CN103103189A - 过表达单一MicroRNA成熟体序列的新方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及过表达单一MicroRNA成熟体序列的新方法。本发明首次提供了一种全新的单一microRNA成熟体表达策略，通过对表达构建物的“茎”部位的碱基互补、配对的巧妙设计，使得表达构建物能够形成茎环结构但不表达另一microRNA成熟体序列，从而专一性表达单一microRNA。本发明克服了现有技术中难以特异性表达microRNA两条成熟序列中的一条的技术难题。

Description

过表达单一MicroRNA成熟体序列的新方法

技术领域

本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及过表达单一MicroRNA成熟体序列的新方法。

背景技术

microRNA是一类长约22个碱基的、广泛存在于动植物体内的内源非编码RNA[1]。近10年来，随着对microRNA研究的不断深入，科学家们已经发现microRNA虽然不编码蛋白，但是，它们可以通过碱基互补配对的方式来识别与之相对应的靶mRNA，通过抑制翻译或是促使靶mRNA降解的方式影响基因表达[2]。microRNA能够参与诸如生长发育、免疫防御等许多生理过程，并且microRNA的调节异常可以参与到多个疾病的病理过程[3，4]。所以，microRNA作为一种新发现的基因表达调控分子有着重要的功能。

过表达所要研究的目的基因，并观察其产生的表型，是探索基因功能的一个不可或缺的方法。对于microRNA，过表达的方式目前主要有：转染人工合成的microRNA类似物或microRNA茎环前体；克隆基因组中的microRNA编码序列到过表达载体中再转染细胞。人工合成的类似物或是前体虽然可以特异性地提高细胞中的某个microRNA的表达，但是，它只能实现瞬时表达，随着细胞的增殖，其过表达水平会被稀释，难以应用到需要长时间稳定表达的研究，更难以实现体内研究。通过质粒过表达的方式，尤其是通过病毒载体进行的过表达，可以实现稳定过表达，并且转染容易，能实现体内功能的研究。

但是，目前的microRNA过表达质粒的构建，依赖于克隆基因组中的microRNA编码序列(通常将pre-microRNA的全部序列同其上下游各一、两百个碱基一并克隆)。每个microRNA基因经过转录、加工，理论上最终都能够产生两种具有不同成熟序列的成熟体microRNA：5p-microRNA和3p-microRNA[5]。在生理条件下，对不同的microRNA，这两种成熟序列会以其中的一种为主进行表达(称为miR-X)，而另外的一种却被淘汰降解丰度很低(称为miR-X^*)；有时则会两种序列共同表达并存在(分别称为miR-X-5p和miR-X-3p)[6]。由于现有的质粒过表达策略是模拟细胞内部的microRNA转录和成熟的过程，而这一过程对成熟体序列有天然的选择性，所以，不能大量地过表达水平低的miR-X^*，也不能随心所欲地单一过表达其中的一条成熟体序列(针对miR-X-5p和miR-X-3p的情况)。

然而，随着研究深入，microRNA的功能不仅局限于早期所鉴定的表达量丰富的成熟体序列，有越来越多的研究表明，原来被认为表达丰度低的成熟体序列，在特定的条件下表达会被上调，进而发挥调节功能[7，8]。同时，由于5p-microRNA和3p-microRNA的序列差异，其功能往往是不同的。

因此，在原有质粒过表达优势的基础上，通过新的策略，单一地过表达microRNA成熟体序列中的一种，势必为今后更精细的研究microRNA的功能提供了一个强有力的工具。

发明内容

本发明的目的在于提供过表达单一MicroRNA成熟体序列的新方法。

在本发明的第一方面，提供一种表达单一microRNA成熟体的方法，所述方法包括：

(1)提供一种表达构建物，所述的表达构建物含有以下结构：

5’Seq_正向-Y-Seq_反向3’    (I)；

其中，Seq_反向为该单一microRNA成熟体相应的DNA序列；Seq_正向为与Seq_{反 向}互补的序列；Y为位于Seq_正向和Seq_反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq_正向和Seq_反向不互补；式I所示的结构可形成如下所示的二级结构：

其中，“|”表示在Seq_正向和Seq_反向中，相应的核苷酸是配对的，在Seq_{正 向}和Seq_反向之间形成氢键；

表示在Seq_正向和Seq_反向中，相应的核苷酸不配对；并且，“|”和

的分布构成了Seq_反向与Seq_正向的互补；

(2)将(1)的表达构建物转化细胞，从而表达单一microRNA成熟体。在一个优选例中，“...”表示省略掉了部分的“|”和/或

在另一优选例中，式I所示的结构进入细胞并被胞内加工后，基于Seq_反向结构表达所述的单一microRNA成熟体，基于Seq_正向结构表达与另一microRNA成熟体不同的RNA，其不具备另一microRNA成熟体的活性。

