CN101379182A - 皮肤护理组合物以及处理 - Google Patents

Abstract

本发明涉及含有由被培养的皮肤细胞合成的生长剂的组合物。将皮肤细胞如角质形成细胞和真皮成纤维细胞体外培养在细胞培养基中，在培养过程中，被培养细胞合成并分泌试剂到该细胞培养基中。收集含有试剂的该培养基，加入到药物制剂或化妆品制剂中，用于处理个体。施用该制剂，并且对细胞和组织有更新的作用。

Description

皮肤护理组合物以及处理

发明领域

本发明的领域是细胞培养以及医药生物技术，特别是含有培养的皮肤试剂(cultured skin agents)的组合物，所述皮肤试剂是从获自皮肤的培养细胞合成的。皮肤细胞例如角质形成细胞以及真皮成纤维细胞是在细胞培养基中体外培养的，在培养的过程中培养细胞会合成并且分泌试剂到细胞培养基中。收集含有试剂的培养基并且掺入局部制剂用于处理个人。该制剂被用于个人的皮肤，并对细胞和组织有更新的作用，以减少细纹和皱纹的出现。

本发明背景的简述

随着皮肤老化，干燥及弹性丧失会变得越来越普遍。另外，暴露于日光，风，污染及其他外来刺激和环境压力会加重皮肤的老化。作为长时间紫外线照射的结果，皮肤结构及功能成分的改变共同地被称为光老化或光损伤。认为光老化的大多数临床特征是随时间发生的老化特征，即，老年斑(光化斑点)及皱纹。可以预料当前的生活方式有所转变，皮肤在太阳下的暴露越来越多以及人造的紫外源及对皮肤随后的紫外线(UV)慢性效应，因此要求医治以改善异常皮肤的光老化患者的数目会越来越多。

在一般群体中，光老化的差异取决于皮肤类型(如，浅色的皮肤会比深色的皮肤更容易光老化)，并且，在过早老化的皮肤中在色素沉着方面的变化似乎是比皱纹更重要的特征。这些差异可能是由于个体在日光暴露下的内在差别以及对阳光长期暴露的天然防卫机理的关系。

紫外线的长期暴露会引起皮肤细胞成分的特征变化。一些临床体征，包括细及粗的皱纹，色素的改变，粗糙，松弛，灰黄以及毛细血管扩张(凸出的细血管)，会导致出现过早的老化并且对某些生活质量方面产生显著影响。在组织学上观察到表皮的萎缩以及发育异常，真皮的弹性组织变性及增强的黑素细胞活性。发育异常及肿瘤的改变例如光化性角化病及基底和鳞状细胞癌同样是光老化皮肤的极端特征。

尽管老化已被认为是不可逆的，但是在上个十年间进行的研究显示一些局部的化合物和外科方法能够改善老化相关的表皮损伤。手术和介入性处理包括面部提升，皮肤擦除术，激光表面重修(resurfacing)，肉毒素注射和胶原注射。这些手术处理在光老化皮肤中产生了临床和组织学的改良，但是带有一定风险，并且不包含预防成分。

为改善皮肤外观，已经开发了许多皮肤护理产品和皮肤护理处理。此外，已经开发了各种医学处理方法用于处理慢性皮肤问题，例如粉刺，癌前病变，疤痕，色素沉着紊乱，皱纹等等。

目前有一些正在被使用或被研究的最近的局部施用的皮肤护理产品和皮肤护理处理。例如，维生素-A(视黄醇)和被称为类视黄醇的维生素-A衍生物是局部处理，被认为通过放松皮肤的顶层并且促使细胞更新而发挥作用。局部施用能够中和自由基的维生素C(抗坏血酸)可修复皮肤并且减少细纹及皱纹。局部施用维生素K可帮助修复破裂的血管，网状静脉，瘀伤，黑眼圈及皮肤红斑。α-羟酸(AHAs)及β-羟酸(BHAs)是改善皮肤活力及预防粉刺的局部脱落剂(exfoliant)。局部施用表皮生长因子(EGF)可以改善皮肤功能并产生总体更年轻的外观。研究人员继续研究那些导致老化外观的皮肤特征。

在老化研究中的一个使人感兴趣的皮肤特征是Grenz区域。Grenz区域是均质物质的一个条带，其在真皮中被发现，紧挨在缺少耐酸纤维(oxytalan fiber)(即，弹性蛋白纤维)的表皮之下。Grenz区域是嗜酸性的，即当用苏木精和伊红染料染色时呈现粉红色。虽然有人定义Grenz区域相当于真皮乳头，但是事实并非如此。Grenz区域构成不同程度的真皮乳头，但是其并非等同于真皮乳头，因为Grenz区域的染色特性十分独特。Grenz区域是新胶原(I和III型)沉积的结果，最近的研究显示Grenz区域变厚是胶原mRNA合成增多的结果。在近几年的文献中记载在Grenz区域中会有一些新弹性蛋白的沉积(紧挨着在基底膜之下)。在光致损伤和老化诱导的改变中，由于在真皮乳头中光老化与断裂物质(即，断裂的老化弹性蛋白)的积累相关，所以增加的Grenz区域厚度可以通过新胶原的沉积来弥补这种组织柔韧性的损失。

作为以获取更年轻皮肤外观为目的进行的整形或面部手术的一种替代，许多人选择介入性小于手术方法的皮肤表面重修处理。这些方法包括激光去皮术，化学去皮术，皮肤擦除术和皮肤光滑术(dermaplaning)。所有的皮肤表面重修处理基本上以同样的方式发挥作用。首先，剥离受损皮肤的外层，达到皱纹和疤痕水平的深度到周围皮肤的水平。至于表浅的或中间的表面重修术，去除的各层皮肤组织可被限制在表皮和真皮乳头。至于较深的表面重修术，还可以去除网状真皮的上层水平。不同的穿透可以处理特定的斑点或皱纹。在处理之后的时间内，由于在修复过程期间新细胞增殖并迁移到表面重修的区域，会呈现出更光滑、紧致、更显年轻的皮肤。在修复过程期间，皮肤护理产品被用于处理过的区域以增强和加速皮肤修复。

广泛存在各种能改善光老化皮肤的化妆品制剂，但其效果并不清楚。因此，考虑到如此大量的效果未知的处理，鉴定那些对控制光老化有效且安全的制剂对我们来说是十分重要的。由此，化妆品工业和制药公司的持续目标是研制皮肤护理产品和皮肤护理处理，用于改善皮肤外观及增进受损皮肤的修复过程。

发明概述

本发明根据下述发现:经调节的细胞培养基(conditioned cellmedium)可被制备到组合物或制剂中，用于局部地处理皮肤。本发明的组合物是经调节的培养基，其含有一种或多种培养的皮肤试剂，所述试剂由来自培养的皮肤细胞合成和分泌，该组合物可用作药物制剂或作为皮肤护理产品。

作为药物制剂，含有经调节的细胞培养基的该产品局部施用，用于处理皮肤状况，例如促进伤口愈合。该局部组合物可以包括任何适当的药学可接受载体。

作为皮肤护理产品或作为皮肤护理处理，含有经调节的细胞培养基的该产品以足以增加细胞增殖和产生的量被局部地施用于皮肤，用于改进皮肤的外观，并且减少细胞衰老。

本发明还涉及制备组合物或制剂的方法，该组合物或制剂含有经调节的细胞培养基，所述培养基含有由培养的皮肤细胞产生的一种或多种培养的皮肤试剂。该方法包括在含有营养物质的培养基内培养皮肤细胞，所述皮肤细胞是角质形成细胞或成纤维细胞，或优选共培养这两种细胞类型，以使皮肤细胞生长，然后诱导细胞合成并分泌一种或多种细胞因子到培养基中。因此将制备的经调节的细胞培养基——目前含有一种或多种培养的皮肤试剂——与培养的皮肤细胞分离并用于制备组合物或制剂，用于局部施用到皮肤。

附图说明

图1描述了用于形成皮肤构建体的仪器，所述皮肤构建体能产生细胞因子并将其沉积到周围培养基中用于对其进行调节。

附图2显示经调节的培养基(ACM)对角质形成细胞集落大小的作用。

附图3显示经调节的培养基(ACM)对角质形成细胞增殖的作用。

附图4显示经调节的培养基(ACM)对角质形成细胞在血纤蛋白上迁移的作用。

附图5显示经调节的培养基(ACM)对角质形成细胞螺旋转角的作用，其沿着血纤蛋白基质迁移。

附图6显示经调节的培养基(ACM)对内皮细胞增殖的作用。

附图7显示经调节的培养基(ACM)对平滑肌细胞增殖的作用。

附图8显示经调节的培养基(ACM)对成纤维细胞增殖的作用。

附图9显示培养基，棉垫和皮肤构建体细胞提取物中经调节的培养基(ACM)细胞因子的表征。

附图10表明经调节的培养基(ACM)的作用不依赖于EGF受体途径。

发明详述

本发明涉及经调节的培养基组合物，其含有培养的皮肤试剂，该试剂由培养的皮肤细胞产生，所述细胞例如真皮成纤维细胞和表皮细胞。在经调节的培养基中的培养的皮肤试剂是生物学活性分子，可用于配制药物，化妆品和伤口愈合制剂。

当来自细胞的培养的皮肤试剂用于化妆品制剂领域时，它们能使消费者获益，用于皮肤整体更新，包括柔韧性、柔软度和弹性增强的外观；皱纹减少；减少老化进程以及修复皮肤。当日常且周期性使用，例如每天使用时，培养的皮肤试剂为皮肤所吸收并且引发新皮肤细胞(角质形成细胞和成纤维细胞，在皮肤中发现的关键细胞类型)的增殖和产生，并减少细胞衰老和支持皮肤细胞合成细胞外基质成分，例如成纤维细胞从头合成弹性蛋白以及胶原，并在Grenz区域沉积，以便通过Grenz区域的加厚来延迟，停止或逆转皮肤起皱以及皱纹外观。还会使皮肤色素沉着呈现更均匀的状态。

作为药物制剂，在经调节的培养基中的培养的皮肤试剂可用于增强二度烧伤、皮肤处理、保湿后的修复过程；减少疼痛；增强光滑度，并在皮肤擦除，皮肤光滑术，表皮脱落，化学脱皮，激光处理，晒伤，风伤，辐射伤，皮肤处理，起水泡，温泉处理及其他方法或能引起皮肤创伤的事件之后更快地用新皮肤形成更完整的修复。同时还能处理脂肪团(cellulite)，脱发，神经病，拉伸痕迹(亦称妊娠纹(straie))。

妊娠纹是当皮肤快速拉伸时可能出现的拉伸痕迹。它们通常与妊娠时腹部的膨大相关联。在迅速长胖的孩子身上能够看到它们。它们在男性和女性的青春期时迅速生长的期间也可能出现。妊娠纹大多数通常位于乳房，髋部，大腿，臀部，腹部和胁腹。拉伸痕迹表现为平行的红色斑纹，变薄的有光泽的皮肤，随着时间而发白，并看上去像疤痕。拉伸痕迹可能会有一点下凹，其纹理可能不同于正常皮肤。妊娠纹还可能作为异常胶原形成的结果存在，或由防碍胶原形成的药物或化学物质而导致。它们还可能与长期施用可的松化合物，糖尿病，库欣氏病和妊娠后有关。

含有培养的皮肤试剂的制剂还可以用来促进组织血管生成。含有这些细胞因子的药物制剂同样可以在手术或损伤之后用于处理粘膜表面。

在伤口愈合制剂中，含有来自经调节的培养基的培养的皮肤试剂的制剂通过直接将该制剂施用到伤口床，或通过掺入到伤口敷料中而使用。通过用该制剂涂覆到移植物表面、整个移植物或伤口床，该制剂可以用作该移植物，例如自体移植物(从患者移走并再施用到相同患者的其它地方)或培养的皮肤构建体的辅助物。当在伤口愈合中用作辅助物时，该伤口愈合制剂所含的培养的皮肤试剂通常可通过诱导角质形成细胞和成纤维细胞增殖及产生，以及形成肉芽组织和血管而增加和改善伤口闭合。

经调节的培养基是指已经接触了组织培养物并已被该组织培养物中的细胞作为营养物，维生素，激素和无机化合物及盐来源的培养基，并且通过接触该组织培养物，此刻已经加入了细胞产物，或“培养的皮肤试剂”，例如细胞因子，蛋白质，细胞外基质成分，或其任何组合，其由该细胞合成并分泌到该培养基中。“调节”是细胞在接触，暴露，交换及在细胞和培养基之间相互作用一定时间，优选6小时到3天一次，更优选12小时到2天，向新鲜的培养基中合成及分泌细胞因子、蛋白质和细胞外基质成分的过程，用于调节该培养基。然后从培养仪器(其在培养物中含有皮肤构建体)移走经调节的培养基，收集经调节的培养基，纯化其中的培养的皮肤试剂，或全部或部分地用作药物、化妆品或伤口愈合组合物，或用于体外细胞培养。

细胞因子是导致细胞功能或活性(例如分化，增殖，分泌或运动性)变化的各种蛋白质。生长因子是一个亚组的细胞因子，也是能够引起功能或活性变化的蛋白质，能促进或抑制细胞生长，增殖，迁移或其它相关的细胞事件。趋化因子是另一个亚组的细胞因子，其在体内吸引并指导T细胞，B细胞及其他趋化因子反应性细胞到特定组织。淋巴因子是另一个亚组的细胞因子，其参与免疫应答。在此，术语“细胞因子”，包括细胞因子，其包括生长因子，趋化因子及淋巴因子，并不限于其正常结构与功能，还可以包括其天然存在的变体和杂交体。本发明的培养的皮肤试剂包含细胞因子。

