CN113430197B - 促进砧木根系发育及抗旱的可移动miRNA及鉴定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术和遗传改良技术领域，公开了一种促进砧木根系发育及抗旱的可移动miRNA及鉴定方法，所述促进砧木根系发育及抗旱的可移动miRNA是苹果中的Mdm‑miR160；所述促进砧木根系发育及抗旱的可移动miRNA的鉴定方法包括：RNA提取和反转录；基因克隆；苹果遗传转化；干旱胁迫处理；原位杂交；微嫁接；烟草嫁接番茄；数据分析。本发明提供的促进砧木根系发育及抗旱的可移动miRNA是苹果中的Mdm‑miR160，可以从接穗移动到砧木，促进砧木的根系发育，从而提高苹果的抗旱性。本发明通过苹果遗传转化，获得过量表达的转基因株系，表型分析发现，Mdm‑miR160e OE表现出矮化症状。

Description

促进砧木根系发育及抗旱的可移动miRNA及鉴定方法
技术领域
本发明属于生物技术和遗传改良技术领域，尤其涉及一种促进砧木根系发育及抗旱的可移动miRNA及鉴定方法。
背景技术
目前，植物已经进化出动态和复杂的细胞间通讯网络，协调和适应它们的生长和发育以适应各种环境变化。除了蛋白质和RNA等大分子外，代谢产物和植物激素等小分子也在植物中起信号传递的作用。作为信号分子RNA可以通过胞间连丝在细胞间局部移动，也可以通过韧皮部长距离移动来发挥生物学功能。非细胞自主RNA可作为植物生长发育、营养分配、基因沉默、抗病毒防御和胁迫响应等多种生理过程的移动信号，对植物体内的潜在调控机制具有重要的生物学意义。
miRNAs是一类内源性的非编码调节RNA，由RNA聚合酶II转录产生初级miRNAs(pri-miRNAs)。在植物中通过DICER-LIKE 1(DCL1)剪切处理大多数的pri-miRNAs，随后相互作用蛋白SE、HYL1和CBC剪切pri-miRNA形成短的双链miRNA，包括一个成熟miRNA和一个信使miRNA链，大约20-24个核苷酸长度。研究表明成熟的miRNAs通过形成RNA诱导的沉默复合体与靶标mRNA结合，从而对靶基因起到负调控作用。在拟南芥中，miR160的靶基因是生长素反应因子(ARF10、ARF16和ARF17)，共同调控植物的生长发育多个方面。然而苹果Mdm-miR160介导的ARF17在干旱响应中的功能尚未有研究报道。因此本发明通过遗传转化获得了苹果Mdm-miR160e的转基因株系，并对Mdm-miR160介导的苹果抗旱性进行了深入的研究。
研究报道一些miRNAs可以作为细胞间信号，进行短距离移动或长距离移动。有一些miRNAs可以在植物内部发生运动，这些miRNAs主要集中在韧皮部的分泌物中，通过营养物质的有效传递进行长距离的移动。但现有技术中关于miRNA移动后促进砧木根系发育及抗旱的相关技术方案尚未见报道。
嫁接是研究miRNA移动的主要手段。目前嫁接已被广泛应用于促进苹果的开花、矮化和抗逆等方面。因此，亟需一种促进砧木根系发育及抗旱的基因及鉴定方法。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：一，现有技术大部分是通过嫁接后韧皮部汁液测序分析、原位杂交、stem-loop RT-qPCR，突变体筛选以及Northern blot等方法研究miRNA的移动，以上实验可以发掘新的可移动miRNAs，但miRNAs移动后发挥的生物学功能研究报道较少。二，miRNA在加工生成过程中会发生两次剪切，因此不能连接荧光标签(如GFP)准确可视化miRNAs的移动过程。三，异源物种嫁接成功率较低，并且miRNA家族在不同的物种间十分保守，这给miRNA移动的实验验证带来不便。
解决以上问题及缺陷的难度为：miRNA与水分子和其他离子不同，在组织间的运输不是循环进行的，因此需要更多的实验来确定可移动的物种和决定一个miRNA是否可移动的特征。miRNAs随着韧皮部汁液的运输而发生移动，验证miRNA及其活性的动态可视化方法对于提供miRNA移动的最终证据至关重要，还需要进一步探索和创新。miRNA介导的细胞和器官间的信号转导机制和调控机制研究较少。为了充分理解可移动miRNA的作用，确定不同家族成员的表达模式、定位和功能，以及阐明不同家族成员是否具有不同的移动性需要更多的研究支持。
