KR20170068857A

KR20170068857A - 폴리데옥시리보뉴클레오타이드를 이용한 항염 및 피부 재생용 조성물의 제조방법

Info

Publication number: KR20170068857A
Application number: KR1020150175836A
Authority: KR
Inventors: 박정규; 김만섭; 윤혜은; 배현욱; 김대익; 윤종국; 최봉근
Original assignee: 주식회사 한국비엔씨; 주식회사 뉴트라팜텍
Priority date: 2015-12-10
Filing date: 2015-12-10
Publication date: 2017-06-20

Abstract

본 발명은 폴리데옥시리보뉴클레오타이드(polydeoxyribonucleotide, PDRN)를 이용한 항염 및 피부 재생용 조성물의 제조방법, 상기 방법으로 제조된 항염 및 피부 재생용 조성물 또는 이를 포함하는 창상피복재에 관한 것이다. 본 발명의 조성물에 포함되는 저분자화된 폴리데옥시리보뉴클레오타이드(polydeoxyribonucleotide, PDRN)는 그 사이즈가 1,000 Da이하로서, 종래 PDRN 보다 피부 침투율이 개선되었다. 또한, 본 발명의 조성물은 피부 부작용을 유발하지 않으면서 피부 염증을 효과적으로 억제하며 피부 세포 재생 효과를 가진다. 이로 인해, 본 발명의 조성물은 약제학적 조성물, 화장료 조성물 또는 창상피복재로 이용될 수 있다.

Description

폴리데옥시리보뉴클레오타이드를 이용한 항염 및 피부 재생용 조성물의 제조방법{Method for Preparing of Composition for Anti-Inflammatory and Skin Regeneration Using Polydeoxyribonucleotide}

본 발명은 폴리데옥시리보뉴클레오타이드(polydeoxyribonucleotide, PDRN)를 이용한 항염 및 피부 재생용 조성물의 제조방법, 상기 방법에 의해 제조된 항염 및 피부 재생용 조성물, 또는 이를 포함하는 창상피복재에 관한 것이다.

염증은 세포나 조직이 손상을 받으면 그 반응을 최소화, 회복시키려고 하는 방어 기전의 하나로서, 조직, 혈액 등과 세포 반응을 일으킨다. 정도가 지나칠 경우 가려움, 발열, 통증, 조직 손상 등의 현상을 초래하기도 한다. 적절한 조건 하에서는 초기 상태가 지난 후 정상 기능을 되찾게 되지만, 염증 자극제가 계속 만들어질 경우, 염증 유발 사이토카인에 의해 혈관확장 등이 일어나고 항체, 혈장(plasma), 식균 세포들이 염증 부위로 몰려들게 되어 피부 염증 및 피부 트러블을 일으키게 된다.

TNF-α는 외부의 자극이나 감염원에 대해 염증, 면역세포에서 주로 분비되는 대표적인 사이토카인(cytokines)으로서 감염, 알레르기성 질환인 건선, 습진 또는 지루성 피부염 등을 매개하며, 접촉성 피부염(Mache E 및 Descapms V, Ann. Dermatol. Venereol. 129(12): 1374-9, 2002)과 알레르기성 질환인 아토피성 피부염을 유발한다. 이를 억제하기 위해서는 TNF-α 생성, 프로세스 및 분비과정을 판단하거나, TNF-α 자체를 중화시키는 방법 등이 이용되고 있다.

염증을 소실시키기 위해 염증원의 제거, 생체 반응 및 증상을 감소시키는 작용을 하는 것을 항염제라 한다. 현재까지 항염의 목적으로 이용되고 있는 물질은 비스테로이드계로서 프루페나믹산(flufenamicacid), 이부프로펜(ibuprofen), 벤지다민(benzydamine), 인도메타신(indomethacin) 등이 있고, 스테로이드계로는 프레드니솔론(prednisolone), 덱사메타손(dexamethasone) 등이 있으며, 그 외에 신경 펩타이드 길항제, 브라디키닌 길항제, COX 억제제 등이 제시되어 왔으나, 피부에 대한 안전성면에서나 화장료 배합시의 안정성 면에서 대부분 문제점을 안고 있어서, 그 사용이 제한되고 있다(대한민국 공개특허 제10-2008-0020853호).

그에 반해 폴리데옥시리보뉴클레오타이드(polydeoxyribonucleotide, PDRN)는 DNA 중합체로 생체 구성성분이기 때문에 합성물질 등에서 나타나는 알러지 반응이나 체내 거부반응이 없고, 주성분이 음전하를 가지는 DNA로 이루어져 친수성의 특성을 지닌 물질로 이러한 특성들로 인해 산업적 적용이 매우 용이하다. 그러나, 어류의 정소에서 추출한 PDRN은 사슬(chain) 길이가 평균 50 bp(=227.5 kDa)이기 때문에 피부에 침투하기 어렵다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 항염 효과와 피부 안전성, 화장료 배합 시 안정성 문제를 해결할 수 있는 항염 물질의 탐색과 조합, 그 효능을 배가하기 위한 처방을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 연어이리 추출물로부터 폴리데옥시리보뉴클레오타이드(polydeoxyribonucleotide, PDRN)를 추출한 다음 pH 조절 및 가열 후 가수분해하여 피부에 흡수될 수 있는 저분자 분획을 스크리닝 하였고, 이어 컴플렉스화 공정을 통해 친수성을 낮추어 줌으로써 종래 PDRN 보다 피부 침투율을 높였으며, 피부 부작용을 유발하지 않으면서 피부 염증을 효과적으로 억제하며 피부 세포 재생 효과가 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 항염 및 피부 재생용 조성물의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상술한 본 발명의 방법으로 제조된 항염 및 피부 재생용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 창상피복재를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 항염 및 피부 재생용 조성물의 제조방법을 제공한다: (a) 연어이리 추출물(salmon milt extract)로부터 폴리데옥시리보뉴클레오타이드(polydeoxyribonucleotide, PDRN)를 추출하는 단계; (b) 상기 단계 (a)의 결과물인 상기 PDRN에 함유된 엔도톡신(endotoxin)을 제거하는 단계; (c) 상기 단계 (b)의 결과물을 투석시켜 잔류용매를 제거하는 단계; 및 (d) 상기 단계 (c)의 결과물에 산성 용매를 첨가하여 반응시켜 저분자화 시키는 단계.

