KR20100089947A

KR20100089947A - 엘라직산을 함유하는 자외선에 의한 피부노화 억제용 조성물

Info

Publication number: KR20100089947A
Application number: KR1020090009150A
Authority: KR
Inventors: 강영희; 배지영; 신승용
Original assignee: 한림대학교 산학협력단
Priority date: 2009-02-05
Filing date: 2009-02-05
Publication date: 2010-08-13
Also published as: KR101068763B1

Abstract

본 발명은 엘라직산(ellagic acid)을 함유하는 자외선에 의한 피부노화 억제 효능을 갖는 조성물에 대한 것이다. 보다 구체적으로, 엘라직산을 함유함으로써 자외선 B 파장에 의한 피부 섬유아세포의 콜라겐(collagen) 분해와 메트릭스 메탈로프로티나제(MMP)인 콜라게나제(collagenase) 효소 활성을 억제하고, 무모쥐(hairless mouse)의 콜라겐 섬유조직(collagen fibers)을 지탱하며, 또한 각질형성세포(keratinocytes)의 유착분자 발현과 피부조직의 염증인자 분비를 감소시켜 자외선으로 인한 피부 주름과 염증을 개선시킬 수 있는 조성물에 대한 것이다.

엘라직산, 피부노화, 메탈로프로테인나아제, 주름개선, 피부염증, 자외선 B

Description

엘라직산을 함유하는 자외선에 의한 피부노화 억제용 조성물{UV-induced skin aging inhibiting composition comprising ellagic acid}

본 발명은 엘라직산(ellagic acid)을 함유하는 피부노화 억제 효능을 갖는 조성물에 대한 것이다. 보다 구체적으로, 엘라직산을 함유함으로써 자외선 B 파장에 의한 피부 섬유아세포의 콜라겐(collagen) 분해와 메트릭스 메탈로프로티나제(MMP)인 콜라게나제(collagenase) 효소 활성을 억제하고, 무모쥐(hairless mouse)의 콜라겐 섬유조직(collagen fibers)을 지탱하며, 또한 각질형성세포(keratinocytes)의 유착분자 발현과 피부조직의 염증인자 분비를 감소시켜 자외선으로 인한 피부 주름과 염증을 개선시킬 수 있는 조성물에 대한 것이다.

인간의 피부는 나이가 들어가면서 양적인 면에서나 질적인 면에서 상당히 많은 변화가 일어나게 된다. 이러한 자연노화 외에도 여러 가지의 외부 환경에 의해서 자극을 받는다. 즉, 분자생물학적인 변화나 외부의 물리, 화학적 인자에 의하여 일련의 변화가 일어난다. 그 중에서도 특히 태양광선에 포함되어 있는 자외선(ultraviolet ray)에 의한 손상을 광노화(photoaging)이라고 하며 이에 관한 연구가 활발히 이루어져 왔다. 일반적으로 자외선은 그 파장에 따라 자외선 A(320- 400nm), 자외선 B(280-320nm) 그리고 자외선 C(190-280nm) 등 세 가지로 나눠진다. 태양광으로부터 지표에 도달하는 자외선 중 자외선 C는 대기권의 상층부에 있는 오존층에서 흡수, 산란되어 여과되므로 자연적 광화학 반응에 별다른 영향을 미치지 않는다. 자외선 A는 일차적으로는 태양으로부터 방출되나 인공 램프 등에 의해서도 방출되며 피부의 표피와 진피층에 깊숙하게 투과한다. 따라서 자외선 A는 현재 피부에 가장 많은 영향을 주는 요소로서 주시되고 있다. 그러나 자외선 B 조사는 자외선 A 보다 더 위험하다. 즉 자외선 B는 자외선 A 보다 파장이 짧아서 피부 깊숙이 침투하지는 못한다고 알려져 있으나 자외선 A 보다 훨씬 강한 에너지를 가지고 있어서 피부 표면에 예리한 홍반을 발생시키는 한편 피부의 광노화를 촉진시키는 파장으로 알려져 있다.