在皮肤构建体的构造过程中以及当完全形成时，培养的皮肤构建体会包含活细胞，其合成和分泌一系列细胞因子及其他物质进入到该构建体的基质以及容纳该构建体的培养基之内。培养的皮肤构建体中的培养细胞典型地由真皮成纤维细胞和表皮细胞组成，表皮细胞也称为角质形成细胞。在构造和培养双层皮肤构建体的过程中，表皮和真皮组织层为细胞-细胞和细胞-基质相互作用提供了一种组织样环境，类似于在天然的哺乳动物和人皮肤中存在的环境，所述组织样环境是一种掺入了细胞外基质的组构的共培养物。在构建体发育过程中的这些相互作用促使广谱细胞因子表达并分泌到培养基中，用于诱导培养物中的其它细胞行使胞外基质发育、基底膜产生以及细胞增殖和分化的功能。

本发明的一个特征是由培养的皮肤构建体生产的细胞因子和生长因子，这些因子包括，但不限于:碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)；表皮生长因子(EGF)；角质形成细胞生长因子(KGF)；转化生长因子α(TGFα)；转化生长因子β(TGFβ)，包括转化生长因子β-1(TGFβ1)和转化生长因子β-2(TGFβ2)；粒细胞集落刺激因子(GCSF)；胰岛素样生长因子(IGF)；血管内皮生长因子(VEGF)和肿瘤坏死因子(TNF)。在趋化因子亚组中，白细胞介素能影响细胞凋亡。包括白细胞介素-1，白细胞介素-6，白细胞介素-8，白细胞介素-11在内的许多白细胞介素也被发育中的皮肤构建体合成，也作为本发明的一个特征。应该注意括号中的上述术语是公知的缩略语，在本领域内用于代表它们之前的正式术语。

本发明的培养的皮肤试剂包含的其它细胞因子和生长因子包括:双调蛋白；血管生成素；血管生成素-2；DTK；EGF-R；ENA-78；FAS；FGF-1；FGF-2；FGF-6；FGF-7；FGF-9；FIT-3配体；GCP-2；G-CSF；GM-CSF；GRO-α；HGF；IGF-1；IGF-2；IGFBP-2；IL-11；IL-1α；IL-lβ；L-IRA；IL-6；IL-6R；IL-8；瘦素；MCP-I1；MCP-2；M-CSF；骨保护素(Osteoprotegrin)；PDGF；PIGF；RANTES；干细胞因子；TGFα；TGFβ1；TGFβ2；TGFβ3；TIMP-I；TIMP-2；TRAIL；UPAR；和VEGF。应当注意上述术语是公知并且用于本领域的缩略语，各术语的全称并入本文作为参考。

优选地，本发明的经调节的培养基是由皮肤细胞(角质形成细胞，真皮成纤维细胞，或二者)的培养细胞产生，更优选同时培养所述细胞，作为角质形成细胞和真皮成纤维细胞的共培养物。本发明的经调节的培养基最优选产生的情形是:当所述共培养物是具有至少一个真皮层和一个表皮层的培养的皮肤构建体时，并且其方向排列为类似于天然的皮肤。真皮层包含成纤维细胞，优选真皮来源的成纤维细胞和胞外基质，主要是胶原。本领域技术人员可以理解:通过有意填加或者持续培养来自原始来源的成纤维细胞的结果，该培养的皮肤构建体可含有皮肤及其他胞外基质成分中存在的其它细胞。

优选用于本发明的细胞类型来源于间充质。更优选的细胞类型是成纤维细胞，基质细胞，及其他支持性结缔组织的细胞，或者，在最优选的实施方式中，是人真皮成纤维细胞。人成纤维细胞株可源自于许多来源，包括但不限于男性新生儿包皮，真皮，腱，肺，脐带，软骨，尿道，角膜基质，口腔粘膜，和肠。人的细胞可包括但不限于:成纤维细胞，平滑肌细胞，软骨细胞及其他间充质来源的结缔组织细胞。优选，然而并非必要，用于生产组织构建体的产生基质的细胞的来源是在使用本发明培养法之后将要类似或者模拟的那种组织类型。例如，多层的片状构建体是用成纤维细胞培养的，形成存活的结缔组织构建体；或者用成肌细胞形成骨骼肌构建体。可使用一个以上细胞类型构造组织构建体。细胞供体可在发育和年龄方面不同。细胞可以来源于胚胎、新生儿或者更年长个人，包括成人的供体组织。胚胎祖细胞例如间充质干细胞可用于本发明并诱导分化，发育为期望的组织。

尽管本发明优选使用人的细胞，但是用于本方法的细胞不限于人来源的细胞。来自其它哺乳动物物种包括但不限于，马科动物，犬科动物，猪科动物，牛科动物，猫科动物，山羊，及绵羊的细胞也可以使用。还可使用鼠细胞及其他来自啮齿动物来源的细胞。此外，能自发地、化学地或者经病毒转染的遗传工程化细胞也可用于本发明。对于那些掺入一种以上细胞类型的实施方案，可以使用正常及遗传学修饰或者转染细胞的混合物，可以使用两个或更多物种或者组织来源的细胞的混合物，或者上述两者。

重组细胞或者遗传工程化的细胞可以用于该组织构建体的生产，形成能作为药物运送移植物一样发挥作用的组织构建体，用于需要提高天然细胞产物或需要用治疗剂处理的患者。在连续的时间段内，或根据培养物中的条件，当发出生物学，化学或热信号时，该细胞可产生重组细胞产物，生长因子，激素，肽或蛋白质。细胞还可以被遗传工程化以表达细胞因子，蛋白质或不同类型的胞外基质成分，该成分或者是′正常的′但高水平表达，或以某种方式被修饰以产生治疗上有利于改善伤口愈合，促进或者指导新血管生成的细胞产物。这些方法是本领域公知的，在Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY(1989)中被描述，并入本文作为参考。上述所有提及的细胞类型均可用于本发明，用于制备培养的皮肤构建体，其能合成含有细胞因子的经调节的培养基。培养的皮肤构建体中的细胞是在基质中被培养，该基质能支持模拟正常皮肤的排列和组成的细胞。

胶原是一种常见并优选用于培养皮肤等同物的组合物。虽然胶原是最优选的用于制备皮肤等同物的胞外基质组合物，其产生并分泌细胞因子及其他培养的皮肤试剂以调节培养基，但是可以使用其它胞外基质成分。这些胞外基质成分可以单独使用，或者优选与胶原一起使用，以模拟天然的真皮基质。这些胞外基质成分可以包括:其它胶原，它们是胶原家族例如II，III，IV，V，VI，VII，VIII，IX，X，XI，XII，XIII，XIV，XV，XVI，XVII，XVIII，XIX型胶原的纤维状和非纤维状胶原，其它基质，其包括但不限于弹性蛋白，蛋白聚糖例如核心蛋白聚糖或者双糖链蛋白聚糖，或者糖蛋白例如腱生蛋白，玻连蛋白，纤连蛋白，层粘连蛋白，血小板反应蛋白I，以及糖胺聚糖(GAG)例如透明质酸(HA)。真皮基质可以在组成以及结构方面不同。胶原海绵状物(collagen sponge)，生物相容的，可生物重塑的，去细胞的真皮，或者胶原凝胶。它们并不是提供胞外基质成分到真皮细胞，而是能在生物可降解的筛构件(例如尼龙或者polygalactin(PGA))上培养，以提供一种培养支持物，并培养以产生胞外基质，直至细胞以及其基质包围该支持物。在优选的实施方案中，真皮层是收缩的胶原凝胶(contracted collagen gel)，通过成纤维细胞收缩，例如在Bell的美国专利No.4,485,096中的描述，并入本文作为参考。在一个更优选具体实施方式中，收缩的胶原凝胶被排列在位于多孔膜上的大块无细胞胶原层上，用于将凝胶锚定到该膜上，预防凝胶过度的放射状收缩。用于掺入大块无细胞胶原层的方法描述于Kemp等人的美国专利No.5,536,656，Wilkins，LM.等，Developmentof a Bilayered Living Skin Construct for Clinical Applications.Biotechnology and Bioengineering，43卷，747-756页(1994)，以及Parenteau，N.L.Skin equivalents.，T.Leigh和F Watt(eds)，TheKeratinocyte Handbook.Cambridge University press，London(1994)，其公开文本并入本文作为参考。

本发明的组织等同物和无细胞的水合胶原凝胶都可以使用来源于皮肤和腱，包括大鼠尾腱，小牛皮胶原和小牛伸肌腱的胶原制备。其它来源的胶原也可使用。在Kemp的美国专利No.5,106,949中公开了一种来源于小牛普通趾伸肌腱的特别优选的胶原组合物及得到所述胶原的方法，其公开文本并入本文作为参考。

在本发明的一个方法中，参见图1，从包含大约0.5到2.0mg/ml，优选约0.9到1.1mg/ml胶原和营养培养基的胶原组合物制备无细胞的水合胶原凝胶25。该胶原组合物加入到内容器20中，维持在能使该胶原组合物凝固并形成尺寸合适的无细胞的水合胶原凝胶的条件下，所述尺寸通常是约1到5mm厚度，优选大约2到约3mm厚度范围。无细胞的水合胶原凝胶25的厚度优选足够可以使当细胞从组织等同物向无细胞的水合胶原凝胶中迁移时一部分保持无细胞，薄度则足够可以使该组织等同物不会不理想地从外容器10中提供的营养源处移开。

使用根据前述专利的方法接下来将真皮等同物浇铸到无细胞的水合胶原凝胶上，如以下所述。将含有胶原和成纤维细胞的浇铸混合物加入内容器20的无细胞的水合胶原凝胶25之上，并维持在能够形成组织等同物的条件下。当该组织等同物在无细胞的水合胶原凝胶25上形成时，它会放射状地收缩。

通常，真皮层26的侧面会向水合胶原凝胶25的外周倾斜，以形成如图1在52所示的平顶高台形状。此刻用上皮细胞接种该真皮层26，形成表皮层28。该表皮细胞以约0.3 x 10⁶到约30 x 10⁶个细胞/ml的浓度接种在培养基中。接种的表皮体积取决于该平顶高台的尺寸。

可以控制胶原的浓度，细胞的数目和浇铸混合物的体积，使该活组织等同物的直径和厚度达到最优化。该浇铸混合物包含营养培养基中的约1.25 x 10⁴到约5 x 10⁴个细胞/ml浓度的细胞和大约0.5到约2.0mg/ml的胶原。优选细胞浓度是大约2.5 x 10⁴个细胞/ml。已经发现用于组织等同物的浇铸混合物的体积与用于无细胞的水合胶原凝胶的浇铸混合物的体积的比能对细胞存活力和分化产生影响。组织等同物浇铸混合物与胶原凝胶浇铸混合物的有用体积与体积(v/v)比大约为3:1到1:3。当细胞在胶原网格(lattice)中大约是2.5 x 10⁴个细胞/ml的浓度时，此时的优选比是3:1。

该培养物被维持在培养箱内，确保细胞培养的充足环境条件，即，受控的温度，湿度和气体混合物。优选的条件为大约34℃到大约38℃，更优选37±1℃，空气为大约5-10±1％ CO₂，相对湿度(Rh)为大约80-90％。

用于将表皮细胞提供给真皮基质的方法和其培养方法，包括诱导表皮的分化和角质化以形成分化的角质形成细胞层，都是本领域已知的，描述于Parenteau等人的美国专利No.5,712,163和Kemp等人的美国专利No.5,536,656，Wilkins(1994)，同上文，和Parenteau(1994)，同上文，其教导并入本文作为参考。为进行细胞-基质构建体的表皮化，通常将角质形成细胞接种到细胞-基质构建体上并在其上培养，直至该层达到一到三个细胞层的厚度。然后诱导角质形成细胞分化，形成多层表皮，然后诱导角质化以形成角质层。

在形成分化的表皮层的方法中，从细胞库储存物中取出传代培养的角质形成细胞，扩充其细胞数目。当已经获得了需要数目的细胞时，从培养物基质中释放细胞，悬浮，计数，稀释然后以大约4.5 x 10³个细胞/cm²到大约5.0 x 10⁵个细胞/cm²，更优选大约1.0 x 10⁴个细胞/cm²到大约1.0 x 10⁵个细胞/cm²，最优选以大约4.5 x 10⁴个细胞/cm²的密度接种到细胞-基质构建体的上表面。然后在37±1℃，10％ CO₂下孵育该构建体约60到约90分钟，让角质形成细胞附着。孵育之后，将该构建体浸在表皮化培养基中。经过一段充足时间的培养之后，角质形成细胞增殖并播散，形成跨细胞-基质构建体的汇合单层。汇合后，该细胞培养基的配方转变为分化培养基，以诱导细胞分化。当已经形成多层上皮时，使用角质化培养基，并且培养物被放置在气-液界面上。为了使角质形成细胞分化和角质化，将细胞暴露于干燥或者低湿度的气-液界面。干燥或者低湿度界面的特征在于设法复制皮肤的低水分的水平。当暴露于这些条件时角质形成细胞会随时间表达大多数或者所有角蛋白及在天然的皮肤中发现的其他特征。

当完全形成时，表皮层是一种多层的、分层的、分化良好的角质形成细胞层，显示出基底层，基底上层，颗粒层和角质层。基底膜的原基或者完整的基底膜存在于真皮-表皮的接合处，半桥粒周围最厚，以VII型胶原组成的锚定原纤丝为标志，这是通过透射电子显微术(TEM)观察到的。看到锚定纤丝从基底膜形成区域引出，将胶原纤丝截留在真皮层中。这些锚定纤丝以及其它基底膜成分是由角质形成细胞分泌的。还知道虽然角质形成细胞能够独自分泌基底膜成分，但是如果缺少成纤维细胞则不会形成可辨别的基底膜。本发明的皮肤构建体的免疫组织化学染色还显示:存在一种基底膜蛋白质——层粘连蛋白。

