CN111148829A

CN111148829A - 细胞培养基

Info

Publication number: CN111148829A
Application number: CN201880063718.1A
Authority: CN
Inventors: P.R.邓巴; V.J.菲斯特; I.D.克尔希
Original assignee: Shangjia Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Shangjia Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2017-09-30
Filing date: 2018-09-28
Publication date: 2020-05-12
Also published as: GB201715930D0; WO2019066664A1; EP3688140A1; US20200263129A1; US20230416678A1

Abstract

本发明涉及用于培养细胞(例如上皮细胞，特别是角质形成细胞)的不包含霍乱毒素的生长培养基、所述培养基用于生长细胞(例如上皮细胞，例如角质形成细胞)的用途和包含所述培养基的试剂盒。还提供了一种生成人全层皮肤、全人表皮或全人真皮的方法，该方法涉及在所述细胞培养基中培养角质形成细胞和饲养细胞。

Description

细胞培养基

本发明涉及用于培养细胞(例如上皮细胞，特别是角质形成细胞)的生长培养基、该培养基用来生长细胞(例如上皮细胞，例如角质形成细胞)的用途、以及包含该培养基的试剂盒。

发明背景

包含表皮的工程化组织(例如在体外生长的)具有广泛的用途。这种组织被用于具有烧伤或慢性伤口的患者的皮肤移植物中，或用于药物、化妆品和其他局部产品的开发和测试中。分化形成表皮的角质形成细胞需要与成纤维细胞的饲养细胞共培养。

在皮肤移植物的生产中，角质形成细胞通常与Green培养基(Green’s medium)和经辐照的异种小鼠胚胎饲养细胞(MEF)一起生长。未经辐照的小鼠饲养细胞的生长超过了角质形成细胞，并淹没培养物。因此，辐照饲养细胞以停止或减慢其复制。

Green培养基是包括以下成分的复杂混合物：

Dulbecco的改进的Eagles培养基(Dulbecco's Modified Eagle Medium，DMEM)包含氯化钙、硝酸铁、硫酸镁、氯化钾、碳酸氢钠、氯化钠、磷酸二氢钠(无水)、L-精氨酸·HCl、L-半胱氨酸·HCl、甘氨酸、L-组氨酸·HCl·H₂O、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸·HCl、L-蛋氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸·2Na·H₂O、L-缬氨酸、氯化胆碱、叶酸、肌醇、烟酰胺、D-泛酸、吡哆醛·HCl、吡哆醇、核黄素、硫胺素·HCl、D-葡萄糖、酚红·钠、丙酮酸；

Ham F12培养基包括氯化钙、硫酸铜·5H₂O、硫酸亚铁·7H₂O、氯化镁、氯化钾、碳酸氢钠、氯化钠、磷酸氢二钠(无水)、硫酸锌·7H₂O、L-丙氨酸、L-精氨酸·HCl、L-天冬酰胺·H₂O、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸·HCl·H₂O、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸·HCl、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸·2Na·H₂O、L-缬氨酸、D-生物素、氯化胆碱、叶酸、肌醇、烟酰胺、D-泛酸、吡哆醇·HCl、核黄素、硫胺素·HCl、维生素B₁₂、D-葡萄糖、次黄嘌呤、亚油酸、酚红·Na、硫辛酸和胸苷；胎牛血清；霍乱毒素；重组人胰岛素；氢化可的松；L'谷氨酰胺、EGF、脱铁运铁蛋白、腺嘌呤和3,3,5,-三-碘化甲状腺氨酸和两种或三种抗生素。

GMP制造过程的监管批准通常需要对使用补充组分(例如介质)的使用进行一些验证和科学支持，除非该材料被归类为“gras试剂”(通常被视为安全的试剂)。

Green培养基从未针对上皮细胞(如角质形成细胞)的生长进行过优化。本发明人对Green培养基成分进行了研究，以确定哪些成分影响最小(因此是多余的)，或者甚至可对角质形成细胞的生长产生不利影响。但是，由于培养基的复杂性，很难确定哪些组分是必不可少的，哪些是不必要的。

Okada等人J.Inves.Dermatol.1982Jul 79(1)42-7公开了霍乱毒素加速了角质形成细胞的生长。显然，产生皮肤产品的总加工时间是加工效率和存活力的重要因素，因此迄今为止，霍乱毒素被认为是培养基的重要方面。

但是，霍乱毒素在培养基中的存在是一个潜在的问题，因为它是一种有效的免疫调节剂，并且具有粘膜和全身佐剂活性。佐剂活性在疫苗中是合适的，因为它增加了对疫苗中抗原的免疫反应。但是，不希望在皮肤移植物中增加免疫反应，因为这些反应会增加移植物排斥的风险。

另外，在一些情况下，霍乱毒素是利用牛脑组织生长的，这具有被朊病毒蛋白污染的风险。

异种饲养细胞的使用意味着体外生长的皮肤样品不是完全人类的。工程化组织中残留的非人类成分/蛋白质会对移植物带来不耐受性，并产生导致移植物排斥的免疫反应。将治疗产品暴露于异种细胞也可导致传染源从非人类宿主传播。

目前，本领域尚无人生产全人类皮肤产品，例如包括全人表皮，特别是完全分化的全层全人皮肤产品，特别是在培养基中不使用霍乱毒素的情况下。

具有一种允许上皮细胞(例如角质形成细胞)与未经辐照的人类成纤维细胞一起培养的细胞培养基，例如在制备包含全人表皮(例如全层全人皮肤)的工程化皮肤产品时是有用处的。因此，需要一种用于生长角质形成细胞的改良培养基，特别是一种简化的培养基，该培养基稳固且可重复并且适合用于GMP制造。

发明概述

在以下段落中概括了本发明：

1.一种细胞培养基，其包含以下成分或由以下成分组成：DMEM、Ham's F12，血清、一种或多种抗生素和/或抗真菌剂、角质形成细胞生长因子(KGF)和/或表皮生长因子，以及任选的角质形成细胞生长促进剂因子，其中该因子不是霍乱毒素。

2.根据段落1的细胞培养基，其中DMEM是高葡萄糖的。

3.根据段落1或2的细胞培养基，其中所述血清是哺乳动物的胎牛血清。

4.根据段落1至3中任一段的细胞培养基，其中所述血清以5至15％的浓度存在，例如5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％或15％，特别是10％。

5.根据段落1至4中任一段的细胞培养基，其中至少一种抗生素(例如1、2或3种抗生素)属于组分。

6.根据段落5的细胞培养基，其中所述抗生素独立地选自青霉素、链霉素、氨苄青霉素、阿莫西林、羧苄青霉素、头孢噻肟、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、多粘菌素、杀稻瘟素、遗传霉素、潮霉素B、霉酚酸、嘌呤霉素、博莱霉素(zeocin)和其两种或多种的组合。

7.根据段落5或6的细胞培养基，其中所述抗生素是庆大霉素。

8.根据段落5至7中任一段的细胞培养基，其中所述抗生素是青霉素。

9.根据段落5至8中任一段的细胞培养基，其中所述抗生素是链霉素。

10.根据段落1至9中任一段的细胞培养基，其中抗真菌剂属于组分。

11.根据段落10的细胞培养基，其中所述抗真菌剂选自两性霉素B、制霉菌素、放线菌素D、磷胺霉素、霉酚酸和其两种或更多种的组合。

12.根据段落11的细胞培养基，其中所述抗真菌剂为两性霉素B，例如浓度为0.500至0.750μg/ml，例如0.625μg/ml。

13.根据段落1至12中任一段的细胞培养基，其中，DMEM∶Ham’s F12的比例为2.5至3.5∶1.5至0.5，例如3∶1。

14.根据段落1至13中的任一段的细胞培养基，其中，所述KGF的浓度在10ng/ml至30ng/ml的范围内，例如20ng/ml。

15.根据段落1至14中任一段的细胞培养基，其中，所述角质形成细胞生长促进因子是ROCK抑制剂，例如小分子ROCK抑制剂。

16.根据段落15的细胞培养基，其中ROCK抑制剂选自：SB772077B、Y-27632、法舒地尔、Ripasudil、Y39983、Wf-536、SLx-2119、氮杂苯并咪唑-氨基呋咱、DE-104、H-1152、ROKα抑制剂、XD-4000、HMN-1152、4-(1-氨基烷基)-N-(4-吡啶基)环己烷-甲酰胺、rhostatin、BA-210、BA-207、BA-215、BA-285、BA-1037、Ki-23095、VAS-012、RKI-1447、GSK429286A、Y-30141、HA-100、H-7、iso H-7、H-89、HA-1004、HA-1077、H-8、H-9、KN-62、GSK269962、喹唑啉和其两种或多种的组合。

17.根据段落16的细胞培养基，其中ROCK抑制剂是SB772077B，Y-27632或两者的组合，特别是SB772077B。

18.根据段落15至17中任一段的细胞培养基，其中ROCK抑制剂的浓度在0.1至100μM的范围内，例如，0.2至50μM或0.3至25μM或0.1至10μM或0.1至0.95μM，例如0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9或0.95μM，特别是0.4μM。

19.一种产生人类全层皮肤、全人表皮或全人真皮(即包含全人表皮)的体外方法，其包括第一培养步骤，其中人类角质形成细胞和饲养细胞在根据段落1至18中任一段的细胞培养基中培养。

20.根据段落19的体外方法，其中所述饲养细胞是成纤维细胞。

21.根据段落20的体外方法，其中所述成纤维细胞完全是人的。

22.根据段落19至21中任一段的体外方法，其中，不在异种饲养细胞的存在下培养人角质形成细胞。

23.根据段落19至22中任一段的体外方法，其中，不辐照人类成纤维细胞。

24.根据段落19至23中任一段的体外方法，其中，所述人成纤维细胞与所述角质形成细胞(和/或患者)性别匹配。

25.根据段落19至24中任一段的体外方法，其中所述人成纤维细胞与角质形成细胞(和/或患者)HLA匹配。

26.根据段落19至25中任一段的体外方法，其中所述人成纤维细胞和角质形成细胞来自同一供体。

27.根据段落19至26中任一段的体外方法，其中所述人类成纤维细胞对人类患者是同种异体的。

28.根据段落19至27中任一段的体外方法，其中所述人角质形成细胞对人患者是同种异体的。

29.根据段落19至23或25中任一段的体外方法，其中所述人类成纤维细胞对于人类患者是自体的。

30.根据段落13至27或29中任一段的体外方法，其中所述人类角质形成细胞对人类患者是自体的。

31.根据段落19至30中任一段的体外方法，其中，所述方法包括具有第一培养阶段的第二培养步骤，其中，所述角质形成细胞不与透气膜(界面)接触并且不在所述液体界面。

32.根据段落31的体外方法，其中将第二步骤中的角质形成细胞培养第二阶段，使其与透气性膜(界面)接触，例如，其中角质形成细胞与透气性膜接触(随后不接触透气层的培养期)。

33.根据段落19至32中任一段的体外方法，其中所述角质形成细胞沉积在基板(substrate)上，例如基质，例如旋转基质或筛网。

34.根据段落33的体外方法，其中所述基板(例如基质)包含生物相容性可生物降解的聚合物。

35.根据权利要求33或34的体外方法，其中所述基底通过电纺丝制备。

36.根据段落30的体外方法，其中来自所述电纺丝的电纺纤维的直径为约0.3μm至约5μm或直径为2至5μm，例如1、1.5、2、2.5、3、3.5、4或4.5μm。

37.根据段落35或36的体外方法，其中，所述基板由从聚合物纺丝的纤维制备，所述聚合物选自PLGA、PLA、PCL、PHBV、PDO、PGA、PLCL、PLLA-DLA、PEUU、醋酸纤维素、PEG-b-PLA、EVOH、PVA、PEO、PVP、混合PLA/PCL、明胶-PVA、PCT/胶原蛋白、海藻酸钠/PEO、壳聚糖/PEO、壳聚糖/PVA、明胶/弹性蛋白/PLGA、丝/PEO、丝素蛋白/壳聚糖、PDO/弹性蛋白、PHBV/胶原蛋白、透明质酸/明胶、胶原蛋白/硫酸软骨素、胶原蛋白/壳聚糖、PDLA/HA、PLLA/HA、明胶/HA、明胶/硅氧烷、PLLA/MWNTs/HA、PLGA/HA、二噁烷酮线性均聚物(如100二噁烷酮线性均聚物)及其两种或多种的组合。

38.根据段落37的体外方法，其中所述聚合物是聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid))(PLGA)。

39.根据段落33至38的体外方法，其中生物相容性生物可降解聚合物的浓度为10至40％w/v，例如26％至40％w/v，例如11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38或39％w/v，特别是15、16、17、18、19、20或21％w/v。

40.根据段落33至39中的任一段的体外方法，其中，所述基底的厚度为10至100μm。

41.根据段落33至40中的任一段的体外方法，其中，所述基底是三维的，并且基本上是平面的，具有两个面。

42.根据段落41中的任一段的体外方法，其中，所述基底的至少一个面是微图案化的、起伏的和/或凹陷的(dimpled)。

43.根据段落33至42中任一段所述的体外方法，其中所述基底用蛋白质、多肽或肽涂覆，以辅助角质形成细胞粘附于基底和/或使细胞分层。

44.根据段落43的体外方法，其中所述蛋白质选自细胞外基质蛋白(例如胶原蛋白，层粘连蛋白和其他细胞外基质蛋白)或其肽，例如合成肽。

45.根据段落44的体外方法，其中所述细胞外基质蛋白选自胶原蛋白IV、胶原蛋白I、层粘连蛋白和纤连蛋白或其组合，例如胶原蛋白IV。

46.根据段落33至45中的任一段的体外方法，其中，所述基底位于包括透气膜的培养装置中，例如使得可以定向一个面以与所述透气层接触或所述一面的取向不与所述透气层接触(移出)。

