CN117986355A - 一种重组人源化iii型胶原蛋白及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种重组人源化III型胶原蛋白及其制备方法和用途，属于基因工程技术领域。本申请制备的重组人源化III型胶原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，优化后的密码子序列如SEQ ID NO:2所示，所述重组III型胶原蛋白100％严格遵守Gly‑X‑Y重复序列，不存在突变导致的疾病风险，生物安全性好；与动物来源的胶原蛋白相比，具有分子量均一、纯度高、无病毒传播隐患和排异反应低等优点，生物活性高，可促进人成纤维细胞的黏附和增殖，修复皮肤屏障，可广泛应用于食品、化妆品、保健品、药械等领域。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种重组人源III型胶原蛋白及其制备方法和用途。
背景技术
胶原蛋白是哺乳动物中最重要和最丰富的蛋白质之一，在人体的皮肤、结缔组织和骨骼以及其它组织中发现的结构蛋白。在人体内胶原蛋白的含量约为总蛋白质的30％。III型胶原蛋白由三条肽链向右卷曲扭成三股螺旋状，一级结构分析表明，其多肽链很长的区段序列是由Gly-X-Y氨基酸序列重复而成。III型胶原蛋白在细胞外基质的组织结构和功能调控中起着重要作用，参与许多生理和病理过程，包括结构支持、细胞黏附和分化、炎症相关病理过程以及与某些疾病的关联。
胶原蛋白具有生物可降解性、良好的生物相容性、低免疫原性；能够促进细胞的增殖、粘附等；此外，胶原蛋白能够形成胶原纤维，具有一定的机械性能，是一种很好的生物材料，可以被广泛使用。胶原蛋白具有促进组织修复、止血等功能，现已被广泛应用于食品、化妆品、生物医学材料、药品等领域。胶原蛋白在医学上主要作为胶原基生物材料的应用，如心脏瓣膜、血管修复、可溶性胶原牙周修复、烧伤修复、胶原止血剂、明胶、人工皮肤、固定化酶载体、胶囊、胶原膜等。现阶段，胶原蛋白主要从动物组织中提取得到，然而来源于动物组织的材料都存在病毒感染的风险，如疯牛病等；同时，III型胶原蛋白因为与其他类型胶原蛋白共生，含量较低，因此，从动物组织提取III胶原蛋白存在难度大、纯度低、成本高等严峻问题，且由于动物个体的差别导致胶原蛋白的批间稳定性很差。
重组表达制备的胶原蛋白具有分子量单一、纯度高、无病毒传播隐患等优点，因此开始被用来替代动物胶原蛋白用于食品、化妆品、保健品或药械产品等领域。重组胶原蛋白是利用基因工程技术构建含有胶原蛋白的全长基因或者部分片段基因的表达工程菌，再通过工程菌来合成胶原蛋白，最后采用特定的提纯工艺得到高纯度的重组胶原蛋白。通过基因工程手段生产的类人胶原蛋白性能与天然胶原蛋白相近，但与天然胶原蛋白相比，类人胶原蛋白无病毒隐患、免疫排斥反应低，不仅保留了胶原蛋白原有功效，更赋予了其新的功能，如：可加工性、水溶性、质量可控性等。因此，利用基因工程技术手段构建基因工程菌株对制备高质量的类人胶原蛋白具有重要意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是利用基因工程技术重组表达一种新的人源化III型胶原蛋白及该重组III型胶原蛋白的制备方法。
基于以上，本发明的技术方案是这样实现的：
本发明提供一种重组人源化III型胶原蛋白，所述重组人源化III型胶原蛋白氨基酸序列包括基本重复单元，基本重复单元为：GPRGAPGERGRPGLP GAAGARGNDGARGSD。
进一步地，所述基本重复单元的重复次数为18。
进一步地，所述重组人源化III型胶原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明还提供一种编码所述重组人源化III型胶原蛋白的核酸分子。
