JP7291427B2 - hPL含有培地で培養された中間葉幹細胞の培養液を含む化粧料組成物 - Google Patents
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Description
本発明における「ヒト血小板溶解物(human platelet lysate、hPL)」は、ヒトの血小板凍結(freeze)/解凍(thaw)後に得られる濁った淡黄色の液体である。血小板凍結/解凍は、血小板を溶解して細胞拡張に必要な多くの量の成長因子を放出する。
本発明において、幹細胞培養のための培地は、当業界に知られた基本培地を制限なく使用することができる。基本培地は、人為的に合成して製造でき、商業的に製造された培地を使用することもできる。商業的に製造される培地の例を挙げると、DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)、MEM(Minimal Essential Medium)、BME(Basal Medium Eagle)、RPMI 1640、F-10、F-12、α-MEM(α-Minimal essential Medium)、G-MEM(Glasgow’s Minimal Essential Medium)及びIsocove’s Modified Dulbecco’s Medium等があり、これに限定されるものではない。
抗酸化剤を含まない培地としては、これに制限されるものではないが、DMEM培地を使用することができ、必要に応じて前記培地に抗酸化剤をさらに加えて培養を遂行することができる。また、必要に応じて抗酸化剤が含まれたα-MEM培地を利用して培養を遂行することができる。
1.1 層分離培養方法(subfractionation culturing method、SCM)により分離された骨髄由来単一クローナル中間葉幹細胞の収得
35歳の男性骨髄提供者の臀部を局所麻酔剤で麻酔させた後、骨盤に注射針を刺して骨髄を採取した。100mm培養容器に20%FBS、1%ペニシリン/ストレプトマイシンを含む10ml DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s Medium,GIBCO-BRL,Life-technologies,MD,USA)、ヒト骨髄3mlを入れて37℃、5%CO2細胞培養器で2時間培養した。培養後、培養容器を一方に軽く傾けて底面に付いた細胞ができるだけ取れないように最大限に培養容器の上層培養液だけを新たな容器に移した。同一の過程をもう一度繰り返した後、収得した培養液を底面に膠原質(collagen)がコーティングされた培養容器(Becton Dickinson)に移した後、37℃で2時間培養した。培養液をまた新たな膠原質がコーティングされた容器に移し、24時間後、また新たな容器に移し、24時間後、また新たな容器に移した。最後に、48時間後、新たな容器に移した後、残っている細胞が培養容器底面に付いて育つことを目視で確認した。約3~5日の時間が過ぎると細胞が単一性細胞群(single clone)を形成するが、この単一性細胞群にトリプシンを処理して分離し、層分離培養方法(大韓民国出願番号10-2006-0075676、subfractionation culturing method、SCM)により分離された骨髄由来単一クローナル中間葉幹細胞を収得した。
実施例1.1のように層分離培養方法により分離された骨髄由来単一クローナル中間葉幹細胞を1000cells/cm2の細胞密度でLow glucose DMEM培地に接種して37℃及び5%CO2培養器で培養した。このとき、10%(w/w)ウシ胎児血清(Fetal Bovine Serum;FBS)または4%(w/w)ヒト血小板溶解物(human platelet lysate;hPL)を含有する培地で細胞の増殖程度(confluency)が80%になるまで37℃及び5%CO2細胞培養器でそれぞれ培養した。ヒト血小板溶解物(hPL)は、Mill Creek Life Sciences,LLCから購入した。
