KR20140072676A

KR20140072676A - 형질전환 닭 역분화 만능줄기세포의 제조방법

Info

Publication number: KR20140072676A
Application number: KR1020120140465A
Authority: KR
Inventors: 도정태; 최현우; 김종수
Original assignee: 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2012-12-05
Filing date: 2012-12-05
Publication date: 2014-06-13

Abstract

본 발명은 닭의 배아로부터 체세포를 분리하는 단계; 상기 분리된 체세포에 외래 유전자를 도입하여 형질전환 세포를 제조하는 단계; 상기 형질전환 세포에 역분화 인자를 코딩하는 유전자를 도입하여 형질전환시켜 역분화 만능줄기세포를 제조하는 단계; 및 상기 역분화 만능줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 형질전환 닭 역분화 만능줄기세포의 제조방법, 상기 방법으로 제조된 닭 역분화 만능줄기세포 및 이의 배양방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 줄기세포 기술을 활용한 새로운 형질전환 닭의 제조방법이 제공되는 바, 종래 형질전환이 어려웠던 닭의 유전자 조작이 가능하게 되어, 조류 세포를 이용한 유전자 연구에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

형질전환 닭 역분화 만능줄기세포의 제조방법 {Preparation Method of Transgenic Chickin Induced Pluripotent Stem Cell}

본 발명은 형질전환 닭 역분화 만능줄기세포의 제조방법, 상기 방법으로 제조된 닭 역분화 만능줄기세포 및 이의 배양방법에 관한 것이다.

줄기세포는 정상적인 체세포와 다르게 무한히 분열할 수 있는 능력을 가지며 적합한 환경 조건 아래에서 특정 세포로 분화하는 능력을 가진다. 그 분화 능력은 줄기세포의 특성에 따라 전분화능(pluripotency), 다분화능(multipotency), 또는 단일분화능(unipotency) 으로 정의되어진다. 따라서 줄기세포를 배양을 통해 증식시킨 후 특정 세포로 분화를 시키는 기술은 세포 치료라는 측면에서 여러 질병을 치료할 수 있는 잠재력을 가지고 있다 할 수 있다.

조혈줄기세포(hematopoietic stem cell), 골수줄기세포(bone marrow stem cell), 신경 줄기세포(neural stem cell) 등의 줄기세포는 성체에서도 존재하므로 환자 본인으로부터 추출할 수 있어 질병 치료 시 면역 거부반응이라는 문제점을 극복할 수 있는 장점이 있다. 이러한 장점은 기존의 장기이식에서 장기 제공자의 확보가 어려웠던 부분을 극복할 수 있다.

하지만, 지금까지 알려진 견해에 따르면 성체줄기세포는 단지 다분화능으로, 분화할 수 있는 능력에 한계를 가진다. 이는 곧 조직 특이줄기세포는 같은 조직유형의 세포로만 분화할 수 있다는 것인데, 중추신경계(central nervous system) (Science 255, 1707-1710 1992; Science 287, 1433-1438 2000), 골수(bone marrow) (Science 276, 71-74, 1997; Science 287, 1442-1446, 2000; Science 284, 143-147, 1999), 망막(retina) (Science 287, 2032-2036, 2000)와 골격근(skeletal muscle) (Proc. Natl Acad. Sci. USA 96, 14482-14486, 1999; Nature 401, 390-394, 1999)에서 분리된 줄기세포는 분화능력 역시 유사조직 계통으로만 분화가 가능하다는 것을 의미한다. 그 예로 조혈줄기세포(hematopoietic stem cell)는 혈액에 관련된 세포로, 신경줄기세포(neural stem cell)는 신경세포(neuron) 또는 신경아교세포(glial cell)로, 골수줄기세포(bone marrow stem cell)는 중배엽세포(mesodermal cell) 로 분화가 가능하다. 뿐만 아니라 이론적으로 무한히 증식 가능한 성체줄기세포이지만, 현재까지의 보고로는 이러한 성체줄기세포를 인 비트로(in vitro) 상에서 증식시키는데 어려움이 있으며 실제 환자로부터 많은 양의 세포를 분리해 내는 것 또한 어렵다.

전분화능 줄기세포(pluripotent stem cell)는 앞에서 열거한 성체줄기세포가 가지고 있던 여러 가지 단점들을 극복해 줄 수 있는 훌륭한 자원이다. 이 세포는 인체를 구성하는 모든 종류의 세포로 분화가 가능하며 인비트로(in vitro) 상에서 무한히 증식이 가능하다. 현재까지 알려진 전분화능 줄기세포로는 배아줄기세포(embryonic stem cell), 배아생식세포(embryonic germ cell), 배아종양세포(embryonic carcinoma cell)가 있으며 그 중 배아줄기세포는 가장 많은 연구가 이루어져 특정 세포들로의 분화 방법 및 동물질병 모델 연구한 기능성 검증과 임상 이용시 다양한 질병들에 대한 치료 가능성을 보여주었다.