进一步地，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明还提供一种包含所述核酸分子的重组表达载体。
进一步地，所述的重组表达载体是以pET-28a为载体。
本发明还提供一种所述重组人源化III型胶原蛋白的重组菌。
进一步地，所述的重组菌是以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主。
需要说明的是，重组菌是指任何细胞类型，其易受包含本申请的多核苷酸的核酸构建体或表达载体的转化、转染、转导等。“重组菌”涵盖亲本细胞的任何后代，其由于复制过程发生突变与亲本细胞不完全相同。宿主细胞可以是在本申请的重组人源化胶原蛋白生产中有用的任何细胞。为了产生重组胶原蛋白，可以将编码重组胶原蛋白的核酸分离，并且将其插入一种或多种载体中，以在宿主细胞中进一步克隆/或表达。可以使用常规技术(例如，通过使用能够与编码重组胶原蛋白的基因特异性结合的寡核苷酸探针)容易地分离和测序这种核酸。所述宿主细胞是指已引入外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括转化体和转化细胞，其包括原代转化细胞和源自其的后代，不考虑传代次数。后代在核酸含量上可能与亲代细胞不完全相同，但可能含有突变。对于载体导入宿主细胞中的方法是公知的，例如使用电转化将载体导入宿主细胞中，所述方法还可以是转染、微注射技术、基因枪技术、脂质体介导法等。所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞。所述宿主细胞选自毕赤酵母、酿酒酵母、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌中的任意一种。优选地，所述原核细胞为大肠杆菌；优选地，所述真核细胞为巴氏毕赤酵母。
本发明还提供一种所述的重组人源化III型胶原蛋白的生产方法，包括如下步骤：将表达所述的重组人源化III型胶原蛋白的重组菌以8～12％接种量接种至发酵培养基中发酵培养30～40h，离心去除菌体，得到含有重组人源化III型胶原蛋白的上清液，纯化除盐得到所述的III型胶原蛋白。
进一步地，所述纯化方法选自盐析法、超滤法、亲和层析法和凝胶过滤层析法中的任意一种。
本发明还提供一种组合物，所述组合物包括所述的重组III型胶原蛋白，或根据所述的核酸分子编码的重组III型胶原蛋白，或由根据所述的重组表达载体表达的人源化III型胶原蛋白，或由根据所述的宿主细胞产生的人源化III型胶原蛋白，或由根据所述的生产方法制备的人源化III型胶原蛋白。
本发明还提供所述组合物在制备食品、化妆品、保健品或药械产品中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
（1）本发明提供一种新型的人源化III型胶原蛋白，以胶原蛋白特征序列Gly-X-Y为基础设计了一段人源化III型胶原蛋白基因，并将构建好的表达质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)，本发明的III型类人胶原蛋白亲水性好，可随意组装形成大分子量的人源化III型胶原蛋白。
（2）本发明所述重组人源化III型胶原蛋白100％严格遵守Gly-X-Y重复序列，不存在突变导致的疾病风险，生物安全性好；所述重组人源化III型胶原蛋白具有多个重要功能位点，生物活性高，可促进人成纤维细胞的黏附和增殖，修复皮肤屏障。
（3）本申请生产的重组III型胶原蛋白不含有内毒素，生产成本低，蛋白表达量较高，质量稳定，且应用于人体不会产生免疫排斥，可以广泛应用于食品、化妆品、保健品和药械产品领域。
附图说明
图1 本发明所述重组人源化III型胶原蛋白的细胞毒性；
图2 本发明所述重组人源化III型胶原蛋白的促细胞增殖活性；