解决以上问题及缺陷的意义为：近年来miRNA研究领域的快速发展预示着在不久的将来会有新的重大发现。miRNA的动态可视化可以更直观的确定miRNA的移动方向和最终的组织定位。研究不同miRNA家族成员的表达模式、定位和功能为进一步研究miRNA移动后发挥的生物学功能奠定了基础。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种促进砧木根系发育及抗旱的可移动miRNA及鉴定方法。
本发明是这样实现的，一种促进砧木根系发育及抗旱的可移动miRNA，所述促进砧木根系发育及抗旱的可移动miRNA是苹果中的Mdm-miR160。
本发明的另一目的在于提供一种应用所述的促进砧木根系发育及抗旱的可移动miRNA的鉴定方法，包括以下步骤：
步骤一，RNA提取和反转录；
步骤二，基因克隆；
步骤三，苹果遗传转化；
步骤四，干旱胁迫处理；
步骤五，原位杂交；
步骤六，微嫁接；
步骤七，烟草嫁接番茄；
步骤八，数据分析。
进一步，步骤一中，所述RNA提取和反转录，包括：
利用CTAB法提取植物总RNA；
采用反转录试剂盒HiScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit+gDNA Wiper反转录合成cDNA。
进一步，步骤二中，所述基因克隆，包括：
通过miRBase下载苹果Mdm-miR160e序列，通过Primer 5设计引物，全长扩增连接至pClone-007载体，转化大肠杆菌Top10，涂含有抗生素的LB平板，37℃过夜培养，挑取阳性单克隆，液体LB培养基摇菌，使用M13通用引物测序正确后提取质粒，-20℃保存待用。
进一步，步骤三中，所述苹果遗传转化，包括：
将Mdm-miR160e的特异序列经PCR扩增、产物回收后融合pK2GW7过表达载体，电击转化农杆菌EHA105，保存菌液待用；其中，所述农杆菌介导的苹果遗传转化方法如下：
将已获得的过表达载体的EHA105农杆菌菌液活化，使用苹果用重悬液重悬，并调节浓度至OD＝0.6-0.9；继代培养一个月的GL-3组培苗，摘取中间部位平展的叶片置于农杆菌重悬液中，使用手术刀片在叶片背部划取4-7道伤口，浸泡10min后将侵染叶片表面菌液吸干，转移到苹果叶片预分化培养基上，放置于21℃培养箱中暗培养3天，转移至苹果叶片分化培养基上，于21℃培养箱中暗培养一个月后转移至组培间进行光照培养(黑暗8h，光照16h，25℃)，经抗生素(头孢100mg/L，卡那霉素50mg/L)筛选获得抗性芽；通过农杆菌介导的遗传转化成功获得了Mdm-miR160e的4个过表达转基因株系#1，#3，#5，#8；然后再经扩繁、生根获得稳定转化的转基因苹果植株。
进一步，步骤四中，所述干旱胁迫处理，包括：
短期干旱：选取长势一致的转基因株系和GL-3移栽苗两组，每组各15棵，作为处理组和对照组；移栽前称重保证盆土重量一致，浇水达到土壤饱和含水量，使用TDR检测使相对土壤体积含水量保持一致，在植物组培间进行短期干旱处理，每天检测土壤含水量，通过称重补水到GL-3和转基因苹果保持一致；持续干旱直到土壤含水量达到0，拍照记录；开始复水一周后进行存活率统计。
进一步，步骤五中，所述原位杂交，包括：
在野生型GL-3苹果中进行Mdm-miR160原位杂交实验，将组织培养的GL-3的新鲜叶片、茎和根在FAA固定液中4℃过夜固定；采用梯度乙醇、正丁醇脱色至组织变为白色。石蜡包埋放到4℃冰箱过夜；蜡块用半薄切片机(RM2265)切成7μm的厚度，用展片台展平蜡片，37℃烘烤过夜；将烘烤好的玻片放入二甲苯中脱蜡，然后用梯度乙醇进行脱水，每步5秒。最后将玻片放入1μg/ml的蛋白酶K中，37℃消化30分钟，用1 x PBS漂洗3次，每次5分钟。其中，所述杂交步骤为：
玻片在DIG-EASY-BYB缓冲液中，37℃浸泡30min，后加入探针42℃孵育18h。在常温下用2 x SSC漂洗玻片2次，用65℃的0.5 x SSC在常温下漂洗玻片2次，每次30min。洗涤缓冲液(washing buffer)漂洗5分钟-封闭工作液(blocking solution)孵育2小时-抗体溶液(antibody solution)中37℃孵育2小时-洗涤缓冲液(washing buffer)洗涤2次，每次15分钟-检测缓冲液(detection buffer)中平衡5分钟-后用TE缓冲液漂洗后保存在水中。试剂和缓冲液均来自DIG核酸检测试剂盒Roche和DIG RNA标签试剂盒SP6/T7；