본 발명자들은 항염 효과와 피부 안전성, 화장료 배합 시 안정성 문제를 해결할 수 있는 항염 물질의 탐색과 조합, 그 효능을 배가하기 위한 처방을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 연어이리 추출물로부터 폴리데옥시리보뉴클레오타이드(polydeoxyribonucleotide, PDRN)를 추출한 다음 pH 조절 및 가열 후 가수분해하여 피부에 흡수될 수 있는 저분자 분획을 스크리닝 하였고, 이어 컴플렉스화 공정을 통해 친수성을 낮추어 줌으로써 종래 PDRN 보다 피부 침투율을 높였으며, 피부 부작용을 유발하지 않으면서 피부 염증을 효과적으로 억제하며 피부 세포 재생 효과가 있음을 확인하였다.

이하, 항염 및 피부 재생용 조성물을 제조하기 위한 본 발명의 방법을 단계별로 상세하게 설명하면 다음과 같다:

(a) 폴리데옥시리보뉴클레오타이드(polydeoxyribonucleotide, PDRN)의 추출

우선, 본 발명의 방법은 (a) 연어이리 추출물(salmon milt extract)로부터 폴리데옥시리보뉴클레오타이드(polydeoxyribonucleotide, PDRN)를 추출하는 단계를 거친다.

본 발명에 이용되는 연어이리 추출물은 상업적으로 구입하여 이용하거나 당업계에 공지된 다양한 방법으로 추출하여 이용할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 단계 (a)의 PDRN의 추출은 다음의 단계를 포함하는 방법으로 실시된다: (a-1) 연어이리 추출물(salmon milt extract)을 세포 용해 용액(cell lysis solution)에 용해시키고 리보뉴클레아제를 첨가하여 반응시키는 단계; (a-2) 상기 단계 (a-1)의 결과물에 단백질 침전 용액(protein precipitation solution)을 첨가하고 교반하는 단계; (a-3) 상기 단계 (a-2)의 결과물을 원심분리시켜 수득한 상등액에 소듐 아세테이트를 첨가하여 인버팅(inverting)시키는 단계; (a-4) 상기 단계 (a-3)의 결과물을 원심분리시켜 상등액을 제거하고 건조시켜 용출(elution)시키는 단계; 및 (a-5) 상기 단계 (a-4)의 결과물에 페놀, 클로로포름 및 이소아밀알코올(isoamylalcohol)을 첨가하고 원심분리 시킨 다음 수득한 상등액에 클로로포름 및 이소아밀알코올을 첨가하고 원심분리 시켜 폴리데옥시리보뉴클레오타이드를 수득하는 단계.

본 발명의 보다 다른 구현예에 따르면, 상기 단계 (a-1)의 세포 용해 용액(cell lysis solution)은 EDTA, Tris 및 SDS를 포함하고, 가장 바람직하게는 100 mM EDTA, 25 mM Tris 및 1 % SDS를 포함한다.

본 발명의 보다 또 다른 구현예에 따르면, 상기 단계 (a-1)의 세포 용해 용액(cell lysis solution)은 pH 7-8이며, 가장 바람직하게는 pH 7 이다.

본 발명의 보다 다른 구현예에 따르면, 상기 단계 (a-2)의 단백질 침전 용액(protein precipitation solution)은 포타슘 아세테이트이고, 가장 바람직하게는 5 M 포타슘 아세테이트이다.

본 발명의 보다 또 다른 구현예에 따르면, 상기 단계 (a-2)의 단백질 침전 용액(protein precipitation solution)은 pH 7-8이며, 가장 바람직하게는 pH 7 이다.

본 발명의 보다 다른 구현예에 따르면, 상기 단계 (a-5)의 페놀, 클로로포름 및 이소아밀알코올은 부피비 20-30 : 20-30 : 1로 첨가되고, 보다 더 바람직하게는 부피비 23-28 : 22-26 : 1로 첨가된다.

본 발명에 이용되는 페놀, 클로로포름 및 이소아밀알코올은 불순물을 제거하여 PDRN의 순도를 높이는 작용을 한다.

본 발명의 보다 또 다른 구현예에 따르면, 상기 단계 (a-5)의 클로로포름 및 이소아밀알코올은 부피비 20-30 : 1로 첨가되고, 보다 더 바람직하게는 부피비 22-26 : 1로 첨가된다.

본 발명의 방법으로 제조된 조성물에 포함되는 폴리데옥시리보뉴클레오타이드(polydeoxyribonucleotide, PDRN)는 DNA 중합체로 생체 구성 성분이기 때문에 합성물질 등에서 나타나는 알러지 반응이나 체내 거부반응이 없고, 주성분이 음전하를 가지는 DNA로 이루어져 친수성의 특성을 지닌 물질이다.

