CN104994724A - 基因沉默 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物、植物组织和植物细胞中内源基因的转录基因沉默(TGS)。更特别地，本发明涉及能通过TGS在植物、植物组织和植物细胞中更有效地沉默感兴趣的基因如内源基因的核酸构建体。本发明进一步涉及使用本发明的核酸构建体，通过TGS在植物、植物组织或植物细胞中更有效地降低内源基因表达的方法。

Description

基因沉默

相关申请的交叉参考

本申请主张2012年12月18日提交的美国临时专利申请61/738,651的优先权。这个申请在此并入作参考。

序列提交

电子形式序列表与本申请一起提交。序列表的题目为2312128PCTSequenceListing.txt，在2013年12月5日建立，大小为27kb。电子形式序列表中的信息以其全部内容并入作参考。

发明背景

本发明涉及植物、植物组织和植物细胞中内源基因(endogene)的转录基因沉默(TGS)。更特别地，本发明涉及能通过TGS在植物、植物组织和植物细胞中更有效地沉默感兴趣基因如内源基因的核酸构建体。本发明进一步涉及使用本发明的核酸构建体，通过TGS在植物、植物组织或植物细胞中更有效地降低内源基因表达的方法。

本文中用于阐明本发明的背景或者提供关于实施的其它详细描述的出版物或其它材料均并入做参考，方便起见在参考文献中分别归类。

在十多年之前，Matzke及其同事报道了植物中转基因启动子(NOS)的转录基因沉默(TGS)与启动子DNA的甲基化之间的关系(Matzke et al.,1989)。自此，对植物中潜在的TGS机制在单子叶植物和双子叶植物中针对转基因和内源基因进行了广泛研究(参见(Matzke and Matzke,2004；Eamenset al.,2008；Matzke et al.,2009))。目前对TGS的研究提示通过双链RNA加工机制(AGO4，DCL3)产生的21-24nt小RNAs(sRNAs)靶向具有序列同源性的基因组区域。这些sRNA通过DNA甲基转移酶(DRM1/2，MET1，CMT3)的作用指导DNA甲基化，并推测这随后是涉及组蛋白甲基转移酶和去乙酰酶的组蛋白修饰，以建立在甲基化基因座的抑制性染色质状态。

使用转基因作为模型系统的早期研究揭示了植物中TGS相关的一些基本特征(Mette et al.,2000；Jones et al.,2001；Sijen et al.,2001)。这些研究表明长发夹结构为产生靶向转基因启动子的sRNA所需。对沉默的转基因的DNA分析证实对称和不对称的胞嘧啶甲基化均增加，并且MET1参与沉默基因座的维持。相似地，长反向重复(IR)也已经证实介导水稻中35S启动子的有效TGS(Okano et al.,2008)。显然，有义(S)或反义(AS)方向的单链沉默子不能在烟草和拟南芥中有效产生sRNA及产生TGS(Mette et al.,2000)。

尽管关于转基因的TGS的事件顺序相对充分明确，但是还未知相似的步骤是否也用于内源基因座(后文称作内源基因)的TGS。令人惊奇地，迄今为止仅报道了少数内源基因座的TGS，均是使用IR RNA。Cigan et al.(2005)报道成功和强力地沉默两个玉米内源基因(Cigan et al.,2005)。在矮牵牛花、马铃薯和水稻中针对一些内源基因观测到中等沉默(Sijen et al.,2001；Heilersig et al.,2006；Okano et al.,2008)。IR RNA触发内源基因TGS的无效性在使用单子叶水稻模型的综合研究中得到充分例证。感兴趣地，在水稻中检验的7个内源基因中有6个示出对通过从IR RNA结构中产生的sRNA所致沉默是抗拒的(Okano et al.,2008)。相反，在相同的实验中，示出35S启动子可以被靶向这个启动子的IR RNA有效沉默。其它不成功的试验(八氢番茄红素脱氢酶(PDS)和查耳酮合成酶(CHS))也已经在拟南芥中报道(Eamens et al.,2008)。总之，这些结果提示内源性基因座也许具有可阻止意外的TGS的一些固有性质；或者，需要探究针对内源性基因座的更有效的沉默策略。除了观测到的在内源基因座的基因沉默的低成功率，也存在针对内源基因的TGS与DNA甲基化之间以及DNA甲基化与组蛋白修饰之间的差异(Okano et al.,2008)。在水稻中大多数情况，靶向启动子区域的IRRNA可以触发同源序列的DNA甲基化，但是其不能诱导染色质修饰和TGS(Okano et al.,2008)。

希望开发增强植物中转录基因沉默的核酸构建体和方法。

发明概述

本发明涉及植物、植物组织和植物细胞中内源基因的转录基因沉默(TGS)。更特别地，本发明涉及能通过TGS在植物、植物组织和植物细胞中更有效沉默感兴趣的基因如内源基因的核酸构建体。本发明进一步涉及使用本发明的核酸构建体，通过TGS更有效地降低植物、植物组织或植物细胞中内源基因表达的方法。

第一方面，本发明提供了核酸构建体，其包含如本文所述的植物可操作启动子，所述植物可操作启动子与包含如本文所述的沉默增强子的核酸分子可操作地连接，所述沉默增强子与如本文所述的核酸沉默子分子可操作地连接。所述核酸构建体可任选包含其它调节序列，如3’调节序列，或者如本文所述的其它序列。根据这个方面，本发明还提供了如本文所述的分离的沉默增强子及核酸构建体，所述核酸构建体包含如本文所述的植物可操作启动子，所述植物可操作启动子与包含如本文所述的沉默增强子的核酸分子可操作地连接。在一些实施方案中，沉默增强子是SUPPRESSOROF ddc(SDC)的启动子区域。在一个实施方案中，沉默增强子包含SEQ IDNO:6所示序列。在另一实施方案中，沉默增强子包含SEQ ID NO:3所示序列。在进一步的实施方案中，沉默增强子包含SEQ ID NO:1所示序列的1-389位核苷酸，及连续的并且与第389位核苷酸在3’连续的任何数目的核苷酸。在一些实施方案中，沉默增强子包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:18所示序列。在其它实施方案中，沉默增强子由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:18.所示序列组成。

在一些实施方案中，沉默增强子是SUPPRESSOR OF ddc(SDC)的启动子区域。在另一实施方案中，沉默增强子可包含与SEQ ID NO:1、3、4、5、6或18具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％序列相同性的核酸序列。沉默增强子可包含在严格条件下与包含SEQID NO:1、3、4、5、6或18的完全互补序列的DNA分子杂交的核苷酸序列。沉默增强子可包含核苷酸序列，其中所述核苷酸序列来自SEQ IDNO:1、3、4、5、6或18，通过选自如下至少一种方法改变一或多个核苷酸：缺失、取代、添加和插入。沉默增强子可包含核苷酸序列，其中所述核苷酸序列相应于SUPPRESSOR OF ddc(SDC)的启动子的等位基因。

在一个实施方案中，本发明的核酸沉默子分子包含植物内源基因靶，即通过TGS负调节的植物内源基因的启动子区域。该第一个实施方案的核酸沉默子分子编码单链沉默子，其为从核酸构建体转录的RNA分子，或者编码从核酸构建体转录的反向重复沉默子。单链沉默子或反向重复沉默子在植物、植物组织和植物细胞中提供内源基因的TGS。在一个实施方案中，单链沉默子是从植物内源基因靶(即核酸沉默子分子)的启动子区域产生的RNA分子，其相对于核酸构建体中的植物可操作启动子处于反义方向。在另一实施方案中，单链沉默子是从植物内源基因靶(即核酸沉默子分子)的启动子区域产生的RNA分子，其相对于核酸构建体中的植物可操作启动子处于有义方向。在每个这些实施方案中，所述构建体、核酸沉默子分子和单链沉默子均不存在反向重复结构，即核酸构建体及由其产生的产物中不存在反向重复结构或者反向重复。在再一个实施方案中，核酸沉默子是从植物内源基因靶的启动子区域产生的RNA分子，其以一式两份提供并排列成相对于核酸构建体中的植物可操作启动子的反向重复构型。核酸沉默子分子的表达产生初始的单链RNA。这个单链的RNA可以通过细胞机制或者由于反向重复结构而转变为双链RNA。

在一个实施方案中，sRNA在含有核酸沉默子分子的细胞中从表达的核酸沉默子分子产生。在另一实施方案中，沉默增强子在含有与所述核酸沉默子分子可操作地连接的沉默增强子的细胞中增强sRNA从表达的核酸沉默子分子的产生。

在一个实施方案中，核酸沉默子分子包含位于靶内源基因的转录起始位点上游的核苷酸。在另一实施方案中，核酸沉默子分子包含位于靶内源基因的转录起始位点上游的核苷酸及位于其转录起始位点下游的核苷酸。在一些实施方案中，核酸沉默子分子包含内源基因的大约300个连续核苷酸至大约1500个连续核苷酸的启动子区域。在其它实施方案中，核酸沉默子分子包含内源基因的大约400个连续核苷酸至大约1200个连续核苷酸的启动子区域。在另外的实施方案中，核酸沉默子分子包含内源基因的大约425个连续核苷酸至大约1100个连续核苷酸的启动子区域。在进一步的实施方案中，核酸沉默子分子包含内源基因的大约425个连续核苷酸至大约1075个连续核苷酸的启动子区域。

在一个实施方案中，本发明的核酸沉默子分子包含植物内源基因靶，即通过TGS负调节的植物内源基因的启动子区域。在另一实施方案中，核酸沉默子分子包含被负调节的内源基因转录起始位点5’紧邻的2000个核苷酸，或者该2000个核苷酸的区域的片段。所述片段可包含该区域的至少100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900或2000个连续核苷酸，所述区域是被负调节的内源基因的转录起始位点5’紧邻的2000个核苷酸。

在植物中可操作的任何启动子均可用于所述核酸构建体中，以驱动核酸分子的表达。在一些实施方案中，启动子是植物可操作启动子，包括如本文所述那些的单一拷贝。在其它实施方案中，启动子是植物可操作启动子的双拷贝，以产生同源双启动子。在进一步的实施方案中，启动子是两个不同启动子的组合，以产生异源双启动子。

第二方面，本发明提供了包含所述核酸构建体的转基因植物细胞。在一个实施方案中，所述核酸构建体稳定整合在转基因植物细胞的基因组中。在另一实施方案中，核酸在转基因植物细胞中表达。

第三方面，本发明提供了包含核酸构建体的转基因植物。在一个实施方案中，核酸构建体稳定整合在转基因植物的基因组中。在另一实施方案中，核酸在转基因植物中表达。

第四方面，本发明提供了一种在植物、植物组织或植物细胞中通过转录基因沉默更有效地沉默感兴趣的基因，如更有效地沉默内源基因表达的方法。在一个实施方案中，所述方法包括用核酸构建体转染植物细胞以产生如本文所述的转基因植物细胞。所述方法进一步包括在如本文所述的转基因植物细胞中表达如本文所述非核酸沉默子分子分子。本文所述的表达的核酸沉默子分子在转基因植物细胞中被切割，产生一或多个小RNA(sRNAs)，其诱导转录基因沉默以降低感兴趣的靶基因的表达。在一些实施方案中，核酸沉默子分子的表达产生初始的单链RNA。这个单链的RNA可以通过细胞机制或者由于反向重复结构而被转变为双链RNA，之后加工产生sRNA。所述方法可任选包括制备编码如本文所述的核酸的核酸构建体。在另一实施方案中，所述方法包括从转基因植物细胞再生转基因植物。在这个实施方案中，核酸沉默子分子在转基因植物中表达。表达的核酸沉默子分子在转基因植物细胞中被切割，产生一或多个sRNA，其诱导转录基因沉默，以降低感兴趣的靶基因的表达。

