KR102402360B1 - 넙치 정소 조직 유래 고순도 폴리데옥시리보뉴클레오티드 (Polydeoxyribonucleotide, PDRN)의 추출방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 어류의 정액 및 정소에서의 PDRN 추출하는 방법으로 우리나라에서 일반적으로 양식되고 있는 넙치 정소 조직을 분리하여 고순도의 PDRN을 추출하는 방법으로 1) 넙치 정소 조직으로부터 DNA를 추출하는 단계; 2) Endotoxin을 제거하는 단계; 3) 투석을 통해 PDRN을 제외한 기타 물질을 제거하는 단계; 4) PDRN을 저분자화하는 단계;를 포함하여 이루어진 것을 특징으로 하는 넙치 정소 조직으로부터 고순도의 PDRN을 추출하는 방법을 제공함으로서 경제적으로 PDRN을 생산할 수 있다.

Description

넙치 정소 조직 유래 고순도 폴리데옥시리보뉴클레오티드 (Polydeoxyribonucleotide, PDRN)의 추출방법{Method for extracting polydeoxyribonucleotides and polynucleotides derived from flatfish.}

본 발명은 넙치의 정소 조직으로부터 고순도 폴리데옥시리보뉴클레오티드를 추출하기 위한 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 1차적으로 염석법(salting-out, high salt)을 통해 단백질 제거를 진행한 후, 페놀/클로로포름(phenol-chloroform)의 혼합물로 기타 잔여물을 반복 제거하여 고순도의 PDRN을 생산하는 방법에 관한 것이다.

폴리데옥시리보뉴클레오티드(Polydeoxyribonucleotide, 이하 'PDRN'이라 한다.)는 인산 및 네 가지 염기 아데닌, 구아닌, 티민, 사이토신을 포함한 것으로 4종의 염기와 데옥시리보오스 그리고 인산이 결합된 구조가 반복단위를 구성하여 고분자량의 이중가닥 중합체를 형성한 것이며, 추가적으로 아데닌(A), 구아닌(G), 시토신(C), 우라실(U)의 4종의 염기와 당과 인산이 반복단위가 되어 단일 가닥의 중합체를 형성한 유전 물질(이하, 유전자로 약칭함)이다.

이들 DNA 또는 RNA와 같은 유전자 물질은 가수분해될 수 있으며 모든 생명체에 단백질과 결합하거나 또는 유리 상태로 분포하고 있다. 유리 상태의 단일가닥 RNA는 상보성을 갖는 부분이 서로 수소 결합을 형성함으로써 헤어핀 구조를 이루면서 부분적으로 이중가닥을 형성하기도 한다.

동물의 정자나 난자 또는 식물의 생장점 부위는 다른 조직들에 비하여, PDRN 함량이 다른 부위에 비하여 상대적으로 높으며 이러한 유전 물질은 저분자, 고분자, 추출방법에 따라 효율 및 효과가 나뉘어지며 최종 산물인 PDRN은 안전성이 확보된 저분자공정화되어 아데노신 A2 Receptor(리셉터)와 복합체를 이루고 VEGF 분비를 촉진시켜 혈관생성을 유도하고, 섬유 아세포, 골아세포, 연골 세포들을 활성화시킨다는 사실이 알려져 있다.

PDRN(Polydeoxyribonucleotide)은 고분자물의 특성인 점탄성을 가지는 동시에, 피내 주입시 조직수복 효과를 나타낸다. 즉, 피부조직을 구성하고 있는 fibroblast를 증식시키고 활성을 높여 collagen 같은 extracellular matrix 분비를 촉진함으로써 단순한 피부 충전제가 아닌 피부조직의 재생을 유도할 수 있는 새로운 개념의 조직수복의료기기의 주성분이 되며, 우리 몸속 조직의 재생과 염증완화에 특별한 효과를 내고 있다.

PDRN은 피부재생 신호 전달체인 A2 purinergic receptor를 자극하여 각종 성장인자 분비촉진, VEGF(혈관내피세포증식인자)에 의한 모세혈관의 생성, 혈액순환 개선, 항 염증 작용 및 모세혈관 누출 방지 기능을 하여 특별한 부작용 없이 피부재생을 촉진하여 화상이나 만성창상 등에 효과적인 것으로 알려져 있다. 유럽에서는 이미 의약품 허가를 받아 다양하게 활용되어지고 있으며, 국내에서도 전문의약품으로 상처치료, 조직재생 등의 용도로 사용되고 있다.