하지만 이러한 배아줄기세포 역시 성체줄기세포처럼 임상이용을 위해 극복해야만 하는 단점들이 존재한다. 우선, 배아줄기세포를 얻기 위해서는 수정된 배아를 파괴해야 하므로 윤리적인 문제점을 가지고 있으며 배아줄기에서 분화된 세포를 환자에 이식했을 경우 면역 거부반응이 일어난다는 문제점을 가지고 있다.

때문에 배아줄기세포의 이러한 문제점들을 극복하기 위해서 다양한 접근 방법이 시도되었는데 그 중 가장 각광을 받은 것이 분화된 세포에서 미분화된 세포로의 역분화 유도 (reprogramming) 이다.

역분화 만능줄기세포 (유도 만능줄기세포; induced pluripotent stem (iPS) cells)는 체세포에 역분화 인자 (Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc)를 과발현 시켜, 체세포를 배아줄기세포와 유사하게 유도한 만능성 세포로서, 배아줄기세포와 같이 embryoid body, 체외 분화능력, 테라토마 형성 및 배반포에 주입하여 대리모의 자궁에 이식하면 키메라 동물을 생산할 수 있는 만능성을 가진 줄기세포이다. 현재까지 생쥐 (mouse), 쥐 (rat), 사람 (human), 돼지 (pig), 원숭이 (rhesus monkey), 토끼 (rabbit), 양 (sheep)에서 역분화 만능줄기세포가 수립된 것으로 보고 되고 있으며, 특히 한국공개특허 10-2012-0092379 호에서는 생쥐 유래 췌장상피세포를 이용한 효율적인 역분화 만능줄기세포를 제조하는 방법을 개시하고 있다. 한편, 닭을 포함한 가금류에서는 아직 역분화 만능줄기세포에 대한 보고가 전무하다.

따라서 본 발명은 닭을 대상으로 역분화 만능줄기세포를 수립하는 방법에 관한 것으로, 닭에서의 역분화 최적 조건 및 역분화 만능줄기세포를 이용한 효율적인 형질전환 닭 생산 방법을 제공하고자 한다.

상기 과제의 해결을 위하여, 본 발명은 닭의 배아로부터 체세포를 분리하는 단계; 상기 분리된 체세포에 외래 유전자를 도입하여 형질전환 세포를 제조하는 단계; 상기 형질전환 세포에 역분화 인자를 코딩하는 유전자를 도입하여 형질전환시켜 역분화 만능줄기세포를 제조하는 단계; 및 상기 역분화 만능줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 형질전환 닭 역분화 만능줄기세포의 제조방법 및 상기 제조방법으로 제조된 형질전환 닭 역분화 만능줄기세포를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 형질전환 닭 역분화 만능줄기세포 또는 이의 콜로니를 17 내지 23% 넉아웃 혈청 대체물(knockout serum replacement), 비필수 아미노산, 페니실린/스트렙토마이신/글루타민, 0.05-0.2 mM 베타-머캅토에탄올, 및 5-15 ng/ml bFGF를 포함하는 DMEM F12 배지에서 배양하는 것을 포함하는, 줄기세포성을 유지하면서 형질전환 닭 역분화 만능줄기세포를 배양하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 줄기세포 기술을 활용한 새로운 형질전환 닭의 제조방법이 제공되는 바, 종래 형질전환이 어려웠던 닭의 유전자 조작이 가능하게 되어, 조류 세포를 이용한 유전자 연구에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 닭 피부 섬유아세포주에 대한 사진으로, 도 1 좌측 사진은 닭 피부 섬유아세포주의 분리에 사용된 HH stage 32-33의 닭 배아이며, 우측은 실시예 1의 방벙브로 분리된 닭 피부 섬유아세포주에 대한 현미경 사진이다.
도 2는 GFP로 형질전환한 닭 피부 섬유아세포주에서 GFP의 발현을 확인한 결과 사진이다.
도 3은 닭 신경줄기세포주 수립 및 형질도입에 대한 사진으로, 좌측 상단 사진은 HH stage 32-33의 닭 배아에서 분리한 뇌를 나타내며 우측 상단의 사진은 닭 뇌로부터 분리하여 배양된 닭 neurosphere에 대한 사진이다. 좌측 하단 사진은 닭 neurosphere로부터 뻗어 나온 신경 줄기세포에 대한 현미경 사진이다. 우측 하단 사진은 닭 신경 줄기세포에 레트로 바이러스를 이용하여 녹색 형광 단백질을 도입한 후 형광 현미경을 통해 확인한 것이다.
도 4a는 생쥐 역분화 인자가 코딩되어 있는 바이러스를 이용하여 역분화를 유도하는 과정에 대한 모식도이다. 도 4b는 녹색 형광 단백질이 발현하는 닭 섬유아세포로부터 생쥐 역분화 인자의 과발현을 통해서 확립한 닭 역분화 줄기세포를 나타낸다.
도 5a 는 상기 동종 지향성 레트로바이러스를 이용하여 역분화를 유도하는 모식도이다. 도 5b 는 사람 역분화 인자를 이용하여 확립한 닭 역분화 만능줄기세포를 나타낸다.
도 6은 닭 역분화 줄기세포의 만능성을 평가하기 위한 Alkaline phosphatase 염색 결과 사진이다.
도 7은 닭 역분화 줄기세포 배양 배지에 따른 세포 배양 결과 사진이다.