在另一优选例中，式(II)中，以Seq_正向为参照，存在于与该Seq_正向序列的特定位点上，该特定位点对应于所述另一microRNA成熟体发挥活性的关键位点。

在另一优选例中，式(II)中，以Seq_正向为参照，

存在于该序列的5’端第2-10位(较佳地，第2-8位)；且

存在的个数为0-5个(较佳地，1-4个；如2或3个)。

在另一优选例中，式(I)中，在Seq_正向和Seq_反向的3’端，存在核苷酸TT。

在另一优选例中，所述的核苷酸TT可包含于间隔序列中。

在另一优选例中，所述的间隔序列的长度是5-19nt；较佳地为7-15个；如9、11或13个。

在另一优选例中，所述的Seq_正向具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；和/或

所述的Seq_反向具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；和/或

所述的Y具有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。

在另一优选例中，式(I)结构的序列选自：

SEQ ID NO：4中第8-60位所示核苷酸序列；或

SEQ ID NO：4中第8-62位所示核苷酸序列；或

SEQ ID NO：4中第6-62位所示核苷酸序列；或

SEQ ID NO：4中第5-66位所示核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的表达构建物包含在shRNA过表达质粒中。

在另一优选例中，所述的shRNA过表达质粒是病毒shRNA过表达质粒或非病毒shRNA过表达质粒。例如所述的shRNA过表达质粒选自但不限于：pSUPER(非病毒)；RNAi-Ready pSIREN-RetroQ Vector(Retrovirus质粒，Clontech公司)。较佳地，所述的shRNA过表达质粒是慢病毒shRNA过表达质粒。

在本发明的另一方面，提供一种表达单一microRNA成熟体的表达构建物，所述的表达构建物含有以下结构：

5’Seq_正向-Y-Seq_反向3’    (I)；

其中，Seq_反向为该单一microRNA相应的DNA序列；Seq_正向为与Seq_反向互补的序列；Y为位于Seq_正向和Seq_反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq_正向和Seq_反向不互补；式I所示的结构在可形成如下所示的二级结构：

其中，“|”表示在Seq_正向和Seq_反向中，相应的核苷酸是配对的，在Seq_{正 向}和Seq_反向之间形成氢键；

表示在Seq_正向和Seq_反向中，相应的核苷酸不配对；并且，“|”和

的分布构成了Seq_反向与Seq_正向的互补。

在一个优选例中，所述的Seq_正向具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；和/或

所述的Seq_反向具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；和/或

所述的Y具有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。

在另一优选例中，式(I)结构的序列选自：

SEQ ID NO：4中第8-60位所示核苷酸序列；或

SEQ ID NO：4中第8-62位所示核苷酸序列；或

SEQ ID NO：4中第6-62位所示核苷酸序列；或

SEQ ID NO：4中第5-66位所示核苷酸序列。

在本发明的另一方面，提供前面任一所述的表达构建物的用途，用于表达单一microRNA成熟体。

在本发明的另一方面，提供一种重组细胞，其中包含前面任一所述的表达构建物。

在另一优选例中，所述的细胞是真核细胞。

在另一优选例中，所述的细胞是哺乳动物细胞。

在另一优选例中，在可转染该质粒的条件下，全部的哺乳动物细胞都适用，如常用的人Hela，293，鼠NIH3T3，MEF等等细胞，甚至是原代细胞。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1：hsa-mir-146b-3p特异性过表达质粒的构建图示。

A：shRNA结构示意图，如图所示由microRNA成熟序列和相应的互补改造序列构成茎部结构，由TTCAAGAGA构成环部结构；

B：过表达hsa-mir-146b-3p的shRNA茎环结构示意图，以及microRNA互补改造序列与hsa-mir-146b5p的对比；

C：合成的DNA片段，退火链接入载体，其中载体图示来源于plvx-shRNA2说明书示意图。

图2：plvx-hs-146b3p能够特异性专一表达hsa-mir-146b-3p的成熟序列。

A：使用ABI公司Taqman Realtime PCR方法检测转染plvx-hs-146b3p和对照空质粒plvx-ctrl的细胞中hsa-mir-146b-3p的过表达水平，图中mock代表只加转染试剂的对照组；

B：使用ABI公司Taqman Realtime PCR方法检测转染plvx-hs-146b3p和对照空质粒plvx-ctrl的细胞中hsa-mir-146b-5p的水平，其中hsa-mir-146b5p的过表达质粒pSIF-hs-146b质粒作为过表达hsa-mir-146b5p的阳性对照，pSIF为pSIF-hs-146b的空质粒对照。此实验结果经过了三次重复。

