CN115537471A - 用于鉴别深县猪的snp位点组合、试剂盒及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了用于鉴别深县猪的SNP位点组合、应用及所述SNP位点组合的筛选方法，涉及分子生物学技术领域。所述SNP位点组合由10个SNP位点组成。应用这些SNP特征位点组合可将深县猪从大白猪、杜洛克猪、蓝塘猪、民猪和北京黑猪群体中鉴别出来。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，尤其是涉及用于鉴别深县猪的SNP位点组合、应用及所述SNP位点组合的筛选方法。
背景技术
深县猪是分布于我国河北省中南部的一种古老家猪，纯种深县猪具有耐粗饲、抗逆性强、耐近交、肉质优异、肌内脂肪含量高等品种优势。然而，当前纯种深县猪群体规模小，难以实施有效的育种选育，在对其进行种质资源利用的同时亟需保种扩繁。
SNP是广泛存在于基因组中的一类DNA序列变异，是由单个碱基的转换或颠换引起的点突变，稳定而可靠，并通常以二等位基因的形式出现。SNP作为遗传标记，其等位基因频率在不同群体中存在差异，因此在物种鉴定等领域得到了广泛应用。现有技术中，基于全基因组重测序或高密度SNP芯片数据进行品种鉴别的成本相对较高。因此，有必要研发一种新的适合用于鉴别深县猪的方法。
鉴于此，本发明筛选了一种用于深县猪鉴别的SNP特征位点组合及其筛选方法与应用。
发明内容
本发明的目的在于提供用于鉴别深县猪的SNP位点组合、应用及所述SNP位点组合的筛选方法。本发明首次经过深入的研究，从大量群体SNP位点(139547个)中筛选得到适用于深县猪种质资源鉴定的SNP特征位点组合。应用这些SNP特征位点组合可将深县猪从大白猪、杜洛克猪、蓝塘猪、民猪和北京黑猪群体中鉴别出来。
在一个方面，本发明提供了用于鉴别深县猪的SNP位点组合，所述SNP位点组合由以下10个SNP位点组成：
SNP位点1：chr1:93005281位置的C或T，
SNP位点2：chr1:252504281位置的C或G，
SNP位点3：chr1:2876173位置的C或T，
SNP位点4：chr2:11972846位置的A或G，
SNP位点5：chr2:24851224位置的C或T，
SNP位点6：chr3:45739362位置的A或G，
SNP位点7：chr4:13264289位置的T或G，
SNP位点8：chr9:111271153位置的C或T；
SNP位点9：chr10:3286345位置的C或T，和
SNP位点10：chr10:15307369位置的C或G；
所述SNP位点的位置是基于猪Sscrofa11.1参考基因组序列确定的。
在一个方面，本发明提供了用于检测所述的SNP位点组合的试剂，所述试剂用于检测所述SNP位点的单核苷酸多态性；优选地，所述试剂包括用于扩增含所述SNP位点的产物的PCR引物。
在本发明中，可以根据上述的SNP位点，针对这些位点所在的一段基因序列设计相应的引物，再通过荧光定量PCR的方法，扩增该片段，再通过扩增结果确定该SNP位点。
在一个方面，用于检测所述的SNP位点组合的基因芯片，所述基因芯片包含检测所述SNP位点的核苷酸探针；优选地，所述核苷酸探针固定在固体载体上。
在现有技术中，多种用于检测SNP分子标记(SNP位点)的多态性的检测方法对于本发明均适用。例如包括但不限于以下一种或几种：基于凝胶电泳的SNP检测法、DNA测序法、DNA芯片法、变性高效液相色谱法或质谱检测法。
在一个方面，本发明提供了所述的SNP位点组合、所述的试剂或所述的基因芯片在猪品种鉴别和/或猪育种中的应用。
在一个实施方案中，所述猪品种鉴别包括鉴别深县猪与非深县猪品种。
在一个实施方案中，所述非深县猪品种包括大白猪、杜洛克猪、北京黑猪、蓝塘猪和民猪中的一种或多种。
在本发明中，可以以所述SNP位点的组合为基础，设计常规产品用于猪种质鉴定、分型(区分或辅助鉴别待测猪是否为深县猪或非深县猪)。也可以利用本发明提供的SNP位点信息，进行猪种质资源改良和育种方面的应用。
例如一种基于SNP位点组合的猪遗传改良的方法，所述方法包括：确定种猪所述的SNP位点信息，并根据所述SNP位点的多态性做出相应的选择；淘汰在这些位点为非目的基因型的种猪个体。
在实际中，也可以根据检测待测猪基因组中所述SNP位点组合的基因型，选择目的基因型的猪进行交配育种。
在一个方面，本发明提供了基于所述的SNP位点组合鉴别深县猪与大白猪、杜洛克猪、北京黑猪、蓝塘猪和民猪的方法，包括：
(a)提取待测猪基因组DNA作为模板；
(b)对含有所述SNP位点组合的目的片段进行扩增并测序；
(c)根据相应SNP位点的基因型确定所述猪的品种。
在一个实施方案中，当所述SNP位点的基因型的结果显示SNP位点1～SNP位点10对应的碱基为CT/TT、GC/CC、CT/TT、GG/AG、CC/TC、AA/GA、GG/TG、TT/CT、TC/CC、GG/CG时，则为深县猪。
