KR20190114620A

KR20190114620A - 인체 지방줄기세포 배양액 추출물과 피디알앤을 함유하는 화장료 조성물

Info

Publication number: KR20190114620A
Application number: KR1020180037607A
Authority: KR
Inventors: 석재식; 구대학; 이원용; 박경원
Original assignee: (주)웰메이드코엔
Priority date: 2018-03-30
Filing date: 2018-03-30
Publication date: 2019-10-10
Also published as: WO2019190200A1; KR102043739B1

Abstract

본 발명의 목적은 인체 지방줄기세포 배양액 추출물과 피디알앤(PDRN)을 함유하는 화장료 조성물을 제공하는 것으로, 구체적으로 인체 지방줄기세포 배양액 추출물과 피디알앤(PDRN)을 함유하는 주름개선용, 미백용, 피부탄력 증진용, 보습용 및 발모촉진용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

Description

인체 지방줄기세포 배양액 추출물과 피디알앤을 함유하는 화장료 조성물{Cosmetic Composition containing Human Adipocyte Conditioned Media Extract and Polydeoxyribonucleotide}

본 발명은 인체 지방줄기세포 배양액 추출물과 피디알앤을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 인체 지방줄기세포 배양액 추출물과 피디알앤을 함유하는 주름개선용, 미백용, 탄력증진용, 보습용 및 발모촉진용 화장료 조성물에 관한 것이다.

화장료의 가장 큰 관심 분야는 노화와 관련된 주름, 색소침착, 탄력감소, 피부 건조화 및 탈모 또는 모발의 윤기 부족 등이다. 피부는 노화를 통해 다양한 변화를 맞게 된다. 먼저 피부의 구성 성분인 표피, 진피 및 피하조직의 두께가 얇아지고 피부에 탄력을 주는 ECM(Extracellular matrix) 성분이 변하게 된다.

피부결합조직을 이루고 있는 콜라겐(collagen), 엘라스틴(elastin), 프로티오글리칸(proteoglycans), 글루코스아미노글리칸(glucosaminoglycan), 라미닌(laminin), 파이브로넥틴(fibronectin) 등이 산화되어 그 기능을 잃음으로써 피부가 탄력을 잃고 주름이 과도하게 형성되면서 노인성 피부로 변화된다. 특히 ECM의 70~80%를 차지하는 콜라겐은 나이가 들면서 그 생성이 급격하게 저하되어 주름생성과 밀접한 관계를 가진다.

ECM(Extracellular matrix)의 결합조직섬유에는 아교섬유(교원섬유, collagen fiber), 세망섬유(reticular fiber), 탄력섬유(탄성섬유, elastic fiber)가 있으며, 이 중 피부결합조직의 70% 정도를 차지하고 있는 콜라겐은 피부의 섬유아세포(fibroblast)에서 대부분 형성된다. 나이가 들면서 피부 결합조직 내의 콜라겐 함량이 줄어드는데 이는 콜라겐 합성의 저하와 분해의 촉진에 의한 것이다. 따라서 콜라겐 생합성의 저하와 콜라겐 분해 촉진은 피부 주름 형성의 가장 큰 원인이라 할 수 있다.

콜라겐 생합성 과정은 전사 수준(Transcription level)과 번역전 수준(Post-translation level)에 관여하는 많은 요소들에 의해 조절을 받아 변화를 일으키며, 콜라겐 분해는 자외선 등에 의해 콜라겐을 분해하는 콜라겐네이즈(Collagenase)와 같은 MMP(Matrix metalloproteases)의 발현의 촉진으로 콜라겐 분해가 촉진되어 콜라겐 함량이 줄어든다. 아울러 외부 환경에 의해 콜라겐의 변형이 가속화되면서 피부는 주름이 많아지고 깊어지게 된다. 결과적으로 피부노화 현상은 세포의 비균질화, 엘라스틴의 소실, 콜라겐의 파괴, 콜라겐 합성의 감소 및 지연 등에 의해 나타난다. 따라서 피부노화 현상은 피부 표피에서도 일어나지만 이보다는 진피에서 일어나는 현상이라고 볼 수 있다.

피부는 노화가 진행되기 전에는 피부세포의 생리활성이 활발하여 진피(Dermis)에 있는 섬유아세포(fibroblast)에서는 피부의 탄력 및 주름형성 억제에 중요한 콜라겐(collagen)의 합성과 신진대사가 왕성하며, 또한 피부수분 유지에 필수적인 히알루론산(Hyaluronic acid)을 포함한 당단백질류인 GAGS(Glucosaminoglycans) 합성도 활발하여 피부에 탄력성, 부드러움, 유연성 및 보습성을 부여한다.

또한 표피에서는 기저세포(basal layer cell)의 증식(proliferation)이 활발하고, 피부세포간의 결합을 강화시키는 라미닌, 인테그린, 데스모좀과 같은 결합단백질(Adhesion protein)의 생성이 균형적으로 이루어져 피부 세포조직을 강화시켜 건강한 피부를 유지해 준다. 그러나 현대인의 피부는 외부의 각종 유해 환경 및 스트레스에 노출되어 다양한 손상을 받고 있고, 나이가 들면서 피부의 생리활성이 저하되고 손상된 피부의 회복속도가 느려지면서 피부는 탄력저하, 건조, 주름형성, 색소침착, 검버섯, 칙칙함 등의 다양한 피부노화 현상이 나타난다. 따라서 화장료의 가장 큰 목표는 이런 노화증세를 개선하는데 있고, 이를 위한 다양한 화장료가 개발되고 있다.

일반적으로, 피부탄력 감소, 피부주름, 색소침착 등의 피부노화현상은 콜라겐의 파괴, 콜라겐 합성의 감소, 엘라스틴의 소실 및 피부생리 저하에 따른 멜라닌 색소침착 등에 의해서 나타나는 것으로서, 피부 표피와 진피에서 일어나는 현상이라고 볼 수 있다. 최근, 피부 노화방지에 대한 피부 생리학적 연구가 많이 행해지고 있으며, 실제로 화장료에 있어서 피부주름방지를 위해 자외선 차단제, 항산화제, 세포활성촉진제 등이 사용되고 있고, 또한 콜라겐 합성에 따른 피부 주름개선 방법들이 제시되고 있다.

한편, 생화학 및 분자생물학의 발전을 기반으로 하여 우리 생체 내에 존재하는 성장인자와 같은 소량의 신호물질들이 발견되었으며, 이를 기반으로 한 생체의 노화이론이 재정립되고 있는 중이다. 또한 이 신호물질은 나이가 증가함에 따라 생체 내에서 감소하게 되는데 바로 이 성장인자의 감소가 우리의 노화와 밀접한 관계가 있다는 것이 밝혀지고 있다. 이러한 성장인자들은 각 조직의 기저에 존재하고 있는 줄기세포에서 다량 생산되고 있다.

일광 중 자외선과 같은 유해요소로부터 피부를 효과적으로 방어하지만 연령이 높아짐에 따라 피부조직이 점차 변화하면서 일광에 대한 방어 능력이 저하되며, 이로 인해 주름, 색소침착, 피부의 처짐, 피부 탄력의 상실, 피부의 거칠어짐, 피부의 건조함, 탈모 및 모발윤기 감소 등이 생기게 된다. 일광에 의한 이러한 영향이 축적되어 생긴 결과를 광노화라 부르기도 한다.

이러한 피부노화에 대한 문제점을 해결하기 위한 다양한 화장료 조성물이 연구되어지고 있는데 피부의 주름개선 효과는 일부에서 가시적인 성과를 보이고 있다. 현재 피부주름 및 기미, 색소침착 개선을 위해 널리 사용되고 있는 레티노이드류, 그중에서도 레티놀(retinol)에 대한 피부 주름제거 임상 결과들이 다양하게 보고되어지고 있는데, 레티놀을 함유한 화장료는 일광에 의해 형성된 피부주름살이나 피부처짐, 탄력감소 등을 효과적으로 개선하였다. 미국 특허 4,603,146 및 4,877,805 등에 콜라겐 합성과 콜라겐나아제 활성억제에 의한 콜라겐 분해억제에 효과적인 레티놀(비타민 A)을 이용한 주름개선 사례가 있다.

