DE10225066A1

DE10225066A1 - Neue Expressionssysteme für Pflanzen

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Publication number: DE10225066A1
Application number: DE2002125066
Authority: DE
Original assignee: BASF Plant Science GmbH
Current assignee: BASF Plant Science GmbH
Priority date: 2002-06-06
Filing date: 2002-06-06
Publication date: 2003-12-18

Abstract

Die Erfindung betrifft transgene replizierbare doppelsträngige RNA-Moleküle und deren Verwendung zur Suppression der Expression endogener Gene oder als Expressionssystem zur transgenen Expression von Proteinen. Umfasst sind ferner Expressionskassetten zur Expression besagter doppelsträngiger RNA-Moleküle, sowie Organismen, insbesondere Pflanzen, umfassend besagte doppelsträngige RNA-Moleküle oder Expressionskassetten, bevorzugt transgene Pflanzen, und davon abgeleitete Kulturen, Teile oder Vermehrungsgut.

Description

Die Erfindung betrifft transgene replizierbare doppelsträngigen RNA-Molekülen und deren Verwendung zur Suppression der Expression endogener Gene oder als Expressionssystem zur transgenen Expression von Proteinen. Umfasst sind ferner Expressionskassetten zur Expression besagter doppelsträngiger RNA-Moleküle, sowie Organismen, insbesondere Pflanzen, umfassend besagte doppelsträngige RNA-Moleküle oder Expressionskassetten, bevorzugt transgene Pflanzen, und davon abgeleitete Kulturen, Teile oder Vermehrungsgut.

Ziel biotechnologischer Arbeiten an Pflanzen ist die Herstellung von Pflanzen mit vorteilhaften, neuen Eigenschaften zum Beispiel zur Steigerung der landwirtschaftlichen Produktivität, zur Qualitätssteigerung bei Nahrungsmitteln oder zur Produktion bestimmter Chemikalien oder Pharmazeutika. Zu diesem Zweck ist kann die Expression heterogener DNA-Moleküle oder aber auch die Suppression der Expression endogener Gene erforderlich sein.

Verschiedene Expressionssysteme als auch Systeme zur Suppression der Expression endogener Gene für Pflanzen sind dem Fachmann bekannt. Zu diesen zählen insbesondere auch virale Expressionssysteme basierend auf Pflanzenviren. Transiente Expressionssysteme auf der Basis von Virusgenomen, d. h. ohne Integration des gewünschten Fremdgens im pflanzlichen Genom, haben Vorteile gegenüber den üblichen stabilen Expressionsverfahren. Da es möglich ist mit hoher Effizienz Protoplasten, Zellkulturen oder intakte Pflanzen mit Virus-RNA-Transkripten bzw. Derivaten zu transfizieren, besteht ein Vorteil darin, dass teils langwierige teils schwierige Regenerationsverfahren umgangen werden können.

Als Expressionssystem basierend auf einen DNA-Virus sind Systeme abgeleitet vom Blumenkohlmosaikvirus zu nennen. Diesen sind jedoch unvorteilhaft, da z. B. der Wirtskreis des CaMV sehr klein ist und Pflanzen außerhalb des Wirtskreises mit chimären Konstrukten nicht infiziert werden können. Bei allen Viren der Caulimovirus-Gruppe ist weiterhin die Insertionsgröße streng limitiert (maximal 1 kb). Selbst innerhalb dieser Grenzen kommt es relativ häufig zu Deletionen von Fremdsequenzen, was auf den retroviralen Replikationsmechanismus dieser Viren zurückzuführen ist. Virusgenome mit integriertem Fremdgen bleiben infektiös und induzieren in der Wirtspflanze Symptome. Bei allen DNA-Viren ist es praktisch unmöglich eine gewebe- bzw. entwicklungsspezifische Expression der gewünschten Fremdgene zu erreichen. Die Expression findet hauptsächlich in grünen Pflanzenteilen statt. Gerade beim "protein farming" ist jedoch eine spezifische Expression im Samen, der sich durch höheren Proteinanteil an der Gesamtmasse auszeichnet und durch geringen Wassergehalt lagerfähig ist, erstrebenswert.

Bezüglich der gezielten Inhibition der Genexpression definierter Gene ist die Expression von antisense-RNA der am häufigsten verwendet Ansatz (u. a. EP-A1 0 458 367; EP-A1 0 140 308; von der Krol AR et al. (1988) BioTechniques 6(10): 658-676; de Lange P et al. (1995) Curr Top Microbiol Immunol 197: 57-75). Antisense- RNA vermittelte Ansätze haben jedoch den Nachteil, dass stöchiometrische Mengen der antisense-RNA erforderlich sind, um eine wirksame Inhibition der Ziel-mRNA zu bewirken. Weitere Probleme stehen im Zusammenhang mit dem Einbringen der antisense-RNA in ausreichenden Mengen in die Zellen und mit der Labilität der antisense-RNA. Ansätze basierend auf antisense-RNA sind daher meist ineffizient.

Ein weiterer Ansatz zur Genregulation ist die "Co-Suppression" und meint die Verminderung der Expression eines endogenen Zielgens durch transgene Expression einer sense-RNA dieses Zielgens (EP-A1 0 465 572). Der Co-Suppression liegen vermutlich mehr als ein Mechanismus zugrunde. Nachteilig ist die mangelnde Verlässlichkeit und Reproduzierbarkeit des Verfahrens. In manchen Fällen erfolgt Suppression, während in anderen Fällen - bedingt durch die Expression der sense-RNA - die erwartete Überexpression erfolgt. Auch ist der erhaltene Phänotyp oft nicht stabil. Die Anwendung der Co-Suppression ist im wesentlichen auf Pflanzen beschränkt.

Systeme basierend auf einzelsträngigen RNA-Viren werden sowohl als Expressionssysteme (WO 94/01408) als auch zur Suppression der Expression endogener Gene eingesetzt (WO 98/38083; WO 99/15682; WO 95/34668; Ratcliff F et al. (2001) Plant J 25(2): 237-245). Die Suppression der Expression endogener Gene durch virale Konstrukte wird aus als "virus induced gene silencing" (VIGS) bezeichnet (Baulcombe D (1999) Curr Opin Plant Biol 2: 109-113).

Den beschriebenen RNA-Virussystemen, sowohl denen zur Expression als auch denen zur Gensuppression, sind eine Reihe von Problemen eigen:

1. Replizierte RNA-Virussysteme sind in der Regel autonom: Gelangt die RNA in die Pflanzenzelle, kann die Replikation nicht mehr gesteuert werden. Zum einen ist dadurch gewebespezifische Expression ausgeschlossen. Das Fremdprotein entsteht dort, wo sich auch das Virus replizieren kann. Zum anderen wirft dies Sicherheitsbedenken auf: Zusammen mit leichter Übertragbarkeit der RNA (mechanisch) auf andere Pflanzen könnten solche Konstrukte außer Kontrolle geraten. Zur Lösung wurde eine Expression der Replikase in trans - beispielsweise nach Integration einer entsprechenden Expressionskassette in das Genom der Pflanze - vorgeschlagen (WO 94/01408; Ahlquist und Pacha (1990) Physiol Plant 79: 163-167; Leiser RM (1990) Kulturpflanzen 38: 81-90).
2. RNA-Replikasen haben i. d. R. keine "proof reading"-Mechanismen, was nach wenigen Replikationszyklen zu Fehlern insbesondere im Insert führt, weil hier die Selektion fehlt.
3. Die Aufnahmekapazität der meisten Viren für zusätzliche Sequenzen ist stark limitiert. Übersteigt die Größe der transgenen Virus Nukleinsäuresequenz eine bestimmte Größe, so kann beispielsweise eine Verpackung in die Virushüllproteine nicht mehr erfolgen. Da das Virus während des Replikationsvorganges die für es stabilste Form wählt, können - z. B. durch spontane Deletionen - nicht-essentielle Sequenzen (wie zum Beispiel eingefügte heterogene Nukleinsäuresequenzen) entfallen.
4. Durch Rekombination insbesondere an duplizierten viralen Sequenzen können in relativ kurzer Zeit große Teile bzw. die gesamte insertierte Sequenz deletiert werden. Die Deletion des Inserts führt schnell zur Einstellung der Fremdproteinsynthese, weil die entstehenden RNA-Spezies besser replizieren und mit inserttragenden Formen effektiv konkurrieren.
5. Die Pflanze hat Abwehrmechanismen gegen Viren entwickelt, so dass die Replikation oder andere essentielle Funktionen des Virus schnell inhibiert werden und eine Virusinfektion selten langanhaltend und noch seltener vererbbar ist. Damit sind dann auch entsprechende negative Effekte auf die transgenen Systeme - nämlich eine nur selten langanhaltende, wenig konstante Wirkung - verbunden. Darüberhinaus neigen die bislang eingesetzten Viren dazu, in das Genom ihres Wirtes zu insertieren. Auch dies kann sich nachteilig auf Eigenschaften oder Wert der Pflanze auswirken, sowie Zulassung und/oder Vermarktung erschweren.
6. Bei Verwendung vollständiger Viren besteht die Möglichkeit einer horizontalen Transmission, die aus ökologischen und regulatorischen Gründen nicht gewünscht ist.
7. Die virus-infizierte Pflanze wird oft durch den Virus (z. B. durch virale Proteine) geschädigt oder wenigstens in ihren Eigenschaften oder Wert beeinträchtigt.

WO 99/32619 und WO 99/53050 beschreiben Verfahren zur Inhibition einzelner Zielgene unter Verwendung einer RNA mit doppelsträngiger Struktur, wobei das Zielgen und die Region der RNA Duplex zumindest eine teilweise Identität aufweisen (siehe auch: Montgomery MK et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95: 15502-15507; Sharp PA (1999) Genes & Development 13(2): 139-141; Fire A et al. (1998) Nature 391: 806-11). Das Verfahren wird heute auch als "RNA-Interference" (RNAi) bezeichnet.

Eine seltene Klasse von Viren stellen die doppelsträngigen RNA- Viren dar. Im Unterschied zu den oben genannten RNA-Viren, die eine doppelsträngige RNA-Struktur - wenn überhaupt - nur während der Replikation aufweisen, besteht das Genom dieser Viren aus doppelsträngiger RNA. Doppelsträngige RNA-Viren wurden in Bakterien, Pilzen, Pflanzen und Tieren identifiziert. Zu den doppelsträngigen RNA-Viren zählen die Reoviridae, die wiederum die Reoviren und die Rotaviren (Bellamy AR und Both GW (1990) Adv Virus Res 38: 1-38) umfassen. Weiterhin zählen die Birnaviridae (z. B. "bursal disease virus" bei Hühneren), Bakteriophagen Φ6 sowie die unsegmentiertem Totiviridae (wie z. B. der L-A Virus der Hefe) zu den doppelsträngigen RNA-Viren. Zu den pflanzlichen doppelsträngigen RNA-Viren zählen insbesondere die Reoviren, sowie Cryptoviren und Mycoviren. Pflanzliche Reoviren umfassen zwei Gattungen: Phytoreoviren und Fijiviren. Doppelsträngie Viren wurden bislang nicht im Rahmen von gentechnischen oder biotechnologischen Arbeiten eingesetzt.

Es stellte sich die Aufgabe, Systeme bereitzustellen, die sich durch die vorteilhaften Eigenschaften viraler Systeme auszeichnen oder diese übertreffen, ohne zugleich deren Nachteile aufzuweisen. Diese Aufgabe wird durch die vorliegende Erfindung gelöst.

Ein erster Gegenstand der Erfindung betrifft eine transgene doppelsträngige Ribonukleotidsequenz, wobei besagte transgene doppelsträngige Ribonukleotidsequenz Sequenzen umfasst, die eine Replikation durch eine RNA-abhängige RNA-Polymerase ermöglichen.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Replikationssystem für doppelsträngige Ribonukleotidsequenzen umfassend in einem Reaktionsraum

a) mindestens eine transgene doppelsträngige Ribonukleotidsequenz, wobei besagte transgene doppelsträngige Ribonukleotidsequenz Sequenzen umfasst, die eine Replikation durch eine RNA-abhängige RNA-Polymerase ermöglichen, und
b) eine RNA-abhängige RNA-Polymerase befähigt zur Replikation einer transgenen doppelsträngigen Ribonukleotidsequenz a),

wobei mindestens ein Teil der transgenen doppelsträngigen Ribonukleotidsequenz durch die RNA-abhängige RNA-Polymerase repliziert wird.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft Verfahren zur Expression von Proteinen durch Einbringen des erfindungsgemäßen Replikationssystems in einen eukaryotischen Rezipientenorganismus, wobei die transgene doppelsträngigen Ribonukleotidsequenz eine insertierte Nukleinsäuresequenz kodierend für das zu exprimierende Protein sowie gegebenenfalls weitere für die Translation erforderliche Sequenzen umfasst.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft Verfahren zur Verminderung der Expression eines endogenen Zielgens durch Einbringen des erfindungsgemäßen Replikationssystems in einen eukaryotischen Rezipientenorganismus, wobei die transgene doppelsträngigen Ribonukleotidsequenz eine insertierte Nukleinsäuresequenz umfasst, die zumindest teilweise identisch ist zu mindestens einem Teil des "sense"-RNA-Transkriptes mindestens eines endogenen Zielgens.

Eine "transgene doppelsträngige Ribonukleotidsequenz Ribonukleotidsequenz umfassend Sequenzen, die eine Replikation durch eine RNA-abhängige RNA-Polymerase ermöglichen" (infolge transgenes dsRNA-Replikon) ist breit zu verstehen und meint allgemein all solche Sequenzen, die Sequenzen aufweisen, die eine Replikation unter Verwendung einer RNA-abhängigen Polymerase, bevorzugt einer doppelsträngigen-RNA-abhängigen Polymerase, ermöglichen.

"Transgen" meint im Rahmen dieser Erfindung - beispielsweise in Bezug eine auf ein dsRNA-Replikon oder den (+)-RNA Strang desselben - alle solche durch gentechnische Methoden zustandegekommene Konstruktionen, die neben den von einem natürlich vorkommenden replizierbaren Ribonukleinsäuremolekül - beispielsweise einem doppelsträngigen RNA-Virus - abgeleiteten Sequenzen mindestens eine insertierte Nukleinsäuresequenz umfassen, die sich nicht in ihrer natürlichen, genetischen Umgebung oder Zustand befindet, oder die durch gentechnische Methoden modifiziert wurden, wobei die Modifikation beispielhaft eine Substitution, Addition, Deletion, Inversion oder Insertion eines oder mehrerer Nukleotidreste umfassen kann.

"Sequenzen, die eine Replikation unter Verwendung einer RNA- abhängigen Polymerase, bevorzugt einer doppelsträngigen-RNA abhängigen Polymerase, ermöglichen", können von natürlichen, replizierenden doppelsträngigen Ribonukleinsäuremolekülen abgeleitet werden. Replizierende doppelsträngige Ribonukleinsäuremoleküle sind beispielsweise für zahlreiche Pflanzen beschrieben worden (Ref. siehe unten). Meist sind diese doppelsträngige Ribonukleinsäuremoleküle viralen Ursprungs, teils ist eine Einstufung als "Virus" nicht ohne weiteres möglich, da eine ausgeprägte pathogene Symptome einer viralen Infektion nicht festzustellen sind und damit ein wesentliches definitionsgemäßes Kriterium eines Virus fehlt. Derartige Systeme werden auch als Cryptoviren bezeichnet. Es wird jedoch diskutiert on diese überhaupt echte Viren darstellen oder nicht eher als sub-virale Agentien einzustufen sind. Für diese "endogenenen dsRNA" wird die Bezeichnung "Endornaviren" vorgeschlagen (Gibbs MJ et al (2000) J Gen Virol 81: 227-233).

Im Rahmen dieser Erfindung seien all solche Systeme als doppelsträngige RNA-Viren bezeichnet, deren Genom aus doppelsträngiger RNA besteht und die sich mittels einer RNA-abhängigen RNA-Polymerase replizieren jedoch autonom nicht existieren können, sondern dazu auf ihren Wirt angewiesen sind.

Bevorzugt ist das transgene dsRNA-Replikon von einem doppelsträngigen RNA-Virus (infolge "dsRNA-Virus") abgeleitet. dsRNA- Viren sind für zahlreichen Organismen (Tiere, Pflanzen, Pilze, Bakterien) beschrieben (Libonata et al. (1980) Mol Cell Biochem 31: 147-164). dsRNA-Viren sind genetische Elemente bestehend aus einem oder mehreren doppelsträngigen Ribonukleinsäuremolekülen, die sich als obligat intrazelluläre Parasiten unabhängig von den Chromosomen einer Zelle replizieren können, bei ihrer Replikation aber die Stoffwechselmaschinerie des Wirts nutzen. dsRNA-Viren umfassen beispielhaft jedoch nicht einschränkend:

1. Birnaviridae umfassend
- a) Aquabirnaviren (z. B. Infectious pancreatic necrosis virus)
- b) Avibirnaviren (z. B. Infectious bursal disease virus; Gumboro Virus)
- c) Entomobirnaviren (z. B. Drosophila x Virus)
- d) Unklassifizierte Birnaviridae (z. B. "marine birnavirus" und "yellowtail ascites virus")
2. Cystoviridae umfassend
- a) Cystoviren (z. B. die Bacteriophagen Φ10, Φ12, Φ7, Φ8, Φ9 und den Pseudomonas Phagen Φ6)
3. Hypoviridae umfassend
- a) Hypoviren (z. B. Cryphonectria Hypovirus, Cryphonectria Hypovirus 1, Cryphonectria Hypovirus 1-EP713, Cryphonectria Hypovirus 3, Cryphonectria parasitica Hypovirulenz-assoziierter Virus)
4. Partitiviridae umfassend
- a) Alphacryptoviren oder Cryptoviren (z. B. Alfalfa 1 Alphacryptovirus, Beet cryptic virus 1, 2 und 3 (Xie WS et al. (1994) Annals of Applied Biology 124: 451-459; Kasanis B et al. (1977) Phytopathologische Zeitschrift 90: 350-360; Kassanis B et al. (1978) Phytopathologische Zeitschrift 91: 76-79; Kassanis B (1977) Phytopathologische Zeitschrift 90: 350-360; White RF und Woods RD (1978) Phytopathologische Zeitschrift 91: 91-93), Vicia cryptic virus, Carnation 1 Alphacryptovirus (Lisa V et al. (1981) Virology 115: 410-413; Lisa V et al. (1981) Annals of Applied Biology 98: 431-437; Lisa V et al. (1981) Virology 115: 410-413), Carrot temperate alphacryptovirus 1, 3 und 4, Cocksfoot alphacryptovirus, Hop trefoil alphacryptovirus 1 und 3, Radish yellow edge alphacryptovirus, Ryegrass alphacryptovirus, Spinach temperate alphacryptovirus, White clover alphacryptovirus 1 und 3).
  Cryptoviren, ihre Eigenschaften und Sequenzen sind dem Fachmann bekannt (u. a. Antoniw JF (1990) Cryptic viruses of beet and other plants. S. 273-292 in: Recognition and Response in Plant-Virus Interactions. RSS Fraser, ed. Springer-Verlag, Berlin; Boccardo G et al. (1987) Cryptic plant viruses. S. 171-214 in: Advances in Virus Research. K Maramorosch and FA Murphy, ed. Academic Press, Orlando; Boccardo G et al. (1983) Cryptic viruses in plants. S. 425-430 in: Double-Stranded RNA Viruses. RW Compans and DHL Bishop, ed. Elsevier Biomedical, New York). Cryptoviren oder Alphacryptoviren weisen keine Symptome auf oder zeigen nur kurz nach Infektion schwachse Symptome. Ihre Konzentration in dem Wirt ist im allgemeinen gering. Die Transmission erfolgt in der Regel über den Samen oder Pollen, ist aber auch mechanisch möglich. Ein breites Spektrum von Wirtpflanzen ist empfänglich für Alphacryptoviren wie beispielsweise Beta vulgaris, Brassica campestris, Brassica rapa, Capsicum annuum, Daucus carota, Medicago lupulina, Medicago sativa, Spinacia oleracea, Vicia faba und andere mehr. Alphcryptovirenvirionen haben eine isometrische Morphologie und weisen keine Hüllproteine auf. Ihr Genom besteht oft aus ein bis drei linearen dsRNA-Molekülen mit einer Gesamtlänge von ca. 3 bis 7 kb, die für ein oder zwei Proteine kodieren.
- b) Partitiviren (Discula destructiva virus 2, Fusarium poae virus 1 (FUPO-1), Heterobasidion annosum partitivirus, Rhizoctonia solani 717 partitivirus, Rhizoctonia solani virus)
- c) unklassifizierte Partitiviridae (z. B. Atkinsonella hypoxylon partitivirus, Discula destructiva virus 1, Gremmeniella abietina RNA virus MS1, Mycovirus FusoV, Nectria radicicola virus L1)
5. Reoviridae umfassend
- a) Aquareoviren (z. B. Aquareovirus A, Aquareovirus B, Grass carp hemorrhagic virus group, tentative Aquareoviren)
- b) Coltiviren (z. B. Banna virus, Colorado tick fever virus, Coltiviren JKT-6423, JKT-6969, JKT-7043, JKT-7075, Eyach virus, Kadipiro virus)
- c) Cypoviren (cytoplasmic polyhedrosis viruses) (z. B. Antheraea assamensis cytoplasmic polyhedrosis virus, Antheraea mylitta cytoplasmic polyhedrosis virus, Antheraea proylei cytoplasmic polyhedrosis virus, Bombyx mori cypovirus 1, Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus, Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus 1 strain I, Choristoneura fumiferana cytoplasmic polyhedrosis virus, Cytoplasmic polyhedrosis virus, Euxoa scandens cytoplasmic polyhedrosis virus, Heliothis armigera cytoplasmic polyhedrosis virus, Lymantria dispar cypovirus 1, Lymantria dispar cypovirus 14, Orgyia pseudotsugata cytoplasmic polyhedrosis virus, Trichoplusia ni cypovirus, Trichoplusia ni cytoplasmic polyhedrosis virus 15)
- d) Fijiviren (plant reovirus 2) (z. B. Fijivirus group 1, Fijivirus group 2, Fijivirus group 3, Rice dwarf virus)
- e) Orbiviren (z. B. African horse sickness group, Bluetongue virus group, Epizootic hemorrhagic disease virus group, Kemerovo virus group, Palyam virus group, Saint Croix river virus, wongorr virus, unclassified Orbivirus)
- f) Orthoreoviren (z. B. Avian orthoreovirus, baboon reovirus, Mammalian orthoreoviruses, Ndelle virus, nelson bay reovirus, Orthoreovirus S1)
- g) Oryzaviren (z. B. rice ragged stunt virus)
- h) Phytoreoviren
  Phytoreoviren umfassen beispielweise "wound tumor virus" (WTV; Anzola JV et al. (1989) Virology 171: 222-228), "rice dwarf virus" (Suzuki N et al. (1992) Virology 190: 240-247) und "rice gall dwarf virus". Fijiviren umfassen beispielsweise "Fiji disease virus", "oat sterile dwarf virus", "maize rough dwarf virus" (Marzachi C et al. (1991) Virology 180: 518-526) und "rice blackstreaked dwarf virus" (Azuhata F et al. (1993) J Gen Virol 74: 1227-1232) sowie "pangola stunt virus". Die Übertragung erfolgt im allgemeinen durch Insekten wie beispielsweise Grashüpfer (Nakashima N und Noda H (1995) Virology 207(1): 303-307).
  Reovirus-Virionen sind isometrisch und weisen als morphologisches Kennzeichnen einen inneren Kern, der die virale RNA umfasst, und eine äußere Hülle auf. Bislang konnten sieben Proteine identifiziert, die für Aktivitäten wie RNA-abhängige RNA Polymerase, Guanyltransferase oder Methyltransferase kodieren und eine Rolle bei der RNA Synthese und post-transkriptionellen Modifikation spielen. Die Genomsegmente aller Reoviren weisen als einheitliches Kennzeichen eine konservierte GGUAUU Sequenz am 5'-Ende und eine konservierte UGAU Sequenz am 3'-Ende auf. Ein "inverted repeat"-Sequenzmotiv ist in Nachbarschaft zu diesen terminalen konservierten Sequenzen lokalisiert, die wiederum die kodierenden Sequenzen flankieren (Kudo H et al. (1991) J Gen Virol 72: 2857-2866; Zou S und Brown EG (1992) Virology 186: 377-388; Nuss DL und Dall DJ (1990) Adv Virus Res 38: 249-306).
- i) Rotaviren (z. B. Bovine rotavirus, Canine rotavirus Equine rotavirus, Feline rotavirus, Gottfried porcine rotavirus, Group B rotaviruses, Group C rotaviruses, Human rotavirus, Lamb rotavirus, Murine rotavirus, Nebraska calfdiarrhea virus, Porcine rotavirus, Rabbit rotavirus, Rhesus rotavirus, Rotavirus 5 serotype G2, Rotavirus A, Rotavirus CC86, Rotavirus CN86, Rotavirus G6, Rotavirus G8, Rotavirus G9, Rotavirus strain I321, Rotavirus subgroup 1, Rotavirus subgroup 2, Simian rotavirus, simian rotavirus G, St. Thomas 3 rotavirus, Turkey rotavirus, Unclassified rotaviruses)
- j) unklassifizierte Reoviridae (z. B. Diadromus pulchellus reovirus, Nelson Bay virus, Nilaparvata lugens reovirus, Reovirus sp., Reovirus sp. RVA, Reovirus sp. RVC, Reovirus sp. RVE, Reovirus sp. RVG, Reovirus sp. RVH, Reovirus sp. T3C43-MA, Reovirus sp. T3C44-MA, Reovirus sp. T3C84-MA
6. Totiviridae (Mycoviren)
Totiviridae bestehen aus einem monopartiten dsRNA Genome werden auch als Mycovirusen bezeichnet. Sie befallen Pilze und Protozen. Die Virions weisen keine Hüllen auf und einthlten lediglich ein lineares doppelsträngiges RNA-Molekül mit einer Länge von ca. 4700-6700 Nukleotiden. Beispielhaft seien zu nennen:
- a) Giardiaviren (z. B. Giardia lamblia virus, Trichomonas vaginalis virus, Trichomonas vaginalis virus 3, Trichomonas vaginalis virus II)
- b) Leishmaniaviren (z. B. Leishmania RNA virus 1-1, Leishmania RNA Virus 1-10, Leishmania RNA Virus 1-11, Leishmania RNA virus 1-13, Leishmania RNA Virus 1-2, Leishmania RNA virus 1-4, Leishmania RNA Virus 1-7, Leishmania RNA Virus 1-8, Leishmania RNA Virus 1-9, Leishmania RNA virus 2-1, Unidentified Leishmania RNA virus)
- c) Totiviren (z. B. Helminthosporium victoriae virus 1905, Saccharomyces cerevisiae virus L-A, Saccharomyces cerevisiae virus La, Ustilago maydis virus, Ustilago maydis virus 1, Ustilago maydis virus P4, Ustilago maydis virus P6, Zygosaccharomyces bailii virus Z)
- d) unklassifizierte Totiviridae (z. B. Eimeria brunetti RNA virus 1, Gremmeniella abietina RNA virus L1, Sphaeropsis sapinea RNA virus 1, Sphaeropsis sapinea RNA virus 2, Ustilago maydis dsRNA virus, Ustilago maydis virus H1, unidentified blackcurrent Totiviridae)
7. Varicosaviren (z. B. Lettuce big-vein virus)
8. Unklassizierte dsRNA Viren (z. B. Diaporthe ambigua RNA virus 1, Discula destructiva virus 3, Eimeria nieschulzi virus, Non-encapsidated dsRNA virus, Picobirnavirus, Human picobirnavirus, rabbit picobirnavirus)

Als eukaryotischer Rezipientenorganismus sind im Prinzip alle eukaryotischen Organismen wie Hefen, tierische Organismen (Vertebraten oder Invertebraten) und pflanzliche Organismen geeignet. Bevorzugt wird die Erfindung auf pflanzliche Organismen angewandt.