第五方面，本发明提供了鉴别和获得用于植物TGS中的其它沉默增强子的核酸构建体和方法。根据这个方面，核酸构建体是适于转化希望鉴别沉默增强子的植物物种的核酸构建体。在一个实施方案中，核酸构建体可以包含在载体中。在一些实施方案中，载体适于农杆菌介导的转化。在其它实施方案中，载体可以适于生物射弹(biolistic)介导的转化。适于植物转化的其它合适的载体为本领域技术人员熟知。在另一实施方案中，核酸构建体可以根据本领域技术人员熟知的技术直接用于转化植物。核酸构建体包含与推定的沉默增强子可操作地连接的植物可操作启动子，所述推定的沉默增强子与如本文所述的核酸沉默子分子可操作地连接，所述核酸沉默子分子与植物可操作的3’调节区可操作地连接。

在一个实施方案中，检测沉默增强子活性的多核苷酸是来自除了拟南芥之外的物种的SUPPRESSOR OF ddc(SDC)同系物的启动子区域。SDC的同系物可来自单子叶植物或双子叶植物。SDC的同系物可选自：玉米、大豆、向日葵、高粱、油菜、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦、小米、甘蔗和柳枝稷。在另一实施方案中，将检测增强转录基因沉默的推定的沉默增强子或多核苷酸是由高水平内源24nt siRNA沉默的并重度甲基化的基因座的启动子区域。在一个实施方案中，植物可操作启动子是单启动子、双同源启动子或者双异源启动子。在一个实施方案中，植物可操作启动子是单或双35S CMV启动子。在一个实施方案中，3’序列是TRV2的3’序列。在另外的实施方案中，3’调节区是polyA添加序列。在一个实施方案中，polyA序列是NOS poly A序列。更有效地沉默靶基因的检测可以根据本领域熟知的方法进行。这些方法包括但不限于RT-PCR、PCR、northern印迹分析、免疫测定和酶测定。针对更有效沉默而检测的启动子区域的片段检测可以根据本文所述的方法进行。

附图简述

图1示出不同的截短的SDC启动子的示意图。

图2a-2d示出气孔簇(stomata cluster)表型。图2a:野生型(WT)气孔模式。图2b:pMA/PTMM植物中的气孔簇。图2c和2d:pBA/PSDC-PTMM植物中的气孔簇。

图3示出TMM RNA水平的qPCR。数字表示不同的转化品系，具有集簇气孔表型的品系以星号标示。

图4a-4c示出内源TMM启动子的DNA甲基化模式图。图4a:通过亚硫酸氢盐处理的DNA测序分析的内源性TMM启动子的区域。图4b和4c:在不同的转化品系中CG、CHG(H＝A、C或T)和CHH类型的胞嘧啶的DNA甲基化水平(％)。

图5a-5f示出在pBA/PSDC(-DR)-PTMM植物中TMM启动子和编码区上组蛋白H3修饰模式。图5a:设计为扩增相应于上述TMM启动子和编码序列的DNA片段(大约100bp)的qPCR引物。图5b-5f:在TMM启动子和编码区中不同的H3修饰。检测三个品系的pBA/PSDC(-DR)-PTMM植物。集簇的气孔表型在品系#4和9中观测到，但在品系#12中未观测到。

图6a-6c示出PTMM-相关siRNA的Northern印迹。图6a:烟草N.benthemiana转化的Northern印迹。图6b:拟南芥的pBA/PTMM稳定转化品系的Northern印迹。图6c:拟南芥的pBA/PSDC(-DR)-PTMM稳定转化品系的Northern印迹。在图6c和6b中，样品c是阳性对照。

图7a-7c示出不同TGS植物中的小RNA分析。图7a:定位于TMM启动子区域的sRNA的克隆数和大小分布。图7b:TMM启动子区域正负链中的小RNA分布。图7c:不同TGS植物中的第一碱基分布。

图8a-8d示出TMM启动子区域中小RNA的分布。图8a:pBA/PSDC(-DR)-PTMM植物的TMM启动子区域上的小RNA的分布。图8b:pBA/PTMM植物的TMM启动子区域上的小RNA的分布。图8c:pBA/PTMM-AS植物的TMM启动子区域上的小RNA的分布。图8d:pBA/PTMM-IR植物的TMM启动子区域上的小RNA的分布。

图9示出SDC启动子的表观基因组图。表观基因组图示出WT(Col-0)、met1、ddc和rdd突变体中的DNA甲基化和小RNA水平。第一条线(从上数)示出SDC(AT2G17690.1)ORF至其上游相邻ORF的区域。PSDC序列分为5个区域，称作A、B、C、TR和DR。第2-5条线(从上数)示出三种类型(CG、CHG和CHH)的DNA甲基化水平。在DR(直接重复)区域，在WT和met、rdd突变体中示出重度DNA甲基化，而在ddc突变体中则否。小RNA水平在第6-9条线(从上数)中示出。小RNA在WT中的DR区域富集，但是在ddc突变体中消除。在A区域，小RNA在rdd突变体中增加。

图10示出Northern印迹，其示出不同的截短的SDC启动子序列促进的siRNA水平。

图11a-11d示出Northern印迹以证实区域A增强其它DNA片段相关的siRNA的产生。图11a:Northern印迹示出区域A对PTMM-AS相关的siRNA产生的增强。图11b:Northern印迹示出区域A对PCH42相关的siRNA产生的增强。图11c和11d:Northern印迹结果示出区域A对PFAD2相关的siRNA产生的增强。

发明详述

本发明涉及植物、植物组织和植物细胞中内源基因的转录基因沉默(TGS)。更特别地，本发明涉及能通过TGS在植物、植物组织和植物细胞中更有效地沉默感兴趣的基因如内源基因的核酸构建体。本发明进一步涉及使用本发明的核酸构建体，通过TGS在植物、植物组织或植物细胞中更有效地降低内源基因表达的方法。

除非另外定义，本文中使用的所有科技术语均具有本领域所属领域技术人员通常理解的相同含义。

术语“多核苷酸”、“核苷酸序列”和“核酸”根据相关语境，用于指核苷酸聚合物(A、C、T、U、G等，或者天然发生的或人工核苷酸类似物)，例如DNA或RNA，或者其表征，如字符串等。指定的多核苷酸或互补多核苷酸可以从任何特定的核苷酸序列确定。

当多核苷酸、多肽或其它成分与其正常关联的成分(其它蛋白质、核酸、细胞、合成试剂等)部分或完全分开时，称其为“分离的”。当核酸或多肽是人工或工程化的，或者衍生自人工或工程化蛋白质或核酸时，称其为“重组的”。例如，插入载体或者任何其它异源位置中的多核苷酸，例如插入重组生物体的基因组中，由此其与通常在天然发现的多核苷酸两侧的序列不结合，称其是重组多核苷酸。在体外或体内从重组多核苷酸表达的蛋白质是重组多肽的一个实例。同样，天然未出现的多核苷酸序列，例如天然发生的基因的变体，是重组的。

术语“核酸构建体”或者“多核苷酸构建体”是指单链或双链的核酸分子，其分离自天然发生的基因，或者其经修饰含有并非天然存在的核酸区段。当核酸构建体含有表达本发明的序列所需的控制序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”同义。

术语“控制序列”在本文定义为包含本发明多核苷酸表达所必需或有益的所有成分。每个控制序列对于所述多核苷酸序列均可以是天然的或外源的。最低限度，控制序列包括启动子和转录终止信号。控制序列可以具有接头，以导入特异的限制位点，促进控制序列与核苷酸序列连接。

术语“可操作地连接”在本文定义为这样的构型，其中控制序列被适当地置于相对于核酸构建体的核苷酸序列的位置，由此控制序列指导本发明的多核苷酸表达。

在本文中，术语“表达”包括多核苷酸的转录。在本文中，术语“表达载体”涵盖线性或环形的DNA分子，其包含本发明的多核苷酸，并与供其转录的其它区段可操作地连接。

术语“植物”包括完整植物、幼苗营养器官/结构(例如叶、茎和块茎)、根、花和花器/结构(例如花苞、萼片、花瓣、雄蕊、心皮、花药和胚珠)、种子(包括胚芽、胚乳和种皮)及果实(成熟子房)、植物组织(例如维管组织、基本组织等)和细胞(例如保卫细胞、卵细胞、毛状体等)及其后代。可用于本发明方法的植物的类别通常与适应转化技术的高等植物和低等植物一样广泛，包括被子植物(单子叶植物和双子叶植物)、裸子植物、蕨类植物和多细胞藻类。其包括各种倍性水平的植物，包括非整倍体、多倍体、二倍体、单倍体和半合子。

如本文所用，术语“异源”描述了两或更多个元件之间的关系，表示所述元件通常在天然彼此并不接近。因此，例如，如果一个多核苷酸序列源自外来物种，或者如果源自相同物种但是从其最初形式加以修饰，则其与生物体或第二多核苷酸序列是“异源的”。例如，启动子可操作地连接的异源编码序列是指来自与启动子衍生的物种不同的物种的编码序列，或者如果衍生自相同物种，则编码序列与启动子不天然相关联(例如遗传工程化的编码序列或者来自不同生态型或品种的等位基因)。异源多肽的实例是在转基因生物体中从重组多核苷酸表达的多肽。异源多核苷酸和多肽是重组分子形式。

如本文所用，术语“转染”是指将核酸有意导入细胞中。转染包括技术人员已知的将核酸导入细胞中的任何方法，包括但不限于农杆菌感染、生物射弹、电穿孔、显微注射等。

如本文所用，术语“沉默增强子”是指这样的核酸片段，当与核酸沉默子分子可操作地连接时，发挥提供更有效地沉默核酸沉默子分子靶的功能。

如本文所用，术语“核酸沉默子分子”是指根据本发明的核酸构建体的一部分，其包含靶植物内源基因的启动子区域。核酸沉默子分子被转录，开始产生单链RNA，其在植物细胞中被加工产生小RNA(sRNA)，诱导靶植物内源基因的转录基因沉默。核酸沉默子分子可以置于相对于核酸构建体的植物可操作启动子的有义方向或反义方向，或者其可以置于相对于核酸构建体的植物可操作启动子的反向重复结构中。

如本文所用，术语“单链有义沉默子”或者“单链S沉默子”是指由相对于启动子是有义方向的核酸沉默子分子产生的单链RNA。

如本文所用，术语“单链反义沉默子”或“单链AS沉默子”是指由相对于启动子是反义方向的核酸沉默子分子产生的单链RNA。

如本文所用，术语“反向重复沉默子”或者“IR沉默子”是指由具有两个拷贝的靶内源基因启动子序列的核酸沉默子分子产生的RNA分子，一个拷贝相对于另一个拷贝是反向的，优选由间隔物分开。

“降低的基因表达”是指与不含有核酸沉默子分子的植物细胞或植物相比，在含有稳定整合在其基因组中的核酸沉默子分子的转基因植物细胞或转基因植物中，植物内源基因的表达降低。“降低的基因表达”可包括植物内源基因的表达降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％。

如本文所用，“更有效的基因沉默”是指沉默增强子存在比不存在时靶基因的基因沉默更有效。更有效的基因沉默可以通过测量基因表达降低的增加而测量。或者，更有效的基因沉默可以通过来自核酸沉默子分子的sRNA产生的增加而测量。此外，更有效的基因沉默可以通过核酸构建体的外显率(penetration rate)增加而测量。或者，更有效的基因沉默可以通过脱靶效应降低而测量。技术人员也易于意识到其它可以测量的因子以确定更有效的基因沉默。当与仅含有稳定整合在其基因组中的核酸沉默子分子的植物细胞或植物相比，在含有包含与稳定整合在其基因组中的核酸沉默子分子可操作地连接的沉默增强子的核酸构建体的植物或植物细胞中观测到由核酸沉默子分子导致更有效的基因沉默。在基因表达降低增加的情况中，由与沉默增强子可操作地连接的核酸沉默分子所致的基因表达降低大于至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％或更多。在由于与沉默增强子可操作地连接的核酸沉默分子所致的外显率增加的情况中，增加至少100％、至少150％、至少200％、至少250％、至少300％、至少350％、至少400％、至少450％、至少500％、至少550％、至少600％或更多。

