CN106754647A - 一种大鲵皮肤表皮细胞的分离、培养及鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种大鲵皮肤表皮细胞的分离、培养及鉴定方法，该方法是从大鲵尾部获得皮肤组织，利用组织块法分离获得原代大鲵皮肤表皮细胞，在28℃及特定培养液(成分：DMEM/F12(60％)+15％FBS+5μg/mL胰岛素+10ng/mL KGF)中进行原代和传代培养，并利用RT‑PCR对获得的大鲵皮肤表皮细胞进行特异性基因(K5、K10和P63)表达鉴定。本发明利用相近物种基因序列的同源性设计引物来对大鲵K5、K10和P63基因进行PCR扩增，首次获得大鲵K5、K10和P63基因序列。本发明提供的大鲵皮肤表皮细胞的分离、培养和鉴定的方法，为大鲵皮肤的深层次研究以及利用大鲵皮肤表皮细胞进行皮肤再生、创伤修复以及构建组织工程皮肤奠定了基础。

Description

一种大鲵皮肤表皮细胞的分离、培养及鉴定方法

技术领域

本发明属于细胞、组织工程技术领域，具体涉及一种大鲵皮肤表皮细胞的分离、培养及鉴定方法。

背景技术

大鲵是世界上现存最大最珍贵的两栖动物，是国家二类水生野生保护动物，也是农业产业化和特色农业重点开发品种，已在我国多地养殖并形成一定产量，2012年大鲵养殖量已经突破330万尾。研究表明，人工养殖大鲵的皮肤中含有丰富的Ⅰ型胶原蛋白，约占大鲵皮肤中蛋白质总量的62.89％，该胶原蛋白具有与哺乳动物胶原相似的氨基酸组成和性质，对人体没有排异性，同时具有嫩白、容颜、祛皱的美容功效。大鲵皮肤分泌的黏液含有多种“蛙皮素”，具有较强的抗菌作用，可作为新的抗生素药物来源进行研究开发。大鲵还有超强的再生和自我修复能力，民间常以其皮肤研粉拌桐油治疗火烫伤，促进皮肤再生。因此，大鲵皮肤及其分泌物的研究有着广阔的应用前景。

但是对于大鲵皮肤及其分泌物的研究还存在以下瓶颈：(1)大鲵表皮细胞的培养基组成成分、细胞培养温度等条件尚不明确，需要经过摸索，才能找到适合大鲵表皮细胞生长的培养条件。(2)大鲵表皮特异基因的序列目前还没有，需要根据基因序列的同源性，比较不同已知物种的序列，在同源性高的区域设计多对PCR引物进行摸索，找到能够扩增大鲵表皮特异基因的引物。因此目前关于大鲵皮肤表皮细胞的研究，特别是大鲵皮肤表皮细胞的分离、培养以及鉴定方法还未见报道。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的是提供一种大鲵皮肤表皮细胞的分离、培养及鉴定方法，该方法实现了大鲵皮肤表皮细胞的人工培养，为大鲵皮肤的实验研究提供了技术支持。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种大鲵皮肤表皮细胞的分离、培养及鉴定方法，包括以下步骤：

(1)取活体大鲵尾部的皮肤组织，放入PBS缓冲液中；

(2)在10min内，将放入PBS缓冲液的皮肤组织表面的粘液刮去，再放入75％酒精中浸泡10s；

(3)用PBS缓冲液清洗6-8次，将皮肤组织剪成直径1mm的组织块，将组织块贴到T25培养瓶中，加入4mL培养液进行贴壁培养，每天更换新鲜培养液，皮肤组织块贴壁培养6天后进行传代培养，得到大鲵皮肤表皮细胞。

所述的PBS缓冲液为4℃预冷、体积分数60％的添加双抗的PBS缓冲液，双抗为青霉素和链霉素，其中，青霉素为500U/mL，链霉素为0.5mg/mL。

所述的培养液主要成分为DMEM/F12培养基，除DMEM/F12培养基外，还包括培养液总体积15％的胎牛血清以及在培养液中浓度为5μg/mL的胰岛素、10ng/mL的KGF和双抗，双抗为青霉素和链霉素，其中，青霉素含量为100U/mL、链霉素含量为0.1mg/mL；所述的DMEM/F12培养基是体积分数60％的DMEM/F12培养基。

