CN106148330A - 一种ChIP实验中鸡卵巢组织超声破碎的方法 - Google Patents

一种ChIP实验中鸡卵巢组织超声破碎的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106148330A
CN106148330A CN201610808518.7A CN201610808518A CN106148330A CN 106148330 A CN106148330 A CN 106148330A CN 201610808518 A CN201610808518 A CN 201610808518A CN 106148330 A CN106148330 A CN 106148330A
Authority
CN
China
Prior art keywords
chip
ovary
nucleus
tissue
broken
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201610808518.7A
Other languages
English (en)
Inventor
姜运良
郭淼
陈欣
陈玉霞
康丽
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shandong Agricultural University
Original Assignee
Shandong Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shandong Agricultural University filed Critical Shandong Agricultural University
Publication of CN106148330A publication Critical patent/CN106148330A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N13/00—Treatment of microorganisms or enzymes with electrical or wave energy, e.g. magnetism, sonic waves

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种ChIP实验中鸡卵巢组织超声破碎的方法；是对鸡卵巢组织不必进行组织均一化处理，也不适合使用核酸酶消化，用一定比例的交联液、细胞裂解液、细胞核抽提液和细胞核裂解液处理一定的时间后，使用Diagenode公司开发生产的非接触式全自动超声破碎仪(BioruptorTM UCD‑200)，通过设置合适的时间和强度，可得到完全保持蛋白活性、长度适中的染色质片段，不仅方法简便快速，而且不受环境影响，得到的染色质片段完全可以满足ChIP‑qPCR、ChIP‑seq等研究的要求。