자외선에 의한 피부 손상 원인 중 하나는 자외선에 의해 형성된 활성 산소종이 세포 신호체계에 신호를 보내어 결국 피부의 세포간물질 (extracellular matrix, ECM)의 성분인 콜라겐이나 젤라틴 등을 분해하는 효소인 메트릭스 메탈로프로티나제 (matrix metalloproteinase, MMP)를 생성하여 콜라겐이나 젤라틴을 파괴함으로서, 피부에 주름이 형성되게 하는 것이다. 만성적인 자외선의 영향을 상징적으로 나타내는 것으로 농부 혹은 어부의 피부를 들 수 있는데, 그 특징은 외형적으로는 피부의 색이 검고 촉감이 뻣뻣하며 깊은 주름이 생긴다. 이 상태가 더욱 심해지면 피부암을 유발하는데 이러한 피부의 변화를 자연노화와 구분하여 광노화라고 한다. 이러한 광노화를 억제할 목적으로 지금까지 많은 기능성 화장품들이 개발되었으며 이들 중에는 비타민 A 계통의 레티놀을 사용하는 것과 비타민 C 계통의 아스코빅산을 사용하는 것이 대부분이다. 그러나 이들 두 가지 성분은 실온에서 불안정하여 화장품을 장기 보존할 경우 쉽게 분해되어 그 효능을 잃게 된다. 현재 이들 두 성분의 실활을 막기 위하여 이들 물질에 지방산을 결합시켜 변형하거나 리포좀으로 포집하는 등 다양한 방법이 동원되고 있다.

콜라겐은 피부의 섬유아세포에서 생성되는 주요 기질 단백질로서 세포외 간질에 존재하고, 생체 단백질 총중량의 30%를 차지하는 중요한 단백질로 견고한 3중 나선구조를 가지고 있다. 주된 기능으로는 피부의 기계적 견고성, 결합조직의 저항력과 조직의 결합력, 세포접착의 지탱, 세포분할과 분화의 유도 등이 알려져 있다. 콜라겐은 피부노화의 외적인 원인이 되는 자외선 노출에 의해서도 파괴되며, 자외선에 의한 변화는 자외선에 노출된 시간의 축적에 비례하는 것으로 알려져 있다. 자외선은 피부 진피층에서 탄력섬유성 물질을 축적시키고 교원섬유를 변성시켜 피부에 주름이 생기게 만들고 탄력성을 저하시킨다.

한편, MMP (matrix metalloproteinases)는 다형핵성 호중구 (polymorphonuclear neutrophil), 대식세포 (macrophage), 섬유아세포 (fibroblast), 골세포 (bone cell) 등과 같은 세포로부터 분비되는 칼슘 및

아연 의존성 엔도펩티다제(endopeptidase)로 중성 pH에서 작용하며, 기질로서 여러 가지 세포외기질을 이용한다. 이러한 단백질 분해효소는 배 발생, 조직의 형성, 암전이, 치주질환, 류마토이드 관절염, 염증, 당뇨병, 각막궤양, 골다공증, 위궤양, 외상, 피부노화 및 주름, 화상 및 상처 치료와 같은 병리학적 과정과 각종 질환에 관여하는 것으로 알려져 있다. 주름의 예방 및 치료를 위한 연구가 발전되면서 피 부에서 콜라겐의 중요한 기능들이 밝혀지고 있으며, 이러한 연구들로부터 피부 내 콜라겐의 합성 촉진에 의해 콜라겐 대사가 활발해지면 진피 메트릭스의 성분이 중가 되어 주름개선, 탄력증진, 피부강화 등의 효과가 있는 것으로 밝혀지고 있다. 콜라겐 합성을 촉진하기 위해 종래에 사용한 물질로서, 레티노이드(RE36068), trans-forming growth factor-β, 동물태반유래의 단백질(JP평08-2312709(A)), 베툴린산(JP평08-208424(A)), 클로렐라 추출물(JP평09-0405239, JP평10-0362839(A)) 등이 알려져 있으나, 레티노인산의 경우 불안정하고 피부적용 시 자극, 발적 등의 안정성 문제로 사용량의 제한이 있으며, 클로렐라 추출물 등은 효과가 미미하여 실질적으로 피부의 콜라겐 합성 촉진으로 인한 피부기능 개선효과를 기대할 수 없다. 최근 새롭게 등장한 주름치료법으로 초음파 치료 및 피부 스케일링, 레이저 박피술, 보툴리눔톡신 주사, 레스틸렌 주사 등이 있으나 시술 비용 및 지속성 면에서 큰

효과를 발휘하지 못하고 있는 실정이다. 따라서 생체에서 콜라겐 합성 촉진 효과가 매우 우수한 촉진제의 개발 및 발굴이 절실히 요망되고 있다.