在培养的皮肤构建体的形成中，通过接触培养基而使该构建体获得营养，所述培养基由于皮肤构建体中的细胞而变成经调节的，因为这些细胞代谢该培养基的成分并向其中分泌细胞因子及其他蛋白质。确定成分培养基是指一种用于细胞培养的培养基，其含有化学确定的成分并且不含有不确定的动物器官或者组织提取物，例如血清，垂体提取物，下丘脑提取物，胎盘提取物，或者胚胎提取物或者饲养细胞分泌的蛋白质和因子。在最优选的实施方式中，该培养基不含有不确定的成分，并且确定的生物成分来源于非人的来源。尽管并不优选添加不确定的成分，但是仍然可以根据该公开的方法在培养过程中的任一时间点使用不确定的成分，以便成功地制造组织构建体。当使用来源于并非非人来源生物成分的化学确定成分，采用筛选的培养的人细胞进行本发明时，得到的组织构建体是确定的人组织构建体。使用这种构建体制造本发明的经调节的培养基的优点是可消除组织构建体或者经调节的培养基之中存在偶发性动物或者交叉物种病毒污染以及感染的顾虑。

新鲜的和从未用过的培养基包含营养物质基(nutrient base)，通常进一步补充有其它成分。技术人员通过合理的预期可以确定动物细胞培养物中的合适营养物质基，用于成功制造本发明的组织构建体和经调节的培养基。许多市售营养物质源可用于实现本发明。这些包括能提供无机盐，能量源，氨基酸，和B-维生素的市售营养物质源，例如Dulbecco的改良伊格尔培养基(DMEM)；极限必需培养基(MEM)；M 199；RPMI1640；Iscove的改良Dulbecco培养基(EDMEM)。极限必需培养基(MEM)和M199需要额外补充磷脂前体和非必需氨基酸。能提供额外氨基酸，核酸，酶辅因子，磷脂前体和无机盐的市售的富含维生素的混合物包括Ham′s F-12，Ham′s F-10，NCTC 109和NCTC 135。虽然有不同的浓度，不过所有的基础培养基都能为细胞提供葡萄糖，氨基酸，维生素和无机离子连同其它基础培养基成分形式的基础营养物质源。本发明最优选的基础培养基包含无钙或者低钙Dulbecco改良的伊格尔培养基(DMEM)的营养物质基，其含有4.5g/L葡萄糖，镁和7.25mM L-谷氨酰胺，不含丙酮酸钠，还含有3:1的Ham′s F-12。

该基础培养基补充了诸如氨基酸，生长因子和激素这些成分。用于进行本发明细胞培养的确定成分培养基描述在Parenteau的美国专利No.5,712,163和国际PCT公开No.WO 95/31473，其公开文本并入本文作为参考。本领域还已知其它培养基，诸如在Ham和McKeehan，Methods in Enzymology，58:44-93(1979)中公开的那些，或者在Bottenstein等人，Methods in Enzymology，58:94-109(1979)中公开的其它适当的化学确定成分培养基。在优选具体实施方式中，基础培养基补充有动物细胞培养领域技术人员公知的下列成分:胰岛素，转铁蛋白，三碘甲腺原氨酸(T3)和单独乙醇胺或o-磷酰-乙醇胺或这二者，这些补充物的浓度和代替物可由本领域技术人员确定。

胰岛素是多肽激素，能促进葡萄糖和氨基酸的摄取，可在多个世代提供长期益处。对于长期培养则必须补充胰岛素或者胰岛素样生长因子(IGF)，因为细胞摄取葡萄糖和氨基酸的能力将最终耗尽且细胞表型可能降解。对于连续培养而言补充胰岛素是推荐的，以优选约0.5μg/ml到约50μg/ml的浓度范围，更优选约5μg/ml提供给培养基。对于胰岛素样生长因子诸如IGF-I或IGF-2的适当补充浓度可以由本领域技术人员根据选用于培养的细胞类型而轻易地确定。

转铁蛋白存在于培养基中用于铁的运送调控。铁是血清中的一种必须微量元素。由于游离态的铁可能对细胞有毒害作用，所以其在血清中以与转铁蛋白结合的状态提供给细胞，浓度范围优选在约0.05到约50μg/ml，更优选约5μgml。

三碘甲腺原氨酸(T3)是一种基本成分，是甲状腺激素的活性形式，包含在培养基中以维持细胞代谢的速率。三碘甲腺原氨酸以约0到约400pM，更优选约2到约200pM，最优选以约20pM的浓度补充到培养基中。

加入单独的乙醇胺和o-磷酰-乙醇胺或者二者，它们为磷脂，功能为肌醇途径和脂肪酸代谢中的一种重要前体。在无血清培养基中必须补充通常在血清中存在的一些脂类。乙醇胺和。-磷酰-乙醇胺以约10^-6到约10^-2M，更优选约1 x 10^-4M的浓度添加到培养基中。

培养期间，基础培养基需要另外补充其它成分，诸如氢化可的松，硒和L-谷氨酸盐，用于诱导合成或分化或用于改善细胞生长。

已经显示在角质形成细胞培养中氢化可的松能促进角质形成细胞表型从而增强分化特征，诸如套膜蛋白(involucrin)和角质形成细胞转谷氨酰胺酶含量(Rubin等，J.Cell Physiol.，138:208-214(1986))。因此，在这些特征为有利的情况下，诸如形成角质形成细胞层移植物或皮肤构建体的情况下，氢化可的松是一种理想的添加剂。氢化可的松可以约0.04μg/ml到约4.0μg/ml的浓度范围，最优选约0.4μg/ml的浓度提供。

向无血清培养基中加入硒，以补充通常由血清提供的微量元素硒。硒的添加浓度为约10^-9M到约10^-7M；最优选约5.3 x 10^-8M。

氨基酸L-谷氨酰胺存在于一些营养物质基中，当不存在或量不足时，可以添加。L-谷氨酰胺也可以稳定形式添加，例如以商标GlutaMAX-1^TM(Gibco BRL，Grand Island，NY)出售的那种。GlutaMAX-1^TM是L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的稳定二肽形式，可以与L-谷氨酰胺互换使用，可以等摩尔浓度添加，作为L-谷氨酰胺的替代品。在储存过程和孵育期间，该二肽能随时间给L-谷氨酰胺提供稳定性，防止降解，避免在培养基中L-谷氨酰胺的有效浓度不确定。通常，该基础培养基补充以优选约1mM到约6mM，更优选约2mM到约5mM，最优选4mM的L-谷氨酰胺或GlutaMAX-1^TM。

还可以向该培养基加入生长因子例如表皮生长因子(EGF)，通过细胞按比例增加和接种来辅助培养物的形成。可以使用天然形式或重组形式的EGF。当制造不包含非人生物成分的皮肤等同物时，优选在该培养基中使用天然或重组的人EGF。EGF是一种任选的成分，可以约1到约15ng/mL，更优选约5到约10ng/mL的浓度提供。

上述培养基通常如下面所述制备。但是，应该理解，本发明的各成分可以使用与其物理性质相容的常规方法制备和组装。本领域公知:出于可获得性或经济目的而使用适当的类似物或功能上等同作用的试剂来取代某些成分，并且可以达到类似的效果。当用于实施本发明时，可以用具有类似质量和结果的重组或合成的生长因子代替天然存在的生长因子。

本发明的培养基均为无菌的。无菌成分可购买，或用常规方法除菌，如制备后过滤除菌。正确的无菌操作在以下实施例的全程中使用。混合DMEM和F-12，然后加入各个成分以补充培养基。所有成分的原液储存于-20℃，但营养源可以储存于4℃。所有原液以上文所列的500X终浓度制备。胰岛素、转铁蛋白、和三碘甲腺原氨酸(均来自Sigma)的原液均如下制备:三碘甲腺原氨酸先溶于2:1的无水乙醇与1N盐酸(HCl)中。胰岛素溶于稀HCl(约0.1N)，转铁蛋白溶于水。然后将这三者混合，用水稀释至500X浓度。乙醇胺和o-磷酰-乙醇胺溶于水至500X浓度并过滤除菌。孕酮溶于无水乙醇并用水稀释。氢化可的松溶于无水乙醇并用磷酸盐缓冲液(PBS)稀释。硒溶于水至500X的浓度并过滤除菌。EGF为无菌商品，将其溶于PBS。腺嘌呤难以溶解，但可用本领域技术人员已知的任何多种方法溶解。可加入人血清白蛋白(HSA)或牛血清白蛋白(BSA)，从而维持孕酮和EGF原液的活性，延长保存时间。培养基可在制备好后马上投入使用，也可储存于4℃。如果是储存，先不加EGF，使用前再加。

通过向培养仪器中吸取，倾注或泵送的形式向培养物供应新鲜培养基。通过使培养基与培养的皮肤构建体接触充足的时间，通常约为6小时到3天或更多，发生培养基的调节，以使构建体从新鲜的培养基吸收或摄取营养物质等等以及向培养基中分泌细胞因子。由于培养的皮肤构建体处于一种恒定的代谢状态，因此只需要短暂的时间来调节该培养基。优选使构建体和培养基彼此接触进行交换，直至新鲜培养基中的营养物几乎耗尽为止。

在每次新鲜培养基与经调节的培养基交换时，通过吸取，抽出，倾注，引流，虹吸或泵送的方式从培养物中取出并收集经调节的培养基。在构造培养的皮肤等同物时，当真皮成纤维细胞和表皮细胞一起存在于该构建体中时，优选从含有该构建体的仪器中收集经调节的培养基。经调节的培养基的收集物可以作为单独的收集物分别地使用，或合并在一起使用。经培养的皮肤构建体的发育以一些事件为标志，所述试剂会产生经调节的培养基，该培养基在各个收集点具有不同细胞因子谱。作为单独的收集物，经调节的培养基会具有某些细胞因子，可能是特定处理适应症或产物所期望的。当通过将收集物合并在一起而进行组合时，经调节的培养基将有大范围适于处理法或产品的细胞因子。

本发明细胞因子收集的另一形式来自于吸收垫，其位于膜的下面，皮肤构建体形成在该膜上。该垫放置在该膜之下，当培养物上升到气-液界面时，其通过毛细作用在空中将培养基带到膜上，辅助角质形成细胞层的角质化。该垫可以是任一吸收性材料，但优选无毒的并且和细胞培养物相容，例如棉花。参见图1，该垫沿着膜24的底面排列，在外室60底部上的膜24之间。该垫显示具有更高浓度的某些细胞因子。但是并不希望被理论束缚，因为该垫是紧密地对着该发育的皮肤构建体，其能收集许多由该皮肤构建体分泌的细胞因子。虽然仍然位于该垫上，但是当其被用作绷带或绷带部分时可以使用该细胞因子，或可从该垫上提取或引流出来。

一旦收集，经调节的培养基可以按照收集的状态使用，或在该培养基上进行进一步加工用于纯化，或轻松施用，或在使用之前储存。可以冻干或蒸发经调节的培养基，以去掉组合物的液体或水的部分。去除水后经调节的培养基呈现晶体粉末形式，含有培养的皮肤试剂:细胞因子，蛋白质和胞外基质成分，并且体积缩小。该形式使其更易制备含有较高剂量的培养的皮肤试剂组合物的产品而不用稀释该制剂，由于其体积减小因此使其更易储存。

还可以使用过滤法，特别是利用分子量截流或一系列分子量滤器的过滤法浓缩经调节的培养基。分子量滤器的使用可以去掉在培养基中存在的大成分例如白蛋白，以及在血清中存在的某些大分子量成分，细胞和细胞碎片。尽管并非必要，但是可能期望在用较小孔滤器过滤之前预先过滤经调节的培养基以去掉这些较大的成分，防止阻塞以及削弱随后使用的任一滤器的过滤能力。可以使用其它过滤及透析方法，从细胞产物组合物中去掉盐。例如，可以使用切向流过滤来提高经调节的培养基中的培养的皮肤试剂的浓度。此外，可以使用切向流过滤减少经调节的培养基中的盐浓度。由于经调节的培养基的含水成分被去除，为减少盐的浓度，以水代替。实际上，培养的皮肤试剂的浓缩及盐浓度的降低可以重复至少一次，以便有效地洗掉培养的皮肤试剂的盐。该培养的皮肤试剂可被进一步纯化，破碎或偶联，以形成纯的细胞因子，蛋白质，或胞外基质组合物，或被增强用于直接运送到特定组织，组织结构或细胞类型。该培养的皮肤试剂的纯化及盐浓度的降低使其更相容，因此优选用于配制本发明的局部制剂。

含有由皮肤构建体产生的细胞因子的经调节的培养基，或单独的本发明细胞因子可用于细胞培养。含有细胞因子的经调节的培养基被用于通过增进存活的新皮肤细胞的细胞增殖及产生培养及维持细胞系，控制干细胞及祖细胞的增殖和分化，以及间充质分化(例如间充质细胞到肌细胞的分化)。经调节的培养基还被用于制造其它用于以特定层或方向抑制或刺激细胞生长的组织构建体。经调节的培养基的作用是浓度依赖性的，较高的浓度会比较低浓度获得更大的作用。