その後、PBS(phosphate buffered saline)で3回洗浄し、抗生剤(ゲンタマイシンまたはペニシリン)、フェノールレッド(phenol red)が添加されていない無血清培地(serum free media)に培養された幹細胞を移して72時間培養した後、幹細胞由来培養液を収去し、収去した培養液は、3000rpmで遠心分離後、フィルタリング(Top filter system,Nunc)して、FBS-CM(FBS-conditioned medium)及びhPL-CM(hPL-conditioned medium)を完成し、冷蔵及び冷凍保管して使用した。対照群としては、細胞なしに同じ条件で培養された無血清培地を使用した。
実施例1のように製造したFBS-CM及びhPL-CM内に存在するサイトカインを分析した。分析方法は、商業的に入手可能な分析キット(proteome profiler human XL cytokine array kit,R&D)を利用してキットと共に提供されるマニュアルに従い、発色後の観察は、LAS4000(富士、日本)を利用した。
前記実施例2を通して、本発明のhPL-CMでさらに多くの種類の成長因子及びタンパク質を含むことを確認したので、もう少し正確な比較のために前記実施例1のような方法で製造したFBS-CMまたはhPL-CM内に存在する代表的な成長因子の含量を比較し、その結果を図3に示した。
前記実施例2、3を通して、本発明のhPL-CMがさらに多くの種類と高濃度の成長因子及びタンパク質を含むことを確認し、これによって皮膚改善効能にも差があるかを確認しようとした。具体的に、ヒト真皮線維芽細胞(human dermal fibroblast、HDF、Lonza社購入)に無血清培地を24時間の間処理した群を対照群とした。実施例1のような方法で製造した100%FBS-CM原液、前記FBS-CM原液を無血清培地で50%希釈した50%FBS-CM希釈液、実施例1のような方法で製造した100%hPL-CM原液、及び前記hPL-CM原液を無血清培地で50%希釈した50%hPL-CM希釈液をヒト真皮線維芽細胞に24時間の間処理した群をそれぞれ実験群とし、各対照群と実験群のヒト真皮芽細胞の増殖促進効果をCCK-8を通して確認し、その結果を図4に示した。
本実施例においては、幹細胞培養液の皮膚老化抑制剤としての有効性を確認するために、コラーゲン合成率をヒト由来の皮膚線維芽細胞を利用して確認した。具体的に、ヒト真皮線維芽細胞を6-ウェルプレートに24時間培養した後、前記実施例1のような方法で製造したFBS-CM、hPL-CMまたは対照群培養液(細胞なしに同じ条件で培養されたserum-free DMEM media)を1000μl処理した後、72時間の間培養した。ヒト真皮線維芽細胞が新たに合成分泌したコラーゲンの量をコラーゲンキット(Sircol TM collagen assay kit)を利用して測定し、結果を図5に示した。
皮膚弾力は、真皮層に存在するエラスチンで構成された弾力繊維により現れるが、このような弾力繊維は、コラーゲンと共に存在し、エラスチンとコラーゲンが十分に存在する状態で皮膚の弾力維持が可能である。FBS-CMまたはhPL-CMのエラスチン合成促進効果を確認するための実験を実施した。具体的に、24ウェルプレートにヒト真皮線維芽細胞を播種(seeding)した後、24時間後、細胞が全て付くと、全ての培養培地を除去した後、前記実施例1のような方法で製造したFBS-CM、hPL-CMまたは無血清培地(対照群)を500μlずつ各ウェルに入れた後、72時間の間培養し、エラスチンの量を測定し、結果を図6に示した。
幹細胞培養液の皮膚美白効果を確認するために、人工皮膚を利用してメラニン量の減少を確認した。3D人工皮膚は、MEL-300-Melanoderm tissues(MarTek Co.Kr)を使用し、37℃及び5%CO2インキュベーターの条件で培養してその結果を観察した。具体的に、対照群として無血清培養液処理群、実験群として1000μg/ml濃度のアルブチン200μl処理群、実施例1で製造したFBS-CM 200μl処理群、1000μg/ml濃度のアルブチン100μl及び実施例1で製造したFBS-CM 100μl混合処理群、実施例1で製造したhPL-CM 200μl処理群、1000μg/ml濃度のアルブチン100μl及び実施例1で製造したhPL-CM 100μl混合処理群を設定した。トランスウェル上に載せられた人工皮膚に2日に1回ずつ前記設定したように、FBS-CM、hPL-CMまたはアルブチンを繰り返し処理して21日間培養した後、メラニン合成量を測定し、測定結果を図7に示した。
