CN113913420A - 一种固定长度重组多核苷酸/多脱氧核糖核苷酸制备方法及其应用 - Google Patents

一种固定长度重组多核苷酸/多脱氧核糖核苷酸制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种固定长度重组多核苷酸/多脱氧核糖核苷酸制备方法及其应用，先建立PN/PDRN的DNA文库，自文库中选取出固定长度的PN/PDRN并进行连接产生多拷贝PN/PDRN片断，将多拷贝PN/PDRN片断转接到克隆载体取得重组PN/PDRN克隆载体；将重组PN/PDRN载体引入适合细菌宿主取得转化子，培养转化子使重组PN/PDRN克隆载体得以大量复制扩增，然后再从转化子内分离出重组PN/PDRN克隆载体，自重组PN/PDRN克隆载体中酶切取得固定长度的重组PN/PDRN片段。有别于传统自人类或动物细胞组织中提取PN/PDRN的方法，本方法制备所得固定长度的重组PN/PDRN，使生产效率大幅提高，不仅能避免使用人类或动物细胞组织材料的风险，也有高产量、低成本优势，可以运用于化妆品、保健品、医疗器械与医药品等用途，经济效益获得显着提升。

Description

一种固定长度重组多核苷酸/多脱氧核糖核苷酸制备方法及 其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种固定长度重组多核苷酸/多脱氧核糖核苷酸制备方法及其应用。
背景技术
众所周知脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid,DNA)是包含人类在内多数生物体的遗传物质，负责生命遗传讯息的维持与传递；DNA是由四种脱氧核糖核苷酸所组成的大分子聚合物，脱氧核糖核苷酸是由脱氧核糖、碱基和磷酸所构成。脱氧核糖核苷酸有4种：腺嘌呤脱氧核糖核苷酸(Adenine deoxyribonucleotide,A)、鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸(Guanine deoxyribonucleotide,G)、胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸(Thyminedeoxyribonucleotide,T)和胞嘧啶脱氧核糖核苷酸(Cytosine deoxyribonucleotide,C)。DNA分子结构则由两股反向互补的多脱氧核糖核苷酸链，A-T、G-C间以氢键形成碱基配对(base pair,bp)，形成稳定的双股螺旋结构。
多核苷酸(Polynucleotides,PN)或多脱氧核糖核苷酸(Polydeoxyribonucleotides,PDRN)是从大分子DNA降解后取得的小片段产物，长度介于数十到数千碱基对，功能性PN/PDRN的长度介于50到2000碱基对；目前已知PN/PDRN的长度决定其生物功能性，对序列则没有特定要求。
以往研究显示PN/PDRN具有许多的生物活性，包括：促进细胞生长、提高细胞活性、促进DNA修复、抗发炎、抗氧化、促进血管生成、促进胶原蛋白合成、促进多种组织修复再生、促进伤口愈合、减少疤痕生成、减少皱纹、增加皮肤与弹性、减小毛孔粗大、抑制黑色素生成等功效。PN/PDRN目前已运用于多种医药品、医疗器械、美容产品中，例如再生类药物、关节腔填补剂、皮下植入剂、水光类美容产品、涂抹类美容产品。
既有PN/PDRN主要提取自人类或哺乳类动物的胎盘组织、大西洋鲑鱼的精细胞/精囊组织、虹鳟鱼的精细胞/精囊组织、太平洋鲑鱼的精细胞/精囊组织、中华鲟的精细胞/精囊组织。现有关于PN/PDRN的制备专利主要集中在如何从鱼类的精液和/或精囊中提取出多核苷酸/多脱氧核糖核苷酸片段，包括：CN107287186A从鱼类的精液分离多脱氧核糖核苷酸的方法、CN110747194A一种小分子多聚脱氧核糖核苷酸及其制备与应用、CN112315836A一种高效的外用PDRN的制备方法及其应用。
发明人在实际使用过程中发现，这些现有技术至少存在以下技术问题：
1、现有制备方式的原料供应有限制：鱼类有一定的养殖周期，甚至要捕捞某些野生鱼种还有季节性问题，因此，现有技术制作PN/PDRN所需原料(raw material)的取得容易受到限制；
2、现有制备方式的PN/PDRN使用上有限制：人类或动物来源的材料在运用上常因病毒传播和不纯物的免疫原性等方面的安全风险问题而受到较严格的要求，因此，人类或动物来源PN/PDRN运用于在高侵入性医疗产品或医药品时易受限制，需要投入更多安全性验证；
3、现有PN/PDRN产品的变异大：市售PN/PDRN产品不同批次取得PN/PDRN长度范围差异大，见图6(A)琼脂糖凝胶电泳图；由于PN/PDRN的长度范围与功能性相关，因此会可能造成功能性不稳定；另外、现有PN/PDRN常源自人类或鱼类，其基因体大小高达2x108～3x109碱基对，按23～32对染色体计算，平均每条染色体起始长度将近有3x106碱基对，要将其制作成50～2000碱基对大小范围的产品，转化效率难以掌控；
4、现有PN/PDRN潜在高风险：人类或鱼类来源的PN/PDRN，即使将片段大小控制在50～2000碱基对大小，PN/PDRN上的序列基本上完全无法掌握，无法完全排除因基因重组造成细胞癌变的可能，长期使用时存有潜在高风险；
