KR101395942B1 - 넙치 유래의 새로운 항미생물성 펩타이드 및 그의 용도 - Google Patents

넙치 유래의 새로운 항미생물성 펩타이드 및 그의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 항미생물성 펩타이드에 관한 것으로서, 서열번호 3의 아미노산 서열로부터 선택되고 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 12 아미노산 이상의 길이를 갖는 항균 펩타이드 및 그의 용도를 제공한다.

Description

넙치 유래의 새로운 항미생물성 펩타이드 및 그의 용도{Novel antimicrobial peptide from the olive flounder and uses there of}
본 발명은 항미생물성 펩타이드에 관한 것으로서, 더 상세하게는 넙치 유래의 새로운 항미생물성 펩타이드 및 그의 용도에 관한 것이다.
항미생물성 펩타이드는 생물체의 선천성 면역체계(innate immune system)의 최전방 생체 방어인자이다. 항미생물성 펩타이드는 특정 미생물이나 항원에 반응하는 후천면역과는 달리 미생물의 종류에 크게 상관없이 작용하며 반응시간도 바로 혹은 몇 시간 내로 매우 빠르다. 내성균의 문제를 항상 내포하고 있는 기존의 항생제와 구분되어 내성의 문제 또는 면역문제나 거부반응의 문제없이 광범위한 생물계에서 미생물로부터 숙주를 보호하기 위해 자연적으로 생성되었기에 이들 항미생물성 펩타이드들은 천연 항생제라고 불린다.
넙치 추출물로부터의 항미생물성 및 항바이러스 활성이 검출되었으나, 아직까지 항미생물 활성을 갖는 단일 성분에 대해서 보고된 바는 없는 실정이다. 또한 추출물로부터 단일 성분을 분리하는 과정은 분리시 소요되는 시간이 길며, 획득률이 낮으며, 천연물이 가지는 잠재적 독성 등의 요인들로 균일한 효과 및 규격화를 기대하기 어렵다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 넙치로부터 유래한 항미생물 활성을 갖는 신규 펩타이드를 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 서열번호 3의 아미노산 서열로부터 선택되고 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 12 아미노산 이상의 길이를 갖는 항균 펩타이드가 제공된다.
상기 항균 펩타이드는 서열번호 3 또는 21의 아미노산 서열을 갖는 항균 펩타이드일 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 본 발명의 일 실시예에 따른 항균 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다.
상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 핵산서열을 갖을 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 본 발명의 일 실시예에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 벡터로 형질전환된 형질전환체가 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항미생물 조성물이 제공된다.
상기 항미생물 조성물은 그람 음성균, 그람 음성균 및 효모에 대한 항균 활성을 나타낼 수 있다.
상기 그람 음성균은 하이드로필라(Aeromonas hydrophila), 대장균(E. coli) 또는 비브리오 파라헤모라이티쿠스(Vibrio parahaemolyticus) 일 수 있으며, 상기 그람 양성균은 바실러스 서브틸러스(Bacillus subtilis), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aures) 또는 스트렙토코커스 이니에(Streptococcus iniae) 일 수 있으며, 상기 효모는 칸디아 알비칸스(Candida albicans) 일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 관점에 따르면, 상기 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 사료첨가제가 제공된다.
상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 일 실시예에 따르면, 넙치 추출물로부터 정제된 펩타이드는 항미생물 효과를 나타낸다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
