JP2009526543A - 正常および異常遺伝子発現におけるdnaの立体構造(ループ構造) - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は診断および遺伝子発現に関する。
既存の疾患診断法は、疾患の確実な診断のため、または疾患の病期を確認するための適切なマーカーを利用できないので、満足のいくものではないことが多い。現行の手法は、タンパク質、mRNA、または抗体の検出の利用を含む。
タンパク質、mRNA、または抗体の検出は、これらの分子の検出が疾患と関連する遺伝子の発現に正確に相当するものではないため、多くの診断症例において不適切である。個々の細胞間におけるこれらの分子の発現レベルの確率的変動はかなり高く、更に、半減期は顕著に変動し、非常に短い可能性もあり、例えばc-myc癌原遺伝子ポリペプチドでは約15分間である。さらに、これらの分子の検出は、転写と翻訳という遺伝子発現の順番に、その後の段階を追跡することしかできない。
本発明により、遺伝子が適合化された三次元の高次の構造の決定に基づいて、および特に、遺伝子内の会合/並列部位の位置/パターンに基づいて、遺伝子の異常発現を検出するための方法が提供される。本方法は、遺伝子内の1つまたは複数の位置における、並列部位の有無、または、そのような並列に起因する染色体立体構造を検出し得る。正常な形態の遺伝子発現とは、通常、生成物(RNAまたはポリペプチド)がその細胞性の/生理学的な機能を実施することを可能にする形態および/または量の、該生成物の発現として定義される。
診断対象の個体は、本明細書で言及されたいずれかの疾患状態の1つもしくは複数の症状を有し得、かつ/または、任意のそのような疾患状態を有することが疑われ得る。個体は、例えば任意のそのような疾患の家族歴を有することによって、または、該疾患の発症を引き起こすか寄与する環境において生活することによって、該疾患状態のリスクを有し得る。ヒトにおける癌の場合、個体は40歳を上回ってもよく、例えば50歳を上回るか、または60歳を上回る。該個体は喫煙歴を有してもよい。
本発明は、異常な遺伝子発現の診断法、およびしたがって、特定の疾患状態の診断法を提供する。本方法は、個体のDNA中に異常な染色体立体構造が存在するかどうかを、(例えば、実際の染色体構造の検出によって直接的に、または、遺伝子中の会合/並列の部位の検出によって間接的に)検出することを含む。そのような異常な立体構造とは、通常、ある遺伝子中の部位(例えば該遺伝子が正常に発現している場合には、通常はこれらが観察されない部位)における新規の並列(または並列の組み合わせ)の存在、または、(通常は正常発現の際に観察される)1つもしくは複数の並列の不在を含む。上述したように、異常な立体構造は、配列および/または機能および/または量の異なるRNA転写産物を発現する遺伝子をもたらし、発現の違いは、個体において疾患、例えば癌を引き起こすまたは寄与する。異常な染色体立体構造は、異なるスプライス変異体の発現を引き起こす可能性がある。
本明細書において言及するように、本発明の方法は、遺伝子の特定の領域の会合によって形成される染色体構造の存在を検出する工程を含む。そのような領域は同じ染色体上に存在し、典型的には、50,000塩基未満、例えば、20,000塩基未満、10,000塩基未満、5000塩基未満、1000塩基未満、または500塩基未満離れている。配列の会合によって、ループ構造/ループ様構造/位相的に閉じた構造が形成され得る。当業者は、会合している遺伝子の領域の参照が意味することを認識するであろう。そのような領域は、本明細書で言及した任意の架橋剤などによって共に架橋されるのに十分な程度に近い。したがってこれらは典型的には、オングストローム台の距離で離れており、例えば、50オングストローム未満または10オングストローム未満離れている。
-転写終結を引き起こし得り、調節し得り、もしくは寄与し得り;かつ/または
-CCマーカーであり得る。
本発明は、本方法を実施するためのキットも提供する。典型的には、本キットは、遺伝子中の特定の並列配列を検出するための手段を含む。典型的には、本キットは、(例えば、本明細書に記載のライゲーション生成物を検出することによって)並列配列を検出するために用いられ得る、プライマー対またはプローブを含む。典型的には、一方もしくは両方のプライマーおよび/またはプローブが、遺伝子配列または該遺伝子配列に相同的な配列の断片である配列を含む(当然ながら、一方のプライマーが遺伝子配列に結合しかつ他方のプライマーが相補的配列に結合するので、遺伝子配列への言及には相補的配列も含まれることが理解されよう)。そのような遺伝子配列は、コード配列の5'側(例えばプロモーター配列)でも、コード配列でも、イントロン配列でも、コード配列の3'側でもよい。