在一个方面，本发明提供了所述的SNP位点组合的筛选方法，包括以下步骤：
(a)将深县猪重测序得到的全基因组SNP数据与已知的公共数据库中的大白猪、杜洛克猪、北京黑猪、蓝塘猪和民猪的全基因组SNP数据进行质控及合并；
(b)将步骤(a)中的不同品种个体的70％划分为训练集，剩余30％划分为测试集；
(c)利用最大分类能力方法选取SNP；
(d)结合机器学习方法中的逻辑回归分类器和贝叶斯分类器对步骤(c)中挑选出的信息SNP进行特征选择；
(e)利用主成分分析方法在测试集中对步骤(d)挑选出的特征位点进行验证。
在一个实施方案中，步骤(a)中选取39头深县猪获取全基因组SNP数据，以及选择16头大白猪、22头杜洛克猪、22头北京黑猪、5头蓝塘猪和5头民猪的全基因组SN及合并；
随机将步骤(a)中6品种个体的70％(共87头)划分为训练集，剩余30％(共22头)划分为测试集；
优选地，质控标准为：剔除SNP检出率＜99％、最小等位基因频率＜0.05、哈代-温伯格平衡检验P值＜10-50以及没有染色体位置信息的SNP位点。
有益效果：
本发明首次获得用于鉴别深县猪的SNP位点组合，应用该SNP特征位点组合可将深县猪从大白猪、杜洛克猪、蓝塘猪、民猪和北京黑猪群体中鉴别出来；
本发明的SNP位点组合能将深县猪从其它5个品种猪中区分，准确率高；
本发明的SNP位点组合可作为分子标记物用于猪种质资源鉴定、辅助育种等技术；
本发明的方法可进一步收集疑似深县猪个体，防止杂种个体混入污染血缘，有利于有效提高种猪育种的经济效益，对深县猪群体规模的扩大及后续合理开发利用有重要意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例提供的基于139547个SNP位点对深县猪、大白猪、杜洛克猪、北京黑猪、蓝塘猪和民猪进行主成分分析的结果图：其中，pc1：主成分1；pc2：主成分2；
图2为本发明实施例提供的基于筛选出的10个深县猪SNP特征位点对深县猪、大白猪、杜洛克猪、北京黑猪、蓝塘猪和民猪进行主成分分析的结果图：其中，pc1：主成分1；pc2：主成分2；
图3为本发明实施例提供的基于本发明筛选出的10个SNP特征位点计算得出的109个个体间基因组亲缘关系的聚类图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1.SNP位点的筛选
实验猪群：本发明使用的材料包括39头深县猪、16头大白猪、22头杜洛克猪、22头北京黑猪、5头蓝塘猪和5头民猪。
采用华大制造的DNBseq PE150对39头深县猪个体进行二代重测序，用TrimGalore0.6.5去除低质量的序列和接头序列，相关参数为：--quality 20、--phred33、--stringency 3、--length 20、-e 0.1。
使用BWA 0.7.17将质控后的数据比对到猪11.1版本(Sus scrofa 11.1)的参考基因组上，并用GATK 4.2.0.0对深县猪进行群体SNP检测。
将深县猪全基因组SNP数据与公共数据库中下载的70头其他品种猪的全基因组SNP数据进行质控及合并，质控标准为：剔除SNP检出率＜99％、最小等位基因频率＜0.05、哈代-温伯格平衡检验P值＜10-50以及没有染色体位置信息的SNP位点，共得到139547个SNP位点，利用这些位点对6个品种109个个体进行主成分分析，结果如图1所示，其中SX代表深县猪，YY代表大白猪，DD代表杜洛克猪，BJ代表北京黑猪，LT代表蓝塘猪，MIN代表民猪，由图1可知深县猪与大白猪、北京黑猪及杜洛克猪群体可以区分开，但无法与蓝塘猪和民猪进行区分。
随机将6品种个体的70％(共87头)划分为训练集，剩余30％(共22头)划分为测试集，运用最大分类能力方法在训练集中进行信息SNP的选择，得到具有强分类能力的SNP1792个，再运用逻辑回归分类器进行正则化选择筛选出9个SNP位点，进一步在之前挑选出的9个位点的基础上使用朴素贝叶斯分类器通过包裹式的方法筛选位点，最后共得到10个SNP位点，此时准确率达到最大。
在测试集中分别用朴素贝叶斯、逻辑回归方法和k邻近分类器计算了该10个SNP位点的准确性，分别是0.9545、0.9545和1.0000。
筛选出的10个SNP位点为：猪Sscrofa11.1参考基因组chr1:93005281位置的C或T、chr1:252504281位置的C或G、chr1:2876173位置的C或T、chr2:11972846位置的A或G、chr2:24851224位置的C或T、chr3:45739362位置的A或G、chr4:13264289位置的T或G、chr9:111271153位置的C或T、chr10:3286345位置的C或T、chr10:15307369位置的C或G。