Description

一种ChIP实验中鸡卵巢组织超声破碎的方法
技术领域
本发明涉及分子遗传学领域，具体涉及了ChIP实验中一种鸡卵巢组织超声破碎的方法，通过特定的细胞裂解液、细胞核抽提液以及细胞核裂解液破碎组织，再超声破碎染色质，使其在保持DNA结合蛋白活性的前提下达到ChIP实验所要求的200bp-500bp的范围，并用该产物成功地实施了ChIP-qPCR和ChIP-seq实验。
背景技术
随着人类基因组测序工作的基本完成，功能基因组学的研究逐渐成为研究的热点。而基因表达的调控又是功能基因组学的一个重要研究领域。研究某个蛋白因子的调控功能，可以通过对蛋白活性(激活或抑制其活性)、蛋白表达量(过表达Overexpression或基因缺陷型Knock out)以及蛋白功能(功能缺陷型蛋白Dominant-negative mutation)的控制，影响下游基因的表达，而下游基因的变化又可以通过基因芯片(cDNA Microarray)，抑制消减杂交(Suppression Subtractive Hybridization)，差异显示RT-PCR等方法进行研究(王春雨等，2005)。然而这些方法都无法提供证据证明这些变化到底是受某个蛋白因子的直接调节还是间接的由其他变化所导致。所以，要想提供蛋白因子直接调控的证据，就要直接检测蛋白质-DNA的相互作用。传统的方法包括转录因子结合实验(TranscriptionFactor Assay)，电泳迁移率变动分析(electrophoretic mobility shift assay)，DNaseI足印法(DNase I footprinting)，酵母单杂交系统等。但这些方法都有一定的局限性，不能充分反映生理情况下DNA与蛋白相互作用的真实情况，而且很难捕捉到在染色质水平上基因表达调控的动态瞬时事件(H Im et al.,2004)。
染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation，ChIP)是基于体内分析发展起来的方法，是研究生物细胞内蛋白质与DNA相互作用的有力工具，通常用于转录因子(transcriptionfactor,TF)与启动子(promoter)结合位点或组蛋白特异性修饰位点的研究。其基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物，并通过超声或酶处理将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过抗原抗体的特异性识别反应沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白所结合的DNA片段，再通过对目的片断的纯化与检测，最终获得蛋白质与DNA相互作用的信息。
ChIP分析中固定活细胞或者组织的方法是甲醛固定，细胞内，当转录因子与启动子相互结合(生物意义上的结合)时，它们必然靠的比较近，或者契合在一起，这个时候用甲醛处理，能使它们之间产生共价键，因此能真实、完整地反映结合在DNA序列上的调控蛋白，是目前确定与特定蛋白结合的基因组区域或确定与特定基因组区域结合的蛋白质的一种很好的方法。ChIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。目前ChIP与其他方法的广泛结合，更是扩大了其应用范围：ChIP与基因芯片相结合建立的CHIP-on-chip方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选；ChIP与体内足迹法相结合，用于寻找反式因子的体内结合位点；RNA-ChIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用；ChIP与深度测序技术相结合(ChIP-Seq)，是用来分析全基因组范围内DNA结合蛋白结合位点、组蛋白修饰、核小体定位或DNA甲基化的高通量方法，可以应用到任何基因组序列已知的物种，并能确切得到每一个片段的序列信息。
目前，ChIP研究多以细胞系或从组织分离培养所得的细胞为材料(Mazumdar A etal.,2001；Oh SW et al.,2006；Kawazu M et al.,2011)，但离体培养的细胞无法完全模拟体内细胞相应的生理状态，无法排除细胞培养过程对基因表达及其调控产生的影响。虽然已有直接将组织作为ChIP材料、避免细胞培养可能产生的潜在影响的报道(Filant.J etal.,2014)，但由于使用生物组织进行ChIP试验中材料前期处理要求条件高、破碎难度大等原因，目前有关组织ChIP方法远不及以细胞ChIP方法成熟，相关研究报道也较少，同时急需进一步研究完善适合不同组织的ChIP方法。另外，相对于肝脏、脾脏等组织，卵巢组织细胞密度较小，加上含有大量膜细胞、富有网状纤维的结缔组织等特点，破碎起来难度尤其大。