5、现有PN/PDRN的成本偏高：现有制备方式使用的原料成本高，批次生产间PN/PDRN片段大小及转化效率均不易标准化，质量与成本皆难以管控，不利于规模化生产，因而使该原料无法广泛被运用。
发明内容
针对现有技术中存在的原物料取得困难、成本高、动物源污染风险、PN/PDRN片段大小控制不易等问题，本发明提出了一种固定长度重组PN/PDRN制备方法及其应用，其目的为：提供一种所需物料明确、制备时间短，同时能制备固定长度PN/PDRN的方法。
为实现上述目的本发明所采用的技术方案是：提供一种固定长度重组PN/PDRN制备方法，制备步骤如下：
(1)建立PN/PDRN的DNA文库(DNAlibrary)
(2)自步骤(1)DNA文库中选取固定长度的重组PN/PDRN；
(3)将步骤(2)重组PN/PDRN作连结，得到多拷贝重组PN/PDRN；
(4)将步骤(3)多拷贝重组PN/PDRN连结到克隆载体，得到多拷贝重组PN/PDRN克隆载体；
(5)将步骤(4)多拷贝重组PN/PDRN克隆载体引入适合细菌宿主，得到转化子；
(6)将步骤(5)转化子进行培养，取得大量转化子；将转化子裂解并提取出多拷贝重组PN/PDRN克隆载体；
(7)将步骤(6)多拷贝重组PN/PDRN克隆载体进行酶切和分离，以提取出固定长度重组PN/PDRN。
其进一步的优选技术方案为：步骤(1)中所述PN/PDRN，可以提取自包括但不限于人类细胞/组织、大西洋鲑鱼精细胞/精囊组织、虹鳟鱼精细胞/精囊组织、太平洋鲑鱼精细胞/精囊组织、中华鲟精细胞/精囊组织，长度介于30～5000个碱基对，更优选为50～2000个碱基对；PN/PDRN的DNA文库建立方式，可以使用包括但不限于自行设计制备、赛默飞MuSeekTM文库制备套组、赛默飞ClaSeek文库制备套组、赛默飞Invitrogen Collibri PCR-Free PS文库制备套组或赛默飞Invitrogen Collibri PS DNA文库制备套组，更优选为自行设计制备，简述如下：
(1)自制或选购市售PN/PDRN原料，取2mg PN/PDRN溶解于TE buffer溶液，先以T4DNA聚合酶(T7 ligase)处理，将3’-端突出序列切平，再加入脱氧核糖核苷三磷酸(Deoxyribonucleotide triphosphates,dNTPs)将5’-端突出序列的互补位置补齐(fill-in)，如此可使PN/PDRN片段末端平齐(blunt end)；
(2)将步骤(1)中的PN/PDRN反应，加热去活化T4 DNA聚合酶，并以DNA纯化树脂纯化取得PN/PDRN；
(3)pUC18载体先以SmaI酶切，加热去活化SmaI酶，再以碱性磷酸酶(alkalinephosphatase)处理以避免pUC18载体自连接(self-ligation)，并以DNA纯化树脂纯化取得pUC18/SmaI载体；
(4)以T4 DNA聚合酶将PN/PDRN连接于pUC18载体的SmaI位点中，见附图1和附图2；
(5)将pUC18-PN/PDRN重组载体转化到大肠杆菌株DH10B，以蓝白筛选(Blue-Whiteselection)方式挑出具有PN/PDRN的转化子；
(6)挑选不同转化子进行小量培养，提取转化子中的重组载体，以限制内切酶BamHI和KpnI自重组载体中切下重组PN/PDRN，以琼脂糖凝胶电泳分离检视，挑选具有不同长度的重组PN/PDRN重组载体；必要时，可用M13定序引物或M13反向定序引物进行PN/PDRN定序；M13定序引物序列：5’-GTAAAACGACGGCCAG-3’、M13反向定序引物序列：5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’；
(7)挑选具有不同大小重组PN/PDRN的转化子进行保存，即可得PN/PDRN的DNA文库。
其进一步的优选技术方案为：步骤(2)中所述固定长度的PN/PDRN，长度介于30～5000个碱基对，更优选为50～2000碱基对；固定长度的重组PN/PDRN可选殖自步骤(1)DNA文库、聚合酶链式反应扩增或人工合成取得，更优选为聚合酶链式反应扩增；由于PN/PDRN的功能没有特定序列的要求，因此，不需选取特定的序列，为避免功能性基因片段可能造成细胞转化(cell transformation)风险，优先选取非编码(non-coding)区域的序列。
聚合酶链式反应扩增时所使用的引物，设计原则二端要预留限制内切酶(restriction endonucleases)的酶切位点，以利后续重组PN/PDRN的连结与酶切，可见实施例2；
其进一步的优选技术方案为：步骤(3)中将重组PN/PDRN连结，可以使用包括但不限于T4 DNA连接酶、T3 DNA连接酶、T7 DNA连接酶进行连结，优选为T4 DNA连接酶；步骤(3)中所述多拷贝重组PN/PDRN，将重组PN/PDRN片段以连结，形成多拷贝(multi-copy)重组PN/PDRN，目的在于使一个重组克隆载体可以切出2～多个拷贝的重组PN/PDRN片段，有利提高转化效率。
其进一步的优选技术方案为：步骤(4)中将多拷贝PN/PDRN连结到克隆载体，可以选用包括但不限于T4 DNA连接酶、T3 DNA连接酶、T7 DNA连接酶进行连结，优选为T4 DNA连接酶；步骤(4)中所述克隆载体(cloning vector)，包含但不限于pUC系列载体、
