CN1231596C - 利用线粒体dna指纹进行动物遗传信息鉴定的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用线粒体DNA指纹进行动物遗传信息鉴定的方法，目的是提供一种较准确，并且较简单的利用线粒体DNA指纹进行动物遗传信息鉴定的方法。本发明的技术方案包括以下步骤：1)提取动物含有mtDNA的总DNA；2)用限制性内切酶进行切割；3)在引物的作用下进行PCR反应；4)单链构象多态电泳。本发明mtDNA指纹技术充分利用了mtDNA D-loop高变异区的碱基突变和重复序列区变异产生的重复序列数目变异和不同重复序列数目mtDNA分子的变异，DNA图谱信息度高、实用性强、结果准确、稳定、重复性好、灵敏度高，具有十分广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程领域中动物遗传信息鉴定的方法，特别是涉及利用线粒体DNA指纹进行动物遗传信息鉴定的方法。
背景技术
线粒体DNA具有拷贝数高、分子量小、无组织特异性、进化速度快等特点，在遗传上具有自主性，是严格的母系遗传。
线粒体DNA指纹(mitochondrial DNA fingerprinting，mtDNA)是指线粒体DNA控制区内的高变异区碱基突变导致的多态，以及重复序列区变异导致的mtDNA异质型多态、分子长度多态。通过对mtDNA功能区碱基高变异区即左功能区(D-loop 5’端)和右功能区(D-loop 3′端)扩增片段进行的单链构象多态(Single Strand ConformationPolymorphism，SSCP)、异源双链分析(Heteroduplex Analysis，HDA)、双脱氧法指纹分析(dideoxy fingerprinting，ddF)和重复序列区扩增片段异源双链分析等研究，可获得高变异的DNA综合图谱。
利用mtDNA D-loop碱基突变和重复序列区变异分析群体遗传纯度和鉴定不同群体、个体的亲缘关系已在果蝇、海虾、蟋蟀、蝙蝠、鲟鱼、鲸、海豹、十八种食肉目动物、十八种鹳形目鸟类、鸡、猴、兔、猪、马等动物研究中广泛开展。目前采用的分析技术均为单一的用单链构象多态检测D-loop左、右功能区的碱基突变或用限制性内切酶(RFLP)检测重复序列变异导致的异质型多态和分子长度多态。
D-loop在mtDNA复制和转录中的特殊作用，使得D-loop结构、功能的研究成为mtDNA研究的热点。研究发现，D-loop的碱基替换率比mtDNA分子的其它区域高5-10倍，是核单拷贝基因的25-100倍。在脊椎动物中，多数动物的D-loop位于tRNApro和tRNAphe之间，在碱基组成上，D-loop为A-T富集区，依照碱基A的比率，D-loop可分为包含D-loop 5′端的左功能区(left domain)、中间保守区(central domain)和包含D-loop 3’端的右功能区(right domain)三部分，左功能区和右功能区为A碱基富集区，在遗传上为高变区；由保守序列区(Conserved Sequence Block，CSB)构成的中间保守序列区为G碱基富集区，遗传上为保守区。不同物种中间保守序列区的结构不尽相同，多数物种的这一区域由三个保守序列区组成，即CSB-1、CSB-2和CSB-3。在D-loop内，特别是在各保守序列区间，多数物种存在数目不等的重复序列(Repeat Sequence，RS)，不同的物种重复序列所在的位置及重复基元序列(motif)不同；同种动物不同个体或同一个体不同mtDNA分子的基元序列重复数也不尽相同，这种差异在个体间直接表现为mtDNA分子长度多态(molecule size polymorphism)，在同一个体内存在两种以上因基元序列重复数不同的mtDNA分子而导致的多态则称为异质型多态(heteropla smic polymorphism)。
常规的单链构象多态和异源双链分析技术只能检测200bp左右的DNA片段中碱基的突变，超过200bp的DNA片段，检测碱基突变的灵敏度将降低，而大多数动物的mtDNA D-loop功能区碱基数均超过200bp，例如猪的mtDNA D-loop左、右功能区分别为700bp和400bp左右，无法采用常规的单链构象多态和异源双链分析技术检测碱基突变。
双脱氧法指纹分析采用荧光标记双脱氧终止碱基的方法，通过核苷酸序列分析仪检测DNA片段的碱基突变，实现了检测DNA碱基突变的自动化操作，虽然双脱氧法指纹分析可分析500bp-1000bp的DNA片段，且检测碱基突变的灵敏度可达到100％，但实验成本较高，不易在实际应用中推广。
