JP7092886B2

JP7092886B2 - 鳥類の卵から分離した細胞である胚盤葉多能性幹細胞、神経幹細胞、胚性線維芽細胞条件培地を有効成分とする細胞の増殖、肌の再生、及びシワ改善用の培地組成物

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Description

本発明は、鳥類の卵（ｅｇｇ）から分離した細胞である胚盤葉多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓ；ＰＳＣｓ）または神経幹細胞（ｎｅｕｒａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ；ＮＳＣｓ）、胚性線維芽細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ；ＦＢｓ）条件培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄｍｅｄｉｕｍ）を有効成分として含有するヒト幹細胞、ヒト間葉系幹細胞またはヒト皮膚細胞をはじめとする細胞の増殖を促すための培地組成物に関する。

幹細胞（ｓｔｅｍｃｅｌｌ）は、好適な環境及び刺激を通じて各種の細胞へ分化できる能力を備えており、しかも、自己増殖能力を備えている細胞であって、初期の胚芽から分離した胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｓ；ＥＳＣｓ）、胚芽期の始原生殖細胞から分離した胚性生殖細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃｇｅｒｍｃｅｌｌ；ＥＧ細胞）、誘導多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌ）の３種類が多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓ；ＰＳＣｓ）としてよく知られており、特に、胚性幹細胞とは、卵の胚盤葉由来の多能性幹細胞（Ｅｇｇｂｌａｓｔｏｄｅｒｍｄｅｒｉｖｅｄｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓ；ＰＳＣｓ）を意味する。なお、造血幹細胞（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｓ；ＨＳＣｓ）、間葉系幹細胞（ＭｅｓａｎｃｈｙｍｌＳｔｅｍｃｅｌｌｓ；ＭＳＣｓ）、神経幹細胞（ＮｅｕｒｏｎａｌＳｔｅｍＣｅｌｌｓ；ＮＳＣｓ）は、成体幹細胞（ａｄｕｌｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓ）であって、複能性幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓ；ＭＳＣｓ）としてよく知られている。幹細胞は、特徴的な現象と特化した機能とを有する細胞に発達する潜在力を有しているため、各種の臓器に対する機能の修復のための細胞資源としての研究の対象となっている。

一方、幹細胞は、細胞分裂が止まった分化済みの細胞とは異なり、細胞分裂により自分と同じ細胞を作り出す（ｓｅｌｆ－ｒｅｎｅｗａｌ）ことができて増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ；ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）するという特性があり、かつ、分化刺激が加えられると、特定の細胞へ分化するが、他の環境または他の分化刺激により他の細胞へも分化することができて分化に柔軟さ（ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ）を有していることが特徴である。幹細胞を得られる方法には、大きく２種類がある。一つは、受精卵から発生した胚性から得ること（胚性幹細胞）であり、もう一つは、成人となった身体の各部分に保持されている幹細胞（成体幹細胞）を回収することである。機能的な面からみて相違点があるとはいえ、胚性幹細胞や成体幹細胞は、色々な種類の細胞へ分化することができるという特徴を有している。

また、真皮は、主としてコラーゲンとエラスチン繊維とからなるが、これらは、肌を支持する役割を果たす。このため、このような真皮に問題が生じると、シワが生じ、肌のハリや弾力がなくなって肌の老化が進んでしまう。コラーゲンは、肌の再生、肌の含水率、傷の治癒及びシワの改善などにおいて最も重要な役割を担うことが知られており、線維芽細胞から生成される。コラーゲンは、多量の水分を含有できる機能があり、真皮に水分を供給する役割を果たすが、老化が進むと、コラーゲンの水分含有機能が劣る結果、シワが増えてしまう。さらに、コラーゲンは、傷がついたとき、線維芽細胞の継続したコラーゲンの生成により傷付いた部分を埋めて傷の治癒作用をもする。真皮は、主としてコラーゲンとエラスチン繊維とからなるが、これらは、肌を支持する役割を果たす。このため、このような真皮に問題が生じると、シワが生じ、肌のハリや弾力がなくなって肌の老化が進んでしまう。コラーゲンは、肌の再生、肌の含水率、傷の治癒及びシワの改善などにおいて最も重要な役割を担うことが知られており、線維芽細胞から生成される。コラーゲンは、多量の水分を含有できる機能があり、真皮に水分を供給する役割を果たすが、老化が進むと、コラーゲンの水分含有機能が劣る結果、シワが増えてしまう。さらに、コラーゲンは、傷がついたとき、線維芽細胞の継続したコラーゲンの生成により傷付いた部分を埋めて傷の治癒作用をもする。

そこで、本発明者らは、卵由来の幹細胞条件培地の新規な用途を開発するために鋭意努力したところ、鳥類の卵由来の幹細胞条件培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄｍｅｄｉｕｍ）は、フィーダー細胞なしにもヒト幹細胞または皮膚細胞などを有意的に増殖し、顕著な肌の再生及びシワ改善の効果を示すことから、前記卵（ｅｇｇ）由来の幹細胞条件培地を細胞増殖用の培地組成物または肌の再生及びシワ改善用の化粧料組成物の有効成分として有効に用いることができるということを見出すことにより、本発明を完成するに至った。

本発明の目的は、鳥類の卵（Ｅｇｇ）由来の幹細胞条件培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄｍｅｄｉｕｍ）を有効成分として含む細胞増殖用の培地組成物を提供することである。