本発明は、遺伝子の異常発現を治療するための化合物を同定する方法を提供するが、該方法は、候補物質が、異常発現の際に適合化された異常構造から正常構造へと該遺伝子の染色体構造を変化させることができるかを判定し、それによって、候補物質が異常発現を治療できるかどうかを判定する工程を含む。染色体構造における変化は、本明細書に記載の任意の適切な方法を用いて検出され得る。また本方法は、候補化合物が遺伝子の構造中に変化を起こすことができるかどうかを再度判定することによって、遺伝子の発現の変化(例えば、ある発現様式から別の発現様式への転換)を引き起こすことができる化合物を同定するために実施することもできる。
本発明は、(i) CCマーカーを遺伝子に導入する工程;および/または(ii) 任意で1つ、2つ、3つ、もしくはそれ以上の変異をCCマーカーに導入することによって、遺伝子からCCマーカーを除去する工程であって、各変異が、ヌクレオチド塩基の付加、置換、もしくは欠失である工程を含む、遺伝子の発現プロファイルを変更する方法を提供するが、本方法では、遺伝子のコード配列の少なくとも50%が変更されないままである。
ポリヌクレオチド配列の相同体について本明細書で言及する。典型的にはそのような相同体は、例えば少なくとも15、20、30、100、またはそれ以上の連続ヌクレオチドの領域にわたって、少なくとも70%の相同性、好ましくは少なくとも80%、90%、95%、97%、または99%の相同性を有する。相同性は、ヌクレオチド同一性(「強い相同性(hard homology)」と称する場合もある)に基づいて算出できる。
真核生物学の新興パラダイムとは、核組織の構造的局面が、遺伝子の転写調節において直接的役割を果たすということである。染色体テリトリーから遺伝子ループまでの多様な構造レベルが、特異的転写応答の重要な構成要素として浮上している(1〜3)。本明細書において、本発明者らは、インビボにおいて転写された遺伝子の構造的組織化に関与するこれらの特性のいくつかを同定するために、2つのアプローチを組み合わせた。本発明者らは、応用数学から、一般化線型モデルおよびベイズの定理に基づくパターン認識解析を採用し、RNAポリメラーゼII(RNAPII)転写単位の境界を同定するためにこれを用いた。本発明者らは、分子生物学から、転写活性のスペクトルおよび該部位における構造的な染色体下(sub-chromosomal)ドメイン組織化を解析および説明するためのインビボアッセイ法を用いた。
式中、データとはDNA配列のセットを表す。P(モデル|データ)とは、該モデルに由来する配列の確率を与える、事後確率である。これは、該モデルに与えられた該データの確率ならびに、該モデルおよび該データの確率に左右される。
式中、Pは位置確率であり、W(x,i)は、切断部位に対するオフセットiのDNA重み行列確率(DNA weight matrix probability)である。次に、これらのマーカーの組み合わせを用いて、一般化線形モデルを構築する:
式中、Mは該遺伝子を規定するマーカーのセットであり、βは各マーカーの所与の重み(すなわち重要度)である。
U2OS細胞から単離した総RNAから、hDHFRに対するノーザンブロッティングを実施した。10% FCS存在下で増殖細胞を培養する一方、0.5% FCS存在下での接触阻害のもとで細胞の休止を行った。hDHFRの第4エキソンと第6エキソンの間の配列を包含する鋳型を用いて合成したプローブを、プローブとして用いた。
増殖U2OS細胞および静止U2OS細胞のFACS選別は、以前に記載されたように実施した(26)。
hDHFRにおける転写産物の終結を確認するための逆転写PCRは、U2OS細胞より単離した総RNAに対して実施した。CCDHFR-1部位、CCDHFR-2部位、およびCCDHFR-3部位に対して、以下のフォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いた。
本質的には以前に記載されたとおりに(27)、RACEを実施した。報告されたヒトCALCRL cDNAの配列に基づき、