엘라직산은 자연계의 식물에 많은 양으로 존재하는 탄닌의 가수분해 산물로 잘 알려진 대표적인 폴리페놀류로서, 엘라직산이 포함된 식품을 섭취함으로써 암을 예방한다는 것이 널리 알려져 있다. 엘라직산은 항변이시험에서 활성을 나타내며, 화학물질로 유도한 설치류의 폐, 간, 피부 및 식도의 발암 현상을 억제하는 것으로 알려져 있다. 또한, 마우스의 피부를 TPA를 이용하여 종양을 유발 억제하는 작용도 있는 것으로 알려져 있다(J Cell Biochem Suppl., 1995;22: 169-80).

상기 엘라직산을 이용한 모발 및 피부 적용에 대한 관련 특허로는 다음과 같이 알려져 있다.

미녹시딜(minoxidil)과 같은 잘 알려진 ATP 의존성 Potassium Channel Opener와 함께 엘라직산 또는 그 염은 모발 케라틴 단백질의 phosphoserine 잔기의 생성을 억제하여 모발 표면의 성질 개선 효과를 얻은 특허가 출원되었다(일본특개평2001-302543).

엘라직산 또는 그 유도체가 TGF-β에 의한 모낭에서 각질형성세포의 세포사멸을 효과적으로 억제함으로써 탈모를 억제하고 발모를 증진시킨다는 것이 특허로 출원되어 있다(공개번호 KR 20050119525).

엘라직산 또는 그 유도체가 피부와 관련된 화장품 및 의약품에서의 사용에 관한 것으로서 엘라직산이 세포외기질 중 collagen VII의 생성량을 촉진하여 표피와 진피의 접합(Junction)을 강화하여 피부 색조와 주름 및 모발 컨디션을 향상한다는 것이 특허출원 되어있다(공개번호 US 20020098213, EP 1021161, WO99/016415).

엘라직산이 섬유아세포와 각질형성세포의 프로테아솜(proteasome) 활성을 촉진시켜 피부노화 현상을 방지 또는 지연시킨다는 특허가 등록되어 있다(등록특허 KR 제0853377호).

또한, 엘라직산의 수분산액을 포함하는 화장 또는 피부과용 조성물, 및 피부 처리를 위한, 특히 피부 탈색소화를 위한 화장 방법에 관한 특허가 등록되어 있다(등록번호 KR 제0807142호).

그러나, 종래 엘라직산은 상기에서 보는 바와 같이 발모증진, 모발개선이나 피부에서의 세포외기질(콜라겐)의 생성과 프로테아솜 활성을 촉진시켜 피부노화 현상 방지 및 피부 탈색소화를 위한 조성물 등으로 이용되어 왔을 뿐, 인간 피부 섬유아세포의 콜라겐 분해와 MMP인 콜라게나제(collagenase) 효소 활성을 억제하고 자외선으로 인한 피부 주름과 염증을 개선시킬 수 있는 용도에 대해서는 전혀 보고된 바 없다.

본 발명자들은 안전하고 독성이 없는 천연물로부터 자외선에 의한 피부노화를 억제하는 제제를 찾던 중 엘라직산이 자외선 B에 노출된 인간 피부 섬유아세포에서 노화의 주원인인 콜라겐의 분해와 MMP/콜라게나제의 활성을 억제시키고, 무모쥐의 콜라겐 섬유조직을 지탱하며, 각질형성세포의 유착분자 발현과 피부조직의 염증인자 분비를 감소시켜 자외선으로 인한 피부 주름과 염증을 개선시킴을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 엘라직산이 자외선 B파장에 노출된 인간 피부 섬유아세포에서 노화의 주원인인 콜라겐의 분해와 MMP/콜라게나제의 활성을 억제시키고 무모쥐의 콜라겐 섬유조직을 지탱하며, 각질형성세포의 유착분자 발현과 피부조직의 염증인자 분비를 감소시켜 자외선으로 인한 피부 주름과 염증을 개선시킬 수 있는 피부노화 억제용 조성물을 제공하는데 있다.

엘라직산을 이용하여 자외선 B에 노출된 인간 피부 섬유아세포에서 노화의 주원인인 콜라겐의 분해와 MMP/콜라게나제의 활성 억제 효과를 확인하고 무모쥐의 콜라겐 섬유조직을 지탱하며, 각질형성세포의 유착분자 발현과 피부조직의 염증인자 분비를 감소시켜 자외선으로 인한 피부 주름과 염증을 개선시켜주는 효과를 확인하였다.

