CN107760717B - 绵羊tnpo1基因双荧光素酶报告基因载体及构建方法和应用 - Google Patents

绵羊tnpo1基因双荧光素酶报告基因载体及构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，具体而言，提供了一种绵羊TNPO1基因双荧光素酶报告基因载体及构建方法和应用。本发明提供的绵羊TNPO1基因双荧光素酶报告基因载体，含有双荧光素酶报告基因载体和TNPO1基因的3’UTR区序列片段，该重组载体可以稳定表达绵羊TNPO1基因，作为一个生物模块用于各种相关技术领域；本发明提供的构建方法操作简便，可以通过筛选基因准确得到带有目的基因的重组载体，并且重组载体可以稳定表达目的基因；本发明提供的重组载体可以用于检测TNPO1基因表达活性，同时筛选得到靶向调控TNPO1基因的miRNA‑21，miRNA‑21负调控抑制TNPO1基因表达。

Description

绵羊TNPO1基因双荧光素酶报告基因载体及构建方法和应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体而言，涉及一种绵羊TNPO1基因双荧光素酶报告基因载体及构建方法和应用。
背景技术
TNPO1基因编码具有多个结构域的转运蛋白1(Transportin1)，Transportin1是转运蛋白家族中的一个重要因子，研究表明，Transportin1在细胞核与细胞质转运过程中发挥相当大的作用，在过去的几年里，在核定位信号(NLSs)中作用的研究取得了很大的进展，使其成为多种生物学过程的分子基础。NLSs可以通过Transportin1参与多种组织、结构和序列的变化。Transportin1除了上述作用外，还与细胞发育过程中的有丝分裂、纤毛活动及细胞质RNA粒化有关。有研究表明，Transportin1在特有蛋白进入纤毛过程中起到作用，并且最终发现TRN1存在于初级纤毛中。研究发现NLSs依赖于转运蛋白突变引起蛋白错配，引起肌萎缩外层硬化，说明转运蛋白在人类健康中的重要性。
MicroRNA(即miRNA)是由18-25个核苷酸组成的一类内源性、短序列非编码单链RNA，它由DNA转录产生，不翻译蛋白质，通过和mRNA3'UTR区结合来调控目标基因的表达。miRNA主要是通过5'端被称为种子序列的7nt序列与位于靶mRNA 3'UTR的miRNA调控元件相互作用以识别靶mRNA。作为一种转录后调控小分子RNA，在动物中主要通过与靶mRNA的3'UTR区特异性互补配对，抑制靶mRNA翻译或引起靶mRNA的降解，从而参与调控细胞分化、组织发育、肿瘤发生发展等多种生命过程。成熟的miRNA可同时封闭多个靶基因的翻译，干预调节miRNA可改变多个靶基因的表达水平，且干预调节效率很高。miRNA作为转录后基因调控的一种方式，在生物体内形成一个调控网络，由于miRNA调控涉及的方便广，调控控作用明显，本身序列短，便于操作和研究，越来越受到人们对其生物学功能研究的重视。研究调控靶mRNA的miRNA对了解生物体内调控代谢机制具有重要意义。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种绵羊TNPO1基因双荧光素酶报告基因载体，本发明的第二目的在于提供上述绵羊TNPO1基因双荧光素酶报告基因载体的构建方法，本发明的第三个目的在于提供上述绵羊TNPO1基因双荧光素酶报告基因载体在检测绵羊TNPO1基因表达活性中的应用，本发明的第四个目的在于提供绵羊TNPO1基因双荧光素酶报告基因载体在筛选调控绵羊TNPO1基因的microRNA上的应用，本发明的第五个目的在于提供上述绵羊TNPO1基因双荧光素酶报告基因载体在检测microRNA调控绵羊TNPO1基因的调控机制中的应用，以缓解现有技术中对绵羊TNPO1基因的调控机制的研究内容和方法不完善的问题，提供一种绵羊TNPO1基因双荧光素酶报告基因载体及构建方法，同时预测调控绵羊TNPO1基因的miRNA。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明提供了一种绵羊TNPO1基因双荧光素酶报告基因载体，所述绵羊TNPO1基因双荧光素酶报告基因载体含有双荧光素酶报告基因载体和TNPO1基因的3’UTR区核苷酸序列片段。
进一步地，所述双荧光素酶报告基因载体为pmiR-RB-REPORTTM。
本发明还提供了上述绵羊TNPO1基因双荧光素酶报告基因载体的构建方法，包括以下步骤：将TNPO1基因的3’UTR区片段，插入到双荧光素酶报告基因载体中，得到所述绵羊TNPO1基因双荧光素酶报告基因载体。
进一步地，还包括：利用PCR扩增得到所述TNPO1基因的3’UTR区片段，所述PCR扩增所用引物包括：
