann vorteilhaft unter
Verwendung von Vektoren realisiert werden.
In einer vorteilhaften Ausführungsform wird die Einführung
der Expressionskassette mittels Plasmidvektoren realisiert.
Bevorzugt sind solche Vektoren, die eine stabile Integration
der Expressionskassette in das Wirtsgenom ermöglichen.
Im Falle von Injektion oder Elektroporation von DNA in pflanz
liche Zellen sind keine besonderen Anforderungen an das ver
wendete Plasmid gestellt. Einfache Plasmide wie die der pUC-Reihe
können verwendet werden. Sollen vollständige Pflanzen aus den
transformierten Zellen regeneriert werden, so ist er erforder
lich, das sich auf dem Plasmid ein zusätzliches selektionierbares
Markergen befindet.
Transformationstechniken sind für verschiedene monokotyle und
dikotyle pflanzliche Organismen beschrieben. Ferner stehen
verschiedene mögliche Plasmidvektoren für die Einführung
fremder Gene in Pflanzen zur Verfügung, die in dier Regel einen
Replikationsursprung für eine Vermehrung in E.coli und ein
Markergen für eine Selektion transformierter Bakterien enthalten.
Beispiele sind pBR322, pUC Reihe, M13mp Reihe, pACYC184 etc.
Die Expressionskassette kann in den Vektor über eine geeignete
Restriktionsschnittstelle eingeführt werden. Das entstandene
Plasmid wird zunächst in E.coli eingeführt. Korrekt trans
formierte E.coli werden selektioniert, gezüchtet und das
rekombinante Plasmid mit dem Fachmann geläufigen Methoden
gewonnen. Restriktionsanalyse und Sequenzierung können dazu
dienen, den Klonierungsschritt zu überprüfen.
Transformierte Zellen d. h. solche, die die einge führte DNA
integriert in die DNA der Wirtszelle enthalten, können von
untransformierten selektioniert werden, wenn ein selektionier
barer Marker Bestandteil der eingeführten DNA ist. Als Marker
kann beispielhaft jedes Gen fungieren, dass eine Resistenz gegen
Antibiotika oder Herbizide zu verleihen vermag. Transformierte
Zellen, die ein solches Markergen exprimieren, sind in der
Lage, in der Gegenwart von Konzentrationen eines entsprechenden
Antibiotikums oder Herbizides zu überleben, die einen untrans
formierten Wildtyp abtöten. Beispiel sind das bar Gen, dass
Resistenz gegen das Herbizid Phosphinotricin verleiht (Rathore
KS et al.,Plant Mol Biol. 1993 Mar; 21 (5): 871-884), das nptII
Gen, dass Resistenz gegen Kanamycin verleiht, das hpt Gen, das
Resistenz gegen Hygromycin verleiht, oder das EPSP-Gen, das
Resistenz gegen das Herbizid Glyphosat verleiht.
Je nach Methode der DNA-Einführung können weitere Gene auf dem
Vektorplasmid erforderlich sein. Werden Agrobacteria verwendet,
so ist die Expressionskassette in spezielle Plasmide zu inte
grieren, entweder in einen Zwischenvektor (englisch: shuttle or
intermediate vector) oder einen binären Vektor. Wenn zum Beispiel
ein Ti oder Ri Plasmid zur Transformation verwendet werden soll,
ist zumindest die rechte Begrenzung, meistens jedoch die rechte
und die linke Begrenzung der Ti oder Ri Plasmid T-DNA als
flankierende Region mit der einzuführenden Expressionskassette
verbunden. Bevorzugt werden binäre Vektoren verwendet. Binäre
Vektoren können sowohl in E.coli als auch in Agrobacterium
replizieren. Sie enthalten in der Regel ein Selektionsmarkergen
und einen Linker oder Polylinker flankiert von der rechten und
linken T-DNA Begrenzungssequenz. Sie können direkt in Agro
bacterium transformiert werden (Holsters et al.,Mol. Gen. Genet.
163 (1978), 181-187). Das Selektionsmarkergen erlaubt eine
Selektion transformierter Agrobakteria und ist zum Beispiel das
nptII Gen, das eine Resistenz gegen Kanamycin verleiht. Das in
diesem Fall als Wirtsorganismus fungierende Agrobacterium sollte
bereits ein Plasmid mit der vir-Region enthalten. Diese ist für
die Übertragung der T-DNA auf die pflanzliche Zelle erforderlich.
Ein so transformiertes Agrobacterium kann zur Transformation
pflanzlicher Zellen verwendet werden.
Die Verwendung von T-DNA zur Transformation pflanzlicher Zellen
ist intensiv untersucht und beschrieben (EP 120516; Hoekema, In:
The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B. V.,
Alblasserdam, Chapter V; Fraley et al., Crit. Rev. Plant. Sci.,
4: 1-46 and An et al., EMBO J. 4 (1985), 277-287). Verschiedene
binäre Vektoren sind bekannt und teilweise kommerziell erhältlich
wie zum Beispiel pBIN19 (Clontech Laboratories, Inc. U.S.A.).
Für den Transfer der DNA auf die pflanzliche Zelle werden pflanz
liche Explantate mit Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium
rhizogenes kokultiviert. Ausgehend von infiziertem Pflanzen
material (z. B. Blatt-, Wurzel- oder Stengelteile, aber auch
Protoplasten oder Suspensionen von Pflanzenzellen) können ganze
Pflanzen unter Verwendung eines geeigneten Mediums, dass zum
Beispiel Antibiotika oder Biozide zur Selektion transformierten
Zellen enthalten kann, regeneriert werden. Die erhaltenen
Pflanzen können dann auf die Präsenz der eingeführten DNA, hier
der erfindungsgemäßen Expressionskassette, durchmustert werden.
Sobald die DNA in das Wirtsgenom integriert ist, ist der ent
sprechende Genotyp in der Regel stabil und die entsprechende
Insertion wird auch in den Nachfolgegenerationen wiedergefunden.
In der Regel enthält die integrierte Expressionskassette einen
Selektionsmarker, der der transformierten Pflanze eine Resistenz
gegen ein Biozid (zum Beispiel ein Herbizid) oder ein Anti
biotikum wie Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin oder
Phosphinotricin etc. verleiht. Der Selektionsmarlcer erlaubt
die Selektion von transformierten Zellen von untransformierten
(McCormick et al., Plant Cell Reports 5 (1986), 81-84). Die
erhaltenen Pflanzen können in üblicher Weise gezüchtet und
gekreuzt werden. Zwei oder mehr Generationen sollten kultiviert
werden, um sicherzustellen, dass die genomische Integration
stabil und vererblich ist.
Die genannten Verfahren sind beispielsweise in B. Jenes et al.,
Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1,
Engineering and Utilization, herausgegeben von S. D. Kung und
R. Wu, Academic Press (1993), 128-143 sowie in Potrykus, Annu.
Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205-225)
beschrieben. Vorzugsweise wird das zu exprimierende Konstrukt
in einen Vektor kloniert, der geeignet ist, Agrobacterium tume
faciens zu transformieren, beispielsweise pBin19 (Bevan et al.,
Nucl. Acids Res. 12 (1984), 8711).
Sobald eine transformierte Pflanzenzelle hergestellt wurde, kann
eine vollständige Pflanze unter Verwendung von dem Fachmann be
kannten Verfahren erhalten werden. Hierbei geht man beispielhaft
von Kalluskulturen aus. Aus diesen noch undifferenzierten Zell
massen kann die Bildung von Spross und Wurzel in bekannter Weise
induziert werden. Die erhaltenen Sprösslinge können ausgepflanzt
und gezüchtet werden.
Die Wirksamkeit der Expression der transgen exprimierten Nuklein
säuren kann beispielsweise in vitro durch Sprossmeristem
vermehrung unter Verwendung einer der oben beschriebenen
Selektionsmethoden ermittelt werden.