进一步，步骤六中，所述微嫁接，包括：
将组培苗GL-3和Mdm-miR160e OE植株培养4周后作为砧木或接穗；微嫁接采用插接法，将接穗切成楔形切口，砧木中间垂直切0.5cm，插入接穗，用无菌的锡箔纸包裹嫁接口，转移至继代培养基培养(16h光照，8h黑暗，25℃)；在嫁接4天和7天分别取样，嫁接口1cm、接穗1cm、砧木1cm，进行原位杂交实验，对Mdm-miR160进行定性和定量分析，以GL-3嫁接GL-3作为对照；
微嫁接完成后的植株转移至生根培养基，一个月后取出进行不定根长度和数目的统计分析；移栽后培养两个月的土培苗经短期干旱处理后，进行存活率的统计；本实验设计3个生物重复，每个生物重复8个嫁接植株。
进一步，步骤七中，所述烟草嫁接番茄，包括：
烟草作为接穗，取生长一个月的烟草植株切成楔形作为接穗；取生长约一个月的番茄植株，从株高中间部位横切后再纵切0.5cm作为嫁接口，使用插接法嫁接后用保鲜膜包裹嫁接口以保湿愈合，同时以烟草和番茄自嫁接作为对照；光照培养箱(16h光照，8h黑暗，25℃)保湿培养7天后，取嫁接口以下1cm的茎段韧皮部作为检测样品，进行RNA提取、反转录和stem loop qPCR实验；PCR产物浓缩后连接至pClone-007载体转化大肠杆菌Top10，挑取阳性单克隆提取质粒进行测序。
进一步，步骤八中，所述数据分析，包括：
数据统计在GraphPad Prism 5使用One-way ANOVA方法对变量进行Tukey检验，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：
(1)本发明提供的促进砧木根系发育及抗旱的可移动miRNA是苹果中的Mdm-miR160，苹果Mdm-miR160可以从接穗移动到砧木，促进砧木的根系发育，从而提高苹果的抗旱性。通过苹果遗传转化，获得过量表达的转基因株系(Mdm-miR160e OE)，表型分析发现，Mdm-miR160e OE表现出矮化症状。与野生型GL-3相比，Mdm-miR160e OE株系不定根数目更多，长度更长。短期干旱处理之后，Mdm-miR160e OE株系具有更低的离子渗透率和更高的存活率，说明苹果Mdm-miR160e通过调控株高和根系发育正调控苹果抗旱性。
(2)通过微嫁接MdHYL1 RNAi的转基因株系和GL-3，后进行基因表达检测发现，苹果中Mdm-miR160疑似可以从接穗向砧木移动。
(3)通过查找茄科miR160的序列，发现烟草的Nta-miR160d与番茄中的Sly-miR160有一个碱基差异，因此使用烟草嫁接番茄作为实验组，以番茄自嫁接作为对照组，7天嫁接口愈合后取砧木(番茄)韧皮部进行RNA提取，反转录后进行stem-loop RT-qPCR检测烟草中的Nta-miR160d的表达水平，发现部分株系中Nta-miR160d丰度增加。随后取上调表达的株系进行扩增，产物连接pClone-007载体，提取质粒进行一代测序，结果在番茄砧木中检测到了烟草特有的Nta-miR160d，进一步说明成熟的miR160可以从接穗(烟草)移动到砧木(番茄)。
(4)查找苹果miRBase数据库，获得Mdm-miR160的成熟体序列和pri-miR160e序列，克隆基因融合过表达载体pK2GW7，通过农杆菌介导的遗传转化至皇家嘎啦(GL-3)苹果叶片，成功获得了4个过表达的转基因株系。
(5)通过在GL-3中进行Mdm-miR160的原位杂交实验发现，Mdm-miR160主要分布在维管组织韧皮部和木质部中。通过在Mdm-miR160e的过表达株系嫁接GL-3(Mdm-miR160e/GL-3)以及GL-3自嫁接(GL-3/GL-3)的砧木中检测Mdm-miR160和Mdm-miR160的靶基因MdARF17的表达量发现，与GL-3/GL-3相比，Mdm-miR160e/GL-3中Mdm-miR160表达量上调，MdARF17表达量下调。说明在苹果中Mdm-miR160可以从接穗移动到砧木，靶定MdARF17并抑制MdARF17的表达。在微嫁接材料中通过原位杂交检测Mdm-miR160的表达，结果发现在嫁接4天，嫁接口处积累Mdm-miR160，并在嫁接7天后，砧木中Mdm-miR160的丰度显著升高，这说明Mdm-miR160可以从微嫁接植株的接穗向砧木移动。