および
に対して遺伝子特異的なプライマーを設計した(28)。5'RACEおよび3'RACE(第1イントロン内で終結)からの転写産物を配列決定し、GenBankデータベースに寄託した。
ヒトCL(hCL)タンパク質(アクセッション番号AAC41994およびAAA62158;CALCRL遺伝子によりコードされる)の最もC末端の427位〜461位の残基
に対応する合成ペプチドに対してウサギポリクローナル抗体LN-1436を産生させた。抗体の特異性は、HEK293T細胞において一過性に発現したCLの免疫ブロット解析により特徴付けられた。
ホルマリン固定しパラフィン包埋した、正常ヒト組織20種類の検体(n=74)を、オックスフォード大学、ジョン・ラドクリフ病院の細胞病理学科(The Department of Cellular Pathology, John Radcliffe Hospital, University of Oxford)(Oxford, UK)の長期保管ファイルから選択した。レシピエントTMAブロック内に高密度で整列させた各検体に対する円柱形のコア(直径1.0 mm)を得ることによって、多組織マイクロアレイ(TMA)を作製した(29)。抗hCL抗体LN-1436を用いて免疫組織化学的検査を行う前に、脱ロウし再水和した4μm切片に対して抗原回収手順を実施した。本質的には以前に記載されたとおりに、免疫組織化学的検査を実施した(30)。ビオチン化二次抗体、ストレプトアビジン-アルカリホスフェート複合体Vectastain ABC-APキット、およびVector Red検出システム(全てVector(Burlingame, US)製)を用いた。対照として、適切な濃度で使用されるウサギ免疫前血清を含めた。
以前の記載に以下の修正を加えた3C解析を実施した(31)。室温で10分間、2%ホルムアミドで処理することによって、約4×106個の全細胞を架橋させた。等モル量のグリシンを用いて架橋を停止させ、細胞を回収して低張緩衝液(10 mM Tris-HCl [pH7.2]、2 mM MgCl2、および0.5% TritonX-100)中で溶出させた。その後、CSK緩衝液(100 mM NaCl、300 mMショ糖、10 mM PIPES [pH 6.8]、3 mM MgCl2、10μM ロイペプチン、1 mM EGTA、1.2 mM PMSF、および0.5% TrionX-100)中、核を再懸濁して、氷上で20分間インキュベーションした。Hettich Mikro 22R遠心機中、4℃、5000rpmで懸濁液を遠心分離し、ペレットを2M NaClで処理した。氷上で10分間インキュベーションした後、十分量の水を添加してNaCl濃度を150 mMまで低下させた。この試料を用いて、以前に記載されたように、RNAPIIクロマチン免疫沈降アッセイ法を実施した(32)。RNAPII抗体(H-224;Santa Cruz Biotechnology Inc., USA)によって免疫沈降させたクロマチンを、次に、制限酵素BglII(New England Biolabs, UK)を用いて制限酵素切断し、T4 DNAリガーゼ(Roche, UK)を用いてライゲーションした。プロテイナーゼK(Roche, UK)でタンパク質を消化してリボヌクレアーゼA(Sigma, UK)でRNAを消化した後、エタノールを用いてDNAを抽出した。タカラバイオ(日本)製のTaKaRa LA Taq(商標)と共に遺伝子特異的プライマーを用いて、抽出されたDNAに対するPCR解析を行った。
正常組織および卵巣癌組織中のMLH1発現(図8参照)
腫瘍抑制遺伝子は、細胞の生存および維持において不可欠な役割を有する。腫瘍抑制因子のサイレンシングは、癌へと至る無秩序増殖のシグナルとなる。フェイルセーフ機構として、無秩序増殖に関するそのようなシグナルが検出されたら、細胞はアポトーシスを受ける。
前立腺診断マーカーに関する試験を、良性および後期の腫瘍増殖のいずれかを示す細胞系に対して行った。最適遺伝子はPSAおよびBORISであった。
精巣癌遺伝子ファミリーの新規メンバーである、刷り込み部位の調節因子Brother(Brother of the regulator of imprinted sites;BORIS)は、精母細胞のみで発現し、正常体細胞では発現しない。しかしその発現は、乳癌および肺癌を含む複数のヒト癌に関連している。BORISは、別のZnフィンガー転写因子である、ヒト悪性病変における後成的動揺に関するCTCFと競合する。したがって本発明者らは、BORISとヒト前立腺癌(LNCaP)との関連を試験することを決定した。