도 1는 넙치 정소 추출물의 역상 HPLC 컬럼을 이용하여 분리한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 넙치 정소 추출물의 이온교환 HPLC 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 상기 도 2에서 최대 활성 피크값을 나타낸 분획물을 역상 HPLC 컬럼을 이용하여 분리한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 상기 도1 도 2 및 3의 3단계 HPLC 방법을 통하여 정제된 아미노산의 분자량을 MALDI-TOF MS 스펙트로미터를 이용하여 분석한 그래프이다.
도 5는 넙치 정소 추출물에서 정제된 항미생물성 단백질의 N-말단 아미노산 서열 결과를 나타낸 그림이다.
도 6은 fH1LP cDNA와 예측된 아미노산 서열을 분석한 결과를 나타낸 그림이다.
도 7은 fH1LP와 그 외 알려진 H1 아미노산 서열을 다중 정렬한 결과를 나타낸 그림이다.
도 8은 넙치 성어의 각 조직에서 fH1LP mRNA 발현을 나타내는 그래프이다.
도 9는 부화 후 넙치의 초기 발달 단계에서 fH1LP mRNA 발현을 나타내는 그래프이다.
도 10은 LPS 자극 후 넙치의 신장과 비장에서 fH1LP mRNA 발현을 나타내는 그래프이다.
이하, 첨부된 도면들을 참조하여 본 발명의 실시예를 설명하면 다음과 같다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 도면에 도시된 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 도면에 도시된 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다. 또한 설명의 편의를 위하여 도면에서는 구성 요소들이 그 크기가 과장 또는 축소될 수 있다.
도 1은 넙치 정소 추출물의 역상 컬럼 HPLC 분석 결과를 나타낸 그래프이다. 본 발명의 일 실시예에 따른 정소 추출물을 역상 HPLC 컬럼인 CapCell-Pak C18(4.6 x 250 mm, Shiseido, 일본)을 이용하였다. 0.1 %의 TFA에 5-65%의 아세토니트릴의 농도 구배로 60분 동안 유속 1 ㎖/분 용출되었고, 파장 220 nm 흡광도를 측정하였다.
도 2는 넙치 정소 추출물의 이온교환 HPLC 분석 결과를 나타낸 그래프이다. 본 발명의 일 실시예에 따른 넙치 정소 추출물을 SP-5PW(7.5 x 75 mm, Tosho, 일본) 컬럼을 이용하여 분리한 후, 10 mM 인산완충액(pH 6.0)에 용해된 NaCl을 0~1.0 M 농도구배로 100분 동안 1 ㎖/분의 속도로 처리하여 용출시켰으며, 상기 용출물은 220 nm 파장에서 흡광도를 측정한 결과, 약 0.62 M의 NaCl 농도에서 용출된 분획물에서 최대 활성이 관찰되었다(화살표 표시).
도 3은 상기 도 2에서 최대 피크 값을 나타낸 분획물을 역상 HPLC 컬럼을 이용하여 분리한 결과를 나타낸 그래프이다. CapCell-Pak C18 column (4.6 x 250 mm, Shiseido, 일본)에 0.1% TFA를 포함하는 100% 아세토나이트릴(CH3CN)을 15~40% 농도구배로 50분 동안 1 ㎖/분의 속도로 처리하여 용출시켰으며, 상기 용출물은 220 nm 파장에서 흡광도를 측정한 결과, 약 36% CH3CN 농도에서 용출된 분획물에서 최대 피크값이 관찰되었다. 본 발명의 일 실시예에서는 3단계 HPLC 방법을 통하여 최대 활성을 나타내는 물질을 정제하였으며, 이렇게 정제된 펩타이드의 특성을 확인하였다.
도 4는 상기 도 1 내지 3의 3단계 HPLC 방법을 통하여 정제된 펩타이드의 분자량을 MALDI-TOF MS 스펙트로미터를 이용하여 분석한 그래프이다. HPLC 방법을 통하여 수득된 최대 활성을 갖는 펩타이드의 1차 구조를 확인하기 위하여, MALDI-TOF MS 스펙트로미터를 이용하여 분석한 결과 20968.37 Da의 분자량이 나타났다.
도 5는 넙치 정소 추출물에서 정제된 펩타이드의 아미노산 서열을 서열분석기를 통하여 분석한 결과와 BLASTP 2.2.10, 그리고 TBLASTN 2.2.10을 이용하여 잔기의 상동성(homology)을 비교한 결과이다. 정제된 항미생물 활성 단백질은 무지개송어(CAB37646), 대서양 연어(CAI46350), 금붕어(AAO72080) 및 제브라피쉬(NP_001017660)를 포함한 다른 종의 히스톤 H1의 N-말단과 높은 유사성을 나타냈다. 보존된 아미노산은 검정 사각둘레로 나타내었다.
