CN112011629A - 晋汾白猪全基因组高密度snp芯片检测试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种晋汾白猪全基因组高密度SNP芯片检测试剂盒及其应用，本发明基于猪基因组(Sscrofa11.1)数据对Illumina SNP 60K芯片进行位点升级，将晋汾白猪特异SNP位点与升级后60K芯片位点整合，去除无效SNP标记，确定位点数为96963个，其中晋汾白猪特异性SNP位点55957个，其余SNP位点的标记探针与猪60K芯片探针一致，55957个晋汾白猪特异性SNP位点中包括76个能够分开晋汾白猪家系的晋汾白猪特异SNP位点。本发明的晋汾白猪全基因组高密度SNP检测试剂盒可用于晋汾白猪品种鉴定和鉴别，进行晋汾白猪聚类分析、亲缘关系分析和种质资源分析，还可用于构建晋汾白猪连锁图谱构建、基因定位分析和分子育种材料选择，将大大提高我国猪选种选育进程。

Description

晋汾白猪全基因组高密度SNP芯片检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及基因分子育种领域，具体涉及一种晋汾白猪全基因组高密度SNP芯片检测试剂盒及其应用。
背景技术
SNP作为继限制性片段长度多态性及简单序列重复之后的第三代DNA遗传标记，具有分布广泛、数量多、遗传稳定性高、易于快速自动化检测等特点。基于SNP高通量分子标记技术主要包括以测序技术为基础的分子标记技术和以基因芯片为基础的分子标记技术。基于测序技术分子标记技术虽然测序深度大、测序范围广，但短序列片段的测序需要依赖于参考基因组序列，位于重复序列区域或者未匹配到参考基因组上的序列难以检测和分析，由于测序成本的缺点难以在分子育种中推广。
基于基因芯片的分子技术由于具有高效率、高通量、微型化、自动化等特点，被广泛应用于物种进化、基因定位、分子育种等。基因芯片又名生物芯片，这一概念于1991年被首次提出。1996年，美国Stanford大学实验室合成了DNA阵列，推出了世界上第1块商业化基因芯片，掀起了基因芯片的研究热潮。基因芯片的原理是将待测DNA样品的靶序列与固化在基片上的已知核酸探针进行分子杂交，通过产生的杂交图谱来确定样品靶序列的过程。当进行了荧光标记的待测DNA样品与芯片上的核酸探针配对后，DNA芯片会产生可检测的荧光斑点，其配对的碱基越多，则荧光越强。
随着各畜禽商业化芯片的问世，基因组选择也已经被广泛应用到动物育种中去。但商业化芯片的缺点也显露的愈发明显。首先，芯片所含标记数量有限，难以满足所有类型的研究需求；其次，商业化芯片一般是针对知名品种进行设计，与许多地方品种遗传距离较大，造成芯片的部分位点在特定群体中失效。Illumina猪SNP 60K芯片是以杜洛克猪基因组序列为模板，融合了大白猪、长白猪、皮特兰猪及野猪的基因组序列信息进行设计，对这些物种具有较好的检测效果。但与中国地方猪种的基因组结构具有差异，检测效率下降。
目前，猪的商业化芯片主要包括基于Iliiumina平台的geneseek公司开发的PorcineSNP60K(含61565个SNP)、GGP-Porcine HD(68528个SNP)、GGP-Porcine(含51000个SNP)和康普森公司设计的compass porcine SNP55K(含55000个SNP)等。目前，市场上主要使用的仍是geneseek公司开发的基因芯片，但针对我国地方地方猪种和培育猪种的检测会使一些位点失效。为保证我国地方猪种和培育猪种的检测效果，提高分子育种的效率，选取合适的SNP制作高密度芯片成为当务之急，才能不断满足猪规模化育种的需要。
发明内容
本申请的目的在于提供一种晋汾白猪全基因组高密度SNP芯片检测试剂盒，以解决在猪育种选育过程中检测效率低，成本高的问题。
本发明的技术方案为：一种晋汾白猪全基因组SNP芯片，SNP芯片由96963个SNP位点组成，其中晋汾白猪特异性SNP位点55957个，其余SNP位点的标记探针与猪60K芯片探针一致，55957个晋汾白猪特异性SNP位点中包括76个能够分开晋汾白猪家系的晋汾白猪特异SNP位点，该76个晋汾白猪特异性SNP分子标记的探针如SEQ NO.1-SEQ NO.76所示。
本发明还提供了一种晋汾白猪全基因组SNP芯片检测试剂盒，所述检测试剂盒含有上述SNP芯片。
本发明还提供了一种晋汾白猪全基因组SNP芯片检测试剂盒的制作方法，包括以下步骤：
步骤S1，晋汾白猪及其马身猪、太湖猪、大白猪和长白猪四个亲本重测序检测；
步骤S2，对重测序数据进行质控；
步骤S3，将质控数据比对到猪参考基因组上，去除重复；
步骤S4，使用GATK4软件BaseRecalibration方法进行重比对后，再使用HaplotypeCaller对每个样本生成GVCF，对晋汾白猪、马身猪、长白猪、大白猪、太湖猪四个猪种进行VariantRecaliration(位点重比对)，使用VariantFilteration工具进行位点质量过滤，最终得到所有样本SNP变异位点的集合；
步骤S5，利用晋汾白猪及其马身猪、太湖猪、大白猪和长白猪四个亲本的重测序数据分析获得晋汾白猪特异SNP位点；筛选标准为：等位基因频率＞0.1、将重测序数据获得的晋汾白猪特异SNP位点与NCBI网站SNP数据库中的位点进行比对，最终筛选获得55957个仅在晋汾白猪群体中出现的晋汾白猪特异SNP位点，其中包含76个能够区分开晋汾白猪家系的晋汾白猪特异SNP位点；其余的55881个SNP位点序列已被相关文献公开，故不再列出该SNP分子标记的探针序列；
