KR20110139644A - 인체유래 줄기세포 배양액 추출물을 포접시킨 리포좀을 함유하는 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인체유래 줄기세포 배양액 추출물을 포접한 저온공정 리포좀을 함유하는 화장료에 관한 것이다.
본 발명에 따른 저온공정 리포좀을 함유하는 화장료는 레시틴과 물을 초임계 이산화탄소를 이용하여 역마이셀(reverse micelle) 에멀젼을 형성시킨 뒤, 초임계 이산화탄소를 감압 기화시켜 리포좀 현탁액을 유도하여 저온 공정 리포좀에 인체유래 줄기세포 배양액 추출물을 함유시켜 제조된다.
그러므로 본 발명의 화장료는 일반적으로 리포좀 제조 시 고온에서 리포좀이 형성되어 열에 약한 유효성분이 불안정화 되거나 파괴되는 것과는 달리, 저온공정리포좀은 상온 및 저온에서 리포좀이 형성되어 유효성분의 활성을 유지할 수 있어 피부 미백 및 피부 주름개선 효과가 매우 우수하다.

Description

인체유래 줄기세포 배양액 추출물을 포접시킨 리포좀을 함유하는 화장료 조성물{Cosmetic Composition comprising human stem cell conditioned media extracts in supercritical liposome as Active Ingredient}

본 발명은 인체유래 줄기세포 배양액 추출물을 포접시킨 리포좀을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

피부의 중요한 기능은 자외선, 건조한 냉난방 환경 및 대기 오염 등과 같은 외부자극으로부터 인체를 보호하고, 체온조절, 호흡 및 배설작용 등의 다양한 역할을 수행하는 중요한 기능을 담당한다.

나이가 들면서 이러한 기능들은 점차 약화되고 피부의 노화가 진행된다. 특히, 피부 장벽의 기능을 수행하는 지질층의 지질조성과 함량이 변화하면서 그 기능이 급격히 저하되어 피부 수분 함량이 감소하게 되면 피부가 건조해지고 기미, 주근깨, 색소 침착 및 다양한 피부 병변이 유발된다. 또한 외부로부터 강한 자외선, 스트레스 및 영양결핍 등과 같은 자극을 받게 되면 피부는 주름생성, 탄력손실 및 각화 등과 같은 피부의 노화가 더욱 가속화 된다.

인체의 피부는 표피와 진피로 나뉘어져 있으며, 표피의 가장 아래에 있는 기저층에서 새로이 형성된 각질 형성세포는 아래층에서 위층으로 서서히 이동하면서 약 14일 이후에 각질로 변하게 되고, 다시 14일 정도 뒤에는 완전히 노화되어 허물이나 때가 벗겨지게 된다. 기저층과 연결되어 있는 진피는 표피에 수분을 공급하고, 피부의 탄력을 유지하는 역할을 하게 된다.

일반적으로, 피부탄력 감소, 피부주름 등의 피부노화 현상은 콜라겐의 파괴, 콜라겐 합성의 감소, 엘라스틴의 소실 등에 의해서 나타나는 것으로서, 피부 표피에서도 일어나지만 이보다는 진피에서 일어나는 현상이라고 볼 수 있다.

최근, 피부의 주름생성 원인 및 개선 방법에 대한 피부 생리학적 연구가 많이 행해지고 있으며, 실제로 화장료에 있어서 피부주름 방지를 위해 자외선 차단제, 항산화제, 세포활성촉진제 등이 사용되고 있고, 또한 콜라겐 합성에 따른 피부 주름개선 방법들이 제시되고 있다.

한편, 생화학 및 분자생물학의 발전을 기반으로 하여 우리 생체 내에 존재하는 성장인자와 같은 소량의 신호물질들이 발견되었으며, 이를 기반으로 한 생체의 노화이론이 재정립되고 있는 중이다. 또한 이 신호물질은 나이가 증가함에 따라 생체 내에서 감소하게 되는데 바로 이 성장인자의 감소가 우리의 노화와 밀접한 관계가 있다는 것이 밝혀지고 있다. 이러한 성장인자들은 각 조직의 기저에 존재하고 있는 줄기세포에서 다량 생산되고 있다.

우리 몸은 약 210여 가지의 세포들로 구성되어 있고 각각의 세포는 고유의 특성을 유지하면서 생명활동을 담당하고 있다. 모든 생명체가 생명이 있듯이 우리 몸의 각각의 세포는 수명이 있고 끊임없이 죽고 대신 새로운 세포로 채워지게 된다. 바로 이러한 과정을 가능하게 하는 것이 줄기세포이다.