MLH1
3C制限酵素 - BssSI
MLH1プライマー
PCR反応の第1ラウンド
2×緩衝液I 25μl
dNTP(2.5 mM) 8μl
DNA 1μl
プライマー(25μM)
フォワード(MREI2) 1μl
リバース(MF3UTR2) 1μl
TakaRa LA Taq 0.5μl
水 13.5μl
計 50μl
プライマー
MREI2 - MF3UTR2
PCRプログラム
94℃ - 5 min
94℃ - 1 min
57℃ - 1 min 30サイクル
72℃ - 45 sec
72℃ - 5 min
生成物の予想サイズ
MREI2 - MF3UTR2 - 527 bp
PCR反応の第2ラウンド
2×緩衝液I 25μl
dNTP(2.5 mM) 8μl
DNA 2μl
プライマー(25μM)
フォワード(MREI1) 1μl
リバース(MF3UTR1) 1μl
TakaRa LA Taq 0.5μl
水 12.5μl
計 50μl
プライマー
MREI1 - MF3UTR1
試料
混合液を48μl、第1ラウンド由来の各PCR反応液を2μl採取する。
PCRプログラム
94℃ - 5 min
94℃ - 1 min
59℃ - 1 min 25サイクル
72℃ - 30 sec
72℃ - 5 min
生成物の予想サイズ
MREI1 - MF3UTR1 - 325 bp
3C制限酵素 - TaqI
BORISプライマー
PCR反応の第1ラウンド
2×緩衝液I 25μl
dNTP(2.5 mM) 8μl
DNA 1μl
プライマー(25μM)
フォワード(BR5UTR4) 1μl
リバース(BR3UTR2) 1μl
TakaRa LA Taq 0.5μl
水 13.5μl
計 50μl
プライマー
BR5UTR4 - BR3UTR2
PCRプログラム
94℃ - 5 min
94℃ - 45 sec
57℃ - 30 sec 30サイクル
72℃ - 25 sec
72℃ - 5 min
生成物の予想サイズ
BR5UTR4 - BR3UTR2 - 430または784 bp
注:3C制限酵素(TaqI)はCCマーカー近傍の2種類の制限酵素部位のいずれかで切断するので、2種類のサイズの生成物が得られる。
PCR反応の第2ラウンド
2×緩衝液I 25μl
dNTP(2.5 mM) 8μl
DNA 2μl
プライマー(25μM)
フォワード(BR5UTR3) 1μl
リバース(BR3UTR1) 1μl
TakaRa LA Taq 0.5μl
水 12.5μl
計 50μl
プライマー
BR5UTR3 - BR3UTR1
試料
混合液を48μl、第1ラウンド由来の各PCR反応液を2μl採取する。
PCRプログラム
94℃ - 5 min
94℃ - 45 sec
55℃ - 30 sec 25サイクル
72℃ - 20 sec
72℃ - 5 min
生成物の予想サイズ
BR5UTR3 - BR3UTR1 - 260または564 bp
注:3C制限酵素(TaqI)はCCマーカー近傍の2種類の制限酵素部位のいずれかで切断するので、ここでは2種類のサイズの生成物が得られる。図9は、配列決定によって確認された564 bpのバンドを示す。
3C制限酵素 - TaqI
PSAプライマー
PCR反応の第1ラウンド
2×緩衝液I 25μl
dNTP(2.5 mM) 8μl
DNA 1μl
プライマー(25μM)
フォワード(PR5UTR2) 1μl
リバース(PF3UTR2) 1μl
TakaRa LA Taq 0.5μl
水 13.5μl
計 50μl
プライマー
PR5UTR2 - PF3UTR2
PCRプログラム
94℃ - 5 min
94℃ - 45 sec
61℃ - 30 sec 30サイクル
72℃ - 25 sec
72℃ - 5 min
生成物の予想サイズ
PR5UTR2 - PF3UTR2 - 481 bp
PCR反応の第2ラウンド
2×緩衝液I 25μl
dNTP(2.5 mM) 8μl
DNA 2μl
プライマー(25μM)
フォワード(PR5UTR1) 1μl
リバース(PF3UTR1) 1μl
TakaRa LA Taq 0.5μl
水 12.5μl
計 50μl
プライマー
PR5UTR1 - PF3UTR1
試料