步骤(3)中的贴壁培养条件为28℃、5％CO₂。

所述的大鲵皮肤表皮细胞的分离、培养及鉴定方法，还包括大鲵特异表达基因K5、K10及P63基因的鉴定。

所述的大鲵特异表达基因K5、K10及P63基因的鉴定方法为：

(1)利用和大鲵同源性高的物种，针对大鲵K5、K10及P63基因，设计引物；

(2)提取大鲵皮肤表皮细胞RNA，反转录成cDNA，以cDNA为模板，利用引物，分别进行PCR扩增；

(3)电泳检测PCR扩增产物并回收目的片段，对目的片段进行测序。

所述的引物如下：

大鲵K5基因上游引物：5’-CAGGACTCTGCTTCAACTCG-3’；下游引物：5’-CGACCAGGAGTAACATTGAAC-3’；

大鲵K10基因上游引物：5’-ACTCACCCTGTCCAAATC-3’；下游引物：5’-TCAGCCATAGCCTCATAC-3’；

大鲵P63基因上游引物：5’-TGTATTGGTGCCGTATGA-3’；下游引物：5’-GTGTTGTCCGTCACTTGC-3’。

目前，人工养殖的大鲵资源丰富，大鲵皮肤及其分泌物用于再生、创伤修复以及组织工程材料的研究前景广阔。本发明在大鲵皮肤表皮细胞的分离、培养的过程中，通过不断探索，比较不同培养条件及对细胞生长、传代培养的影响，最终确定了大鲵表皮细胞的最佳培养条件：28℃、5％CO₂以及DMEM/F12(60％)+15％FBS+5μg/mL胰岛素+10ng/mL的角质细胞生长因子(KGF)。本发明的培养条件公开尚属首次，这为大鲵皮肤表皮细胞的分离和人工培养开辟了新的途径，为进一步深入研究大鲵皮肤表皮细胞的功能提供了技术支持。同时，本发明在大鲵皮肤表皮细胞的鉴定过程中，寻找与大鲵相近物种的基因序列，并将不同物种基因序列进行比对，设计引物，利用RT-PCR扩增大鲵皮肤表皮特异基因K5、K10和P63基因，并对扩增结果进行序列测定，首次获得大鲵K5、K10和P63基因的序列，这对大鲵皮肤深层次研究以及利用大鲵皮肤表皮细胞进行皮肤再生、创伤修复以及构建组织工程皮肤奠定了基础。

附图说明

图1是不同温度下，组织块贴壁培养4天的情况图(100×)。图中，A是26℃条件下，B是28℃条件下，C是37℃条件下。

图2为温度28℃时，不同时间段的细胞生长情况图。图中，A为大鲵皮肤组织块图(100×)，B为组织块贴壁培养2天的情况图(200×)，C为组织块贴壁培养4天的情况图(100×)，D为组织块贴壁培养4天的情况图(200×)，E为组织块贴壁培养6天的情况图(100×)，F为组织块贴壁培养6天的情况图(200×)。

图3为传代培养过程中不同时间段的细胞情况图。图中，A是传代后培养24h(200×)，B是传代后培养6天(200×)。

图4为在不同培养液中组织块贴壁培养6天的情况图。图中，A为培养液2(200×)，B为培养液3(100×)。

图5是PCR扩增K5基因结果。其中第1泳道为内参β-actin，第2泳道为Marker 2000，第3泳道为扩增得到的K5基因片段；

图6是PCR扩增K10基因结果。其中第1泳道为Marker 2000，第2泳道为内参β-actin，第3泳道为扩增得到的K10基因片段；

图7是PCR扩增P63基因结果。其中第1泳道为内参β-actin，第2泳道为Marker2000，第3泳道为扩增得到的P63基因片段。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