(6)对微嫁接材料Mdm-miR160e的过表达株系嫁接GL-3(Mdm-miR160e/GL-3)以及GL-3自嫁接(GL-3/GL-3)进行生根，移栽前进行根系统计，结果表明Mdm-miR160e/GL-3的不定根数目和长度均大于GL-3/GL-3。移栽两个月后的微嫁接植株进行了短期干旱处理，结果显示Mdm-miR160e/GL-3比GL-3/GL-3具有更高的存活率。进行根系统计发现，Mdm-miR160e/GL-3的不定根长度大于GL-3/GL-3。综上所述，苹果Mdm-miR160可以从接穗移动到砧木，促进砧木的根系发育，从而提高苹果的抗旱性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的促进砧木根系发育及抗旱的可移动miRNA的鉴定方法流程图。
图2是本发明实施例提供的Mdm-miR160在干旱胁迫后的表达示意图，星号表示基于单因素方差分析的显著性差异(*，P<0.05；**，P<0.01)。
图3是本发明实施例提供的干旱处理后苹果Mdm-miR160e，Mdm-miR160a，Mdm-miR160b/d和Mdm-miR160c的表达模式分析示意图，星号表示基于单因素方差分析的显著性差异(*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001)。
图4是本发明实施例提供的Mdm-miR160e在Mdm-miR160e过表达转基因植物中的表达分析示意图，星号表示基于单因素方差分析的显著性差异(*P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001)。
图5是本发明实施例提供的Mdm-miR160e OE转基因株系短期干旱后的表型分析示意图，星号表示基于单因素方差分析的显著性差异(***，P<0.001)。
图5A是本发明实施例提供的Mdm-miR160e OE转基因植物与GL-3的干旱表型示意图。
图5B是本发明实施例提供的存活率统计示意图。
图5C是本发明实施例提供的离子渗透率检测示意图。
图6是本发明实施例提供的Mdm-miR160e OE苹果不定根的表型分析示意图，星号表示基于单因素方差分析的显著性差异(***，P<0.001)。
图6A是本发明实施例提供的根系表型示意图。
图6B是本发明实施例提供的不定根的长度示意图，标尺等于5cm。
图6C是本发明实施例提供的不定根的数目示意图。
图7是本发明实施例提供的Mdm-miR160的分布和表达水平检测示意图，星号表示基于单因素方差分析的显著性差异(**，P<0.01)。
图7A是本发明实施例提供的原位杂交实验分析Mdm-miR160在苹果组织中的分布示意图；
图中：Ba，树皮；Xy，木质部；Ph，韧皮部；Pi，髓；Px，初生木质部；Pp，初生韧皮部；Me，纵隔；Pe，中柱鞘。
图7B是本发明实施例提供的微嫁接实验证明Mdm-miR160可以从接穗到砧木发生移动示意图。
图8是本发明实施例提供的Nta-miR160d从接穗向砧木移动的实验分析示意图。
图8A是本发明实施例提供的烟草嫁接番茄以及番茄自嫁接示意图。
图8B是本发明实施例提供的Nta-miR160d在烟草自嫁接以及烟草嫁接番茄的基因表达分析示意图。
图8C是本发明实施例提供的烟草、番茄和烟草嫁接番茄中的成熟miR160序列比对示意图。
图9是本发明实施例提供的Mdm-miR160在组织间的移动分析示意图。
图9A是本发明实施例提供的原位杂交实验分析Mdm-miR160在接穗，嫁接口和砧木中的分布情况示意图。
图9B是本发明实施例提供的Mdm-miR160和MdARF17在嫁接砧木中的基因表达分析示意图。
图10A-图10C是本发明实施例提供的Mdm-miR160e OE/GL-3和GL-3/GL-3植株的不定根表型分析示意图，星号表示基于单因素方差分析的显著性差异(**，P<0.01)。
图11是本发明实施例提供的Mdm-miR160e OE/GL-3植株比GL-3/GL-3植株的短期干旱实验示意图，星号表示基于单因素方差分析的显著性差异(*，P<0.05；**，P<0.01)。
图11A是本发明实施例提供的短期干旱表型分析示意图。
图11B是本发明实施例提供的短期干旱存活率统计示意图。
