KR101344201B1 - 면역세포 증식 배양액이 함유된 화장료 조성물 제조방법 - Google Patents
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Abstract
면역세포 증식 배양액이 함유된 화장료 조성물 제조방법이 개시된다. (a) 면역세포(T세포) 증식용 배지를 조성단계;(b) 동물의 말초혈액에서 림프구를 추출하는 단계;(c) 상기 림프구를 상기 배지에 혼합하여 상기 림프구에 포함된 면역세포(T세포)를 배양함으로써 면역세포 증식 배양 혼합액을 제조하는 단계;(d) 상기 면역세포를 상기 면역세포 증식 배양 혼합액으로부터 분리하여 면역세포 증식 배양액을 제조하는 단계; 및(e) 화장료 성분을 상기 면역세포 증식 배양액에 혼합하는 단계를 포함하는 면역세포 증식 배양액이 함유된 화장료 조성물 제조방법이 제공된다.
Description
본 발명은 면역세포 증식 배양액을 이용하여 피부노화를 개선시키는 화장료 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
피부의 중요한 기능은 자외선, 건조한 냉난방 환경 및 대기 오염 등과 같은 외부자극으로부터 인체를 보호하고, 체온조절, 호흡 및 배설작용 등의 다양한 역할을 수행하는 중요한 기능을 담당한다.
나이가 들면서 이러한 기능들은 점차 약화되고 피부의 노화가 진행된다. 특히, 피부 장벽의 기능을 수행하는 지질층의 지질조성과 함량이 변화하면서 그 기능이 급격히 저하되어 피부 수분 함량이 감소하게 되면 피부가 건조해지고 기미, 주근깨, 색소 침착 및 다양한 피부 병변이 유발된다. 또한 외부로부터 강한 자외선, 스트레스 및 영양결핍 등과 같은 자극을 받게 되면 피부는 주름생성, 탄력손실 및 각화 등과 같은 피부의 노화가 더욱 가속화 된다.
인체의 피부는 표피와 진피로 나뉘어져 있으며, 표피의 가장 아래에 있는 기저층에서 새로이 형성된 각질 형성세포는 아래층에서 위층으로 서서히 이동하면서 약 14일 이후에 각질로 변하게 되고, 다시 14일 정도 뒤에는 완전히 노화되어 허물이나 때가 벗겨지게 된다. 기저층과 연결되어 있는 진피는 표피에 수분을 공급하고, 피부의 탄력을 유지하는 역할을 하게 된다.
일반적으로, 피부탄력 감소, 피부주름 등의 피부노화 현상은 콜라겐의 파괴, 콜라겐 합성의 감소, 엘라스틴의 소실 등에 의해서 나타나는 것으로서, 피부 표피에서도 일어나지만 이보다는 진피에서 일어나는 현상이라고 볼 수 있다.
최근, 피부의 주름생성 원인 및 개선 방법에 대한 피부 생리학적 연구가 많이 행해지고 있으며, 실제로 화장료에 있어서 피부주름 방지를 위해 자외선 차단제, 항산화제, 세포활성촉진제 등이 사용되고 있고, 또한 콜라겐 합성에 따른 피부 주름개선 방법들이 제시되고 있다.
한편, 생화학 및 분자생물학의 발전을 기반으로 하여 우리 생체 내에 존재하는 성장인자와 같은 소량의 신호물질들이 발견되었으며, 이를 기반으로 한 생체의 노화이론이 재정립되고 있는 중이다. 또한 이 신호물질은 나이가 증가함에 따라 생체 내에서 감소하게 되는데 바로 이 성장인자의 감소가 우리의 노화와 밀접한 관계가 있다는 것이 밝혀지고 있다. 이러한 성장인자들은 각 조직의 기저에 존재하고 있는 줄기세포에서 다량 생산되고 있다.
우리 몸은 약 210여 가지의 세포들로 구성되어 있고 각각의 세포는 고유의 특성을 유지하면서 생명활동을 담당하고 있다. 모든 생명체가 생명이 있듯이 우리 몸의 각각의 세포는 수명이 있고 끊임없이 죽고 대신 새로운 세포로 채워지게 된다. 바로 이러한 과정을 가능하게 하는 것이 줄기세포이다.
줄기세포는 조직이나 기관의 분화된 세포들 사이에 존재하는 미분화 세포로써, 끊임없이 스스로 증식하는 자가 재생능력(Self Renewal)과 신체내의 모든 조직세포로 분화할 수 있는 능력(Differentiation to specific tissue)을 가진 만능세포이다. 성체줄기세포는 조혈모세포, 중간엽줄기세포, 신경모세포, 상피모세포 등이 존재하며 조혈모세포의 경우 혈구 및 임파구를 생산할 수 있는 모세포로서 혈액암을 포함한 면역계 질환 치료에 도움이 되고, 중간엽 줄기세포의 경우 뼈, 연골, 지방 및 섬유조직으로 분화되며 각 조직이 손상되었을 때 이들의 회복에 관여한다. 그러나 이러한 성체 줄기세포는 각각의 조직에 소량 존재하며 수년간 분열 혹은 증식을 하지 않고 잠잠하게 지내기도 한다. 즉, 줄기세포라 함은 이러한 분화능력은 가지고 있으나, 아직 분화는 일어나지 않은 '미분화'세포이다. 이러한 미분화 상태에서 적절한 조건을 맞춰주면 줄기세포는 다양한 조직 세포로 분화할 수 있다.
줄기세포는 또 크게 배아줄기세포, 성체줄기세포로 나누어진다. 줄기세포는 출생 후부터 우리 몸에 있는 여러 종류의 조직에 존재하는 성체줄기세포(Adult Stem Cell)와 인간 생명의 시초가 되는 수정란에서 유래하는 배아줄기세포(Embryonic Stem Cell)의 두 종류로 구분될 수 있다. 성체줄기세포는 특정한 조직을 구성하는 세포로 즉, 골수세포는 혈구세포로, 피부줄기세포는 피부로, 신경세포는 후각신경세포로만 분화되도록 운명이 정해져 있는 세포이다. 줄기세포가 어떤 세포로 분화되느냐 하는 것은 그 줄기세포를 어떠한 환경에서 배양하느냐에 따라 좌우된다.