oar-TNPO1-3'UTR-F:5’-GGCGGCTCGAGTAAGATTGGATGAGTTTTATGGAG-3’(SEQ IDNO.1)；
oar-TNPO1-3'UTR-R:5’-AATGCGGCCGCACCCTCAAAACAAAAACCAAG-3’(SEQ IDNO.2)。
进一步地，所述oar-TNPO1-3'UTR-F含有XhoI限制性内切酶的酶切位点；所述oar-TNPO1-3'UTR-R含有NotI限制性内切酶的酶切位点。
进一步地，所述基因载体为经过XhoI和NotI限制性内切酶双酶切的pmiR-RB-REPORTTM。
本发明还提供了上述绵羊TNPO1基因双荧光素酶报告基因载体在检测绵羊TNPO1基因表达活性中的应用。
本发明还提供了上述绵羊TNPO1基因双荧光素酶报告基因载体在筛选调控绵羊TNPO1基因的microRNA上的应用。
本发明还提供了上述绵羊TNPO1基因双荧光素酶报告基因载体在检测microRNA调控绵羊TNPO1基因的调控机制上的应用。
进一步地，所述microRNA为miRNA-21。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供的绵羊TNPO1基因双荧光素酶报告基因载体，含有双荧光素酶报告基因载体和TNPO1基因的3’UTR区核苷酸序列片段，该载体可以稳定表达绵羊TNPO1基因，同时双荧光素酶报告基因可以作为检测指标反映绵羊TNPO1基因的表达量，可以作为一个生物模块应用于相关技术领域；本发明提供的上述绵羊TNPO1基因双荧光素酶报告基因载体的构建方法操作简便，快速易得，可以通过筛选基因准确得到带有目的基因的重组载体，制备得到的重组载体可以稳定表达目的基因；本发明提供的绵羊TNPO1基因双荧光素酶报告基因载体不仅可以通过荧光素酶活性的测定得到绵羊TNPO1基因的表达活性，也可以用于筛选调控绵羊TNPO1基因的microRNA，同时对预测的microRNA在细胞水平和动物水平上调控TNPO1基因的调控机制进行研究，方法操作简便，条件简单，耗时短，特异性高，结果准确，为深入挖掘调控TNPO1基因表达的miRNA提供实验基础。
附图说明
图1为实施例2中pmiR-RB-REPORTTM载体的结构示意图；
图2为实施例1中TNPO1-3'UTR区片段PCR电泳结果图；
图3为实施例3中绵羊TNPO1基因双荧光素酶报告载体菌落PCR电泳结果图；
图4为实施例3中绵羊TNPO1基因双荧光素酶报告载体测序结果图；
图5为实施例4中突变型绵羊TNPO1基因双荧光素酶报告载体测序结果图；
图6为实施例5中预测的miRNA-21与TNPO1基因3'UTR区碱基互补茎环结构图；
图7为实施例7中miRNA-21mimics对293T细胞荧光素酶表达的影响的结果图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
本发明提供了一种绵羊TNPO1基因双荧光素酶报告基因载体，绵羊TNPO1基因双荧光素酶报告基因载体含有双荧光素酶报告基因载体和TNPO1基因的3’UTR区核苷酸序列片段。
在一个优选的实施方式中，双荧光素酶报告基因载体为pmiR-RB-REPORTTM。
本发明中的绵羊TNPO1基因双荧光素酶报告基因载体可以稳定表达绵羊TNPO1基因，同时双荧光素酶报告基因可以作为检测指标反映绵羊TNPO1基因的表达量，组合载体可以作为生物模块应用于相关技术领域。
本发明还提供了上述绵羊TNPO1基因双荧光素酶报告基因载体的构建方法，包括以下步骤：将TNPO1基因的3’UTR区片段，插入到双荧光素酶报告基因载体中，得到绵羊TNPO1基因双荧光素酶报告基因载体。
在一个优选的实施方式中，利用PCR扩增得到所述TNPO1基因的3’UTR区片段，PCR扩增所用引物包括：
oar-TNPO1-3'UTR-F:5’-GGCGGCTCGAGTAAGATTGGATGAGTTTTATGGAG-3’(SEQ IDNO.1)；
oar-TNPO1-3'UTR-R:5’-AATGCGGCCGCACCCTCAAAACAAAAACCAAG-3’(SEQ IDNO.2)。
在一个优选的实施方式中，oar-TNPO1-3'UTR-F含有XhoI限制性内切酶的酶切位点；oar-TNPO1-3'UTR-R含有NotI限制性内切酶的酶切位点。
在一个优选的实施方式中，基因载体为经过XhoI和NotI限制性内切酶双酶切的pmiR-RB-REPORTTM。
在引物两端加入XhoI和NotI限制性内切酶的酶切位点，针对TNPO1基因的3’UTR区设计得到上述引物，用上述引物可以PCR得到两端带有XhoI和NotI限制性内切酶酶切位点的TNPO1基因的3’UTR区片段，再利用XhoI和NotI限制性内切酶进行双酶切，两端得到连接位点；pmiR-RB-REPORTTM也用XhoI和NotI限制性内切酶进行双酶切，两端得到连接位点；将TNPO1基因的3’UTR区片段与pmiR-RB-REPORTTM片段进行连接反应，得到的阳性结果即为绵羊TNPO1基因双荧光素酶报告基因载体。该方法操作简便，快速易得。