본 발명에 의한 자외선에 의한 피부노화 억제용 조성물을 이용하면, 피부가 일광에 노출되면 피부의 콜라겐, 탄력섬유가 손상되어 피부 탄력을 잃고 주름이 생기게 되며 홍반과 같은 염증현상을 예방 또는 개선할 수 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 엘라직산을 유효성분으로 함유하는 자외선에 의한 피부노화 억제용 조성물을 제공한다.

보다 상세하게는 엘라직산을 유효성분으로 함유하는 자외선에 노출된 인간 피부 섬유아세포에서 노화의 주원인인 콜라겐의 분해와 MMP/콜라게나제의 효소 활성을 억제시키고, 무모쥐의 콜라겐 섬유조직을 지탱하며, 각질형성세포의 유착분자 발현과 피부조직의 염증인자 분비를 감소시켜 자외선으로 인한 피부 주름과 염증을 개선시키는 조성물을 제공한다.

엘라직산은 하기 화학식 1과 같은 구조를 갖고 있고 통상적인 방법에 따라 제조하여 사용하거나 시판되는 것을 구입하여 사용할 수 있다.

화학식 I

상기 유효성분은 조성물 총 중량에 대하여 0.001~3%의 양으로 함유되는 것을 특징으로 한다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명의 자외선에 의한 피부노화 억제용 조성물은 자외선 B 파장에 노출된 인간 피부 섬유아세포에서 노화의 주원인인 콜라겐의 분해와 MMP/콜라게나제의 효소 활성을 억제하고 무모쥐의 콜라겐 섬유조직을 지탱하며, 각질형성세포의 유착분자 발현과 피부조직의 염증인자 분비를 감소시켜 자외선으로 인한 피부 주름과 염증을 개선함으로써 피부노화 억제효과를 나타내는 것이다.

본 발명에 의한 콜라겐의 분해와 MMP/콜라게나제의 효소 활성, 그리고 염증인자의 형성을 억제시키는 엘라직산은 전체 조성물 총 중량에 대하여 0.001에서 5중량%의 범위로 사용된다. 이는 0.001중량% 미만에서는 그 효과를 기대할 수 없고, 5중량% 초과에서는 안전성, 또는 제형상의 제조에 어려움이 있기 때문이다. 유효한 효과와 안정성, 및 제형 안정성을 고려한다면 0.01~3.0중량%가 바람직하다.

본 발명에 의한 피부노화 억제용 조성물은 그 제형에 있어서 특별히 한정되지 않지만, 구체적으로 화장수, 영양크림, 영양로션, 마사지크림, 영양에센스, 팩 등의 화장료 제형 또는 연고 등의 의약 제형일 수 있다.

본 발명은 다음의 실시 예에 의거하여 더욱 상세히 설명되나, 본 발명이 이에 의해 제한되지는 않는다.

(실시 예1) 세포배양 실험

성인의 피부조직에서 일차배양으로 분리한 인간 피부 섬유아세포는 Clonetics (San Diego, CA, USA)에서 구입하였다. 인간 피부 섬유아세포와 각질형성세포(독일 Fusenig 교수로부터 제공받음)는 10% fetal bovine serum (FBS)와 100 U/ml penicillin이 첨가되어있는 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, Sigma co., St. Louis, MO, USA)으로 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다.

(실시 예2) 엘라직산의 조제

실험에 사용된 엘라직산은 시그마알드리치사(Sigma co., St. Louis, MO, USA)에서 구입하였으며 dimethyl sulfoxide (DMSO)에 용해하여 실험 시 DMSO 농도가 0.5% 이하가 되도록 하였다.

(실시 예3) 자외선 B 파장 조사

자외선은 Bio-sun (Vilber Lourmat, Marine, Cedex, France) 형광등으로 조사하였다. 자외선 조사 전에 배지를 제거한 후 phosphate buffered saline (PBS)로 세척하여 배지 내 serum 성분을 제거하여 100 mJ/cm² UV-B를 조사하였다.