発毛は、真皮毛乳頭細胞(dermal papilla)の生成及び増殖を通して可能である。従って、培養条件による幹細胞培養液の発毛効能を確認するために、ヒト毛乳頭細胞(primary human dermal papilla cell)を利用して、成長、即ち、増殖に影響を与えるかを確認した。具体的に、実施例1のような方法で製造したFBS-CM処理群または実施例1のような方法で製造したhPL-CM処理群を実験群とし、無血清培地処理群を対照群に設定した。96ウェルプレートにヒト毛乳頭細胞(PromoCell社購入)を播種(seeding)し、24時間後、細胞が全て付くと、各ウェルにFBS-CM、hPL-CMまたは無血清培地を200μlずつ入れた後、48時間の間培養し、ヒト毛乳頭細胞に対する増殖促進効果をCCK-8を通して確認し、その結果を図8に示した。
濃度勾配遠心分離法(Gradient centrifugation method、GCM)の分離方法で分離された骨髄由来単一クローナル中間葉幹細胞を実施例1.2で実施した方法と同じ方法で作製した中間葉幹細胞培養液(以下、GCM conditioned medium、GCM-CM)と実施例1の層分離培養方法で分離された幹細胞培養液(以下、SCM-CM)の効能比較を実施した。
実験群としてGCM分離方法で分離された中間葉幹細胞を実施例1.2のような方法でFBSまたはhPL包含培地で培養後、無血清培地に移して培養して収得した中間葉幹細胞培養液(以下、GCM-FBS-CMまたはGCM-hPL-CMと命名)を処理した、GCM-FBS-CM処理群及びGCM-hPL-CM処理群を設定し、実施例1のように層分離培養方法で分離した骨髄由来単一クローナル中間葉幹細胞をFBSまたはhPL包含培地で培養後、無血清培地に移して培養して収得した中間葉幹細胞培養液(以下、SCM-FBS-CMまたはSCM-hPL-CMと命名)を処理したSCM-FBS-CM処理群及びSCM-hPL-CM処理群を設定した。対照群として無血清培地処理群を設定した。
96ウェルプレートにヒト真皮線維芽細胞を播種(seeding)した後、24時間後、細胞が全て付くと、全ての培養培地を除去した後、前記実施例9.1で設定したように幹細胞培養液または無血清培地を200μlずつ各ウェルに入れた後、48時間の間培養し、ヒト真皮線維芽細胞の増殖促進効果をCCK-8を通して確認し、その結果を図9に示した。
GCM分離方法で分離された中間葉幹細胞の培養液と実施例1の層分離培養方法で分離された幹細胞培養液の効能比較をさらに実施した。具体的に、実施例9.1で作製した対照群と実験群であるGCM-FBS-CM群、GCM-hPL-CM群、SCM-FBS-CM群及びSCM-hPL-CM群を対象に実施例2と同じ方法で代表的な成長因子であるVEGFの含量を比較し、その結果を図10に示した。
本発明の中間葉幹細胞培養液を含有した化粧料のうち化粧水の剤形例は、下記のとおりである。
成分(含量、単位:重量%)
本発明の中間葉幹細胞培養液 2.0
グリセリン 5.0
1,3-ブチレングリコール 3.0
PEG1500 1.0
アラントイン 0.1
DL-パンテノール 0.3
EDTA-2Na 0.02
ベンゾフェノン-9 0.04
ヒアルロン酸ナトリウム 5.0
エタノール 10.0
オクチルドデセス-16 0.2
ポリソルベート20 0.2
防腐剤、香り、色素 微量
蒸留水 残量
合計 100
本発明の中間葉幹細胞培養液を含有した化粧料のうちクリームの処方例は、下記のとおりである。
成分(含量、単位:重量%)
本発明の中間葉幹細胞培養液 2.0
親油型モノステアリン酸グリセリン 2.0
セテアリルアルコール 2.2
ステアリン酸 1.5
蜜蝋 1.0
ポリソルベート60 1.6
ソルビタンステアレート 0.6
硬化植物油 1.0
スクアラン 3.0
鉱物油 5.0
トリオクタノイン 5.0
ジメチコン 1.0
ナトリウムマグネシウムシリケート 0.1
グリセリン 5.0
ベタイン 3.0
トリエタノールアミン 1.0
ヒアルロン酸ナトリウム 4.0
防腐剤、香り、色素 微量