图11C是本发明实施例提供的微嫁接植株干旱后的根长分析示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种促进砧木根系发育及抗旱的可移动miRNA及鉴定方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
本发明实施例提供的促进砧木根系发育及抗旱的可移动miRNA是苹果中的Mdm-miR160。
如图1所示，本发明实施例提供的促进砧木根系发育及抗旱的可移动miRNA的鉴定方法包括以下步骤：
S101，RNA提取和反转录；
S102，基因克隆；
S103，苹果遗传转化；
S104，干旱胁迫处理；
S105，原位杂交；
S106，微嫁接；
S107，烟草嫁接番茄；
S108，数据分析。
下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步描述。
本发明提供的可促进砧木根系发育及抗旱的可移动miRNA在苹果中的鉴定，苹果Mdm-miR160可以从接穗移动到砧木，促进砧木的根系发育，从而提高苹果的抗旱性。本发明首先通过原位杂交实验，基因表达分析，以及微嫁接的转基因植株进行短期干旱实验，并统计分析了Mdm-miR160e OE/GL-3植株与GL-3/GL-3植株的耐旱性和根系发育情况，因此进一步研究Mdm-miR160是否发生移动以及移动后发挥的生物学功能具有重要的意义。本发明通过微嫁接、二代测序以及基因表达分析的方法验证了miRNA可以在组织间移动的实验结论，所述实验方法和所得结论如下：
1、材料和方法
1.1试验材料和处理
基因克隆和表达分析所用的‘金冠’(Golden Delicious)苹果盆栽苗，生长于西北农林科技大学园艺场，新疆野苹果根系，20％PEG8000模拟的干旱处理过程详细步骤见。
本发明所用转基因材料背景为‘皇家嘎啦’(Royal Gala)实生后代GL-3。组培苗扩繁、继代、生根后，移栽至含有营养基质：蛭石：珍珠岩(3：1：1)的营养钵中，培养箱(光照16h，黑暗8h)培养1个月左右，转移到植物组培间(16h光照，8h黑暗，25℃)培养，以备后续实验使用。
胁迫响应处理：干旱处理选择长势一致的盆栽苗，称重浇水并保持盆重一致，在充分灌溉后标记为第0天开始处理，之后分别在0、2、4、6、8天取成熟叶片，液氮冷冻保存。组织特异性材料为金冠实生苗的根、茎、叶、花、果实等样品，液氮冷冻保存。
本发明所用的烟草为生长一个月的本式烟草(Nicotiana benthamiana)，番茄为移栽一个月的野生型番茄(Solanum lycopersicum)，来自于战祥强老师实验室赠予。
1.2试验仪器和培养基
主要仪器：超净工作台、光照培养箱、水浴锅、通风橱、制冰机、低温离心机、灭菌锅、恒温摇床(28℃，37℃)、高速离心机、低温冰箱、实时荧光定量仪、天平、PCR仪(CFX96)、磁力搅拌器、pH计、分光光度计(Thermo Fisher，Nanodrop 1000)。
主要培养基种类：苹果继代培养基(4.43g/L MS，30g/L蔗糖，0.2mg/L 6-BA，0.2mg/L IAA，8.0g/L琼脂粉，pH＝5.8-6.0)，生根培养基(2.22g/L MS，20g/L蔗糖，0.5mg/LIBA，0.5mg/L IAA，8.0g/L琼脂粉，pH＝5.8-6.0)。叶片预分化培养基(4.43g/L MS，30g/L蔗糖，2mg/L TDZ，0.5mg/L NAA，0.1mM乙酰丁香酮，1mM甜菜碱，8.0g/L琼脂粉，pH＝5.8-6.0)，苹果叶片分化培养基(4.43g/LMS，30g/L蔗糖，2mg/L TDZ，0.5mg/L NAA，250mg/L头孢，25mg/L卡那霉素，8.0g/L琼脂粉，pH＝5.8-6.0)，苹果用菌重悬液(4.43g/L MS，20mM柠檬酸三钠，20g/L蔗糖，0.1mM乙酰丁香酮，1mM甜菜碱，pH＝5.3)。
菌株：大肠杆菌菌株Top10、农杆菌菌株EHA105。
载体：植物过表达载体pK2GW7，T载体pClone007、Gateway中间载体pDONR222等。
1.3实验方法和步骤
1.3.1 RNA提取和反转录
CTAB法提取植物总RNA。