PDRN은 사람의 태반 속에 극소량 들어 있는 물질이나 윤리적 문제와 의약품 생산성 등의 어려움이 있기 때문에, 핵산 함유량에 있어 양적으로 우월한 송어, 연어의 정액 및 정소 속 PDRN이 대안으로 제시되었다.

어류 유래의 PDRN은 연어(Oncorhynchus keta), 송어(Oncorhynchus mykiss)의 정액 또는 정소에서 추출된 DNA 절편을 일정 크기로 분획화하여 약리활성을 갖도록 만든 저분자 DNA 복합체이다. PDRN은 80~2200개 사이의 염기쌍으로 구성되어 50~1500kDa 범위의 특정 분자량 분포를 갖고 있는 DNA 혼합체로, 80~200 kDa에 가장 많은 DNA 절편이 모여 약리 효과를 나타낸다고 알려져 있다.

한편 넙치는 아시아 국가에서 양식되고 있는 주요 어종 중 하나로 2018년 기준 우리나라 양식 생산량의 약 45% 이상을 차지하는 양식 어종이다. 최근 공급과잉 및 소비 패턴 다양화에 따라 넙치의 소비량이 점차 감소하고 있으며, 넙치의 소비 증진을 위해 고부가가치 기술 개발 등의 연구가 활발하게 이루어지고 있다.

또한 어류 유래 PDRN은 대략 2.5 kg인 연어 성체 한마리에서 얻을 수 있는 정소 크기는 80~100g이며, 1 kg의 넙치 성체 한마리에서 얻을 수 있는 정소 크기는 약 35~40g 정도이므로 연어보다 넙치에서 경제적으로 PDRN을 생산할 수 있다.

따라서 본 발명은 우리나라에서 양식되고 있는 넙치의 정소에서 고순도의 PDRN을 추출하는 방법을 제안하고자 한다.

국내 공개특허번호 제10-2019-0139633호에는 연어과 어류의 정액 및 정소로 부터 페놀등의 유기용제의 사용 없이 공정 및 비용 경제적으로 고효율의 피디알엔(PDRN)을 추출하는 방법에 관하여 개시하고 있다. 국내 등록특허번호 제10-2031152호에는 연어 유래 폴리디옥시리보뉴클레오티드(PDRN, polydeoxyribonucleotide)-고분자복합체, 연어연골 추출물을 가수분해효소 처리하여 연어연골 효소분해물 및 연어오일을 포함하는 PDRN 코어쉘 나노캡슐를 함유하는 피부개선 기능성 화장료 조성물의 제조방법 및 그에 따라 제조된 화장료 조성물에 관하여 개시하고 있다. 국내 공개특허번호 제10-2018-0060693호에는 피부 주름 제거 및 탄력 개선 효과가 향상된 화장료 조성물에 관한 것이며, 인간으로부터 유래된 혈관주위 (Perivascular) 줄기세포를 배양한 배양액 및 폴리디옥시리보뉴클레오티드를 포함함, 사용자의 피부 주름생성을 억제하고 생성된 주름을 제거하며 피부 탄력을 증진시킬 수 있는 장점을 갖는 피부 주름 제거 및 탄력 개선 효과가 향상된 화장료 조성물에 관하여 개시하고 있다.

일반적인 유기용매를 이용하여 DNA를 추출하는 방법은 단백질, 지방 및 기타 잔여물이 DNA quality에 영향을 줄 수 있는 점을 개선하기 위해 본 발명은 1차적으로 염석법(salting-out, high salt)을 통해 단백질 제거를 진행한 후, 페놀/클로로포름(phenol-chloroform)의 혼합물로 기타 잔여물을 반복 제거하여 고순도의 PDRN을 생산하는 방법을 제공하고자 한다.

본 발명의 넙치 정소 조직 유래 고순도 PDRN 추출방법 실시예에 따른 폴리데옥시리보뉴클레오타이드 추출 방법은 1) 넙치 정소 조직으로부터 DNA를 추출하는 단계; 2) Endotoxin을 제거하는 단계; 3) 투석을 통해 PDRN을 제외한 기타 물질을 제거하는 단계; 4) PDRN을 저분자화하는 단계;를 포함하여 이루어질 수 있다.