发明内容
本发明的目的是提供一种较准确，并且较简单的利用线粒体DNA指纹进行动物遗传信息鉴定的方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种利用线粒体DNA指纹进行动物遗传信息鉴定的方法，包括以下步骤：
1)提取动物含有mtDNA的总DNA；
2)用限制性内切酶进行切割；
3)在引物的作用下进行PCR反应；
4)单链构象多态电泳。
为了更方便、快捷、准确地研究通过上述方法得到的结果，所述单链构象多态电泳结果用凝胶银染进行染色。
本发明的方法对于动物的遗传信息鉴定具有普遍性，当所述动物为猪时，PCR的引物为：
5’-GCACGACAATCCAAACAAGGTGCT-3’
5’-TACCTGCTTATATGCGCGTGTACG-3’
PCR的条件为94℃5分钟后进行30个循环的94℃30秒、72℃30秒之后，反应于72℃延伸5分钟。
所述动物为牛时，PCR的引物为：
5’-CATTACAGTCAATGGTCACAGG-3’
5’-GCTTTGGGTTAAGCTACATCAAC-3’
PCR的条件为94℃5分钟后进行30个循环的94℃30秒、55℃30秒、72℃30秒，之后，反应于72℃延伸5分钟。
所述动物为羊时，PCR的引物为：
5’-GTCTATCTTAAACATGCAAACGG-3’
5’-CCCTACATGCTTCAGTGAAAC-3’
PCR的条件为94℃5分钟后进行30个循环的94℃30秒、55℃30秒、72℃30秒，之后，反应于72℃延伸5分钟。
所述动物为兔时，有两种情况，一种PCR的引物为：
5’-CATTCTTTTAATGCTTGTCGGACAT-3’
5’-CAATGAATTTACTTAGTGGGGGGGTA-3’
PCR的条件为94℃5分钟后进行30个循环的94℃30秒、58℃30秒、72℃30秒，之后，反应于72℃延伸5分钟。
所述动物为兔的另一种情况PCR的引物为：
5’-GCATATTAATTTCCTGCCAAACCCCA-3’
5’-CAGTGCTTTGCTTTGTTGTTAAGC-3’
PCR的条件为94℃5分钟后进行30个循环的94℃30秒、53℃30秒、72℃30秒，之后，反应于72℃延伸5分钟。
所述动物为鸡时，PCR的引物为：
5’-TATTCCCGCTTGGTTAGACCCCAA-3’
5’-TATGTCCGACAAGCATTCACTAAAT-3’
PCR的条件为94℃5分钟后进行30个循环的94℃30秒、55℃30秒、72℃1分钟，之后，反应于72℃延伸5分钟。
所述动物为马时，PCR的引物为：
5’-CAGTCCATGGTAACAGGACATAG-3’
5’-TTTAATGGGG GGTAGGGGGGGTTT-3’
PCR的条件为94℃5分钟后进行30个循环的94℃30秒、56℃30秒、72℃30秒，之后，反应于72℃延伸5分钟。
本发明创造性地将D-loop序列和DNASIS软件相结合，寻找合适的限制性内切酶，先将大片段的mtDNA D-loop酶切为小于200bp的DNA片段后，进行常规单链构象多态和异源双链分析，检测mtDNA D-loop碱基的突变，可以更为精确地获得高度变异的多态信息。
本发明同时采用限制性内切酶-单链构象多态和限制性内切酶异源双链分析技术作为比较，通过两种不同方法研究mtDNA指纹技术，操作简便，成本低，更易于在实际应用中推广使用。
mtDNA D-loop内重复序列区的变异包括拷贝数的变异(异质型多态)和分子长度变异(分子长度多态)，本发明巧妙地采用异源双链分析技术通过高分辨率凝胶和凝胶银染技术直接比较、分析重复序列区的变异，获得高度变异的DNA图谱以更快捷准确地确定动物的遗传特性，进行不同品种(品系)亲缘关系鉴定和群体遗传纯度分析。
本发明利用mtDNA拷贝数高、无组织特异性、结构稳定的特点，加之研究方法采用PCR技术，使得mtDNA指纹技术对样品的要求了诸多DNA指纹技术中的最低，同时由于无需放射性同位素标记，避免了制备探针、筛选基因文库、Southern杂交等繁琐操作，使得mtDNA指纹技术在操作上具有简便、快速、经济、安全的特点。本发明mtDNA指纹技术充分利用了mtDNA D-loop高变异区的碱基突变和重复序列区变异产生的重复序列数目变异(分子长度多态)、不同重复序列数目mtDNA分子的变异(异质型多态)，DNA图谱信息度高、实用性强、结果准确、稳定、重复性好、灵敏度高，是继小卫星、微卫星、RAPD等DNA指纹技术之后又一新的DNA指纹技术方案，具有十分广阔的应用前景。
