CN103860444B

CN103860444B - 含有抑制黑色素生成的siRNA细胞培养物美白精华液

Info

Publication number: CN103860444B
Application number: CN201410073669.3A
Authority: CN
Inventors: 周萱
Original assignee: JIANGSU STEM CELL OSDBIO Co Ltd
Current assignee: JIANGSU STEM CELL OSDBIO Co Ltd
Priority date: 2014-03-03
Filing date: 2014-03-03
Publication date: 2017-11-21
Anticipated expiration: 2034-03-03
Also published as: CN103860444A

Abstract

本发明公开了一种含有抑制黑色素生成的siRNA细胞培养物美白精华液，该美白精华液由表皮细胞培养液制成，含有抑制酪氨酸酶(Tyr)表达的siRNA,阻断皮肤组织黑色素细胞中的黑色素形成。该siRNA通过脂质体包被，进入皮肤，发挥基因抑制作用。表皮细胞培养液中富含表皮细胞分泌的生长因子、氨基酸和维生素，又添加了含量明确的细胞生长因子，并添加了甘油和玻尿酸，使该美白精华液增加了保湿效果。制备该精华液的方法包括针对tyr基因设计合成siRNA、制成siRNA‑脂质体复合物、获取新生儿脐带组织表皮、收集细胞培养液、过滤、浓缩、添加活性成分。该美白精华液从分子层面上阻断了黑色素的生成，并为肌肤提供多种具有生理活性的内源性营养成分，并且具有保湿效果。

Description

含有抑制黑色素生成的siRNA细胞培养物美白精华液

技术领域

本发明涉及一种表皮细胞培养液制成的精华液，具体涉及一种抑制黑色素生成的siRNA的细胞培养物美白精华液。

背景技术

目前大多数美白化妆品中多含有双氧水、对苯二酚、汞、铅、酵素及香料等物质，对肌肤具有直接刺激性，还可能导致肌肤敏感、色素沉着、痤疮等，甚至致癌。而且由于此类化妆品中含有重金属，长期使用会引起重金属积聚，导致黑色素增多、沉着，甚至机体中毒。

市场上常见的精华液多为植物提取物，制作过程经过多次有机溶剂提取纯化，成品中含有有机溶剂残留较多，会对皮肤造成过敏性刺激，甚至脏器损伤，不适合所有人群使用。改良美容精华液的制作方法，找到一种无有机物残留、非化工合成的精华液制造方法，得到健康无副作用美容产品，是此技术的特色。

黑色素是广泛存在于人的皮肤、粘膜、视网膜、软脑膜及胆囊与卵巢等处。皮肤的黑色素细胞主要分布在表皮之基底层，也见于毛根及外毛鞘。人的表皮约有20亿个黑色素细胞，重约一克，平均每平方毫米1560个对称分布于全身。黑色素细胞能合成并分泌黑色素，因此是一种腺性细胞。然而黑色素的生物合成非常复杂，是通过色体（未成熟的黑色素）内酪氨酸—酪氨酸酶反应形成的。对小鼠的研究表明，超过127个基因影响毛色的形成过程。

酪氨酸酶（TYR），是一种含铜酶，来源于胚胎神经峭细胞，是黑素代谢和儿茶酚胺的关键酶，也是目前惟一已明确的黑色素代谢酶。酪氨酸酶具有多种特征性催化活性，既可以作为酪氨酸羟化酶、多巴氧化酶，又可以作为5, 6 -二羟基吲哚氧化酶，在黑色素生成过程中起着至关重要的作用。黑色素细胞产生的黑色素在酪氨酸酶的作用下，由酪氨酸酶转化为多巴，再经一系列复杂的生化过程而生成。酪氨酸酶活性高，即与酪氨酸作用其产物黑色素生成增多，表现于面部皮肤上产生各种黑斑。因此，抑制酪氨酸酶活性是有效减少黑色素生成的一种途径。而减少黑色素的生成，需要下调黑色素酶基因的表达。