Bei der Anwendung der Erfindung auf pflanzliche Organismen sind insbesondere dsRNA-Replikons basierend auf Phytoviren bevorzugt. Phytoviren meint Viren, die Pflanzen oder Pilze als Wirt bevorzugen. Insbesondere bevorzugt sind Phytoreoviren, Cryptpviren und Mycoviren, unter denen wiederum Cryptoviren und Mycoviren ganz besonders bevorzugt sind.

Cryptoviren oder Mycoviren werden auch als RNA Plasmide bezeichnet (Boccardo G et al. (1987) Adv Virus Res 32: 171-214; Brown GG und Finnegan PM (1989) Internat Rev Cytol 117: 1-56) und haben den Vorteil, dass sie stabile in den Wirten persistieren können, ohne dabei horizontal übertragen werden zu können. Cryptoviren übertragen sich fast ausschließlich über Samen und/oder Pollen auf die Nachkommenschaft. Auch eine Vermehrung von Zelle zu Zelle ist in der Regel ausgeschlossen und nur bei Zellteilung möglich. Diese Eigenschaften sind aufgrund von ökologischen und Sicherheitsgesichtspunken besonders vorteilhaft, da so eine ungewollte Ausbreitung der transgenen Materie verhindert werden kann.

Besonders bevorzugt sind solche Cryptoviren, deren Gegenwart in der Pflanze mit keinen auffälligen Symptomen verbunden ist. Am meisten bevorzugt sind die Cryptoviren, die keine Hüllstrukturen (Capside) aufweisen. Derartige Viren sind für verschiedene Pflanzenarten wie Brassica Arten, Mais, Soja, Reis, Sonnenblume beschrieben. Ferner gibt es zahlreiche dsRNA-Moleküle, die sich in virus-ähnlicher Weise replizieren aber keinerlei Symptome erzeugen. Diese seien im Rahmen der Erfindung unter dem Begriff der Cryptoviren subsummiert. Unter Cryptoviren seien auch dsRNA-Moleküle zu verstehen, wie sie beispielsweise in den Mitochondrien von Algen und höheren Pflanzen - wie beispielsweise Mais - vorkommen (Brown GG et al. (1993) Mitochondrial plasmids: DNA and RNA. In: Levings III CS, Vasil IK (eds) The Molecular Biology of Plant Mitochondria, pp. 61-91. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht (1993); Finnegan PM, Brown GG (1986) Proc Natl Acad Sci USA 83: 5175-5179). Entsprechende Sequenzen sind beschrieben (Koga R et al. (1998) Plant Mol Biol 36: 717-724; Hong Y et al. (1998) Virology 246: 158-169); Zhang M et al. (1993) J Mol Biol 230: 757-765; Polashock JJ et al. (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91: 8680-8684; Formanova N et al. (1997) Plant Mol Biol 34: 383-392).

"Abgeleitet" von einem dsRNA-Virus meint in Bezug auf das transgene dsRNA-Replikon, dass zumindest die für die Replikation essentiellen Sequenzen noch vorhanden sind. Diese stellen meist Ansatzpunkte für dsRNA-abhängige RNA-Polymerasen dar und sind in der Regel an den terminalen Ende der viralen dsRNA lokalisiert. Dabei werden bevorzugt terminale Sequenzen von mindestens 50 Basenpaaren, bevorzugt mindestens 100 Basenpaaren, besonders bevorzugt mindestens 250 Basenpaaren, ganz besonders bevorzugt mindestens 500 Basenpaaren, am meisten bevorzugt mindestens 1000 Basenpaaren einer dsRNA-Virus dsRNA als flankierende Sequenzen des transgenen dsRNA-Replikons eingesetzt.

Es kann gezeigt werden, dass die Deletion großer Teile der kodierenden Region eines dsRNA-Virus bis hin zu einer vollständigen Unfähigkeit zur Expression funktioneller, viraler Proteine dennoch die Replikationsfähigkeit nicht beeinträchtigt, solange die dsRNA-abhängige RNA-Polymerase weiterhin, beispielsweise durch Gegenwart eines vollständigen Virus oder transgene Expression bereitgestellt wird. Derartige Systeme sind besonders vorteilhaft, da - abgesehen von der Replikase, die viralen Ursprungs sein kann - keine funktionellen, viralen Proteine gebildet werden. Ferner kann erwartet werden, dass derartige dsRNA-Replikons in der Lage sind, große heterogene Sequenzen aufzunehmen, ohne dass Beschränkungen - wie bei viralen Systemen - bestehen. Darüberhinaus ist für das transgene dsRNA-Replikon eine gesteigerte Stabilität im Vergleich zu den parentalen Viren anzunehmen. Deletionen - wie bei anderen viralen System beobachtbar sind unwahrscheinlich.

Bevorzugt werden für die dsRNA-Replikons natürliche Deletionsmutanten eines dsRNA-Virus verwendet. Derartige sogenannte "defective RNAs" (infolge auch D-RNA) können ausgehend von einem natürlichen Virus durch Infektion des entsprechenden Wirtes oder einer entsprechenden Wirtszelle erzeugt werden, indem die bei einer Virusinfektion abschließend erhaltene Viruskultur oder der Kulturüberstand mit den Viren wieder für eine nachfolgende Infektion eingesetzt wird. Mehrfaches Wiederholen dieses Passagierens führt dazu, dass sich die D-RNAs gegenüber den parentalen Viren anreichern. Die D-RNA kann in der dem Fachmann geläufigen Weise gewonnen und beispielsweise in cDNA revers transkribiert werden. Ferner kann die so erhaltene cDNA einer D-RNA in einen Vektor kloniert werden und steht dann für die Konstruktion der erfindungsgemäßen Expressionskassetten für die dsRNA-Replikons zur Verfügung. D-RNAs können - in Nachahmung der spontanen, natürlichen Deletionen - auch künstlich durch gezielte Deletion von Nukleinsäuresequenzen aus dem Genom eines geeigneten parentalen Virus erreicht werden. Der natürliche Deletionsprozess ist jedoch bevorzugt, da er besonders vorteilhafte, stabile D-RNAs ergibt.

Verschiedene Sequenzen von dsRNA Viren sind bekannt und aus Literatur und Datenbanken - beispielsweise der GenBank (http:/ / www.ncbi.nlm.nih.gov/) - erhältlich. Beispielhaft seien zu nennen:

1. GenBank Acc.-No.: NC_001492.1
Cryphonectria hypovirus 1 (Shapira R et al. (1991) EMBO J 10(4): 731-739; SEQ ID NO: 23); zu diesem Virus sind entsprechende D-RNAs mit einer Länge von 0,6-1,7 kb bekannt; Shapira R et al. (1991) EMBO J 10(4): 741-746). Die korrespondierende und im Rahmen dieser Erfindung bevorzugt einzusetzende RNA-abhängige RNA-Polymerase ist auf der dsRNA kodiert (SEQ ID NO: 24)
2. GenBank Acc.-No.: D32136.1
Oryza sativa endogene dsRNA (japonica Kultivar Gruppe; Fukuhara T et al. (1995) J Biol Chem 70(30): 18147-18149; Fukuhara T et al. (1993) Plant Mol Biol 21: 1121-1130; SEQ ID NO: 25). Die korrespondierende und im Rahmen dieser Erfindung bevorzugt einzusetzende RNA-abhängige RNA-Polymerase ist auf der dsRNA kodiert (SEQ ID NO: 26)
3. GenBank Acc.-No.: AB014344.1
Oryza rufipogon endogene dsRNA (Fukuhara T et al. (1995) J Biol Chem 70(30): 18147-18149; Fukuhara T et al. (1993) Plant Mol Biol 21: 1121-1130; SEQ ID NO: 29). Aus Reis wurden ferner die kurzen dsRNA Moleküle mit den GenBank Acc.-No.: AB014345.1 (SEQ ID NO: 27) und AB014343.1 (SEQ ID NO: 28) isoliert.
4. GenBank Acc.-No.: AJ000929.1
Vicia faba dsRNA (Pfeiffer P et al. (1993) J Gen Virol 74: 1167-1173; Pfeiffer P (1998) J Gen Virol 79: 2349-2358; Lefebvre A et al. (1990) Plant Mol Biol 14: 477-490; SEQ ID NO: 30). Die korrespondierende und im Rahmen dieser Erfindung bevorzugt einzusetzende RNA-abhängige RNA-Polymerase ist auf der dsRNA kodiert (SEQ ID NO: 31)
5. GenBank Acc.-No.: X16637.1
Phaseolus vulgaris dsRNA (Wakarchuk D & Hamilton RI (1990) Plant Mol Biol 14: 637-639; SEQ ID NO: 34)
6. GenBank Acc.-No.:AF142094.1 Diaporthe ambigua RNA Virus 1 (Preisig O et al. (2000) J Gen Virol 81: 3107-3114; SEQ ID NO: 32). Die korrespondierende und im Rahmen dieser Erfindung bevorzugt einzusetzende RNA-abhängige RNA-Polymerase ist auf der dsRNA kodiert (SEQ ID NO: 33).
7. GenBank Acc.-No.:AB070653
Bryopsis cinicola Chloroplasten dsRNA Replikon-Gen für RNA- abhängige RNA Polymerase (Koga R et al. (1998) Plant Mol Biol 36: 717-724; SEQ ID NO: 35). Die korrespondierende und im Rahmen dieser Erfindung bevorzugt einzusetzende RNA-abhängige RNA-Polymerase ist auf der dsRNA kodiert (SEQ ID NO: 36).

Alle Im Rahmen dieser Erfindung angegebenen Nukleotidsequenzen sind als DNA-Sequenzen angegeben. Im Falle von dsRNA Molekülen sind es die entsprechenden für den (+)-RNA Strang kodierenden cDNA Sequenzen.

Die Mechanismen zur Replikation eines dsRNA-Virus und die entsprechenden Replikasen sind dem Fachmann bekannt (Wickner RB (1993) J Biol Chem 268: 3797-3800). Als dsRNA-abhängige RNA-Polymerase (infolge dsRNA-Replikase) können im Prinzip alle dsRNA- abhängige RNA-Polymerasen der oben beschriebenen Viren verwendet werden. Bevorzugt wird für die Replikation eines bestimmten dsRNA-Replikons die Replikase des jeweiligen parentalen Virus eingesetzt. Dies ist jedoch nicht zwingend erforderlich. Virale Polymerasen haben alle eine ähnliche Struktur und Wirkungsmechanismus (Bruenn JA (1991) Nucl Acids Res 19: 217-226; Koonin EV et al. (1991) Proc Natl Acad Sci USA 88: 10647-10651) und können auch die RNA anderer Viren replizieren. Charakteristische Sequenzmotive für dsRNA-Replikasen wurden beschrieben und können der Auffindung weiterer geeigneter dsRNA-Replikasen - beispielsweise mittels einer Datenbank-Suche - dienen (Moriyama H et al. (1995) Mol Gen Genet 248: 364-369; Moriyama H et al (1999) Proc Natl Acad Sci USA 274(11): 6882-6888; Gibbs MJ et al. (2000) J Gen Virol 81: 227-233; Preisig O et al. (2000) J Gen Virol 81: 3107-3114).

Als dsRNA-Replikasen werden bevorzugt die Replikasen der oben genannten Viren sowie die der Partitiviridae eingesetzt. Entsprechende Sequenzinformationen sind beispielsweise aus der GenBank erhältlich (Internet-Adresse:
http:/ / www.ncbi.nlm.nih.gov:80/). Beispielhaft jedoch nicht einschränkend seien neben den dsRNA-Replikasen kodiert durch die oben genannten Viren (SEQ ID NO: 24, 26, 31, 33 oder 36) zu nennen:

1. GenBank Acc.-No.: 563913
RNA-abhängige RNA-Polymerase des Beet Cryptic Virus 3 (BCV3) (Protein_id = "AAB27624.1; SEQ ID NO: 2)
2. GenBank Acc.-No.: AB012616.1
RNA-abhängige RNA-Polymerase von Pyrus pyrifolia (Protein_id = "BAA34783.1; SEQ ID NO: 4)
3. GenBank Acc.-No.: AY089993.1
RNA-abhängige RNA-Polymerase des Gremmeniella abietina Virus MS1 (Protein_id = "AAM12240.1; SEQ ID NO: 6)
4. GenBank Acc.-No.: AY033436.1
RNA-abhängige RNA-Polymerase des Discula destructiva virus 2 (Protein_id = "AAK59379.1; SEQ ID NO: 8)
5. GenBank Acc.-No.: AF316992.1
RNA-abhängige RNA-Polymerase des Discula destructiva virus 1 (Protein_id = "AAG59816.1; SEQ ID NO: 10)
6. GenBank Acc.-No.: D55668.1
RNA-abhängige RNA-Polymerase des Mycovirus FusoV (aus Fusarium solani) (Protein_id = "BAA09520.1; SEQ ID NO: 12)
7. GenBank Acc.-No.: U95995.1
RNA-abhängige RNA-Polymerase aus Cryptosporidium parvum (Protein_id = "AAC47805.1; SEQ ID NO: 14)
8. GenBank Acc.-No.: AF473549
RNA-abhängige RNA-Polymerase des Heterobasidion annosum P-type Partitivirus (Protein_id = "AAL79540.1; SEQ ID NO: 16)
9. GenBank Acc.-No.: L39125.1
RNA-abhängige RNA-Polymerase des Atkinsonella hypoxylon Virus (Protein_id = "AAA61829.1; SEQ ID NO: 18)
10. GenBank Acc.-No.: AF133290.1
RNA-abhängige RNA-Polymerase des Rhizoctonia solani 717 Partitivirus (Protein_id = "AAF22160.1; SEQ ID NO: 20)
11. GenBank Acc.-No.: AF047013.1
RNA-abhängige RNA-Polymerase des Fusarium poae Virus 1 (Protein_id = "AAC98734.1; SEQ ID NO: 22)

Zahlreiche weitere geeignete dsRNA-Replikasen können beispielsweise über Homologiesuchen unter Verwendung der oben genannten Sequenzen in den GenBank identifiziert werden. Beispielhaft jedoch nicht einschränkend seien zu nennen die Sequenzen mit Gen-Bank Acc.-No.: Y09237, AJ004930, AF224490, AF463399, M95491. Als dsRNA-Replikase sind auch weitere dsRNA-abhängige RNA-Polymerasen geeignet, wie sie z. B. aus Chloroplasten bestimmtes Arten isoliert werden können. Zu nennen ist hier beispielhaft

1. GenBank Acc.-No.: AB070653.1
RNA-abhängige RNA-Polymerase des Bryopsis cinicola Chloroplasten dsRNA-Replikons (SEQ ID NO: 36)

Die Accession-Nummern der angegebenen Replikasen beziehen sich auf die Nukleinsäuresequenzen der entsprechenden Replikasen. Angegeben sind ferner die Acc.-No für das entsprechende Protein (Protein_id). Dem Fachmann ist bekannt, dass er zum einen die für die Replikase kodierende virale Nukleinsäuresequenz verwenden kann. Er kann aber auch die Nukleinsäuresequenz in ihrer Kodon-Verwendung an den jeweiligen Wirtsorganismus, in dem das erfindungsgemäße Expressionssystem zum Einsatz kommen, anpassen.

Als Ausgangssequenz für das dsRNA-Replikon und/oder die dsRNA- Replikase sind ferner Sequenzen geeignet, die zu einer der oben genannten Sequenz funktionell äquivalent sind.

Funktionelle Äquivalente einer Ausgangssequenz eines dsRNA-Replikons ist breit zu verstehen und meint allgemein bevorzugt all solche doppelsträngigen RNA-Moleküle, die durch dsRNA-Replikasen repliziert in der Zelle eines pflanzlichen Organismus werden können. Bevorzugt haben die entsprechenden Sequenzen eine Homologie von mindestens 30%, bevorzugt mindestens 40%, besonders bevorzug mindestens 50%, ganz besonders ebvorzugt mindestens 50%, am meistens bevorzugt mindestens 70% zu einer der Sequenzen mit der SEQ ID NO: 23, 25, 27, 28, 29, 30, 32, 34 oder 35. Dabei erstreckt sich die Homologie bevorzugt über die terminalen Bereiche der entsprechenden Sequenzen. Terminale Bereiche meint dabei Sequenzen am 5'- und 3'-Ende der dsRNA bezogen auf den (+)-RNA Strang, wobei die Länge der Sequenzen unabhängig voneinander mindestens 50 Basenpaare, bevorzugt mindestens 100 Basenpaare, besonders bevorzugt mindestens 250 Basenpaare, ganz besonders bevorzugt mindestens 500 Basenpaare, am meistens bevorzugt mindestens 1000 Basenpaare beträgt.

Funktionelle Äquivalente einer dsRNA-Replikase ist breit zu verstehen und meint allgemein bevorzugt all solche Proteine, die in der Lage sind doppelsträngige RNA-Moleküle zu replizieren. Bevorzugt haben die entsprechenden Sequenzen eine Homologie von mindestens 30%, bevorzugt mindestens 40%, besonders bevorzug mindestens 50%, ganz besonders ebvorzugt mindestens 50%, am meistens bevorzugt mindestens 70% zu einer der Sequenzen mit der SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 31, 33 oder 36.

Unter Homologie wird das Maß der Übereinstimmung zwischen zwei Nukleotid-, Ribonukleotid- oder Proteinsequenzen verstanden, die bevorzugt durch Vergleich mit Hilfe des Programmalgorithmus GAP (Wisconsin Package Version 10.0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), Madison, USA; Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389 ff) unter Einstellung folgender Parameter berechnet wird:
Gap Weight: 50 Length Weight: 3
Average Match: 10 Average Mismatch: 0

Dem Fachmann ist bewusst, dass wenn die Homologie zwischen DNA (z. B. Genen) und RNA bestimmt wird, Thymin (T) in der DNA Sequenz als äquivalent zu Uracil (U) in der RNA Sequenz betrachtet wird.

Die dsRNA-Replikase kann von dem dsRNA-Replikon selber kodiert sein und ausgehend von dem selben exprimiert werden (d. h. in cis) oder aber auch unabhängig davon, beispielsweise von einem separaten parentalen Vuris oder durch eine transgene Expressionskassette, (d. h. in trans) bereitgestellt werden.

Das transgene dsRNA-Replikon kann neben der insertierten Nukleinsäuresequenz weitere Sequenzelemente umfassen, die beispielsweise die Translation der insertierten Nukleinsäuresequenz oder aber die generelle Funktion des Replikons gewährleisten oder beeinflussen. So kann das dsRNA-Replikon beispielsweise geeignete Ribosomen-Bindestellen bereitstellen die eine Translation ermöglichen. Diese Ribosomenbindestellen können auch von dem parentalen dsRNA-Virus, von dem das dsRNA-Replikon abgeleitet wurde, oder aber von der zu exprimierenden insertierten Nukleinsäuresequenz selber bereitgestellt werden.

Der Begriff der "weiteren Sequenzelemente" ist breit zu verstehen und umfasst beispielhaft die unten aufgeführten Funktionselemente. Insbesondere sind Sequenz umfasst, die eine Selektion von dsRNA-Replikon umfassenden Zellen ermöglichen. Dies können die unten aufgeführten positiven Selektionsmarker sein.

Das dsRNA-Replikon, die dsRNA-Replikase und/oder das Replikastionssystem kann auf verschiedene dem Fachmann geläufige Weise in einen Organismus oder eine Zelle eingebracht werden. "Einbringen" ist breit zu verstehen und umfasst im Rahmen der Erfindung alle Verfahren, die dazu geeignet das dsRNA-Replikon, die dsRNA-Replikase und/oder das Replikastionssystem direkt oder indirekt, in einen Organismus oder eine Zelle, Kompartiment, Gewebe, Organ oder Samen desselben einzuführen oder dort zu generieren. Die Einbringung kann zu einer vorübergehenden (transienten) Präsenz des dsRNA-Replikons, der dsRNA-Replikase und/oder des Replikationssystem führen oder aber auch zu einer dauerhaften (stabilen). Umfasst sind Verfahren der direkten Transfektion oder Transformation der Zelle mit dem dsRNA-Replikon, der dsRNA-Replikase und/oder dem Replikationssystem als auch die Transformation oder Transfektion der Zelle mit Expressionskassetten, die befähigt sind, das dsRNA-Replikon, die dsRNA-Replikase und/oder das Replikationssystem zu exprimieren. Die Expression des dsRNA- Replikons, der dsRNA-Replikase und/oder des Replikationssystems kann transient oder - beispielsweise nach Integration der entsprechenden Expressionskassette in das Genom des Organismus - permanent erfolgen. Die Duplex-Bildung zum dsRNA-Replikon kann entweder außerhalb der Zelle oder innerhalb derselben initiiert werden.

Das dsRNA-Replikon - beispielsweise zur Verwendung in einer direkten Transformation oder Transfektion - kann kann in vivo oder in vitro, durch enzymatische, molekularbiologische oder chemisch-synthetische Verfahren synthetisiert werden. Dazu können eukaryotische, prokaryotische oder Bakteriophagen RNA Polymerasen (wie z. B. T3-, T7- oder SP6 RNA-Polymerase) verwendet werden. Entsprechende Verfahren zu in vitro Expression von RNA sind beschrieben (WO 97/32016; US 5,593,874; US 5,698,425, US 5,712,135, US 5,789,214, US 5,804,693). Ein gezieltes Verfahren zur Herstellung von dsRNA ist beispielsweise in US 3,819,482 beschrieben. Eine chemisch oder enzymatisch in vitro synthetisiertes dsRNA-Replikon kann vor der Einführung in eine Zelle, Gewebe oder Organismus aus dem Reaktionsgemisch beispielsweise durch Extraktion, Präzipitation, Elektrophorese, Chromatographie oder Kombinationen dieser Verfahren ganz oder teilweise aufgereinigt werden. Das dsRNA-Replikon kann direkt in die Zelle eingeführt werden (beispielsweise durch Partikelbeschuss oder Mikroinjektion) oder aber extrazellulär (z. B. in den Interstitialraum, das Gefäßsystem, das Verdauungssystem o. ä.) applifiziert werden.

Dem Fachmann ist ferner bekannt, dass zur Erzeugung eines dsRNA- Replikons auch das Einbringen des (+)-RNA Stranges alleine in Kombination mit der dsRNA-Replikase ausreichend ist. Die dsRNA- Replikase ist befähigt, ausgehend von dem (+)-RNA Strang durch Synthese des korrespondierenden (-)-RNA Stranges ein dsRNA-Replikon zu vervollständigen.