本发明还提供了上述的绵羊TNPO1基因双荧光素酶报告基因载体在检测绵羊TNPO1基因表达活性中的应用。
本发明还提供了上述的绵羊TNPO1基因双荧光素酶报告基因载体在筛选调控绵羊TNPO1基因的microRNA上的应用。该应用操作简便，条件简单，耗时短，特异性高，结果准确，可以准确得出与绵羊TNPO1基因相互作用的microRNA。
本发明还提供了上述的绵羊TNPO1基因双荧光素酶报告基因载体在检测microRNA调控绵羊TNPO1基因的调控机制中的应用。microRNA对有调控作用的基因的调控机制可以分为正调控和负调控，正调控是提高microRNA作用基因的表达量，负调控是抑制microRNA作用基因的表达量。通过预测microRNA与绵羊TNPO1基因双荧光素酶报告基因载体的相互作用结果，检测绵羊TNPO1基因的表达量变化，就可以得知预测microRNA调控绵羊TNPO1基因的调控机制。研究调控靶mRNA的miRNA对了解生物体内调控代谢机制具有重要意义，针对绵羊TNPO1基因构建其双荧光素酶报告基因载体，可用于筛选获得调控绵羊TNPO1基因表达的候选miRNA和研究其功能，也可以为后续进一步的研究提供基础和思路。
在一个优选的实施方式中，microRNA为miRNA-21。miRNA-21在细胞的凋亡、免疫及肿瘤抑制中发挥着重要的作用，比如miRNA-21在多种肿瘤细胞中都特异性高表达。而TNPO1是生物信息学软件预测的miRNA-21的靶基因之一，同时实验证明miRNA-21确实对TNPO1具有负调控作用。
为了有助于更清楚的理解本发明的内容，现结合具体地实施例详细介绍如下。
实施例1绵羊TNPO1基因3'UTR区片段的制备
根据GenBank中的绵羊TNPO1基因序列(ID：101115311)中的3'UTR区采用PrimerPremier5.0软件设计PCR引物，TNPO1基因扩增引物序列如下：
oar-TNPO1-3'UTR-F:5’-GGCGGCTCGAGTAAGATTGGATGAGTTTTATGGAG-3’(SEQ IDNO.1)；
oar-TNPO1-3'UTR-R:5’-AATGCGGCCGCACCCTCAAAACAAAAACCAAG-3’(SEQ IDNO.2)；
上述引物由广州市锐博生物科技有限公司合成。目标片段DNA大小为680bp。
首先，进行降落PCR，PCR扩增反应体系如下，体系总体积为30μL：
Figure BDA0001461618660000071
反应程序为：98℃2min预变性，首先循环内98℃变性10s，从65℃每个循环降1℃退火，72℃延伸30s，10个循环；再98℃变性10s，60℃退火，72℃延伸30s，进行15个循环；接着PCR反应循环后72℃继续延伸3min；最后4℃保存。
PCR反应完取5μl PCR产物进行1.5％琼脂糖电泳分析，结果如图2所示，图中M表示DNA Marker2000，图中1表示目标片段TNPO1基因的3'UTR区。从图中可以得出实验成功PCR扩增得到带有XhoI和NotI限制性内切酶酶切位点的绵羊TNPO1基因的3'UTR区片段。
接着，对验证正确的PCR产物进行纯化，用两种内切酶XhoI和NotI对上述PCR产物进行双酶切，酶切反应体系如下，体系总体积为40μl：
Figure BDA0001461618660000081
反应程序为：在37℃酶切4h，随后进行回收纯化。
实施例2 pmiR-RB-REPORTTM双酶切处理
pmiR-RB-REPORTTM载体的结构示意图如图1所示，载体含有限制性内切酶XhoI和NotI酶切位点。用两种内切酶XhoI和NotI对上述PCR产物进行双酶切，酶切反应体系如下，体系总体积为40μl：
Figure BDA0001461618660000082
反应程序为：在37℃酶切4h，随后进行回收纯化。
实施例3绵羊TNPO1基因双荧光素酶报告载体的构建
将实施例1和2双酶切处理制备得到的目标片段DNA和载体进行连接反应，连接反应体系如下，体系总体积为10μl：
Figure BDA0001461618660000083
反应程序为：16℃连接30min。
将连接产物转化入感受态细胞，对阳性克隆菌落进行菌落PCR鉴定，结果如图3所示，图中M表示DNA Marker2000，图中1-5表示单菌落的菌落PCR鉴定结果；进一步地，对重组载体绵羊TNPO1基因双荧光素酶报告载体进行测序验证，结果如图4所示；菌落PCR和测序结果都表明实验成功构建重组载体，命名为TNPO1-WT。