또한, 콜라겐 합성 과정에 필수적인 L-아스코르브산(비타민 C)을 함유하는 화장료 조성물이 피부주름개선, 자외선차단, 기미/주근깨/검버섯 등의 색소침착 등에 효과적이라는 보고가 있다(USP4,938,969/USP4,772,591/EP0533667).

뿐만 아니라, 각질제거에 효과가 있는 아하(α-Hydroxy acid : AHA) 함유 화장료 조성물 역시 과각질 제거와 함께 세포의 활성을 촉진하여 피부를 개선하는데 널리 사용되어지고 있다.

우리 몸은 약 210여 가지의 세포들로 구성되어 있고 각각의 세포는 고유의 특성을 유지하면서 생명활동을 담당하고 있다. 모든 생명체가 생명이 있듯이 우리 몸의 각각의 세포는 수명이 있고 끊임없이 죽고 대신 새로운 세포로 채워지게 된다. 바로 이러한 과정을 가능하게 하는 것이 줄기세포이다. 줄기세포는 조직이나 기관의 분화된 세포들 사이에 존재하는 미분화 세포로써, 끊임없이 스스로 증식하는 자가 재생능력(Self Renewal)과 신체내의 모든 조직세포로 분화할 수 있는 능력(Differentiation to specific tissue)을 가진 만능세포이다.

성체줄기세포는 조혈모세포, 중간엽줄기세포, 신경모세포, 상피모세포 등이 존재하며 조혈모세포의 경우 혈구 및 임파구를 생산할 수 있는 모세포로서 혈액암을 포함한 면역계 질환 치료에 도움이 되고, 중간엽줄기세포의 경우 뼈, 연골, 지방 및 섬유조직으로 분화되며 각 조직이 손상되었을 때 이들의 회복에 관여한다. 그러나 이러한 성체 줄기세포는 각각의 조직에 소량 존재하며 수년간 분열 혹은 증식을 하지 않고 잠잠하게 지내기도 한다. 즉, 줄기세포라 함은 이러한 분화능력은 가지고 있으나, 아직 분화는 일어나지 않은 미분화 세포이다. 이러한 미분화 상태에서 적절한 조건을 맞춰주면 줄기세포는 다양한 조직 세포로 분화할 수 있다. 따라서 줄기세포의 이러한 분화능력을 이용하여, 손상된 조직을 재생하는 등의 치료에 응용하기 위한 연구가 진행되고 있다.

줄기세포는 또 크게 배아줄기세포, 성체줄기세포로 나누어진다. 줄기세포는 출생 후부터 우리 몸에 있는 여러 종류의 조직에 존재하는 성체줄기세포 (Adult Stem Cell)와 인체 생명의 시초가 되는 수정란에서 유래하는 배아줄기세포 (Embryonic Stem Cell)의 두 종류로 구분될 수 있다. 성체줄기세포는 특정한 조직을 구성하는 세포로 즉, 골수세포는 혈구세포로, 피부줄기세포는 피부로, 신경세포는 후각신경세포로만 분화되도록 운명이 정해져 있는 세포이다. 줄기세포가 어떤 세포로 분화되느냐 하는 것은 그 줄기세포를 어떠한 환경에서 배양하느냐에 따라 좌우된다. 따라서 신경세포로 분화할 환경을 만들어 주면 신경세포가 되고, 피부세포로 분화할 환경을 만들어 주면 피부세포가 될 수 있는 것이다. 본 발명에서는 이러한 특성을 이용하여 화장품 조성물에 줄기세포배양 추출물을 응용하고자 하는 것이다.

인체 유래 지방줄기세포 배양액 추출물(Human adipocyte conditioned media extracts)을 생산하기 위한 줄기세포의 배양방법으로는 지방조직에서 지방을 제거한 세포를 여러 세대 배양해 줄기세포를 분리해 낸 후, 줄기세포 배양액으로부터 줄기세포가 만들어낸 단백질을 얻을 수 있다. 이 단백질 혼합물에는 EGF(표피세포성장인자), vEGF(혈관내피성장인자), TGF(형질전환성장인자), HGF(간세포증식인자), FGF(섬유아세포성장인자), IGF(인슐린유사성장인자) 등 150여 가지의 성장인자(growth factor) 단백질 성분을 포함하고 있는 것으로 보고되고 있다. 지방줄기세포는 성체줄기세포의 한 종류로써 골수줄기세포나 제대혈 줄기세포보다 채취하기가 쉽고 대량배양이 가능하면서도 줄기세포 함유량이 많기 때문에 지방줄기세포가 가장 많이 활용되고 있다. 하나의 세포가 증식하고 다른 종류로 분화하는데 있어서 가장 중요한 역할을 하는 것이 바로 성장 인자(growth factor)다. 이 성장 인자는 세포가 증식 또는 분화를 일으키는 신호를 세포 내부로 전달하는 역할을 하며, 이러한 신호를 바탕으로 세포는 분열, 분화를 하게 되어 피부를 생생하고 생기롭게 가꾸어주며 언제나 피부의 컨디션을 신선하고, 최상으로 만들어주는 상태를 유지할 수 있다. 줄기세포로부터 만들어낸 단백질들을 피부의 섬유아세포(fibroblast)에 처리하자 섬유아세포에서 생성되는 결합조직인 '콜라겐'의 양이 5배 이상 증가했으며 섬유아세포 자체의 증식도 30% 이상 증가했다. 섬유아세포는 피부의 진피층을 형성하는 콜라겐을 생산하는 세포이며 콜라겐의 양이 줄어들면 피부 탄력이 줄고 주름이 늘어나는 특징을 가지고 있다. 줄기세포는 다 분화능을 지닌 세포로서 in vitro 뿐만 아니라 in vivo 조건에서 뼈, 연골, 인대, 지방, 심근, 근육 등의 세포로의 분화 능력을 지니고 있는 다분화능 세포이다. 이러한 다분화능 세포인 줄기세포는 각 조직 세포로의 분화기전 연구에 있어 좋은 모델로 이용되고 있을 뿐만 아니라, 현재 다양한 세포 치료법 개발에 이용되고 있다. 세포 치료 대상 세포로서의 응용적 측면에서 볼 때, 중간엽 줄기세포는 세포의 채취가 상대적으로 쉽고 안전하며 자가 이식이 가능하다는 점에서 배아줄기세포에 비해 많은 장점을 가지고 있다. 앞에서 언급한 장점들로 인하여 줄기세포를 이용한 심근경색, 골절, 연골 손상, 뇌졸중 등 다양한 질병의 치료법이 연구되고 있다. 그러나 줄기세포는 배아줄기 세포와는 달리 생체외에서 배양 시 활용할 수 있는 줄기세포로서, 그 수명이 매우 짧고 분화능도 짧은 기간 동안만 보유한다. 이러한 줄기세포의 제한된 수명은 해당 세포의 활용에 있어 큰 제약이 되고 있다.

화장품 분야에서의 줄기세포의 이용은 대사 산물로서의 성장인자를 이용하는 것이다. 성장인자들은 세포의 표면에 있는 수용체와 결합하여 세포의 증식과 분화를 자극하는 작용을 하는 단백질이다. 성장인자들의 기능은 매우 다양하여 여러 가지 세포에 분열을 자극하는 작용을 하기도 하는 반면, 어떤 경우에는 특이한 세포형에만 작용하기도 한다. 성장인자는 세포 증식의 자극을 위해서 필수적인 성분으로서 세포 분화, 이주, 증식과정을 조절한다는 것이 밝혀졌다. 특이적 수용체에 성장인자가 결합하게 되면 신호 전달 사슬을 활성화하여 세포의 외부로부터 내부의 핵으로 신호가 전달된다. 신호 전달이 계속되면 다량의 다른 전달자와 같이 작용하여 최종적으로 새로운 단백질이 합성된다. 그러므로 성장인자는 세포간 상호작용의 전달, 기능 제어에 있어서 중요한 신호 전달 네트워크를 형성하게 된다. 또한 생쥐를 대상으로 한 피부 상처 재생 실험 결과에서도 줄기세포 유래 단백질을 적용했을 때 적용하지 않은 경우보다 상처 크기가 40%이상 줄어드는 것을 확인할 수 있다. 아울러 색소침착 현상을 나타내는 피검자를 대상으로 한 미백효과에서도 좋은 결과를 보여 화장품 원료로서 강한 효능효과 및 안전성을 확보하고 있다.

