KR101108847B1

KR101108847B1 - 간엽줄기세포의 무혈청 배양액을 함유하는 피부주름 개선용 화장료 조성물

Info

Publication number: KR101108847B1
Application number: KR1020090059991A
Authority: KR
Inventors: 정대현; 모상현; 이정훈; 김수정; 김형식; 서효현; 임창일; 이기범; 노범석; 박병희
Original assignee: 재단법인 송도테크노파크; 주식회사 바이오에프디엔씨
Priority date: 2009-06-30
Filing date: 2009-06-30
Publication date: 2012-01-31
Also published as: KR20110001830A

Abstract

본 발명은 간엽줄기세포의 무혈청 배양액을 함유하는 피부주름 개선용 화장료 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 포유동물의 골수 또는 제대혈 유래 간엽줄기세포의 무혈청 배양액을 함유하는 피부주름 개선용 화장료 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 포유동물의 골수 또는 제대혈 유래 간엽줄기세포의 무혈청 배양액을 함유하는 피부주름 개선용 화장료 조성물은 간엽줄기세포 배양액에 다양하게 존재하는 싸이토카인류, 성장인자류 및 각종 생리활성물질로 인해 피부에 안전하고, 항산화능이 강력하며, 주름 개선 효과가 탁월하여 기능성 화장품의 소재로써 활용할 수 있다.

주름 개선, 간엽줄기세포, 무혈청, 세포배양액

Description

간엽줄기세포의 무혈청 배양액을 함유하는 피부주름 개선용 화장료 조성물{Cosmetic Composition for Wrinkle-Care Comprising Mesenchymal Stem Cell Serum-free Culture Solution}

화장품 산업은 기술적 측면에서 화학, 생물학, 생리학, 약학 등의 기초과학과 응용 기술이 복합적으로 적용되는 분야로, 기술집약적이고 고부가가치 산업이다. 오늘날 화장품은 사람의 피부에 직접 사용하는 제품으로써 피부에 대한 안전성, 효능, 사용 편의성 등을 갖추어야 하며, 아름다움을 가꾸는 미적 기능 뿐 아니라 피부를 보호, 청결, 보습, 유연 및 피부 생리적 기능을 유지하는 생물학적 기능 또한 갖추어야 한다. 이 점에서, 최근 기능성이 높은 단백질 성장인자들을 화장품에 적용하여 기능성이 높은 제품을 개발하고자하는 시도들이 꾸준히 화장품 업체와 관련 소재개발 바이오기업들을 중심으로 진행되고 있다.

줄기세포란 미분화세포로서, 오랜기간동안 분열을 하고 자기 갱신(self-renewal)을 할 수 있으며, 어떤 조건이 주어지면 다양한 종류의 세포로 분화할 수 있는 세포를 말한다. 줄기세포는 기원되는 조직에 따라 배아줄기 세포와 성체줄기 세포로 나뉘어지게 되는데, 배아줄기세포는 수정란, 배아로 부터 획득되고, 증식력이 강하며, 자가재생산이 용이한 반면 암을 형성할 수 있고, 텔로미어의 길이가 길고 많은 수의 증식이 가능한 장점이 있으나, 면역학적인 겨부반응 극복이 필요하고 원하는 세포로의 순수분화 기술이 필요하며, 윤리적인 문제점이 있다.

성체 줄기세포의 경우, 성체조직, 탯줄혈액으로 부터 얻을 수 있고, 분화가 용이하며, 생체 조직 특수성에 적응하는 분화능력이 있으며, 쉽게 줄기세포 성질을 상실하는 단점이 있으나, 생체조직환경에 적합한 분화능력이 있는 점과, 의학적 적용이 용이하고 이식후의 안정성이 보장되는 장점이 있다. 다만, 줄기세포의 양이 한정되어 있고, 희귀하며, 줄기세포 성질 유지 및 자가재생산을 통한 대량 생산 기술이 요구되고 있다. 이러한 면에서, 윤리적 문제가 없고 부작용이 없는 성체줄기세포를 대상으로 많은 조성물이 연구되고 있다.

성체줄기세포인 간엽줄기세포(mesenchymal stem cell)는 골수에서 가장 먼저 발견되었으며, 오늘날 상업적으로 골수유래 간엽줄기세포를 획득할 수 있다는 점에서 연구개발의 중요한 소재가 되고 있다. 최근에는 제대혈, 지방조직 등 골수 외의 조직에도 간엽줄기세포가 있다는 보고가 많이 축적되고 있으며, 다양한 분리 및 배양 기술이 집중적으로 개발되는 단계에 있다. 특히 제대혈은 채취가 쉽고 산모나 신생아에게 영향이 없으며, 연간 약 50만 여명의 신생아수를 감안할 때, 간엽줄기 세포의 훌륭한 자원 중의 하나로 부각되고 있다.

본 발명자들은, 최근 다양한 난치병에 대한 인류 궁극의 치료법으로 제시되고 있는 간엽줄기세포 생명공학 기술이 진일보함에 따라, 각종 생리활성 물질과 성장인자들이 다량 함유되어 있고 인간 세포에서 유래되어 안정성과 유효성이 탁월한 인간 간엽줄기세포의 배양액을 이용하여 고기능성, 고부가가치 화장품 원료로 개발하던 중, 무혈청 간엽줄기세포 배양액을 제조하여 이것이 주름개선에 탁월한 효과를 가짐을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 포유동물의 골수 또는 제대혈 유래 간엽줄기세포의 무혈청 배양액을 함유하는 피부주름 개선용 화장료 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은, 다음 단계를 포함하는, 포유동물의 골수 또는 제대혈 유래 간엽줄기세포의 무혈청 배양액의 제조방법을 제공하는데 있다:

(a) 분리된 골수 또는 제대혈 유래 간엽줄기세포를 혈청 함유 배지에서 배양하는 단계; (b) 상기 배양된 간엽줄기세포를 UVB 조사된 각질형성 세포의 배양액으로 처리하는 단계; 및 (c) 상기 처리된 간엽줄기세포를 무혈청 배지에서 배양한 다음, 배양액을 회수하는 단계.

본 발명의 다른 목적은, 상기 방법을 포함하는 것을 특징으로 하는, 포유동물의 골수 또는 제대혈 유래 간엽줄기세포의 무혈청 배양액을 함유한 피부주름 개선용 화장료 조성물의 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은, 포유동물의 골수 또는 제대혈 유래 간엽줄기세포로부터 인간 성장인자를 대량으로 생산하는 방법을 제공하는데 있다:

(a) 분리된 골수 또는 제대혈 유래 간엽줄기세포를 혈청 함유 배지에서 배양하는 단계; (b) 상기 배양된 간엽줄기세포를 UVB 조사된 각질형성 세포의 배양액으로 처리하는 단계; 및 (c) 상기 처리된 간엽줄기세포를 무혈청 배지에서 배양한 다음, 배양액을 회수하여 인간 성장인자를 수득하는 단계.

본 발명은 포유동물의 골수 또는 제대혈 유래 간엽줄기세포의 무혈청 배양액을 함유하는 피부주름 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명은, 다음 단계를 포함하는, 포유동물의 골수 또는 제대혈 유래 간엽줄기세포의 무혈청 배양액의 제조방법을 제공한다:

본 발명은, 상기 방법을 포함하는 것을 특징으로 하는, 포유동물의 골수 또는 제대혈 유래 간엽줄기세포의 무혈청 배양액을 함유한 피부주름 개선용 화장료 조성물의 제조방법을 제공한다.

본 발명은, 포유동물의 골수 또는 제대혈 유래 간엽줄기세포로부터 인간 성장인자를 대량으로 생산하는 방법을 제공한다:

본 발명에 따른 포유동물의 골수 또는 제대혈 유래 간엽줄기세포의 무혈청 배양액을 함유하는 피부주름 개선용 화장료 조성물은 피부 각질형성세포 배양액을 전처리하는 방법을 이용함으로써, 간엽줄기세포 배양액에 다양하게 존재하는 싸이토카인류, 성장인자류 및 각종 생리활성물질로 인해 피부에 안전하고, 항산화능이 강력하며, 주름 개선 효과가 탁월하여 피부노화방지 등의 기능성 화장품의 소재로써 활용할 수 있다.