Figure BDA0003241086770000041
系列载体、
Figure BDA0003241086770000042
系列载体、pTZ系列载体中的一种或多种，载体拷贝数(copy number)>100，首选为拷贝数>300的载体。高拷贝数载体可在一个细菌宿主内可增殖出数百条的重组载体，可有效提高生产效能。
其进一步的优选技术方案为：步骤(5)中所述适合细菌宿主，包含但不限于大肠杆菌株MC1061、DH5a、DH10B、BL21、Top10、DB3.1中的一种或多种，首选为DH10B、BL21。
其进一步的优选技术方案为：步骤(6)中所述培养，包含但不限于GYT培养基、Luria-Bertani培养基、M9培养基、NZCYM培养基、NZYM培养基、NZM培养基、SOB培养基、SOC培养基、Terrific肉汤培养基、2×YT培养基中的一种或多种，首选为Luria-Bertani培养基、Terrific肉汤培养基，培养温度35±2℃，培养时间12～30小时。依克隆载体上的筛选标签(selection marker)类型，培养基需外加适当抗生素进行筛选。步骤(4)所述pUC系列载体、pGEM系列载体、pBluescript系列载体、pTZ系列载体所用的筛选标签均为AMPR，需于培养基中加入氨苄青霉素(Ampicillin)做为筛选压力，以利重组载体保有绝对的增殖优势。步骤(6)中所述裂解并提取出重组克隆载体，裂解方法包含但不限于碱溶解法、煮沸法、酵素法或机械破碎法，首选为碱溶解法或机械破碎法；提取方法包含但不限于沉淀法、超高速离心法、膜过滤法、层析法的一种或多种，首选为沉淀法。
其进一步的优选技术方案为：步骤(7)中所述提取出多拷贝重组PN/PDRN，以限制性内切酶酶切法自多拷贝重组PN/PDRN克隆载体中切出重组PN/PDRN，搭配琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、淀粉凝胶电泳或层析法进行分离，可提取出固定长度重组PN/PDRN。
其进一步的优选技术方案为：一种固定长度重组多核苷酸/多脱氧核糖核苷酸，由上述制备方案制备而成。
其进一步的优选技术方案为：一种固定长度重组多核苷酸/多脱氧核糖核苷酸的应用，包括但不限于功能性食品、化妆品、敷料类产品、微针注射用产品、骨关节注射用产品、美容注射用产品、细胞治疗载体和组织工程基质产品、3D打印用生物墨水、医药品；
或将多种固定长度的重组PN/PDRN混合制备出重组PN/PDRN复合物，包含二种及以上固定长度的重组PN/PDRN；
或透过改质方式制备出重组PN/PDRN衍生物进行应用，包含但不限于物理性交联、化学性交联、生物性交联或与其他非DNA物质交联形成PN/PDRN共聚物；
或将重组PN/PDRN或重组PN/PDRN衍生物再加工成不同形式产品进行应用，再加工方法包含但不限于干燥成粉(powder)、干燥造粒(particle)、干燥制锭(table)、干燥成膜(film)、冷冻干燥成海绵(sponge)、纺制成丝线(thread)；
或混合其他物质制成复合产品应用，其他物质包含但不限于人类干细胞提取物、人类干细胞外泌体、透明质酸钠、交联透明质酸钠、交联明胶、交联动物胶原蛋白、交联重组人类胶原蛋白、交联重组人类弹性蛋白、交联重组人类纤维粘连蛋白、聚乙二醇-聚乳酸共聚物、聚乙二醇-聚乳酸共聚物微粒、羟基磷灰石微粒、聚左旋乳酸微粒、聚己内酯微粒、聚甲基丙烯酸甲酯微粒、富血小板血浆、同种异体细胞或组织移植物、自体细胞或组织移植物。
相比现有技术，本发明的技术方案具有如下优点/有益效果：
与使用人类或动物细胞或组织中提取PN/PDRN的多数方法比较，本专利透过分子克隆(molecular cloning)技术进行重组PN/PDRN的扩增，有以下优点：
1、非动物源PN/PDRN：可避免人类间疾病传染、人–动物共通疾病传染的风险。
2、原料取得容易：透过简单的发酵培养在一天内即可取得大量原料，反之，人或动物组织原料的取得则困难度高且变异性也大，动物的养殖则耗时且占空间，有些鱼种组织的取得甚至会受季节影响。
3、重组PN/PDRN的序列可以选取控制：重组PN/PDRN的序列可以挑选；反之，人或动物组织提取的PN/PDRN序列则无法控制，批次生产取得的多聚核苷酸序列会存在变异。
4、固定长度重组PN/PDRN的纯度高：重组PN/PDRN的长度可以精准控制，纯度可达99％以上；反之，人或动物组织提取的PN/PDRN只能勉强控制在一个范围，此范围所占整体比例多小于90％甚至更低，PN/PDRN的纯度受限，而且批次生产间的PN/PDRN长度变异度颇大。
5、重组PN/PDRN有利于规模化生产：固定长度及多拷贝重组PN/PDRN的设计，搭配高拷贝数重组克隆载体，可以有效增加转化效率及单位产量；制程所用的培养基、培养条件、辅助原料及分离设备等方法多已有合乎工业生产条件的选择，有利于未来规模化生产。
总体而言，固定长度重组PN/PDRN的制备方法，可生产出高纯度、低成本的PN/PDRN，这也使PN/PDRN有更广泛的应用范围，包括保健品、化妆品、医疗器械与医药品等用途，经济效益获得显着提升。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单的介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1是本发明一种固定长度重组PN/PDRN的制备方法及其应用中，DNA文库及实施例所用克隆载体pUC18的重要组成序列及其说明。