줄기세포는 조직이나 기관의 분화된 세포들 사이에 존재하는 미분화 세포로써, 끊임없이 스스로 증식하는 자가 재생능력(Self Renewal)과 신체내의 모든 조직세포로 분화할 수 있는 능력(Differentiation to specific tissue)을 가진 만능세포이다. 성체줄기세포는 조혈모세포, 중간엽줄기세포, 신경모세포, 상피모세포 등이 존재하며 조혈모세포의 경우 혈구 및 임파구를 생산할 수 있는 모세포로서 혈액암을 포함한 면역계 질환 치료에 도움이 되고, 중간엽 줄기세포의 경우 뼈, 연골, 지방 및 섬유조직으로 분화되며 각 조직이 손상되었을 때 이들의 회복에 관여한다. 그러나 이러한 성체 줄기세포는 각각의 조직에 소량 존재하며 수년간 분열 혹은 증식을 하지 않고 잠잠하게 지내기도 한다. 즉, 줄기세포라 함은 이러한 분화능력은 가지고 있으나, 아직 분화는 일어나지 않은 '미분화'세포 이다. 이러한 미분화 상태에서 적절한 조건을 맞춰주면 줄기세포는 다양한 조직 세포로 분화할 수 있다.

줄기세포는 또 크게 배아줄기세포, 성체줄기세포로 나누어진다. 줄기세포는 출생 후부터 우리 몸에 있는 여러 종류의 조직에 존재하는 성체줄기세포(Adult Stem Cell)와 인간 생명의 시초가 되는 수정란에서 유래하는 배아줄기세포(Embryonic Stem Cell)의 두 종류로 구분될 수 있다. 성체줄기세포는 특정한 조직을 구성하는 세포로 즉, 골수세포는 혈구세포로, 피부줄기세포는 피부로, 신경줄기세포는 신경세포로만 분화되도록 운명이 정해져 있는 세포이다. 줄기세포가 어떤 세포로 분화되느냐 하는 것은 그 줄기세포를 어떠한 환경에서 배양하느냐에 따라 좌우된다.

인체유래 줄기세포는 배아줄기세포를 제외한 성체로부터 얻어지는 줄기세포를 의미하며, 예로서 지방, 골수, 제대혈 및 말초혈액을 포함하는 혈액 및 조직의 기저에서 기원되는 줄기세포를 모두 포함한다. 특히, 인간유래 지방줄기세포 배양액 추출물(Human adipocyte conditioned media extracts )은 지방조직에서 지방을 제거한 세포를 여러 세대 배양해 줄기세포를 분리해 낸 후, 줄기세포 배양액으로부터 줄기세포가 만들어낸 단백질을 얻을 수 있다. 이 단백질 혼합물에는 vEGF(혈관내피성장인자), TGF(형질전환성장인자), HGF(간세포증식인자), FGF(섬유아세포성장인자), IGF(인슐린유사성장인자) 등 150여 가지의 성장인자(growth factor) 단백질 성분을 포함하고 있는 것으로 보고되고 있다. 지방줄기세포는 성체줄기세포의 한 종류로써 골수줄기세포나 제대혈 줄기세포보다 채취하기가 쉽고 대량배양이 가능하면서도 줄기세포 함유량이 많기 때문에 지방 줄기세포가 가장 많이 활용되고 있다.

하나의 세포가 증식하고 다른 종류로 분화하는데 있어서 가장 중요한 역할을 하는 것이 바로 성장인자(growth factor)이다. 이 성장인자는 세포가 증식 또는 분화를 일으키는 신호를 세포 내외부로 전달하는 역할을 하며, 이러한 신호를 바탕으로 세포는 분열, 분화를 하게 되어 피부를 생생하고 생기롭게 가꾸어주며 언제나 피부의 컨디션을 신선하고, 최상으로 만들어주는 상태를 유지할 수 있다.