步骤S6，以猪Illumina SNP 60K芯片为模板，利用猪最新参考基因组(Sscrofa11.1)版本进行位点升级，根据SNP效应估计结果的精确性和在基因组中的分布，对SNP进行筛选的优化，剔除原60K芯片中约9000个无效位点。其中，Illumina平台猪SNP60基因分型芯片是通过Illumina的iSelect项目与国际领先研究协会合作开发。它包含超过60000个SNP位点，以步长平均每40kb有一个标记，覆盖猪的基因组。此12样本芯片整合了多种猪的基因差异，包括杜洛克猪，长白猪，皮特兰猪和大白猪，其性价比高，能提供足够的SNP密度，可应用与全基因组关联研究或其他研究中，如：全基因组选择、测定遗传指数、鉴定数量性状位点、比较基因研究。
步骤S7，将晋汾白猪特异SNP位点和位点升级后的主SNP 60K芯片位点整合，获得了96963个有效SNP，定制晋汾白猪全基因组高密度SNP芯片检测试剂盒。
本发明还有一个目的在于提供一种晋汾白猪全基因组SNP芯片在不同品种猪亲子鉴定中的应用。
本发明还有一个目的在于提供一种晋汾白猪全基因组SNP芯片在不同品种猪基因组选择中的应用。
本发明还有一个目的在于提供一种晋汾白猪全基因组SNP芯片在猪聚类分析、猪亲缘关系分析中的应用。
本发明还有一个目的在于提供一种晋汾白猪全基因组SNP芯片在猪连锁图谱构建和基因定位中的应用。
本发明还有一个目的在于提供一种晋汾白猪全基因组SNP芯片在猪分子育种材料背景选择中的应用。
本发明的有益效果为：
1、本发明的晋汾白猪高密度SNP芯片检测试剂盒以猪Ilumina SNP 60K芯片为模板，依据晋汾白猪及其马身猪、太湖猪、长白猪和大白猪4个亲本群体为测定群体，设计芯片检测试剂盒具有群体多样性和代表性。该芯片检测试剂盒主要包括了本发明检测到的特异SNP位点和先前已成熟的显著位点，既提升了我国地方猪种和培育猪种的检测效率，也保持对知名品种相近的检测效率，在猪分子育种更具有应用价值。
2、本发明的晋汾白猪高密度SNP芯片检测试剂盒利用最新的猪参考基因组(Sscrofa 11.1)版本对现已成熟的猪Ilumina SNP 60K进行位点升级，整合晋汾白猪特异SNP位点，依据SNP效应估计结果的精确性和在基因组中的分布，剔除原60K芯片中约9000个无效位点。
3、通过本发明的芯片检测试剂盒可以低成本、快速的检测出相关SNP标记，对猪选种选育具有重要意义，大大提高我国猪育种选育进程。
附图说明
图1是晋汾白猪个体ROH长度的样本数分布图；
图2是晋汾白猪染色体上ROH数量分布图；
图3是头晋汾白猪个体间的亲缘关系图；
图4是图3中左下角标示的放大示意图。
具体实施方式
实施例1
本发明提供一种晋汾白猪全基因组SNP芯片，SNP芯片由96963个SNP位点组成，其中晋汾白猪特异性SNP位点55957个，其余SNP位点的标记探针与猪60K芯片探针一致，55957个晋汾白猪特异性SNP位点中包括76个能够分开晋汾白猪家系的晋汾白猪特异SNP位点，该76个晋汾白猪特异性SNP分子标记的探针如SEQ NO.1-SEQ NO.76所示，具体如表1所示：
表1 76个晋汾白猪特异性SNP位点的探针位点信息表
Figure BDA0002722090020000051
Figure BDA0002722090020000061
Figure BDA0002722090020000071
实施例2
本发明提供一种包含实施例1中SNP芯片的检测试剂盒，本发明的晋汾白猪全基因组高密度SNP芯片检测试剂盒以晋汾白猪及其马身猪、太湖猪、长白猪和大白猪4个亲本深度重测序数据分析，获得55957个晋汾白猪特异SNP位点。以猪Ilumina SNP 60K芯片为模板，利用最新的猪参考基因组(Sscrofa 11.1)版本对现已成熟的猪Ilumina SNP 60K进行位点升级，整合晋汾白猪特异SNP位点，剔除原60K芯片中约9000个无效位点，共获得96963个有效SNP，最终定制集基因组DNA提取、文库构建、基因分型于一体的高密度(100K)基因芯片检测试剂盒(M01455)。
实施例3
本发明的一种晋汾白猪全基因组高密度SNP芯片检测试剂盒主要包括以下步骤：
步骤S1，晋汾白猪及其马身猪、太湖猪、大白猪和长白猪四个亲本重测序检测；
步骤S2，对重测序数据进行质控；
步骤S3，将质控数据比对到猪参考基因组上，去除重复；
步骤S4，使用GATK4软件BaseRecalibration方法进行重比对后，再使用HaplotypeCaller对每个样本生成GVCF，对每个猪种(晋汾白猪、马身猪、长白猪、大白猪、太湖猪)进行VariantRecaliration(位点重比对)，使用VariantFilteration工具进行位点质量过滤，最终得到所有样本SNP变异位点的集合。
步骤S5，利用晋汾白猪及其马身猪、太湖猪、大白猪和长白猪四个亲本的重测序数据分析获得晋汾白猪特异SNP位点；筛选标准为：等位基因频率＞0.1、将重测序数据获得的晋汾白猪特异SNP位点与NCBI网站SNP数据库中的位点进行比对，最终筛选获得55957个仅在晋汾白猪群体中出现的晋汾白猪特异SNP位点，其中包含76个能够区分开晋汾白猪家系的晋汾白猪特异SNP位点；其余的55881个SNP位点序列已被相关文献公开，故不再列出该SNP分子标记的探针序列；