본 발명은 닭의 배아로부터 체세포를 분리하는 단계; 상기 분리된 체세포에 외래 유전자를 도입하여 형질전환 세포를 제조하는 단계; 상기 형질전환 세포에 역분화 인자를 코딩하는 유전자를 도입하여 형질전환시켜 역분화 만능줄기세포를 제조하는 단계; 및 상기 역분화 만능줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 형질전환 닭 역분화 만능줄기세포의 제조방법을 제공한다.

본 명세서에서, "역분화 만능 줄기세포 (induced pluripotent stem cells, iPS 세포)"라 함은 "reprogrammed pluripotent stem cells"로도 지칭되며, 분화된 세포를 재프로그램하여(즉, 역분화시켜) 만능분화능(pluripotency)을 갖도록 유도된 세포를 말하며 자기재생능 (self-renewal)과 만능분화능 (pluripotency)을 가지고 있다.

본 발명의 발명자들은 닭을 대상으로 역분화 만능줄기세포를 수립하고, 이를 통해 형질전환 닭을 용이하게 생산하는 방법에 대해 연구하던 중, 닭에서의 역분화 최적 조건 및 닭 역분화 만능줄기세포의 지속적인 유지를 위한 최적 배양 조건을 도출해 냄으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 한 구체예에서, 상기 체세포는 섬유아세포 또는 신경줄기세포일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 구체예에서, 상기 역분화 인자는 Oct4, Sox2, Kif4 및 c-Myc 단백질일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 Oct-4 전사인자는 옥타머 전사인자 (octamer transcription factor) 가운데 하나로 POU [0005] (Pit-Oct-Unc) 패밀리의 클래스 V POU 도메인 구성원이다. Oct4는 미분화 세포인 배아줄기세포 및 배아종양세포에서만 발현되고 줄기세포의 만능성 (pluripotency)을 유지하는데 중요한 역할을 한다. Oct-4 발현이 정상 수준인 경우 배아줄기세포의 자가 재생산과 만능성이 유지되지만, 정상 수준 이상으로 증가하게 되면 원시 내배엽 (primitive endoderm)과 원시 중배엽 (primitive mesoderm)으로 분화하고, 반대로 정상 수준 이하로 감소하게 되면 영양외배엽(trophectoderm) 세포로 발달하므로, Oct-4가 배아줄기세포의 만능성을 결정하고 분화를 조절하는 중요한 인자이며, Oct-4는 Sox2 전사인자와 상호작용을 통해 Oct-4의 하위 유전자인 Fgf4, Utf-1, Nanog와 Sox2 유전자들의 발현을 증가시키는 상승효과를 보인다.

Sox 패밀리의 유전자들은 다능성 줄기세포 (multipotent stem cell)나 단능성 줄기세포 (unipotent stem cell)와도 관련이되어 있으며 그 중 Sox2 (SRY-type high mobility group box 2) 전사인자는 HMG box DNA 결합 모티프를 포함하는 Sox 패밀리 구성원 중 하나로, 20개의 Sox 패밀리 단백질 중 유일하게 배아줄기세포의 만능성 유지에 중요한 역할을 한다. Oct-4와 마찬가지로 생쥐의 배아줄기세포에서 Sox2의 발현을 저해하면 분화가 유도되며 여러 Sox2 하위 유전자의 프로모터 영역에서 발견되는 Sox2 결합 부위는 종종 Oct-4와 Nanog 결합 부위와 인접하게 존재한다. 그러므로 Sox2 전사인자와 Oct-4 전사인자 사이의 상호 작용이 역분화 줄기세포가 미분화상태를 유지하고 배아줄기세포의 특성을 지니게 한다.