줄기세포로부터 만들어진 단백질들을 피부의 섬유아세포(fibroblast)에 처리하자 섬유아세포에서 생성되는 결합조직인 콜라겐의 양이 5배 이상 증가했으며, 섬유아세포 자체의 증식도 30% 이상 증가했다. 섬유아세포는 피부의 진피층을 형성하는 콜라겐을 생산하는 세포이며 콜라겐의 양이 줄어들면 피부 탄력이 줄고 주름이 늘어나는 특징을 가지고 있다. 줄기세포는 다 분화능을 지닌 세포로서 in vitro 뿐만 아니라 in vivo 조건에서 뼈, 연골, 인대, 지방, 심근, 근육 등의 세포로의 분화 능력을 지니고 있는 다분화능 세포이다. 이러한 다분화능 세포인 줄기세포는 각 조직 세포로의 분화기전 연구에 있어 좋은 모델로 이용되고 있을 뿐만 아니라, 현재 다양한 세포 치료법 개발에 이용되고 있다.

세포 치료 대상 세포로서의 응용적 측면에서 볼 때, 중간엽 줄기세포는 세포의 채취가 상대적으로 쉽고 안전하며 자가 이식이 가능하다는 점에서 배아줄기세포에 비해 많은 장점을 가지고 있다.

앞에서 언급한 장점들로 인하여 줄기세포를 이용한 심근경색, 골절, 연골 손상, 뇌졸중 등 다양한 질병의 치료법이 연구되고 있다. 그러나 줄기세포는 배아줄기 세포와는 달리 생체외에서 배양 시 활용할 수 있는 줄기세포는 그 수명이 매우 짧고 분화능 또한 짧은 기간 동안 만 보유된다. 이러한 줄기세포의 제한된 수명은 해당세포의 활용에 있어 큰 제약이 되고 있다.

화장품 분야에서의 줄기세포의 이용은 그 대사산물로서의 성장인자를 이용하는 것이다. 성장인자들은 세포의 표면에 있는 수용체와 결합하여 세포의 증식과 분화를 자극하는 작용을 하는 단백질이다. 성장인자들의 기능은 매우 다양하여 여러 가지 세포에 분열을 자극하는 작용을 하기도 하는 반면, 어떤 경우에는 특이한 세포형에만 작용하기도 한다. 성장인자는 세포 증식의 자극을 위해서 필수적인 성분으로서 세포 분화, 이주, 증식과정을 조절한다는 것이 밝혀졌다. 특이적 수용체에 성장인자가 결합하게 되면 신호 전달 사슬을 활성화하여 세포의 외부로부터 내부의 핵으로 신호가 전달된다. 신호 전달이 계속되면 다량의 다른 전달자와 같이 작용하여 최종적으로 새로운 단백질이 합성된다. 그러므로 성장인자는 세포간 상호작용의 전달, 기능 제어에 있어서 중요한 신호 전달 네트워크를 형성하게 된다.

또한 생쥐를 대상으로 한 피부 상처 재생 실험 결과에서도 줄기세포 유래 단백질을 적용했을 때 적용하지 않은 경우보다 상처 크기가 40%이상 줄어드는 것을 확인할 수 있다. 아울러 색소침착 사람을 대상으로 한 미백효과에서도 좋은 결과를 보여 화장품 원료로서 강한 효능효과 및 안전성을 확보하고 있다.

따라서 신경세포로 분화할 환경을 만들어 주면 신경세포가 되고, 피부세포로 분화할 환경을 만들어 주면 피부세포가 될 수 있는 것이다. 이러한 특성을 이용하여 화장품 조성물에 줄기세포배양 추출물을 응용하기 위한 연구가 진행되고 있다.

대한민국 특허출원 제2005-55017호에는 동종유래 및/또는 자기유래 지방세포, 동종유래 및/또는 자기유래지방세포로부터 분리한 줄기세포 또는 이들로부터 분리된 섬유아세포성장인자를 함유하는 주름개선 및/또는 노화방지용 함유하는 화장료 조성물이 공지되어 있으며, 대한민국 특허등록 제848056호 발명은 줄기세포 배양액 또는 그 배양액에서 분리된 단백질을 포함하는 미백용 화장료 조성물이 공지되어 있고, 대한민국 특허출원 제2007-15211호에는 인간 지방 줄기세포를 항산화제, 비타민, 아미노산 및 무기질이 포함된 무혈청 배지에서 1일 이상 배양하여 수득한 조건배지를 함유하고, 조직 재생용 인간 줄기세포 함유 주사제에 사용되는 주사제용 첨가제가 공지되어 있다.