因此，第一方面，本发明提供了包含本文所述的植物可操作启动子的核酸构建体，所述植物可操作启动子与包含本文所述的沉默增强子的核酸分子可操作地连接，所述沉默增强子与本文所述的核酸沉默子分子可操作地连接。所述核酸构建体可任选包含其它调节序列，如3’调节序列，或者本文所述的其它序列。根据这个方面，本发明还提供了本文所述的分离的沉默增强子和包含本文所述的植物可操作启动子的核酸构建体，所述植物可操作启动子与包含本文所述的沉默增强子的核酸分子可操作地连接。在一些实施方案中，沉默增强子是SUPPRESSOR OF ddc(SDC)的启动子区域。在一个实施方案中，沉默增强子包含SEQ ID NO:6所示序列。在另一实施方案中，沉默增强子包含SEQ ID NO:3所示序列。在进一步的实施方案中，沉默增强子包含SEQ ID NO:1所示序列的1-389位核苷酸及连续的并且与第389位核苷酸在3’连续的任何数目的核苷酸。在一个实施方案中，沉默增强子包含SEQ ID NO:1所示序列的1-390位核苷酸。在另一实施方案中，合成的启动子包含SEQ ID NO:1所示序列的1-600位核苷酸。在另一个实施方案中，沉默增强子包含SEQ ID NO:1所示序列的1-709位核苷酸。在进一步的实施方案中，沉默增强子包含SEQ ID NO:1所示序列的1-810位核苷酸。在另一实施方案中，沉默增强子包含SEQ ID NO:1所示序列的1-1000位核苷酸。在另一个实施方案中，沉默增强子包含SEQ ID NO:1所示序列的1-1120位核苷酸。在进一步的实施方案中，沉默增强子包含SEQID NO:1所示序列的1-1225位核苷酸。在一个实施方案中，沉默增强子包含SEQ ID NO:1所示序列的1-1346位核苷酸。在另一实施方案中，沉默增强子包含SEQ ID NO:1所示序列的1-1466位核苷酸。在另一个实施方案中，沉默增强子包含SEQ ID NO:1所示序列的1-1487位核苷酸。在进一步的实施方案中，沉默增强子包含SEQ ID NO:1所示序列的1-1592位核苷酸。在另一实施方案中，沉默增强子包含SEQ ID NO:1所示序列的1-1663位核苷酸。在进一步的实施方案中，沉默增强子包含SEQ ID NO:1所示序列的1-1730位核苷酸。在一些实施方案中，沉默阻抑基因包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:18所示序列。这些沉默增强子的实例只是举例而言，并例证了本发明人期望的包含具有SEQ ID NO:1的1-389位核苷酸的389-1731个连续核苷酸的任何沉默增强子。在一些实施方案中，沉默增强子包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:18所示序列。在其它实施方案中，沉默增强子由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:18所示序列组成。

在一些实施方案中，沉默增强子是SUPPRESSOR OF ddc(SDC)的启动子区域。在另一实施方案中，沉默增强子可包含与SEQ ID NO:1、3、4、5、6或18具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％序列相同性的核酸序列。沉默增强子可包含在严格条件下与包含SEQID NO:1、3、4、5、6或18的完全互补序列的DNA分子可杂交的核苷酸序列。沉默增强子可包含核苷酸序列，其中所述核苷酸序列来自SEQ IDNO:1、3、4、5、6或18，通过选自如下的至少一种方法改变一或多个核苷酸：缺失、取代、添加和插入。沉默增强子可包含核苷酸序列，其中所述核苷酸序列相应于SUPPRESSOR OF ddc(SDC)的启动子的等位基因。

术语“在严格条件下”是指两个序列在中等或高度严格条件下杂交。更特别地，中等严格条件可以由本领域技术人员例如根据DNA的长度确定。基本条件由Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,third edition,chapters 6and 7,Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001描述，包括使用针对硝化纤维滤膜的预洗涤溶液5×SSC、0.5％SDS、1.0mMEDTA(pH 8.0)，杂交条件为大约50％甲酰胺、2×SSC至6×SSC，约40-50℃(或者其它相似杂交溶液，如Stark’s溶液，大约50％甲酰胺，大约42℃)，以及例如大约40-60℃、0.5-6×SSC、0.1％SDS的洗涤条件。优选地，中等严格条件包括在大约50℃和6×SSC杂交(和洗涤)。高度严格条件也可以由本领域技术人员例如根据DNA长度确定。

通常地，与中等严格条件相比，这个条件包括在较高温度和/或较低盐浓度下杂交和/或洗涤(如在大约65℃、6×SSC至0.2×SSC、优选6×SSC、更优选2×SSC、最优选0.2×SSC杂交)。例如，高度严格条件可包括如上所述的杂交，及在大约65-68℃、0.2×SSC、0.1％SDS条件下洗涤。在杂交和洗涤缓冲液中，SSPE(1×SSPE是0.15M NaCl、10mM NaH2PO4和1.25mM EDTA，pH 7.4)可以代替SSC(1×SSC是0.15M NaCl和15mM柠檬酸钠)；洗涤在完成杂交后进行15分钟。

在一个实施方案中，本发明的核酸沉默子分子包含植物内源基因靶，即通过TGS被负调节的植物内源基因的启动子区域。这个实施方案的核酸沉默子分子编码单链沉默子或反向重复(IR)沉默子，其任一最初是从核酸构建体转录的RNA分子。单链沉默子和IR沉默子在植物、植物组织和植物细胞中提供内源基因的TGS。在一个实施方案中，单链沉默子是从植物内源基因靶(即核酸沉默子分子)的启动子区域产生的RNA分子，其相对于核酸构建体中的植物可操作启动子是反义方向。在另一实施方案中，单链沉默子是从植物内源基因靶(即核酸沉默子分子)的启动子区域产生的RNA分子，其相对于核酸构建体中的植物可操作启动子是有义方向。在每个这些单链沉默子的实施方案中，构建体、核酸沉默子分子和单链沉默子没有反向重复结构，即无反向重复结构或反向重复存在于所述核酸构建体及由其产生的产物中。或者，在另一实施方案中，核酸沉默子分子是反向重复沉默子，并且是从植物内源基因靶的启动子区域产生的RNA分子，其中RNA分子以一式两份提供，并排列在核酸构建体的反向构型中。在一个实施方案中，在反向重复结构中的靶序列的一式两份的拷贝由间隔物分开。在一个实施方案中，间隔物含有在植物细胞中起作用的内含子。在另一实施方案中，间隔物是来自大豆7S启动子的片段。然而，可以预见间隔物不限于这些特征，其可以是适于允许反向重复序列杂交的任何序列。这种间隔物序列例如是SEQ ID NO:15。在一些实施方案中，核酸沉默子分子的表达产生初始的单链RNA。这个单链RNA通过细胞机制或由于反向重复结构可以被转变为双链RNA。

在一个实施方案中，启动子区域包含位于靶基因转录起始位点上游的核苷酸。在另一实施方案中，启动子区域包含位于靶基因的转录起始位点上游的核苷酸及转录起始位点下游的核苷酸。在一些实施方案中，启动子区域包含大约300至大约1500个核苷酸。在其它实施方案中，启动子区域包含大约400至大约1200个核苷酸。在另外的实施方案中，启动子区域包含大约425至大约1100个核苷酸。在进一步的实施方案中，启动子区域包含大约425至大约1075个核苷酸。见2012年9月7日提交的美国临时专利申请61/698,203，所述专利申请以其全部内容并入本文作参考。

在一个实施方案中，本发明的核酸沉默子分子包含植物内源基因靶，即通过TGS被负调节的植物内源基因的启动子区域。在另一实施方案中，核酸沉默子分子包含在被负调节的内源基因转录起始位点5’紧邻的2000个核苷酸，或者该2000个核苷酸的区域的片段。所述片段可包含该区域的至少100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900或2000个连续核苷酸，所述区域是被负调节的内源基因的转录起始位点5’紧邻的2000个核苷酸。

在一个实施方案中，sRNA在含有核酸沉默子分子的细胞中从表达的核酸沉默子分子产生。在另一实施方案中，沉默增强子在含有与核酸沉默子分子可操作地连接的沉默增强子的细胞中增强从表达的核酸沉默子分子产生sRNA。

在植物中可操作的任何启动子均可用于核酸构建体中。在一些实施方案中，启动子是植物可操作启动子的单一拷贝，包括本文所述的那些。在其它实施方案中，启动子是植物可操作启动子的双拷贝，以产生同源双启动子。在进一步的实施方案中，启动子是两个不同启动子的组合以产生异源双启动子。在一个实施方案中，植物可操作启动子是双35S CMV启动子。在另一个实施方案中，植物可操作启动子是单一35S CMV启动子。双35SCMV启动子的序列在SEQ ID NO:16中示出。所述核酸构建体可进一步包含使得可以克隆核酸构建体的序列或者促进剪切的序列。在一个实施方案中，另外的序列可以是3’序列，其在植物中是可操作的。在另一实施方案中，3’序列衍生自TRV2(烟草脆裂病毒2)，其位于核酸沉默子分子的下游。TRV23’序列的序列在SEQ ID NO:17中示出。

核酸构建体也可以包含植物可操作的3’调节序列。在一个实施方案中，植物可操作的3’调节序列是polyA添加序列。在另一个实施方案中，polyA添加序列是NOS polyA序列。

第二方面，本发明提供了包含核酸构建体的转基因植物细胞。在一个实施方案中，核酸构建体稳定整合在转基因植物细胞的基因组中。转基因植物细胞是通过用核酸构建体转染植物细胞而制备的，使用本领域熟知的方法进行，包括但不限于本文所述的那些方法。各种植物物种的植物细胞均可以用本发明的核酸构建体转染。含有所述核酸构建体的植物细胞根据常规技术选择，包括但不限于本文所述的那些技术。使用本领域熟知的生长条件，在适于核酸在转染的植物细胞中表达的条件下生长植物细胞。

本发明可用于转染各种植物物种的植物细胞，包括但不限于单子叶植物和双子叶植物。感兴趣的植物的实例包括但不限于玉米(Zea mays)，芸苔属(例如欧洲油菜(B.napus)、芫菁(B.rapa)、芥菜(B.juncea))，特别是可用作种子油来源的那些芸苔属，紫苜蓿(Medicago sativa)，水稻(Oryza sativa)，黑麦(Secale cereale)，高粱(Sorghum bicolor,Sorghum vulgare)，小米(例如黑粟(Pennisetum glaucum)，黍子(Panicum miliaceum)，粟(Setara italica)，龙爪稷(Eleusine coracana)，向日葵(Helianthus annuus)，红花(Carthamustinctorius)，小麦(Triticum aestivum)，大豆(Glycine max)，烟草(Nicotianatabacum)，马铃薯(Solanum tuberosum)，花生(Arachis hypogaea)，棉花(Gossypium barbadense,Gossypium hirsutum)，番薯(Ipomoea batatus)，木薯(Manihot esculenta)，咖啡(Coffea spp.)，椰子(Cocos nucifera)，菠萝(Ananascomosus)，柑橘树(Citrus spp.)，可可(Theobroma cacao)，茶(Camelliasinensis)，香蕉(Musa spp.)，鳄梨(Persea americana)，无花果(Ficus casica)，番石榴(Psidium guajava)，芒果(Mangifera indica)，橄榄(Olea europaea)，番木瓜(Carica papaya)，腰果(Anacardium occidentale)，澳洲坚果(Macadamiaintegrifolia)，杏仁(Prunus amygdalus)，甜菜(Beta vulgaris)，甘蔗(Saccharumspp.)，燕麦(Avena sativa),大麦(Hordeum vulgare)，柳枝稷(Panicumvirgatum)，蔬菜，观赏植物和针叶树。见美国专利No.7,763,773列举的可用于本发明中的另外的植物物种。