本发明的培养的皮肤试剂组合物特别适用于处理皮肤所用的制剂。因此，本发明的一个优选实施方式包括用作药物制剂或皮肤护理产品的经调节的细胞培养基，该培养基含有下列的任何一种或多种:细胞因子，蛋白质以及胞外基质成分，其由被培养的皮肤细胞合成及分泌。在另一优选实施方式中，本发明是一种皮肤护理组合物，包含培养的皮肤试剂和载体试剂，所述培养的皮肤试剂由培养的皮肤细胞合成及分泌。含有所述培养的皮肤试剂的组合物类型的配制方法取决于所述试剂的特定形式及其预定用途。上皮组织处理领域的技术人员能够确定将配制在药物或化妆品制剂中的培养的皮肤试剂的有效量。在一种优选实施方式中，本发明是一种用于护理及改善皮肤外观的化妆品制剂，用于局部施用到皮肤，其含有经调节的培养基成分。该化妆品制剂可用作下列非限制性产品实例或作为其一种成分:保湿剂，晚霜，粉底霜，晒黑霜，防晒剂，护手霜，化妆品及化妆品基，面膜或油膏。

本发明的一个特别的益处是在人体局部施用组合物于皮肤，用于增进皮肤细胞，即角质形成细胞及成纤维细胞的产生及增殖，减少表皮细胞衰老及维持皮肤合成胞外基质成分，或二者兼有。该方法不需要对完整皮肤进行预先处理以刺激细胞生长，使其成为一种特别简易的皮肤局部施用方法，不需要通过整形外科技术或任何方式的创伤来磨损完整皮肤。但是，在本发明的一个优选实施方式中，该皮肤被预先处理，去除了全部或几层角质层。该预处理可以是机械的，例如用微粒擦洗器、丝瓜穰(loofa)等等擦除，也可以是化学的，包括生物化学的，例如角质层溶解剂，例如α-羟酸或维生素A(retin-A)处理，或用化妆品学可接受的油处理。还可以实行使用机械、化学或激光手段的手术擦除。

用于本发明方法的培养的皮肤试剂制剂最优选以适当组合物的形式施用，该组合物含有来自经调节的培养基的培养的皮肤试剂和载体试剂。该载体应该是基本上惰性的，因此不与培养的皮肤试剂反应而削弱其活性。优选该载体能增强及改善细胞因子向皮肤的渗透性，以提高其效力。合适的惰性载体包括水，聚乙二醇，矿物油或石油凝胶，丙二醇及本领域已知的其它试剂。

为制备本发明的药物组合物，将有效量的特定培养的皮肤试剂作为活性成分与药学可接受载体混合成紧密的混合物，该载体可以施用所需的制剂形式而采取多种形式。期望该药物组合物是单元剂型，特别是适用于局部的或经皮的施用。还包括固态制剂，打算在即将使用之前将其转化为液态制剂。在适合于经皮施用的组合物中，所述载体任选地含有渗透增强剂和/或合适的润湿剂，其可任选地与小比例的任何性质的适宜添加剂组合，所述添加剂不会对皮肤产生显著的有害影响。

由于本发明的培养的皮肤试剂通常是大分子，所以本发明的皮肤护理组合物还含有一种“渗透增强剂”，有时被称为“透过增强剂”，用于促进所述培养的皮肤试剂穿过角质层。渗透增强剂是能降低皮肤行使其屏障功能的能力的试剂。如果没有某种辅助，许多物质将不能以治疗有意义的速率和数量扩散到皮肤中。渗透增强剂使得皮肤更具有通透性，允许物质以更快的速率或更高的浓度，或既快速又高浓度地穿越皮肤。应当注意一种物质的特定渗入途径主要上取决于皮肤的状况和需要增强渗透的物质的理化性质。

人皮肤的通透性依赖于人之间以及身体不同的区域之间的差异。个体之间的通透性不同。患者的年龄可影响物质穿过皮肤的通透性。新生儿和老年人的皮肤比其它年龄组具有更强的通透性。虽然不希望被理论束缚，但是种族也是一种皮肤通透性的因素；例如，白种人的皮肤比美裔非洲人的更具通透性。身体各区域之间的通透性不同。最具通透性的区域是粘膜，阴囊皮肤和眼睑。中度通透性的区域包括面部，头部，胸部，背部，臀部，腹部和上臂及腿部。通透性最小的区域是手掌及脚底表面及指甲。通透性随皮肤或状况而变。含水皮肤比干燥皮肤更具通透性。例如，水是一种渗透增强剂。通过提高角质层的水合，皮肤的屏障功能可被降低，因此提高皮肤通透性。阻塞剂能抑制正常的经表皮的水分丢失并增加皮肤的通透性。通过利用阻塞剂，天然的皮肤水合作用就变成一种自然的渗透增强剂。在破裂或受刺激的皮肤中，物质可以更轻易地绕过角质层，从而提高通透性。温暖的皮肤更具通透性。刚刚被晒伤的皮肤通透性较弱，但如果发生脱皮则通透性增强。热烫伤的皮肤更具通透性。受湿疹影响的皮肤区域显示出增强的通透性。受牛皮癣影响的皮肤区域更厚，通透性较弱。化学去皮法能去除角质层并且增强皮肤的通透性。不仅渗透增强剂的效果会在各皮肤类型和皮肤状况之间变化，而且渗透途径也会根据渗透增强剂及需要渗透增强的物质而有不同。

有一些主要途径，通过该途径，物质可以越过皮肤未破损的角质层并到达系统循环。一种直接途径称作跨细胞途径，通过直接经过磷脂膜和死亡的角质形成细胞(构成角质层)的胞质，物质跨过皮肤。尽管这是最短距离的路径，但是物质仍可能遇到显著的渗透阻力，这是由于该药物必须越过每个细胞的亲脂膜，然后是含有角蛋白的亲水性细胞内容物，然后又是该细胞的磷脂双层。必须经过包含角质层的大量细胞意味着该阻力在有些情况下会较高。一些渗透增强剂能从皮肤中去除脂类，暂时破坏皮肤的屏障功能。其它化学物质可以更复杂的方式增强渗透，其是通过抑制角质层形成或促进其破裂，来削弱皮肤的屏障功能，或许还能增强渗透。

穿过皮肤的另一途径是通过胞间途径，凭借该途径穿过皮肤的物质必须经过皮肤细胞之间的小间隙，因此该途径更为曲折。尽管角质层的厚度只有约20μm，但是大多数分子穿过皮肤的实际扩散路径在400

μm的数量级。渗透分子的实际路径增加了20倍，大大地降低了渗透速率。

渗透的另一途径是毛囊途径。毛囊穿过角质层到达真皮，允许更直接到达真皮基质中的细胞。毛囊渗透增强剂通过在毛孔浓缩并通过皮肤分配而靶向毛囊运送，将试剂携带到角质层下面的皮肤细胞。毛囊途径取决于皮肤中毛囊的存在。

渗透增强剂可以区分为各类型，例如“毛囊渗透增强剂”，“化学渗透增强剂”和“活性渗透增强剂”。

毛囊渗透增强剂的实例包括磷脂酶A2和磷脂酰胆碱依赖性的磷脂酶C。

化学渗透增强剂的实例包括醇，比如乙醇，甲醇，和异丙醇；氯仿；薄荷醇；萜烯；丙酮；去污剂；碱；丙二醇；吡咯烷酮；二甲基乙酰胺；二甲基甲酰胺；二甲亚砜；烷基亚砜；氧化膦；表面活性剂；己内酰胺，比如azone；胺和酰胺；烷基N，N-分布的氨基醋酸酯；癸甲基亚砜；吡咯烷酮；pirotiodecane(HPE-101)；benzlyalkonium；benzylalkoniumchloride；基于硅酮的聚合物；脂肪酸；环状尿素；萜烯；和环糊精；和角质溶解剂(keratinolytics)比如水杨酸尿素。优选的基于硅酮的渗透增强剂包括环状聚二甲基硅氧烷和含聚氧乙烯或聚氧丙烯侧链的聚二甲基硅氧烷(PEG/PPG-18/18聚二甲基硅氧烷)。

活性渗透增强剂的实例包括脂质体，富勒烯(fullerenes)和磷脂，例如在Waugh的美国专利申请20040220100中描述的那些磷脂。

还可以使用物理技术增强本发明的皮肤护理试剂的通透性，包括离子电渗，超声波，电穿孔，胶带剥离，基因枪或其它推进设备的使用，尖齿例如用于TB尖齿测试的尖齿或能刺穿皮肤外表面的微针头，或能去除皮肤外层的擦除剂。

优选的化学渗透增强剂是基于硅酮的聚合物。用于本发明的优选的基于硅酮的聚合物选自:环状聚二甲基硅氧烷和含聚氧乙烯或聚氧丙烯侧链的聚二甲基硅氧烷(PEG/PPG-18/18二甲聚硅氧烷)。可以鉴定其它基于硅酮的聚合物并与掺入含有培养的皮肤试剂的制剂，以帮助培养的皮肤试剂渗入到个体的皮肤中。不希望由理论束缚，但是基于硅酮的渗透作用的机理是:基于硅酮的聚合物能在皮肤上提供一种水分屏障，因此与没有基于硅酮的聚合物相比，该皮肤的水合程度更高。正如以上的讨论，水合皮肤比干燥皮肤通透性更强，通过增强角质层的水合作用降低了皮肤的屏障功能，因此皮肤通透性有所增强，允许培养的皮肤试剂通过，进入皮肤层。

除直接局部施用培养的皮肤试剂制剂之外，本发明的组合物能通过其他的方法局部施用，例如，包封在温度和/或压力敏感的基质中或在可溶于体液的膜或固体载体等等中，用于随后的释放，优选持续释放活性成分。

作为适于局部施用的组合物，可以提到通常用于局部施用治疗剂的所有组合物，如霜，胶冻，敷料，洗发水，酊剂，糊，油膏，软膏，粉末，乳剂，液体或半液体的制剂等等。所述组合物的施用可以通过气溶胶，例如含有推进剂如空气，氮气，二氧化碳，氟利昂，或不含推进剂，例如泵送喷雾，喷雾器，液滴，洗液，或半固体，例如增稠的组合物可以通过拭子施用。具体的，半固体组合物例如软膏，霜，糊，胶冻，油膏等等可方便地使用。

如上所述，本发明的培养的皮肤试剂能够用于被认为是皮肤护理用途的许多应用，例如维持皮肤的年轻外观。一种维持这种外观的方法是停止或逆转皮肤细胞中的细胞衰老。许多研究显示:正常的二倍体细胞在体外连续传代期间会经历多次的细胞的，生理学的，生物化学的及分子的变化。大多数变化是渐进性和累积的，导致不可逆的增殖停滞，然后细胞死亡。这些变化已经被认为是体外细胞老化的标志。简而言之，体内以及体外老化可以总结为无法修复，导致细胞死亡。类似地，这些事件发生在体内，并能在皮肤上肉眼可见。许多研究人员正在研究停止或逆转衰老从而维持群体年轻、健康，以及患者组织中的合成和增殖的细胞。使用本发明的培养的皮肤试剂处理皮肤细胞，能导致在细胞中合成胞外基质成分以维持并恢复周围的胞外基质并支持它们。于是胞外基质的维持和恢复引起老化标记，包括细纹和皱纹外观的停止及逆转。

特别优选的是本领域公知用于在皮肤上局部使用的皮肤护理组合物，优选是低变应原性和pH控制的，包括盥洗用香水，面膜，洗液，润肤乳或乳液除所述培养的皮肤试剂之外本制剂还含有通常用于这类制剂的各种成分，起到培养的细胞因子的载体的作用。这种载体成分的实例是油，脂肪，蜡，表面活性剂，保湿剂，增稠剂，抗氧化剂，粘度稳定剂，螯合剂，缓冲液，防腐剂，香水，染料，低级烷醇等等。如果需要，可进一步向该组合物中掺入成分，如抗炎剂，抗细菌剂，抗真菌剂，消毒剂，维生素，防晒剂，抗生素，皮肤增白剂，修复增强剂/成纤维细胞增殖化合物，神经肌肉阻断剂，防晒剂，或其它抗粉刺剂。

作为种载体试剂的油的实例包括:脂肪和油，比如橄榄油和氢化油；蜡，比如蜂蜡和羊毛脂；烃化合物，比如液体石蜡，地蜡，和角鲨烯；脂肪酸，比如硬脂酸和油酸；醇，比如鲸蜡醇，硬酯醇，羊毛脂醇，和十六烷醇；以及酯，比如肉豆蔻酸异丙酯，棕榈酸异丙酯和硬脂酸丁酯。作为载体试剂的表面活性剂的实例，可以提到阴离子表面活性剂，例如硬脂酸钠，辛基硫酸钠，聚氧乙烯月桂基醚磷酸酯，N-酰基谷氨酸钠；阳离子表面活性剂，例如硬脂基二甲基苄基氯化铵和硬脂基三甲基氯化铵；两性表面活性剂，如盐酸烷基氨基乙基甘氨酸溶液和卵磷脂；以及非离子型表面活性剂，例如，甘油单硬脂酸酯，失水山梨醇单硬脂酸酯，蔗糖脂肪酸酯，丙二醇单硬脂酸酯，聚氧乙烯油基醚，聚乙二醇单硬脂酸酯，聚氧乙烯失水山梨醇醚单棕榈酸酯，聚氧乙烯椰油脂肪酸单乙醇酰胺，聚氧丙烯二醇(polyoxypropylene glycol)(例如以商标“Pluronic”销售的材料)，聚氧乙烯蓖麻油，以及聚氧乙烯羊毛脂。作为载体试剂的保湿剂的实例包括甘油，1，3-丁二醇，以及丙二醇；低级醇的实例包括乙醇和异丙醇；增稠剂的实例包括黄原胶，羟丙基纤维素，羟丙基甲基纤维素，聚乙二醇以及羧甲基纤维素钠。抗氧化剂的实例包括2，6-二叔丁基对甲酚，叔丁基对羟基茴香醚，没食子酸丙酯，柠檬酸，乙氧基喹，α硫辛酸，维生素C，维生素E，辅酶Q-10，和艾地苯醌(idebenone)；植物性抗氧化剂包括类胡萝卜素，例如番茄红素；类黄酮，水飞蓟素(乳蓟)、水飞蓟宾(silybin)、水飞蓟宁(silydianin)，水飞蓟亭(silychristine)；大豆(异黄素)，葡萄籽提取物；多酚，例如绿茶提取物，迷迭香酸(迷迭香)，金丝桃素(圣约翰草)，油橄榄苦素(橄榄叶)，姜黄素(curcurmin)(姜黄根)，四氢姜黄素(tetrahydrocurcumin)，和pycogenol海洋白皮松)。抗炎剂的实例包括抗炎植物药材，例如尿囊素，芦荟，银杏，绿茶(也被认为是一种抗氧化剂)。皮肤增白剂的实例是氢醌或曲酸。修复增强剂/成纤维细胞增殖化合物的实例包括铜肽或棕榈酰五肽(pal-KTTKS)。神经肌肉阻断剂的实例例如乙酰基六肽3(argireline)或二甲氨基乙醇。螯合剂的实例包括乙二胺四乙酸二钠和乙醇羟基二磷酸盐(ethanohydroxy diphosphate)。作为载体试剂的缓冲液的实例包括柠檬酸，柠檬酸钠，硼酸，硼砂和磷酸氢二钠；防腐剂的实例是对羟基苯甲酸甲酯，对羟基苯甲酸乙酯，脱氢乙酸，水杨酸和苯甲酸。