현재 화장료 조성물에 많이 사용되고 있는 인간 유래 지방줄기세포 배양액 추출물(Human adipocyte conditioned media extracts )은 지방조직에서 지방을 제거한 세포를 여러 세대 배양해 줄기세포를 분리해 낸 후, 줄기세포 배양액으로부터 줄기세포가 만들어낸 단백질을 얻을 수 있다. 이 단백질 혼합물에는 vEGF(혈관내피성장인자), TGF(형질전환성장인자), HGF(간세포증식인자), FGF(섬유아세포성장인자), IGF(인슐린유사성장인자) 등 150여 가지의 성장인자(growth factor) 단백질 성분을 포함하고 있는 것으로 보고되고 있다. 지방줄기세포는 성체줄기세포의 한 종류로써 골수줄기세포나 제대혈 줄기세포보다 채취하기가 쉽고 대량배양이 가능하면서도 줄기세포 함유량이 많기 때문에 지방 줄기세포가 가장 많이 활용되고 있다.
하나의 세포가 증식하고 다른 종류로 분화하는데 있어서 가장 중요한 역할을 하는 것이 바로 성장인자(growth factor)이다. 이 성장인자는 세포가 증식 또는 분화를 일으키는 신호를 세포 내부로 전달하는 역할을 하며, 이러한 신호를 바탕으로 세포는 분열, 분화를 하게 되어 피부를 생생하고 생기롭게 가꾸어주며 언제나 피부의 컨디션을 신선하고, 최상으로 만들어주는 상태를 유지할 수 있다. 줄기세포로부터 만들어낸 단백질들을 피부의 섬유아세포(fibroblast)에 처리하자 섬유아세포에서 생성되는 결합조직인 콜라겐의 양이 5배 이상 증가했으며, 섬유아세포 자체의 증식도 30% 이상 증가했다. 섬유아세포는 피부의 진피층을 형성하는 콜라겐을 생산하는 세포이며 콜라겐의 양이 줄어들면 피부 탄력이 줄고 주름이 늘어나는 특징을 가지고 있다.
줄기세포는 다 분화능을 지닌 세포로서 인비트로(in vitro) 뿐만 아니라 인비트로(in vivo) 조건에서 뼈, 연골, 인대, 지방, 심근, 근육 등의 세포로의 분화 능력을 지니고 있는 다분화능 세포이다. 이러한 다분화능 세포인 줄기세포는 각 조직 세포로의 분화기전 연구에 있어 좋은 모델로 이용되고 있을 뿐만 아니라, 현재 다양한 세포 치료법 개발에 이용되고 있다.
화장료 조성물 분야에서의 줄기세포의 이용은 그 대사산물로서의 성장인자를 이용하는 것이다. 성장인자들은 세포의 표면에 있는 수용체와 결합하여 세포의 증식과 분화를 자극하는 작용을 하는 단백질이다. 성장인자들의 기능은 매우 다양하여 여러 가지 세포에 분열을 자극하는 작용을 하기도 하는 반면, 어떤 경우에는 특이한 세포형에만 작용하기도 한다. 성장인자는 세포 증식의 자극을 위해서 필수적인 성분으로서 세포 분화, 이주, 증식과정을 조절한다는 것이 밝혀졌다. 특이적 수용체에 성장인자가 결합하게 되면 신호 전달 사슬을 활성화하여 세포의 외부로부터 내부의 핵으로 신호가 전달된다. 신호 전달이 계속되면 다량의 다른 전달자와 같이 작용하여 최종적으로 새로운 단백질이 합성된다. 그러므로 성장인자는 세포간 상호작용의 전달, 기능 제어에 있어서 중요한 신호 전달 네트워크를 형성하게 된다. 또한 생쥐를 대상으로 한 피부 상처 재생 실험 결과에서도 줄기세포 유래 단백질을 적용했을 때 적용하지 않은 경우보다 상처 크기가 40%이상 줄어드는 것을 확인할 수 있다. 아울러 색소침착 인간을 대상으로 한 미백효과에서도 좋은 결과를 보여 화장료 조성물 원료로서 강한 효능효과 및 안전성을 확보하고 있다.
따라서 신경세포로 분화할 환경을 만들어 주면 신경세포가 되고, 피부세포로 분화할 환경을 만들어 주면 피부세포가 될 수 있는 것이다. 이러한 특성을 이용하여 화장료 조성물 조성물에 줄기세포배양 추출물을 응용하기 위한 연구가 진행되고 있다.
대한민국 특허출원 제2005-55017호에는 동종유래 및/또는 자기유래 지방세포, 동종유래 및/또는 자기유래지방세포로부터 분리한 줄기세포 또는 이들로부터 분리된 섬유아세포성장인자를 함유하는 주름개선 및/또는 노화방지용 함유하는 화장료 조성물이 공지되어 있으며, 대한민국 특허등록 제848056호 발명은 줄기세포 배양액 또는 그 배양액에서 분리된 단백질을 포함하는 미백용 화장료 조성물이 공지되어 있고, 대한민국 등록특허 제0735081호 발명은 CD4 T 세포 활성화 방법이 공지되어 있으며, 대한민국 특허출원 제2007-15211호에는 인간 지방 줄기세포를 항산화제, 비타민, 아미노산 및 무기질이 포함된 무혈청 배지에서 1일 이상 배양하여 수득한 조건배지를 함유하고, 조직 재생용 인간 줄기세포 함유 주사제에 사용되는 주사제용 첨가제가 공지되어 있다.
하지만 이런 인체 유래 줄기세포는 안전성이 확보되지 않아 화장료 조성물에 안전하게 사용하는데 여전히 한계가 있고, 특별히 윤리적인 문제가 남아 있어 향 후 그 사용에 많은 제약을 갖고 있을 뿐만 아니라, 인체유래 줄기세포 배양액 추출물 내에 함유되어 있는 다양한 유효성분, 좀 더 구체적으로는 다양한 세포 성장인자들의 피부 침투에 어려움이 있어 의학적인 치료목적에 우수한 효과를 보이는 것과는 달리 화장료로써 정상인의 피부에서는 그 효과에 한계가 있다. 따라서 현재 피부 노화 현상을 개선시키기 위해 피부과 영역에서는 직접 피부 안으로 인체유래 줄기세포 배양액 추출물을 주사 하거나 피부에 특수한 기구를 활용하여 미세한 통로(Hole)를 만들어 피부 침투를 유도하고 있지만 이 과정에서 다양한 피부 안전성의 문제점을 갖고 있어 이 방법을 화장료로 활용하는 것은 어려움이 있다.