Bevorzugt wird das dsRNA-Replikon bzw. der korrespondierende (+)-RNA Strang und/oder die dsRNA-Replikase ausgehend von entsprechenden Expressionskassetten in der Zelle exprimiert.

Soll das dsRNA-Replikon in Form von zwei komplementären Strängen exprimiert werden, so umfasst das Expressionssystem zwei Expressionskassetten, wobei jeder der beiden Stränge in funktioneller Verknüpfung mit einen Promotor steht, der geeignet ist, die Expression in der jeweiligen eukaryotischen Zelle zu gewährleisten. Optional können die Expressionskassetten weitere funktionelle Elemente wie beispielsweise Transkriptionsterminatoren und/oder Polyadenylierungssignale umfassen.

Die Kombination der beiden Expressionskassetten zu dem erfindungsgemäßen Expressionssystem kann auf verschiedene dem Fachmann geläufige Art geschehen. Beispielhaft seien zu nennen:

a) Transformation der Zelle oder Pflanze mit einem Vektor, der Expressionskassetten für beide RNA-Stränge umfasst,
b) Kotransformation der Zelle oder Pflanze mit zwei Vektoren, wobei jeweils ein Vektor für jeweils einen der beiden Stränge der dsRNA kodiert.
c) Kreuzung von zwei Pflanzen, die mit jeweils einem Vektor transformiert wurden, wobei jeweils ein Vektor für jeweils einen der beiden Stränge der dsRNA kodiert.

Es ist auch möglich, das eine Expressionskassette einzusetzen, bei der die für das dsRNA-Replikon kodierende DNA-Sequenz zwischen zwei Promotoren mit entgegengerichteter Transkriptionsrichtung lokalisiert ist und so von beiden Seiten transkribiert wird.

Um die Expression von RNA-Strängen mit einer definierten Länge zur Bildung des dsRNA-Replikons bzw. des korrespondierenden (+)-RNA Stranges zu gewährleisten, wird in einer bevorzugten Ausführungsform die cDNA kodierend für das dsRNA-Replikon bzw. den korrespondierenden (+)-RNA Strang am 5'-Ende so mit einem Promotor verbunden, dass der Transkriptionsstart auf den Beginn des dsRNA-Replikon bzw. den korrespondierenden (+)-RNA Strang fällt.

Um ein definiertes 3'-Ende zu gewährleisten, wird bei einer transienten Expression des dsRNA-Replikons die Expressionskassette unter Verwendung entsprechender gezielt plazierter Restriktionsendonuklease-Schnittstellen exakt am gewünschten 3'-Ende geschnitten. Mittels einer "run-off" Expression werden dann RNA-Moleküle mit definierter Länge erzeugt. Für eine stabile Expression nach Integration der Expressionskassette in das Genom des Rezipientenorganismus wird die cDNA kodierend für das dsRNA-Replikon mit einem entsprechenden Terminationssignal verbunden, wobei besonders bevorzugt zwischen dem 3'-Ende der Virussequenz und dem Polyadenylierungssignal eine Ribozymsequenz eingefügt wird, die nach der Transkription autokatalytisch das exakte 3'-Ende der Virus-RNA erzeugt (methodische Details siehe Leiser RM et al. (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89(19): 9136-40).

Ribozyme meint katalytische RNA-Moleküle, die an jede beliebige Ziel-RNA angepasst werden können und das Phosphodiester-Gerüst an spezifischen Positionen spalten (Tanner NK (1999) FEMS Microbiol Rev 23(3): 257-275). Das Ribozym wird dadurch nicht selber modifiziert, sondern ist in der Lage, weitere Ziel-RNA-Moleküle analog zu spalten, wodurch es die Eigenschaften eines Enzyms erhält. Die Herstellung und Verwendung entsprechender Ribozym-Moleküle wie z. B. "Hammerhead"-Ribozyme ist beschrieben (u. a. bei Haseloff et al. (1988) Nature 334: 585-591); Haselhoff und Gerlach (1988) Nature 334: 585-591; Steinecke P et al. (1992) EMBO J 11(4): 1525-1530; de Feyter R et al. (1996) Mol Gen Genet. 250(3): 329-338). Geeignete Zielsequenzen und Ribozyme können zum Beispiel wie bei "Steinecke P, Ribozymes, Methods in Cell Biology 50, Galbraith et al. eds, Academic Press, Inc. (1995), S. 449-460" beschrieben, durch Sekundärstrukturberechnungen von Ribozym- und Ziel-RNA sowie durch deren Interaktion bestimmt werden (Bayley CC et al. (1992) Plant Mol Biol. 18(2): 353-361; Lloyd AM and Davis RW et al. (1994) Mol Gen Genet. 242(6): 653-657). Beispielsweise können Derivate der Tetrahymena L-19 IVS RNA konstruiert werden, die komplementäre Bereiche zu der mRNA des zu den Spacersequenzen aufweisen (siehe auch US 4,987,071 und US 5,116,742).

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft besagte Expressionskassetten zur Expression eines dsRNA-Replikon, einer dsRNA-Replikase und/oder eines Replikationssystems. Diese können in das Kern- oder Organellengenom des Rezipienten integriert werden oder ohne Integration persistieren und dadurch nur transient exprimiert werden. Die Transkription des dsRNA- Replikons bzw. der RNA kodierend für die dsRNA-Replikase und/oder das Replikastionssystem kann ausgehend von der erfindungsgemäßen Expressionskassetten in der Rezipientenzelle durch einen konstitutiven oder regulierbaren Promotor, vorzugsweise einen gewebe- oder ontogenesespezifischen Promotor, gesteuert werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform werden die erfindungsgemäßen Verfahren so durchgeführt, bzw. das erfindungsgemäße Replikationssystem so realisiert, dass man

a) ein oder mehrere Expressionskassetten "A", die die Expression eines transgenen dsRNA-Replikons oder des korresponierenden (+)-RNA Stranges des dsRNA-Replikons bewirken, und
b) ein Expressionskassetten "B", das die Expression einer dsRNA- Replikase bewirkt, die zur Replikation des besagten transgenen dsRNA-Replikons befähigt ist,

in einem Reaktionsraum zusammenbringt und dort Expression und Replikation des transgene dsRNA-Replikons erfolgt.

Die Kombination von Expressionskassetten stellt ein überlegenes System dar. Die in vivo Expression des dsRNA-Replikons in Kombination mit einer parallelen Expression der dsRNA-Replikase führt zu einer starken, lang anhaltenden Expression und überwindet die Probleme, die oft bei der Übertragung von dsRNA-Viren auftreten. Die Expressionskassette für das dsRNA-Replikon bedingt eine hohe Start-Anzahl von dsRNA-Molekülen. Die Replikase ist infolge in der Lage, das dsRNA-Replikon zu erkennen und zu amplifizieren. Die Kopienzahl des dsRNA-Replikons steigt in Folge drastisch an. Da die Proteinproduktion unter anderem von der kodierenden RNA- Menge abhängt, kann für den Einsatz des dsRNA-Replikon basierten Expressionssystems eine höhere Ausbeute gezeigt werden, als sie mit konventionellen viralen Vektoren erreicht werden kann. Die Expression ist kurz nach Transfektion nachweisbar und ist zeitlich unbegrenzt. Ebenso ist die Anzahl der für eine Verminderung von endogenen Zielgenen zur Verfügung stehenden dRNA-Replikon Moleküle deutlich erhöht, was zu einer extrem effizienten Verminderung bis hin zu einer vollständigen Unterbindung der Expression führen kann.

Ein weiterer Vorteil der Verwendung von Expressionskassetten für das dsRNA-Replikon und die Replikase ist die Möglichkeit die Expression zu steuern. dsRNA-Replikons können - außer durch Zellteilung - nicht von Zelle zu Zelle transferiert werden. Damit läßt sich durch Verwendung entsprechender Promotoren in den Expressionskassetten - insbesondere für das dsRNA-Replikon - eine induzierbare, gewebe- und/oder zeitspezifische Expression des Zielgens erreichen. Damit können Effekte gezielt dort erreicht werden, wo und wann sie vom Fachmann gewünscht werden, was mit anderen auf dsRNA basierenden System zur Gensuppression nicht erreicht werden kann.

"Reaktionsraum" meint allgemein alle in vitro oder in vivo Bedingungen unter denen bei gleichzeitigem Vorliegen von dsRNA- Replikon und dsRNA-Replikase (oder aber den Expressionskassetten "A" und "B") Replikation des transgenen dsRNA-Replikons erfolgen kann. Bevorzugt werden dsRNA-Replikon und dsRNA-Replikase (oder aber die Expressionskassetten "A" und "B") in eine Zelle als einem Reaktionsraum eingebracht. Besagte Zelle kann Teil eines Gewebes, Organs, Teils oder Vermehrungsgutes eines Organismus sein oder aber auch alle Zellen des Gewebes, Organs, Teils oder Vermehrungsgutes oder des Organismus ausmachen. Besonders bevorzugt wird das System auf pflanzliche Zellen, Gewebe oder Organismen angewendet.

"Expressionskonstrukt" meint allgemein solche Konstruktionen in denen eine zu exprimierende Nukleinsäuresequenz in funktioneller Verknüpfung mit mindestens einer genetischen Kontrollsequenz - bevorzugt einer Promotorsequenz - steht. Expressionskonstrukte bestehen bevorzugt aus doppelsträngiger DNA und können eine lineare oder zirkuläre Struktur haben. Sie können in verschiedener Form vorliegen, beispielsweise als separate Moleküle oder aber integriert in das Genom einer Zelle.

Unter einer funktionellen Verknüpfung versteht man zum Beispiel die sequentielle Anordnung eines Promotors mit einer zu transkribierenden Nukleinsäuresequenz (beispielsweise kodierend für ein dsRNA-Replikon oder eines dsRNA-Replikase) und ggf. weiterer regulativer Elemente wie zum Beispiel einem Terminator und/oder Polyadenylierungssignalen derart, dass jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der Transkription der Nukleinsäuresequenz, je nach Anordnung der Nukleinsäuresequenzen erfüllen kann. Funktion kann dabei beispielsweise die Kontrolle der Expression d. h. Transkription und/oder Translation der Nukleinsäuresequenz kodierend für ein transgenes dsRNA-Replikon bzw. eine dsRNA-Replikase bedeuten. Kontrolle umfasst dabei beispielsweise das Initiieren, Steigerung, Steuerung oder Suppression der Expression d. h. Transkription und ggf. Translation. Dazu ist nicht unbedingt eine direkte Verknüpfung im chemischen Sinne erforderlich. Genetische Kontrollsequenzen, wie zum Beispiel Enhancer-Sequenzen, können ihre Funktion auch von weiter entfernten Positionen oder gar von anderen DNA-Molekülen aus auf die Zielsequenz ausüben. Bevorzugt sind Anordnungen, in denen die zu transkribierende Nukleinsäuresequenz hinter der als Promoter fungierenden Sequenz positioniert wird, so dass beide Sequenzen kovalent miteinander verbunden sind. Bevorzugt ist dabei der Abstand zwischen der Promotorsequenz und der transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz geringer als 200 Basenpaare, besonders bevorzugt kleiner als 100 Basenpaare, ganz besonders bevorzugt kleiner als 50 Basenpaare. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die zu transkribierende Nukleinsäuresequenz so hinter dem Promotor lokalisiert, das der Transkriptionsstart identisch ist mit dem gewünschten Beginn des dsRNA-Replikons.

Dem Fachmann sind verschiedene Wege bekannt, um zu einer der erfindungsgemässen Expressionskassette zu gelangen. Die Herstellung einer erfindungsgemässen Expressionskassette erfolgt beispielsweise bevorzugt durch direkte Fusion einer als Promoter fungierenden Nukleinsäuresequenz mit einer zu exprimierenden Nukleotidsequenz - beispielsweise kodierend für ein transgenes dsRNA-Replikon bzw. dsRNA-Replikase. Die Herstellung einer funktionellen Verknüpfung kann mittels gängiger Rekombinations- und Klonierungstechniken realisiert werden, wie sie beispielsweise in Maniatis T, Fritsch EF und Sambrook J, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) sowie in Silhavy TJ, Berman ML und Enquist LW, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, FM et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987) beschrieben sind.

Unter einer Expressionskassette sind aber auch solche Konstruktionen zu verstehen, bei denen zum Beispiel eine Nukleinsäuresequenz kodierend für ein dsRNA-Replikon oder eine dsRNA- Replikase derart hinter einen endogenen Promotor platziert wird, dass der gleiche Effekt auftritt. Auch dieser Ansatz führt zu einer erfindungsgemäßen Expressionskassetten.

Der Begriff der "genetischen Kontrollsequenzen" ist breit zu verstehen und meint all solche Sequenzen, die einen Einfluss auf das Zustandekommen oder die Funktion der erfindungsgemässen Expressionskassette haben. Genetische Kontrollsequenzen gewährleisten zum Beispiel die Transkription und gegebenenfalls Translation in prokaryotischen oder eukaryotischen Organismen. Genetische Kontrollsequenzen sind beispielsweise beschrieben bei "Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)" oder "Gruber and Crosby, in: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnolgy, CRC Press, Bova Raton, Florida, eds.: Glick and Thompson, Chapter 7, 89-108" sowie den dort aufgewiesenen Zitaten.

Genetische Kontrollsequenzen umfassen insbesondere in Pflanzen funktionelle Promotoren. Als bevorzugte Promotoren für die Expressionskassetten ist grundsätzlich jeder Promotor geeignet, der die Expression von Genen, insbesondere Fremdgenen, in Pflanzen steuern kann.

Vorzugsweise umfassen die erfindungsgemässen Expressionskassetten 5'-stromaufwärts von der jeweiligen transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz einen Promotor und 3'-stromabwärts eine Terminatorsequenz als zusätzliche genetische Kontrollsequenz, sowie gegebenenfalls weitere übliche regulative Elemente, und zwar jeweils funktionell verknüpft mit der transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz.

Pflanzenspezifische Promotoren meint grundsätzlich jeden Promotor, der die Expression von Genen, insbesondere Fremdgenen, in Pflanzen oder Pflanzenteilen, -zellen, -geweben, -kulturen steuern kann. Dabei kann die Expression beispielsweise konstitutiv, induzierbar oder entwicklungsabhängig sein. Bevorzugt sind:

a) Konstitutive Promotoren
"Konstitutive" Promotoren meint solche Promotoren, die eine Expression in zahlreichen, bevorzugt allen, Geweben über einen größeren Zeitraum der Pflanzenentwicklung, bevorzugt zu allen Zeitpunkten der Pflanzenentwicklung, gewährleisten (Benfey et al. (1989) EMBO J 8: 2195-2202). Vorzugsweise verwendet man insbesondere einen pflanzlichen Promotor oder einen Promotor, der einem Pflanzenvirus entstammt. Insbesondere bevorzugt ist der Promotor des 35S-Transkriptes des CaMV Blumenkohlmosaikvirus (Franck et al. (1980) Cell 21: 285-294; Odell et al. (1985) Nature 313: 810-812; Shewmaker et al. (1985) Virology 140: 281-288; Gardner et al. (1986) Plant Mol Biol 6: 221-228) oder der 195 CaMV Promotor (US 5,352,605; WO 84/02913; Benfey et al. (1989) EMBO J 8: 2195-2202) sowie der Promotor des Nitrilase-1 Gens aus Arabidopsis thaliana (GenBank Acc.-No.: U38846, Nukleotide 3862 bis 5325 oder alternativ 5342).
Ein weiterer geeigneter konstitutiver Promotor ist der "Rubisco small subunit (SSU)"-Promotor (US 4,962,028), der LeguminB-Promotor (GenBank Acc.-Nr. X03677), der Promotor der Nopalinsynthase aus Agrobacterium, der TR-Doppelpromotor, der OCS (Octopin Synthase) Promotor aus Agrobacterium, der Ubiquitin Promotor (Holtorf S et al. (1995) Plant Mol Biol 29: 637-649), den Ubiquitin 1 Promotor (Christensen et al. (1992) Plant Mol Biol 18: 675-689; Bruce et al. (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86: 9692-9696), den Smas Promotor, den Cinnamylalkoholdehydrogenase-Promotor (US 5,683,439), die Promotoren der vakuolärer ATPase Untereinheiten oder der Promotor eines prolinreichen Proteins aus Weizen (WO 91/13991), sowie weitere Promotoren von Genen, deren konstitutive Expression in Pflanzen dem Fachmann bekannt ist.
b) Gewebespezifische Promotoren
Bevorzugt sind ferner Promotoren mit Spezifitäten für die Antheren, Ovarien, Blüten, Blätter, Stengel, Wurzeln und Samen.
Samenspezifische Promotoren wie zum Beispiel der Promotor des Phaseolins (US 5,504,200; Bustos MM et al. (1989) Plant Cell 1(9): 839-53), des 25 Albumingens (Joseffson LG et al. (1987) J Biol Chem 262: 12196-12201), des Legumins (Shirsat A et al. (1989) Mol Gen Genet 215(2): 326-331), des USP (unknown seed protein; Bäumlein H et al. (1991) Mol Gen Genet 225(3): 459-67), des Napin Gens (US 5,608,152; Stalberg K et al. (1996) L Planta 199: 515-519), des Saccharosebindeproteins (WO 00/26388) oder der Legumin B4-Promotor (LeB4; Bäumlein H et al. (1991) Mol Gen Genet 225: 121-128; Baeumlein et al. (1992) Plant Journal 2(2): 233-9; Fiedler U et al. (1995) Biotechnology (NY) 13(10): 1090f), der Oleosin-Promoter aus Arabidopsis (WO 98/45461), der Bce4-Promoter aus Brassica (WO 91/13980). Weitere geeignete samenspezifische Promotoren sind die der Gene kodierend für das "High Molecular Weight Glutenin" (HMWG), Gliadin, Verzweigungsenzym, ADP Glucose Pyrophosphatase (AGPase) oder die Stärkesynthase. Bevorzugt sind ferner Promotoren, die eine samenspezifische Expression in Monokotyledonen wie Mais, Gerste, Weizen, Roggen, Reis etc. erlauben. Vorteilhaft eingesetzt werden können der Promoter des lpt2 oder lpt1-Gen (WO 95/15389, WO 95/23230) oder die Promotoren beschrieben in WO 99/16890 (Promotoren des Hordein-Gens, des Glutelin-Gens, des Oryzin-Gens, des Prolamin-Gens, des Gliadin-Gens, des Glutelin-Gens, des Zein- Gens, des Kasirin-Gens oder des Secalin-Gens). Weitere samenspezifische Promotoren sind beschrieben in WO 89/03887.
Knollen-, Speicherwurzel- oder Wurzel-spezifische Promotoren wie beispielsweise der Patatin Promotor Klasse I (B33), der Promotor des Cathepsin D Inhibitors aus Kartoffel.
Blattspezifische Promotoren wie Promotor der cytosolischen FBPase aus Kartoffel (WO 97/05900), der SSU Promotor (small subunit) der Rubisco (Ribulose-1,5-bisphosphatcarboxylase) oder der ST-LSI Promotor aus Kartoffel (Stockhaus et al. (1989) EMBO J 8: 2445-2451).
Blütenspezifische Promotoren wie beispielsweise der Phytoen Synthase Promotor (WO 92/16635) oder der Promotor des P-rr Gens (WO 98/22593).
Antheren-spezifische Promotoren wie den 5126-Promotor (US 5,689,049, US 5,689,051), den glob-l Promotor und den γ-Zein Promotor.
c) Chemisch induzierbare Promotoren
Die Expressionskassetten können auch einen chemisch induzierbaren Promotor enthalten (Übersichtsartikel: Gatz et al. (1997) Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 48: 89-108), durch den die Expression des exogenen Gens in der Pflanze zu einem bestimmten Zeitpunkt gesteuert werden kann. Derartige Promotoren, wie z. B. der PRP1 Promotor (Ward et al. (1993) Plant Mol Biol 22: 361-366), durch Salicylsäure induzierbarer Promotor (WO 95/19443), ein durch Benzolsulfonamid-induzierbarer Promotor (EP 0 388 186), ein durch Tetrazyklin- induzierbarer Promotor (Gatz et al. (1992) Plant J 2: 397-404), ein durch Abscisinsäure induzierbarer Promotor (EP 0 335 528) bzw. ein durch Ethanol- oder Cyclohexanon- induzierbarer Promotor (WO 93/21334) können ebenfalls verwendet werden. Ferner geeignet ist der Promotor des Glutathione-S-transferase Isoform II Gens (GST-II-27), der durch exogen applizierte Safener wie z. B. N,N-Diallyl-2,2-dichloroacetamid aktiviert werden kann (WO 93/01294) und in zahlreichen Geweben von sowohl Monokotyledonen als auch Dikotyledonen funktionell ist.
d) Stress- oder Pathogen-induzierbare Promotoren
Ferner sind Promotoren bevorzugt, die durch biotischen oder ablotischen Stress induziert werden wie beispielsweise der pathogen-induzierbare Promotor des PRP1-Gens (Ward et al. (1993) Plant Mol Biol 22: 361-366), der hitzeinduzierbare hsp70- oder hsp80-Promoter aus Tomate (US 5,187,267), der kälteinduzierare alpha-Amylase Promoter aus der Kartoffel (WO 96/12814), der licht-induzierbare PPDK Promotor oder der verwundungsinduzierte pinII-Promoter (EP 375091).
Pathogen-induzierbare Promotoren umfassen die von Genen, die infolge eines Pathogenbefalls induziert werden wie beispielsweise Gene von PR-Proteinen, SAR-Proteinen, β-1,3-Glucanase, Chitinase usw. (beispielsweise Redolfi et al. (1983) Neth J Plant Pathol 89: 245-254; Uknes, et al. (1992) The Plant Cell 4: 645-656; Van Loon (1985) Plant Mol Viral 4: 111-116; Marineau et al. (1987) Plant Mol Biol 9: 335-342; Matton et al. (1987) Molecular Plant-Microbe Interactions 2: 325-342; Somssich et al. (1986) Proc Natl Acad Sci USA 83: 2427-2430; Somssich et al. (1988) Mol Gen Genetics 2: 93-98; Chen et al. (1996) Plant J 10: 955-966; Zhang and Sing (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91: 2507-2511; Warner, et al. (1993) Plant J 3: 191-201; Siebertz et al. (1989) Plant Cell 1: 961-968 (1989). Umfasst sind auch verwundungs-induzierbare Promotoren wie der des pinII Gens (Ryan (1990) Ann Rev Phytopath 28: 425-449; Duan et al. (1996) Nat Biotech 14: 494-498), des wun1 und wun2-Gens (US 5,428,148), des win1- und win2-Gens (Stanford et al. (1989) Mol Gen Genet 215: 200-208), des Systemin (McGurl et al. (1992) Science 225: 1570-1573), des WIP1-Gens (Rohmeier et al. (1993) Plant Mol Biol 22: 783-792; Eckelkamp et al. (1993) FEBS Letters 323: 73-76), des MPI-Gens (Corderok et al. (1994) The Plant J 6(2): 141-150) und dergleichen.
e) Entwicklungsabhängige Promotoren
Weitere geeignete Promotoren sind beispielsweise fruchtreifung-spezifische Promotoren, wie beispielsweise der fruchtreifung-spezifische Promotor aus Tomate (WO 94/21794, EP 409 625). Entwicklungsabhängige Promotoren schließt zum Teil die Gewebespezifischen Promotoren ein, da die Ausbildung einzelner Gewebe naturgemäß entwicklungsabhängig erfolgt.

Besonders bevorzugt sind konstitutive, induzierbare sowie samenspezifische Promotoren.

Genetische Kontrollsequenzen umfassen auch weitere Promotoren, Promotorelemente oder Minimalpromotoren, die die expressionssteuernden Eigenschaften modifizieren können. So kann durch genetische Kontrollsequenzen zum Beispiel die gewebespezifische Expression zusätzlich abhängig von bestimmten Stressfaktoren erfolgen. Entsprechende Elemente sind zum Beispiel für Wasserstress, Abscisinsäure (Lam E und Chua NH (1991) J Biol Chem 266(26): 17131-17135) und Hitzestress (Schoffl F et al. (1989) Molecular & General Genetics 217(2-3): 246-53) beschrieben.

Genetische Kontrollsequenzen umfassen ferner auch die 5'-untranslatierte Regionen, Introns oder nichtkodierende 3'-Region von Genen wie beispielsweise das Actin-1 Intron, oder die Adh1-S Introns 1, 2 und 6 (allgemein: The Maize Handbook, Chapter 116, Freeling and Walbot, Eds., Springer, New York (1994)). Es ist gezeigt worden, dass diese eine signifikante Funktionen bei der Regulation der Genexpression spielen können. So wurde gezeigt, dass 5'-untranslatierte Sequenzen die transiente Expression heterologer Gene verstärken können. Sie können ferner die Gewebsspezifität fördern (Rouster J et al. (1998) Plant J. 15: 435-440). Beispielhaft für Translationsverstärker sei die 5'-Leadersequenz aus dem Tabak-Mosaik-Virus zu nennen (Gallie et al. (1987) Nucl Acids Res 15: 8693-8711) und dergleichen. Sie können ferner die Gewebsspezifität fördern (Rouster J et al. (1998) Plant J 15: 435-440).