蒸留水 残量
合計 100
本発明の中間葉幹細胞培養液を含有した化粧料のうちエッセンスの処方例は、下記のとおりである。
成分(含量、単位:重量%)
本発明の中間葉幹細胞培養液 2.0
グリセリン 10.0
ベタイン 5.0
PEG1500 2.0
アラントイン 0.1
DL-パンテノール 0.3
EDTA-2Na 0.02
ベンゾフェノン-9 0.04
ヒドロキシエチルセルロース 0.1
ヒアルロン酸ナトリウム 8.0
カルボキシビニルポリマー 0.2
トリエタノールアミン 0.18
オクチルドデカノール 0.3
オクチルドデセス-16 0.4
エタノール 6.0
防腐剤、香り、色素 微量
蒸留水 残量
合計 100
Claims (11)
- 1)中間葉幹細胞をヒト血小板溶解物(human platelet lysate、hPL)が含まれた培地で培養するステップ;
2)培養された幹細胞を収得して無血清培地で培養するステップ;及び
3)中間葉幹細胞由来培養液を収去し、ろ過して幹細胞培養液を収得するステップ;を含む
成長因子及びサイトカインを含む中間葉幹細胞培養液の製造方法であって、
前記中間葉幹細胞は、幹細胞の層分離培養方法(subfractionation culturing method、SCM)により分離された骨髄由来単一クローナル中間葉幹細胞であり、
a)軟骨、骨組織、脂肪組織及び骨髄からなる群から選択されるいずれか一つの組織を培養するステップ;
b)前記a)ステップの上層液だけを新たな容器に移動させて培養するステップ;
c)前記b)ステップの上層液だけを分離して培養容器で35℃~39℃で1時間~3時間培養後、35℃~39℃で12~36時間培養を2~3回繰り返し、次いで35℃~39℃で24~72時間培養し、毎回上層液を新たな培養容器に移動させて繰り返し培養するステップ;及び
d)最終培養容器で単一クローナル幹細胞を得るステップ;を含む、方法。 - 前記hPLが含まれた培地は、1%~10%(w/w)のhPLが含まれた培地であることを特徴とする、請求項1に記載の中間葉幹細胞培養液の製造方法。
- 前記1)ステップの中間葉幹細胞は、50細胞/cm2~1000細胞/cm2の密度で接種することを特徴とする、請求項1に記載の中間葉幹細胞培養液の製造方法。
- 前記成長因子及びサイトカインは、アポリポプロテイン-A-1(apolipoprotein-A-1)、ケモカイン(C-X-Cモチーフ)リガンド-4(chemokine(C-X-C motif)ligand-4、CXCL-4)、ケモカイン(C-Cモチーフ)リガンド-5(chemokine(C-C motif)ligand-5、CCL-5)、レチノール結合タンパク質-4(Retinol binding protein-4、RBP-4)、ビタミンD-BP(Vitamin D-BP)、アディポネクチン(Adiponectin)、脳由来神経栄養因子(Brain derived neurotrophic factor、BDNF)、補体成分5/補体成分5a(C5/C5a)、分化クラスター14(Cluster of differentiation 14、CD14)、Fasリガンド(TNF SF6)(Fas ligand(TNF SF6))、成長/分化因子15(Growth/differentiation factor 15、GDF15)、インターロイキン-6(IL-6)、インターロイキン-8(IL-8)、血小板由来成長因子-AA(platelet derived growth factor-AA、PDGF-AA)、マクロファージコロニー刺激因子(macrophage colony stimulating factor、M-CSF)及び白血病阻止因子(Leukemia inhibitory factor、LIF)からなる群から選択される、いずれか1以上を含むことを特徴とする、請求項1に記載の中間葉幹細胞培養液の製造方法。