蔬菜包括番茄(Lycopersicon esculentum)，莴苣(例如Lactuca sativa)，绿豆(Phaseolus vulgaris)，利马豆(Phaseolus limensis)，豌豆(Lathyrus spp.)及香瓜属成员如黄瓜(C.sativus)，香瓜(C.cantalupensis)，及甜瓜(C.melo)。观赏植物包括杜鹃(Rhododendron spp.)，绣球花(Macrophylla hydrangea)，木槿(Hibiscus rosasanensis)，玫瑰(Rosa spp.)，郁金香(Tulipa spp.)，水仙(Narcissusspp.)，牵牛花(Petunia hybrida)，康乃馨(Dianthus caryophyllus)，一品红(Euphorbia pulchernima)及菊花。可用于实施本发明的针叶树包括例如松树如火炬松(Pinus taeda)，湿地松(Pinus elliotii)，西黄松(Pinus ponderosa)，美国黑松(Pinus contorta)及辐射松(Pinus radiata)；花旗松(Pseudotsugamenziesil)；西部铁杉(Tsuga canadensis)；西加云杉(Picea glauca)；红杉(Sequoia sempervirens)；冷杉如银杉(Abies amabilis)和香脂冷杉(Abiesbalsamea)；以及雪松如西方红色雪松(Thuja plicata)和阿拉斯加黄桧(Chamaecyparis nootkatensis)。

第三方面，本发明提供了包含核酸构建体的转基因植物。在一个实施方案中，所述核酸构建体稳定整合在转基因植物的基因组中。转基因植物从本文所述转基因植物细胞再生，使用本领域技术人员熟知的常规技术通过各种途径进行，包括体细胞胚发生和器官发生。可以培养通过植物转化技术包括上述那些技术获得的转化的植物细胞，以再生具有转化的基因型及希望的表型的完整植物。这种再生技术通常依赖于在组织培养生长培养基中对某些植物激素的操纵，典型依赖于与希望的核苷酸序列一起导入的标记。见例如美国专利7,763,773、美国专利申请公开2010/0199371和国际公开的申请WO 2008/094127及其中引用的参考文献。在适于转基因植物中核酸表达的条件下生长转基因植物，使用本领域熟知的生长条件。

第四方面，本发明提供了一种在植物、植物组织或植物细胞中通过转录基因沉默更有效地沉默感兴趣的基因的方法，如更有效地沉默内源基因表达。在一个实施方案中，所述方法包括用核酸构建体转染植物细胞以产生本文所述的转基因植物细胞。所述方法进一步包括在本文所述的转基因植物细胞中表达如本文所述核酸沉默子分子。本文所述的表达的核酸沉默子分子在转基因植物细胞中被切割，产生一或多个小RNA(sRNA)，其诱导转录基因沉默，以降低感兴趣的靶基因的表达。在一些实施方案中，核酸沉默子分子的表达产生初始的单链RNA。这个单链RNA通过细胞机制或由于反向重复结构可以被转变为双链RNA，之后加工产生sRNA。所述方法可任选包括制备编码本文所述的核酸的核酸构建体。在另一实施方案中，所述方法包括从转基因植物细胞再生转基因植物。在这个实施方案中，核酸沉默子分子在转基因植物中表达。表达的核酸在转基因植物细胞中被切割，产生一或多个sRNA，其诱导转录基因沉默，以降低感兴趣的靶基因的表达。

根据本发明插入植物中的包含本文所述的沉默增强子和本文所述的核酸沉默分子的核酸分子(感兴趣的核酸分子)对于转化过程不是关键的。通常地，被导入植物中的感兴趣的核酸分子是本文所述构建体的一部分。所述构建体典型地包括与感兴趣的核酸分子的5’端和/或与感兴趣的核酸分子的3’端可操作地连接的调节区。含有所有这些元件的盒在本文也称作表达盒。表达盒可另外含有在表达盒构建体中的5’前导序列。调节区(即启动子、转录调节区和转录终止区)对于宿主细胞或彼此可以是天然的/类似的。或者，调节区对宿主细胞或彼此可以是异源的。见美国专利7,205,453和7,763,773，及美国专利申请公开2006/0218670、2006/0248616和20090100536，及其中引用的参考文献。

在植物可操作启动子控制下的感兴趣的核酸分子可以是本文定义的任何核酸分子，并可通过转录基因沉默机制以负调节靶基因而用于改变其导入的植物的任何特性或性状。靶基因可编码调节蛋白如转录因子等、结合或相互作用蛋白，或者改变转基因植物细胞或转基因植物的表型性状的蛋白质。靶基因的负调节可以增强、改变或修饰植物的性状，如农业学性状。农业学性状可涉及植物形态学、生理学、生长和发育、产量、营养、疾病或有害生物抗性，或者环境或化学耐受性。在一些方面，所述性状选自水分利用效率、耐热性、产量、氮利用效率、种子蛋白质、种子油和生物量。产量可包括在非应激条件下增加的产量及在环境应激条件下增加的产量。应激条件可包括例如干旱、遮阳、真菌疾病、病毒疾病、细菌疾病、昆虫侵袭、线虫侵袭、极端温度暴露(冷或热)、渗透压、减低的氮营养利用度、减低的磷营养利用度和高植物密度。在一些实施方案中，感兴趣的核酸分子可用于修饰代谢途径，如种子中脂肪酸生物合成或者脂质生物合成途径，或者改变植物病原体抗性。

通常地，表达盒可另外包含选择标记基因以选择转化的细胞。选择标记基因用于选择转化的细胞或组织。通常地，植物选择标记基因编码抗生素抗性，合适的基因包括至少一系列编码抗生素壮观霉素抗性的基因、编码链霉素抗性的链霉素磷酸转移酶(spt)基因、编码卡那霉素或遗传霉素抗性的新霉素磷酸转移酶(nptII)基因、编码潮霉素抗性的潮霉素磷酸盐转移酶(hpt或aphiv)基因、乙酰乳酸合酶(als)基因。或者，植物选择标记基因编码除草剂抗性如对磺脲类除草剂、草铵膦、草甘膦、铵、溴苯腈、咪唑啉酮和2,4-二氯苯氧乙酸盐(2,4-D)抗性，包括编码除草剂抗性的基因，其抑制谷氨酰胺合成酶如草丁膦或basta(例如bar基因)作用。通常见国际公开WO 02/36782、美国专利7,205,453和7,763,773及美国专利申请公开2006/0218670、2006/0248616、2007/0143880和20090100536以及其中的参考文献。也见Jefferson et al.(1991)；De Wet et al.(1987)；Goff et al.(1990)；Kain et al.(1995)和Chiu et al.(1996)。这个选择标记基因列表无限制之意。任何选择标记基因均可使用。选择标记基因也在被转化的植物物种中可操作启动子的控制下。这种启动子包括在国际公开WO 2008/094127及其中引用的参考文献中描述的那些。也见美国专利申请公开2008/0313773和2010/0199371举例的可用于本发明中的另外的标记。

许多启动子可用于实施本发明。启动子可以基于希望的结果选择。即核酸可以与组成型、组织优选的或者其它启动子组合以在感兴趣的宿主细胞中表达。这种组成型启动子包括例如Rsyn7核心启动子(WO 99/48338和美国专利6,072,050)；核心CaMV35S启动子(Odell et al.,1985)；水稻actin(McElroy et al.,1990)；泛素(Christensen and Quail,1989；Christensen etal.,1992)；pEMU(Last et al.,1991)；MAS(Velten et al.,1984)；ALS启动子(美国专利5,659,026)等。其它组成型启动子包括例如在美国专利5,608,149、5,608,144、5,604,121、5,569,597、5,466,785、5,399,680、5,268,463和5,608,142中公开的那些启动子。

其它启动子包括可诱导启动子。可诱导启动子应答内源性或外源性刺激如化学化合物(化学诱导剂)的存在或者应答环境、激素、化学和/或发育信号而选择性表达可操作地连接的DNA序列。可诱导或调节的启动子包括例如由光、热、应激、洪涝或干旱、植物激素、创伤、或者化合物如乙醇、茉莉酮酸酯、水杨酸或者安全剂调节的启动子。病原体可诱导的启动子包括来自致病相关蛋白质(PR蛋白质)的那些启动子，其在病原体感染后被诱导，例如PR蛋白、SAR蛋白、β-1,3-葡聚糖酶、壳多糖酶等。其它启动子包括在病原体感染位点局部或附近表达的那些启动子。在进一步的实施方案中，启动子可以是创伤可诱导的启动子。在其它实施方案中，通过外源化学调节物的应用，化学调节的启动子可用于调节植物中基因的表达。启动子可以是可化学诱导的启动子，化合物的应用诱导基因表达，或者是可化学阻抑的启动子，化合物的应用抑制基因表达。此外，组织优选的启动子可用于在特定植物组织内靶向增强感兴趣的多核苷酸的表达。每个这些启动子均在美国专利6,506,962、6,575,814、6,972,349和7,301,069及美国专利申请公开2007/0061917和2007/0143880中描述。也见美国专利申请公开2008/0313773和2010/0199371举例的可用于本发明中的其它启动子。技术人员已知的可用于植物中的其它启动子也可用于本发明中。

用于本发明启动子可包括：RIP2、mLIP15、ZmCOR1、Rab17、CaMV35S、RD29A、B22E、Zag2、SAM合成酶、泛素、CaMV 19S、nos、Adh、蔗糖合酶、R-等位基因、维管组织优选的启动子S2A(Genbank登录号EF030816)和S2B(Genbank登录号EF030817)，以及来自玉米(Zea mays)的组成型启动子GOS2。其它启动子包括根优选的启动子，如玉米NAS2启动子、玉米Cyclo启动子(美国专利申请公开2006/0156439)、玉米ROOTMET2启动子(国际公开WO05/063998)、CR1BIO启动子(国际公开WO06/055487)、CRWAQ81启动子(国际公开WO05/035770)和玉米ZRP2.47启动子(NCBI登录号:U38790；GI No.1063664)。在一些实施方案中，使用的启动子是双启动子，例如双CaMV 35S启动子。本文公开的任何启动子以及本领域技术人员已知可用于植物中的其它启动子的双启动子均可用于本发明中。

在制备表达盒时，各种DNA片段可以经处理以提供处于适当方向及适当阅读框中(酌情)的DNA序列。为此，可以应用衔接子(adapter)或接头以连接DNA片段，或者可以包括其它处理以提供方便的限制位点，除去过多的DNA，除去限制位点等。为此，可以包括体外诱变、引物修复、限制、退火、重取代，例如可以包括转换和颠换。

一旦已经将核酸克隆进表达载体中，可以使用常规转化(或转染)程序将其导入植物细胞中。术语“植物细胞”意在涵盖来自植物的任何细胞，所述植物包括未分化的组织如愈伤组织和悬浮培养物，以及植物种子、花粉或者植物胚胎。适于转化的植物组织包括叶组织、根组织、分生组织、原生质体、胚轴、子叶、盾片、苗端、根、未成熟胚、花粉和花药。“转化”是指通过外部应用重组DNA直接修饰细胞基因组，导致其摄取并整合进对象细胞基因组中。以此方式，可以获得遗传修饰的植物、植物细胞、植物组织、种子等。