본 발명은, FBS(우태아혈청) 등의 혈청 함유 배양 배지에서 충분히 증식된 인간 간엽줄기세포를 우태아혈청이 함유되지 않은 배양배지로 교체하여 최종적으로 우태아혈청이 함유되지 않는 간엽줄기세포 배양액을 획득하는 것에 특징이 있다.

특히, 본 발명에 있어서, 간엽줄기세포는 성체줄기세포로 매우 높은 의약적 치료효과와 관련 응용기술에 대한 경제적 가치가 큰 생물학적 소재이다. 이러한 간엽줄기세포는 자가재생능과 다분화성을 갖는 세포로서, 골, 연골, 골수간질세포, 지방세포, 신경세포 등으로 분화되는 세포이다.

줄기세포의 수득 과정

본 발명에 따른 중간엽 줄기세포는 인간의 골수 또는 제대혈, 태반 내에 존재하는 세포 중에서 정제과정을 거쳐서 수득하는 것이 가능하다. 각각의 조직의 특성에 따라 줄기세포를 추출하는 과정은 이미 국내외 특허와 논문을 통하여 당업자에게 주지의 사실이고, 현재는 인간 유래 중간엽 줄기세포를 연구용 목적으로 사용 가능한 세포주를 판매하고 있어, 쉽고 용이하게 중간엽 줄기세포를 얻을 수 있다.

줄기세포의 배양 과정

본 출원시 이전에 다양한 문헌을 통해, 줄기세포 배양 과정에 있어서 필수적으로 포함되어야 할 과정들은 공개되어 있으며, 세포배양의 시작에 앞서 주지의 방법으로 공급원으로부터 추출한 생검 즉, 골수, 태반 등은 일반적인 항생제를 포함한 세척배지를 이용한 반복적인 세척과정을 통해 후속배양에 있을 오염의 가능성을 최소한으로 감소시킬 수 있다. 본 발명에서는 구체적으로, 중간엽 줄기세포의 혈청배지에서 배양한 다음 무혈청배지에서 계대배양하는 단계를 순차 진행함으로써 성장인자의 생산량을 극대화한다.

혈청을 포함한 초기단계 세포배양을 위한 배지는 중간엽 줄기세포와 같은 세포형을 유지하고 보관하는데 적합한 목적의 배지인 것이 바람직하다.본 발명에서는 당업계에서 일반적으로 세포배양에 사용하는 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)을 기본으로 하고, 세포배양에 통상적으로 사용되는 혈청을 포함한다.

이 때 초기 배지에 7～10％의 디메틸 술폭시드(DMSO ; dimethyl sulfoxide)를 첨가하면 동결 배지일 수도 있고,따라서 줄기세포를 동결한 다음 필요한 경우 해동하여 사용할 수 있다.

혈청은 0.1 내지 20％의 소 태아 혈청(FBS)을 첨가하는 것이 바람직하고, 항생제, 항진균제 및 오염을 야기하는 마이코플라스마의 성장을 예방하는 시제를 첨가하는 것이 더욱 바람직하다.

항생제로는 페니실린-스트렙토마이신 등 통상 세포배양에 사용되는 항생제를 모두 이용가능하며, 항진균제로는 암포테리신 B, 마이코플라스마 억제제로는 타일로신을 이용하는 것이 바람직하며 젠타마이신, 시프로플록사신, 아지트로마이신등으로 마이코플라스마 오염을 방지할 수 있으며, 필요에 따라 글루타민 등의 산화영양소와 소디움 피루베이트등 에너지 대사물질을 더 첨가할 수 있다.

더욱 바람직한 배지는 1～2mM 의 글루타민, 0.5～1mM 소디움 피루베이트, 0.1～10％ FBS, 1％ 항생제(100 IU/ml)로 보충된 글루코오스 및 DMEM을 함유하는데 이를 완전혈청배지라 한다. 이 때 글루코스의 농도범주는 대략적으로 1g/L ～ 4.5g/L일 수 있다. 상기 완전혈청배지는 골수 또는 제대혈 유래 줄기세포의 보관과 유지 및 시험관내 안정된 기본배양조건을 제공해 주며 효과적인 세포의 안정화를 보여준다.

초기 배양의 일반적 배양조건은 세포배양에 가장 적합한 조건을 적용하여 습도 90～95％, 온도 35～39℃, 5～10％ CO₂ 배양기에서 배양하고, 5～10％ CO₂ 배양 시에는 최종농도가 0.17～0.22 중량％가 되게 소디움 바이카보네이트 등의 탄소 조절원을 첨가해줄 수 있다.

초기배양 단계동안 조직단편은 배양 용기 바닥에 부착된 상태를 유지시키는 게 바람직하며, 세포 배양의 표준 기술에 따른 트립신-EDTA 처리로 인한 짧은 자극으로 성장을 촉진할 수 있다.

누적집단배증시간 (doubling time)은 플라스크 내 배양중인 세포가 75～85％ 합류(confluence) 때까지 유지하고 바람직하게 80％ 합류시기에 세포를 채취하여 계대배양을 한다.

이하, 본 발명에 관하여 상세히 설명한다.

일 관점에서, 본 발명은 포유동물의 골수 또는 제대혈 유래 간엽줄기세포의 무혈청 배양액을 함유하는 피부주름 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 포유동물은 사람, 돼지, 소 등일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 무혈청 간엽줄기세포 배양액은 간엽줄기세포를 혈청 함유 배지에서 배양한 다음, 무혈청 배지에서 배양함으로써 다양한 성장인자가 증가된 수준의 발현량을 가질 수 있으며, 특히, IL-6, IL-8, MCP-1, IGFBP-4, PARC, Osteoprotegerin 및 TIMP-2로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 성장인자가, 혈청 간엽줄기세포 배양액에 비하여 유사한 수준, 구체적으로는 80～120％의 발현량을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 무혈청 배지에서 배양할시에, 글루타민 및 글루코스를 첨가하여 배양함으로써, 상기 무혈청 간엽줄기세포 배양액은 80～150mM의 글루코스 및 20～60mM의 글루타민을 함유하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는, 100～125mM의 글루코스, 30～50mM의 글루타민을 함유하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 포유동물의 골수 또는 제대혈 유래 간엽줄기세포의 무혈청 배양액은 자외선으로 조사된 피부 각질형성세포 배양액으로 전처리하는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 전처리 과정은, 예컨대, 혈청 배지에서 배양된 간엽줄기세포에 자외선 조사된 피부각질형성세포 배양액을 첨가하고, 24시간, 3～5일 또는 7～9일 이상 추가 세포배양 하는 것이다. 피부 각질형성세포 배양액의 첨가량 또는 세포배양기간은 제한없이 적용가능하다.

본 발명에 있어서, 상기 피부각질형성세포는 인간 피부 각질형성세포인 HaCaT일 수 있고, 또는 인간 피부에서 직접 분리된 각질형성세포(keratinocyte) 세포일 수 있다.

상기 피부각질형성세포 배양액은 피부각질형성세포를 혈청 함유 배지에서 배양한 다음, UVB와 같은 자외선으로 5mJ ～ 50mJ로 조사해줌으로써 얻어진 배양액인 것을 특징으로 할 수 있다.

UVB조사는 피부 각질형성세포에 대표적인 환경 스트레스 인자로 잘 알려져 있다. 심한 조사를 하면 죽게되는데, 5mJ ～ 50mJ와 같이 죽지 않을 정도의 UVB 조사는 피부 각질형성세포는 다양한 스트레스를 유발하여 이에 상응되는 생리활성물질을 각질형성세포가 배양배지에 만들게 된다.

본 발명에 있어서, 상기 무혈청 간엽줄기세포 배양액은 IL-6, IL-8, MCP-1, IGFBP-4, PARC, Osteoprotegerin 및 TIMP-2로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 성장인자가, 자외선으로 조사된 피부 각질형성세포 배양액을 전처리하는 않은 경우에 비하여 100 ～ 700％의 발현량을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 간엽줄기세포는, 포유동물의 골수 및 제대혈로 구성된 군에서 선택된 유래를 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.