47.根据段落46的体外方法，其中，所述基底可在使一个面与所述透气层接触的位置与使所述一个面不与所述透气层接触(移出)的位置之间之间移动(例如通过旋转或滑动)。

48.根据段落19至47中任一段的体外方法，其进一步包括通过蛋白酶消化来消化包含人类角质形成细胞和人类成纤维细胞饲养细胞的样品(例如皮肤样品)的预处理步骤。

49.根据段落48的体外方法，其中蛋白酶选自分散酶、胰蛋白酶及其组合。

50.根据段落49的体外方法，其中使用分散酶(例如消化表皮)。

51.根据第48至50段中任一段所述的体外方法，其中使用胰蛋白酶(例如消化真皮)。

52.根据段落48至51中任一段的体外方法，其中所述消化在胶原蛋白酶的存在下进行。

53.根据段落48至52中任一段的体外方法，其中所述消化在不分离真皮和表皮的情况下进行(本发明中称为全细胞消化)。

54.一种完全皮肤产品，其包含通过段落19至53中任一段的方法培养的人类表皮。

55.根据段落54的全人皮肤产品，其包含分化的真皮和表皮。

56.根据段落54或55的全人皮肤产品，其用于治疗。

57.根据段落56的全人表皮，其中所述治疗是针对选自以下的病症或疾病：组织损伤，例如割伤、撕裂伤、擦伤(例如剥落)、剪力损伤、咬伤(包括动物咬伤，例如狗咬伤和昆虫咬伤)；皮肤再生(例如神经和细胞器)；伤口愈合，例如促进/增强伤口愈合，包括糜烂、溃疡(例如糖尿病性溃疡)、麻风引起的伤口、营养不良性表皮松解的伤口、化脓性汗腺炎伤口、粘膜类天疱疮伤口、类天疱疮伤口、寻常型天疱疮的伤口、坏疽性脓皮病的伤口、带状疱疹的伤口；烧伤愈合，包括辐照烧伤、晒伤、化学烧伤(例如酸烧伤和碱烧伤)、热烧伤；皮肤再生和修复(例如萎缩)或组织切除后，例如，切除的部位为：癌细胞皮肤细胞(包括黑素瘤，基底细胞癌，鳞状细胞癌(例如鲍温病)、乳房外柏哲德氏病(extra-mammary Paget’sdisease))、乳腺癌，Darrier病的组织、囊肿、疣(包括跖疣)、坏死性筋膜炎(例如耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌)、坏死组织(例如坏疽)、表现出Hailey-Hailey病的组织、表现出与寻常型天疱疮相关的水疱的组织；大疱性表皮松解症；提高皮肤质量(例如治疗鱼鳞病)或外观；预防或修复皮肤疾病，例如脓肿，皮炎(包括接触性皮炎)，特应性皮炎，痤疮，光化性角化病、酒渣鼻、痈、湿疹、牛皮癣、蜂窝组织炎、毛发角化病，黄褐斑、脓疱病或裂痕；疤痕组织的减少或消失(例如治疗瘢痕瘤)；乳房皮肤再生(手术后)；化妆品应用，例如抗衰老；用于皱纹和其他皮肤缺陷的真皮再生；促进毛囊生长、神经和其他细胞器再生；愈合而不会留下疤痕，或再愈合以减少疤痕。在一个实施方案中，所述病状或疾病选自：组织损伤；具有神经和细胞器的皮肤再生；伤口愈合，例如促进/增强伤口愈合，包括溃疡，例如糖尿病性溃疡；烧伤愈合；皮肤再生和修复；大疱性表皮松解；改善皮肤质量或外观；预防或补救皮肤疾病；疤痕组织的减少或消失；乳房皮肤再生(手术后)；化妆品应用，例如抗衰老；用于皱纹和其他皮肤缺陷的真皮再生；促进毛囊生长、神经和其他细胞器再生；愈合而不会留下疤痕，或再愈合以减少疤痕。

58.一种治疗方法，包括将根据段落54或55的全人表皮缝合至有需要的患者，例如用于治疗选自以下的病症或疾病：组织损伤，例如割伤、撕裂伤、擦伤(例如剥落)、剪力损伤、咬伤(包括动物咬伤，例如狗咬伤和昆虫咬伤)；皮肤再生(例如神经和细胞器)；伤口愈合，例如促进/增强伤口愈合，包括糜烂、溃疡(例如糖尿病性溃疡)、麻风引起的伤口、营养不良性表皮松解的伤口、化脓性汗腺炎伤口、粘膜类天疱疮伤口、类天疱疮伤口、寻常型天疱疮的伤口、坏疽性脓皮病的伤口、带状疱疹的伤口；烧伤愈合，包括辐照烧伤、晒伤、化学烧伤(例如酸烧伤和碱烧伤)、热烧伤；皮肤再生和修复(例如萎缩)或组织切除后，例如，切除的部位为：癌细胞皮肤细胞(包括黑素瘤，基底细胞癌，鳞状细胞癌(例如鲍温病)、乳房外柏哲德氏病(extra-mammary Paget’s disease))、乳腺癌，Darrier病的组织、囊肿、疣(包括跖疣)、坏死性筋膜炎(例如耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌)、坏死组织(例如坏疽)、表现出Hailey-Hailey病的组织、表现出与寻常型天疱疮相关的水疱的组织；大疱性表皮松解症；提高皮肤质量(例如治疗鱼鳞病)或外观；预防或修复皮肤疾病，例如脓肿，皮炎(包括接触性皮炎)，特应性皮炎，痤疮，光化性角化病、酒渣鼻、痈、湿疹、牛皮癣、蜂窝组织炎、毛发角化病，黄褐斑、脓疱病或裂痕；疤痕组织的减少或消失(例如治疗瘢痕瘤)；乳房皮肤再生(手术后)；化妆品应用，例如抗衰老；用于皱纹和其他皮肤缺陷的真皮再生；促进毛囊生长，神经和其他细胞器再生；愈合而不会留下疤痕，或再愈合以减少疤痕。

59.根据段落54或55的全人表皮在制造用于选自以下的疾病或病症的药物中的用途：组织损伤，例如割伤、撕裂伤、擦伤(例如剥落)、剪力损伤、咬伤(包括动物咬伤，例如狗咬伤和昆虫咬伤)；皮肤再生(例如神经和细胞器)；伤口愈合，例如促进/增强伤口愈合，包括糜烂、溃疡(例如糖尿病性溃疡)、麻风引起的伤口、营养不良性表皮松解的伤口、化脓性汗腺炎伤口、粘膜类天疱疮伤口、类天疱疮伤口、寻常型天疱疮的伤口、坏疽性脓皮病的伤口、带状疱疹的伤口；烧伤愈合，包括辐照烧伤、晒伤、化学烧伤(例如酸烧伤和碱烧伤)、热烧伤；皮肤再生和修复(例如萎缩)或组织切除后，例如，切除的部位为：癌细胞皮肤细胞(包括黑素瘤，基底细胞癌，鳞状细胞癌(例如鲍温病)、乳房外柏哲德氏病(extra-mammaryPaget’s disease))、乳腺癌，Darrier病的组织、囊肿、疣(包括跖疣)、坏死性筋膜炎(例如耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌)、坏死组织(例如坏疽)、表现出Hailey-Hailey病的组织、表现出与寻常型天疱疮相关的水疱的组织；大疱性表皮松解症；提高皮肤质量(例如治疗鱼鳞病)或外观；预防或修复皮肤疾病，例如脓肿，皮炎(包括接触性皮炎)，特应性皮炎，痤疮，光化性角化病、酒渣鼻、痈、湿疹、牛皮癣、蜂窝组织炎、毛发角化病，黄褐斑、脓疱病或裂痕；疤痕组织的减少或消失(例如治疗瘢痕瘤)；乳房皮肤再生(手术后)；化妆品应用，例如抗衰老；用于皱纹和其他皮肤缺陷的真皮再生；促进毛囊生长，神经和其他细胞器再生；愈合而不会留下疤痕，或再愈合以减少疤痕。

60.根据段落54或55的完全人类的皮肤产品，用于测试局部用制剂。

61.试剂盒，其包含段落1至18中任一段的细胞培养基。

62.根据段落61的试剂盒，其进一步包含在与介质分开的容器中的ROCK抑制剂。

本发明人确定，Green培养基中存在的表皮生长因子(EGF)和霍乱毒素是Green培养基中的关键成分。已知霍乱毒素和异种小鼠饲养细胞与促进角质形成细胞生长的机制紧密相连。因此，本发明人假设霍乱毒素不直接作用于角质形成细胞以促进生长，而是刺激异种小鼠饲养细胞产生角质形成细胞生长因子(KGF)，从而间接地辅助角质形成细胞的生长。因此，本发明人选择通过将霍乱毒素刺激的终产物即KGF直接添加到培养基中来代替对霍乱毒素的需要。

因此，一方面，提供了一种细胞培养基，其由以下组成：DMEM高葡萄糖、Ham’s F12、胎牛血清、一种或多种抗生素和/或抗真菌剂和角质形成细胞生长因子(KGF)。

在一个实施方案中，细胞培养基由以下组成：DMEM高葡萄糖：Ham's F12(3:1)，10％胎牛血清、青霉素、链霉素、0.625μg/ml两性霉素B和20ng/ml KGF，本发明人称此培养基为“Kelch培养基”。有利地，公开的细胞培养基不含霍乱毒素。出人意料的是，发明人发现KGF可以成功地替代霍乱毒素，当其包含在缺乏霍乱毒素的基础培养基中时，它可以提供与Green培养基相似的角质形成细胞生长动力学。另外，所述细胞培养基是适合于支持角质形成细胞(例如人角质形成细胞)生长的基本培养基，它可以清除通常存在Green培养基中的所有不必要成分。此外，本发明的培养基在小鼠胚胎饲养细胞(MEF)的存在下产生与具有MEF的Green培养基相似的角质形成细胞生长。

但是，要使用未辐照的成纤维细胞饲养细胞，则角质形成细胞需要存在“另外的”生长加速因子。因此通常需要角质形成细胞生长促进因子，例如ROCK抑制剂。该因子可以作为培养基的成分添加，也可以作为成分直接添加到培养物中。因此，在一个实施方案中，该介质适合与ROCK抑制剂一起使用。

在一个实施方案中，细胞培养基由以下组成：DMEM高葡萄糖：Ham’s F12(3:1)、10％的胎牛血清、青霉素、链霉素、0.625μg/ml的两性霉素B和20ng/ml的KGF和角质形成细胞生长促进因子(例如ROCK抑制剂，特别是本发明公开的一种抑制剂)，其中所述因子不是霍乱毒素。

因此，目前公开的细胞培养基可以代替Green培养基而不使用MEF，从而消除了对霍乱毒素和MEF的需求。此外，因为细胞培养基是基本培养基，所以它更方便且易于制备，并且成本更低。

在一个实施方案中，角质形成细胞生长促进因子是ROCK抑制剂，例如小分子ROCK抑制剂。有利地，本发明人已经确定，与不存在ROCK抑制剂时相比，在细胞培养物中包含ROCK抑制剂导致角质形成细胞生长速率提高。

在一个实施方案中，ROCK抑制剂选自：SB772077B、Y-27632、法舒地尔、Ripasudil、Y39983、Wf-536、SLx-2119、氮杂苯并咪唑-氨基呋咱、DE-104、H-1152、ROKα抑制剂、XD-4000、HMN-1152、4-(1-氨基烷基)-N-(4-吡啶基)环己烷-甲酰胺、rhostatin、BA-210、BA-207、BA-215、BA-285、BA-1037、Ki-23095、VAS-012、RKI-1447、GSK429286A、Y-30141、HA-100、H-7、iso H-7、H-89、HA-1004、HA-1077、H-8、H-9、KN-62、GSK269962和喹唑啉。

在一个实施方案中，ROCK抑制剂是Y-27632、SB772077B或两者的组合，特别是SB772077B。本发明人已经确定这两种ROCK抑制剂都特别适合于增强角质形成细胞的生长速率。但是，SB772077B的优势是与Y27632相比具有更高的结合效力和特异性，这意味着与Y27632相比，它可以以更低的浓度使用以达到相同的效果(

对10μm)。

同样，向目前要求保护的细胞培养基中添加ROCK抑制剂可显著增加角质形成细胞的生长速率，从而使角质形成细胞能够生长，因此当它们与未辐照的成纤维细胞(特别是未辐照的人类成纤维细胞)在同一培养物中一起生长时，它们不会被成纤维细胞淹没。

这是有利的，因为为了从皮肤样品中生长人角质形成细胞，传统上必须先将表皮与真皮分离，然后再进行消化以从这两层皮肤中分离出细胞，以便在细胞培养中进行体外生长。其原因是存在于真皮中的成纤维细胞在培养时通常具有超过角质形成细胞的趋势，导致获得成纤维细胞的培养物而不是所需的角质形成细胞的培养物。通过消除在样品处理开始时将真皮与表皮分离的需要，与来自同一个人皮肤样品中的未辐照的成纤维细胞一起生长人类角质形成细胞的能力大大降低了样品制备的复杂性。它还允许制备完全人类的产品。

另外，由于未辐照的人成纤维细胞先前不能与人角质形成细胞一起培养，因此辐照的异种饲养细胞，例如小鼠饲养细胞通常被包括在培养物中，以提供角质形成细胞生长所需的细胞外分泌物。当生产用于临床中的皮肤移植的角质形成细胞时，依赖于来自不同生物的饲养细胞的需求远非理想，这是因为其具有免疫原性和传播传染因子的风险。