Klf 패밀리의 한 멤버인 Klf4는 Yamanaka 그룹과 Jaenisch 그룹에 의해 생쥐와 인간의 역분화 줄기세포를 제작하는데 사용되었다. 그러나 Thomson 그룹은 Klf4 없이도 인간 역분화 줄기세포를 제작하였으므로, Klf4가 인간 역분화 줄기세포 제작에 반드시 필요한 유전자는 아닌 것으로 추정된다. Klf4는 Kruppel-type zinc-finger 전사인자로써 성장 억제에 관여하여 세포 주기를 조절하는 역할을 한다. c-Myc과 유사하게 배아줄기세포에서 STAT3의 하위 유전자로 작용하며, 과발현 시 Oct-4 발현을 유지시켜 생쥐 배아줄기세포의 분화를 억제한다고 밝혀졌다. 또한, Klf4는 배아줄기세포에서 Oct-4 하위 유전자로 알려진 Lefty1의 발현 조절에 Sox2와 Klf4가 관여하고 있으며 p53 항암 유전자의 기능을 억제한다. 따라서 Klf4가 간접적인 기작으로 배아 특이적인 유전인자인 Nanog의 활성을 증가시키고, c-Myc에 의해 유도되는 apoptosis를 억제하여 역분화 줄기세포 유도에 역할을 할 것으로 예상된다. Klf4뿐만 아니라 Klf2도 인간 역분화 줄기세포 제작에 사용할 수 있고, 관련 유전자인 Klf1과 Klf5도 인간 역분화 줄기세포 제작에 사용할 수 있지만 Klf4나 Klf2를 사용할 때보다 효율이 낮다고 보고되었다.

Helix-loop-helix/leucine zipper 전사인자인 c-Myc은 세포 성장, 분화, 증식, 세포예정사 및 암세포로의 형질전환 등의 다양한 세포 내 기능을 수행하는 발암 유전자이며, 만능성을 유지하는 주요 기작인 LIF (leukaemia inhibitory factor)/STAT3와 Wnt 신호 전달 메커니즘의 하위 유전자이다. c-Myc 전사인자는 역분화 줄기세포 내에서 Klf4 유전자에 의해 p21 유전자가 활성화되어 세포의 증식을 저해하는 것을 막아주는 역할을 한다. 또한, c-Myc은 게놈 상에 존재하는 Myc 인식부위에 결합할 뿐 아니라 histone acetylase 컴플렉스를 끌어옴으로써 염색질 구조를 변화시켜 Oct-4와 Sox2가 표적 유전자에 잘 결합할 수 있도록 도와 주는 기능을 수행한다.

상기 외래유전자 및 Oct4, Sox2, Kif4 및 c-Myc 단백질을 코딩하는 핵산은 벡터에 포함되어 세포내로 도입될 수 있다.

본 발명에서 용어, "벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다.

본 발명에서 용어, "작동가능하게 연결된(operably linked)"은 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것을 말한다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술 분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.

본 발명의 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 인핸서 같은 발현 조절 요소 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한, 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함하고, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다. 벡터는 자가 복제하거나 숙주 DNA에 통합될 수 있다.

벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 바이러스 벡터 등을 포함한다. 바람직하게는, 바이러스 벡터이다. 바이러스 벡터는 레트로바이러스(Retrovirus), 예를 들어 HIV(Human immunodeficiency virus) MLV(Murineleukemia virus) ASLV(Avian sarcoma/leukosis), SNV(Spleen necrosis virus), RSV(Rous sarcoma virus), MMTV(Mouse mammary tumor virus) 등, 아데노바이러스(Adenovirus), 아데노 관련 바이러스(Adenoassociatedvirus), 헤르페스 심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus) 등에서 유래한 벡터를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 유전자의 도입은 도입될 유전자를 발현하는 바이러스를 통해 수행될 수 있다.

본 발명에서 용어, "바이러스"는 도입될 유전자를 포함하는 핵산분자를 포함하는 바이러스 벡터를 패키징 세포로 형질전환 및 감염시켜 제작한, 도입될 유전자를 발현하는 바이러스를 의미한다.

상기 바이러스 제조에 사용될 수 있는 바이러스는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스 등을 포함하며 이로 제한되지 않는다. 바람직하게는, 레트로바이러스이며, 본 발명의 이하 실시예에서는, 외래 유전자로 녹색 형광 단백질 유전자 또는 Slc7al 유전자를 사용하여, 레트로 바이러스 벡터에 도입하였고, 이를 패키징 세포인 293T 또는 293FT 세포로 형질전환시켜, 상기 외래 유전자를 발현하는 바이러스를 제조하여 분리된 체세포를 감염시켰다.