다른 관점에서, 본 발명은, (a) 분리된 골수 또는 제대혈 유래 간엽줄기세포를 혈청 함유 배지에서 배양하는 단계; (b) 상기 배양된 간엽줄기세포를 UVB 조사된 각질형성 세포의 배양액으로 처리하는 단계; 및 (c) 상기 처리된 간엽줄기세포를 무혈청 배지에서 배양한 다음, 배양액을 회수하는 단계를 포함하는 포유동물 골수 또는 제대혈 유래 간엽줄기세포의 무혈청 배양액의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계에서, 골수 또는 제대혈 유래 간엽줄기세포를 혈청 함유배지에서 배양하는 단계는, 하기 실시예에 나타난 바와 같이, 동일한 함량의 혈청 함유 배지에서 배양할 수도 있고, 점차 순차적으로 혈청 함유량을 줄여가면서 계대배양 할 수도 있다.

일 예로, 10～20％ 혈청 함유 배지에서 계대배양하거나, 10～20％ 혈청 함유 배지에서 배양후, 5～7％, 1～3％ 혈청 함유 배지 등으로 옮겨가며 순차적으로 혈청 함유량을 줄인 배지에서 배양한 다음, 무혈청 배지에서 배양하는 것을 특징으로 할 수 있다.

또한, 배양 과정에 있어서, 세포 배양 시작 후 24시간된 시점에서 배양배지를 제거하고, 다시 새롭게 준비된 배양배지를 넣어주며, 그로부터 3～4일 후에 새롭게 준비된 배양배지를 넣어주어 배양한 다음, 7～9일 후에 배양배지를 제거하고, 계대배양할 수 있으나, 배지를 갈아주는 시기나, 배양기간에 특별한 제한이 있는 것은 아니고 모두 적용가능하다.

본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계에서, 무혈청 배지는 글루코스 및 글루타민이 각각 80～150mM 및 20～60mM의 농도로 함유되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.

즉, 무혈청 배지 배양단계에서 배지조성물에 글루코스 및 글루타민을 추가함으로써 총 함량은 상기와 같은 농도범위를 가질 수 있다.

다른 관점에서, 본 발명은, 상기 방법을 포함하는 것을 특징으로 하는, 포유동물 골수 또는 제대혈 유래 간엽줄기세포의 무혈청 배양액을 함유한 피부주름 개선용 화장료 조성물의 제조방법에 관한 것이다.

다른 관점에서, 본 발명은, (a) 분리된 골수 또는 제대혈 유래 간엽줄기세포를 혈청 함유 배지에서 배양하는 단계; (b) 상기 배양된 간엽줄기세포를 UVB 조사된 각질형성 세포의 배양액으로 처리하는 단계; 및 (c) 상기 처리된 간엽줄기세포를 무혈청 배지에서 배양한 다음, 배양액을 회수하여 인간 성장인자를 수득하는 단계를 포함하는 골수 또는 제대혈 유래 간엽줄기세포로부터 인간 성장인자를 대량으로 생산하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 인간 성장인자는 배양액 내에 함유되어 있는 다양한 성장인자들일 수 있으며, 일 예로, IL-6, IL-8, MCP-1, IGFBP-4, PARC, Osteoprotegerin 또는 TIMP-2 등 일 수 있다.

본 발명에 있어서, IL-6(Interleukin-6)는 생체 항상성 유지와 면역 및 염증에서 매우 중요한 인자로 피부에서는 각질형성세포의 성장을 촉진하는 기능을 수행하며, 기타의 기능으로 B 세포의 분화에 작용하여 면역 글로블린의 생성을 촉진하며 급성 염증 반응 시 간세포에서는 c-reactive protein(CRP)과 같은 급성기 염증물질을 생성하는 작용을 한다. 이외에도 신장의 mesangial cell의 성장 유도한다.

IL-8(Interleukin-8)는 염증세포(호중구, T 세포)에 대한 화학주성인자(chemoattractant)로써 일반적인 작용을 한다. 피부에 관한 생리적인 효과로는 시험관상(in vitro)에서 피부 각질형성세포의 증식을 촉진시키고 각질형성세포의 이상과증식이 특징인 건선(psoriasis)에 연관되어 있다고 알려져 있다.

MCP-1(Monocyte chemoattractant protein-1)은 단핵구 화학유인물질로 염증성 매개 물질에 반으으하여 백혈구의 이동과 세포로의 유입 과정에서 중요한 역할을 하는 물질이다. 피부에 관한 연구는 많지 않은 편이나, 피부가 과도한 산화적 스트레스를 받을 경우 발현이 증가하는 것으로 알려져 있어 적절한 스트레스 대응기전에 요구되는 물질로 판단될 수 있다.

IGFBP-4(Insulin-like growth factor binding protein-4)는 인슐린 유사 성장인자(IGF) 중 IGF-I에 의존적인 저해제로 알려져 있다. 주요 기능으로는 IGF의 다양한 기능 중 골형성에 관한 기능을 조절하는 기전이 가장 유력 시 되고있다. 피부에 관한 직접적인 연구결과는 적으나 절절한 상처 회복 및 조직 재생에 필요한 IGF의 기능을 조절하는 것으로 사료된다.

PARC(Pulmonary and activation-regulated chemokine)는 MIP-4(macrophage inflammatory protein-4)로도 불리우는 싸이토카인으로 염증의 중요한 매개 인자로 사료된다. 아직까지 특이적인 수용체는 발혀지지 않았으며 특정 피부 병변에 외부 병원체의 침입이 있으며 신속한 면역 반응과 염증 반응을 매개하는 물질로 사료된다.

Osteoprotegerin은 간엽줄기세포가 관장하는 조직 분화능 중 골형성과 관계된 인자이다. 고유의 기능으로는 골형성과 관계된 파골세포의 분화와 활성화를 조절하는 인자로 알려져 있다.

TIMP-2(Tissue inhibitor of metalloproteinase-2)는 피부에 존재하는 다양한 금속이온 의존성 protease들인 metalloproteases의 저해제 들이다. 간엽줄기세포가 생산하는 TIMP-2는 상처로부터의 피부 재생과 다양한 환경인자에 의해 파괴된 피부의 재생에 관여될 것으로 사료된다.

본 발명에 따라 제조된 간엽줄기세포 무혈청 배양액은 화장료 조성물 전체로서 사용될 수 있으나, 일반적으로 화장료 조성물 제조에 사용되는 첨가제들과 조합하여 화장료 조성물로 제조될 수 있어, 화장료 조성물 전체에 대하여 1～80중량부로 포함할 수도 있다.

본 발명에 있어서, 상기 화장료 조성물은 화장수, 크림, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 로션, 모이스처 로션, 밀크로션, 영양로션, 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아이스트린젠트, 팩, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 스킨 젤, 스킨 오일, 스킨 토너, 훼이스 로션(face lotion), 수렴수 및 디오더 런트로 이루어진 군으로부터 선택되는 제형을 갖을 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 피부 세정용일 수 있고, 상기 피부 세정용의 화장료 조성물은 크림, 로션, 화장수, 클렌저, 폼, 클렌징 폼, 필링젤, 바디워시, 스크럽, 비누, 오일, 에멀젼, 헤어비누, 헤어 린스, 바디클렌져, 샴푸, 유액, 고형 세정제 및 액상 세정료로 이루어진 군으로부터 선택되는 제형을 갖을 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 정제수, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 항염증제, 착색제, 물 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 기타 성분 등을 포함할 수 있으며, 이들 성분은 전체 조성물의 약 98.0 내지 99.1중량％의 양으로 존재할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에 사용되는 계면활성제는 음이온성, 양이온성 및 양쪽성 모두를 포함하며, 사용량은 전형적으로 30중량％이상, 바람직하게는 70중량％ 이상이다. 계면활성제의 종류 및 사용량을 선택 결정하는 것은 본 분야의 당업자에 의해 용이하게 이루어질 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에 사용될 수 있는 바람직한 안정화제로는, 이로서 한정되는 것은 아니지만, 글리콜 스테아레이트가 포함된다. 안정화제가 사용되는 경우, 일반적으로, 조성물의 약 0.1 내지 5중량％이다.