目前公开的培养基能够显著增强角质形成细胞的生长，因此未辐照的人成纤维细胞可以用作角质形成细胞的饲养细胞，而非使用辐照的异种饲养细胞，例如MEF，因为成纤维细胞的生长不再超过角质形成细胞。因此，与现有技术方法相比，本发明公开的方法产生的免疫原性和传染性产品较少。

在一个实施方案中，该方法还包括在胰蛋白酶和任选的胶原蛋白酶的存在下消化包含人角质形成细胞和人成纤维细胞饲养细胞的样品(例如皮肤样品)的预处理步骤。有利地，本发明人已经发现，与通常使用的现有技术的分散酶胶原蛋白酶顺序消化方法相比，仅用胰蛋白酶或用胰蛋白酶和胶原蛋白酶消化皮肤样品导致细胞产量明显更高。

本发明所采用的预处理步骤仅被用来强调该步骤与样品制备有关，并且无意于限制本发明所进行的步骤的顺序。因此，可以提供皮肤产品的任何合理顺序来执行该方法的步骤。

在一个实施方案中，在单次消化反应中从同一皮肤样品中分离出角质形成细胞和成纤维细胞。有利地，所公开的方法允许使用单次消化反应从表皮分离角质形成细胞，并从真皮分离成纤维细胞。这样就不需要在两个独立的反应中消化表皮和真皮，从而节省了时间并简化了工艺。

在一个实施方案中，在胰蛋白酶和胶原蛋白酶的存在下消化样品。在胶原蛋白酶的存在下进行消化的优势在于，胶原蛋白酶有助于消化真皮和基底膜，从而从皮肤组织中释放出更多的细胞。与仅使用胰蛋白酶相比，这可导致更高的细胞产量。此外，本发明人已经发现，与从分散酶消化的表皮和胶原蛋白酶消化的真皮分离的角质形成细胞和/或成纤维细胞相比，通过在胰蛋白酶和胶原蛋白酶中消化皮肤而分离的角质形成细胞和/或成纤维细胞在培养物中生长时可以更快地增殖。

在一个实施方案中，该胶原蛋白酶是I型胶原蛋白酶。有利地，I型胶原蛋白酶具有胶原蛋白酶、酪蛋白酶、梭菌蛋白酶和胰蛋白酶活性，使其非常适合消化包含一系列不同细胞类型的皮肤样品。

在一个实施方案中，皮肤样品获自人(特别是患者)，来自任何合适的位置，例如肩膀、手臂、大腿、小腿、乳房、腹部、包皮和/或臀部。

在一个实施方案中，不在异种饲养细胞的存在下培养人角质形成细胞。这具有在上文中讨论的优点。在一个实施方案中，不辐照人成纤维细胞。这样做的优点是，成纤维细胞仍然活跃，最终能够生长并分化为真皮。另一个优点是，由于不需要辐照细胞或通过质量控制系统确保辐照过程不会使任何细胞逃逸辐照和增殖，因此大大简化了生长角质形成细胞的过程。

在一个实施方案中，人类成纤维细胞对于人类患者是自体的。在一个实施方案中，人角质形成细胞对人患者是自体的。有利的是，当从患者自己的皮肤细胞中产生全人表皮时，这可以大大降低患者的免疫原性风险。此外，通过本发明的方法制备的皮肤移植物产品可以在短至3周内生产，这使得产生针对个体患者的移植物成为可能。自体和同种异体(也称为异源)在将皮肤移植物应用于特定患者的情况下是相关的，且可能在获取原始样品的情况下是相关的。其不是影响该方法本身的各个步骤的参数。

在一个实施方案中，将角质形成细胞培养一段时间而不接触透气膜(界面)。在一个实施方案中，将角质形成细胞与透气膜(界面)接触培养一段时间。后者帮助细胞分化。在一个实施方案中，角质形成细胞与透气膜接触的培养时间段之后是在不接触透气层的情况下的培养时间段。

在一个实施方案中，相关细胞到透气层的距离(例如，其中细胞与透气层接触)为2cm或更小，例如1cm或更小，特别是0.5、0.4、0.3、0.2、0.1或0.05cm。

在一个实施方案中，基板用细胞外基质蛋白或其肽(例如合成肽(例如胶原蛋白、层粘连蛋白和其他细胞外基质蛋白))涂覆。有利地，涂覆的存在产生第二细胞信号(第一信号在空气-液体或透气的界面处使皮肤组织生长)，这增强了皮肤组织的适当分层。

如以上在一个实施方案中所讨论的，基板位于包括透气膜的培养装置中，例如，基板可移动至这样的位置，其中沉积在其上的细胞与透气层接触，或者可移动到所述细胞不与透气层的接触位置。在WO2016/209089中公开了合适的设备，其通过引用并入本发明。

在一个实施方案中，培养装置包括：容器，其包括第一端壁(底部)和至少一个侧壁，可拆卸的第二端壁(顶部)，其适于与容器接合以限定腔室，以及支架，其适于容纳用于细胞驻留的基板，其中第一端壁(底部)、侧壁或第二端壁(顶部)中的至少一个的至少一部分包括透气性材料或适于与透气性材料接合，并穿孔以允许气体交换；且其中该装置可在以下模式之间配置：(a)第一模式，其中，基板不与透气材料进行气体连通；以及(b)第二模式，其中，移动基板以使其与透气材料进行气体连通。

有利地，在两种模式之间移动基板的能力允许细胞在生长的初始阶段被浸没在培养基中，然后容易地与大气接触(例如接触透气膜)以适当地分化为全层皮肤。

在一个实施方案中，支架与至少一个侧壁接合以(a)允许支架在腔室的第一端壁(底部)和第二端壁(顶部)之间至少部分地进行基本线性的运动，并限制支架围绕垂直于至少一个侧壁的轴线的旋转或倒转，或(b)允许支架围绕垂直于至少一个侧壁的轴线的旋转运动。

在一个实施方案中，支架包括限定内部周界和外部周界的框架，所述框架包括：基本平坦的上表面；用于细胞驻留的基板，其以基本平坦的布置保持在框架的内部周界上，其中当将支架放置在包括至少一个透气界面的培养装置中时，支架被配置为使基本上所有的基板或基板上存在的细胞或组织与透气界面接触。

在一方面中，提供了通过本发明所述方法培养的人类全层皮肤，例如包括表皮和真皮两者。

在一方面中，提供了通过本发明所述的方法培养的完整人类表皮。

在一方面中，提供了通过本发明所述的方法培养的人类全层皮肤，全人表皮或全人真皮，其用于治疗，特别是提供了包含表皮的全人皮肤产品。

在一个实施方案中，所述治疗针对选自以下的病症或疾病：组织损伤；神经和细胞器的皮肤再生；伤口愈合，例如促进/增强伤口愈合，包括溃疡，例如糖尿病性溃疡；烧伤愈合；皮肤再生和修复；大疱性表皮松解症；提高皮肤质量或外观；预防或修复皮肤疾病；疤痕组织的减少或消失；乳房皮肤再生(手术后)；化妆品应用，例如抗衰老；用于皱纹和其他皮肤缺陷的真皮再生；促进毛囊生长，神经和其他细胞器再生；愈合而不会留下疤痕，或再愈合以减少疤痕。

一方面，提供了通过本发明所述方法培养的人全层皮肤、全人表皮或完全人真皮在制备用于例如本发明上文所公开的病症或疾病的药物中的用途。

一方面，提供了一种治疗方法，该方法包括将通过本发明所述的方法培养的人全层皮肤、全人表皮或全人真皮缝合到对其有需要的患者。

在一个实施方案中，所述治疗是针对病症或疾病，例如本发明其他各处所公开的。

发明详述

“DMEM”或“Dulbecco的改良版Eagle培养基”是基础培养基Eagle的改良形式，它含有四倍浓度的氨基酸和维生素以及其他成分。具体成分列于本发明的发明背景部分。DMEM通常包含约1000mg/L的葡萄糖。“DMEM高葡萄糖”是指DMEM的一种形式，其中包含4500mg/L的葡萄糖，而不是通常的1000mg/L。

“Ham’s F12”是为低密度、无血清的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞生长而设计的培养基。Ham’s F12是以Ham’s F10培养基为基础，但具有浓度增加的胆碱、肌醇、腐胺和其他氨基酸。具体成分列于本发明的发明背景部分。

细胞培养基中DMEM：Ham’s F12的比例可以是1：1、2：1、3：1、4：1、5：1。在一个实施方案中，该比率是3∶1。

本发明使用的Green培养基为比例为3：1的DMEM：Ham’s F12(Life Technologies31765-035)。胎牛血清(FCS)通常被用作血清，尽管NCS和血清替代产品也适用，而例如Hepes缓冲液被用作缓冲液。细胞培养基、缓冲液和血清的溶液的pH值通常在6.0至8.0的范围内，例如在6.5至7.5的范围内，更特别地在7.0的范围内。

“胎牛血清”或FBS是用于真核细胞培养的最广泛使用的动物血清补充剂。这是由于其抗体水平非常低，并且存在生长因子，这使得FBS适合于许多不同的细胞培养应用。目前要求保护的培养基包含胎牛血清，但是技术人员会意识到，也可以使用其他类型的血清，例如牛血清白蛋白(BSA)、人血小板裂解物和铁补充的小牛血清(ICS)。通常使用10％的血清，但也可以根据血清类型使用其他浓度，例如0.1％至20％，如0.5％、1％、1.5％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％和20％。

如本发明所用，“青霉素”是指一组β-内酰胺抗生素，包括青霉素G、青霉素V、普鲁卡因青霉素和苄星青霉素。青霉素通过抑制细菌细胞壁中肽聚糖交联的形成而起作用。这削弱了分裂细菌的细胞壁，最终由于渗透压使细胞壁破裂，细菌死亡。革兰氏阳性细菌的细胞壁较厚，含有高水平的肽聚糖，而革兰氏阴性细菌的特征是细胞壁较薄，肽聚糖含量较低。因此，青霉素对革兰氏阳性细菌最有效。

“链霉素”是最初从灰链霉菌纯化的抗生素。它通过与细菌核糖体的30S亚基结合而起作用，从而导致蛋白质合成的抑制和易感细菌的死亡。链霉素能够通过水通道被动扩散而穿过阴性生物的外细胞壁。相反，革兰氏阳性细菌的较厚细胞壁抑制链霉素的运输。因此，链霉素在革兰氏阴性细菌上效果更好。

在一个实施方案中，细胞培养基同时包含青霉素和链霉素，从而帮助保护培养物中生长的细胞免受革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的侵害。

“庆大霉素”是一种抗生素，其包含三种不同的紧密相关的氨基糖苷硫酸盐庆大霉素C₁、C2和C1a的复合物，该复合物得自绛红小单孢菌和相关物种。庆大霉素是一种广谱抗生素，通常用于以下微生物的严重感染：铜绿假单胞菌、变形杆菌种(吲哚阳性和吲哚阴性)、大肠杆菌、克雷伯菌-肠杆菌-沙雷氏菌种、柠檬酸杆菌种和葡萄球菌种(凝固酶阳性和凝固酶阴性)。

在一个实施方案中，细胞培养基包含庆大霉素。

在一个实施方案中，该培养基不含一种或多种与过敏反应有关的抗生素，例如青霉素和/或链霉素。

“两性霉素B”是用于严重真菌感染和利什曼病(leishmaniasis)的抗真菌药物。它通过与麦角固醇(真菌细胞膜的一种成分)结合而起作用，形成小孔，这些孔会导致单价离子(例如K⁺，Na⁺，H⁺和Cl^-)快速泄漏，从而导致真菌细胞死亡。

在一个实施方案中，细胞培养基包含靶向革兰氏阳性细菌的抗生素(例如青霉素)、靶向革兰氏阴性细菌的抗生素(例如链霉素)和抗真菌药物。

“角质形成细胞生长因子”或KGF是在伤口愈合的上皮化阶段中存在的生长因子。KGF由FGF7基因在人类中编码。KGF是与成纤维细胞生长因子受体2b(FGFR2b)结合的小信号分子。有23种已知的FGF和4种FGF受体。已知KGF是有效的上皮细胞特异性生长因子，其促有丝分裂活性主要在角质形成细胞中表现出来，而在成纤维细胞或内皮细胞中没有表现。

如本发明所用，“ROCK抑制剂”是指具有减少或阻断Rho相关蛋白激酶(ROCK)的活性的功能的任何化合物或蛋白质，例如小分子ROCK抑制剂或抗体。

ROCK抑制剂的实例包括但不限于：SB 772077B、Y-27632、法舒地尔、Ripasudil、Y39983、Wf-536、SLx-2119、氮杂苯并咪唑-氨基呋咱、DE-104、H-1152、ROKα抑制剂、XD-4000、HMN-1152、4-(1-氨基烷基)-N-(4-吡啶基)环己烷-羧酰胺、rhostatin、BA-210、BA-207、BA-215、BA-285、BA-1037、Ki-23095、VAS-012、RKI-1447、GSK429286A、Y-30141、HA-100、H-7、iso H-7、H-89、HA-1004、HA-1077、H-8、H-9、KN-62、GSK269962和喹唑啉。

技术人员还知晓其他ROCK抑制剂。

术语“上皮细胞”和“上皮”是指覆盖内部和外部身体表面(皮肤，粘液和浆液)的细胞，包括腺体和衍生自其的其他结构，例如角膜、食道、喉、表皮、毛囊和尿道上皮细胞。

在一个实施方案中，采用的细胞是皮肤细胞，例如人皮肤细胞，例如形成表皮和真皮的细胞，例如成纤维细胞和角质形成细胞。

其他示例性上皮组织包括：嗅上皮，其是位于鼻腔的嗅觉区域内的假复层上皮，并且包含用于嗅觉的受体；腺上皮，是指由分泌细胞组成的上皮；鳞状上皮，指由扁平的板状细胞组成的上皮。

