CN105441448B - miR-192对绵羊骨骼肌卫星细胞增殖分化调控应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种非编码小RNA miR‑192在抑制绵羊骨骼肌卫星细胞成肌分化和促进绵羊骨骼肌卫星细胞增殖中的应用，将非编码小RNA miR‑192的类似物转染至绵羊骨骼肌卫星细胞内造成细胞内miR‑192的过量表达，过表达miR‑192的绵羊骨骼肌卫星细胞与过表达对照核苷酸序列的细胞相比，绵羊骨骼肌卫星细胞分化受到抑制，但增殖能力得到提高。本发明还提供miR‑192在绵羊骨骼肌卫星细胞内抑制RB1蛋白水平表达的应用。本发明首次发现了miR‑192具有负调控绵羊骨骼肌卫星细胞成肌分化和促进绵羊骨骼肌卫星细胞增殖的功能。

Description

miR-192对绵羊骨骼肌卫星细胞增殖分化调控应用

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及miR-192对绵羊骨骼肌卫星细胞增殖分化调控应用。

背景技术

骨骼肌卫星细胞是一种称体肌源性干细胞，负责动物骨骼肌损伤后的再生,是一种研究骨骼肌生发育的体外模型。当骨骼肌遭遇损伤后，骨骼肌卫星细胞能迅速启动修复程序，在很短时间内可融合为新的肌管,或融合到损伤的肌纤维中修复肌肉组织。在发育生物学中，骨骼肌损伤后的再生过程被认为同骨骼肌的发育过程非常相似，而骨骼肌卫星细胞负责动物骨骼肌损伤后的再生，因此，骨骼肌卫星细胞的成肌分化和增殖可作为体外模拟骨骼肌生长发育的模型，进而更加深入研究骨骼肌的生长发育过程。

绵羊作为一种重要的家养动物，其产肉量和肉品质一直是人们关注的热点。解析绵羊骨骼肌生长发育的生物学机理，可为提高其产肉量和肉品质提供科学依据。

虽然miR-192已被发现参与了癌细胞的发生，但其在骨骼肌卫星细胞成肌分化和增殖中的作用尚不清楚。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供miR-192序列在对绵羊骨骼肌卫星细胞增殖分化调控应用。

miR-192序列，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID No:1所示。

在绵羊骨骼肌卫星细胞中，所述的miR-192序列在抑制成肌分化中的应用。

在绵羊骨骼肌卫星细胞中，所述的miR-192序列在促进增殖中的应用。

所述的miR-192序列在抑制RB1基因的蛋白水平表达中的应用。

本发明所述的应用，其中，所述的miR-192序列在绵羊骨骼肌卫星细胞内通过结合靶向RB1基因的3’非编码区来抑制RB1基因的表达。

本发明所述的miR-192序列对绵羊骨骼肌卫星细胞增殖分化调控检测方法，包括如下步骤：

(1)在绵羊骨骼肌卫星细胞中转染miR-192类似物，实现细胞内miR-192的过表达，设置对照组，诱导绵羊骨骼肌卫星细胞向成肌方向分化2天；收集细胞，利用免疫荧光检测细胞肌管形成情况；同时检测对照组及实验组的绵羊骨骼肌卫星细胞分化标志基因表达水平；

(2)利用刮伤-愈合的方法检测过表达miR-192后的绵羊骨骼肌卫星细胞在细胞增殖迁移上是否受到影响，首先按照转染体系将miR-192类似物或对照转染至绵羊骨骼肌卫星细胞内，实现细胞内miR-192的过表达；待细胞继续生长48h，用1ml移液枪枪头，在培养皿上刮一下，造成刮后伤痕，更换低浓度血清培养基后继续培养24h，观察愈合情况。

本发明的应用的有益效果：骨骼肌卫星细胞的成肌分化和增殖可作为体外模拟骨骼肌生长发育的模型，进而更加深入研究骨骼肌的生长发育过程，绵羊作为一种重要的家养动物，其产肉量和肉品质一直是人们关注的热点，解析绵羊骨骼肌生长发育的生物学机理，可为提高其产肉量和肉品质提供科学依据。因此，本发明的研究显得尤为重要。