또한, Oct4, Sox2, Kif4 및 c-Myc 단백질을 코딩하는 유전자를 각각 레트로바이러스 벡터에 도입하였고, 이를 패키징 세포인 293T 또는 PLAT-E 세포로 형질전환시켜, 상기 유전자를 발현하는 바이러스를 제조하여 상기 녹색 형광 단백질 유전자 또는 Slc7al 유전자로 형질전환된 체세포에 감염시켰다.

상기 역분화 인자 (Oct4, Sox2, Kif4 및 c-Myc)가 형질도입된 세포는 세포의 형태가 변화되며 형질도입 후 약 8 내지 11일째부터 콜로니를 형성하며 자라 역분화 만능줄기세포로 확립된다.

상기 확립된 역분화 만능줄기세포는 만능성 마커인 Alkaline Phosphatase 발현 여부의 분석을 통해 만능성이 평가될 수 있다.

이하의 실시예 7 및 도 6에 따르면, 본 발명에 따른 방법으로 제조된 역분화 만능줄기세포는 모두 Alkaline phosphatase 반응을 보이는 것으로 확인되었는 바, 만능성을 유지하고 있는 것으로 판단된다.

상기 방법으로 제조된 형질전환 닭 역분화 만능줄기세포는 이후 형질전환된 닭으로 분화하여 활용될 수 있는데, 이를 위해서는 상기 닭 역분화 만능줄기세포가 장기간 안정적으로 배양이 가능한 배양 조건의 확립이 필수적이다. 본 발명의 한 구체예에서, 상기 배양은 무-지지세포 (feeder cell-free) 조건 하에서 수행될 수 있으며, 이때 배지로는 넉아웃 혈청 대체물, 비필수 아미노산, 베타-머캅토에탄올, 항생제 및 bFGF (basic fibroblast growth factor)를 포함하는 DMEM F12 배지가 사용될 수 있다.

보다 구체적으로, 상기 배지는 17 내지 23% 또는 19 내지 21% 넉아웃 혈청 대체물(knockout serum replacement); 비필수 아미노산; 페니실린/스트렙토마이신/글루타민; 0.05-0.2 mM 또는 0.08-0.12 mM 베타-머캅토에탄올; 및 5-15 ng/ml 또는 8-12 ng/ml bFGF;를 포함하는 DMEM F12 배지일 수 있다.

또한 본 발명은 상기 방법으로 제조된 형질전환 닭 역분화 만능줄기세포를 제공한다. 상기 줄기세포는 전분화성을 갖는 바, 형질전환 닭으로 재분화가 가능하다.

상기 '줄기세포성(stemness)'은 닭의 모든 세포를 생성할 수 있는 능력인 만능분화능(pluropotency)과 자기와 닮은 세포들을 무한정 만들어 낼 수 있는 자기재생(self-renewal)능력의 두 성질을 합한 것을 지칭한다.

상기 배양 방법으로 배양시, 본 발명의 형질전환 닭 역분화 만능줄기세포는 무-지지세포(feeder cell-free) 조건 하에서 장기간 배양(즉, 계대배양)이 가능하다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 실시예 1> 닭 피부 섬유아세포주 확립

Hamburger-Hamilton (HH) stage 32-33의 배아에서 몸을 분리한 후 다른 장기 조직을 제거하고 피부조직을 trypsin/EDTA가 들어있는 배양액을 이용하여 분리하였고, 배양을 시작하였다. 피부조직으로부터 분리된 단일 세포를 gelatin이 코팅되어 있는 배양접시에서 15% 신생 송아지 혈청(Fetal Bovine Serum, FBS)이 포함되어 있는 배양액에서 배양하였다. 3-5일간 계대배양을 하며 세포주를 확립 및 특성을 분석하였다.

도 1의 좌측 사진은 HH stage 32-33의 닭 배아를 나타내며, 우측 사진은 상기 방법으로 분리된 피부 섬유아세포주에 대한 현미경 사진이다.