本发明的DNA构建体可用于转化任何植物。构建体可以通过各种常规技术导入希望的植物宿主的基因组中。转化各种高等植物物种的技术为本领域熟知，并在科技文献中描述。转化方案可以根据靶向转化的植物或植物细胞的类型(即单子叶植物或双子叶植物)而不同，这为本领域技术人员熟知。例如，DNA构建体可以使用如电穿孔和显微注射植物细胞原生质体等技术直接导入植物细胞的基因组DNA中，或者DNA构建体可以使用生物射弹方法，如DNA粒子轰击直接导入植物组织中。或者，DNA构建体可以与合适的T-DNA侧翼区组合并导入常规的根瘤土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)宿主载体中。当细胞感染细菌根瘤土壤杆菌时，根瘤土壤杆菌宿主的毒力作用将指导构建体及相邻标记插入植物细胞DNA中。因此，可以应用提供有效转化/转染的任何方法。见例如美国专利7,241,937、7,273,966和7,291,765及美国专利申请公开2007/0231905和2008/0010704及其中引用的参考文献。也见国际公开申请WO 2005/103271和WO2008/094127及其中引用的参考文献。也见美国专利申请公开2008/0313773和2010/0199371举例的针对可用于本发明中的各种植物物种的转化方案。

可以培养通过上述任何转化技术衍生的转化植物细胞以再生具有转化的基因型及希望的表型的完整植物，例如转基因植物。“转基因植物”是其中已导入外来DNA的植物。“转基因植物”包含有性或无性繁殖的其所有后代、杂种和杂交体(cross)，并且其继续携带所述外来DNA。再生技术依赖于在组织培养生长培养基中一些植物激素的操作，典型地依赖于与希望的核苷酸序列一起导入的杀生物剂和/或除草剂标记。参见，例如国际申请公开WO 2008/094127及其引用的参考文献，和美国专利申请公开2010/0199371。

前述转化方法典型用于产生转基因品种，其中表达盒被稳定掺入。在表达盒被稳定掺入转基因植物中之后，其可以通过有性杂交转移到其它植物中。在一个实施方案中，转基因品种可以然后与另一个(非转化或转化)品种杂交，以产生新的转基因品种。或者，已使用前述转化技术工程化到特定棉花品系中的遗传性状可以用植物育种领域熟知的传统回交技术移到另一品系中。例如，回交途径可以用于将工程化性状从公共非良种移到良种中，或者从基因组中含有外来基因的品种移到不含有该基因的一或多个品种中。如本文所用，“杂交”根据上下文可以指简单的X和Y杂交，或者回交过程。根据杂交物种，可以使用任何标准育种技术。

一旦产生这种类型的转基因植物，植物本身可以根据常规程序栽培。转基因种子当然可以从转基因植物中回收。这些种子然后可以种植在土壤中并用常规程序栽培以产生转基因植物。栽培的转基因植物会表达本文描述的核酸，并且其被切割产生sRNA。

在第五方面，本发明提供了鉴别和获得植物TGS的其它沉默增强子的核酸构建体和方法。根据这个方面，所述核酸构建体是适合转化希望鉴别沉默增强子的植物物种的核酸构建体。在一个实施方案中，所述核酸构建体可以包括在载体中。在一些实施方案中，载体适合农杆菌介导的转化。在其它实施方案中，载体可以适合于生物射弹介导的转化。其它用于植物转化的合适载体是本领域技术人员熟知的。在另一个实施方案中，所述核酸构建体可以根据本领域技术人员熟知的技术直接用于转化植物。所述核酸构建体包含植物可操作启动子，所述植物可操作启动子可操作地连接于推测的沉默增强子，所述推测的沉默增强子可操作地连接于本文所述的核酸沉默子分子，所述核酸沉默子分子可操作连接于植物可操作3’调节区。

在一个实施方案中，被测试沉默增强子活性的多核苷酸是来自非拟南芥物种的SUPPRESSOR OF ddc(SDC)的同系物的启动子区。SDC同系物可以来自单子叶或双子叶植物。SDC的同系物可以选自：玉米、大豆、向日葵、高粱、芸苔、小麦、紫花苜蓿(alfalfa)、棉花、水稻、大麦、粟、甘蔗和柳枝稷(switchgrass)。在另一个实施方案中，推测的沉默增强子或待被测试增强转录基因沉默的多核苷酸是被高水平内源性24nt siRNA沉默的并且高度甲基化的基因座的启动子区。在一个实施方案中，植物可操作启动子是单个启动子、双同源性启动子或者双异源性启动子。在一个实施方案中，植物可操作启动子是单或双35S CMV启动子。在一个实施方案中，3’序列是TRV23’序列。在另一个实施方案中，3’调节区是polyA添加序列。在一个实施方案中，polyA序列是NOS poly A序列。测试更有效沉默可以根据本领域熟知方法进行。这些方法包括但不限于RT-PCR、PCR、northern印迹分析、免疫学测定和酶学测定。在一些实施方案中，靶启动子的甲基化状态可以通过McrBc酶消化测定。在其它实施方案中，染色质修饰状态通过利用针对组蛋白甲基化或乙酰化位点的抗体的免疫学测定进行测试。在进一步的实施方案中，基因产物的量被确定。待被测试更有效沉默感兴趣基因的启动子区的片段的测试可以根据本发明描述的方法进行。

进一步根据这个方面，合适的沉默增强子通过包括以下步骤的方法鉴别：制备核酸构建体，所述核酸构建体包含本文所述的推测的沉默增强子和核酸沉默子分子，用所述核酸构建体转化感兴趣植物物种的细胞或组织，及确定推测的沉默增强子是否更有效地沉默测试的内源基因。如果测试的内源基因被更有效地沉默，则所述推测的沉默增强子被鉴别为TGS的沉默增强子。在一个实施方案中，所述确定是通过培养转化的植物细胞表达核酸沉默子分子及测试培养的转化植物细胞或组织中的转录基因沉默而进行。在另一个实施方案中，所述确定是通过从转化的植物细胞或组织再生植物并测试转化植物中的转录基因沉默而进行的。转化植物的再生是根据本领域技术人员熟知的技术进行。测试沉默可以根据本领域熟知方法进行。这些方法包括但不限于RT-PCR、PCR、northern印迹分析、免疫学测定和酶学测定，以及本文所述的其它方法。

除非另有说明，本发明的实施采用化学、分子生物学、微生物学、重组DNA、遗传学、免疫学、细胞生物学、细胞培养和转基因生物学的传统技术，其属于本领域技术范围内，参见例如Maniatis et al.,1982,MolecularCloning(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York)；Sambrook et al.,1989,Molecular Cloning,2nd Ed.(Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,New York)；Sambrook and Russell,2001,Molecular Cloning,3rd Ed.(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,New York)；Green and Sambrook,2012,Molecular Cloning,4th Ed.(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York)；Ausubel et al.,1992),Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley&Sons,including periodic updates)；Glover,1985,DNA Cloning(IRL Press,Oxford)；Russell,1984,Molecular biology of plants:a laboratory course manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.)；Anand,Techniques for the Analysis of Complex Genomes,(Academic Press,New York,1992)；Guthrie and Fink,Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology(Academic Press,New York,1991)；Harlow and Lane,1988,Antibodies,(ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York)；Nucleic AcidHybridization(B.D.Hames&S.J.Higgins eds.1984)；Transcription AndTranslation(B.D.Hames&S.J.Higgins eds.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney,Alan R.Liss,Inc.,1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRLPress,1986)；B.Perbal,A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)；thetreatise,Methods In Enzymology(Academic Press,Inc.,N.Y.)；Methods InEnzymology,Vols.154 and 155(Wu et al.eds.),Immunochemical Methods InCell And Molecular Biology(Mayer and Walker,eds.,Academic Press,London,1987)；Handbook Of Experimental Immunology,Volumes I-IV(D.M.Weir andC.C.Blackwell,eds.,1986)；Riott,Essential Immunology,6th Edition,Blackwell Scientific Publications,Oxford,1988；Fire et al.,RNA InterferenceTechnology:From Basic Science to Drug Development,Cambridge UniversityPress,Cambridge,2005；Schepers,RNA Interference in Practice,Wiley–VCH,2005；Engelke,RNA Interference(RNAi):The Nuts&Bolts of siRNATechnology,DNA Press,2003；Gott,RNA Interference,Editing,andModification:Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology),HumanPress,Totowa,NJ,2004；Sohail,Gene Silencing by RNA Interference:Technology and Application,CRC,2004.

实施例

本发明参考下述实施例进行描述，其提供举例，不以任何方式限制本发明。使用本领域熟知的标准技术或以下具体描述的技术。

实施例1

载体构建

使用标准PCR和克隆技术，将来自AT2G17690(SDC)启动子区的1731bp拟南芥(Arabidopsis thaliana)野生型(WT)基因组片段(位置-274至-2004；转录起始位点是+1)克隆进Gateway进入载体以产生pENTR/PSDC。来自AT1G80080(TMM)的启动子区的475bp基因组DNA片段(-9至-483；转录起始位点是+1)被克隆进Gateway进入载体以产生pENTR/PTMM-S。用于克隆这两个基因组DNA片段的引物含有限制酶位点，正向引物中是AvrII，反向引物中是SpeI和AscI。pENTR/PSDC被SpeI和AscI双酶切成线性化pENTR/PSDC。pENTR/PTMM-S被AvrII和AscI消化以释放PTMM-S DNA片段。因为AvrII和SpeI的消化末端相容，所以消化的PTMM-SDNA片段可以被连接进线性pENTR/PSDC中以产生pENTR/PSDC-PTMM-S。pENTR/PTMM-S和pENTR/PSDC-PTMM-S通过Gateway LR反应被克隆进从pBA002(Kost et al.,1998)修饰而来的Gateway目的载体pBADC，分别产生pBA/PTMM-S和pBA/PSDC-PTMM-S。在两个构建体中，序列均置于CaMV 35S启动子的下游。这两个进入载体还被克隆进pKGWFS7以产生pKGWFS7/PTMM-S和pKGWFS7/PSDC-PTMM-S，其中没有启动子被置于序列上游。通过这个方法，构建了下述载体(pBA/PSDC1-PTMM-S、pBA/PSDC2-PTMM-S、pBA/PSDC3-PTMM-S、pBA/PSDC4-PTMM-S、pBA/PSDC5-PTMM-S、pBA/PSDC6-PTMM-S、pBA/PSDC7-PTMM-S、pBA/PSDC8-PTMM-S、pBA/PTMM-AS、pBA/PSDC-PTMM-AS、pBA/PSDC3-PTMM-AS、pBA/PSDC7-PTMM-AS、pBA/PTMM-IR、pBA/PSDC3-PTMM-IR、pBA/PSDC7-PTMM-IR,pBA/PFAD2、pBA/PSDC3-PFAD2、pBA/PCH42、pBA/PSDC4-PCH42、pBA/TMM-S、pBA/PSDC3-TMM-S)，在所有这些载体中，使用CaMV启动子转录下游序列。这些DNA序列和用于克隆这些DNA片段的引物如下：

PSDC:

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PTMM-S:tgttgctccatgggcatgtgcttttcgtatgcacagaccacgcgtccgtttattcagattctcgtgttacaacaaaataatgattttaaggttcagaatcaaacatatgaaactttttatcaattgctatctacggtttgttacaaaaacaaatacagtgcccagttcaaaatacaaattgaataatagcccaacatatcgtaaatgggaaaatgggctcagcccaaataaaaaaaaagtaaacgataaggagacgtcgggtcccgttcacgaagcggtcggatctagggcccaacacaagacgaatgaagggaatatctcgtgaaagcaataaatgcagaaatcgagaatcatgaattttatttatttcgctcctcgagttatcccgtgaaagtcataaagacattgcgaacgtttttatggacccaccaattgtttcttcagaattatacatatacacactgacaatttcgaa(475bp)(SEQ ID NO:2).