实施4突变型绵羊TNPO1基因双荧光素酶报告载体的构建
根据GenBank中的绵羊TNPO1基因序列(ID：101106407)中的3'UTR区采用PrimerPremier5.0软件设计PCR引物，设计突变引物将靶序列中的ATAAGCT突变为TATTCGA，突变引物序列如下：
oar-TNPO1-Mut-F:5’-AATTTTTGTATTCGAGCTGAATTTTAAAGAGAG-3’(SEQ ID NO.3)；
oar-TNPO1-Mut-R:5’-AATTCAGCTCGAATACAAAAATTAAAACCGTAT-3’(SEQ ID NO.4)；
上述引物由广州市锐博生物科技有限公司合成。
利用PCR突变的方法，在野生型载体基础上，按照实施例1，2和3所述步骤构建突变型绵羊TNPO1基因双荧光素酶报告载体，对重组载体进行测序验证，结果如图5所示，成功将靶序列ATAAGCT突变为TATTCGA，将测序正确的突变型重组载体命名为TNPO1-Mut。
实施例5靶向TNPO1基因3'UTR区的miRNA预测
在(http：//www.targetscan.org)网页中检索出与TNPO1基因3'UTR区可能存在关联的miRNA，按照生物信息学的预测法则，从miRNA的第二位碱基以后寻找与目的基因种子序列配对较好，并且根据结合的自由能以及基因物种的保守性进行综合评估。图6为预测的miRNA-21与TNPO1基因3'UTR区碱基互补茎环结构。miRNA-21从第二位碱基开始到第十二位碱基与TNPO1基因3'UTR序列完全互补配对，且其余序列在形成茎环后互补性良好，且两段碱基以-14.50kJ/mol的自由能相互结合，充分说明TNPO1基因是miRNA-21靶基因的可能性；之后进一步搜索了人、牛、羊等物种的TNPO1基因3'UTR序列，发现在这些物种中此序列具有严格的保守性。因此说明我们的预测符合生物信息学靶基因预测规则，可以将预测miRNA用于后续的验证实验。
实施例6细胞转染
细胞培养是在常规条件下进行，温度37℃，CO2浓度5％，细胞类型为293T细胞。待细胞长到对数生长期，用细胞计数板计数，按所需细胞浓度接种于96孔板，培养24h后进行细胞的转染。
取10μL OPTI-MEM培养基稀释miRNA mimics(miRNA-21)或Non-target Control，15μL OPTI-MEM培养基稀释TNPO1-WT或TNPO1-Mut，25μL OPTI-MEM培养基稀释0.25μLLipofectamineTM 2000试剂，5min后三者混合，共50μL，轻轻摇匀，静置20min。将质粒载体、mimics加入细胞前，每孔先吸走50μL培养基，然后再加入上述50μL混合液，最终每孔总体积100μL。其中mimics转染浓度均为50nmol/L，载体浓度为100ng/孔，每组设3个复孔。6h后再加100μL新鲜培养基。
各实验组设3个平行孔，每组实验重复3次。转染细胞分组如下：①转染pmiR-RB-REPORTTM(空质粒组)②共转染pmiR-RB-REPORTTM(空质粒)+NC(阴性对照)；③共转染TNPO1-WT+NC；④共转染TNPO1-WT+miRNA-21mimics；⑤共转染TNPO1-Mut+NC⑥共转染TNPO1-Mut+miRNA-21mimics。各转染组反应24h后，消化细胞，对各组的荧光素酶活性进行检测。
实施例7荧光素酶活性测定与生物统计学分析
转染293T细胞后miRNA-21的表达对TNPO1 3'-UTR的荧光素酶活性的影响主要是应用相关试剂盒的检测，详细步骤按双荧光素酶检测试剂盒(Invitrogen公司)说明书操作如下：首先将试剂盒的荧光素酶底物与缓冲液混合成荧光素酶试剂分装，-80℃贮存，stop&Glo缓冲液恢复至室温后与stop&Glo底物混合成stop&Glo试剂，现配现用。细胞转染48h后吸出培养基，以35μl/孔加入新鲜培养基，首先加入等量荧光素酶试剂，振荡10min，测定荧光值，再加入30μlstop&Glo试剂，振荡10min，以荧光照度计测定荧光值。
所有数据以平均值±标准差表示。统计分析采用SPSS17.0软件，两组之间有显著差异表示为P﹤0.05，两组之间有极显著差异表示为P﹤0.01。
结果如图7所示，从荧光素酶结果我们看出，TNPO1-WT+miRNA-21mimics组的293T细胞组荧光素酶活性比其余各组降低了48％左右(P﹤0.01)，在统计学上具有极显著差异，而其余五组无明显差异。