また、本発明は、鳥類の卵（Ｅｇｇ）由来の細胞条件培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄｍｅｄｉｕｍ）を有効成分として含む肌の再生及びシワ改善用の化粧料組成物を提供することである。

前記目的を達成するために、本発明は、鳥類の卵（Ｅｇｇ）由来の幹細胞条件培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄｍｅｄｉｕｍ）を有効成分として含む細胞増殖用の培地組成物を提供する。

また、本発明は、鳥類の卵（Ｅｇｇ）由来の細胞条件培地を有効成分として含む創傷治療用の薬学的組成物を提供する。

さらに、本発明は、鳥類の卵（ｅｇｇ）由来の細胞条件培地を有効成分として含有する肌の再生またはシワ改善用の化粧料組成物を提供する。

本発明の鳥類の卵（ｅｇｇ）幹細胞条件培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄｍｅｄｉｕｍ）は、動物血清の使用による汚染を根本から遮断することができ、さらに、支持細胞の使用による異種間の感染物質による伝染の可能性なしに、ヒト幹細胞、皮膚細胞をはじめとする様々な細胞の増殖効果を示し、かつ、有意的な肌の再生またはシワの改善効果を示すことから、卵幹細胞条件培地を細胞増殖用の培地組成物、及び肌の再生またはシワ改善用の化粧料組成物として有効に用いることができる。

卵受精卵の胚盤葉から誘導した多能性幹細胞を示す図であって、Ａは、コロニーを形成した様子を示す図であり、Ｂは、免疫細胞染色法を用いて、ＯＣＴ４遺伝子が発現していることを確認した図であり、Ｃは、アルカリフォスファターゼの活性を確認した図であり、Ｄは、多能性幹細胞のマーカーであるＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧの発現有無を確認した図である。Ａは、卵由来の神経幹細胞のアルカリフォスファターゼ活性を確認した図であり、Ｂは、神経幹細胞のマーカーであるＮｅｓｔｉｎ及びＳＯＸ９の発現有無を確認した図である。卵由来の幹細胞条件培地のヒト胚性幹細胞及びヒト間葉系幹細胞の増殖効果を確認した図である。卵由来の幹細胞条件培地の皮膚細胞の増殖効果を確認した図である。コラーゲン遺伝子の発現に対する卵由来の幹細胞条件培地の効果を確認した図である。ＨＡＳ－２の発現及びヒアルロン酸の生成量に対する卵由来の幹細胞条件培地の効果を確認した図である。エラスチンの発現に対する卵由来の幹細胞条件培地の効果を確認した図である。

以下、本発明についてさらに詳しく説明する。

本発明は、鳥類の卵（Ｅｇｇ）由来の幹細胞条件培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄｍｅｄｉｕｍ）を有効成分として含む細胞増殖用の培地組成物を提供する。

前記卵は、鳥類の卵（Ｅｇｇ）であり、前記鳥類は、ニワトリ、シチメンチョウ、カモ、ガン、ウズラ、キジ、スズメ、ハト、オウム、フィンチ（ｆｉｎｃｈｅｓ）、タカ、カラス、ダチョウ、エミュー（ｅｍｕ）及びヒクイドリ（ｃａｓｓｏｗａｒｙ）など、分類学的にａｖａ綱（ｃｌａｓｓ）のあらゆる種（ｓｐｅｃｉｅｓ）、亜種（ｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓ）または属（ｒａｓｓ）を含むが、これらに限定されるものではない。特に、好ましくは、赤色野鶏（Ｇａｌｌｕｓｇａｌｌｕｓ）またはニワトリの種類である白色レグホン、褐色レグホン、バードロック（Ｂａｒｒｅｄ－Ｒｏｃｋ）、サセックス（Ｓｕｓｓｅｘ）、カリフォルニアグレイ（ＣａｌｉｆｏｒｎｉａＧｒａｙ）、イタリアンパートリッジカラード（ＩｔａｌｉａｎＰａｒｔｒｉｄｇｅ－ｃｏｌｏｒｅｄ）である。

本発明の卵由来の幹細胞は、イヤル―ギラディ及びコチャブ（Ｅｙａｌ－ＧｉｌａｄｉａｎｄＫｏｃｈａｙ；ＥＧ＆Ｋ，１９７６）の発生段階においてステージＸまたはＸＩに相当する胚芽の卵受精卵の胚盤葉（ｂｌａｓｔｏｄｅｒｍ）から得た多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌ）、卵受精卵を培養機において３～５日間３８℃の条件下で培養してハンバーガーとハミルトン（ＨａｍｂｕｒｇｅｒａｎｄＨａｍｉｌｔｏｎ；Ｈ＆Ｈ，１９５１）ステージ１４～１７の発生段階に至った胚芽から血液を採取して得た多能性細胞、卵受精卵を培養機において５～６日間３８℃の条件下で培養してハンバーガーとハミルトン（ＨａｍｂｕｒｇｅｒａｎｄＨａｍｉｌｔｏｎ；Ｈ＆Ｈ，１９５１）ステージ２８において形成された生殖腺から分離した胚性生殖細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃｇｅｒｍｃｅｌｌｓ；ＥＧＣｓ）、卵受精卵を１１日間３８℃の条件下で培養して得た筋肉組織から得た胚性線維芽細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ；ＥＦｓ）を山中４因子と呼ばれる４つの転写因子（ＯＣＴ４、Ｓｏｘ２、ＫＩＦ－４、ｃ－Ｍｙｃ）で処理して逆分化させたり、ｍｉＲＮＡ－３０２クラスターを過発現させたりして得た誘導多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓ；ｉＰＳＣｓ）を含むが、これらに限定されるものではない。