또한 상기 넙치 정소 조직으로부터 DNA를 추출하는 단계는 정소 조직에 cell lysis solution를 첨가하여 조직을 분쇄한 뒤 Rnase A를 첨가하여 반응시키는 단계; 상기 혼합액에 Protein precipitation solution (high salt solution) 을 첨가 및 교반하여 반응시킨 뒤 원심분리하여 상층액을 추출하는 단계; 상기 상층액에 3M sodium acetate 을 첨가하여 교반하는 단계를 포함하여 이루어지며, 상기 상층액에 3M sodium acetate 을 첨가하여 교반한 혼합액에 동량의 Phenol : Chloroform : Isoamyl alcohol (25:24:1)을 첨가 및 교반한 후 원심분리하여 상층액을 추출하는 단계 및 상기 추출된 상층액에 동량의 Ethanol 첨가하여 5분 이상 반응시켜 원심분리한 후 상층액을 제거하고 DNA 펠렛을 확인한 후, 70~75% Ethanol을 첨가하여 원심분리 후 상층액을 제거하고, DNA 펠렛을 건조한 후 멸균 증류수로 용해시키는 단계를 포함하여 이루어질 수 있다.

본 발명의 Endotoxin을 제거하는 단계는 추출된 DNA에 3M sodium acetate를 첨가하여 얼음물에서 반응시키고 endotoxin removal 용액을 첨가후 교반하여 반응시킨 후 원심분리하여 Upper phase 용액을 추출하는 단계를 포함하여 이루어질 수 있고, 투석을 통해 PDRN을 제외한 기타 물질을 제거하는 단계는 Membrane hydration을 위해 멸균증류수에 반응시키고 Endotoxin을 제거하는 단계에서 얻어진 샘플을 주사기를 이용하여 membrane에 주입한 후 버퍼(H₂O)에 반응시키는 단계를 포함하여 이루어질 수 있다.

본 발명은 국내에서 생산량이 높은 넙치로부터 PDRN을 추출하는 최적의 방법 및 이에 의해 추출된 넙치 정소 유래 PDRN을 제공하여 1 kg의 넙치 성체 한마리에서 얻을 수 있는 정소 크기는 약 35~40g 정도이므로 기존의 연어보다 경제적으로 PDRN을 생산할 수 있고, 일반적인 유기용매를 이용하는 기존의 방법 대비 3-5배의 추출량을 얻을 수 있으며 추출된 고순도의 PDRN은 화장품, 의약품 등 다양한 분야의 원료로 활용가능한 효과가 있다.

도 1은 a) 일반적인 유기용매 추출에 의한 방법 및 b) 염석법(salting-out, high salt)과 페놀/클로로포름(phenol-chloroform) 추출법의 혼합 사용을 이용하여 분리한 DNA의 순도를 비교 분석하기 위하여 nanodrop 분광광도계(spectrophotometer)로 측정한 결과를 나타낸다.
도 2는 nanodrop 분광광도계(spectrophotometer)를 이용하여 넙치 정소 조직에서 추출하여 저분자화된 PDRN의 농도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 넙치 유래 저분자화된 PDRN의 DNA 전기영동 결과를 나타낸 것이다.

본 발명에서 지칭하는 용어, 폴리디옥시리보뉴클레오티드(PDRN; Polydeoxyribonucleotide)는 인산 및 네 가지 염기 아데닌, 구아닌, 티민, 사이토신을 포함한 것으로 4종의 염기와 데옥시리보오스 그리고 인산이 결합된 구조가 반복단위를 구성하여 고분자량의 이중가닥 중합체 또는 저분자량의 이중가닥 중합체를 형성한 것이며, 추가적으로 아데닌(A), 구아닌(G), 시토신(C), 우라실(U)의 4종의 염기와 당과 인산이 반복단위가 되어 단일 가닥의 중합체를 형성한 유전 물질(이하, 유전자로 약칭함)을 지칭한다.

또한, 본 발명에서 제조되는 저분자된 폴리디옥시리보뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오타이드의 분자량은 5kDa-20000kDa인 것일 수 있으며 더 자세하게는 저분자된 폴리디옥시리보뉴클레오티드는 5kDa 이하 일 수 있다.

본 발명은 어류의 정액 및 정소에서의 PDRN 추출하는 방법으로 기존의 연어 또는 송어의 정액 또는 정소로부터 PDRN을 추출하는 방법이 아닌 우리나라에서 일반적으로 양식되고 있는 넙치 정소 조직을 분리하여 고순도의 PDRN을 추출하는 방법을 제공한다.