图3 本发明所述重组人源化III型胶原蛋白的促细胞粘附活性。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行说明，以使本发明技术方案更易于理解、掌握，但本发明并不局限于此。下述实施例所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述药材和试剂，如无特殊说明，均可从商业途径获得；且不同来源产品性能不具有显著性影响。
对于本领域的技术人员来说，通过阅读本说明书公开的内容，本发明的特征、有益效果和优点将变得显而易见。
除非另外指明，所有百分比、分数和比率都是按本发明组合物的总质量计算的。本文术语“质量含量”可用符号“％”表示。
本文中“包括”、“包含”、“含”、“含有”、“具有”或其它变体意在涵盖非封闭式包括，这些术语之间不作区分。术语“包含”是指可加入不影响最终结果的其它步骤和成分。术语“包含”还包括术语“由...组成”和“基本上由...组成”。本发明的组合物和方法/工艺可包含、由其组成和基本上由本文描述的必要元素和限制项以及本文描述的任一的附加的或任选的成分、组分、步骤或限制项组成。
实施例1 基因设计及合成
基因设计：重组人源化III型胶原蛋白氨基酸序列，SEQ ID NO:1：
GPRGAPGERGRPGLPGAAGARGNDGARGSDGPRGAPGERGRPGLPGAAGARGNDGARGSDGPRGAPGERGRPGLPGAAGARGNDGARGSDGPRGAPGERGRPGLPGAAGARGNDGARGSDGPRGAPGERGRPGLPGAAGARGNDGARGSDGPRGAPGERGRPGLPGAAGARGNDGARGSDGPRGAPGERGRPGLPGAAGARGNDGARGSDGPRGAPGERGRPGLPGAAGARGNDGARGSDGPRGAPGERGRPGLPGAAGARGNDGARGSDGPRGAPGERGRPGLPGAAGARGNDGARGSDGPRGAPGERGRPGLPGAAGARGNDGARGSDGPRGAPGERGRPGLPGAAGARGNDGARGSDGPRGAPGERGRPGLPGAAGARGNDGARGSDGPRGAPGERGRPGLPGAAGARGNDGARGSDGPRGAPGERGRPGLPGAAGARGNDGARGSDGPRGAPGERGRPGLPGAAGARGNDGARGSDGPRGAPGERGRPGLPGAAGARGNDGARGSDGPRGAPGERGRPGLPGAAGARGNDGARGSD。
利用在线密码子优化工具（ExpOptimizer）（https://www.novopro.cn/tools/codon-optimization.html）反向设计基因序列，针对宿主大肠杆菌表达所需的优选密码子，在设计过程中去除NdeI和XhoI酶切位点，有利后期基因操作，优化后的基因序列为SEQID NO:2所示，该序列与原始基因序列相比：GC含量由88.89%下降到64.81%，有利于宿主菌大肠杆菌高效表达该基因。
优化后的基因序列为SEQ ID NO:2如下所示：
GGTCCGCGCGGTGCTCCAGGTGAACGTGGTCGTCCTGGTCTGCCAGGTGCTGCCGGTGCTCGTGGTAACGATGGTGCGCGTGGCTCCGATGGTCCACGTGGTGCTCCTGGTGAACGTGGTCGTCCTGGTCTGCCAGGTGCCGCAGGTGCTCGTGGTAACGATGGTGCACGTGGTTCTGATGGTCCTCGTGGTGCACCAGGTGAACGTGGTCGTCCAGGCCTGCCAGGTGCAGCTGGTGCTCGTGGTAACGATGGTGCCCGCGGTTCTGATGGTCCGCGTGGTGCTCCGGGTGAACGTGGTCGTCCTGGTCTGCCGGGTGCTGCTGGTGCTCGTGGTAATGATGGCGCTCGTGGTTCCGATGGTCCGCGTGGTGCACCAGGCGAACGTGGTCGTCCTGGTCTGCCAGGCGCTGCTGGTGCTCGTGGTAACGACGGTGCTCGTGGTTCCGATGGTCCTCGTGGTGCTCCTGGTGAACGTGGTCGCCCAGGTCTGCCAGGTGCTGCTGGTGCTCGTGGTAACGATGGTGCTCGTGGCTCTGACGGTCCGCGTGGTGCTCCTGGTGAACGTGGCCGTCCTGGTCTGCCAGGTGCTGCTGGTGCGCGTGGTAACGACGGTGCTCGTGGTTCTGATGGTCCTCGTGGTGCTCCTGGTGAACGTGGTCGTCCGGGTCTGCCAGGTGCTGCTGGTGCACGTGGTAATGACGGTGCTCGTGGTTCTGACGGTCCGCGTGGTGCTCCAGGTGAACGTGGTCGTCCAGGTCTGCCGGGTGCTGCTGGTGCACGTGGTAATGATGGTGCACGCGGTTCTGATGGTCCGCGTGGTGCGCCTGGTGAACGTGGTCGTCCTGGTCTGCCAGGTGCAGCAGGTGCTCGTGGTAACGATGGCGCTCGTGGTTCTGATGGTCCTCGTGGCGCACCGGGTGAACGTGGTCGTCCAGGTCTGCCAGGTGCAGCAGGTGCTCGTGGTAATGATGGTGCTCGTGGCTCTGATGGTCCTCGTGGTGCACCGGGTGAACGCGGTCGTCCTGGTCTGCCAGGTGCTGCAGGTGCTCGCGGTAACGATGGTGCACGCGGTTCTGATGGTCCGCGTGGTGCACCTGGTGAACGTGGTCGTCCTGGTCTGCCTGGCGCTGCTGGTGCACGTGGTAACGATGGCGCACGTGGCTCTGATGGTCCGCGTGGTGCTCCTGGTGAACGTGGTCGTCCAGGCCTGCCTGGTGCTGCTGGTGCACGTGGTAACGATGGTGCTCGTGGCTCCGATGGCCCTCGTGGTGCACCAGGTGAACGTGGTCGTCCAGGTCTGCCGGGTGCAGCAGGTGCACGTGGTAACGACGGTGCTCGTGGCTCTGATGGCCCTCGTGGTGCTCCGGGTGAACGTGGTCGTCCAGGTCTGCCTGGTGCTGCTGGTGCTCGTGGCAACGACGGTGCTCGTGGTTCTGATGGTCCACGTGGTGCACCAGGCGAACGTGGTCGTCCGGGTCTGCCTGGTGCAGCAGGTGCACGTGGTAACGATGGTGCACGTGGTTCTGATGGTCCACGTGGTGCACCAGGTGAACGTGGTCGTCCTGGTCTGCCTGGTGCGGCAGGTGCTCGTGGTAACGATGGTGCTCGTGGTAGCGAC。
根据SEQ ID NO:2所示基因序列，即1620个碱基的核苷酸片段交由上海生工进行全基因合成。
实施例2 表达载体的构建及表达、纯化
（1）利用 PCR 的方法克隆扩增上述SEQ ID NO:2的 DNA片段，琼脂糖凝胶电泳回收目的基因。利用引物上加入的NdeI和XhoI的酶切位点，加入相应的限制性内切酶将基因片段切成粘性末端，并与相应酶切处理过的pET-28a的表达载体共孵育，加入T4 DNA连接酶，4℃连接12小时，转化大肠杆菌DH5α；用氨苄青霉素钠-LB平板筛选挑出白斑克隆，利用分子克隆的碱裂解法或者煮沸法提取质粒，再用酶切和PCR的方法鉴定阳性克隆正确，最后测序确定重组质粒含有正确的基因序列阅读框架，构建成功 pET-28a-1620重组表达载体。
（2）将正确的pET-28a-1620质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，用氨苄青霉素钠-LB平板筛选出单斑克隆，在5ml LB培养基中培养过夜，按照1:100转接，在摇瓶中37℃培养至OD600为0.4-0.6，按照1:5000加入IPTG储液，20℃培养8-10小时，离心收集菌体，保存于-20℃或者立即进入下步纯化。