본 발명은 면역세포 증식 배양액이 함유된 화장료 조성물의 제조방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 면역세포 증식 배양액이 함유되어 피부노화와 주름개선에 효과가 있는 화장료 조성물의 제조방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 일 측면에 따르면,
(a) 면역세포(T세포) 증식용 배지를 조성단계;
(b) 동물의 말초혈액에서 림프구를 추출하는 단계;
(c) 상기 림프구를 상기 배지에 혼합하여 상기 림프구에 포함된 면역세포(T세포)를 배양함으로써 면역세포 증식 배양 혼합액을 제조하는 단계;
(d) 상기 면역세포를 상기 면역세포 증식 배양 혼합액으로부터 분리하여 면역세포 증식 배양액을 제조하는 단계;
(e) 화장료 성분을 상기 면역세포 증식 배양액에 혼합하는 단계를 포함하는 면역세포 증식 배양액이 함유된 화장료 조성물 제조방법이 제공된다.
또한, 상기 (b)단계는,
상기 동물의 말초혈액을 1.077 비중의 피콜 파크 플러스(Ficoll-Paque Plus)용액에 중첩시켜 원심력으로 원심 침전시켜, 비중의 차이에 따라 비중이 1.077보다 큰 적혈구와 과립구층은 아래로, 1.077 이하인 단핵세포층과 혈소판 등은 위로 분리되게 하여 림프구가 포함된 단핵세포층을 얻고, 분리된 단핵세포층으로부터 림프구만을 추출하는 과정으로 이루어진 것을 특징으로 하는 면역세포 증식 배양액이 함유된 화장료 조성물 제조방법이 제공된다.
또한, 상기 (c) 단계는,
(c1)상기 (b) 단계를 통해 수확한 상기 림프구를 L-글루타민(L-glutamine), 혈장(plasma)이 첨가된 배양액에서 항CD28, 항CD16의 존재하에 배양하여 1차 면역세포 증식 배양혼합액을 제조하는 단계;
(c2) 상기 1차 면역세포 증식 배양 혼합액에 혈장을 추가적으로 첨가하고, 배양액이 든 가스투과성 배양백에 상기 1차 면역세포 증식 배양 혼합액을 주입한 후, 더 배양함으로써 림프구를 다량으로 증식시키는 2차 면역세포 증식 배양액 제조 단계를 포함하는 면역세포 증식 배양액이 함유된 화장료 조성물 제조방법이 제공된다.
또한, 상기 (d) 단계는,
(d1) 원심분리하여 면역세포와 면역세포 증식 배양액을 각각 상층부와 하층부로 분리하는 단계;
(d2) 상기 분리된 면역세포 증식 배양액을 셀 스트레이너(Cell Strainer)와 마이크로 필터를 사용하여 필터링하는 단계를 포함하는 면역세포 증식 배양액이 함유된 화장료 조성물 제조방법이 제공된다.
본 발명은 면역세포 증식 배양액이 함유된 화장료 조성물의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 면역세포 증식 배양액이 함유되어 피부노화와 주름개선에 효과가 있는 화장료 조성물의 제조방법을 제공한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 면역세포 증식 배양액이 함유된 화장료 조성물의 제조방법의 순서도.
본 발명은 동물의 말초혈액에서 유래된 림프구 배양시 항CD28(anti-CD28) 항체를 첨가물로 사용하여 T 세포(면역세포)를 고르게 활성화시켜 배양함으로써, 피부 미용에 효과가 뛰어난 면역세포 증식 배양액 혼합물을 생성하고, 여기서 면역세포 증식 배양 혼합물로부터 면역세포 증식 배양액를 분리한다.
본 발명에 대한 구체적인 설명에 앞서, 먼저 T 세포(면역세포)의 특징과 함께, 면역세포 증폭 및 활성화에 이용되는 상기 각 첨가물들의 작용기전을 살펴보기로 한다.
T 세포는 세포 표면에 항원 수용체(T cell antigen receptor; TCR)를 가지는 세포를 말한다. TCR은 α사슬과 β사슬의 이합체 CD3 항원과 이형 이합체를 형성하고 있다. T세포의 일부(말초혈 T세포의 5% 전후)는 αβ가 아닌, γ사슬과 δ사슬의 이합체로 되어있다. TCR은 CD3 항원 (γ, δ, ε, ζ, ζ또는η)과 복합체를 형성하고 있는데, CD3항원은 TCR이 항원을 인식하면 그 신호를 세포 내에 전달하는 역할을 맡는다.
일반적으로 암세포에 대한 면역반응을 촉진하는 헬퍼T세포는 다양한 사이토카인을 방출해 킬러T세포, B세포 및 매크로파지 등을 활성화시키게되는데, 사이토카인의 종류로는 세포와 세포 사이의 정보전달물질인 인터루킨1, 2, 3, TNF-α 및 interferon-γ 등 다양한 물질이 있다. 본 발명에서는 배양액에 항CD28(anti-CD28) 항체, 항CD16(anti-CD16) 항체를 첨가하여 킬러T세포, B세포, 매크로파지 등의 면역세포를 활성화시키게 된다.
IL-2는 T 세포가 항원을 인식하여 활성화 될 때 만들어지는 분자량 14 ~ 17 kDa의 당단백질(glycoprotein)로서, T 세포 밖으로 분비된 다음, IL-2를 생산한 T 세포 자신과 반응하여 해당 T 세포의 성장을 촉진하게 된다. IL-2는 또한 NK 세포에 작용하여 성장을 촉진하고 NK 세포의 살해능력을 강화하며, B 세포에 작용하여 그 성장을 촉진하기도 한다.
NKT 세포는 내재면역의 한 수행원으로서 비교적 근래에 그 기능들이 밝혀지고 있는 T 세포의 한 종류이다. 이름에서도 알 수 있듯이 T 세포의 수용체와 NK 세포 특이적인 세포표면마커(surface marker)를 발현하고 있다. NKT 세포의 한가지 놀라운 특징은 활성 후 IL-4, IL-10, IL-13, IFN-γ, TNF-α등과 같은 여러 사이토카인을 매우 빠른 시간 안에 분비한다는 점이다. 이러한 특징은 NKT 세포가 적응면역반응에 커다란 영향을 끼칠 수 있음을 암시한다.