(b) 엔도톡신(endotoxin)의 제거

그 다음, 본 발명의 방법은 (b) 상기 단계 (a)의 결과물인 상기 PDRN에 함유된 엔도톡신(endotoxin)을 제거하는 단계를 거친다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 단계 (b)의 엔도톡신의 제거는 다음의 단계를 포함하는 방법으로 실시된다: (b-1) 상기 단계 (a)의 PDRN에 Triton X-114 및 SDS를 포함하는 용액을 첨가하고 NaCl을 첨가한 다음 원심분리 시켜 상등액을 수득하는 단계; (b-2) 상기 단계 (b-1)의 결과물에 소듐 아세테이트를 첨가한 다음 인버팅(inverting)시키는 단계; 및 (b-3) 상기 단계 (b-2)의 결과물을 원심분리 시킨 다음 PBS 용액으로 용해시키는 단계.

상기 단계 (b-1)의 Triton X-114 및 SDS를 포함하는 용액은 가장 바람직하게는 6 % Triton X-114 및 3 % SDS를 포함하고, 본 발명에서 엔도톡신 제거 용액(endotoxin removal solution)으로 이용된다.

(c) 잔류용매의 제거

그 다음, 본 발명의 방법은 (c) 상기 단계 (b)의 결과물을 투석시켜 잔류용매를 제거하는 단계를 포함한다.

본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 단계 (c)의 투석은 상기 단계 (b)의 결과물을 투석막에 넣고 이에 PBS 용액을 첨가한 다음 24-60 시간동안 실시한다.

보다 바람직하게는 상기 투석막은 MWCO(molecular weight cut off) 14,000 이고, 상기 투석은 온도 2-6℃에서 실시하고 가장 바람직하게는 온도 4℃에서 실시한다. 또한, 상기 투석 시간은 가장 바람직하게는 48시간동안 실시한다.

(d) 저분자화 공정

마지막으로, 본 발명의 방법은 (d) 상기 단계 (c)의 결과물에 산성 용매를 첨가하여 반응시켜 저분자화 시키는 단계를 거친다.

상기 산성 용매는 당업계에 공지된 다양한 산성 용매를 이용할 수 있고, 바람직하게는 아세트산, 인산, 푸마르산(fumaric acid), 시트르산, 뷰티르산(butyric acid), 개미산, 프로피온산(propionic acid) 및 염산으로 구성된 군으로부터 선택되고, 보다 바람직하게는 아세트산, 인산, 시트르산 또는 염산이며, 보다 더 바람직하게는 아세트산 또는 염산이고, 가장 바람직하게는 염산이다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 단계 (d)의 저분자화 시키는 단계는 상기 단계 (c)의 결과물을 0.2-0.6%로 함량을 조절한 다음, 이에 산성 용매를 첨가하여 pH 2.5-4로 조절하고 60-80℃에서 8시간 이상 반응시켜 실시하고, 보다 바람직하게는 상기 단계 (c)의 결과물을 0.3-0.5%로 함량을 조절한 다음, 이에 산성 용매를 첨가하여 pH 3.0-3.4로 조절하고 65-75℃에서 8시간 내지 12시간 동안 반응시켜 실시한다.

본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 저분자화된 PDRN은 1,000 Da이하이고, 보다 바람직하게는 300 내지 1,000 Da이다.

종래 어류의 정소에서 추출한 PDRN은 사슬(chain)길이가 평균 50 bp(227 kDa)이기 때문에 피부에 침투하기 어려우나, 본 발명의 방법에 의해 추출 및 저분자화된 PDRN은 1,000 Da이하로서 피부 침투성이 개선되었다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 단계 (d)의 저분자화 시키는 단계 이후에 (d-1) 상기 단계 (d)의 결과물을 pH 7로 중화시키는 단계를 추가적으로 포함한다.

이러한 방법으로 항염 및 피부 재생용 조성물을 제조할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 방법은 상기 단계 (d) 이후에 (e) 상기 단계 (d)의 결과물에 히알루론산(hyaluronic acid)을 첨가하여 혼합하는 단계를 추가적으로 포함한다.

(e) 저분자화된 PDRN에 히알루론산(hyaluronic acid)의 첨가 및 혼합

추가적으로, 본 발명의 방법은 (e) 상기 단계 (d)의 결과물에 히알루론산(hyaluronic acid)을 첨가하여 혼합하는 단계를 포함한다.

본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 단계 (e)의 저분자화된 PDRN 및 히알루론산은 중량비 1:1이다.

본 발명에 따르면, 상기 단계 (d)의 결과물인 저분자화된 PDRN을 함량 0.2%로 조절 후 2.0% 히알루론산과 혼합하여 0.1% PDRN 및 1.0% 히알루론산이 되도록 한다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 히알루론산은 저분자이다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 방법으로 제조된 항염 및 피부 재생용 조성물을 제공한다.

본 발명의 항염 및 피부 재생용 조성물은 상술한 본 발명의 방법에 의해 제조되는 것이기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 반복 기재에 따른 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

본 발명의 조성물에 포함되는 저분자화된 PDRN, 또는 저분자화된 PDRN 및 히알루론산은 항염 및 피부 재생 효과를 나타내어, 피부 자극 및 염증 생성을 방지 또는 완화시키며, 민감성 피부를 완화하거나 정상화 시키는 효능을 나타낼 것으로 기대된다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 저분자화된 PDRN, 또는 저분자화된 PDRN 및 히알루론산은 전체 조성물을 기준으로 하여 0.001 내지 10 중량%, 보다 바람직하게는 0.001 내지 5 중량%이다. 저분자화된 PDRN, 또는 저분자화된 PDRN 및 히알루론산의 중량이 0.001 중량% 미만일 때는 그 효과가 나타나기 어렵고, 10.0 중량%를 초과하는 경우에는 함량의 증가에 따른 효과의 증가가 매우 미약하고, 제형상의 안정성이 확보되지 않는 문제점이 있다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 조성물은 약제학적 조성물 또는 화장료 조성물이다.