根据现有技术，发明人先后按照EpiQuik公司生产的组织ChIP试剂盒(P-2003-2)和Millipore公司生产的组织ChIP试剂盒(No.17-20000)说明书提供的方法在宁波新芝生物科技有限公司生产的超声波细胞粉碎机(92-ⅡN)上进行鸡卵巢组织破碎，但由于超声法断裂染色质过程中产生的泡沫、积热以及接触式超声波破碎仪超声效果可重复性差等原因，虽多次反复调整、几乎尝试了各种超声条件，均未在蛋白发生变性前将DNA片段断裂在100～500bp之间(附图1)。然后又应用微球菌核酸酶(Micrococcal nuclease)消化法来尝试破碎鸡卵巢组织染色质，虽得到少部分符合实验要求的染色质，但总体效率太低(附图2)，加上考虑到该法适用范围较窄(主要适用于组蛋白的ChIP实验，由于转录因子与DNA的结合较弱又缺乏规律性，不适合此法)，故此法也不适用于ChIP实验的鸡卵巢组织的破碎。
发明内容
基于上述原因，本发明在用不同方法多次尝试对鸡卵巢组织进行破碎的基础上，摸索出一整套针对鸡卵巢组织、适用于ChIP试验的染色质最佳超声破碎方法，可得到完全保持蛋白活性、长度适中的染色质片段，为使用该组织进行ChIP-qPCR、ChIP-seq等实验研究提供了技术保障。
发明者进一步优化了细胞裂解液、细胞核抽提液以及细胞核裂解液的配方，换用比利时Diagenode公司开发生产的非接触式全自动超声破碎仪(BioruptorTMUCD-200)，经多次调整超声条件，最终获得了理想的染色质片段(附图3)。然后以雌激素受体alpha(estrogen receptor，ERα)为目的蛋白，经ChIP-qPCR证实，得到了富集有ERα靶序列的DNA片段，且样品质量达到华大公司对ChIP样品的测序要求；华大公司测序分析结果显示，利用改进后的ChIP方法获得的样品数据背景干净、峰形显著、重复性高(附图4-6)，可满足ChIP-seq要求。
该操作需要准备如下试剂：终浓度为1％的甲醛交联液；90％乙醇、70％乙醇；1.25M甘氨酸溶液；1M Tris-HCl(PH8.0)；1M Tris-HCl(PH8.0)；1M MgCl2；2M蔗糖；10％SDS；0.5M EDTA(PH8.0)；14.3Mβ-ME(β-巯基乙醇)；蛋白酶抑制剂(PIC)；细胞裂解液。
其具体操作步骤如下：
1.配制细胞核抽提液和细胞核裂解液
(1)细胞核抽提液，加14.3M的β-ME 35μL、1M的Tris-HCl(PH8.0)1mL、1M的MgCl21mL、2M的蔗糖20mL，最后用双蒸水定容至100mL，4℃保存。
(2)细胞核裂解液，加0.5M的EDTA(PH8.0)1mL、1M的Tris-HCL(PH8.0)2.5mL、10％的SDS 5mL,最后用双蒸水定容至50mL，4℃保存。
2.组织交联
(1)将鸡卵巢组织样品取出，迅速进行前期处理。
(2)处理后立刻进行组织匀浆。按组织与交联液体积40:1的比例加交联液，摇床室温孵育10min。
(3)按交联液与甘氨酸(1.25M)9：1的比例加甘氨酸终止交联。
(4)用0～4℃的PBS清洗后，离心并弃上清。
3.裂解细胞和DNA剪切
(1)加细胞裂解液(包含0.5％的蛋白酶抑制剂混合物PIC)重悬分解了的组织(按20mg组织100μL/的比例)，冰上孵育10min，间或振荡。
(2)离心并弃上清，沉淀中加细胞核抽提液(含0.5％PIC)，混匀，置冰上5min。
(3)离心并弃上清，沉淀中加细胞核裂解液(含0.5％PIC)，分装至1.5mL离心管(每管约200-300μL)。
(4)超声破碎DNA。将上述离心管在Diagenode公司出产的UCD-200型非接触式全自动超声破碎仪中固定好，高档位上设置超声频率为每次30s、间隔30s，共时长30min。(注意：整个超声破碎的过程中要保持样品处于0℃冰水中，最好用循环制冷装置，如若没有，则最长每5分钟更换一次冰水，以维持低温环境；交联的DNA破碎的条件可根据组织和所用的仪器适当调整。)
(5)离心并去除不溶的物质，将上清液移至新管，-80℃保存或者立即进行ChIP实验。
附图说明
图1为普通超声波法破碎鸡卵巢组织后的染色质片段电泳图，由图可看出破碎效果未达到ChIP实验要求；
图2为微球菌核酸酶消化法破碎鸡卵巢组织后的染色质片段电泳图，由图可看出破碎效果未达到ChIP实验要求；
图3为利用改进后的超声波法破碎鸡卵巢组织后的染色质片段电泳图，由图可看出破碎效果完全满足ChIP实验要求；
图4为利用改进后的ChIP方法获得的45D鸡卵巢组织ChIP后DNA样品质量检测数据，由图可看出破碎后的DNA样品质量优；
图5为利用改进后的ChIP方法获得的90D鸡卵巢组织ChIP后DNA样品质量检测数据，由图可看出破碎后的DNA样品质量优；
图6为利用改进后的ChIP方法获得的160D鸡卵巢组织ChIP后DNA样品质量检测数据，由图可看出破碎后的DNA样品质量优；
图7为Western blot检测ERα蛋白在不同发育时期的海兰褐蛋鸡卵巢组织中的表达，由图可看出ERα蛋白表达量在45D时较高，到90D时下调至最低，160D时又上调至最高；
图8为ChIP-qPCR检测在45d海兰褐鸡卵巢组织中，ERα在CTNNA3、FAM26E、LARGE基因调控区的富集情况，由图可看出45D时作为转录因子的ERα蛋白在上述三个基因的调控区存在明显富集；
图9为ChIP-qPCR检测在90d海兰褐鸡卵巢组织中，ERα在CTNNA3、FAM26E、LARGE基因调控区的富集情况，由图可看出90D时作为转录因子的ERα蛋白在上述三个基因的调控区存在富集但不如45D、160D时富集量显著，与Western blot检测结果一致；