Als Kontrollsequenzen geeignete Polyadenylierungssignale sind pflanzliche Polyadenylierungssignale, vorzugsweise solche, die im wesentlichen T-DNA Polyadenylierungssignale aus Agrobacterium tumefaciens, insbesondere des Gens 3 der T-DNA (Octopin Synthase) des Ti-Plasmids pTiACHS entsprechen (Gielen et al. (1984) EMBO J 3: 835 ff) oder funktionelle Äquivalente davon. Beispiele für besonders geeignete Terminatorsequenzen sind der OCS(Octopin- Synthase)-Terminator und der NOS(Nopalin-Synthase)-Terminator (Depicker A et al (1982) J Mol Appl Genet 1: 561-573), als auch die Terminatoren von Sojabohnen Actin, RUBISCo oder alpha-Amylase aus Weizen (Baulcombe DC et al (1987) Mol Gen Genet 209: 33-40).

Es können ferner weitere Promotoren funktionell mit der zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz verknüpft sein, die eine Expression in weiteren Pflanzengeweben oder in anderen Organismen, wie zum Beispiel E. coli Bakterien ermöglichen.

Ferner sind für die gezielte Expression in den Plastiden plastiden-spezifische Promotoren bevorzugt. Geeignete Promotoren sind beispielsweise beschrieben in WO 98/55595 oder WO 97/06250. Zu nennen sind das rpoB Promotorelement, das atoB Promotorelement, das clpP Promotorelement (siehe auch WO 99/46394) oder das 16SrDNA Promotorelement. Weiterhin sind virale Promotoren geeignet (WO 95/16783).

Eine gezielte plastidäre Expression kann auch erreicht werden, wenn man zum Beispiel einen bakteriellen oder bakteriophagen Promotor verwendet, die resultierende Expressionskassette in die plastidäre DNA einbringt und die Expression dann durch ein Fusionsprotein aus einer bakteriellen oder bacteriophagen Polymerase und einem plastidären Transitpeptid exprimiert. Ein entsprechendes Verfahren ist in US 5,925,806 beschrieben.

Die Expressionskassette kann vorteilhafterweise eine oder mehrere sogenannte "enhancer Sequenzen" funktionell verknüpft mit dem Promoter enthalten, die eine erhöhte transgene Expression der Nukleinsäuresequenz ermöglichen. Auch am 3'-Ende der transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenzen können zusätzliche vorteilhafte Sequenzen insertiert werden, wie weitere regulatorische Elemente oder Terminatoren. Die transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenzen können in einer oder mehreren Kopien im Genkonstrukt enthalten sein.

Genetische Kontrollsequenzen meint ferner Sequenzen, die für Fusionsproteine bestehend aus einer Signalpeptidsequenz kodieren. Die Expression des Zielgenes ist in jedem gewünschten Zellkompartiment, wie z. B. dem Endomembransystem, der Vakuole und den Chloroplasten möglich. Durch Nutzung des sekretorischen Weges sind gewünschte Glykosylierungsreaktionen, besondere Faltungen u. ä. möglich. Auch die Sekretion des Zielproteins zur Zelloberfläche bzw. die Sezernierung ins Kulturmedium, beispielsweise bei Nutzung suspensionskultivierter Zellen oder Protoplasten ist möglich. Die dafür notwendigen Targetsequenzen können sowohl in einzelnen Vektorvariationen berücksichtigt werden als auch durch Verwendung einer geeigneten Klonierungsstrategie gemeinsam mit dem zu klonierenden Zielgen in den Vektor mit eingebracht werden.

Als Targetsequenzen können sowohl Gen eigene, sofern vorhanden, oder heterologe Sequenzen genutzt werden. Zusätzliche, heterologe zur funktionellen Verknüpfung bevorzugte aber nicht darauf beschränkte Sequenzen sind weitere Targeting-Sequenzen zur Gewährleistung der subzellulären Lokalisation im Apoplasten, in der Vakuole, in Plastiden, im Mitochondrium, im Endoplasmatischen Retikulum (ER), im Zellkern, in Ölkörperchen oder anderen Kompartimenten; sowie Translationsverstärker wie die 5'-Leadersequenz aus dem Tabak-Mosaik-Virus (Gallie et al. (1987) Nucl Acids Res 15: 8693-8711) und dergleichen. Das Verfahren, an sich nicht in den Plastiden lokalisierte Proteine, gezielt in die Plastiden zu transportieren ist beschrieben (Klosgen RB und Weil JH (1991) Mol Gen Genet. 225(2): 297-304; Van Breusegem F et al. (1998) Plant Mol Biol. 38(3): 491-496). Bevorzugte Sequenzen sind:

a) kleine Untereinheit (SSU) der Ribulosebisphosphatcarboxylase (Rubisco ssu) aus Erbse, Mais, Sonneblume
b) Transitpeptide abgeleitet von Genen der pflanzlichen Fettbiosynthese wie das Transitpeptid des plastidären "Acyl Carrier Protein" (ACP), die Stearyl-ACP-Desaturase, β-Ketoacyl-ACP Synthase oder die Acyl-ACP-Thioesterase.
c) das Transitpeptid für GBSSI ("Starch Granule Bound Synthase I")
d) LHCP II Gene.

Als Kontrollsequenzen sind weiterhin solche zu verstehen, die eine homologe Rekombination bzw. Insertion in das Genom eines Wirtsorganismus ermöglichen oder die Entfernung aus dem Genom erlauben. Methoden wie die cre/lox-Technologie erlauben eine gewebsspezifische, unter Umständen induzierbare Entfernung der Expressionskassette aus dem Genom des Wirtsorganismus (Sauer B. Methods. 1998; 14(4): 381-92). Hier werden bestimmte flankierende Sequenzen dem Zielgen angefügt (lox-Sequenzen), die später eine Entfernung mittels der cre-Rekombinase ermöglichen.

Bevorzugt kann die Expressionskassette, bestehend aus einer Verknüpfung von Promoter und zu transkribierender Nukleinsäuresequenz, integriert in einem Vektor vorliegen und durch zum Beispiel Transformation - nach einem der unten beschriebenen Verfahren - in die eukaryotische Zelle oder Organismus eingebracht werden. Die nachfolgende Expression kann transient sein oder aber auch - bevorzugt - stabil nach Insertion (beispielsweise unter Verwendung von Selektionsmarkern) der Expressionskassetten in das Genom erfolgen. Bevorzugt wird das dsRNA-Expressionssystem stabil in das Genom - beispielsweise die chromosomale DNA oder die DNA der Organellen (z. B. der Plastiden, Mitochondrien etc.) - einer Zelle integriert.

Zu einem der erfindungsgemäßen Replikationssysteme kann man auf verschiedene dem Fachmann geläufige Weisen gelangen. So können die Expressionskassetten "A" (kodierend für ein transgene dsRNA- Replikon oder den korrespondierenden (+)-RNA-Strang) und "B" (kodierend für eine dsRNA-Replikase) beispielsweise folgendermaßen in einem Organismus, einer Zelle oder einem Gewebe zusammengebracht werden:

1. Es werden auf dem üblichen Weg, bevorzugt durch Agrobakterien-vermittelte Transformation, Masterorganismen (z. B. Masterpflanzen) hergestellt, die das entsprechende dsRNA- Replikase Gen (Expressionskassette "B") tragen und exprimieren. Die dsRNA-Replikase exprimierenden Primärtransformanten werden direkt für die Transformation eingesetzt oder - bevorzugt - in geeigneter Weise bis zur Homozygotie geführt und dienen dann als Master- bzw. Wirtspflanzen, in die die dsRNA-Replikon Expressionskonstrukte "A" eingeführt werden. Dazu kann jedes beliebige Gewebe verwendet werden. Ebenso können ausgehend von diesen Masterorganismen in vitro Kulturen, wie z. B. Kallus- oder embryogene Kulturen angelegt, etabliert und zur Transformation verwendet werden. Die Transformation kann jeweils stabil oder transient erfolgen.
2. Das Replikasegen (Expressionskonstrukt "B") kann in einen Vektor, der bereits ein Expressionskonstrukt "A" kodierend für ein transgenes dsRNA-Replikon trägt, integriert werden und dadurch zeitgleich mit dem dsRNA-Replikon in die Zelle eingeführt werden.
3. Das Replikasegen (Expressionskonstrukt "B") kann mit Hilfe der Co-Transformation zeitgleich mit dem Expressionskonstrukt "A", aber auf einem separaten Vektor in die Zelle transformiert werden. Die Co-Transformation kann jeweils stabil oder transient erfolgen.
4. Replikase exprimierenden Organismen (z. B. Pflanzen) können auch als Kreuzungspartner dienen. Die Nachkommen der Kreuzung zwischen Replikase exprimierenden Organismen (z. B. Pflanzen) einerseits und solchen, die eine Expressionskassette für das transgene dsRNA-Replikon tragen, weisen das erfindungsgemäße Replikationssystem auf.

Die erfindungsgemäßen Expressionskassetten und die von ihnen abgeleiteten Vektoren können weitere Funktionselemente enthalten. In bezug auf die Expressionskassette kodierend für das transgene dsRNA-Replikon können die Funktionselement sowohl außerhalb der Sequenz kodierend für das dsRNA-Replikon als auch innerhalb derselben lokalisiert sein.

Der Begriff Funktionselement ist breit zu verstehen und meint all solche Elemente, die einen Einfluss auf Herstellung, Vermehrung oder Funktion der erfindungsgemäßen Expressionskassetten oder von diesen abgeleitete Vektoren oder Organismen haben. Die erfindungsgemäßen Expressionskassetten können einen oder mehrere dieser Funktionselemente umfassen. Sie können aber auch ohne diese ihre erfindungsgemäße Funktion ausüben. Beispielhaft aber nicht einschränkend seien zu nennen:

a) Selektionsmarker
Selektionsmarker umfasst sowohl positive Selektionsmarker, die eine Resistenz gegen ein Antibiotikum, Herbizid oder Biozid verleihen, als auch negative Selektionsmarker, die eine Sensitivität gegen eben diese verleihen, als auch Marker die dem transformierten Organismus einen Wachstumsvorteil gewähren (beispielsweise durch Expression von Schlüsselgenen der Cytokinbiosynthese; Ebinuma H et al. (2000) Proc Natl Acad Sci USA 94: 2117-2121). Bei der positiven Selektion gedeihen nur die Organismen, die den entsprechenden Selektionsmarker exprimieren, während bei der negativen Selektion eben diese eingehen. Bei der Herstellung transgener Pflanzen ist die Verwendung eines positiven Selektionsmarkers bevorzugt. Bevorzugt ist ferner die Verwendung von Selektionsmarkern, die Wachstumsvorteile verleihen. Negative Selektionsmarker können vorteilhaft verwendet werden, wenn es darum geht, bestimmt Gene oder Genomabschnitte aus einem Organismus zu entfernen (beispielsweise im Rahmen eines Kreuzungsprozesses).
Beispielhaft als Selektionsmarker seien genannt:
- a) Positive Selektionsmarker:
  Der mit dem Expressionskassette eingebrachte selektionierbaren Marker verleiht den erfolgreich transformierten Zellen eine Resistenz gegen ein Biozid (zum Beispiel ein Herbizid wie Phosphinothricin, Glyphosat oder Bromoxynil), einen Metabolismusinhibitor wie 2-Desoxyglucose-6-phosphat (WO 98/45456) oder ein Antibiotikum, wie zum Beispiel Tetracycline, Ampicillin, Kanamycin, G 418, Neomycin, Bleomycin oder Hygromycin, verleiht. Der Selektionsmarker erlaubt die Selektion der transformierten Zellen von untransformierten (McCormick et al. (1986) Plant Cell Rep 5: 81-84). Besonders bevorzugte Selektionsmarker sind solche die eine Resistenz gegen Herbizide verleihen. Beispielhaft als Selektionsmarker seien genannt:
- - DNA Sequenzen, die für Phosphinothricinacetyltransferasen (PAT) kodieren und eine Detoxifizierung des Phosphinotricins (PPT) bewirken (de Block et al. (1987) EMBO J 6: 2513-2518) (auch Bialophos®resistenzgen (bar) genannt). Entsprechende natürliche und mutierte Sequenzen sind bekannt (GenBank Acc.-No.: X17220, X05822, M22827, X65195; US 5,489,520; Becker et al. (1994) Plant J 5: 299-307; Vickers JE et al. (1996) Plant Mol Biol Rep 14: 363-368; Thompson CJ et al. (1987) EMBO J 6: 2519-2523).
- - 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphatsynthasegene (EPSP Synthasegene), die eine Resistenz gegen Glyphosat® (N-(phosphonomethyl)glycin) verleihen (Steinrucken HC et al. (1980) Biochem Biophys Res Commun 94: 1207-1212; Levin JG und Sprinson DB (1964) J Biol Chem 239: 1142-1150). Glyphosat-tolerante EPSP- Synthasen sind beschrieben (Padgette SR et al. (1995) Crop Science 35(5): 1451-1461; US 5,510,471; US 5,776,760; US 5,864,425; US 5,633,435; US 5,627;061; US 5,463,175; EP-A 0 218 571; GenBank Acc.-No.: X63374; M10947).
- - Glyphosatoxidoreduktase (gox) katalysiert die Spaltung einer C-N Bindung in Glyphosat® was so zu Aminomethylphosphonsäure (AMPA) und Glyoxylat umgesetzt und inaktiviert wird (Padgette SR et al. (1996) J Nutr 126(3): 702-16; Shah D et al. (1986) Science 233: 478-481).
- - Dalapon® inaktivierende Dehalogenasen (deh Gene). Entsprechende Sequenzen sind bekannt (GenBank Acc.- No.: AX022822, AX022820, WO 99/27116)
- - Bromoxynil® degradierende Nitrilasen (bxn Gene), z. B. aus Klebsiella ozanenae. Entsprechende Sequenzen sind bekannt (Genbank Acc.-No: E01313, J03196).
- - Neomycinphosphotransferasen verleihen eine Resistenz gegen Antibiotika (Aminoglykoside) wie Neomycin, G418, Hygromycin, Paromomycin oder Kanamycin, indem sie durch eine Phosphorylierungsreaktion deren inhibierende Wirkung reduziert. Besonders bevorzugt ist das nptII Gen. Sequenzen können aus der GenBank erhalten werden (AF080390; AF080389). Zudem ist das Gen Bestandteil zahlreicher Expressionsvektoren und kann unter Verwendung von dem Fachmann geläufigen Verfahren (wie z. B. PCR) aus diesen isoliert werden (GenBank Acc.-No.: AF234316 pCAMBIA-2301; AF234315 pCAMBIA-2300, AF234314 pCAMBIA-2201). Das NPTII Gen kodiert für eine Aminoglycosid-3'O-phosphotransferase aus E. coli, Tn5 (GenBank Acc.-No: U00004 Position 1401-2300; Beck et al. (1982) Gene 19 327-336).
- - 2-Desoxyglukose-6-phosphat Phosphatase (DOG^R1-Gen) aus Saccharomyces cerevisiae verleiht eine Resistenz gegen 2-Desoxyglucose (EP 0 807 836; Randez-Gil et al. (1995) Yeast 11: 1233-1240; Sanz et al. (1994) Yeast 10: 1195-1202; GenBank Acc.-No.: NC001140; Basenpaar 194799-194056).
- - Sulfonylurea- und Imidazolinon inaktivierende Acetolactatsynthasen, die eine Resistenz gegen Imidazolinon/Sulfonylurea-Herbizide verleihen. Wie beispielsweise die unter der GenBank Acc-No.: X51514 abgelegte Sequenz für das Arabidopsis thaliana Csr 1.2 Gen (EC 4.1.3.18) (Sathasivan K et al. (1990) Nucleic Acids Res 18(8): 2188). Acetolactatesynthasen und entsprechende vorteilhafte Mutanten, die eine Resistenz gegen Imidazolinon-Herbizide verleihen sind ferner beschrieben unter den GenBank Acc.-No.: AB049823, AF094326, X07645, X07644, A19547, A19546, A19545, I05376, I05373, AL133315.
- - Hygromycinphosphotransferasen (X74325 P. pseudomallei gene for hygromycin phosphotransferase) die eine Resitenz gegen das Antibiotikum Hygromycin verleihen. Das Gen ist Bestandteil zahlreicher Expressionsvektoren und kann unter Verwendung von dem Fachmann geläufigen Verfahren (wie beispielsweise Polymerasekettenreaktion) aus diesen isoliert werden (AF294981 pINDEX4; AF234301 pCAMBIA-1380; AF234300 pCAMBIA-1304; AF234299 pCAMBIA-1303; AF234298 pCAMBIA-1302; AF354046 pCAMBIA-1305.; AF354045 pCAMBIA-1305.1)
- - Resistenzgene gegen
b) Chloramphenicol (Chloramphenicolacetyltransferase),
c) Tetracyclin, verschiedene Resitenzgene sind beschrieben (z. B. GenBank Acc.-No.: X65876, X51366). Zudem ist das Gen bereits Bestandteil zahlreicher Expressionsvektoren und kann unter Verwendung von dem Fachmann geläufigen Verfahren (wie beispielsweise Polymerasekettenreaktion) aus diesen isoliert werden
d) Streptomycin, verschiedene Resistenzgene sind beschrieben (z. B. GenBank Acc.-No.: AJ278607)
e) Zeocin, das entsprechende Resistenzgen ist Bestandteil zahlreicher Klonierungsvektoren (z. B. L36849 Cloning vector pZEO) und kann unter Verwendung von dem Fachmann geläufigen Verfahren (wie beispielsweise Polymerasekettenreaktion) aus diesen isoliert werden.
f) Ampicillin (β-Lactamase Gen; Datta N, Richmond MH (1966) Biochem J 98(1): 204-9; Heffron F et al. (1975) J Bacteriol 122: 250-256; Bolivar F et al. (1977) Gene 2: 95-114). Die Sequenz ist Bestandteil zahlreicher Klonierungsvektoren und kann unter Verwendung von dem Fachmann geläufigen Verfahren (wie beispielsweise Polymerasekettenreaktion) aus diesen isoliert werden.
- - Gene wie die Isopentenyltransferase aus Agrobacterium tumefaciens (strain: PO22) (Genbank Acc.-No.: AB025109). Das ipt Gen ist ein Schlüsselenzym der Cytokin-Biosynthese. Seine Überexpression erleichtert die Regeneration von Pflanzen (z. B. Selektion auf Cytokin-freien Medium). Das Verfahren zur Nutzung des ipt Gens ist beschrieben (Ebinuma H et al. (2000) Proc Natl Acad Sci USA 94: 2117-2121; Ebinuma, H et al. (2000) Selection of Marker-free transgenic plants using the oncogenes (ipt, rol A, B, C) of Agrobacterium as selectable markers, In Molecular Biology of Woody Plants. Kluwer Academic Publishers).
- - Verschiedene weitere positive Selektionsmarker, die den transformierten Pflanzen einen Wachstumsvorteil gegenüber nicht transformierten verleihen, sowie Verfahren zu ihrer Verwendung sind u. a. beschrieben in EP-A 0 601 092. Beispielhaft sind zu nennen β-Glucuronidase (in Verbindung mit z. B. Cytokininglucuronid), Mannose-6-phosphat-Isomerase (in Verbindung mit Mannose), UDP-Galaktose-4-Epimerase (in Verbindung mit z. B. Galactose), wobei Mannose- 6-phosphat-Isomerase in Verbindung mit Mannose besonders bevorzugt ist.
  - a) Negative Selektionsmarker ermöglichen beispielsweise die Selektion von Organismen mit erfolgreich deletierten Sequenzen, die das Markergen umfassen (Koprek T et al. (1999) Plant J 19(6): 719-726). Der Selektionsdruck wird i. d. R. durch Umsetzung einer nicht-toxischen Verbindung zu einer toxischen bewirkt. beispielhaft seien zu nennen: Thymidinkinase (TK), Diphtheria Toxin A Fragment (DT-A), codA Gen kodierend für eine Cytosindeaminase (WO 93/01281; US 5,358,866; Gleave AP et al. (1999) Plant Mol Biol 40(2): 223-35; Perera RJ et al. (1993) Plant Mol Biol 23(4): 793-799; Stougaard J (1993) Plant J 3: 755-761), das Cytochrom P450 Gen (Koprek et al. (1999) Plant J 16: 719-726), Gene kodierend für eine Haloalkan Dehalogenase (Naested H (1999) Plant J 18: 571-576), das iaaH Gen (Sundaresan V et al. (1995) Genes & Development 9: 1797-1810) oder das tms2 Gen (Fedoroff NV & Smith DL (1993) Plant J 3: 273-289).
g) Reportergene, die für leicht quantifizierbare Proteine kodieren und über Eigenfarbe oder Enzymaktivität eine Bewertung der Transformationseffizienz, des Expressionsortes oder -zeitpunktes gewährleisten. Ganz besonders bevorzugt sind dabei Gene kodierend für Reporter-Proteine (siehe auch Schenborn E, Groskreutz D (1999) Mol Biotechnol 13(1): 29-44) wie
- - "green fluorescence protein" (GFP) (Chui WL et al. (1996) Curr Biol 6: 325-330; Leffel SM et al. (1997) Biotechniques 23(5): 912-8; Sheen et al. (1995) Plant J 8(5): 777-784; Haseloff et al. (1997) Proc Natl Acad Sci USA 94(6): 2122-2127; Reichel et al. (1996) Proc Natl Acad Sci USA 93(12): 5888-5893; Tian et al. (1997) Plant Cell Rep 16: 267-271; WO 97/41228)
- - Chloramphenicoltransferase
- - Luziferase (Millar et al. (1992) Plant Mol Biol Rep 10: 324-414; Ow et al. (1986) Science 234: 856-859); erlaubt Bioluminescenzdetektion.
- - β-Galactosidase (kodiert für ein Enzym für das verschiedenen chromogene Substrate zur Verfügung stehen)
- - β-Glucuronidase (GUS) (Jefferson et al. (1987) EMBO J 6: 3901-3907) oder das uidA Gen (kodieren für Enzyme für die verschiedene chromogene Substrate zur Verfügung stehen)
- - R-Locus Genprodukt, das die Produktion von Anthocyaninpigmenten (rote Färbung) in pflanzlichen Gewebe reguliert und so eine direkte Analyse der Promotoraktivität ohne Zugabe zusätzlicher Hilfsstoffe oder chromogener Substrate ermöglicht (Dellaporta et al. (1988) In: Chromosome Structure and Function: Impact of New Concepts, 18^th Stadler Genetics Symposium, 11: 263-282)
- - β-Lactamase (Sutcliffe (1978) Proc Natl Acad Sci USA 75: 3737-3741), Enzym für verschiedene chromogene Substrate (z. B. PADAC, eine chromogenes Cephalosporin).
- - xylE Genprodukt (Zukowsky et al. (1983) Proc Natl Acad Sci USA 80: 1101-1105), Catecholdioxygenase, die chromogene Catechole umsetzen kann.
- - Alpha-Amylase (Ikuta et al. (1990) Bio/technol. 8: 241-242).
- - Tyrosinase (Katz et al. (1983) J Gen Microbiol 129: 2703-2714), Enzym, das Tyrosin zu DOPA und Dopaquinon oxidiert, die infolge das leicht nachweisbare Melanin bilden.
- - Aequorin (Prasher et al. (1985) Biochem Biophys Res Commun 126(3): 1259-1268), kann in der Calcium-sensitiven Bioluminescenzdetektion verwendet werden.
h) Replikationsursprünge, die eine Vermehrung der erfindungsgemäßen Expressionskassetten oder Vektoren in zum Beispiel E. coli gewährleisten. Beispielhaft seien genannt ORI (origin of DNA replication), der pBR322 ori oder der P15A ori (Sambrook et al.: Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2^nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).
i) Elemente zum Beispiel "Bordersequenzen", die einen Agrobakterien-vermittelte Transfer in Pflanzenzellen für die Übertragung und Integration ins Pflanzengenom ermöglichen, wie zum Beispiel die rechte oder linke Begrenzung der T-DNA oder die vir-Region.
j) Multiple Klonierungsregionen (MCS) erlauben und erleichtern die Insertion eines oder mehrerer Nukleinsäureseguenzen.

Zur Selektion erfolgreich transformierter Zellen ist es bevorzugt, zusätzlich einen selektionierbaren Marker einzuführen, der den erfolgreich rekombinierten Zellen eine Resistenz gegen ein Biozid (zum Beispiel ein Herbizid), einen Metabolismusinhibitor wie 2-Desoxyglucose-6-phosphat (WO 98/45456) oder ein Antibiotikum verleiht. Der Selektionsmarker erlaubt die Selektion der transformierten Zellen von untransformierten (McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5: 81-84).

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft transgene Zellen und/oder Organismen, die eines der erfindungsgemäßen dsRNA-Replikons oder Rekombinationssysteme oder Expressionskassetten für ein dsRNA-Replikon oder eine dsRNA-Replikase enthalten. Die Zelle kann von einem Organismus abgeleitet oder in diesem enthalten sein, meint aber auch einzellige Organismen wie Mikroorganismen. Die Zelle kann prokaryotisch oder eukarypotischer Natur sein. Wobei das erfindungsgemäße Verfahren auf eukaryotische Organismen angewendet wird. Dennoch können prokaryotische Organismen die erfindungsgemäßen Expressionssysteme beispielsweise zum Zwecke der dsRNA-Produktion enthalten. Auch können prokaryotische Organismen, beispielsweise Agrobakterien, vorteilhaft als Vehikel für die Transformation beispielsweise pflanzlicher Organismen eingesetzt werden.