본 발명은 1) 넙치 정소 조직으로부터 DNA를 추출하는 단계; 2) Endotoxin을 제거하는 단계; 3) 투석을 통해 PDRN을 제외한 기타 물질을 제거하는 단계; 4) PDRN을 저분자화하는 단계;를 포함하여 이루어진 것을 특징으로 하는 넙치 정소 조직으로부터 고순도의 PDRN을 추출하는 방법으로 이루어진다.

일반적인 PDRN 추출법은 어류 정소 조직에서 핵산 복합 물질을 분리 추출하거나, 유기용매 추출에 의한 방법(ethanol 혹은 sodium acetate 와 Isopropanol의 혼합물 이용)이 사용되고 있다.

이와 같이 일반적인 유기용매를 이용하여 DNA를 추출하는 방법은 단백질, 지방 및 기타 잔여물이 DNA quality에 영향을 줄 수 있으므로, 본 발명에서는 1차적으로 염석법(salting-out, high salt)을 통해 단백질 제거를 진행한 후, 페놀/클로로포름(phenol-chloroform)의 혼합물로 기타 잔여물을 반복 제거하여 고순도의 PDRN을 생산한다.

염석법은 염 농도(이온강도)가 증가함에 따라 단백질의 용해도는 감소하면서 단백질끼리 엉김현상이 일어나는데, 이러한 효과를 염석(salting out)이라 한다. 수용액에 고농도의 이온이 존재할 경우 불순물 및 단백질이 침전 효과가 증가하므로, 고순도의 PDRN을 획득할 수 있다.

페놀/클로로포름(phenol-chloroform) 추출법은 단백질과 지질에서 핵산을 분리하는데 사용되는 액체-액체 추출기술로서, 페놀은 단백질을 변성 및 제거하는 역할을 하며 클로로포름은 수층의 페놀을 제거하는 역할을 한다. 상기 혼합 제거 방법은 보편적으로 실시하는 PDRN 추출법과 상이하다.

마지막으로 고순도의 PDRN을 추출하기 위해 DNA를 제외한 잔여물 제거를 위한 투석을 진행한다. 투석법은 반투막을 이용하여 고분자 물질과 혼합된 저분자 물질들을 농도기울기를 통해 막 밖으로 확산시키는 방법이다.

이상의 추출법을 통해 단백질, 다당류, 지질 등의 여러 불순물로부터 고순도의 DNA를 분리하는 것이 가능하다. 이하, 본 발명의 고순도 폴리데옥시리보뉴클레오타이드를 추출하는 방법과 관련한 도면을 첨부하여 상세히 설명하면 다음과 같다.

(가) 넙치원료확보 단계

본 발명의 원료확보단계(가)는 양식된 넙치를 확보하는 단계로서 상기 넙치는 가자미목 넙치과의 Paralichthys olivaceus 어종으로 체장은 약 24.3ㅁ1.8 cm, 체중은 약 166ㅁ40.3 g 이상으로 성숙한 것이 바람직하다. 양식장에서 사육된 넙치는 정소 조직을 추출하기 전까지 수온 17℃, 광주기 12L:12D로 유지하면서 넙치를 안정화 시킨다.

넙치는 국내에서 양식되고 있는 주요 어종 중 하나로 성장 속도가 빠르고 병해에도 강해 경제성과 상업성을 갖춘 어종이다. 본 발명에 의한 PDRN 추출방법에 의하면, 넙치 정소로부터 고수율의 PDNR을 추출할 수 있으며, 보편적으로 PDRN의 원료가 되는 연어를 대체할 수 있고 비용 및 절차 경제적인 방법으로 PDNR을 추출할 수 있다.

나) 정소 조직 DNA 추출

정소 조직에 cell lysis solution를 첨가하여 조직을 분쇄한 뒤 Rnase A를 첨가하여 반응시킨다. 상기 혼합액에 Protein precipitation solution (high salt solution) 을 첨가 및 교반하여 반응시킨 뒤 원심분리하여 상층액을 새 tube에 옮긴다. 상기 상층액에 3M sodium acetate 을 첨가하여 교반한다.

Phenol-chloroform 방법으로 상기 혼합액에 동량의 Phenol : Chloroform : Isoamyl alcohol (25:24:1)을 첨가 및 교반하였다. 그 다음 원심분리하여 상층액을 새 tube에 옮긴다. 혼합액에 동량의 Chloroform : Isoamyl alcohol 혼합액(24:1)을 첨가 및 교반하여 원심분리 후 상층액을 새 tube에 옮긴 후 상기 과정을 1회 반복한다. 반복 과정에서 사용되는 혼합액에서 페놀성분을 제외하여 교반함으로서 최종산물의 순도를 높일 수 있다.