混合液を48μl、第1ラウンド由来の各PCR反応液を2μl採取する。
PCRプログラム
94℃ - 5 min
94℃ - 45 sec
61℃ - 30 sec 25サイクル
72℃ - 20 sec
72℃ - 5 min
生成物の予想サイズ
PR5UTR1 - PF3UTR1 - 266 bp
MLH1
CC1 - TSSの24367 bp下流
CC2 - TSSの57357 bp下流
(太字の下線付き文字は、CCマーカー配列を表す。)
正常組織中においては、代替的転写産物によって遺伝子が発現する。1つのそのような転写産物は、CC1が存在する第8イントロンで開始され、CC2マーカーで終結する。卵巣癌組織中においては、不完全な転写産物をもたらすか転写産物を全く生じない変異、欠失、およびメチル化が蓄積するので、遺伝子はダウンレギュレートされる。本発明者らは、正常組織においてCC1とCC2の並列を見出したが、卵巣癌組織においては見られなかった。このことは、これらの組織における遺伝子の転写様式の転換に関連する。
CC1 - TSSの5282 bp上流
CC2 - TSSの28038 bp下流
(太字の下線付き文字は、CCマーカー配列を表す。)
BORISは2つのCC部位を有するが、そのうちの一方は5'UTR中に、もう一方は3'UTR中に存在する。U2OS細胞中では、BORIS発現は予想されておらず、したがって、CCマーカーの並列も見られないはずである。ところが、ヒト前立腺癌細胞系(LNCaP)において、BORISが発現する。本発明者らは、CC1とCC2の並列をLNCaP中で見出したが、U2OS中では見られなかった。
CC1 - TSSの408 bp上流
CC2 - TSSの5843 bp下流
(太字の下線付き文字は、CCマーカー配列を表す。)
KLK3は2つのCC部位を有するが、そのうちの一方は5'UTR近傍に、もう一方は3'UTR中に存在する。U2OS細胞中で、KLK3発現は予想されておらず、したがって、CCマーカーの並列も見られないはずである。ところが、良性前立腺肥大症細胞系(BPH-1)において、KLK3が発現する。したがって、CC1とCC2の並列がBPH-1では見られるが、U2OSでは見られない。
パターン認識解析は、医学、工学、および言語学などの多様な研究分野に広く適用されており、ここで、画像解析およびデータ解読によって、複合系において根底にある特徴的なマーカーの同定が可能になる。本発明者らは、RNAポリメラーゼIIによってプロセシングされた転写単位に関してヒトゲノムデータを解析するために、パターン認識方法論を用いた。ヒト第22染色体上の手動解析された遺伝子422個由来の配列セットを、転写単位の境界上に存在する調節シグナルのコンピュータによる同定のために用いた。転写単位の3'末端におけるシグナルの同定について特に配慮した。これにより、インビボにおいてシグナルが終結特性を有することを確認したその後の実験との、機能的関連性が示された。
(a) 同定された各シグナルのDNAアルファベット;
(b) ガウス分布幅としての各シグナルの位置変化;
(c) パターン中の各シグナル間の距離(塩基対)。
(a) 調査対象の配列;
(b) XMLフォーマットのパターン;
(c) 弱いCCマーカーを除外するためのストリンジェンシー係数(逆対数スコア)(例えばデフォルト値=0.99)。
以下に記載される方法は、組織試料中のCCマーカー並列の検出における重要な段階を大まかに明らかにするものである。これは、患者に由来する冷凍組織試料を解析するための第一の開発された方法論である。
・ 組織試料をスライドガラス上でスライスして薄片にする。
・ 1 mlの氷冷1×PBSをスライドガラスに加え、5分間洗浄する。
・ 0.67Mパラホルムアルデヒドを加えてタンパク質とDNAを架橋させる。
・ ロッキングプラットフォーム上、室温で10分間インキュベーションする。
・ 1Mグリシンを加えて架橋反応をクエンチする。
・ 細胞をかき落とし、エッペンドルフチューブに細胞を移す。
・ 13,000 rpmで1分間遠心分離して、室温で細胞を回収する。
・ 上清を除去し、1 mlの氷冷低張緩衝液を加える。
・ 細胞を数回ピペッティングして、細かい細胞懸濁液にする(必要ならば、短時間の小規模なスピンを行う)。
・ 氷上で10分間インキュベーションし、細胞を膨潤させて核を出現させる。
・ 5,000 rpmで5分間、4℃で遠心分離を行い、核を回収する。