또한, 대한민국 특허등록 제899329호에는 개체로부터 분리된 인간의 골수, 제대혈 또는 태반 조직으로부터 중간엽 줄기세포를 수득하는 단계; 상기 줄기세포를 혈청배지에서 배양 후 무혈청배지에서 계대배양하는 단계; 및 배양한 줄기세포에 저산소 배양의 물리적 자극을 가하는 단계를 포함하는 중간엽 줄기세포로부터 염기성섬유아세포 성장인자 또는 인간형질전환 성장인자-베타를 대량으로 생산하는 방법이 공지되어 있다.

한편, 리포좀이 유효성분의 피부 침투를 용이하게 하므로 화장료 조성물에 많이 이용되고 있지만, 리포좀의 제조 과정에 60℃ 이상의 열이 발생하는 고압유화장치(microflidizer)를 활용하여야 한다.

그러므로 인체유래 줄기세포 배양액 추출물을 리포좀화 하여 화장료로 사용하는 경우에는 유효성분의 피부 침투를 용이하게 할 수 있지만 유효성분인 단백질인 성장인자(growth factor)와 같은 여러 생리활성 물질들의 열에 의한 안정성에 문제점이 발생한다.

이에 본 발명자들은 인체유래 줄기세포 배양액 추출물을 리포좀화 할 수 있는 방법을 연구하던 중에 저온공정에 의하여 인체유래 줄기세포 배양액 추출물을 포접시켜 리포좀화 함으로써 인체유래 줄기세포 배양액 추출물의 안정성을 확보하고 피부에 대한 생리활성 효과를 극대화 할 수 있는 저온공정 리포좀 기술을 개발하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 인체유래 줄기세포 배양액 추출물의 열 안정성을 유지하며 리포좀화 할 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 인체유래 줄기세포 배양액 추출물의 리포좀을 함유하는 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 인체유래 줄기세포 배양액 추출물을 저온공정으로 포접시키므로써 열 안정성을 유지하며 리포좀화 할 수 있는 방법을 제공한다.

본 발명에서 인체유래 줄기세포는 배아줄기세포를 제외한 성체로부터 얻어지는 줄기세포를 의미하며, 예로서 지방, 골수, 제대혈 및 말초혈액을 포함하는 혈액 및 조직의 기저에서 기원되는 줄기세포를 모두 포함하며, 이에 제한되지 않는다.

인체유래 줄기세포의 배양액 추출물은 주로 세포의 성장을 조절하는 펩타이드와 단백질로서, 예를 들면 PDGF(혈소판 유래 성장인자), Basic FGF(염기성 섬유아세포 성장인자), KGF(각질세포 성장인자), TGF-β1(형질변환성장인자), HGF(간세포 성장인자), VEGF(혈관내피 성장인자), 콜라겐, 파이브로넥틴, SOD(항산화 효소) 등이 포함된다.

상기 인체유래 줄기세포의 배양액 추출물은 피부 구성세포인 섬유아세포 이동 촉진, 활성화 효과, 피부 재생 및 항노화 효과, 콜라겐합성 증가, 티로시나제의 활성 억제 효과, 멜라닌 합성 억제, 모발 성장 및 축소된 모낭 복원 효과가 알려져 있다.

본 발명은 열에 불안정한 유효성분인 인체유래 줄기세포의 배양액 추출물을 안정화시키고 경피 흡수를 용이하게 하기 위해서 저온공정으로 처리하여 리포좀에 포접하여 화장료에 함유시키는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 리포좀은 레시틴과 수상성분만으로 구성되며, 저온공정으로 처리하여 리포좀에 인체유래 줄기세포의 배양액 추출물을 포접시킨 것이다.

본 발명에서 인체유래 줄기세포의 배양액 추출물을 포접시킨 리포좀은 상온에서 레시틴을 인체유래 줄기세포의 배양액 추출물이 포함된 수상에 분산시킨 뒤 초임계 이산화탄소를 이용하여 역마이셀(reverse micelle) 에멀젼(수상/저온공정 이산화탄소)을 형성시켜 반응을 중지하고 초임계 이산화탄소를 감압 기화시키면 초암계 이산화탄소 상이 제거되면서 인체유래 줄기세포의 배양액 추출물이 포접된 리포좀(이하 이를 ‘저온공정 리포좀’이라 한다) 현탁액을 얻을 수 있다.