实施例1

本发明采用的大鲵皮肤表皮细胞的分离、培养方法，包括以下步骤：

(1)将活体大鲵固定后，从其尾部剪下1cm×1cm左右大小的皮肤组织，立即放入4℃预冷的、添加双抗(青霉素500U/mL、链霉素0.5mg/mL)的60％PBS缓冲液(将PBS缓冲液用高压灭菌的超纯水稀释至PBS体积分数60％)中，10min内运至实验室超净工作台中；

(2)在超净工作台中用眼科镊将PBS中的大鲵皮肤组织表面的粘液刮除干净，放入体积分数75％酒精中浸泡10s；

(3)用4℃预冷的、添加双抗(青霉素500U/mL、链霉素0.5mg/mL)的60％PBS缓冲液清洗6-8次，放入灭菌的安瓿瓶中；

(4)用眼科剪将大鲵皮肤组织剪成直径大约1mm的组织块；

(5)将组织块贴到T25培养瓶中(图2A)，加入4mL培养液，分别放入温度为26℃、28℃及37℃，5％CO₂培养箱中进行贴壁培养，每天更换新鲜培养液一次，并观察不同时间段的细胞生长情况，结果见图1A-C和图2B-F。

图1是不同温度条件下，组织块贴壁培养4天的情况。结果表明，温度为28℃时，细胞生长状态最好，优于温度为26℃时的细胞生长状态，当温度为37℃时几乎无细胞迁出。

图2B-F是温度为28℃时，不同时间段的细胞生长情况。结果表明，组织块在28℃、5％CO₂培养箱中贴壁培养2天开始有细胞迁出。贴壁培养4天，有细胞大量迁出，贴壁培养6天，细胞生长达到80％融合，可以进行传代培养。

(6)选择在28℃条件下贴壁培养6天的组织块，在培养瓶中加入0.25％胰酶进行消化，按1:3传代，观察传代后不同时间段培养的细胞生长情况(见图3A、3B)，并获得大鲵皮肤表皮细胞。

本发明实施例1方法中所述的培养液主要成分为DMEM/F12培养基，除DMEM/F12培养基外，还包括培养液总体积15％的胎牛血清以及在培养液中浓度为5μg/mL的胰岛素、10ng/mL的角质细胞生长因子(KGF)和双抗，双抗为青霉素和链霉素，其中，青霉素含量为100U/mL、链霉素含量为0.1mg/mL；所述的DMEM/F12培养基是体积分数60％的DMEM/F12培养基，使用前用高压灭菌的超纯水对DMEM/F12培养基进行稀释至DMEM/F12培养基体积分数60％[培养液配方简写为：DMEM/F12(60％)+15％FBS+5μg/mL胰岛素+10ng/mL KGF+双抗(青霉素100U/mL、链霉素0.1mg/mL)；后续培养液简写的含义同实施例1]。

实施例2

本发明采用的大鲵皮肤表皮细胞的分离、培养方法，包括以下步骤：

(1)将活体大鲵固定后，从其尾部剪下1cm×1cm左右大小的皮肤组织，立即放入4℃预冷的、添加双抗(青霉素500U/mL、链霉素0.5mg/mL)的60％PBS缓冲液中，10min内运至实验室超净工作台中；

(2)在超净工作台中用眼科镊将PBS中的大鲵皮肤组织表面的粘液刮除干净，放入体积分数75％酒精中浸泡10s；

(3)用4℃预冷的、添加双抗(青霉素500U/mL、链霉素0.5mg/mL)的60％PBS缓冲液清洗6-8次，放入灭菌的安瓿瓶中；

(4)用眼科剪将大鲵皮肤组织剪成直径大约1mm的组织块；

(5)将组织块贴到T25培养瓶中，分别加入4mL培养液1、培养液2和培养液3，再放入28℃、5％CO₂培养箱中培养，每天更换相应的新鲜培养液一次，并观察不同时间段的细胞生长情况。