・ サイトゾル上清を排出し、1 mlのCSK緩衝液中で核ペレットを溶解させる。
・ 氷上で20分間インキュベーションする。
・ 5,000 rpmで5分間、4℃で遠心分離を行い、核を回収する。
・ 可能な限り上清を排出し、ペレットを保持する。
・ 核ペレットを2M NaCl中に溶解させる(溶液は粘性になる)。
・ 氷上で10分間インキュベーションする。
・ 試料を十分な水で希釈し、NaCl濃度を150 mMまで低下させる。
・ 10μlのPol II抗体(H-224)をエッペンドルフチューブに添加する。
・ 撹拌または回転させながら4℃で一晩インキュベーションする。
・ 約20μlの乾燥ビーズを得るために30μlのプロテインGセファロースビーズスラリーを採取する(必要ならばピペット先端を切断する)。
・ ビーズを回収するために2,000 rpmで3分間遠心分離する。
・ 1 mlのミリQ水で2回洗浄し、2,000 rpmで3分間遠心分離して、ビーズを回収する。
・ 1 mlの制限酵素洗浄緩衝液をビーズに加える。
・ ウェルを混合し、(必要ならば)別々のエッペンドルフチューブに分注し、洗浄して、2,000 rpmで3分間遠心分離し、ビーズを回収する。
・ ビーズと共に全内容物をエッペンドルフチューブに移し、ウェルを混合する。
・ 撹拌または回転させながら4℃で1時間インキュベーションする。
・ 4℃で3分間、1000rpmでスピンを行い、上清を除去する。未結合画分について上清を解析してもよい。
・ 1 mlの制限酵素洗浄緩衝液を加え、4℃で5分間回転させ、2000 rpmで3分間、4℃で遠心分離する。上清を除去する。
・ 1 mlの制限酵素洗浄緩衝液を加え、4℃で5分間回転させ、2000 rpmで3分間、4℃で遠心分離する。上清を除去する。
・ 1 mlの制限酵素洗浄緩衝液を加え、4℃で5分間回転させ、2000 rpmで3分間、4℃で遠心分離する。上清を除去する。
・ ビーズおよび残った制限酵素緩衝液の量を計量し、以下を加える:
・ 制限酵素緩衝液 1×
・ 制限酵素 30〜60ユニット
・ 水 100μl反応用に可変
・ 37℃で一晩インキュベーションすることによってDNAを消化する。
・ 65℃で10分間インキュベーションして、制限酵素消化を停止させる。
・ > 200μg/mlのRNase Aを緩衝液に加える。
・ 37℃で30分間インキュベーションする。
・ 400μlのミリQ水を加えて制限酵素反応液を希釈する。
・ 以下を加える:
・ ライゲーション緩衝液 1×
・ T4 DNAリガーゼ 30ユニット
・ 水 100μl反応用に可変
・ 16℃で4時間インキュベーションする。
・ 65℃で一晩インキュベーションして、架橋を転換する。
・ 450μgのプロテイナーゼKを各試料に加える。
・ 42℃で1時間インキュベーションして、タンパク質を消化する。
・ 660μlのフェノール、pH7.9(等量)を各試料に加えて、ボルテックスにかける。
・ 13,000 rpmで10分間遠心分離する。
・ 上清を1.5 mlエッペンドルフチューブに移す。
・ 0.3 MのNaClおよび0.5μgのグリコゲンを加える。
・ ウェルを混合し、1 mlの氷冷エタノールを加える。
・ -80℃で1時間、DNAを沈降させる。
・ 14,000 rpmで20分間、4℃で遠心分離する。
・ 10μlのRNase非含有水中で、DNAペレットを再懸濁する。
・ 各試料用のTaKaRa PCR反応液を準備する:
・ PCR緩衝液 1×
・ dNTP 各NTP 200μM
・ DNA 1μl
・ フォワードプライマー 0.5μM
・ リバースプライマー 0.5μM
・ TakaRa LA Taq 2.5ユニット
・ 水 50μl反応用に可変
・ 2%アガロースゲル中で試料を流す。
Claims (22)
- 個体から得た試料中で、遺伝子の2つの離れた領域が近接している染色体構造の有無を判定し、それによって、該個体が異常な遺伝子発現を有するかどうかを検出または診断する段階を含む、個体における異常な遺伝子発現を検出または診断する方法。
- -遺伝子疾患を診断するため、または
-癌を診断するため、または
-癌の特定の病期を確認するため、または
-癌の進行リスクを決定するため、または
-癌進行の様式または速度を決定するため
に実施される、請求項1記載の方法。 - 遺伝子の2つの離れた領域が近接している染色体構造を、遺伝子の正常な発現時に該染色体構造が生じる位置とは異なる位置で、遺伝子が含むかどうかを判定する段階を含む方法であって、該染色体構造が任意でループ状のまたは位相的に閉じた構造である、請求項1または2記載の方法。