前記条件培地とは、細胞を細胞分裂の最盛期である対数成長期に達したときに無血清培地に交換した後、培養液のみを回収した培地のことをいう。これは、分裂中の細胞から培地内において抽出される未知の成長因子（ｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ）、サイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）を用いることをいう。一つの具体的な形態によれば、前記条件培地は、卵幹細胞を無血清培地で培養した後、前記幹細胞を除去した溶液を含むものであり、卵幹細胞に由来する成長因子、サイトカインなどの物質が豊富に含有されていてもよい。

また、前記条件培地は、卵幹細胞を成長因子などが含まれている培地で１次培養した後、無血清培地で培養して条件培地を製造してもよいが、１次前培養段階を行わなくても構わず、基本培地に卵幹細胞を培養した後、幹細胞を用いて製造されてもよい。

一方、前記細胞増殖用は、ヒト幹細胞、体細胞及び皮膚細胞からなる群より選ばれるいずれか１種の細胞増殖用であることが好ましく、前記ヒト幹細胞は、胚性幹細胞または成体幹細胞であることが好ましく、前記成体幹細胞は、骨髄由来、脂肪由来、臍帯血由来、血液由来、肝臓由来、皮膚由来、胃腸管由来、胎盤由来、神経由来、副腎由来、上皮由来及び子宮由来の幹細胞からなる群よりいずれか１種を選んで用いてもよい。

本発明の具体的な実施例において、本発明者らは、ニワトリの卵から神経幹細胞、多能性幹細胞を分離した後（図１及び図２を参照）、基本培地で培養して卵幹細胞条件培地を製造した。

また、本発明の卵幹細胞条件培地の細胞増殖の効果を確認するために、卵幹細胞条件培地を含む基本培地にヒト幹細胞または皮膚細胞を培養したところ、動物性の血清及び支持細胞の添加なしにも、ヒト幹細胞または皮膚細胞の有意的な増殖能を示すことを確認した（図３及び図４を参照）。

したがって、本発明の鳥類の卵（ｅｇｇ）幹細胞条件培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄｍｅｄｉｕｍ）は、動物血清の使用による汚染を根本から遮断することができ、さらに、支持細胞の使用による異種間の感染物質による伝染の可能性なしに、ヒト幹細胞、皮膚細胞をはじめとする様々な細胞の増殖のための培地組成物として有効に用いることができる。

さらに、本発明は、鳥類の卵（Ｅｇｇ）由来の細胞条件培地を有効成分として含有する肌の創傷治療用の薬学的組成物を提供する。

前記鳥類の卵由来の細胞は、多能性幹細胞、神経幹細胞及び線維芽細胞からなる群より選ばれるいずれか１種であることが好ましい。

本発明の創傷とは、生体が損傷された状態を意味し、生体の内部または外部の表面をなす組織など個体のいかなる部分への損傷も含まれ得る。

前記鳥類の卵（Ｅｇｇ）由来の細胞条件培地は、皮膚細胞の増殖を促し、創傷の治療、肌の再生に活性を有し、本発明の前記有効成分は、組成物の全重量に対して０．１～１００重量％で含有することができる。

本発明の具体的な実施例において、本発明者らは、卵（Ｅｇｇ）由来の細胞条件培地上において皮膚細胞の増殖能を確認するために、ＨａＣａＴ（ケラチノサイト、Ｔｈｅｒｍｏ）皮膚細胞を卵由来の細胞培養液上において一定期間培養した後、成長度を比較したところ、有効な皮膚細胞の増殖能を確認した（図４を参照）。

結論的に、本発明の鳥類の卵（Ｅｇｇ）由来の細胞条件培地上において皮膚細胞を培養するとき、皮膚細胞の増殖効果に優れていることを確認したため、鳥類の卵（Ｅｇｇ）由来の細胞条件培地は、肌の創傷治療用の薬学的組成物の有効成分として用いることができる。

本発明の卵（Ｅｇｇ）由来の細胞条件培地を含む薬学的組成物は、有効成分である卵（Ｅｇｇ）由来の細胞条件培地の以外に、通常的に用いる適切な担体、賦形剤及び希釈剤をさらに含んでいてもよい。なお、薬学的組成物の製造には、固体または液体の製剤用添加物を用いることができる。製剤用添加物は、有機または無機のどちらであっても差し支えない。

賦形剤としては、例えば、乳糖、ショ糖、白糖、ブドウ糖、トウモロコシ澱粉（コーンスターチ）、澱粉、タルク、ソルバイト、結晶セルロース、デキストリン、カオリン、炭酸カルシウム、二酸化ケイ素などが挙げられる。結合剤としては、例えば、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、エチルセルロース、メチルセルロース、アラビアゴム、トラガント（ｔｒａｇａｃａｎｔｈ）、ゼラチン、シェラック（ｓｈｅｌｌａｃ）、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、クエン酸カルシウム、デキストリン、ペクチン（ｐｅｃｔｉｎ）などが挙げられる。滑沢剤としては、例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール、シリカ、硬化植物油などが挙げられる。着色剤としては、通常、医薬品に添加することが許可されているものであれば、いずれも使用可能である。これらの錠剤、顆粒剤には、糖衣、ゼラチンコーティング、その他に、必要に応じて適宜にコーティングを施してもよい。なお、必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤などを添加してもよい。

本発明の薬学的組成物は、当業界において通常的に製造されるいかなる剤形にも製造することができ（例えば、文献Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅ，最新版；ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ，ＥａｓｔｏｎＰＡ）、製剤の形態は、特に限定されることはないが、好ましくは、外用剤であってもよい。本発明の外用剤には、シート剤、液状塗布剤、噴霧剤、ローション剤、クリーム剤、パッフ剤、粉剤、浸透パッド剤、噴霧剤、ゲル剤、パスタ剤、塗布剤、軟膏剤、エアロゾル、粉末剤、懸濁液剤、経皮吸収剤などの通常の外用剤の形態が含まれ得る。これらの剤形は、あらゆる製薬化学において一般的に公知となっている処方書である文献［Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅ，１５ｔｈＥｄｉｔｉｏｎ，１９７５，ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ１８０４２（Ｃｈａｐｔｅｒ８７：Ｂｌａｕｇ，Ｓｅｙｍｏｕｒ）に述べられている。

本発明の外用剤において、薬剤学上許容される担体としては、その剤形によるが、ワセリン、流動パラフィン、ゲル化炭化水素（別名：プラスチベース）などの炭化水素類；重鎖脂肪酸トリグリセリド、豚脂、固い脂肪、カカオ脂などの動植物性オイル；セタノール、ステアリルアルコール、ステアリン酸、パルミチン酸イソプロピルなどの高級脂肪酸アルコール及び脂肪酸ならびにそのエステル類；マクロゴール（ポリエチレングリコール）、１，３－ブチレングリコール、グリセロール、ゼラチン、白糖、糖アルコールなどの水溶性基剤；グリセリン脂肪酸エステル、ステアリン酸ポリオキシル、ポリオキシエチレン硬化ひまし油などの乳化剤；アクリル酸エステル、アルギン酸ナトリウムなどの粘着剤；液化石油ガス、二酸化炭素などの噴射剤；パラオキシ安息香酸エステル類などの防腐剤などが挙げられ、本発明の外用剤は、これらを用いて通常の方法に従って製造することができる。また、これらの以外にも、安定剤、香料、着色剤、ｐＨ調整剤、希釈剤、界面活性剤、保存剤、抗酸化剤などを必要に応じて配合してもよい。本発明の外用剤は、通常の方法により局所創傷部に塗布されて用いられてもよい。また、本発明に係る外用剤は、通常の絆創膏の創傷剥離カバーなどの固体支持体の上に粘着されて用いられてもよい。本発明の態様によれば、まず、固体支持体を粘着層で被覆して固体支持体への培養液の付着を向上させる。粘着剤の例としては、ポリアクリレート及びシアノアクリレートが挙げられる。

本発明の薬学的な有効量は、患者の創傷の種類、適用部位、処理回数、処理時間、剤形、患者の状態、補助剤の種類などに応じて変わり得る。使用量は、特に限定されないが、通常、本発明の薬学組成物の１日有効量は、卵（Ｅｇｇ）由来の細胞条件培地を含む組成物を創傷に適用するとき、１～５０μｌ／ｃｍ^２であってもよく、好ましくは、５～２０μｌ／ｃｍ^２であってもよい。前記１日有効量は、１日につき１回、または適当間隔おきに１日につき２～３回に分けて投与してもよく、数日おきに間欠投与してもよい。しかしながら、本発明の薬剤学的組成物の前記使用量は、投与経路、患者の年齢、性別、体重、患者の重症度、創傷の種類、適用部位、処理回数、処理時間、剤形、患者の状態、補助剤の種類などの色々な因子を鑑みて決定されるものであるため、前記有効量は、いかなる側面からも、本発明の範囲を制限することはない。

さらに、本発明は、卵（Ｅｇｇ）由来の細胞条件培地を有効成分として含有する肌の再生またはシワ改善用の化粧料組成物を提供する。

本発明の卵（Ｅｇｇ）由来の細胞条件培地は、皮膚細胞を有効に増殖し、肌のシワと保湿に関わるコラーゲン遺伝子の発現を増加させ、ヒアルロン酸の生成を増加させ、エラスチン遺伝子の発現を増加させるので、肌の再生またはシワ改善用の化粧料組成物として用いることができる。

本発明の卵（Ｅｇｇ）由来の細胞条件培地を含む肌の状態改善用の化粧料組成物は、化粧品製剤において収容可能な担体を含んでいてもよい。ここで、「化粧品製剤において収容可能な担体」とは、化粧品製剤に含まれ得る、既に公知となって用いられている化合物または組成物、もしくは、今後開発されるべき化合物または組成物であって、肌と接触したとき、人体が適応可能なレベル以上の毒性、不安定性または刺激性がないものをいう。前記担体は、本発明の化粧料組成物にその全重量に対して約１～９９．９９重量％、好ましくは、組成物の重量の約９０～９９．９９重量％で含まれてもよい。しかしながら、前記割合は、本発明の化粧料組成物が製造される後述する剤形に応じて、かつ、その具体的な適用部位（顔、首など）やその好適な適用量などに応じて異なるため、前記割合は、いかなる側面からも、本発明の範囲を制限することはない。