（3）用PBS缓冲液洗涤混合后的菌体沉淀，用20-40ml体积重悬约500ml 菌液沉淀，用溶菌酶配合Triton X-100帮助裂解细菌，在冰水混合物环境下超声破菌45min，12000rpm/min离心20min，收集上清液。此时溶液中即含有大量的 目的III型胶原蛋白。
（4）选用硫酸铵沉淀分级盐析初步纯化，经过对硫酸铵饱和度的摸索，硫酸铵盐析的最佳饱和度为0-20％。采用PBS缓冲液清洗镍离子亲和柱（Ni-NTA His-Bind Resin）柱材，然后将柱材和上述经脱盐纯化的溶液混合共育，室温或冰上轻摇 30min，然后上柱，用含有15mM咪唑的PBS溶液洗涤杂蛋白，柱上就剩下了纯的III型胶原蛋白，在柱上加入适量具有His标签的Prescission Protease蛋白酶，于室温或冰上轻摇2小时，即可将III型胶原蛋白蛋白从柱上释放出来，用PBS溶液洗脱，即可获得纯度为95％以上的SEQ ID NO:1的重组人源化III型胶原蛋白，冻干为干粉待用。
实施例3 重组人源化III型胶原蛋白细胞毒性评价
取生长至培养瓶底面积70％-80％的HeLa细胞，0.25％胰酶消化，用完全培养液制成细胞密度为1×105个/mL的细胞悬液。取100μL细胞悬液接种于96孔培养板中并置于37℃，5％CO2饱和湿度的培养箱中培养。细胞培养24h后，吸出完全培养液。在实验组中加入高糖DMEM培养基稀释的浓度为0.05mg/ml 和0.1mg/ml的重组人源化III型胶原蛋白溶液(每个浓度设置3个复孔)，对照组为DMEM培养基培养的细胞，空白组为不含细胞的DMEM培养基，继续于37℃、5％CO2饱和湿度的培养箱中培养24h。向各组加入CCK-8试剂10μL，细胞培养箱内孵育1-4h，使用酶联免疫检测仪在450nm波长下测各孔吸光度值(OD值)。根据各组的吸光度均值按照如下公式计算细胞存活率：
；
本实施例中，对照组为市售重组III型胶原蛋白样品溶液，按照0.10mg/ml加入到细胞培养液中，每组3个平行样。
实验结果如图1所示，各实验组的细胞活力都在100％以上，表明本发明制备的重组人源化III型胶原蛋白均无细胞毒性，安全性良好。
实施例4 重组人源化III型胶原蛋白促细胞增殖活性评价
选择对数生长期状态良好的BALB/c 3T3细胞(小鼠胚胎成纤维细胞)(购自中国科学院上海细胞库)，接种于96孔细胞培养板中，经0.25％胰蛋白酶消化，离心后重悬于含有10％胎牛血清的DMEM培养基中并计数；将BALB/c 3T3细胞接种于96孔培养板中，每孔细胞数约为5×103，并设置未加细胞的空白对照，37℃、5％CO2环境中培养过夜。分别按终浓度为0.05mg/ml和0.1mg/ml加入实施例2制备的重组人源化III型胶原蛋白，每组3个复孔，于37℃，5％CO2环境中培养48h。培养结束前4h，加入5g/L的MTT溶液，继续培养4h后终止培养；吸弃孔内液体，用PBS洗涤1次，加入DMSO溶解结晶，于570nm波长处测定各孔吸光度值。
促细胞增殖率＝(测定孔吸光度值-空白对照组吸光度值)/(细胞对照组吸光度值-空白对照组吸光度值)×100％。
本实施例中，对照组为市售重组III型胶原蛋白样品溶液，按照0.10mg/ml加入到细胞培养液中，每组3个平行样。
如图2所示，实验结果表明，在浓度为0.1mg/ml条件下，对照组的胶原蛋白和本申请重组人源化III型胶原蛋白对BALB/c 3T3细胞的促增值率分别为20.8%和32.4%，且二者都优于0.05mg/ml的本申请重组人源化III型胶原蛋白的15.8%，说明本发明所制备的重组人源化III型胶原蛋白能够显著促进成纤维细胞的增殖，效果优于市售重组III型胶原蛋白。
实施例5 重组人源化III型胶原蛋白促细胞粘附活性评价