本发明提供了一种非编码小RNA miR-192在抑制绵羊骨骼肌卫星细胞成肌分化和促进绵羊骨骼肌卫星细胞增殖中的应用，其是将非编码小RNA miR-192的类似物转染至绵羊骨骼肌卫星细胞内造成细胞内miR-192的过量表达，过表达miR-192的绵羊骨骼肌卫星细胞与过表达对照核苷酸序列的细胞相比，绵羊骨骼肌卫星细胞分化受到抑制，但增殖能力得到提高。本发明还提供miR-192在绵羊骨骼肌卫星细胞内抑制RB1蛋白水平表达的应用。miR-192在细胞内通过靶向RB13’非编码区抑制基因表达的应用，miR-192可在细胞内靶向RB13’非编码区中特定的一段序列抑制荧光素酶的表达。本发明首次发现了miR-192具有负调控绵羊骨骼肌卫星细胞成肌分化和促进绵羊骨骼肌卫星细胞增殖的功能。

下面结合附图对本发明的miR-192序列的应用作进一步说明。

附图说明

图1为本发明中转染miR-192类似物和对照(NC)后对绵羊骨骼肌卫星细胞成肌分化的影响结果；(右下角标尺代表100μm)；

图2为本发明中转染miR-192类似物和对照(NC)后对绵羊骨骼肌卫星细胞增殖的影响结果；

图3为本发明中转染miR-192类似物和对照后，诱导分化84h，收集细胞，提取RNA。RT-qPCR检测肌球蛋白重链(myosin heavy chain,MHC)表达情况；

图4为本发明中转染miR-192类似物和对照后，诱导分化84h，收集细胞，提取RNA。RT-qPCR检测myogenin(MyoG)的表达情况；

图5为本发明中miR-192与RB13’非编码区内预测位点的相互作用示意图；

图6为本发明中miR-192对RB1蛋白水平影响的检测结果；

图7为本发明中检测是否成功构建载体的琼脂糖凝胶电泳图；

图8为本发明中双荧光素酶试验结果图。

具体实施方式

实施例1 miR-192对绵羊骨骼肌卫星细胞增殖分化的调控研究

根据前期对绵羊骨骼肌进行高通量测序，发现miR-192(序列见序列表中SEQ IDNO：1)在绵羊骨骼肌胎儿期和出生后差异表达，并利用qPCR验证这一结果。接下来是对miR-192的一些基本生物特性进行了分析，包括miR-192在基因组中的位置，miR-192的前体(发夹结构)及在发夹结构中的位置，miR-192在各物种中的保守性。miR-192在绵羊骨骼肌生长发育过程中呈现差异表达，可能对骨骼肌的生长发育有一定的作用。

对绵羊骨骼肌卫星细胞经过诱导分化，在分化0、1、3天，收集细胞，RT-qPCR检测miR-192的表达量，发现miR-192下调表达。将miR-192类似物或对照转染至绵羊骨骼肌卫星细胞内，实现细胞内miR-192的过表达。

转染体系为：

在上述体系中，先将miR-192类似物或对照与opti-MEM充分混匀，再将lipofectamine3000与opti-MEM充分混匀；然后将2种混合物混合，孵育5分钟，加入培养基中。37℃，5％CO₂培养箱中培养4h。然后更换分化培养基，诱导绵羊骨骼肌卫星细胞向成肌方向分化2天。收集细胞，利用细胞免疫荧光检测肌管形成情况，结果如图1所示。免疫荧光所用一抗为小鼠抗肌球蛋白重链(myosin heavy chain,MHC)，二抗为AlexaFluor-488标记的兔抗小鼠IgG。