为制备油膏，霜，盥洗用香水，乳液等等，通常向该组合物中掺入约0.01到约90％，特别是约0.1到约20％，更特别是约0.2到约25％的活性成分，如培养的细胞因子。在油膏或乳膏剂中，举例来说该载体由以下组成:1到20％，特别是5到15％的保湿剂，0.1到10％，特别是0.5到5％的增稠剂和水；或者所述载体可以由以下组成:70到99％，特别是20到95％的表面活性剂，和0到20％，特别是2.5到15％的脂肪；或80到99.9％，特别是90到99％的增稠剂；或5到15％的表面活性剂，2-15％的保湿剂，0到80％的油，很少量(<2％)的防腐剂，着色剂和/或香水，以及水。在盥洗用香水中，举例来说该载体由以下组成:2到10％的低级醇，0.1到10％或特别是0.5到1％的表面活性剂，1到20％，特别是3到7％的保湿剂，0到5％的缓冲液，水以及少量(<2％)防腐剂，染料和/或香水。在乳液中，该载体通常由10-50％的油，1到10％的表面活性剂，50-80％的水以及0到3％的防腐剂和/或香水组成。在上述制剂中，所有的％符号指重量百分比。

用于本发明方法的具体组合物是这样的组合物:其中培养的皮肤试剂配制在含脂质体的组合物中，其中脂质体作为该培养的皮肤试剂的功能性载体试剂。脂质体是由两性分子形成的人造液泡，所述两性分子例如极性脂类，比如磷脂酰胆碱，乙醇胺以及丝氨酸，鞘磷脂，心磷脂，缩醛磷脂，磷脂酸以及脑苷脂。当适宜的两性分子能够在水或者水溶液中膨胀形成液晶时，就形成了脂质体，所述液晶通常是多层结构，包含由含水物质彼此分开的多个双层(也称作粗脂质体)。另一种类型的脂质体公知是由包封着液态材料的单个双层组成，称为单层液泡(unilame1lar vesicle)。如果在脂类膨胀期间水相中含有水溶性的材料，它们将被截留在脂双层之间的水层中。

水溶性的活性成分，例如培养的皮肤试剂的各种盐形式，被包封在该分子层之间的含水空间内。培养的细胞因子的脂类可溶性活性成分，例如有机模拟物，被主要地掺入该脂类层，尽管极性头部基团可能从该层中伸出到含水空间中。许多方法都能实现这些化合物的包封过程。最常用的方法涉及通过从有机溶剂的蒸发而将磷脂薄膜浇铸到烧瓶壁上。当该薄膜分散在适宜的含水介质中时，就形成了多层脂质体。适当的超声处理后，这种粗脂质体形成较小的类似闭合的液泡。

通常通过用化合物水溶液分散浇铸膜而掺入水溶性的活性成分。然后通过离心，层析法，透析或者其它本领域公知的适用方法去除这种未包封的化合物。通常在进行膜浇铸之前，将脂类可溶性活性成分与磷脂一起溶解于有机溶解中，从而将其掺入。如果在脂相中这种材料的溶解度不高于或者其存在的量不多于将要与其结合的化合物，则通过上述方法制备的脂质体含有的这种材料通常大部分都结合在脂双层中；并不要求从未包封的材料中分离这种脂质体。

在EP-A-253,619中描述了一种特别便利的方法，用于制备脂质体配制形式的治疗剂，其中含有培养的皮肤试剂，该文引入本文作为参考。在该方法中，含有包封的培养的皮肤试剂的单个双层脂质体按如下制备:将脂类成分溶解在有机介质中，在压力下将该脂类成分的有机溶液注射到含水成分中，同时用高速匀浆器或混合设备混合该有机和含水成分，于是自发地形成脂质体。

含有包封的培养的皮肤试剂的单个双层脂质体可以被直接使用，或可以在适当的药学可接受载体中使用，用于进行局部施用。脂质体的粘度可以通过加入一种或多种适当的增稠剂而增强，例如黄原胶，羟丙基纤维素，羟丙基甲基纤维素和其混合物。含水成分可以由单独的水组成，或其可含有电解质，缓冲系统及其他成分，例如防腐剂。可以使用的适用电解质包含金属盐，例如碱金属和碱土金属盐。优选的金属盐是氯化钙，氯化钠和氯化钾。电解质的浓度可从0到260mM，优选5mM到160mM。该含水成分置于适当的容器中，在有机成分的注射过程中，该容器通过强烈的旋涡而适用于实现匀浆。这两种成分的匀浆作用可以在该容器之内完成，或者该含水和有机成分可以独立地注射到该容器外面的混合设备中。在后者情况下，脂质体是在混合设备中形成然后被转移到另一容器进行收集。

有机载体成分由合适的无毒药学可接受溶剂，例如乙醇，甘油，丙二醇和聚乙二醇，和可溶于这溶剂的适当磷脂组成。可以使用的适当磷脂包含卵磷脂，磷脂酰胆碱，磷脂酰丝氨酸，磷脂酰乙醇胺，磷脂酰肌醇，溶血卵磷脂和磷脂酰甘油。可以使用其它的亲脂性添加剂以便选择性地改进脂质体特性。这种其它添加剂的实例包含硬脂胺，磷脂酸，生育酚，胆固醇和羊毛脂提取物。

此外，能防止磷脂氧化的其它成分也能被加到该有机成分中。这种其它成分的实例包括生育酚，丁基对羟基茴香醚，2，6-二叔丁基对甲酚，棕榈酸抗坏血酸酯和油酸抗坏血酸酯。还可以加入防腐剂，如苯甲酸，对羟基苯甲酸甲酯和对羟苯甲酸丙酯。

除了上述组合物，还可以使用覆盖物，如石膏，绷带，敷料，纱布垫等等，其中含有本发明组合物，所述组合物含有适当量的培养的皮肤试剂。在一些情况下，可以使用石膏，绷带，敷料，纱布垫等等，其中掺入了含有治疗性制剂的局部制剂。组织密封剂，例如用于辅助伤口闭合的手术胶也可以含有培养的皮肤试剂。组织密封剂的一种优选实例是血纤蛋白胶，这是由于其与细胞具有生物相容性。该密封剂可以是液态形式，适合于加入并混入培养的皮肤试剂组合物。当本发明的培养的皮肤试剂加入到密封剂中时，该组合物施用于伤口以帮助伤口闭合，细胞因子能通过密封剂施用部位的细胞促进创伤愈合。

在一个优选的用培养的皮肤试剂组合物处理皮肤的方法中，该培养的皮肤试剂组合物与包含渗透增强剂的载体混合用于形成皮肤护理组合物，所述渗透增强剂可以例如是硅酮，其是化学渗透增强剂的一种实例。将该皮肤护理组合物局部施用于表现皱纹外观的皮肤区域，处理皮肤以减少皱纹外观。优选重复地局部施用，至少每天一次，更优选每天两次组织学表明，当局部施用时，本发明的组合物能诱导皮肤中的成纤维细胞从头合成弹性蛋白并增加皮肤grenz区域层中的胶原。照像术显示皱纹外观有所减少。因此，本发明的一种方法是减少皮肤中的皱纹外观的方法，该方法包括向具有表现皱纹外观的区域的皮肤局部地施用该组合物，其中该组合物能诱导该区域中的皮肤细胞从头合成弹性蛋白，并且增加皮肤的grenz区域层中的胶原，使得皱纹外观减少。

在另一优选的用培养的皮肤试剂组合物处理皮肤的方法中，该皮肤已经首先经历过一次表面重修处理法。所有的皮肤表面重修处理基本上以同样的方式发挥作用。首先，剥离掉受损皮肤的外层。然后，由于在修复过程期间新细胞增殖并迁移到表面重修的区域，于是会呈现出更光滑、紧致、更显年轻的皮肤表面。在修复过程期间，来源于经调节的培养基的培养的皮肤试剂组合物被施用于接受过处理的区域，用于增强并加速皮肤修复及色素重新沉着。至于表浅的或中间的表面重修，去除的各层皮组织可被限制在表皮和真皮乳头。至于较深的表面重修，还可以去除网状真皮的上层。不同的穿透程度可以处理特定的斑点或皱纹。

在激光表面重修，有时叫做“激光去皮”过程中，使用二氧化碳(CO₂)激光一层一层地去除受损或者起皱皮肤的区域。以特定和受控的穿透水平，使用能蒸发受损皮肤上层的激光能量束进行激光表面重修过程。该方法通常用于将细纹外观减到最低程度，特别是嘴部和眼部周围；但是在处理面部的疤痕或者不均匀的色素沉着区域方面也有效。激光表面重修术还可以在整个面部或者在特定区域进行。通常，该方法与其他美容操作，例如拉皮手术或者眼睑手术结合进行。

通过受控的手术刮擦方法，“皮肤擦除术”和“皮肤光滑术”有助于整修皮肤的顶层。该处理法能软化不规则表面的锐边，赋予皮肤更光滑的外观。皮肤擦除术最常用于改善面部皮肤的意外残留疤痕或者以前的外科手术残留疤痕，或者消除面部的细小皱纹，例如嘴部周围的那些，不过有时也用于去除称作角质骨骼的癌前生长。在皮肤擦除术中，外科医生用附着于机械化摇柄上的粗糙钢丝刷或者带有金刚石颗粒的磨石刮擦掉皮肤的最外层。持续刮擦直至外科医生达到最安全的水平，使得疤痕或者皱纹不再可见。皮肤光滑术通常用于处理深的粉刺疤痕。在皮肤光滑术中，外科医生使用一种叫做皮刀(dermatome)的手持式仪器。类似于一种电动刮胡刀，该皮刀具有一个振动叶，往复式移动，以便均匀地撇去凹坑或其它面部缺陷周围的皮肤表层。持续撇去过程，直至粉刺疤痕或皱纹的最低点变得与周围皮肤更加均匀。皮肤擦除术和皮肤光滑术两者都能在皮肤的狭小区域或在整个面部进行。它们能够单独或和其它方法一起使用，例如拉皮手术，疤痕去除或修复术，或化学去皮术。

化学去皮术运用一种化学溶液通过去除面部皮肤的受损外层以改善和平滑面部皮肤的纹理。苯酚，三氯乙酸(TCA)和α羟酸(AHAs)可用于该目的。尽管化学去皮术可以和拉皮手术一起进行，但其并非是这种外科手术的替代，也不会防止或减缓老化进程。α羟酸(AHAs)，例如乙醇酸，乳酸或水果酸是最温和的去皮配方，会获得轻微的剥离。AHA去皮术可以用于处理细小的皱纹，干燥区域，不均匀的色素沉着和粉刺。可以每周或以更长时间间隔施用各种浓度的AHA，用于获得最佳成效。α羟酸，例如乙醇酸，还可以较小的浓度与含有细胞因子的面部洗液或霜混合，作为日常的皮肤护理方案的一部分，改善皮肤的纹理。三氯乙酸(TCA)可以多种浓度使用，不过最常用于中等深度的去皮术。细小的表面皱纹，表浅的瑕疵和色素问题通常用一种或多种TCA处理法处理。苯酚是最强的化学溶液，会产生深度的去皮效果，有时在紧接着的时期内能增亮接受过处理的区域并且影响皮肤色素沉着。其主要用于处理具有粗糙的面部皱纹，日光暴露所引起的带斑的区域或受损皮肤，或癌前生长的患者。

在皮肤表面重修方法之后，皮肤会变得非常红肿，伴随一些麻刺感，灼烧感，或疼痛；可以用药物控制疼痛。几天到一周时间内肿胀会减退，在接受过处理的区域上形成痂或硬皮，开始修复。当下面形成了一层新的，紧致的粉红色皮肤时，痂或硬皮就会脱落。当该过程结束时，外科医生可以决定施用含有培养的皮肤试剂组合物的保护性霜或油膏处理表面重修的皮肤，直至完成修复。如果在外科手术之后立刻施用油膏，几乎不会形成痂或完全不形成痂。外科医生还可以选择在最初的5-10天，在接受过处理的区域上施用绷带，其将覆盖并且保护正在修复的皮肤。施用于表面重修区域的含有培养的皮肤试剂组合物的油膏对患者有益:能提供维持年轻的皮肤细胞生长的生长因子，用于进行更快的修复，并且得到改善的美容效果。