其中：
rep：载体复制所需序列，与克隆载体在宿主内拷贝数高低有关；
lacZ：可使细菌宿主表现β－半乳糖苷酶，一旦有外来DNA片段插入后，会破坏其表现，搭配5-Bromo-4-chloro-3-indolylβ-D-galactopyranoside试剂的使用，可以蓝白筛选(Blue-White Selection)加速挑选出具有外来DNA片段重组克隆载体的转化子；
AMPR：筛选标志(Selection marker)，可使细菌宿主对氨苄青霉素(Ampicillin)产生抗性；
MCS：多克隆位点(multiple cloning site)，内含多种鉴识内切酶的辨识酶切部位，有助于将外来DNA片段连接到克隆载体产生重组克隆载体或是自重组克隆载体上将外来DNA片段切下；
M13定序引物及M13反向定序引物：有利于对克隆的外来DNA片段进行定序。
图2是本发明一种固定长度重组PN/PDRN的制备方法及其应用中，建立PN/PDRNDNA文库范例。
图3是本发明实施例1过程图示
图4是本发明实施例2过程图示
图5是本发明实施例3过程图示
图6为本发明中实施例1-3成果与市售产品的琼脂糖凝胶电泳对比图
具体实施方式
为使本发明目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明的一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。因此，以下提供的本发明的实施方式的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施方式。
应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中可以不对其进行进一步定义和解释。
实施例1：
(1)自PN/PDRN DNA文库中挑选一个固定长度PN/PDRN的转化子，称为pUC18-PN/PDRN01，PN/PDRN01组成序列如下：
Figure BDA0003241086770000071
Figure BDA0003241086770000081
(2)将pUC18-PN/PDRN01转化子培养于含50μg/mL氨苄青霉素的Luria-Bertani培养基，置于35±2℃培养16小时；
(3)以碱裂解法搭配酒精沉淀法提取出pUC18-PN/PDRN01重组克隆载体；
(4)先以BamHI+KpnI于37℃进行酶切4小时，可自重组克隆载体切下重组PN/PDRN01；
(5)以琼脂糖凝胶电泳分离pUC18/BamHI+KpnI载体克隆载体和重组PN/PDRN01，利用DNA纯化树脂纯化可取得固定长度的重组PN/PDRN01片段及pUC18/BamHI+KpnI载体克隆载体；
(6)设计并合成KpnI-BamHI连结物(linker)，序列如下：
正向(Forward)5’-CGGGGGG-3’
反向(Reverse)3’-CATGGCCCCCCCATG-5’(下划线分别为KpnI、BamHI限制内切酶辨识部位5个序列)
(7)将重组PN/PDRN01加KpnI-BamHI连结物混合，以T4 DNA连接酶进行反应，可产生多拷贝重组PN/PDRN01，简称(PN/PDRN01)m；
(8)以T4 DNA聚合酶将(PN/PDRN01)m连接于pUC18载体的BamHI+KpnI位点中，见附图3；
(9)将pUC18-(PN/PDRN01)m重组载体转化到大肠杆菌株DH10B，以蓝白筛选方式挑出具有多拷贝重组PN/PDRN的转化子；
(10)挑选不同转化子进行小量培养，提取转化子中的重组载体，以限制内切酶XbaI和EcoRI自重组载体中切下(PN/PDRN01)m，以琼脂糖凝胶电泳分离检视，挑选具有长度最长的(PN/PDRN01)m重组载体；
(11)以BamHI+KpnI进行酶切，即可将(PN/PDRN01)m切出固定长度的重组PN/PDRN01，见附图6(B)琼脂糖凝胶电泳图。
实施例2：
(1)自PN/PDRN DNA文库中挑选一个固定长度PN/PDRN的转化子，称为pUC18-PN/PDRN02，PN/PDRN02组成序列如下：
Figure BDA0003241086770000091
Figure BDA0003241086770000101
Figure BDA0003241086770000111
(2)将pUC18-PN/PDRN02转化子培养于含50μg/mL氨苄青霉素的Luria-Bertani培养基，置于35±2℃培养16小时；
(3)以碱裂解法搭配酒精沉淀法提取出pUC18-PN/PDRN02重组克隆载体；
(4)以M13定序引物序列：5’-GTAAAACGACGGCCAG-3’定出重组PDRN02序列；
(5)设计并合成聚合酶链式反应所需引物(primers)，引物设计原则为，正向引物(forwardprimer)使用pUC18上含BamHI限制内切酶辨识部位的序列，反向引物(reverseprimer)则使用PDRN02上3’端序列10～12核苷酸并加上BamHI限制内切酶辨识部位5个序列，序列如下：