图10为ChIP-qPCR检测在160D海兰褐鸡卵巢组织中，ERα在CTNNA3、FAM26E、LARGE基因调控区的富集情况，由图可看出160D时作为转录因子的ERα蛋白在上述三个基因的调控区存在明显富集，与Western blot检测结果一致；
图11为90D、160D海兰褐鸡各3只的卵巢组织超声破碎后的染色质片段电泳图，由图可看出破碎效果完全满足ChIP实验要求；
图12为ChIP-qPCR检测90D、160D海兰褐鸡卵巢组织中组蛋白H3二、三甲基化在第一对引物覆盖区域中富集情况，由图可看出二、三甲基化的组蛋白H3在ERα基因调控区的该区段存在明显富集，但在这两个时期之间没有明显差异；
图13为ChIP-qPCR检测90D、160D海兰褐鸡卵巢组织中组蛋白H3二、三甲基化在第二对引物覆盖区域中富集情况，由图可看出二、三甲基化的组蛋白H3在ERα基因调控区的该区段存在明显富集，但在这两个时期之间没有明显差异。
图14为ChIP-qPCR检测90D、160D海兰褐鸡卵巢组织中组蛋白H3二、三甲基化在第三对引物覆盖区域中富集情况，由图可看出二、三甲基化的组蛋白H3在ERα基因调控区的该区段存在明显富集，但在这两个时期之间没有明显差异。
具体实施方式
在本说明书的上下文中，除非特别指明,否则本说明书所用的任何术语具有本领域技术人员在本领域中通常理解的含义，而未注明详细条件的实验方法是按照常规试验方法或按照供应商所建议的操作说明书进行的。
实施例1 鸡卵巢中雌激素受体α(ERα)诱导表达基因的筛选
根据前期研究结果(附图7)，选取ERα蛋白表达差异显著的45D、90D和开产后的160D的海兰褐蛋鸡卵巢作为材料，采用针对ERα蛋白多克隆抗体的ChIP-seq方法，筛选在鸡卵泡发育过程中受ERα诱导表达的基因。
1.试验动物和材料预处理
发育正常的未开产45D、90D和开产后160D(规律产蛋两周以上)的海兰褐商品蛋鸡(山东省泰安市赵家庄养鸡场)各3只，颈椎脱臼法处死，取完整的卵巢组织，迅速在冰冷的磷酸缓冲液中冲洗干净。
2.试验方法
2.1组织交联、细胞裂解、染色质超声波破碎、染色质免疫共沉淀、高通量测序(1)配制如下试剂；保证所有的溶液都是无菌的，若溶液有沉淀，可摇晃或漩涡。终浓度为1％的甲醛交联液，室温保存；90％乙醇、70％乙醇，室温保存；1.25M甘氨酸溶液，用0.22um滤网过滤，4℃保存；1M Tris-HCl(PH8.0)，高温高压灭菌，室温保存；1M MgCl2，高温高压灭菌，室温保存；2M蔗糖，高温高压灭菌，室温保存；10％SDS,10gSDS溶于90ml水中，加热至68℃，磁力搅拌器搅拌辅助溶解，加HCl调PH至7.2，加水定容至100ml；0.5M EDTA(PH8.0),加18.61gNa2EDTA·2H2O至80ml水中，磁力搅拌机中剧烈搅拌，用约2g NaOH调PH值至8.0，用水定容至100ml，高温高压灭菌，室温保存；14.3Mβ-ME(β-巯基乙醇)，室温保存；蛋白酶抑制剂(PIC),购自Millipore公司；细胞裂解液，购自Fermentas公司；细胞核抽提液，加14.3M的β-ME 35μL、1M的Tris-HCl(PH8.0)1mL、1M的MgCl21mL、2M的蔗糖20mL，最后用双蒸水定容至100mL，4°C保存；细胞核裂解液，加0.5M的EDTA(PH8.0)1mL、1M的Tris-HCL(PH8.0)2.5mL、10％的SDS 5mL,最后用双蒸水定容至50mL，4℃保存。
(2)组织交联
1)将每时期3只鸡的卵巢组织剪碎后混池，置60mm培养皿。去除脂肪、坏死的组织等不用的部分。将组织称重并用刀片或剪刀切成1-2mm3的小块。
2)移组织至15mL离心管。每40mg组织加1mL交联液，摇床室温孵育15-20min。
3)每9mL交联液加1mL甘氨酸(1.25M)溶液，使甘氨酸的终浓度为0.125M，混匀，800rpm离心5min,弃上清。用10mL冰冷的PBS清洗，800rpm离心5min,弃上清。
4)移组织小块至匀浆器。每200mg组织加1mL Homogenizing Buffer，通过10-20下匀浆使组织破碎。
5)移均质混合液至15mL离心管，3000rpm、4℃离心5min。如果混合物总量不超过2mL,移混合物至2mL离心管，5000rpm、4℃离心5min。弃上清。
6)用0～4℃的PBS清洗，10000rpm、4℃离心5min。弃上清。
(3)裂解细胞和DNA剪切
1)加细胞裂解液(包含0.5％蛋白酶抑制剂混合物PIC)重悬分解了的组织(每1mL细胞裂解液加10μL PIC)(100μL/20mg组织)。将悬浮液移至1.5mL离心管(每管500μL混合液)，冰上孵育10min，间或振荡。
2)5000rpm、4℃离心10min。弃上清。
3)加细胞核抽提液(含0.5％PIC)(100μL/20mg组织)，轻翻混匀，置冰上5min。
4)5000rpm、4℃离心20min。弃上清。
5)加细胞核裂解液(含0.5％PIC)(100μL/20mg组织)，分装至1.5ml离心管(每管约200-300μL)，准备超声破碎。
6)超声破碎DNA。将上述离心管在Diagenode公司出产的UCD-200型非接触式全自动超声破碎仪中固定好，调至高档位，设置超声频率为每次30s、间隔30s，整个破碎过程保持样品处于0℃冰水中,共破碎时长30min。