상기 혼합액에 동량의 Ethanol 첨가하여 5분 이상 반응시킨다. 원심분리하여 상층액을 제거하고 DNA 펠렛을 확인한 후 70~75% Ethanol을 첨가하여 원심분리 후 상층액을 제거한다. DNA 펠렛을 건조한 후 멸균 증류수로 용해시킨다.

도 1은 본 발명의 정소 조직으로부터 a) 일반적인 유기용매 추출에 의한 방법 및 b) 염석법(salting-out, high salt)과 페놀/클로로포름(phenol-chloroform) 추출법의 혼합 사용 방법을 이용하여 추출한 DNA 순도를 비교 분석하기 위해 nanodrop 분광광도계(spectrophotometer)로 측정한 결과를 나타낸다.

정소 조직으로부터 추출한 DNA의 순도 비교결과( a) 일반적인 유기용매 추출에 의한 방법 및 b) 염석법(salting-out, high salt)과 페놀 / 클로로포름(phenol-chloroform) 추출법의 혼합 사용방법)

Sample ID	Nucleic Acid	Unit	A260 (Abs)	A280 (Abs)	260/280	260/230	Type
a	182	ng/ul	1.025	0.552	1.86	1.55	DNA
b	664	ng/ul	13.7	7.2	1.90	1.94	DNA

본 발명에 따른 DNA흡광도는 Thermo 사의 nanodrop-1000장비를 이용하여 DNA 원액을 분광광도계를 사용하여 260nm에서 흡광도(Absorbance, A)를 측정하고, 추출된 PDRN의 260(DNA)/280nm(단백질) 값의 비율이 1.7 ~ 2.0 사이일 경우, 순도 99%로 판정한다.

본 발명의 정소 조직 DNA 추출 단계를 거친 DNA를 nanodrop 분광광도계(spectrophotometer)로 PDRN의 260(DNA)/280nm(단백질) 값의 비율을 측정한 결과를 살펴보면 a) 일반적인 유기용매 추출에 의한 방법은 1.86 및 b) 염석법(salting-out, high salt)과 페놀 / 클로로포름(phenol-chloroform) 추출법의 혼합 사용방법은 1.90으로 나타나 두가지 방법 모두 DNA 흡광도 측정 값이 1.7을 넘어 순도 99% 이상임을 확인하였다. 그러나 본원발명의 염석법(salting-out, high salt)과 페놀 / 클로로포름(phenol-chloroform) 추출법의 혼합 사용방법이 일반적인 방법보다 더 높은 순도의 결과를 나타내었다.

다) Endotoxin 제거

DNA에 3M sodium acetate를 첨가하여 얼음물에서 반응시킨다. endotoxin removal 용액 첨가 및 교반하여 반응시킨다. 상기의 혼합액을 반응시킨 후 원심분리하여 Upper phase 용액을 새 tube에 옮긴다. 상기 과정의 1회 더 반복하여 다음 단계를 진행한다. isopropanol 첨가 및 교반하여 반응시킨후, 상기 혼합용액을 원심분리하여 상층액을 제거하고 펠렛을 확인한다. 펠렛에 ethanol을 첨가하여 원심분리한 뒤 상층액을 제거하고 펠렛을 건조하여 멸균 증류수로 희석한다.

라) 투석

Membrane hydration을 위해 멸균증류수에 반응시킨다. 상기 과정에서 멸균 증류수에 희석한 샘플을 주사기를 이용하여 membrane에 주입한 후 버퍼(H₂O)에 반응시킨다. 상온에서 반응 후 2회 버퍼를 교체한 후 overnight 반응한다. 샘플 주입할 때와 마찬가지로 주사기를 이용하여 샘플을 회수한다.

마) 저분자화

초음파 분쇄기(sonicator)를 이용하여 샘플을 약 50~500 bp 길이가 되도록 단편화하였다. 소니케이션(sonication) 처리를 진행하고 micro-filter column에 옮겨 8000rpm 10분간 원심분리를 실시한다. 이후 정제수를 5ml 넣고 12000rpm에서 2분간 원심분리를 실시하여 최종 저분자의 폴리디옥시리보뉴클레오티드를 확보한다. 본 발명의 저분자 단계는 상기 (라)단계로 건조된 결과물을 1% 나트륨 정제수 1ml를 첨가하여 희석 후 발효 아세트산을 이용하여 10분간 처리 후 소니케이션 처리를 10분간 진행하며, 원심분리를 실시하여 저분자 폴리디옥시리보뉴클레오티드를 확보하는 단계를 포함한다.