Erfindungsgemäß sind ferner von den oben beschriebenen transgenen
Organismen abgeleitete Zellen, Zellkulturen, Teile - wie zum
Beispiel bei transgenen pflanzlichen Organismen Wurzeln, Blätter
etc. -, und transgenes Vermehrungsgut wie Saaten oder Früchte.
Von Menschen und Tieren verzehrbare erfindungsgemäße, genetisch
veränderte Pflanzen können auch beispielsweise direkt oder nach
an sich bekannter Aufbereitung als Nahrungsmittel oder Futter
mittel verwendet werden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung der
oben beschriebenen erfindungsgemäßen, transgenen Organismen und
der von ihnen abgeleitete Zellen, Zellkulturen, Teile - wie zum
Beispiel bei transgenen pflanzlichen Organismen Wurzeln, Blätter
etc. -, und transgenes Vermehrungsgut wie Saaten oder Früchte,
zur Herstellung von Nahrungs- oder Futtermitteln, Pharmazeutika
oder Feinchemikalien.
Bevorzugt ist ferner ein Verfahren zur rekombinanten Herstellung
von Pharmazeutika oder Feinchemikalien in Wirtsorganismen, wobei
ein Wirtsorganismus mit einer der oben beschriebenen Expressions
konstrukte transformiert wird und diese Expressionskassette ein
oder mehrere Strukturgene enthält, die für die gewünschte Fein
chemikalie kodieren oder die Biosynthese der gewünschten Fein
chemikalie katalysieren, der transformierte Wirtsorganismus ge
züchtet wird und die gewünschte Feinchemikalie aus dem Züchtungs
medium isoliert wird. Dieses Verfahren ist für Feinchemikalien
wie Enzyme, Vitamine, Aminosäuren, Zucker, Fettsäuren, natürliche
und synthetische Geschmacks-, Aroma- und Farbstoffe breit anwend
bar. Besonders bevorzugt ist die Produktion von Tocopherolen
und Tocotrienolen sowie Carotinoiden. Die Züchtung der trans
formierten Wirtsorganismen sowie die Isolierung aus den Wirts
organismen bzw. aus dem Züchtungsmedium erfolgt mit dem Fachmann
bekannten Verfahren. Die Produktion von Pharmazeutika, wie zum
Beispiel Antikörpern, Vakzinen, Enzymen oder pharmazeutisch
ativen Proteinen ist beschrieben (Hood EE, Jilka JM. (1999) Curr
Opin Biotechnol. 10 (4): 382-6; Ma JK, Vine ND. (1999) Curr Top
Microbiol. Immunol. 236: 275-92; Russel DA (1999), Current Topics
in Microbiology and Immunology 240: 119-138; Cramer CL et al.
(1999), Current Topics in Microbiology and Immunology 240: 95-118;
Gavilondo JV. und Larrick J 30766 00070 552 001000280000000200012000285913065500040 0002010127882 00004 30647W. (2000) Biotechnigues 29 (1): 128-138;
Holliger P. und Bohlen H. (1999) Cancer & Metastasis Reviews
18 (4): 411-419).
1. SEQ ID NO: 1
Promotor and 5'-untranslatierte Region des Arabidopsis thaliana LOX5 Gens.
2. SEQ ID NO: 2
861 bp Fragment von Promotor and 5'-untranslatierte Region des Arabidopsis thaliana LOXS Gens.
3. SEQ ID NO: 3
521 bp Fragment von Promotor and 5'-untranslatierte Region des Arabidopsis thaliana LOXS Gens.
4. SEQ ID NO: 4
Vorwärts-Primer (BIS22): 5'-AATAAGCTTAACAATAAAAGTCCATTTC-3'
5. SEQ ID NO: 5
Rückwärts-Primer (BIS23): 5'-CTATCTAGATCGTCGTCGTCTTCTT-3'
6. SEQ ID NO: 6
APF-1 Primer: 5'-ATG AAG ATA GAA GGA GAA G-3'
7. SEQ ID NO: 7
APF-2 Primer: 5'-CAT CTG GAA AAA TGG GTA AC-3'
8. SEQ ID NO: 8
APF-3 Primer: 5'-GAT TGG GAC GAG TCA ATG-3'
9. SEQ ID NO: 9
APR-1 Primer: 5'-GGT GGA AAT TCC TGA AGA ACG-3'
10. SEQ ID NO: 10
APR-2 Primer: 5'-GCT TCT TGG ACA TTG AGG CCG-3'
11. SEQ ID NO: 11
APR-3 Primer: 5'-CTT TGC TGA CCG ATC CAT ATG-3'
12. SEQ ID NO: 12
APR-4 Primer: 5'-CAA CAA TGT GTA CGG TAT G-3'
Promotor and 5'-untranslatierte Region des Arabidopsis thaliana LOX5 Gens.
2. SEQ ID NO: 2
861 bp Fragment von Promotor and 5'-untranslatierte Region des Arabidopsis thaliana LOXS Gens.
3. SEQ ID NO: 3
521 bp Fragment von Promotor and 5'-untranslatierte Region des Arabidopsis thaliana LOXS Gens.
4. SEQ ID NO: 4
Vorwärts-Primer (BIS22): 5'-AATAAGCTTAACAATAAAAGTCCATTTC-3'
5. SEQ ID NO: 5
Rückwärts-Primer (BIS23): 5'-CTATCTAGATCGTCGTCGTCTTCTT-3'
6. SEQ ID NO: 6
APF-1 Primer: 5'-ATG AAG ATA GAA GGA GAA G-3'
7. SEQ ID NO: 7
APF-2 Primer: 5'-CAT CTG GAA AAA TGG GTA AC-3'
8. SEQ ID NO: 8
APF-3 Primer: 5'-GAT TGG GAC GAG TCA ATG-3'
9. SEQ ID NO: 9
APR-1 Primer: 5'-GGT GGA AAT TCC TGA AGA ACG-3'
10. SEQ ID NO: 10
APR-2 Primer: 5'-GCT TCT TGG ACA TTG AGG CCG-3'
11. SEQ ID NO: 11
APR-3 Primer: 5'-CTT TGC TGA CCG ATC CAT ATG-3'
12. SEQ ID NO: 12
APR-4 Primer: 5'-CAA CAA TGT GTA CGG TAT G-3'
Fig. 1: Reportergenaktivität in Keimblättern nach GUS-Färbung
von transgenen Arabidopsissamen (pGPTV-ALLOX5::GUS).
Abbildungsteil A stellt die Samen ohne Verdeutlichung der
GUS-Färbung dar. In Abbildungsteil B ist die GUS-Färbung
durch Schraffur hervorgehoben. Der Pfeil weißt auf die
Region der Keimblätter hin.
Fig. 2: Schematische Darstellung der Vektoren pBSK-LOX5 (I),
pBSK-LOX5 (861) (II), pBSK-LOX5 (521) (IIa), pGPTV-
LOX5::GUS (VI), pGPTVl-LOX5::GUS (V) und pGPTV2-LOXS:GUS
(VI). Die Pfeilrichtung gibt die Orientierung des
Promotors an, wobei die Pfeilspitze in Richtung des
Startkodons weist. Die Abkürzungen haben folgende
Bedeutung:
LOX5: Promotor oder Promotorfragment des AtLOX5 Promotors
NOST: Terminatorsequenz der Nopalin-Synthase (NOS)
GUS: Reportergen (bakterielle β-Glucuronidase)
LOX5: Promotor oder Promotorfragment des AtLOX5 Promotors
NOST: Terminatorsequenz der Nopalin-Synthase (NOS)
GUS: Reportergen (bakterielle β-Glucuronidase)
Die chemische Synthese von Oligonukleotiden kann beispielsweise,
in bekannter Weise, nach der Phosphoamiditmethode (Voet, Voet, 2.