下面结合附图对本发明的具体实施方式做进一步说明。
附图说明
图1为猪的mtDNA指纹。
图2为牛的mtDNA指纹。
图3为羊的mtDNA指纹。
图4为兔的mtDNA指纹。
图5为兔的mtDNA指纹。
图6为鸡的mtDNA指纹。
图7为马的mtDNA指纹。
具体实施方式
实施例1、用动物血样制作模板DNA的方法
700μl抗凝血中加入35μl 10％的SDS，室温下剧烈振荡数分钟后加入等体积饱和苯酚抽提两次，每次振荡15分钟，12000g离心2分钟，水相加入5M的NaCl至终浓度为0.25M，混匀，加入0.6倍体积的异丙醇，混匀后室温下放置10分钟。12000g离心5分钟，沉淀以70％的乙醇洗涤，离心后真空或空气中干燥，溶于20μl灭菌双蒸水中。
实施例2、用动物组织制作模板DNA的方法
以SE缓冲液(0.25M蔗糖，30mMTris-HCl，10mM EDTA，2.5mMCaCl2，pH8.0)冲洗组织块后，剪取0.5g左右的组织块置于1.5ml EP管内，加入10％SDS至终浓度1％，蛋白酶K 80ng，加入SE缓冲液至0.8ml，65℃保持直至组织块消化完全(一般需要4-12小时)，之后加入0.6ml饱和苯酚抽提蛋白两次，每次振荡15分钟，12000g离心10分钟后，水相移入新的1.5mlEP管内，加入5M NaCl至终浓度0.25M，加入0.6ml异丙醇，混匀，室温下放置10分钟后12000g离心5分钟，沉淀以70％乙醇洗涤两次，空气或真空干燥后溶于0.05ml灭菌的双蒸水中。
实施例3、利用猪的线粒体DNA指纹对其进行遗传信息鉴定
1、用实施例1的方法自猪的血样中提取模板DNA；
2、依据已报道的猪(GenBank accession humber：AJ002189)mtDNA序列设计引物：5′-GCACGACAATCCAAACAAGGTGCT-3′
5′-TACCTGCTTATATGCGCGTGTACG-3′
3、进行PCR反应：PCR的条件为94℃5分钟后进行30个循环的94℃30秒、72℃30秒之后，反应于72℃延伸5分钟，扩增的片段是68+10n(14-29)bp，其中n为串联重复序列数；
4、PCR产物的纯化：以Geneclean试剂盒(Biolab LTD)回收纯化扩增产物，溶解于20μl灭菌双蒸水中。
5、单链构象多态电泳：取扩增产物1μl加入3μl载样缓冲液(95％甲酰胺，20mMNaOH，0.025％二甲苯蓝，0.025％溴酚蓝)于95℃保温5min，立即置于冰上直至电泳。电泳采用15％的acr∶bis为37.5∶1的聚丙烯酰胺凝胶，凝胶中加入5％的甘油；
6、凝胶银染：采用Caetano-Anolles and Gresshoff(Caetano-Anolles G，Gresshoff PM.Staining nucleic acids with silver.Promega notes.1994，45，15-18)的银染方法进行；
7、如图1所示，为通过上述方法得到的猪的mtDNA指纹，从图中可以看出，mtDNA指纹可直接鉴定不同母系来源的个体，不存在组织特异性，证明mtDNA指纹可用于动物的个体识别和群体亲缘关系鉴定。
实施例4、利用牛的线粒体DNA指纹对其进行遗传信息鉴定
1、用实施例1的方法自牛的血样中提取模板DNA；
2、依据已报道的牛(GenBank accession number：NC001567)mtDNA序列设计引物：5’-CATTACAGTCAATGGTCACAGG-3’
5’-GCTTTGGGTTAAGCTACATCAAC-3’
3、进行PCR反应：PCR的条件为94℃5分钟后进行30个循环的94℃30秒、55℃30秒、72℃30秒，之后，反应于72℃延伸5分钟，扩增的片段是213bp：
4、PCR产物的纯化：以Geneclean试剂盒(Biolab LTD)回收纯化扩增产物，溶解于20μl灭菌双蒸水中。
5、单链构象多态电泳：取扩增产物1μl加入3μl载样缓冲液(95％甲酰胺，20mMNaOH，0.025％二甲苯蓝，0.025％溴酚蓝)于95℃保温5min，立即置于冰上直至电泳。电泳采用15％的acr∶bis为37.5∶1的聚丙烯酰胺凝胶，凝胶中加入5％的甘油；