7)14000rpm、4℃离心10min，去除不溶的物质，将上清液移至新管，取其中2μL跑琼脂糖凝胶电泳初步检测，大部分DNA的长度应在200-500bp之间；其余上清液可直接用于ChIP实验或-80℃保存。
(4)ChIP实验
抗体采用订制的鸡anti-ERα(GenScript公司)；由于前期处理中使用了SDS，为避免影响蛋白质高级结构，染色质样品需进行至少10倍稀释。其他步骤按照Millipore公司生产的组织ChIP试剂盒(No.17-20000)说明书进行染色质免疫共沉淀、蛋白质-DNA解交联以及DNA提纯。
将获得的DNA送至深圳华大基因科技服务有限公司进行高通量测序。
2.2ChIP-qPCR扩增验证测序结果
根据华大基因的检测报告，选择受ERα调控的下游基因CTNNA3、FAM26E、LARGE，分别以45D、90D、160D的海兰褐鸡卵巢组织中针对ERα蛋白的ChIP产物为模板，做qPCR来验证测序结果。
2.2.1引物设计
根据已发表红色原鸡序列(GenBank Accession NC_006093.4、NC_006090.4、NC_006088.3)设计三对引物P-CTNNA3、P-FAM26E、P-LARGE(其序列详见表1中SEQ ID NO.1～NO.6)，此引物是为验证以ERα为目的蛋白的ChIP实验效果而根据鸡CTNNA3、NGLY1、FAM26E调控区中与ERα结合的序列而特意设计的。
2.2.2qPCR扩增
在Stratagene Mx3000P荧光定量PCR仪上进行。利用Takara试剂盒，反应体系15μL，其中包括1.5μL ChIP后获得的DNA模板(50-100ng)，7.5μL SYBRPremix ExTaq，0.3μLROXⅡ，上下游引物各0.2μL(10μM)，ddH2O补足至15μL。扩增程序：95℃预变性30sec；95℃变性5sec，退火温度30sec，72°C读板20sec，进行40个循环；95℃变性1min，退火温度+2℃30sec，95℃30sec，进行1个循环，收集信号。
表1引物序列和退火温度
3.结果与分析
超声破碎后凝胶电泳分析结果显示，染色质片段长度分布理想，符合ChIP-seq要求(附图3)。
ChIP-seq样品质量检测报告显示，送测序的DNA片段在浓度、纯度、片段大小和分布等方面均符合ChIP-seq要求(表1，附图4-6)。
表1ChIP-seq样品质量检测结果
注：1、浓度检测方法为Qubit Fluorometer；片段分布检测方法为Agilent 2100。
2、A类是指质量满足建库测序要求，且总量可以满足2次或者2次以上建库需要的样品；B类是指质量满足建库测序要求，且总量可以满足1次但不足2次建库需要的样品。
ChIP-qPCR扩增结果显示，海兰褐鸡45D、160D的卵巢中，ERα在CTNNA3、FAM26E、LARGE基因调控区存在明显富集。由于ERα蛋白在90D的海兰褐鸡卵巢中表达量最低，所以在这三个基因调控区的富集程度也最低。由此证明测序结果可靠(附图8-10)。
实施例2 鸡卵巢中ERα基因启动子区H3K4的二、三甲基化水平研究
根据前期研究结果(附图7)，选取ERα蛋白表达差异最为显著的开产前90D和开产后160D的海兰褐蛋鸡卵巢作为材料，采用针对ChIP级小鼠单克隆抗体Anti-Histone H3(di+tri methyl K4)(mAbcam 6000)的ChIP-qPCR方法，研究在ERα蛋白差异表达过程中组蛋白H3的二、三甲基化水平变化。
1.试验动物和材料预处理
发育正常的90D和160D的海兰褐商品蛋鸡(山东省泰安市赵家庄养鸡场)各3只，颈椎脱臼法处死，取完整的卵巢组织，迅速在冰冷的磷酸缓冲液中冲洗干净。
2.试验方法
2.1组织交联、细胞裂解、染色质超声波破碎、染色质免疫共沉淀
具体步骤同实施例1.
2.2qPCR扩增
2.2.1引物设计
根据已发表红色原鸡序列(GenBank Accession NC_006090.4)在ERα基因核心启动子区设计三对引物P-ERα(其序列详见表2中SEQ ID NO.7～NO.12)，此引物是为研究ERα基因启动子区组蛋白修饰水平而特意设计的。
2.2.2qPCR扩增
在Stratagene Mx3000P荧光定量PCR仪上进行。利用Takara试剂盒，反应体系15μL，其中包括1.5μL ChIP后获得的DNA模板(50-100ng)，7.5μLSYBRPremix ExTaq，0.3μL ROXⅡ，上下游引物各0.2μL(10μM)，ddH2O补足至15μL。扩增程序：95℃预变性30sec；95℃变性5sec，退火温度30sec，72°C读板20sec，进行40个循环；95℃变性1min，退火温度+2℃30sec，95℃30sec，进行1个循环，收集信号。
表2引物序列和退火温度
3.结果与分析
超声破碎后凝胶电泳分析结果显示，染色质片段长度分布理想，符合ChIP-qPCR要求。(附图11)
ChIP-qPCR扩增结果显示，海兰褐鸡90D、160D的卵巢中，Histone H3(di+trimethyl K4)存在明显富集；三对引物覆盖区域的组蛋白H3二、三甲基化水平在海兰褐鸡90D、160D的卵巢中没有明显差异，说明ERα基因的表达未受到该位点组蛋白H3二、三甲基化的调控(附图12-14)。