도 6은 본 발명의 일 실시예를 통하여 fH1LP 전구체 cDNA의 염기 서열과 예측된 아미노산 서열이다. 염기 서열의 오른쪽에 있는 숫자는 각 행의 마지막 염기 및 아미노산의 위치를 제공한다. 프라이머에 대한 바인딩 사이트는 화살표(5'→3')로 표시하고 에드만 분해(Edman degeneration)에 의해 얻은 부분 N-터미널 아미노산 부분은 볼드체와 이탤릭체 문자로 표시하였다. 히스톤 1과 5의 도메인 영역은 음영 처리하였다.
도 7은 본 발명의 일 실시예를 통하여 fH1LP의 아마노산 정렬과 그 외 알려진 히스톤 H1의 염기서열이다. 동일한 아미노산의 경우 별(*)로 유사한 아미노산의 경우 점(·)으로 표시하였다. 하이픈(-)은 정렬을 극대화하기 위해 간격을 나타냈다. 예측된 DNA 결합 부위는 사각둘레로 표시 하였다. 정렬된 서열과 fH1LP의 아미노산 식별은 각 서열에 끝에서 보여주며 서열 등록번호는 다음과 같다: Danio rerio, NP_001017660; Carassius auratus, AAO72080; Oncorhynchus mykiss, P06350; Xenopus laevis, AAB29881; Gallus gallus, XP_425456; Mus musculus, NP_064418; Rattus norvegicus, NP_00102887.
도 8은 본 발명의 일 실시예를 통하여 성인 넙치의 각 조직에서 fH1LP mRNA의 발현을 나타낸 그래프이다. 18S rRNA로 상대 정량을 하였으며 각 시료를 3회 반복 시행하였으며 평균과 표준편차로 나타내었다. B, 뇌; G, 아가미; I, 장; K, 신장; L, 간; M, 근육; Sp,비장; P, 유문맹낭; Sk, 피부; St, 위; T, 정소; O, 난소를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예를 통하여 부화 후 초기 발달 단계에서 fH1LP mRNA의 발현을 나타낸 그래프이다. 18S rRNA로 상대 정량을 하였으며 각 시료를 3회 반복 시행하였으며 평균과 표준편차로 나타내었다.
도 10은 본 발명의 일 실시예를 통하여 LPS 자극의 유무를 비교하여 신장과 비장에서 fH1LP mRNA의 발현을 나타낸 그래프이다. 18S rRNA로 상대 정량을 하였으며 각 시료를 3회 반복 시행하였으며 평균과 표준편차로 나타내었다.
이하, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예 및 실험예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예 및 실험예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1: 넙치 정소 조직 추출물의 제조
길이 40-50 cm, 무게 1 kg 가량인 넙치(Olive flounder) 수컷 성어(부산 해변 시장, 한국)의 정소 조직을 적출한 후, 적출한 정소 조직과 1%의 초산(v/v)를 1:4(v/v)의 비율로 혼합하고 5분간 100℃에서 가열하였다. 가열된 조직은 얼음 속에서 냉각시킨 후, 균질기(Speed #3, Polytron PT1200 C homogenizer; Kinematica AG, Lucerne, 스위스)를 이용하여 완전히 조직을 파쇄한 후, 4℃, 15,000 Xg 조건에서 30분 동안 원심분리를 하여 상층액을 분리하였다.
실시예 2: 항미생물 활성 펩타이드의 정제
3단계 HPLC 방법을 사용하여 상기 실시예 1의 넙치 정소 추출물로부터 항미생물 활성 펩타이드를 분리하였다. 첫 번째 HPLC 단계에서는 HPLC 단계에서 역상 HPLC 컬럼인 CapCell-Pak C18 column(4.6 x 250 mm, Shiseido, 일본)에 적용시켜 분리하였으며, 두 번째 HPLC 단계에서는 이온 HPLC 컬럼인 TSK-Gel SP-5PW(7.5 x 75 mm, Tosho, 일본)를 이용하여 정제한 후, 가장 큰 활성을 나타내는 0.62 M NaCl 농도에서 용출된 활성분획을 세 번째 HPLC 단계에서 역상 HPLC 컬럼인 CapCell-Pak C18 column(4.6 x 250 mm, Shiseido, 일본)에 이용하여 분리하였다. 이때 각 단계의 조건은 하기 표 1과 같다.
그 결과, 1 단계 HPLC 분석시 활성 피크는 36% CH3CN로 용출되었고(도 1), 2 단계 HPLC 분석시 약 0.62 M NaCl 농도에서 용출된 분획에서 피크를 나타내며(도 2), 상기 분획물을 이용하여 세 번째 동일한 HPLC 역상 C18 컬럼(도 3)을 가지고 분석을 수행하여, 가장 큰 항미생물 활성을 나타내는 단일 물질이 정제되었다.
3단계 HPLC의 조건