피디알앤(폴리데옥시리보뉴클레오티드(Polydeoxyribonucleotide); PDRN)은 특정 규격의 뉴클레오티드 분절체로서 회귀 어류인 연어에서 추출한 소듐디앤에이(Sodium DNA)이다. 이미 주사제 의약품으로 사용되며, 안정성과 효능이 입증된 PDRN은 조직재생 효능을 가지고 있으며, 피부재생 신호전달체인 A2 수용체를 자극하여 각종 성장인자 분비촉진, 혈관내피세포증식인자(Vascular endothelial growth factor; VEGF)에 의한 모세혈관의 생성, 혈액순환 개선, 항염증 작용 및 모세혈관 누출방지 기능을 한다. 또한 피디알앤(PDRN)은 인체 세포에 상시 존재하며 생리적으로 섬유아세포(fibroblast)의 재생 및 대사활성을 자극하여 최상의 컨디션을 유지할 수 있도록 돕는 작용을 한다. 이런 PDRN(Polydeoxyribonucleotide)은 특별한 부작용 없이 피부재생을 촉진하여 화상 등 창상에 의한 상처치료에 효과가 있다는 연구결과가 발표되어 많은 관심을 받고 있으며, 신속한 조직 재생으로 상처 치유시간 단축 및 세포재생활성화, Collagenic과 Non-collagenic protein 생성을 동시에 촉진하여 normal matrix를 형성하고, 각종 세포(stem cell, fibroblast, osteoblast, chondrocyte 등)의 분화를 촉진하여 VEGF induction 및 micro circulation 개선하고, 항 염증 작용도 갖고 있다. 이외에도 탈모 치료에 관한 다양한 연구가 진행되어 탈모치료에 PDRN을 이용한 모낭세포 재생, 두피모세혈관 생성, 두피조직 재생 등 PDRN을 활용한 새로운 치료법으로 등장하고 있다. PDRN은 두피의 혈액순환을 개선하여 시술 후 4~6주면 신생모를 관찰할 수 있어 환자들의 만족도가 높다．또한, 모발이식 때 PDRN을 사용하게 되면 기존 PRP 치료의 단점이 보완돼 이식된 모발의 생착률 및 이식 후 발생하는 부종을 현저히 완화시킬 수 있다. 뿐만아니라 PDRN은 피부줄기세포인 섬유아세포를 재생·성장시키고, 콜라겐이나 엘라스틴 등의 탄력섬유를 생성해 손상된 피부를 빠르게 재생시켜 주며, 피부혈액순환을 개선해 피부를 더욱 탄력 있게 유지시켜주는 효과를 갖고 있어 다양한 피부줄기세포와 함께 사용 시 줄기세포의 효과를 극대화 시킬 수 있는 매우 효과적인 방법이라고 판단되었다.

본 발명자들은 인체 지방줄기세포의 배양액 추출물과 피디알앤(Polydeoxyribonucleotide; PDRN)을 유효성분으로 하는 화장료 조성물이 주름개선 효과, 미백효과, 피부탄력 증진효과, 보습 효과 및 발모 촉진 효과가 매우 우수함을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

한국등록특허 제10-1627562호는 인체 지방줄기세포 배양액 추출물과 히아루론산을 함유하는 화장료 조성물에 관하여 개시되어 있다. 또한, 한국공개특허 제10-2017-0068857호는 폴리데옥시리보뉴클레오티드를 이용한 항염 및 피부 재생용 조성물에 관하여 개시되어 있다.

본 발명의 목적은 인체 지방줄기세포 배양액 추출물과 피디알앤(Polydeoxyribonucleotide; PDRN)을 함유하는 화장료 조성물을 제공하는 것으로, 구체적으로 인체 지방줄기세포 배양액 추출물과 피디알앤(PDRN)을 함유하는 주름개선용, 미백용, 피부탄력 증진용, 보습용 및 발모촉진용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 인체 지방줄기세포 배양액 추출물과 피디알앤(PDRN)을 함유하는 주름개선용 화장료 조성물로서, 상기 화장료 조성물은 화장료의 총 중량에 대하여 0.01 내지 10 중량%의 인체 지방줄기세포 배양액 추출물 및 0.01 내지 2.0 중량%의 피디알앤(PDRN)을 포함하고, 상기 인체 지방줄기세포 배양액 추출물과 피디알앤(PDRN)의 중량비는 1:1 내지 10:1이다.

본 발명은 인체 지방줄기세포 배양액 추출물과 피디알앤(PDRN)을 함유하는 미백용 화장료 조성물로서, 상기 화장료 조성물은 화장료의 총 중량에 대하여 0.01 내지 10 중량%의 인체 지방줄기세포 배양액 추출물 및 0.01 내지 2.0 중량%의 피디알앤(PDRN)을 포함하고, 상기 인체 지방줄기세포 배양액 추출물과 피디알앤(PDRN)의 중량비는 1:1 내지 10:1이다.

본 발명은 인체 지방줄기세포 배양액 추출물과 피디알앤(PDRN)을 함유하는 피부탄력 증진용 화장료 조성물로서, 상기 화장료 조성물은 화장료의 총 중량에 대하여 0.01 내지 10 중량%의 인체 지방줄기세포 배양액 추출물 및 0.01 내지 2.0 중량%의 피디알앤(PDRN)을 포함하고, 상기 인체 지방줄기세포 배양액 추출물과 피디알앤(PDRN)의 중량비는 1:1 내지 10:1이다.

본 발명은 인체 지방줄기세포 배양액 추출물과 피디알앤(PDRN)을 함유하는 보습용 화장료 조성물로서, 상기 화장료 조성물은 화장료의 총 중량에 대하여 0.01 내지 10 중량%의 인체 지방줄기세포 배양액 추출물 및 0.01 내지 2.0 중량%의 피디알앤(PDRN)을 포함하고, 상기 인체 지방줄기세포 배양액 추출물과 피디알앤(PDRN)의 중량비는 1:1 내지 10:1이다.

또한, 본 발명은 인체 지방줄기세포 배양액 추출물과 피디알앤(PDRN)을 함유하는 발모촉진용 화장료 조성물로서, 상기 화장료 조성물은 화장료의 총 중량에 대하여 0.01 내지 10 중량%의 인체 지방줄기세포 배양액 추출물 및 0.01 내지 2.0 중량%의 피디알앤(PDRN)을 포함하고, 상기 인체 지방줄기세포 배양액 추출물과 피디알앤(PDRN)의 중량비는 1:1 내지 10:1이다.

본 발명에 따른 인체 지방줄기세포 배양액 추출물과 피디알앤(PDRN)을 함유하는 화장료 조성물을 사용함으로써, 기존 인체 지방줄기세포 배양액 추출물 또는 피디알앤(PDRN)만 함유한 화장료 조성물 보다 우수한 피부의 주름개선효과, 미백 효과, 피부탄력 증진효과, 보습효과 및 발모촉진 효과를 얻을 수 있다.

상기 인체 지방줄기세포 배양액 추출물은 지방줄기세포를 배양하여 얻을 수 있는 배양액 및 배양한 지방줄기세포를 파쇄하여 얻을 수 있는 모든 추출물을 포함한다.

상기 인체 지방줄기세포는 배아줄기세포를 제외한 성체로부터 얻어지는 줄기세포를 의미하며, 골수, 재대혈 및 말초혈액을 포함하는 혈액 및 조직의 기저에서 기원되는 줄기세포를 모두 포함하며, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 인체 지방줄기세포 배양액 추출물의 유효 성분은 주로 세포의 성장을 조절하는 펩타이드와 단백질로서, 예를 들면 PDGF(혈소판 유래 성장인자), Basic FGF(염기성 섬유아세포 성장인자), KGF(각질세포 성장인자), TGF-β1(형질변환성장인자), HGF(간세포 성장인자), VEGF(혈관내피 성장인자), 콜라겐, 파이브로넥틴, SOD(항산화 효소) 등을 포함하며, 이에 제한되지 않는다. 상기 인체 줄기세포 배양액 추출물은 상기한 성장인자를 함유하고 있기 때문에 피부 구성세포인 섬유아세포 이동 촉진, 활성화 효과, 피부 재생 및 항노화 효과, 콜라겐합성 증가, 티로시나제의 활성 억제 효과, 멜라닌 합성 억제, 모발 성장 및 축소된 모낭 복원 효과를 기대할 수 있다.