Claims (3)

1.一种鸡卵巢组织超声破碎的方法，其特征在于：该方法是在迅速处理鸡卵巢组织的基础上，通过一定配方和比例的细胞裂解液、细胞核抽提液和细胞核裂解液处理卵巢组织，再通过确定的超声破碎设备、设定确定的破碎时间和强度获得适合ChIP实验的染色质片段。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：具体步骤如下：
(1)细胞核抽提液的配方:14.3M的β-ME 35μL、1M的Tris-HCl(PH8.0)1mL、1M的MgCl21mL、2M的蔗糖20mL，最后用双蒸水定容至100mL，4℃保存；细胞核裂解液的配方：0.5M的EDTA(PH8.0)1mL、1M的Tris-HCL(PH8.0)2.5mL、10％的SDS 5mL,最后用双蒸水定容至50mL，4℃保存；
(2)将获得的新鲜鸡卵巢组织迅速匀浆后立即用甲醛交联液进行DNA-蛋白质的交联(DNA protein crosslinks,DPC)，交联条件为室温下摇床孵育10min；
(3)细胞核抽提液的添加比例为每200mg组织3mL；细胞核裂解液的添加比例为每200mg组织800μL；
(4)用比利时Diagenode公司开发生产的非接触式全自动超声破碎仪(BioruptorTMUCD-200)破碎鸡卵巢组织，高档位下设置超声频率为每次30s、间隔30s，共时长30min。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：确定步骤(1)中交联的时机和处理时间；确定所述步骤(2)中细胞裂解液、细胞核抽提液、细胞核裂解液的配方及其处理鸡卵巢组织适用的浓度；确定步骤(3)中超声破碎的强度、频率以及时间。
CN201610808518.7A 2016-04-27 2016-09-07 一种ChIP实验中鸡卵巢组织超声破碎的方法 Pending CN106148330A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2016102503451 2016-04-27
CN201610250345 2016-04-27