1단계 HPLC
2단계 HPLC
3단계 HPLC

A용매:0.1% TFA (Trifluoroacetic acid) 수용액 (pH 2.2)

B용매: 0.1% TFA를 포함하는 100% CH3CN (pH2.2)
B용매의 농도구배: 5-65%(60분)


유속: 1.0 ㎖/분
파장: 220 nm
온도: 실온
A용매: 10 mM 인산완충액
(pH 6.0)


B용매: 10 mM 인산완충액
(pH 6.0)/1.0 M NaCl
B용매의 농도구배:0→1.0 M NaCl(100 분)

유속: 1.0 ㎖/분
파장: 220 nm
온도: 실온
A용매:0.1%TFA (Trifluoroacetic acid) 수용액 (pH 2.2)

B용매: 0.1% TFA를 포함하는 100% CH3CN (pH2.2)
B용매의 농도구배: 5-40%(50분)


유속: 1.0 ㎖/분
파장: 220 nm
온도: 실온
실시예3: 정제된 펩타이드의 분자량 측정
정제된 펩타이드의 분자량 측정은 선형 모드(Bruker Daltonics, USA)에 pulsed SMARTBEAM II(355 nm Nd:YAG 레이저; 반복 속도, 1 kHz)을 갖춘 UltrafleXtreme MALDI-TOF 질량분석기(Voyager-DETM PRO spectrometer, Perseptive Biosystems, USA)로 측정하였다. 정제된 단백질은 0.1% TFA/50% 아세토니트릴(1:1, V/V)에 용해시켰고, SA(sinapinic acid) 매트릭스 용액[0.1% TFA/50% CH3CN(1:1, v/v)에 10 mg/㎖ SA]과 혼합하고 직접 MALDI 플레이트에 충진 하였다. 스펙트럼은 Flex 분석 소프트웨어 v3.3(Bruker Daltonics)을 사용하여 분석하였다. 분자량 측정 결과 정제된 펩타이드의 분자량은 20968.37 Da 이었다(도 4).이는 알려진 히스톤 H1(~21 kDa)의 상대적 분자량과 유사하였다.
실시예 4: 정제된 펩타이드의 아미노산 서열 분석
정제된 단백질의 N-말단 아미노산 서열은 서열분석기(모델 473A; Applied Biosystems Inc., USA)를 이용하여 자동 에드만 절단방법에 의해 분석되었다. 이미 알려진 방법으로(Seo et al., Comp. Viochem. Physiol. B., 158: 223-229, 2005) 항균 시험에 대한 정제된 단백질의 양은 동일한 용출 조건 하에 3 ㎍ 인간 히스톤 H1 표준(M2501S, ~21 kDa, Abs220 nm = 0.05; New England BioLabs, USA)의 피크 흡광도와 비교하여 추정하였다. 정제된 단백질 N-말단의 1~40 번째 잔기의 서열분석을 수행한 결과는 다음과 같다:NH2-AEVPPAPAPAPAKAAKKKVVKPKKVGPSVREIIIEAVSAS-OH(서열번호 1). 확인된 서열은 풍부한 염기성 아미노산(7 Lys 과 1 Arg)과 다수의 Pro(7 잔기)과 Ala(9 잔기)으로 구성되어 있었다. 상기 조성은 히스톤 H1의 N-말단에서 발견되는 것과 유사하다.
이에 본 발명자들은 상기 서열이 공지된 단백질과 어느 정도 유사한지 여부를 Genome Net(http://www.ncbi.nlm.gov/BLAST)에서 BLASTP 2.2.10 와 TBLASTN 2.2.10을 이용하여 조사하였다. 이론적인 등전점과 질량 분석은 ExPASy(://www.expasy.ch/tools/peptide-mass.html)로 추정하였다. 서열 정렬은 ClustalX를 사용하여 수행하였고(Thomson et al., Nucl. Acids Res., 25: 4876-4882, 1997), 서열 상동성은 GENETYX version 8.0.으로 계산하였다. 구조적으로 중요한 도메인의 확인은 간단한 모듈형 아키텍쳐 연구 도구 프로그램(SMART version 4.0(://smart.embl-heidelberg.de)으로 예측하였다. 그 결과, 본 발명에서 분리한 펩타이드는 다른 종 유래의 히스톤 H1의 N-말단과 높은 상동성(60-73%)을 나타냈는데, 여기에는 대서양 연어(73%, CAI46350, 서열번호 4), 금붕어(68%, AAO72080, 서열번호 5), 무지개송어(73%, CAB37646, 서열번호 6)및 제브라피쉬(60%, NP_001017660, 서열번호 7)를 포함한다(도 5).
실시예 5: 정제된 단백질 전구체 cDNA의 클로닝
정제된 단백질의 전구체를 전체 길이 서열을 클로닝하기 위하여 제조업체 방법에 따라 트리졸(Invitrogen, USA)을 사용하여 수컷 성어 넙치의 정소로부터 전체RNA를 추출하였다. cDNA는 Advantage RT-for-PCR 키트(BD Biosciences, USA)를 사용하여 합성하였다. 정제된 단백질의 부분적 N-말단 아미노산 서열(서열번호 1)에 기초하여, 축퇴성 올리고뉴클레오티드(degenerate oligonucleotide) 프라이머를 말단에서 설계하였다(H1-deg-F and H1-deg-R; 표 1). PCR은 다음과 같이 94℃ 2분 동안 사전 가열단계를 거쳐, 94℃ 30초 45-55℃ 30초, 72℃ 1분을 30회전 반복한 후 최종적으로 확장단계를 72℃ 10분으로 하여 수행하였다. PCR 생성물은 pGEM-T Easy 벡터(Promega, USA)로 삽입하였고 ABI 3130 서열분석기(Applied Biosystems, USA)를 사용 하여, 핵산서열을 결정하였다. fH1LP의 5' 및 3' 말단을 증폭하기 위해, cDNA의 말단의 5' 및 3' RACE(rapid amplification of cDNA ends)를 위한 정소의 cDNA를 제조업체 지시에 따라 스마트 RACE cDNA 증폭 키트(BD Bioscience)를 사용하여 각각 합성하였다. 유전자-특이적 프라이머(표 2)는 정제된 단백질을 암호화하는 염기서열에 기초하여 설계되었다. 증폭된 단편은 pGEM-T easy 벡터(Promega)로 서브클로닝하였고 ABI 3130 서열분석기(Applied Biosystems, USA)를 사용하여, 핵산서열을 결정하였다. 정제된 단백질의 전체길이 서열분석를 완료하기 위해, 5'- 및 3'-말단 및 단백질의 N-말단의 부분적 서열을 병합하였고, GENETYX v. 8.0(SDC Software Development, 일본)을 사용하여 정렬하였다.
본 발명에 사용된 프라이머