따라서, 본 발명에서는 동물의 말초혈액의 림프구로부터 T 세포 등의 면역세포를 활성화시키기 위하여 배양시 항CD28 단일항체, 항CD16 단일항체를 사용한다.
본 발명은 하기의 실시예, 실험예 및 비교예에 의해 보다 명확하게 설명하고자 하나, 본 발명을 이들에 한정하고자 하는 것은 아니다.
이하, 본 발명에 따른 면역세포 증식 배양액 제조방법을 상세하게 설명하기로 한다. 본 발명에서 언급하는 "면역세포 증식 배양 혼합액"은 면역세포와 면역세포 증식 배양액의 혼합액이다. 면역세포 증식 배양액은 면역세포 증식 배양 혼합액에서 면역세포를 분리함으로써 얻을 수 있다. 면역세포 증식 배양액에는 면역세포의 2차 대사산물이 혼합되어 있다.
본 발명은 면역세포(T세포)를 증식 한 후, 이로부터 생산된 2차 대사산물이 혼합된 면역세포 증식 배양액을 화장료 성분으로 활용한다.
따라서, 본 발명은 면역세포의 증식 과정과 화장료 조성물의 제조 과정으로 크게 나눌 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 면역세포 증식 배양액이 함유된 화장료 조성물의 제조방법의 순서도이다. S11단계에서 S14단계는 면역세포 증식 배양액의 제조 방법이며, S15단계에서 화장료 성분을 혼합함으로써 최종적으로 화장료 조성물이 완성된다.
S11은 면역세포(T세포) 증식용 배지를 조성하는 단계이다.
본 발명을 위해 먼저 면역세포가 증식할 수 있는 환경의 배지를 조성해야 한다. 우선 아미노산(amino acids)들을 정제수에 녹여 각각의 용액을 얻고, 무기물(inorganic compounds)들을 정제수에 녹여 용액을 얻는다. 유기물(organic compounds)들은 무기물 용액에 혼합한다. 각각의 비타민(vitamins)들을 정제수에 녹여 용액을 얻고, 지질(lipids) 성분들과 단백질(proteins)성분들을 혼합하여 용액을 얻는다. 이들 용액들을 적절한 비율로 혼합하면 배지가 완성된다.
배지의 총 중량에 대하여 무기물 용액은 0.1 ~ 100 중량 %, 바람직하게는 5 ~ 20 중량 %를 함유하고, 아미노산 용액은 0.1 ~ 100 중량 %, 바람직하게는 0.1 ~ 10 중량 %, 비타민 용액은 1 ~ 100 중량 %, 바람직하게는 0.01 ~ 10 중량 %, 단백질 용액은 0.1 ~ 100 중량 %, 바람직하게는 1 ~ 10 중량 %, 지질 용액은 0.1 ~ 100 중량 %, 바람직하게는 0.01 ~ 2 중량 % 이다. 이러한 배지의 조성은 표 1과 같을 수 있다.
| 성분 | 단위:중량% | |
| Human Oligopeptide-1,2 | 0.01 | |
| A |
L-Alanine | 0.2 |
| L-Asparagine | 0.06 | |
| L-Arginine | 0.06 | |
| L-Aspartic acid | 0.02 | |
| L-Cystine | 0.04 | |
| L-Glutamic acid | 0.02 | |
| L-Glutamine | 0.7 | |
| L-Glycine | 0.01 | |
| L-Histidine | 0.02 | |
| L-Isoleucine | 0.05 | |
| L-Leucine | 0.05 | |
| L-Lysine | 0.04 | |
| L-Methionine | 0.02 | |
| L-Phenylalanine | 0.02 | |
| L-Proline | 0.02 | |
| L-Serine | 0.03 | |
| L-Threonine | 0.02 | |
| L-Tryptophan | 0.01 | |
| L-Tyrosine | 0.02 | |
| L-Valine | 0.02 | |
| Taurine | 0.1 | |
| B |
CaCl2 | 0.05 |
| MgSO4 | 0.05 | |
| KCl | 0.4 | |
| NaCl | 6.0 | |
| NaH2PO4 | 0.8 | |
| KNO3 | 0.05 | |
| Na2SeO3 | 0.00001 | |
| NaHCO3 | 2.0 | |
| C |
2-amino ethanol | 0.001 |
| D-Glucose | 2.0 | |
| HEPES | 2.0 | |
| Sodium pyruvate | 0.11 | |
| D |
D-Biotin | 0.0002 |
| Cyanocobalamin | 0.000005 | |
| Cholin chloride | 0.003 | |
| Folic acid | 0.001 | |
| myo-Inositol | 0.035 | |
| Niacinamide | 0.001 | |
| D-1/2 Ca Pantothenate | 0.00025 | |
| Pyridoxine | 0.001 | |
| Thiamine | 0.001 | |
| Cholecalciferol | 0.002 | |
| Ergocalciferol | 0.002 | |
| Ascorbic acid | 0.002 | |
| Riboflavin | 0.0002 | |
| E |
Linoleic acid | 0.015 |
| Oleic acid | 0.015 | |
| F |
Apotransferrin | 0.005 |
| Albumin | 2.0 | |
| 정제수 | 잔량 | |
| 계 |
100 | |
S12는 동물의 말초혈액에서 림프구를 추출하는 단계이다.
동물의 림프구 또는 단핵구 등의 단핵세포가 1.077보다 낮은 비중을 가지는 성질을 이용하여 동물의 말초혈액을 1.077 비중의 피콜 파크 플러스(Ficoll-Paque Plus)용액에 중첩시켜 일정한 원심력으로 원심 침전시킴으로써, 비중의 차이에 따라 비중이 1.077보다 큰 적혈구와 과립구층은 아래로, 1.077 이하인 단핵세포층과 혈소판 등은 위로 분리되게 하여 림프구가 포함된 단핵세포층을 얻고, 분리된 단핵세포층으로부터 림프구만을 추출한다. 이 림프구 추출물에는 면역세포(T 세포)가 함유되어 있다.