6、凝胶银染：采用Caetano-Anolles and Gresshoff(Caetano-Anolles G，Gresshoff PM.Staining nucleic acids with silver.Promega notes.1994，45，15-18)的银染方法进行；
7、如图2所示，为通过上述方法得到的牛的mtDNA指纹，从图中可以看出，mtDNA指纹可直接鉴定不同母系来源的个体，证明mtDNA指纹可用于动物的个体识别和群体亲缘关系鉴定。
实施例5、利用羊的线粒体DNA指纹对其进行遗传信息鉴定
1、用实施例1的方法自羊的血样中提取模板DNA；
2、依据已报道的羊(GenBank accession number：AF010406)mtDNA序列设计引物：5’-GTCTATCTTAAACATGCAAACGG-3’
5’-CCCTACATGCTTCAGTGAAAC-3’
3、进行PCR反应：PCR的条件为94℃5分钟后进行30个循环的94℃30秒、55℃30秒、72℃30秒，之后，反应于72℃延伸5分钟，扩增的片段是40+75n(4)，其中n为串联重复序列数；
4、PCR产物的纯化：以Geneclean试剂盒(Biolab LTD)回收纯化扩增产物，溶解于20μl灭菌双蒸水中。
5、单链构象多态电泳：取扩增产物1μl加入3μl载样缓冲液(95％甲酰胺，20mMNaOH，0.025％二甲苯蓝，0.025％溴酚蓝)于95℃保温5min，立即置于冰上直至电泳。电泳采用15％的acr∶bis为37.5∶1的聚丙烯酰胺凝胶，凝胶中加入5％的甘油；
6、凝胶银染：采用Caetano-Anolles and Gresshoff(Caetano-Anolles G，Gresshoff PM.Staining nucleic acids with silver.Promega notes.1994，45，15-18)的银染方法进行；
7、如图3所示，为通过上述方法得到的羊的mtDNA指纹，从图中可以看出，mtDNA指纹可直接鉴定不同母系来源的个体，证明mtDNA指纹可用于动物的个体识别和群体亲缘关系鉴定。
实施例6、利用兔的线粒体DNA指纹对其进行遗传信息鉴定
1、用实施例1的方法自兔的血样中提取模板DNA；
2、依据已报道的兔(GenBank accession number：AJ001588)mtDNA序列设计引物；
5’-CATTCTTTTAATGCTTGTCGGACAT-3’
5’-CAATGAATTTACTTAGTGGGGGGGTA-3’
3、进行PCR反应：PCR的条件为94℃5分钟后进行30个循环的94℃30秒、58℃30秒、72℃30秒，之后，反应于72℃延伸5分钟，扩增的片段是152+20n(1-10)，其中n为串联重复序列数；
4、PCR产物的纯化：以Geneclean试剂盒(Biolab LTD)回收纯化扩增产物，溶解于20μl灭菌双蒸水中。
5、单链构象多态电泳：取扩增产物1μl加入3μl载样缓冲液(95％甲酰胺，20mMNaOH，0.025％二甲苯蓝，0.025％溴酚蓝)于95℃保温5min，立即置于冰上直至电泳。电泳采用1％的acr∶bis为37.5∶1的聚丙烯酰胺凝胶，凝胶中加入5％的甘油；
6、凝胶银染：采用Caetano-Anolles and Gresshoff(Caetano-Anolles G，Gresshoff PM.Staining nucleic acids with silver.Promega notes.1994，45，15-18)的银染方法进行；
7、如图4所示，为通过上述方法得到的兔的mtDNA指纹，从图中可以看出，mtDNA指纹可直接鉴定不同母系来源的个体，证明mtDNA指纹可用于动物的个体识别和群体亲缘关系鉴定。
实施例7、利用兔的线粒体DNA指纹对其进行遗传信息鉴定
1、用实施例2的方法自兔的组织样中提取模板DNA；
2、依据已报道的兔(GenBank accession number：AJ001588)mtDNA序列设计引物：
5’-GCATATTAATTTCCTGCCAAACCCCA-3’
5’-CAGTGCTTTGCTTTGTTGTTAAGC-3’
3、进行PCR反应：PCR的条件为94℃5分钟后进行30个循环的94℃30秒、53℃30秒、72℃30秒，之后，反应于72℃延伸5分钟，扩增的片段是124+153n(1-4)，其中n为串联重复序列数；
4、PCR产物的纯化：以Geneclean试剂盒(Biolab LTD)回收纯化扩增产物，溶解于20μl灭菌双蒸水中。