正向引物5’-CTAGAGGATCCCC-3’(下划线为BamHI限制内切酶辨识部位)
反向引物3’-PDRN02序列+CCTAG-5’(下划线为BamHI限制内切酶辨识部位5个序列)
(6)取适量pUC18-PN/PDRN02作为模板，加入正向和反向引物，利用聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)进行重组PN/PDRN02的扩增；
(7)将重组PN/PDRN02的PCR扩增产物以BamHI进行酶切；
(8)将重组PN/PDRN02的BamHI酶切产物以T4 DNA连接酶进行反应，可产生多拷贝重组PN/PDRN02，简称(PN/PDRN02)m；
(9)以T4 DNA聚合酶将(PN/PDRN02)m连接于pUC18载体的BamHI位点中，见附图4；
(10)将pUC18-(PN/PDRN02)m重组载体转化到大肠杆菌株DH10B，以蓝白筛选方式挑出具有(PN/PDRN02)m的转化子；
(11)挑选不同转化子进行小量培养，提取转化子中的重组载体，以限制内切酶XbaI和KpnI自重组载体中切下(PN/PDRN02)m，以琼脂糖凝胶电泳分离检视，挑选具有长度最长的(PN/PDRN02)m重组载体；
(12)以BamHI进行酶切即可将(PN/PDRN02)m切出固定长度的重组PN/PDRN02，见附图6(C)琼脂糖凝胶电泳图。
实施例3：
(1)自PN/PDRN DNA文库中挑选一个固定长度PN/PDRN的转化子，称为pUC18-PN/PDRN03，PN/PDRN03组成序列如下：
Figure BDA0003241086770000121
Figure BDA0003241086770000131
(2)PN/PDRN03长度不宜过长，以50～60碱基对为佳；
(2)将pUC18-PN/PDRN03转化子培养于含50μg/mL氨苄青霉素的Luria-Bertani培养基，置于35±2℃培养16小时；
(3)以碱裂解法搭配酒精沉淀法提取出pUC18-PN/PDRN03重组克隆载体；
(4)以M13定序引物序列：5’-GTAAAACGACGGCCAG-3’定出PDRN03序列；
(5)设计并合成KpnI-PN/PDRN03-BamHI连结物互补序列，序列如下：
正向序列5’-GPDRN03序列G-3’
反向序列3’-GTACCPDRN03序列CCTAG-5’(下划线分别为KpnI和BamHI限制内切酶辨识部位的5个序列)
(6)将KpnI-PN/PDRN03-BamHI连结物互补序列混合，加热变性(heat denature)、退火(annealing)可形成重组PN/PDRN03连结物；
(6)将重组PN/PDRN03和重组PN/PDRN03连结物混合，以T4 DNA连接酶进行反应，可产生多拷贝重组PN/PDRN03，简称(PN/PDRN03)m；
(7)以T4 DNA聚合酶将(PN/PDRN03)m连接于pUC18载体的BamHI+KpnI位点中，见附图5；
(8)将pUC18-(PN/PDRN03)m重组载体转化到大肠杆菌株DH10B；
(9)挑选不同转化子进行小量培养，提取转化子中的重组载体，以限制内切酶XbaI和EcoRI自重组载体中切下(PN/PDRN03)m，以琼脂糖凝胶电泳分离检视，挑选具有(PN/PDRN01)m的重组载体；
(10)以BamHI+KpnI进行酶切，即可将(PN/PDRN03)m切成固定长度的重组PN/PDRN03，
见附图6(D)琼脂糖凝胶电泳图。
在实施例1-3中，所述DNA文库、实施例所用克隆载体pUC18的重要组成序列及其说明如图1。
其中：
rep：载体复制所需序列，与克隆载体在宿主内拷贝数高低有关；
lacZ：可使细菌宿主表现β－半乳糖苷酶，一旦有外来DNA片段插入后，会破坏其表现，搭配5-Bromo-4-chloro-3-indolylβ-D-galactopyranoside试剂的使用，可以蓝白筛选(Blue-White Selection)加速挑选出具有外来DNA片段重组克隆载体的转化子；
AMPR：筛选标志(Selection marker)，可使细菌宿主对氨苄青霉素(Ampicillin)产生抗性；
MCS：多克隆位点(multiple cloning site)，内含多种鉴识内切酶的辨识酶切部位，有助于将外来DNA片段连接到克隆载体产生重组克隆载体或是自重组克隆载体上将外来DNA片段切下；M13定序引物及M13反向定序引物：有利于对克隆的外来DNA片段进行定序。
建立PN/PDRN DNA文库范例的方法如图2所示。
在图6中，可见采用本发明方法所制得的PN/PDRN01-PN/PDRN03与市售PN/PDRN产品的电泳
图对比结果。
MW代表DL1000 DNA分子量标记；带1：A公司PN/PDRN产品；带2～5：B公司四个不同批
次PN/PDRN产品，带6：C公司PN/PDRN产品。(注：带2～6上方均有长度更长的DNA讯号出现，显示PN/PDRN长度的控制并不理想；带2～4均为B公司PN/PDRN产品，四个不同批次PN/PDRN产品的DNA讯号范围不一致，显示批次间变异度大；带1DNA讯号范围较集中，但分子量范围偏小，不是理想的PN/PDRN产品。
(B)实施例1纯化后固定长度重组PN/PDRN01电泳图