Auflage, Wiley Press New York, Seite 896-897) erfolgen. Die im
Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführten Klonierungs
schritte wie z. B. Restriktionsspaltungen, Agarosegelelektro
phorese, Reinigung von DNA-Fragmenten, Transfer von Nuklein
säuren auf Nitrozellulose und Nylonmembranen, Verknüpfen von
DNA-Fragmenten, Transformation von E. coli Zellen, Anzucht von
Bakterien, Vermehrung von Phagen und Sequenzanalyse rekombinanter
DNA werden wie bei Sambrook et al. (1989) Cold Spring Harbor
Laboratory Press; ISBN 0-87969-309-6 beschrieben durchgeführt.
Die Sequenzierung rekombinanter DNA-Moleküle erfolgt mit einem
Laserfluoreszenz-DNA-Sequenzierer der Firma ABI nach der Methode
von Sanger (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977),
5463-5467).
Um 6 Tage alte Keimlinge zu erhalten, werden jeweils unge
fähr 500 Samen (Arabidopsis thaliana Ökotyp Columbia) an
der Oberfläche mit einer 70%igen Ethanollösung für 2 Minuten
sterilisiert, mit einer Natriumhypochloritlösung (5% v/v)
2 Minuten behandelt, fünfmal mit destilliertem Wasser gewaschen
und bei 4°C für 1 Tag inkubiert, um eine gleichmäßige Keimung
sicherzustellen. Anschliessend werden die Samen in sterilisierten
Behältern (9,7 cm × 9,6 cm × 9 cm) auf mit Hoagland-Nährlösung
(modifiziert für Arabidopsis thaliana) getränktem Filterpapier
ausgesäht. Die Hoagland-Lösung ist aus drei verschiedenen 200x
Stammlösungen hergestellt. Die Stammlösung I enthält 0,5 M
Ca(NO3)2, die Stammlösung II enthält 0,1 M MgSO4, und die Stamm
lösung III enthält 0.5 M KNO3 und 0,1 M KH2PO4. Alle Stammlösungen
wurden vor Gebrauch 1 : 200 verdünnt und 1 : 1 : 1 gemischt. Spuren
elemente wurden mittels einer 2000x Spurenelement-Stammlösung
(5 × 10-2 M H3BO3, 4,5 × 10-3 M MNCl2, 3,8 × 10-3 M ZnSO4, 3 ×
10-4 M CuSO4, 1 × 10-4 M (NH4)6MO7O24)und 250x Fe-EDTA-Stammlösung
(10 mM FeCl3, 10 mM Na-EDTA) zugesetzt. Der pH-Wert der Nährlösung
wurde mit 5 N KOH auf pH 6,0 eingestellt und die Hoaglandlösung
dann autoklaviert. Die Sämlinge werden im Dunkeln bei 22°C
gezüchtet und nach 6 Tagen nach Beginn der Keimphase geerntet.
Für die Gewinnung von Wurzeln werden 100 Samen wie oben
beschrieben sterilisiert, bei 4°C 4 Tage inkubiert und dann in
250 ml Flaschen mit MS Medium (Sigma M5519) unter Zusatz von
weiteren 3% Saccharose und 0,5 g/l MES (Sigma M8652), pH 5,7
gezüchtet. Die Sämlinge werden in einem 16-stündigen Licht-/
8-stündigen Dunkelheitszyklus (Philips 58W/33 Weißlichtlampen)
bei 22°C, 120 U/min gezüchtet und nach 3 Wochen geerntet. Für alle
anderen verwendeten pflanzlichen Organe werden die Samen auf Ein
heitserde (Typ VM, Manna-Italia, Via S. Giacomo 42, 39050 San
Giacomo/Laives, Bolzano, Italien) ausgesäht, 4 Tage bei 4°C
inkubiert um eine gleichmäßige Keimung zu gewährleisten und
zunächst unter Kurztagsbedingungen bei 2200, 9 h Licht (150 mE)
und 60 bis 65% rel. Luftfeuchte mit einer Nachtabsenkung auf 18°C
gezüchtet. Um die Spross- und Blütenentwicklung zu fördern,
wurden die Pflanzen zu Langtagsbedingungen mit einem 16-stündigen
Licht-/8-stündigen Dunkelheitszyklus (OSRAM Lumilux Daylight
36W/12 Leuchtstoffröhren) bei 22°C, umgesetzt. Junge Rosetten
blätter werden im 8-Blattstadium (nach 3 Wochen) geerntet,
Stengel, geöffnete Blüten werden in Stadium 14 sofort nach der
Staubblattentwicklung geerntet. Die verwendeten grünen Schoten
hatten eine Länge von 10 bis 13 mm.
Gesamt-RNA wird aus den in Beispiel 1 beschriebenen Organen
der Pflanze zu verschiedenen Zeitpunkten der Entwicklung nach
dem RNA-Isolierungspotokoll(Sambrook et al., 1989), modi
fiziert für Arabidopsis thaliana isoliert. Die Proben wurden
mit flüssigem N2 fein zermörsert, mit 1 ml Homogenisierungspuffer
(4 M Guanidiniumthiocyanat, 0,1 M Tris HCl pH 7,0, 10 mM EDTA,
0,5% Na-Laurylsarcosin, 1% (v/v) β-Mercaptoethanol) versetzt
und während des Auftauens weiter sorgfältig aufgeschlossen und
in ein mit 800 µl Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (P/C/I/)
(25 : 24 : 1 v/v, mit DEPC (Diethylpyrocarbonat)-Wasser über
schichtet) gefülltes 2-ml-Reaktionsgefäß überführt. Es wurde
1 min gevortext, bei 4°C für 15 min bei 17500 × g zentrifugiert,
die wässrige Phase abgenommen und erneut mit 800 µl P/C/I aus
geschüttelt und zentrifugiert (17500 × g, für 15 min, bei 4°C).
Um das Phenol zu entfernen, erfolgte eine Extraktion mit 800 µl
Chloroform/Isoamylalkohol (24 : 1 v/v). Eine bessere Phasen
trennung wurde durch erneute Zentrifugation (s. o.) erreicht. Der
Überstand wurde abgenommen, die Nukleinsäuren mit dem 1-fachen
Volumen Isopropanol bei -20°C für 1 h gefällt. Das Präzipitat
wurde bei 4°C für 15 min bei 17500 × g sedimentiert, mit 3 M
Na-Acetat (pH 5,4) gewaschen, wieder zentrifugiert (10 min, bei
17500 × g und 4°C), danach nochmals 2 × mit eiskaltem 70% Ethanol
gewaschen. Das Pellet wurde in 750 µl TENS Puffer (50 mM Tris HCl
pH 8,0, 10 mM EDTA, 100 mM NaCl, 2% SDS (w/v), 3 mg/ml Diethyl
thiocyanat) resuspendiert, mit 800 µl P/C/I extrahiert und mit
800 µl Chloroform/ Isoamylalkohol ausgescrüttelt (s. o.). Die
wässrige Phase wurde im Verhältnis 1 : 1 mit 5 M LiCl versetzt,
die RNA bei 4°C über Nacht gefällt und dann für 30 min bei 4°C
und 17500 × g abzentrifugiert. Danach wurde das Pellet zweimal
mit 70% Ethanol gewaschen, bei 50°C im Heizblock getrocknet
und in 40 µl H2O resuspendiert. Alle Lösungen wurden mit tridest.
H2O, das vorher mit Diethylpyrocarbonat (DEPC) behandelt und
anschließend autoklaviert worden ist, angesetzt.
Die Reverse Transkriptase Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) wird
verwendet, um das AtLOX5 Gentranskript nachzuweisen. Die Erst
strang cDNA Synthese wird ausgehend von 6 µg Gesamt-RNA mit einem
oligo-(dT) Primer und RT Superscript™II Enzym (200 Units) nach
Angaben des Herstellers in einem Gesamtvolumen von 20 µl (Life
Technologies, Gaithersburg, MD; Cat. No. 18064-022) durchgeführt.