目前，核糖核苷酸（RNA）干扰技术是基因调节的主要方法。该技术利用一段与目的基因同源的双链RNA分子，利用RNA沉默通路来抑制目的基因的表达。目前应用较广泛的RNA干扰手段是siRNA（small interfering RNA）。siRNA是一段合成的双链RNA分子，长度大约19nt，末端带有悬垂修饰，其反义链与目的基因mRNA互补。siRNA在RNA沉默通路中起中心作用，是对特定信使RNA进行降解的指导要素。

现阶段，基因药物常用脂质体进行包封，用于体内、体外制剂。脂质体是将药物包封于类脂双分子层形成的薄膜中间所制成的超微型球状载体制剂。脂质体进入体内主要被网状内皮细胞系统吞噬而释放药物，并改变被包封药物的体内分布，提高药物的治疗指数，减少药物的治疗剂量，能够降低药物毒副作用、提高生物利用度、并具有长效缓释作用。在研究的各种新型脂质体中，热敏脂质体（温度敏感脂质体）是一个很有发展前途的分支，它有效利用了脂质体和热疗的双重优势来提高治疗效果，降低毒副作用。体外用药的脂质体因皮肤温度比自身温度高，磷脂分子运动加强，脂质体膜的结构发生变化，原来排列整齐致密的胶晶态磷脂双分子层在较高温度下变成疏松混乱的液晶态。小单层脂质体(SUV)由于其高度弯曲的脂质双层张力较大，相变温度低。本发明将脂质体用于美容制品，既有利于药物与皮肤直接接触，在局部发挥药效，又可避免因吸收而产生的不良反应，同时有护肤、美容之功效。

本发明通过培养人表皮细胞，获得富含促进表皮细胞生长的各类生长因子的培养液，加入以上siRNA-脂质体复合物，制成的精华液。该精华液不同于植物提取物，无铅、汞、酒精、防腐剂、激素、香料等有害物质残留。本发明制成精华液，是生物技术领域衍生产品，利用人类表皮细胞培养液中的生物成分，与甘油、玻尿酸配伍，并且加入抑制黑色素产生的siRNA，制成具有生物活性的美容精华液，具有显著的护肤效果。该产品的生产方法脱离了化工生产工艺，具有很高的安全性，具有较好的推广和应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供抑制黑色素生成、纯天然的细胞培养物精华液，为了达到上述目的，本发明通过以下技术方案实现：

一种含有抑制黑色素生成的siRNA细胞培养物美白精华液，由以下组分组成：表皮细胞培养液浓缩液79.3%、抑制黑色素的siRNA-脂质体复合物0.5%、甘油20%和玻尿酸0.2%。

进一步的，所述的表皮干细胞培养浓缩液是表皮干细胞培养液按照5:1的比例浓缩制成。

进一步的，所述的抑制黑色素的siRNA-脂质体复合物是由低熔点阳离子脂质体（SUV）与siRNA产物在无菌生理盐水中按摩尔比1∶1混合均匀得到的。

进一步的，所述的siRNA为根据目的DNA序列设计的，长度为21nt，其序列为：

正义链：5’GUACAACAGCCAUCAGUCUUU

反义链：5’CUCAUGUUGUCGGUAGUCAGA。

进一步的，所述的目的DNA序列是从美国国家卫生研究院的NCBI标准数据库中选酪氨酸酶基因tyr片段序列。

一种含有抑制黑色素生成的siRNA的细胞培养物美白精华液的制备方法，其特征是由下述步骤组成：

步骤1）选定目的DNA序列：本发明以酪氨酸酶作为靶点，根据美国国家卫生研究院的NCBI标准数据库中选酪氨酸酶基因tyr片段序列为靶序列；

步骤2）设计并合成siRNA：根据tyr基因设计siRNA片段，并用化学合成法合成；

步骤3））制备siRNA-脂质体复合物：用低熔点阳离子脂质体(SUV)与步骤2）得到的siRNA产物在无菌生理盐水中按摩尔比1∶1混合均匀，制成siRNA-脂质体复合物；