본 발명의 인체 지방줄기세포 배양액 추출물은 미국특허 제6,153,432호(2000.11.28)에서 명시된 방법으로 얻을 수 있다. 먼저, 지방 흡입술을 통해 얻어진 지방조직으로부터 지방줄기세포를 분리한다. 이를 기질 배지에 현탁시켜 배양 용기에 접종한 후 37℃, CO₂ 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하여 지방줄기세포가 배양용기 바닥에 붙으면 기질 배지를 제거하고 분화배지(DIFFERENTIATION MEDIA)를 넣는다. 이를 3일 동안 배양한 후 지방세포 배지(adipocyte media)를 넣고 지방세포로 분화시킨다. 지방줄기세포의 분화 단계는 분화 초기에 세포질 내 작은 지질 방울의 형성이 시작되는 단계, 작은 지질 방울의 수가 점차 증가하는 단계, 그리고 작은 지질 방울들이 점점 합쳐져 큰 지질 방울을 형성하는 단계를 거치면서 성숙하고, 완전히 성숙하면 한 개의 지질 방울이 세포질 전체를 차지하게 되며 성숙과정 동안 세포의 크기도 점차 증가하게 된다. 이와 같은 지방유래 세포를 얻는 단계에서, 배양 배지를 무혈청 DMEM 배지로, 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF; basic Fibroblast Growth Factor) 및/또는 표피세포 성장 인자(EGF; Epidermal Growth Factor)를 각각 0.1~100 ng/㎖ 농도로 더욱 포함하는 DMEM 배지로 배양하여 얻어진 배양액을 분리 정제하여 본 발명의 지방줄기세포 배양액 추출물로 사용하였다.

상기 본 발명의 피디알앤(PDRN)은 폴리데옥시리보뉴클레오티드(Polydeoxyribonucleotide)의 약자로 DNA 조각이나 일반 DNA와 달리 유전정보를 전달하지 않고 약리학적 활성을 나타낸다고 해서 피디알앤(PDRN)이라고 부른다. 이는 연어(Oncorhynchus keta)나 송어(Oncorhynchus mykiss) 정액에서 추출한 뒤 고열 처리하여 얻은 순도 95% 이상의 활성형인 순수한 피디알앤(PDRN)으로 INCI명은 소듐디앤에이(Sodium DNA)이다. 여기서 말하는 PDRN(폴리디옥시리보뉴클레오티드, polydeoxyribonucleotide)은 특정 사이즈의 DNA 중합체로 이뤄져 있으며 생체조직 내에 투여되면 DNA의 합성을 촉진할 뿐 아니라 과도한 염증반응이나 조직생산에 대해 빠른 재생을 촉진하는 역할을 한다. 특히 신속한 항염증 및 조직재생효과로 상처치유 시간을 단축시키고 세포재생을 활성화시키며, 콜라겐을 함유해 각종 단백질 생성을 활성화하고 다양한 세포의 분화를 촉진하는 것이 특징이다.

피부재생 신호전달체인 A2 수용체를 자극하여 각종 성장인자 분비촉진, VEGF(Vascular endothelial growth factor 혈관내피세포증식인자)에 의한 모세혈관의 생성, 혈액순환 개선, 항염증 작용 및 모세혈관 누출방지 기능을 한다. 또한 피디알앤(PDRN)은 인체 세포에 상시 존재하며 생리적으로 섬유아세포(fibroblast)의 재생 및 대사활성을 자극하여 최상의 컨디션을 유지할 수 있도록 돕는 작용을 한다. 이런 PDRN(Polydeoxyribonucleotide)은 특별한 부작용 없이 피부재생을 촉진하여 화상 등 창상에 의한 상처치료에 효과가 있다는 연구결과가 발표되어 많은 관심을 받고 있으며, 신속한 tissue regeneration으로 상처치유시간 단축 및 세포재생활성화, Collagenic과 Non-collagenic protein 생성을 동시에 촉진하여 normal matrix를 형성하고, 각종 세포(stem cell, fibroblast, osteoblast, chondrocyte 등)의 분화를 촉진하여 VEGF induction 및 micro circulation 개선하고, 항 염증 작용도 갖고 있다. 이외에도 탈모 치료에 관한 다양한 연구가 진행되어 탈모치료에 PDRN을 이용한 모낭세포 재생, 두피모세혈관 생성, 두피조직 재생등 PDRN을 활용한 새로운 치료법으로 등장하고 있다. PDRN은 두피의 혈액순환을 개선하여 시술 후 4~6주면 신생모를 관찰할 수 있어 환자들의 만족도가 높다．또한, 모발이식 때 PDRN을 사용하게 되면 기존 PRP 치료의 단점이 보완돼 이식된 모발의 생착률 및 이식 후 발생하는 부종을 현저히 완화시킬 수 있다. 또한, PDRN은 피부줄기세포인 섬유아세포를 재생·성장시키고, 콜라겐이나 엘라스틴 등의 탄력섬유를 생성해 손상된 피부를 빠르게 재생시켜 주며, 피부혈액순환을 개선해 피부를 더욱 탄력 있게 유지시켜주는 효과를 갖고 있어 다양한 피부줄기세포와 함께 사용 시 줄기세포의 효과를 극대화 시킬 수 있는 매우 효과적인 방법이라고 판단되었다.

본 발명의 화장료 조성물은 화장료의 총 중량에 대하여 0.01 내지 10.0 중량%의 인체 지방줄기세포 배양액 추출물 및 0.01 내지 2.0 중량%의 피디알앤(PDRN)을 포함할 수 있다. 또한, 인체 지방줄기세포 배양액 추출물과 피디알앤(PDRN)의 중량비는 1:1 내지 10:1일 수 있고, 바람직하게는 1:1 내지 5:1일 수 있다.

본 발명의 구체적인 예시에 따르면, 인체 지방줄기세포 배양액 추출물과 피디알앤(PDRN)을 유효성분으로 함유하는 본 발명의 화장료 조성물은 피부주름 개선 효과, 미백 효과, 피부탄력 증진효과, 보습효과 및 발모촉진 효과 등과 같은 피부 노화방지 효과를 갖는다.

이하에서 실시예와 실험예를 들어서 본 발명을 상세하게 설명하지만, 이러한 실시예와 실험예에 의하여 본 발명의 권리범위가 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 화장료 조성물을 위해 아래 실시예와 같이 인체 지방줄기세포 배양액 추출물과 피디알앤(PDRN)을 함유하는 화장료를 제조하였다.

실시예 1. 인체 지방줄기세포 배양액 추출물과 피디알앤(PDRN)을 함유하는 화장료의 제조

하기 표 1과 같이 인체 지방줄기세포 배양액 추출물과 피디알앤(PDRN)을 함유한 조성물(실시예 1)과 인체 지방줄기세포 배양액 추출물만을 함유한 조성물(비교실시예 1) 및 피디알앤(PDRN)만을 함유한 조성물(비교실시예 2)을 제조하였다.