본 발명에 의한 저온공정 리포좀(Low Temperature Process liposome)은 제조공정이 4℃ 이하에서 제조되는 리포좀으로 기존의 고압유화장치(microfludizer)를 이용한 리포좀 제조공정이 고온(60℃이상)에서 리포좀이 형성됨으로 인해 온도에 민감한 성분들의 열 안정성을 확보할 수 없는 단점을 보안할 수 있고, 유효성분의 봉입 효율이 10% 이상으로 기존 리포좀 보다 3배 이상의 봉입 효율을 줄 수 있을 뿐만 아니라 지용성 성분의 봉입 효율도 기존 리포좀보다 50% 이상 높일 수 있는 장점이 있다.

본 발명에서, 저온공정 리포좀은 통상적인 리포좀의 형태를 갖는 것으로 평균 소적 크기가 50 내지 500 nm이며, 바람직하게는 80 내지 300 nm이며, 가장 바람직하게는 100 내지 200nm인 나노화된 리포좀을 의미한다. 상기 저온공정 리포좀의 평균 소적 크기가 500nm를 초과하는 경우에는 본 발명에서 달성하고자 하는 기술적 효과 중 피부 침투 및 제형 안정성이 매우 미약하다.

본 발명에서 인체유래 줄기세포의 배양액 추출물의 함량은 저온공정 리포좀 총 중량에 대하여 0.001-50.0 중량% 함유되며, 바람직하게는 총 중량에 대하여 0.1-10.0 중량% 함유한다. 저온공정 리포좀을 구성하는 레시틴의 함량은 저온공정리포좀 총 중량에 대하여 0.001-10.0 중량% 함유되며, 바람직하게는 총 중량에 대하여 0.01-5.0 중량% 함유한다.

본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서 인체유래 줄기세포의 배양액 추출물 이외에 생체성분의 활성을 유지시켜주는 다양한 성분들, 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 화장료 조성물은 그 제형에 있어서 특별히 한정되는 바가 없는데, 예를 들면, 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 아이크림, 영양크림, 맛사지크림, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 파우더, 엣센스, 팩 등의 제형을 가질 수 있다. 또한, 각 제형의 화장료 조성물에 있어서, 피부개선 원료로써 상기한 인체유래 줄기세포의 배양액 추출물을 포함하여 이외의 성분들을 화장료의 제형 또는 사용목적 등에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있다.

본 발명은 기존의 리포좀 제조 과정 시 발생되는 열에 의해 불안정해질 수 있는 활성성분인 인체유래 줄기세포의 배양액 추출물을 저온공정 이산화탄소를 사용하여 저온 또는 상온에서 리포좀 제조가 가능하게 함으로서 인체유래 줄기세포의 배양액 추출물 함유한 안정한 저온공정 리포좀을 제조할 수 있어 열에 불안정한 활성성분의 활성을 유지할 수 있다.

따라서, 본 발명에 따른 저온공정 리포좀에 포접된 지방줄기세포 배양액 추출물을 함유한 화장료 조성물은 온도에 따른 인체유래 줄기세포의 배양액 추출물 내의 활성성분의 안정성을 확보함으로서 기존 리포좀에 포접된 지방줄기세포 배양액 추출물을 함유한 화장료 조성물 보다 매우 우수한 피부 주름개선이나 미백효과를 나타내어 화장료로 유용하게 이용할 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 실시예 1에 의해 제조된 인간 지방줄기세포 배양액 추출물을 포접시킨 저온공정 리포좀의 입자분포를 나타낸 것이다.

본 발명은 하기의 실시예 및 실험예에 의해 보다 명확하게 설명하고자 하나, 본 발명을 이들에 한정하고자 하는 것은 아니다.

<실시예 1> 인간 지방줄기세포 배양액 추출물이 포접된 저온공정 리포좀의 제조

상온(15℃)에서 레시틴 3%를 인간 지방줄기세포 배양액 추출물 10%가 포함된 수상에 분산시킨 뒤 초임계 이산화탄소를 이용하여 역마이셀(reverse micelle) 에멀젼(수상/저온공정 이산화탄소)을 형성시킨 다음 반응을 중지하고 초임계 이산화탄소를 감압 기화시켜 초임계 이산화탄소 상을 제거하고 인간 지방줄기세포 배양액 추출물이 포접된 저온공정 리포좀 현탁액을 얻었다. 이때 반응 공정의 온도는 4℃이하로 진행하였다.

<실시예 2> 본 발명에 따른 저온공정 리포좀이 포접된 화장료 조성물의 제조

상기 실시예 1에 의해 제조된 인간 지방줄기세포 배양액 추출물이 포접시킨 저온공정 리포좀을 이용하여 하기 표 1에 기재된 조성으로 화장료 조성물을 제조하였다.