Zur RNA werden dazu 500 ng oligo-(dT) Primer in einem Endvolumen
von 12 µl gegeben. Der Ansatz wird für 10 min bei 70°C erhitzt
und anschließend sofort auf Eis gekühlt. Dann werden 4 µl des 5X
Erststrangpuffers [250 mM Tris-HCl (pH 8,3 bei Raumtemperatur),
375 mM KCl, 15 mM MgCl2], 2 µl 0,1 M DTT und 1 µl 10 mM dNTP-Mix
(jeweils 10 mM dATP, dCTP, dGTP und dTTP bei neutralem pH) zuge
geben. Der Ansatz wird für 2 min auf 42°C erhitzt, RT Superscript
™II Enzym (1 µl (200 Units), Life Technologies) zugegeben und für
50 min bei 42°C inkubiert. Als oligo-(dT) Primer wird ein Oligo
nukleotid mit 17 dT Resten verwendet.
Für die PCR-Reaktion werden ungefähr 2 µl der Erststrang cDNA
Synthese eingesetzt. In einem Gesamtvolumen von 50 µl werden
gemäß den Angaben des Herstellers (Life Technologies) zusammen
gegeben:
5 µl 10X PCR Buffer [200 mM Tris-HCl (pH 8,4), 500 mM KCl],
1,5 µl 50 mM MgCl2,
1 µl 10 mM dNTP Mix (jeweils 10 mM dATP, dCTP, dGTP und dTTP),
1 µl Amplifikations-Primer 1 (10 µM),
1 µl Amplifikations-Primer 2 (10 µM),
0,4 µl Taq DNA polymerase (5 U/µl),
2 µl cDNA (aus der Erststrang cDNA Synthese),
38,1 µl autoklaviertes, destilliertes Wasser.
5 µl 10X PCR Buffer [200 mM Tris-HCl (pH 8,4), 500 mM KCl],
1,5 µl 50 mM MgCl2,
1 µl 10 mM dNTP Mix (jeweils 10 mM dATP, dCTP, dGTP und dTTP),
1 µl Amplifikations-Primer 1 (10 µM),
1 µl Amplifikations-Primer 2 (10 µM),
0,4 µl Taq DNA polymerase (5 U/µl),
2 µl cDNA (aus der Erststrang cDNA Synthese),
38,1 µl autoklaviertes, destilliertes Wasser.
Das Reaktionsgemisch wird mit ca. 50 µl Silikonöl überschichtet
und nachfolgendem Temperaturprogramm ausgesetzt (Thermocycler:
MWG Biotech Primus HT; MWG Biotech, Deutschland):
1 Zyklus mit 180 sec bei 95°C,
30 Zyklen mit 95°C für 40 sec, 53°C für 60 sec und 72°C für 2 min,
1 Zyklus mit 72°C für 5 min.
1 Zyklus mit 180 sec bei 95°C,
30 Zyklen mit 95°C für 40 sec, 53°C für 60 sec und 72°C für 2 min,
1 Zyklus mit 72°C für 5 min.
Die Präsenz der AtLOX5 mRNA in einer Probe wird dann durch Auf
trennung des Reaktionsgemisches auf einem 1% Agarosegel elektro
phoretisch nach Färbung beispielsweise mit Ethidiumbromid nach
gewiesen.
Als Amplifikations-Primer 1 ("forward"-Primer) wird eines der
nachfolgender Oligonukleotide eingesetzt:
APF-1 (SEQ ID NO: 6): 5'-ATG AAG ATA GAA GGA GAA G-3',
APF-2 (SEQ ID NO: 7): 5'-CAT CTG GAA AAA TGG GT. A AC-3',
APF-3 (SEQ ID NO: 8): 5'-GAT TGG GAC GAG TCA ATG-3'.
APF-1 (SEQ ID NO: 6): 5'-ATG AAG ATA GAA GGA GAA G-3',
APF-2 (SEQ ID NO: 7): 5'-CAT CTG GAA AAA TGG GT. A AC-3',
APF-3 (SEQ ID NO: 8): 5'-GAT TGG GAC GAG TCA ATG-3'.
Als Amplifikations-Primer 2 ("reverse"-Primer) wird eines der
nachfolgender Oligonukleotide eingesetzt:
APR-1 (SEQ ID NO: 9): 5'-GGT GGA AAT TCC TGA. AGA ACG-3',
APR-2 (SEQ ID NO: 10): 5'-GCT TCT TGG ACA TTG. AGG CCG-3',
APR-3 (SEQ ID NO: 11): 5'-CTT TGC TGA CCG ATC CAT ATG-3',
APR-4 (SEQ ID NO: 12): 5'-CAA CAA TGT GTA CGG TAT G-3'.
APR-1 (SEQ ID NO: 9): 5'-GGT GGA AAT TCC TGA. AGA ACG-3',
APR-2 (SEQ ID NO: 10): 5'-GCT TCT TGG ACA TTG. AGG CCG-3',
APR-3 (SEQ ID NO: 11): 5'-CTT TGC TGA CCG ATC CAT ATG-3',
APR-4 (SEQ ID NO: 12): 5'-CAA CAA TGT GTA CGG TAT G-3'.
Weitere Primer sind aus der bekannten cDNA Sequenz des AtLOX5
(AJ302043 Arabidopsis thaliana partial mRNA for lipoxygenase
(LOX5 gene) gi|11967676|emb|AJ302043.1|ATH302043[11967676])
ableitbar.
Kleine Stückchen von grünen Schoten wurden von ausgewachsenen
Pflanzen entnommen und in 4% para-Formaldehyd und 0,1% Triton
X-100 in PBS für 2 h bei RT fixiert. Nach dreimaligem Waschen mit
PBS wurden die Proben über eine aufsteigende Ethanolreihe ent
wässert, über Xylol mit Paraplast (SIGMA) infiltriert und ein
gebettet. Längsschnitte durch den medianen Bereich der Schoten
(5 µm dick) wurden auf poly-L-Lysin-beschichtete Objektträger
aufgebracht, das Paraplast mittels Xylol wieder entfernt und
die Schnitte über eine absteigende Ethanolreihe bewässert. Nach
30 min Blockierung der Schnitte mit 1% BSA in PBS erfolgte die
Inkubation mit dem primären Antikörper (anti-LB-LOX, 1 : 500 in 1%
BSA/PBS; Feussner I und Kindl H (1994) Planta 194: 22-28) ON bei
4°C. Als sekundärer AK wurde ein anti-Kaninchen IgG, konjugiert
mit alkalischer Phosphatase (Roche Diagnostics) wie dort be
schrieben nach den Angaben des Herstellers eingesetzt. Der Nach
weis der immunmarkierten LOX erfolgte über die Farbreaktion der
alkalischen Phosphatase mittels NBT und BCIP. Abschließend wurden
die Schnitte mit Glycerin eingeschlossen und mit Hilfe eines
Zeiss "Axioskop" analysiert.
Um den vollständigen AtLOX5 Promotor zu isolieren, wird
genomische DNA aus Arabidopsis thaliana (Ökotyp Columbia)
extrahiert. Dies geschieht mit Hilfe des Qiagen DNAeäsy Plant
Mini Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland). Die isolierte DNA wird
als Matrizen-DNA in einer PCR-Vervielfältigungsreaktion unter
Verwendung folgender Primer eingesetzt:
Vorwärts-Primer (BIS22): 5'-AATAAGCTTAACAATAAAAGTCCATTTC-3' (SEQ ID NO: 4),
Rückwärts-Primer (BIS23): 5'-CTATCTAGATCGTCGTCGTCTTCTT-3' (SEQ ID NO: 5).
Vorwärts-Primer (BIS22): 5'-AATAAGCTTAACAATAAAAGTCCATTTC-3' (SEQ ID NO: 4),
Rückwärts-Primer (BIS23): 5'-CTATCTAGATCGTCGTCGTCTTCTT-3' (SEQ ID NO: 5).