단위:중량%
성분		실시예 1	비교실시예 1	비교실시예 2
인체 지방줄기세포 배양액 추출물		10.0	12.0	-
피디알앤(PDRN)		2.0	-	12.0
A	아라키딜알콜	3.0	3.0	3.0
	글리세릴스테아레이트	1.5	1.5	1.5
	스쿠알란	5.0	5.0	5.0
	하이드록시폴리데신	2.0	2.0	2.0
	트리옥타노인	5.0	5.0	5.0
	폴리솔베이트 80	1.0	1.0	1.0
	솔비탄스테아레이트	0.5	0.5	0.5
	사이클로펜타실록산	3.0	3.0	3.0
	토코페릴아세테이트	0.2	0.2	0.2
	BHT	0.05	0.05	0.05
B	정제수	잔량	잔량	잔량
	농글리세린	4.0	4.0	4.0
	1,3-부틸렌글리콜	2.0	2.0	2.0
	디메치콘/비닐디메치콘크로스폴리머	0.4	0.4	0.4
	EDTA-2Na	0.05	0.05	0.05
향,방부제		적량	적량	적량
계		100	100	100

실험예 1. 피부주름개선효과

1. 기기적 평가

상기 본 발명에 따른 실시예 1에 의해 제조된 화장료 조성물에 대한 피부주름 개선 효과(기기적 평가)를 측정하기 위하여 20세 이상의 여성 30명(평균연령 45.5세)을 각각 A, B, C 세 그룹으로 나누어, 본 발명에 따른 상기 표1의 실시예 에 의해 제조된 화장료 조성물을 A그룹에는 실시예 1을, B그룹에는 비교실시예 1를, C그룹에는 비교실시예 2를 각각 적용하였다.

A, B, C 그룹 각각의 대상에게 팔의 상박 2X2 ㎠의 면적에(2회/일, 0.2g/회) 6주간 도포하면서, 투명한 실리콘 재질의 용액을 이용하여 피부주름의 레플리카(Replica)를 떠서 피부주름측정기(SKIN VISIOMETER SV400, C+K Electronics GmbH. Germany)로 피부주름변화를 측정하였다. 레플리카의 상을 CCD 카메라로 3차원적 분석하고, 각각의 주름의 거칠기(R_m: m은 1이상의 정수)의 합을 주름의 개수로 나눈 값인 하기 식 1의 평균주름거칠기(R_z)로 주름개선 효과를 분석하였다. 시험결과는 하기 표 2에 나타내었다.

피부주름개선효과(6주)

	평균주름거칠기(R_z _,㎛)
	실시예 1			비교실시예 1			비교실시예 2
	T0	T6	△R_z	T0	T6	△R_z	T0	T6	△R_z
피검자 1	125	51	-74	129	88	-41	128	84	-44
피검자 2	130	45	-85	126	50	-76	122	71	-51
피검자 3	90	32	-58	115	77	-38	110	90	-20
피검자 4	125	33	-92	119	58	-61	129	101	-28
피검자 5	128	20	-108	135	68	-67	126	53	-73
피검자 6	135	21	-114	126	42	-84	133	72	-61
피검자 7	145	35	-110	125	50	-75	125	89	-36
피검자 8	147	41	-106	127	87	-40	133	73	-60
피검자 9	124	26	-98	118	45	-73	126	46	-80
피검자 10	139	47	-92	129	61	-68	121	51	-70
평균			-93.7			-62.3			-52.3

상기 표 2에서 알 수 있는 바와 같이, 6주 후 본 발명에 따른 실시예 1은 평균주름거칠기(R_z)는 93.7㎛(p<0.01) 감소하였고, 비교실시예 1은 62.3㎛(p<0.05), 비교실시예 2는 52.3㎛(p<0.05) 감소하여, 본 발명에 따른 인체 지방줄기세포 배양액 추출물과 피디알앤(PDRN)을 함유하는 화장료는 인체지방줄기세포배양액만을 함유하는 비교실시예 1 보다 약 33.5%, 비교실시예 2보다는 44.2% 주름개선 효과를 보였다.

따라서 본 발명에 따른 인체 지방줄기세포 배양액 추출물과 피디알앤(PDRN)을 함유하는 화장료는 인체 지방줄기세포 배양액 추출물이나 피디알앤(PDRN)을 단독으로 함유하는 화장료보다 주름개선효과가 매우 효과적으로 상승되었음을 알 수 있다.

2. 육안평가

상기 본 발명에 따른 인체 지방줄기세포 배양액 추출물과 피디알앤(PDRN)을 함유하는 실시예에 의해 제조된 화장료 조성물에 대한 피부주름 개선 효과(육안 평가)를 측정하기 위하여 20세 이상의 여성 30명(평균연령 45.5세)을 각각 A, B, C 세 그룹으로 나누어, 본 발명에 따른 상기 표1의 실시예에 의해 제조된 화장료 조성물을 A그룹에는 실시예 1을, B그룹에는 비교실시예 1를, C그룹에는 비교실시예 2를 각각 적용하였다.

A, B, C 그룹 각각의 대상에게 주름이 있는 눈가를 중심으로 6주간 도포(2회/일)한 후, 숙련자의 객관적 평가와 피검자의 주관적 평가를 다음의 6등급으로 분류하여 평가함으로써 피부주름의 개선정도(ΔW)를 측정하였다. 결과는 하기 표 3 및 표 4에 나타내었다.

<피부주름개선 평가기준>

-3: 극히 심하게 악화 -2: 악화 -1: 약간 악화

0: 변화없음 1: 약간 개선 2: 개선 3: 매우 개선

피부주름개선 임상효과(숙련자의 객관적 평가)

	피부주름 개선정도(△W)
	실시예 1		비교실시예 1		비교실시예 2
	T0	T6	T0	T6	T0	T6
피검자 1	0	3	0	2	0	1
피검자 2	0	3	0	2	0	1
피검자 3	0	3	0	1	0	1
피검자 4	0	2	0	2	0	2
피검자 5	0	3	0	1	0	1
피검자 6	0	2	0	2	0	1
피검자 7	0	3	0	2	0	2
피검자 8	0	2	0	2	0	1
피검자 9	0	3	0	2	0	2
피검자 10	0	3	0	2	0	3
△W(T6-T0)	2.7		1.8		1.5

피부주름개선 임상효과(피검자의 주관적 평가)

	피부주름 개선정도(△W)
	실시예 1		비교실시예 1		비교실시예 2
	T0	T6	T0	T6	T0	T6
피검자 1	0	3	0	2	0	2
피검자 2	0	2	0	2	0	2
피검자 3	0	3	0	1	0	1
피검자 4	0	2	0	2	0	2
피검자 5	0	3	0	2	0	2
피검자 6	0	3	0	1	0	1
피검자 7	0	3	0	3	0	2
피검자 8	0	3	0	2	0	2
피검자 9	0	2	0	2	0	1
피검자 10	0	2	0	2	0	1
△W(T6-T0)	2.6		1.9		1.6

상기 표 3 및 표 4에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 인체 지방줄기세포 배양액 추출물과 피디알앤(PDRN)을 함유하는 실시예 1에서는 숙련자의 객관적 평가와 피검자의 주관적 평가가 각각 2.7, 2.6으로 숙련자의 객관적 평가에서는 비교실시예 1보다는 33.3%, 비교실시예 2보다 44.4% 증가하였고 피검자의 주관적 평가에서는 비교실시예 1보다는 26.9%, 비교실시예 2보다는 38.5% 증가한 것으로 나타나 본 발명의 인체 지방줄기세포 배양액 추출물과 피디알앤(PDRN)을 함유한 화장료가 인체 지방줄기세포 배양액 추출물이나 피디알앤(PDRN) 만을 함유한 화장료보다 매우 효과적으로 주름을 개선시킴을 알 수 있다.

실험예 2. 피부미백효과(멜라노사이트에서 멜라닌 생성에 대한 저해효과)

멜라노사이트는 마우스 유래 B-16 멜라노마(ATCC CRL 6323) 세포주를 구입하여 사용하였다. 멜라노마 세포주를 포도당 4.5 g/L, 10% 혈청, 1% 항생제가 함유된 DMEM 배지에 접종하여 50㎖ T-플라스크에 37℃에서 배양한다. 5% CO₂조건하에서 24시간 배양한 후, 0.02% EDTA가 함유된 0.05% 트립신(Trypsin)을 처리하여 세포를 분리한 후 50㎖ T-플라스크에 접종하여 48시간 배양한다. 이 때 세포수는 5.76 × 10⁶ 세포/플라스크이다. 여기에 본 발명의 인체 지방줄기세포 배양액 추출물과 피디알앤(PDRN)을 각각 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100㎍/㎖로 DMEM 배지에 희석시켜 배양된 멜라노마 세포에 처리하여 37℃에서 5일간 배양한다. 배양 후 배지를 모두 제거하고, 0.02% EDTA와 0.05%트립신을 함유한 살린-포스페이트 완충용액(PBS)을 1㎖ 처리하여 세포를 분리시킨 후 5분간 원심 분리하여 세포만을 수집한다. 5% 트리클로로아세테이트(TCA)를 처리하여 교반하고, 원심 분리하여 침전된 멜라닌을 살린-포스페이트 완충용액으로 세척한다. 침전된 멜라닌에 1N NaOH를 처리하여 용해시킨 후, 475nm에서 흡광도를 측정한다. 멜라닌 농도는 합성 멜라닌(시그마사)의 표준 농도 곡선으로부터 결정하였다. 실험 결과는 표 5에 나타내었다.