본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 경구 또는 비경구 등의 다양한 경로로 투여할 수 있으며, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 또는 피부 도포 등으로 투여할 수 있으며, 가장 바람직하게는 피부 도포 이다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 예컨대 0.001-100 ㎎/㎏이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 산제, 과립제, 정제, 캅셀제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 연고, 크림등의 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액 등을 비롯하여 약제학적 제제에 적합한 어떠한 형태로든 사용할 수 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물이 화장료 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서의 저분자화된 PDRN, 또는 저분자화된 PDRN 및 히알루론산 이외에 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 영양 크림, 수렴 화장수, 유연 화장수, 영양화장수, 로션, 에센스, 영양젤, 마사지 크림, 아이크림, 아이에센스, 클렌징크림, 클렌징로션, 클렌징폼, 클렌징워터, 팩, 파우더, 바디로션, 바디크림, 바디오일, 바디에센스, 바디세정제, 염모제, 헤어토닉, 스칼프트리트먼트, 연고, 젤, 크림, 패취 또는 분무제 등의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로 플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 항염 및 피부 재생용 조성물을 포함하는 창상피복재를 제공한다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면 상기 창상피복재는 2차치유폼 창상피복재이다.

본 명세서에서 용어 “창상피복재”는 외과적 수술, 감염, 창상, 출혈 및 염증 등으로 인한 상처에 부착할 수 있는 드레싱(dressing) 또는 매트릭스(matrix)를 의미한다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명은 항염 및 피부 재생용 조성물의 제조방법을 제공한다.

(ⅱ) 본 발명의 조성물에 포함되는 저분자화된 폴리데옥시리보뉴클레오타이드(polydeoxyribonucleotide, PDRN)는 그 사이즈가 1,000 Da이하로서, 종래 PDRN 보다 피부 침투율이 개선되었다.

(ⅲ) 또한, 본 발명의 조성물은 피부 부작용을 유발하지 않으면서 피부 염증을 효과적으로 억제하며 피부 세포 재생 효과를 가진다.

(ⅳ) 이로 인해, 본 발명의 조성물은 약제학적 조성물, 화장료 조성물 또는 창상피복재로 이용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 추출된 PDRN을 0.4% 아가로스 전기영동으로 확인한 것으로 M은 마커(marker), 레인(lane) 1은 3.5 μg, 레인 2는 7 μg, 레인 3은 12 μg이다.
도 2는 추출한 PDRN에 온도와 pH를 조절하여 저분자화 시킨 것을 마찬가지로 0.4% 아가로스 전기영동으로 확인한 것이며, M은 마커, 레인 1은 대조군, 레인 2는 1시간, 레인 3은 2 시간, 레인 4는 4 시간, 레인 5는 6시간, 레인 6은 8시간 후를 말한다.
도 3은 PDRN의 저분자화 정도를 알아보고자 FPLC(Fast Protein Liquid Chromatography) 분석을 진행한 결과이다. A는 저분자화 시키기 전인 대조군, B는 저분자화 한 PDRN군, C는 표준품인 아데노신 5' 모노포스페이트(Adenosine 5' monophosphate)(분자량 : 391 Da)를 나타낸다.
도 4는 창상유발 후 29일째의 창상부를 포함한 부위의 병리조직학적 관찰을 H&E 염색을 통해 확인한 결과이다. A는 비처리군(CO), B는 양성대조군(PC), C는 도포군(HA), D는 도포군(PD) 그리고 E는 혼합한 도포군(PH)을 나타낸다. 도 4a는 광학현미경 50X 비율로 관찰한 것이고, 도 4b는 100X 비율로 관찰 한 것이다.
도 5는 창상유발 후 29일째의 창상부를 포함한 부위의 병리조직학적 관찰을 Tunel 염색을 통해 확인한 결과이다. A는 비처리군(CO), B는 양성대조군(PC), C는 도포군(HA), D는 도포군(PD) 그리고 E는 혼합한 도포군(PH)을 나타낸다. 도 5a는 광학현미경 50X 비율로 관찰한 것이고, 도 5b는 200X 비율로 관찰 한 것이다.
도 6은 창상치유과정에 관여하는 성장 인자(growth factor)인 TGF-β와 VEGF의 발현량을 그래프로 나타낸 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 “%“는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.

실험재료 및 방법

연어이리 추출물로부터 PDRN 추출, 엔도톡신 제거 공정 및 저분자화

PDRN 추출

연어이리 추출물(salmon milt extract) 5 g을 원심분리기용 바틀(bottle)에 0.5 g씩 나누어 세포 용해 용액(cell lysis solution)(GeneAll Biotechnology Co., LTD., 대한민국) 50 mL에 녹인 후 Rnase A 100 μl(Sigma, St. Louis, 미국)을 첨가하여 37℃ 항온수조에서 5분 간 반응 시키고 상온에서 식혔다. 단백질 침전 용액(protein precipitation solution)(GeneAll Biotechnology Co., 서울, 대한민국)을 넣고 교반 후 얼음물에 식혔다. 이를 14,000 x g에서 10분간 원심분리한 후 상등액을 취하였다. 취한 부피의 1/10 만큼의 3 M 소듐 아세테이트(DUKSAN PIRE CHEMICALS CO., LTD, 대한민국)를 첨가하여 인버팅(inverting) 해주었다. 아이스-콜드(ice-cold) 100% 에탄올을 총 부피의 2배만큼 넣고 얼음에 5분 이상 방치하였다. 다시 14,000 x g에서 5분간 원심분리 후 상등액을 제거하였다. 70% 에탄올을 첨가하고 14,000 x g에서 5분간 원심분리 후 상등액을 제거하였다. 펠릿(pellet)을 말린 후 H₂O로 용출(elution) 시켰다. 여기에 동량의 페놀 : 클로로포름 : 이소아밀알코올(isoamylalcohol)(25:24:1)(Sigma, St. Louis, 미국)을 첨가하여 3분간 볼텍싱(vortexing)한 후 10,000 x g에서 1분간 원심분리 후 상등액을 취하였다. 클로로포름 : 이소아밀알코올(24:1)(Sigma, St. Louis, USA, JUNSEI, Kyoto, 일본)을 상등액과 동량으로 넣어 10,000 x g에서 1분간 원심분리 후 이 과정을 두 번 반복하였다.