图3：plvx-hs-146b3p过表达的hsa-mir-146b-3p成熟序列具有抑制其靶基因表达的生理功能但是不具有hsa-mir-146b-5p的活性。将plvx-hs-146b3p同psicheck-146b3psensor和psicheck-146b5psensor以及对照报告质粒psicheck-ctrl共转染到Hela细胞中，24hr后收集蛋白，进行双荧光检测。此实验结果经过了三次重复。

具体实施方式

本发明人经过深入研究，首次提供了一种全新的单一microRNA成熟体表达策略，通过对表达构建物的“茎”部位的碱基互补、配对的巧妙设计，使得表达构建物能够形成茎环结构但不表达另一microRNA成熟序列，从而专一性表达所欲表达的单一microRNA。本发明克服了现有技术中难以特异性表达microRNA两条成熟序列中的一条的技术难题。

术语

如本文所用，所述的“微小RNA(miRNA)”是指一种RNA分子，被从可形成miRNA前体的转录物加工而来。成熟的miRNA通常具有18-26个核苷酸(一般约22个核苷酸)，然而也不排除具有其它数目核苷酸的miRNA分子。miRNA通常可被Northern印迹检测到。天然状态下，动物来源的miRNA是在动物细胞中由前体miRNA加工获得的miRNA。

如本文所用，“互补”是指核苷酸的序列是足够互补的，可以以一种可预见的方式发生相互作用，如形成二级结构(如茎环结构)。通常，两条“基本上互补”的核苷酸序列互相之间至少有60％的核苷酸是配对的；优选的，至少有70％的核苷酸是互补的；更优选的，至少有80％的核苷酸是互补的。本发明中，两条足够互补的分子之间可以具有最多6个不配对的核苷酸；优选的，具有最多5个不匹配的核苷酸；更优选的，具有最多4个不匹配的核苷酸；进一步优选的，具有2-3个不匹配的核苷酸。

如本文所用，核苷酸的“配对”是指两条序列中相应的核苷酸构成了键(如氢键)的连接。两条序列中足够多(如多于60％的核苷酸是配对的)核苷酸的“配对”使得两条序列发生互补。本发明中，除非另外说明，核苷酸的配对以“|”表示；反之，核苷酸的不配对以表示。

如本文所用，“茎环”结构也被称作“发夹(Hairpin)”结构，是指一种寡核苷酸分子，其可形成一种包括双链区域(茎部)的二级结构，所述的双链区域由该寡核苷酸分子的两个区域(位于同一分子上)形成，两个区域分列双链部分的两侧；其还包括至少一个“环”结构，包括非互补的核苷酸分子，即单链区域。即使该寡核苷酸分子的两个区域不是完全互补的，寡核苷酸的双链部分也可保持双链状态。例如，插入、缺失、取代等可导致一个小区域的不互补或该小区域自身形成环结构或其它形式的二级结构，然而，该两个区域仍可基本上互补，并在可预见的方式中发生相互作用，形成茎环结构的双链区域。茎环结构是本领域技术人员所熟知的，通常在获得了一条具有一级结构的寡核苷酸序列后，本领域技术人员能够确定该核酸是否能形成茎环结构。

如本文所用，所述的“可操作(性)地连接”或“操作性连接”是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如：启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导，从而，启动子区域被“可操作地连接”到该核酸序列上。

如本文所用，“RNA相应的DNA序列”是指一种DNA序列，若RNA序列是“AU”，则该RNA序列相应的DNA序列是“AT”，这种转换是本领域技术人员所公知的。

本领域公知，在天然状态下，每个microRNA基因经过转录、加工，理论上最终都能够产生两种具有不同成熟序列的成熟体microRNA：5p-microRNA和3p-microRNA。因此，本文中，除非另外说明，“单一microRNA成熟体”是指两种成熟体microRNA的其中一种，并且，该种成熟体microRNA是人们感兴趣的，希望实现细胞内高表达的；有些情况下，所述“单一microRNA成熟体”指“低丰度microRNA”，通常即3p-microRNA。“另一microRNA成熟体”是指来自于同一个前体的两种成熟体microRNA中除“单一microRNA成熟体”以外的另一种成熟体microRNA。例如，当所述的“单一microRNA成熟体”为3p-microRNA，则所述的“另一microRNA成熟体”为5p-microRNA。

如本文所用，“shRNA过表达质粒”是指一些本领域常规用于构建shRNA的质粒，通常该质粒上存在“间隔序列”以及位于“间隔序列”两边的多克隆位点或供替换序列，从而人们可以将shRNA(或类似物)相应的DNA序列通过正向和反向的方式插入多克隆位点或替换其上的供替换序列，该DNA序列转录后的RNA可形成shRNA(Short Hairpin)结构。所述的“shRNA过表达质粒”目前已经完全可以通过商购的途径购买获得。

