TWI611815B - 幹細胞條件培養基抑制黑色素生成達到皮膚美白之用途 - Google Patents
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Abstract
本發明係有關於一種幹細胞條件培養基抑制黑色素生成達到皮膚美白之用途，其係先將間葉幹細胞生長於含有完全培養基(complete growth medium)的細胞培養皿中，再將間葉幹細胞繼代培養於基礎培養基(basal medium)三代後收集而得條件培養基；藉此，含有2.5wt.%以上條件培養基的化妝品可有效降低酪胺酸酶活性及減少黑色素生成，而達到皮膚美白淡斑的效果。
Description
本發明係有關於一種幹細胞條件培養基抑制黑色素生成達到皮膚美白之用途，尤其係指一種人類Wharton’s Jelly間葉幹細胞之條件培養基，其可用以降低酪胺酸酶活性以及減少黑色素生成，用以改善使用者皮膚狀況而達到皮膚美白淡斑之功效。
按，人體皮膚係與外界環境接觸的第一層防護，因此最容易受到外界的刺激與紫外線傷害，為了保護皮膚免於紫外線傷害，皮膚中的黑色素細胞(melanocytes)會合成黑色素(melanin)以防禦抵抗陽光中的紫外線。黑色素是一種生物色素，係酪胺酸(tyrosine)經過一連串化學反應所形成。在黑色素細胞內，酪胺酸由酪胺酸酶(tyrosinase)催化後生成多巴(dopa)，多巴脫氫後形成多巴醌(dopaquinone)，再經由TRP-1及TRP-2等蛋白作用，最後產生黑色素(eu-melanin)。再者，當皮膚暴露於紫外線下，產生少量的自由基，亦會活化訊息傳遞路徑，刺激酪胺酸酶的轉錄作用，造成黑色素生合成增加，導致皮膚產生黑斑。若沒有及時保養肌膚，不斷增加的斑點不僅會影響美觀，亦容易使膚色看起來較為暗沉、缺乏精神。
目前已被確認具有美白功效的成分包括熊果素(arbutin)、杜鵑花酸(acelaic acid)、麴酸(kojic acid)和對苯二酚(hydroquinone)
等，但在使用上各有其限制或副作用，例如麴酸可能會導致肝癌的產生，對苯二酚性質較不穩定，對於黑色素細胞具毒性。再者，有些美白劑塗抹於皮膚上也可能會導致使用者過敏、發紅與不適感；因此，如何研發出一個安全且有效的美白成分，便成為相關領域發明人所思及之方向。
幹細胞研究近年來在國際間蔚為風潮，其主要可分為胚胎、成體幹細胞兩大類，其中間葉幹細胞(Mesenchymal Stem Cell,MSC)係屬於成體幹細胞，具有強大的分化能力，除了可分化為人體骨骼等源自中胚層的細胞組織，還可以分化成內胚層的肝臟、胰臟等內臟細胞，以及源自外胚層的神經細胞等。間葉幹細胞雖廣泛存在於成人體內，可以由骨髓及多種器官中分離出來，但由於各部位所含的間葉幹細胞數目不多，而且成人體內的間葉幹細胞，會隨著年齡的增加而逐漸減少，故如何取得足量之間葉幹細胞勢必非常重要。骨髓間葉幹細胞主要係來自成人的骨髓，然，侵入性的取得方式會造成捐獻者有疼痛不舒服的感覺；而臍帶中含有數量豐富、年輕的間葉幹細胞，且取得方便、具較強分化潛力，因此可作為間葉幹細胞的重要來源。另，亦有研究指出，脂肪幹細胞之條件培養基(adipose-derived stem cells-conditioned medium，ADSC-CM)具有抑制黑色素瘤細胞B16黑色素生成之能力(Biol.Pharm.Bull.31(4)606-610,2008)，此條件培養基可以透過抑制黑色素生成相關蛋白(如酪胺酸酶及TRP-1)的表現，明顯地達到美白效果。
今，發明人即是鑑於上述現有促進美白之產品於實際實施使用時仍具有多處缺失，於是乃一本孜孜不倦之精神，並藉由其豐富專業知識及多年之實務經驗所輔佐，而加以改善，並據此研創出本發明。