Als transgene Organismen bevorzugt sind vor allem pflanzliche Organismen. "Pflanzlicher Organismus" umfasst jeden Organismus, der zur Photosynthese befähigt ist, sowie die von diesem abgeleitete Zellen, Gewebe, Teile oder Vermehrungsgut (wie Samen oder Früchte). Eingeschlossen sind im Rahmen der Erfindung alle Gattungen und Arten höherer und niedrigerer Pflanzen des Pflanzenreiches. Einjährige, mehrjährige, monocotyledone und dicotyledone Pflanzen sowie Gymnospermen sind bevorzugt. Eingeschlossen sind reife Pflanze, Saatgut, Sprosse und Keimlinge, sowie davon abgeleitete Teile, Vermehrungsgut (zum Beispiel Knollen, Samen oder Früchte) und Kulturen, zum Beispiel Zell- oder Kalluskulturen. Reife Pflanzen meint Pflanzen zu jedem beliebigen Entwicklungsstadium jenseits des Keimlings. Keimling meint eine junge, unreife Pflanze in einem frühen Entwicklungsstadium.

"Pflanze" im Rahmen der Erfindung meint alle Gattungen und Arten höherer und niedrigerer Pflanzen des Pflanzenreiches. Eingeschlossen unter dem Begriff sind die reifen Pflanzen, Saatgut, Sprossen und Keimlinge, sowie davon abgeleitete Teile, Vermehrungsgut, Pflanzenorgane, Gewebe, Protoplasten, Kallus und andere Kulturen, zum Beispiel Zellkulturen, sowie alle anderen Arten von Gruppierungen von Pflanzenzellen zu funktionellen oder strukturellen Einheiten. Reife Pflanzen meint Pflanzen zu jedem beliebigen Entwicklungsstadium jenseits des Keimlings. Keimling meint eine junge, unreife Pflanze in einem frühen Entwicklungsstadium. "Pflanze" umfasst alle einjährigen und mehrjährige, monokotyledonen und dikotyledonen Pflanzen und schließt beispielhaft jedoch nicht einschränkend solche der Gattungen Cucurbita, Rosa, Vitis, Juglans, Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis, Trifolium, Trigonella, Vigna, Citrus, Linum, Geranium, Manihot, Daucus, Arabidopsis, Brassica, Raphanus, Sinapis, Atropa, Capsicum, Datura, Hyoscyamus, Lycopersicon, Nicotiana, Solarium, Petunia, Digitalis, Majorana, Ciahorium, Helianthus, Lactuca, Bromus, Asparagus, Antirrhinum, Heterocallis, Nemesis, Pelargonium, Panieum, Pennisetum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis, Cucumis, Browaalia, Glycine, Pisum, Phaseolus, Lolium, Oryza, Zea, Avena, Hordeum, Secale, Triticum, Sorghum, Picea und Populus ein.

Bevorzugt sind Pflanzen nachfolgender Pflanzenfamilien: Amaranthaceae, Asteraceae, Brassicaceae, Carophyllaceae, Chenopodiaceae, Compositae, Cruciferae, Cucurbitaceae, Labiatae, Leguminosae, Papilionoideae, Liliaceae, Linaceae, Malvaceae, Rosaceae, Rubiaceae, Saxifragaceae, Scrophulariaceae, Solanacea, Sterculiaceae, Tetragoniacea, Theaceae, Umbelliferae.

Bevorzugte monokotyle Pflanzen sind insbesondere ausgewählt aus den monokotylen Kulturpflanzen, wie zum Beispiel der Familie der Gramineae wie Alfalfa, Reis, Mais, Weizen oder andere Getreidearten wie Gerste, Hirse, Roggen, Triticale oder Hafer sowie dem Zuckerrohr sowie alle Arten von Gräsern.

Die Erfindung wird ganz besonders bevorzugt aus dikotyledone pflanzliche Organismen angewendet. Bevorzugte dikotyle Pflanzen sind insbesondere ausgewählt aus den dikotylen Kulturpflanzen, wie zum Beispiel

- Asteraceae wie Sonnenblume, Tagetes oder Calendula und andere mehr,
- Compositae, besonders die Gattung Lactuca, ganz besonders die Art sativa (Salat) und andere mehr,
- Cruciferae, besonders die Gattung Brassica, ganz besonders die Arten napus (Raps), campestris (Rübe), oleracea cv Tastie (Kohl), oleracea cv Snowball Y (Blumenkohl) und oleracea cv Emperor (Broccoli) und weitere Kohlarten; und der Gattung Arabidopsis, ganz besonders die Art thaliana sowie Kresse oder Canola und andere mehr,
- Cucurbitaceae wie Melone, Kürbis oder Zucchini und andere mehr,
- Leguminosae besonders die Gattung Glycine, ganz besonders die Art max (Sojabohne) Soja sowie Alfalfa, Erbse, Bohnengewächsen oder Erdnuss und andere mehr
- Rubiaceae, bevorzugt der Unterklasse Lamiidae wie beispielsweise Coffea arabica oder Coffea liberica (Kaffestrauch) und andere mehr,
- Solanaceae besonders die Gattung Lycopersicon, ganz besonders die Art esculentum (Tomate) und die Gattung Solanum, ganz besonders die Art tuberosum (Kartoffel) und melongena (Aubergine) sowie Tabak oder Paprika und andere mehr,
- Sterculiaceae, bevorzugt der Unterklasse Dilleniidae wie beispielsweise Theobroma cacao (Kakaostrauch) und andere mehr,
- Theaceae, bevorzugt der Unterklasse Dilleniidae wie beispielsweise Camellia sinensis oder Thea sinensis (Teestrauch) und andere mehr,
- Umbelliferae, besonders die Gattung Daucus (ganz besonders die Art carota (Karrotte)) und Apium (ganz besonders die Art graveolens dulce (Selarie)) und andere mehr; und die Gattung Capsicum, ganz besonders die Art annum (Pfeffer) und andere mehr,
sowie Lein, Soja, Baumwolle, Hanf, Flachs, Gurke, Spinat, Möhre, Zuckerrübe und den verschiedenen Baum-, Nuss- und Weinarten, insbesondere Banane und Kiwi.

Pflanzliche Organismen im Sinne der Erfindung sind weiterhin weitere photosynthetisch aktive befähigte Organismen, wie zum Beispiel Algen, Cyanobakterien sowie Moose. Bevorzugte Algen sind Grünalgen, wie beispielsweise Algen der Gattung Haematococcus, Phaedactylum tricornatum, Volvox oder Dunaliella. Insbesondere bevorzugt ist Synechocystis.

Am meisten bevorzugt sind

a) Pflanzen, die zur Ölproduktion geeignet sind, wie beispielsweise Raps, Sonnenblume, Sesam, Färberdistel (Carthamus tinctorius), Ölbaum, Soja, Mais, Erdnuss, Rizinus, Ölpalme, Weizen, Kakaostrauch oder verschiedene Nussarten wie beispielsweise Walnuss, Kokosnuss oder Mandel. Unter diesen wieder besonders bevorzugt sind dikotyledonen Pflanzen, insbesondere Raps, Soja und Sonnenblume.
b) Pflanzen, die der Stärkeproduktion dienen, wie beispielsweise Mais, Weizen oder Kartoffel.
c) Pflanzen, die als Nahrungs- und/oder Futtermittel und/oder Nutzpflanze genutzt werden und bei denen eine Resistenz gg. Pathogene vorteilhaft wäre, wie beispielsweise Gerste, Roggen, Reis, Kartoffel, Baumwolle, Flachs, Lein.
d) Pflanzen, die zur Produktion von Feinchemikalien wie beispielsweise Vitaminen und/oder Carotinoiden dienen können, wie beispielsweise Raps.

Die in den Verfahren verwendeten Organismen werden je nach Wirtsorganismus in dem Fachmann bekannter Weise angezogen bzw. gezüchtet.

Die Einführung einer erfindungsgemässen transgenen Expressionskassette in einen Organismus oder Zellen, Geweben, Organe, Teile bzw. Samen desselben (bevorzugt in Pflanzen bzw. pflanzliche Zellen, Gewebe, Organe, Teile oder Samen) kann vorteilhaft unter Verwendung von Vektoren realisiert werden, in denen die transgenen Expressionskassetten enthalten sind. Vektoren können beispielhaft Plasmide, Cosmide, Phagen, Viren oder auch Agrobakterien sein. Die transgenen Expressionskassetten können in den Vektor (bevorzugt ein Plasmidvektor) über eine geeignete Restriktionsschnittstelle insertiert werden. Der entstandene Vektor kann zunächst in E. coli eingeführt und amplifiziert werden. Korrekt transformierte E. coli werden selektioniert, gezüchtet und der rekombinante Vektor mit dem Fachmann geläufigen Methoden gewonnen. Restriktionsanalyse und Sequenzierung können dazu dienen, den Klonierungsschritt zu überprüfen. Bevorzugt sind solche Vektoren, die eine stabile Integration der Expressionskassette in das Wirtsgenom ermöglichen.

Die Herstellung eines transformierten Organismus (bzw. einer transformierten Zelle oder Gewebes) erfordert, dass die entsprechende DNA (z. B. der Expressionsvektor) oder RNA in die entsprechende Wirtszelle eingebracht wird. Für diesen Vorgang, der als Transformation (oder Transduktion bzw. Transfektion) bezeichnet wird, steht eine Vielzahl von Methoden zur Verfügung (Keown et al. (1990) Methods in Enzymology 185: 527-537). So kann die DNA oder RNA beispielhaft direkt durch Mikroinjektion oder durch Bombardierung mit DNA-beschichteten Mikropartikeln eingeführt werden. Auch kann die Zelle chemisch, zum Beispiel mit Polyethylenglycol, permeabilisiert werden, so dass die DNA durch Diffusion in die Zelle gelangen kann. Die DNA kann auch durch Protoplastenfusion mit anderen DNA-enthaltenden Einheiten wie Minicells, Zellen, Lysosomen oder Liposomen erfolgen. Elektroporation ist eine weitere geeignete Methode zur Einführung von DNA, bei der die Zellen reversibel durch einen elektrischen Impuls permeabilisert werden. Entsprechende Verfahren sind beschrieben (beispielsweise bei Bilang et al. (1991) Gene 100: 247-250; Scheid et al. (1991) Mol Gen Genet 228: 104-112; Guerche et al. (1987) Plant Science 52: 111-116; Neuhause et al. (1987) Theor Appl Genet 75: 30-36; Klein et al. (1987) Nature 327: 70-73; Howell et al. (1980) Science 208: 1265; Horsch et al. (1985) Science 227: 1229-1231; DeBlock et al. (1989) Plant Physiology 91: 694-701; Methods for Plant Molecular Biology (Weissbach and Weissbach, eds.) Academic Press Inc. (1988); and Methods in Plant Molecular Biology (Schuler and Zielinski, eds.) Academic Press Inc. (1989)).

Verschiedene Methoden und Vektoren zum Einschleusen von Genen in das Genom von Pflanzen sowie zur Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen sind bekannt (Plant Molecular Biology and Biotechnology (CRC Press, Boca Raton, Florida), Kapitel 6/7, S. 71-119 (1993); White FF (1993) Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsgb.: Kung und Wu R, Academic Press, 15-38; Jenes B et al. (1993) Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsgb.: Kung und R. Wu, Academic Press, S. 128-143; Potrykus (1991) Annu Rev Plant Physiol Plant Molec Biol 42: 205-225; Halford NG, Shewry PR (2000) Br Med Bull 56(1): 62-73). Dazu zählen beispielhaft die oben erwähnten. Bei Pflanzen werden dabei die beschriebenen Methoden zur Transformation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen zur transienten oder stabilen Transformation genutzt. Geeignete Methoden sind vor allem die Protoplastentransformation durch Polyethylenglykol-induzierte DNA-Aufnahme, die Liposomen vermittelte Transformation (Freeman et al. (1984) Plant Cell Physiol. 29: 1353 ff; US 4,536,475), biolistische Verfahren mit der Genkanone ("particle bombardment" Methode; US 5,100,792; EP-A 0 444 882; EP-A 0 434 616; Fromm ME et al. (1990) Bio/Technology. 8(9): 833-9; Gordon-Kamm et al. (1990) The Plant Cell 2: 603), die Elektroporation, die Inkubation trockener Embryonen in DNA-haltiger Lösung, Elektroporation (EP-A 290 395, WO 87/06614), Mikroinjektion (WO 92/09696, WO 94/00583, EP-A 0 331 083, EP-A 0 175 966) oder andere Methoden der direkten DNA-Einführung (DE 40 05 152, WO 90/12096, US 4,684,611). Physikalische Methoden der DNA-Einführung in pflanzliche Zelle sind im Überblick dargestellt bei Oard (1991) Biotech Adv 9: 1-11.

Im Falle dieser "direkten" Transformationsmethoden sind keine besonderen Anforderungen an das verwendete Plasmid gestellt. Einfache Plasmide wie die der pUC-Reihe, pBR322, M13mp Reihe, pA- CYC184 etc. können verwendet werden. Sollen vollständige Pflanzen aus den transformierten Zellen regeneriert werden, so ist er erforderlich, das sich auf dem Plasmid ein zusätzliches selektionierbares Markergen befindet.

Neben diesen "direkten" Transformationstechniken kann eine Transformation auch durch bakterielle Infektion mittels Agrobacterium (z. B. EP 0 116 718), virale Infektion mittels viraler Vektoren (EP 0 067 553; US 4,407,956; WO 95/34668; WO 93/03161) oder mittels Pollen (EP 0 270 356; WO 85/01856; US 4,684,611) durchgeführt werden.

Bevorzugt erfolgt die Transformation mittels Agrobakterien, die "entwaffnete" (disarmed) Ti-Plasmidvektor enthalten, wobei deren natürliche Fährigkeit zum Gentransfer auf Pflanzen genutzt wird (EP-A 0 270 355; EP-A 0 116 718).

Agrobacterium-Transformation ist weit verbreitet für die Transformation von Dicotyledonen, wird aber auch zunehmend auf Monocotyledonen angewandt (Toriyama et al. (1988) Bio/Technology 6: 1072-1074; Zhang et al. (1988) Plant Cell Rep 7: 379-384; Zhang et al. (1988) Theor Appl Genet 76: 835-840; Shimamoto et al. (1989) Nature 338: 274-276; Datta et al. (1990) Bio/Technology 8: 736-740; Christou et al. (1991) Bio/Technology 9: 957-962; Peng et al. (1991) International Rice Research Institute, Manila, Philippines 563-574; Cao et al. (1992) Plant Cell Rep 11: 585-591; Li et al. (1993) Plant Cell Rep 12: 250-255; Rathore et al. (1993) Plant Mol Biol 21: 871-884; Fromm et al. (1990) Bio/Technology 8: 833-839; Gordon-Kamm et al. (1990) Plant Cell 2: 603-618; D'Halluin et al. (1992) Plant Cell 4: 1495-1505; Walters et al. (1992) Plant Mol Biol 18: 189-200; Koziel et al. (1993) Biotechnology 11: 194-200; Vasil IK (1994) Plant Mol Biol 25: 925-937; Weeks et al. (1993) Plant Physiol 102: 1077-1084; Somers et al. (1992) Bio/Technology 10: 1589-1594; WO 92/14828; Hiei et al. (1994) Plant J 6: 271-282).

Die für die Agrombacterium-Transformation meist verwendeten Stämme Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes eine auch durch bakterielle Infektion mittels enthalten ein Plasmid (Ti bzw. Ri Plasmid), das auf die Pflanze nach Agrobacterium-Infektion übertragen wird. Ein Teil dieses Plasmids, genannt T-DNA (transferred DNA), wird in das Genom der Pflanzenzelle integriert. Alternativ können durch Agrobakterium auch binäre vektoren (Mini-Ti-Plasmide) auf Pflanzen übertragen und in deren Genom integriert werden. Die Agrobacterium-vermittelte Transformation ist am besten für dicotyledone, diploide Pflanzenzellen geeignet, wohingegen die direkten Transformationstechniken sich für jeden Zelltyp eignen.

Die Anwendung von Agrobakterium tumefaciens für die Transformation von Pflanzen unter Verwendung von Gewebekulturexplantaten ist beschrieben (u. a. Horsch RB et al. (1985) Science 225: 1229 ff.; Fraley et al. (1983) Proc Natl Acad Sci USA 80: 4803-4807; Bevans et al. (1983) Nature 304: 184-187). Viele Stämme von Agrobakterium tumefaciens sind in der Lage, genetisches Material - beispielsweise die erfindungsgemäßen Expressionskassetten - zu übertragen, wie z. B. die Stämme EHA101[pEHA101], EHA105[pEHA105], LBA4404[pAL4404], C58C1[pMP90] und C58C1[pGV2260] (Hood et al. (1993) Transgenic Res 2: 208-218; Hoekema et al. (1983) Nature 303: 179-181; Koncz and Schell (1986) Gen Genet 204: 383-396; Deblaere et al. (1985) Nucl Acids Res 13: 4777-4788).

Werden Agrobakterien verwendet, so ist die Expressionskassette in spezielle Plasmide zu integrieren, entweder in einen Zwischenvektor (englisch: shuttle or intermediate vector) oder einen binären Vektor. Wird ein Ti oder Ri Plasmid zur Transformation verwendet werden soll, ist zumindest die rechte Begrenzung, meistens jedoch die rechte und die linke Begrenzung der Ti oder Ri Plasmid T-DNA als flankierende Region mit der einzuführenden Expressionskassette verbunden.

Für die Agrobacterium Transformation werden bevorzugt binäre Vektoren verwendet. Binäre Vektoren können sowohl in E. coli als auch in Agrobacterium replizieren. Sie enthalten in der Regel ein Selektionsmarkergen und einen Linker oder Polylinker flankiert von der rechten und linken T-DNA Begrenzungssequenz. Sie können direkt in Agrobacterium transformiert werden (Holsters et al. (1978) Mol Gen Genet 163: 181-187). Das Selektionsmarkergen erlaubt eine Selektion transformierter Agrobakteria und ist zum Beispiel das nptII Gen, das eine Resistenz gegen Kanamycin verleiht. Das in diesem Fall als Wirtsorganismus fungierende Agrobacterium sollte bereits ein Plasmid mit der vir-Region enthalten. Diese ist für die Übertragung der T-DNA auf die pflanzliche Zelle erforderlich. Ein so transformiertes Agrobacterium kann zur Transformation pflanzlicher Zellen verwendet werden. Die Verwendung von T-DNA zur Transformation pflanzlicher Zellen ist intensiv untersucht und beschrieben (EP-A 0 120 516; Hoekema, In: The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B. V., Alblasserdam, Chapter V; An et al. (1985) EMBO J 4: 277-287). Verschiedene binäre Vektoren sind bekannt und teilweise kommerziell erhältlich wie zum Beispiel pBI101.2 oder pBIN19 (Clontech Laboratories, Inc. USA; Bevan et al. (1984) Nucl Acids Res 12: 8711), pBinAR, pPZP200 oder pPTV.

Die mit einem solchen Vektor transformierten Agrobakterien können dann in bekannter Weise zur Transformation von Pflanzen, insbesondere von Kulturpflanzen, wie z. B. von Raps, verwendet werden, indem beispielsweise verwundete Blätter oder Blattstücke in einer Agrobakterienlösung gebadet und anschließend in geeigneten Medien kultiviert werden. Die Transformation von Pflanzen durch Agrobakterien ist beschrieben (White FF, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von S. D. Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15-38; Jenes B et al. (1993) Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von S. D. Kung und R. Wu, Academic Press, S. 128-143; Potrykus (1991) Annu Rev Plant Physiol Plant Molec Biol 42: 205-225). Aus den transformierten Zellen der verwundeten Blätter bzw. Blattstücke können in bekannter Weise transgene Pflanzen regeneriert werden, die integriert die oben beschriebenen erfindungsgemässen Expressionssysteme enthalten.

Stabil transformierte Zellen d. h. solche, die die eingeführte DNA integriert in die DNA der Wirtszelle enthalten, können von untransformierten selektioniert werden, wenn ein selektionierbarer Marker Bestandteil der eingeführten DNA ist. Als Marker kann beispielhaft jedes Gen fungieren, dass eine Resistenz gegen Antibiotika oder Herbizide (wie Kanamycin, G418, Bleomycin, Hygromycin oder Phosphinotricin etc.) zu verleihen vermag (s. o.). Transformierte Zellen, die ein solches Markergen exprimieren, sind in der Lage, in der Gegenwart von Konzentrationen eines entsprechenden Antibiotikums oder Herbizides zu überleben, die einen untransformierten Wildtyp abtöten. Beispiel sind oben genannt und umfassen bevorzugt das bar Gen, dass Resistenz gegen das Herbizid Phosphinotricin verleiht (Rathore KS et al. (1993) Plant Mol Biol 21(5): 871-884), das nptII Gen, dass Resistenz gegen Kanamycin verleiht, das hpt Gen, das Resistenz gegen Hygromycin verleiht, oder das EPSP-Gen, das Resistenz gegen das Herbizid Glyphosat verleiht. Der Selektionsmarker erlaubt die Selektion von transformierten Zellen von untransformierten (McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5: 81-84). Die erhaltenen Pflanzen können in üblicher Weise gezüchtet und gekreuzt werden. Zwei oder mehr Generationen sollten vorzugsweise kultiviert werden, um sicherzustellen, dass die genomische Integration stabil und vererblich ist.

Sobald eine transformierte Pflanzenzelle hergestellt wurde, kann eine vollständige Pflanze unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Verfahren erhalten werden. Hierbei geht man beispielhaft von Kalluskulturen, einzelnen Zellen (z. B. Protoplasten) oder Blattscheiben aus (Vasil et al. (1984) Cell Culture and Somatic Cel Genetics of Plants, Vol I, II and III, Laboratory Procedures and nTheir Applications, Academic Press; Weissbach and Weissbach (1989) Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press). Aus diesen noch undifferenzierten Callus-Zellmassen kann die Bildung von Spross und Wurzel in bekannter Weise induziert werden. Die erhaltenen Sprösslinge können ausgepflanzt und gezüchtet werden. Entsprechende Verfahren sind beschriebe (Fennell et al. (1992) Plant Cell Rep. 11: 567-570; Stoeger et al (1995) Plant Cell Rep. 14: 273-278; Jahne et al. (1994) Theor Appl Genet 89: 525-533).

Die Wirksamkeit der Expression der transgen exprimierten Nukleinsäuren kann beispielsweise in vitro durch Sprossmeristemvermehrung unter Verwendung einer der oben beschriebenen Selektionsmethoden ermittelt werden. Zudem kann eine in Art und Höhe veränderte Expression eines Zielgens und die Auswirkung auf den Phänptyp der Pflanze an Testpflanzen in Gewächshausversuchen getestet werden.

Bevorzugt werden die erfindungsgemäßen Verfahren im Rahmen der Pflanzenbiotechnologie zur Erzeugung von Pflanzen mit vorteilhaften Eigenschaften eingesetzt. So kann Eignung der Pflanzen oder deren Samen als Nahrungs- oder Futtermittel verbessert werden, beispielsweise über eine Veränderung der Zusammensetzungen und/oder des Gehalt an Metaboliten, insbesondere Proteinen, Ölen, Vitaminen und/oder Stärke. Auch können Wachstumsrate, Ertrag oder die Resistenz gegen biotische oder abiotische Stressfaktoren erhöht werden.

Vorteilhafte Effekte können sowohl durch transgene Expression von Nukleinsäuren oder Proteinen als auch durch gezielte Verminderung der Expression endogener Gene hinsichtlich des Phänotypes der transgenen Pflanze erzielt werden. Dazu kann die insertierte Nukleinsäuresequenz in Bezug auf die Nukleinsäuresequenz kodierend für den (+)-RNA Strang der viralen Sequenzen des dsRNA- Replikons in sense- oder anti-sense Orientierung eingeführt werden, so dass die Expression des (+)-RNA STranges des transgenen dsRNA-Replikons zur Expression einer RNA führt, die eine sense-RNA oder anti-sense RNA der insertierten Nukleinsäuresequenz umfasst. Im Falle einer sense-RNA kann infolge bevorzugt die Translation des durch die sense-RNA kodierten Proteins erfolgen. Dazu ist es vorteilhaft, wenn die besagte Nukleinsäuresequenz möglichst am 5'-Ende der dsRNA-Replikons eingefügt wird.