反转录合成cDNA采用诺唯赞公司(Vazyme)反转录试剂盒HiScript II 1stStrand cDNA Synthesis Kit(+gDNA Wiper)。
1.3.2基因克隆
通过miRBase下载苹果Mdm-miR160e序列，利用Primer 5软件设计引物，全长扩增连接至pClone-007载体，转化大肠杆菌Top10，涂含有抗生素的LB平板，37℃过夜培养，挑取阳性单克隆，用加抗生素的液体LB培养基摇菌，使用M13通用引物测序正确后提取质粒，-20℃保存待用。
1.3.3苹果遗传转化
将Mdm-miR160e的特异序列经PCR扩增、产物回收后融合pK2GW7过表达载体，电击转化农杆菌EHA105，保存菌液待用。农杆菌介导的苹果遗传转化方法如下：将已获得的过表达和沉默载体的EHA105农杆菌菌液活化，使用苹果用重悬液重悬，调节浓度至OD＝0.6-0.9；继代培养一个月左右的GL-3组培苗，摘取中间部位平展的叶片置于农杆菌重悬液中，在叶片背部使用手术刀片划取4-7道伤口，浸泡约10分钟后将侵染叶片表面菌液吸干，转移到苹果叶片预分化培养基上，放置于21℃培养箱暗培养3天，转移至苹果叶片分化培养基上，于21℃培养箱中暗培养1个月后转移至组培间进行光照培养，经抗生素(头孢100mg/L，卡那霉素50mg/L)筛选获得抗性芽。通过农杆菌介导的遗传转化成功获得了Mdm-miR160e的4个过表达转基因株系#1，#3，#5，#8。然后再经扩繁、生根获得稳定转化的转基因苹果植株。
1.2.4干旱胁迫处理
短期干旱：选取长势一致的转基因株系和GL-3移栽苗两组，每组各15棵，作为处理组和对照组。移栽前称重保证盆土重量一致，浇水达到土壤饱和含水量，使用TDR检测使相对土壤体积含水量保持一致，在植物组培间进行短期干旱处理，每天检测土壤含水量，通过称重补水到GL-3和转基因苹果保持一致的土壤含水量。持续干旱直到土壤含水量达到0，拍照记录。开始复水一周后进行存活率统计。
1.2.5原位杂交
在苹果GL-3中进行了Mdm-miR160原位杂交实验，参考耿达力2019年的毕业论文并进行了少量修改。简单来说，将组织培养的GL-3的新鲜叶片、茎和根在FAA固定液中4℃过夜固定；采用梯度乙醇、正丁醇脱色至组织变为白色。石蜡包埋放到4℃冰箱过夜；蜡块用半薄切片机(RM2265)切成7μm的厚度，用展片台展平蜡片，37℃烘烤过夜；将烘烤好的玻片放入二甲苯中脱蜡，然后用梯度乙醇进行脱水，每步5秒。最后将玻片放入1μg/ml的蛋白酶K中，37℃消化30分钟，用1 x PBS漂洗3次，每次5分钟。其中，所述杂交步骤为：
玻片在DIG-EASY-BYB缓冲液中，37℃浸泡30min，后加入探针42℃孵育18h。在常温下用2 x SSC漂洗玻片2次，用65℃的0.5 x SSC在常温下漂洗玻片2次，每次30min。洗涤缓冲液(washing buffer)漂洗5分钟-封闭工作液(blocking solution)孵育2小时-抗体溶液(antibody solution)中37℃孵育2小时-洗涤缓冲液(washing buffer)洗涤2次，每次15分钟-检测缓冲液(detection buffer)中平衡5分钟-后用TE缓冲液漂洗后保存在水中。试剂和缓冲液均来自DIG核酸检测试剂盒Roche和DIG RNA标签试剂盒SP6/T7。
在微嫁接植株中进行Mdm-miR160的原位杂交，将嫁接愈合后的茎制作横切面，在愈合上方1cm，嫁接口处1cm，愈合下方1cm取样进行实验，具体步骤如上所述。
1.2.6微嫁接
将组培苗GL-3和Mdm-miR160e OE植株培养4周后作为砧木或接穗。微嫁接采用插接法，将接穗切成楔形切口，砧木中间垂直切0.5cm左右，插入接穗，用无菌的锡箔纸包裹嫁接口，转移至继代培养基培养。组培间(16小时光照，8小时黑暗，25℃)培养，在嫁接4天和7天分别取样(嫁接口1cm、接穗1cm、砧木1cm)进行原位杂交实验，对Mdm-miR160进行定性和定量分析，以GL-3嫁接GL-3作为对照。
微嫁接的植株，嫁接完成后转移至生根培养基，一个月后取出进行不定根长度和数目的统计分析。移栽后培养一个月的土培苗进行短期干旱实验和存活率的统计。本实验设计3个生物重复，每个生物重复8个嫁接植株。
1.2.7烟草嫁接番茄