(실시 예4) 배양 상층액의 준비와 콜라게나제 분비 억제

(4-1) 웨스턴블롯

세포외의 분비물인 MMP-1, MMP-8, MMP-13의 활성을 측정하기 위해 피부 섬유아세포에 엘라직산을 처리하고 100 mJ/cm² UV-B를 조사하여 48시간 배양한 후 그 배양한 세포배양액을 3000 rpm에서 10분간 원심분리하여 얻은 상층액을 이용하였다. 이렇게 얻은 상층액을 10% SDS-PAGE gel 상에서 80V로 전기영동 하였다. Gel상에 있는 단백질은 nitrocellulose membrane으로 전이시킨 다음, 비특이적인 결합을 방지하기 위하여 3% bovine serum albumin (BSA)와 함께 배양하였다. MMP-1의 일차항체 (monoclonal mouse anti-human antibody, Santa Cruz Biotech., Santa Cruz, CA, USA), MMP-8, MMP-13의 일차항체 (polyclonal goat anti-human antibody, Santa Cruz Biotech.) 모두 100 배로 희석하여 nitrocellulose membrane과 교반하면서 3시간 배양한 후 4℃에서 하룻밤 배양하고 다시 실온에서 3시간 배양한 후 이차항체인 donkey anti-goat horseradish peroxidase (Jackson ImmunoResearch Lab., West Grove, PA, USA)를 5000 배 희석하여 1시간 동안 배양하였다. Nitrocellulose membrane에 전이된 단백질은 Supersignal West pico chemiluminescence (Pierce Biotech., Rockford, IL, USA)로 검출하여 X-ray 필름 (Konica Co., Tokyo, Japan)으로 촬영하였다.

도 1은 콜라겐의 분해를 일으키는 MMP인 MMP-1, -8, -13의 분비를 배양된 배지로 웨스턴블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 그 결과 자외선 B를 조사하였을 때 과도하게 분비된 MMP는 엘라직산을 처리한 결과 5 농도부터 상기 세 가지 종류의 MMP 분비가 감소되는 것으로 나타났다. 이 결과는 엘라직산이 자외선 B 조사에 의한 MMP의 분비를 감소시킴으로써 콜라게나제 효소의 생성을 억제시키는 효과가 있음을 보여준다.

(실시 예5) 엘라직산의 콜라겐 분해 억제

피부 진피세포 내 주요 단백질인 콜라겐의 수준을 측정하기 위하여 인간 피부 섬유아세포에 엘라직산을 처리하고 100 mJ/cm² UV-B를 조사하여 48시간 배양한 후 세포에 1 M β-glycerophosphate, 0.1 M Na₃Vo₄, 0.5 M NaF, 10% SDS 그리고 protease inhibitor cocktail이 함유된 1.0 M Tris-HCl (pH 6.8) lysis buffer를 사용하여 세포를 용해하였다.

(5-1) 웨스턴블롯

인간 피부 섬유아세포의 콜라겐 수준을 측정하기 위하여 웨스턴 블롯을 시도하였다. 세포 extracts의 단백질은 6% SDS-PAGE gel 상에서80V로 전기영동 하였다. Gel상에 있는 단백질은 nitrocellulose membrane으로 전이시킨 다음, 비특이적 인 결합을 방지하기 위하여 3% BSA와 함께 배양하였다. 콜라겐 단백질의 일차항체 (polyclonal goat anti-human antibody, Santa Cruz Biotech.)는 100 배로 희석하여 nitrocellulose membrane과 교반하면서 3시간 배양한 후 4℃에서 하룻밤 배양하고 다시 실온에서 3시간 배양한 후 이차항체인 goat anti-mouse horseradish peroxidase (Jackson ImmunoResearch Lab.)를 5000 배 희석하여 1시간 동안 배양하였다. Nitrocellulose membrane에 전이된 단백질은 Supersignal West pico chemiluminescence (Pierce Biotech.)로 검출하여 X-ray 필름 (Konica Co.)으로 촬영하였다.

그 결과 정상적인 진피세포에는 콜라겐이 많이 존재하고 있으나, 자외선 B를 조사한 세포에서는 그 수준이 현저하게 감소하였는데 엘라직산을 처리한 세포에서는 자외선 B 조사에 의해서 콜라겐 수준이 감소되는 것을 억제시키는 효과가 나타났다(도 2).