如本文所用，术语“星号microRNA”、“过客microRNA”、“低丰度microRNA”、“miR-X^*”(X代表microRNA编号)可以互换使用，均是指两种成熟体microRNA中较难表达或表达丰度低的一种成熟体microRNA。

如本文所用，术语“高丰度microRNA(miR-X)”是指两种成熟体microRNA中较易表达或表达丰度高的一种成熟体microRNA。

表达构建物

根据本发明所提供的miRNA表达策略，可设计出在被导入细胞中后可被细胞加工成所需表达的单一microRNA成熟体的多核苷酸构建物。因此，本发明提供了一种人工构建的表达构建物，所述的表达构建物包含一个间隔序列(与两侧序列不互补)，两端连接上互补的基因序列，导入细胞后，能产生“茎-环”结构，并且“茎”状部分中Seq_反向能够在细胞内被加工成活性的单一microRNA成熟体，而Seq_正向尽管也在细胞中被加工，但形成的RNA不是所述的单一microRNA成熟体，也不是所述的另一microRNA成熟序列，且不保留有另一microRNA成熟序列的天然活性。

作为本发明的一种优选方式，所述的表达构建物含有至少一个如下所示的结构：

5’Seq_正向-Y-Seq_反向3’    (I)；

其中，Seq_反向为该单一microRNA相应的DNA序列；Seq_正向为与Seq_反向互补的序列；Y为位于Seq_正向和Seq_反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq_正向和Seq_反向不互补；式I所示的结构在可形成如下所示的二级结构：

其中，“|”表示在Seq_正向和Seq_反向中，相应的核苷酸是配对的，在Seq_{正 向}和Seq_反向之间形成氢键；表示在Seq_正向和Seq_反向中，相应的核苷酸不配对；并且，“|”和

的分布构成了Seq_反向与Seq_正向的互补。

上述结构进入细胞并被胞内加工后，基于Seq_反向结构表达所述的单一microRNA成熟体，基于Seq_正向结构表达与另一microRNA成熟体不同的RNA序列，其不具备另一microRNA成熟序列的活性。

本领域均了解，microRNA成熟序列中，发挥活性的关键位点(通常是microRNA成熟序列与靶序列发生互补的位点)通常位于其5’端的若干个碱基。根据公知的情况，通常位于5’端的第2-10位(较佳地第2-8位)上，因此，以Seq_正向为参照，

存在于与该Seq_正向序列的特定位点上，该特定位点对应于所述另一microRNA成熟体发挥活性的关键位点。这种设计使得基于Seq_正向结构表达出的分子因为序列的改变，不再具备另一microRNA成熟序列的活性。

在设计所述的表达构建物时，还可以根据本领域常规设计干扰RNA分子的方法，在Seq_反向和Seq_正向的3’端设计悬垂碱基，例如“TT(UU)”。这种设计是本领域技术人员所熟知的。

在设计所述的表达构建物时，间隔序列的设计也可以参照本领域的常规模式，本领域技术人员非常清楚怎样的间隔序列可以达到形成茎环结构的目的。并且，许多商业化的载体使用说明上本身已经提供了间隔序列。较佳地，所述的间隔序列的长度是5-19nt(较佳地为9nt左右)。

所述的表达构建物还可以制备成可形成多于1个茎环结构的形式，例如，可以包含2个或2个以上的茎环结构，这些茎环结构“茎”状部分(即由Seq_正向和Seq_反向相互作用形成)用于生产所需的单一microRNA成熟体。多于1个的茎环结构对于提高单一microRNA成熟体的产量可能是有用的。

表达方法

本发明还提供了一种表达单一microRNA成熟体的方法，所述方法包括：提供一种如上所述的表达构建物；该表达构建物转化细胞，从而表达单一microRNA成熟体。

通常，所述的表达构建物位于表达载体上。因此，本发明还包括一种表达载体，它含有所述的构建物。所述的表达载体通常还含有与所述的表达构建物操作性相连的启动子、复制起点和/或标记基因等。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的表达构建物可有效连接到表达载体中的适当启动子上。这些启动子的代表性例子有：U6启动子、H1启动子或CMV启动子以及其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。所述的表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶基因、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)基因，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性基因。