烟草嫁接番茄实验，取生长一个月的烟草植株切成楔形作为接穗，切成楔形。取生长约一个月的番茄植株，从株高中间部位横切后再纵切0.5cm左右作为嫁接口，使用插接法嫁接后用保鲜膜包裹嫁接口以保湿愈合，同时以烟草和番茄自嫁接作为对照。光照培养箱(16h光照，8h黑暗，25℃)保湿培养7天后，取嫁接口以下约1cm的茎段韧皮部作为检测样品，进行RNA提取、反转录和stem loop qPCR实验。PCR产物浓缩后连接至pClone-007载体转化大肠杆菌Top10，挑取阳性单克隆提取质粒进行测序。
1.2.8数据分析
数据统计在GraphPad Prism 5使用One-way ANOVA方法对变量进行Tukey检验，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
1.2.9引物
2、结果与分析
2.1苹果Mdm-miR160响应干旱胁迫的表达分析
本发明对Mdm-miR160在干旱胁迫的表达模式进行分析，结果表明Mdm-miR160在干旱处理之后诱导表达(见图2)，苹果中的Mdm-miR160有5个前体Mdm-miR160a/c，Mdm-miR160b/d和Mdm-miR160e，利用干旱处理的金冠材料，分析表达模式发现只有Mdm-miR160e(见图3A)与Mdm-miR160一致，在干旱处理后上调表达，而其他的Mdm-miR160a，Mdm-miR160b/d和Mdm-miR160c均表现出不同的干旱表达模式(见图3B-D)。
2.2苹果Mdm-miR160负调控靶基因的表达
本发明通过农杆菌介导的叶盘法侵染无性系GL-3叶片，共获得了四个Mdm-miR160e的过表达株系(#1，#3，#5和#8)，上调倍数达到5-30倍左右(见图4)。
2.3苹果Mdm-miR160的干旱表型分析
干旱胁迫后，小麦叶片和根中miR160的表达水平上调。通过短期干旱实验结果表明，与GL-3相比，Mdm-miR160e OE的转基因株系更抗旱。如图5所示，短期自然干旱后Mdm-miR160e OE的转基因株系，叶片具有更低的离子渗透率，植株具有更高的存活率。
通过分析测量移栽一个月的转基因苹果根系发现，Mdm-miR160参与不定根的发育过程。与GL-3相比，Mdm-miR160e OE的转基因株系具有更多的不定根数目和更长的不定根长度(见图6)。
2.4微嫁接实验证明Mdm-miR160在组织间的可移动性
本发明原位杂交分析表明，Mdm-miR160在苹果野生型GL-3维管组织中大量存在，包括木质部和韧皮部(见图7A)。为了了解Mdm-miR160是否在接穗和砧木之间移动，本发明以GL-3和MdHYL1 RNAi植株作为砧木和接穗相互进行微嫁接，分析结果发现，如图7B所示，当GL-3植株作为接穗时，GL-3/GL-3(GL-3植株嫁接到GL-3植株上)接穗中Mdm-miR160的转录本高于GL-3/MdHYL1 RNAi(GL-3植株嫁接到MdHYL1 RNAi植株上)。以MdHYL1 RNAi植株作为砧木时，GL-3/MdHYL1 RNAi的砧木中Mdm-miR160转录本丰度高于MdHYL1RNAi/MdHYL1RNAi(MdHYL1 RNAi植株嫁接于MdHYL1 RNAi植株上)，说明Mdm-miR160可能从接穗移动到砧木。
2.5烟草嫁接番茄证明Nta-miR160可以从接穗移动到砧木
为了进一步证明miR160在植物组织间的可移动性，本发明查找了茄科马铃薯、烟草和番茄中的miR160的成熟体序列。结果表明马铃薯中有一个成熟的miR160，序列为Stu-miR160a-5p UGCCUGGCUCCCUGUAUGCCA(见SEQ ID NO：1)。番茄中只有一个成熟的Sly-miR160，序列为Sly-miR160aUGCCUGGCUCCCUGUAUGCCA(见SEQ ID NO：2)。烟草中有四个miR160的成熟体分别为Nta-miR160a UGCCUGGCUCCCUGUAUGCCA(见SEQ ID NO：3)、Nta-miR160b UGCCUGGCUCCCUGUAUGCCA(见SEQ ID NO：4)、Nta-miR160cUGCCUGGCUCCCUGUAUGCCA(见SEQ ID NO：5)和Nta-miR160d UGCCUGGCUCCCUGCAUGCCA(见SEQID NO：6)。其中马铃薯和番茄以及烟草的miR160a/b/c的序列完全一致，只有烟草的Nta-miR160d有一个碱基差异。因此本发明选择烟草作为接穗嫁接番茄，在嫁接完全愈合后的第七天取砧木的韧皮部进行RNA提取、反转录、stem loop qPCR后连接载体，利用一代测序的方式在番茄的砧木中检测烟草的Nta-miR160d(见图8A)。本发明嫁接植株在嫁接愈合七天后取砧木韧皮部进行RNA提取和反转录后进行qPCR检测，发现在番茄的韧皮部中Nta-miR160d的表达水平相比于番茄自嫁接的对照提高了两倍以上(见图8B)。将PCR产物连接载体测序，成功测序的质粒中检测到3个株系与烟草的Nta-miR160d序列完全一致(见图8C)。