为了确定miR-192对绵羊骨骼肌卫星细胞增殖的作用，利用刮伤-愈合的方法检测过表达miR-192后的绵羊骨骼肌卫星细胞在细胞增殖迁移上是否受到影响。首先按照转染体系将miR-192类似物或对照转染至绵羊骨骼肌卫星细胞内，实现细胞内miR-192的过表达。更换新鲜生长培养基后，待细胞继续生长48h，用1ml移液枪枪头，在培养皿上刮一下，造成刮后伤痕。更换低浓度血清培养基后继续培养24h，观察愈合情况，结果如图2所示。

将绵羊骨骼肌卫星细胞接种至6孔板后，转染miR-192类似物。在分化84h时收集细胞，提取RNA，对分化标志基因MHC和MyoG进行RT-qPCR检测，结果表明，转染miR-192类似物实验组的分化标志基因MHC和MyoG的水平显著低于对照组，如图3和图4。

综合以上结果说明，miR-192抑制绵羊骨骼肌卫星细胞的成肌分化，促进绵羊骨骼肌卫星细胞的增殖。

实施例2 miR-192对绵羊骨骼肌卫星细胞中RB1蛋白水平表达影响的检测

miRNA被认为是在转录后水平调控基因的表达，利用Targetscan软件预测miR-192的靶基因得到视网膜母细胞瘤基因1(Retinoblastoma1，RB1)的3’非编码区有一个miR-192的靶位点(如图5所示)，提示RB1可能为miR-192的一个靶基因。RB1是人类第一个分离克隆的抑癌基因，因为该基因与视网膜母细胞瘤的发生密切相关，因此被命名为视网膜母细胞瘤基因。RB1基因已经被证明参与了许多生长发育调节过程，包括细胞周期调控、细胞衰老、细胞凋亡和生长抑制等。

因此，本发明进一步检测miR-192对RB1蛋白水平的表达是否有影响。首先按照转染体系将miR-192类似物或对照转染至绵羊骨骼肌卫星细胞内，实现细胞内miR-192的过表达。随后更换新鲜生长培养基，待细胞继续生长48h，收集细胞，提取总蛋白。接着，将过表达miR-192后的卫星细胞在分化培养基中诱导其向成肌分化，待分化1天后收集细胞，提取总蛋白。Western blot检测RB1蛋白水平的表达情况，所用一抗为兔抗RB1和兔抗GAPDH(内参蛋白)，二抗为HRP标记的小鼠抗兔IgG。

Western blot操作步骤如下：

(1)按照试剂盒说明书配制分离胶和浓缩胶(5％)。向制胶板中加入浓缩胶至溢出后，插梳子(1.5mm)，晾干40min；

(2)上样：将聚丙烯酰胺凝胶浸没到电泳缓冲液中，拔掉梳子，每泳道加上蛋白样品约40μg，使用预染的蛋白质标准分子量marker；

(3)电泳：以80V恒定电压，在SDS-聚丙烯酰胺凝胶中约0.5h，待溴酚蓝完全越过浓缩胶后，变换电压至120V，在分离胶中充分分离蛋白约2h，根据marker的电泳情况，待目的蛋白适当分离后停止电泳；

(4)转膜：将PVDF膜用甲醛浸泡3min，激活PVDF膜。使用Bio-Rad公司的转膜装置，依照顺序铺放滤纸及PVDF膜：海绵→2层转膜缓冲液浸湿的滤纸→聚丙烯酰胺凝胶→PVDF膜→2层转膜缓冲液浸湿的滤纸。用玻璃涂布器赶走海绵、滤纸中的气泡并保证操作过程中每一层都不能夹有气泡，组装转膜装置，然后以200mA恒流将蛋白转移到PVDF膜上。