PSDC1:gaaaatgaggaaagtgttgtgccaaatcacgaattagtacccatgtctgttgatgctctaacaattctttccacaagaccacaactccacaagtaacccgcgctatgttttcacgggtatcgacaatgttctcaggttccactataaactcattatccattgagaatttagtgcgcagaggagttgcttcaagttgattgaccaatacttttttcaattgttagacataaacactgaatacaaatctttgaacaacctgacttagatcatcctcattgcacaataaaacacagttttttttttttttttttttaaatgaaaaataaaataaaatgttatttagtgcttttaggaggaagactcactgtctttcatgtctctgcaaagacattttcttacttttaaagacatcacacttgactaataaatgactcaaattaaaataatgttaatttttataataaactataataaagacatctctaaaaaagtcaccaatgagaatgctcttaggaaccaaattttgcatgaggaaaactgttagctaagttagggtctggtttagaactcaagtccaactttcaaaatttaaaagaactaacttagtcaggttacgggttcttgggaatacgtttgtagtcgaaagaactgttttctcgatcgaaatttttggtaaaacatgaatgaaagaaaggtgatctccgacgaaaaattaataacctaatttatcatgaggttttgtagactaattttctttttactaaagtagtgtatttaagactcggtaatcaattaactatgttcagaatttttggttgtttggattgacttttgggtaaaagaatttagaattgcaaagaattgcaaacaatcggtttgttcggattaggtaaaagcattccgaattgaaaacctaagtttgtcttggacccctaaaatttaagcttaatttatcaatttcggtacatttgcaaagttcagtccaattcaaatattcggtttagaccaaaagttcgaataatgaaaaaaaaacatctgaaagttgtggaatttttttttaaagcaaattggtaaaccataagaacttctttaaaagtccaccacatcatttatccttcaaaatctccccaaatacgaaatcaagcaagtcttccgaaatttagaatctccaatacaccatgttgggaaacaaaccaactttttacatccgaagattatagatatattgtctaatatatcaatcaagtccaactccaattagaagaaagtttttttggaaaaaagccctaaacaaatttgtgcaagttttaccacttggacccaaagcggacaatatcatcctaatcgaaaaagttggaatgggcttggagagcccaacaaccctattttttagaaaacaataaatttatttgcaaaacgacatgaaaatcatcgtacaaaacattcaagatatatgatgaattatt(1466bp)(SEQID NO:3).

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PSDC4:gaaaatgaggaaagtgttgtgccaaatcacgaattagtacccatgtctgttgatgctctaacaattctttccacaagaccacaactccacaagtaacccgcgctatgttttcacgggtatcgacaatgttctcaggttccactataaactcattatccattgagaatttagtgcgcagaggagttgcttcaagttgattgaccaatacttttttcaattgttagacataaacactgaatacaaatctttgaacaacctgacttagatcatcctcattgcacaataaaacacagttttttttttttttttttttaaatgaaaaataaaataaaatgttatttagtgcttttaggaggaagactcactgtctttcatgtctctgcaaagac(389bp)(SEQ ID NO:6).

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PTMM-IR:ctgttgctccatgggcatgtgcttttcgtatgcacagaccacgcgtccgtttattcagattctcgtgttacaacaaaataatgattttaaggttcagaatcaaacatatgaaactttttatcaattgctatctacggtttgttacaaaaacaaatacagtgcccagttcaaaatacaaattgaataatagcccaacatatcgtaaatgggaaaatgggctcagcccaaataaaaaaaaagtaaacgataaggagacgtcgggtcccgttcacgaagcggtcggatctagggcccaacacaagacgaatgaagggaatatctcgtgaaagcaataaatgcagaaatcgagaatcatgaattttatttatttcgctcctcgagttatcccgtgaaagtcataaagacattgcgaacgtttttatggacccaccaattgtttcttcagaattatacatatacacactgacaatttcgaaactagggccatgcacaacaacacgtactcacaaaggtgtcaatcgagcagcccaaaacattcaccaactcaacccatcatgagcccacacatttgttgtttctaacccaacctcaaacccgtattctcttccgccacctcatttttgtttagttcaacacccgtcaaactgcatcccaccccgtggactaggttcgaaattgtcagtgtgtatatgtataattctgaagaaacaattggtgggtccataaaaacgttcgcaatgtctttatgactttcacgggataactcgaggagcgaaataaataaaattcatgattctcgatttctgcatttattgctttcacgagatattcccttcattcgtcttgtgttgggccctagatccgaccgcttcgtgaacgggacccgacgtctccttatcgtttactttttttttatttgggctgagcccattttcccatttacgatatgttgggctattattcaatttgtattttgaactgggcactgtatttgtttttgtaacaaaccgtagatagcaattgataaaaagtttcatatgtttgattctgaaccttaaaatcattattttgttgtaacacgagaatctgaataaacggacgcgtggtctgtgcatacgaaaagcacatgcccatggagcaacag(1144bp)(SEQ ID NO:12).

PFAD2-S:atcagttaacacttattaagaacaaaaatgtggtttcttgtgagaaaaatggtttaataaaaatccgtgattgatagaagaaaaagatcaaaataaatggttggtgacgggtgatcttaaaaatgttgaaattaaggtgtgtcgtcgttatacgcggtaaatagatagatagaaaaatagaagtccaatgcaagagacttaacttaatcatcccaattaattgattgcattaacttgtacttgtattttccgtccgccacctaatttgattaataatataataaagattacaattgaaaacataaacaagagaaaatccgcacgaatctaccaaagtgcatcacgtttgggtatccatacacgtgaccaccagtccaccacaacacaatgtctgtagatattttaatgtttcacatgatagaagaagccaaacgtaagaactctcttttccacttttagccctttccccgcctaccactgcttacgacttgtgtaagtggcaaactagtaataatagagacgaaacttaaatataaaaaagttgaatccaaccaagttggtgttaatcaaatggttaagttataatggtgaaagatttgccatgtgtattgtattaagagttaagaccaaggtttggttcccatcacttacgattctttcttttcatatgattctaaagttagttattataaacatcttaatttactacacaatattcggtaatttctacatattttagagattagtttgagtttcaatccatactttactagtgattataaattaatatacgtacttttcgactataaagtgaaactaagtaaattagaacgtgatattaaaaagttaatgttcactgttatatttttttcacaagtaaaaaatgggttatttgcggtaaataaaaataccagatattttgaattgattaaaaaggttgaaataagagaggaggggaaagaaaagaaggtgggggcccagtatgaaagggaaaggtgtcatcaaatcatctctctctctctctctctaccttcgacc(1038bp)(SEQ ID NO:13).

PCH42-S:tcgagactaaatttcagggacaacgagcagcacgaaactaagtttaggagaaagtgcatcttagcattgatcgaacatttcttactcaaatctacgcataaacgtcacctctaacacagaaatgttcatcgattatgatcaaccgatcgtcaatcgtcgaaccttagcaaaccgaagctaaaacaacgcctgacagtgagattctactcaatcgacgagcaacgagggtaaattcttaccgattgaatcgctttgcagttgtatatgtagtaggcgctaacgataaacgttcaacggcaacaagacgacgacaccggagagaaaatcgccgacggaactcgaaggggggagattttgaaattagctgggctccgaatgatttgacttgggcctttatattcttatgtttggtatatatatatagaagctcgcctttttttttggtacggctattttattttctatatcatttttga(476bp)(SEQ ID NO:14).

引物：

PSDC f1,CACCTAGGAAAATGAGGAAAGTGTTGTGCCA(SEQ ID NO:19)

PSDC r2,CGGCGCGCCCACCCTTAATAGTCGACTCTAGACTAGTCTAGTATGTTTTGTGTTAGGGC(SEQ ID NO:20)

PSDC1 f1,CACCTAGGAAAATGAGGAAAGTGTTGTGCCA(SEQ ID NO:21)

PSDC1 r2,TACTCGAGTCTAGACTAGTAATAATTCATCATATATCTTGA(SEQ ID NO:22)

PSDC2 f1,CACCTAGGAAAATGAGGAAAGTGTTGTGCCA(SEQ ID NO:23)

PSDC2 r2,ACTCGAGTCTAGACTAGTATGGTGTATTGGAGATTCTA(SEQ ID NO:24)

PSDC3 f1,CACCTAGGAAAATGAGGAAAGTGTTGTGCCA(SEQ ID NO:25)

PSDC3 r2,TACTCGAGTCTAGACTAGTTTCGTCGGAGATCACCTTTCT(SEQ ID NO:26)

PSDC4 f1,CACCTAGGAAAATGAGGAAAGTGTTGTGCCA(SEQ ID NO:27)

PSDC4 r2,TACTCGAGTCTAGACTAGTGTCTTTGCAGAGACATGAAAGA(SEQ ID NO:28)

PSDC5 f1,CACCTAGGAATTTTCTTACTTTTAAAGACA(SEQ ID NO:29)

PSDC5 r2,CGGCGCGCCCACCCTTAATAGTCGACTCTAGACTAGTCTAGTATGTTTTGTGTTAGGGC(SEQ ID NO:30)

PSDC6 f1,CACCTAGGAAATTAATAACCTAATTTATCA(SEQ ID NO:31)

PSDC6 r2,CGGCGCGCCCACCCTTAATAGTCGACTCTAGACTAGTCTAGTATGTTTTGTGTTAGGGC(SEQ ID NO:32)

PSDC7 f1,CACCTAGGGTTGGGAAACAAACCAACTTTTTACA(SEQ ID NO:33)

PSDC7 r2,CGGCGCGCCCACCCTTAATAGTCGACTCTAGACTAGTCTAGTATGTTTTGTGTTAGGGC(SEQ ID NO:34)

PSDC8 f1,CACCTAGGTGATTATTACCACGTCAGTA(SEQ ID NO:35)

PSDC8 r2,CGGCGCGCCCACCCTTAATAGTCGACTCTAGACTAGTCTAGTATGTTTTGTGTTAGGGC(SEQ ID NO:36)

PTMM-S f1,CACCTAGGCTGTTGCTCCATGGGCATGTGCT(SEQ ID NO:37)

PTMM-S r2,CGGCGCGCCCACCCTTAATAGTCGACTCTAGACTAGTTTCGAAATTGTCAGTGTGTA(SEQ ID NO:38)

PTMM-AS f1,CACCTAGGTTCGAAATTGTCAGTGTGTA(SEQ ID NO:39)

PTMM-AS r2,CGGCGCGCCCACCCTTAATAGTCGACTCTAGACTAGTCTGTTGCTCCATGGGCATGTGC(SEQ ID NO:40)

PFAD2-S f1,CACCTAGGATCAGTTAACACTTATTAAGA(SEQ ID NO:41)

PFAD2-S r2,TCGGCGCGCCCACCCTTAGTCGACTCTAGAGGTCGAAGGTAGAGAGAGAGAGA(SEQ ID NO:42)

PCH42-S f1,CACCTAGGTCGAGACTAAATTTCAGGGA(SEQ ID NO:43)

PCH42-S r2,ACTCGAGTCGACTCTAGACTAGTTCAAAAATGATATAGAAAAT AAAATA(SEQ ID NO:44)