도 2는 본원발명의 넙치 정소 조직에서 추출된 저분자화된 PDRN을 nanodrop 분광광도계(spectrophotometer)를 이용하여 PDRN의 농도를 확인한 결과를 나타낸다.

넙치 정소 조직에서 추출된 저분자화된 PDRN을 nanodrop 분광광도계(spectrophotometer)를 이용하여 PDRN의 농도를 확인한 결과

Sample ID	Nucleic Acid	Unit	A260 (Abs)	A280 (Abs)	260/280	260/230	Type
PDRN	2319.1	ng/ul	46.333	24.313	1.91	2.43	DNA

본 발명에 따른 DNA흡광도는 Thermo 사의 nanodrop-1000장비를 이용하여 DNA 원액을 분광광도계를 사용하여 260nm에서 흡광도(Absorbance, A)를 측정하고, 추출된 PDRN의 260(DNA)/280nm(단백질) 값의 비율이 1.7 ~ 2.0 사이일 경우, 순도 99%로 판정한다. 본 발명의 정소 조직 DNA 추출 단계를 거친 DNA를 nanodrop 분광광도계(spectrophotometer)로 측정한 PDRN의 260(DNA)/280nm(단백질) 값의결과를 살펴보면 1.91으로 나타나 DNA 흡광도 측정 값이 1.7을 넘어 순도 99% 이상임을 확인하였다.

도 3은 본원발명의 넙치 정소 조직에서 추출된 저분자화된 PDRN의 크기에 대한 DNA 전기영동 결과를 나타낸 것이다. 일반적으로 피부흡수, 조직 침투율, 흡수율 등을 효과적으로 하기 위해 저분자화 과정이 반드시 필요하다. 따라서 본 실험결과에서도 알 수 있듯이 5kDa이하의 저분자 공정으로 생산된 유전물질이 향후 조직, 피부 등에서 침투, 흡수율을 높일 수 있는 것으로 판단된다.

이상과 같은 구성을 갖는 본 발명은 특정 온도에서 조직파쇄, 멸균 및 분자량 저감공정을 통해 DNA를 추출하므로, 정소 조직으로부터 특정 분자량 범위의 DNA 중합체 단편들을 보다 효율적으로 얻을 수 있다.

본 발명은 국내에서 생산량이 높은 넙치로부터 고순도의 경제적인 PDRN을 추출방법 및 이로부터 추출된 넙치 정소 유래 PDRN을 제공함으로서 화장품, 의약품 등 다양한 분야의 원료로 활용 가능한 산업상 이용가능성이 있다.

Claims (6)

1) 넙치 정소 조직에 cell lysis solution를 첨가하여 조직을 분쇄한 뒤 Rnase A를 첨가하여 반응시키는 단계; 상기 혼합액에 Protein precipitation solution (high salt solution) 을 첨가 및 교반하여 반응시킨 뒤 원심분리하여 상층액을 추출하는 단계;
상기 상층액에 3M sodium acetate을 첨가하여 교반한 혼합액에 혼합액 동량의 Phenol : Chloroform : Isoamyl alcohol (25:24:1)을 첨가 및 교반한 후, 원심분리하여 상층액을 추출하고,
상기 추출된 상층액에 동량의 Ethanol 첨가하여 5분 이상 반응시켜 원심분리한 후, 상층액을 제거하고 DNA 펠렛을 확인하고, 70~75% Ethanol을 첨가하여 원심분리하여, 상층액을 제거하고, DNA 펠렛을 건조한 후 멸균 증류수로 용해시키는 단계로 이루어지는 DNA를 추출하는 단계;
2) 상기 추출된 DNA에 3M sodium acetate를 첨가하여 얼음물에서 반응시키고 endotoxin remova 용액을 첨가 후 교반하여 반응시킨 후 원심분리하여 Upper phase 용액을 추출하는 Endotoxin을 제거하는 단계;
3) Endotoxin을 제거하는 단계에서 얻어진 샘플을 주사기를 이용하여 membrane에 주입한 후 버퍼(H2O)에 반응시키는 투석을 통해 PDRN을 제외한 기타 물질을 제거하는 단계 및 PDRN을 저분자화시킴으로써 5kda 이하의 PDRN을 수득하는 단계;를 포함하여 이루어진 것을 특징으로 하는 넙치 정소 조직 유래 고순도 PDRN 추출방법

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