培养液1为实施例1的培养液。

培养液2的配方为：DMEM/F12(60％)+15％FBS+双抗(青霉素100U/mL、链霉素0.1mg/mL)。

培养液3的配方为：DMEM/F12(60％)+15％FBS+1％胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂(ITS)(100×)+双抗(青霉素100U/mL、链霉素0.1mg/mL)。

(6)组织块贴壁培养6天后，观察细胞的生长情况，结果见图4A-B。

图4A为培养液2的细胞生长情况图。图4A结果表明，以培养液2培养的细胞，其细胞之间的连接非常松散，后续无法传代培养。

图4B为培养液3的细胞生长情况图。图4B结果表明，以培养液3培养的细胞，其细胞大量聚集在一起，不能均匀分散贴到培养瓶中，后续无法传代培养。

以上结果表明，本发明培养液1的配方明显优于培养液2和培养液3，采用培养液1对细胞进行培养，细胞生长情况良好，且能够用于后续传代培养。

实施例3

本发明利用实施例1获得的大鲵皮肤表皮细胞，对大鲵K5、K10及P63基因进行测序，包括以下步骤：

(1)引物设计

由于大鲵的K5、K10和P63基因序列尚未公布，首先选定与大鲵同源性较高的物种，再在NCBI数据库中查找这些物种的K5、K10和P63基因序列，利用BioXM软件对这些物种的K5、K10和P63基因序列进行比对，在同源性高的部位设计引物。设计的引物如下：

大鲵K5基因上游引物：5’-CAGGACTCTGCTTCAACTCG-3’(SEQ ID NO.1)；下游引物：5’-CGACCAGGAGTAACATTGAAC-3’(SEQ ID NO.2)；

大鲵K10基因上游引物：5’-ACTCACCCTGTCCAAATC-3’(SEQ ID NO.3)；下游引物：5’-TCAGCCATAGCCTCATAC-3’(SEQ ID NO.4)；

大鲵P63基因上游引物：5’-TGTATTGGTGCCGTATGA-3’(SEQ ID NO.5)；下游引物：5’-GTGTTGTCCGTCACTTGC-3’(SEQ ID NO.6)。

(2)大鲵表皮细胞RNA的提取

(a)将贴壁生长的细胞用0.25％胰酶消化分解后，并加入新鲜培养液(实施例1)中和、重悬，将重悬液加入15mL离心管中进行离心，小心将上清倒掉并按100μL中含有2×10⁶个细胞的量留少量上清。充分震荡直到细胞彻底混匀，再从中取100μL重悬液加入1.5mL EP管，备用。

(b)按照培养细胞/细菌总RNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司，DP430)说明书中的步骤提取大鲵皮肤表皮细胞总RNA。

(3)RNA反转录

以提取的大鲵皮肤表皮细胞RNA为模板，反转录成cDNA。

(a)取出总RNA(约500ng/μL)2μg放于PCR试管中，再分别加入dNTP(2.5mM each)1μL和0.5μg/μL OligodT 1μL。

(b)70℃加热5min，冰上放置2min。

(c)在同一管中加入2μL 10×Buffer，1μL RNase抑制剂(40U/μL)和1μL反转录酶(50U/μL)。

(d)轻轻混匀后置于42℃，60min。然后置于80℃，5min。

(4)PCR扩增

以RNA反转录得到的cDNA为模板，用设计好的引物分别进行PCR扩增。

PCR反应体系：

PCR反应程序：

其中2-4步循环30次。

(5)电泳检测及目的片段回收

取PCR产物5μL点样到1％的琼脂糖凝胶板上，以5V/cm的电压电泳30min，在凝胶成像系统中进行DNA条带的检测，检测到大鲵K5(图5)、K10(图6)和P63(图7)基因的表达。

同时，将PCR反应体系扩增的产物全部上样于琼脂糖胶上用以上参数进行电泳，电泳完后在紫外灯下将目的条带处的胶切下，并按照普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司，DP209)说明书中的操作步骤进行DNA回收。