본 발명의 화장료 조성물에 사용될 수 있는 바람직한 보존제로는, 이들로 한 정되는 것은 아니지만, 테트라나트륨 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA), 1-(3-클로로알릴)-3,5,7-트라아자-1-아다만탄, 파라벤, 메틸파라벤, 5-클로로-2-메틸-4-이소티아졸린-3-온과 2-메틸-4-이소티아졸린-3-온의 혼합물, 페녹시에탄올, 벤질알코올, 벤조페논-4, 메틸클로로이소티아졸리논 및 메틸이소티아졸리논 또는 이들의 혼합물이 포함될 수 있다. 보존제가 사용되는 경우, 이의 양은 전형적으로 조성물의 약 0.01 내지 6중량％이고, 바람직한 양은 약 0.05 내지 4중량％, 더욱 바람직한 양은 약 0.1 내지 2중량％이다.

본 발명의 화장료 조성물에 사용될 수 있는 바람직한 습윤화제로는 밀 단백질(예, 라우르디모늄 하이드록시프로필 가수분해된 밀 단백질), 헤어 케라틴 아미노산, 나트륨 퍼옥실린카르볼산, 판테놀, 토코페롤(비타민 E) 및 디메티콘 또는 이들의 혼합물이 포함된다. 또한 염화나트륨이 존재할 수 있으며 특히 헤어 케라틴 아미노산이 습윤화제로서 포함되는 경우 그러하다. 습윤화제는 전형적으로 조성물의 약 0.01 내지 10중량％, 바람직하게는 약 0.05 내지 1.5 중량％, 더욱 바람직하게는 약 0.01 내지 1 중량％가 사용된다.

본 발명의 화장료 조성물에 사용될 수 있는 바람직한 착색제로는 FD＆C 그린 3번, Ext. D＆C 바이올렛 2번, FD＆C 옐로우 5번 및 FD＆C 레드 40번 또는 이들의 혼합물이 포함될 수 있다. 착색제는 사용되는 경우 전형적으로 조성물의 약 0.001 내지 0.1중량％, 바람직하게는 약 0.005 내지 0.05중량％이다.

본 발명의 화장료 조성물에 사용될 수 있는 바람직한 항염증제로는 국소적으로 투여하기에 적합하고 약학적으로 허용되는 화합물이라면 그 어느 것도 포함되 며, 바람직하게는 알란토인이다. 항염증제는 사용하는 경우 염증 억제 또는 경감시키기에 충분한 양으로 사용되며 전형적으로는 조성물의 약 0.1 내지 2중량％, 바람직하게는 약 0.3 내지 1.5중량％, 더욱 바람직하게는 약 0.1 내지 1중량％이다.

본 발명의 화장료 조성물에 사용될 수 있는 항산화제는 효소형 항산화제와 비효소형 항산화제 모두 사용될 수 있다. 천연 효소형 항산화제의 예로는 과산화물디스뮤타제(SOD), 카탈라제 및 글루타티온 퍼옥시다제를 들 수 있다. 적합한 비효소형 항산화제로는 비타민 E(예, 토코페롤), 비타민 C(아스코브산), 카로테노이드, 에키나코시드(Echinacoside), 카페오일 유도체, 올리고머 프로안토시아니딘, 프로안타놀(예, 포도 종자 추출물), 실리마린(예, 밀크 엉겅퀴 추출물, 실리붐 마리아늄), 은행나무(Ginkgo biloba) 및 녹차 폴리페놀 또는 이들의 혼합물이 포함될 수 있다. 카로테노이드는 강력한 항산화제이며 이의 예로는 베타-카로틴, 칸타크산틴, 제아크산틴, 라이코펜, 루테인, 크로세틴 및 캡산틴 등이 포함된다. 바람직한 항산화제는 비타민 E, 비타민 C 또는 카로테노이드이다. 항산화제는 사용되는 경우 피부에서 유리-라디칼의 영향을 억제하거나 경감시키기에 충분한 양으로 사용된다. 항산화제의 전형적인 사용량은 조성물의 약 0.001 내지 1중량％이고, 바람직한 양은 약 0.01 내지 0.5중량％이다.

본 발명의 화장료 조성물은 본 분야에서 통상적으로 사용되는 다른 보조제를 함유할 수 있다. 이러한 보조제의 예로는 향료, 염료(헤어를 동시에 염색하거나 색조를 부가하는 염료를 포함), 용매, 불투명화제, 펄제(pearlescent agent)(예를 들어, 지방산과 폴리올의 에스테르, 지방산의 마그네슘 염 및 아연 염), 공중합체 계 분산액, 농후화제(예를 들어, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화암모늄 및 황산나트륨), 지방산 알킬올아미드, 셀룰로즈 유도체, 천연 검, 식물 추출물, 알부민 유도체(예를 들어 젤라틴), 콜라겐 가수분해 생성물, 천연 또는 합성 폴리펩타이드, 난황, 레시틴, 라놀린 또는 라놀린 유도체, 지방, 오일, 지방 알코올, 실리콘, 디오더런트, 항균 물질, 항지루성 물질, 각질용해제(예를 들어, 황, 살리실산, 벤조일 퍼옥사이드, 셀레늄 설파이드, PG, FA, 효소) 및 각화제(예를 들어, 타르, 황, 살리실산, 셀레늄 설파이드, 항균제, 벤조일 퍼옥사이드, 클로르헥시딘, 요오드, 트리클로산, 항진균제 및 효소) 또는 이들의 혼합물을 들 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. 특히, 실시예에서는 골수 유래 줄기세포로 실험한 결과에 대해 기재되어 있으나, 제대혈 유래 줄기세포의 배양액 내에도 다양한 성장인자들이 포함되어 있어 동일한 효과가 있음은 당업자에게 자명할 것이다.

실시예 1: 기능성이 강화된 무혈청 간엽줄기세포 배양액의 제조

1.1: 피부 각질형성 세포주 HaCaT 배양액 제조

10％ FBS(Fetal Bovine Serum, Cetificated, Cat. No. 16000, GIBCO)와 antibiotics(Antibiotics-Antimycotic, Cat. No. 15240-062, GIBCO)가 함유된 DMEM(GIBCO) 20ml을 37℃로 30분간 미리 승온한 후 75T flask(NUNC)에 넣었다. LN2 탱크에서 보관하고 있는 각질형성세포 HaCaT 세포 (CLC Cell line serveice, Germany) stock을 해동하여, 해동한 HaCaT 세포 vial을 10ml 동일 배지에 현탁 후 2,000 rpm에서 3분간 원심분리하여 세포만을 획득하였다. 상등액을 제거하고 획득된 세포를 1ml의 동일한 배지에 재 현탁한 후 10㎕를 획득하여 C-Chip(Cat. No. DHC-N01, iNCYTO)과 광학현미경을 이용하여 계수하였다.

계수된 세포를 이용하여 1 × 10⁵ cell/cm²의 농도로 75 T-flask에 접종하여 5％ CO₂, 37℃로 세포 배양을 시작하였고, 세포 배양 시작 24시간 후 배양에 사용 중인 배양배지를 제거하고, 새롭게 준비된 10％ FBS와 antibiotics(Antibiotics-Antimycotic, Cat. No. 15240-062, GIBCO)가 함유된 DMEM(GIBCO) 20ml을 넣어주었다. 세포 배양 시작 3 ～ 4일 후 배양에 사용 중인 배양배지를 제거하고, 새롭게 준비된 10％ FBS와 antibiotics가 함유된 DMEM 20ml을 넣어주었다. 배양 시작 7 ～ 9일 후 배양에 사용 중인 배양배지를 제거하고, Ca²⁺와 Mg²⁺를 함유하지않은 DPBS(GIBCO™ Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1X), GIBCO) 5ml로 가볍게 씻어준 다음, 5ml의 Trypsin-EDTA 용액 (GIBCO)를 첨가하고 37℃에서 5분간 반응시켜 세포를 용기에서 떼어내었다.