实施例2

植物材料和转化

本研究中使用拟南芥(Arabidopsis thaliana)WT(Col-0)和烟草Nicotiana benthamiana。通过Zhang et al.(2006)描述的浸花法进行拟南芥的稳定转化。转化植物在选择培养基(1x MS盐+1％蔗糖+0.5g/L MES+100mg/L羧苄西林+10mg/L basta+8％琼脂pH 5.7)上进行筛选。使用2周龄T1和T2幼苗在显微镜下评估成簇气孔表型。T3纯合幼苗用于DNA甲基化和染色质修饰测定。烟草N.benthamiana叶Agro-浸润(Voinnet et al.,2003)用于测定由不同构建体产生的小RNA水平。

实施例3

气孔表型观测

使用2周龄T1和T2幼苗的子叶在显微镜下评估气孔表型。在野生型中(WT)，气孔出现在子叶下表面上，它们由至少一个间插(intervening)表皮细胞分开。如果两个或两个以上气孔位于一起，则幼苗被评估为展示tmm突变体表型(成簇气孔表型)。对于构建体的每个转化事件，32-64个T1独立品系和24个T2独立品系被评估以确定tmm表型外显率。

实施例4

DNA甲基化分析

通过DNeasy Plant Mini Kit(Qiagen)从2周龄幼苗中提取拟南芥基因组DNA。用1μg基因组DNA和EpiTech Bisulfite Kit(Qiagen)根据厂商方案进行亚硫酸氢盐DNA转化。用位于靶向区域之外的设计用于单链甲基化检测的引物进行PCR。PCR产物然后用TA克隆试剂盒(Invitrogen)克隆进pCR2.1。对于每种基因型，用M13R引物测序至少20个独立克隆。数据经Cymate(Hetzl et al.,2007)分析。

实施例5

染色质沉淀(ChIP)

如Gendrel et al.(Gendrel et al.,2005)所述(经小修改)，用3克2周龄幼苗进行免疫沉淀实验。将重悬于核裂解缓冲液中的交联染色质沉淀在Bioruptor(Bioruptor UCD 200,Diagenode)中在最大水平超声处理10分钟。样品超声处理30秒，在处理之间间隔30秒。组蛋白H3三甲基Lys4(K4me3)抗体来自Active Motif(Cat.No.39159)。组蛋白H3乙酰化、组蛋白H3三甲基Lys9(K9me3)、组蛋白H3三甲基Lys27(K27me3)抗体来自Milipore(Cat.No.06-599,07-442,07-449)。

实施例6

小RNA分析

通过Trizol Reagent(Invitrogen)根据厂商指导从2周龄幼苗中提取总RNA。通过TruSeq Small RNA Sample Prep Kit(Illumina)根据厂商指导构建小RNA文库。简而言之，1μg总RNA或纯化的小RNA与3’和5’衔接子(adaptor)连接并用作RT-PCR模板。在PCR扩增后，合并6μl每种样品并在6％聚丙烯酰胺凝胶上分离。相应于约20-30nt小RNA的凝胶片被回收。在洛克菲勒大学基因组中心经Illunina HiSeq确定序列。衔接头序列经localPerl script剪切，仅长度大于15nt的读数(read)用于进一步分析。所有保留的读数通过不允许错配的C程序作图到拟南芥基因组(TAIR 9version)上

实施例7

小RNA Northern印迹

使用每泳道10g总RNA进行RNA凝胶印迹分析。RNA经17％PAGE/8M尿素/0.5X TBE缓冲液(National Diagnostics,USA)分离。凝胶电印迹到Hybond N+膜(Amersham,Piscataway,NJ)上然后UV交联。通过体外转录来自候选启动子区的DNA片段制备探针。在UltraHyb杂交溶液(Ambion,Austin,TX)中根据厂商指导在42℃过夜进行杂交。杂交后，膜在具有0.1％SDS的2X SSC中洗涤，用BioMax MS胶片(Kodak)分析。

实施例8

当与TMM启动子DNA片段共表达时SDC启动子片段(-274至-2,004)增强TMM的转录基因沉默(TGS)

Too Many Mouths(TMM)编码富含亮氨酸的重复受体样蛋白质，其在增殖性后原表皮层细胞(proliferative post protodermal cell)中表达。其能够感应位置提示(positional cues)并且控制最小的单细胞气孔间隔模式。TMM的破坏将导致形成气孔簇(tmm突变体表型)，其在子叶中清晰可见(Yang et al.,1995)。TMM启动子序列的发夹结构(-9至-483)的过表达能够有效沉默TMM，表明这个基因座是转录基因沉默(TGS)研究的良好候选者。当过表达TMM启动子的有义链(-9至-483)时，仅观测到弱tmm突变体表型，外显率低。我们使用这个弱TGS系统筛选能增强TGS的序列。

在拟南芥基因组中，许多DNA基因座被较高水平内源性24nt siRNA沉默，这些基因座重度甲基化。这些基因座之一是SUPPRESSOR OF ddc(SDC)的启动子，其编码未知功能的F-box蛋白。SDC在WT中是沉默的，在ddc突变体中被重新激活250倍以上，其中不对称DNA甲基化被消除(Henderson et al.,2008)。为测试这个基因座是否含有可以促进TGS的序列，我们克隆了来自SDC的启动子区的1,731-bp DNA片段(-274至-2,004；转录起始位点是+1,图1)，并且融合于TMM启动子DNA片段(-9至-483；转录起始位点是+1)的5’末端。4个构建体pBA/PTMM-S、pBA/PSDC-PTMM-S、pKGWFS7/PTMM-S和pKGWFS7/PSDC-PTMM-S被转化进拟南芥中。注意pBA/PTMM-S和pBA/PSDC-PTMM-S含有35s启动子，而pKGWFS7/PTMM-S和pKGWFS7/PSDC-PTMM-S不具有任何启动子。在显微镜下评估转基因植物的成簇气孔表型(tmm)。在WT中，气孔由间插表皮细胞隔开(图2a)。在PTMM-S植物中，3或4个气孔成簇定位(图2b)。在PSDC-PTMM-S植物中，成簇气孔表型比PTMM-S植物更严重(图2c，2d)。用2周龄幼苗评估表型外显率(表1)。在T1代中，PTMM-S植物无一显示任何tmm表型，而PSDC-PTMM-S转基因植物显示tmm突变体表型，外显率18.8％。在T2代中，每个品系检查了在选择培养基上生长的4-8个幼苗，每个构建体分析了总共24个品系。具有PTMM-S的转基因幼苗显示12.5％的外显率，其在PSDC-PTMM-S植物中增加至50.5％。在pKGWFS7/PTMM-S和pKGWFS7/PSDC-PTMM-S植物的T1或T2代中未观测到成簇气孔表型，其中这些DNA序列上游未放置启动子。这些结果表明PSDC当与TMM启动子DNA片段共表达时能够促进成簇气孔表型。

表1

表型外显率

实施例9

SDC启动子不具有其直接重复时更有效增强成簇气孔表型

SDC启动子含有7个直接重复(DR)，位于SDC转录起始位点上游-296至-518位置。这个DR区含有更高水平的相关24nt siRNA，其被推测介导重度DNA甲基化(Henderson et al.,2008)。因此，DR序列可能导致TMM基因座的TGS的增强。为测试这个假说，SDC启动子DR区(PSDC8,图1)和不具有DR的SDC启动子序列(PSDC1,图1)被克隆并分别融合于PTMM-S以产生两个新构建体pBA/PSDC8-PTMM-S和pBA/PSDC1-PTMM-S。这两个构建体被转化进拟南芥以产生稳定的转基因植物。在T1和T2代中评估成簇气孔表型。表2示出在T1代中，50个携带PSDC8-PTMM-S的独立品系中无一显示成簇气孔表型。相反，PSDC-PTMM-S和PSDC1-PTMM-S植物产生外显率分别为18.8％和50％的tmm突变体表型。在T2代中，PSDC1-PTMM-S植物显示与PSDC-PTMM-S植物(50.5％)相比更高的外显率(87.5％)。DR区看起来在TGS中起负面作用，因为PSDC8-PTMM-S植物的外显率(4.2％)甚至低于PTMM-S植物(12.5％)。这些结果表明具有或不具有DR的SDC启动子序列均能通过增强TGS而增加tmm突变体表型的外显率。另外，不具有DR的SDC启动子序列更有效，DR区具有抑制作用。

表2

表型外显率

实施例10

成簇气孔表型由TMM基因座的TGS导致

为检查tmm突变体成簇气孔表型与TMM mRNA水平的关系，从具有或不具有表型的PTMM-S和PSDC1-PTMM-S植物的一些T2品系的2周龄幼苗制备RNA。总RNA中的TMM mRNA水平经实时PCR检查。图3示出在PTMM-S植物中，与不具有任何tmm表型的品系(品系#23,#2,#4,#6和#20)相比，具有tmm表型的品系(品系#1,#16)表达低得多的TMM mRNA水平。用PSDC1-PTMM-S植物获得类似结果。这些结果表明成簇气孔表型与较低的TMM mRNA表达水平相关。

在启动子区增加的DNA甲基化通常被认为是TGS的特点(Aufsatz et al.,2002)。为确定成簇气孔是否与TMM启动子DNA甲基化相关，我们分析了PTMM-S和PSDC1-PTMM-S植物的T3品系。不具有tmm表型的转基因植物用作对照。在所有4种测试的具有表型的品系(PTMM-S品系#1,#16及PSDC1-PTMM-S品系#4,#9)中，在TMM启动子区所有CG、CHG(H代表A、C或T)和CHH DNA甲基化均显著增加。相反，不展示任何表型的转基因品系(PTMM-S品系#6,#20及PSDC1-PTMM-S品系#12,#22)显示WT DNA甲基化水平(图4b和4c)。

为确定在TMM启动子区观察到的DNA甲基化的改变是否伴有组蛋白修饰中的改变，我们使用染色质免疫沉淀(ChIP)测定研究活化标记的H3乙酰化和H3K4三甲基化，及阻抑标记的H3K9me2、H3K9me3和H3K27me3。设计2个引物对以研究内源性TMM基因座的启动子和编码区(图5a)。在两个阳性品系(PSDC1-PTMM-S品系#4,#9)中的TMM启动子区观测到与阴性品系(PSDC1-PTMM-S品系#12)和WT植物相比活化标记H3K9/14Ac和H3K4me3的显著降低(图5b和5c)。对于染色质阻抑标记，阳性转基因植物品系显示在TMM启动子的水平高于阴性转基因植物品系和WT(图5d-5f)。在TMM编码区，在所有测试品系和WT之间对于任何染色质修饰没有明显差异(图5b-5f)。

具有更低TMM mRNA水平、更高DNA甲基化、更低水平活化染色质修饰标记和更高水平阻抑染色质标记的阳性转基因植物证实转基因植物中的tmm表型是TMM基因座的TGS的结果。

实施例11

SDC启动子序列促进siRNA产生

小RNA特别是24nt siRNA被插入Ago4复合物中，所述复合物指导靶向基因组基因座的从头DNA甲基化。siRNA的丰度与SDC启动子的上游区相关，提示其可能含有有利于siRNA产生的一些特征。增加siRNA产生的能力可以解释其作为TGS增强子的功能。为测试这个假说，携带构建体pBA/PTMM-S、pBA/PSDC-PTMM-S、pBA/PSDC1-PTMM-S或pBA/PSDC8-PTMM的农杆菌浸润到烟草叶中。用每种构建体浸润两个叶子，PAT(膦丝菌素乙酰转移酶)的mRNA用作内部对照评估转化效率。浸润后2天从这些叶子中提取总RNA。Northern印迹分析(图6a)显示PTMM相关的siRNA在用PSDC1-PTMM-S浸润的叶子中以高水平表达，但是在用PTMM-S浸润的叶子中以较低水平表达。在PSDC8-PTMM-S叶子中，没有PTMM相关的siRNA的表达或者表达水平非常低。这些结果显示不具有直接重复的SDC启动子(PSDC1)可以增强PTMM相关的siRNA产生，但是直接重复(PSDC8)起抑制作用。比较PTMM相关的siRNA水平和成簇气孔表型外显率(图2a-2d)，我们发现两者之间的直接相关性。因此，促进siRNA产生是SDC启动子序列作为在TMM基因座的TGS增强子的至少一个重要原因。还通过northern印迹分析了一些表达PTMMS或PSDC1-PTMM-S的T2拟南芥稳定转基因品系(图6b和6c)。结果证实PSDC1-PTMM植物与PTMM-S转基因植物相比表达高水平的PTMM相关的siRNA。