包含上述的适当基因序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞。用重组DNA转化(转染)细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行，当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物细胞，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的单一microRNA成熟体。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在本发明的一种较佳的实施例中，本发明人构建了经过碱基互补性设计的表达质粒，以实现特异性单一地过表达microRNA两条成熟序列中的一种，从而达到稳定过表达低丰度星号成熟体(miR-X^*，X代表microRNA编号)，又没有相应高丰度成熟体(miR-X)干扰的目的。首先，利用shRNA茎环结构设计插入序列结构：在插入siRNA序列的位置，插入目的microRNA(以hsa-mir-146b-3p作为范例，hsa-mir-146b-3p即hsa-mir-146b所产生的低丰度microRNA)的成熟序列；在对侧，插入与该成熟序列互补的序列，用于形成茎环。通过碱基替换，对互补序列进行修正，达到：互补序列没有潜在的siRNA干扰效应；破坏可能出现在2-8位及其附近的hsa-mir-146b-5p的种子序列，以排除该种子序列带来的可能存在的hsa-mir-146b-5p的活性；同时，保证上述改造能够维持原有shRNA的茎环结构。之后，将改造好的shRNA序列插入到过表达载体中。应用Taqman Realtime PCR方法检测microRNA过表达水平；应用基于Luciferase报告系统的hsa-mir-146b-3p和hsa-mir-146b-5p的sensor质粒检测过表达的序列是否有生理功能。结果，通过上述方法得到了hsa-mir-146b-3p的过表达质粒plvx-hs-146b3p。将plvx-hs-146b3p转染到Hela细胞中，24小时培养后抽提RNA，进行Realtime检测。与转染对照质粒相比，plvx-hs-146b3p成功过表达了hsa-mir-146b-3p的成熟序列，而没有检测到hsa-mir-146b-5p的过表达。通过Luciferase报告系统，证实plvx-hs-146b3p能够抑制hsa-mir-146b-3p sensor的Renilla酶表达，而不能对hsa-mir-146b-5p的sensor产生抑制作用。上述结果表明：通过改造shRNA过表达系统，能够成功地达到特异性单一地过表达microRNA两条成熟序列中的低丰度星号成熟体(miR-X^*)的效果。同时，双荧光报告基因实验，验证了过表达的低丰度星号成熟体(miR-X^*)具有抑制其靶基因表达的生理功能，并排除了相应高丰度成熟体(miR-X)microRNA活性的存在。从而证明本发明人的策略可以应用于特异性单一地过表达microRNA低丰度星号成熟体。这个方法为深入研究microRNA不同成熟序列之间的功能提供了有力工具。理论上，利用该策略还可以达到分别过表达microRNA5’端成熟序列(5p-microRNA)或3’端成熟序列(3p-microRNA)的目的，这为今后区别研究同一前体产生的microRNA成熟序列的功能，以及基于microRNA过表达而设计的疾病治疗方案，也提供了一种有潜力的开发工具。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

I.材料和方法

1、质粒构建

plvx-hs-146b3p过表达质粒的构建

茎环结构的构建示意图如图1A-B，将hsa-mir-146b-3p的成熟序列5’tgccctgtggactcagttctgg 3’(SEQ ID NO：1)以及设计好的对侧互补序列5’ccaggattgagtccacagggca 3’(SEQ ID NO：2)分别插入到shRNA茎环结构的3’端和5’端。通过DNA合成(上海生物工程公司)得到上游具有BamHI粘性末端和下游具有EcoRI粘性末端的两条长链DNA引物，序列如下：

上游引物：

5’GATCCCCccaggattgagtccacagggcaTTCAAGAGAtgccctgtggactcagttctggTTTTTA 3’(SEQ ID NO：4)；

下游引物：

5’AATTTAAAAAccaggattgagtccacagggcaTCTCTTGAAtgccctgtggactcagttctggGGG 3’(SEQ ID NO：5)。

通过退火反应(退火体系(50uL)：碧云天的退火缓冲液10uL，双蒸水20uL，上下游引物各10uL。退火条件：95℃2分钟，然后每1分30秒下降1℃，最后降到25℃，4℃无穷)合成带有粘性末端的插入序列，连接到BamHI和EcoRI双酶切后的plvx-shRNA2载体(购自clontech公司)中，如图1C。

hsa-mir-146b-3p和hsa-mir-146b-5p的sensor报告基因质粒psicheck-146b3psensor和psicheck-146b5psensor的构建

参考文献[7]的方法合成上下游长链引物，上游引物末端为XhoI的粘性末端，下游引物末端为NotI的粘性末端，退火后连接到XhoI和NotI双酶切的psicheck载体(购自Promega公司)中，引物序列如下：

psicheck-146b3psensor上游引物：

5’TCGACACCCCAGAACTGAGTCCACAGGGCAGGTCAACAATCACCCCAGAACTGAGTCCACAGGGCAGGC3’(SEQ ID NO：6)；

psicheck-146b3psensor下游引物：

5’GGCCGCCTGCCCTGTGGACTCAGTTCTGGGGTGATTGTTGACCTGCCCTGTGGACTCAGTTCTGGGGTG3’(SEQ ID NO：7)。

psicheck-146b5psensor上游引物：

5’TCGACACCAGCCTATGGAATTCAGTTCTCAGGTCAACAATCACCAGCCTATGGAATTCAGTTCTCAGGC3’(SEQ ID NO：8)；

psicheck-146b5psensor下游引物：

5’GGCCGCCTGAGAACTGAATTCCATAGGCTGGTGATTGTTGACCTGAGAACTGAATTCCATAGGCTGGTG3’(SEQ ID NO：9)。

以上质粒都经过测序证明其序列的正确性。

2、细胞培养

Hela细胞来源于美国菌种保藏中心(ATCC)，购至中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。培养基：DMEM(Invitrogen公司)添加10％(v/v)胎牛血清和100U/ml青霉素-链霉素。置于37℃，5％二氧化碳条件下培养。