5ml의 10％ FBS와 antibiotics가 함유된 DMEM(GIBCO)을 첨가하여 트립신의 활성을 차단하였고, 획득된 세포 현탁액을 2,000 rpm에서 3분간 원심분리하여 세포만을 획득하였다. 상등액을 제거하고 획득된 세포를 1ml의 동일한 배지에 재 현탁한 후 10㎕를 획득하여 C-Chip(Cat. No. DHC-N01, iNCYTO)와 광학현미경을 이용하여 계수하였다.

계수된 세포를 이용하여 1 × 10⁵ cell/Cm²의 농도로 175 T-flask 8개에 접종하고, 각 175 T-flask에 50ml의 10％ FBS와 antibiotics가 함유된 DMEM을 첨가하여 5％ CO₂, 37℃로 세포 배양을 시작하였다. 배양 3 ～ 4일에 한번씩 동일한 배지로 교환하여 각질형성세포의 confluence가 90％～ 100％에 도달할때까지 배양하였다. 배양이 완료되면 배양액을 제거하여 세포를 노출시키고 UVB 발생용 전용등을 사용하여 25mJ의 UVB를 조사하였다. 조사 후 각각의 175 T-flask에 2 ％ FBS와 antibiotics가 함유된 DMEM(GIBCO) 50ml을 사용하여 24시간 배양하였다. 24시간 배양 후 각각의 175 T-flask에서 배양액을 회수하고 0.22μm의 membrane filteration을 통하여, 무혈청 간엽줄기세포 배양액에 첨가할 피부각질형성세포 배양액을 얻었다.

1.2: 무혈청 간엽줄기세포 배양액 제조를 위한 배지의 개량 실험

인간 골수 유래 간엽줄기세포로부터, 기능성이 강화된, 그리고 FBS(우태아혈청)을 사용하지 않는 배양액을 획득하기 위하여 다양한 배지들을 시험하였다. 이를 위해 잘 길러진 간엽줄기세포에 기능성 강화를 위한 단계로, UVB-조사 각질형성세포(HaCaT)의 배양액을 처리한 후 2％로 낮추어진 FBS를 갖는 DMEM 배양 배지로 순응을 시켰다. 이후 최종적인 무혈청 배지를 획득하기 위해 FBS가 들어있지 않은 다양한 배지에 아래와 같은 변형을 주어 세포 생존율을 시험하였다 (구체적인 배양과정은, 하기 실시예 1.3에 기재되어 있는 배양방법과 동일한 방법으로 진행하였다).

시험 결과 표 1에 나타난 바와 같이, FBS 없이도 100mM glucose와 50mM glutamine을 추가한 DMEM 배양 배지를 사용할 경우, 10％ FBS를 사용하는 경우에 비해 91％에 해당하는 세포 증식을 유도할 수 있음을 확인하였다.

[표 1] 간엽줄기세포 증식 유지에 대한 다양한 무혈청 배지 효과

1.3: 기능성이 강화된 무혈청 간엽 줄기세포 배양액의 제조

10％ FBS(Fetal Bovine Serum, Cetificated, Cat. No. 16000, GIBCO)와 antibiotics(Antibiotics-Antimycotic, Cat. No. 15240-062, GIBCO)가 함유된 DMEM(GIBCO) 20ml을 37℃로 30분간 미리 승온한 후 75T flask(NUNC)에 넣었다. 그리고, LN2 탱크에서 보관하고 있는 인간 골수유래 간엽줄기세포 (Poietics®Human Mesenchymal Stem Cells, LONZA, USA) stock을 해동하여, 간엽줄기세포 vial을 10ml 동일 배지에 현탁 후 2,000 rpm에서 3분간 원심분리하여 세포만을 획득하였고, 상등액을 제거하고 획득된 세포를 1ml의 동일한 배지에 재 현탁한 후 10㎕를 획득하여 C-Chip(Cat. No. DHC-N01, iNCYTO)와 광학현미경을 이용하여 계수하였다.

계수된 세포를 이용하여 1 × 10⁴ cell/Cm²의 농도로 75 T-flask에 접종하여 5％ CO₂, 37℃로 세포 배양을 시작하였다. 세포 배양 시작 24시간 후 배양에 사용 중인 배양배지를 제거하고 새롭게 준비된 10％ FBS와 antibiotics가 함유된 DMEM 20ml을 넣어주었고, 세포 배양 시작 3 ～ 4일 후 배양에 사용 중인 배양배지를 제거하고 새롭게 준비된 10％ FBS와 antibiotics가 함유된 DMEM 20ml을 넣어주었다.

배양 시작 7 ～ 9일 후 배양에 사용 중인 배양배지를 제거하고, Ca²⁺와 Mg²⁺를 함유하지않은 DPBS(GIBCO™ Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1X), GIBCO) 5ml로 가볍게 씻어준 다음, 5ml의 Trypsin-EDTA 용액 (GIBCO)를 첨가하고 37℃에서 5분간 반응시켜 세포를 용기에서 떼어내었다. 5ml의 10％ FBS와 antibiotics가 함유된 DMEM을 첨가하여 트립신의 활성을 차단하였고, 획득된 세포 현탁액을 2,000 rpm에서 3분간 원심분리하여 세포만을 획득하였다. 상등액을 제거하고 획득된 세포를 1ml의 동일한 배지에 재현탁한 후 10㎕를 획득하여 C-Chip(Cat. No. DHC-N01, iNCYTO)과 광학현미경을 이용하여 계수하였다.

계수된 세포를 이용하여 1 × 10⁴ cell/cm²의 농도로 175 T-flask 8개에 접종하고, 각 175 T-flask에 50ml의 10％ FBS와 antibiotics가 함유된 DMEM을 첨가하여 5％ CO₂, 37℃로 세포 배양을 시작하였다. 세포 배양 시작 3 ～ 4일 후 배양에 사용 중인 배양배지를 제거하고 각각의 175 T-flask 당 10％ FBS와 antibiotics가 함유된 DMEM 50ml을 넣어주었다. 세포 배양 시작 7 ～ 9일 후 간엽줄기세포의 confluence가 90％～ 100％에 도달하면, 각각의 175 T-flask에 2 ％ FBS와 antibiotics가 함유된 DMEM(GIBCO) 20ml을 사용하여 3회 씻어준 다음, 낮은 농도의 FBS를 함유하는 배지에 순응시키기 위해, 낮은 농도의 FBS를 함유하는 배지에 순응시키기 위하여 각각의 175 T-flask에 2 ％ FBS와 antibiotics가 함유된 DMEM(GIBCO) 50ml을 사용하여 5％ CO₂, 37℃로 24시간 추가 세포 배양을 수행하였다. 기능성이 강화된 무혈청 간엽줄기세포 배양액을 획득하기 위하여는 이 단계에서 2 ％ FBS와 antibiotics가 함유된 DMEM(GIBCO)을 사용하는 대신 실시예 1.1에서 제작된 피부각질형성세포 배양액 50ml씩을 첨가하고 5％ CO₂, 37℃로 24시간 추가 세포 배양을 수행하였다. 24시간 추가배양 후, FBS를 함유하지 않고(0％) antibiotics, 100mM glucose와 50mM glutamine 추가 함유하는 DMEM 20ml을 사용하여 3회 씻어준 다음, 각각의 175 T-flask에 FBS를 함유하지 않고(0％) antibiotics, 100mM glucose와 50mM glutamine 추가 함유하는 DMEM 50ml을 첨가하고 5％ CO₂, 37℃로 48시간 추가 세포 배양을 수행하였다. 48시간 배양 후 무혈청 간엽줄기세포 배양액을 회수하고, 회수된 간엽줄기세포 배양액은 0.22 μm filteration을 통하여 여과 및 제균하였다.