(5-2) 면역세포화학법

세포배양 실험을 거친 인간 피부 섬유아세포에 0.2% Tween 20이 함유된 차가운 PBS로 세척하여 4% formaldehyde로 20 분간 고정시키고 이를 PBS로 세척하여 0.1% Triton-X 100과 0.1% sodium citrate가 첨가된 PBS에 5 분 동안 처리하였다. 비특이적인 결합을 방지하기 위하여 25% FBS가 첨가된 PBS에 1시간 동안 배양시킨 후 polyclonal goat anti-human collagen type 1 일차항체 (1:100; Santa Cruz Biotech.)를 가하여 4℃에서 하룻밤 배양하였다. 그런 다음 Cy3 conjugated anti-goat IgG (1:10000; Rockland Immunochemicals) 이차항체로 발색하여 AXIOIMAGER (Zeiss, G, Germany) 형광현미경을 통하여 관찰하였다.

세포에 콜라겐 항체와 함께 cy3로 염색하면 콜라겐 수준에 따라 세포질이 빨간색을 띄게 되는데 이렇게 세포를 염색한 세포면역학적 분석에서도 웨스턴블롯 분석과 동일한 결과를 보여주었다(도 2).

(실시 예6) 엘라직산의 유착분자 발현 억제 효과

각질형성세포 내에서 ICAM-1의 증가는 대식세포와 백혈구세포들 같은 염증과 관련되어 있는 세포들의 피부 내의 침윤현상을 일으키게 한다. 피부의 염증반응에서 중요한 조절인자로 작용하는 진피의 혈관내피세포와 마찬가지로 표피의 각질형성세포에서의 ICAM-1 발현도 피부염증에 관여하는 것으로 알려져 있다(J Invest Dermatol., 1994; 103: 23-28). 엘라직산이 자외선 B 조사에 의해서 유도된 ICAM-1 단백질 발현에 미치는 영향을 조사한 것이다. 이를 위하여 ICAM-1 단백질에 특이적인 항체를 사용하여 웨스턴블롯 및 세포면역화학법 분석을 시도하였다.

(6-1) 단백질 분리와 웨스턴블롯 분석

각질형성세포에 자외선 B를 조사한 후 ICAM-1 단백질 발현을 측정하기 위하여 웨스턴블롯을 실시하였다. 세포에 lysis buffer를 처리하여 세포 추출물을 준비 하였다. 세포 추출물의 단백질은 8 % SDS-PAGE를 수행하였다. 전기영동 된 단백질 밴드들은 nitrocellulose membrane으로 전이시키고, 비특이적인 결합을 방지하기 위하여 5% 탈지분유를 처리한 다음 ICAM-1 단백질의 일차항체(monoclonal rabbit anti-human antibody, Santa Cruz Biotech.)를 1000배로 희석하여 교반하면서 반응시키고, goat anti-rabbit horseradish peroxidase (1:10000, Jackson ImmunoReasearch Lab.)의 이차항체로 1시간 반응시켰다. Nitrocellulose membrane에 있는 ICAM-1 단백질은 Supersignal West pico chemiluminescence (Pierce Biotech.)로 검출하여 X-ray 필름 (Konica Co.)으로 촬영하였다.

(6-2) 면역세포화학법

세포배양 실험을 거친 각질형성세포에 0.2% Tween 20이 함유된 차가운 PBS로 세척하여 4% formaldehyde로 20 분간 고정시키고 이를 PBS로 세척하여 0.1% Triton-X 100과 0.1% sodium citrate가 첨가된 PBS에 5분 동안 처리하였다. 비특이적인 결합을 방지하기 위하여 25% FBS가 첨가된 PBS에 1 시간 동안 배양시킨 후 polyclonal rabbit anti-human ICAM-1 일차항체 (1:1000; Santa Cruz Biotech.)를 가하여 4℃에서 하룻밤 배양하였다. 그런 다음 Cy3 conjugated anti-rabbit IgG (1:10000; Rockland Immunochemicals) 이차항체로 발색하여 AXIOIMAGER 형광현미경을 통하여 관찰하였다.

그 결과, 자외선 B를 조사하지 않은 각질형성세포에서는 ICAM-1 단백질이 전혀 발현되지 않았지만, 자외선 B를 조사하였을 때는 ICAM-1 단백질의 발현이 현저히 증가하였다. 이에 반해 자외선 B를 조사한 각질형성세포에 엘라직산을 농도별로 처리한 경우 10 μM 농도에서 ICAM-1 단백질의 발현이 현저히 억제되었다(도 3).