(5)封闭：转膜完毕后，立即把PVDF膜，做上正反面标记，将膜转移到5％脱脂奶粉封闭液中，于摇床上缓慢摆动，室温封闭1h。

(6)一抗孵育：根据一抗说明书，按照适当比例稀释一抗。将膜置于一抗液中，4℃孵育过夜。

(7)二抗孵育：将膜于TBST洗膜2次，TBS洗膜1次，每次10min。按照适当比例用封闭液稀释二抗。将膜置于二抗液中，室温孵育1h。

(8)成像分析：将膜于TBST洗膜2次，TBS洗膜1次，每次10min。利用ImageQuantLAS4000mini(GE)成像系统检测目的蛋白。

研究发现，miR-192能明显下调绵羊骨骼肌卫星细胞中RB1蛋白水平，如图6所示。

实施例3miR-192通过靶向RB13’非编码区抑制RB1基因表达

为了验证miR-192是否直接靶向RB1，本发明构建包含有miR-192靶位点的双荧光素酶载体和包含有miR-192靶位点突变后的双荧光素酶载体。首先，将RB13’非编码区内一段包含有miR-192靶位点的核苷酸序列连接到双荧光素酶载体中。具体操作步骤如下：

从绵羊基因组中扩增RB13’非编码区内一段包含靶位点的核苷酸序列，靶位点如图5所示，以绵羊基因组DNA为模板扩增目的片段，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID No:2所示，TTAACTTCAGCATGGTCTTACACTGGCACATTCAAAGCCACATTATTTCTAGGCCACAGTGCAGGTGATGAAAGGTCTTTGGGTTAGGCATTAATGTTTCTCTCTCTGATTTTGTGCAGAAGCTTCAAATTAAAATAGCTACAGTAGAAAAAGAGGCGCTTTCCCCCTCCCCCAACACCTAAAGGTGTAATTTAAACTATCTTGTGTGATTAACTTATTTAGAGATGGTATAATTTAAAATAGGTGGTATTTAAGGTAGGATCTACTAGCTTTTAGAAAATTACTTTTGTTTAAACTGAGAGTTCTTTTTAAAAAGAAATCTGGTCTTATTTGTTAGAAAGCAAAATTTTATTTTGTGCTCAATTAAGTTGAAACTCATTTTTTGACAGTTATCTTGGTAACACAGGCACTAGAAAGCTTTATCTCATGTCCTCATTCATTTTTGCATGAATATCATACAAATCAGTTAGCTTTTAGGTCAAGGGCTTACCACATTACTGGGTCTTTTGCTAATAAGTTCATGTTAGAATTAGTGTCAGAATTTAAGGAACTTC

SEQ ID No:2所示序列是本发明中的一段RB13’非编码区内一段包含有miR-192靶位点的核苷酸序列，此序列被用于构建到双荧光素酶载体中荧光素酶基因的3’非编码区，下划线为预测的miR-192靶位点。接着，将预测的miR-192靶位点突变为ATCCAGT后，构建到双荧光素酶载体中，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID No:3所示，

TTAACTTCAGCATGGTCTTACACTGGCACATTCAAAGCCACATTATTTCTAGGCCACAGTGCAGGTGATGAAAGGTCTTTGGGTTAGGCATTAATGTTTCTCTCTCTGATTTTGTGCAGAAGCTTCAAATTAAAATAGCTACAGTAGAAAAAGAGGCGCTTTCCCCCTCCCCCAACACCTAAAGGTGTAATTTAAACTATCTTGTGTGATTAACTTATTTAGAGATGGTATAATTTAAAATAGGTGGTATTTAAGGTAGGATCTACTAGCTTTTAGAAAATTACTTTTGTTTAAACTGAGAGTTCTTTTTAAAAAGAAATCTGGTCTTATTTGTTAGAAAGCAAAATTTTATTTTGTGCTCAATTAAGTTGAAACTCATTTTTTGACAGTTATCTTGGTAACACAGGCACTAGAAAGCTTTATCTCATGTCCTCATTCATTTTTGCATGAATATCATACAAATCAGTTAGCTTTATCCAGTAGGGCTTACCACATTACTGGGTCTTTTGCTAATAAGTTCATGTTAGAATTAGTGTCAGAATTTAAGGAACTTC