2.6Mdm-miR160从接穗向砧木移动的表达分析
原位杂交是指将特定标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交，从而对已知核酸进行精确定性和简单定量的过程。为了进一步验证Mdm-miR160从接穗到砧木的移动性，本发明将Mdm-miR160e OE植株嫁接到野生型GL-3植株(Mdm-miR160e OE/GL-3)上，并以自嫁接的GL-3植株(GL-3/GL-3)作为对照。原位杂交分析显示，相比于GL-3嫁接GL-3的植株，Mdm-miR160e OE/GL-3植株嫁接4天后在嫁接结合处检测到Mdm-miR160，嫁接7天后在砧木中检测到丰度更高的Mdm-miR160。本发明还检测了Mdm-miR160和MdARF17在Mdm-miR160eOE/GL-3和GL-3/GL-3植株中的表达情况，如图9所示，本发明发现嫁接10天后，GL-3砧木茎中Mdm-miR160转录本的表达量增加而MdARF17的表达量减少。综上实验证明在苹果中Mdm-miR160可以从接穗移动到砧木。
2.7Mdm-miR160e微嫁接植株的根系表型分析
为了进一步研究发生移动后的miR160发挥的生物学功能，本发明将Mdm-miR160eOE/GL-3和GL-3/GL-3的嫁接植株进行表型分析和短期干旱的胁迫处理。通过观察分析微嫁接一个月后的生根苗发现，Mdm-miR160e OE/GL-3的嫁接植株比GL-3/GL-3的嫁接植株有更多的不定根数目和更长的根长(见图10)。在短期干旱条件下Mdm-miR160e OE/GL-3植株比GL-3/GL-3植株具有更高的存活率和更强的耐旱性。此外，Mdm-miR160e OE/GL-3植株在干旱后根长大于GL-3/GL-3植株。这些数据表明从接穗中移动到砧木的Mdm-miR160可以促进砧木的根系发育，从而提高砧木的抗旱性(见图11)。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 西北农林科技大学
管清美，申小霞，平怡坤，李雪薇，樊天乐，张子桐
<120> 一种促进砧木根系发育及抗旱的可移动miRNA及鉴定方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ugccuggcuc ccuguaugcc a 21
<210> 2
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ugccuggcuc ccuguaugcc a 21
<210> 3
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ugccuggcuc ccuguaugcc a 21
<210> 4
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ugccuggcuc ccuguaugcc a 21
<210> 5
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ugccuggcuc ccuguaugcc a 21
<210> 6
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ugccuggcuc ccugcaugcc a 21

Claims (1)

1.一种苹果Mdm-miR160e在促进苹果砧木根系发育及抗旱性中的应用，苹果Mdm-miR160e序列为：ugccuggcucccuguaugcca。
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