(실시 예7) 엘라직산의 피부노화와 염증 억제 효과(동물실험)

(7-1) 무모쥐의 자외선 처리

생후 4주령의 무모쥐(hairless mouse)를 이용하여 7일간의 적응기간을 두어 체중 증가 및 일반 증상에 이상이 없는 쥐를 선별한 후 자외선 B를 조사하였다. 자외선 조사는 1주에 3회씩 8주간 조사하였으며, 조사량은 1주에는 1 MED, 2주에는 2 MED 그리고 3주부터 8주까지는 3 MED로 조사하였다. 실험이 진행되는 8주간 매일 같은 시간에 엘라직산이 함유된 시료와 함유되지 않은 시료를 등 부위에 골고루 도포하였다. 시험물질은 아세톤에 10 농도로 녹여 제조하여 사용하였다. 처리군당 6마리의 무모쥐를 사용하였으며, 자외선을 조사하지 않은 정상군, 자외선만 조사한 대조군, 그리고 자외선과 엘라직산을 처리한 실험군으로 나누어 결과를 비교하였다.

실험이 종료된 쥐의 피부상태를 측정하기 위해 디지털 카메라와 CCD 카메라를 이용하여 피부 사진을 촬영하였다. 그 결과는 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타난 바와 같이, 정상군에 비해서 자외선을 조사한 대조군의 피부 에는 염증과 홍반뿐만 아니라 깊은 주름이 생성된 것이 관찰되었다. 또한, 영상분석 장치인 Visioscan인 VC98 CCD 카메라로 피부주름 및 피부 표면상태를 측정한 결과 정상군에 비해서 대조군에서 주름의 생성을 관찰 할 수 있었다. 이에 반해, 엘라직산을 도포한 실험군에서는 대조군에 비해 주름의 생성이 감소된 것이 관찰되었다.

(7-2) 엘라직산의 피부조직 개선 효과

7-1의 정상군, 자외선 대조군 및 자외선/엘라직산 도포한 실험군의 무모쥐를 이용, 병리조직학적 관찰을 위하여 헤마톡실린과 에오신 염색법 및 메이슨 염색법을 이용한 면역조직 화학염색을 시행하였다. 조직을 파라핀으로 고정하고 5 μm로 절편한 후 자일렌으로 탈 파라핀 단계를 거치고, 농도별 에탄올로 함수단계를 거친 후 각각의 염색약으로 염색한 후 다시 농도별 에탄올로 탈수 단계를 거쳐 마무리 하였다.

도 5는 좌측부터 정상군, 자외선만 조사한 대조군, 엘라직산을 도포한 실험군의 피부조직을 나타낸 것이다. 도면에 나타난 바와 같이, 자외선 B를 조사한 대조군의 표피 두께는 정상군에 비해서 약 4배 정도 두꺼워졌으며 엘라직산을 도포한 실험군의 표피 두께는 대조군에 비해 약 2배 정도 감소되었다. 이들 결과는 엘라직산이 자외선 B 조사에 의한 각질의 축적으로 나타나는 표피가 두꺼워지는 증상을 개선시켜 주는 효과가 있음을 보여준다.

도 6은 메이슨염색법을 이용하여 진피 내 콜라겐 양을 분석한 결과이다. 도면에 나타낸 바와 같이 정상군의 진피 내에는 많은 양의 콜라겐이 존재하고 있으나 자외선 B를 조사한 대조군에서는 진피층의 손상에 의해서 콜라겐 양이 현저히 감소된 것이 관찰되었다. 이에 비해, 10 농도로 엘라직산을 도포한 실험군에서는 정상군과 마찬가지로 콜라겐의 양이 전혀 감소되지 않았다.

(7-3) 엘라직산의 사이토카인 분비 억제 효과

8주간의 실험을 마친 무모쥐의 등 피부조직에 1 M β-glycerophosphate, 0.1 M Na₃Vo₄, 0.5 M NaF, 10% SDS 그리고 protease inhibitor cocktail이 함유된 1.0 M Tris-HCl (pH 6.8) buffer를 사용하여 조직을 균질화 하였다. 이렇게 균질화 된 조직은 2000× g의 속도로 10분간 원심분리하여 획득한 상층액을 사용하여 염증성 사이토카인에 해당하는 interleukin(IL)-1β와 IL-6의 양을 ELISA kits(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)로 측정하였다.