前記担体としては、アルコール、オイル、界面活性剤、脂肪酸、シリコーンオイル、湿潤剤、補湿剤、粘性変形剤、乳剤、安定剤、紫外線散乱剤、紫外線吸収剤、発色剤、香料などが挙げられる。前記アルコール、オイル、界面活性剤、脂肪酸、シリコーンオイル、湿潤剤、補湿剤、粘性変形剤、乳剤、安定剤、紫外線散乱剤、紫外線吸収剤、発色剤、香料として使用可能な化合物／組成物などは、既に当業界において公知となっているため、当業者であれば、適宜な当該物質／組成物を選んで用いることができる。本発明の一実現例によれば、本発明に係る化粧料組成物は、前記卵由来の幹細胞培養液の以外に、グリセリン、ブチレングリコール、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン硬化ひまし油、エタノール、トリエタノールアミンなどを含んでいてもよく、防腐剤、香料、着色料、精製水などを必要に応じて微量含んでいてもよい。本発明に係る化粧料組成物は、様々な形態で製造されてもよいが、例えば、化粧水、エッセンス、ゲル、エマルジョン、ローション、クリーム（水中油滴型、油中水滴型、多重相）、溶液、懸濁液（無水及び水系）、無水生成物（オイル及びグリコール系）、ゲル、マスク、パック、粉末、またはゼラチンなどの皮膜付きカプセル（ソフトカプセル、ハードカプセル）剤形などの形態で製造されてもよい。本発明における肌は、顔だけではなく、頭皮、全身を網羅する概念であり、このような頭皮に適用可能な化粧料組成物として、シャンプ、リンス、トリートメント、発毛剤などが挙げられ、全身に適用可能なボディクレンザーなどの用途に種々の形態で製造されてもよい。本発明に係る卵由来の幹細胞培養液を含有する肌の再生または肌の創傷改善用の化粧料組成物の製造方法は、前述した製造方法に何ら限定されるものではなく、本発明が属する技術分野において通常の知識を有する者であれば、前記製造方法を一部変形した方法でも本発明に係る化粧料組成物を製造することができる。

とりわけ、前記肌の再生用の化粧料組成物またはシワ改善用の化粧料組成物は、本発明に格別に開示されている製造方法の以外にも、通常的に知られている製造方法を用いて、一般的な乳化剤形及び可溶化剤形の形態で製造されてもよい。乳化剤形及び可溶化剤形の化粧料組成物として製造される場合、乳化剤形の化粧品としては、栄養化粧水、クリーム、エッセンスなどが挙げられ、可溶化剤形の化粧品としては、柔軟化粧水が挙げられる。また、皮膚科学的に許容可能な媒質または基剤を含有することにより、皮膚科学分野において通常的に用いられる局所適用または全身適用が可能な補助剤の形態で製造されてもよい。さらに、好適な化粧品の剤形としては、例えば、溶液、ゲル、固体または練り無水生成物、水相に油相を分散させて得たエマルジョン、懸濁液、マイクロエマルジョン、マイクロカプセル、微細顆粒球またはイオン型（リポソーム）、非イオン型の小胞分散剤の形態、クリーム、化粧水、ローション、パウダー、軟膏、スプレーもしくはコンシールスティックの形態で提供されてもよい。なお、泡沫（ｆｏａｍ）の形態で、または圧縮された推進剤をさらに含有したエアロゾル組成物の形態でも製造されてもよい。

また、本発明の肌の再生用の化粧料組成物またはシワ改善用の化粧料組成物は、さらに脂肪物質、有機溶媒、溶解剤、濃縮剤及びゲル化剤、軟化剤、抗酸化剤、懸濁化剤、安定化剤、発泡剤（ｆｏａｍｉｎｇａｇｅｎｔ）、芳香剤、界面活性剤、水、イオン型または非イオン型乳化剤、充填剤、金属イオン封鎖剤及びキレート化剤、保存剤、ビタミン、遮断剤、湿潤化剤、必須オイル、染料、顔料、親水性または親油性の活性剤、脂質小胞または化粧品に通常的に用いられる任意の他の成分のような化粧品学もしくは皮膚科学分野において通常的に用いられる補助剤を含有していてもよい。そして、これらの成分は、皮膚科学分野において一般的に用いられる量でも取り込まれてもよい。このような本発明に係る化粧料組成物は、肌の収斂、抗炎、創傷、傷の治癒、抗老化などの機能性化粧品の形態を含む。

以下、本発明について実施例及び実験例により詳しく説明する。

但し、下記の実施例及び実験例は、単に本発明を例示するものにすぎず、本発明の内容が下記の実施例及び実験例に限定されることはない。

＜実施例１＞鳥類の卵（Ｅｇｇ）細胞からの幹細胞の分離及び培養
＜１－１＞鳥類の卵からの神経幹細胞の分離及び培養
赤色野鶏の１種類である白色レグホン種（ＷｈｉｔｅＬｅｇｈｏｒｎ）種の卵（ｅｇｇ）を用いて、神経幹細胞を分離及び培養した。