带1：DL5000 DNA分子量标记；带2：DL2000Plus DNA分子量标记；带3：重组PN/PDRN01。
(C)实施例2纯化后固定长度重组PN/PDRN02电泳图
带1：DL5000 DNA分子量标记；带2：DL2000Plus DNA分子量标记；带3：重组PN/PDRN02。
(D)实施例3纯化后固定长度重组PN/PDRN03电泳图
带1：DL5000 DNA分子量标记；带2：DL2000Plus DNA分子量标记；带3：重组PN/PDRN03。
(注：图B、C、D电泳图中带3的DNA讯号集中在固定长度位置，上下均无额外DNA杂讯，显示重组PN/PDRN长度获得准确控制。)
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
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<110> 尚诚怡美(成都)生物科技有限公司
<120> 一种固定长度重组多核苷酸/多脱氧核糖核苷酸制备方法及其应用
<130> 2021.7.23
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 630
<212> DNA
<213> Oncorhynchus mykiss
<400> 1
gctagatcta ctgtctctat tatagtatga cagaccaggt agatctacta tctctagtat 60
attatgacag accttctaga tatactgtct ctattatatt ttgacagacc agctagatct 120
attgtctcta ttatatgaca gacgagatag atctactgtc tctattatat tatgacagac 180
cagctcgatc tgctgtctct attatattat gacagaccac ctagatcaac tgtttctatt 240
atattatgac agaccagcta gatctaccgt gtctattata atatgacaga ccagctagat 300
ctactgtgtc taatattttt ttacagacca gccagatcta ctgtgtctat tatattctga 360
cagaccagct agatctgctg tctctattaa attatgatag accagctaga tctactgtct 420
ctgtgtctct attatattat gacagaccac ctagatcgac tgtctctatt atattatgac 480
agaccagcta gatatactgt gtatattata ttatgacaga ccagctagat ctactatctc 540
tagtatatta tgacagacca tctagatata ctgtctctat tatattttga cagaccagct 600
Acatctattg tctcttttaa atgacagacg 630
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<130> 2021.7.23
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 2
<211> 1604
<212> DNA
<213> Oncorhynchus mykiss
<400> 1
ggctagtctg gtgttatata cctgtttata aatgctagct acatgtcagg ctagtctggt 60
gttatatacc tgtttataaa tgctagctac atgtcaggct agtctggtgt taaatgctta 120
atgacactag tttttagcca cagacgaaaa tgtctctttt tgaattgcaa gtgctagatt 180
ttgaacagca agaccttgat ctgatattac tacacaggag gggaaaaaaa gaaagagcga 240
aaacgtaaag gtcatccact gaacactaca aatagggatg atggagaata cactacatga 300
aaaaaagtat gtggacacct gctcgtccaa catctcattc caaaatcatg ggcattaata 360
tggagttggt cccccctttg ctgctataac agcctccact attctgggga ggctttccac 420
tagatgtagg aacattgctg ctgggacttg cttccattca gccacaagca cattagtgag 480
gctgggcact gatgttgggc gattaagcct gcctcgcagt cggcgagggc agacgatttt 540
tacgggctaa gcgtttcagc actctgcggt cccgttctgt gagcttgtgt ggcctaggtt 600
gttgctccta gacgtttcca cttcacaata acagcactta tagttgaccg gggcagctct 660