프라이머
핵산서열(5'→3')
서열번호

H1-deg-F
GCIGARGTICCICCIGCICC
8

H1-deg-R

ACIGCYTCDATDATDATYTC
9

H1-5RACE-1

CACTTTGAGAGCAGCCGTCTTGACC
10

H1-5RACE-2

CCTTGGTCTGGACCAGGGTCCCCTTG
11

H1-3RACE-1

AAAGCGGCCAAGAAGAAGGTTGTG
12

H1-3RACE-2
GGAGGCTACGATGTGCAGAAGAACAA
13

H1-3RACE-3

ATCAAGGGCCTGGTGATCAA
14

H1-ORF-F
ATGGCAGAAGTCGCTCCAGCT
15

H1-ORF-R

CACAGTGAGGACAGCTCA
16
핵산서열 분석 결과, fH1LP cDNA의 전체길이는 229 bp의 5'-비번역부위(UTR)과 191 bp의 3'-UTR을 포함하여 1047 bp를 포함하며, 본 발명자들은 상기 핵산서열과 아미노산 서열을 2012년 6월 12일자로 GenBank에 등록하였다(GenBank accession nos. JN984910(서열번호 2)과 AFI80898(서열번호 3)). 전체 fH1LP cDNA는 208 아미노산으로 인코딩된 627 bp의 개방해독틀을 포함한다(도 6). Met를 포함한 fH1LP cDNA 예측된 분자량은 대략 21 kDa 이며, 이는 MALDI-TOF 결과와 일치한다(도 4). 다른 알려진 H1 아미노산 서열과 fH1LP과의 다중 정렬은 DNA 결합 부위에서 강한 아미노산 보존을 나타낸다. fH1LP은 붕어의 H1와 가장 높은 상동성을 나타냈으며 다른 알려진 H1에 대해 55-68% 정도의 상동성을 나타냈다(도 7).
실시예 6: 유도체의 설계 및 합성
넙치 유래 fH1LP cDNA가 암호화하는 아미노산 시퀀스(전체 208개 아미노산)를 바탕으로 선도 물질 개발을 위한 유도체의 설계와 선별 과정을 수행하였다. 유도체 설계는 Swissmodel 프로그램(http://swissmodel.expasy.org)을 이용하여 이차구조를 예측한 후 알파헬릭스(alpha-helix) 부분으로부터 5개의 후보 단편을 선별하였고, 고상합성법을 이용하여 선별된 5개의 후보 물질들을 확보하였다(표 3).
넙치 정소유래의 fH1LP 유도체들의 일차구조

Analog #
아미노산 서열
위치
길이
등전점
분자량
서열번호

1
AEVPPAPAPAPAKAAKK-NH2

2-18
17
9.7
1612. 9
17

2
EIIIEAVSASKE-NH2

32-43
12
4.25
1287.5
18

3
AKKAPAAKKAPAKKAAK-NH2

181-197
17
10.78
1677.1
19

4
KSPKKVAKSPKK-NH2

160-171
12
10.7
1324.7
20

5
GLVIKGTLVQTK-NH2

76-87
12
10.0
1255.6
21
실험예 1: 정제된 단백질의 항미생물 활성 측정
상기 정제된 단백질의 항균 활성은 종래에 보고된 바에 따라 측정하였다(Seo et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 338:1998-2004, 2005). 항미생물 활성 측정 대상 미생물로는 그람 양성균으로 Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, 및 Streptococcus iniae, 그람 음성균으로 Aeromonas hydrophila, Escherichia coli, 및 Vibrio parahaemolyticus 그리고 진균으로 효모(Candida albicans)를 사용하였다. A. hydrophila, S. iniae 그리고 V. parahemolyticus는 25℃, 그 외 균주는 37℃에서 18시간 동안 TSB(Trypticase soy broth) 또는 SDB(Sabouraud's dextrose broth)에서 배양하였다. 