도 7은 자외선 B를 조사한 피부조직에서 분비되는 염증성 사이토카인 IL-1β와 IL-6의 양을 분석한 결과이다. 자외선 B를 8주간 조사한 대조군에서 IL-1β와 IL-6의 발현은 정상군에 비해 약 4배 정도 증가하였으며 엘라직산을 도포한 실험군에서는 대조군에 비해 약 2배 정도 감소하였다. 이들 결과는 엘라직산이 자외선 B 를 조사한 피부조직 내에 염증성 사이토카인의 분비를 억제시켜 주는 효과가 있음을 보여준다.

(7-4) 엘라직산의 대식세포 침윤 억제 효과

면역조직화학법의 방법을 이용하여 엘라직산이 자외선 B 조사에 의한 대식세포의 침윤에 미치는 영향을 알아보고자 파라핀에 고정된 조직절편을 사용하였다. 자일렌으로 탈 파라핀 과정을 거치고 농도별 에탄올로 함수단계를 거쳐 준비된 조직절편은 내인성 페록시다아제를 제거하기 위하여 0.5% 과산화수소가 포함된 메탄올로 반응한 후 비특이적인 단백질의 결합을 억제하기 위하여 3% BSA와 0.1% Tween 20이 포함된 PBS에 1시간 동안 반응한 후 일차항체인 goat anti-mouse SR-A (1:100)를 이용하여 실온에서 1시간 반응시켰다. 이차항체로 peroxidase-conjugated anti-goat IgG를 실온에서 1시간 반응시켰고 PBS로 세척한 뒤 3’,3’-diaminobenzidine 용액으로 발색한 후 헤마톡실린으로 대조 염색하였다.

그 결과는 도 8에 나타내었다.

도 8에 나타난 바와 같이 8주간 자외선 B만 조사한 대조군의 진피조직에서는 대식세포의 침윤현상이 두드러지게 증가하였지만, 10 농도로 엘라직산을 도포한 실험군에서는 대식세포의 침윤현상이 억제되는 것으로 나타났다.

도 1은 엘라직산의 섬유아세포 MMP-1, MMP-8, MMP-13 콜라게나제 효소의 분비 억제효과를 나타낸 도이다.

도 2는 엘라직산의 섬유아세포 제1형 콜라겐 수준에 대한 효과를 나타낸 도이다. 여기에서 A는 웨스턴블롯, B는 세포면역학적 분석결과를 나타낸다.

도 3은 엘라직산의 각질형성세포 ICAM-1 단백질 발현억제 효과를 나타낸 도이다. A는 웨스턴블롯, B는 세포면역학적 분석결과를 나타낸다.

도 4는 디지털 카메라와 CCD 카메라를 이용하여 무모쥐의 피부조직 상태를 촬영한 사진이다.

도 5는 무모쥐 피부조직 절편을 헤마톡실린과 에오신으로 염색하여 표피의 두께를 분석한 결과이다. 여기에서 윗부분에 쓰여진 알파벳 문자는 덩컨의 다중검정법(Duncan's multiple range test)에 의할 경우, 유의수준 p＜0.05의 범위에서 유의하게 다른 값들을 나타낸 것이다.

도 6은 무모쥐 피부조직 절편을 메이슨으로 염색하여 진피의 콜라겐 섬유의 양을 분석한 결과이다.

도 7은 무모쥐 피부조직을 균질화하여 사이토카인인 IL-1β와 IL-6의 분비량을 나타낸 결과이다. 여기에서 윗부분에 쓰여진 알파벳 문자는 덩컨의 다중검정법에 의할 경우, 유의수준 p＜0.05의 범위에서 유의하게 다른 값들을 나타낸 것이다.

도 8은 무모쥐 피부조직 절편을 면역조직화학법을 이용하여 대식세포 의 진피 내 침윤현상을 나타낸 결과이다.

Claims

엘라직산은 자외선으로 인한 인간 피부 섬유아세포의 MMP 콜라게나제 효소 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 피부노화 억제용 조성물.
엘라직산은 자외선에 의한 피부 표피조직의 각질화와 피부 진피의 콜라겐 섬유의 손실에 의한 주름생성을 억제시킴을 특징으로 하는 피부노화 억제용 조성물.
엘라직산은 장기적인 자외선으로 인한 피부 표피 각질형성세포의 유착분자 발현과 피부조직의 염증인자 분비를 감소시킴으로서 자외선으로 인한 피부 주름과 염증을 개선시킴을 특징으로 하는 피부노화 억제용 조성물.