步骤4）收集人表皮细胞培养液：采集获取新生儿脐带表皮细胞，原代培养3-5天，传代培养3-6代，收集培养液；

步骤5）原液过滤：收集的细胞培养液经过过滤系统，滤去细胞碎片及微生物；

步骤6）过滤液浓缩：过滤液置于超滤管中低温高速离心，得到的浓缩液置于4℃冰箱储存；

步骤7）制备精华液：向步骤6所述的浓缩液中加入步骤3所述的siRNA-脂质体复合物以及医用甘油和玻尿酸原液，混合均匀。

进一步的，所述的步骤1）中，目的DNA序列为：

ATGCTCCTGG CTGTTTTGTA CTGCCTGCTG TGGAGTTTCC AGACCTCCGC TGGCCATTTCCCTAGAGCCT GTGTCTCCTC TAAGAACCTG ATGGAGAAGG AATGCTGTCC ACCGTGGAGC GGGGACAGGAGTCCCTGTGG CCAGCTTTCA GGCAGAGGTT CCTGTCAGAA TATCCTTCTG TCCAATGCAC CACTTGGGCCTCAATTTCCC TTCACAGGGG TGGATGACCG GGAGTCGTGG CCTTCCGTCT TTTATAATAG GACCTGCCAGTGCTCTGGCA ACTTCATGGG ATTCAACTGT。

进一步的，所述的步骤3）中siRNA-脂质体复合物的浓度为20ug/ml。

进一步的，所述的步骤4）中原代培养基为NaHCO₃含量0.37%的高糖DMEM培养基，胎牛血清含量20%；传代培养基为NaHCO₃含量0.37%的高糖DMEM培养基，胎牛血清含量5%，消化细胞所用的消化液是不含EDTA的0.025%的胰酶，消化细胞的条件为37℃，CO₂浓度5%，3分钟；收集细胞培养液为细胞第3-6代的细胞培养液。

进一步的，所述的步骤5）中细胞培养液原液过滤系统为孔径0.22um的PES过滤系统。

进一步的，所述的步骤6）中细胞培养液过滤液浓缩系统为：Millipore 5K超滤管，温度4℃，离心力12000 g，离心2小时。

进一步的，所述的步骤7）中精华液的siRNA-脂质体复合物的终浓度为0.5%；医用甘油和玻尿酸原液的终浓度为20%和0.2%。

本发明相对于现有技术具有以下优点和效果：

1.本发明不同于其他美白产品，用siRNA下调酪氨酸酶的表达量，因而阻断了黑色素的合成，淡化色斑。由于不使用化学美白产品，避免了有害化学物质损伤细胞、重金属沉积等副作用。

2.本发明以低熔点脂质体（SUV）作为体外用药的载体，借助与低熔点脂质体可以在体温条件下改变结构，释放基因药物的特点，有效释放药物，达到高效美白的效果。

3.本发明采用细胞培养方法，得到含有多种表皮细胞因子的培养液，这些分泌的细胞因子都是人体成分，可以直接被皮肤吸收，避免过敏反应，无副作用。其中，每种细胞因子都具有各自不同作用：成纤维细胞生长因子能促进成纤维细胞有丝分裂、中胚层细胞的生长，还可刺激血管形成，在创伤愈合及肢体再生中发挥作用；表皮细胞生长因子能促进受损表皮的修复与再生，对烧伤、烫伤、光疗、等多种表皮创伤的修复的功效十分显著。

4.本发明富含细胞因子，因此不能使用高温及化学灭菌的方式。因此本发明利用过滤法去除微生物污染，既避免了产品出现污染变质问题，又保证生物活性成分不被高温、辐射或化学杀菌剂改变结果，保证了产品中细胞因子的活性，使产品效果稳定。