그 후, 상기 세균과 C. albicans 현탁액은 세균의 경우 약 ~108 CFU/㎖, C. albicans의 경우 약 106 CFU/㎖에 상응하도록 McFarland 표준탁도 0.5(Vitek Colorimeter #52-1210; Hach, Loveland, CO, 미국)로 희석하였다. 상기 희석된 세균 현탁액 0.5 ㎖을 9.5 ㎖의 깔개 겔(underlay gel)[10 mM 인산 완충액(pH 6.57), 0.03% TSB(tryptic soy broth) 또는 0.03% SDB(Sabouraud's dextrose broth), 및 1% I형 한천(low EEO)]에 혼합하여 5 X 106 CFU/㎖로 조정한 후 직경 10 cm 높이 1.5 cm 평판 접시에 도포하였으며 그 결과 1 mm 높이의 겔이 형성되었다 그 후 상기 평판 접시 내에 형성된 겔에 직경 2.5 mm 크기로 구멍을 뚫어 웰(well)을 만들었다. 실시예 2에서 정제된 단백질을 0.01%(v/v) 초산용액 5 ㎕에 2배씩 순차적으로 희석한 후, 1 mm 두께의 깔개 겔 내에 형성된 직경 2.5 mm의 웰에 각 희석액을 첨가한 후, A. hydrophila, S. iniae 및 V. parahaemolyticus의 경우 25℃에서, 그 외의 균은 37℃에서 3시간 동안 배양하였다. 배양 후 세균 또는 C. albicans 현탁액 위에 10 mM 인산완충용액(pH 6.57)에 6% TSB 또는 6% SDB, 및 1% 한천을 포함하는 강도 두 배의 덮개 젤 10 ㎖을 덮었다. 평판 접시를 추가적으로 18~24시간 동안 배양한 후 투명지역의 직경을 측정하였다. 웰의 직경을 제한 후 투명지역(clear zone)의 직경을 유니트(U)로 표현하였는데, 0.1 mm을 1 U로 환산하였고 정제된 펩타이드의 최소 효과 농도(minimal effective concentration, MEC, ㎍/㎖)는 펩타이드 농도의 로그값에 대한 유니트의 곡선의 X-intercept로 계산하였다(Seo et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 338, 1998~2004, 2005). 양성 대조군으로는 교잡종 줄무늬 베스(hybrid striped bass, Morone saxatilis x M. chrysops)로부터 분리된 α-나선형의 항미생물성 펩타이드인 피시딘 1(Piscidin 1)을 사용하였다(Silphaduang et al, Nature, 414(6861): 268-269, 2001).
그 결과 본 발명의 일실시예에 따른 정제된 단백질은 그람 음성균(Bacillus subtilis KCTC1021와 Streptococcus iniae FP5229)과 그람 양성균(Escherichia. coli D31, Aeromonas hydrophila KCTC2358)에 대해서 강한 항미생물 활성을 나타내었다(표 3). 이러한 결과는 넙치 정소 조직이 선천적 면역에 주요한 항미생물 활성을 나타내는 물질이 함유되어 있음을 입증하는 것이다. 또한 정제된 단백질의 항미생물 활성은 피시딘 1(piscidin 1)의 항미생물 활성과 유사하였다(표 3). fH1LP는 Aeromonas hydrophila와 Escherichia coli 그리고 Vibrio parahaemolyticus을 포함한 그람 음성균(MECs, 1.4-12.0 ㎍/㎖)과 Bacillus subtilis과 Staphylococcus aureus을 포함한 그람 양성균(MECs, 10-30 ㎍/㎖)에 대하여 강한 항미생물 활성을 나타냈다. 넙치에서 중요한 세균병원체인 Streptococcus iniae에 대한 상당한 활성이 관찰되었다(MEC, 2.8 ㎍/㎖). 또한 효모인 Candida albicans에 대한 잠재적 항미생물 활성을 보여준다(MEC, 2.0 ㎍/㎖).
fH1LP과 피시딘의 항미생물 활성