具体的に、卵受精卵を８日間３８℃の条件下で培養して脊椎管を１ｍｍの断片に切断した後、酵素（０．０１％ｐａｐａｉｎ（ｓｉｇｍａ）、０．０１％ＤＮＡＩ）で処理した後、ＰＢＳバッファーを添加して８００ｇで３分間遠心分離した後、上澄み液を取り除き、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ、インシュリンの成長因子が含まれているｎｅｕｒｏｂａｓａｌＡ培地で１週間培養して球状の神経細胞塊を得た。具体的な培養方法については、ＷｈａｌｌｅｙＷｅｔａｌ．，（２００９），ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌＢｉｏｌｏｇｙ３３２：２３４－２４５を参照した。

＜１－２＞鳥類の卵の胚盤葉からの多能性幹細胞の分離及び培養
本発明の多能性幹細胞とは、受精卵の胚盤葉細胞から分離・培養した胚性幹細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌ；ＥＳＣ）を意味し、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、アルカリフォスファターゼ（Ａｌｋａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）活性を有している細胞を意味する。

具体的に、ニワトリの１種類である白色レグホン（ＷｈｉｔｅＬｅｇｈｏｒｎ）または褐色レグホン（ＢｒｏｗｎＬｅｇｈｏｒｎ）種の受精卵（ｆｅｒｔｉｌｉｚｅｄｅｇｇ）を用いた。イヤル―ギラディ及びコチャブ（Ｅｙａｌ－ＧｉｌａｄｉａｎｄＫｏｃｈａｖ；ＥＧ＆Ｋ，１９７６）による発生段階、すなわち、ステージＸまたはステージＸＩの胚芽の胚盤葉（ｂｌａｓｔｏｄｅｒｍ）を、手術用はさみを用いて切り抜いた。ＰＢＳバッファーから前記切り抜いた胚盤葉の透明膜と卵黄（ｖｉｔｅｌｌｉｎｅ）を除去し、多能性を持った胚盤葉から胚性幹細胞を分離した。胚性幹細胞の成長のために、細胞をマイトマイシンＣ（ＭｉｔｏｍｙｃｉｎｅＣ）（１０ｕｇ／ｍｌ）で２時間処理して成長を抑えたニワトリ胚性線維芽細胞（ｃｈｉｃｋｅｎｅｍｂｒｙｏｎｉｃｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｃｅｌｌｓ）またはＳＴＯ細胞と共培養した。なお、具体的な培養方法については、Ｅｙａｌ－ＧｉｌａｄｉａｎｄＫｏｃｈａｙ（１９７６），ＤｅｖＢｉｏｌ．４９：３２１－３７及びＰａｉｎＢｅｔａｌ．（１９９６），Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１２２：２３３９－２３４８を参考にした。

＜１－３＞鳥類の卵からの胚性線維芽細胞の分離及び培養
赤色野鶏の１種類である白色レグホン種（ＷｈｉｔｅＬｅｇｈｏｒｎ）種の卵（ｅｇｇ）を用いた。卵受精卵を４日間３７℃～３８℃の条件下で培養して得た組織を取った後、頭と内臓を除去してから、酵素（トリプシン－ＥＤＴＡ）で処理した。１０５％ＦＢＳ入りＤＭＥＭを添加した後、８００ｇで３分間遠心分離した後、上澄み液を除去し、１０％ＤＭＥＭ培地で長期にわたって培養して、胚性線維芽細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ；ＦＢｓ）を得た。具体的な培養方法については、ＤａｉＲｅｔａｌ（２０１４）．Ｓｔｅｍｃｅｌｌｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ２０１４：１－１５を参照した。

＜実施例２＞鳥類の卵幹細胞条件培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄｍｅｄｉｕｍ）
前記＜実施例１＞において得た卵由来の幹細胞である多能性幹細胞、または神経幹細胞、及び線維芽細胞を用いて条件培地を製造した。

具体的に、多能性幹細胞、神経幹細胞または線維芽細胞を基本培地であるＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で３日間培養した後、多能性幹細胞、神経幹細胞または線維芽細胞を除去してから、培養液のみを回収して、最終的に鳥類の卵幹細胞条件培地、鳥類の線維芽細胞条件培地を製造した。

＜実験例１＞鳥類の卵（Ｅｇｇ）細胞から分離された幹細胞の確認
前記＜実施例１＞において分離及び培養した卵由来の幹細胞の幹細胞能を確認した。多能性幹細胞は、アルカリフォスファターゼ（Ａｌｋａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）活性及びマーカー遺伝子であるＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ遺伝子を発現させ、神経幹細胞は、アルカリフォスファターゼ活性及びマーカー遺伝子であるＮｅｓｔｉｎ、ＳＯＸ９を発現させるため、アルカリフォスファターゼ染色、ＲＴ－ＰＣＲまたは免疫化学染色を用いて卵由来の幹細胞の幹細胞能を確認した。

アルカリフォスファターゼ染色は、１０％ＭｇＣｌ_２が含まれているトリスマレートバッファーにナフトール－ＡＳ－ＭＡ－リン酸ナトリウム塩（Ｓｉｇｍａ、Ｎ５０００）とファストレッドＴＲ塩（Ｓｉｇｍａ、Ｆ２７６８）を用いた。また、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、Ｎｅｓｔｉｎの遺伝子の発現はＲＴ－ＰＣＲで行い、免疫染色に用いられた抗体ＯＣＴ４としては、抗マウスＯｃｔ４（ＳａｎｔａＣｒｕｚ）とＣｙ３抗マウスＩｇＧを用いた。ＲＴ－ＰＣＲに用いられたプライマーを下記の表１に示す。