- 遺伝子中のCCマーカーとの結合により遺伝子中の配列が近接しているかどうかを判定することによって染色体構造を検出する段階を含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- ループ状の立体構造が、
-近接しているDNAを架橋させること、続いて
-任意で配列に基づく検出方法により、架橋したDNAを検出すること
により検出される、前記請求項のいずれか一項記載の方法。 - DNAの架橋の後に、
-架橋したDNAを制限酵素消化に供し、
-消化された構造をライゲーションに供し、かつ
-ライゲーションされた構造を分析/検出する、
請求項5記載の方法。 - ライゲーションされた構造の分析が、遺伝子中には存在しないがライゲーションされた構造中に存在するDNA配列の検出を含む、請求項6記載の方法。
- ライゲーションされた構造中に存在するDNA配列が、配列決定またはPCRによって検出される、請求項7記載の方法。
- ライゲーションされた配列を鋳型として用いてプライマーがPCR生成物の形成に成功するが、同じPCR条件下で遺伝子の配列は増幅しないPCR反応を用いて、ライゲーションされた配列の存在が検出される、請求項8記載の方法。
- 個体の2、3、4種類またはより多くの遺伝子の染色体構造を、前記請求項のいずれか一項に定義された方法により解析する段階を含む、個体のフィンガープリンティングを行う方法。
- 癌に関連する2種類以上の遺伝子が、癌の種類の診断を可能にするために解析され、かつ/または、解析される遺伝子の少なくとも1種類が、異常な発現が起こっている組織の同定を可能にする組織特異的な遺伝子である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- ライゲーションされた構造中に存在するDNA配列を検出することができる1種または複数種のポリヌクレオチドと、任意でDNAを架橋することができる薬剤とを含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法を実施するためのキット。
- ポリヌクレオチドが、DNA配列を検出することができるプローブまたはプライマー対を含む、請求項12記載のキット。
- ポリヌクレオチドが、ライゲーションされた構造中に存在するDNAに結合できる遺伝子の断片または該断片の相同体に相当する、請求項12または13記載のキット。
- 候補物質が、異常な発現の際の異常な構造から正常な構造へと遺伝子の染色体構造を変化させることができるかどうかを判定し、それによって、候補物質が異常な発現を治療できるかどうかを判定する段階を含む、遺伝子の異常な発現を治療するための化合物を同定する方法。
- 候補物質が、一つの発現様式の際の構造から別の発現様式における構造へと遺伝子の染色体構造を変化させることができるかどうかを判定し、それによって、候補物質が遺伝子の発現様式を変化させることが可能かどうかを判定する段階を含む、遺伝子の発現様式を変化させるための化合物を同定する方法。
- (iii)遺伝子へとCCマーカーを導入する段階、および/または
(iv)任意で1、2、3、またはそれ以上の変異をCCマーカーに導入することにより遺伝子からCCマーカーを除去する段階であって、各変異が核酸塩基の付加、置換、もしくは欠失である、段階
を含む、遺伝子の発現プロファイルを変化させる方法であって、遺伝子のコード配列の少なくとも50%は変化しないままである、方法。 - 遺伝子を複製および/または発現させる段階を更に含む、請求項17記載の方法。
- 発現プロファイルがCCマーカー配列の導入および/または除去により変化している遺伝子をゲノム中に少なくとも1つ含む、非ヒト改変真核生物であって、該遺伝子のコード配列の少なくとも50%は変化しないままである、非ヒト改変真核生物。
- 請求項19記載の生物の細胞または器官。
- 生物の細胞中の遺伝子においてCCマーカーを導入または除去する段階、および、多細胞生物の場合には、細胞を成長させて生物とする段階を含む、請求項19記載の改変生物の作製法。
- 遺伝子の発現を変化させるためのCCマーカーを含むポリヌクレオチドの使用。
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