实施例12

大部分PTMM相关的siRNA是24个核苷酸(24nt)

有良好证据表明TGS可以用smRNA通过RdDM诱导，所述smRNA大多数是24-26nt，来自外源/内源双链反向重复(IR)RNA(Wassenegger et al.,1994；Mette et al.,2000；Hamilton et al.,2002)。另一方面，更短的smRNA种类(21-22nt)主要介导具有序列同源性的靶RNA的降解，导致转录后基因沉默(PTGS)(Hamilton et al.,2002；Vaucheret,2006)。为研究阳性转基因植物的小RNA特征，来自PTMM-S、PSDC1-PTMM、PTMM-AS和PTMM-IR阳性品系的小RNA被测序，总读数总结在表3中。每个样品我们获得了大约3千万个总读数(read)，具有20-25nt长度的小RNA被详细分析。大部分小RNA长度是24nt(图7a)，表明PTMM相关的siRNA与TMM基因座的TGS的相关性。小RNA的第一个碱基优选是A(图7c)，有利于它们掺入Ago4复合物(Mi et al,2008)。我们还发现小RNA主要来自负链(图7b)。TMM基因座上的小RNA分布分析(图8a-8d)表明不存在相应于TMM编码区的小RNA，证实tmm突变体表型是由TGS导致的。

表3

	总读数	独特读数	独特读数(19-28nt)
				WT	29,942,636	8,656,293	5,723,487
35S::PSDC1-PTMM-S	33,447,020	10,168,998	5,937,487
				35S::PTMM-S	26,970,285	7,982,744	5,125,099
35S::PTMM-AS	29,520,225	8,749,079	4,824,961
				35S::PTMM-IR	30,510,016	9,204,333	5,126,612

实施例13

SDC启动子5’区对于促进siRNA产生是关键的

不具有直接重复(DR)的SDC启动子能增强PTMM相关的siRNA产生这一观察结果提示DR序列上游存在siRNA产生增强子。为研究这个DNA序列，根据来自Anno-J:Arabidopsis epigenome maps website的小RNA和DNA甲基化信息将SDC启动子分成5个区域(图8a-8d)。DR序列产生丰富的与WT中的严重DNA甲基化相关的小RNA，所述严重DNA甲基化在ddc突变体中不存在。位于DR上游的串联重复(TR)产生在WT和突变体之间类似水平的小RNA和DNA甲基化。B区和C区在WT中含有DNA甲基化峰，所述峰在met1突变体中不存在。在A区中，与在WT中相比在rdd突变体中的小RNA水平急剧增加。通过从SDC启动子的5’或3’末端除去系列序列(图1)而设计的截短的PSDC片段被克隆并融合于PTMM-S的5’末端以产生下述构建体：pBA/PSDC-PTMM-S、pBA/PSDC1-PTMM-S、pBA/PSDC2-PTMM-S、pBA/PSDC3-PTMM-S、pBA/PSDC4-PTMM-S、pBA/PSDC5-PTMM-S、pBA/PSDC6-PTMM-S、pBA/PSDC7-PTMM-S和pBA/PSDC8-PTMM-S。

使用从用携带这些构建体的农杆菌浸润的烟草叶提取的总RNA，经northern印迹分析PTMM相关的siRNA。这些构建体的选择标记PAT的mRNA水平用作内部对照监测烟草叶转化效率。图10示出这些PSDC截短的构建体可以根据PTMM相关的siRNA水平分成两组。在第一组(图10，左边第2-6泳道)中PTMM相关的siRNA表达高于PTMM-S对照(图10，左边第一泳道)，但在第二组(图10，左边第7-10泳道)中的表达低于PTMM-S对照。这些结果表明siRNA产生增强子在第一组中而不在第二组中。根据截短的SDC启动子信息(图1)，所有第一组构建体均含有SDC启动子5’区序列(A区)，其在第二组中不存在。因此，A区促进siRNA产生。为进一步证实这点，我们还分析了DR相关的siRNA产生(图10)。有5个构建体(pBA/PSDC-PTMM-S、pBA/PSDC5-PTMM-S、pBA/PSDC6-PTMMS、pBAPSDC7-PTMMS和pBA/PSDC8-PTMM-S)含有DR序列。只有具有A区的构建体(pBA/PSDC-PTMM-S)表达高水平的DR相关的siRNA。所有其它构建体(不具有A区)不产生或者产生非常低水平的DR相关的siRNA。

实施例14

SDC启动子A区能够促进其它DNA片段的siRNA产生

SDC启动子的A区序列可以增强PTMM相关的siRNA产生。我们想要知道这种促进功能是否也适用于其它基因座。为解决这个问题，克隆TMM启动子反义DNA片段(-9至-483；转录起始位点是+1)并融合到不同截短的PSDC序列的3’末端以产生pBA/PTMM-AS、pBA/PSDC-PTMM-AS、pBA/PSDC3-PTMM-AS和pBA/PSDC7-PTMM-AS。所有这些构建体均转化进烟草叶用于Northern印迹分析。在这个实验中，两个叶子用每种构建体浸润，并使用PAT的mRNA水平作为内部对照评估转化效率。PTMM-AS相关的siRNA在PSDC3-PTMM-AS(具有A区)叶子中以比在PTMM-AS叶子中更高的水平表达。这个结果表明A区能够增强与TMM启动子反义DNA片段相关的siRNA的产生(图11a)。结果还表明不具有A区的DR(PSDC7)显示对PTMM-AS相关的siRNA产生的负面效果。类似实验在CH42启动子DNA片段(-40至-515；转录起始位点是+1)中进行。PCH42相关的siRNA在PSDC4-PCH42(具有A区)叶子中以高水平表达，但是在PCH42叶子中不是这样(图11b)。克隆FAD2启动子序列(-28至-1,065；转录起始位点是+1)并且融合在PSDC3(A区)的3’末端以得到pBA/PFAD2和pBA/PSDC3-PFAD2构建体。这两个构建体转化进拟南芥以产生稳定的转基因品系。使用2周龄幼苗进行northern分析。每个构建体随机选择12个品系。Northern印迹结果(图11c和11d)表明PFAD2相关的siRNA在pBA/PSDC3-PFAD2转基因品系中也更高。

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Claims (20)

1.分离的沉默增强子，其包含SEQ ID NO:6所示核苷酸序列。

2.权利要求1的分离的沉默增强子，其中所述沉默增强子在3’末端还包含1-1342个SEQ ID NO:1所示的连续核苷酸。

3.权利要求1的分离的沉默增强子，其中所述沉默增强子包含SEQ IDNO:5所示核苷酸序列。

4.权利要求1的分离的沉默增强子，其中所述沉默增强子包含SEQ IDNO:4所示核苷酸序列。

5.权利要求1的分离的沉默增强子，其中所述沉默增强子包含SEQ IDNO:3所示核苷酸序列。

6.权利要求1的分离的沉默增强子，其中所述沉默增强子包含SEQ IDNO:18所示核苷酸序列。

7.包含植物可操作启动子的核酸构建体，所述植物可操作启动子与包含权利要求1-6任一项的沉默增强子的核酸分子可操作地连接。

8.权利要求7的核酸构建体，其中所述植物可操作启动子是异源植物可操纵启动子。

9.权利要求7或8的核酸构建体，还包含核酸沉默子分子，所述核酸沉默子分子与包含所述沉默增强子的核酸分子可操作地连接。

10.一种转基因植物细胞，其包含稳定整合在其基因组中的权利要求9的核酸构建体。

11.一种转基因植物，其包含稳定整合在其基因组中的权利要求9的核酸构建体。

12.一种制备转基因植物的方法，所述转基因植物具有对感兴趣的基因更有效的基因沉默，所述方法包括将权利要求9的核酸构建体导入植物中，其中所述转基因植物具有稳定整合在其基因组中的所述核酸构建体。

13.一种制备转基因植物的方法，所述转基因植物具有对感兴趣的基因更有效的基因沉默，所述方法包括将权利要求9的核酸构建体转染进一或多个植物细胞中，并从转染的一或多个植物细胞再生转基因植物，其中所述转基因植物具有稳定整合在其基因组中的所述核酸构建体。

14.一种增强植物细胞中植物基因的基因表达降低的方法，包括在适于核酸沉默子分子表达的条件下培养权利要求10的转基因植物细胞，从而相对于不包含所述沉默增强子的相应转基因植物细胞，植物基因的降低的表达被增强。

15.一种增强植物中植物基因的基因表达降低的方法，包括在适于核酸沉默子分子表达的条件下生长权利要求11的转基因植物，从而相对于不包含所述沉默增强子的相应转基因植物，植物基因的降低的表达被增强。

16.一种增强植物细胞中植物基因的基因表达降低的方法，包括

用权利要求9的核酸构建体转化植物细胞，以产生具有稳定整合在其基因组中的核酸构建体的转基因植物细胞，及

在适于核酸沉默子分子表达的条件下培养所述转基因植物细胞，从而相对于不包含所述沉默增强子的相应转基因植物细胞，植物基因的降低的表达被增强。

17.一种增强植物中植物基因的基因表达降低的方法，包括

用权利要求9的核酸构建体转化植物细胞，以产生具有稳定整合在其基因组中的核酸构建体的转基因植物细胞，

从转基因植物细胞再生转基因植物，其中转基因植物具有稳定整合在其基因组中的所述核酸构建体，及

在适于核酸沉默子分子表达的条件下生长所述转基因植物，从而相对于不包含所述沉默增强子的相应转基因植物，植物基因的降低的表达被增强。

18.一种鉴别可用于在植物中更有效地沉默感兴趣的基因的推定的沉默增强子的方法，所述方法包括：

(a)用第一种核酸构建体转化第一种植物细胞，所述第一种核酸构建体包含与核酸可操作地连接的植物可操作启动子，所述核酸包含与核酸沉默子分子可操作地连接的推定的沉默增强子；

(b)用第二种核酸构建体转化第二种植物细胞，所述第二种核酸构建体包含与核酸沉默子分子可操作地连接的植物可操作启动子；

(c)确定第一种转化的植物细胞及第二种转化的植物细胞中的基因沉默水平；及

(d)如果第一种转化的植物细胞比第二种转化的植物细胞中的基因沉默水平高，则鉴别推定的沉默增强子是沉默增强子。

19.权利要求18的方法，其进一步包括：

(a1)在适于推定的沉默增强子和核酸沉默子分子表达的条件下培养第一种转化的植物细胞，及

(b1)在适于核酸沉默子分子表达的条件下培养第二种转化的植物细胞。

20.权利要求18的方法，其进一步包括：

(a1)从第一种转化的植物细胞再生第一种转化的植物，其中第一种转化的植物包含第一种核酸构建体；

(a2)在适于核酸沉默子分子在第一种转化的植物的细胞中表达的条件下生长第一种转化的植物；

(b1)从第二种转化的植物细胞再生第二种转化的植物，其中第二种转化的植物包含第二种核酸构建体；及

(b2)在适于核酸沉默子分子在第二种转化的植物的细胞中表达的条件下生长第二种转化的植物。