엔도톡신(endotoxin) 제거 공정

100 mL(1.0 Vol.)의 PDRN에 50 mL(0.2 Vol.)의 TXS 용액을 첨가하여 상온에서 10분간 방치하였다. 이후 5 M NaCl이 1 M NaCl이 되도록 첨가한 후 14,000 x g에서 10분간 원심분리하였다. 상등액을 조심스럽게 취하여 총 부피의 1/10 만큼의 3 M 소듐 아세테이트(DUKSAN PIRE CHEMICALS CO., LTD, 대한민국)를 첨가 후 인버팅(inverting) 해주었다. 아이스-콜드(ice-cold) 100% 에탄올(Millipore, Billerica, MA, 미국)을 총 부피의 2배만큼 넣고 얼음에 5분 이상 방치 후 6,000 x g에서 5분간 원심분리 하였다. 이후 70% 에탄올(Millipore, Billerica, MA, 미국)을 넣어 6,000 x g에서 5분간 스핀 다운(spin down) 시켰다. 이 과정을 3번 반복하였고 1XPBS로 녹였다.

잔류용매 제거 공정

잔류하는 염을 제거하기 위해 투석막(dialysis tubing)(MWCO 14,000)(Sigma, St. Louis, 미국)에 넣고 1XPBS를 이용하여 48시간 투석하였다.

저분자화 공정

추출한 PDRN을 0.1 N HCl로 pH를 3.2로 조정 후 고온에서 8시간 이상 가열하면서 반응시켰다. pH를 다시 7.0으로 중화시킨 후 상등액을 취하여 제균여과를 실시하였다.

PDRN에 대한 동물실험

실험동물 및 창상유발

실험동물은 체중 80-90 g의 4주령 수컷 스프라그-도올리 래트(Sprague-Dawley rat)를 (주)중앙실험동물에서 구입하여 일정한 온도(21.2± 2.0℃), 상대습도(55.0± 10.0%)를 유지하고, 규칙적인 명암(12시간 명/암)을 인공조명으로 조절하였으며, 사료와 물은 충분히 공급하면서 1주일 동안 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 안정화 기간이 지난 후 실험동물은 졸레틸(zoletil) 50(Virbac, Carros, 프랑스) 주사 마취하에 등 부위를 제모한 다음 피혁용 펀치(biopsy punch; 8 ㎜)를 이용하여 좌우대칭의 원형 결손창을 2개소 만들어 창상을 유발하였다. 동물실험 수행에 관련한 모든 과정은 동물보호법의 3R 및 동물실험윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC)의 원칙을 준수하고 윤리적인 측면을 고려하면서 수행하였다.

실험군 분류 및 시료 처리

실험군은 창상유발 후 시료를 처리하지 않은 비처리군(CO), PDRN(0.1%) 도포군(PD), 히알루론산(hyaulronic acid)(1.0%) 도포군(HA), PDRN(0.1%)과 히알루론산(1.0%)을 혼합한 도포군(PH), 20 ㎎/g의 후시딘산나트륨이 함유된 시판 연고를 도포한 양성대조군(PC) 총 5개 군으로 분류하였으며, 각 군당 8마리씩 총 40마리로 실험을 수행하였다. 약물 도포량은 가피가 탈각될 때까지 매일 1회씩 창상 유발 부위가 덮일 정도로 충분하게 도포하였으며, 외부 공기와 접촉을 최소화하였다.

육안적 상처 변화의 관찰

상처치유의 진행과정을 관찰하기 위해 창상유발 후 3일 간격으로 디지털 카메라(CAMEDIA^TM, Olympus Co., Tokyo, 일본)를 이용하여 각 군별로 일정한 거리에서 창상 부위를 촬영하여 상처의 변화를 육안으로 관찰하였으며, 객관적 지표로 나타내기 위하여 디지털 캘리퍼스(digital calliper)(Mitutoyo Co., Kawasaki, 일본)로 창상의 면적을 측정하였다.

조직병리학적 변화의 관찰

각 실험군의 조직병리학적 검사를 위해 실험동물들을 에틸 에테르(Duksan Pure Chemical Co., Ltd., 대한민국)로 마취한 후 창상 부위가 포함된 조직절편을 채취하여 10% 중성 포르말린 용액에 24시간 동안 고정하였다. 고정된 조직은 창상 중앙을 통과하는 절편을 취하여 탈수하고 파라핀 블록에 포매한 후 조직절편기(RM2125, Leica, Wetzlar, 독일)를 이용하여 3 μm 두께로 절단한 다음, silanized coating slide에 부착하였다. 부착된 조직 절편은 자일렌(xylene)으로 파라핀을 제거하고 알코올과 증류수로 10분 동안 함수시킨 후 증류수로 세척하였다. 이 후 헤마톡실린(hematoxylin) 용액을 떨어뜨려 3분간 반응시키고 증류수로 1분씩 3회 세척한 후 에오신(eosin) 용액으로 10분간 반응시키고 증류수로 세척하였다. 이를 퍼마운트(permount)로 마운팅(mounting)한 후 광학현미경을 이용하여 관찰하였다.