Die Amplifikation wird wie folgt durchgeführt:
1 × PCR reaction buffer (Roche Diagnostics),
5 µl genomische DNA (entspricht etwa 80 ng),
je 2,5 mM dATP, dCTP, dGTP und dTTP (Invitrogen: dNTP Mix),
1 µl Primer BIS22 (SEQ ID NO: 11) 330 µg/ml,
1 µl Primer BIS23 (SEQ ID NO: 12) 230 µg/ml,
1 µl Taq DNA Polymerase 5 U/µl (Roche Diagnostics),
in einem Endvolumen von 100 µl.
1 × PCR reaction buffer (Roche Diagnostics),
5 µl genomische DNA (entspricht etwa 80 ng),
je 2,5 mM dATP, dCTP, dGTP und dTTP (Invitrogen: dNTP Mix),
1 µl Primer BIS22 (SEQ ID NO: 11) 330 µg/ml,
1 µl Primer BIS23 (SEQ ID NO: 12) 230 µg/ml,
1 µl Taq DNA Polymerase 5 U/µl (Roche Diagnostics),
in einem Endvolumen von 100 µl.
Folgendes Temperaturprogramm wird verwendet (Thermocycler: MWG
Biotech Primus HT; MWG Biotech, Deutschland):
1 Zyklus mit 180 sec bei 95°C,
30 Zyklen mit 95°C für 40 sec, 53°C für 60 sec und 72°C für 2 min,
1 Zyklus mit 72°C für 5 min.
1 Zyklus mit 180 sec bei 95°C,
30 Zyklen mit 95°C für 40 sec, 53°C für 60 sec und 72°C für 2 min,
1 Zyklus mit 72°C für 5 min.
Das PCR-Produkt wird auf ein 1% (w/v) Agarosegel aufgetragen und
bei 80 V aufgetrennt. Fragmente von etwa 1400 Basenpaaren Länge
werden aus dem Gel ausgeschnitten und mit Hilfe des Qiagen Gel
Extraction Kits (Qiagen, Hilden, Deutschland) aufgereinigt. Das
Eluat von 50 Microlitern kann ggf. eingedampft werden. Die auf
gereinigte DNA wird wie folgt 2 Stunden bei 37°C verdaut:
19 µl aufgereinigte PCR-DNA,
1 µl HindIII Restriktionsenzym (10 U, Roche Diagnostics),
1 µl XbaI Restriktionsenzym (10 U, Roche Diagnostics),
10 µl Puffer B (Roche Diagnostics),
69 µl dest. Wasser.
19 µl aufgereinigte PCR-DNA,
1 µl HindIII Restriktionsenzym (10 U, Roche Diagnostics),
1 µl XbaI Restriktionsenzym (10 U, Roche Diagnostics),
10 µl Puffer B (Roche Diagnostics),
69 µl dest. Wasser.
Anschließend folgt eine Aufreinigung entweder über eine
phenolische Extraktion und eine ethanolische Fällung (Sambrook
et al., 1989) oder alternativ über den PCR Purification Kit
(Roche Diagnostics). Das geschnittene und aufgereinigte DNA-
Fragment wird in das Bluescript-Plasmid (Stratagene) in die
HindIII- und XbaI-Schnittstellen eingefügt. Ligation des Vektors,
Transformation in E.coli Zellen und Analyse der Plasmide erfolgt
nach Standardmethoden (Sambrook et al., 1989). Die Identität
kann durch Sequenzierung des Plasmides und Vergleich mit der
genomischen DNA-Sequenz (Genbank Nummer AB022215) überprüft
werden. Das erhaltene Konstrukt ist pBSK-AtLOX5 (Fig. 2,
Konstrukt I).
Alternativ kann das PCR Produkt direkt in den Velctor pCR4-TOPO
(Invitrogen) nach Herstellerangaben kloniert werden d. h. das
erhaltene PCR-Produkt wird mittels seiner A-Überhänge und einer
Topoisomerase in einen Vektor mit T-Überhängen eingefügt.
Die Klonierungsverfahren ist von Rouster (Rouster J et al. (1997)
Plant Journal 11 (3): 513-523) und Sambrook (Sambrook et al., Mole
cular Cloning. A Laboratory Manual. Second Edition, Cold Spring
Harbor Laboratory Press, 1989) beschrieben.
Eine Feinkartierung des AtLOX5 Promotors, d. h. eine Einengung der
für seine Spezifität relevanten Nukleinsäureabschnitte, erfolgt
durch Herstellung verschiedener Reportergen-Expressionsvektoren,
die zum einen den gesamten Promotorbereich, zum anderen ver
schiedene Fragmente desselben enthalten. Kloniert wird einerseits
die gesamte Promotorregion bzw. Fragmente davon in den pGPTV-GUS-
Kan Vektor (Becker D et al., 1992 Plant Mol Biol 20: 1195-1197).
Dafür werden einerseits Fragmente eingesetzt, die durch die Ver
wendung von Restriktionsenzymen für die internen Restriktions
schnittstellen in der Volllängen-Promotorsequenz erhalten werden.
Andererseits werden PCR-Fragmente eingesetzt, die mit durch
Primer eingeführte Schnittstellen versehen sind.
Für die Klonierung des Volllängen-Promotors wird der Vektor pBSK-
AtLOX5 (Fig. 2, Konstrukt I) mit Hindlil und Xbal: verdaut und das
aus einem 1%igen Agarose-Gel isolierte DNA-Fragment in die Hin
dlii und XbaI-Schnittstellen des pGPTV-GUS-Kan kloniert. Das
erhaltene Konstrukt wird mit pGPTV-LOX5::GUS bezeichnet (Fig. 2,
Konstrukt IV).
Für einen ersten verkürzten Promotor wird pBSK-AtLOX5 mit EcoRI
und XbaI verdaut und das aus einem 1%igen Agarosegel isolierte,
851 Basenpaare große Fragment in pBluescript SK (Stratagene)
subkloniert. Das Insert wird aus dem entstandenen Vektor pBSK-
LOX5(861) (Fig. 2, Konstrukt II) durch Verdau mit HindIII und XbaI
gewonnen, über ein 1%iges Agarosegel isoliert und in pGPTV-GUS-
Kan kloniert. Das erhaltene Konstrukt trägt die Bezeichnung
pGPTVl-LOX5::GUS (Fig. 2, Konstrukt V).
Für einen zweiten verkürzten Promotor wird pBSK-AtLOX5 mit SpeI
und XbaI verdaut und das aus einem 1%igen Agarosegel isolierte,
ca. 521 Basenpaare große Fragment in pBluescript SK (Stratagene)
subkloniert. Das Insert wird aus dem entstandenen Vektor pBSK-
LOX5 (521) (Fig. 2, Konstrukt III) durch Verdau mit HindIII und
XbaI gewonnen, über ein 1%iges Agarosegel isoliert und in pGPTV-
GUS-Kan kloniert. Das erhaltene Konstrukt trägt die Bezeichnung
pGPTV2-LOX5::GUS (Fig. 2, Konstrukt VI).