3、转染Hela细胞

按照Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)的说明书方法进行。

对于实时荧光定量PCR实验：转染前一天100000细胞/孔铺24孔板，第二天细胞达到50-60％密度时候进行转染。microRNA过表达质粒400ng/孔，0.8ulLipofectamine2000/孔，4小时后换液，24hr后收集RNA，-80℃保存待测。

4、荧光素酶报告基因实验

转染前一天10000细胞/孔铺96孔板，第二天细胞达到50-60％密度时候进行转染。报告质粒(psicheck-146b3psensor和psicheck-146b5psensor和psicheck-ctrl(即psicheck空载体用量)20ng/孔，microRNA过表达质粒100ng/孔，0.24ul Lipofectamine2000/孔，4小时后换液，24hr后除去上清，加入30uL/孔裂解液(Promega公司)，150转室温摇30分钟，收集蛋白，取5uL上机检测，底物购自Promega，firefly和renilla底物各60uL/孔。

5、实时荧光定量PCR(Real-time PCR)

使用酚氯仿法抽提，每孔细胞使用0.5mL Trizol(Invitrogen公司)收集RNA，加入100uL氯仿混匀后静置3分钟，12000g 4℃离心15分钟，吸取上清并加入300uL异丙醇混匀后静置10分钟，12000g 4℃离心10分钟，除去上清，用500uL的75％的乙醇洗涤两次，每次7500g 4℃离心5分钟。使用Nanodrop测定其浓度。

然后，经miRNA特异性引物逆转录，体系为dNTP 0.03ul、MMLV 0.2ul、10×Buffer 0.3ul、RNase Inhibitor 0.02ul、ddH₂O(RNase free)0.45ul、Primer 1ul和RNA 1ul(20-30ng)(Applied Biosystems公司)。

逆转录反应：16℃30min，42℃30min，85℃5min，4℃无穷。实时荧光定量PCR(Real-time PCR)体系，cDNA1uL，miRNA特异性探针1uL，buffer2uL(Applied Biosystems公司)。在Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCRSystem上进行检测。

II.实施例

实施例1、hsa-mir-146b-3p特异性过表达质粒的构建

随着microRNA研究的深入，星号microRNA成熟体的生理活性和功能正逐渐被认识[7]。稳定过表达星号microRNA成熟体是研究中必不可少的工具。本发明人基于以往使用人工合成microRNA类似物进行转染，以过表达microRNA某一成熟体序列的研究方法，提出假说：只要能够稳定地向细胞中引入星号microRNA的成熟体序列，就能够达到在该细胞中过表达星号microRNA的目的。于是，本发明人利用shRNA过表达方法能够特异性过表达siRNA序列，并且shRNA不仅剪切成熟过程利用了同microRNA相同的细胞机制，同时siRNA发挥功能也同microRNA一样，利用了Ago2所组成的效应蛋白复合体的事实[9]，提出了借助shRNA过表达的方式来表达星号microRNA成熟体的新策略。下面就利用hsa-mir-1463p的过表达质粒的构建说明新策略的实现过程：

首先，进行茎环结构的设计。如图1A，茎部结构由星号microRNA的成熟体以及对侧的与其互补的序列构成。环部采用了TTCAAGAGA(SEQ ID NO：3)的9个碱基所组成的环状结构[10]。

其次，对茎部结构所使用的星号microRNA的互补序列进行修正。为了避免茎部对侧序列表达所产生的副加效应，应使其满足以下两个条件：不具备siRNA的活性，即与转录组RNA没有完全匹配的现象；另外，不存在同相应5p-microRNA种子区完全一致或大部分一致的序列，以避免可能的microRNA效应。由于天然microRNA前体中的茎环结构的茎部是由互补配对的5p-microRNA和3p-microRNA构成的，所以星号microRNA的成熟体的互补序列的5’端2-8位会出现相应高丰度成熟体的种子区序列，这种情况随microRNA种类不同而程度不同。如图1B，实线框中序列为hsa-mir-146b-3p，虚线框突出显示了hsa-mir-146b-5p和hsa-mir-146b-3p互补序列的种子区的位置，hsa-mir-146b-3p互补序列的2-8位出现了AGAACU这六个同hsa-mir-146b-5p种子区的后六个碱基相同的序列，为了避免可能产生的microRNA效应将该序列改为AGGAUU，由于GU可以形成非典型的碱基配对，且是生理存在的较稳定的配对组合[11]，所以这里利用了GU配对替换AU配对的方式进行改造。最终，比对分析得到的茎部对侧序列没有siRNA的效应。