S13은 상기 림프구를 상기 배지에 혼합하여 상기 림프구에 포함된 면역세포(T세포)를 증식(배양)함으로서 면역세포 증식 배양 혼합액을 제조하는 단계이다.
배양 단계는 1차 배양단계과 2차 배양단계로 나눌 수 있다.
1. 1차 배양단계 -1차 면역세포 증식 배양 혼합액 제조과정
상기 림프구 추출 단계(S12)를 통해 수확한 림프구를 L-글루타민(L-glutamine), 혈장(plasma)이 첨가된 배양액에서 항CD28, 항CD16의 존재하에 6~8일간 배양한다. 그 구체적인 과정은 다음과 같다.
먼저, 수확한 림프구를 3㎖의 배양액에 현탁한 후, L-글루타민 20~100㎕와, 혈장 1~2㎖, 항CD16를 1~10㎕, 배양액 25~45㎖가 섞여있는 항CD28 고형화된 75㎠의 배양용기에 혼입하고, 37℃ CO2 배양기에서 3~4일 배양한다. 본 과정을 거치면, 1차 면역세포 증식 배양 혼합액이 제조된다.
2. 2차 배양단계- 2차 면역세포 증식 배양 혼합액 제조 과정
상기 제1 배양 단계를 거친 면역세포 증식 배양 혼합액(29~49㎖)에 혈장(3~5㎖)을 첨가하고, 혈장이 새로 첨가된 면역세포 증식 배양 혼합액을 1ℓ의 배양액이 든 가스투과성 배양백에 주입한 후, 3~4 일간 더 배양함으로써 림프구를 다량으로 증식시킨다.
이상에서와 같은 제1, 제2 배양 단계를 거치면서 T세포(면역세포) 수가 대량으로 증가하며 각 T세포의 크기 역시 증가하게 되는데, 실제 배양 실험 결과 30cc 혈액에서 림프구 분리시 전체 림프구수가 1.0x106~3.0x107이던 것이 최종적으로 1.0x109~5.0x109까지 증가하게 됨을 알 수 있었다.본 과정을 거치면 2차 면역세포 증식 배양 혼합액 제조된다.
S14단계는 면역세포를 면역세포 증식 배양 혼합액으로부터 분리하여 면역세포 증식 배양액을 제조하는 단계이다. S14단계는 원심분리하여 면역세포와 면역세포 증식 배양액을 각각 상층부와 하층부로 분리하는 단계와, 상기 분리된 면역세포 증식 배양액을 셀 스트레이너(Cell Strainer)와 필터를 사용하여 필터링하는 단계로 나눌 수 있다.
1.원심분리하여 면역세포와 면역세포 증식 배양액을 각각 상층부와 하층부로 분리하는 단계
1000mL용량의 가스투과성 배양백에 배양되고 있는 면역세포 증식 배양 혼합액을 500mL의 멸균된 원심 분리관에 옮기고 1000rpm~2500rpm에서 15분~25간 원심분리하여 면역세포(하층액)와 면역세포 증식 배양액(상층액)을 분리한다.
2. 분리된 면역세포 증식 배양액을 셀 스트레이너(Cell Strainer)와 필터를 사용하여 필터링하는 단계
분리된 면역세포 증식 배양액을 셀 스트레이너(Cell Strainer, 70㎛ pore size)와 마이크로 필터(0.2㎛ pore size)를 사용하여 면역세포와 면역세포 증식 배양액을 완전히 분리한 후 멸균된 용기에 충진한다.
본 S14 단계를 진행하면 T세포를 비롯한 림프구 전체가 사실상 분리된다.
이상의 S11 단계와 S14 단계를 거치면 면역세포 증식 배양액이 제조된다. 이하에서는, 면역세포 증식 배양액을 이용하여 화장료 조성물을 제조하는 방법을 설명하기로 한다.
화장료 조성물은 다양한 목적과 성상에 맞춰, 기존의 화장료 성분들을 조합함으로써 완성될 수 있다. 본 실시예의 화장료 조성물은 하나의 실시예에 불과하며, 본 발명의 면역세포 증식 배양액을 기존의 화장료 성분들과 혼합하면 다양한 목적의 화장료 조성물이 제조된다.
<실시예 1> 발명에 따른 면역세포 증식 배양액 혼합액을 함유하는 화장료 조성물의 제조
아래의 표 2에 기재된 조성으로 만들어진 면역세포 증식 배양액 혼합액을 함유하는 화장료 조성물을 제조하였다.
| 성분 | 단위:중량% | |
| 델타-토코페롤 | 0.2 | |
| 면역세포 증식 배양액 | 5.0 | |
| A | 세토스테아릴알콜 | 2.0 |
| 글리세릴스테아레이트 | 1.5 | |
| 마이크로크리스탈린 | 0.7 | |
| 스쿠알란 | 5.0 | |
| 유동파라핀 | 3.0 | |
| 트리옥타노인 | 5.0 | |
| 폴리솔베이트 60 | 1.2 | |
| 솔비탄스테아레이트 | 0.5 | |
| 싸이크로메치콘 | 3.0 | |
| 토코페릴아세테이트 | 0.2 | |
| BHT | 0.05 | |
| B | 정제수 | 잔량 |
| 농글리세린 | 4.0 | |
| 1,3-부틸렌글리콜 | 2.0 | |
| 산탄검 | 0.1 | |
| EDTA-2Na | 0.05 | |
| 향,방부제 | 적량 | |
| 계 | 100 | |
<비교예 1> 인체유래 지방줄기세포배양액 추출물을 함유하는 화장료 조성물의 제조
상기 표1의 조성에서 면역세포 증식 배양액을 제외한 나머지 화장료 조성물(표2 참조)에 인체유래 지방줄기세포 배양액을 함유시켜, 비교예 1의 화장료 조성물을 제조하였다.(표 3)
| 성분 | 단위:중량% | |
| 델타-토코페롤 | 0.2 | |
| 인체유래지방줄기세포배양액 | 5.0 | |
| A | 세토스테아릴알콜 | 2.0 |
| 글리세릴스테아레이트 | 1.5 | |
| 마이크로크리스탈린 | 0.7 | |
| 스쿠알란 | 5.0 | |
| 유동파라핀 | 3.0 | |
| 트리옥타노인 | 5.0 | |
| 폴리솔베이트 60 | 1.2 | |
| 솔비탄스테아레이트 | 0.5 | |
| 싸이크로메치콘 | 3.0 | |
| 토코페릴아세테이트 | 0.2 | |
| BHT | 0.05 | |
| B | 정제수 | 잔량 |
| 농글리세린 | 4.0 | |
| 1,3-부틸렌글리콜 | 2.0 | |
| 산탄검 | 0.1 | |
| EDTA-2Na | 0.05 | |
| 향,방부제 | 적량 | |
| 계 | 100 | |
<실험예 1> 피부주름개선효과
1. 기기적 평가
상기 본 발명에 따른 실시예 1 및 비교예 1에 의해 제조된 화장료 조성물에 대한 피부주름 개선 효과(기기적 평가)를 측정하기 위하여 20세 이상의 여성 20명(평균연령 28.5세)을 각각 A, B 그룹으로 나누어 본 발명에 따른 실시예 1에 의해 제조된 화장료 조성물은 A그룹을 대상으로, 비교예 1에 의해 제조된 화장료 조성물은 B그룹에 적용하였다.