Zur Herstellung transgener Arabidopsis Pflanzen wird Agro
bacterium turnefaciens (Stamm C58C1 pGV2260) mit verschiedenen
AtLOX5 Promotor-GUS Vektorkonstrukten transformiert. Die Agro
bakterienstämme werden anschließend zur Herstellung transgener
Pflanzen verwendet. Dazu wird eine einzelne transformierte
Agrobakterium-Kolonie in einer 4 ml Kultur (Medium: YEB-Medium
mit 50 µg/ml Kanamycin und 25 µg/ml Rifampicin) über Nacht bei
28°C inkubiert. Mit dieser Kultur wird anschließend eine 400 ml
Kultur in demselben Medium angeimpft, über Nacht inkubiert (28°C,
220 U/min) und abzentrifugiert (GSA-Rotor, 8.000 U/min, 20 min).
Das Pellet wird in Infiltrationsmedium (1/2 MS-Medium; 0,5 g/l
MES, pH 5,8; 50 g/l Saccharose) resuspendiert. Die Suspension
wird in eine Pflanzenbox (Duchefa) eingebracht und 100 ml SIL
WET L-77 (mit Polyalkylenoxid modifiziertes Heptamethyltri
siloxan; Osi Specialties Inc., Cat. P030196) wurde zu einer End
konzentration von 0,02% hinzugegeben. Die Pflanzenbox mit 8 bis
12 Pflanzen wird in einem Exikator für 10 bis 15 Minuten einem
Vakuum mit anschließender spontaner Belüftung ausgesetzt. Dies
wird 2 bis 3 Mal wiederholt. Hernach werden alle Pflanzen in
Pflanztöpfe mit Feuchterde gepflanzt und unter Langtagbedingungen
gezüchtet (Tagestemperatur 22 bis 24°C, Nachttemperatur 19°C; 65%
relative Luftfeuchte). Nach 6 Wochen werden die Samen geerntet.
Alternativ können transgene Arabidopsis Pflanzen durch Wurzel
transformation erhalten werden. Weiße Wurzelsprossen von maximal
8 Wochen alten Pflanzen werden verwendet. Dazu werden Pflanzen,
die unter sterilen Bedingungen in 1 MS-Medium (1% Saccharose;
100 mg/l Inositol; 1,0 mg/l Thiamin; 0,5 mg/l Pyridoxin; 0,5 mg/l
Nicotinsäure; 0,5 g MES, pH 5,7; 0,8% Agar) gehalten werden,
verwendet. Wurzeln werden auf Kallus-induzierendem Medium für
3 Tage kultiviert (1x Gambourg's B5 Medium; 2% Glukosev 0,5 g/l
Mercaptoethanol; 0,8% Agar; 0,5 mg/l 2,4-D (2,4-Dichlorphenoxy
essigsäure); 0,05 mg/l Kinetin). 0,5 cm lange Wurzelabschnitte
werden in 10 bis 20 ml Kallusinduzierendes Flüssigmedium über
führt (Zusammensetzung wie oben beschrieben, jedoch ohne Agar
zusatz) und mit 1 ml der oben beschriebenen Übernacht-Agro
bakterienkultur (gewachsen bei 28°C, 200 U/min in LB) angeimpft
und für 2 min geschüttelt. Die Wurzelexplantate werden nach
Entfernen von überschüssigem Medium durch Abtropfen in Kallus
induzierendes Medium mit Agar überführt, anschließend in Kallus
induzierendes Flüssigmediun ohne Agar (mit 500 mg/l Betabactyl,
SmithKline Beecham Pharma GmbH, München) unter Schütteln
inkubiert und abschließend in Spross-induzierendtes Medium (5 mg/l
2-Isopentenyl-Adenin-Phosphat; 0,15 mg/l Indol-3-Essigsäure;
50 mg/l Kanamycin; 500 mg/l Betabactyl) überführt. Nach 5 Wochen
und 1 bis 2maligem Mediumwechsel werden die kleinen, grünen
Sprösslinge auf Keimungsmedium (1 MS-medium; 1% Saccharose;
100 mg/l Inositol; 1,0 mg/l Thiamin; 0,5 mg/l Pyridoxin; 0,5 mg/l
Nicotinsäure; 0,5 g MES, pH 5,7; 0,8% Agar) gesetzt und zu
Pflanzen regeneriert.
Die Agrobacterium-vermittelte Pflanzentransformation kann unter
Verwendung von Standard-Transformations- und Regenerations
techniken auch zum Zwecke der Transformation von Kulturpflanzen
durchgeführt werden (Gelvin SB, Schilperoort RA (1995) Plant
Molecular Biology Manual, 2. Aufl., Dordrecht: Kluwer Academic
Publ., ISBN 0-7923-2731-4; Glick BR, Thompson, JE (1993) Methods
in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Boca Raton: CRC
Press, ISBN 0-8493-5164-2).
Beispielsweise kann Raps mittels Kotyledonen- oder Hypokotyl
transformation transformiert werden (Moloney et al., Plant
Cell 8 (1989) 238-242; De Block et al., Plant Physiol. 91 (1989)
694-701). Die Verwendung von Antibiotika für die Agrobacterium-
und Pflanzenselektion hängt von dem für die Transformation ver
wendeten binären Vektor und Agrobacterium-Stamm ab. Die Raps
selektion wird gewöhnlich unter Verwendung von Kanamycin
als selektierbarem Pflanzenmarker durchgeführt.
Der Agrobacterium-vermittelte Gentransfer in Lein (Linum
usitatissimum) lässt sich unter Verwendung von beispielsweise
einer von Mlynarova et al. (1994) Plant Cell Report 13: 282-285
beschriebenen Technik durchführen.
Die Transformation von Soja kann unter Verwendung von beispiels
weise einer in EP-A-0 0424 047 (Pioneer Hi-Bred International)
oder in EP-A-0 0397 687, US 5,376,543, US 5,169,770 (University
Toledo) beschriebenen Technik durchgeführt werden.
Die Pflanzentransformation unter Verwendung von Teilchen
beschuss, Polyethylenglycol-vermittelter DNA-Aufnahme oder
über die Siliziumcarbonatfaser-Technik ist beispielsweise
beschrieben von Freeling und Walbot "The maize handbook" (1993)
ISBN 3-540-97826-7, Springer Verlag (New York).
Zur Pflanzentransformation können binäre Vektoren, wie pBinAR
(Höfgen und Willmitzer, Plant Science 66 (1990) 221-230) oder
pGPTV (Becker et al. 1992, Plant Mol. Biol. 20: 1195-1197) ver
wendet werden. Die Konstruktion der binären Vektoren kann durch
Ligation der cDNA in Sense- oder Antisense-Orientierung in
T-DNA erfolgen. 5' der cDNA aktiviert ein Pflanzenpromotor die
Transkription der cDNA. Eine Polyadenylierungssequenz befindet
sich 3' von der cDNA. Die binären Vektoren können unterschied
liche Markergene tragen. So kann etwa die Resistenz durch die
Expression des nptII Markergens unter Kontrolle des 35S oder des
nos Promoters erfolgen. Insbesondere kann das nptII-Markergen
codierend für Kanamycin-Resistenz vermittelt durch Neomycin
phosphötransferase gegen die herbizidresistente Form eines
Acetolactat Synthasegens (AHAS oder ALS) ausgetauscht werden.
Das ALS-Gen ist beschrieben in Ott et al., J. Mol. Biol. 1996,
263: 359-360. Geeignet für manche Pflanzen ist auch die Verwendung
des Hygromycin-Resistenz-Gens. Der v-ATPase-c1-Promotor kann
in das Plasmid pBinl9 oder pGPTV kloniert werden und durch
Klonierung vor die kodierende Region des ALS Gens für die Marker
genexpression genutzt werden. Der genannte v-ATPase-c1-Promotor
entspricht einem 1153 Basenpaarfragment aus Beta vulgaris (Plant
Mol Biol, 1999, 39: 463-475). Der genannte nos Promoter. Dabei
können sowohl Sulphonylharnstoffe als auch Imidazolinone wie
Imazethapyr oder Sulphonylharnstoffe als Antimetaboliten zur
Selektion verwendet werden. Alternativ kann auch der nos-Promoter
für die Markergenexpression verwendet werden.