5.本发明加入了甘油和玻尿酸，在美白的同时增加了保湿效果，也增加了该液的浓稠度。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1为含有抑制黑色素生成的siRNA细胞培养物美白精华液生产流程图。

具体实施方式

下面将参考附图并结合实施例，来详细说明本发明。

参照图1所示，本实施例具体实施方式如下：

一种含有抑制黑色素生成的siRNA的细胞培养物美白精华液，由以下组分组成：表皮细胞培养液浓缩液79.3%、抑制黑色素的siRNA-脂质体复合物0.5%、甘油20%和玻尿酸0.2%。由下述步骤制备而成：

步骤1）选定目的DNA序列：本发明以酪氨酸酶作为靶点，根据美国国家卫生研究院的NCBI标准数据库中选酪氨酸酶基因tyr片段序列为靶序列；其中，目的DNA序列为：

ATGCTCCTGG CTGTTTTGTA CTGCCTGCTG TGGAGTTTCC AGACCTCCGC TGGCCATTTCCCTAGAGCCT GTGTCTCCTC TAAGAACCTG ATGGAGAAGG AATGCTGTCC ACCGTGGAGC GGGGACAGGAGTCCCTGTGG CCAGCTTTCA GGCAGAGGTT CCTGTCAGAA TATCCTTCTG TCCAATGCAC CACTTGGGCCTCAATTTCCC TTCACAGGGG TGGATGACCG GGAGTCGTGG CCTTCCGTCT TTTATAATAG GACCTGCCAGTGCTCTGGCA ACTTCATGGG ATTCAACTGT；

步骤2）设计并合成siRNA：根据tyr基因设计siRNA片段，并用化学合成法合成；设计的siRNA序列为：

正义链：5’GUACAACAGCCAUCAGUCUUU

反义链：5’CUCAUGUUGUCGGUAGUCAGA；

步骤3）制备siRNA-脂质体复合物：用商品化小单层脂质体(SUV)与步骤2）得到的siRNA产物，在生理盐水中按摩尔比1:1均匀混合，制成siRNA-脂质体复合物，siRNA-脂质体复合物的浓度为20ug/ml；

步骤4）收集人表皮细胞培养液：采集获取新生儿脐带表皮细胞，原代培养3-5天，传代培养3-6代，收集培养液；其中：原代培养基为NaHCO₃含量0.37%的高糖DMEM培养基，胎牛血清含量20%；传代培养基为NaHCO₃含量0.37%的高糖DMEM培养基，胎牛血清含量5%，消化细胞所用的消化液是不含EDTA的0.025%的胰酶，消化细胞的条件为37℃，CO₂浓度5%，3分钟；收集细胞培养液为细胞第3-6代的细胞培养液；

步骤5）原液过滤：收集的细胞培养液经过孔径0.22um的PES过滤系统，滤去细胞碎片及微生物；

步骤6）过滤液浓缩：过滤液置于超滤管中低温高速离心，浓缩系统为：Millipore5K超滤管，温度4℃，离心力12000 g，离心2小时；以5:1的比例浓缩；将得到的浓缩液置于4℃冰箱储存；

步骤7）制备精华液：向步骤6所述的浓缩液中加入步骤3所述的siRNA-脂质体复合物以及医用甘油和玻尿酸原液，混合均匀；其中：siRNA-脂质体复合物的终浓度为0.5%；甘油和玻尿酸原液的终浓度为20%和0.2%。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种含有抑制黑色素生成的siRNA细胞培养物美白精华液，其特征在于：由以下组分组

成：表皮细胞培养液浓缩液79.3%、抑制黑色素的siRNA-脂质体复合物0.5%、甘油20%和玻尿酸0.2%；其中，所述的抑制黑色素的siRNA-脂质体复合物是由低熔点阳离子脂质体SUV与siRNA产物在无菌生理盐水中按摩尔比1:1混合均匀得到的，其中，所述的siRNA为根据目的DNA序列设计的siRNA，长度为21nt，序列为：