< 비교예 1> 인간 지방줄기세포 배양액 추출물을 함유하는 리포좀의 제조

레시틴 3%, 프로필렌글리콜 10%, 에틸알콜 10%, 미네랄오일 3%를 혼합한 뒤 60℃ 정도까지 가온하여 용해한 뒤, 인간 지방줄기세포 배양액 추출물 10%가 포함된 수상을 상기 레시틴을 포함하고 있는 용기에 부어 교반한 후 고압유화균질기(Microfludizer)에서 1,000bar의 압력 하에 2회 통과시켜 리포좀을 얻었다.

< 비교예 2> 일반적인 기존의 리포좀을 함유하는 화장료 조성물의 제조

상기 비교예 1에 의해 제조된 리포좀을 이용하여 하기 표 2 기재된 조성으로 화장료 조성물을 제조하였다.

< 실험예 1> 본 발명의 리포좀 입자의 입도 분포에 따른 안정성 평가

상기 실시예 1에서 얻은 저온공정 리포좀을 10%-Microplasma Hyopnemoniae OD410=0.1 완충용액에 적당한 농도로 희석한 후 리포좀 입자의 입도를 측정하였다. 상기 실시예 1의 입자의 입도는 제타사이저 엔에스(Zetasizer Ns) 장비를 이용하여 빛 산란방식을 분석하고 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 실시예 1의 저온공정 리포좀은 입자크기가 178.7± 21.3 nm 로서 입도 균질성이 뛰어나 본 발명은 저온공정에 의해 지방줄기세포 배양액 추출물이 안정하게 포접되어 리포좀을 형성시킴을 알 수 있다.

< 실험예 2> 피부주름개선효과

1. 기기적 평가

상기 본 발명에 따른 실시예 2 및 비교예 2에 의해 제조된 화장료 조성물에 대한 피부주름 개선 효과(기기적 평가)를 측정하기 위하여 20세 이상의 여성 20명(평균연령 28.5세)을 각각 A, B 그룹으로 나누어 본 발명에 따른 실시예 2에 의해 제조된 화장료 조성물은 A그룹을 대상으로, 비교예 2에 의해 제조된 화장료 조성물은 B그룹에 적용하였다.

A, B 그룹 각각의 대상에게 팔의 상박 2X2 ㎠의 면적에(2회/일, 0.2g/회) 6주간 도포하면서, 투명한 실리콘 재질의 용액을 이용하여 피부주름의 레플리카(Replica)를 떠서 피부주름측정기(SKIN VISIOMETER SV400, C+K Electronics GmbH. Germany)로 피부주름변화를 측정하였다. 레플리카의 상을 CCD 카메라로 3차원적 분석하고, 각각의 주름의 거칠기(R_m: m은 1이상의 정수)의 합을 주름의 개수로 나눈 값인 하기 식 1의 평균주름거칠기(R_z)로 주름개선 효과를 분석하였다. 시험결과는 하기 표 3에 나타내었다.

상기 표 3에서 알 수 있는 바와 같이, 6주 후 본 발명에 따른 실시예 2는 평균주름거칠기(R_z)는 86.4㎛(p<0.01)이며, 비교예 1은 57.0㎛(p<0.01)으로서, 본 발명에 따른 화장료는 비교예 2 보다 약 51.6% 정도 주름이 더 개선되었다.

따라서 본 발명에 따른 저온공정 리포좀을 함유하는 화장료는 주름개선효과가 매우 효과적으로 상승되었음을 알 수 있다.

2. 육안평가

상기 본 발명에 따른 실시예 2 및 비교예 2에 의해 제조된 화장료 조성물에 대한 피부주름 개선 효과(육안평가)를 측정하기 위하여 20세 이상의 여성 20명(평균연령 28.5세)을 각각 A, B 그룹으로 나누어 본 발명에 따른 실시예 2에 의해 제조된 화장료 조성물은 A그룹을 대상으로, 비교예 2에 의해 제조된 화장료 조성물은 B그룹에 적용하였다.

A, B 그룹 각각의 대상에게 주름이 있는 눈가를 중심으로 12주간 도포(2회/일)한 후, 숙련자의 객관적 평가와 피검자의 주관적 평가를 다음의 6등급으로 분류하여 평가함으로써 피부주름의 개선정도(ΔW)를 측정하였다. 결과는 하기 표 4 및 표 5에 나타내었다.