步骤S6，以猪Illumina SNP 60K芯片为模板，利用猪最新参考基因组(Sscrofa11.1)版本进行位点升级，根据SNP效应估计结果的精确性和在基因组中的分布，对SNP进行筛选的优化，剔除原60K芯片中约9000个无效位点。
实施例4
利用晋汾白猪全基因组高密度SNP芯片检测试剂盒鉴定群体遗传多样性。
获取数据，30头晋汾白猪来自大同种猪场、平定华亿种猪饲养场、绛县佳绿养殖合作社，同样按不同家系随机筛选。耳组织取样，以备DNA的抽提。
利用晋汾白猪全基因组高密度SNP检测试剂盒对30头晋汾白猪进行检测。
利用PLINK软件计算遗传多样性指数：多态性标记比(PN)、观察杂合度(Ho)和期望杂合度(He)。
利用PLINK软件对每个个体的ROH进行估算，统计每一个猪样本ROH的详细分布长度和数目，然后通过计算个体中ROH片段的总长度占常染色体基因组总长的比例得到基于ROH的近交系数。计算公式如下：
Figure BDA0002722090020000081
LROH为常染色体上ROH片段的长度之和，Lgenome为常染色体的物理长度之和。
(5)采用Gmatrix软件构建群体G矩阵，并通过R语言绘制热图展现样本之间的遗传亲缘关系。计算公式如下：
Figure BDA0002722090020000091
其中，Z是单位矩阵；Z’是Z的逆矩阵；Pi是第i个等位基因的频率。
利用晋汾白猪全基因组高密度SNP芯片检测试剂盒获得SNP计算评估遗传多样性的指数，多态性标记比(PN)为0.62，观察杂合度(Ho)为0.31，期望杂合度(He)为0.30。
所有晋汾白猪个体的ROH结果如图1和图2，共检测到2486个ROH片段，1～2Mb长度的ROH数量最多、占78.96％。最短的ROH长度为1.00Mb，位于第2条染色体；最长的ROH长度为105.01Mb，位于2号染色体。单个个体的ROH总长度从58.78Mb到302.41Mb不等，平均长度为136.94Mb，ROH总长度在50～150Mb内的个体数量最多，占73.33％(图2)。晋汾白猪ROH的数量与染色体的物理长度呈正比，染色体越长，检测到的ROH数量越多。在猪的18条常染色体上，1号染色体的ROH数量最多、为502个，12号染色体上最少、为22个(图2)。不同个体检测到的ROH数量变化较大，从最少的33个到最多的186个，平均为82.86个。通过对群体中各个体的ROH统计，获得每个个体基于ROH的近交系数值，当前整个群体的平均近交系数值为0.0558。
利用G矩阵评估部分晋汾白猪个体间的亲缘关系。如图3和图4所示的G矩阵结果中，该方格颜色越接近深色说明两个个体的亲缘关系越近。30个样本共形成435个关系对，73.33％个体对亲缘关系较远(亲缘系数小于0)，18.40％个体对亲缘关系较近(亲缘系数0～0.1)。
序列表
<110> 山西农业大学
<120> 晋汾白猪全基因组高密度SNP芯片检测试剂盒及其应用
<130> 无
<160> 76
<170> PatentIn version 3.5
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<213> 人工序列
<221> misc_feature
<222> (1)..(40)
<223> 晋汾白猪特异性SNP分子标记探针
<400> 21
gtgggatcca ggaggagagg gagtcacttg ggcagatagg 40
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<212> DNA
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<223> 晋汾白猪特异性SNP分子标记探针
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cacatgtcac cttccctttg tcaccaccag ctttttatgc 40
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gttcaaatgc attttccaca tgtaacagcc ccatgcaaag 40
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aggccccctg ctgggcagca ccagccggct ggtagcacag 40
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cgagcggtag ataagggctc aaccctcacg agtcctatac 40
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tttgttatta ttcataggca caactttttc ctctaataag 40
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tgtgggcata cagaggttca gcaggtgaga acggcaggtg 40
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gccacgtagc ggtcataggc catgaccacc aggatgaagg 40