멜라노사이트에서 멜라닌 합성 저해 효과

농도 (㎍/㎖)	멜라닌 생성 억제율(%)
농도 (㎍/㎖)	인체 지방줄기세포 배양액 추출물 + 피디알앤(PDRN) (5:1)	인체 지방줄기세포 배양액 추출물	피디알앤(PDRN)
무처리	-	-	-
1	10.0	4.8	5.5
2	18.2	12.8	11.8
5	35.5	23.7	28.1
10	43.9	26.2	33.9
20	51.6	29.9	39.3
50	62.9	38.1	51.0
100	82.1	45.3	65.5

표 5에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 실시예 1의 인체 지방줄기세포 배양액 추출물과 피디알앤(PDRN)을 5:1의 혼합 중량비로 혼합한 경우가 비교실시예 1의 인체 지방줄기세포 배양액 추출물만 처리한 경우와 비교실시예 2의 피디알앤(PDRN)만 처리한 경우보다 멜라닌 합성 억제효과가 높게 나타났다. 이를 통하여, 본 발명의 인체 지방줄기세포 배양액 추출물과 피디알앤(PDRN)을 함께 사용했을 때 인체 지방줄기세포 배양액 추출물이나 피디알앤(PDRN)을 단독으로 사용하였을 때보다 멜라노사이트의 멜라닌 생성을 더 효과적으로 억제하여 피부 미백효과를 나타내는 것을 알 수 있다.

실험예 3. 피부탄력 증진효과

상기 본 발명의 인체 지방줄기세포 배양액 추출물과 피디알앤(PDRN)을 함유하는 화장료 실시예 1과 인체 지방줄기세포 배양액 추출물만을 함유하는 화장료 비교실시예 1, 피디알앤(PDRN)만을 함유하는 화장료 비교실시예 2에 대한 피부탄력개선효과를 측정하였다.

온도 24-26℃, 습도 45% 조건에서 20세 이상의 여성 30명(평균연령 45.5세)을 각각 A, B, C 세 그룹으로 나누어, 본 발명에 따른 상기 표1의 실시예 1에 의해 제조된 화장료 조성물은 A그룹에, 비교실시예 1는 B그룹에, 비교실시예 2는 C그룹에 각각 눈가를 중심으로 6주간 도포(2회/일)한 후, 피부탄력측정기(Cutometer SEM 575, C+K Electronic Co., Germany)를 이용하여 피부탄력을 측정하였다. 시험 결과는 하기 표 6에 Cutometer SEM 575의 △R(R(사용 전)-R8(사용 후)) 값으로 기재하였다. R 값은 피부 점탄성(viscoelasticity)의 성질을 나타낸다.

피부탄력(6주 후)

	피부 점탄성 개선정도(△R)
	실시예 1	비교실시예 1	비교실시예 2
피검자 1	0.62	0.40	0.49
피검자 2	0.35	0.43	0.47
피검자 3	0.58	0.37	0.35
피검자 4	0.67	0.32	0.58
피검자 5	0.45	0.37	0.39
피검자 6	0.49	0.28	0.33
피검자 7	0.61	0.26	0.39
피검자 8	0.57	0.32	0.31
피검자 9	0.41	0.29	0.30
피검자 10	0.49	0.39	0.47
△R	0.52	0.34	0.41

표 6의 결과에서 알 수 있듯이 인체 지방줄기세포 배양액 추출물과 피디알앤(PDRN)을 함유한 화장료 실시예 1은 인체 지방줄기세포 배양액 추출물만을 함유하는 비교실시예 1에 비해 피부 탄력이 34.6%, 피디알앤(PDRN)만을 함유하는 비교실시예 2에 비해서는 21.2% 증가하여 인체지방줄기세포 배양액 추출물 및 피디알앤(PDRN)만을 함유하는 화장료에 비해 매우 효과적으로 피부탄력을 증진시켰다.

실험예 4. 보습효과

상기 본 발명의 인체 지방줄기세포 배양액 추출물과 피디알앤(PDRN)을 함유하는 화장료 실시예 1과 인체 지방줄기세포 배양액 추출물만을 함유하는 화장료 비교실시예 1과 피디알앤(PDRN)만을 함유하는 화장료 비교실시예 2에 대한 피부 보습효과를 측정하였다. 측정 시에는 온도 24-26℃, 상대습도 45%, 공기의 흐름이 없는 실내에서 20~30분간 피부를 안정화시킨 뒤 측정하였다. 20세 이상의 여성 30명(평균연령 45.5세)을 각각 A, B, C 그룹으로 나누어 본 발명에 따른 실시예 1에 의해 제조된 화장료 조성물은 A그룹에, 비교실시예 1에 의해 제조된 화장료 조성물은 B그룹에, 비교실시예 2에 의해 제조된 화장료 조성물은 C그룹에 눈가를 중심으로 6주간 도포(2회/일)한 후, TEWAMETER TM210(C+K electronic GmbH. Germany)를 이용하여 경피수분손실량 즉, TEWL(Transepidermal Water Loss)값을 시간 변화에 따른 TEWL 값 변화량 △TEWL로 측정하고, CORNEOMETER CM 820 PC(C+K electronic GmbH. Germany)를 이용하여 표피 수분량에 따른 전기전도도의 변화로 0에서 150까지 피부의 수분량을 수치화하여 보습효과를 측정하였다. 시험결과는 하기 표 7에 나타내었다.

피부보습효과

시험제품	△TEWL	Corneometer Value
실시예 1	6.8	139
비교실시예 1	3.4	95
비교실시예 2	4.9	118

시험 결과, 실시예 1의 △TEWL 값은 6.8g/hm²로 경피수분손실량이 6주 후 비교실시예 1에 비해 50.0%, 비교실시예 2에 비해 27.9% 증가하여 매우 효과적으로 개선되었음을 알 수 있다.

아울러 피부의 수분량을 측정한 수분측정값(Corneometer value)에서도 실시예 1이 비교실시예 1에 비해 31.7%, 비교실시예 2에 비해 15.1% 증가하여 피부가 매우 촉촉해짐을 알 수 있다.

실시예 2. 인체 지방줄기세포 배양액 추출물과 피디알앤(PDRN)을 함유하는 화장료의 제조

하기 표 8과 같이 인체 지방줄기세포 배양액 추출물과 피디알앤(PDRN)을 함유한 조성물(실시예 2)과 인체 지방줄기세포 배양액 추출물만을 함유한 조성물(비교실시예 3) 및 피디알앤(PDRN)만을 함유한 조성물(비교실시예 4)을 제조하였다.