<피부주름개선 평가기준>

-3: 극히 심하게 악화 -2: 악화 -1: 약간 악화

0: 변화없음 1: 약간 개선 2: 개선 3: 매우 개선

상기 표 4 및 표 5에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 실시예 2에서는 숙련자의 객관적 평가와 피검자의 주관적 평가가 각각 2.5, 2.4로 비교예 2에 비해 숙련자의 객관적 평가에서는 25%, 피검자의 주관적 평가에서는 33% 증가한 것으로 나타나 본 발명의 저온공정 리포좀에 인간 지방줄기세포 배양액 추출물을 함유한 화장료가 기존 리포좀에 인간 지방줄기세포 배양액 추출물을 함유한 화장료보다 매우 효과적으로 주름을 개선시킴을 알 수 있다.

< 실험예 3> 피부미백효과 : 멜라노사이트에서 멜라닌 생성에 대한 저해 효과

멜라노 사이트는 마우스 유래 B-16 멜라노마(ATCC CRL 6323) 세포주를 구입하여 사용하였다. 멜라노마 세포주를 포도당 4.5 g/L, 10% 혈청, 1% 항생제가 함유된 DMEM 배지에 접종하여 50㎖ T-플라스크에 37℃에서 배양한다. 5% CO₂ 조건하에서 24시간 배양한 후, 0.02% EDTA가 함유된 0.05% 트립신(Trypsin)을 처리하여 세포를 분리한 후 50㎖ T-플라스크에 접종하여 48시간 배양한다. 이 때 세포수는 5.76 × 10⁶ 세포/플라스크이다. 여기에 적당 농도의 본 발명에 따른 실시예 1의 저온공정 리포좀과 비교예 1의 일반 리포좀을 DMEM 배지에 희석시켜, 배양된 멜라노마 세포에 처리하여 37℃에서 5일간 배양한다. 배양 후 배지를 모두 제거하고, 0.02% EDTA와 0.05%트립신을 함유한 살린-포스페이트 완충용액(PBS)을 1㎖ 처리하여 세포를 분리시킨 후 5분간 원심 분리하여 세포만을 수집한다. 5% 트리클로로아세테이트(TCA)를 처리하여 교반하고, 원심 분리하여 침전된 멜라닌을 살린-포스페이트 완충용액으로 세척한다. 침전된 멜라닌에 1N NaOH를 처리하여 용해시킨 후, 475nm에서 흡광도를 측정한다. 멜라닌 농도는 합성 멜라닌(시그마사)의 표준 농도 곡선으로부터 결정하였다. 실험 결과는 표 6에 나타내었다.

표 6에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 실시예 1의 저온공정 리포좀에 포접된 인간 지방줄기세포 배양액 추출물이 비교예 1의 일반 리포좀에 포접된 인간 지방줄기세포 배양액 추출물을 처리했을 때 보다 높은 멜라닌 합성 억제효과가 높게 나타내어 본 발명은 멜라노사이트의 멜라닌 생성을 억제하여 피부 미백효과를 보임을 알 수 있다.

이는 저온공정 리포좀이 저온공정(4℃ 이하)으로 제조되는데 비해, 기존의 일반 리포좀은 제조공정에 고압유화장치(microfludizer)를 통과 시 고온(60℃이상) 공정을 거치면서 성장인자와 같은 온도에 민감한 성분들이 발생한 열에 의해 활성이 떨어지거나 변성되어 멜라닌 합성 저해 효과가 떨어진 것으로 사료된다.

< 실험예 4> 피부 안전성 시험

상기 본 발명에 따른 실시예 2의 인간 지방줄기세포 배양액 추출물을 함유한 저온공정 리포좀이 포함된 화장료에 대한 피부 안전성 시험을 실시하였다.

피검자 20명(평균연령 26.7세, 연령분포 18세-30세)을 대상으로 Haye's Test Chamber를 이용하여 상박에 피부 첩포시험(Patch Test)을 실시하였다. 단 건선(Psoriasis), 습진(Eczema), 기타 피부병변 보유자나 임신, 수유부 또는 피임제, 항히스타민제 등을 복용하고 있는 사람은 본 실험의 피검자에서 제외 하였다. 시험부위를 70% 에탄올로 닦아낸 뒤 건조시키고, 본 발명에 다른 실시예 2 및 비교예 2에서 제조된 화장료를 각각 15μg씩 Chamber에 적하 시킨 후, 시험 부위인 상박 부위에 얹어 고정시킨다. 첩포는 24시간 동안 도포하고 첩포를 제거한 후에는 Marking Pen으로 시험부위를 표시하여 각각 24시간, 48시간 후에 시험부위를 관찰한다. 판정은 첩포 제거 24시간, 48시간 후에 행하며 피부반응은 하기 표 7의 국제접촉피부염연구회(International Contact Dermatitis Research Group:ICDRG)의 규정에 따라 판정하였다. 시험결과는 하기 표 8에 나타내었다.