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN106148330A true CN106148330A (zh) 2016-11-23

Family

ID=57341380

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610808518.7A Pending CN106148330A (zh) 2016-04-27 2016-09-07 一种ChIP实验中鸡卵巢组织超声破碎的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106148330A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107254512A (zh) * 2017-06-21 2017-10-17 华中农业大学 一种猪组织染色质免疫沉淀处理方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104781407A (zh) * 2012-09-07 2015-07-15 洛克菲勒大学 植物中内源基因的转录基因沉默
CN104994724A (zh) * 2012-12-18 2015-10-21 洛克菲勒大学 基因沉默

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104781407A (zh) * 2012-09-07 2015-07-15 洛克菲勒大学 植物中内源基因的转录基因沉默
CN104994724A (zh) * 2012-12-18 2015-10-21 洛克菲勒大学 基因沉默

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GENELIBS: "Promiscuous RNA binding by PRC2", 《HTTP://WWW.GENELIBS.COM/GEN/COMMAND/SEARCH/EXPERIMENT/DETAIL/26404》 *
JACK KEILY: "The Systems Biology of the Circadian Control of Freezing Tolerance in Arabidopsis thaliana", 《UNIVERSITY OF EXETER》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107254512A (zh) * 2017-06-21 2017-10-17 华中农业大学 一种猪组织染色质免疫沉淀处理方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Maniati et al. Mouse ovarian cancer models recapitulate the human tumor microenvironment and patient response to treatment
Jänes et al. Chromatin accessibility dynamics across C. elegans development and ageing
Wright et al. ePAD, an oocyte and early embryo-abundant peptidylarginine deiminase-like protein that localizes to egg cytoplasmic sheets
JP2009526543A (ja) 正常および異常遺伝子発現におけるｄｎａの立体構造（ループ構造）
Song et al. In vitro spermatogenesis: A long journey to get tails
Hao et al. Generation of cashmere goats carrying an EDAR gene mutant using CRISPR-Cas9-mediated genome editing
Kittler et al. RNA interference: gene silencing in the fast lane
CN106148330A (zh) 一种ChIP实验中鸡卵巢组织超声破碎的方法
Yan et al. Developmental expression and function of DKKL1/Dkkl1 in humans and mice
Chen et al. Role of a distal enhancer in the transcriptional responsiveness of the human CD200 gene to interferon-γ and tumor necrosis factor-α
Chen et al. Identification and evolutionary analysis of long non-coding RNAs in zebra finch
Moretti et al. Plasmatic membrane toll-like receptor expressions in human astrocytomas
Wang et al. UCHL1 expression and localization on testicular development and spermatogenesis of Chinese giant salamanders
Zhou et al. TRAF6 as the key adaptor of TLR4 signaling pathway is involved in acute pancreatitis
Mizushima et al. Cyclin D1 gene expression is essential for cell cycle progression from the maternal-to-zygotic transition during blastoderm development in Japanese quail
Li et al. Expression analysis of ZPB2a and its regulatory role in sperm-binding in viviparous teleost black rockfish
Zhao et al. Identification and preliminary function study of Xenopus laevis DRR1 gene
Pagani et al. RNA extraction from cartilage: issues, methods, tips
CN106754647A (zh) 一种大鲵皮肤表皮细胞的分离、培养及鉴定方法
Long et al. Roles of Clara cell 10-kD protein and type 2 innate lymphoid cells in allergic rhinitis
Wei et al. The use of RNAi technology to interfere with Zfx gene increases the male rates of red deer (Cervus elaphus) offspring
CN101492725A (zh) Magea4基因的应用
Kim et al. Comparison of humoral and cell-mediated immunity in three different C57BL/6N mouse substrains
Jeong et al. Regulation of Tjp1 mRNA by CPEB2 for tight junction assembly in mouse blastocyst
Jiang et al. Proteomic analysis of proteins related to homozygotic sterility derived from gynogenesis in the Japanese flounder, Paralichthys olivaceus

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20161123