本發明主要目的為提供一種幹細胞條件培養基抑制黑色素生成
達到皮膚美白之用途，其係為人類Wharton’s Jelly間葉幹細胞之條件培養基，其可用以降低酪胺酸酶活性以及減少黑色素生成，藉此，若將此幹細胞條件培養基運用於化妝材料組成物中，可用以改善使用者皮膚狀況而達到皮膚美白淡斑之功效。
為了達到上述實施目的，本發明一種幹細胞條件培養基抑制黑色素生成達到皮膚美白之用途，此條件培養基係先將幹細胞生長於含有完全培養基的細胞培養皿中，完全培養基係包含有α-MEM、胎牛血清以及人類鹼性成纖維細胞生長因子，並且條件培養基係於幹細胞繼代培養於基礎培養基(basal medium)之後收集而得，基礎培養基僅包含有α-MEM以及人類鹼性成纖維細胞生長因子(不含胎牛血清)。條件培養基係於幹細胞繼代培養至少三代後收集而得。
本發明亦提供一種幹細胞條件培養基於減少黑色素生成之用途，其係施予一重量百分濃度為2.5%~50%之條件培養基於皮膚，以降低酪胺酸酶活性以及減少黑色素生成。
於本發明之一實施例中，幹細胞係為間葉幹細胞，最佳係為來自人類臍帶之Wharton’s Jelly間葉幹細胞。
於本發明之一實施例中，完全培養基若以100%的組成成份總重量百分比計算，係包含有10-20%的胎牛血清、2-6ng/ml的人類鹼性成纖維細胞生長因子，以及剩餘重量百分比的Minimum Essential Medium Alpha(α-MEM)；其中，幹細胞最佳係繼代培養三代。
於本發明之一實施例中，基礎培養基若以100%的組成成份總重量百分比計算，係包含有2-6ng/ml的人類鹼性成纖維細胞生長因子，以及剩餘重量百分比的α-MEM；其中，幹細胞最佳係繼代培養三代。
於本發明之一實施例中，可例如施予一重量百分濃度為2.5%-10%之條件培養基於皮膚至少七天以上，以降低酪胺酸酶活性以及減少黑色素生成。
第一圖-A：幹細胞條件培養基影響黑色素含量之示意圖。
第一圖-B：幹細胞條件培養基可有效地抑制黑色素生成。
第二圖-A：低濃度長時效的幹細胞條件培養基影響黑色素含量之示意圖。
第二圖-B：低濃度長時效的幹細胞條件培養基可有效地抑制黑色素的生成。
第三圖-A：幹細胞條件培養基影響酪胺酸酶表現之示意圖。
第三圖-B：幹細胞條件培養基可有效地降低酪胺酸酶表現。
第四圖：幹細胞條件培養基美白機制示意圖。
本發明之目的及其結構功能上的優點，將依據以下圖面所示之結構，配合具體實施例予以說明，俾使審查委員能對本發明有更深入且具體之瞭解。
本發明一種幹細胞條件培養基抑制黑色素生成達到皮膚美白之用途，其中條件培養基係先將幹細胞生長於含有完全培養基(complete growth medium)的細胞培養皿中；完全培養基以100%的組成成份總重量百分比計算，可包含有10-20%(最佳係為20%)的胎牛血清(Fetal bovine serum)、2-6ng/ml(最佳係為4ng/ml)的人類鹼性成纖維細胞生長因子(human-basic fibroblast growth factor)，以及剩餘重量百分比的α-MEM；再者，條件培養基係於上述幹細胞繼代培養於基礎培養基(basal medium)至少三代後收集而得，最佳係為培養三代；基礎培養基以100%的組成成份總重量百分比計算，可包含有2-6ng/ml(最佳係為4ng/ml)的人類鹼性成纖維細胞生長因子，以及剩餘重量百分比的α-MEM，但不包含胎牛血清。幹細胞係間葉幹細胞(mesenchymal stem cell)，最佳可為人類Wharton’s Jelly間葉幹細胞。