最后，如图1C所示，在所设计的序列的上下游加上过表达载体酶切所产生的粘性末端序列，合成DNA，并退火，形成带粘性末端的双链DNA，链接到过表达载体中。本发明人应用了慢病毒shRNA过表达质粒plvx-shRNA2，来构建hsa-mir-1463p的过表达质粒，并命名为plvx-hs-146b3p。

实施例2、plvx-hs-146b3p质粒能够特异性过表达hsa-mir-146b-3p的成熟序列

上述质粒构建成功后，通过测序证明了插入序列的正确性。为了验证plvx-hs-146b3p的过表达效果，本发明人将plvx-hs-146b3p转染到Hela细胞中。24hr培养后，收集RNA，检测hsa-mir-146b-3p的表达量。如图2A所示，只用转染试剂处理mock的细胞和转染空质粒plvx-ctrl的细胞中检测不到hsa-mir-146b-3p的成熟序列，而转染plvx-hs-146b3p的细胞中则有高丰度的hsa-mir-146b-3p。除此以外，本发明人还检测了是否有hsa-mir-146b-5p的过表达。如图2B所示，同pSIF-hs-146b质粒过表达高丰度的hsa-mir-146b-5p相比，在只用转染试剂处理mock的细胞和转染空质粒plvx-ctrl或plvx-hs-146b3p的细胞中检测不到过表达的hsa-mir-146b-5p。于是证明，本发明人构建的plvx-hs-146b3p质粒能够特异性的提高细胞中hsa-mir-146b-3p的表达水平，而不会导致hsa-mir-146b-5p的水平升高。

实施例3、plvx-hs-146b3p过表达的hsa-mir-146b-3p的成熟序列具有抑制其靶基因表达的生理功能

为了进一步证明plvx-hs-146b3p质粒过表达的hsa-mir-146b-3p的成熟序列具有抑制靶基因表达的生理功能。本发明人构建了用于检测hsa-mir-146b-3p活性的双荧光报告质粒psicheck-146b3psensor，通过两个存在于Renilla基因3’UTR中的与hsa-mir-146b-3p互补的串联重复序列，该质粒的Renilla基因能够受到hsa-mir-146b-3p的抑制。如图3所示，对于没有该3’UTR存在的对照质粒psicheck-ctrl，Renilla的相对荧光强度不能被plvx-hs-146b3p下调。而psicheck-146b3psensor中Renilla的相对荧光强度能被plvx-hs-146b3p下调。进一步通过hsa-mir-146b-5p的报告质粒，本发明人发现plvx-hs-146b3p质粒过表达过程中，不会引入hsa-mir-146b-5p的活性。

讨论

通过利用接近于shRNA过表达短序列siRNA的方式，以hsa-mir-146b-3p为范例，本发明人成功构建了基于shRNA过表达载体系统的，能够过表达单一microRNA成熟体序列的过表达质粒，并成功实现了低丰度microRNA，hsa-mir-146b-3p的过表达，更进一步证实了过表达的microRNA成熟序列具有生理功能。

microRNA作为基因转录后调控的一个新的环节，不仅为基因表达提供了精细的调节方式，还通过控制关键基因的表达参与了很多生理功能[1，3]。除此以外，microRNA的异常表达或是遗传改变能够参与诸如癌症，自身免疫疾病，感染等多种疾病的病理过程[3，4，12]。在人类以及其他哺乳动物中microRNA的数量众多，同时，每个microRNA编码基因都具有产生两种不同microRNA成熟序列的能力，由于不同的microRNA成熟序列所具有的种子区不尽相同，不同microRNA的功能也具有多样性[13]。所以，鉴定各种microRNA的功能，是microRNA研究领域的一个重要课题。microRNA的早期研究认为，在microRNA成熟过程中，编码于5’端和3’端的成熟序列最终只能有一条存在下来，并发挥功能，而另外的一条用星号命名，被称为过客microRNA，认为它们只是一个需要被降解的副产物，不发挥功能[7]。于是，对于microRNA功能的研究，多集中在高丰度的microRNA成熟体上。但是，近年来随着研究的深入，人们发现，星号microRNA的表达在某些情况下能够被上调，星号microRNA同样存在生理活性[8]，并且许多microRNA会表达出丰度相当的5’端3’端成熟序列，所以越来越多的学者，认为microRNA的两条成熟序列都有发挥调控作用潜力[7，14，15]。