실험예 1: 소 알부민 부존재 실험

실시예 1에서 최종적으로 제조한 간엽 줄기세포 배양액이 혈청을 함유하지 않았음을 확인하기 위해, FBS(우태아혈청)에 존재하는 대표적인 단백질인 소알부민 (bovine albumin)의 존재를 항원-항체 반응의 높은 특이성으로 단백질 정량에 보편적으로 사용되는 Western blotting(Immunoblotting) 분석법을 사용하여 확인하였다.

실시예 1에서 획득된 최종 간엽줄기세포 배양액을 0.02 ml을 5X SDS-sample buffer 0.05 ml에 잘 섞고 끓는 물에서 5분간 가열하였다. 8％ SDS-PAGE electrophoresis를 이용해서 분리하였다. 이렇게 전기영동된 줄기세포 배양액의 전체 단백질들은 정전기적인 이동을 통하여 고체 matrix인 nitrocellulose membrane으로 이동되었다.

제조된 간엽줄기세포 배양액에 우태아혈청이 존재하는 지를 검사하기 위하여 우태아혈청의 주요 단백질인 소 알부민의 특이 항체(Rabbit Anti-Bovine Albumin Serum Polyclonal Antibody, Unconjugated)(Abbiotec, USA)와 상기의 NC membrane을 일정 시간 반응 시킨 후, 소 알부민의 항체와 특이 반응을 하는 2차 항체를 반응시켰다. 이때 2차 항체는 Horseradish peroxidase (HRP)가 융합되어 있으며, 적절한 기질을 이용하여 X-ray film을 감광후 생성되는 신호의 강도를 통해 소 알부민이 줄기세포 배양액에 잔존하는 지를 검사하였다.

상기 실시예 1에서 제조 과정의 중간 순응 단계인, 10％ FBS 함유 배지에서 배양 후, 2％ FBS 함유 배지에서 24시간 배양한 배양액을 대조군으로 사용하였다.

도 1에 나타난 바와 같이, 완전히 무혈청 (0％ FBS) 배지에서 획득된 간엽줄기세포 배양액에서는 우태아혈청 알부민이 존재하지 않는 반면 (A), 2％ FBS (우태아혈청)을 함유하는 배양 배지에서 24시간 배양한 배양액에서는 여전히 높은 함량 의 FBS (우태아혈청) 알부민이 검출되었다.

실험예 2: DPPH를 이용한 항산화능 시험

화합물 1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl (DPPH, Sigma D9132-1G, USA)는 에탄올 내에서 자유라디칼을 발생하는데, 실시예 1에서 제조된 간엽줄기세포 배양액과 일정 비율로 혼합하여 생성된 자유라디칼의 양이 어느 정도 감소하는지를 확인하였다.

에탄올을 0.2 ml에 에탄올로 제조된 0.1 mM DPPH 용액 0.5 ml 및 정제수를 이용하여, 최종농도가 30％～ 1％ 되도록 실시예 1에서 제조한 조성물을 0.3ml을 첨가하였다. 10초간 강하게 볼텍싱(vortexing) 하고, 냉암소에서 30분간 보관한 다음, ELISA를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 항산화능의 정도는 순수한 물을 사용한 대조군의 흡광 강도를 기준으로 백분율로 표시하였다.

도 2에서 나타난 바와 같이, 무첨가군(0％) 대비하여, 30％ 실험군에서 생성된 자유라디칼의 82 ± 8 ％가 감소하는 매우 강한 항산화능을 보였으며, 검사된 항산화능은 첨가된 간엽줄기세포의 배양액 함량이 감소할수록 (20％, 10％, 1％ 함유 실험군) 감소되는 농도의존성을 보여 해당 항산화능이 간엽줄기세포 배양액에 의한 고유 특성임을 확인할 수 있었다.

실험예 3: 에틸리놀리에이트를 이용한 항산화능 시험

실시예 1에서 제조된 간엽줄기세포 배양액의 항산화능 효과를 알아보기 위해, 에틸 리놀리에이트 (Ethyl Linoleate)를 이용하여 항산화능을 확인하였다.

펜톤 시약 (Fenton's reagent)를 이용하여 에틸리놀리에이트를 산화시켰다. 1.5 mg/L 에틸리놀리에이트, 0.2％ 소디움 도데실 셀페이트 (sodium dodecyl sulfate), 1 mmol 염화제일철 (ferrous chloride), 0.5 mmol 과산화수소 (hydrogen peroxide), 그리고 0.75 mmol 염화칼륨 (potassium chloride)을 함유하는 0.25 mmol 트리즈마-염산 (Trizma-HCl) 버퍼 (pH 7.4) 5 ml에 실시예 1에서 제조된 무혈청 간엽줄기세포 배양액이 30％ - 1％가 되게 첨가하였다.

대조군으로는 동량의 정제수를 사용하였으며, 반응액은 37℃에서 16시간동안 교반하면서 유지하였다. 에탄올에 녹인 4％ 부틸화된 하이드록시톨루엔 (butylated hydroxytoluene, BHT) 50 ml를 첨가하여 추가적인 산화를 막았다. 산화의 정도는 티오바르비튜릭산 (thiobarbituric acid, TBA)법을 이용하여 측정하였다. 간단하게 상기의 반응액 0.2 ml과 8％ 소디움 도데실 셀페이트 0.2 ml, 1 M 아세트산 버퍼 1.5 ml, 그리고 0.67％ 티오바르비튜릭산 용액 1.5 ml를 혼합하였다. 혼합 후 90℃에서 60분간 가열하였다. 상온으로 냉각한 후, 포화된 부탄올 용액 5 ml을 첨가하였다. 혼합 후 3000 rpm으로 20분간 원심분리하고 상부의 부탄올 층의 흡광도를 분광광도계를 이용하여 532 nm에서 측정하였다. 항산화능의 정도는 순수한 물을 사용한 대조군의 흡광 강도를 기준으로 백분율로 표시하였다.

도 3 에서 나타난 바와 같이, 반응계에 30％에서 1％까지의 실시예 1에서 제조된 무혈청 간엽줄기세포 배양액이 존재할 경우, 정제수를 사용한 대조군에 비하여, 유의적인 지질과산화 보호 효과 즉 항산화능이 존재함을 알 수 있었다. 정제수를 사용한 대조군에 비하여 30％ 농도로 무혈청 간엽줄기세포 배양액이 함유된 실험군의 경우, 47 ± 2.9％의 지질과산화 억제를, 20％, 10％, 그리고 1％ 함유시 각각 26 ± 3.6％, 7.8 ± 2.4％, 그리고 1.9 ± 1.3％ 지질과산화 억제 효과를 보였다.

실험예 4: 성장인자 특성 분석

최근에 특히 간엽줄기세포의 다양한 생물학적 기능에 중요하다고 알려진 싸이토카인들을 전체 세포 수준에서 분석할 수 있는 법이 개발되고 있다. 이에 간엽줄기세포의 배양 배지에 존재하는 다양한 종류의 성장인자들과 싸이토카인의 종류를 특징화하고, 실시예 1에서 제조한 무혈청 간엽세포 배양액의 제조법의 완성도를 검증하기 위하여, RayBio Human Cytokine Antibody Array를 사용하여 혈청이 첨가된 배지에서 증식시킨 간엽줄기세포의 배양배지와 무혈청적으로 유도된 간엽줄기세포의 배양배지 내 성장인자와 싸이토카인의 특성을 분석하였다.