< 실시예 2> 레트로바이러스를 이용한 외래 유전자(녹색 형광 단백질, GFP ) 도입 및 발현

293T 세포를 DMEM (Hyclone), 15% 신생 송아지 혈청 (Hyclone), 1 X 페니실린/스트렙토마이신/글루타민 (Gibco), 0.1 mM 비필수 아미노산, 1 mM 베타 머캅토에탄올에서 배양하였다. 레트로 바이러스 벡터 pMXs-GFP 그리고 pUMVC, pCMV-VSV-G를 293T 세포에 형질도입 시킨지 48 내지 76시간 후, 신선 배지에서 수확하여 여과하였다. 바이러스가 포함되어 있는 배지를 농축 세트 (Concentration kit-Thermo) 를 통해 농축한 다음 프로타민 설페이트 (protamine sulfate) 4 μg/ml의 최종농도로 상기 실시예 1에서 만들어진 35 mm 플레이트 중의 1 x 105 개의 닭 섬유아세포에 형질도입을 유도 하였다. 녹색 형광 단백질의 발현은 형광 현미경을 통해 확인 하였고, 이를 도 2에 나타내었다.

도 2를 참조하면, 닭 섬유아세포를 형광현미경으로 촬영한 사진(우측)에서 녹색 형광 단백질의 발현을 확인할 수 있다.

< 실시예 3> 닭 신경 줄기세포주 확립

HH stage 32-33 배아의 머리에서 뇌를 분리한 후 trypsin/EDTA가 포함되어 있는 HBSS용액에 37°C의 온도에서 30분간 유지하여 단일 세포로 분리하였다. 큰 세포로 이루어진 세포 덩어리를 제거하기 위해 분리된 세포를 70 mm 나일론 메쉬에 통과 시켰다. 나일론 메쉬에 통과된 단일 세포를 각각 0.9 M sucrose가 포함되어 있는 HBSS용액과 4% bovine serum albumin (BSA)가 포함되어 있는 EBSS 용액을 이용해 세척한 후, neurosphere를 형성하기 위해 N2B27 배지에서 7-10일간 배양시켰다. 형성된 neurosphere를 gelatin 이 코팅된 배양접시에서 신경 줄기세포 배지에서 배양시켜 neurosphere에서 나온 세포를 trypsin/EDTA를 이용해 단일 세포로 분리하여 닭 신경 줄기세포주를 확립하였다. N2B27배지는 DMEM/F12 (Gibco)에 N2 supplement (Gibco), B27 supplement (Gibco), 1 X 페니실린/스트렙토마이신/글루타민 (Gibco), 0.6% Glucose (Sigma), 20 ng/ml bFGF (Invitrogen), 20 ng/ml EGF (Invitrogen)를 첨가하여 사용하였다. 신경 줄기세포 배지는 DMEM/F12 (Gibco)에 N2 supplement (Gibco), 1 X 페니실린/스트렙토마이신/글루타민 (Gibco), 10 ng/ml bFGF (Invitrogen), 10 ng/ml EGF (Invitrogen)를 첨가하여 사용하였다.

도 3의 좌측 상단 사진은 HH stage 32-33의 닭 배아에서 분리한 뇌를 나타내며 우측 상단의 사진은 닭 뇌로부터 분리하여 배양된 닭 neurosphere에 대한 사진이다. 좌측 하단 사진은 닭 neurosphere로부터 뻗어 나온 신경 줄기세포에 대한 현미경 사진이다. 우측 하단 사진은 실시예 2의 방법으로 닭 신경 줄기세포에 레트로 바이러스를 이용하여 녹색 형광 단백질을 도입한 후 형광 현미경을 통해 확인한 결과 사진이다.

< 실시예 4> 생쥐 역분화 인자 도입 입자의 제조 및 감염, 닭 역분화 줄기세포 유도

생쥐 역분화 인자를 코딩하고 있는 pMXs-Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc 레트로 바이러스 벡터(addgene)를 각각 pUMVC, pCMV-VSV-G 와 함께 293T세포에 형질도입 시킨지 48 내지 76시간 후에 신선 배지에서 수확하여 여과하였다. 바이러스가 포함되어 있는 배지를 농축 세트 (Concentration kit-Thermo) 를 통해 농축한 다음 프로타민 설페이트 (protamine sulfate) 4 μg/ml 의 최종농도로 35 mm 플레이트 중의 1 x 10⁵개의 닭 섬유아세포에 형질도입을 유도하였다. 바이러스 감염 후 5일 째에 trypsin/EDTA를 통해 단일세포로 분리 후 지지세포가 포함되어 있는 배양 접시로 계대배양을 수행하였다.

도 4a는 생쥐 역분화 인자가 코딩되어 있는 바이러스를 이용하여 역분화를 유도하는 과정에 대한 모식도이다. 도 3b는 녹색 형광 단백질이 발현하는 닭 섬유아세포로부터 생쥐 역분화 인자의 과발현을 통해서 확립한 닭 역분화 줄기세포를 나타낸다. 도 4b를 참조하면, 확립된 역분화 줄기세포에서도 녹색 형광 단백질이 발현하는 것을 알 수 있었다.