- 前記成長因子及びサイトカインは、血管内皮成長因子(Vascular endothelial growth factor、VEGF)、線維芽細胞成長因子2(Fibroblast growth factor 2、FGF2)、肝細胞成長因子(Hepatocyte growth factor、HGF)、線維芽細胞成長因子7(Fibroblast growth factor 7、FGF7)、線維芽細胞成長因子19(Fibroblast growth factor 19、FGF19)、アンギオゲニン(Angiogenin)、アンジオポエチン-1(Angiopoietin-1)、アンジオポエチン-2(Angiopoietin-2)、ディックコプフ関連タンパク質1(Dickkopf related protein 1、DKK-1)、インスリン様増殖因子結合タンパク質-2(insulin like growth factor binding protein-2、IGFBP-2)、インスリン様増殖因子結合タンパク質-3(insulin like growth factor binding protein-3、IGFBP-3)、血管細胞接着分子-1(Vascular cell adhesion molecule-1、VCAM-1)、ケモカイン(C-X-Cモチーフ)リガンド-12(chemokine(C-X-C motif)ligand-12、CXCL-12)、ケモカイン(C-Cモチーフ)リガンド-2(chemokine(C-C motif)ligand-2、CCL-2)、ペントラキシン-3(Pentraxin-3)、ケモカイン(C-Cモチーフ)リガンド-7(chemokine(C-C motif)ligand-7、CCL-7)、マクロファージ遊走阻止因子(macrophage migration inhibitory factor、MIF)、インターロイキン-22(IL-22)、インターロイキン-4(IL-4)、インターロイキン-17A(IL-17A)、キチナーゼ3-like 1(Chitinase 3-like 1)、アジプシン(adipsin)、C-反応性タンパク(C-reactive protein)、ジペプチジルペプチダーゼIV(Dipeptidyl peptidase IV、DPP IV)、シスタチンC(Cystatin C)、エンプリン(Emmprin)、オステオポンチン(Osteopontin)、セルピン(Serpin)E1(nexin)、トロンボスポンジン(Thrombospondin)-1(TSP-1)、レジスチン(Resistin)、ウロキナーゼ受容体(Urokinase receptor、uPAR)及びエンドグリン(Endoglin)からなる群から選択される、いずれか1以上をさらに含むことを特徴とする、請求項4に記載の中間葉幹細胞培養液の製造方法。
- 1)中間葉幹細胞をヒト血小板溶解物(human platelet lysate、hPL)が含まれた培地で培養するステップ;
2)培養された幹細胞を収得して無血清培地で培養するステップ;及び
3)中間葉幹細胞由来培養液を収去し、ろ過して幹細胞培養液を収得するステップ;を含む
成長因子及びサイトカインを含む、皮膚再生、シワ改善、皮膚美白、発毛または育毛用化粧料組成物製造用中間葉幹細胞培養液の製造方法であって、
前記中間葉幹細胞は、幹細胞の層分離培養方法(subfractionation culturing method、SCM)により分離された骨髄由来単一クローナル中間葉幹細胞であり、
a)軟骨、骨組織、脂肪組織及び骨髄からなる群から選択されるいずれか一つの組織を培養するステップ;
b)前記a)ステップの上層液だけを新たな容器に移動させて培養するステップ;
c)前記b)ステップの上層液だけを分離して培養容器で35℃~39℃で1時間~3時間培養後、35℃~39℃で12~36時間培養を2~3回繰り返し、次いで35℃~39℃で24~72時間培養し、毎回上層液を新たな培養容器に移動させて繰り返し培養するステップ;及び
d)最終培養容器で単一クローナル幹細胞を得るステップ;を含む、方法。 - 請求項1乃至6のいずれか一項に記載の方法で製造された成長因子及びサイトカインを含む中間葉幹細胞培養液。
- 請求項7に記載の中間葉幹細胞培養液を含む皮膚再生用化粧料組成物。
- 請求項7に記載の中間葉幹細胞培養液を含むシワ改善及び皮膚弾力増進用化粧料組成物。
- 請求項7に記載の中間葉幹細胞培養液を含む皮膚美白用化粧料組成物。
- 請求項7に記載の中間葉幹細胞培養液を含む発毛または育毛促進用化粧料組成物。
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