4종류의 배양액 2 ml씩을 사용하였다 (A: 10％ FBS 함유 배양배지로 간엽줄기세포를 배양한 배지, B: FBS를 함유하지 않는 배양법으로 배양된 간엽줄기세포 배양배지, C: A의 대조군으로 10％ FBS를 함유하는 배지, 그리고 D: B의 대조군으로 FBS를 함유하지 않는 배지). 시험에 사용할 cytokine array membrane를 공급된 tray에 넣고 1X blocking buffer 2 ml 씩을 첨가하여 상온에서 30분간 배양 하였다. 배양이 끝난 후, 상등액을 버리고, 1X Washing buffer Ⅰ을 2 ml을 첨가하고 상온에서 5분간 흔들면서 씻어 주었다. 이러한 washing을 총 3회 반복하였다. 마지막 wahsing이 끝난 후, 상등액을 버리고, 1X Washing buffer Ⅱ를 2 ml을 첨가하고 상온에서 5분간 흔들면서 씻어주었다. 이러한 washing을 총 2회 반복 하였다. 100 ul의 1X blocking buffer를 Biotin-Conjugated nti-Cytokines antibody tube에 넣 고 잘 현탁하였다 (1개의 tube는 2개의 membrane에 사용된다). 이 100 ul의 현탁액을 2 ml의 1X blocking buffer에 잘 섞어준 후 이 primary antibody solution을 각각의 membrane에 1 ml 씩 첨가하고 상온에서 2시간 잘 흔들면서 배양 하였다. 배양이 끝난 후, 상등액을 버리고, 1X Washing buffer Ⅰ을 2 ml을 첨가하고 상온에서 5분간 흔들면서 씻어 주었다. 이러한 washing을 총 3회 반복한다. 이후 상등액을 버리고, 1X Washing buffer Ⅱ를 2 ml을 첨가하고 상온에서 5분간 흔들면서 씻어준다. 이러한 washing을 총 2회 반복한다. 상등액을 제거하고 1000배 희석한 HRP-conjugated streptavidin 2 ml을 각 membrane에 첨가해 준다. 이 용액은 2 ul의 HRP-conjugated streptavidin을 2 ml의 1X blocking buffer에 섞어 만들었다. 이를 상온에서 2시간 배양한 후, 상등액을 버리고, 1X Washing buffer Ⅰ을 2 ml을 첨가하고 상온에서 5분간 흔들면서 씻어준다. 이러한 washing을 총 3회 반복한다. 이를 마치고 상등액을 버리고, 1X Washing buffer Ⅱ를 2 ml을 첨가하고 상온에서 5분간 흔들면서 씻어준다. 이러한 washing을 총 2회 반복한다. 다음으로 핀셋으로 한쪽 끝을 집어 과도한 buffer를 제거하고 부드러운 투명 필름 사이에 놓는다. Deteciton buffer C와 D 0.25 ml 씩을 섞어 얻어지는 0.5 ml을 하나의 membrane 발색에 사용하였다. 적절한 X-ray 감광용 film을 사용하여 감광 반응시키고, developer와 fixer를 이용하여 신호를 얻어 비교 분석하였다.

동일한 시험법으로 25mJ의 UVB 조사된 각질형성세포의 배양액을 사용하여 획득된 기능성이 강화된 무혈청 간엽줄기세포 배양액의 변화된 특성을 분석하기 위하여 보통의 무혈청 간엽줄기세포 배양액과 기능성이 강화된 배양액을 antibody array 분석법으로 비교 하였다.

그 결과, 인간 간엽줄기세포의 배양액에서 다양한 성장인자들과 싸이토카인의 발현이 확인되었다(도 4). 특히 10％ FBS (우태아혈청)가 함유된 배지에서 증식시킨 인간 간엽줄기세포를 통해 획득된 배양액의 성장인자 및 싸이토카인의 profile(도4, A)과 상기 실시예 1에서의 무혈청 배양시스템을 이용하여 확보된 간엽줄기세포배양액의 성장인자 및 싸이토카인의 profile (도 4, B)가 매우 유사함을 확인하였다. 10％ FBS가 함유된 배양배지 대조군 (도 4, C) 및 무혈청 배양배지 대조군(도 4, D)과 비교 분석한 결과, 간엽줄기세포 배양액에는 IL-6(interleukin-6, 2H), IL-8(interleukin-8, 2J), MCP-1(monocyte chemoattractant protein-1, 3E), IGFBP-4(insulin-like growth factor binding protein-4, 7B), Osteoprotegerin(8B), PARC(plumonary and activation-regulated cytokine, 8C), TIMP-2(tissue inhibitor of metalloproteinase-2, 8H) 등이 높은 함량 포함되어 있는 것으로 확인되었다. 즉, 본 발명에 따른 실시예 1의 무혈청 간엽줄기세포 배양액은 상대적으로 높은 IL-6, MCP-1, PARC, TIMP-2 발현량을 나타내는 것을 특징으로 한다.

동일한 시험법으로 25mJ의 UVB 조사된 각질형성세포의 배양액을 사용하여 획득된, 실시예 1에 따라 최종적으로 글루코스, 글루타민이 첨가되어 배양된 무혈청 간엽줄기세포 배양액의 변화된 특성을 분석하기 위하여 보통의 무혈청 간엽줄기세포 배양액과 기능성이 강화된 배양액을 antibody array 분석법으로 비교하였다 (도 5). 분석 후 상대적인 발현 정도를 비교한 결과, 7개 모든 성장인자에서 발현정도 가 증가되었으며 osteoprotegerin은 690 ± 58 ％로 가장 크게 증가되었다.

실험예 5: 인간피부각질형성세포 HaCaT 증식 촉진 효과 시험

본 발명에 따른 인간 간엽줄기세포 배양액의 인간 피부각질형성세포(keratinocyte) 세포주인 HaCaT cell line에 대하여 생육 혹은 증식 촉진능을 검사하기 위해 MTT 시험법이 사용되었다.

이를 위해 대조군으로 FBS(우태아혈청)를 함유하지 않으나 100mM glucose와 50mM glutamine이 추가된 DMEM 배지를 사용하였고, 이것의 증식 촉진능을 기준으로, 10％ FBS(우태아혈청)를 함유하는 간엽줄기세포 배양액, FBS를 함유하지 않는 무혈청 간엽줄기세포 배양액, 그리고 실시예 1에 따라 글루타민, 글루코스가 첨가되어 배양된 기능성이 강화된 무혈청 간엽줄기세포 배양액의 증식 촉진능을 비교 시험 하였다. 이를 위해 인간 각질형성 세포주 HaCaT 세포를 24 well plate에 5 × 10³ cells/well 씩 동일하게 heamacytometer를 이용하여 계수한 후 분주하였다. 10％ FBS를 함유하는 DMEM에서 48시간 배양하여 배양용기 표면적의 25 ～ 30％만큼 배양되면, 위에서 설명한 줄기세포 및 대조군 배양액들로 교체하고 48 시간 더 배양하였다. 배양 후 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT, Sigma M5655, USA) 용액 (2.5 mg/ml)을 50 ㎕ 첨가하고 3시간 추가로 배양하였다. 그 후, 세포 배양액을 전부 버리고, 200 ㎕의 dimethyl sulfoxide (DMSO, Sigma D2650, USA)를 각 well 당 200㎕ 처리하여 교반한 후, 100 ㎕ 씩을 96 well로 취하여 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)로 570 nm에서 흡광 도를 측정하였다. 세포 증식을 촉진하는 정도는 순수한 물을 사용한 대조군의 흡광 강도를 기준으로 백분율로 표시하였다.

그 결과, 간엽줄기세포를 10％ FBS (우태아혈청)가 함유된 배지에서 증식시켜 획득한 세포배양배지는 인간 각질형성세포 HaCaT cell line의 증식을 동일한 세포가 FBS (우태아혈청)를 함유하지 않는 DMEM 배지에서 성장할 때를 기준으로 하여 약 183±32％의 증식 촉진효과를 그리고 무혈청배지 조건에서 확보된 인간 간엽줄기세포 배양액은 172±22％ 정도의 증식 촉진 효과를 확인할 수 있었다. 비록 10％ FBS (우태아혈청)를 제거한 배양배지를 사용하여 획득한 줄기세포배양액이 약간 감소된 증식촉진 효과를 보였으나, 이 차이는 통계적으로 유의적이지 않았다. 특히 기능성이 강화된, 실시예 1에 따라 최종적으로 얻어진 무혈청 간엽줄기세포 배양액은 대조군 및 일반 줄기세포 배양액 대비 268.5 ± 25 ％라는 매우 높은 증식효과를 보였다(도 6).