在研究microRNA功能的过程中，过表达该microRNA是必不可少的，但是使用合成的类似物转染的方法不能够实现稳定长期过表达的目的，而使用克隆microRNA编码序列构建质粒的方法，由于倾向性的高表达高丰度的成熟体，又不适合专一的研究星号microRNA的功能，也不适合研究5’端或3’端成熟序列具有相似表达丰度的microRNA的功能。

对于以上问题，本发明人结合自身研究的需要，设计了基于慢病毒shRNA过表达载体的，能够专一过表达hsa-mir-146b-3p的成熟序列的过表达质粒，并取得了成功。该方法在理论上，还具有可以专一过表达任意microRNA成熟序列的潜力。尽管由于不同microRNA之间序列上的差异，在shRNA设计时，与目的microRNA成熟序列互补的茎部序列的修正各不相同，需要根据具体情况和过表达效果进行适当调整；但是根据本发明提供的设计策略，这种修正是本领域人员可以进行的。虽然，本发明人没有针对每个microRNA都进行过表达尝试，但是，本发明所提供的过表达策略，为体内、体外研究microRNA功能，尤其是对同一microRNA前体所产生的不同成熟序列的单独过表达以及功能的区别研究提供了新的途径。长远来看，由于microRNA在疾病的发生发展中扮演了重要角色，所以microRNA作为潜在的治疗靶点应用价值很大[16]，本发明人的过表达策略能够达到只表达一种microRNA成熟序列的目的，排除了同时过表达另一成熟序列的副作用，具有重要的应用价值。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

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Claims (12)

1.一种表达单一microRNA成熟体的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)提供一种表达构建物，所述的表达构建物含有以下结构：

5’Seq_正向-Y-Seq_反向3’    (I)；

其中，Seq_反向为该单一microRNA成熟体相应的DNA序列；Seq_正向为与Seq_{反 向}互补的序列；Y为位于Seq_正向和Seq_反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq_正向和Seq_反向不互补；式I所示的结构可形成如下所示的二级结构：

其中，“|”表示在Seq_正向和Seq_反向中，相应的核苷酸是配对的，在Seq_{正 向}和Seq_反向之间形成氢键；

表示在Seq_正向和Seq_反向中，相应的核苷酸不配对；并且，“|”和

的分布构成了Seq_反向与Seq_正向的互补；

(2)将(1)的表达构建物转化细胞，从而表达单一microRNA成熟体。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，式I所示的结构进入细胞并被胞内加工后，基于Seq_反向结构表达所述的单一microRNA成熟体，基于Seq_正向结构表达与另一microRNA成熟体不同的RNA，其不具备另一microRNA成熟体的活性。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，式(II)中，以Seq_正向为参照，存在于与该Seq_正向序列的特定位点上，该特定位点对应于所述另一microRNA成熟体发挥活性的关键位点。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，式(II)中，以Seq_正向为参照，

存在于该序列的5’端第2-10位；且

存在的个数为0-5个。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的Seq_正向具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；和/或

所述的Seq_反向具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；和/或

所述的Y具有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，式(I)结构的序列选自：

SEQ ID NO：4中第8-60位所示核苷酸序列；或

SEQ ID NO：4中第8-62位所示核苷酸序列；或

SEQ ID NO：4中第6-62位所示核苷酸序列；或

SEQ ID NO：4中第5-66位所示核苷酸序列。

7.一种表达单一microRNA成熟体的表达构建物，所述的表达构建物含有以下结构：

5’Seq_正向-Y-Seq_反向3’    (I)；

其中，Seq反向为该单一microRNA相应的DNA序列；Seq_正向为与Seq_反向互补的序列；Y为位于Seq_正向和Seq_反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq_正向和Seq_反向不互补；式I所示的结构在可形成如下所示的二级结构：

其中，“|”表示在Seq_正向和Seq_反向中，相应的核苷酸是配对的，在Seq_{正 向}和Seq_反向之间形成氢键；

表示在Seq_正向和Seq_反向中，相应的核苷酸不配对；并且，“|”和

的分布构成了Seq_反向与Seq_正向的互补。

8.如权利要求7所述的表达构建物，其特征在于，所述的Seq_正向具有SEQID NO：2所示的核苷酸序列；和/或

所述的Seq_反向具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；和/或

所述的Y具有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。

9.如权利要求8所述的表达构建物，其特征在于，式(I)结构的序列选自：

SEQ ID NO：4中第8-60位所示核苷酸序列；或

SEQ ID NO：4中第8-62位所示核苷酸序列；或

SEQ ID NO：4中第6-62位所示核苷酸序列；或

SEQ ID NO：4中第5-66位所示核苷酸序列。

10.权利要求7-9任一所述的表达构建物的用途，用于表达单一microRNA成熟体。

11.一种重组细胞，其中包含权利要求7-9任一所述的表达构建物。

12.如权利要求11所述的重组细胞，其特征在于，所述的细胞是哺乳动物细胞。

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