提供下面的实施例以更好解释本发明的实施，而且无论如何它们不应被解释为对本发明范围的限制。本领域的技术人员会发现在不背离本发明的精神和范围时可以对这里所述方法进行多种修改。

实施例

实施例1:培养双层皮肤构建体以生产经调节的培养基

人新生儿包皮成纤维细胞(来自Organognesis Inc.Canton，MA)以5 x 10⁵个细胞/162cm²接种于组织培养处理的烧瓶(Costar Corp.，Cambridge，MA，产品目录号3150)并在生长培养基上生长。生长培养基的组成为:Dulbecco的改良Eagle培养基(DMEM)(高葡萄糖配方，无L-谷氨酰胺，Bio Whittaker，Walkersville，MD)，其中补加有10％新生小牛血清(NBCS)(HyClone实验室，Inc.，Logan，Utah)和4mM L-谷氨酰胺(BioWhittaker，Walkersville，MD)。将细胞置于培养箱于37±1℃，10±1％ CO₂气氛下维持。每2-3天将培养基更换成新制备的培养基。培养8天后，细胞长至汇合；即细胞沿组织培养瓶的底部形成紧密的单层，从培养瓶中将培养基吸出。将无菌过滤的磷酸盐缓冲液加到每个培养瓶的底部以冲洗所述单层，然后从瓶中吸出。向每个瓶中加入5ml胰蛋白酶-维尔烯(versene)谷氨酰胺(BioWhittaker，Walkersville，MD)并轻轻摇动以确保完全覆盖所述单层，使细胞从烧瓶上消化下来。将培养物放回培养箱。一旦细胞被消化下来立即向每个烧瓶中加入5ml SBTI(大豆胰蛋白酶抑制剂)并与悬浮液混合使胰蛋白酶-维尔烯的作用终止。将细胞悬浮液从烧瓶中移出并均分入无菌圆锥形离心管中。于大约800-1000g离心5分钟收集细胞。

使用类似于图1所示的仪器进行以下所述工作。手术前放好覆盖物维持无菌，进行手术时取掉该覆盖物。列举该仪器的有关信息:外容器10直径38mm，容积35ml，内容器20直径24mm，容积4ml。可渗透构件24由聚碳酸酯膜组成，孔径约3μm(微米)，厚度5μm(微米)。

如下述，在该可渗透构件24上形成无细胞的水合胶原凝胶25:16.2ml1OX极限必需培养基(MEM)，1.6ml 200mM L-谷氨酰胺，0.2ml50mg/ml庆大霉素，18.0ml胎牛血清，5.0ml71.2mg/ml碳酸氢钠的“预混合”溶液。按照上述排序，无菌地组合所述各原液，并在无菌的50ml试管中于4℃储存大约30分钟。将约27.8g溶于0.05％v/v乙酸中的1mg/ml胶原溶液(从小牛普通趾伸肌腱中通过酸提取得到)称量到50ml试管中，4℃储存30分钟。加入约8.2ml上述的预混合物和4ml DMEM完全培养基(含有10％ FBS，4mM L-谷氨酰胺，50μg/ml庆大霉素)，吸取1ml该等分物，加到内容器20的膜上，在室温下生成凝胶。

用人真皮成纤维细胞浇铸真皮层，即含细胞的水合的胶原凝胶，并如下所述接种人表皮(上皮)细胞。在Bell的美国专利4,485,096，Kemp的美国专利5,536,656和Parenteau的美国专利5,712,163中也有方法和试剂的一般说明。用于制备真皮层的浇铸混合物包含约8.2ml的上述预混合物，并同样如上文所述加入27.8g溶于0.05％v/v乙酸中的1mg/ml胶原溶液，和4ml密度为2.5 x 10⁵个细胞的人真皮成纤维细胞。吸取3ml等分物到容器20上面的无细胞水合胶原凝胶25上，使其形成凝胶。向外容器20中加入约4.5ml Dulbccco极限必需培养基(DMEM)完全培养基，在36℃/10％ CO₂条件下培养4到8天，使胶原收缩，形成收缩的胶原网格，作为真皮层52。

制备如下培养基，用于将表皮细胞结合到真皮层52的上表面，该过程称为表皮化(epidermalization)。按照类似于上面培养真皮成纤维细胞的方法培养并收集表皮细胞的单层培养物。表皮化培养基由3:1体积比混合的无钙DMEM和Ham′s F-12的基础混合物组成，并加入如下成分:1.1mM氢化可的松，5μg/ml胰岛素，5μg/ml转铁蛋白，20pM三碘甲腺原氨酸(T3)，1 x 10^-4M乙醇胺，1 x 10^-4Mo-磷酰乙醇胺，0.18mM腺嘌呤，2 x 10^-9M孕酮，5.26 x 10^-8M硒，0.3％新生小牛血清，10ng/ml表皮生长因子(EGF)。

浇铸组织等同物之后在第6天开始表皮化。从内容器20和外容器10上去掉含有真皮构建体的培养基。将50μl人表皮细胞悬浮液(大约3.33 x 10⁶个细胞ml)置于该真皮构建体上。然后在36℃和10％ CO₂条件下孵育容器4小时，然后向外室中加入12.0ml表皮化培养基，向孔中加入4ml。将培养物再放回同一培养箱。

表皮化后两天，向表皮化培养基配方中加入钙，诱导表皮层的分化。从培养皿上去掉经调节的表皮化培养基，放置，以分化培养基代替。分化培养基由3:1体积比混合的无钙DMEM和Ham′s F-12的基础混合物组成，并加入如下成分:1.1mM氢化可的松，5μg/ml胰岛素，5μg/ml转铁蛋白，20pM三碘甲腺原氨酸(T3)，1 x 10^-4M乙醇胺，I x 10^-4Mo-磷酰乙醇胺，0.18mM腺嘌呤，2 x 10^-9M孕酮，5.26 x 10^-8M硒，0.3％新生小牛血清，10ng/ml表皮生长因子(EGF)和1.8mM氯化钙。将培养物再放回同一培养箱。

在5天表皮化后，空气提升培养物，使培养的皮肤构建体的正在形成的表皮层表面处于气-液界面，也就是说，使该表皮表面接触空气。从平皿容器的内室和外室去除培养的分化培养基，放置，取出内容器，将棉垫放置在外室10的底板内部，向下室加入角质化培养基，浸透该棉垫。小心地将内容器20放回到该被浸透的棉垫上，确保在容器和垫之间没有气泡。角质化培养基由1:1体积比混合的无钙DMEM和Ham′sF-12的基础混合物组成，并加入如下成分:1.1mM氢化可的松，5μg/ml胰岛素，5μg/ml转铁蛋白，20pM三碘甲腺原氨酸(T3)，1 x 10^-4M乙醇胺，I x 10^-4M o-磷酰乙醇胺，0.18mM腺嘌呤，5.26 x 10^-8M硒，2.0％新生小牛血清，和2mM抗坏血酸钠。将培养的皮肤构建体放回培养箱，在35.5℃和10％ CO₂条件下培养。

每4天取出经调节的培养基，放置，以新鲜的加钙维持培养基代替。该维持培养基由1:1体积比混合的无钙DMEM和Ham′s F-12的基础混合物组成，并加入如下成分:1.1mM氢化可的松，5μg/ml胰岛素，5μg/ml转铁蛋白，20pM三碘甲腺原氨酸(T3)，1 x 10^-4M乙醇胺，I x10^-4Mo-磷酰乙醇胺，0.18mM腺嘌呤，5.26 x 10^-8M硒，和1.0％新生小牛血清。此时，在真皮层52的上表面形成了良好分层的表皮层28，其呈现正常的天然皮肤的许多形态学和生物化学特征。

使用细胞增殖，迁移和ELISA测定，检验从制造培养的皮肤构建体的过程中所收集的培养的表皮化、分化、角质化和维持培养基。

实施例2:通过人新生儿包皮成纤维细胞体外形成由内源产生的胶原基质所形成的皮肤构建体

通过双层皮肤构建体生产经调节的培养基，该构建体具有由真皮成纤维细胞内源性生产的基质，所述成纤维细胞描述在Murphy的国际PCT专利申请公开号WO 00/29553中，该公开文本引入本文。

培养人新生儿包皮成纤维细胞，扩充数目，从它们的基质中释放，计数，浓缩，然后重悬到3 x 10⁶个细胞/ml的浓度，在六孔板中以3.0 x10⁶个细胞/TW(6.6 x 10⁵个细胞/cm²)的密度接种于孔径为0.4微米，直径为24mm的组织培养处理的膜插入物上。用培养基维持该细胞，并每2-3天换以新鲜的培养基，培养25天。更具体地说，该培养基含有:DMEM和Hams F-12培养基(Quality Biologies，Gaithersburg，MD)的3:1的基础混合物；4mM GlutaMAX(Gibco BRL，Grand Island，NY)及添加剂:5ng/ml人重组表皮生长因子(Upstate Biotechnology，Lake Placid，NY)，0.4μg/ml氢化可的松(Sigma，St.Louis，MO)，1 x10^-4M乙醇胺(Fluka，Ronkonkoma，NY产品目录#02400 ACS等级)，1 x 10^-4Mo-磷酰乙醇胺(Sigma，St.Louis，MO)，5μg/ml胰岛素(Sigma，St.Louis，MO)，5μg/ml转铁蛋白(Sigma，St.Louis，MO)，20pM三碘甲腺原氨酸(Sigma，St.Louis，MO)，和6.78ng/ml硒(SigmaAldrich Fine Chemicals Company，Milwaukee，WI)，50ng/ml L-抗坏血酸(WAKO Chemicals USA，Inc)，0.2μg/ml L-脯氨酸(Sigma，St.Louis，MO)，0.1μg/ml甘氨酸(Sigma，St.Louis，MO)和0.05％聚乙二醇(PEG)(Sigma，St.Louis，MO)。

使用如上述形成的25天的真皮构建体，将正常人新生儿包皮表皮角质形成细胞接种在细胞-基质构建体的上表面，形成皮肤构建体的表皮层。从培养插入物上及其周围无菌地去掉培养基。使用来自冷冻的传代培养细胞储存物，按比例扩大以传代4次从而汇合的正常人表皮角质形成细胞。然后使用胰蛋白酶-维尔烯从培养皿释放细胞，合并，离心形成细胞沉淀，在表皮化培养基中重悬，计数并以4.5 x 10⁴个细胞/cm²的密度接种在膜顶部。然后在37±1°C，10％ CO₂下孵育该构建体约90分钟，让角质形成细胞附着。孵育之后，将该构建体浸在表皮化的培养基中。该表皮化培养基包含Dulbecco的改进型Eagle培养基(DMEM)(不含葡萄糖并且无钙，BioWhittaker，Walkersville，MD)和Hams F-12培养基(Quality Biologies，Gaithersburg，MD)的3:1的基础混合物，并补充有:0.4μg/ml氢化可的松(Sigma，St.Louis，MO)，1 x 10^-4M乙醇胺(Fluka，Ronkonkoma，NY)，1 x 10^-4Mo-磷酰乙醇胺(Sigma，St.Louis，MO)，5μg/ml胰岛素(Sigma，St.Louis，MO)，5μg/ml转铁蛋白(Sigma，St.Louis，MO)，20pM三碘甲腺原氨酸(Sigma，St.Louis，MO)，6.78ng/ml硒(Aldrich)，24.4μg/ml腺嘌呤(Sigma Aldrich Fine Chemicals Company，Milwaukee，WI)，4mM L-谷氨酰胺(BioWhittaker，Walkersville，MD)，50μg/ml L-抗坏血酸钠盐(Sigma Aldrich Fine Chemicals Company，Milwaukee，WI)，16μM亚油酸(Sigma，St.Louis，MO)，1μM醋酸生育酚(Sigma，St.Louis，MO)和50μg/ml硫酸庆大霉素(Amersham，ArlingtonHeights，IL)。该构建体在37±1℃，10±1％ CO₂条件下在该表皮化培养基中培养2天。

2天后用如上组成的新鲜培养基替换该培养基，放回到设定为37±1℃，10±1％ CO₂的培养箱中2天。2天后，含有该构建体的载体被无菌地转移到带有足量培养基的新培养盘中，使得液面水平刚刚到达该载体膜的表面，发育中的构建体处于气-液界面上。接触到形成中的表皮层上表面的空气能使上皮层分层。在37±1℃，10％ CO₂和低湿度条件下在培养基中孵育该构建体7天，并每2-3天更换培养基。该培养基含有Dulbecco改进型Eagle培养基(DMEM)(不含葡萄糖并且无钙，BioWhittaker，Walkersville，MD)和Hams F-12培养基(QualityBiologies，Gaithersburg，MD)1:1的混合物，并补充有:0.4μg/ml氢化可的松(Sigma，St.Louis，MO)，5 x 10^-4M乙醇胺(Fluka，Ronkonkoma，NY)，5 x 10^-4Mo-磷酰乙醇胺(Sigma，St.Louis，MO)，5μg/ml胰岛素(Sigma，St.Louis，MO)，5μg/ml转铁蛋白(Sigma，St.Louis，MO)，20pM三碘甲腺原氨酸(Sigma，St.Louis，MO)，6.78ng/ml硒(Aldrich)，24.4μg/ml腺嘌呤(Sigma Aldrich FineChemicals Company，Milwaukee，WI)，4mM L-谷氨酰胺(BioWhittaker，Walkersville，MD)，2.65μg/ml氯化钙(Mallinckrodt，Chesterfield，MO)，16μM亚油酸(Sigma，St.Louis，MO)，1μM醋酸生育酚(Sigma，St.Louis，MO)，1.25mM丝氨酸(Sigma，St.Louis，MO)，0.64mM氯化胆碱(Sigma，St.Louis，MO)和50μg/ml硫酸庆大霉素(Amersham，Arlington Heights，IL)。每2-3天给培养物补料，共14天。