术语“组织”用于指在特定功能的执行中联合的相似特化细胞的聚集。组织旨在涵盖所有类型的生物组织，包括硬组织和软组织。“组织”是嵌入其天然基质中的特定细胞的集合或聚集，其中天然基质由特定活细胞产生。该术语还可以指在体外例如在人造器官中扩增的相似特化细胞的离体聚集。

如本发明所用，术语“皮肤组织”或“皮肤”是指任何组织，包括表皮，真皮，并且还可以包括基底膜组织，例如全层皮肤。

根据本发明的方法能够产生全层人类皮肤，该皮肤由两个组织特异性层组成，即真皮等同物和表皮等同物。所述皮肤组织在组织学和功能上基本上对应于天然皮肤。

如本发明所用，“表皮”是指构成皮肤的两层的外层，内层是“真皮”。

如本发明所用，“完全人类”是指不包含且未制备任何非人类细胞的组织，例如异种饲养细胞，例如小鼠胚胎成纤维细胞。根据本发明的细胞和组织不包含任何非人类组分，因为它们是完全来自人类的。但是，用于培养细胞的培养基可以包含例如胎牛血清。该血清不会使本发明的细胞和组织成为非人类的。

如本发明所用，“成纤维细胞”应理解为天然存在的成纤维细胞或其前体细胞，例如脂肪来源的基质细胞，更特别地，存在于真皮中的成纤维细胞，遗传修饰的成纤维细胞或由自发突变或其前体产生的成纤维细胞。

如本发明所用，“角质形成细胞”应理解为形成角化板上皮的表皮细胞、遗传修饰的角质形成细胞或由自发突变或其前体产生的角质形成细胞，所述角质形成细胞可以是动物或人类来源的。或者，对于正常的皮肤角质形成细胞，可以将粘膜角质形成细胞或肠上皮细胞应用于基质。这些是例如预培养的细胞，并且在一个实施方案中，是第一或第二细胞传代中的角质形成细胞，尽管也可以使用来自更高传代的细胞。

通过本领域技术人员已知的方法获得和培养成纤维细胞和角质形成细胞，所述方法可以适合于待生产的皮肤组织的所需特性。

在一个实施方案中，其他细胞类型和/或其他组织类型的其他细胞，例如黑素细胞、巨噬细胞、单核细胞、白细胞、浆细胞、神经元细胞、脂肪细胞、朗格汉斯细胞的诱导和非诱导前体细胞、朗格汉斯细胞和其他免疫细胞、内皮细胞、尤其是皮脂腺细胞或皮脂腺组织或皮脂腺外植体、汗腺细胞或汗腺组织或汗腺外植体、毛囊细胞或毛囊外植体；以及来自其他器官的肿瘤或转移瘤的细胞，可以与人角质形成细胞一起培养。提及的细胞可以是人和动物来源的，但是除非另外提及，否则将是人的，以便产生全人表皮。各种来源的干细胞、组织特异性干细胞、胚胎和/或成年干细胞也可以整合到皮肤模型中。

本发明使用的“胰蛋白酶”(EC号3.4.21.4)是来自PA氏族超家族的丝氨酸蛋白酶，存在于消化系统中，例如在许多脊椎动物的胰腺中，胰蛋白酶在其中水解蛋白质。胰蛋白酶主要在赖氨酸或精氨酸氨基酸的羧基侧切割肽链。如果酸性残基在切割位点的任一侧，则水解速率较慢；如果脯氨酸残基在切割位点的羧基侧，则不发生切割。如当前公开的方法中所使用的，胰蛋白酶能够消化皮肤样品的表皮和真皮层。

如本发明所用，“胶原蛋白酶”是指分解将动物组织保持在一起的天然胶原蛋白的一组酶。胶原蛋白酶是由多种不同的微生物和许多不同的动物细胞制成。粗制胶原蛋白酶制剂包含两种不同胶原蛋白酶的几种同工型，分别为巯基蛋白酶、梭菌蛋白酶、类胰蛋白酶和氨基肽酶。胶原蛋白水解和蛋白水解活性的这种结合有效地分解了细胞间基质，这是组织离解的重要部分。该复合物的一个成分是水解酶，该酶优选在Pro-Y-Gly-Pro序列中的Y-Gly键处降解天然胶原蛋白中的螺旋区，其中Y最常见为中性氨基酸。这种切割产生易于进一步肽酶消化的产物。粗制胶原蛋白酶受金属螯合剂(例如半胱氨酸，EDTA或邻菲咯啉)抑制，但不受DFP抑制。它也被大血浆糖蛋白α2-巨球蛋白抑制。Ca²⁺是酶活性所必需的。根据需求，通常使用4种主要类型的胶原蛋白酶：

·1型粗制胶原蛋白酶具有胶原蛋白酶、酪蛋白酶、梭菌蛋白酶和胰蛋白酶活性的原始平衡。

·2型包含较高的相对水平的蛋白酶活性，尤其是梭菌蛋白酶。

·3型包含最低水平的二级蛋白酶。

·4型被设计为胰蛋白酶的活性特别低，以限制对膜蛋白和受体的破坏。

在一个实施方案中，在本发明的方法中使用1型胶原蛋白酶。

如本发明所用，“饲养细胞”是指细胞群，通常是结缔组织细胞，其用于营养被培养的组织细胞，特别是如本发明所述的人角质形成细胞。饲养细胞向它们支持的细胞提供代谢产物和其他营养物质。饲养细胞通常不生长或分裂，并且通常通过辐照例如γ辐照而失活。然而，在本发明中，饲养细胞未被辐照。

在一个实施方案中，人成纤维细胞作用为饲养细胞以支持人角质形成细胞的生长。在一个实施方案中，不辐照人成纤维细胞。这意味着人类成纤维细胞没有被灭活，并且能够与培养物中的人类角质形成细胞一起继续生长。这是可能的，因为ROCK抑制剂的存在可使角质形成细胞以避免被成纤维细胞生长超过的速率生长。

在一个实施方案中，人成纤维细胞与人角质形成细胞匹配。例如，成纤维细胞可以与角质形成细胞性别匹配和/或HLA匹配。

在另一个实施方案中，人成纤维细胞和人角质形成细胞都可以源自相同的供体。备选地，待培养的人角质形成细胞和/或人成纤维细胞是自体的，其源于打算使用全人表皮的患者。如上所述，自体/异体在技术上与执行实际的工艺步骤无关，但是与对患者的施用有关。

在一个实施方案中，皮肤细胞在基质上的接种是在生理溶液的存在下进行的。

如本发明所用，术语“生理溶液”是指与一种或多种生理条件相似或相同或可以改变一些生理环境的生理状态的溶液。如本发明所用，术语“生理溶液”还指能够支持细胞(包括但不限于哺乳动物、脊椎动物和/或其他细胞)生长的溶液。

在一个实施方案中，生理溶液包括确定的培养基，其中每种培养基组分的浓度是已知的和/或受控的。限定的培养基通常包含支持细胞生长所需的所有营养素，包括但不限于盐、氨基酸、维生素、脂质、微量元素和能量源(例如碳水化合物)。限定的培养基的非限制性示例包括DMEM、Basal Media Eagle(BME)、培养基199；F-12(Ham)营养混合物；F-IO(Ham)营养混合物；基本基础培养基(MEM)、培养基E(Williams'Media E)和RPMI 1640。

在一个实施方案中，生理溶液是本发明公开的细胞培养基。

在一个实施方案中，培养基可以包含其他因子，例如激素、生长因子、粘附蛋白、抗生素、选择因子、酶和酶抑制剂等。例如生长因子可以帮助增强接种细胞的增殖。

本发明所用的抗体是指全长抗体，其结合片段或包含它们中的任一种的抗体分子。抗体结合片段的实例包括Fab、修饰的Fab、Fab’、修饰的Fab’、F(ab’)2、Fv、Fab-Fv、Fab-dsFv、单域抗体(例如VH或VL或VHH)、scFv、二价、三价或四价抗体、Bis-scFv、双抗体、三抗体、四抗体和以上任何一个的表位结合片段(实例参见Holliger和Hudson,2005,NatureBiotech.23(9):1126-1136；Adair和Lawson,2005,Drug Design Reviews-Online 2(3),209-217)。

本发明所用的肽是2至50个氨基酸的序列。

本发明所用的合成肽是指通过合成化学技术制备的肽(与重组表达的肽相反)。

如本发明中所使用的，基本上平面的是指具有基本上(其主要部分)位于一个平面中的表面。

本发明的基板/基质

除非上下文另外指出，否则术语“基质”、“细胞基质”、“细胞的基质”、“基板”或“细胞基板”在本发明可互换使用。它是指任何物理结构，包括但不限于固体或半固体结构，例如带有孔的纤维网状结构，可提供：

对细胞或组织的粘附和增殖的机械或其他支持，以及

允许在培养过程中迁移至少一种细胞类型。

例如用于离体皮肤组织培养。

如本发明所用，与气体可渗透层/膜接触是指相关细胞在膜/层上或在膜/层附近，使得可以发生细胞的生长和/或特别是分化。因此，接近通常将意味着没有任何东西将透气层/膜和相关细胞分开(它们之间的空间将被例如培养基、缓冲液或CO₂填充，特别是被细胞培养基填充)。在一个实施方案中，相关细胞到透气层的距离为2cm或更小，例如1cm或更小，特别是0.5、0.4、0.3、0.2、0.1或0.05cm。在一个实施方案中，用于分化的细胞的外部被搁置在透气层/膜上。

通常，基质将是三维的，具有可在其上沉积细胞的第一2D面和第二面2D(具有较大的表面积)，并且两个面之间的深度给出了第三维(对应于最终的皮肤的横截面–如上所述，大约在100μm的范围内)。

本发明的基质可以由天然或合成材料构造。基质可以是特定的形状或形式，以影响或界定一组增殖细胞所假定的三维形状或形式。此类形状或形式包括但不限于薄膜(例如，其中两个维度显著大于第三维度的形式)、带状、绳状、薄片、平盘、圆柱体、球体、三维无定形形状等。

在一个实施方案中，基质仅包含合成材料。在另一个实施方案中，基质包含合成和天然材料的混合物。

在一个实施方案中，用于制备本发明的基质的合成材料是生物相容的和可生物降解的(例如，经过酶和水解降解)，例如可生物降解的聚合物。

如本发明所用，“生物相容性”是指当植入哺乳动物中时不会在哺乳动物中引起不良反应的任何材料。当将生物相容性材料引入个体时，对该个体无毒或无害，也不会在哺乳动物中诱导对该材料的免疫排斥。

如本发明所用，术语“可生物降解的”或“可生物吸收的”旨在描述在生物环境中存在有限时间并在生理条件下降解以形成可被代谢或排泄而不会损害受试者的产物的材料。在一些实施方案中，产物被代谢或排泄而对受试者没有永久性损害。

在一个实施方案中，所述基质可被受试者的身体完全吸收。

在一个实施方案中，当置于生物环境中时，本发明的生物可吸收基质可以存在数天、数周或数月。例如，当置于生物环境中时，生物可吸收基质可存在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180天或更长。

在一个实施方案中，所述基质层以与所述区域中位于所述膜基质层下面的组织细胞的生长大约相同的速率被所述受试者的身体吸收。在一些实施方案中，细胞是上皮细胞。在一些实施方案中，在施用皮肤移植物后约3至12个月内所述基质层基本完全被所述主体吸收。在一些实施方案中，所述基质在约3个月内基本完全被吸收。

可生物降解的材料(例如聚合物)是可水解降解的，可需要细胞和/或酶促作用以完全降解、例如水解、氧化、酶促过程、吞噬作用或其他过程，包括上述各项的组合。

可生物降解的聚合物是本领域普通技术人员已知的，包括但不限于合成聚合物、天然聚合物、合成和天然聚合物的混合物、无机材料等。

在一个实施方案中，基质在其构造中掺入一种或多种合成聚合物。该基质可以由杂聚物，单聚物或其组合制成。适用于制造细胞基质的聚合物的实例包括但不限于脂肪族聚酯、共聚(醚酯)、聚亚烷基草酸酯、聚酰胺、聚(亚氨基碳酸酯)、聚原酸酯、聚氧杂酯(polyoxaester)、聚酰胺基酯、含胺基的聚氧杂酯、聚(酸酐)、聚磷腈、生物分子及其混合物。合适的脂肪族聚酯包括具有线性、支化或星形结构的均聚物、共聚物(无规、嵌段、分段、锥形嵌段、接枝、三嵌段等)。用于制备脂族均聚物和共聚物的合适单体可以选自但不限于以下组成的组：乳酸、丙交酯(包括L-、D-、内消旋和D、L混合物)、乙醇酸、乙交酯、ε-己内酯、对二噁烷酮(1,4-二噁烷-2-酮)、碳酸三亚甲基酯(1,4-二噁烷-2-酮)、δ-戊内酯、β-丁内酯、ε-癸内酯、2,5-二酮吗啉新戊内酯、α,α-二乙基丙内酯、碳酸亚乙酯、草酸亚乙酯、3-甲基-1,4-二噁烷-2,5-二酮、3,3-二乙基-1,4-二噁烷-2,5-二酮、γ-丁内酯、1,4-二氧环庚-2-酮、1,5-二氧环庚-2-酮、6,6-二甲基二氧环庚-2-酮、6,8-二氧杂双环辛烷-7-酮及其组合。6,8-二氧杂双环辛-7-酮及其组合。在一个实施方案中，所述合成聚合物选自PLGA、PLA、PCL、PHBV、PDO、PGA、PLCL、PLLA-DLA、PEUU、醋酸纤维素、PEG-b-PLA、EVOH、PVA、PEO、PVP、混合PLA/PCL、PDLA/HA、PLLA/HA、PLLA/MWNT/HA、PLGA/HA、100二噁烷酮线性均聚物和其两种或多种的组合。