A, B 그룹 각각의 대상에게 팔의 상박 2X2 ㎠의 면적에(2회/일, 0.2g/회) 6주간 도포하면서, 투명한 실리콘 재질의 용액을 이용하여 피부주름의 레플리카(Replica)를 떠서 피부주름측정기(SKIN VISIOMETER SV400, C+K Electronics GmbH. Germany)로 피부주름변화를 측정하였다. 레플리카의 상을 CCD 카메라로 3차원적으로 분석하고, 각각의 주름의 거칠기(Rm: m은 1이상의 정수)의 합을 주름의 개수로 나눈 값인 하기 식 1의 평균주름거칠기(Rz)로 주름개선 효과를 분석하였다. 시험결과는 하기 표 4에 나타내었다.
| 평균주름거칠기(Rz, ㎛) | ||||||
| 실시예 1 | 비교예 1 | |||||
| T0 | T6 | △Rz | T0 | T6 | △Rz | |
| 피검자 1 | 122 | 60 | -62 | 120 | 86 | -34 |
| 피검자 2 | 120 | 33 | -87 | 117 | 42 | -75 |
| 피검자 3 | 96 | 22 | -74 | 132 | 60 | -62 |
| 피검자 4 | 121 | 46 | -75 | 115 | 59 | -56 |
| 피검자 5 | 119 | 25 | -94 | 128 | 50 | -78 |
| 피검자 6 | 140 | 27 | -113 | 125 | 33 | -92 |
| 피검자 7 | 133 | 35 | -98 | 120 | 49 | -71 |
| 피검자 8 | 136 | 33 | -103 | 142 | 108 | -34 |
| 피검자 9 | 115 | 20 | -95 | 98 | 16 | -82 |
| 피검자 10 | 123 | 51 | -72 | 119 | 44 | -75 |
| 평균 | -87.3 | -65.9 | ||||
상기 표 4에서 알 수 있는 바와 같이, 6주 후 본 발명에 따른 실시예 1은 평균주름거칠기(Rz)는 87.3㎛(p<0.01)이며, 비교예 1은 65.9㎛(p<0.01)으로서, 본 발명에 따른 화장료는 비교예 1 보다 약 32.5% 정도 주름이 더 개선되었다.
따라서 본 발명에 따른 면역세포 증식 배양액 혼합액을 함유하는 화장료 조성물은 주름개선효과가 매우 효과적으로 상승되었음을 알 수 있다.
2. 육안평가
상기 본 발명에 따른 실시예 1 및 비교예 1에 의해 제조된 화장료 조성물에 대한 피부주름 개선 효과(육안평가)를 측정하기 위하여 20세 이상의 여성 20명(평균연령 28.5세)을 각각 A, B 그룹으로 나누어 본 발명에 따른 실시예 1에 의해 제조된 화장료 조성물은 A그룹을 대상으로, 비교예 1에 의해 제조된 화장료 조성물은 B그룹에 적용하였다.
A, B 그룹 각각의 대상에게 주름이 있는 눈가를 중심으로 6주간 도포(2회/일)한 후, 숙련자의 객관적 평가와 피검자의 주관적 평가를 다음의 6등급으로 분류하여 평가함으로써 피부주름의 개선정도(ΔW)를 측정하였다. 결과는 하기 표 5 및 표 6에 나타내었다.
<피부주름개선 평가기준>
-3: 극히 심하게 악화 -2: 악화 -1: 약간 악화
0: 변화없음 1: 약간 개선 2: 개선 3: 매우 개선
| 피부주름 개선정도(△W) | ||||
| 실시예 1 | 비교예 1 | |||
| T0 | T6 | T0 | T6 | |
| 피검자 1 | 0 | 3 | 0 | 3 |
| 피검자 2 | 0 | 3 | 0 | 2 |
| 피검자 3 | 0 | 3 | 0 | 3 |
| 피검자 4 | 0 | 2 | 0 | 2 |
| 피검자 5 | 0 | 3 | 0 | 1 |
| 피검자 6 | 0 | 3 | 0 | 3 |
| 피검자 7 | 0 | 3 | 0 | 2 |
| 피검자 8 | 0 | 3 | 0 | 3 |
| 피검자 9 | 0 | 2 | 0 | 3 |
| 피검자 10 | 0 | 2 | 0 | 2 |
| △W(T6-T0) | 2.7 | 2.4 | ||
| 피부주름 개선정도(△W) | ||||
| 실시예 1 | 비교예 1 | |||
| T0 | T6 | T0 | T6 | |
| 피검자 1 | 0 | 3 | 0 | 2 |
| 피검자 2 | 0 | 2 | 0 | 3 |
| 피검자 3 | 0 | 3 | 0 | 1 |
| 피검자 4 | 0 | 2 | 0 | 2 |
| 피검자 5 | 0 | 3 | 0 | 2 |
| 피검자 6 | 0 | 2 | 0 | 1 |
| 피검자 7 | 0 | 3 | 0 | 3 |
| 피검자 8 | 0 | 3 | 0 | 3 |
| 피검자 9 | 0 | 2 | 0 | 3 |
| 피검자 10 | 0 | 2 | 0 | 2 |
| △W(T6-T0) | 2.5 | 2.2 | ||
상기 표 5 및 표 6에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 실시예 1에서는 숙련자의 객관적 평가와 피검자의 주관적 평가가 각각 2.7, 2.5로 비교예 1에 비해 숙련자의 객관적 평가에서는 12.5%, 피검자의 주관적 평가에서는 13.6% 증가한 것으로 나타나 본 발명의 면역세포 증식 배양액 혼합액을 함유한 화장료가 인간 지방줄기세포 배양액 추출물을 함유한 화장료보다 매우 효과적으로 주름을 개선시킴을 알 수 있다.