将表皮细胞施用到真皮构建体后，从培养盘吸出含有发育中的皮肤构建体的经调节的培养基，并冷冻直到直接使用，或经过处理以浓缩或纯化细胞产生的皮肤试剂。

实施例3:向个体施用含有培养的皮肤试剂的组合物

为测定含有实施例1的经调节的培养基的局部霜对皮肤衰老的影响，将受试者入选到研究中，比较受试组合物与对照组合物，所述对照组合物不含有来自经调节的组织培养基的培养的皮肤试剂。用两种不同的霜制剂局部地处理志愿受试者。试验区被分成四个区域，即每个前臂肘窝远端两厘米处的区域和每个前臂肘窝近端两厘米的区域。

每个试验区每天处理两次，共60天。在施用期间将1毫升各自的霜施用于每个试验区。在60天末，从每个受试者上各试验区处获得各自的照片，此外从各试验区处获得2mm穿刺活组织检查物。这些活组织检查物在胰蛋白酶溶液中孵育十二小时，使表皮与真皮分离。表皮被分离后，接受流式细胞术分析，测定S相中的角质形成细胞百分比。

结果显示受试制剂相对于对照能明显增加细胞分裂速度，表明来自经调节的组织培养基的培养的皮肤试剂能发挥促有丝分裂作用，对衰老表皮细胞周期有逆转或停止作用。

为测定经调节的培养基组合物的强中胚层作用是否能产生真皮作用，进一步分析真皮的羟脯氨酸含量，作为细胞活动的一个间接量度。羟脯氨酸试验的数据显示:对照制剂似乎没有对真皮发挥统计学作用，而获自被培养的皮肤构建体的含有培养的皮肤试剂制剂的受试霜增加了羟脯氨酸含量。

实施例4:角质形成细胞的克隆密度培养:评价集落规模

评价来自培养的双层皮肤构建体的经调节的培养基对角质形成细胞迁移的作用，使用方法如Green H，Kchindc O，Thomas J:＂Growth ofhuman epidermal cells into multiple cpithelia suitable for grafting”Proceedings of the National Academy of Science USA 76:5665-5668(1979)中所教导，其引入本文作为参考。空气提升后(PAL)10到12天从培养的皮肤构建体上取出经调节的维持培养基。对照培养基是与新鲜的FAD培养基1:1混合的新鲜的、未经调节的维持培养基，和新鲜的FAD培养基(100％)；受试培养基是与新鲜的FAD培养基1:1混合的经调节的培养基。用I型胶原包被100mm或60mm培养皿。用1.5-5.O x IO⁵丝裂霉素处理过的3T3细胞接种到该胶原包被的平皿上作为饲养层。该3T3细胞培养在不含EGF的FAD培养基10％ FCS。

以每100mm平皿100个细胞或每60mm平皿50个细胞的密度接种角质形成细胞。每2-3天更换培养基，培养的第12天固定培养物。使用酸性品红染色平皿观察细胞，计数细胞，测定角质形成细胞集落的面积测量值。数据列于表1和图2。

该结果显示经调节的培养基对角质形成细胞集落大小和数目有显著作用，表明含有生物活性成分的经调节的培养基相对于新鲜的对照培养基能够增强角质形成细胞迁移。

实施例5:测量角质形成细胞增殖

为研究来自培养的皮肤构建体的经调节的培养基对角质形成细胞增殖的作用，使用实施例1描述的3T3培养系统。在包被了胶原的24-孔板上进行增殖试验。接种3T3饲养细胞到板中的FAD培养基。以1x 10³个细胞/孔接种角质形成细胞到该饲养层，培养9天，每2-3天更换培养基。受试的培养基条件是:

A.100％未经调节的维持培养基。

B.100％未经调节的维持培养基±10ng/ml EGF。

C.90％未经调节的维持培养基/10％ PAL 10到12天来自培养的皮肤构建体的经调节的维持培养基。

D.50％未经调节的维持培养基/50％ PAL 10到12天来自培养的皮肤构建体的经调节的维持培养基。

E.100％ PAL 10到12天来自培养的皮肤构建体的经调节的维持培养基。

增殖试验结果显示，如图3所示，条件E的培养基相对于条件B的含EGF的未经调节的培养基能增加增殖。此外，条件D的未经调节的和经调节的培养基的1:1混合物相对于条件C的未经调节的和经调节的培养基的9:1混合物增加了角质形成细胞增殖，条件C的培养基相对于条件A的100％未经调节的培养基具有更大的增殖作用。这些结果表明经调节的培养基含有不同于EGF的其它细胞因子，其能促进角质形成细胞增殖。

实施例6:血纤蛋白基质上经调节的培养基对细胞迁移的作用

使用Ronfard，V.和Barrandon，Y.的评价角质形成细胞迁移的方法进行细胞迁移测定，如国际PCT申请号WO 97/25617公开的，该方法引入本文作为参考。根据该方法在各平皿底上制备血纤蛋白凝胶基质。

在血纤蛋白基质的顶部，将1 x 10⁴个角质形成细胞铺板在50％DMEM±10％胎牛血清/50％受试培养基中。测试的受试培养基是:不含EGF的对照培养基，含有EGF的对照培养基和经调节的培养基。培养物在37℃孵育20-24小时，固定，随着螺旋转角计数迁移的细胞，该转角是细胞迁移到血纤蛋白凝胶基质的过程中形成的。细胞迁移数据列于图4和5。图4显示粘附细胞数目，包括血纤蛋白基质上静止的细胞和以螺旋状模式迁移的运动细胞。图5显示运动细胞在血纤蛋白基质上造成的螺旋转角的平均数。在经调节的培养基(ACM)中的细胞与含EGF的新鲜对照培养基形成的转角几乎一样多，显示存在诱导细胞运动性的生长因子作用，表明经调节的培养基(ACM)也含有生长因子。

实施例7:其它细胞的细胞增殖

使用在Kratz和Haegerstrand:＂Conditioned Medium from CulturedHuman Keratinocytes Has Growth Stimulatory Properties on DifferentHuman Cell Types.Journal of Investigative Dermatology，97:1039-1043(1991)中所述的方法，进行内皮细胞，平滑肌细胞和真皮成纤维细胞的细胞增殖测定，该文献的教导引入本文作为参考。

当用获自培养的皮肤构建体的条件培养基培养内皮细胞时，相对于对照培养基中培养的内皮细胞，显示出更强的增殖活性。内皮细胞增殖数据列于图6。

在下面的培养基条件中(分别)测试平滑肌细胞和真皮成纤维细胞的增殖活性:

A.100％未经调节的维持培养基。

B.100％未经调节的维持培养基±10ng/ml EGF。

C.90％未经调节的维持培养基/10％ PAL 10到12天来自培养的皮肤构建体的经调节的维持培养基。

D.50％未经调节的维持培养基/50％ PAL 10到12天来自培养的皮肤构建体的经调节的维持培养基。

E.100％ PAL 10到12天来自培养的皮肤构建体的经调节的维持培养基。

平滑肌增殖试验结果列于图7，真皮成纤维细胞增殖试验结果列于图8。对于这两种测试的细胞类型而言，来自培养的皮肤构建体的经调节的培养基刺激细胞增殖的水平高于未经调节的培养基，含有更高浓度经调节的培养基的培养物中，具有增加的增殖作用。该结果表明培养的皮肤构建体能产生生物活性细胞因子，其对细胞增殖有显著作用。

实施例8:ELISA

使用ELISA表征在经调节的培养基、未经调节的对照培养基、空气提升培养物使其处于气-液界面过程中所用棉垫、和获自培养的皮肤构建体的细胞提取物中的细胞因子。具体地，针对照组细胞因子测定碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，角质形成细胞生长因子(KGF)和转化生长因子α(TGFα)，所述对照细胞因子为:KGF(R&D Systems，产品目录#DKG00)；bFGF(R&D Systems，产品目录#DFB00)；和TGFα(α)(Oncogene Research Products，产品目录#QIA61)。

结果如图9所示，表明:新鲜的未经调节的培养基之中存在少量的TGFα，而经调节的培养基也含有KGF，bFGF，和高于对照水平的TGF

α，表明培养的皮肤构建体的细胞在受调节过程中能产生这些细胞因子并将其沉积到培养基中。棉垫(通过从其中挤出培养基而获得经调节的培养基)具有甚至更高浓度的bFGF和KGF，以及几乎相同量的TGF α。该结果也表明:获自培养的皮肤构建体的细胞提取物比对照培养基含有更高水平的全部三种成分，再次强调了使用培养的皮肤构建体刺激伤口愈合过程的作用。

实施例9:纯化/浓缩

使用超滤细胞滤器过滤来自实施例1的经调节的培养基，去掉培养基中的大分子量成分。使用Amicon 8050超滤细胞产品进行超滤，该产品带有一个上室以及一个下室，其间由一个分子量截止滤器分隔。经调节的培养基被置于许多超滤单元的上室，使用压缩氮气迫使其通过过滤膜。将经调节的培养基保留物加入到新鲜的未经调节的培养基中，加入角质形成细胞培养物，测试其与新鲜的不带该保留物的培养基相比的增殖能力。在含经调节的培养基滤液的新鲜培养基中培养的细胞相对于对照物显示出更强的增殖能力。

实施例10:经调节的培养基(ACM)对人角质形成细胞迁移的作用不依赖于EGF-受体途径。

为测试经调节的培养基对角质形成细胞培养物导致的迁移作用是否是由于EGF，进行如下实验。收集实施例1中的维持培养基，分别使用，因为新鲜的维持培养基开始时不含EGF。在100mm板中使人角质形成细胞生长至汇合，然后胰蛋白酶化获得细胞悬浮液。在1ml存在(GSR或ACM1R)或缺乏(GS或ACM1)浓度为10μg抗体/10⁴个细胞/ml培养基的中和性抗EGF受体抗体(Upstate Biotechnology，目录#05-101)的培养基中，在室温下孵育细胞0.5小时。然后，细胞铺板到血纤蛋白基质上，测试其迁移的能力，如先前实施例6所述。测试含有或不含EGF(10ng/ml)的未经调节的(GS)或经调节的培养基(ACM)。结果列于图10，代表三次实验。

该结果表明培养的人角质形成细胞能产生一种或多种刺激培养的人细胞迁移的因子，该作用类似于EGF的作用。但是，EGF抗体的加入(这样能够阻断EGF作用)并未消除ACM的作用，表明经调节的培养基的效果并非由EGF引起。该结果强调ACM能产生一种或多种不同于EGF的因子，其会显著诱导角质形成细胞按照体内皮肤处理的需要迁移。

实施例11:制备含培养的皮肤试剂的皮肤护理组合物以及在皮肤表面重修术后处理患者

开发含来自实施例1的培养的皮肤试剂的局部制剂，作为皮肤护理产品，用于通过控制激光表面重修术之后的发红以及不适的程度，加速患者复原。测试该局部制剂，发现包含至少如下成分:FGF-1(成纤维细胞生长因子)，IL-1α(白介素)，IL-6(白介素)，IL-8(白介素)，IL-11(白介素)，TGF-β1(转化的生长因子)，TGF-β3(转化生长因子)，GMCSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)。

在无菌条件下，以40％v:v将浓缩的培养的皮肤试剂加入凝胶皮肤护理基料(载体)形成受试产品，所述基料由以下成分组成:羧甲基纤维素钠，氯化钠，三水乙酸钠，冰醋酸，对羟基苯甲酸甲酯，对羟基苯甲酸丙酯，作为防腐剂的间甲酚，作为稳定剂的1-赖氨酸盐酸盐。

在十名健康受试者中评价激光表面重修术后施用该受试皮肤产品用于改善美肤结果的潜能。该研究是在美国三个临床中心进行的双盲多中心研究。在基线，全部十个受试者接受用Coherent Ultrapulse 5000C二氧化碳激光进行的激光表面重修术，其中采用六角形点大小2，密度6，功率300毫焦耳，单次通过，第一层之后擦抹。每人都在面部两侧在下眼睑接受处理。在术后14天，每一侧随机分配接受受试产品(载体中的皮肤护理试剂)或者单独的载体。因此，每一受试者充当他/她的自身对照。在激光表面重修术后第一个4天期间，在各自指定位点施用受试产品或对照后，下眼睑的两侧用Flexzan局部伤口敷料(Dow B.Hickam，Inc.，Sugar Land，TX)覆盖。其后，该受试者再施用受试产品或对照，直至研究第14天并且继续直至研究第90天。

在研究第2，4，10，14，30和90天评价下列临床指标:发红，水肿，上皮形成，患者不适，受试者满意度和整体美容效果。主要效力终点是在处理部位的红斑程度。次要终点是水肿程度，上皮形成，受试者不适，受试者满意度和整体美容效果。处理的确定由该受试者和研究者判断。在研究结束时，具有处理激光表面重修术患者的专业知识和经验的内科医师以盲法检查照片。红斑以4分标准进行评估:(1)没有，(2)轻度，(3)中度，(4)重度。通过临床观察和受试者询问评价安全性。

所有的患者在激光表面重修术之后几天内经历了中度到重度红斑和水肿以及不同数量的结硬皮。到手术后10天，受试产品组的平均红斑得分(通过照片评定)少于对照，并在该研究的整段时期内保持如此。平均六次随访的累积红斑得分在受试产品处理组中是1.85，对照处理组是1.91。手术后90天所有的受试者回到基线评估值。使用单侧t-检验统计分析，该差异并非统计学显著的，但是小样本规模的固有限制有希望被未来采用其它受试产品制剂、更精细的方法以及更大的样本大小的研究克服。