(6)在金思特科技(南京)公司将回收的PCR产物进行序列测定。大鲵K5、K10和P63基因片段序列分别如下：

大鲵K5基因部分序列(451bp)：

CAGGACTCTGCTTCAACTCGGCTTCTGTCAGCGATCGCCTGATACTCAGCCTTGACCTCGGCGATGATGCTGCTCAGGTCCAAAGATCGGTTGTTGTCCATCGAGAGAACCACAGAGGTGTCGGAAACCTGTGACTGCATTTGAGCTAGTTCCGCGTCATAGAGAGCTCTGAGGAAGTTGATCTCATCAGTCAGACCATCCACTTTGCTCTCCAACTCCACTTTGTTCATGTAAGCAGCATCCACATCCTTCTTGAGCACCACAAAGTCATTCTCAGCAGCAGTGCGCTTGTTGATTTCATCTTCATACTTGTTCTTGAAATCTTCAACCATGTCCTGAATGTTCCTTAGTTCTGAATCCAGTCTATGTCTGTCATTGCCCAAGCCATCCAACTGCCTACGTAAGTTGTTAATATAAGCTTCAAACATGGGTTCAATGTTACTCCTGGTCG(SEQ IDNO.7)

大鲵K10基因部分序列(207bp)：

ACTCACCCTGTCCAAATCTGACCTGGAATCTCAGCTTGAAAGCCTTGTTGAAGAAATTGCTCTTCTTAAGAAGAACCATGAGGAGGAGGTTAAAGGAGGCCAAAAAACAACTGTTGGTGATGTCAACGTAGAAATGAATGCTGCTCCAGGAAGTGATCTGCTAAAGAAAATGAATGATATGCGAGAGCAGTATGAGGCTATGGCTGA(SEQ ID NO.8)

大鲵P63基因部分序列(249bp)：

TGTATTGGTGCCGTATGAACCCCCACAGGTTGGCACAGAATTTACTACGATATTGTACAATTTCATGTGCAACAGCAGCTGCGTGGGTGGGATGAACCGCCGGCCGATCCTGATCATTGTAACACTTGAAACAAGAGACGGTCAGGTTTTGGGGCGTCGGTGTTTTGAAGCTCGTATTTGCGCTTGTCCTGGCCGTGATCGCAAAGCAGATGAGGATAGCATTCGAAAGCAGCAAGTGACGGACAACAC(SEQ ID NO.9)。

SEQUENCE LISTING

<110> 洛阳师范学院

<120> 一种大鲵皮肤表皮细胞的分离、培养及鉴定方法

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

caggactctg cttcaactcg 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cgaccaggag taacattgaa c 21

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

actcaccctg tccaaatc 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tcagccatag cctcatac 18