< 실시예 5> 동종 지향성 레트로 바이러스 수용기 Slc7a1 유전자 도입 입자의 제조 및 감염

Slc7a1 유전자 도입은 Takahashi 등 (2007) 에 의해 기술된 바와 같이 제조하였다. 보다 구체적으로, 6 x 10⁶ 개의 293FT 세포를 100 mm 배양접시에서 하룻밤 동안 배양하였다. 3 μg 의 pLenti6/UbC-Slc7a1 벡터와 함께 9 μg 의 virapower pakaging mix를 Lipofectamine 2000 (Invitrogen)을 통해 293FT 세포에 형질도입하였다. 트랜스펙션 후 48 시간동안 배양한 배지에서 수확하여 여과 하였다. 바이러스 감염 하루 전 닭 섬유아세포를 100 mm 배양 접시에 8 x 10⁵ 개의 세포를 배양하고, 배양배지를 바이러스가 포함되어 있는 배지로 교체 후 폴리 브렌을 4 μg/ml 의 최종농도로 첨가해주고 24시간 동안 배양한 후 신선 배지로 교체해 주었다.

< 실시예 6> 사람 역분화 인자 도입 입자의 제조 및 감염, 닭 역분화 줄기세포 유도

사람 역분화 인자 도입은 Takahashi 등 (2007) 에 의해 기술된 바와 같이 제조 하였다. 보다 구체적으로, 8 x 10⁶ 개의 PLAT-E packaging 세포를 100 mm 배양접시에서 하룻밤동안 배양하였다. pMXs-OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC 레트로 바이러스 벡터(addgene) 를 Fugene 6 transfection reagent (Roche)를 통해 PLAT-E packaging 세포에 형질도입하였다. 형질도입 24 시간 후 바이러스가 포함되어 있는 배지를 수확하고 신선한 배지를 다시 첨가하였다. 신선한 배지 첨가 24 시간 후 두 번째 바이러스가 포함된 배지를 수확하고 여과한다. Slc7a1 유전자가 발현되는 8 x 10⁵ 개의 닭 섬유아세포를 100 mm 배양접시에서 하룻밤동안 배양을 한 후, 바이러스가 포함되어 있는 배지를 2일 동안 2번 감염시킨 후 신선 배지로 교체해준다. 바이러스 감염시킨 6일 후 Trypsin/EDTA를 통해 단일세포로 분리 후 지지세포가 포함되어 있는 배양접시로 계대배양을 하였다.

도 5a 는 상기 동종 지향성 레트로바이러스를 이용하여 역분화를 유도하는 모식도이다. 도 5b 는 사람 역분화 인자를 이용하여 확립한 닭 역분화 만능줄기세포를 나타낸다.

< 실시예 7> Alkaline phosphotase 염색

Alkaline phosphotase 염색은 Alkaline phosphotase kit (Sigma)를 이용해서 실시하였다. 염색약을 준비하기 위해 100 μl Sodium nitrite 와 100 μl FRV-alkaline solution을 혼합하고 2분 동안 상온에 방치한 다음, 4.5 ml의 DDW을 첨가하고 다시 100 μl napthol AS-B1 alkaline solution을 첨가하였다. 확립된 닭 역분화 줄기세포를 PBS로 세척후 4% PFA를 이용해 고정하고 미리 준비한 염색약을 통해 20 분동안 상온에서 방치하였다. 염색된 닭 역분화 줄기세포는 해부 현미경을 통해 확인하였고, 이를 도 6에 나타내었다. 본 발명에 따른 방법으로 제조된 역분화 만능줄기세포는 모두 Alkaline phosphatase 반응을 보이는 것으로 확인되었는 바, 만능성을 유지하고 있는 것으로 판단된다.

< 실시예 8> 닭 역분화 줄기세포 배양 조건 및 유지

닭 역분화 줄기세포 배양 및 유지는 Pain 등 (1996), Lavoir 등 (2006) 에 의해 기술된 바와 같이 하여, 배지의 조성은 하기와 같이 변형시켜 수행하였다.

닭 역분화 줄기세포의 만능성을 유지하기 위해 3가지 닭 만능성 줄기세포 배지를 사용하였다. 첫 번째 닭 만능성 줄기세포 배지는 DMEM F12 (Gibco) 에 80% 버팔로 래빗 간세포 조정배지, 10% 신생 송아지 혈청 (Hyuclone), 2 mM 글루타민, 1 mM 피루베이트, 1 X 비필수 아미노산, 0.1 mM beta-mercaptoethanol을 첨가하여 사용하였다.