실험예 6: 피부안전성 시험

실시예 1에서 제조된 무혈청 간엽줄기세포 배양액의 피부자극 정도를 측정하기 위해 11명의 피험자들을 대상으로 patch test를 실시하였다.

본 배양액 및 대조군을 100㎕ 함유하는 patch를 피험자의 팔 안쪽 깨끗한 부위에 부착하고 48시간 후에 흐르는 물로 씻어 낸 후 30분 후의 자극 정도를 판정하였다. 음성대조군은 순수한 물을 사용하였으며, 양성대조군은 5％의 SLS(Sodium Laureth Sulfate)를 사용하였다.

피부 반응의 평가는 자극 수치를 5단계로 나누어 판정한 결과, 실시예 1에서 제조된 무혈청 간엽줄기세포 배양액의 피부자극성은 4.5％(자극성판정 1)로 음성대조군에서 4.5％(자극성판정 1)과 동일하였으며, 양성대조군에서 38.6％(자극성판정 4)인 것에 비해 피부자극성이 거의 존재하지 않음을 확인하였다 (표 2).

[표 2] 실시예 1에서 제조된 기능성이 강화된 무혈청 간엽줄기세포 배양액의 피부안전성

* 피부자극 평균정도(％) :

* 자극성 판정 : 1(10이하, 최소자극), 2(10-20, 온화한 자극) 3(20-30, 보통자극), 4(30이상, 심한자극)

실험예 7: 피부 주름 개선 효과 시험

실시예 1에서 최종 얻어진 인간 간엽줄기세포의 무혈청 배양액의 피부 주름 개선효과를 확인하기 위하여 50세 이상의 건강한 성인 남녀 22명을 대상으로 14일간 기능성이 강화된 인간 간엽줄기세포의 무혈청 배양액과 세포 배양에 사용하지 않은 동일한 배양 배지를 1일 2회 1 ml씩 화장솜에 적셔 왼쪽과 오른쪽 손등의 특정 부위에 도포하는 방법으로 시험하였다. 14일간 도포 후 개선 효과는 손등 피부 모사판(skin replica)를 획득한 후 이를 화상 해석하는 방법으로 분석하였다. 주름깊이를 측정하여 매우 효과, 약간 효과, 무 효과, 주름 악화의 4단계로 수치화 하였다.

[표 3] 무혈청 간엽줄기세포 배양액의 피부 주름 개선효과

상기 표 3에서 나타난 바와 같이, 대조군으로 배양 배지를 처방한 경우 14일간 처방 후 시험군 22명 중에서 "매우 효과"는 없는 반면 "약간 효과"가 5명으로 22.7 ％에 해당하였다. 이러한 이유는 세포 배양 배지 성분이 그 자체로써 인간 피부 세포의 증식에 미약하나마 도움이 되었을 것으로 사료된다. 그러나 72.7％에 해당하는 16명에서는 주름 개선 효과가 나타나지 않았으며, 실험에 참가한 1명에게서는 주름이 깊어지는 악화가 나왔다. 상대적으로 간엽줄기세포의 유용성분을 함유하는 실시예 1에서 최종적으로 얻어진 기능성이 강화된 무혈청 간엽줄기세포 배양액 처방군에서는 22명 중 매우 큰 주름개선 효과가 8명(36.4％) 그리고 약간 효과가 12명(54.5％)로, 전체 중 효과가 있다고 판단된 사례가 무려 91％에 육박하여 이를 우수한 활성을 확인하였다.

도 1은 FBS(우태아혈청) 알부민의 웨스턴 블럿 결과를 나타낸 그림이다.

도 2는 실시예 1에서 제조한 무혈청 간엽줄기세포 배양액의 DPPH 자유라디컬 소거 항산화능 시험 결과를 나타낸 그래프이다.

도 3은 실시예 1에서 제조한 무혈청 간엽줄기세포 배양액의 ethyl linoleate 항산화능 시험 결과를 나타낸 그래프이다.

도 4는 실시예 1에서 제조한 인간간엽줄기세포 배양액에 존재하는 성장인자와 싸이토카인 특성을 나타낸 결과이다 (A: 10％ FBS 함유 배양배지(DMEM)를 사용하여 획득된 인간 골수 유래 간엽줄기세포를 배양액 , B: 무혈청 배양배지(FBS를 함유하지 않으면서 glucose와 glutamine 이 추가된 DMEM)를 사용하여 획득된 인간 골수 유래 간엽줄기세포를 배양액, C: A의 대조군으로써 10％ FBS 함유 배양배지(DMEM), D: B의 대조군으로써 무혈청 배양배지(FBS를 함유하지 않으면서 glucose와 glutamine 이 추가된 DMEM)).

도 5는 실시예 1에서 제조한 보통의 무혈청 간엽줄기세포 배양액과 UVB-조사 각질형성세포 배양액의 전처리를 통하여 기능성이 강화된 무혈청 간엽줄기세포의 배양액 간 증가된 성장인자 특성을 비교한 그래프이다 (무혈청간엽줄기세포배양액(A): UVB-조사된 각질형성세포 배양액의 전처리가 없는 보통의 무혈청 간엽줄기세포 배양액, 기능성이 강화된 간엽줄기세포 배양액(B): UVB-조사 각질형성세포 배양액의 전처리를 통하여 기능성이 강화된 무혈청 간엽줄기세포의 배양액)

도 6은 실시예 1에서 제조한 간엽줄기세포 배양액의 피부세포 증식 촉진능을 나타낸 그래프이다 (A: 10％ FBS 함유 배양배지(DMEM) 대조군, B: 10％ FBS 함유 배양배지(DMEM)를 사용하여 획득된 인간 골수 유래 간엽줄기세포를 배양액의 촉진능, C: 무혈청 배양배지(FBS를 함유하지 않으면서 glucose와 glutamine 이 추가된 DMEM)를 사용하여 획득된 인간 골수 유래 간엽줄기세포를 배양액의 촉진능 D: 무혈청 배양배지(FBS를 함유하지 않으면서 glucose와 glutamine 이 추가된 DMEM)를 사용하고 UVB-조사 각질형성세포 배양액의 전처리를 통하여 기능성이 강화된 인간 골수 유래 간엽줄기세포를 배양액의 촉진능.)

Claims

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다음 단계를 포함하는, 포유동물 골수 또는 제대혈 유래 간엽줄기세포의 무혈청 배양액의 제조방법:

(a) 분리된 골수 또는 제대혈 유래 간엽줄기세포를 혈청 함유 배지에서 배양하는 단계;

(b) 상기 배양된 간엽줄기세포를 UVB 조사된 피부각질형성 세포의 배양액으로 처리하는 단계; 및

(c) 상기 처리된 간엽줄기세포를 무혈청 배지에서 배양한 다음, 배양액을 회수하는 단계.
제6항에 있어서, 상기 (c) 단계에서, 무혈청 배지는 글루코스 및 글루타민이 각각 80～150mM 및 20～60mM의 농도로 함유되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제6항 또는 제7항의 방법을 포함하는 것을 특징으로 하는, 포유동물 골수 또 는 제대혈 유래 간엽줄기세포의 무혈청 배양액을 함유한 피부주름 개선용 화장료 조성물의 제조방법.
골수 또는 제대혈 유래 간엽줄기세포로부터 인간 성장인자를 대량으로 생산하는 방법:

(a) 분리된 골수 또는 제대혈 유래 간엽줄기세포를 혈청 함유 배지에서 배양하는 단계;

(b) 상기 배양된 간엽줄기세포를 UVB 조사된 피부각질형성 세포의 배양액으로 처리하는 단계; 및

(c) 상기 처리된 간엽줄기세포를 무혈청 배지에서 배양한 다음, 배양액을 회수하여 인간 성장인자를 수득하는 단계.
제9항에 있어서, 상기 (c) 단계에서, 무혈청 배지는 글루코스 및 글루타민이 각각 80～150mM 및 20～60mM의 농도로 함유되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제9항에 있어서, 상기 인간 성장인자는 IL-6, IL-8, MCP-1, IGFBP-4, PARC, Osteoprotegerin 및 TIMP-2로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.