Um die Eigenschaften des Promotors zu bestimmen und die
essentiellen Elemente desselben, die seine Gewebespezifität
ausmachen, zu identifizieren, ist es erforderlich, den Promotor
selbst und verschiedene Fragmente desselben vor ein sogenanntes
Reportergen zu setzen, das eine Bestimmung der Expressions
aktivität ermöglicht. Beispielhaft sei die bakterielle
β-Glucuronidase genannt (Jefferson et al., EMBO J. 1987, 6,
3901-3907). Die β-Glucuronidase Aktivität kann in-planta mittels
eines chromogenen Substrates wie 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-
β-D-Glucuronsäure im Rahmen einer Aktivitätsfärbung bestimmt
werden (Jefferson, 1987, Plant Molecular Biology Reporter 5,
387-405). Für die Untersuchungen der Gewebespezifität wird
das pflanzliche Gewebe geschnitten, eingebettet, gefärbt und
analysiert wie beschrieben (z. B. Bäumlein H et al., 1991 Mol
Gen Genet 225: 121-128). Besonders vorteilhaft ist es Embryonen
aus unreifen oder reifen Samen herauszupräparieren und erst
dann zu färben (siehe Fig. 1). Ebenso können ungeöffnete Blüten
gefärbt werden, um eine Promoteraktivität durch GUS-Färbung
im Pollen nachzuweisen.
Ein zweiter Assay erlaubt eine quantitative Bestimmung der
GUS-Aktivität in dem untersuchten Gewebe. Für die quantitative
Aktivitätsbestimmung wird als Substrat für die β-Glucuronidase
MUG (4-Methyl-umbelliferyl-beta-D-glucuronid) verwendet, das
in MU (Methyl-umbelliferon) und Glucuronsäure gespalten wird.
Dabei wird zunächst ein Proteinextrakt des gewünschten Gewebe
hergestellt, dem dann das Substrat der GUS zugesetzt wird. Das
Substrat ist erst nach der Umsetzung durch GUS fluorimetrisch
messbar. Zu verschiedenen Zeitpunkten werden Proben entnommen,
die anschließend im Fluorimeter gemessen werden. Dieser Test kann
z. B. mit Leinembryonen verschiedener Altersstadien durchgeführt
(21, 24 oder 30 Tage nach Beginn der Blüte, daf = days after
flowering). Dazu wird je ein Embryo in einem 2 ml-Reaktionsgefäß
mit Hilfe einer Schwingmühle (Retsch MM 2000) in flüssigem Stick
stoff zu Pulver zerrieben. Nach Zugabe von 100 ml EGL-Puffer wird
für 10 min bei 25°C und 14000 × g zentrifugiert. Der Überstand
wird abgenommen und ein zweites Mal zentrifugiert. Wieder wird
der Überstand in ein neues Reaktionsgefäß überführt und bis zur
weiteren Verwendung auf Eis gehalten. Von diesem Proteinextrakt
werden 25 ml mit 65 ml EGL-Puffer (ohne DTT) versetzt und für den
GUS-Assay eingesetzt. Nun werden 10 ml des Substrates MUG (10 mM
4-Methyl-umbelliferyl-β-D-glucuronid) dazugegeben, gevortext und
sofort 30 ml als Nullwert entnommen und mit 470 ml Stopp-Puffer
(0,2 M Na2CO3) versetzt. Dieser Vorgang wurde für alle Proben in
einem Abstand von 30 s wiederholt. Die entnommenen Proben wurden
bis zur Messung im Kühlschrank gelagert. Weitere Messwerte wurden
nach 1 h und nach 2 h entnommen. Für die Messung im Fluorimeter
wurde eine Eichreihe erstellt, die Konzentrationen von 0,1 mM bis
10 mM MU (4-Methyl-umbelliferon) enthielt. Waren die Probenwerte
außerhalb dieser Konzentrationen, wurde weniger Proteinextrakt
eingesetzt (10 ml, 1 ml, 1 ml aus 1 : 10 Verdünnung), und es wurden
kürzere Zeitabstände gemessen (0 h, 30 min, 1 h). Die Messung
erfolgte bei einer Exitation von 365 nm und einer Emission von
445 nm in einem Fluoroscan II-Gerät (Labsystem). Alternativ kann
die Substratspaltung unter alkalischen Bedingungen fluorometrisch
verfolgt werden (Anregung bei 365 nm, Messung der Emission bei
455 nm; Spectro Fluorimeter BMG Polarstar+) wie beschrieben in
Bustos M. M. et al., 1989 Plant Cell 1: 839-853. Alle Proben wurden
einer Proteinkonzentrationsbestimmung nach Bradford (1976) unter
zogen, um so eine Aussage über die Promoteraktivität und -stärke
in verschiedenen Geweben und Pflanzen erlauben.
EGL-Puffer,
0,1 M KPO4, pH 7,8,
1 m MEDTA,
5% Glycerin,
1M DTT
EGL-Puffer,
0,1 M KPO4, pH 7,8,
1 m MEDTA,
5% Glycerin,
1M DTT
Um die Promoteraktivität zu modifizieren oder wichtige Promotor
elemente zu identifizieren, sind dem Fachmann verschiedene Ver
fahren bekannt. Eines basiert auf der zufälligen Mutation und
nachfolgenden Testung mit Reportergenen wie zuvor beschrieben.
Die in vivo-Mutagenese von Mikroorganismen kann mittels Passage
der Plasmid-(oder einer anderen Vektor-)DNA durch E. coli
oder andere Mikroorganismen (z. B. Bacillus spp. oder Hefen,
wie Saccharomyces cerevisiae), bei denen die Fähigkeiten, die
Unversehrtheit ihrer genetischen Information aufrechtzuerhalten,
gestört ist, erfolgen. Übliche Mutator-Stämme haben Mutationen
in den Genen für das DNA-Reparatursystem (z. B. mutHLS, mutD,
mutT usw.; als Literaturstelle siehe Rupp WD (1996) DNA repair
mechanisms, in: Escherichia coli and Salmonella, S. 2277-2294,
ASM: Washington). Diese Stämme sind dem Fachmann. bekannt. Die
Verwendung dieser Stämme ist beispielsweise erläutert bei Greener
A und Callahan M (1994) Strategies 7: 32-34. Der Transfer mutier
ter DNA-Moleküle in Pflanzen erfolgt vorzugsweise nach Selektion
und Test der Mikrooganismen. Transgene Pflanzen werden analog den
unter Beispiel 6 bis 9 hergestellt und analysiert.
Claims (21)
1. Expressionskassette zur transgenen Expression von Nuklein
säuren enthaltend
- a) den Promotor des LOX5 Gens aus Arabidopsis thaliana gemäß SEQ ID NO: 1, oder
- b) eine Deletionsvariante des LOX5 Gens aus Arabidopsis thaliana gemäß SEQ ID NO: 2 oder 3, oder
- c) funktionelle Äquivalente oder äquivalente Fragmente von a) oder b), die im wesentlichen die gleichen Promotor aktivitäten wie a) oder b) besitzen,
wobei a) oder b) funktionell mit einer transgen zu
exprimierenden Nukleinsäuresequenz verknüpft sind.
2. Expressionskassette nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
dass
- a) die zu exprimierende Nukleinsäuresequenz mit weiteren genetischen Kontrollsequenzen funktionell verknüpft ist, oder
- b) die Expressionskassette zusätzliche Funktionselemente enthält, oder
- c) a) und b) gegeben sind.