再者，本發明一種幹細胞條件培養基於減少黑色素生成之用途，其係施予一重量百分濃度為2.5%~50%之條件培養基於皮膚，可例如施予一重量百分濃度為2.5%-10%之條件培養基於皮膚至少七天以上，以降低酪胺酸酶活性以及減少黑色素生成，其中條件培養基係先將幹細胞生長於含有完全培養基的細胞培養皿中，完全培養基係包含有α-MEM、胎牛血清以及人類鹼性成纖維細胞生長因子，再者，條件培養基係於上述幹細胞繼代培養於基礎培養基至少三代後收集而得，最佳係為培養三代；基礎培養基以100%的組成成份總重量百分比計算，可包含有2-6ng/ml(最佳係為4ng/ml)的人類鹼性成纖維細胞生長因子，以及剩餘重量百分比的α-MEM。
此外，藉由下述具體實施例，可進一步證明本發明可實際應用之範圍，但不意欲以任何形式限制本發明之範圍。
實驗一：幹細胞條件培養基於黑色素生成之影響
〈細胞培養〉
首先，將人類包皮纖維母細胞(Hs68：BCRC 603800)培養於含有完全培養基(complete growth medium)的細胞培養皿中(BD Falcon/BD biosciences)，完全培養基含有DMEM(Gibco)外加10% Fetal bovine serum(FBS)(Gibco)；而人類Wharton’s Jelly間葉幹細胞(WJMSC：BCRC H-WJ001)培養於內含有完全培養基(complete growth medium)的細胞培養皿中(BD Falcon/BD biosciences)，此完全培養基含有α-MEM(Gibco)，外加20%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)(Gibco)以及4ng/ml人類鹼性成纖維細胞生長因子(human-basic fibroblast growth factor，bFGF)(Peprotech)。將上述兩種細胞培養於溫度37℃且內含有5%二氧化碳的細胞培養箱中。細胞培養3天之後進行繼代培養(subculture)。
繼代培養的步驟如下：先將原本的細胞培養基去除，之後利用phosphate buffered saline(PBS)(Roche)潤濕貼附的細胞，移除上清液再
利用0.05% Trypsin-EDTA(Life Technologies)於細胞培養箱作用5分鐘，將細胞從培養皿上面移下來。之後加入培養基將細胞打散，以1,200rpm的轉速離心3分鐘，移除上清液，剩餘的細胞團塊(pellet)用培養基打散，並培養在5% CO2、37℃的細胞培養箱內。繼代培養至第3代後，開始收集細胞條件培養基。
〈細胞條件培養基〉
人類Wharton’s Jelly間葉幹細胞以每5 X 104cells/cm2的密度種於細胞培養皿中，細胞培養1天之後利用PBS處理貼附的細胞三次，加入基礎培養基(只含α-MEM以及4ng/ml人類鹼性成纖維細胞生長因子)，經過48小時之後，用50ml離心管收集培養基，以2,000rpm的轉速離心10分鐘，將上清液用0.22μm濾杯(BD Falcon/BD biosciences)過濾，即可以得到間葉幹細胞條件培養基。此培養基可放於-20℃冰箱中保存。
〈黑色素濃度觀察〉
纖維母細胞以每2 X 104cells/cm2的密度種於細胞培養皿中培養一天，將原本的培養基去除，再加入只含DMEM之基礎培養基(basal medium)、黑色素瘤細胞條件培養基、幹細胞條件培養基(0%、2%、5%、10%、50%及100%)，經過48小時之後，利用PBS處理貼附的細胞，再利用0.05% Trypsin-EDTA(Life Technologies)於細胞培養箱作用5分鐘，將細胞從培養皿上面移下來，以1,200rpm的轉速離心3分鐘。移除上清液，剩餘的細胞團塊(pellet)用PBS打散，再次1,200rpm的轉速離心3分鐘，拍照觀察細胞團塊的顏色。
〈黑色素濃度測定〉