세균



그람

MEC (㎍/㎖)[M]

fH1LP

피시딘

박테리아

Bacillus subtilis KCTC1021
+
8.0 [0.4]
7.5 [2.9]

Staphylococcus aureus RM4220
+
30.0 [1.4]

4.4 [1.7]

Streptococcus iniae FP5229
+
2.8 [0.1]

6.5 [2.5]

Aeromonas hydrophila KCTC2358
-
12.0 [0.6]

10.0 [3.9]

Escherichia. coli D31
-
1.6 [0.1]

3.8 [1.5]

Vibrio parahaemolyticus KCCM41664
-
1.4 [0.1]

3.0 [1.2]

효모

Candida albicans KCTC7965
2.0 [0.1]

>62.5 [24.3]
실험예 2: 유도체의 항미생물 활성 측정
본 발명의 상기 실시예 6에 따라 설계 및 합성된 유도체들의 항미생물 활성은 Ultrasensitive Radial Diffusion Assay (URDA)법을 사용하여 수행하였다 (표 5). 그 결과, 유도체 5는 측정에 사용된 거의 모든 균주에 대해서 강한 항미생물 활성을 나타내었다. 특히, A. hydrophila, S. iniae 및 V. parahemolyticus등을 포함하는 어병세균에 강한 항균활성을 나타내었다.
넙치 정소 유래의 fH1LP 유도체들의 항미생물 활성



미생물
최소 유효 농도 (ug/ml)