SEQ ID NO:3是本发明中用于构建靶位点突变型双荧光素酶载体的一段核苷酸序列，是将SEQ ID NO：2中miR-192的靶位点突变为ATCCAGT(下划线表示突变后的核苷酸序列)。

扩增过程所使用的PCR反应体系为：

上述体系中所用引物序列如下：

正向引物5’-GGCGCTCGAGTTAACTTCAGCATGGTCTT-3’；

反向引物5’-AATGCGGCCGCGAAGTTCCTTAAATTCTGA-3’；

其中下划线分别为XhoI和NotI酶切位点序列，之前序列为保护碱基。

PCR反应条件为：

然后用XhoI和NotI分别消化目的片段和载体psiCHECK-2luciferase reporter，酶切反应体系如下：

反应条件为37℃，4小时。

酶切后回收并纯化酶切产物。然后使用连接酶将目的片段连接到载体中得到连接产物，随后将连接产物转化到DH5α感受态细胞中，经过一段时间培养后，挑取单克隆进行菌液PCR鉴定。PCR反应体系为：

PCR反应条件为：

琼脂糖电泳分析结果如图7所示。上述结果表明，成功构建了RB13’非编码区内miR-192靶位点的双荧光素酶载体。

同时，利用PCR的方法，在野生型载体基础上，设计突变引物将TAGGTCA突变为ATCCAGT。然后再将突变后的核酸构建入双荧光素酶载体中。

接下来，将包含有野生型miR-192靶位点的双荧光素酶载体和包含有突变型miR-192靶位点的双荧光素酶载体同miR-192类似物和其对照共转染至HEK293细胞。48h后检测双荧光素酶表达情况，试验结果显示与对照组相比miR-192显著抑制了野生型荧光素酶的表达，但对突变型荧光素酶的表达没有影响，结果如图8所示。从上述结果可以推断，之所以miR-192使得荧光素酶基因的表达下调，就是因为miR-192靶向双荧光素酶载体中RB13’非编码区使得荧光素酶基因表达抑制。说明miR-192通过靶向RB1的3’非编码区抑制了荧光素酶基因的表达。这也解释了miR-192在绵羊骨骼肌卫星细胞内使得RB1蛋白产物降低是因为miR-192直接靶向了RB1的3’非编码区，从而使RB1翻译抑制，蛋白产物减少。

从上面的结果可以看出，如果在绵羊骨骼肌卫星细胞中过表达miR-192就会引绵羊骨骼肌卫星细胞分化的抑制，并且与之相一致的是绵羊骨骼肌卫星细胞中的RB1蛋白水平会下调。

以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (3)

1.在绵羊骨骼肌卫星细胞中，miR-192序列在抑制成肌分化中的应用，所述miR-192序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No:1所示。

2.在绵羊骨骼肌卫星细胞中，miR-192序列在促进增殖中的应用，所述miR-192序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No:1所示。

3.miR-192序列对绵羊骨骼肌卫星细胞增殖分化调控检测方法，其特征在于，所述miR-192序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No:1所示；

包括如下步骤：

(1)在绵羊骨骼肌卫星细胞中转染miR-192类似物，实现细胞内miR-192的过表达，设置对照组，诱导绵羊骨骼肌卫星细胞向成肌方向分化2天；收集细胞，免疫荧光观察细胞肌管形成情况；同时检测对照组及实验组的骨骼肌卫星细胞分化标志基因肌球蛋白重链基因MHC和肌细胞生成素基因MyoG表达水平；

(2)利用刮伤-愈合的方法检测过表达miR-192后的绵羊骨骼肌卫星细胞在细胞增殖迁移上是否受到影响，首先按照转染体系将miR-192类似物或对照转染至绵羊骨骼肌卫星细胞内，实现细胞内miR-192的过表达；待细胞继续生长48h，用1ml移液枪枪头，在培养皿上刮一下，造成刮后伤痕，更换低浓度血清培养基后继续培养24h，观察愈合情况。