Tunel 염색은 ApopTag Kit(Intergen Co., USA)를 사용하여 실험하였다. 파라핀이 제거된 조직절편을 0.05 M PBS (phosphate buffered saline, pH 7.4)용액으로 5분간 수세한 다음 proteinase K(20 μg/ml in 0.05 M PBS)로 실온에서 15분간 반응시킨 후 증류수로 2분간 3회 수세하였다. 이후 3 % H₂O₂액에 5분간 반응시킨 다음 PBS용액으로 5분간 2회 세척하고 equilibration buffer에 1분간 반응시켰다. 이후 working strength TdT Enzyme을 조직절편에 떨어뜨린 다음 1시간 동안 반응시키고 stop/wash buffer에 10분간 실온에서 반응시켰다. 이후 PBS용액으로 5분간 3회 세척하고 anti-digoxigenin-peroxidase를 실온에서 30분 동안 반응시켰다. 이후 PBS용액으로 5분간 3회 세척하고 퍼옥시데이즈 기질(peroxidase substrate)를 실온에서 5분간 반응시켰다. 반응이 끝난 조직절편은 PBS용액으로 5분간 3회 세척 후 0.5% 메틸그린(methylgreen) 용액에 10분간 반응시켰다. 염색이 끝난 조직절편은 수세 후 100% 에탄올로 탈수하고 자일렌 처리한 다음 permanent로 마운팅한 후 광학현미경을 이용하여 관찰하였다.

피부조직의 유전자 발현량 측정

창상유발 후 7일간격으로 각 군별 실험동물들의 창상부위 조직을 채취하여 RNAlater RNA (Qiagen, Hilden, North Rhine-Westphalia, 독일)를 사용하여 4℃에 보관하면서 본 실험에 이용하였다. 조직으로부터 RNA는 RNeasy fibrous tissue mini kit(Qiagen)를 이용하여 추출한 후 RNA 2 μg을 RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit(Thermo Fisher Scientific Inc.)를 이용하여 cDNA 합성을 수행하였다. PCR 반응액은 cDNA 0.5 μL, 전방향 프라이머(forward primer)(10 pmole) 1 μL, 역방향 프라이머(reverse primer)(10 pmole) 1 μL, SYBR Green supermix(Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, 미국) 12.5 μL, 멸균증류수 10 μL를 혼합하여 준비한 다음, iCycler iQ5 real time PCR detection system(Bio-Rad Laboratories Inc.)을 사용하여 RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reaction) 수행 후 GAPDH(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) 유전자 발현에 대한 각 유전자 발현 정도를 백분율(%)로 나타내었다. PCR 반응에 사용되어진 프라이머 염기서열은 다음과 같다: VEFG(vascular endothelial growth factor) 전방향 프라이머 5'-AGT CTT GCC AAT GTG GAC TC-3', 역방향 프라이머 5'-GGC AGT GGA TTC TCA TCT TG-3'; TGF-β1(transforming growth factor-beta 1) 전방향 프라이머 5'-GCC TCC GCA TCC CAC CTT TG-3', 역방향 프라이머 5'-GCG GGT GAC TTC TTT GGC GT-3'; IL-10(interleukine-10) 전방향 프라이머 5'-GAA AAC AGA GCT TCA GCA TGC TTG G-3', 역방향 프라이머 5'-TTT GAG TGT CAC GTA GGC TTC TAT GC-3'; GADPH 전방향 프라이머 5'-TCC CTC AAG ATT GTC AGC AA-3', 역방향 프라이머 5'-AGA TCC ACA ACG GAT ACA(22).

통계분석

본 연구의 모든 실험 결과는 3회 반복실험에 대한 평균값(mean)과 평균의 표준편차(SD)로 나타내었으며, 각 그룹간의 통계적 유의성은 SPSS ver 10.0(SPSS Inc., IL., 미국)을 이용하여 one-way ANOVA 검정을 적용하여 p<0.05 수준에서 유의성 검정을 실시하였다.

실험 결과

연어이리 추출물로부터 PDRN 추출, 엔도톡신 제거 공정 및 저분자화

상술한 방법으로 추출한 PDRN의 사이즈를 확인한 결과는 도 1과 같다. 연어이리 추출물로부터 PDRN이 분리정제 되었는지 확인하기 위하여 추출한 PDRN을 0.4 % 아가로스 겔 전기영동을 통하여 사이즈를 확인하였다. 그 결과, 약 250 bp의 크기를 가지는 것을 확인하였다.

PDRN의 순도와 단백질 함량을 낮추기 위해 페놀 : 클로로포름 : 이소아밀알코올 (25:24:1)을 추출 2번 반복한 결과 PCI(25:24:1) 사용 전과 후에는 순도는 1.782에서 1.847로 개선되었고 단백질 함량은 1.0%에서 0.2%로 상당히 개선된 것을 확인할 수 있었다(표 1).

-	순도(A₂₆₀/A₂₈₀₎	단백질 함량(%)
PCI(25:24:1) 추출 전	1.782	1.0
PCI(25:24:1) 추출 후	1.847	0.2

pH와 온도를 조절하여 저분자화 시킨 PDRN의 사이즈가 작아졌는지 확인하기 위해 마찬가지로 0.4 % 아가로스 전기영동을 통하여 확인한 결과는 도 2와 같다. 1, 2, 4, 6, 8 시간이 지날수록 대조군(0시간)보다 PDRN의 크기가 상당히 작아지는 것을 확인하였다.