agcaagtgta acagggttat attggtgatt ccccttgcca ctttattgtt aagccaatgg 720
gtttttggtt tgagtttgtc ttgccttcac ctactcaaca tggcatctta ttggctggtt 780
tgcgtagctt gcttacgagg ggggatgttc cagttagaat cgtcccagtg aacaagcacc 840
aaaccagcgg taagttgttg gttgcaaagc actgtacatc aaaagtgatt tttatactct 900
caagtgatga tttaaatgta caatttatat caaattgttt gtaaatgtta ttcgaacatc 960
atacataaga tgcagcggtt tttggagaat atttgttgtg cattttgtta taaagaattc 1020
ccgccagtac tagctagcaa cttactgtgt ctggtggggg gggggggggt tcatatattt 1080
tgtacagtgt gtgagtgcag agttggatgg tgagacgtgc attgcatgac gtgtaatttt 1140
gtgccgttcc taacaggtac attgttaaat atattatatt gtatattgta attgtattat 1200
tttggtaact accccagtga acaagcacca aaccagcgtg cgtgagtgca gagttggatg 1260
gtgagacgtg cattgcatga cgtgcaattt tgtgccgttc ctaacagaat aaagctacat 1320
gattggtgct acatgttgga gttccgtgtc gatgactgat tgtacacaac gcaagacgag 1380
cactgttaca gtggtgccgt gaccgttctt ctggatcgga tcatccttcg ctggatttcc 1440
atctcagaac ttcgccgtgg ttgctggtgc agtttatggc gatatcgcat tttgccacaa 1500
gagggcgcca ctagaacgtt ttattatcga aattgatgat ttctctggct gaggctcttc 1560
aaagataaat gataactttt gtgttgcttg tttatttgca attc 1604
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<210> 3
<211> 637
<212> DNA
<213> Oncorhynchus mykiss
<400> 1
ggacttggtc ttttaccaaa tagggatatc ttctgtaaac catccctacc ttgtcacaac 60
acaacctatt ggctcaaaca ctttaagaag gaaagaaatt ccacaaatga acttttaaga 120
aggtacacct gttaattgaa aaacattcct ggtgactacc tcatgaaaag gtttgagaga 180
atgccaagag tgtgcaaagt ggtcaaggaa aaggatggct acttcaaaga ttctcaaatg 240
taaaatatat tttgatttgt ttaacagtta atgcttacta catgattcca attgtgctat 300
ttcatagttt tgatgtcttc actatttttc taaaatgtaa aaaattgtaa aataaagaaa 360
aacccttaaa tgagtaggtg tgtccagact tttgactggt actgtatata ttgtgatatt 420
gtaaatatgg tacaatccaa gggtgcaaag cttttggaga cttacccaga aagactcaca 480
gctttaatcg ctgccaaagg tgattctaac atgtattgtg aatatttctg tatttcattt 540
tcaatacatt tgaaaaaaaa attaaaacat gtttttactt tgtcattatg gggtgttgtc 600
tgtagctggg tgagatgata aaaaactata atttaat 637

Claims (10)

1.一种固定长度重组多核苷酸/多脱氧核糖核苷酸制备方法，其特征在于，制备步骤如下：
(1)建立PN/PDRN的DNA文库
(2)自步骤(1)DNA文库中选取固定长度重组PN/PDRN；
(3)将步骤(2)固定长度重组PN/PDRN作连结，得到多拷贝重组PN/PDRN；
(4)将步骤(3)多拷贝重组PN/PDRN连结到克隆载体，得到多拷贝重组PN/PDRN克隆载体；
(5)将步骤(4)多拷贝重组PN/PDRN克隆载体引入适合细菌宿主，得到转化子；
(6)将步骤(5)转化子进行培养，取得大量转化子；将转化子裂解并提取出多拷贝重组PN/PDRN克隆载体；
(7)将步骤(6)多拷贝重组PN/PDRN克隆载体进行酶切和分离，以提取出固定长度的重组PN/PDRN。