黑色素瘤細胞B16以每2 X 104cells/cm2的密度種於細胞培養皿中培養一天，將原本的培養基去除，加入只含DMEM之基礎培養基(basal medium)、黑色素瘤細胞完全培養基、幹細胞完全培養基(0%、
2%、5%、10%、50%及100%)，經過48小時之後，利用PBS處理貼附的細胞，加入100μl的1N NaOH內含有50%DMSO於60℃作用，之後用多功能微量盤分析儀470nm的波長分析黑色素的含量。
實驗二：低濃度、長時效之幹細胞條件培養基於黑色素生成之影響
〈黑色素濃度觀察〉
纖維母細胞以每2 X 104cells/cm2的密度種於細胞培養皿中培養一天，將原本的培養基去除，再加入只含DMEM之基礎培養基(basal medium)、黑色素瘤細胞完全培養基、幹細胞完全培養基(0%、0.625%、1.25%、2.5%、5%及10%)，經過7天之後，利用PBS處理貼附的細胞，再利用0.05% Trypsin-EDTA(Life Technologies)於細胞培養箱作用5分鐘，將細胞從培養皿上面移下來，以1,200rpm的轉速離心3分鐘。移除上清液，剩餘的細胞團塊(pellet)用PBS打散，再次1,200rpm的轉速離心3分鐘，拍照觀察細胞團塊的顏色。
〈黑色素濃度測定〉
黑色素瘤細胞B16以每2 X 104cells/cm2的密度種於細胞培養皿中培養一天，將原本的培養基去除，加入只含DMEM之基礎培養基(basal medium)、黑色素瘤細胞完全培養基、幹細胞完全培養基(0%、0.625%、1.25%、2.5%、5%及10%)，經過7天之後，利用PBS處理貼附的細胞，加入100μl的1N NaOH內含有50%DMSO於60℃作用，之後用多功能微量盤分析儀470nm的波長分析黑色素的含量。
實驗三：幹細胞條件培養基於酪胺酸酶生成之影響
黑色素瘤細胞B16以每2 X 104cells/cm2的密度種於細胞培養皿中，加入只含DMEM之基礎培養基(basal medium)、黑色素瘤細胞完全培養基、幹細胞完全培養基(0%、5%、10%及50%)，經過48小時之後，利用PBS處理貼附的細胞，加入適量RIPA[50mM Tris-HCl,pH7.4,1%
NP-40,0.25% deoxycholic acid,0.15M NaCl,1mM EDTA,1mM PMSF/NaF/sodium ortho-vanadate and protease inhibitors cocktail(Roche)]溶液，之後用刮杓(scraper)將細胞蒐集至1.5ml離心管，並放置在冰上作用30-60分鐘，以1,2000rpm轉速離心30分鐘，保留上清液。採用Bio-Rad蛋白質濃度測定法檢測細胞萃取液蛋白質濃度。利用分光光度計吸光值595nm的測定後，取20μg的蛋白質進行後續的實驗。蛋白質於95℃煮沸5分鐘後，利用10% SDS-PAGE將不同分子量的蛋白質分離，再將蛋白質從SDS-PAGE轉漬到polyvinyl difluoride(PVDF(Pall))膜上。之後將膜浸泡於5%脫脂牛奶於室溫進行阻斷作用(blocking)1小時，阻斷溶液(blocking solution)係含有5%脫脂牛奶(skim milk)及0.1% Tween-20的PBS溶液；再加入1° Antibody(抗體)於室溫反應1小時。
使用的1°抗體如下：酪胺酸酶(1：1000)、β-actin(1：10000)。接著使用PBST(PBS外加0.1% Tween-20)清洗5分鐘3次，之後再加入合適物種並且上面帶有horseradish peroxidase(HRP)的2°抗體(Chemicon，1：5000)於室溫反應60分鐘。接著使用PBST(PBS，0.1% Tween-20)清洗5分鐘3次。最後加入ECL試劑(enhanced chemiluminescence，Perkin-Elmer)於室溫中作用2分鐘，再用X-ray感光。用AlphaEaseFC軟體(Alpha Innotech Corporation)進行量化分析。