实施例2制备的重组人源化III型胶原蛋白溶解在PBS中，分别按终浓度为0.05mg/ml和0.10mg/ml加入，96孔细胞培养板每孔加入50μL重组人源化III型胶原蛋白溶液，37℃放置2h，对照孔加PBS。BALB/3T3细胞用胰酶消化，计数，每孔加入5×104个细胞，37℃、5％CO2培养箱培养2h。PBS洗3遍，洗去未粘附的细胞，再加入200μLDMEM培养基；每孔加入10μLCCK-8试剂，37℃，5％CO2细胞培养箱孵育2h后取出。用酶标仪读取96孔板在450nm和630nm的吸光值，以630nm为参比波长，在450nm处测定吸光度，记录测定结果。
促细胞粘附率＝(实验组450nm吸光值-阴性对照组450nm吸光值)/阴性对照组450nm吸光值×100％。
本实施例中，对照组为市售重组III型胶原蛋白样品溶液，按照0.10mg/ml加入到细胞培养液中，每组3个平行样。
实验结果如图3所示，结果表明，在浓度为0.1mg/ml条件下，对照组的胶原蛋白和本申请重组人源化III型胶原蛋白对BALB/c 3T3细胞的促细胞粘附率分别为48.7%和30.6%，且二者都优于0.05mg/ml的本申请重组人源化III型胶原蛋白的21.4%，说明本发明制备的重组人源化III型胶原蛋白具有较好的促细胞粘附活性，效果优于市售重组III型胶原蛋白。
基于以上实施例，本发明表达的重组人源化III型胶原蛋白分子量均一，可溶性好，具有良好的细胞黏附和增殖性能，可以应用于多种领域，例如食品、化妆品、保健品或药械产品中等。
以上描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明的范围内。本发明要求的保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。
Claims (10)
1.一种重组人源化III型胶原蛋白，其特征在于，所述重组人源化III型胶原蛋白氨基酸序列包括基本重复单元，基本重复单元为：GPRGAPGERGRPGLP GAAGARGNDGARGSD；所述基本重复单元的重复次数为18，所述重组人源化III型胶原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一种编码权利要求1所述的重组人源化III型胶原蛋白的核酸分子。
3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示。
4.一种包含权利要求2-3任一项所述的核酸分子的重组表达载体。
5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述的重组表达载体是以pET-28a为载体。
6.一种表达权利要求1所述的重组人源化III型胶原蛋白的重组菌。
7.根据权利要求6所述的重组菌，其特征在于，所述的重组菌选自大肠杆菌BL21(DE3)。
8.权利要求1所述的重组人源化III型胶原蛋白的生产方法，其特征在于，包括如下步骤：将表达所述的重组人源化III型胶原蛋白的重组菌接种至发酵培养基中发酵培养，离心去除菌体，得到含有重组人源化III型胶原蛋白的上清液，纯化除盐得到权利要求1所述的重组人源化III型胶原蛋白。
9.一种组合物，其特征在于，所述组合物包括根据权利要求1所述的重组人源化III型胶原蛋白，或根据权利要求2-3中任一项所述的核酸分子编码的重组人源化III型胶原蛋白，或由根据权利要求4-5中任一项所述的重组表达载体表达的重组人源化III型胶原蛋白，或由根据权利要求6-7中任一项所述的重组菌产生的重组人源化III型胶原蛋白，或由根据权利要求8所述的生产方法制备的重组人源化III型胶原蛋白。
10.权利要求9所述的组合物在制备食品、化妆品、保健品或药械产品中的应用。
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