2.根据权利要求1所述的一种固定长度重组多核苷酸/多脱氧核糖核苷酸制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述PN/PDRN，可以提取自包括但不限于人类细胞/组织、大西洋鲑鱼精细胞/精囊组织、虹鳟鱼精细胞/精囊组织、太平洋鲑鱼精细胞/精囊组织、中华鲟精细胞/精囊组织，长度介于30～5000个碱基对，更优选为50～2000个碱基对；PN/PDRN的DNA文库建立方式，可以使用包括但不限于自行设计制备、赛默飞MuSeek文库制备套组、赛默飞ClaSeek文库制备套组、赛默飞Invitrogen Collibri PCR-Free PS文库制备套组或赛默飞Invitrogen Collibri PSDNA文库制备套组，更优选为自行设计制备。
3.根据权利要求1所述的一种固定长度重组多核苷酸/多脱氧核糖核苷酸制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述固定长度PN/PDRN，固定长度是指介于30～5000个碱基对，更优选为50～2000碱基对；固定长度重组PN/PDRN可自步骤(1)DNA文库进行选殖或聚合酶链式反应扩增、或人工合成取得；PN/PDRN的序列不定，更优选为非编码区域的序列。
4.根据权利要求1所述的一种固定长度重组多核苷酸/多脱氧核糖核苷酸制备方法，其特征在于，步骤(3)中将固定长度重组PN/PDRN连结，可以使用包括但不限于T4 DNA连接酶、T3 DNA连接酶、T7 DNA连接酶进行连结，优选为T4 DNA连接酶；步骤(3)中所述多拷贝重组PN/PDRN，包含2或多个拷贝固定长度的PN/PDRN片段。
5.根据权利要求1所述的一种固定长度重组多核苷酸/多脱氧核糖核苷酸制备方法，其特征在于，步骤(4)中将多拷贝PN/PDRN连结到克隆载体，可以选用包括但不限于T4 DNA连接酶、T3 DNA连接酶、T7 DNA连接酶进行连结，优选为T4 DNA连接酶；步骤(4)中所述克隆载体，包含但不限于pUC系列载体、pGEM系列载体、pBluescript系列载体、pTZ系列载体中的一种或多种，载体拷贝数>100，首选为拷贝数>300的载体。
6.根据权利要求1所述的一种固定长度重组多核苷酸/多脱氧核糖核苷酸制备方法，其特征在于，步骤(5)中所述适合细菌宿主，包含但不限于大肠杆菌株MC1061、DH5α、DH10B、BL21、Top10、DB3.1中的一种或多种，首选为DH10B、BL21。
7.根据权利要求1所述的一种固定长度重组多核苷酸/多脱氧核糖核苷酸制备方法，其特征在于，步骤(6)中所述培养，包含但不限于GYT培养基、Luria-Bertani培养基、M9培养基、NZCYM培养基、NZYM培养基、NZM培养基、SOB培养基、SOC培养基、Terrific肉汤培养基、2×YT培养基中的一种或多种，首选为Luria-Bertani培养基、Terrific肉汤培养基，培养温度35±2℃，培养时间12～30小时。依克隆载体上的筛选标签类型，培养基需外加适当抗生素进行筛选；步骤(6)中所述裂解并提取出重组PN/PDRN克隆载体，裂解方法包含但不限于碱溶解法、煮沸法、酵素法或机械破碎法，首选为碱溶解法或机械破碎法；提取方法包含但不限于沉淀法、超高速离心法、膜过滤法、层析法的一种或多种，首选为沉淀法。
8.根据权利要求1所述的一种固定长度重组多核苷酸/多脱氧核糖核苷酸制备方法，其特征在于，步骤(7)中所述提取出多拷贝重组PN/PDRN，以限制性内切酶酶切法自重组PN/PDRN克隆载体中切下重组PN/PDRN，搭配琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、淀粉凝胶电泳或层析法进行分离，可提取出固定长度重组PN/PDRN。
9.一种固定长度重组多核苷酸/多脱氧核糖核苷酸，其特征在于，根据权利要求1-8任一项所述方法制得。
10.根据权利要求9所述的一种固定长度重组多核苷酸/多脱氧核糖核苷酸的应用，包括但不限于功能性食品、化妆品、敷料类产品、微针注射用产品、骨关节注射用产品、美容注射用产品、细胞治疗载体和组织工程基质产品、3D打印用生物墨水、医药品；
或将多种固定长度的重组PN/PDRN混合制备出重组PN/PDRN复合物，包含二种及以上固定长度的重组PN/PDRN；
或透过改质方式制备出重组PN/PDRN衍生物进行应用，包含但不限于物理性交联、化学性交联、生物性交联或与其他非DNA物质交联形成PN/PDRN共聚物；
或将重组PN/PDRN或重组PN/PDRN衍生物再加工成不同形式产品进行应用，再加工方法包含但不限于干燥成粉、干燥造粒、干燥制锭、干燥成膜、冷冻干燥成海绵、纺制成丝线；
或混合其他物质制成复合产品应用，其他物质包含但不限于人类干细胞提取物、人类干细胞外泌体、透明质酸钠、交联透明质酸钠、交联明胶、交联动物胶原蛋白、交联重组人类胶原蛋白、交联重组人类弹性蛋白、交联重组人类纤维粘连蛋白、聚乙二醇-聚乳酸共聚物、聚乙二醇-聚乳酸共聚物微粒、羟基磷灰石微粒、聚左旋乳酸微粒、聚己内酯微粒、聚甲基丙烯酸甲酯微粒、富血小板血浆、同种异体细胞或组织移植物、自体细胞或组织移植物。
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