5、单链构象多态电泳：取扩增产物1μl加入3μl载样缓冲液(95％甲酰胺，20mMNaOH，0.025％二甲苯蓝，0.025％溴酚蓝)于95℃保温5min，立即置于冰上直至电泳。电泳采用2.5％的acr∶bis为37.5∶1的聚丙烯酰胺凝胶，凝胶中加入5％的甘油；
6、凝胶银染：采用Caetano-Anolles and Gresshoff(Caetano-Anolles G.Gresshoff PM.Staining nucleic acids with silver.Promega notes.1994，45，15-18)的银染方法进行；
7、如图5所示，为通过上述方法得到的兔的mtDNA指纹，从图中可以看出，mtDNA指纹可直接鉴定不同母系来源的个体，证明mtDNA指纹可用于动物的个体识别和群体亲缘关系鉴定。
实施例8、利用鸡的线粒体DNA指纹对其进行遗传信息鉴定
1、用实施例2的方法自鸡的组织样中提取模板DNA；
2、依据已报道的鸡(GenBank accession number：NC001323)mtDNA序列设计引物：
5’-TATTCCCGCTTGGTTAGACCCCAA-3’
5’-TATGTCCGACAAGCATTCACTAAAT-3’
3、进行PCR反应：PCR的条件为94℃5分钟后进行30个循环的94℃30秒、55℃30秒、72℃1分钟，之后，反应于72℃延伸5分钟，扩增的片段是902+29n(2)，其中n为串联重复序列数；
4、PCR产物的纯化：以Geneclean试剂盒(Biolab LTD)回收纯化扩增产物，溶解于20μl灭菌双蒸水中。
5、单链构象多态电泳：取扩增产物1μl加入3μl载样缓冲液(95％甲酰胺，20mMNaOH，0.025％二甲苯蓝，0.025％溴酚蓝)于95℃保温5min，立即置于冰上直至电泳。电泳采用15％的acr∶bis为37.5∶1的聚丙烯酰胺凝胶，凝胶中加入5％的甘油；
6、凝胶银染：采用Caetano-Anolles and Gresshoff(Caetano-Anolles G，Gresshoff PM.Staining nucleic acids with silver.Promega notes.1994，45，15-18)的银染方法进行；
7、如图6所示，为通过上述方法得到的鸡的mtDNA指纹，从图中可以看出，mtDNA指纹可直接鉴定不同母系来源的个体，证明mtDNA指纹可用于动物的个体识别和群体亲缘关系鉴定。
实施例9、利用马的线粒体DNA指纹对其进行遗传信息鉴定
1、用实施例2的方法自马的组织样中提取模板DNA；
2、依据已报道的马(EMBL accession number：X79547)mtDNA序列设计引物：
5’-CAGTCCATGGTAACAGGACATAG-3’
5’-TTTAATGGGGGGTAGGGGGGGTTT-3’
3、进行PCR反应：PCR的条件为94℃5分钟后进行30个循环的94℃30秒、56℃30秒、72℃30秒，之后，反应于72℃延伸5分钟，扩增的片段是123+8n(1-22)，其中n为串联重复序列数；
4、PCR产物的纯化：以Geneclean试剂盒(Biolab LTD)回收纯化扩增产物，溶解于20μl灭菌双蒸水中。
5、单链构象多态电泳：取扩增产物1μl加入3μl载样缓冲液(95％甲酰胺，20mMNaOH，0.025％二甲苯蓝，0.025％溴酚蓝)于95℃保温5min，立即置于冰上直至电泳。电泳采用15％的acr∶bis为37.5∶1的聚丙烯酰胺凝胶，凝胶中加入5％的甘油；
6、凝胶银染：采用Caetano-Anolles and Gresshoff(Caetano-Anolles G，Gresshoff PM.Staining nucleic acids with silver.Promega notes.1994，45，15-18)的银染方法进行；
7、如图6所示，为通过上述方法得到的马的mtDNA指纹，从图中可以看出通过mtDNA指纹可直接鉴定不同母系来源的个体，证明mtDNA指纹可用于动物的个体识别和群体亲缘关系鉴定。
Claims (1)
1、一种利用线粒体DNA指纹进行牛遗传信息鉴定的方法，包括以下步骤：
1)提取牛含有mtDNA的总DNA；
2)在牛的D-loop区设计PCR引物：
5’-CATTACAGTCAATGGTCACAGG-3’
5’-GCTTTGGGTTAAGCTACATCAAC-3’
3)在引物的作用下进行PCR反应；
4)单链构象多态电泳。
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