단위:중량%
성분		실시예 2	비교실시예 3	비교실시예 4
인체지방줄기세포배양액 추출물		10.0	12.0	0.0
피디알앤(PDRN)		2.0	0.0	12.0
A	세토스테아릴알콜	2.0	2.0	2.0
	글리세릴스테아레이트	1.5	1.5	1.5
	마이크로크리스탈린	0.7	0.7	0.7
	스쿠알란	5.0	5.0	5.0
	유동파라핀	3.0	3.0	3.0
	트리옥타노인	5.0	5.0	5.0
	폴리솔베이트 60	1.2	1.2	1.2
	솔비탄스테아레이트	0.5	0.5	0.5
	싸이크로메치콘	3.0	3.0	3.0
	토코페릴아세테이트	0.2	0.2	0.2
	BHT	0.05	0.05	0.05
	정제수	잔량	잔량	잔량
B	글리세린	4.0	4.0	4.0
	1,3-부틸렌글리콜	2.0	2.0	2.0
	산탄검	0.1	0.1	0.1
	EDTA-2Na	0.05	0.05	0.05
향,방부제		적량	적량	적량
계		100	100	100

실험예 5. 발모촉진 효과 - Dermal papilla cell의 증식 효과

Rat vibrissa immortalized dermal papilla cell(Filsell W, et al., 1994)을 100 units/mL penicillin-100 ug/mL streptomycin(Gibco Inc, NY, USA)과 10heat-inactivated fetal bovin serum(FBS; Gibco Inc, NY, USA)이 함유된 DMEM(Hyclone Inc, USA) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂ 항온기에서 배양하였으며, 3일에 한 번씩 계대 배양하였다. Rat vibrissa immortalized dermal papilla cell의 증식은 MTT 분석을 이용하여 측정하였다. 모유두 진피(Dermal papilla) 세포 (1.0×10⁴ cells/mL)를 96well plate에 넣고 24시간 배양 후 serum-free DMEM 배지로 교환하여 다시 24 시간 배양한 다음 실시예 2, 비교실시예 3 및 비교실시예 4를 각각 1, 10, 50 및 100㎍/㎖의 농도로 처리하였다. 양성 대조군인 미녹시딜 황산염(Sigma, USA)는 1μM의 농도로 처리한다. 4일 동안 배양한 후 50 uL의 MTT(Sigma, MO, USA)을 첨가하고 4시간 동안 반응시킨다. 상층액은 제거하고 DMSO 200 uL을 가하여 침전물을 용해시킨 후 microplate reader(Amersh-am Pharmacia Biotech, NY, USA)를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정한다. 각 시료군에 대한 평균 흡광도 값을 구하였으며, 대조군의 흡광도 값과 비교하여 증식 정도를 조사하여 아래 표 9에 나타내었다.

Dermal papilla cell의 증식 효과

농도 (μM)	Dermal papilla cell의 증식(%)
농도 (μM)	minoxidil sulfate	실시예 2	비교실시예 3	비교실시예 4
무처리	-	-	-	-
1	36.0	40.1	23.9	30.1
10	79.9	62.5	41.4	48.8
50	92.5	77.7	54.2	65.4
100	97.2	88.9	60.8	72.4

표 9에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 실시예 2(인체 지방줄기세포 배양액 추출물과 피디알앤(PDRN)을 함유하는 조성물)의 모유두 진피 세포의 증식 효과를 평가한 결과 실시예 2는 모유두 진피 세포의 증식 효과가 우수함을 알 수 있었다. 특히, 실시예 2의 Dermal papilla cell의 증식 효과는 양성 대조군인 미녹시딜 황산염과 유사한 모유두 진피 세포의 증식효과를 보였다. 따라서, 실시예 2에 사용한 인체 지방줄기세포 배양액 추출물과 피디알앤(PDRN)이 모낭성장에 우수한 발모촉진 효과를 나타냄을 알 수 있었다.

실험예 6. 발모촉진 효과 - 5α-reductase 억제 효과

5α-reductase 활성은 rat prostate 5α-reductase를 이용하여 첨가한 [3H]testosterone(T)이 [3H]dihydrotestosterone (DHT)로 전환되는 양을 가지고 평 가하였다. 7~8주령 된 Wistar rat 수컷을 에틸 에테르로 마취시킨 후 경추 도살하여 전립선을 적출하고, 곧바로 액체 질소에 넣어서 보관하고 실험마다 필요한 양의 전립선을 꺼내어 사용하였다. 전립선을 4℃ homogeniger buffer(20 mM potassium phosphate, pH6.5, 0.32 M sucrose, 0.1 mM dithiothreitol (DTT))를 넣은 glass homogeniger에 넣고 뿌옇게 될 때까지 분쇄하였다. 원심분리(1000rpm, 10분, 4℃) 후 cell free extract를 얻은 후에 다시 원심분리(24,000rpm, 90분, 4℃)하여 상층액을 제거하였고, pellet에 homogenizer buffe를 넣어서 suspension하여 crude enzyme으로 사용하였다. 5α-reductase assay는 다음과 같이 수행하였다. 마이크로튜브에 crude enzyme과 시료 및 reaction buffer(40m M potassium phosphate, pH 6.5, 50uM NADPH, 120nCi[1,2,6,7-3H]T)를 넣어 최종 반응액을 500 uL로 맞춘 후, 37℃에서 30분간 반응시켰다. 1mL의 에틸 아세테이트를 넣고 원심분리(1000g, 10분)하여 상층액을 취해서 새로운 마이크로튜브로 옮긴 후, speed vac을 이용하여 완전히 건조한다. 마이크로튜브에 50uL의 에틸 아세테이트를 넣고, TLC plate에 spotting하고 전개용매(50% 사이클로헥산, 50% 에틸 아세테이트)하에서 2회 전개한다. UV spectrometer로 254nm에서 T(testosterone)을 확인하고 10% 황산을 뿌려서 DHT(dihydro testosterone)를 확인 후 T와 DHT 부위를 가위로 오려내서 각각의 scintilation vial에 넣고 cocktail 10 mL을 넣어 β-counter로 측정한다. 5α-reductase 활성에 의한 테스토스테론의 전환율을 DHT/(T+DHT)의 비로 계산하여 아래 표 10에 나타내었다.

5α-reductase 억제 효과

농도 (μM)	5a-reductase 억제 효과(%)
농도 (μM)	minoxidil sulfate	실시예 2	비교실시예 3	비교실시예 4
무처리	-	-	-	-
1	32.0	30.1	17.1	28.0
10	57.9	53.1	36.6	41.8
50	73.3	68.9	46.8	62.3
100	93.8	89.5	60.9	76.5

표 10에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 실시예 2는 매우 우수한 5α-reductase 억제 효과를 나타냄을 알 수 있다. 특히 인체 지방줄기세포 배양액 추출물과 피디알앤(PDRN)을 함께 사용하였을 때의 5α-reductase 억제 효과는 양성 대조군인 minoxidil sulfate과 유사한 5α-reductase 억제 효과를 보여, 본 발명의 실시예 2는 매우 우수한 발모촉진 효과가 있음을 알 수 있다.

실험예 7. 제형의 안정성 시험

상기 본 발명의 인체 지방줄기세포 배양액 추출물과 피디알앤(PDRN)을 함유한 화장료에 대한 제형의 안정성 시험을 실시하였다. 화장료의 안정성을 실험하기위해 상기 표 1의 실시예 1, 실시예 2, 비교실시예 1, 비교실시예 2, 비교실시예 3, 비교실시예 4를 4℃와 45℃로 일정하게 유지되는 항온조에 투명 초자 용기에 담아 각각 4주 동안 보관한 후 분리, 변색 및 변취(특이취) 정도를 비교 측정하였다. 그 결과를 하기 표 11에 나타내었다. 이때 제품 분리, 변색, 변취 정도를 다음의 6등급으로 분류하여 평가하였다.

제품 변색 평가 기준 :

0: 변화 없음 1: 극히 조금 분리(변색, 변취)

2: 조금 분리(변색, 변취) 3: 조금 심하게 분리(변색, 변취)

4: 심하게 분리(변색, 변취) 5: 극히 심하게 분리(변색, 변취)

온도	분리			변색			변취(특이취)
온도	실시예 1	비교 실시예1	비교 실시예2	실시예 1	비교 실시예1	비교 실시예2	실시예 1	비교 실시예1	비교 실시예2
45℃	0	0	0	0	0	0	0	0	0
4℃	0	0	0	0	0	0	0	0	0
온도	분리			변색			변취(특이취)
온도	실시예 2	비교 실시예3	비교 실시예4	실시예 2	비교 실시예3	비교 실시예4	실시예 2	비교 실시예3	비교 실시예4
45℃	0	0	0	0	0	0	0	0	0
4℃	0	0	0	0	0	0	0	0	0

상기 표 11에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 인체 지방줄기세포 배양액 추출물과 피디알앤(PDRN)을 함유한 실시예 1, 실시예 2와 인체 지방줄기세포 배양액 추출물만을 함유한 비교실시예 1, 비교실시예 3 및 피디알앤(PDRN)만을 함유한 비교실시예 2, 비교실시예 4는 모두 분리, 변색 및 변취(특이취) 현상이 전혀 없어 안정한 기제임을 알 수 있다.