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aagccccttc cctcatggca ggggacaagg gaatgggcag 40
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agcctcgctc ctttcattgt acccagagcc ttgcctgttg 40
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aaacatttga gataaaggga aaaagtataa ggtacatcct 40
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gctgcaagaa ttcccaaagt ccacactgtg ccctcctaga 40
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gtctctgaga aggagagaat ttctgctgat gtggttaagg 40
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<223> 晋汾白猪特异性SNP分子标记探针
<400> 59
caagtgctcc tcacaagtta taacaatgag tgaaaacctc 40
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cccgccccca ccctcccaaa aagaagctct agtgttaatg 40
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<400> 61
tgcttaatca cttccttatt ctctcttcca tggctctctc 40
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<223> 晋汾白猪特异性SNP分子标记探针
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gtcctgccgt gccccgcccc agccttaatg cccacgatgc 40
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ttaggtagac aactgacatt catttcagca gctcagaacc 40
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tcagggtgag ggcagggatc accccctttg taggactcag 40
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<223> 晋汾白猪特异性SNP分子标记探针
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ccccaccagg cacccacctc cagggctggg ccgacagacc 40
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<223> 晋汾白猪特异性SNP分子标记探针
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gttcagttat ggttttgctc tggaaggctc tatgaaaaag 40
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<223> 晋汾白猪特异性SNP分子标记探针
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ttcctgatgg gggcatctat acactctccc tgccttattc 40
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<223> 晋汾白猪特异性SNP分子标记探针
<400> 68
gattttagct gttaaaatta acgttcagcg taggggttcc 40
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<223> 晋汾白猪特异性SNP分子标记探针
<400> 69
gtgtgtggcc cagcacagcc aagggtgggg gctgagtctg 40
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<212> DNA
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<223> 晋汾白猪特异性SNP分子标记探针
<400> 70
tgactagaac tgaaaggttg tctatgctga gaggggttgg 40
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<223> 晋汾白猪特异性SNP分子标记探针
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tgctctaggg agggtggcgt gggaggaggc agcttctagg 40