Die in der transgenen Pflanze zu erzielenden vorteilhaften Effekte umfassen beispielsweise:

- Erhöhte Resistenz gegen Pathogene (biotischer Stress)
- Erhöhte Resistenz gegen Umwelteinflüsse wie Hitze, Kälte, Frost Trockenheit, UV-Licht, oxidativen Stress, Nässe, Salz etc. (abiotischer Stress)
- Erhöhte Ertragsleistung
- Verbesserte Qualität z. B. erhöhter Nährwert, erhöhte Lagerfähigkeit

Für die im Rahmen einer transgenen Expression vorteilhaft geeigneten Sequenzen seien beispielhaft aber nicht einschränkend genannt:

1. Gene die eine Resistenz oder Toleranz gegen Insekten vermitteln:
- - vollständige oder partielle Bacillus thuringiensis δ-Endotoxin-Kristallproteine (Tian YC et al. (1991) Chin J Biotechnol 7(1): 1-13; Tian Y et al. (1993) Chin J Biotechnol. 9(4): 219-227; von der Salm T et al. (1994) Plant Mol Biol. 26(1): 51-59; Fujimoto H et al. (1993) Biotechnology (NY). 11(10): 1151-1155; Zhao R et al. (1995) Chin J Biotechnol. 11(1): 1-7)
- - Proteaseinhibitoren (Johnson et al. (1989) Proc Natl Acad Sci USA, 86: 9871-9875) wie beispielsweise das Proteaseinhibitor-II Gen (pinII) aus Tomate oder Kartoffel oder das Gen kodierend für den Cowpea Trypsininhibitor (CpTI; Hilder et al. (1989) Plant Mol. Biol. 13(6): 701-710).
- - Gene, die eine Inhibition des Verdauungssystem von Insekten bewirken oder für Enzyme oder Kofaktoren kodieren, die die Produktion von Inhibitoren bewirken, wie Oryzacystatin und Amylaseinhibitoren (z. B. aus Weizen oder Gerste)
- - Lectine (Phytohemagglutinine) mit insektizide Wirkung gegen Schädlingen wie Rüssel- oder Getreidekäfer, Maiszünsler und Wurzelwurm (Murdock et al. (1990) Phytochemistry, 29: 85-89; Czapla and Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83: 2480-2485). Vorteilhaft einzusetzende Lectingene schließen Gersten- und Weizenkeimagglutinin (WGA), Phytohemagglutinin, Schneeglöckchenlectin sowie Reisagglutinine ein (Gatehouse et al. (1984) J. Sci. Food. Agric. 35: 373-380), wobei WGA besonders bevorzugt ist.
- - Gene, die die Produktion kleiner oder größerer Polypeptide mit insektizider Wirkung (z. B. lytische Peptide, Peptidhormone, Toxine oder Gifte) steuern. Beispiele sind Juvenilhormon-Esterase (Hammock et al. (1990) Nature, 344: 458-461).
- - Enzyme, die die Integrität der Insektenhülle beeinträchtigen wie Chitinasen, Proteasen, Lipasen, als auch Gene die für die Produktion von Nikkomycin (Inhibitor der Chitinsynthese) verantwortlich sind. Besonders bevorzugt sind Nukleinsäuren, die für die chit42 Endochitinase aus Trichoderma harzianum (GenBank Acc.-No.: S78423).
- - Gene, deren Produkte die Verpuppung der Insekten beeintächtigen, beispielsweise solche, die die Produktion der Ecdysteroid-UDP-glucosyltransferase verhindern.
- - Weiterhin sind Gene bevorzugt, die die Qualität der Pflanze als Insektennahrung reduzieren. So ist es beispielsweise möglich, der Pflanze eine insektizide Aktivität durch Veränderung der Sterolzusammensetzung zu verleihen. Insekten nehmen Sterole über die Nahrung auf und verwenden diese zur Hormonsynthese und zur Gewährleistung der Membranstabilität. Veränderungen der Steroidzusammensetzung in der Pflanze durch transgene Expression bestimmter Gene, die beispielsweise das Verhältnis der von Insekten bevorzugten zu nicht-bevorzugten Sterolen verschieben, kann so einen negativen Effekt auf Insektenwachstum und -entwicklung haben und somit der Pflanze eine insektizide Eigenschaft verleihen. Lipoxygenase sind natürliche, pflanzliche Enzyme, denen die Eigenschaft zugeordnet werden kann, die Eignung einer Pflanze als Insektennahrung zu vermindern. In einer bevorzugten Ausführungsform, werden daher erhöhte Lipoxygenaseaktivitäten exprimiert.
- - Gene die für Avermectin kodieren (Avermectin und Abamectin; Campbell WC (ed.), In: Avermectin and Abamectin, 1989. Ikeda et al. (1987) J. Bacteriol., 169: 5615-5621), die besonders zur Abwehr des Mais- Wurzelwurms geeignet sind.
- - Gene kodierend für Ribosomen-inaktivierende Proteine (RIPs)
2. Resistenz gegen Viren:
Die transgene Expression bestimmter Gene kann eine Resistenz gegen Virusbefall gewähren. So kann beispielsweise der Virusbefall durch Expression viraler Hüllproteine verhindert werden Cuozzo et al. (1988) Bio/Technology, 6: 549-553; Hemenway et al. (1988) The EMBO J., 7: 1273-1280; Abel et al. (1986) Science, 232: 738-743).
3. Resistenz gegen Pilze und Bakterien:
Eine transgene Expression bestimmter Polypeptide kann zu einer erhöhten Resistenz gegen Befall durch Bakterien und Pilze führen. Bevorzugt ist die Expression von sogenannten "Peptidantibiotika", "Pathogenesis related" (PR) Proteinen, Toxinresistenz, sowie von Proteinen, die die Wirt-Pathogen Interaktion betreffen. Bevorzugte Peptid-Antibiotika zählen zur Klasse der Cecropine oder Magainine und inhibieren das Wachstum verschiedener Bakterien- und Pilzarten. Die Expression von PR-Genen in monocotyledonen Pflanzen wie beispielsweise Mais kann ebenfalls eine Resistenz gegen bakterielle Schädlinge verleihen. Diese Gene werden natürlicherweise infolge eines Schädlingsbefalls induziert und sind in fünf Klassen unterteilt (Bol et al. (1990) Annu. Rev. Phytopath. 28: 113-138). Zu den PR-Proteinen zählen β-1,3-Glucanasen, Chitinasen, Osmotin und weitere Proteine. Andere Proteine zeigen eine fungizide Wirkung wie beispielsweise UDA (stinging nettle lectin) und Hevein (Broakaert et al. (1989) Science 245: 1100-1102; Barkai-Golan et al. (1978) Arch. Microbiol., 116: 119-124). Verschiedene pflanzliche Erkrankungen werden durch Phytotoxine verursacht. Enzyme, die derartige Toxine abbauen, können vorteilhaft zur Bekämpfung derartiger Erkrankungen eingesetzt werden. Auch die Veränderung struktureller Eigenschaften der Pflanze, wie beispielsweise Wachsgehalt oder Stärke der Cuticula, können vorteilhaft bei der Abwehr von Pathogenen sein, indem sie das Eindringen derselben in das pflanzliche Gewebe verhindern.
4. Durch eine Expression von Glucosinolate kann eine Nematodenabwehr erreicht werden.
5. Verbesserter UV-Schutz:
Ein verbesserter UV-Schutz kann durch Veränderung der Pigmentierung durch Expression bestimmter Polypeptide wie Enyzme der Flavonoidbiosynthese wie die Chalconsynthase oder die Phenylalaninammonialyase oder bestimmter Enyzme der DNA- Reparatur wie der Photolyase (Sakamoto A et al. (1998) DNA Seq. 9(5-6): 335-40). Besonders bevorzugt sind Nukleinsäuren, die für die Chalconsynthase aus Arabidopsis thaliana (GenBank Acc.-No.: M20308), die 6-4 Photolyase aus Arabidopsis thaliana (GenBank Acc.-No.: BAB00748) oder den Blaulicht- Photorezeptor/Photolyase Homolog (PHH1) aus Arabidopsis thaliana (GenBank Acc.-No.: US62549) oder funktionelle Äquivalente derselben kodieren.
6. Verbesserter Schutz gegen abiotische Stressfaktoren
Ein verbesserter Schutz gegen Trockenheit, Hitze, oder Kälte zum Beispiel durch Überexpression von dem "antifreeze polypeptides aus Myoxocephalus Scorpius (WO 00/00512), Myoxocephalus octodecemspinosus, dem Arabidopsis thaliana Transkriptionsaktivator CBF1, Glutamatdehydrogenasen (WO 97/12983, WO 98/11240), einem späten Embryogenesegen (LEA) zum Beispiel aus Gerste (WO 97/13843), Calcium-abhängigen Proteinkinasegenen (WO 98/26045), Calcineurinen (WO 99/05902), Farnesyltransferasen (WO 99/06580), Pei ZM et al., Science 1998, 282: 287-290), Ferritin (Deak M et al., Nature Biotechnology 1999, 17: 192-196), Oxalatoxidase (WO 99/04013; Dunwell JM (1998) Biotechnology and Genetic Engeneering Reviews 15: 1-32), DREB1A-Faktor (dehydration response element B 1A; Kasuga M et al. (1999) Nature Biotechnology 17: 276-286), Genen der Mannitol- oder Trehalosesynthese wie der Trehalosephosphatsynthase oder der Trehalosephosphatphosphatase (WO 97/42326), oder durch Inhibition von Genen wie der Trehalase (WO 97/50561). Besonders bevorzugt sind Nukleinsäuren, die für den transkriptionellen Aktivator CBF1 aus Arabidopsis thaliana (GenBank Acc.-No.: U77378) oder das "antifreeze protein" aus Myoxocephalus octodecemspinosus (GenBank Acc.- No.: AF306348) oder funktionelle Äquivalente derselben kodieren.
7. Modifikation der Speicherreserven durch Expression einer Stärkeinvertase aus Hefe oder die Modifikation des Lipidgehaltes durch Expression von Lipasen, bevorzugt von Triacylglycerol-Lipasen. Besonders bevorzugt sind Nukleinsäuren die für das tglA Gen der Triacylglycerol-Lipase aus Aspergillus oryzae (GenBank Acc.-No.: AB039325) oder die SUC2 Invertase aus Saccharomyces cerevisiae (GenBank Acc.-No.: V01311) oder funktionelle Äquivalente derselben kodieren.
8. Expression von Stoffwechselenzymen zur Verwendung im Futter- und Nahrungsmittelbereich, zum Beispiel die Expression von Phytase und Cellulasen. Besonders bevorzugt sind Nukleinsäuren wie die künstliche für eine mikrobielle Phytase kodierende cDNA (GenBank Acc.-No.: A19451) oder funktionelle Äquivalente derselben.
9. Expression von Genen, die eine Akkumulation von Feinchemikalien, wie von Tocopherolen, Tocotrienolen oder Carotinoiden bewirken. Beispielhaft sei die Phytoendesaturase genannt. Bevorzugt sind Nukleinsäuren, die für die Phytoendesaturase aus Narcissus pseudonarcissus (GenBank Acc.-No.: X78815) oder funktionelle Äquivalente derselben kodieren.
10. Erzeugung von sterilen Pflanzen durch Verhinderung der Befruchtung und/oder der Keimung mit Hilfe der Expression eines geeigneten Inhibitors zum Beispiel eines Toxins in Blüten und im Samen.
11. Produktion von Neutraceuticals wie zum Beispiel polyungesättigten Fettsäuren wie beispielsweise Arachidonsäure oder EP (Eicosapentaensäure) oder DHA (Docosahexaensäure) durch Expression von Fettsäureelongasen und/oder -desaturasen oder Produktion von Proteinen mit verbessertem Nahrungswert wie zum Beispiel mit einem hohen Anteil an essentiellen Aminosäuren (z. B. das methioninreiche 2S Albumingens der Brasilnuss). Bevorzugt sind Nukleinsäuren, die für das methioninreiche 25 Albumin aus Bertholletia excelsa (GenBank Acc.- No.: AB044391), die Δ6-Acyllipiddesaturase aus Physcomitrella patens (GenBank Acc.-No.: AJ222980; Girke et al 1998, The Plant Journal 15: 39-48), die Δ6-Desaturase aus Mortierella alpina (Sakuradani et al 1999 Gene 238: 445-453), die Δ5 Desaturase aus Caenorhabditis elegans (Michaelson et al. 1998, FEBS Letters 439: 215-218), die Δ5-Fettsäuredesaturase (des-5) aus Caenorhabditis elegans (GenBank Acc.-No.: AF078796), die Δ5-Desaturase aus Mortierella alpina (Michaelson et al. JBC 273: 19055-19059), die Δ6-Elongase aus Caenorhabditis elegans (Beaudoin et al. 2000, PNAS 97: 6421-6426), die Δ6-Elongase aus Physcomitrella patens (Zank et al. 2000, Biochemical Society Transactions 28: 654-657) oder funktionelle Äquivalente derselben kodieren.
12. Produktion von Pharmazeutika, wie zum Beispiel Antikörpern oder Vakzinen wie beschrieben bei Hood EE, Jilka JM. Curr Opin Biotechnol. 1999 Aug; 10(4): 382-6; Ma JK, Vine ND. Curr Top Microbiol Immunol. 1999; 236: 275-92. Besonders bevorzugte Beispiele sind in Tabelle 1 wiedergegeben.
13. Produktion von Enyzmen für industrielle Anwendungen oder zur Herstellung von Nahrungs- und Futtermitteln bzw. Pharmazeutika.
14. Modifikation des Faseranteils in Nahrungsmitteln auf Samenbasis durch zum Beispiel Expression von antisense- Transkripten der Coffeinsäure-O-methyltransferase oder des Cinnamoylalkoholdehydrogenase Gens.

Weitere Beispiele für vorteilhafte Gene sind zum Beispiel genannt bei Dunwell JM, Transgenic approaches to crop improvement, J Exp Bot. 2000; 51 Spec No; Seite 487-96.

Die replizierbare doppelsträngige Ribonukleotidsequenz (infolge "dsRNA-Replikon") ist insbesondere dazu geeignet, die Verminderung der Expression eines endogenen Zielgens zu bewirken, und enthält zu diesem Zweck mindestens eine insertierte Nukleinsäuresequenz, die zumindest teilweise identisch ist zu mindestens einem Teil des "sense"-RNA-Transkriptes eines endogenen Zielgens.

"Verminderung" oder "vermindern" der Expression eines Zielgens ist im Zusammenhang weit auszulegen und umfasst die teilweise oder im wesentlichen vollständige, auf unterschiedliche zellbiologische Mechanismen beruhende Unterbindung oder Blockierung der Expression des Zielgens oder der von ihm abgeleiteten RNA, mRNA, rRNA, tRNA und/oder des dadurch kodierten Proteinproduktes in einer Zelle oder einem Organismus oder einem davon abgeleiteten Teil, Gewebe, Organ, Zelle oder Samen. Eine Verminderung im Sinne der Erfindung umfasst die mengenmäßige Verringerung einer vom Zielgen exprimierten RNA, mRNA, rRNA, tRNA und/oder des dadurch kodierten Proteinproduktes bis hin zu einem im wesentlichen vollständigen Fehlen derselben. Dabei wird die Expression einer bestimmten RNA, mRNA, rRNA, tRNA und/oder des dadurch kodierten Proteinproduktes in einer Zelle oder einem Organismus im Vergleich zu der selben Zelle oder Organismus, die dem Verfahren nicht unterworfen wurden, bevorzugt um mehr als 50%, besonders bevorzugt um mehr als 80%, ganz besonders bevorzugt um mehr als 90%, am meisten bevorzugt mehr al 95% vermindert. Dabei kann die Verminderung durch dem Fachmann geläufigen Verfahren ermittelt werden. So kann die Verminderung der Proteinmenge beispielsweise durch immunologischen Nachweis des Proteins bestimmt werden. Weiterhin können biochemische Techniken wie Northern-Hybridisierung, "nuclease protection assay", Reverse Transkription (quantitative RT-PCR), ELISA ("enzyme linked immunosorbent assay"), Western-Blotting, Radioimmunoassay (RIA) oder andere Immunoassays sowie "fluorescence activated cell analysis" (FACS) eingesetzt werden. Je nach Art des verminderten Proteinproduktes kann auch die Aktivität oder der Einfluss auf den Phänotyp des Organismus oder der Zelle ermittelt werden.

"Proteinmenge" meinte die Menge eines bestimmten Polypeptides in einem Organismus, einem Gewebe, einer Zelle oder einem Zellkompartiment.

"Verminderung" der Proteinmenge meint die mengenmäßige Verminderung der Menge eines bestimmten Polypeptides in einem Organismus, einem Gewebe, einer Zelle oder einem Zellkompartiment - beispielsweise durch das erfindungsgemäße Verfahren - im Vergleich zu dem Wildtyp derselben Gattung und Art auf den dieses Verfahren nicht angewendet wurde, unter ansonst gleichen Rahmenbedingungen (wie beispielsweise Kulturbedingungen, Alter, Nährstoffzufuhr etc.). Der Verminderung beträgt dabei mindestens 10%, bevorzugt mindestens 10% oder mindestens 20%, besonders bevorzugt um mindestens 40% oder 60%, ganz besonders bevorzugt um mindestens 70% oder 80%, am meisten bevorzugt um mindestens 90% oder 95%. Verfahren zur Bestimmung der Proteinmenge sind dem Fachmann bekannt. Beispielhaft seien zu nennen: Das Mikro- Biuret Verfahren (Goa J (1953) Scand J Clin Lab Invest 5: 218-222), die Folin-Ciocalteu-Methode (Lowry OH et al. (1951) J Biol Chem 193: 265-275) oder die Messung der Adsorption von CBB G-250 (Bradford MM (1976) Analyt Biochem 72: 248-254).

"Zumindest teilweise identisch" meint, dass eine "sense"-Ribonukleotidsequenz der dsRNA auch Insertionen, Deletionen sowie einzelne Punktmutationen im Vergleich zu der Sequenz des "sense"-RNA-Transkriptes eines endogenen Zielgens aufweisen kann. Mutationen umfassen Substitutionen, Additionen, Deletionen, Inversion oder Insertionen eines oder mehrerer Basen einer Nukleinsäuresequenz. Bevorzugt beträgt die Homologie zwischen einer "sense"-Ribonukleotidsequenz einer dsRNA und mindestens einem Teil des "sense"-RNA-Transkript eines endogenen Zielgens mindestens 60%, bevorzugt mindestens 70%, ganz besonders bevorzugt mindestens 90%, am meisten bevorzugt 95%. Die Sequenzen können auch identisch mit der korrespondierenden Sequenz des Zielgens sein. Eine 100%ige Sequenzidentität zwischen der "sense"-Ribonukleotidsequenz der dsRNA und mindestens einem Teil des "sense"-Stranges der Transkriptes eines endogenen Gens ist bevorzugt, wenn gleich nicht zwingend erforderlich, um eine effiziente Verminderung der Expression des endogenen Gens zu bewirken. Einzelne Mutationen werden toleriert. Das Verfahren ist demnach tolerant gegenüber Sequenzabweichungen, wie sie infolge genetischer Mutationen, Polymorphismen oder evolutionärer Divergenzen vorliegen können. So ist es beispielsweise auch möglich mit einer einzigen dsRNA, die ausgehend von einer bestimmten endogenen Gen generiert wurde, die Expression weiterer homologer endogener Gene des gleichen Organismus oder aber auch die Expression homologer endogener Gene in anderen verwandten Arten zu unterdrücken.

"Teil des "sense"-RNA-Transkriptes eines endogenen Zielgens" meint Fragmente einer RNA oder mRNA transkribiert von einem endogenen Zielgen. Dabei hat besagtes Teil bevorzugt eine Sequenzlänge von mindestens 10 Basen, bevorzugt mindestens 25 Basen, besonders bevorzugt mindestens 50 Basen, ganz besonders bevorzugt mindestens 100 Basen, am meisten bevorzugt mindestens 200 Basen oder mindestens 300 Basen. Umfasst ist auch die vollständige transkribierte RNA oder mRNA.

Vorzugsweise wird die Sequenz der dsRNA so gewählt, dass die angestrebte dsRNA Struktur nach Ausbildung der Duplex - im Vergleich zu anderen möglichen Faltungsvarianten der Primärstruktur der dsRNA - die jeweils geringste freie Energie hat. Dies kann beispielsweise durch Vermeidung von Sequenzduplikationen etc. gewährleistet werden. Die spezifische Sekundärstruktur kann beispielsweise mit geeigneten Computerprogrammen vorausgesagt und optimiert werden (z. B. FOLDRNA; Zuker and Stiegler (1981) Nucleic Acids Res 9(1): 133-48).

"Endogenes Zielgen einer eukaryotischen Zelle oder eines eukaryotische Organismus" meint jede Nukleinsäuresequenz in einer eukaryotischen Zelle, einem eukaryotische Organismus oder einem Teil, Organ, Gewebe, Samen etc. desselben, die zur Transkription befähigt ist. Dabei kann es sich um natürlicherweise vorkommende oder aber künstlich eingeführte Sequenzen (wie beispielsweise transgene Sequenzen) handeln, wobei natürlicherweise vorkommende Sequenzen bevorzugt sind. Natürlicherweise vorkommende Sequenzen sind bevorzugt und umfassen sowohl die eigenen Sequenzen der eukaryotischen Zelle oder des eukaryotischen Organismus als auch Gene von Pathogenen, die in der eukaryotischen Zelle oder dem eukaryotischen Organismus nach einem Befall durch ein Pathogen präsent sind. Das Zielgen kann in der chromosomalen DNA oder der DNA der Organellen (wie beispielsweise der Plastiden z. B. Chloroplasten etc.) lokalisiert sein oder aber sich extrachromosomal in der Zelle befinden. Die natürlicherweise vorkommenden, eigenen Sequenzen des eukaryotischen Organismus umfassen bevorzugt Gene desselben, die stabil im Genom vorliegen, wobei das Genom die Gesamtheit der genetischen Information meint und sowohl die chromosomale als auch die plastidäre DNA umfasst. Bevorzugt ist das endogene Zielgen ein natürlicherweise in der chromosomalen DNA vorkommendes Gen. Bevorzugt sind Gene deren verminderte Expression zu einem veränderten Phänotyp führt.