上述结果初步表明，miRNA-21可以抑制TNPO1-3'UTR荧光素酶报告载体的活性，这一抑制作用主要是因为miRNA-21与TNPO1-3'UTR的相互作用而产生；而当对结合位点突变以后，miRNA-21抑制剂对TNPO1-3'UTR荧光素酶报告载体活性的抑制作用消失，进一步验证说明了miRNA-21与TNPO1-3'UTR之间的相互作用，并且miRNA-21与TNPO1均与细胞生长发育有关联，因此针对两者之间的相互调节与细胞生长发育之间的联系我们可以进行下一步的验证分析。而miRNA-21对TNPO1蛋白水平的调控也可以成为以后的研究方向。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。
SEQUENCE LISTING
<110> 吉林省农业科学院
<120> 绵羊TNPO1基因双荧光素酶报告基因载体及构建方法和应用
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ggcggctcga gtaagattgg atgagtttta tggag 35
<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
aatgcggccg caccctcaaa acaaaaacca ag 32
<210> 3
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
aatttttgta ttcgagctga attttaaaga gag 33
<210> 4
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
aattcagctc gaatacaaaa attaaaaccg tat 33

Claims (2)

1.绵羊TNPO1基因双荧光素酶报告基因载体在检测microRNA调控绵羊TNPO1基因的调控机制中的应用；
所述microRNA为miRNA-21；
所述绵羊TNPO1基因双荧光素酶报告基因载体含有双荧光素酶报告基因载体和TNPO1基因的3’UTR区核苷酸序列片段。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述双荧光素酶报告基因载体为pmiR-RB-REPORTTM。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2012020308A2 (en) * 2010-08-13 2012-02-16 The University Court Of The University Of Glasgow Cellular and molecular therapies
CN103060355A (zh) * 2011-10-21 2013-04-24 上海中医药大学附属普陀医院 Bcl2基因3-utr双荧光素酶报告基因质粒及其构建方法和用途
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Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012020308A2 (en) * 2010-08-13 2012-02-16 The University Court Of The University Of Glasgow Cellular and molecular therapies
CN103060355A (zh) * 2011-10-21 2013-04-24 上海中医药大学附属普陀医院 Bcl2基因3-utr双荧光素酶报告基因质粒及其构建方法和用途
CN103173481A (zh) * 2013-03-01 2013-06-26 上海中医药大学附属普陀医院 一种含有abcb1基因3′utr序列和报告基因的质粒载体及其构建方法和用途
CN103898137A (zh) * 2014-03-04 2014-07-02 上海中医药大学附属市中医医院 一种含有malat1基因3’utr序列和双荧光素酶报告基因的质粒及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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KLF3基因3"-UTR区双荧光素酶报告载体及其突变载体的构建与活性鉴定;翟博;《中国畜牧兽医》;20170331;第44卷(第3期);644-650 *
MicroRNA miR-128 represses LINE-1 (L1) retrotransposition by down-regulating the nuclear import factor TNPO1;Adam Idica等;《J. Biol. Chem.》;20171003;第292卷(第50期);第20505页，右栏，第3段 *

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