その結果、図１に示すように、卵受精卵の胚盤葉から分離した多能性幹細胞は、コロニーを形成し（図１Ａ）、ＯＣＴ４遺伝子を発現させ（図１Ｂ）、アルカリフォスファターゼ活性を示し（図１Ｃ）、多能性幹細胞のマーカー遺伝子が胚性線維芽細胞と比較して顕著に発現されることを確認した（図１Ｄ）。また、図２に示すように、卵由来の神経幹細胞もまた、アルカリフォスファターゼ活性を示し（図２Ａ）、神経幹細胞のマーカーであるＮｅｓｔｉｎ、ＳＯＸ９が有意的に発現されることを確認した（図２Ｂ）。

したがって、＜実施例１＞において分離及び培養した卵由来の幹細胞は、それぞれ多能性幹細胞及び神経幹細胞であることを確認した。

＜実験例２＞鳥類の卵幹細胞条件培地の細胞増殖能の確認
鳥類の卵幹細胞条件培地のヒト幹細胞の増殖能を確認するために、血清代替物（ＳｅｒｕｍＲｅｐｌａｃｅｒ）（２０％）入りＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（ＳＲ）と前記＜実施例２＞において製造した卵由来の多能性幹細胞条件培地（ＰＣＳ－ＣＭ）上でヒト胚性幹細胞または間葉系幹細胞をそれぞれ培養した後、結果を比較・分析した。

具体的に、ヒト胚性幹細胞（ｈｕｍａｎｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｓ；ｈＥＳＣｓ）は、対照群として、２０％の血清代替物（Ｇｉｂｃｏ）が含まれているＤＭＥＭ／Ｆ１２で培養した。また、実験群においては、前記＜実施例２＞において製造した卵由来の多能性幹細胞条件培地（２０％）を含んでいるＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で培養した。合計で５日間行い、成長の度合いを示した（図３Ａ）。さらに、ヒト間葉系幹細胞（ｈｕｍａｎｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ）の培養は、１０％ＦＢＳ入り培地で培養し、培養された細胞を６０ｍｍの皿に１×１０^６個接種した後、対照群１は、ＦＢＳ不含ＤＭＥＭ培地、対照群２は、５％ＦＢＳ入りＤＭＥＭ培地（５％ＦＢＳ）を用い、実験群としては、＜実施例２＞において製造した卵由来の多能性幹細胞条件培地５％を含んでいるＤＭＥＭ培地（５％ＰＳＣＣＭ）で３日間培養した後、成長の度合いを計数した（図３Ｂ）。

その結果、図３に示すように、本発明の卵由来の多能性幹細胞条件培地を含む基本培地におけるヒト胚性幹細胞または間葉系幹細胞の増殖が顕著に卓越していることを確認した（図３）。

したがって、本発明の卵幹細胞条件培地は、幹細胞増殖用の培地組成物として用いることができるということを確認した。

＜実験例３＞鳥類の卵幹細胞条件培地の皮膚細胞増殖能の確認
鳥類の卵幹細胞条件培地の皮膚細胞の増殖能を確認するために、前記＜実施例１＞において分離した線維芽細胞、神経幹細胞、多能性幹細胞条件培地を４％の濃度で含んでいる基本培地で皮膚細胞を培養した。

具体的に、皮膚細胞であるＨａｔＣａｔ細胞の場合、１０％ＦＢＳ入りＤＭＥＭ培地で培養した後、ＦＢＳ不含ＤＭＥＭで１日間培養して細胞の成長を抑えた。そして、ＦＢＳ不含ＤＭＥＭ培地を対照群とし、実験群としては、ＦＢＳ無しＤＭＥＭ培地に線維芽細胞、神経幹細胞、多能性幹細胞条件培地を４％の濃度で添加した後、１日から３日間にかけて成長度を確認した。

その結果、図４に示すように、神経幹細胞、多能性幹細胞条件培地は、無処理対照群と比較してＨａＣａＴ細胞を有意的に増殖し、線維芽細胞条件培地でもＨａＣａＴ細胞を増殖する効果を確認した（図４）。

さらに、有意的な効果を示す多能性幹細胞条件培地は、４％、２％、１％へと容量を減らしながら試験を行ったところ、２％以下の添加濃度でも対照群と比較して有意的な増殖効果があることを確認した（図４）。

＜実験例４＞鳥類の卵幹細胞条件培地の肌の再生及びシワ改善効果の確認
鳥類の卵幹細胞条件培地の肌の再生及びシワ改善の効果を確認した。

具体的に、前記＜実施例１＞において分離した線維芽細胞、神経幹細胞、多能性幹細胞条件培地を４％の濃度で含んでいるＤＭＥＭ基本培地で皮膚細胞（ＨａＣａＴ）を２日間培養した後、シワの改善に関わるコラーゲン遺伝子（ＣＯＬＡ１（コラーゲンタイプＩ α１；ＮＭ＿００００８８．３），ＣＯＬＡ２（コラーゲンタイプＩ α２；ＮＭ＿００００８９．３）の発現の有無や発現の度合いを、ｑＰＣＲを用いて確認し、対照群としては、ＤＭＥＭ基本培地で皮膚細胞を培養した後、コラーゲン遺伝子の発現の有無を確認した。