<실험예 3> 피부미백효과 : 멜라노사이트에서 멜라닌 생성에 대한 저해 효과
멜라노사이트는 마우스 유래 B-16 멜라노마(ATCC CRL 6323) 세포주를 구입하여 사용하였다. 멜라노마 세포주를 포도당 4.5 g/L, 10% 혈청, 1% 항생제가 함유된 DMEM 배지에 접종하여 50㎖ T-플라스크에 37℃에서 배양한다. 5% CO2 조건하에서 24시간 배양한 후, 0.02% EDTA가 함유된 0.05% 트립신(Trypsin)을 처리하여 세포를 분리한 후 50㎖ T-플라스크에 접종하여 48시간 배양한다. 이 때 세포수는 5.76 × 106 세포/플라스크이다. 여기에 적당 농도의 본 발명에 따른 실시예 1의 면역세포 증식 배양액 혼합액과 비교예 1에 시용된 인체유래지방줄기세포 배양액 추출물을 DMEM 배지에 희석시켜 배양된 멜라노마 세포에 처리하여 37℃에서 5일간 배양한다. 배양 후 배지를 모두 제거하고, 0.02% EDTA와 0.05%트립신을 함유한 살린-포스페이트 완충용액(PBS)을 1㎖ 처리하여 세포를 분리시킨 후 5분간 원심 분리하여 세포만을 수집한다. 5% 트리클로로아세테이트(TCA)를 처리하여 교반하고, 원심 분리하여 침전된 멜라닌을 살린-포스페이트 완충용액으로 세척한다. 침전된 멜라닌에 1N NaOH를 처리하여 용해시킨 후, 475nm에서 흡광도를 측정한다. 멜라닌 농도는 합성 멜라닌(시그마사)의 표준 농도 곡선으로부터 결정하였다. 실험 결과는 표 7에 나타내었다.
| 농도 (㎍/㎖) |
멜라닌 생성 억제율(%) | |
| 면역세포 증식 배양액 | 인체유래줄기세포배양액 | |
| 무처리 | - | - |
| 1 | 6.4 | 4.7 |
| 2 | 18.8 | 12.3 |
| 5 | 23.1 | 20.5 |
| 10 | 39.9 | 33.3 |
| 20 | 61.2 | 55.1 |
| 50 | 79.4 | 58.9 |
| 100 | 107.4 | 65.8 |
표 7에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 실시예 1의 면역세포 증식 배양액이 비교예 1에 사용한 인간 지방줄기세포 배양액을 처리했을 때 보다 높은 멜라닌 합성 억제효과가 높게 나타내어 본 발명은 멜라노사이트의 멜라닌 생성을 억제하여 피부 미백효과를 보임을 알 수 있다.
<실험예 4> 피부탄력 개선효과
상기 본 발명의 면역세포 증식 배양액을 함유하는 화장료 조성물인 실시예 1와 인체유래지방줄기세포 배양액 추출물을 함유하는 화장료 조성물인 비교예 1에 대한 피부탄력개선효과를 측정하였다.
온도 24-26℃, 습도 45% 조건에서 20세 이상의 여성 20명(평균연령 28.5세)을 각각 A, B 그룹으로 나누어 본 발명에 따른 실시예 1에 의해 제조된 화장료 조성물은 A그룹을 대상으로, 비교예 1에 의해 제조된 화장료 조성물은 B그룹에 눈가를 중심으로 6주간 도포(2회/일)한 후, 피부탄력측정기(Cutometer SEM 575, C+K Electronic Co., Germany)를 이용하여 피부탄력을 측정하였다. 시험 결과는 하기 표 7에 Cutometer SEM 575의 △R(R(사용 전)-R8(사용 후)) 값으로 기재하였는데, R 값은 피부 점탄성(viscoelasticity)의 성질을 나타낸다.
| 피부 점탄성 개선정도(△R) | ||
| 실시예 1 | 비교예 1 | |
| 피검자 1 | 0.45 | 0.43 |
| 피검자 2 | 0.37 | 0.41 |
| 피검자 3 | 0.49 | 0.30 |
| 피검자 4 | 0.51 | 0.42 |
| 피검자 5 | 0.27 | 0.33 |
| 피검자 6 | 0.44 | 0.25 |
| 피검자 7 | 0.46 | 0.28 |
| 피검자 8 | 0.59 | 0.31 |
| 피검자 9 | 0.22 | 0.24 |
| 피검자 10 | 0.45 | 0.35 |
| △R | 0.43 | 0.33 |
표 8 의 결과에서 알 수 있듯이 식물줄기세포 추출물 혼합액을 함유한 화장료 실시예 1은 비교예 1에 비해 피부 탄력이 30.3% 증가했다.
<실험예 5> 보습효과
상기 본 발명의 면역세포 증식 배양액을 함유하는 화장료 조성물인 실시예 1과 인체유래지방줄기세포 배양액을 함유하는 화장료 조성물인 비교예 1에 대한 피부 보습효과를 측정하였다. 측정 시에는 온도 24-26℃, 상대습도 45%, 공기의 흐름이 없는 실내에서 20~30분간 피부를 안정화시킨 뒤 측정하였다. 20세 이상의 여성 20명(평균연령 28.5세)을 각각 A, B 그룹으로 나누어 본 발명에 따른 실시예 1에 의해 제조된 화장료 조성물은 A그룹을 대상으로, 비교예 1에 의해 제조된 화장료 조성물은 B그룹에 눈가를 중심으로 6주간 도포(2회/일)한 후, TEWAMETER TM210(C+K electronic GmbH. Germany)를 이용하여 경피수분손실량 즉, TEWL(Transepidermal Water Loss)값을 시간 변화에 따른 TEWL 값 변화량 △TEWL로 측정하고, CORNEOMETER CM 820 PC(C+K electronic GmbH. Germany)를 이용하여 표피 수분량에 따른 전기전도도의 변화로 0에서 150까지 피부의 수분량을 수치화하여 보습효과를 측정하였다. 시험결과는 하기 표 9에 나타내었다.
| 시험제품 | △TEWL | Corneometer Value |
| 실시예 1 | 5.2 | 119 |
| 비교예 1 | 3.3 | 101 |
시험 결과, 실시예 1의 △TEWL 값은 5.2
로 비교예 1에 비해 경피수분손실량이 6주 후 매우 효과적으로 개선되었음을 알 수 있다.