实施例12:使用切向流过滤浓缩及脱盐

使用过滤法浓缩来自实施例1的皮肤培养物的收集的经调节的培养基。

经调节的培养基首先通过微孔膜过滤，去掉所有的大颗粒，例如细胞及细胞碎片。去除经调节的培养基中的大成分使得下游过滤更加有效。

用于浓缩收集的经调节的培养基的切向流过滤装置是一个闭环系统，包括一个进料槽，一个串联连接蠕动进料泵的出口，该泵又串联连接到一个过滤组件上，该过滤组件又串联连接到一个阀，该阀串联连接到进料槽的入口。进料槽也供连续进料之用，用于在去除滤液时维持系统体积。这些元件之间的连接是通过医学级管道。压力阀串联连接，位于该过滤设备的两侧。该过滤组件包含一个入口及一个出口，其串联过滤环。在过滤器的相对侧，有一个第二出口，从闭环系统中去除滤液。

从冷藏储存物(在大约4℃)处取出含经调节的培养基的储存容器，从储存容器倾注或泵入过滤系统的进料槽。一旦进料槽内具有足够体积的经调节的培养基，即打开泵。当培养基循环时，培养基是沿着膜表面切向地被泵送。施加的压力用来使一部分培养基通过膜到达滤液一侧，而太大以至于不能经过膜孔的颗粒及大分子保留在上游侧，被切向流扫除掉，因此被保留在循环中而不会堵塞在膜表面。

泵一直开着，以保证经调节的培养基通过过滤回路进行循环。在培养基经过膜表面的每次流通过程中，施加的压力迫使一部分流体穿越该膜到达滤液流，因此增加了该培养基中太大以至于无法经过该膜的分子量成分的浓度。经调节的培养基已经达到约2OX的浓度，也就是说，未过滤的(1X)经调节的培养基浓度的约二十倍，关掉泵。

该切向流过滤系统同样提供一种去除浓缩的经调节的培养基成分中的盐的系统及方法。向该过滤系统的进料槽加入无菌过滤的水，稀释经调节的培养基中的水溶性盐及大分子量成分。打开泵，使流体循环通过该系统，再次浓缩经调节的培养基，同时去除水溶性盐。当经调节的培养基中大分子量成分保持在系统中的时候，含有溶解了的盐的含水部分通过该过滤器并作为滤液被弃去。再次，经调节的培养基已经达到约2OX的浓度，也就是说，未过滤的(1X)经调节的培养基浓度的约二十倍，关掉泵。结果是包含过滤并浓缩了的经调节的培养基成分的保留物中盐浓度被降低。

实施例12:制备含培养的皮肤试剂及渗透增强剂的皮肤护理组合物并在光老化皮肤上测试

为测定含培养的皮肤试剂的受试制剂改善光老化皮肤外观的可行性，用10名35岁或更年长，除具有光老化体征外均健康的研究受试者，进行单中心、双盲、有对照的飞行研究。该研究针对的光老化是指在臂及手上的光损伤皮肤，在两个对侧手及臂上具有2个或更多的总体集合光老化评估(参见所附标准)。

通过向皮肤护理基料(载体)中加入浓缩的培养的皮肤试剂(20％v:v)和渗透增强剂，配制含有培养的皮肤试剂的受试制剂，该基料由广泛用于化妆品产品的成分组成。受试制剂的基础成分包括:纯净水，甲基丙烯酸聚甘油酯(AND)丙二醇，凡士林，二辛酰醚(Diccaprylyl ether)，PEG-5硬脂酸甘油酯，甘油，聚二甲基硅氧烷(AND)聚二甲基硅烷醇，鲸蜡醇，甜杏仁油，丙烯酸酯/丙烯酸C10-30烷酯交叉聚合物，醋酸生育酚，苯氧乙醇，苯甲醇，乙二胺四乙酸钠，氢氧化钠，乳酸。

这是受试产品与对照(仅仅用载体，作为安慰剂)的双盲、有对照的飞行研究。每个受试者都有一个内部对照(对侧肢体)及一个历史对照(基线)。受试产品的效果与每个受试者试验区的基线预处理评价以及其对侧肢体相比。10个受试者将进入研究，他们具有光老化的体征，这些体征是通过色素沉着，血管变化，萎缩，及皮肤松弛度的表现确定的，这是在半定量记分卡上评定的。这些研究受试者被要求在该研究之前两星期内停止在该处理部位使用任何局部试剂。在12周的随访，从他们的手臂的预鉴定的处理及对照位点在基线进行标准的4-6mm皮肤活组织检查。在第0天，给每个研究受试者提供一个处理包，其中含有受试霜的各试管，标记了“左”及“右”，用每个处理包中的试管上应用的标记“左”或“右”随机指定，记录具体的处理包中哪个试管含有受试产品以及哪个仅仅含有载体。该代码对研究受试者或者调查者保密，直至研究完成及数据分析。每个受试者的右或左臂/手都可以充当处理或对照。维持医疗包的顺次列表，当新的研究受试者编入该研究时，研究者可以为他们顺序地指定处理包。给研究受试者提供足量的受试产品及载体霜(安慰剂)，确保该研究期间够用。研究受试者被要求每天两次在前臂，腕及手背施用该受试产品及载体霜，坚持14个星期。告诉研究受试者每天在处理区域使用一种温和的肥皂及保湿剂。

在处理之前-14天，第0天，4星期，8星期，12星期及14星期评价该研究受试者处理部位。在每次随访时，评价每个研究受试者的细小皱纹，粗皱纹，色斑色素沉着过度，雀斑，不规则的脱色，触觉粗糙，毛细血管扩张，弹性组织变性的外观以及总体集合评定。任一参数都以6分的标准分级。每次随访还进行处理的总反应，比较研究受试者的状况和基线状况，表示为7分的标准。另外，研究者会进行非侵入性的测定，用于评价该处理及对照位点。这些包括照像(数字式，交叉极化，紫外的)，分光术及cutometry。分光术及cutometry是非侵入性测量，涉及在处理部位的皮肤上安插探针。激发荧光分光术使用一种光源及一种光电倍增管，检测发色团例如胶原，弹性蛋白的内源荧光及细胞增殖标记。Cutometry通过小探针末端产生的吸力测量皮肤弹性。还评价研究受试者的孔大小的存在及光老化相关病变(即，光化性角化病)，研究者可以在图表中标记是否存在这些病变及该研究霜是否改变它们。在第14星期，研究受试者完成调查表用于与基线状况相比较地评价皮肤的美容外观，以及用于评价其关于该研究霜的意见。每次随访时，询问研究受试者是否经历了该研究开始后可能会发生的任何副作用，药物的变化，或在任何方法中的偏差。

为了明确和理解，通过举例说明和实施例详述了以上发明，但显然对于本领域技术人员来说，在所附权利要求书的范围内可进行特定的变化和修饰。

Claims (42)

1.用作药物制剂或用作皮肤护理产品的组合物，含有

(a)载体基料；

(b)经调节的细胞培养基，其含有由培养的角质形成细胞以及成纤维细胞合成并分泌的一种或多种培养的皮肤试剂；以及

(c)渗透增强剂。

2.用作药物制剂或用作皮肤护理产品的组合物，含有

(a)载体基料；

(b)经调节的细胞培养基，其含有由培养的角质形成细胞以及成纤维细胞合成并分泌的一种或多种培养的皮肤试剂；

(c)渗透增强剂；以及

(d)抗氧化剂。

3.权利要求1的组合物，其中该角质形成细胞以及成纤维细胞是模拟天然皮肤构造的双层构造的共培养物。

4.权利要求3的组合物，其中该共培养物包含收缩的胶原网格中的成纤维细胞和所述收缩的胶原网格上排列的角质形成细胞。

5.权利要求3的组合物，其中该共培养物包含内源产生的基质中的成纤维细胞和所述基质上排列的角质形成细胞。

6.权利要求3的组合物，其中该共培养物包含胶原海绵状物中的成纤维细胞和所述胶原海绵状物上排列的角质形成细胞。

7.权利要求6的组合物，其中该海绵状物还含有糖胺聚糖。

8.权利要求3的组合物，其中该共培养物包含筛构件上的成纤维细胞和所述筛构件上排列的角质形成细胞。

9.权利要求1的组合物，其中渗透增强剂是化学渗透增强剂、活性渗透增强剂，或毛囊渗透增强剂。

10.制备含有经调节的细胞培养基的制剂的方法，所述培养基含有由培养的皮肤细胞产生的一种或多种培养的皮肤试剂，该方法包括:

(a)在含有营养物质的培养基内培养皮肤细胞以使皮肤细胞生长，诱导皮肤细胞合成并分泌一种或多种培养的皮肤试剂到培养基中；

(b)将含一种或多种培养的皮肤试剂的经调节的培养基与培养的皮肤细胞分离开；以及

(c)制备含有经调节的培养基的制剂，所述培养基含一种或多种培养的皮肤试剂。

11.制备含有经调节的细胞培养基的制剂的方法，所述培养基含有由培养的皮肤细胞产生的一种或多种培养的皮肤试剂，该方法包括:

(a)在含有营养物质的培养基内培养皮肤细胞以使皮肤细胞生长，诱导皮肤细胞合成并分泌一种或多种培养的皮肤试剂到培养基中；

(b)将含一种或多种培养的皮肤试剂的经调节的培养基与培养的皮肤细胞分离开；以及

(c)增加经调节的细胞培养基中的培养的皮肤试剂的浓度；

(d)降低所述经调节的培养基中的盐浓度

(e)制备含有经调节的培养基的制剂，所述经调节的培养基含一种或多种培养的皮肤试剂。

12.权利要求11的方法，其中所述皮肤细胞是以模拟天然皮肤构造的双层构造共培养的角质形成细胞以及成纤维细胞。

13.权利要求12的方法，其中该双层构造包含收缩的胶原网格中的成纤维细胞和所述收缩的胶原网格上排列的角质形成细胞。

14.权利要求12的方法，其中该双层构造包含内源产生的基质中的成纤维细胞和所述基质上排列的角质形成细胞。

15.权利要求12的方法，其中该双层构造包含胶原海绵状物中的成纤维细胞和所述胶原海绵状物上排列的角质形成细胞。

16.权利要求15的方法，其中该海绵状物还含有糖胺聚糖。

17.权利要求12的方法，其中该双层构造包含筛构件上的成纤维细胞和所述筛构件上排列的角质形成细胞。

18.权利要求11的方法，其中培养的皮肤试剂的浓度增加了5到30倍。

19.权利要求11的方法，其中培养的皮肤试剂的浓度增加了10到25倍。

20.权利要求11的方法，其中培养的皮肤试剂的浓度增加了15到20倍。

21.权利要求11的方法，其中步骤(c)及(d)同时进行。

22.权利要求11的方法，其中步骤(c)及(d)是重复进行。

23.权利要求11的方法，其中步骤(c)及(d)是使用切向流过滤进行。

24.权利要求11的方法，其中步骤(c)是使用切向流过滤进行。

25.权利要求11的方法，其中步骤(d)是使用切向流过滤进行。

26.权利要求11的方法，其中经调节的细胞培养基在浓缩之前被预过滤以去除细胞及细胞碎片。

27.含一种或多种培养的皮肤试剂的经调节的细胞培养基在制备药物制剂中的用途，所述培养的皮肤试剂由培养的皮肤细胞合成及分泌。

28.处理个体皮肤的方法，包括:将含有经调节的细胞培养基的组合物局部地施用于皮肤，所述培养基含有一种或多种培养的皮肤试剂，所述试剂由培养的皮肤细胞合成并分泌。

29.权利要求28的方法，其中所述个体的皮肤被处理从而增加细胞增殖和产生。

30.权利要求28的方法，其中所述个体的皮肤被处理从而降低皮肤中的细胞衰老的速率。

31.权利要求28的方法，其中所述个体的皮肤被处理从而减少所述皮肤中的皱纹和细纹。

32.权利要求28的方法，其中所述个体的皮肤被处理从而减少脂肪团。

33.权利要求28的方法，其中所述个体的皮肤被处理从而促进血管生成。

34.权利要求28的方法，其中所述个体的皮肤被处理从而治疗神经病。

35.权利要求28的方法，其中所述个体的皮肤被处理从而减少瘢痕形成。

36.权利要求28的方法，其中所述个体的皮肤被处理从而减少疤痕外观。

37.权利要求28的方法，其中所述个体的皮肤被处理从而促进毛发生长。

38.一种皮肤处理，包含用于增加细胞增殖和产生以及用于减少细胞衰老的局部施用的组合物，该组合物用经调节的细胞培养基配制，所述培养基含有一种或多种培养的皮肤试剂，所述试剂由培养的皮肤细胞合成并分泌。

39.用作药物制剂或用作皮肤护理产品的组合物，含有

(a)载体基料；

(b)经调节的细胞培养基，其含有培养的角质形成细胞以及成纤维细胞合成并分泌的一种或多种培养的皮肤试剂；以及

(c)基于硅酮的渗透增强剂。

40.权利要求39的组合物，其中所述基于硅酮的渗透增强剂选自:环状聚二甲基硅氧烷和含聚氧乙烯或聚氧丙烯侧链的聚二甲基硅氧烷。

41.权利要求39的组合物，其中培养的皮肤试剂浓缩、脱盐，并且显示近似中性的pH。

42.处理呈现皱纹外观的皮肤区域的方法，包括:

将含有经调节的细胞培养基的组合物局部地施用于呈现皱纹外观的皮肤区域，所述培养基含有一种或多种培养的皮肤试剂，所述试剂由培养的皮肤细胞合成并分泌，

其中局部施用至少一天一次，用于处理该皮肤区域，从而诱导皮肤内成纤维细胞在所述皮肤的Grenz区域中从头合成弹性蛋白，以加厚Grenz区域。

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