弹性体共聚物在当前公开的基质中也特别有用。合适的生物可吸收的生物相容性弹性体包括但不限于选自以下的弹性体：ε-己内酯和乙交酯的弹性体共聚物(ε-己内酯与乙交酯的合适的摩尔比为约35:65至约65:35，例如为45:55至35:65)；ε-己内酯和丙交酯的弹性体共聚物，包括L-丙交酯，D-丙交酯、其混合物或乳酸的共聚物(ε-己内酯与丙交酯的摩尔比合适地为约35:65至约65:35，并且例如为45:55至30:70或约95：5至约85:15)；对-二噁烷酮(1,4-二噁烷-2-酮)和丙交酯(包括L-丙交酯，D-丙交酯和乳酸)的弹性共聚物(对-二噁烷酮与丙交酯的摩尔比优选为约40:60至约60:40)；ε-己内酯和对二噁烷酮的弹性体共聚物(ε-己内酯与对二噁烷酮的合适的摩尔比为约30:70至约70:30)；对二噁烷酮与碳酸三亚甲基酯的弹性体共聚物(对二噁烷酮与碳酸三亚甲基酯的合适的摩尔比为约30:70至约70:30)；碳酸三亚甲基酯和乙交酯的弹性体共聚物(适当地，碳酸三亚甲基酯与乙交酯的摩尔比为约30:70至约70:30)；碳酸三亚甲基酯和丙交酯的弹性体共聚物，包括L-丙交酯、D-丙交酯、其共混物或乳酸的共聚物(适当地，碳酸三亚甲基酯与丙交酯的摩尔比为约30:70至约70:30)；和其共混物。合适的生物可吸收弹性体的实例描述于US4,045,418；US4,057,537和US5,468,253，所有这些以引用方式并入本发明。这些弹性体聚合物的特性粘度为约1.2dL/g至约4dL/g，优选的特性粘度为约1.2dL/g至约2dL/g和，例如在25℃在0.1克每分升(g/dL)的聚合物在六氟异丙醇(HFIP)中的溶液中测定的特性粘度为约1.4dL/g至约2dL/g。

适合用作本发明的基质的其他材料包括但不限于，聚乳酸-乙醇酸(PLGA)、聚原酸酯、聚酸酐、聚磷腈及其组合。不可生物降解的聚合物包括聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、乙烯醋酸乙烯酯、聚乙烯醇、聚丙交酯、硫酸软骨素(一种蛋白聚糖成分)、聚酯、聚乙二醇、聚碳酸酯、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、聚酰胺、聚丙烯酸酯、聚酯、聚醚酯、聚甲基丙烯酸酯、聚氨酯、聚己内酯、聚磷腈、聚原酸酯、聚乙交酯、赖氨酸和乳酸的共聚物、赖氨酸-RGD和乳酸的共聚物等，以及它们的共聚物。合成聚合物可进一步包括选自以下的那些：脂肪族聚酯、聚氨基酸、聚富马酸丙二醇酯、共聚醚酯、聚亚烷基草酸酯、聚酰胺、酪氨酸衍生的聚碳酸酯、聚亚氨基碳酸酯、聚原酸酯、聚氧杂酯、聚酰胺酯、含胺基的聚氧杂酯、聚酸酐)、聚磷腈及其共混物。

在一个实施方案中，基质掺入了聚乳酸(PLA)。由于PLA在人体内降解形成乳酸(一种天然存在的化学物质，很容易从体内清除)，因此PLA特别适合使用细胞基质的组织工程化方法。本发明的细胞基质还可掺入聚乙醇酸(PGA)和/或聚己内酯(PCL)作为基质材料。PGA和PCL具有与PLA相似的降解途径，但PGA在体内的降解速度要比PLA快，而PCL的降解速率比PLA慢。

PGA已被广泛用于组织工程化。PGA基质可以容易地制备为各种三维结构，并为细胞提供了出色的支撑和运输方式(Christenson L,Mikos A G,Gibbons D F,等人:Biomaterials for tissue engineering:summary.Tissue Eng.3(1):71-73；discussion73-76,1997)。单独由聚乙醇酸制成以及由PGA与其他天然和/或合成的生物相容性材料的组合制成的基质在本发明的范围内。

在一个实施方案中，基质包含聚(乳酸-乙醇酸共聚物)(PLGA)，例如PLGA微纤维或纳米纤维。

在另一实施方案中，所述基质包含二噁烷酮线性均聚物，如100二噁烷酮线性均聚物(例如Dioxaprene 100M)。

在一个实施方案中，基质包含PLGA和100二噁烷酮的组合。

本发明使用的术语“纤维”是指呈连续长丝或离散的细长形式的材料，其通常包括诸如上述那些可生物降解的聚合物或由诸如上述那些可生物降解的聚合物组成。本发明的纤维通常具有在微米范围内的直径，如，0.5μm至5μm，例如1μm、1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm或5μm，特别地，1至3μm。

本发明使用的术语“纤维基质”是指将纤维布置成支撑框架，例如以一片纤维的形式，然后可用于支撑细胞或其他附加材料(另请参见“基质”的定义)。技术人员已知可以用于生产合适的纤维的各种方法，包括但不限于界面聚合和电纺丝。

在一个实施方案中，使用电纺丝形成本发明的基质。

术语“电纺丝”通常是指利用高压电源、喷丝板(例如，皮下注射针)和导电集电板(例如，铝箔或不锈钢)的技术。为了使用这些材料执行电纺丝工艺，通常首先将电纺丝液(即用于形成纤维的所需材料的熔体或溶液)装入注射器中，然后以注射泵按特定速率进料。

当通过注射泵以足够高的电压给液体进料时，固定在所得液滴表面上的电荷之间的排斥力克服了表面张力的限制，并促使液体从孔口中喷出。然后，带电的射流经历搅打和拉伸过程，随后导致形成均匀的纳米纤维。此外，随着射流的拉伸和溶剂的蒸发，然后可以将纤维的直径连续减小至所需的尺度，例如微米，甚至小至纳米，并且在电场的影响下，纤维随后可被迫朝着接地的收集器行进，通常将它们作为非织造垫子沉积在该收集器上。在本发明的上下文中，由于表面积与体积的高比率和一维形态，电纺纤维可以模拟细胞外基质的结构。

用于生产本发明的纳米纤维的材料的实例选自下表1和2中列出的那些。

表1-用于生产电纺纤维(天然聚合物)的示例性材料。

在一个实施方案中，本发明的基质由合成的微纤维或纳米纤维组成，例如使用表2中列出的材料。

特定聚合物的选择及其在指定量或浓度或其范围内的使用，提供了控制、定制和调整聚合物降解速率以及因此的基质降解速率的能力。这是有用的，因为希望基质保留为皮肤移植物的一部分，以便为生长的皮肤组织提供结构支撑，但是一旦患者自己的细胞吸收了皮肤移植物，基质最终会降解并被患者身体生物吸收，从而消除了以后从患者体内回收基质的要求。

可以使用各种聚合物共混物，例如通过使用表1和2中列出的材料进行电纺丝制成纤维，以改善纤维的生物相容性以及其机械、物理和化学性质。

一旦产生了所需的微纤维或纳米纤维基质，在一个实施方案中，将本发明的两个或更多个纤维基质层铺在一起。通过对多个纤维基质进行层铺，可以将每个纤维基质的优点结合起来，并且在一些情况下会产生协同效应。

例如，第一基质可以包括用于接收一种或多种相关细胞和/或皮肤组织的微孔，然后将其层铺在具有径向排列的纤维的第二基质上。在该实例中，所述第一基质可通过提供相关的细胞和/或皮肤组织而提供增加受损皮肤修复的益处，而第二基质可提供指导和增强细胞从层铺的基质的外围向中心迁移的益处。将两个或多个基质层铺也可以帮助增强基质的水密性。本领域技术人员能够推导两个或更多个不同基质的各种组合以实现期望的特性。

在一个实施方案中，本发明的基质可以通过单一方法或方法的组合进一步处理，这些方法或方法的组合减少了在基质的储存和/或分布条件下能够在基质中生长的微生物数量。

在一个实施方案中，使用伽马射线对基质进行灭菌。在另一个实施方案中，使用环氧乙烷(EtO)对基质进行灭菌。在另一个实施方案中，使用Revox，其利用过乙酸对基质进行灭菌。

在一个实施方案中，使用电离辐射例如电子束辐射对基质进行灭菌。在目前公认的任何灭菌方法中，电子束处理的处理周期最短。在电子束辐照下，产品会暴露在辐射下几秒钟，而将产品运入和运出辐射屏蔽层会消耗大量的处理时间。整个过程时间(包括运输时间)为5至7分钟。电子束处理涉及使用高能电子，该高能电子通常具有300万至1000万电子伏特(MeV)的能量，以辐射一次性医疗产品。电子由以脉冲和连续束模式工作的加速器产生。需要这些高能量水平来穿透例如包装在其最终运输容器中的产品。当光束扫描通过产品时，电子与材料相互作用并产生次级高能物质，例如电子、离子对和自由基。这些次级高能物质使微生物灭活，因为它们破坏了微生物的DNA链，从而使产品变得无菌。技术人员知道用于对本发明的基质进行灭菌的其他可能方法。

细胞基质的接种密度可以变化，并且细胞基质的各个层可以具有相同或不同的接种密度。接种密度可以根据细胞基质所适用的特定应用而变化。接种密度也可根据用于制造细胞基质的细胞类型而变化。

可以通过改变悬浮液中细胞的浓度，或通过改变分散在基质给定面积或体积上的悬浮液的数量，来改变接种到基质中或基质上的细胞的数量和浓度。

在一个实施方案中，接种密度为约150,000角质形成细胞/cm²或更高，如200,000、250,000、300,000、350,000、400,000、450,000、500,000、550,000或600,000角质形成细胞/cm²。

在一个实施方案中，接种密度为约50,000成纤维细胞/cm²或更高，如60,000、70,000、80,000、90,000、100,000、110,000、120,000、130,000、140,000、150,000、160,000、170,000、180,000、190,000或200,000成纤维细胞/cm²。

基质各层的接种密度将取决于基质的用途。尽管本领域技术人员可以理解特定应用将需要的特定接种密度，但是可以多种接种密度来接种基质的各个层。本领域的技术人员将理解，基质的各个层的接种密度可以根据基质的用途而变化。散播涉及使用诸如刮铲的工具将接种物散布在海绵状基质上。通过喷涂接种基质是通过将刷子浸入接种物中，将其抽出，然后将充满接种物的刷子在基质上擦拭完成的。该方法具有以下缺点：大量的单元格可能附在刷子上，而不会被涂覆于网格。然而，它仍然可以是有用的，特别是在需要仔细控制接种物分布的格子的图案或区域的情况下。通过喷雾接种基质通常涉及使接种物通过任何类型的喷嘴，这些喷嘴会将液体转变成小的空气悬浮液滴。该实施方案受到两个约束。首先，它不得使溶液中的细胞受到剪切力或压力，这会破坏或杀死大量细胞。其次，不应该要求细胞悬浮液与对细胞或伤口床有毒或有害的推进剂流体混合。普遍可用的多种喷嘴满足这两个约束。这样的喷嘴可以以任何常规方式连接到包含上皮干细胞接种物的贮存器。

通过移液对基质进行接种是使用移液管、普通的“滴管”或其他能够将少量接种物置于本发明的基质表面上的类似装置来完成的。水性液体将渗透通过多孔基质。悬浮液中的细胞趋向于陷入在基质表面上，并因此保留在基质表面上。

根据本发明的另一个实施方案，可通过装备有空心针或其他导管的皮下注射器接种细胞接种物。将细胞悬浮液注入注射器的针筒中，并将针头插入基质。按下注射器的柱塞可将一定量的溶液通过针头从圆柱体中喷出，并进入支架。

利用细胞的水悬浮液的一个重要优点是，它可以用于大大扩展有效接种物分布在其上的基质面积。这提供了两个明显的优点。首先，如果非常有限数量的完整组织可用于自体移植，则可以使用各种悬浮方法来显著增加可被接种有限数量的可用细胞的基质的面积或体积。其次，如果需要在给定面积或体积的基质上接种细胞，则可以大大减少需要从供体部位收获的完整组织的数量。具体应用的最佳接种密度可通过本领域技术人员经由常规实验确定。

通常，基质的尺寸应基本上是平面的，并且其厚度应能使接种的细胞充分进入营养培养基。植入后，细胞基质必须有足够的体液接触以去除营养和废物。基质的厚度可随基质孔隙率的变化而变化。因此，基质孔隙率的增加可使基质具有更大的厚度，而更大的孔径改善l对外部介质和体液的接触。

因此，在一个实施方案中，基质的厚度为100μm或更小，例如100、90、80、70、60、50、40、30、20、10或5μm。通过将基质的厚度保持在100μm或更小，可以使接种的角质形成细胞仅通过扩散就可以接受营养并清除废物，而无需脉管系统即可存活。

接种层铺的基质涉及将一个或多个所需细胞群引入所选的基板材料，例如，随后将材料结合以形成层状基质。可替代地，可以预先连接基质，并且将所选择的细胞群引入到所选择的位置。接种不同于细胞从例如放置基质的伤口部位到基质中的自发渗透和迁移。