結果
結果一：幹細胞條件培養基可有效地抑制黑色素生成
請參閱第一圖-A，纖維母細胞株(Hs68)分別經過基礎培養基(控制組，control)或2%-100%幹細胞條件培養基培養(CM)培養兩天之後，利用trypsin將細胞收集到15ml離心管並觀察黑色素細胞中的黑色素生成情形。細胞經過10%以上的幹細胞條件培養基處理之後，明顯抑制黑色素的形成。請再參閱第一圖-B，經過student t-test分析得知，相較於控制組，細胞在10%幹細胞條件培養基(WJMSC-CM)處理後可以抑制
38.6%±5.7%的黑色素生成；在50%以上的幹細胞條件培養基處理後可以抑制90%以上的黑色素形成。此實驗至少進行三重複，且圖中的標示為平均值(mean)±平均值標準誤差(SEM)。**P<0.01；*** P<0.005。
由此結果可知，本發明之幹細胞條件培養基在短時效(48小時)的實驗中僅需要10%以上，即可以有效抑制黑色素，相較於前案(Biol.Pharm.Bull.31(4)606-610,2008)利用脂肪幹細胞條件培養基需要到50%才能看到明顯的效果。因此，Wharton’s jelly間葉幹細胞的條件培養基比脂肪條件培養基更有效的抑制黑色素生成。
結果二：低濃度、長時效的幹細胞條件培養基處理可有效地抑制黑色素的生成
請再參閱第二圖-A，幹細胞株(WJMSC)分別經過基礎培養基(控制組，control)或0.625%-10%幹細胞條件培養基培養(CM)培養七天之後，利用trypsin將細胞收集到15ml離心管並觀察黑色素細胞中的黑色素(melanin)生成情形。細胞只需要低濃度(2.5%以上)的幹細胞條件培養基處理7天之後，就可明顯抑制黑色素的形成。請再參閱第二圖-B，經過student t-test分析得知，細胞在2.5%幹細胞條件培養基(WJMSC-CM)處理後可以抑制18.2%±3.6%的黑色素生成；在5%的幹細胞條件培養基處理後可以抑制34.5%±3.9%以上的黑色素形成。在10%的幹細胞條件培養基處理後可以抑制89.3%±1.8%以上的黑色素形成。此實驗至少進行三重複，且圖中的標示為平均值(mean)±平均值標準誤差(SEM)。
*P<0.05；**P<0.01；*** P<0.005。
結果三：幹細胞條件培養基可有效地降低酪胺酸酶表現
請再參閱第三圖-A，幹細胞株(WJMSC)分別經過基礎培養基(控制組，control)或0%-50%幹細胞條件培養基培養(WJMSC-CM)培養兩天之後，利用trypsin將細胞收集到15ml離心管並觀察黑色素細胞中的酪胺酸酶表現情形。細胞經過10%以上的幹細胞條件培養基處理之後，明
顯抑制酪胺酸酶的表現。請再參閱第三圖-B，經過student t-test分析得知，細胞在10%幹細胞條件培養基處理後可以抑制22.75%±6.0%的酪胺酸酶表現；在50%以上的幹細胞條件培養基處理後可以抑制40.39%±5.6%以上的酪胺酸酶表現。此實驗至少進行三重複，且圖中的標示為平均值(mean)±平均值標準誤差(SEM)。**P<0.01；*** P<0.005。
綜上所述，請參閱第四圖，為本發明幹細胞條件培養基美白機制示意圖，根據實驗結果發現，人類Wharton’s Jelly間葉幹細胞(WJMSC)可分泌許多生長因子到培養基中，形成一幹細胞條件培養基(WJMSC-CM)；此幹細胞條件培養基培養可藉由抑制酪胺酸酶的表現，進而減少黑色素生成，最終達到美白的功效。藉此，本發明所述之幹細胞條件培養基可進一步運用、添加於化妝材料組成物中，用以改善使用者皮膚狀況而達到皮膚美白淡斑之功效。