이를 아가로스 전기영동 뿐 아니라 FPLC(AKTA Purifier, AKTA FPLC, GE Healthcare korea) 기기를 이용하여 PDRN의 상대적인 저분자화 정도를 알고자 측정한 결과는 도 3과 같다. Superdex peptide 10/300 GL 컬럼으로, 유속(flow rate) 0.5 ml/min에서 100 μ주입하였고 이동상은 50 mM 포스페이트, 0.15 M NaCl, pH 7.0을 사용하였으며 260 nm에서 분석하였다. A는 저분자화 시키기 전인 대조군으로 피크가 15분대에서 확인이 되었고, C는 표준품으로 삼은 아데노신 5' 모노포스페이트는 분자량이 391 Da으로 약 40분에서 피크를 확인하였다. B는 pH와 온도를 조절하여 저분자화 한 PDRN군으로 15분에서 40분 사이로 넓은 모양의 피크가 나타났는데 이는 PDRN이 조각이 나서 사이즈가 작아진 것을 의미하며 대조군보다 조각난 PDRN이 상당히 많으며, 가장 작은 사이즈로 조각난 것은 아데노신 5' 모노포스페이트 수준정도의 분자량으로 저분자화 된 것을 확인하였다.

상처 면적 및 피부표면 변화

창상 발생 후 상처부위에는 염증기 단계와 함께 혈관수축 및 혈소판 응고 반응이 일어나고 그 후 교원질의 합성, 신생 혈관의 형성 등에 의한 복잡한 병리학적 과정이 일어나 육아조직이 상처 부위를 채우는 재상피화 후 상처부위가 수축되게 된다. 각 실험군의 창상치유에 있어 신생조직의 형성 결과인 창상면적의 감소를 육안적으로 관찰하여 그 수치를 측정한 결과는 표 2와 같다.

상처의 면적은 치료 4주 동안 유사한 경향으로 감소되는 경향을 나타내었으며, 28일째 약물을 도포하지 않은 비처리군 CO군의 상처면적이 1.03± 0.21인 것에 비해 PD군은 0.94± 0.14로 약 9 % 정도, PH군은 0.87± 0.16으로 약 15 % 정도로 유의적으로 상처 면적 감소를 보였으며(P<0.05), PC군과도 유의적인 창상면적의 감소효과를 나타내었다. 4주간 상처면적의 감소 경향은 PC군 > PH군 > PD군 > HA군의 순으로 관찰되었다.

-		CO	PC	HA	PD	PH
상처 면적 (㎜)	0 주	8.00± 0.00^NS	8.00± 0.00	8.00± 0.00	8.00± 0.00	8.00± 0.00
	1 주	5.54± 0.14	5.06± 0.11	5.22± 0.13	5.21± 0.22	5.10± 0.12
	2 주	4.02± 0.11	3.65± 0.14	3.90± 0.11	3.90± 0.15	3.70± 0.15
	3 주	2.08± 0.12	1.66± 0.15	1.97± 0.10	1.95± 0.14	1.65± 0.13
	4 주	1.03± 0.21	0.85± 0.18	0.97± 0.11	0.94± 0.14	0.87± 0.16

조직병리학적 변화 관찰 결과

창상유발 후 28일째의 창상부를 포함한 부위의 병리조직학적 관찰은 H&E와 Tunel 염색을 통해 확인하였고, 그 결과는 각각 도 4와 도 5와 같다.

H&E(Hematoxylin and Eosin) 염색 되어진 조직검경 결과, 실험군 모두 피부 신생조직의 재형성이 이루어지고 있었으며, 그 중 양성대조군은 대조군에 비하여 빠른 재상피화가 이뤄진 것이 관찰 되었다. 또한 PH군은 HA와 PD군과 대비하여 양상대조군과 유사한 수준의 재상피화가 이뤄진 것을 확인 할 수 있었다.

조직의 교원질층은 CO군과 대비하여 PC군이 더욱 치밀하고 일정하게 형성된 것을 확인 할 수 있었다. CO군과 대비한 실험군들의 교원질 재합성 및 형성 수준은 PH군 > PD군 > HA군 순으로 조직재생이 빠르게 이뤄지고 있는 것을 확인 할 수 있었다. 염증성 세포 침윤정도는 CO군과 HA군간에 큰 차이는 보이지 않았으며 CO군과 비교하여 PC군, PD군, PH군의 적은 분포를 관찰 할 수 있었다. PD 또는 PH 시료가 실험동물의 창상치유과정을 촉진하고 손상된 조직회복에 긍정적으로 관여하는 것으로 사료된다.

TUNEL 염색 되어진 조직검경 결과, CO군내 apoptotic 세포가 상당하게 관찰되었다. 이와 비교해 HA군은 CO군과의 큰 차이는 보이지 않았으며, PC군과 PH군 피부조직에서는 apoptotic 세포가 감소된 것을 확인할 수 있었고 PD군 역시 CO군 대비 적은 분포가 관찰 되었다. 이는 PD군 또는 PH군 시료가 손상조직의 치유과정을 촉진시켜 계속되는 손상수복 반응이 일어나지 않은 것에 의한 것으로 사료된다.

피부조직의 유전자 발현량 변화

창상치유과정은 PDGF(plattele-derived growth factor), VEGF(vascular endothelial growth factor), EGF(epidermal growth factor), TGF-β(transforming growth factor beta), IL-10(interleukine-10) 등의 성장 인자(growth factor)와 사이토카인(cytokine)이 관여하여 세포 및 조직들에서 복합적으로 활성을 나타내어 이루어진다. 특히 VEGF는 혈관 신생을 유도하는데 이러한 VEGF는 TGF-β등에 의하여 자극을 받으며, 섬유모세포, 대식구 및 각질형성세포, 혈관내피세포 등에서도 분비되어 주로 섬유화 및 육아조직을 이루는데 기여한다고 알려져 있다. 본 실험에서는 도포한 시료가 창상치유에 관여하는 인자들 중 VEGF 및 TGF-β 유전자 발현에 미치는 영향을 qRT-PCR을 통하여 확인한 결과 도 6과 같다.