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tgtattggtg ccgtatga 18

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gtgttgtccg tcacttgc 18

<210> 7

<211> 451

<212> DNA

<213> 大鲵（Andrias davidianus Blanchard）

<400> 7

caggactctg cttcaactcg gcttctgtca gcgatcgcct gatactcagc cttgacctcg 60

gcgatgatgc tgctcaggtc caaagatcgg ttgttgtcca tcgagagaac cacagaggtg 120

tcggaaacct gtgactgcat ttgagctagt tccgcgtcat agagagctct gaggaagttg 180

atctcatcag tcagaccatc cactttgctc tccaactcca ctttgttcat gtaagcagca 240

tccacatcct tcttgagcac cacaaagtca ttctcagcag cagtgcgctt gttgatttca 300

tcttcatact tgttcttgaa atcttcaacc atgtcctgaa tgttccttag ttctgaatcc 360

agtctatgtc tgtcattgcc caagccatcc aactgcctac gtaagttgtt aatataagct 420

tcaaacatgg gttcaatgtt actcctggtc g 451

<210> 8

<211> 207

<212> DNA

<213> 大鲵（Andrias davidianus Blanchard）

<400> 8

actcaccctg tccaaatctg acctggaatc tcagcttgaa agccttgttg aagaaattgc 60

tcttcttaag aagaaccatg aggaggaggt taaaggaggc caaaaaacaa ctgttggtga 120

tgtcaacgta gaaatgaatg ctgctccagg aagtgatctg ctaaagaaaa tgaatgatat 180

gcgagagcag tatgaggcta tggctga 207

<210> 9

<211> 249

<212> DNA

<213> 大鲵（Andrias davidianus Blanchard）

<400> 9

tgtattggtg ccgtatgaac ccccacaggt tggcacagaa tttactacga tattgtacaa 60

tttcatgtgc aacagcagct gcgtgggtgg gatgaaccgc cggccgatcc tgatcattgt 120

aacacttgaa acaagagacg gtcaggtttt ggggcgtcgg tgttttgaag ctcgtatttg 180

cgcttgtcct ggccgtgatc gcaaagcaga tgaggatagc attcgaaagc agcaagtgac 240

ggacaacac 249

Claims (7)

1.一种大鲵皮肤表皮细胞的分离、培养及鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)取活体大鲵尾部的皮肤组织，放入PBS缓冲液中；

(2)在10min内，将放入PBS缓冲液的皮肤组织表面的粘液刮去，再放入75％酒精中浸泡10s；

(3)用PBS缓冲液清洗6-8次，将皮肤组织剪成直径1mm的组织块，将组织块贴到T25培养瓶中，加入4mL培养液进行贴壁培养，每天更换新鲜培养液，皮肤组织块贴壁培养6天后进行传代培养，得到大鲵皮肤表皮细胞。

2.根据权利要求1所述的大鲵皮肤表皮细胞的分离、培养及鉴定方法，其特征在于，所述的PBS缓冲液为4℃预冷、体积分数60％的添加双抗的PBS缓冲液，双抗为青霉素和链霉素，其中，青霉素为500U/mL，链霉素为0.5mg/mL。

3.根据权利要求1所述的大鲵皮肤表皮细胞的分离、培养及鉴定方法，其特征在于，所述的培养液主要成分为DMEM/F12培养基，除DMEM/F12培养基外，还包括培养液总体积15％的胎牛血清以及在培养液中浓度为5μg/mL的胰岛素、10ng/mL的KGF和双抗，双抗为青霉素和链霉素，其中，青霉素含量为100U/mL、链霉素含量为0.1mg/mL；所述的DMEM/F12培养基是体积分数60％的DMEM/F12培养基。

4.根据权利要求1所述的大鲵皮肤表皮细胞的分离、培养及鉴定方法，其特征在于，步骤(3)中的贴壁培养条件为28℃、5％CO₂。

5.根据权利要求1-4任一项所述的大鲵皮肤表皮细胞的分离、培养及鉴定方法，其特征在于，还包括大鲵特异表达基因K5、K10及P63基因的鉴定。

6.根据权利要求5所述的大鲵皮肤表皮细胞的分离、培养及鉴定方法，其特征在于，所述的大鲵特异表达基因K5、K10及P63基因的鉴定方法为：

(1)利用和大鲵同源性高的物种，针对大鲵K5、K10及P63基因，设计引物；

(2)提取大鲵皮肤表皮细胞RNA，反转录成cDNA，以cDNA为模板，利用引物，分别进行PCR扩增；

(3)电泳检测PCR扩增产物并回收目的片段，对目的片段进行测序。

7.根据权利要求6所述的大鲵皮肤表皮细胞的分离、培养及鉴定方法，其特征在于，所述的引物如下：

大鲵K5基因上游引物：5’-CAGGACTCTGCTTCAACTCG-3’；下游引物：5’-CGACCAGGAGTAACATTGAAC-3’；

大鲵K10基因上游引物：5’-ACTCACCCTGTCCAAATC-3’；下游引物：5’-TCAGCCATAGCCTCATAC-3’；

大鲵P63基因上游引物：5’-TGTATTGGTGCCGTATGA-3’；下游引物：5’-GTGTTGTCCGTCACTTGC-3’。