また、肌のシワ及び補湿に関わるヒアルロン酸の合成にも関連性があるかどうかを確認するために、ヒアルロン酸合成遺伝子であるヒアルロン酸合成酵素２（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃａｃｉｄｓｙｎｔｈｅｔｓｅ２；ＨＡＳ２）及びエラスチン遺伝子の発現を確認し、ＨＡアッセイＥＬＩＳＡキットを用いてヒアルロン酸の生成量を測定した。

具体的に、６０ｍｍの皿にＨａＣａｔ細胞１０^５個を接種した後、１０％ＦＢＳ入りＤＭＥＭ培地で培養し、無血清基本培地を用いて２４時間細胞の成長を止めた後、線維芽細胞または多能性幹細胞条件培地０～４％を含む培地に添加し、４８時間培養した後、ヒアルロン酸合成酵素（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃａｃｉｄｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ－２；ＨＡＳ－２）の発現を確認した。

一方、この実験に供されたプライマーは、下記の表２に示す。

その結果、図５に示すように、本発明の神経幹細胞条件培地と多能性幹細胞条件培地を含んでいる培地は、対照群及び線維芽細胞条件培地を含んでいる培地と比較して、シワの改善に関わるコラーゲン遺伝子の発現を有意的に増加させることを確認した（図５Ａ及び図５Ｃ）。特に、顕著な効果を示す多能性幹細胞条件培地は、添加量を減らしながらコラーゲン遺伝子の発現を確認したところ、２％以下の添加濃度でも対照群と比較して遺伝子の発現が有意的に増加していることを確認した（図５Ｂ及び図５Ｄ）。なお、図６に示すように、本発明の多能性幹細胞条件培地を含んでいる培地は、ＨＡＳ－２の発現及びヒアルロン酸の生成量を有意的に増加させることを確認した（図６）。

併せて、図７に示すように、本発明の多能性幹細胞条件培地を含んでいる培地は、肌のハリや弾力に関わるエラスチンの発現もまた著しく増加させることを確認した（図７）。

したがって、本発明の神経幹細胞条件培地と多能性幹細胞条件培地は、有意的な肌の再生及びシワ改善の効果を示すことを確認した。

Claims

ニワトリの卵（Ｅｇｇ）由来の幹細胞条件培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄｍｅｄｉｕｍ）を有効成分として含む細胞増殖用の培地組成物であって、
前記ニワトリの卵由来の幹細胞は、卵細胞から抽出した多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓ；ＰＳＣｓ）または神経幹細胞であり、
前記細胞増殖用は、ヒト幹細胞または皮膚細胞増殖用である、細胞増殖用の培地組成物。
前記ヒト幹細胞は、胚性幹細胞または成体幹細胞であることを特徴とする、請求項１に記載の細胞増殖用の培地組成物。
前記成体幹細胞は、骨髄由来、臍帯血由来、脂肪由来、血液由来、肝臓由来、皮膚由来、胃腸管由来、胎盤由来、神経由来、副腎由来、上皮由来及び子宮由来の幹細胞からなる群より選ばれるいずれか１種であることを特徴とする、請求項２に記載の細胞増殖用の培地組成物。
ニワトリの卵（Ｅｇｇ）由来の細胞条件培地を有効成分として含み、
前記ニワトリの卵由来の細胞は、ニワトリの卵細胞から抽出した多能性幹細胞、神経幹細胞及び線維芽細胞からなる群より選ばれるいずれか１種である、創傷治療用の薬学的組成物。
ニワトリの卵（ｅｇｇ）由来の細胞条件培地を有効成分として含有し、
前記ニワトリの卵由来の細胞は、ニワトリの卵細胞から抽出した多能性幹細胞、神経幹細胞及び線維芽細胞からなる群より選ばれるいずれか１種である、肌の再生またはシワ改善用の化粧料組成物。
前記ニワトリの卵（ｅｇｇ）由来条件培地は、コラーゲン遺伝子の発現を増加させ、ヒアルロン酸の生成を増加させることを特徴とする、請求項５に記載の肌の再生またはシワ改善用の化粧料組成物。
前記ニワトリの卵（ｅｇｇ）由来条件培地は、エラスチン遺伝子の発現を増加させることを特徴とする、請求項５に記載の肌の再生またはシワ改善用の化粧料組成物。
前記組成物は、化粧水、皮膚軟化剤、スキントナー、アストリンジェント、ローション、乳液、モイスチャーローション、栄養ローション、マッサージクリーム、栄養クリーム、モイスチャークリーム、ハンドクリーム、ファンデーション、エッセンス、栄養エッセンス、パック、石鹸、クレンジングフォーム、クレンジングローション、クレンジングクリーム、ボディローション、ボディクレンザー、洗顔剤、トリートメント、美容液、美容パック、軟膏剤、ゲル剤、塗布剤、液剤、パッチ及び噴霧剤からなる群より選ばれるいずれか１種に剤形化されることを特徴とする、請求項５に記載の肌の再生またはシワ改善用の化粧料組成物。
ニワトリの卵（Ｅｇｇ）由来の幹細胞条件培地を細胞と培養するステップを含み、
前記ニワトリの卵由来の幹細胞は、ニワトリの卵細胞から抽出した多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓ；ＰＳＣｓ）または神経幹細胞であり、
前記細胞は、ヒト幹細胞または皮膚細胞である、細胞の増殖方法。