아울러 피부의 수분량을 측정한 Corneometer value에서도 실시예 1이 비교예 1에 비해 각각 17.8% 증가하여 피부가 매우 촉촉해짐을 알 수 있다.
<실험예 6> 피부 안전성 시험
상기 본 발명에 따른 실시예 1의 면역세포 증식 배양액을 함유한 화장료 조성물에 대한 피부 안전성 시험을 실시하였다.
피검자 20명(평균연령 26.7세, 연령분포 18세-30세)을 대상으로 Haye's Test Chamber를 이용하여 상박에 피부 첩포시험(Patch Test)을 실시하였다. 단 건선(Psoriasis), 습진(Eczema), 기타 피부병변 보유자나 임신, 수유부 또는 피임제, 항히스타민제 등을 복용하고 있는 사람은 본 실험의 피검자에서 제외 하였다. 시험부위를 70% 에탄올로 닦아낸 뒤 건조시키고, 본 발명에 따른 실시예 1 및 비교예 1에서 제조된 화장료를 각각 15μg씩 Chamber에 적하 시킨 후, 시험 부위인 상박 부위에 얹어 고정시킨다. 첩포는 24시간 동안 도포하고 첩포를 제거한 후에는 Marking Pen으로 시험부위를 표시하여 각각 24시간, 48시간 후에 시험부위를 관찰한다. 판정은 첩포 제거 24시간, 48시간 후에 행하며 피부반응은 하기 표 10의 국제접촉피부염연구회(International Contact Dermatitis Research Group:ICDRG)의 규정에 따라 판정하였다. 시험결과는 하기 표 10에 나타내었다.
| 기호 | 판 정 기 준 | 평 가 | Mean Score |
| ± + ++ +++ - |
Doubtful or slight reaction and erythema Erythema + Induration Erythema + Induration + Vesicle Erythema + Induration + Bullae Negative |
미소자극 경자극 중자극 강자극 무자극 |
0~0.9 1.0~2.9 3.0~4.9 5.0이상 0 |
| 경과시간 | 실시예 1 | 비교예 1 |
| 24시간 | 0 | 0.0 |
| 48시간 | 0 | 0.0 |
표 11에서 알 수 있는 바와 같이, 피부안전성 시험 결과, 본 발명에 따른 실시예 1 및 비교예 1 모두 평균 자극정도가 0으로 피부에 자극이 없는 안전한 화장료임을 알 수 있다.
이상에서 본 발명의 실시예에 대해서 상세히 설명하였으나, 이는 하나의 실시예에 불과하며, 이로써 본 발명의 특허청구범위를 한정하는 것은 아니다. 본 실시예를 바탕으로 균등한 범위까지 당업자가 변형 및 추가하는 범위도 본 발명의 권리범위에 속한다 할 것이다.
없음
Claims (4)
- (a) 면역세포(T세포) 증식용 배지를 조성단계;
(b) 동물의 말초혈액에서 림프구를 추출하는 단계;
(c) 상기 림프구를 상기 배지에 혼합하여 상기 림프구에 포함된 면역세포(T세포)를 배양함으로써 면역세포 증식 배양 혼합액을 제조하는 단계;
(d) 상기 면역세포(T세포)를 상기 면역세포 증식 배양 혼합액으로부터 분리하여 면역세포 증식 배양액을 제조하는 단계; 및
(e) 화장료 성분을 상기 면역세포 증식 배양액에 혼합하는 단계를 포함하는 면역세포 증식 배양액이 함유된 화장료 조성물 제조방법.
- 제1항에 있어서,
상기 (b)단계는,
상기 동물의 말초혈액을 1.077 비중의 피콜 파크 플러스(Ficoll-Paque Plus)용액에 중첩시켜 원심력으로 원심 침전시켜, 비중의 차이에 따라 비중이 1.077보다 큰 적혈구와 과립구층은 아래로, 1.077 이하인 단핵세포층과 혈소판 등은 위로 분리되게 하여 림프구가 포함된 단핵세포층을 얻고, 분리된 단핵세포층으로부터 림프구만을 추출하는 과정으로 이루어진 것을 특징으로 하는 면역세포 증식 배양액이 함유된 화장료 조성물 제조방법.
- 제1항에 있어서,
상기 (c) 단계는,
(c1)상기 (b) 단계를 통해 수확한 상기 림프구를 L-글루타민(L-glutamine), 혈장(plasma)이 첨가된 배양액에서 항CD28, 항CD16의 존재하에 배양하여 1차 면역세포 증식 배양혼합액을 제조하는 단계;
(c2) 상기 1차 면역세포 증식 배양 혼합액에 혈장을 추가적으로 첨가하고, 배양액이 든 가스투과성 배양백에 상기 1차 면역세포 증식 배양 혼합액을 주입한 후, 더 배양함으로써 림프구를 다량으로 증식시키는 2차 면역세포 증식 배양액 제조 단계를 포함하는 면역세포 증식 배양액이 함유된 화장료 조성물 제조방법.
- 제1항에 있어서,
상기 (d) 단계는,
(d1) 원심분리하여 면역세포와 면역세포 증식 배양액을 각각 상층부와 하층부로 분리하는 단계;
(d2) 상기 분리된 면역세포 증식 배양액을 셀 스트레이너(Cell Strainer)와 마이크로 필터를 사용하여 필터링하는 단계를 포함하는 면역세포 증식 배양액이 함유된 화장료 조성물 제조방법.
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