표 8에서 알 수 있는 바와 같이, 피부안전성 시험 결과, 본 발명에 따른 실시예 2 및 비교예 2 모두 평균 자극정도가 0으로 피부에 자극이 없는 안전한 화장료임을 알 수 있다.

< 실험예 5> 제제안정성 시험

상기 본 발명에 따른 인간 지방줄기세포 배양액 추출물을 함유한 저온공정 리포좀이 포함된 화장료에 대한 안정성 시험을 시험하였다.

화장료의 안정성을 시험하기 위해 상기 실시예 2 및 비교예 2를 45℃로 일정하게 유지되는 항온조에서 불투명 초자 용기에 담아 12주동안 보관하고, 또한 4℃로 일정하게 유지되는 완전히 차광된 냉장고 내에서 불투명 초자 용기에 담아 12주 동안 보관한 후, 분리 정도 및 변색 정도를 비교 측정하였다. 그 결과를 하기 표 9에 나타내었다. 이때 제품 분리 및 변색 정도를 다음의 6등급으로 분류하여 평가하였다.

제품 변색 평가 기준 :

0: 변화 없음 1: 극히 조금 분리(변색)

2: 조금 분리(변색) 3: 조금 심하게 분리(변색)

4: 심하게 분리(변색) 5: 극히 심하게 분리(변색)

상기 표 9에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 저온공정 리포좀이 포함된 화장료인 실시예 2는 4℃와 45℃에서 모두 변색이나 분리 증상이 없이 안정하였으나 일반 리포좀을 함유한 비교예 2는 4℃는 변색이나 분리 증상이 없었으나 45℃에서 분리 증상을 나타내었다.

그러므로 본 발명에 따른 인간 지방줄기세포 배양액 추출물을 함유한 저온공정 리포좀이 포함된 화장료는 매우 안정한 조성물임을 알 수 있다.

이하 본 발명에 따른 인간 지방줄기세포 배양액 추출물을 포접한 저온공정 리포좀을 포함하는 화장료를 조성하여 제시한다. 그러나, 본 발명의 조성물을 하기의 제형예들로 한정하고자 하는 것은 아니다.

< 제조예 1> 유연화장수(스킨로션)

하기 표에 기재된 조성성분을 통상적인 제조방법에 따라 유연화장수를 제조한다.

< 제조예 2> 영양화장수( 밀크로션 )

하기 표에 기재된 조성성분을 통상적인 제조방법에 따라 영양화장수를 제조한다.

< 제조예 3> 영양크림

하기 표에 기재된 조성성분을 통상적인 제조방법에 따라 영양크림을 제조한다.

< 제조예 4> 마사지크림

하기 표에 기재된 조성성분을 통상적인 제조방법에 따라 마사지크림을 제조한다.

< 제조예 5> 팩

하기 표에 기재된 조성성분을 통상적인 제조방법에 따라 팩을 제조한다.

Claims (4)

1. 상온에서 레시틴을 인체유래 줄기세포 배양액 추출물이 포함된 수상에 분산시킨 분산액을 제조하고, 상기 분산액을 초임계 이산화탄소를 이용하여 형성시킨 역마이셀(reverse micelle) 에멀젼에 초임계 이산화탄소를 감압 기화시켜 초임계 이산화탄소 상을 제거하여 제조되는 인체유래 줄기세포의 배양액 추출물을 포접시킨 리포좀을 함유함을 특징으로 하는 화장료.
   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 화장료는 피부 미백 효과를 갖는 것임을 특징으로 하는 화장료.
   
3. 제 1 항에 있어서, 상기 화장료는 피부 주름개선 효과를 갖는 것임을 특징으로 하는 화장료.
   
4. 제 1 항에 있어서, 상기 화장료는 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 아이크림, 영양크림, 맛사지크림, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 파우더, 엣센스, 팩 중에서 선택되는 제형으로 제조됨을 특징으로 하는 화장료.

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