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<223> 晋汾白猪特异性SNP分子标记探针
<400> 72
gttactttca atcaaccgga aatgcatttc agcagagtcc 40
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<213> 人工序列
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<223> 晋汾白猪特异性SNP分子标记探针
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aagtcctctt tgaacaacag agcaatatta gaagaacagg 40
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<212> DNA
<213> 人工序列
<221> misc_feature
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<223> 晋汾白猪特异性SNP分子标记探针
<400> 74
cctgcatggc agttataaga gcctttgcca actgatacac 40
<210> 75
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<212> DNA
<213> 人工序列
<221> misc_feature
<222> (1)..(40)
<223> 晋汾白猪特异性SNP分子标记探针
<400> 75
gtgtatcagt tggcaaaggc tcttataact gccatgcagg 40
<210> 76
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> misc_feature
<222> (1)..(40)
<223> 晋汾白猪特异性SNP分子标记探针
<400> 76
tgatgtgaca aacccagctc tatggctgtg gctgtagacg 40

Claims (8)

1.一种晋汾白猪全基因组SNP芯片，其特征在于，所述SNP芯片由96963个SNP位点组成，其中晋汾白猪特异性SNP位点55957个，其余SNP位点的标记探针与猪60K芯片探针一致，55957个晋汾白猪特异性SNP位点中包括76个能够分开晋汾白猪家系的晋汾白猪特异SNP位点，该76个晋汾白猪特异性SNP分子标记的探针如SEQ NO.1-SEQ NO.76所示。
2.一种晋汾白猪全基因组SNP芯片检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒含有权利要求1所述的SNP芯片。
3.如权利要求2所述的一种晋汾白猪全基因组SNP芯片检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒的制作方法包括以下步骤：
步骤S1，晋汾白猪及其马身猪、太湖猪、大白猪和长白猪四个亲本重测序检测；
步骤S2，对重测序数据进行质控；
步骤S3，将质控数据比对到猪参考基因组上，去除重复；
步骤S4，使用GATK4软件BaseRecalibration方法进行重比对后，再使用HaplotypeCaller对每个样本生成GVCF，对晋汾白猪及其马身猪、长白猪、大白猪、太湖猪四个猪种进行位点重比对，使用VariantFilteration工具进行位点质量过滤，最终得到所有样本SNP变异位点的集合；
步骤S5，利用晋汾白猪及其马身猪、太湖猪、大白猪和长白猪四个亲本的重测序数据分析获得晋汾白猪特异SNP位点；筛选标准为：等位基因频率＞0.1、将重测序数据获得的晋汾白猪特异SNP位点与NCBI网站SNP数据库中的位点进行比对，最终筛选获得55957个仅在晋汾白猪群体中出现的晋汾白猪特异SNP位点，其中包含76个能够区分开晋汾白猪家系的晋汾白猪特异SNP位点；
步骤S6，以猪Illumina SNP 60K芯片为模板，利用猪最新参考基因组版本进行位点升级，根据SNP效应估计结果的精确性和在基因组中的分布，对SNP进行筛选的优化，剔除原60K芯片中无效位点；
步骤S7，将晋汾白猪特异SNP位点和位点升级后的主SNP 60K芯片位点整合，获得了96963个有效SNP，定制晋汾白猪全基因组高密度SNP芯片检测试剂盒。
4.如权利要求1中任意一项所述的晋汾白猪全基因组SNP芯片，其特征在于，所述SNP芯片在不同品种猪亲子鉴定中的应用。
5.如权利要求1中任意一项所述的晋汾白猪全基因组SNP芯片，其特征在于，所述SNP芯片在不同品种猪基因组选择中的应用。
6.如权利要求1中任意一项所述的晋汾白猪全基因组SNP芯片，其特征在于，所述SNP芯片在猪聚类分析、猪亲缘关系分析中的应用。
7.如权利要求1中任意一项所述的晋汾白猪全基因组SNP芯片，其特征在于，所述SNP芯片在猪连锁图谱构建和基因定位中的应用。
8.如权利要求1中任意一项所述的晋汾白猪全基因组SNP芯片，其特征在于，所述SNP芯片在猪分子育种材料背景选择中的应用。
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