由上述之實施說明可知，本發明與現有技術相較之下，本發明具有以下優點：
1.本發明之間葉幹細胞條件培養基，其內含有大量的生長因子(growth factors)可藉由抑制酪胺酸酶的表現，明顯地抑制黑色素生成而達到肌膚美白淡斑之功效，進而改善黑色素沉澱、黑斑形成等問題。
2.相較於前案利用脂肪幹細胞條件培養基需要到50%才能看到明顯的效果，本發明之幹細胞條件培養基在短時效(48小時)的實驗中僅需要10%以上，即可以有效抑制黑色素；因此，Wharton’s jelly間葉幹細胞的條件培養基比脂肪條件培養基更有效的抑制黑色素生成。
3.本發明之間葉幹細胞條件培養基僅需以低濃度2.5%-10%處理細胞七天，即可達到明顯抑制黑色素生成之效果，將此間葉幹細胞條件培養運用於美白劑成分，可大幅增加美白效率。
4.本發明所使用之臍帶Wharton’s jelly間葉幹細胞係取自嬰兒出生後不需要的臍帶，相較於取自骨髓，不會造成疼痛感，亦可避免倫理
道德的問題；並且，幹細胞於臍帶的含量較高，因此取得較容易。
5.骨髓間葉幹細胞屬於較晚期的細胞，可以分化的細胞種類比較少，並且容易受到捐獻者年齡的影響；而臍帶Wharton’s jelly間葉幹細胞屬於較早期的族群，可以分化的細胞種類比較多，其條件培養基具有較佳之蛋白因子，較能有效的減緩黑色素生成，使肌膚白皙無瑕。
綜上所述，本發明之幹細胞條件培養基抑制黑色素生成達到皮膚美白之用途，的確能藉由上述所揭露之實施例，達到所預期之使用功效，且本發明亦未曾公開於申請前，誠已完全符合專利法之規定與要求。爰依法提出發明專利之申請，懇請惠予審查，並賜准專利，則實感德便。
惟，上述所揭之圖示及說明，僅為本發明之較佳實施例，非為限定本發明之保護範圍；大凡熟悉該項技藝之人士，其所依本發明之特徵範疇，所作之其它等效變化或修飾，皆應視為不脫離本發明之設計範疇。
Claims (2)
- 一種幹細胞條件培養基用於製備抑制黑色素生成達到皮膚美白之組成物之用途，其中該組成物含有重量百分濃度為2.5%~50%之幹細胞條件培養基，且其中該幹細胞條件培養基係先將瓦頓氏凝膠(Wharton’s Jelly)間葉幹細胞生長於含有完全培養基(complete growth medium)的細胞培養皿中培養3天之後進行繼代培養，再將該瓦頓氏凝膠間葉幹細胞繼代培養於基礎培養基(basal medium)三代後，並經離心及過濾之後收集而得，所得之條件培養基不含幹細胞；該完全培養基係包含有α-MEM、胎牛血清(Fetal bovine serum)以及人類鹼性成纖維細胞生長因子(human-basic fibroblast growth factor)，該基礎培養基係包含有α-MEM以及人類鹼性成纖維細胞生長因子。
- 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該完全培養基以100%的組成成份總重量百分比計算，係包含有10-20%的胎牛血清、2-6ng/ml的人類鹼性成纖維細胞生長因子，以及剩餘重量百分比的α-MEM，且該基礎培養基以100%的組成成份總重量百分比計算，係包含有2-6ng/ml的人類鹼性成纖維細胞生長因子以及剩餘重量百分比的α-MEM。
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| 馮睿勛，移植人類臍帶間質幹細胞治療大白鼠皮膚創傷的可行性. 國立陽明大學碩士論文，國家圖書館紙本上架日2012/5/12 * |
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