10个SNP位点在深县猪和其它5个品种中的基因型情况如表1所示。SX代表深县猪，YY代表大白猪，DD代表杜洛克猪，BJ代表北京黑猪，LT代表蓝塘猪，MIN代表民猪。以SNP位点：chr3:45739362为例，在深县猪个体中AA的比例很高(32/39)，而在其它品种中该位点基因型均为AG或GG。每个SNP特征位点在深县猪中的主要基因型都与其它品种猪不一样，因此通过该10个特征位点的组合可以将深县猪从大白猪、杜洛克猪、北京黑猪、蓝塘猪和民猪中鉴别出来。
表1. 10个SNP特征位点在6个品种中分布情况
实施例2. 10个SNP位点鉴别深县猪与其他猪的应用
为了验证该10个SNP特征位点是否能将深县猪从大白猪、杜洛克猪、北京黑猪、蓝塘猪和民猪中鉴别出来，采用这10个SNP位点对全部109个个体进行了主成分分析，结果如图2所示，由图可知：通过该10个SNP位点可以将深县猪与其它5个品种区分开，表明本发明筛选出的10个SNP特征位点可用于深县猪的鉴别。进一步基于该10个位点利用GCTA软件计算了109个个体两两间的基因组亲缘关系，并绘制聚类图，如图3，从聚类结果可以看出39个深县猪单独聚成一大类，与其它品种猪可以很好的区分开。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.用于鉴别深县猪的SNP位点组合，其特征在于，所述SNP位点组合由以下10个SNP位点组成：
SNP位点1：chr1:93005281位置的C或T，
SNP位点2：chr1:252504281位置的C或G，
SNP位点3：chr1:2876173位置的C或T，
SNP位点4：chr2:11972846位置的A或G，
SNP位点5：chr2:24851224位置的C或T，
SNP位点6：chr3:45739362位置的A或G，
SNP位点7：chr4:13264289位置的T或G，
SNP位点8：chr9:111271153位置的C或T；
SNP位点9：chr10:3286345位置的C或T，和
SNP位点10：chr10:15307369位置的C或G；
所述SNP位点的位置是基于猪Sscrofa11.1参考基因组序列确定的。
2.用于检测权利要求1所述的SNP位点组合的试剂，其特征在于，所述试剂用于检测所述SNP位点的单核苷酸多态性；优选地，所述试剂包括用于扩增含所述SNP位点的产物的PCR引物。
3.用于检测权利要求1所述的SNP位点组合的基因芯片，其特征在于，所述基因芯片包含检测所述SNP位点的核苷酸探针；优选地，所述核苷酸探针固定在固体载体上。
4.权利要求1所述的SNP位点组合、权利要求2所述的试剂或权利要求3所述的基因芯片在猪品种鉴别和/或猪育种中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述猪品种鉴别包括鉴别深县猪与非深县猪品种。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述非深县猪品种包括大白猪、杜洛克猪、北京黑猪、蓝塘猪和民猪中的一种或多种。
7.一种基于权利要求1所述的SNP位点组合鉴别深县猪与大白猪、杜洛克猪、北京黑猪、蓝塘猪和民猪的方法，其特征在于，包括：
(a)提取待测猪基因组DNA作为模板；
(b)对含有所述SNP位点组合的目的片段进行扩增并测序；
(c)根据相应SNP位点的基因型确定所述猪的品种。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，当所述SNP位点的基因型的结果显示SNP位点1～SNP位点10对应的碱基为CT/TT、GC/CC、CT/TT、GG/AG、CC/TC、AA/GA、GG/TG、TT/CT、TC/CC、GG/CG时，则为深县猪。
9.权利要求1所述的SNP位点组合的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
(a)将深县猪重测序得到的全基因组SNP数据与已知的公共数据库中的大白猪、杜洛克猪、北京黑猪、蓝塘猪和民猪的全基因组SNP数据进行质控及合并；
(b)将步骤(a)中的不同品种个体的70％划分为训练集，剩余30％划分为测试集；
(c)利用最大分类能力方法选取SNP；
(d)结合机器学习方法中的逻辑回归分类器和贝叶斯分类器对步骤(c)中挑选出的信息SNP进行特征选择；
(e)利用主成分分析方法在测试集中对步骤(d)挑选出的特征位点进行验证。
10.根据权利要求9所述的筛选方法，其特征在于，步骤(a)中选取39头深县猪获取全基因组SNP数据，以及选择16头大白猪、22头杜洛克猪、22头北京黑猪、5头蓝塘猪和5头民猪的全基因组SNP数据进行质控及合并；
优选地，质控标准为：剔除SNP检出率＜99％、最小等位基因频率＜0.05、哈代-温伯格平衡检验P值＜10-50以及没有染色体位置信息的SNP位点。
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