3. Expressionskassette nach einem der Ansprüchen 1 oder 2,
dadurch gekennzeichnet, dass die transgen zu exprimierende
Nukleinsäuresequenz
- a) die Expression eines von besagter Nukleinsäuresequenz kodierten Proteins, oder
- b) die Expression eines von besagter Nukleinsäuresequenz kodierter sense oder anti-sense-RNA
4. Expressionskassette nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei
die transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz ausgewählt
ist aus Nukleinsäuren kodierend für Aminosäuretransporter,
Saccharidtransporter, Phytasen, Lipasen, Triacylglycerol-
Lipasen, Acetyl-CoA Carboxylasen, Endochitinasen, das
N-hydroxylierende, multifunktionelle Cytochrom P-450, den
transkriptionellen Aktivator CBF1, Invertasen, das 2S Albumin
aus Bertholletia excelsa, Endoxylglucantransferasen, Phytoen
desaturasen, das ABI3-Protein, das VP-1 Protein, "anti
freeze"-Proteinen, Glutamatdehydrogenasen, einem späten
Embryogenesegen (LEA), Calcium-abhängigen Proteinkinasen,
Calcineurinen, Farnesyltransferasen, Ferritin, Oxalatoxidase,
DREBIA-Faktor, Trehalosephosphatsynthase, Trehalosephosphat
phosphatase, Trehalase, Cellulasen, Chitinasen, Glucanasen,
Ribosom-inaktivierende Proteine, Lysozyme, Bacillus thurin
giensis Endotoxin, a-Amylaseinhibitor, Proteaseinhibitoren,
Lektine, RMAasen, Ribozyme, Fettsäuredesaturasen, Fettsäure
elongasen, Coffeinsäure-O-methyltransferase, Cinnamoyl
alkoholdehydrogenase, AINTEGUMENT-Gen, Lipoxygenasen, ADP
glucose phosphorylasen, Cruciferin Speicherproteine.
5. Expressionskassette nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei
die transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz ausgewählt
ist aus der Gruppe der Nukleinsäurensequenzen mit den Genbank
Accession-Nummern X92657, M20308, AJ002399, A19451, U40256,
AB039325, L25042, S78423, U32624, U77378, V01311, AB044391,
AF163819, X78815, AF306348, M60214, X6ß141, AJ222980,
AF078796, AJ302043, X92890, AJ271162, X14555.
6. Vektor enthaltend eine Expressionskassette gemäß einem
der Ansprüche 1 bis 5.
7. Verfahren zur transgenen Expression von Nukleinsäuren,
dadurch gekennzeichnet, dass eine Nukleinsäuresequenz in
funktioneller Verknüpfung mit
- a) dem Promotor des LOXS Gens aus Arabidopsis thaliana gemäß SEQ ID NO: 1, oder
- b) einer Deletionsvariante des LOX5 Gens aus Arabidopsis thaliana gemäß SEQ ID NO: 2 oder 3, oder
- c) einem funktionelle Äquivalent oder äquivalente Fragment von a) oder b), das im wesentlichen die gleichen Promotoraktivitäten wie a) oder b) besitzt,
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass
- a) die zu exprimierende Nukleinsäuresequenz mit weiteren genetischen Kontrollsequenzen funktionell verknüpft ist, oder
- b) eine verwendete Expressionskassette zusätzliche Funktionselemente enthält, oder
- c) a) und b) gegeben sind.
9. Verfahren nach einem der Ansprüchen 7 oder 8, dadurch gekenn
zeichnet, dass die transgen zu exprimierende Nukleinsäure
sequenz
- a) die Expression eines von besagter Nukleinsäuresequenz kodierten Proteins, oder
- b) die Expression eines von besagter Nukleinsäuresequenz kodierter sense oder anti-sense-RNA
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, wobei die
transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz ausgewählt
ist aus Nukleinsäuren kodierend für Aminosäuretransporter,
Saccharidtransporter, Phytasen, Lipasen, Triacylglycerol-
Lipasen, Acetyl-CoA Carboxylasen, Endochitinasen, das
N-hydroxylierende, multifunktionelle Cytochrom P-450, den
transkriptionellen Aktivator CBF1, Invertasen, das 2S Albumin
aus Bertholletia excelsa, Endoxylglucantransferasen, Phytoen
desaturasen, das ABI3-Protein, das VP-1 Protein, "anti
freeze"-Proteinen, Glutamatdehydrogenasen, einem späten
Embryogenesegen (LEA), Calcium-abhängigen Proteinkinasen,
Calcineurinen, Farnesyltransferasen, Ferritin, Oxalatoxidase,
DREBIA-Faktor, Trehalosephosphatsynthase, Trehalosephosphat
phosphatase, Trehalase, Cellulasen, Chitinasen, Glucanasen,
Ribosom-inaktivierende Proteine, Lysozyme, Bacillus thurin
giensis Endotoxin, a-Amylaseinhibitor, Proteaseinhibitoren,
Lektine, RMAasen, Ribozyme, Fettsäuredesaturasen, Fettsäure
elongasen, Coffeinsäure-O-methyltransferase, Cinnamoyl
alkoholdehydrogenase, AINTEGUMENT-Gen, Lipoxygenasen, ADP
glucose phosphorylasen, Cruciferin Speicherproteine.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 10, wobei die
transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz ausgewählt
ist aus der Gruppe der Nukleinsäurensequenzen mit den Genbank
Accession-Nummern X92657, M20308, AJ002399, A19451, U40256,
AB039325, L25042, S78423, U32624, U77378, V01311, AB044391,
AF163819, X78815, AF306348, M60214, X68141, AJ222980,
AF078796, AJ302043, X92890, AJ271162, X14555.
12. Transgener Organismus transformiert mit einer Expressions
kassette gemäß den Ansprüchen 1 bis 5 oder einem Vektor gemäß
Anspruch 6.
13. Transgener Organismus nach Anspruch 12 ausgewählt aus der
Gruppe bestehend aus Bakterien, Hefen, Pilzen, tierischen und
pflanzlichen Organismen
14. Zellkulturen, Teile oder transgenes Vermehrungsgut abgeleitet
von einem transgenen Organismus nach einem cler Ansprüche 12
oder 13.
15. Verwendung eines transgenen Organismus nach einem der
Ansprüche 12 oder 13 oder von diesem abgeleitete Zell
kulturen, Teile oder transgenes Vermehrungsgut nach
Anspruch 14 zur Herstellung von Nahrungs-, Futtermitteln,
Saatgut, Pharmazeutika oder Feinchemikalien.
16. Verwendung nach Anspruch 15, wobei die Feinchemikalien
Enzyme, Vitamine, Aminosäuren, Zucker, gesättigte oder
ungesättigte Fettsäuren, natürliche oder synthetische
Geschmacks-, Aroma- oder Farbstoffe sind.
17. Verwendung nach Anspruch 15, wobei das Pharmazeutikum ein
Antikörper, Enzym oder pharmazeutisch aktives Protein ist.
18. Verfahren zur Herstellung von Pharmazeutika oder Fein
chemikalien in transgenen Organismen nach einem der
Ansprüche 12 oder 13 oder von diesen abgeleiteten Zell
kulturen, Teilen oder transgenes Vermehrungsgut, dadurch
gekennzeichnet, dass der transgene Organismus gezüchtet
und das gewünschte Pharmazeutikon oder die gewünschte
Feinchemikalie isoliert wird.
19. Verfahren nach Anspruch 18, wobei die Feinchemikalien Enzyme,
Vitamine, Aminosäuren, Zucker, gesättigte oder ungesättigte
Fettsäuren, natürliche oder synthetische Geschmacks-, Aroma-
oder Farbstoffe sind.
20. Verfahren nach Anspruch 18, wobei das Pharmazeutikum ein
Antikörper, Vakzine, Enzym oder pharmazeutisch aktives
Protein ist.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE2001127882 DE10127882A1 (de) | 2001-06-11 | 2001-06-11 | Expressionskonstrukte zur transgenen Expression von Nukleinsäuren |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE2001127882 DE10127882A1 (de) | 2001-06-11 | 2001-06-11 | Expressionskonstrukte zur transgenen Expression von Nukleinsäuren |
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN112326966A (zh) * | 2020-11-02 | 2021-02-05 | 杭州昱鼎生物科技有限公司 | 一种新型冠状病毒抗原的快速检测试剂盒及其制备方法和应用 |
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2001
- 2001-06-11 DE DE2001127882 patent/DE10127882A1/de not_active Withdrawn
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CN112326966A (zh) * | 2020-11-02 | 2021-02-05 | 杭州昱鼎生物科技有限公司 | 一种新型冠状病毒抗原的快速检测试剂盒及其制备方法和应用 |
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