在一个实施方案中，在各个细胞接种表面彼此相对以形成分层结构之前，将基质接种在至少一个表面上。

各种另外的材料和/或生物分子可以附着到本发明的基质上。术语“附着”包括但不限于以任何方式涂覆、嵌入或掺入额外的材料和/或生物分子，并且附着可以指将这样的组分掺入整个基质或其仅一部分上。

在一个实施方案中，将细胞因子涂覆/附着于本发明的基质。如本发明所用，术语“细胞因子”是指由活细胞(例如干细胞)合成并在身体(例如哺乳动物或人体)中产生有益作用的物质。细胞因子包括但绝不限于生长因子、调节因子、激素、酶、淋巴因子、肽及其组合。细胞因子可具有多种作用，包括但不限于在体内和/或体外影响细胞(例如干细胞)的生长、增殖、定型和/或分化。

细胞因子的一些非限制性实例包括但不限于，细胞因子(例如共同的β链、共同的γ链和IL-6细胞因子家族)、血管内皮生长因子(例如VEGF-A、-B、-C、-D和-E)、肾上腺髓质素、胰岛素样生长因子、表皮生长因子EGF、成纤维细胞生长因子FGF、自分泌运动因子、GDF、IGF、PDGF、生长分化因子9、促红细胞生成素、激活素、TGF-α、TGF-β、骨形态发生蛋白(BMP)、刺猬分子(Hedgehog molecule)、Wnt-相关分子及其组合。

在一个实施方案中，生长因子例如EGF(表皮生长因子)、IGF-I(胰岛素样生长因子)、成纤维细胞生长因子家族的成员(FGF)、角质形成细胞生长因子(KGF)、PDGF(血小板衍生生长因子AA、AB、BB)、TGF-β(转化生长因子家族-βl、β2、β3)、CIF(软骨诱导因子)、BMP 1-14中的至少一种(骨形态发生蛋白)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)或其组合，生长因子可以促进组织再生，其可以附着或涂覆到本发明的基质上。

在一个实施方案中，生长因子是VEGF。在另一个实施方案中，生长因子是PDGF。本领域技术人员知道可以附着或用于涂覆目前公开的主题的基质的各种其他材料和生物分子，并且可以基于它们将要应用到的组织来针对特定应用进行选择。

在一个实施方案中，诸如纤连蛋白、层粘连蛋白和/或胶原蛋白的细胞外基质蛋白被进一步附着或涂覆在基质上。因此，在一个实施方案中，用胶原蛋白IV、胶原蛋白I、层粘连蛋白和纤连蛋白或其组合涂覆基质。本发明人已经发现这些蛋白质有助于提供次级细胞信号，其与在气液界面处(例如在透气膜上)的生长相结合，引起使用该基质生长的皮肤细胞的适当分层。

在一个实施方案中，使用胶原蛋白IV。胶原蛋白IV被证明在产生适当的表皮分层方面特别有效。

细胞外基质蛋白可以是全长蛋白或其肽，例如合成肽的形式。

在另一个实施方案中，治疗剂被进一步附着于基质。本发明所用的术语“治疗剂”是指与本发明的方法、基质和/或皮肤组织结合使用时表现出一种或多种有益治疗作用的多种试剂中的任何一种。可以使用的治疗剂的实例包括但不限于蛋白质、肽、药物、细胞因子、细胞外基质分子和/或生长因子。本领域技术人员将意识到可以根据本发明使用的其他合适和/或有利的治疗剂。

在一个实施方案中，治疗剂是抗炎剂或抗生素。可掺入基质中的抗炎剂的实例包括但不限于，甾体类抗炎剂，如倍他米松、曲安奈德、地塞米松、泼尼松、莫米松、氟替卡松、倍氯米松、氟尼缩松和布地奈德；和非甾体类抗炎剂，如芬诺洛芬、氟比洛芬、布洛芬、酮洛芬、萘普生、奥沙普嗪、双氯芬酸、依托度酸、吲哚美辛、酮咯酸、萘丁美酮、舒林酸托美汀甲氯芬那酸、甲灭酸、吡罗昔康和舒洛芬。

根据当前公开的主题，也可以使用各种抗生素。非限制性实例包括：氨基糖苷，如阿米卡星、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、奈替米星、巴龙霉素、链霉素或妥布霉素；碳青霉烯类，例如厄他培南、亚胺培南、美罗培南；氯霉素；氟喹诺酮类药物，例如环丙沙星、加替沙星、吉米沙星、格雷沙星、左氧氟沙星、洛美沙星、莫西沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、司帕沙星或曲伐沙星；糖肽，例如万古霉素；林可酰胺，例如克林霉素；大环内酯类/酮内酯类，例如阿奇霉素、克拉霉素、地红霉素、红霉素或泰利霉素；头孢菌素、如头孢羟氨苄、头孢唑啉、头孢氨苄、头孢噻吩、头孢匹林、头孢拉定、头孢克洛、头孢孟多、头孢尼西、头孢替坦、头孢西丁、头孢丙烯、头孢呋辛、氯碳头孢、头孢地尼、头孢托仑、头孢克肟、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢泊肟、头孢他啶、头孢布烯、头孢唑肟、头孢曲松或头孢吡肟；单环β-内酰胺类，例如氨曲南；硝基咪唑，如甲硝唑；噁唑烷酮，如利奈唑胺；青霉素，例如阿莫西林、阿莫西林/克拉维酸、氨苄青霉素、氨苄青霉素/舒巴坦、巴坎西林、羧苄青霉素、氯洒西林、双氯西林、甲氧西林、美洛西林、萘夫西林、苯唑西林、青霉素G、青霉素V、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、替卡西林或替卡西林/克拉维酸；链阳性菌素，例如奎奴普丁/达福普汀；磺酰胺/叶酸拮抗剂，如磺胺甲噁唑/甲氧苄氨嘧啶；四环素，例如地美环素，强力霉素、米诺环素或四环素；唑类抗真菌剂，例如克霉唑、氟康唑、伊曲康唑、酮康唑、咪康唑或伏立康唑；多烯抗真菌剂，例如两性霉素B或制霉菌素；棘球白素抗真菌剂，例如卡泊芬净或米卡芬净，或其他抗真菌剂，例如环吡酮、氟胞嘧啶、灰黄霉素或特比萘芬。

在一个实施方案中，各种镇痛药和/或麻醉剂被附着到本发明的基质或掺入到本发明的基质中。如本发明所用，术语“镇痛药”是指用于缓解疼痛的药物，并且在一些实施方案中，可以与术语“抗炎剂”互换使用，使得术语镇痛药可以包括本发明所述的示例性的抗炎剂。示例性镇痛药包括但不限于：扑热息痛和非甾体抗炎剂、COX-2抑制剂和鸦片制剂(例如吗啡)和吗啡模拟物。

如本发明所用，术语“麻醉剂”是指用于在受试者中引起可逆的感觉丧失并因此可用于减轻疼痛的药剂。可以根据当前公开的主题使用的示例性麻醉剂包括但不限于：局部麻醉药，例如普鲁卡因、地卡因、可卡因、利多卡因、丙胺卡因、布比卡因、左布比卡因、罗哌卡因、卡波卡因和地布卡因。

本发明的培养装置

可以使用适合于产生全人表皮的任何细胞培养装置来进行本发明的方法。WO2016/209089描述了这样的设备，其内容通过引用并入本发明。技术人员将意识到其他替代性培养装置。

本发明的全人表皮的用途

本发明提供了使用本发明所述方法制备的组织，如上皮、表皮、分层上皮、分层表皮和真皮、断层皮或全层皮的用途，例如使用本发明的基质用于治疗有此需要的受试者的组织损伤。

术语“受试者”在本发明中用于指人类和动物受试者，但通常旨在指需要治疗的人类患者。

如本发明所用，术语“治疗”包括但不限于抑制对组织的损害的进展，阻止对组织的损害的发展，降低对组织的损害的严重性，改善或减轻与组织损伤有关的症状，以及修复、再生和/或引起损伤组织的消退或与损伤组织有关的一种或多种症状的消退。

本发明提供了一种在有需要的受试者中治疗组织损伤的方法，该方法包括：

a)提供一种皮肤组织，如上皮、分层上皮、表皮、分层表皮、分层表皮和真皮、断层皮或全层皮，其已以例如本发明所述的方法生长，例如采用使用本发明所述方法产生的全人表皮的方法生长，

b)在无菌或灭菌条件下用基质恢复组织，以及

c)将组织应用于患者。

在各种实施方案中，所述组织损伤是伤口、慢性伤口、手术伤口、溃疡、无法愈合的伤口、疤痕、手术疤痕、烫伤或烧伤。在各种实施方案中，烧伤是一级烧伤、二级烧伤、三级烧伤、深层皮肤烧伤或全层烧伤。

在各种实施方式中，所述组织损伤是位于粘膜表面的上皮。在各种实施方案中，上皮位于皮肤、肺、胃肠道(例如，食道或口腔)、生殖道或泌尿道(例如，尿道)上或之中。

治疗的其他实例包括但不限于：神经和细胞器的皮肤再生；伤口愈合，例如促进/增强伤口愈合，包括溃疡，例如糖尿病性溃疡；烧伤愈合；皮肤再生和修复；大疱性表皮松解症；提高皮肤质量或外观；预防或修复皮肤疾病；疤痕组织的减少或消失；乳房皮肤再生(手术后)；化妆品应用，例如抗衰老；用于皱纹和其他皮肤缺陷的真皮再生；促进毛囊生长，神经和其他细胞器再生；愈合而不会留下疤痕，或再愈合以减少疤痕。

在一个实施方案中，本发明提供了可用于再生受损，丢失和/或退化的组织的基质，皮肤组织和方法。例如，可以使用本发明的基质，方法或皮肤组织来引发，增加，支持，促进和/或引导受损，丢失和/或退化的组织的再生，特别是受损皮肤的再生。

如本发明所用，“再生”是指引发、增加、调节、促进、支持和/或引导脆弱、受损、丢失和/或退化的组织的生长、再生长、修复、功能、图案化、连通性、加固、活力、和/或自然伤口愈合过程的任何方法或特性。这些术语还可以指引发、增加、调节、促进、支持和/或引导脆弱，疲倦和/或正常组织的生长、加固、功能、活力、韧性、效力和/或健康的任何过程或特性。

如本发明所用，术语“伤口”广泛地指以不同方式(例如，长期卧床休息引起的褥疮和由创伤引起的伤口)和具有不同特征的皮肤和皮下组织的损伤。伤口通常根据伤口的深度划分为四个等级之一：等级I：仅限于上皮的伤口；II级：伤口延伸到真皮；III级：伤口延伸到皮下组织；和IV级(或全层伤口)，即骨头暴露在外的伤口(例如，骨压点，例如大转子或骶骨)。

如本发明所用，术语“表浅性伤口(partial thickness wound)”是指包括I-III级的伤口；例如，烧伤、褥疮、静脉淤血溃疡和糖尿病性溃疡。如本发明所用，术语“深部伤口(deep wound)”用于描述III级和IV级伤口。

在一个实施方案中，提供了一种皮肤组织，例如上皮、表皮、分层上皮、分层表皮和真皮、断层皮或全层皮肤，其使用本发明所述的方法制备，所述方法通过覆盖受试者的身体的受损、受伤、创伤、患病、去除或缺失的皮肤组织区域以用于促进皮肤移植。

如本发明所用，“移植物”是指通常被植入个体以替代、纠正或以其他方式克服缺陷的细胞、组织或器官。因此，“皮肤移植物”是可以被植入到个体中的皮肤组织，例如被缝合到该个体上。移植物可以进一步包含本发明的基质，例如其中基质被整合到皮肤移植物中。组织或器官可以由起源于同一个体的细胞组成。该移植物在本发明中通过以下可互换的术语指代：“同种移植物(allograft)”、“自体移植体(autologous transplant)”、“自体植入物(autologous implant)”和“自体移植物(autologous graft)”。本发明中通过以下可互换的术语来指代包含来自相同物种的遗传不同个体的细胞的移植物：“同种异体移植物(allograft)”、“同种异体移植体(allogeneic transplant)”、“同种异体植入物(allogeneic implant)”、“同种异体移植物(allogeneic graft)”和“异种移植物(heterologous graft)”。“异种移植物(xenograft)”、“异种移植体(xenogeneictransplant)”或“异种植入物(xenogeneic implant)”，是指从一个体到另一个物种的移植物。

在一个实施方案中，使用受试者自体的细胞来制备组织。例如，在各种实施方案中，使用受试者自体的成纤维细胞、角质形成细胞或成纤维细胞和角质形成细胞来制备组织。在替代实施方案中，使用与受试者异源的细胞制备组织。在另一个实施方案中，使用细胞的组合来制备组织，其中一些细胞对于受试者是自体的，而一些细胞对于受试者是异源的。

应当理解，可以使用本领域已知的任何方法分离细胞(例如受试者自体的)。例如，可通过消化样品组织并从消化的组织中分离成纤维细胞和/或角质形成细胞，从皮肤样品或从受试者获得的皮肤活检物中分离细胞(例如自体细胞)。

在一个实施方案中，组织是自体移植物，例如皮肤自体移植物。在各种实施方式中，组织是表皮自体移植物、断层皮自体移植物或全层皮自体移植物。在另一个实施方案中，组织是同种异体移植物。