창상유발 28일째 실험군들의 조직에서 VEGF 유전자 발현(fold change)은 CO군이 1.01± 0.30으로 가장 낮게 나타났고, 양성대조군인 PC군은 HA군과 유사하게 나타났으며, PD군은 1.14± 0.42로 PC군과 HA군보다 조금 높게 나타났고, PDRN과 히알루론산(hyaluronic acid)이 혼합된 PH군은 1.25± 0.51로 가장 높은 값을 나타내었다. 그러나, TGF-β 유전자 발현은 PC군이 CO군보다 97% 높게 나타나 실험군 중 가장 높은 값을 나타냈으며, PH군은 CO군보다 86%, HA군은 CO군보다 74%, PD군은 CO군보다 46% 높게 나타났다.

다른 연구에서 창상회복기간 중 VEGF 발현이 낮아지며, TGF-β의 과발현은 반흔을 감소시켜주며 콜라겐합성에 기여한다고 보고한 바 있다. 저분자화된 PDRN은 창상치유 속도를 가속화하는 동시에 창상과 반흔 면적감소에 기여함으로써 피부창상치유와 관련 기능성 화장품 소재로써 산업적 활용이 유용 할 것으로 여겨진다. 래트를 졸레틸(25 mg/kg, Zoletile 50^TM; VirbacLab., 프랑스) 마취 하에 왼쪽 대퇴부를 제모한 후, 대퇴부를 3 cm 피부 절개 후 대퇴사두근을 3 cm 절개하여 창상을 유발하였다. 이후 젠타큐를 각각 1× 2 cm²(총 4 mg)의 크기로 이식한 후(각각 3마리) 3-0 나일론으로 피부를 봉합했다. 이식 수술 후 1일째부터 7일 동안 복대정맥으로부터 채혈을 하고 이식 부위의 근육을 샘플링하였다. 이식 및 샘플링 전 과정은 블라인드로 수의사에 의해 실시하였다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

다음의 단계를 포함하는 항염 및 피부 재생용 조성물의 제조방법:
(a) 연어이리 추출물(salmon milt extract)로부터 폴리데옥시리보뉴클레오타이드(polydeoxyribonucleotide, PDRN)를 추출하는 단계;
(b) 상기 단계 (a)의 결과물인 상기 PDRN에 함유된 엔도톡신(endotoxin)을 제거하는 단계;
(c) 상기 단계 (b)의 결과물을 투석시켜 잔류용매를 제거하는 단계; 및
(d) 상기 단계 (c)의 결과물에 산성 용매를 첨가하여 반응시켜 저분자화 시키는 단계.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)의 PDRN의 추출은 다음의 단계를 포함하는 방법으로 실시되는 것을 특징으로 하는 방법:
(a-1) 연어이리 추출물(salmon milt extract)을 세포 용해 용액(cell lysis solution)에 용해시키고 리보뉴클레아제를 첨가하여 반응시키는 단계;
(a-2) 상기 단계 (a-1)의 결과물에 단백질 침전 용액(protein precipitation solution)을 첨가하고 교반하는 단계;
(a-3) 상기 단계 (a-2)의 결과물을 원심분리시켜 수득한 상등액에 소듐 아세테이트를 첨가하여 인버팅(inverting)시키는 단계;
(a-4) 상기 단계 (a-3)의 결과물을 원심분리시켜 상등액을 제거하고 건조시켜 용출(elution)시키는 단계; 및
(a-5) 상기 단계 (a-4)의 결과물에 페놀, 클로로포름 및 이소아밀알코올(isoamylalcohol)을 첨가하고 원심분리 시킨 다음 수득한 상등액에 클로로포름 및 이소아밀알코올을 첨가하고 원심분리 시켜 폴리데옥시리보뉴클레오타이드를 수득하는 단계.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (b)의 엔도톡신의 제거는 다음의 단계를 포함하는 방법으로 실시되는 것을 특징으로 하는 방법:
(b-1) 상기 단계 (a)의 PDRN에 Triton X-114 및 SDS을 포함하는 용액을 첨가하고 NaCl을 첨가한 다음 원심분리 시켜 상등액을 수득하는 단계;
(b-2) 상기 단계 (b-1)의 결과물에 소듐 아세테이트를 첨가한 다음 인버팅(inverting)시키는 단계; 및
(b-3) 상기 단계 (b-2)의 결과물을 원심분리 시킨 다음 PBS 용액으로 용해시키는 단계.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (c)의 투석은 상기 단계 (b)의 결과물을 투석막에 넣고 이에 PBS 용액을 첨가한 다음 24-60시간동안 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (d)의 산성 용매는 아세트산, 인산, 푸마르산(fumaric acid), 시트르산, 뷰티르산(butyric acid), 개미산, 프로피온산(propionic acid) 및 염산으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (d)의 저분자화 시키는 단계는 상기 단계 (c)의 결과물을 0.2-0.6%로 함량을 조절한 다음, 이에 산성 용매를 첨가하여 pH 2.5-4로 조절하고 60-80℃에서 8시간 이상 반응시켜 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 방법은 상기 단계 (d) 이후에 (e) 상기 단계 (d)의 결과물에 히알루론산(hyaluronic acid)을 첨가하여 혼합하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 7 항에 있어서, 상기 단계 (e)의 저분자화된 PDRN 및 히알루론산은 중량비 1:1인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 항염 및 피부 재생용 조성물.
제 9 항에 있어서, 상기 조성물은 약제학적 조성물 또는 화장료 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 9 항의 항염 및 피부 재생용 조성물을 포함하는 창상피복재.