두 번째 닭 만능성 줄기세포 배지는 GMEM (Gibco) 에 10% 신생 송아지 혈청 (Hyclone), 2% 닭 혈청 (Valbiotech), 20 ng/ml 코날부민 (Sigma), 1mM 소디움 피루베이트(Gibco), 1% 비필수 아미노산(Gibco), 1 mM beta-mercaptoethanol (Gibco), 1 X 페니실린/스트렙토마이신/글루타민 (Gibco), 10 ng/ml bFGF (Invitrogen), 20 ng/ml h-IGF-1 (Peprotech), 1% vol/vol mouse SCF (Peprotech), 1% vol/vol h-LIF (Milipore), 1% vol/vol h-IL-11 (Peprotech)을 첨가하여 사용하였다.

세 번째 닭 만능성 줄기세포 배지는 DMEM F12 (Gibco) 에 20% Knockout Serum Replacement (Gibco), 1 X 비필수 아미노산, 1 X 페니실린/스트렙토마이신/글루타민 (Gibco), 0.1 mM beta-mercaptoethanol, 10 ng/ml bFGF 를 첨가하여 사용하였다.

세포 배양 결과를 도 7에 나타내었다.

레트로바이러스 도입으로 확립한 닭 역분화 만능줄기세포는 레트로바이러스 도입 후 8일째부터 군집의 형성이 일어나며, 이후 군집이 형성된 닭 역분화 줄기세포를 상기 세 종류의 배지에 배양하여 만능성이 유지되며 배양이 계속되는지 여부를 확인하였다.

도 7a와 7b는 닭 역분화 줄기세포를 첫번째 배지와 두번째 배지에 처음 계대배양하여 배양한 사진을 나타내며, 도 7c는 닭 역분화 줄기세포를 세번째 배지에서 여러 계대배양을 통해 유지시킨 후의 사진이다.

첫번째 배지와 두번째 배지가 들어있는 배양접시에 닭 역분화 줄기세포를 계대배양하면 성장이 멈추거나 군집 형성이 사라지는 것을 확인할 수 있다 (각각 도 7a, 도7b 참조). 한편, 세번째 닭 만능성 줄기세포 배지에 닭 역분화 줄기세포를 배양하면 세포의 성장이 원활히 이루어지며, 3번의 계대배양 (9~15일) 후에도 군집의 형성이 유지되는 것을 확인할 수 있었다 (도 6b).

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

닭의 배아로부터 체세포를 분리하는 단계;
상기 분리된 체세포에 외래 유전자를 도입하여 형질전환 세포를 제조하는 단계;
상기 형질전환 세포에 역분화 인자를 코딩하는 유전자를 도입하여 형질전환시켜 역분화 만능줄기세포를 제조하는 단계; 및
상기 역분화 만능줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 형질전환 닭 역분화 만능줄기세포의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 체세포는 섬유아세포 또는 신경줄기세포인 것인 형질전환 닭 역분화 만능줄기세포의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 역분화 인자는 Oct4, Sox2, Kif4 및 c-Myc 단백질인 것인 형질전환 닭 역분화 만능줄기세포의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 유전자의 도입은 도입될 유전자를 발현하는 바이러스를 통해 수행되는 것인 형질전환 닭 역분화 만능줄기세포의 제조방법.
재1항에 있어서,
상기 배양은 무-지지세포(feeder cell-free) 조건 하에서 수행되는 것인 형질전환 닭 역분화 만능줄기세포의 제조방법.
제5항에 있어서,
상기 배양은
17 내지 23% 넉아웃 혈청 대체물(knockout serum replacement), 비필수 아미노산, 페니실린/스트렙토마이신/글루타민, 0.05-0.2 mM 베타-머캅토에탄올, 및 5-15 ng/ml bFGF를 포함하는 DMEM F12 배지에서 수행되는 것인 형질전환 닭 역분화 만능줄기세포의 제조방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 형질전환 닭 역분화 만능줄기세포.
제7항의 형질전환 닭 역분화 만능줄기세포 또는 이의 콜로니를 DMEM F12, 17 내지 23% 넉아웃 혈청 대체물(knockout serum replacement), 비필수 아미노산, 페니실린/스트렙토마이신/글루타민, 0.05-0.2 mM 베타-머캅토에탄올, 및 5-15 ng/ml bFGF를 포함하는 배지에서 배양하는 것을 포함하는, 줄기세포성을 유지하면서 형질전환 닭 역분화 만능줄기세포를 배양하는 방법.