将会认识到，非常需要使用患者自体细胞制备的组织，例如自体移植物，以减少或防止组织的免疫排斥并减少正在进行的免疫治疗或其他辅助治疗的需要。

在一个实施方案中，组织还包括基质。在另一个实施方案中，在施用于患者之前将组织与基质分离。

通常，通过手术将组织施用于患者。在一个实施例中，在无菌或灭菌条件下的恢复是在手术期间或手术之前，例如在手术室中。

通常，将组织施用于患者的组织损伤部位处或附近。在各种实施方案中，组织被施用以至少部分地覆盖组织损伤的部位或完全覆盖组织损伤的部位。

在一个实施方案中，所述组织被施用以暂时覆盖组织损伤的部位。在替代实施方案中，组织被施用以永久覆盖组织损伤的部位。

其他非医学用途

通常使用动物皮肤或活体动物、人体尸体皮肤或人工合成的人类皮肤模型测试局部应用的药物、营养保健品或化妆品的功效和安全性。

动物和人类皮肤之间的形态差异意味着，用于产品测试的切割动物皮肤或活体动物不是最佳的。此外，对于使用活体动物或动物皮来测试化妆品的行为，存在相当大的伦理关注，包括在一些国家禁止进行此类测试。由于这些原因，强烈希望找到动物模型的替代品来测试此类产品。

当将人体尸体皮肤用于产品测试时，观察到不一致且高度可变的结果。

因此，使用本发明所述的装置或方法制备的细胞或组织，例如皮肤组织，可用于药物、营养品和/或化妆品的体外测试。

在各种实施方案中，使用本发明所述的装置或方法制备的细胞或组织用于测试化合物的透皮渗透、测试化合物穿过表皮、真皮或基底膜的渗透、测试活性成分治疗或预防某种病症例如皮肤病症的功效，或测试化合物的毒性。

更特别地，根据本发明生产的皮肤组织适合于测试产品，例如有效性，不希望的副作用，例如刺激、毒性和炎症或过敏原作用，或物质的相容性。这些物质可以是潜在用作药物的物质，例如用作皮肤病药的物质，也可以是化妆品或甚至与皮肤接触的消费品(例如洗衣粉等)的成分的物质。

本发明的皮肤组织还可以用于例如研究物质的吸收、传递和/或渗透。它也适合于研究其他试剂(物理量)，例如光或热，放射活性，声音，电磁辐射，电场，例如用于研究光毒性，即不同波长的光对细胞结构的破坏作用。皮肤组织还可以用于研究伤口愈合，也适合于研究气体、气溶胶、烟尘对细胞结构或代谢或基因表达的影响。

在各种实施方案中，细胞或组织用于确定目标化合物是否为皮肤刺激性，例如，确定目标化合物是否诱导皮疹、炎症或接触性皮炎。

物质或试剂对人类皮肤的影响可以通过例如人类或动物皮肤模型系统的细胞的物质释放(例如细胞因子或介体)以及对这些细胞的基因表达、代谢、增殖、分化和重组的影响来确定。使用定量细胞损伤的方法，更特别地，使用诸如四唑衍生物的活体染料，可以检测例如对皮肤细胞的细胞毒性作用。使用皮肤组织的对物质或试剂的测试可以包括组织学过程以及免疫学和/或分子生物学过程。

如本发明所用，“测试剂”是经评估其在受试者中诊断、治愈、减轻、治疗或预防疾病的能力或旨在改变受试者身体的结构或功能的任何物质。测试剂包括但不限于化学化合物、生物剂、蛋白质、肽、核酸、脂质、多糖、补充剂、信号、诊断剂和免疫调节剂。测试剂可以进一步包括电磁力和/或机械力。

在另一个实施方案中，根据本发明生产的皮肤组织可以用作模型系统，用于研究皮肤疾病和用于开发皮肤疾病的新疗法。例如，患有某种遗传或获得性皮肤病的患者的细胞可以用于建立患者特异性的皮肤模型系统，该系统又可以用于研究和评估一些疗法和/或药物的有效性。

在一个实施方案中，所述皮肤组织可以填充有微生物，更特别地是病原微生物。具有致病性或寄生性微生物，尤其包括人致病性微生物的种群。

如本发明所用，“微生物”通常是指真菌、细菌和病毒。微生物优选选自已知感染皮肤的真菌或病原和/或寄生细菌。这些包括但不限于白色念珠菌、须毛癣菌、糠秕马拉色菌和金黄色葡萄球菌的种类。

使用相应地填充的皮肤组织，既可以研究微生物本身的微生物种群的过程，尤其可以研究微生物本身的感染过程，也可以研究皮肤对该种群的反应。另外，可以研究在集群之前、之中或之后施用的物质对群体本身的影响或群体对皮肤组织的影响。

在各种实施方案中，细胞包含成纤维细胞、角质形成细胞或免疫细胞，或其任何两种或更多种的组合。在一个实施方案中，细胞包含成纤维细胞和角质形成细胞。在各种实施方案中，该组织选自表皮、分层表皮和真皮、分层表皮和真皮、断层皮或全层皮肤。

在各种实施方案中，该化合物是药物化合物、化妆品化合物或保健品化合物。

在各种实施方案中，将用于测试的化合物单独地或与药学上或美容上可接受的载体、赋形剂或稀释剂混合施用至组织。

在各种实施方案中，将用于测试的化合物以无菌乳膏、凝胶、浇泼(pour-on)制剂或点滴制剂、悬浮液、洗剂、软膏、撒布剂、浸液、喷雾、掺入药物的敷料、洗发水、衣领或皮肤补丁的形式局部施用于组织。

如本发明所用，术语“透气材料”或“透气膜”是指可以发生气体交换的材料或膜。

在本说明书的上下文中，“包含”旨在表示“包括”。

在技术上适当的地方，可以组合本发明的实施方案。

本发明将实施方案描述为包括一些特征/元素。本发明还扩展到由所述特征/元素组成或基本上由所述特征/元素组成的单独的实施方案。

通过引用将诸如专利和申请之类的技术参考文献并入本发明。

本发明具体和明确叙述的任何实施方案可以单独或与一个或多个其他实施方案组合形成免责声明的基础。

本说明书的背景包含与本发明公开内容有关的技术信息，并且可以用作修改的基础。

本申请要求于2018年9月30日提交的GB1715930.2的优先权，其通过引用并入本发明。可以使用优先权文档作为对本申请中的错误进行校正的基础。

现在将参考以下实施例描述本发明，这些实施例仅是示例性的，绝不应以任何方式解释为限制本发明的范围。

附图简述

图1表明在存在ROCK抑制剂的情况下，Green培养基中的一些成分对于角质形成细胞的生长不是必需的。从冷冻保存中回收人原代角质形成细胞，并在Green培养基、Kelch培养基(图中为“基础培养基”+KGF)或DF10(均添加了ROCK抑制剂Y27632)中生长，直到达到80％融合度为止。为了确定Green培养基中的非必需成分，一次将一种成分从Green混合物中剔除。加入KGF以鉴定其对每种培养基中角质形成细胞生长的影响。角质形成细胞在小鼠胚胎饲养细胞(MEF)存在下(右)或不存在(左)下生长。为了评估角质形成细胞的生长，将细胞固定，用若丹明B染色，并使用Operetta读板仪测量融合度。结果显示为一个代表性供体(+SD)的一式三份，用虚线表示Green培养基+Y27632的生长水平。N＝2。这些结果表明，即使没有MEF，当添加ROCK抑制剂时，Kelch培养基与Green培养基一样有效地诱导角质形成细胞增殖。这也表明霍乱毒素和EGF都是Green培养基在产生角质形成细胞增殖中的重要成分。

图2显示了Kelch培养基与Green培养基中角质形成细胞生长的比较结果。来自冷冻表皮制剂的人原代角质形成细胞在补充了ROCK抑制剂SB772077B的不同培养基中生长至80％融合度。细胞在有或没有MEF的常规Green培养基中生长(右)，或在添加KGF、MEF或两者的基础培养基中生长(左)。Kelch培养基在图中用基础培养基加KGF表示。为了评估角质形成细胞的生长，将细胞固定，用若丹明B染色，并使用Operetta读板仪测量融合度。结果显示了3个供体(+SD)的平均值，并使用双尾Student’s t检验进行了统计分析。N＝3。这些结果表明，无论是否存在MEF饲养细胞，Kelch培养基产生的角质形成细胞增殖至少和Green培养基一样。它还表明，KGF是Kelch培养基中的关键成分，因为在基础培养基加ROCK抑制剂中角质形成细胞的增殖明显低于在基础培养基加ROCK抑制剂加KGF中的角质形成细胞的增殖。在不存在饲养细胞的情况下，在Kelch培养基中加入KGF可使角质形成细胞的增殖在统计学上等同于在存在饲养细胞的情况下在Green培养基中的增殖，这证实了Kelch培养基能够去除异种饲养细胞。

图3表明，ROCK抑制剂Y27632和SB772077B对角质形成细胞的生长具有相当的作用。冷冻的人角质形成细胞在补充有Y27632或SB772077B的基础培养基、基础培养基加KGF(在图例中为“Kelch培养基”)或Green培养基中生长。为了评估角质形成细胞的生长，将细胞固定，用若丹明B染色，并使用Operetta读板仪测量融合度。结果显示为三个供体的一式三份(+SD)。N＝3。这些结果表明，在添加ROCK抑制剂后，Kelch培养基(基础培养基加KGF)可驱动角质形成细胞的增殖，优于Green培养基或不含KGF的基础培养基加ROCK抑制剂，这表明KGF是Kelch培养基的关键成分。

图4表明Kelch培养基加ROCK抑制剂SB772077B)与Green培养基加ROCK抑制剂提供相同的角质形成细胞生长。胰蛋白酶和胶原蛋白酶消化的皮肤细胞在Kelch培养基与Green培养基中生长，两者均含有ROCK抑制剂SB772077B。一式三份的样品最多生长30天，当它们达到80-90％融合时，以1：9传代。N＝1。

图5显示了无血清Optipeak培养基(InVitria)对角质形成细胞生长的影响。冷冻保存的表皮制剂中的人类原代角质形成细胞在4种不同配方的无血清Optipeak培养基或Green培养基中与小鼠胚胎饲养细胞(MEF)一起培养8天。在有和没有ROCK抑制剂Y27632的情况下测试所有培养基。为了评估角质形成细胞的生长，将细胞固定，用若丹明B染色，并使用Operetta读板仪测量融合度。结果显示为一个代表性供体(+SD)的一式三份。N＝2。这些结果表明，尽管ROCK抑制剂增强了无血清Optipeak培养基中角质形成细胞的生长，但所产生的增殖仍然不如在存在MEF的情况下在Green培养基中进行培养所产生的增殖。这些结果还表明，ROCK抑制剂可以增强在存在MEF的情况下，Green培养基中角质形成细胞的生长。

图6显示了Green培养基与市售角质形成细胞生长培养基之间角质形成细胞生长速率的比较。表皮细胞在含有MEF的Green培养基、CnT Prime、补充有S7或EDGS的Epilife培养基中生长。在有和没有ROCK抑制剂Y27632的情况下测试所有培养基。在每种培养基中生长550,000个表皮细胞，直到一个样品达到80％融合为止，此时将所有样品固定并用若丹明B染色。然后将样品的融合度分配为0到4之间的一个分数，0表示没有细胞，而4表示最大融合。N＝2。这些结果表明，ROCK抑制剂还可以增强其他角质形成细胞生长培养基中角质形成细胞的生长，但是与Kelch培养基不同，这些培养基都不能产生与Green培养基加MEF相当的角质形成细胞生长。

实施例

CnT-Prime是可从CellnTec获得的完全定义的无动物成分的培养基。它适用于从皮肤、角膜、牙龈、乳腺和膀胱组织中分离和扩增上皮细胞。它是使用人体组织开发的，但也可以与其他物种(例如小鼠)一起使用。

补充物S7可从ThermoFisher获得。它是一种无菌的、浓缩的(100X)离子平衡溶液，旨在用作人表皮角质形成细胞的完整培养环境中的一种组分。补充物S7经过化学定义，不含动物来源。每瓶5ml的补充物S7是500ml瓶的

基础培养基的正确补充剂量。

EDGS也可从ThermoFisher获得。它是一种经过定义的无菌浓缩(100X)溶液，旨在与

培养基一起用于培养人表皮角质形成细胞。EDGS不旨在用于培养基154。EDGS包含人类表皮角质形成细胞生长所需的所有生长因子和激素。每瓶含有正确量的500ml瓶的

培养基的补充剂。EDGS包含：·纯化的牛血清白蛋白；·纯化的牛转铁蛋白；·氢化可的松；·重组人胰岛素样生长因子1型(rhIGF-1)；·前列腺素E2(PGE2)；·重组人表皮生长因子(rhEGF)。EDGS中的牛产品是从北美起源的动物中分离出来。这些组分的隔离过程包括使病毒失活的步骤。EDGS的所有成分纯度均大于95％。

实施例1–方法

材料

Green培养基–DMEM高葡萄糖:Hams F12 3:1、10％胎牛血清、青霉素、链霉素、10ng/ml EGF、0.1nM霍乱毒素、0.4μg/ml氢化可的松、180μM腺嘌呤、5ug/ml胰岛素、5μg/ml脱铁运铁蛋白、2nM 3,3,5,-三-碘化甲状腺氨酸、2mM谷氨酰胺、0.625μg/ml两性霉素B、10μM Y27632

Kelch培养基-DMEM高葡萄糖:Hams F12 3:1,10％胎牛血清、青霉素、链霉素、0.625μg/ml两性霉素、20ng/ml KGF

基础培养基-DMEM高葡萄糖:Hams F12 3:1,10％胎牛血清、青霉素、链霉素、0.625μg/ml两性霉素

Y27632的最终浓度为10μM。SB772077B最终浓度为400nM。

CnT Prime–Cellntech目录号CNT-PR；Epilife培养基–Thermofisher目录号MEPI500CA；S7补充物–Thermofisher目录号S0175；EDGS–Thermofisher目录号S0125；涂层基质–Thermofisher目录号R011K；Y27632–Selleckchem目录号S1049；SB772077B-Tocris目录#4118