analog 1
analog 2
analog 3
analog 4
analog 5

B. subtilis KCTC1021
>250
>250
>250
>250
14

S. iniae FP5229
>250
>250
>250
>250
9

A. hydrophila KCTC2358
>250
>250
>250
>250
250

E. coli D31
>250
>250
>250
>250
14

E. coli KCTC1116
>250
>250
>250
>250
14

E. cloacae KCTC1685
>250
>250
>250
>250
125

E. tarda RE1
>250
>250
>250
>250
>250

P. aeroginosa KCTC2004
>250
>250
>250
>250
125

S. enterica KCTC2514
>250
>250
>250
>250
14

S. flexneri KCTC2517
>250
>250
>250
>250
12

C. albicans KCTC7965
>250
>250
>250
>250
125
실험예 3: fH1LP mRNA발현
본 발명자들은 초기 발달 단계 동안에 fH1LP의 fH1LP mRNA 발현을 조사하기 위해(부화 후 1, 3, 7, 14, 27, 34일째), 건강한 암컷 및 수컷 넙치 성체를 해부하여, 뇌, 아가미, 소장, 신장, 간, 근육, 비장, 유문맹낭, 피부, 위, 정소 및 난소의 12군데 다른 조직으로부터 RNA를 추출하기 위해 적출하였다. 실험에 사용한 넙치와 수정된 알은 국립수산과학원 전략양식연구소 육종연구센터(거제, 한국)에서 분양받았다. 실시간 정량적 PCR은 LightCycler 시스템(Roche, 미국)과 FastStart DNA 마스터 SYBR 그린 I(Roche, 미국)을 사용하여 수행하였다. 구체적으로, 95℃에서 초기 10분 동안 Taq 활성화 단계를 거쳐 PCR는 95℃에서 10초, 57℃에서 5초, 72℃에서 20초 조건으로 40 사이클을 반복 수행 하였다. 증폭 후 즉시, 형광 방출 강도의 온도를 점진적으로(0.1℃/s) 증가시킴으로써 녹는점 곡선 분석을 수행하였다. 전사체의 수준은 18S rRNA 전사체 수준에 대한 상대값으로 정량하였다. 모든 분석은 세 cDNA 시료를 이용한 독립실험을 통해 수행하였다. 그 결과, fH1LP mRNA는 정소(178 배), 난소(270 배)과 같은 생식조직에서 대부분 발현하였고, 아가미(10 배), 신장(21 배), 비장(9.8 배)와 같은 일차 면역 조직에서 중간 정도로 발현하였으며, 다른 조직에서는 약하게 발현하였다(도 8). fH1LP mRNA 수준은 부화 후 1일에 가장 높았으며, 그 후 시간이 지남에 따라 크게 감소하였다(도 9). fH1LP 유전자가 미생물 감염에 의해 발현이 다시 유도되는지 여부를 확인하기 위해, 본 발명자들은 LPS를 넙치에 주입한 후, 넙치의 신장과 비장의 fH1LP의 mRNA 발현을 정량적 PCR에 의해 확인하였다. 구체적으로 넙치를 MS-222로 마취한 후, 100 ㎍(100 ㎕) LPS를 복강 내 주입하였다. 마취에서 깨어난 넙치를 20℃ 해수에 보관하다가, 12 및 24시간 후에 세 마리의 건강어류군(비자극 어류군)과 세 마리 자극 어류군에서 RNA 추출을 위하여 신장과 비장 조직을 적출하였다. 0, 12, 24시간에 채취한 시료를 측청 하였으나 fH1LP의 mRNA 발현에 눈에 띄는 차이는 발견할 수 없었다(도 10).
본 발명은 상술한 실시예 및 실험예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예 및 실험예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (12)

  1. 서열번호 3의 아미노산 서열로부터 선택되고 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 12 이상의 아미노산으로 구성되는 항균 펩타이드.
  2. 제1항에 있어서, 서열번호 3 또는 21의 아미노산 서열로 구성되는 항균 펩타이드.
  3. 제1항 또는 제2항의 항균 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
  4. 제3항에 있어서,
    서열번호 2의 핵산서열로 구성되는, 폴리뉴클레오티드.
  5. 제3항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  6. 제5항의 벡터로 형질전환된 비인간 형질전환체.
  7. 제1항 또는 제2항의 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항미생물 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    그람 음성균, 그람 양성균 및 효모에 대한 항균 활성을 나타내는, 항미생물 조성물.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 그람 음성균은 Aeromonas hydrophila, E. coli 또는 Vibrio parahaemolyticus인, 항미생물 조성물.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 그람 양성균은 Bacillus subtilis, Staphylococcus aures 또는 Streptococcus iniae인, 항미생물 조성물.
  11. 제8항에 있어서,
    상기 효모는 Candida albicans인, 항미생물 조성물.
  12. 제1항 또는 제2항의 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 사료 첨가제.
















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