Das erfindungsgemäße Expressionssystem kann ebenso zur Unterdrückung bzw. Reduktion von Replikation oder/und Translation von Targetgenen durch "Gene silencing" eingesetzt werden. Bevorzugte Gene bzw. Proteine, deren Suppression einen vorteilhaften Phänotyp bedingt, umfassen beispielhaft, aber nicht einschränkend:

1. Verbesserter Schutz gegen abiotische Stressfaktoren (Hitze, Kälte, Trockenheit, erhöhte Feuchtigkeit, Umweltgifte, UV- Strahlung). Bevorzugt werden Gene in ihrer Expression vermindert, die am Stressreaktionen beteiligt sind.
2. Modifikation der Zusammensetzung und/oder des Gehaltes an Fettsäuren, Lipiden oder Ölen
Eine Veränderung des Fettsäuregehalten oder der Fettsäurezusammensetzung, vorzugsweise in einer Ölfrucht wie Raps oder Sonnenblume, kann beispielsweise erreicht werden durch Verminderung der Genexpression von Genen der Fettsäurebiosynthese vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Genen kodierend für Acetyltransacylasen, Acyltransportproteinen ("acyl carrier protein"), Desaturasen wie Stearyldesaturasen oder mikrosomale Δ12-Desaturasen insbesondere Fad2-1 Gene, Malonyltransacylase, β-Ketoacyl-ACP-synthetasen, 3-Keto-ACP-reduktasen, Enoyl-ACP-hydrasen, Thioesterasen wie Acyl-ACP-thioesterases, Enoyl-ACP-reduktasen. Verschiedene weitere vorteilhafte Ansätze zur Modifizierung der Lipidzusammensetzung sind beschrieben (Shure M et al. (1983) Cell 35: 225-233; Preiss et al. (1987) Tailoring Genes for Crop Improvement (Bruening et al., eds.), Plenum Press, S. 133-152; Gupta et al. (1988) Plant Mol Biol. 10: 215-224; Olive et al. (1989) Plant Mol Biol 12: 525-538; Bhattacharyya et al. (1990) Cell 60: 155-122; Dunwell JM (2000) J Exp Botany 51Spec No: 487-96; Brar DS et al. (1996) Biotech Genet Eng Rev 13: 167-79; Kishore GM und Somerville CR (1993) Curr Opin Biotech 4(2): 152-8). Bevorzugt sind insbesondere Fad2 Gene (z. B. beschrieben durch Genbank Acc.-Nr.: AF124360 (Brassica carinata), AF042841 (Brassica rapa), L26296 (Arabidopsis thaliana), A65102 (Corylus avellana)). Weitere vorteilhafte Gene und Verfahren zur Modifikation des Lipidgehaltes sind beispielsweise beschrieben in US 5,530,192 und WO 94/18337. Ein erhöhter Lipidgehalt kann auch erreicht werden durch Verminderung des Stärkegehalte bespielsweise infolge verminderter Expression von von Enzymen des Kohlenhydratstoffwechsels (z. B. ADP-Glucosepyrophosphorylasen).
3. Modifikation der Kohlenhydratzusammensetzung
Eine Modifikation der Kohlenhydratzusammensetzung kann beispielsweise erreicht werden durch Verminderung der Genexpression von Genen des Kohlenhydratstoffwechsels oder der Kohlenhydratbiosynthese, beispielsweise der Biosynthese von Amylose, Pektinen, Cellulose oder Zellwandkohlenhydraten. Dadurch kann eine Vielzahl zellulärer Prozesse (Reifung, Haltfestigkeit, Stärkezusammensetzung oder -gehalt etc.) in vorteilhafter Weise beeinflusst werden. Als Zielgene seien beispielhaft jedoch nicht einschränkend zu nennen Phosphorylasen, Stärkesynthetasen, Q-Enzyme, Sucrose-6- phosphatsynthetasen, Sucrose-6-phosphatphosphatasen, ADP- Glucosepyrophosphorylasen, Branching-Enzyme, Debranching- Enzyme sowie diverse Amylasen. Die entsprechenden Gene sind beschrieben (Dunwell JM (2000) J Exp Botany 51Spec No: 487-96; Brar DS et al. (1996) Biotech Genet Eng Rev 13: 167-79; Kishore GM und Somerville CR (1993) Curr Opin Biotech 4(2): 152-8). Vorteilhafte Gene zur Beeinflussung des Kohlenhydratstoffwechsels - insbesondere der Stärkebiosynthese - sind beschrieben in WO 92/11375, WO 92/11376, US 5,365,016 und WO 95/07355.
Eine Verschiebung des Amylose/Amylopektingehaltes in Stärke kann durch Suppression der Expression des Verzweigungsenzyms Q erreicht werden, das für die α-1,6-glykosidische Verknüpfung verantwortlich ist. Entsprechende Vorgehensweisen sind beschrieben (beispielsweise bei Schwall GP et al. (2000) Nat Biotechnol 18(5): 551-554). Bevorzugt werden dazu Nukleinsäuresequenzen wie die des Starch branching enzyme II der Kartoffel (GenBank Acc.-No.: AR123356; US 6,169,226) oder dessen Homologe aus anderen Gattungen und Arten verwendet.
4. Veränderung der Farbe oder Pigmentierung
Veränderung der Farbe oder Pigmentierung vorzugsweise von Zierpflanzen kann beispielsweise erreicht werden durch Verminderung der Genexpression von Genen der Flavonoid/Anthocyan-Biosynthese. Entsprechende Vorgehensweisen sind beschrieben (beispielsweise bei Forkmann G, Martens S. (2001) Curr Opin Biotechnol 12(2): 155-160). Geeignete Zielsequenzen sind beispielsweise Chalconsynthasen (GenBank Acc.-No.: AB061022), Chalconisomerasen (GenBank Acc.-No.: AF276302), Phenylalaninammonialyasen, Dehydrokaempferol(flavone)hydroxylasen wie Flavanon-3-hydroxylasen (GenBank Acc.-No.: X72592) oder Flavanon-2-hydroxylasen, Flavonesynthase II (GenBank Acc.-No.: AB045592), Dihydroflavonolreduktasen, Dihydroflavanol-2-hydroxylasen, Dihydroflavanol-4-reduktase (GenBank Acc.-No.: AF017451), Flavonoid-3'-hydroxylasen (GenBank Acc.- No.: AB045593), Flavonoid-5'-hydroxylasen, Flavonoidglycosyltransferasen (z. B. Glucosyltransferasen wie UDPG:Flavonoid- 3-0-glucosyltransferasen, UDPG: Flavonol-7-0-glucosytransferasen oder Rhamnosyltransferasen), Flavonoidmethyltransferasen (wie z. B. SAM: Anthocyanidin-3-(p-coumaroyl)-rutinosid-5-glucosid-3',5'-0-methyltransferasen) und Flavonoidacyltransferasen (Hahlbrock (1981) Biochemistry of Plants, Vol. 7, Conn (Ed.); Weiring and de Vlaming (1984) "Petunia", KC Sink (Ed.), Springer-Verlag, New York). Geeignet sind insbesondere die in EP-A1 522 880 beschriebenen Sequenzen.
5. Verminderung des Gehaltes von Speicherproteinen
Die Verminderung der Genexpression von Genen kodierend für Speicherproteine (infolge SP) hat zahlreiche Vorteile, wie beispielsweise Verminderung des allergenen Potentials oder Veränderung in der Zusammensetzung oder Menge anderer Metabolite. Speicherproteine sind u. a beschrieben in EP-A 0 591 530, WO 87/47731, WO 98/26064, EP-A 0 620 281; Kohno-Murase J et al. (1994) Plant Mol Biol 26(4): 1115-1124.
SP dienen zur Speicherung von Kohlenstoff, Stickstoff und Schwefel, die für das schnelle heterotrophe Wachstum bei Keimung von Samen oder Pollen benötigt werden. Sie haben meist keine enzymatische Aktivität. SP werden dabei nur im Embryo während der Samenentwicklung synthetisiert und akkumulieren dabei zum einen in Proteinspeichervakuolen (PSV) von unterschiedlich differentzierten Zellen im Embryo bzw. Endosperm.
Bevorzugt ist das Speicherprotein ausgewählt aus den Klassen der 2S-Albumine (Napin-ähnlich), 7S-Globuline (Phaseolinähnlich), 11S/12S-Globuline (Legumin-/Cruciferin-ähnlich) oder Zein-Prolamine.
6. Erreichen einer Resistenz gegen pflanzliche Pathogene
Eine Resistenz gegen pflanzliche Pathogene wie Arachniden, Pilze, Insekten, Nematoden, Protozoen, Viren, Bakterien und Krankheiten kann erreicht werden durch Verminderung der Genexpression von Genen, die für das Wachstum, Überleben, bestimmte Entwicklungsstufen (beispielsweise Verpuppung) oder die Vermehrung eine bestimmten Pathogens essentiell sind. Eine entsprechende Verminderung kann eine vollständige Inhibition vorgenannter Schritte aber auch eine Verzögerung derselben bewirken. Dies können pflanzliche Gene sein, die dem Pathogen beispielsweise das Eindringen ermöglichen, können aber auch pathogen-eigene Gene sein. Bevorzugt ist die dsRNA gg. Gene des Pathogens gerichtet. Als anti-Pathogenes Agens kann dabei die dsRNA selber, jedoch auch die Expressionssysteme, Expressionskassetten oder transgenen Organismen wirken. Pflanzen können beispielsweise mit geeigneten Formulierungen vorgenannter Agentien behandelt, beispielsweise besprüht oder bestäubt werden Die Pflanzen selber können jedoch in Form eines transgenen Organismus die Agentien beinhalten und diese - beispielsweise in Form eines Fraßgiftes - an die Pathogene weitergeben. Verschiedene essentielle Gene diverser Pathogene sind dem Fachmann bekannt (z. B. für Nematodenresistenz WO 93/10251, WO 94/17194).
Am meisten bevorzugt als Pathogen sind Pilzpathogene wie Phytophthora infestans, Fusarium nivale, Fusarium graminearum, Fusarium culmorum, Fusarium oxysporum, Blumeria graminis, Magnaporthe grisea, Sclerotinia sclerotium, Septoria nodorum, Septoria tritici, Alternaria brassicae, Phoma lingam, bakterielle Pathogene wie Corynebacterium sepedonicum, Erwinia carotovora, Erwinia amylovora, Streptomyces scabies, Pseudomonas syringae pv. tabaci, Pseudomonas syringae pv. phaseolicola, Pseudomonas syringae pv. tomato, Xanthomonas campestris pv. malvacearum und Xanthomonas campestris pv. oryzae, und Nematoden wie Globodera rostochiensis, G. pallida, Heterodera schachtii, Heterodera avenae, Ditylenchus dipsaci, Anguina tritici und Meloidogyne hapla.
Eine Virusresistenz kann beispielsweise durch Verminderung der Expression eines viralen Hüllproteins, einer viralen Replikase, einer viralen Protease etc. erreicht werden. Zahlreiche Pflanzenviren und entsprechende Zielgene sind dem Fachmann bekannt.
7. Verhinderung von Halmbruch
8. Eine verminderte Anfälligkeit gegen Halmbruch kann beispielsweise erreicht werden durch Verminderung der Genexpression von Genen des Kohlenhydratstoffwechsels (s. o.). Vorteilhafte Gene sind beschrieben (u. a. WO 97/13865) und umfassen gewebsspezifische Polygalacturonasen oder Cellulasen.
9. Verzögerung der Fruchtreifung
10. Eine verzögerte Fruchtreifung kann beispielsweise erreicht werden durch Verminderung der Genexpression von Genen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polygalacturonasen (Gen- Bank Acc.-No.: X14074), Pectinesterasen, β-(1-4)glucanasen (Cellulasen), β-Galactanasen (β-Galactosidasen), oder Gene der Ethylenbiosynthese wie 1-Aminocyclopropan-1-carboxylatsynthase, Gene der Carotinoidbiosynthese wie z. B. Gene der Prephytoen- oder Phytoenbiosynthese beispielsweise Phytoendesaturasen. Weitere vorteilhafte Gene sind beispielsweise in WO 91/16440, WO 91/05865, WO 91/16426, WO 92/17596, WO 93/07275 oder WO 92/04456.
11. Erzielen einer männlichen Sterilität ("male sterility"). Entsprechende Zielgene sind beschrieben u. a. in WO 94/29465, WO 89/10396, WO 92/18625.
12. Verminderung der Expression von allergenen Proteinen wie beispielsweise beschrieben bei Tada Y et al. (1996) FEBS Lett 391(3): 341-345 oder Nakamura R (1996) Biosci Biotechnol Biochem 60(8): 1215-1221.
13. Verminderung unerwünschter oder toxischer Pflanzeninhaltsstoffe wie z. B. Glucosinolaten. Entsprechende Zielgene sind beschrieben (u. a. in WO 97/16559).
14. Verzögerung von Alterserscheinungen. Entsprechende Zielgene sind u. a. Cinnamoyl-CoA:NADPH-Reduktasen oder Cinnamoyl- alkoholdehydrogenasen. Weitere Zielgene sind beschrieben (u. a. in WO 95/07993).
15. Modifikation der Lignifikation und/oder des Ligningehaltes vor allem in Baumarten. Entsprechende Zielgene sind beschrieben u. a. in WO 93/05159, WO 93/05160.
16. Modifikation des Faseranteils in Nahrungsmitteln vorzugsweise in Samen durch Verminderung der Expression der Coffeinsäure- O-methyltransferase oder der Cinnamoylalkoholdehydrogenase.
17. Modifikation der Faserqualität in Baumwolle. Entsprechende Zielgene sind beschrieben u. a. in US 5,597,718.
18. Verminderung der Stoßanfälligkeit von beispielsweise Kartoffeln durch Verminderung beispielsweise der Polyphenoloxidase (WO 94/03607) etc.
19. Steigerung der Vitamin E Biosynthese beispielsweise durch Verminderung der Expression von Genen aus dem Homogentisatabbauweg wie z. B. der Homogentisat-1,2-dioxygenase (HGD; EC-Nr.: 1.13.11.5), der Maleylacetoacetatisomerase (MAAI; EC-Nr.: 5.2.1.2.) oder der Fumarylacetoacetathydrolase (FAAH; EC-Nr.: 3.7.1.2).
20. Verminderung des Nikotingehaltes beispielsweise in Tabak durch verminderte Expression beispielsweise der N-Methylputrescinoxidase und der Putrescin-N-methyltransferase.
21. Verminderung des Coffeingehaltes in der Kaffeebohne (Coffea arabica) durch durch Verminderung der Genexpression von Genen der Coffeinbiosynthese wie 7-Methylxanthine-3-methyltransferase.
22. Verminderung des Theophyllin-Gehaltes im Tee (Camellia sinensis) durch durch Verminderung der Genexpression von Genen der Theophyllin-Biosynthese wie beispielsweise 1-Methylxanthin-3-methyltransferase.
23. Erhöhung des Methioningehaltes durch Verminderung der Threoninbiosynthese, beispielsweise durch Verminderung der Expression der Threoninsynthase (Zeh M et al. (2001) Plant Physiol 127(3): 792-802).

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung der erfindungsgemässen, transgenen Organismen, bevorzugt der transgenen Pflanzen, und der von ihnen abgeleitete Zellen, Zellkulturen, Teile - wie zum Beispiel bei transgenen pflanzlichen Organismen Wurzeln, Blätter etc. -, und transgenes Vermehrungsgut wie Saaten oder Früchte, zur Herstellung von Nahrungs- oder Futtermitteln, Pharmazeutika oder Feinchemikalien, wie beispielsweise Enzymen, Vitaminen, Aminosäuren, Zucker, Fettsäuren, natürliche und synthetische Geschmacks-, Aroma- und Farbstoffe. Besonders bevorzugt ist die Produktion von Triaclyglyceriden, Lipiden, Ölen, Fettsäuren, Stärke, Tocopherolen und Tocotrienolen sowie Carotinoiden. Von Menschen und Tieren verzehrbare erfindungsgemäße, genetisch veränderte Pflanzen können auch beispielsweise direkt oder nach an sich bekannter Aufbereitung als Nahrungsmittel oder Futtermittel verwendet werden.

Sequenzen 1. SEQ ID NO: 1

cDNA Sequenz kodierend für RNA abhängige RNA-Polymerase des Beet Cryptic Virus 3 (BCV3)

2. SEQ ID NO: 2

Proteinsequenz kodierend für RNA abhängige RNA-Polymerase des Beet Cryptic Virus 3 (BCV3)

3. SEQ ID NO: 3

cDNA Sequenz kodierend für RNA abhängige RNA-Polymerase von Pyrus pyrifolia

4. SEQ ID NO: 4

Proteinsequenz kodierend für RNA abhängige RNA-Polymerase von Pyrus pyrifolia

5. SEQ ID NO: 5

cDNA Sequenz kodierend für RNA abhängige RNA-Polymerase des Gremmeniella abietina Virus MS1

6. SEQ ID NO: 6

Proteinsequenz kodierend für RNA abhängige RNA-Polymerase des Gremmeniella abietina Virus MS1

7. SEQ ID NO: 7

cDNA Sequenz kodierend für RNA abhängige RNA-Polymerase des Discula destructiva virus 2

8. SEQ ID NO: 8

Proteinsequenz kodierend für RNA abhängige RNA-Polymerase des Discula destructiva virus 2

9. SEQ ID NO: 9

cDNA Sequenz kodierend für RNA abhängige RNA-Polymerase des Discula destructiva virus 1

10. SEQ ID NO: 10

Proteinsequenz kodierend für RNA abhängige RNA-Polymerase des Discula destructiva virus 1

11. SEQ ID NO: 11

cDNA Sequenz kodierend für RNA abhängige RNA-Polymerase des Mycovirus FusoV (aus Fusarium solani)

12. SEQ ID NO: 12

Proteinsequenz kodierend für RNA abhängige RNA-Polymerase des Mycovirus FusoV (aus Fusarium solani)

13. SEQ ID NO: 13

cDNA Sequenz kodierend für RNA abhängige RNA-Polymerase aus Cryptosporidium parvum

14. SEQ ID NO: 14

Proteinsequenz kodierend für RNA abhängige RNA-Polymerase aus Cryptosporidium parvum

15. SEQ ID NO: 15

cDNA Sequenz kodierend für RNA abhängige RNA-Polymerase des Heterobasidion annosum P-type Partitivirus

16. SEQ ID NO: 16

Proteinsequenz kodierend für RNA abhängige RNA-Polymerase des Heterobasidion annosum P-type Partitivirus

17. SEQ ID NO: 17

cDNA Sequenz kodierend für RNA abhängige RNA-Polymerase des Atkinsonella hypoxylon Virus

18. SEQ ID NO: 18

Proteinsequenz kodierend für RNA abhängige RNA-Polymerase des Atkinsonella hypoxylon Virus

19. SEQ ID NO: 19

cDNA Sequenz kodierend für RNA abhängige RNA-Polymerase des Rhizoctonia solani 717 Partitivirus

20. SEQ ID NO: 20

Proteinsequenz kodierend für RNA abhängige RNA-Polymerase des Rhizoctonia solani 717 Partitivirus

21. SEQ ID NO: 21

cDNA Sequenz kodierend für RNA abhängige RNA-Polymerase des Fusarium poae Virus 1

22. SEQ ID NO: 22

Proteinsequenz kodierend für RNA abhängige RNA-Polymerase des Fusarium poae Virus 1

23. SEQ ID NO: 23

cDNA Sequenz kodierend für Cryphonectria Hypovirus 1

24. SEQ ID NO: 24

Proteinsequenz kodierend für RNA abhängige RNA-Polymerase des Cryphonectria Hypovirus 1

25. SEQ ID NO: 25

cDNA Sequenz kodierend für Oryza sativa endogene dsRNA

26. SEQ ID NO: 26

Proteinsequenz kodierend für RNA abhängige RNA-Polymerase der Oryza sativa endogenen dsRNA

27. SEQ ID NO: 27

cDNA Sequenz kodierend für Oryza sativa endogene dsRNA

28. SEQ ID NO: 28

cDNA Sequenz kodierend für Oryza sativa endogene dsRNA

29. SEQ ID NO: 29

cDNA Sequenz kodierend für Oryza rufipogon endogene dsRNA

30. SEQ ID NO: 30

cDNA Sequenz kodierend für Vicia faba endogene dsRNA

31. SEQ ID NO: 31

Proteinsequenz kodierend für RNA abhängige RNA-Polymerase der Vicia faba endogenen dsRNA

32. SEQ ID NO: 32

cDNA Sequenz kodierend für Diaporthe ambigua RNA Virus 1

33. SEQ ID NO: 33

Proteinsequenz kodierend für RNA abhängige RNA-Polymerase des Diaporthe ambigua RNA Virus 1

34. SEQ ID NO: 34

cDNA Sequenz kodierend für Phaseolus vulgaris dsRNA

35. SEQ ID NO: 35

cDNA Sequenz kodierend für Bryopsis cinicola Chloroplasten dsRNA Replikon

36. SEQ ID NO: 36

Proteinsequenz kodierend für RNA abhängige RNA-Polymerase des Bryopsis cinicola Chloroplasten dsRNA Replikons.

Ausführungsbeispiele

Die Erfindung wird in den folgenden Ausführungsbeispielen unter Bezugnahme auf die beiliegenden Figuren näher erläutert. Dabei werden Abkürzungen mit folgender Bedeutung verwendet:

Allgemeine Methoden

Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführten Klonierungsschritte wie z. B. Restriktionsspaltungen, Agarosegelelektrophorese, Reinigung von DNA-Fragmenten, Transfer von Nukleinsäuren auf Nitrozellulose und Nylonmembranen, Verknüpfen von DNA-Fragmenten, Transformation von E. coli Zellen, Anzucht der Bakterien und Sequenzanalyse rekombinanter DNA werden wie bei Sambrook et al. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press; ISBN 0-87969-309-6 beschrieben durchgeführt. Die chemische Synthese von Oligonukleotiden kann beispielsweise, in bekannter Weise, nach der Phosphoamiditmethode (Voet, Voet, 2. Auflage, Wiley Press New York, S. 896-897) erfolgen. Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführten Klonierungsschritte wie z. B. Restriktionsspaltungen, Agarosegelelektrophorese, Reinigung von DNA-Fragmenten, Transfer von Nukleinsäuren auf Nitrozellulose und Nylonmembranen, Verknüpfen von DNA-Fragmenten, Transformation von E. coli Zellen, Anzucht von Bakterien, Vermehrung von Phagen und Sequenzanalyse rekombinanter DNA werden wie bei Sambrook et al. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press; ISBN 0-87969-309-6 beschrieben durchgeführt. Die Sequenzierung rekombinanter DNA- Moleküle erfolgte mit einem Laserfluoreszenz-DNA-Sequenzierer der Firma ABI nach der Methode von Sanger (Sanger et al. (1977) Proc Natl Acad Sci USA 74: 5463-5467).

a) Anzucht von Arabidopsis Pflanzen

Die Pflanze Arabidopsis thaliana repräsentiert ein Mitglied der höheren Pflanzen (Samenpflanzen). Diese Pflanze ist eng verwandt mit anderen Pflanzenarten aus der Familie der Cruciferen wie z. B. Brassica napus, aber auch mit anderen Pflanzenfamilien der Likotyledonen. Aufgrund des hohen Grades an Homologie ihrer DNA-Sequenzen bzw. Polypeptidsequenzen kann Arabidopsis thaliana als Modellpflanze für andere Pflanzenarten eingesetzt werden.

Die Pflanzen werden entweder auf Murashige-Skoog Medium mit 0,5% Saccharose (Ogas et al. (1997) Science 277: 91-94) oder auf Erde gezogen (Focks & Benning (1998) Plant Physiol 118: 91-101). Um einheitliche Keimungs- und Blühzeiten zu erreichen, werden die Samen nach Ausplattieren bzw. Ausstreuen auf Erde zwei Tage bei 4°C stratifiziert. Nach der Blüte werden die Schoten markiert. Entsprechend der Markierungen werden dann Schoten mit einem Alter von 6 bis 20 Tagen nach der Blüte geerntet.

b) Plasmide für die Pflanzentransformation

Zur Pflanzentransformation können binäre Vektoren, wie pBinAR verwendet werden (Höfgen und Willmitzer (1990) Plant Science 66: 221-230). Die Konstruktion der binären Vektoren kann durch Ligation der cDNA in Sense- oder Antisense-Orientierung in T-DNA erfolgen. 5' der cDNA aktiviert ein Pflanzenpromotor die Transkripition der cDNA. Eine Polyadenylierungssequenz befindet sich 3' von der cDNA.

Die gewebespezifische Expression lässt sich unter Verwendung eines gewebespezifischen Promotors erzielen. Beispielsweise kann die samenspezifische Expression erreicht werden, indem der Napin- oder der LeB4- oder der USP-Promotor 5' der cDNA einkloniert wird. Auch jedes andere samenspezifische Promotorelement kann verwendet werden. Zur konstitutiven Expression in der ganzen Pflanzen lässt sich der CaMV-355-Promotor oder der Nitrilase1- Promotor (Nit1-Promotor) aus Arabidopsis thaliana (Promotor des Nitrilase-1 Gen aus Arabidopsis thaliana; GenBank Acc.-No.: U38846, Nukleotide 3862 bis 5325 oder alternativ 5342) verwenden.

c) Transformation von Agrobacterium

Die Agrobacterium-vermittelte Pflanzentransformation kann zum Beispiel unter Verwendung der Agrobacterium tumefaciens-Stämme GV3101 (pMP90) (Koncz und Schell (1986) Mol Gen Genet 204: 383-396) oder LBA4404 (Clontech) durchgeführt werden. Die Transformation kann durch Standard-Transformationstechniken durchgeführt werden (Deblaere et al. (1984) Nucl Acids Res 13: 4777-4788).

d) Pflanzentransformation

Die Agrobacterium-vermittelte Pflanzentransformation kann unter Verwendung von Standard-Transformations- und Regenerationstechniken durchgeführt werden (Gelvin SB, Schilperoort R, Plant Molecular Biology Manual, 2. Aufl., Dordrecht: Kluwer Academic Publ., 1995, in Sect., Ringbuc Zentrale Signatur: BT11-P ISBN 0-7923-2731-4; Glick BR, Thompson JE, Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Boca Raton: CRC Press, 1993, 360 S., ISBN 0-8493-5164-2).

Die Transformation mittels Agrobacterium von Arabidopsis thaliana wird durch die Methode nach Bechthold et al., 1993 (C. R. Acad. Sci. Ser. III Sci. Vie., 316, 1194-1199) durchgeführt. Beispielsweise kann Raps mittels Kotyledonen- oder Hypokotyltransformation transformiert werden (Moloney et al. (1989) Plant Cell Report 8: 238-242; De Block et al. (1989) Plant Physiol 91: 694-701). Die Verwendung von Antibiotika für die Agrobacterium- und Pflanzenselektion hängt von dem für die Transformation verwendeten binären Vektor und Agrobacterium-Stamm ab. Die Rapsselektion wird gewöhnlich unter Verwendung von Kanamycin als selektierbarem Pflanzenmarker durchgeführt.

Die Pflanzentransformation unter Verwendung von Teilchenbeschuss, Polyethylenglycol-vermittelter DNA-Aufnahme oder über die Siliziumcarbonatfaser-Technik ist beispielsweise beschrieben von Freeling und Walbot "The maize handbook" (1993) ISBN 3-540-97826-7, Springer Verlag New York).

e) Herstellung transgener Arabidopis thaliana Pflanzen

Wildtyp Arabidopsis thaliana Pflanzen (Columbia) werden mit dem Agrabacterium tumefaciens Stamm (GV3101 [pMP90]) auf Grundlage einer modifizierten Vacuuminfiltrationsmethode transformiert (Clough S und Bent A (1998) Plant J 16(6): 735-43; der Bechtold N et al. (1993) in: Planta Agrobacterium-mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants. CRAcad Sci Paris 1144(2): 204-212). Die verwendeten Agrobacterium tumefaciens Zellen waren im Vorfeld mit den Plasmiden transformiert worden.

Samen der Primärtransformanden werden auf Grundlage der Antibiotikaresistenz selektioniert. Antibiotika resistente Keimlinge werden in Erde gepflanzt und als vollentwickelte Pflanzen zur biochemischen Analyse verwendet.

f) Herstellung transgener Brassica napus Pflanzen

Die Herstellung transgener Rapspflanzen orientiert sich an einem Protokoll von Bade JB und Damm B (in Gene Transfer to Plants, Potrykus I und Spangenberg G (eds.) Springer Lab Manual, Springer Verlag, 1995, 30-38), in welchem auch die Zusammensetzung der verwendeten Medien und Puffer angegeben ist.