Tryple–Life Technologies目录#12604021

Green，Cellntec，S7，EDGE培养基比较

用S7和EDGS补充的Epilife培养基样品的涂层基质预涂烧瓶。将1.7ml稀释缓冲液加入每个T25烧瓶中。然后加入17μl涂层基质。将混合物在室温温育30分钟。接下来，在添加细胞和培养基之前，从烧瓶中除去稀释缓冲液和涂层基质混合物。

将550,000个表皮细胞和5ml每种需要的培养基(含或不含10μlY27632)添加到T25烧瓶中。将烧瓶在37℃与5％CO₂中温育，直到一个样品达到80％融合度。

接下来，从烧瓶中移出培养基，并将细胞用4％甲醛固定30分钟。加入1％若丹明B溶液，并将细胞在室温下温育10分钟。除去若丹明B溶液，并用水彻底冲洗细胞。最后，使用移液管将烧瓶中的所有液体除去。对细胞成像并计算融合度。

胰蛋白酶和胶原蛋白酶消化方法

从皮肤样品上修剪掉所有皮下脂肪和皮下组织。接下来，将皮肤切成1cm²的片并称重。最终，使用手术刀对真皮的下侧进行了深划痕。

将皮肤碎片放置在6孔板的孔中。接下来，用MilliQ水制备5mg/ml胶原蛋白酶(I型)，并在通风橱中通过0.2um注射过滤器过滤酶原液。然后将0.25％的胰蛋白酶在D0中稀释至0.1％，并添加600μl胶原蛋白酶，使总体积为6ml。将该板置于37℃、5％CO₂的培养箱中过夜。

第二天，将含有皮肤和酶的培养基转移至10cm的培养皿中的6mlDF10中，并用手术刀将皮肤分开。接下来，通过反复通过移液管将皮肤进一步破碎。接下来，将细胞混合物通过100μm过滤器。

接下来，将混合物以1800rpm离心10分钟，并在不干扰细胞沉淀的情况下除去尽可能多的上清液。最后，将细胞沉淀重悬于DF10中以评估细胞数量和活力。

角质形成细胞扩增

将具有400nM SB 772077B的4.5ml角质形成细胞生长培养基添加到T25烧瓶中。

将来自胰蛋白酶/胶原蛋白酶消化过程的500μl单细胞悬液添加到T25烧瓶中。然后将细胞在37℃/5％CO₂温育过夜。

除去所有培养基，并用5ml具有400nM SB772077B的角质形成细胞生长培养基代替。

监测细胞生长直至烧瓶达到80-90％融合度，然后传代细胞以继续扩增。

传代1角质形成细胞传代

从T25烧瓶中除去所有培养基。

用1ml的TrypLE^TM洗涤细胞一次。加入2ml的Tryple，将混合物在37℃/5％CO₂下温育，直到用力敲击烧瓶后大部分细胞脱离。

将具有400nM SB772077B的4ml角质形成细胞生长培养基添加到T25烧瓶中。接下来，使用血清移液管将烧瓶的底部淋洗3次。这使所有剩余的细胞脱离并使细胞团破裂。

将具有400nM SB772077B的10ml角质形成细胞生长培养基添加到T75烧瓶中。将三分之一的分离的细胞混合物加入到T75烧瓶中。

接下来，将细胞在37℃/5％CO₂下温育。监测细胞生长直至烧瓶达到80-90％融合度，然后使细胞传代以继续扩增。

P2至Px角质形成细胞传代

从T75烧瓶中移出所有培养基。接着，将细胞用2ml的TrypLE^TM洗涤一次。加入4mlTrypLE^TM，将细胞在37℃/5％CO₂下温育，直到用力敲击烧瓶后大部分细胞脱离。

接下来，将8ml具有SB772077B的角质形成细胞生长培养基添加到T75烧瓶中。然后用血清移液管将烧瓶的底部淋洗3次。这样可以分离所有剩余的细胞，并使任何细胞团破裂。

将具有400nM SB772077B的11ml角质形成细胞生长培养基添加到T75烧瓶中。然后将十分之一的分离的细胞混合物转移到T75烧瓶中。

将细胞在37℃/5％CO₂下温育。监测细胞生长直至烧瓶达到80-90％融合度，然后传代细胞继续扩增。

实施例2–确定角质形成细胞生长不需要Green培养基中的哪些成分。

在图1中，通过一次将Green培养基的活性成分排除在混合培养基之外，从而对它们进行了评估。重要的是，细胞在ROCK抑制剂(Y27632)的存在下生长，这会刺激细胞生长，使一些Green培养基成分的作用过时。右图显示，如果将角质形成细胞与小鼠胚胎饲养细胞(MEF)共培养，它们会在两种混合物中快速生长。缺少任何单独的成分并没有产生明显的影响。但是，如果不存在MEF(左图)，则缺少一些成分会对角质形成细胞的生长产生负面影响，即表皮生长因子(EGF)和霍乱毒素。后来我们发现EGF不能增强角质形成细胞的生长(数据未显示)。

总之，霍乱毒素是Green培养基最重要的单一成分之一。有趣的是，角质形成细胞生长因子(KGF)加入基础培养基(DMEM：F12 3：1，10％胎牛血清、青霉素、链霉素、两性霉素)+Y27632，可刺激生长，但无法增强Green培养基+Y27632中的角质形成细胞生长，并且无法挽救缺乏霍乱毒素的培养基中的生长。总体而言，基础培养基+KGF+Y27632(Kelch培养基)中的角质形成细胞生长与Green培养基Y27632中的生长相近，甚至更好。

从Green培养基+Y27632中单独去除腺嘌呤可以增强角质形成细胞的生长。

与DF10+KGF相比，在Green或Kelch培养基中角质形成细胞的生长也要好得多。

实施例3–比较Kelch培养基和Green培养基中角质形成细胞的生长

图2比较了在均添加了ROCK抑制剂的Kelch培养基和Green培养基中角质形成细胞的生长情况。相比于仅使用培养基，在存在MEF的情况下，角质形成细胞生长最好，这对于Kelch和Green培养基都是如此。在存在ROCK抑制剂的情况下，向基础培养基中添加KGF(基础培养基+KGF＝Kelch培养基)与向基础培养基中添加MEF具有相似的作用，这表明KGF是角质形成细胞培养中MEF的有效替代品。在Kelch培养基中，角质形成细胞的生长与Green培养基(+/-MEF)相同。具有ROCK抑制剂的Kelch培养基中的角质形成细胞生长明显好于缺少KGF的具有ROCK抑制剂的基础培养基，但与Kelch培养基+MEF+ROCK抑制剂或Green培养基+ROCK抑制剂(+/-MEF)相比并无显著差异。

因此，与Green培养基相比，Kelch培养基会产生相似的角质形成细胞生长速率。

实施例4–使用Y27632与SB772077B比较角质形成细胞的生长

图3显示了ROCK抑制剂Y27632和SB772077B对角质形成细胞生长的作用的相似性。因此，SB772077B可用作用于角质形成细胞生长的Y27632的替代品。

实施例5-比较在Kelch培养基和Green培养基中，从用胰蛋白酶胶原蛋白酶消化的皮肤获得的角质形成细胞的生长

使用胰蛋白酶和胶原蛋白酶消化的皮肤样品在添加了SB772077B的Green培养基或添加了SB772077B的Kelch培养基中生长。图4显示了角质形成细胞增殖速率的图。在30天的时间里，Kelch培养基中的角质形成细胞生长与Green培养基中的角质形成细胞生长相当。因此，Kelch培养基可以替代Green培养基，因为它可以提供等效的角质形成细胞生长动力学，并且不需要霍乱毒素。

实施例6–确定无血清Opti-Peak^TM培养基的潜在用途的实验

图5检验了无血清Optipeak培养基在角质形成细胞生长中的潜在用途。我们测试了InVitria提供的4种Opti-Peak^TM培养基配方。在仅使用这些培养基中的任何一种时，细胞都没有表现出任何明显的生长。如果将ROCK抑制剂Y27632添加到培养物中，则一些菌落开始形成。但是，这4种配方都不如Green培养基，而Green培养基本身尤其是在存在Y27632时，对角质形成细胞的生长具有显著的作用。

实施例7-Green培养基和市售角质形成细胞生长培养基之间角质形成细胞生长的比较

图6显示了Green培养基和市售角质形成细胞生长培养基之间角质形成细胞生长的比较。S7和EDGS用于补充Gibco系列的

培养基。CnT Prime从Cellntech获得。所有市售培养基均设计为无血清和无饲养细胞。Green培养基使用血清和小鼠胚胎饲养细胞。所有培养基均使用和不使用已知对角质形成细胞的生长具有积极作用的ROCK抑制剂Y27632。Green培养基中添加了ROCK抑制剂和小鼠胚胎饲养细胞，从而提供了最快的角质形成细胞生长。ROCK抑制剂增强了Green培养基、S7培养基和CnT Prime培养基中角质形成细胞的生长。

Claims

1.一种细胞培养基，其由以下成分组成：DMEM、Ham's F12、血清、一种或多种抗生素和/或抗真菌剂、角质形成细胞生长因子(KGF)和任选的角质形成细胞生长促进因子，其中的因子不是霍乱毒素。

2.根据权利要求1的细胞培养基，其中DMEM是高葡萄糖。

3.根据权利要求1或2的细胞培养基，其中所述血清是哺乳动物的，例如胎牛血清。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的细胞培养基，其中所述血清以5至15％的浓度存在，例如5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％或15％，特别是10％。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的细胞培养基，其中，至少一种成分是抗生素(例如1、2或3种抗生素)。

6.根据权利要求5所述的细胞培养基，其中，所述抗生素独立地选自青霉素、链霉素、氨苄青霉素、阿莫西林、羧苄青霉素、头孢噻肟、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、多粘菌素、杀稻瘟素、遗传霉素、潮霉素B、霉酚酸、嘌呤霉素、博莱霉素和其两种或更多种的组合。

7.根据权利要求5或6所述的细胞培养基，其中所述抗生素为庆大霉素。

8.根据段落5至7中任一项的细胞培养基，其中所述抗生素是青霉素。

9.根据权利要求5至8中任一项所述的细胞培养物，其中，所述抗生素是链霉素。

10.根据段落1至9中任一项的细胞培养基，其中一种成分是抗真菌剂。

11.根据权利要求10所述的细胞培养基，其中，所述抗真菌剂选自两性霉素B、制霉菌素、放线菌素D、磷胺霉素、霉酚酸和其两种或更多种的组合。

12.根据权利要求11所述的细胞培养基，其中，所述抗真菌剂是两性霉素B，例如其浓度为0.500至0.750μg/ml，例如0.625μg/ml。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的细胞培养基，其中，DMEM∶Ham’s F12的比例为2.5至3.5∶1.5至0.5，例如3∶1。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的细胞培养基，其中所述KGF的浓度在10ng/ml至30ng/ml的范围内，例如20ng/ml。

15.根据权利要求1至14中任一项所述的细胞培养基，其中，所述角质形成细胞生长促进因子是ROCK抑制剂，例如小分子ROCK抑制剂。

16.根据权利要求15所述的细胞培养基，其中，所述ROCK抑制剂选自：SB 772077B、Y-27632、法舒地尔、Ripasudil、Y39983、Wf-536、SLx-2119、氮杂苯并咪唑-氨基呋咱、DE-104、H-1152、ROKα抑制剂、XD-4000、HMN-1152、4-(1-氨基烷基)-N-(4-吡啶基)环己烷-甲酰胺、rhostatin、BA-210、BA-207、BA-215、BA-285、BA-1037、Ki-23095、VAS-012、RKI-1447、GSK429286A、Y-30141、HA-100、H-7、iso H-7、H-89、HA-1004、HA-1077、H-8、H-9、KN-62、GSK269962、喹唑啉和其两种或更多种的组合。

17.根据权利要求16所述的细胞培养基，其中所述ROCK抑制剂是SB 772077B、Y-27632或两者的组合，特别是SB 772077B。

18.根据权利要求15至17中任一项所述的细胞培养基，其中，所述ROCK抑制剂的浓度在0.1至100μM的范围内，例如0.2至50μM或0.3至25μM或0.1至10μM或0.1至0.95μM，如0.15μM、0.2μM、0.25μM、0.3μM、0.35μM、0.4μM、0.45μM、0.5μM、0.55μM、0.6μM、0.65μM、0.7μM、0.75μM、0.8μM、0.85μM、0.9μM或0.95μM，特别是0.4μM。

19.一种产生人全层皮肤、全人表皮或全人真皮的体外方法，其包括第一培养步骤，其中在根据段落1至18中任一项的细胞培养基中培养人角质形成细胞和饲养细胞。

20.根据权利要求19所述的体外方法，其中，所述饲养细胞是成纤维细胞。

21.根据权利要求20的体外方法，其中所述成纤维细胞是完全人类的。

22.根据权利要求19至21中任一项所述的体外方法，其中，不在异种饲养细胞的存在下培养人角质形成细胞。

23.根据权利要求19至22中任一项所述的体外方法，其中，不辐照人成纤维细胞。

24.根据权利要求19至23中任一项所述的体外方法，其中所述人成纤维细胞和角质形成细胞来自同一供体。

25.一种完全皮肤产品，其包含通过权利要求19至24中任一项所述的方法培养的人类表皮。

26.根据权利要求25所述的全人皮肤产品，其包含分化的真皮和表皮。

27.根据权利要求25或26的全人皮肤产品，其用于治疗。