正义链：5’GUACAACAGCCAUCAGUCUUU

反义链：5’CUCAUGUUGUCGGUAGUCAGA。

2.根据权利要求1所述的一种含有抑制黑色素生成的siRNA细胞培养物美白精华液，其特

征在于：所述的表皮细胞培养浓缩液是表皮细胞培养液按照5:1的体积比例浓缩制成。

3.根据权利要求1所述的一种含有抑制黑色素生成的siRNA细胞培养物美白精华液，其特

征在于：所述的siRNA的目的DNA序列是由美国国家卫生研究院的NCBI标准数据库中选酪氨酸酶基因tyr片段序列。

4.权利要求1所述的一种含有抑制黑色素生成的siRNA细胞培养物美白精华液的制备方法，

其特征在于：由下述步骤组成：

步骤1）选定目的DNA序列：以酪氨酸酶作为靶点，根据美国国家卫生研究所的NCBI标准数据库中选酪氨酸酶基因tyr片段序列为靶序列；

步骤2）设计并合成siRNA：根据tyr基因设计siRNA片段，并用化学合成法合成；

步骤3）制备siRNA-脂质体复合物：用低熔点阳离子脂质体SUV与步骤2）得到的siRNA产物，在生理盐水中按摩尔比1:1均匀混合，制成siRNA-脂质体复合物；

步骤7）加入甘油及玻尿酸：向步骤6）所述的浓缩液中加入步骤3）所述的siRNA-脂质体复合物以及医用甘油和玻尿酸原液，混合均匀，即制备完成精华液。

5.根据权利要求4所述的一种含有抑制黑色素生成siRNA的细胞培养物美白精华液的制备

方法，其特征在于：所述的步骤1）中，目的DNA序列为：

ATGCTCCTGG CTGTTTTGTA CTGCCTGCTG TGGAGTTTCC AGACCTCCGC

TGGCCATTTC CCTAGAGCCT GTGTCTCCTC TAAGAACCTG ATGGAGAAGG

AATGCTGTCC ACCGTGGAGC GGGGACAGGA GTCCCTGTGG CCAGCTTTCA

GGCAGAGGTT CCTGTCAGAA TATCCTTCTG TCCAATGCAC CACTTGGGCC

TCAATTTCCC TTCACAGGGG TGGATGACCG GGAGTCGTGG CCTTCCGTCT

TTTATAATAG GACCTGCCAG TGCTCTGGCA ACTTCATGGG ATTCAACTGT。

6.根据权利要求4所述的一种含有抑制黑色素生成的siRNA细胞培养物美白精华液的制备方法，其特征在于：所述的步骤3）中siRNA-脂质体复合物浓度为20ug/ml。

7.根据权利要求4所述的一种含有抑制黑色素生成的siRNA细胞培养物美白精华液的制备方法，其特征在于：所述的步骤4）中原代培养基为NaHCO₃的含量为0.37%的高糖DMEM培养基，胎牛血清含量20%；传代培养基为NaHCO₃的含量为0.37%的高糖DMEM培养基，胎牛血清含量5%，消化细胞所用的消化液是不含EDTA的0.025%的胰酶，消化细胞的条件为37℃，CO₂浓度5%，3分钟；收集的细胞培养液为细胞第3-6代的细胞培养液。

8.根据权利要求4所述的一种含有抑制黑色素生成的siRNA细胞培养物美白精华液的制备方法，其特征在于：所述的步骤5）中细胞培养液原液过滤系统为孔径0.22um的PES过滤系统。

9.根据权利要求4所述的一种含有抑制黑色素生成的siRNA细胞培养物美白精华液的制备方法，其特征在于：所述的步骤6）中细胞培养液过滤液浓缩系统为：Millipore 5K 超滤管，温度4℃，离心力12000 g，离心2小时。