Die Transformationen erfolgen mit dem Agrobacterium tumefaciens Stamm GV3101 [pMP90]. Zur Transformation werden die Plasmide pBinAR-TkTP/Vit E-AT verwendet. Samen von Brassica napus var. Westar werden mit 70% Ethanol (v/v) oberflächensteril gemacht, 10 Minuten bei 55°C in Wasser gewaschen, in 1%iger Hypochlorit- Lösung (25% v/v Teepol, 0,1% v/v Tween 20) für 20 Minuten inkubiert und sechsmal mit sterilem Wasser für jeweils 20 Minuten gewaschen. Die Samen werden drei Tage auf Filterpapier getrocknet und 10 bis 15 Samen in einem Glaskolben mit 15 ml Keimungsmedium zur Keimung gebracht. Von mehreren Keimlingen (ca. 10 cm groß) werden die Wurzeln und Apices entfernt und die verbleibenden Hypokotyle in ca. 6 mm lange Stücke geschnitten. Die so gewonnenen ca. 600 Explantate werden 30 Minuten mit 50 ml Basalmedium gewaschen und in einen 300 ml Kolben überführt. Nach Zugabe von 100 ml Kallusinduktionsmedium werden die Kulturen für 24 Stunden bei 100 U/min inkubiert.

Vom Agrobacterium Stamm wird eine Übernachtkultur bei 29°C in Luria Broth-Medium mit Kanamycin (20 mg/l) angesetzt, davon 2 ml in 50 ml Luria Broth-Medium ohne Kanamycin für 4 Stunden bei 29°C bis zu einer OD₆₀₀ von 0,4 bis 0,5 inkubiert. Nach der Pelletierung der Kultur bei 2000 U/min für 25 min wird das Zellpellet in 25 ml Basalmedium resuspendiert. Die Konzentration der Bakterien in der Lösung wird durch Zugabe von weiterem Basalmedium auf eine OD₆₀₀ von 0,3 eingestellt.

Aus den Raps-Explantaten wird das Kallus-Induktionsmedium mit sterilen Pipetten entfernt, 50 ml Agrobakterium-Lösung hinzugefügt, vorsichtig gemischt und für 20 min inkubiert. Die Agrobacterien-Suspension wird entfernt, die Raps-Explantate für 1 min mit 50 ml Kallus-Induktionsmedium gewaschen und anschließend 100 ml Kallus-Induktionsmedium hinzugefügt. Die Co-Kultivierung wird für 24 h auf einem Rotationsschüttler bei 100 U/min durchgeführt. Die Co-Kultivierung wird durch Wegnahme des Kallus- Induktionsmediums gestoppt und die Explantate zweimal für jeweils 1 min mit 25 ml und zweimal für 60 min mit jeweils 100 ml Waschmedium bei 100 U/min gewaschen. Das Waschmedium mit den Explantaten wird in 15 cm Petrischalen überführt und das Medium mit sterilen Pipetten entfernt.

Zur Regeneration werden jeweils 20 bis 30 Explantate in 90 mm Petrischalen überführt, welche 25 ml Sprossinduktionsmedium mit Kanamycin enthalten. Die Petrischalen werden mit 2 Lagen Leukopor verschlossen und bei 25°C und 2000 lux bei Photoperioden von 16 Stunden Licht/8 Stunden Dunkelheit inkubiert. Alle 12 Tage werden die sich entwickelnden Kalli auf frische Petrischalen mit Sproß-Induktionsmedium umgesetzt. Alle weiteren Schritte zur Regeneration ganzer Pflanzen werden wie von Bade, J. B und Damm, B. (in: Gene Transfer to Plants, Potrykus I und Spangenberg G (eds.) Springer Lab Manual, Springer Verlag, 1995, 30-38) beschrieben durchgeführt.

g) Untersuchung der Expression eines rekombinanten Genproduktes in einem transformierten Organismus

Die Aktivität eines rekombinanten Genproduktes im transformierten Wirtsorganismus wird auf der Transkriptions- und/oder der Translationsebene gemessen.

Ein geeignetes Verfahren zur Bestimmung der Menge an Transkription des Gens (ein Hinweis auf die Menge an RNA, die für die Translation des Genproduktes zur Verfügung steht) ist die Durchführung eines Northern-Blots wie unten ausgeführt (als Bezugsstelle siehe Ausubel et al. (1988) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley: New York, oder den oben erwähnten Beispielteil), wobei ein Primer, der so gestaltet ist, dass er an das Gen von Interesse bindet, mit einer nachweisbaren Markierung (gewöhnlich radioaktiv oder chemilumineszent) markiert wird, so dass, wenn die Gesamt-RNA einer Kultur des Organismus extrahiert, auf einem Gel aufgetrennt, auf eine stabile Matrix transferiert und mit dieser Sonde inkubiert wird, die Bindung und das Ausmaß der Bindung der Sonde das Vorliegen und auch die Menge der mRNA für dieses Gen anzeigt. Diese Information zeigt den Grad der Transkription des transformierten Gens an. Zelluläre Gesamt-RNA kann aus Zellen, Geweben oder Organen mit mehreren Verfahren, die alle im Fachgebiet bekannt sind, wie zum Beispiel das von Bormann ER et al. (1992) Mol Microbiol 6: 317-326 beschriebene, präpariert werden.

Northern-Hybridisierung

Für die RNA-Hybridisierung werden 20 µg Gesamt-RNA oder 1 µg poly(A)+-RNA mittels Gelelektrophorese in Agarosegelen mit einer Stärke von 1,25% unter Verwendung von Formaldehyd, wie beschrieben in Amasino (1986, Anal. Biochem. 152, 304) aufgetrennt, mittels Kapillaranziehung unter Verwendung von 10 × SSC auf positiv geladene Nylonmembranen (Hybond N+, Amersham, Braunschweig) übertragen, mittels UV-Licht immobilisiert und 3 Stunden bei 68°C unter Verwendung von Hybridisierungspuffer (10% Dextransulfat Gew./Vol., 1 M NaCl, 1% SDS, 100 mg Heringssperma-DNA) vorhybridisiert. Die Markierung der DNA-Sonde mit dem Highprime DNA labeling-Kit (Roche, Mannheim, Deutschland) erfolgte während der Vorhybridisierung unter Verwendung von alpha-32P-dCTP (Amersham Pharmacia, Braunschweig, Deutschland). Die Hybridisierung wird nach Zugabe der markierten DNA-Sonde im gleichen Puffer bei 68°C über Nacht durchgeführt. Die Waschschritte werden zweimal für 15 min unter Verwendung von 2 × SSC und zweimal für 30 min unter Verwendung von 1 × SSC, 1% SDS, bei 68°C durchgeführt. Die Exposition der verschlossenen Filter wird bei -70°C für einen Zeitraum von 1 bis 14 T durchgeführt.

Zur Untersuchung des Vorliegens oder der relativen Menge an von dieser mRNA translatiertem Protein können Standardtechniken, wie ein Western-Blot, eingesetzt werden (siehe beispielsweise Ausubel et al. (1988) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley: New York). Bei diesem Verfahren werden die zellulären Gesamt- Proteine extrahiert, mittels Gelelektrophorese aufgetrennt, auf eine Matrix, wie Nitrozellulose, übertragen und mit einer Sonde, wie einem Antikörper, der spezifisch an das gewünschte Protein bindet, inkubiert. Diese Sonde ist gewöhnlich mit einer chemilumineszenten oder kolorimetrischen Markierung versehen, die sich leicht nachweisen lässt. Das Vorliegen und die Menge der beobachteten Markierung zeigt das Vorliegen und die Menge des gewünschten, in der Zelle vorliegenden mutierten Proteins an.

Beispiel 1 Klonstruktion des dsRNA-Replikons

Die cDNA kodierend für die vollständige Bryopsis cinicola Chloroplasten dsRNA (Koga R et al. (1998) Plant Mol Biol 36: 717-724; SEQ ID NO: 35) wird aus cDNA-Fragmenten unterschiedlicher Länge, die in der Summe teilweise überlappend die gesamte Sequenz der dsRNA enthalten, konstruiert.

Die Sequenz kodierend für die RNA abhängige Polymerase (Basenpaar 199 bis 1920 von SEQ ID NO: 35) wird unter Kontrolle des Nitrilase1-Promotors (Nit1-Promotor) aus Arabidopsis thaliana (Promotor des Nitrilase-1 Gen aus Arabidopsis thaliana; GenBank Acc.-No.: U38846, Nukleotide 3862 bis 5325 oder alternativ 5342) kloniert und in der dem Fachmann bekannten Weise mittels Agrobacterium Transfektion stabil in A. thaliana und Raps (Brassica napus) eingebracht. "Masterpflanzen", die die RNA abhängige Polymerase exprimieren werden in üblicher Weise selektioniert und homozygote Linien gezüchtet.

Ein dsRNA-Replikon umfassend eine Glukuronidase (GUS) Sequenz (infolge GUS-dsRNA-Replikon) wird ausgehend von der vollständigen cDNA der dsRNA konstruiert. In das DNA-Konstrukt für das dsRNA- Replikon wird dazu das Gen für das Markerenzym β-Glukuronidase (GUS) eingefügt. Dazu wird zunächst die kodierende Sequenz des GUS-Gens ohne Promotor und Polyadenylierungssignal über eine Polymerase-Kettenreaktion amplifiziert. Als Grundlage für die Amplifikation dient ein Plasmid (z. B. pRT103 GUS), das das GUS- Gen enthält. Es werden Oligonukleotide benutzt, die neben der spezifischen GUS-Sequenz am 5'-Ende und am 3'-Ende eine EcoRI- Schnittstelle besitzen. Das Amplifikat wird nach der PCR über Gelelektrophorese gereinigt und mit EcoRI verdaut.

Die dsRNA-cDNA (SEQ ID NO: 35) - enthaltend in einem pUC-Derivat ohne weitere EcoRI-Schnittstellen - wird mit EcoRI verdaut, was zu der Deletion des mittleren Teils der cDNA führt. In die entstandene EcoRI-Schnittstelle wird die GUS-Sequenz mit den entsprechenden kompatiblen EcoRI-Überhängen insertiert. Es entsteht eine GUS-Sequenz (infolge GUS-dsRNA-Replikon cDNA), die am 5'-Ende flankierende 225 Basenpaare und am 3'-Ende 441 Basenpaar der dsRNA-cDNA umfasst.

Zum Zwecke der in vitro Transkription, wird diese Sequenz mittels eines chimären Primers (5'-ONP) umfassend die Sequenz des T7-Promotors und die 5'-Sequenz der dsRNA-cDNA amplifiziert. Der 3'-Primer (3'-ONP) stellt die 3'-Sequenz der dsRNA-cDNA dar. Die entsprechende Sequenz wird als T7-GUS-Replikon cDNA bezeichnet.

Das generierte PCR-Fragment ermöglicht die Synthese von +-RNA unter Kontrolle des Bacteriophagen T7-RNA-Polymerase Promotors. Die in vitro Transkripte replizieren sich wie dsRNA nach Elektroporation in Protoplasten aus Arabidopsis thaliana, die die entsprechende RNA abhängige RNA-Polymerase exprimieren (s. o.). Die Synthese der GUS wird nachgewiesen.

Nach dem Überprüfen der biologischen Aktivität der in vitro Transkripte, wird die cDNA kodierend für das GUS-dsRNA-Replikon am 5'-Ende mit dem Nit1-Promotor (s. o.) und am 3'-Ende mit dem nos-Polyadenylierungssignal verbunden. Zwischen dem 3'-Ende der GUS-Replikon cDNA und dem Polyadenylierungssignal wird eine Ribozymsequenz eingefügt, die nach der Transkription autokatalytisch das exakte 3'-Ende der dsRNA (+)-RNA kreiert (methodische Details siehe Leiser RM et al. (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89(19): 9136-40). Auf diese Weise entsteht eine Expressionskassette, die es erlaubte, (+)-RNA der des GUS-dsRNA-Replikons zu erzeugen.

Das chimäre Konstrukt "Nit1-Promotor → dsRNA-Replikon → Ribozym → nos-Polyadenylierungssignal" wird in einen Binärvektor unkloniert (z. B. pBIN 19). Der Binärvektor wird dazu vorher im Polylinker mit denselben Restriktionsendonukleasen linearisiert, um kompatible Enden für die Ligation mit dem zu klonierenden chimären Konstrukt zu schaffen. Mit Binärvektor-Klonen, die das chimäre Konstrukt zwischen rechter und linker T-DNA-Bordersequenz enthalten, werden Agrobakterien durch Elektroporation transformiert. Die verwendeten Agrobakterienstämme (A. tumefaciens 2260 oder EHIA 101 für die Transformation von Tabak) enthalten ein residentes Plasmid auf dem die Virulenz-Funktionen enthalten sind. Nach Selektion der Agrobakterienkolonien, die das Binärvektorkonstrukt enthalten, werden mit den Bakteriensuspensionen Pflanzenzellen transformiert.

Durch die korrekte Verbindung zwischen Promotor und der cDNA kodierend für das dsRNA-Replikon beginnt die Transkription genau am 5'-Ende der dsRNA-Replikon-Sequenz. Die integrierte Ribozymsequenz schaft auf autokatalytischem Wege ein 3'-Ende, das dem der dsRNA entspricht. Von solchen Transkripten werden zunächst unter Einsatz der transgenen dsRNA-abhängigen RNA-Polymerase minus-Strang Intermedieate gebildet, die wiederum als Matrizen für neue plus-Stränge dienen. Von der RNA mit minus-Polarität wird auch subgenomische RNA gebildet, auf der sich das zu exprimierende Fremdgen (GUS) befindet. Die Expression des Fremdgens kann auf RNA-Ebene (in Northern-Blots) oder auf Protein-Ebene (serologisch in Western-Blots oder durch Bestimmung der Enzymaktivität des zu exprimierenden Proteins) nachgewiesen werden.

Das Konstrukt kodierend für das transgene GUS-dsRNA-Replikon wird mittels Elektroporation in Protoplasten, mittels einer Partikel- Kanone oder durch Agroinokulation in Pflanzenzellen eingebracht.

In Gegenwart der dsRNA-Replikase replizieren solche in vivo Transkripte genau wie die native dsRNA. In den Zellen erfolgt die transiente Expression. Eines der translatierten Produkte ist das GUS-Enzym. Die Enzymaktivität, die chemisch bzw. histochemisch leicht zu bestimmen ist, ist proportional zur Menge des synthetisierten Enzyms. Auf diese Weise wird das relative Expressionsniveau im Vergleich zu einem GUS-Gen ermittelt, welches direkt unter Kontrolle eines Nit1-Promotors gestellt ist und in Parallelversuchen ebenfalls als DNA in Zellen eingebracht wird. Die Ergebnisse geben Aufschluss über das durch RNA- Amplifikation erreichte Expressionsniveau.

Beispiel 2

Suppression

Entsprechend Beispiel 1 wird in die EcoRI-Schnittstelle der nativen dsRNA-cDNA ein nicht-translationsfähiges Fragment der kodierende Sequenz des 2S-Samenspeicherprotein-Gens aus Raps eingefügt. Die kodierende Sequenz des Gens wird dazu mittels PCR aus einer Raps cDNA-Bank mit entsprechenden EcoRI-Überhängen amplifizert, und wie oben für die GUS-Sequenz beschrieben in die dsRNA-cDNA insertiert. Die Herstellung eines Expressionskonstruktes unter Kontrolle des Nit1-Promoters erfolgt dann wie oben beschrieben. Die Expressionskassette wird in entsprechende die dsRNA-abhängige RNA-Polymerase exprimierende Rapszellen eingebracht.

Die Expression des Fragmentes des Samenspeicherprotein-Gen in der transgenen dsRNA-Replikon (SP-dsRNA-Replikon) wird durch den Nit1-Promotor kontrolliert. Während der Replikation wird von der genomischen RNA subgenomische RNA synthetisiert an deren 5'-Ende sich das Samenspeicherprotein-Fragment befindet.

Das Konstrukt kodierend für das SP-dsRNA-Replikon wird als DNA in Protoplasten elektroporiert und in den Zellen transient exprimiert. Die Amplifikation der dsRNA durch die dsRNA-abhängige RNA- Polymerase, kann in Northern-Experimenten mit dsRNA-spezifischen oder Samenspeicherprotein-Gen-spezifischen Sonden verfolgt werden. Die dsRNA, auf deren 5'-terminalen Teil das Samenspeicherprotein kodiert ist, ist nicht translationsaktiv.

In den mit dem SP-dsRNA-Replikon transformierten Protoplasten kann - im Vergleich zu nicht transformierten Zellen - eine signifikante Verminderung des SP-Proteinprodukt serologisch mit Antikörpern gegen das natürliche SP-Protein nachgewiesen werden. Alternativ zu dem konstitutiven Nit1-Promotor kann hier auch vorteilhaft der samenspezifische Phaseolin-Promotor verwendet werden. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Transgene doppelsträngige Ribonukleotidsequenz, wobei besagte transgene doppelsträngige Ribonukleotidsequenz Sequenzen umfasst, die eine Replikation durch eine RNA-abhängige RNA- Polymerase ermöglichen.

2. Transgene doppelsträngige Ribonukleotidsequenz nach Anspruch 1, wobei die doppelsträngige Ribonukleotidsequenz Sequenzen eines doppelsträngigen RNA-Virus umfasst ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Birnaviridae, Cystoviridae, Hypoviridae, Partitiviridae, Reoviridae, Totiviridae, Mycoviren, Varicosaviren und unklassifizierte dsRNA-Viren.

3. Transgene doppelsträngige Ribonukleotidsequenz nach Anspruch 2, wobei der doppelsträngigen RNA-Virus ausgewählt ist aus der Gruppe der Alphacryptoviren, Cryptoviren oder Phytoreoviren.

4. Transgene doppelsträngige Ribonukleotidsequenz nach einem der Anspruch 2 oder 3, wobei der doppelsträngigen RNA-Virus beschrieben ist durch eine cDNA Sequenz mit der SEQ ID NO: 23, 25, 27, 28, 29, 30, 32, 34 oder 35.

5. Transgene doppelsträngige Ribonukleotidsequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die transgene doppelsträngige Ribonukleotidsequenz als terminale Sequenzen mindestens 50 Basenpaaren der terminalen Sequenzen eines doppelsträngigen RNA- Virus umfasst.

6. Transgene Expressionskassette umfassend eine transgene doppelsträngige Ribonukleotidsequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 5 unter Kontrolle eines in einem pflanzlichen Organismus oder einem Gewebe, Organ, Teil oder Zelle desselben funktionellen Promotors.

7. Transgene Expressionskassette umfassend unter Kontrolle eines in einem pflanzlichen Organismus oder einem Gewebe, Organ, Teil oder Zelle desselben funktionellen Promotors eine doppelsträngige-RNA abhängige RNA Polymerase.

8. Transgene Expressionskassette nach Anspruch 7, wobei die RNA-abhängige RNA-Polymerase beschrieben wird durch

a) eine Sequenz mit der SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 31, 33 oder 36 oder

b) eine Sequenz, die eine Homologie von mindestens 30% zu einer der Sequenzen mit der SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 31, 33 oder 36 hat.

9. Replikationssystem für doppelsträngige Ribonukleotidsequenzen umfassend in einem Reaktionsraum

a) mindestens eine transgene doppelsträngige Ribonukleotidsequenz, wobei besagte transgene doppelsträngige Ribonukleotidsequenz Sequenzen umfasst, die eine Replikation durch eine RNA-abhängige RNA-Polymerase ermöglichen, und

b) eine RNA-abhängige RNA-Polymerase befähigt zur Replikation einer transgenen doppelsträngigen Ribonukleotidsequenz a),

10. Replikationssystem nach Anspruch 5, wobei

a) die transgene doppelsträngige Ribonukleotidsequenz wie in einem der Ansprüche 2 bis 5 definiert ist, und/oder

b) die RNA-abhängige RNA-Polymerase wie in einem der Ansprüche 7 oder 8 definiert ist.

11. Replikationssystem nach einem der Ansprüche 9 oder 10, wobei die transgene doppelsträngige Ribonukleotidsequenz und/oder die RNA-abhängige RNA-Polymerase ausgehend von einer transgenen Expressionskassette gemäß einem der Ansprüche 6 und/oder einem der Ansprüche 7 oder 8 in dem Reaktionsraum exprimiert werden.

12. Replikationssystem nach einem der Ansprüche 9 bis 11, wobei der Reaktionsraum eine Zelle eines pflanzlichen Organismus darstellt.

13. Transgener Organismus enthalten eine transgene doppelsträngige Ribonukleotidsequenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, eine transgene Expressionskassette gemäße einem der Ansprüche 6 bis 8 oder eine Replikationssystem gemäß einem der Ansprüche 9 bis 12.

14. Transgener Organismus nach Anspruch 13, wobei der transgene Organismus ein pflanzlicher Organismus ist.

15. Verfahren zur Expression von Proteinen durch Einbringen eines Replikationssystems gemäß einem der Ansprüche 9 bis 12 in einen eukaryotischen Rezipientenorganismus, wobei die transgene doppelsträngigen Ribonukleotidsequenz eine insertierte Nukleinsäuresequenz kodierend für das zu exprimierende Protein sowie gegebenenfalls weitere für die Translation erforderliche Sequenzen umfasst.

16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei der eukaryotischen Rezipientenorganismus ein pflanzlicher Organismus ist, und die insertierte Nukleinsäuresequenz ausgewählt ist aus Nukleinsäuresequenzen kodierend für Bacillus thuringiensis δ-Endotoxin-Kristallproteine, Proteaseinhibitoren, Oryzacystatin, Amylaseinhibitoren, Lectine, Juvenilhormon-Esterase, Chitinasen, Proteasen, Lipasen, Avermectin, Abamectin, Ribosomen-inaktivierende Proteine, virale Hüllproteine, Peptidantibiotika, Cecropine, Magainine, "Pathogenesis related" Proteine, β-1,3-Glucanasen, Chitinasen, Osmotin, Chalconsynthase, Phenylalaninammonialyase, Photolyase, "antifreeze" Polypeptide, Transkriptionsaktivator CBF1, Glutamatdehydrogenasen, späte Embryogenesegene (LEA), Calcium-abhängigen Proteinkinasen, Calcineurine, Farnesyltransferasen, Ferritin, Oxalatoxidasen, DREB1A-Faktor, Trehalosephosphatsynthase, Trehalosephosphatphosphatase, Triacylglycerol-Lipasen, Phytasen, Cellulasen, Phytoendesaturasen, Fettsäureelongasen, Fettsäuredesaturasen, Antikörpern, Vakzinen, Coffeinsäure- O-methyltransferasen oder Cinnamoylalkoholdehydrogenasen.

17. Verfahren zur Verminderung der Expression eines endogenen Zielgens durch Einbringen eines Replikationssystems gemäß einem der Ansprüche 9 bis 12 in einen eukaryotischen Rezipientenorganismus, wobei die transgene doppelsträngigen Ribonukleotidsequenz eine insertierte Nukleinsäuresequenz umfasst, die zumindest teilweise identisch ist zu mindestens einem Teil des "sense"-RNA-Transkriptes mindestens eines endogenen Zielgens.

18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei der eukaryotischen Rezipientenorganismus ein pflanzlicher Organismus ist, und das endogene Zielgen ausgewählt ist aus Nukleinsäuresequenzen kodierend für Acetyltransacylasen, Acyltransportproteinen, Desaturasen, Malonyltransacylase, β-Ketoacyl-ACP-synthetasen, 3-Keto-ACP-reduktasen, Enoyl-ACP-hydrasen, Thioesterasen wie Acyl-ACP-thioesterases, Enoyl-ACP-reduktasen, ADP-Glucosepyrophosphorylasen, Phosphorylasen, Stärkesynthetasen, Q-Enzyme, Sucrose-6-phosphatsynthetasen, Sucrose-6-phosphatphosphatasen, ADP-Glucosepyrophosphorylasen, Branching- Enzyme, Debranching-Enzyme, Amylasen, Chalconsynthasen, Chalconisomerasen, Phenylalaninammonialyasen, Dehydrokaempferol(flavone)hydroxylasen, Flavonesynthase II, Dihydroflavonolreduktasen, Dihydroflavanol-2-hydroxylasen, Dihydroflavanol-4-reduktase, Flavonoid-3'-hydroxylasen, Flavonoid-5'-hydroxylasen, Flavonoidglycosyltransferasen, Flavonoidmethyltransferasen, Flavonoidacyltransferasen, Speicherproteinen, Polygalacturonasen, Cellulasen, Pectinesterasen, β-(1-4)glucanasen, β-Galactanasen, 1-Aminocyclopropan-1- carboxylatsynthase, Phytoendesaturasen, Cinnamoyl-CoA:NADPH- Reduktasen, Cinnamoylalkoholdehydrogenasen, Coffeinsäure- O-methyltransferase, Cinnamoylalkoholdehydrogenase, Polyphenoloxidase, Homogentisat-1,2-dioxygenase, Maleylacetoacetatisomerase, Fumarylacetoacetathydrolase, N-Methylputrescinoxidase, Putrescin-N-methyltransferase, 7-Methylxanthine-3-methyltransferase, 1-Methylxanthin-3-methyltransferase oder Threoninsynthase.

19. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 18, wobei das Replikationssystem wie in einem der Ansprüche 11 bis 14 gekennzeichnet ist.