실험예 8. 제형의 안전성 시험

상기 본 발명의 인체 지방줄기세포 배양액 추출물과 피디알앤(PDRN)을 함유한 화장료에 대한 피부 안전성 시험을 실시하였다.

피검자 30명(평균연령 40.3세, 연령분포 18세-55세)을 본 발명의 실시예 및 비교실시예를 표 1과 표8에 따라 제형하여 Haye's Test Chamber를 이용 상박에 피부 첩포시험(Patch Test)을 실시하였다. 단 건선(Psoriasis), 습진(Eczema), 기타 피부병변 보유자나 임신, 수유부 또는 피임제, 항히스타민제 등을 복용하고 있는 사람은 본 실험에서 제외 하였다. 시험부위를 70% 에탄올로 닦아낸 뒤 건조시키고, 실시예 1, 실시예 2와 비교실시예 1, 비교실시예 2, 비교실시예 3, 비교실시예 4를 각각 15μg씩 챔버에 적하시킨 후, 시험 부위인 상박 부위에 얹어 고정시킨다. 첩포는 24시간 동안 도포하고 첩포를 제거한 후에는 마킹 펜으로 시험부위를 표시하여 각각 24시간, 48시간 후에 시험부위를 관찰한다. 판정은 첩포 제거 24시간, 48시간 후에 행하며 피부반응은 하기 표 12의 국제접촉피부염연구회(International Contact Dermatitis Research Group:ICDRG)의 규정에 따라 판정하였다. 시험결과는 하기 표 13에서 피부 안정성으로 나타내었다.

기호	판 정 기 준	평 가	Mean Score
± + ++ +++ -	Doubtful or slight reaction and erythema Erythema + Induration Erythema + Induration + Vesicle Erythema + Induration + Bullae Negative	미소자극 경자극 중자극 강자극 무자극	0~0.9 1.0~2.9 3.0~4.9 5.0이상 0

경과시간	실시예 1	실시예 2	비교실시예 1	비교실시예 2	비교실시예 3	비교실시예 4
24시간	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0
48시간	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0

표 13에서 본 바와 같이 피부안전성 시험 결과, 실시예 1, 실시예 2와 비교실시예 1, 비교실시예 2, 비교실시예 3, 비교실시예 4 모두 평균 자극정도가 0으로 피부에 자극이 없는 안전한 화장료임을 알 수 있다.

이하 상기한 실험예들의 결과를 근거로 하여 인체 지방줄기세포 배양액 추출물과 피디알앤(PDRN)을 함유하는 화장료를 조성하여 제시한다. 그러나 본 발명의 조성물을 하기의 제형예들로 한정하고자 하는 것은 아니다.

제형예 1. 유연화장수(스킨로션)

배합성분	중량부
인체 지방줄기세포 배양액 추출물	3.0
피디알앤(PDRN)	0.1
1,3-부틸렌글리콜	6.0
글리세린	4.0
올레일알코올	0.1
폴리솔베이트 20	0.5
에탄올	15.0
벤조페놀-9	0.05
향, 방부제	미량
정제수	to 100

제형예 2. 영양화장수( 밀크로션 )

배합성분	중량부
인체 지방줄기세포 배앵액 추출물	5.0
피디알앤(PDRN)	0.5
프로필렌글리콜	6.0
글리세린	4.0
트리에탄올아민	1.2
토코페릴아세테이트	3.0
유동 파라핀	5.0
스쿠알란	3.0
마카다미아너트오일	2.0
폴리솔베이트 60	1.5
솔비탄세스퀴올레이트	1.0
카르복시비닐 폴리머	1.0
비에치티이	0.01
이디티에이-2엔에이	0.01
향, 방부제	미량
정제수	to 100

제형예 3. 영양크림

배합성분	중량부
인체 지방줄기세포 배양액 추출물	10.0
피디알앤(PDRN)	2.0
세토스테아릴알콜	2.0
글리세릴스테아레이트	1.5
트리옥타노인	5.0
폴리솔베이트 60	1.2
솔비탄스테아레이트	0.5
스쿠알란	5.0
유동파라핀	3.0
싸이클로메치콘	3.0
비에치티이	0.05
델타-토코페롤	0.2
농글리세린	4.0
1,3-부틸렌글리콜	2.0
산탄검	0.1
이디티에이-2엔에이	0.05
향, 방부제	미량
정제수	to 100

제형예 4. 마사지크림

배합성분	중량부
인체 지방줄기세포 배양액 추출물	3.0
피디알앤(PDRN)	0.3
프로필렌글리콜	6.0
글리세린	4.0
트리에탄올아민	0.5
밀납	2.0
토코페릴아세테이트	0.1
폴리솔베이트 60	3.0
솔비탄세스퀴올레이트	2.5
세테아릴알코올	2.0
유동파라핀	30.0
카르복시비닐폴리머	0.5
향, 방부제	미량
정제수	to 100

제형예 5. 팩

배합성분	중량부
인체 지방줄기세포 배양액 추출물	5.0
피디알앤(PDRN)	0.5
프로필렌글리콜	2.0
글리세린	4.0
카르복시비닐 폴리머	0.3
에탄올	7.0
피이지-40 히드로게비이티드 캐스터 오일	0.8
트리에탄올아민	0.3
비에치티이	0.01
이디티에이-2엔에이	0.01
향, 방부제	미량
정제수	to 100

Claims

인체 지방줄기세포 배양액 추출물과 피디알앤(PDRN)을 함유하는 주름개선용 화장료 조성물로서,
상기 화장료 조성물은 화장료의 총 중량에 대하여 0.01 내지 10 중량%의 인체 지방줄기세포 배양액 추출물 및 0.01 내지 2.0 중량%의 피디알앤(PDRN)을 포함하고,
상기 인체 지방줄기세포 배양액 추출물과 피디알앤(PDRN)의 중량비는 1:1 내지 10:1인, 주름개선용 화장료 조성물.
인체 지방줄기세포 배양액 추출물과 피디알앤(PDRN)을 함유하는 미백용 화장료 조성물로서,
상기 화장료 조성물은 화장료의 총 중량에 대하여 0.01 내지 10 중량%의 인체 지방줄기세포 배양액 추출물 및 0.01 내지 2.0 중량%의 피디알앤(PDRN)을 포함하고,
상기 인체 지방줄기세포 배양액 추출물과 피디알앤(PDRN)의 중량비는 1:1 내지 10:1인, 미백용 화장료 조성물.
인체 지방줄기세포 배양액 추출물과 피디알앤(PDRN)을 함유하는 피부탄력 증진용 화장료 조성물로서,
상기 화장료 조성물은 화장료의 총 중량에 대하여 0.01 내지 10 중량%의 인체 지방줄기세포 배양액 추출물 및 0.01 내지 2.0 중량%의 피디알앤(PDRN)을 포함하고,
상기 인체 지방줄기세포 배양액 추출물과 피디알앤(PDRN)의 중량비는 1:1 내지 10:1인, 피부탄력 증진용 화장료 조성물.
인체 지방줄기세포 배양액 추출물과 피디알앤(PDRN)을 함유하는 보습용 화장료 조성물로서,
상기 화장료 조성물은 화장료의 총 중량에 대하여 0.01 내지 10 중량%의 인체 지방줄기세포 배양액 추출물 및 0.01 내지 2.0 중량%의 피디알앤(PDRN)을 포함하고,
상기 인체 지방줄기세포 배양액 추출물과 피디알앤(PDRN)의 중량비는 1:1 내지 10:1인, 보습용 화장료 조성물.
인체 지방줄기세포 배양액 추출물과 피디알앤(PDRN)을 함유하는 발모촉진용 화장료 조성물로서,
상기 화장료 조성물은 화장료의 총 중량에 대하여 0.01 내지 10 중량%의 인체 지방줄기세포 배양액 추출물 및 0.01 내지 2.0 중량%의 피디알앤(PDRN)을 포함하고,
상기 인체 지방줄기세포 배양액 추출물과 피디알앤(PDRN)의 중량비는 1:1 내지 10:1인, 발모촉진용 화장료 조성물.